ＫＩＭ−１アンタゴニストおよび免疫系を調節するための使用
【課題】自己免疫疾患および哺乳動物の免疫系における他の障害の免疫機能を治療的に調節するための方法を提供すること。
【解決手段】Ｔ細胞と、第二の細胞（例えば、抗原提示細胞）との間のシグナル伝達を阻害するＫＩＭ−１アンタゴニストの使用が開示される。このような阻害は、種々の自己免疫疾患および移植片対宿主疾患を含む疾患の処置に対して有用である。また開示されるものは、哺乳動物におけるリンパ球もしくは他の免疫細胞によるＩＦＮ−γの分泌を阻害するためのＫＩＭ−１アンタゴニストの使用である。ＩＦＮ−γの阻害は、炎症性疾患または炎症性障害（例えば、炎症性腸疾患）の処置に対して有用である。
【解決手段】Ｔ細胞と、第二の細胞（例えば、抗原提示細胞）との間のシグナル伝達を阻害するＫＩＭ−１アンタゴニストの使用が開示される。このような阻害は、種々の自己免疫疾患および移植片対宿主疾患を含む疾患の処置に対して有用である。また開示されるものは、哺乳動物におけるリンパ球もしくは他の免疫細胞によるＩＦＮ−γの分泌を阻害するためのＫＩＭ−１アンタゴニストの使用である。ＩＦＮ−γの阻害は、炎症性疾患または炎症性障害（例えば、炎症性腸疾患）の処置に対して有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明の分野は、医学、免疫学、分子生物学およびタンパク質化学である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ＫＩＭ−１（Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｊｕｒｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）は、Ｉ型細胞膜糖タンパク質（Ｉｃｈｉｍｕｒａら，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：４１３５−４１４２）である。ＫＩＭ−１の細胞外部分（外部ドメイン）は、６個のシステイン免疫グロブリン様ドメインおよびムチン様Ｏグリコシル化タンパク質に特有のＴ／ＳＰリッチドメインを含む。このムチンドメインは、柄のように、細胞表面から離れたＩｇ様ドメインを伸ばす（Ｊｅｎｔｏｆｔ，１９９０，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１５：２９１−２９４）。ＫＩＭ−１は、Ａ型肝炎ウイルスに対するレセプターとして同定されている（Ｋａｐｌａｎら，１９９６，ＥＭＢＯ Ｊ．１５：４２８２−４２９６；ＷＯ ９６／０４３７６；米国特許第５，６２２，８６１号）。二つのヒトＫＩＭ−１スプライス改変体が発見され、一つは肝臓において優勢であり（Ｆｅｉｇｅｌｓｔｏｃｋ，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：６６２１−６６２８）、もう一つは、腎臓において優勢である（前出のＩｃｈｉｍｕｒａら）。
【０００３】
ＫＩＭ−１は、ＴＩＭ（Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン）ファミリーとして公知の遺伝子ファミリーのメンバーである。ＫＩＭ−１に加えて、ヒトにおいてＴＩＭファミリーの少なくとも二つの他のメンバーがある。一つのメンバーは、クローニングされて「２００遺伝子（２００ ｇｅｎｅ）」（特許文献１）と命名されたが、その後、ＴＩＭ−３として公知になった。別のメンバーも、クローニングされて「遺伝子５８（ｇｅｎｅ ５８）」と命名された（特許文献２）。
ＫＩＭ−１は、腎臓ダメージに対する臨床の診断マーカーとして興味を引いている（Ｂａｉｌｌｙら，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３９７３９−３９７４８；Ｈａｎら，２００２，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｌ．６２：２３７−２４４）。ＫＩＭ−１（ＴＩＭ−１）のマウスホモログは、気道反応性亢進の発生に関与していると考えられる遺伝子座内に存在することが報告されている（ＭｃＩｎｔｉｒｅら，２００１，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２：１１０９）。ＴＩＭ−２として公知のマウスタンパク質は、抗原特異的Ｔ細胞のインビボでの発生において役割を果たすことが報告されている（Ｋｕｍａｎｏｇｏｈら，２００２，Ｎａｔｕｒｅ ４１９：６２９−６３３）。ＴＩＭ−３として公知のマウスタンパク質は、マウスにおける免疫応答調節に関連している（Ｍｏｎｎｅｙら，２００２．Ｎａｔｕｒｅ ４１５：５３６−５４１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０００／７３４９８号
【特許文献２】国際公開第９９／３８８８１号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
ＫＩＭ−１アンタゴニストを用いた哺乳動物の処置は、Ｔ細胞と他の免疫系細胞（例えば、樹状細胞、単球マクロファージおよびＢ細胞）との相互作用を変化させ、これによって抗原に対するＩｇＧ応答を強く抑制することが発見されている。さらに、このような処置は、抗原を用いたその後の抗原投与に応答して、記憶Ｂ細胞によるＩｇＧ１産生をほとんどなくすことが発見されている。さらに、ＫＩＭ−１のそのレセプターへの結合の遮断は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、抗原応答に関与する免疫細胞によるＩＦＮ−γの分泌を減少することが発見されている。これらの発見に基づき、本発明は、自己免疫疾患および哺乳動物の免疫系における他の障害の免疫機能を治療的に調節するための方法を提供する。
【０００６】
本発明は、哺乳動物において、Ｔ細胞と第二の細胞（例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ））との間のシグナル伝達を阻害する方法を提供する。この方法は、哺乳動物（例えば、免疫疾患または免疫障害を有する哺乳動物、または組織移植片を受ける準備のある哺乳動物）を同定する工程；ならびに哺乳動物に以下の型の有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストの１つを投与する工程を包含する：（ａ）ＫＩＭ−１ Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｂ）抗ＫＩＭ−１抗体；ならびに（ｃ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメント。
【０００７】
上記のＴ細胞は、活性化Ｔ細胞（例えば、ヘルパーＴ細胞）であり得る。これはＴｈ２細胞またはＴｈ１細胞であり得る。本発明のいくつかの実施形態において、このＴ細胞は、移植されるドナーＴ細胞である。ＡＰＣは、単球、マクロファージ、樹状細胞、またはＢ細胞であり得るが、これらに限定されない。本発明のいくつかの実施形態では、ＡＰＣは、自己抗原を提示している。
【０００８】
好ましくは、上記のＫＩＭ−１アンタゴニストは、可溶性ポリペプチドであり、この可溶性ポリペプチドは、ＫＩＭ−１ Ｉｇドメインに加えてＫＩＭ−１ムチンドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、このポリペプチドは、異種部分（例えば、免疫グロブリン（Ｉｇ）部分、血清アルブミン部分、標的部分、レポーター部分、多量体化部分および精製容易化部分）を含む。好ましい異種部分は、Ｆｃ部分のようなＩｇ部分である。
【０００９】
いくつかの実施形態において、上記のＫＩＭ−１アンタゴニストは、ポリマー（例えば、ポリアルキレングリコール、糖ポリマー、あるいはポリペプチド）に結合体化されたポリペプチドである。好ましいポリマーは、ポリアルキレングリコールであり、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は特に好ましい。このポリマーの平均分子量は、好ましくは、２，０００Ｄａ〜３０，０００Ｄａであり、そしてより好ましくは、５，０００Ｄａ〜２０，０００Ｄａ（例えば、約１０，０００Ｄａ）である。
【００１０】
本発明は、例えば、Ｔｈ２細胞のような活性化Ｔ細胞によって、細胞哺乳動物におけるＢ細胞の活性化を阻害する方法を提供する。この方法は、Ｂ細胞または他のＡＰＣを有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストと接触させる工程、またはこのアンタゴニストが抗ＫＩＭ−１抗体である場合、Ｔ細胞を有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストと接触させる工程を包含する。本発明のいくつかの実施形態において、活性化Ｔ細胞は、移植されるドナーＴ細胞である。
【００１１】
本発明は、哺乳動物における一以上の抗原に対して反応性のＩｇＧのような抗体（例えば、ＩｇＧ１）のサブセットの産生を阻害する方法を提供する。この方法は、有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストは、哺乳動物の免疫系が最初に一以上の抗原を認識する３０分〜３０日前に、投与される。この抗原は、処置される疾患、障害、または状態に応じて、アロ抗原または自己抗原である。
【００１２】
本発明は、自己免疫疾患における疾患再発を阻害する方法を提供する。この方法は、有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する。
【００１３】
本発明は、自己免疫疾患におけるエピトープ拡散を阻害する方法を提供する。この方法は、有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する。
【００１４】
本発明は、Ｔｈ２媒介性疾患（例えば、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、シャーガス病、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ヴェグナー肉芽腫症、結節性多発性動脈炎、急速進行性半月体形成性糸球体腎炎、または移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ））、喘息、アトピー性皮膚炎、気管反応性亢進疾患のようなアトピー性障害および呼吸困難症候群を処置する方法を提供する。この方法は、有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する。
【００１５】
本発明は、ＧＶＨＤを阻害する方法を提供する。この方法は、移植の３０分〜３０日前に有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する。
【００１６】
本発明は、哺乳動物において、リンパ球によるＩＦＮ−γの分泌を阻害する方法を提供する。この方法は、この哺乳動物に有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する。
【００１７】
本発明は、Ｔｈ１ Ｔ細胞エフェクター機能の活性化、ならびにその結果、炎症性状態において起きる細胞性免疫応答を阻害する方法を提供する。このような炎症性状態の例は、炎症性腸疾患である。この方法は、この哺乳動物に有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する。
【００１８】
本発明は、哺乳動物における炎症性疾患または炎症性障害（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎および回腸炎のような炎症性腸疾患）を処置する方法を提供する。この方法は、この哺乳動物に有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「抗ＫＩＭ−１抗体」は、抗体（例えば、全長ＫＩＭ−１ポリペプチドの細胞外部分に特異的に結合するＩｇＧ分子）を意味する。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「全長ヒトＫＩＭ−１ポリペプチド」は、その全体で配列番号１のポリペプチドまたはその全体で配列番号２のポリペプチドを意味する。これらの二つのポリペプチドは、ヒトＫＩＭ−１遺伝子のスプライス改変体を表す。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、「異種部分」は、全長ヒトＫＩＭ−１ポリペプチド内に存在しないアミノ酸配列を意味する。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「ＫＩＭ−１アンタゴニスト」は、（ａ）ＫＩＭ−１ Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｂ）抗ＫＩＭ−１抗体；または（ｃ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントを意味し、これらの各々が、天然に存在するＫＩＭ−１の生物学的活性を、遮断するか、阻害するか、または妨害する。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「ＫＩＭ−１融合タンパク質」は、異種部分に融合されたＫＩＭ−１部分を含む融合タンパク質を意味する。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、「ＫＩＭ−１部分」は、全長ＫＩＭ−１ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントを意味する。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「ＫＩＭ−１ポリペプチド」は、ＫＩＭ−１部分単独またはＫＩＭ−１部分を含む融合タンパク質を意味する。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「ＫＩＭ−１ Ｉｇドメイン」は、そのアミノ末端がアミノ酸２９〜３６であり、そしてそのカルボキシ末端がアミノ酸１０５〜１０７である配列番号１の一部分を意味する。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「ＫＩＭ−１ムチンドメイン」は、そのアミノ末端がアミノ酸１２６〜１３０であり、そしてそのカルボキシ末端がアミノ酸２５５〜２７４である配列番号１の一部分を意味する。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「ＫＩＭ−１膜貫通ドメイン」は、配列番号１のアミノ酸２９０〜３１１を意味する。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「ＫＩＭ−１細胞質ドメイン」は、配列番号１のアミノ酸３１２〜３３４、または配列番号２の３１２〜３５９を意味する。
【００３０】
他に規定されない限り、本明細書中に使用される全ての技術および科学用語は、本発明が関係する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、規定を含める本明細書は、支配する。本明細書中に記載される全ての刊行物、特許および他の参考文献は、参考として援用される。
本明細書中に記載されるものと同様または等価である方法および材料は、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料は、以下に記載される。この材料、方法および例は、単なる例示であり、限定することを意味しない。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明および添付の特許請求の範囲から明らかになる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
哺乳動物における免疫応答に関与するＴ細胞と第二の細胞との間のシグナル伝達を阻害する方法であって、以下：
（ａ）免疫疾患または免疫障害を有する哺乳動物および組織移植片の調整における哺乳動物からなる群から選択される哺乳動物を同定する工程；および
（ｂ）該哺乳動物に以下：（ｉ）ＫＩＭ−１ Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｉｉ）抗ＫＩＭ−１抗体；ならびに（ｉｉｉ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程、
を包含する、方法。
（項目２）
前記第二の細胞が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記Ｔ細胞が、活性化Ｔ細胞である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記Ｔ細胞が、ヘルパーＴ細胞である、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記ヘルパーＴ細胞が、Ｔｈ２細胞である、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記Ｔ細胞が、移植されるドナーＴ細胞である、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記ＡＰＣが、単球、マクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記ＡＰＣが、自己抗原を提示している、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記ポリペプチドが、さらにＫＩＭ−１ムチンドメインを含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記ポリペプチドが、さらに異種部分を含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記異種部分が、免疫グロブリン（Ｉｇ）部分、血清アルブミン部分、標的部分、レポーター部分および精製容易化部分からなる群から選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記異種部分が、Ｉｇ部分である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記Ｉｇ部分が、Ｆｃ部分である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記ポリペプチドが、ポリマーに結合体化される、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記ポリマーが、ポリアルキレングリコール、糖ポリマーおよびポリペプチドからなる群から選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ポリマーが、ポリアルキレングリコールである、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記ポリマーの平均分子量が、２，０００Ｄａ〜３０，０００Ｄａである、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記ポリマーの平均分子量が、５，０００Ｄａ〜２０，０００Ｄａである、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記ポリマーの平均分子量が、約１０，０００Ｄａである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
哺乳動物におけるＢ細胞の活性化を阻害する方法であって、Ｂ細胞を、以下：（ａ）ＫＩＭ−１ Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｂ）抗ＫＩＭ−１抗体；ならびに（ｃ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストと接触させる工程を包含する、方法。
（項目２２）
前記Ｂ細胞の活性化が、活性化Ｔ細胞によって媒介される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記活性化Ｔ細胞が、Ｔｈ２細胞である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記活性化Ｔ細胞が、移植されるドナーＴ細胞である、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
哺乳動物において、一以上の抗原に対する抗体のサブセットの産生を阻害する方法であって、以下（ａ）ＫＩＭ−１ Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｂ）抗ＫＩＭ−１抗体；ならびに（ｃ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
（項目２６）
前記抗体が、ＩｇＧクラスである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記抗体が、ＩｇＧ１サブクラスである、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
有効量の前記ポリペプチドが、前記哺乳動物の免疫系が一以上の抗原を初めて認識する３０分〜３０日前に、該哺乳動物に投与される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記一以上の抗原が、アロ抗原である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記一以上の抗原が、自己抗原である、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記哺乳動物の前記免疫系が、前記一以上の抗原を、自己免疫疾患の過程におけるエピトープ拡散プロセスの一部として、初めて認識する、項目２８に記載の方法。
（項目３２）
自己免疫疾患におけるエピロープ拡散を阻害する方法であって、以下：（ａ）ＫＩＭ−１
Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｂ）抗ＫＩＭ−１抗体；ならびに（ｃ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
（項目３３）
Ｔｈ２細胞媒介性疾患を処置する方法であって、以下：（ａ）ＫＩＭ−１ Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｂ）抗ＫＩＭ−１抗体；ならびに（ｃ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
（項目３４）
前記Ｔｈ２細胞媒介性疾患が、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、シャーガス病、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ヴェグナー肉芽腫症、結節性多発性動脈炎、急速進行性半月体形成性糸球体腎炎、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）および全身性ループス腎炎（ＳＬＥ）からなる群から選択される、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
ＧＶＨＤを阻害する方法であって、以下：（ａ）ＫＩＭ−１ Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｂ）抗ＫＩＭ−１抗体；ならびに（ｃ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
（項目３６）
ＫＩＭ−１ ＩｇドメインおよびＦｃ部分を含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド。
（項目３７）
哺乳動物に有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する、該哺乳動物内のリンパ球によるＩＦＮ−γの分泌を阻害する方法。
（項目３８）
哺乳動物に有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する、該哺乳動物における炎症性疾患または炎症性障害を処置する方法。
（項目３９）
前記炎症性疾患および前記炎症性障害が、炎症性腸疾患である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記炎症性疾患または前記炎症性障害が、急性炎症または慢性炎症である、項目３８に記載の方法。
（項目４１）
前記ヘルパーＴ細胞が、Ｔｈ１細胞である、項目４に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１（先行技術）は、ヒトＫＩＭ−１ポリペプチドの二つの天然に存在するスプライス改変体の略図である。この二つのアミノ酸配列は、残基３２３まで同一である。シグナル配列（残基１〜２０）を下線で示す。膜貫通ドメイン（残基２９０〜３１１）を二重下線により示す。
【図２】図２（先行技術）は、３５９個のアミノ酸のヒトＫＩＭ−１スプライス改変体の略図である。シグナル配列および膜貫通ドメインを、黒い影で示す。Ｉｇドメイン上のシステイン残基を「Ｃ」により示す。逆三角形は、Ｎ−グリカン結合点を示す。ムチンドメインに相当するＴＳＰリッチドメインを黒い太枠で示す。
【図３】図３は、ヒツジ赤血球で一次抗原投与を受けたＢａｌｂ／ｃマウスにおいて、１４日目に測定した免疫グロブリン力価をまとめたヒストグラムである（実験１）。
【図４】図４は、ヒツジ赤血球で一次抗原投与を受けたＢａｌｂ／ｃマウスにおいて、１４日目に測定した免疫グロブリン力価をまとめたヒストグラムである（実験２）。
【図５】図５は、ヒツジ赤血球で一次抗原投与を受けたＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて、７日目に測定された免疫グロブリン力価をまとめたヒストグラムである。
【図６】図６は、実験１由来のマウスにおいて、一次抗原投与（図３）から完全に回復させ、次いで再抗原投与した後、測定した免疫グロブリン力価をまとめたヒストグラムである。免疫グロブリン力価を、再抗原投与して３日後に測定した。
【図７】図７は、実験２由来のマウスにおいて、一次抗原投与（図４）から完全に回復させ、次いで再抗原投与した後、測定した免疫グロブリン力価をまとめたヒストグラムである。免疫グロブリン力価を、再抗原投与した３日後に測定した。
【図８】図８は、マウスＭＬＲ培養におけるＩＦＮγ産生に関するデータをまとめたヒストグラムである。照射Ｂａｌｂ／ｃ脾細胞をＣ５７Ｂｌ６マウス由来の脾細胞を刺激するために使用した。培養にて４８時間後、その上清を回収し、ＩＦＮγレベルを測定するために使用した。インキュベーションの際のｍＡｂ ３Ａ２およびｍＡｂ １Ｈ９用いた培養物の処理よって、上清中に分泌されたＩＦＮγのレベルは有意に低下した。
【図９】図９は、マウスＭＬＲ培養における細胞増殖に関するデータをまとめたヒストグラムである。照射Ｂａｌｂ／ｃ脾細胞をＣ５７Ｂｌ６マウス由来の脾細胞を刺激するために使用した。培養にて７２時間後、生体色素（ｖｉｔａｌ ｄｙｅ）を培養物に添加して、１〜４時間にわたり発色させた。３日の培養期間の間、抗ＫＩＭ−１抗体用いた培養物の処理によって、細胞増殖は影響されなかった。
【図１０】図１０は、マウスＭＬＲ培養におけるＩＦＮγ産生に関するデータをまとめたヒストグラムである。照射Ｂａｌｂ／ｃ脾細胞を、Ｃ５７Ｂｌ６マウス由来の脾細胞を刺激するために使用した。培養にて４８時間後、その上清を回収して、ＩＦＮγレベルを測定するために使用した。インキュベーションの際のＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質を用いた培養物の処理によって、上清中に分泌されたＩＦＮγのレベルは有意に低下した。
【図１１】図１１は、マウスＭＬＲ培養における細胞増殖に関するデータをまとめたヒストグラムである。照射Ｂａｌｂ／ｃ脾細胞を、Ｃ５７Ｂｌ６マウス由来の脾細胞を刺激するために使用した。培養にて７２時間後、生体色素を培養物に添加して、１〜４時間にわたり発色させた。３日の培養期間の間、ＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質を用いた培養物の処理によって、細胞増殖は影響されなかった。
【図１２】図１２Ａおよび図１２Ｂは、ヒトＭＬＲ培養におけるＩＦＮγ産生に関するデータをまとめたヒストグラムである。照射ＪＹ細胞を、健常人のドナー由来の末梢血単核細胞を刺激するために使用した。培養にて５日後、その上清を回収して、ＩＦＮγレベルおよびＩｌ−２レベルを測定するために使用した。インキュベーションの際のｍＡｂ ＡＵＦ１およびｍＡｂ ＡＫＧ７を用いた培養物の処理によって、上清中に分泌されたＩＦＮγのレベルは有意に低下したが（図１２Ａ）、一方で産生したＩｌ−２のレベルは、変わらないままであった（図１２Ｂ）。
【図１３】図１３は、ヒトＭＬＲ培養における細胞増殖に関するデータをまとめたヒストグラムである。照射ＪＹ細胞を、健常人のドナー由来の末梢血単核細胞を刺激するために使用した。培養にて６日後、生体色素を培養物に添加して、１〜４時間にわたり発色させた。６日の培養期間の間、抗ヒトＫＩＭ−１ ｍＡｂを用いた培養物の処理によって、細胞増殖は有意にもたされなかった。
【図１４】図１４は、マウスにおいて、炎症性腸疾患の誘導後の体重減少に関するデータをまとめたヒストグラムである。雌性のＢａｌｂ／ｃマウスをデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）に暴露した。８日後、マウスをただの水に換え戻して、ＤＳＳ暴露から回復させた。三日後、マウスを体重測定した。この体重を、実験の開始時の体重に対する百分率として計算した。ＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質を用いた処理によって、体重スコアにおける改善で示すように、マウスに対して有意な防御が与えられた。１０マウス／グループであった。平均等価（ｅｑｕｉｖｉｌｅｎｃｅ）試験により、＞ｐ＝０．０００１の有意差が得られた。
【図１５】図１５Ａおよび図１５Ｂは、マウスにおいて、炎症性腸疾患の誘導後の臨床スコアデータをまとめたヒストグラムである。３日の回復期間後、マウスを下痢および糞便中の血液の存在について評価した。ＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質を用いて処理したマウスは、未処置のグループまたはコントロール−Ｉｇ処理のグループより有意に優れたスコアを有した（図１５Ａ）。これは、部分的に、糞石における血液の存在を有した有意により少ないマウスがよるものであった（図１５Ｂ）。平均等価試験により、ＫＩＭ−１−Ｉｇ処置した同齢集団と比較して、未処理のコントロールの臨床スコアにおいて差異についての有意な値（ｐ＝０．０５）が得られた。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
（発明の詳細な説明）
ネイティブなヒトＫＩＭ−１遺伝子は、少なくとも部分的には組織依存的なスプライス変化に依存して３３４アミノ酸または３５９アミノ酸（配列番号１）を含むポリペプチド（図１）をコードする。両方の配列とも以下を含む：シグナル配列、Ｉｇドメイン、ムチンドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン。
【００３３】
可溶性のダイマー化ＫＩＭ−１外部ドメイン−Ｆｃ融合タンパク質（マウスＫＩＭ−１外部ドメインおよびヒトＦｃ部分を含む各モノマー）ならびに認識される動物モデル（マウスのＳＲＢＣ反応）を使用して、本発明者らは、哺乳動物の免疫応答の著明な変化を成し遂げた。理論に縛られる意図はないが、本発明者らは、観察結果を融合タンパク質がＫＩＭ−１アンタゴニストのように作用し、この拮抗作用は、Ｔ細胞とＡＰＣとの間のＫＩＭ−１媒介性シグナル伝達の相互作用を妨害することを示すものとして解釈する。この妨害の下流の効果は、哺乳動物の免疫反応の有用な調節を含む。このような調節は、自己免疫疾患ならびに哺乳動物の免疫系が、Ｔ細胞細胞傷害または免疫グロブリン反応のいずれかを介して、不適切な標的を攻撃する他の疾患および障害を処置するために使用され得る。免疫系調節が有益である疾患または障害の例としては、関節炎、全身性エリテマトーデス（ｅｒｙｔｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ）（ＳＬＥまたはループスとしてもまた公知）および移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
本発明の方法において、可溶性ＫＩＭ−１アンタゴニストポリペプチドまたはＫＩＭ−１ブロッキング抗体（あるいは抗原結合性抗体フラグメント）は、予備形成されたポリペプチドとして直接投与され得る。あるいは、それは、核酸ベクター（このポリペプチドをコードし、そして発現する）を介して非直接的に投与され得る。いずれの方法にせよ、この結果は、ＫＩＭ−１媒介性のＴ細胞上の効果（Ｔ細胞活性化およびＴ細胞増殖刺激を含める）を拮抗することである。Ｔ細胞上に位置するＫＩＭ−１のこの拮抗作用は、Ｔ細胞それ自体の破壊的作用をブロックすることによって、直接的に、所望の治療効果を達成し得る。さらに、この拮抗作用は、Ｂ細胞の活性化Ｔ細胞媒介性の活性化を阻害して、それによって有害な抗体産生を減少させることによって、間接的に、所望の治療効果を達成し得る。
【００３５】
自己免疫疾患および特定のタイプの病原性感染を含める種々の疾患において、ダメージは自己抗体反応（すなわち、自己抗原を認識する抗体の産生）から生じる。本発明は、Ｔ細胞活性化およびＴ細胞分化を妨害することによって、このようなダメージを減少させるための方法および分子を提供する。これは、次いで、Ｂ細胞による特異的免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１）の産生および分泌を妨害する活性化Ｔ細胞媒介性のＢ細胞活性化を妨害する。従って、自己抗体反応によって特徴付けられる任意の疾患または障害は、本発明の方法および分子を使用することによって、処置され得る。
【００３６】
特定の自己免疫疾患が処置される場合、抗原への暴露ならびに免疫系反応は、一過性である。これは、有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストの投与が、一以上の抗原に対する免疫応答の後に続く再活性化を阻害する際の緩解をもたらす。この方法において、本発明は、疾患再発をブロックするために使用され得る。特定の自己免疫疾患が処置される場合、哺乳動物の免疫系は、一以上の抗原を、自己免疫疾患の過程におけるエピトープ拡散プロセスの一部として、初めて認識する。
【００３７】
移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）におけるダメージの多くは、一旦、例えば、骨髄移植において、移植される場合、（宿主抗原に対して）宿主において活性化されたドナーＴ細胞の作用から、直接的に生じる。Ｔ細胞活性化を妨害するこの能力によって、本発明は、ＧＶＨＤを阻害するために有用である。活性化ドナーＴ細胞の直接的作用からのダメージに加えて、ＧＶＨＤにおいて、抗体媒介性成分もまたある。この抗体媒介性成分は、自己抗体産生Ｂ細胞を活性化するドナーＴ細胞の活性化に依存することから、本発明は、ＧＶＨＤにおいて自己抗体媒介性ダメージおよび細胞性免疫媒介性ダメージを減少させる。
【００３８】
（抗体媒介性自己免疫疾患）
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ；ループス）は、細胞内抗原（例えば、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよびヒストン）に対して指向される高レベルの自己抗体によって特徴付けられるＴＨ−２媒介性自己免疫障害である。これらの特徴を考えると、ループスは、本発明に従って処置され得る自己免疫疾患を例示する。
【００３９】
本発明による処置に適した他の器官特異的疾患または全身性自己免疫疾患の例としては、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、グレーブス病、シャーガス病、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ヴェグナー肉芽腫症、結節性多発性動脈炎および急性進行性半月体形成性糸球体腎炎が挙げられる。例えば、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉら、１９９６、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ、第三版（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ）を参照のこと。さらに、一旦、Ｔ細胞細胞傷害性活性によって媒介されると考えると、慢性関節リウマチ（ＲＡ）が、Ｂ細胞および／または抗体成分を有することは、現在公知であり（Ｌｅａｎｄｒｏら，２００２，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．，６１：８６３−８６６；Ｄｅ Ｖｉｔａら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４６：２０２９−２０３３；Ｔｓｕｊｉら，２００２，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６：１２７７−１２９０）、従って、本発明による処置に適している。
【００４０】
いくつかの病原性感染薬剤に対する正常な免疫応答は、有害な自己抗体応答を誘発する。一つの例は、シャーガス病であり、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉで慢性的に感染したヒトおよび実験動物において発生する炎症性心筋症である。抗自己抗体は、シャーガス病患者の血清中に存在し（Ｂａｃｈ−Ｅｌｉａｓら、１９９８、Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．Ｒｅｓ．８４：７９６−７９９；Ｔｉｂｂｅｔｔｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１４９３−１４９９）、従って、この疾患は、本発明による処置に適している。
【００４１】
感染から生じる自己抗体による細胞の破壊の別の例は、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）であり、この自己抗体は、（ＦｃレセプターまたはＣ３ｂレセプターを有する補体または食細胞によって）血小板破壊を引き起こし、出血を導き得る。ＩＴＰは、本発明による処置に適している。
【００４２】
（移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ））
ＧＶＨＤは、本発明の方法を使用して処置され得るＴ細胞媒介性状態を例示する。ＧＶＨＤは、Ｔ細胞が宿主抗原を外来抗原として認識する場合に、惹起される。ヒト患者において、しばしば、骨髄移植（ＢＭＴ）の致命的結果となるＧＶＨＤは、急性または慢性であり得る。ＧＶＨＤの急性形態および慢性形態は、それぞれ、抗原特異的なＴｈ１応答およびＴｈ２応答の発生を例示する。急性ＧＶＨＤは、ＢＭＴ後はじめの２ヵ月以内に発症し、そして、皮膚、腸、肝臓および他の器官に対するドナー細胞傷害性Ｔ細胞媒介性ダメージによって特徴付けられる。慢性ＧＶＨＤは、より遅く現れ（ＢＭＴ後１００日以上）、そして自己抗体を含む免疫グロブリン（Ｉｇ）の過剰産生、ならびにＩｇ沈着によって引き起こされる皮膚、腎臓および他の器官へダメージによって特徴付けられる。急性ＧＶＨＤ患者の約９０％は、慢性ＧＶＨＤを発生するようになる。慢性ＧＶＨＤは、Ｔｈ２ Ｔ細胞媒介性疾患であるように思われる（Ｄｅ Ｗｉｔら，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：３６１−３６６）。急性ＧＶＨＤは、Ｔｈ１媒介性疾患である（Ｋｒｅｎｇｅｒら，１９９６，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．１５：５０−７３；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら，１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：６８９−６９９）。Ｔ細胞細胞傷害は、急性ＧＶＨＤ特有である。ドナーの抗宿主細胞傷害の結果は、種々の方法において見られ得る。第一に、宿主リンパ球は、急速に破壊され、これによって、急性ＧＶＨＤを発症しているマウスは、大いに免疫抑制されている。第二に、ドナーリンパ球は、移植され、宿主の脾臓において拡大し、そしてこれらの細胞傷害活性は、ドナー細胞によって（外来として）認識され得る宿主抗原を発現する細胞株を利用することによって、インビトロで、直接測定され得る。第三に、この疾患は、さらなる組織にとって、致死性になり、そして細胞集団は、破壊される。
【００４３】
慢性ＧＶＨＤは、宿主組織および宿主細胞の抗体媒介性破壊から生じ、「ＳＬＥ様」ＧＶＨＤと呼ばれている。徴候としては、自己抗体形成、種々の器官（腎臓、肝臓）におけるＩｇ沈着、皮膚発疹、リンパ系の過形成、シェーグレン様病変、強皮症様病変、多発動脈炎および他の病理が挙げられる。この疾患は、自己抗体形成によって、部分的に媒介される。前述のことを考えると、慢性ＧＶＨＤは、本発明による処置に適している。
【００４４】
（他のＴｈ２関連疾患）
アトピー障害は、活性化Ｔ細胞およびＡＰＣを含む免疫系細胞による、サイトカイン、ケモカイン、およびＴｈ２応答に特有な他の分子（例えば、とりわけＩＬ−４サイトカイン、ＩＬ−５サイトカインおよびＩＬ−１３サイトカイン）の発現によって特徴付けられる。従って、このようなアトピー障害は、Ｔｈ２応答の発生を拮抗する方法（例えば、本発明のＫＩＭ−１アンタゴニスト）による処置を受け入れる。アトピー障害としては、喘息（気道過敏症および気道困難症候群）およびアトピー皮膚炎のような病理が挙げられる。本発明は、アトピー障害を阻害する方法を提供する。この方法は、有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する。
【００４５】
（活性化リンパ球、ＡＰＣおよび炎症誘発性サイトカインによって媒介される炎症性疾患および炎症性障害）
マウスモデル系およびヒトモデル系における混合リンパ球反応アッセイ（ＭＬＲ）を用いて、本発明者らは、（例えば、抗ＫＩＭ−１ ｍＡｂまたはＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質を用いる）ＫＩＭ−１のそのレセプターへの結合の遮断は、反応細胞によるＩＦＮγの分泌を減少させることを示している。従って、ＫＩＭ−１アンタゴニストは、ＩＦＮγにより媒介される任意の疾患または障害を処置するために使用され得る。
【００４６】
ＩＦＮγは、免疫応答において、重要なサイトカインである。これは、炎症性かつ免疫プロセスの発現および程度に対し多面発現（ｐｌｅｏｔｒｏｐｉｃ）効果を有する（Ｂｏｅｈｍら１９９７，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５：７４９−７９５）。ＩＦＮγ産生の欠乏は、抗ウイルス性応答および抗細菌性応答を縮小し、炎症性応答を減弱する。ＫＩＭ−１アンタゴニストは、ＩＦＮγ産生が過剰か、または不適切な疾患または障害において、ＩＦＮγ産生を減少させるために、有利に使用され得る。このような疾患または障害の例としては、自己免疫疾患、大腸炎および慢性炎症が挙げられる。
【００４７】
ＩＦＮγは、Ｔ細胞活性化およびＢ細胞応答の鍵成分である。これは、Ｔ細胞エフェクター細胞発生（例えば、Ｉｌ−４との交差調節を介して）およびＢ細胞活性化（例えば、ＭＨＣ媒介性抗原提示およびＢ７分子の発現の調節を介して）に影響する。ＩＦＮγは、Ｔｈ１ Ｔ細胞媒介性免疫応答の重要な成分である。ＩＦＮγは、他の免疫系構成要素（例えば、マクロファージおよび好中球）に対し、明白な効果を有する。これは、これらの免疫系構成要素の活性化および有毒なエフェクター分子の放出を刺激する。
【００４８】
ＩＦＮγは、組織常在性細胞型に対し、強力な効果を有する。内皮は、ＩＦＮγによって活性化される。ＩＦＮγで刺激される場合、患部組織に常在性細胞（例えば、慢性関節リウマチにおける滑膜細胞）は、ＴＮＦおよび他のサイトカイン、ＭＣＰ−１および他のケモカインならびに有毒なエフェクター分子（例えば、一酸化窒素）を分泌する。ＩＦＮγによって媒介されるこれらの後者の機能の全ては、炎症の際に、組織内へ細胞輸送に影響する。
【００４９】
実施例５（以下）に示されるように、ＫＩＭ−１のそのレセプターへの結合の遮断は、ＳＲＢＣモデル系におけるＩｇＧ１産生を減少させるか、またはなくさせる。ＭＬＲアッセイにおいて、本発明者らは、ＫＩＭ−１のそのレセプターへの結合の遮断が、リンパ球によるＩＦＮγ産生を減少させることを発見している。理論に縛られる意図はないが、ＩｇＧ１産生における減少およびＩＦＮγ産生の減少が、ＫＩＭ−１遮断の二つの別々の効果を表し得、直接的に関連し得ないことは、注目される。従って、ＫＩＭ−１アンタゴニストが、本発明による免疫機能を調節するために使用される場合、ＫＩＭ−１アンタゴニストは、二つの別々の作用機構を介して、有益な効果を提供し得る。
【００５０】
（融合タンパク質および結合体化ポリペプチド）
本発明のいくつかの実施形態は、ＫＩＭ−１アンタゴニストポリペプチドを含み、ＫＩＭ−１部分は、異種部分に融合されて、ＫＩＭ−１融合タンパク質を形成する。ＫＩＭ−１融合タンパク質は、ＫＩＭ−１部分単独とは対照的に、種々の目的を達成するために使用され得る。このような目的としては、例えば、血清半減期の上昇、バイオアベイラビリティーの改善、特異的器官または組織型へのインビボターゲティング、組換え発現効率の改善、宿主細胞分泌の改善および精製の容易さが挙げられる。達成する目的に依存して、異種部分は、不活性であってもよく、または生物学的に活性でもよい。また、異種部分は、ＫＩＭ−１部分に安定的に融合されるか、あるいはインビトロまたはインビボにて切断可能なように選択され得る。種々の目的を達成する異種部分は、当該分野において公知である。
【００５１】
ＫＩＭ−１融合タンパク質の発現の代わりとして、選択された異種部分が、予備形成され得、そしてＫＩＭ−１部分に化学的に結合され得る。ほとんどの場合、選択された異種部分は、ＫＩＭ−１部分に融合されるか、または結合されるかにかかわらず、同様に機能する。従って、異種アミノ酸配列の以下の議論において、他に記載されない場合、異種配列は、融合タンパク質の形態で、あるいは化学的結合として、ＫＩＭ−１部分に連結され得ることを理解すべきである。
【００５２】
薬理学的に活性なポリペプチド（例えば、ＫＩＭ−１ポリペプチド）は、しばしば、迅速なインビボクリアランスを示すことから、身体内で、治療的に有効な濃度を達成するためには、大量の用量を必要とする。さらに、約２０ｋＤａより小さいポリペプチドは、潜在的に、糸球体濾過を受け、時折、腎毒性を導く。比較的小さいポリペプチド（例えば、ＫＩＭ−１フラグメント）の融合物または結合体は、利用されて、このような腎毒性の危険性を低下させ得るか、または回避し得る。治療的ポリペプチドのインビボ安定性（すなわち血清半減期）を上昇するための種々の異種アミノ酸配列（すなわち、ポリペプチド部分、すなわち「キャリア」）は、公知である。
【００５３】
その長い半減期、広範なインビボ分布および酵素学的または免疫学的機能の欠如によって、基本的に全長ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）あるいはＨＳＡフラグメントは、異種部分に好ましい。方法および材料の適用（例えば、Ｙｅｈら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１９０４−１９０８およびＳｙｅｄら，１９９７，Ｂｌｏｏｄ ８９：３２４３−３２５２に教示されるもの）を通じて、ＨＳＡは、使用されてＫＩＭ−１融合タンパク質、またはＫＩＭ−１部分によって薬理学的活性を示し、かつインビボでの安定性の有意な上昇（例えば、１０倍〜１００倍より高い）を示す結合体を形成し得る。好ましくは、ＨＳＡのＮ末端は、ＫＩＭ−１部分のＣ末端に融合される。ＨＳＡは天然に分泌されるタンパク質であることから、ＫＩＭ−１融合タンパク質が真核細胞の（例えば、哺乳動物の）発現系で産生される場合、ＨＳＡシグナル配列は、細胞培養培地中へのＫＩＭ−１融合タンパク質の分泌物を得るために利用され得る。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態は、ＫＩＭ−１ポリペプチドを利用し、ＫＩＭ−１部分はＦｃ領域（すなわち、Ｉｇ重鎖定常領域のＣ末端部分）に融合される。ＫＩＭ−１−Ｆｃ融合物の潜在的利点としては、溶解性、インビボ安定性および多価性（例えば、二量体化）が挙げられる。使用されるＦｃ領域は、ＩｇＡ Ｆｃ領域、ＩｇＤ Ｆｃ領域またはＩｇＧ Ｆｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）であり得る。あるいは、使用されるＦｃ領域は、ＩｇＥ Ｆｃ領域、またはＩｇＭ Ｆｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４）であり得る。ＩｇＧ Ｆｃ領域は、好ましい（例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）。Ｆｃ融合物をコードするＤＮＡを構築および発現するための材料ならびに方法は、当該分野において公知であり、過度の実験なしでＫＩＭ−１融合物を得るために適用され得る。
【００５５】
好ましくは、ＫＩＭ−１−Ｆｃ融合物は、方向性をもって構築され、ＫＩＭ−１部分は、融合タンパク質のアミノ末端部分を形成する。この方向性をもったＦｃ融合物の構築および発現の例については、例えば、Ｗａｌｌｎｅｒら，米国特許第５，５４７，８５３（ｐＳＡＢ１５２）を参照のこと。あるいは、この融合物は、逆の方向性をもって構築され得、すなわち、ＫＩＭ−１部分は、この融合物のカルボキシ末端部分を形成する。この方向性の例および議論については、例えば、Ｌｏら，米国特許第５，５４１，０８７号を参照のこと。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態は、Ｌｏら，米国特許第５，５４１，０８７号に従って、ＫＩＭ−１免疫融合ＤＮＡを構築することによって得られるＫＩＭ−１融合タンパク質を利用する。免疫融合ＤＮＡは、分泌カセットをコードするポリヌクレオチドを含む。この分泌カセットは、シグナル配列、免疫グロブリンＦｃ領域および分泌カセットの３’末端に融合されるＫＩＭ−１部分を（５’から３’方向で）コードする配列を含む。ＤＮＡは、宿主細胞において、高レベルで発現され得、融合タンパク質は、効率的に産生され、宿主細胞から分泌される。この分泌免疫融合物は、宿主細胞の溶解を必要とせずに、培養培地から回収され得る。
【００５７】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ配列は、ＫＩＭ−１部分と異種部分との間のタンパク分解性切断部位をコードする。切断部位は、コードされる融合タンパク質のタンパク分解性切断部位（従って、標的タンパク質からＦｃドメインを分離する）のために提供される。有用なタンパク分解性切断部位は、タンパク質分解酵素（例えば、トリプシン、プラスミン、エンテロキナーゼ Ｋ）で認識されるアミノ酸配列を含む。
【００５８】
ＫＩＭ−１ポリペプチド構築物は、複製可能な発現ベクターに組込まれ得る。有用なベクターとしては、直鎖状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミドなどが挙げられる。例示的な発現ベクターは、ｐＳＡＢ１５２（Ｗａｌｌｎｅｒら，米国特許第５，５４７，８５３号）。別の例示的な発現ベクターは、ｐｄＣであり、このｐｄＣ内の免疫融合ＤＮＡの転写は、ヒトサイトメガロウイルスのエンハンサーおよびプロモーターの制御下に置かれる（Ｌｏら，１９９１，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０８８：７１２；およびＬｏら，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：４９５−５００）。適切な宿主細胞は、ＫＩＭ−１ポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換され得るか、またはトランスフェクトされ得、そしてその宿主細胞は、ＫＩＭ−１ポリペプチドの発現および分泌のために使用される。好ましい宿主細胞としては、不死のハイブリドーマ細胞、ミエローマ細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｈｅｌａ細胞およびＣＯＳ細胞が挙げられる。
【００５９】
完全にインタクトで野生型のＦｃ領域は、本発明によるＦｃ融合タンパク質において、通常は不必要でかつ望まれていないエフェクター機能を示す。従って、特定の結合部位は、好ましくは、ＫＩＭ−１−Ｆｃ融合タンパク質の構築の際に、Ｆｃ領域から欠失させられる。例えば、軽鎖との同時発現は、不必要であることから、重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ（Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔら，１９８７，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ８：１１１−１１４））に対する結合部位は、ＩｇＥのＦｃ領域から欠失させられて、これにより、この部位は、融合タンパク質の効率的な分泌を妨害しない。同様に、免疫グロブリンの軽鎖への結合の原因であるＦｃ領域内のシステイン残基は、欠失されるか、または別のアミノ酸で置換されるべきであり、これにより、これらのシステイン残基は、このＦｃ領域が免疫融合物として産生されるときに、Ｆｃ領域の正しい折りたたみを妨害しない。膜貫通ドメイン配列（例えば、ＩｇＭで存在する膜貫通ドメイン）は、欠失されるべきである。
【００６０】
ＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、好ましい。あるいは、免疫グロブリンγの他のサブクラス（γ−２、γ−３およびγ−４）のＦｃ領域は、分泌カセットで使用され得る。分泌カセットにおいて好ましく使用される免疫グロブリンγー１のＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、ヒンジ領域（少なくとも一部）、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む。いくつかの実施形態において、免疫グロブリンγー１のＦｃ領域は、ヒンジ領域の一部およびＣＨ３領域を含むが、ＣＨ２領域を含まないＣＨ２欠失Ｆｃである。ＣＨ２欠失Ｆｃは、Ｇｉｌｌｉｅｓら，１９９０，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，１：４７により記載されている。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭのＦｃ領域が、使用される。
【００６１】
ＫＩＭ−１−Ｆｃ融合タンパク質は、いくつかの異なる構造において構築され得る。一つの構造では、ＫＩＭ−１部分のＣ末端は、Ｆｃ部分のＮ末端に直接融合される。わずかに異なる構造では、短いリンカー（例えば、２〜１０個のアミノ酸）が、ＫＩＭ−１部分のＣ末端とＦｃ領域のＮ末端の融合物の間に組み込まれる。このようなリンカーは、高次構造的な可撓性を提供し、この可撓性は、いくつかの状況において、生物学的活性を改善させ得る。ヒンジ領域の十分な部分がＦｃ部分において保持される場合、ＫＩＭ−１−Ｆｃ融合物は、二量体化し、従って、二価の分子を形成する。単量体のＦｃ融合物の同質集団は、単一特異性で二価の二量体を産生する。それぞれ異なる特異性を有する二つの単量体のＦｃ領域の混合物は、二重特異性で二価の二量体を産生する。
【００６２】
ＫＩＭ−１結合体は、当該分野において公知の方法を用いて構築され得る。相当するアミノ反応基およびチオール反応基を含む多くの架橋剤の任意のものが、ＫＩＭ−１を血清アルブミンに連結するために使用され得る。適したリンカーの例としては、チオール反応性マレイミドを挿入するアミン反応性架橋剤が挙げられる。これらのリンカーとしては、例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳまたはＧＭＢＳが挙げられる。他の適したリンカーは、チオール反応性ハロアセテート基を挿入する。これらのリンカーとしては、例えば、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢが挙げられ、そして還元可能な結合を作製するために、スルフヒドリル基と反応するための保護チオールまたは非保護チオールを提供するリンカーとしては、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡまたはＳＡＴＰ（これらの全ては、市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））がある。当業者は、ＫＩＭ−１のＮ末端を血清アルブミンと連結する代わりの戦略を同様に想像し得る。
【００６３】
当業者は、ＫＩＭ−１ポリペプチドのＮ末端または血清アルブミン上のチオール部分で標的にされない血清アルブミンへの結合体を作り出し得る。例えば、ＫＩＭ−１−アルブミン融合物は、遺伝子操作技術を用いて作り出され得、ＫＩＭ−１部分は、ＫＩＭ−１のアミノ末端（Ｎ−ｔｅｒ）、カルボキシ末端（Ｃ−ｔｅｒ）または両方の末端で、血清アルブミン遺伝子に融合される。
【００６４】
ＫＩＭ−１ポリペプチドの他の誘導体は、改変されたＫＩＭ−１またはＫＩＭ−１のフラグメントの他のタンパク質またはポリペプチドとの共有結合性結合体、あるいは凝集的結合体（例えば、さらなるＮ末端またはＣ末端として組換え培養での合成による）を含む。例えば、結合体化ペプチドは、タンパク質の輸送を、同時翻訳でか、あるいは翻訳後に、合成部位から細胞膜または細胞壁の内側か、または外側の機能部位に方向付けるタンパク質のＮ末端の領域でのシグナル（またはリーダー）ポリペプチド配列（例えば、酵母α因子リーダー）であり得る。ＫＩＭ−１ポリペプチドは、ＫＩＭ−１部分の精製または同定を容易にするために、異種のペプチドに融合され得る（例えば、ヒスチジン／ＫＩＭ−１融合物）。ＫＩＭ−１部分はまた、ペプチドＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号）（Ｈｏｐｐら，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４）に連結され得る。この配列は、より高い抗原性であり、特異的モノクローナル抗体によって可逆的に結合されるエピトープを提供する。結果として、この配列は、アッセイおよび発現された組換えタンパク質の精製を容易にする。この配列は、ウシ粘膜エンテロキナーゼによって、Ａｓｐ−Ｌｙｓ対形成の直後の残基で、特異的に切断される。
【００６５】
遺伝子融合構築物を利用する発現系は、細菌内のタンパク質産生を向上するために使用されている。融合タンパク質のアミノ末端融合パートナーのように非常に高レベルで正常に発現される細菌タンパク質を利用することは、このメッセージの効率的な転写および翻訳、ならびにある場合では、この融合タンパク質の分泌および可溶化を保証することに役立つ（Ｓｍｉｔｈら，１９８８ Ｇｅｎｅ ６７：３１；前出のＨｏｐｐら；Ｌａ Ｖａｌｌｉｅら，１９９３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１８７）。
【００６６】
（結合体化ポリマー（ポリペプチド以外））
本発明のいくつかの実施形態は、ＫＩＭ−１ポリペプチドを含み、一以上のポリマーが、ＫＩＭ−１ポリペプチドに結合体化される（共有結合的に連結される）。このような結合に適したポリマーの例としては、ポリペプチド（上記で議論される）、糖ポリマーおよびポリアルキレングリコール鎖が挙げられる。代表的に、必ずでもないが、ポリマーは、以下の一以上を改善する目的のために、ＫＩＭ−１ポリペプチドに結合体化される：溶解性、安定性またはバイオアベイラビリティー。
【００６７】
ＫＩＭ−１ポリペプチドへの結合のためのポリマーの好ましいクラスは、ポリアルキレングリコールである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、好ましいポリアルキレングリコールである。ＰＥＧ部分（例えば、１〜６個のＰＥＧポリマー）は、ＫＩＭ−１ポリペプチド単独と比較して、血清半減期を上昇するために、各ＫＩＭ−１ポリペプチドに結合体化され得る。ＰＥＧ部分は、非抗原性であり、そして基本的に生物学的に不活性である。本発明の実施において使用されるＰＥＧ部分は、分枝状または非分枝状であり得る。
【００６８】
ＫＩＭ−１ポリペプチドに結合されるＰＥＧ部分の数および個々のＰＥＧ鎖の分子量は、種々であり得る。概して、ポリマーの分子量は高分子になるほど、ポリペプチドに結合されるポリマー鎖は少なくなる。好ましくは、ＰＥＧの平均分子量は、２ｋＤａ〜１００ｋＤａである。より好ましくは、平均分子量は、５ｋＤａ〜２０ｋＤａであり、最も好ましくは、８ｋＤａ〜１２ｋＤａである。
【００６９】
ポリマー（例えば、ＰＥＧ）は、任意の適した、ポリペプチド上の露出した反応基を介して、ＫＩＭ−１ポリペプチドに連結され得る。この露出した反応基は、例えば、Ｎ末端アミノ基または内部のリジン残基のεアミノ基か、もしくは両方であり得る。天然に存在するリジン残基は、この目的のために利用され得るか、またはリジン残基は、ＫＩＭ−１アミノ酸配列内に設計され得る。活性化ポリマーは、ＫＩＭ−１ポリペプチド上の任意の遊離のアミノ基で反応し得、共有結合的に連結され得る。（利用可能な場合）ＫＩＭ−１の遊離のカルボキシル基、適切に活性化したカルボニル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、イミダゾール基、参加した炭水化物部分およびメルカプト基もまた、ポリマー付着のための反応基として使用され得る。
【００７０】
好ましくは、結合反応において、ポリペプチド濃度に依存して、一モルのポリペプチド当たり約１．０〜約１０モルの活性化ポリマーが使用される。通常、選択した比は、反応を最大限に引き出しつつ、一方でＫＩＭ−１部分の所望の薬理学的活性を損ない得る（しばしば非特異的）副反応を最小限に抑えるバランスを表す。好ましくは、ＫＩＭ−１ポリペプチドの生物学的活性のうちの少なくとも５０％が保持され、最も好ましくは、約１００％が保持される。
【００７１】
ポリマーは、従来の化学を用いてＫＩＭ−１ポリペプチドに結合体化され得る。例えば、ポリアルキレングリコール部分は、ＫＩＭ−１ポリペプチドのリジンεアミノ基にカップリングされ得る。このリジン側鎖の結合は、Ｎ−ヒドロキシルスクシニミド（ＮＨＳ）活性エステル（例えば、ＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（ＳＳ−ＰＥＧ）およびＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ−ＰＥＧ））を用いて行われる。適したポリアルキレングリコール部分としては、例えば、カルボキシメチル−ＮＨＳ、ノルロイシン−ＮＨＳ、ＳＣ−ＰＥＧ、トレシレート、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾールおよびＰＮＰカルボネートが挙げられる。これらの試薬は、市販されている。さらなるアミン反応ＰＥＧリンカーは、スクシンイミジル部分と置換され得る。これらのリンカーとしては、例えば、イソチオシアネート、ニトロフェニルカルボネート、エポキシドおよびベンゾトリアゾールカルボネートが挙げられる。好ましくは、条件は、反応の（ｏｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ）選択性および進行性を最大限引き出すために選択される。反応条件のこのような最適化は、当該分野における通常の技術内である。
【００７２】
ＰＥＧ化は、当該分野で公知の任意のＰＥＧ化反応によって行われ得る。例えば、Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，３：４−１０，１９９２；公開欧州特許出願第ＥＰ ０ １５４ ３１６号および公開同第ＥＰ ０ ４０１ ３８４号を参照のこと。ＰＥＧ化は、反応性のポリエチレングリコール分子（または類似の反応性の水溶性ポリマー）用いるアシル化反応またはアルキル化反応を使用して行われ得る。
【００７３】
概して、アシル化によるＰＥＧ化は、ポリエチレングリコールの活性エステル誘導体を反応させることを含む。任意の反応性ＰＥＧ分子が、ＰＥＧ化に使用され得る。好ましい活性化ＰＥＧエステルは、Ｎヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）にＰＥＧエステル化される。本明細書中で使用される場合、「アシル化」は、治療用タンパク質と水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）との間の以下のタイプの結合（ｌｉｎｋａｇｅ）を含む：アミド、カルバメート、ウレタンなど。例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０，１９９４を参照のこと。反応パラメータは、ＫＩＭ−１ポリペプチドにダメージを与えるか、または不活性化する温度、溶媒、ｐＨの条件を回避するように選択されるべきである。
【００７４】
好ましくは、連結する結合は、アミドである。好ましくは、生じる生成物のうちの少なくとも９５％は、モノＰＥＧ化、ジＰＥＧ化、またはトリＰＥＧ化である。しかしながら、高度のＰＥＧ化を有するいくつかの種は、使用される特定の反応条件に依存する量で形成され得る。必要に応じて、精製ＰＥＧ化種は、従来の精製法（例えば、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび電気泳動を含む）によって、混合物（特に未反応種）から分離される。
【００７５】
アルキル化によるＰＥＧ化は、概して、還元剤の存在下で、ＰＥＧの末端のアルデヒド誘導体をＫＩＭ−１と反応させる工程を包含する。さらに、反応条件を操作して、実質的にＫＩＭ−１のＮ末端のα−アミノ基だけのＰＥＧ化を支持し得る（すなわち、モノ−ＰＥＧ化タンパク質）。モノ−ＰＥＧ化またはポリ−ＰＥＧ化のいずれかの場合においても、ＰＥＧ基は、好ましくは、−ＣＨ２−ＮＨ−基を介して、タンパク質に結合される。−ＣＨ２−基に特に関連して、このタイプの結合は、「アルキル」結合として公知である。
【００７６】
モノ−ＰＥＧ化産物を生産するため還元アルキル化を介した誘導体化は、誘導体化に利用可能な異なるタイプの第１級アミノ基（リジン対Ｎ末端）の差次的な反応を利用する。この反応は、リジン残基のε−アミノ基とこのタンパク質のＮ末端残基のα−アミノ基との間のｐＫａの差を利用するｐＨで行われる。このような選択性の誘導体化によって、アルデヒドのような反応基を含む水溶性ポリマーのタンパク質への付着は、制御される：ポリマーとの結合は、主にタンパク質のＮ末端で起こり、他の反応基（例えば、リジン側鎖アミノ基）の大きな改変は起きない。
【００７７】
アシル化アプローチおよびアルキル化アプローチの両方で使用されるポリマー分子は、上記に記載されるような水溶性ポリマーから選択され得る。この選択されるポリマーは、単一の反応基（例えば、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒド）を有するように修飾されるべきであり、好ましくは、これにより、ポリマー化度は、本方法で提供されるように、制御され得る。例示的な反応性ＰＥＧアルデヒドは、水に対して安定であるポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドであるか、またはこのモノＣ１−Ｃ１０アルコキシ誘導体もしくはモノＣ１−Ｃ１０アリールオキシアリールオキシ誘導体（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）である。このポリマーは、分枝状または非分枝状であり得る。アシル化反応について、選択されるポリマーは、単一の反応性エステル基を有するべきである。還元アルキル化について、選択されるポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有すべきである。概して、水溶性ポリマーは、天然に存在するグリコシル残基から選択され得る。なぜなら、これらの水溶性ポリマーは、通常、哺乳動物組換え発現系によってより都合よく作製されるからである。
【００７８】
ＰＥＧ化ＫＩＭ−１を調製するための方法は、概して、（ａ）分子が一以上のＰＥＧ基に結合される条件下で、ＫＩＭ−１タンパク質またはＫＩＭ−１ポリペプチドをポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステル誘導体または反応性アルデヒド誘導体）と反応させる工程および（ｂ）反応生成物を得る工程を包含する。概して、アシル化反応についての最適な反応条件は、公知のパラメータおよび所望の結果に基づき、個別的に決定される。例えば、ＰＥＧ：タンパク質の比が大きくなるほど、ポリ−ＰＥＧ化産物の割合は大きくなる。
【００７９】
モノ−ポリマー／ＫＩＭ−１の実質的に同種の集団を実質的に産生するための還元アルキル化は、（ａ）ＫＩＭ−１のアミノ末端のα−アミノ基の選択的改変を可能にする（ｐｅｎ−ｎｉｔ）適したｐＨで、還元アルキル化条件下においてＫＩＭ−１ポリペプチドを反応性ＰＥＧ分子と反応させる工程；および（ｂ）反応生成物を得る工程を包含する。
【００８０】
モノ−ポリマー／ＫＩＭ−１ポリペプチドの実質的に同種の集団について、還元アルキル化反応条件は、水溶性のポリマー部分のＫＩＭ−１のＮ末端への選択的結合を可能にする条件である。このような反応条件は、概して、リジンアミノ基とＮ末端のα−アミノ基との間のｐＫａの差を提供する（ｐＫａは、アミノ基の５０％がプロトン化され、５０％はプロトン化されないｐＨである）。このｐＨはまた、使用されるタンパク質に対するポリマーの比に影響する。概して、ｐＨが低い場合、タンパク質に対して大過剰のポリマーが所望される（すなわち、Ｎ末端のα−アミノ基がより小さい反応性になるほど、最適条件を達成するためにより多くのポリマーが必要とされる）。ｐＨが高い場合、ポリマー：タンパク質の比は、それほど大きくなくてよい。（なぜなら、より反応性の高い基が利用可能なので、より少ないポリマー分子が必要とされるからである）。本発明のために、好ましいｐＨは３〜９の範囲であり、より好ましくは、３〜６の範囲である。
【００８１】
ＫＩＭ−１ポリペプチドは、タグ（例えば、タンパク分解によって、後で放出され得る部分）を含み得る。従って、リジン部分は、初めに改変されるＨｉｓタグを、リジンおよびＮ末端の両方と反応するトラウト試薬（Ｔｒａｕｔ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｐｉｅｒｃｅ）のような低分子量リンカーと反応させ、次いで、このｈｉｓタグを放出することによって選択的に改変され得る。次いで、このポリペプチドは、チオール反応性ヘッド基（例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基または遊離のＳＨもしくは保護ＳＨ）を含むＰＥＧで選択的に改変され得る改変のＳＨ基を含む。
【００８２】
トラウト試薬（Ｔｒａｕｔ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔ）は、ＰＥＧ結合のための特異的部位を設置する任意のリンカーで置換され得る。一例として、トラウト試薬（Ｔｒａｕｔ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔ）は、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡまたはＳＡＴＰ（全てＰｉｅｒｃｅから市販）で置換され得る。同様に、このタンパク質を、マレイミド基を挿入するアミン反応性リンカー（例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ，ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳまたはＧＭＢＳ）、ハロアセテート基を挿入するアミン反応性リンカー（ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ）またはビニルスルホン基を挿入するアミン反応性リンカーと反応させ得、そして、結果生じる生成物を遊離のＳＨを含むＰＥＧと反応させ得る。使用されるリンカーの大きさの唯一の限定は、リンカーがＮ末端タグの後での除去をブロックし得ないことである。
【００８３】
いくつかの実施形態において、ポリアルキレングリコール部分は、ＫＩＭ−１ポリペプチドのシステイン基にカップリングされる。カップリングは、例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基およびチオール基を利用してもたらされ得る。
【００８４】
必要に応じて、ＫＩＭ−１ポリペプチドは、不安定な結合を介してポリエチレングリコール部分に結合体化される。この不安定な結合は、例えば、生化学的加水分解、タンパク質分解またはスルフヒドリル切断において、切断され得る。例えば、この結合は、インビボでの（生理的）条件下において、切断され得る。
【００８５】
この反応は、反応基がＮ末端のαアミノ基上にある場合、好ましくは、約ｐＨ ５〜８（例えば、ｐＨ ５、６、７または８）で、生物学的活性物質を不活性ポリマーと反応させるために使用される任意の適した方法によって起こり得る。概して、このプロセスは、活性化ポリマーを調製する工程およびこの後に、タンパク質をこの活性化ポリマーと反応させ、処方物にとって適した可溶性タンパク質を産生する工程を包含する。
【００８６】
ＫＩＭ−１ポリペプチド上の一以上の部位が、ポリマーにカップリングされ得る。例えば、一つか、二つか、三つか、四つか、または五つのＰＥＧ部分が、ポリペプチドに結合され得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、アミノ末端に結合される。
【００８７】
（抗ＫＩＭ−１抗体）
本発明に従って使用される抗ＫＩＭ−１抗体またはその抗原結合性フラグメントは、種々のタイプの分子の任意のものであり得、この種々のタイプの分子としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆｄフラグメント、ｄＡｂフラグメント、および相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
本明細書中で使用される場合：Ｆｄは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるフラグメントを意味し；Ｆｖは、抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるフラグメントを意味し；そしてｄＡｂはＶＨドメインからなるフラグメントを意味する（Ｗａｒｄら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）。本明細書中で使用される場合、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬ領域およびＶＨ領域が、これらを一本鎖タンパク質鎖としての作製を可能にする合成リンカーを介して対形成されて一価の分子を形成する抗体を意味する（Ｂｉｒｄら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３）。本明細書中で使用される場合、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、短すぎて同一鎖上の二つのドメイン間で対形成できないリンカーを用いて、従ってこれらのドメインを、別の鎖の相補的なドメインと対形成させ、そして二つの抗原結合部位を作製して、一本ポリペプチド鎖で発現される二重特異性抗体を意味する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８；およびＰｏｌｊａｋら，１９９４，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３を参照のこと）。
【００８９】
概して、抗体を得るための適用可能な方法は、当該分野で公知である。抗ＫＩＭ−１抗体の作製にとって有用な方法および材料の概説については、例えば、Ｈａｒｌｏｗら，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｙｅｌｔｏｎら，１９８１，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５０：６５７−８０．；ならびにＡｕｓｕｂｅｌら，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ）を参照のこと。抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合特性は、種々の従来の方法（例えばラジオイムノアッセイ、免疫ブロットアッセイおよびＥＬＩＳＡ）の任意のもの利用して、当業者によって決定され得る。本発明の抗体を産生するための他の適した技術は、インビトロでのＫＩＭ−１ポリペプチドへのリンパ球の暴露、またはファージベクターまたは同様のベクターにおける抗体ライブラリーのスクリーニングを包含する。例えば、Ｈｕｓｅら，１９８９．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１を参照のこと。
【００９０】
（ベクター）
本発明は、ＫＩＭ−１ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを提供する。ベクターおよび本発明の核酸が作動可能に連結される発現制御配列の選択は、所望の機能的特性（例えば、タンパク質発現、および形質転換される宿主細胞）に依存する。本発明のベクターは、ｒＤＮＡ分子に含まれる構造遺伝子の複製または宿主染色体内への挿入、そして好ましくはまた、発現も指向することを少なくとも可能であり得る。
【００９１】
作動可能に連結されるコード配列の発現を調節することにとって有用な発現制御エレメントは、当該分野において公知である。例としては、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、および他の調節性エレメントが挙げられるが、これらに限定されない。誘導性プロモーターが使用される場合、誘導性プロモーターは、例えば、宿主細胞培地における栄養状態の変化、または温度変化によって、制御され得る。
【００９２】
ベクターは、原核生物レプリコン（すなわち、原核生物の宿主細胞（例えば、ＤＮＡ配列で形質転換される細菌宿主細胞）において、染色体外性の組換えＤＮＡ分子の自律複製および維持を指向する能力を有するＤＮＡ配列）を含み得る。このようなレプリコンは、当該分野において周知である。さらに、原核生物レプリコンを含むベクターはまた、遺伝子の発現が、検出可能なマーカー（例えば、薬剤耐性）をもたらす上記遺伝子を含み得る。代表的な薬剤耐性遺伝子は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対して耐性をもたらす遺伝子である。
【００９３】
原核生物レプリコンを含むベクターは、細菌宿主細胞において、コード遺伝子配列の発現を指向するための原核生物プロモーターまたはバクテリオファージプロモーターをさらに含み得る。細菌宿主に適合性のプロモーター配列は、代表的に、本発明のＤＮＡセグメントの挿入に都合のよい制限部位を含むプラスミドベクター内で提供される。このようなベクタープラスミドの例は、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ｐＰＬおよびｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。任意の適した原核生物宿主は、本発明のタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を発現するために使用され得る。
【００９４】
真核生物細胞発現ベクターは、当該分野で公知であり、そして市販されている。代表的に、このようなベクターは、所望のＤＮＡセグメントの挿入に都合のよい制限部位を含む。例示的なベクターとしては、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ），ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），ｐＴＤＴｌ（ＡＴＣＣ ３１２５５）が挙げられる。
【００９５】
真核生物細胞発現ベクターはまた、選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子）を含み得る。好ましい薬剤耐性遺伝子は、ネオマイシン耐性（すなわち、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１））をもたらす。
【００９６】
抗体または抗体フラグメントを発現するために、部分的な軽鎖および重鎖、または全長の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは、発現ベクター内に挿入される。発現ベクターとしては、プラスミド、レトロウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来のエピソームなどが挙げられる。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞に適合性であるように選択される。抗体の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子は、別々のベクター内に挿入され得る。いくつかの実施形態において、両方の遺伝子は、同一の発現ベクター内に挿入される。
【００９７】
都合のよいベクターは、機能的に完全なヒトのＣＨ免疫グロブリン配列またはＣＬ免疫グロブリン配列をコードするベクターである。好ましくは、制限部位は操作されて、それにより、上記に記載されるように、任意のＶＨまたはＶＬ配列が容易に挿入され得、そして発現され得る。このようなベクターにおいて、スプライシングは、挿入されたＪ領域のスプライシングドナー部位とヒトＣ領域の前にあるスプライシングアクセプター部位との間で通常起こし、ヒトＣＨエキソン内に生じるスプライス領域にもまた生じる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域下流の天然の染色体部位で起こる。組換え発現ベクターはまた、宿主細胞から抗体鎖の分泌を容易にするシグナルペプチドをコードし得る。
【００９８】
哺乳動物の宿主細胞発現のための好ましい調節配列は、哺乳動物細胞において、高レベルのタンパク質発現を指向するウイルス性エレメント（例えば、レトロウイルス性ＬＴＲ由来のプロモーターおよびエンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーターおよびエンハンサー（例えば、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーターおよびエンハンサー（例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス由来のプロモーターおよびエンハンサー（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマ由来のプロモーターおよびエンハンサーならびに強力な哺乳動物プロモーター（例えば、天然の免疫グロブリンプロモーターおよびアクチンプロモーター））を含む。ウイルス性調節エレメントおよびその配列のさらなる説明については、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉによる米国特許第５，１６８，０６２号、Ｂｅｌｌらによる同第４，５１０，２４５号およびＳｃｈａｆｆｎｅｒらによる同第４，９６８，６１５号を参照のこと。
【００９９】
組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択マーカー遺伝子を保有し得る。この選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、全てＡｘｅｌらによる米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号および同第５，１７９，０１７号を参照のこと）。例えば、代表的に、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞で、薬剤（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキセート）に対する耐性をもたらす。好ましい選択マーカー遺伝子としては、（メトトレキセート選択／増幅を用いるｄｈｆｒ−宿主細胞における使用については）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子および（Ｇ４１８選択については）ｎｅｏ遺伝子が挙げられる。
【０１００】
ＫＩＭ−１ポリペプチドおよび抗ＫＩＭ−１抗体をコードする核酸分子、ならびにこれらの核酸分子を含むベクターは、適した宿主細胞の形質転換のために使用され得る。哺乳動物細胞内への外来性ＤＮＡの導入のための方法は、当該分野において周知であり、この方法としては、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内ポリヌクレオチドの封入、および核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが挙げられる。さらに、核酸分子は、ウイルスベクターにより哺乳動物内へ導入され得る。
【０１０１】
宿主細胞の形質導入は、使用されるベクターおよび宿主細胞に適した従来の方法によって成し遂げられ得る。原核生物宿主細胞の形質転換に関しては、エレクトロポレーション法および塩処理法が使用され得る（Ｃｏｈｅｎら，１９７２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２１１０−２１１４）。脊椎動物細胞の形質転換に関しては、エレクトロポレーション法、カチオン性脂質または塩処理法が使用され得る。例えば、Ｇｒａｈａｍら，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６−４６７；Ｗｉｇｌｅｒら，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１３７３−１３７６）を参照のこと。
【０１０２】
宿主細胞は、原核生物か、または真核生物であり得る。好ましい真核生物宿主細胞としては、酵母および哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。有用な真核宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ６１）、ＮＩＨ Ｓｗｉｓｓマウス胚細胞ＮＩＨ−３Ｔ３（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１６５８）、およびベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）が挙げられる。発現用の宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該分野で公知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から市販される多くの不死化細胞株を含む。これらとしては、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝臓癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、および多くの他の細胞株が挙げられる。
【０１０３】
産生細胞株からのポリペプチドの発現は、公知技術を利用して向上され得る。例えば、グルタミン合成酵素（ＧＳ）系は、通常、特定の条件下で発現を向上するために使用される。例えば、欧州特許第０２１６８４６号、同第０２５６０５５号、および同０３２３９９７号ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号を参照のこと。
【０１０４】
（処方物）
ＫＩＭ−１ポリペプチド、抗ＫＩＭ−１抗体、または抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントを含有する組成物は、適した薬学的に受容可能なキャリアを含有し得る。例えば、これらの組成物は、作用部位への送達のために設計された調製物内への活性化合物の加工を容易にする賦形剤および／または助剤を含有し得る。非経口投与のための適した処方物としては、水溶性形態における活性化合物の水溶液（例えば、水溶性塩）を含む。さらに、適切な油性注射懸濁液としての活性化合物の懸濁液が投与され得る。適切な親油性溶媒または親油性ビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド）が挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘性を増大させる物質を含み得、これらの物質は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよびデキストランを含む。必要に応じて、懸濁液はまた、安定剤を含み得る。リポソームはまた、本発明の分子を細胞または間質領域内へ封入するために使用され得る。例示的な薬学的に受容可能なキャリアとしては、生理学的に適合性溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなどが挙げられる。いくつかの実施形態において、組成物は等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール）、ソルビトール、塩化ナトリウム）を含有する。いくつかの実施形態において、組成物は、薬学的に受容可能な物質（例えば、潤滑性物質または少量の補助物質（例えば、潤滑剤または乳化剤）、防腐剤または緩衝液を含み、これらは活性成分の有効期間または有効性を向上させる。
【０１０５】
本発明の組成物は、種々の形態であり得、この形態としては、例えば、液体の、半流動性のおよび固形の投薬形態（例えば、液体溶液（例えば、注射液および輸液）、分散系または懸濁液）が挙げられる。好ましい形態は、投与の意図する様態および治療用途に依存する。いくつかの実施形態において、組成物は、注射液または輸液（例えば、ヒトの受動免疫のために使用されるものに類似した組成物）の形態である。
【０１０６】
この組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散系、リポソーム、または高薬剤濃度に適した他の規則構造として処方され得る。滅菌注射液は、必要量の活性成分を、適切な上記で列挙された成分の一つまたは組み合わせを有する溶媒内へ組み込み、必要な場合は続いて濾過滅菌することによって調製され得る。概して、分散系は、活性成分を、基本分散媒および上記で列挙された成分由来の必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル内へ組み込むことによって調製される。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、この事前に濾過滅菌溶液から、活性成分ならびに任意のさらなる所望の成分の粉末を得る真空乾燥および凍結乾燥であり、溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーディングの使用、分散の場合における必要な特定サイズの維持および界面活性物質の使用によって維持され得る。注射組成物の長期吸収は、組成物内に吸収を遅延する薬剤（例えば、モノステアレート塩およびゲラチン）を含有することによって、もたらされ得る。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、活性成分は、制御開放処方またはデバイスを用いて処方される。このような処方およびデバイスの例としては、移植、経皮貼布、およびマイクロカプセル化送達システムが挙げられる。生分解性、かつ生体適合性ポリマーが使用される（例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）。このような処方およびデバイスの調製のための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９７８，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，（編），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。
【０１０８】
補充性活性化合物もまた、組成物内に組み込まれ得る。いくつかの実施形態において、ＫＩＭ−１ポリペプチド、抗ＫＩＭ−１抗体またはこのフラグメントは、第二の免疫調節剤（例えば、ＢＡＦＦ−Ｒ−Ｉｇ、ＬＴβ−Ｒ−Ｉｇ、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、抗ＣＤ４０Ｌ、または抗ＣＤ２０モノクローナル抗体）とともに同時投与される。
【０１０９】
投薬レジメンは、最適の所望の反応を提供するように調整され得る。例えば、単回の大量瞬時投与（ｂｏｌｕｓ）は、投与されてもよく、数回の分割用量は、時間をかけて投与されてもよく、また用量は、治療状況の緊急性によって示されるように、比例的に減少しても、上昇してもよい。投与の容易さのための投薬単位形態において非経口的組成物を処方することは都合がよく、そして本明細書中使用される場合の投薬単位形態の均一性は、処置される哺乳動物の被験体についての単回投薬として適した物理的に不連続の単位を意味し、各単位は必要とされる薬学的キャリアに関連して所望の治療効果を生じるように計算された活性化合物の所定量を含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、ＫＩＭ−１ポリペプチドのための治療的有効用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。いくつかの実施形態おいては、治療的有効用量は、０．５〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲である。いくつかの実施形態おいては、治療的有効用量は、１．０〜１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約５ｍｇ／ｋｇ）の範囲である。治療的有効用量の決定はまた、インビトロで、適切な（治療的）時間にわたって、標的細胞（変性剤に依存性のＫＩＭ−１陽性細胞またはＫＩＭ−１レセプター陽性細胞）をコーティングするために必要な変性剤の濃度を測定するインビトロ実験を行うことによって評価され得る。ＦＡＣＳおよびＥＬＩＳＡレセプター−リガンド結合アッセイは、細胞コーティング反応をモニターするために使用され得る。このようなインビトロでの結合アッセイの結果に基づき、適した変性剤濃度の範囲が選択され得る。
【０１１１】
本発明の分子は、薬学的に受容可能な無毒の賦形剤またはキャリアとの混合によって薬学的組成物内に処方され得る。このような組成物は、特に、液体溶液または液体懸濁液の形態で、非経口投与での使用のために調製され得る。この組成物は、単位用量形態で投与され得、そして任意の適した方法によって調製され得る。このような方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９８０）を参照のこと。
【０１１２】
液体投薬形態としては、薬学的に受容可能な溶液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、および懸濁液が挙げられる。活性化合物に加えて、この液体投薬形態は、水、エチルアルコール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタン脂肪酸エステル、およびこれらの混合物を含む不活性成分を含み得る。
【０１１３】
注射用貯蔵処方物は、生分解性ポリマー（例えば、ポリ乳酸−ポリ糖脂質）において、薬物のマイクロカプセル化マトリックスを形成することによって作製され得る。ポリマーに対する薬剤の比、使用されるポリマーの性質に依存して、薬剤放出の速度は、制御され得る。他の例示的な生分解性ポリマーとしては、ポリオルトエステルおよびポリ無水物が挙げられる。貯蔵注射用処方物はまた、薬剤をリポソーム、または体組織に適合性のマイクロエマルジョン内に閉じ込めることによって調製され得る。
【実施例】
【０１１４】
本発明は、以下の実施例により示される。これらの実施例は、例示的な目的のためだけに提供されるのであって、決して本発明の範囲または内容を限定するものとして解釈すべきでない。
【０１１５】
（実施例１：ヒトＫＩＭ−１細胞外ドメイン−Ｆｃ構築物（ｐＨＩ１０５））
ヒトＫＩＭ−１の細胞外ドメイン（残基１〜２９０）をヒトＩｇＧ１（ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３）Ｆｃ部分に融合し、そしてｐＥＡＧ３４７（Ｂｉｏｇｅｎ哺乳動物発現プラスミド）内へクローン化した。このプラスミドは、構成的発現のための直列型プロモーターおよび安定的に発現する細胞株のメトトレキセート選択のためのジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含んでいた。このコードされた融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりであった：
【０１１６】
【表１】
このシグナル配列を下線で示す。Ｆｃヒンジを囲みで示す。
【０１１７】
（実施例２：ヒトＫＩＭ１ＥＣＤｍｕｃｉｎΔ−Ｆｃ（ｐＨＩ１００））
ヒトＩｇＧ１（ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３）のＦｃ部分に融合したヒトＫＩＭ−１の残基１〜１２９をコードするＤＮＡをｐＥＡＧ３４７（構成的発現のための直列型プロモーターおよび安定的に発現する細胞株のメトトレキセート選択のためのジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含むＢｉｏｇｅｎ哺乳動物発現プラスミド）内にクローン化した。このコードされた融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりであった：
【０１１８】
【表２】
（実施例３：ヒトＫＩＭ１ＥＣＤ−６×Ｈｉｓ（ｐＶＢ６０２））
ヒトＫＩＭ−１の細胞外ドメイン（残基１〜２９０）を、６個のヒスチジン残基の繰り返しを含む短いＣ末端ペプチド［ＶＥＨＨＨＨＨＨ］に融合し、ｐＣＡ１２５（哺乳動物細胞における一過性構成的発現のためのＣＭＶプロモーターを含むＢＩＯＧＥＮ哺乳動物発現プラスミド）内にクローン化した。このコードされた融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりであった：
【０１１９】
【表３】
（実施例４：マウスＫＩＭ−１−Ｆｃ融合物）
ＮｏｔＩ部位およびＳａｌＩ部位に隣接したマウスｋｉｍ−１のＰＣＲ増幅外部ドメインを（ＳａｌＩ−ＮｏｔＩフラグメントとしてＥＡＧ４０９から単離した）ヒトＩｇＧ１Ｆｃに融合し、Ｅｂｎａ２９３細胞発現ベクターＣＨ２６９内にクローン化し（構築物ＰＥＭ０７３−６）、およびＣＨＯ細胞発現ベクターｐＶ９０内にクローン化した（構築物ＰＥＭ０７８−１）。ＳａｌＩ部位は、ｋｉｍ１とＦｃとの間の接合部にある。融合タンパク質についてのＯＲＦの得られるヌクレオチド配列は、以下のとおりであった（大文字はＳａｌＩ部位）：
【０１２０】
【表４】
ｍｕｋｉｍ−１外部ドメイン−ヒトＦｃの翻訳配列は、以下のとおりであった。ＳａｌＩにより生じる二つの接合アミノ酸を太字で示す：
【０１２１】
【表５】
（実施例５：マウスＳＲＢＣモデルにおけるＫＩＭ−１−Ｆｃ融合物）
ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）に対するげっ歯類の免疫応答は、コンピテントＴ細胞のＡＰＣおよびＢ細胞との相互作用に依存する。従って、抗ＳＲＢＣ反応は、リンパ球およびＡＰＣ上の細胞性タンパク質が免疫応答の発生および成熟に果たす役割を検査するための有用なモデルである。マウスにおける抗ＳＲＢＣ反応は、ＩｇＭおよび種々のＩｇＧアイソタイプ（高レベルのＩｇＧ１アイソタイプを含み、同様に見られるかなりのレベルのＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂも伴う）の産生からなる。ＩｇＧ１は、Ｔｈ２媒介性免疫応答によって誘導されるアイソタイプであると考えられ、Ｔｈ２媒介性免疫応答は、Ｉｌ−４、Ｉｌ−５、およびＩｌ−１３のようなサイトカインの発現によって特徴付けられる。ＩｇＧ２ａアイソタイプおよびＩｇＧ２ｂアイソタイプは、Ｔｈ１誘導性）免疫応答により特徴的なものであり、Ｉｌ−１２の発現と関連がある。最後に、ＩｇＧ３アイソタイプは、Ｔ細胞非依存性免疫応答に典型的なものである。４つの全てのアイソタイプは抗ＳＲＢＣ反応において表される。
【０１２２】
抗ＳＲＢＣ反応の経過を、Ｔ細胞におけるＫＩＭ−１依存性活性を妨害するようにマウスＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質（ｍＫＩＭ−１−Ｉｇ）で処置したマウスにおいて追った。マウスを抗原投与前日（Ｄ−１）に１５０μｇｓ／マウスｍＫＩＭ−１−Ｉｇを用いて処置し、０日目に１００μｌのＰＢＳ中１０％溶液のＳＲＢＣ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｅｒｕｍ Ｃｏｍｐａｎｙ）で抗原投与し、次いで３日目および６日目に１５０μｇのｍＫＩＭ−１−Ｉｇを用いて再度処理した。マウスを、免疫後、７日目、１４日目、２１日目、および３０日目に血清サンプル用に採血し、抗ＳＲＢＣ抗体力価を、赤血球凝集アッセイを用いて測定した。このアッセイは、（ＩｇＭについて）抗体の五量体構造または（Ｉｇクラスについて）第三の種の抗イディオタイプ抗血清の存在に基づきＳＲＢＣを架橋し、そしてクラスター形成する（「凝集」（ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｅ））抗体の能力に依存した。
【０１２３】
簡潔には、プロトコールは以下のとおりであった。血清サンプルを、測定するアイソタイプに依存して適切なように（１：１５〜１：２００）希釈し、次いで反応の日に、Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）＃３７９５）から購入した９６ウェルアッセイプレートを用いて１：２工程で力価測定した。ＩｇＭアッセイについては、この血清サンプルを二連でアッセイした。グルコース−ＰＢＳ（Ｇ−ＰＢＳ）中の２５μｌの１０％ＳＲＢＣをウェルに加え、そして凝集反応を、３７℃１時間にわたり展開した。Ｉｇアッセイについて、血清サンプルを三連でプレート内にロードし、希釈した。Ｇ−ＰＢＳ中に希釈した２５μｌの１％２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）を各血清サンプルの一連に加え、次いでこのプレートを３７℃で３０分にわたりインキュベートした。これは、ＩｇＭ五量体を一緒に保持する全てのジスルフィド結合を破壊し、従って任意のＩｇＭ骨格をなくすためになされた。次いで２５μｌのＧ−ＰＢＳ中１０％ＳＲＢＣおよび２５μｌの抗イディオタイプ抗血清（ヤギ抗マウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、またはＩｇＧ３（全てＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓより））のＧ−ＰＢＳ中１：２５０希釈を各三連の初めの２連に加え、サブタイプが存在する抗ＳＲＢＣ ＩｇＧを架橋した。各三連の第三のウェルを未架橋のままにし、２−メルカプトエタノール処理を逃れ得た任意の残存ＩｇＭ活性についてのコントロールとして供した。このプレートを３７℃で１時間にわたりインキュベートした。全てのアッセイプレートを４℃一晩放置し、記録および撮影する前に生じた赤血球凝集を安定化した。全ての力価を陽性の赤血球凝集読み出し（ｒｅａｄｏｕｔ）を生じる最後の希釈として記録した。
【０１２４】
ｍＫＩＭ−１−Ｉｇ処理の抗ＳＲＢＣ反応に対する効果をＳＲＢＣで抗原投与していないか、またはＳＲＢＣで抗原投与したが、抗ＣＤ４０Ｌ、非特異的ポリクローナルｈＩｇＧ、もしくはＰＢＳで投与したマウスのコントロール群と比較した。非抗原投与および抗ＣＤ４０Ｌ処置したマウスは、予想どおり抗ＳＲＢＣ反応を有さなかった。ＳＲＢＣが与えられたマウスおよびＰＢＳまたはｈＩｇＧのいずれかで投与されたマウスは試験されたＩｇの全てのクラスに対する強い抗体力価を有した。対照的にｍＫＩＭ−１−Ｉｇで処置されたマウスは、ＩｇＧ１抗ＳＲＢＣアイソタイプにおいて非常に著しいかつ特異的欠陥を有した。Ｂａｌｂ／ｃ系統のマウスを使用した２つの非依存性実験において、著しく欠陥的レベルのＩｇＧ１抗ＳＢＲＣを検出した（図３および図４）。抗ＳＲＢＣ反応の誘導７日後、ＩｇＧ１力価は、コントロール処置マウスよりｍＫＩＭ−１−Ｉｇ処置マウスにおいて平均して７０％低かった。抗ＳＲＢＣ反応の誘導１４日後まで、ＩｇＧ１力価は、８５％を超えるまで減少した。同様の欠陥は、Ｃ５７Ｂｌ／６系統のマウスを用いた１つの実験において観察された（図５）。Ｂａｌｂ／ｃマウスおよびＣ５７Ｂｌ／６マウスを、これらの免疫応答において異なる傾向を有し、Ｂａｌｂ／ｃマウスは、主にＴｈ２媒介性応答を有するとして特徴づけられ、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスでは、Ｔｈ１媒介性応答を有すると考えられた。従って、これらのマウス系統において、マウスＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質のＩｇＧ１アイソタイプ産生をブロックする能力により、系統における固有のＴｈ傾向は無効にされた。驚いたことに、ｍＫＩＭ−１−Ｉｇ処置の効果は、第二の応答まで拡大し、そのため、ＩｇＧ１は、後のＳＲＢＣ抗原投与に応答して、記憶Ｂ細胞によって産生されなかった（図６および図７）。
【０１２５】
（実施例６：移植片対宿主病（ＧＶＨＤ））
ＧＶＨＤは、Ｆ１への親の細胞移植レジメンを使用して、マウスでモデルとされる。マウスのＤＢＡ２系統由来の脾細胞を（ＤＢＡ２×Ｃ５７Ｂｌ／６）Ｆ１マウス（Ｂ６Ｄ２Ｆ１と呼ばれる）にｉｖで注射する。この注射した脾細胞は移植片を構成し、そしてＤＢＡ２マウスは、その移植片のドナーである。移植片を受けるＦ１マウスは、宿主である。移植片に存在するドナーＴ細胞は、宿主細胞上の半分のＭＨＣマーカー（ハプロタイプ）を外来として認識する。なぜなら、他（Ｃ５７Ｂｌ／６親）に由来するからである。これは、宿主が生じるＧＶＨＤに対するドナーＴ細胞応答を誘導する。ＤＢＡ／２親の脾細胞をＢ６Ｄ２Ｆ１宿主内に注射する場合、慢性ＧＶＨＤが発生する。対照的に、Ｃ５７Ｂｌ／６脾細胞をＢ６Ｄ２Ｆ１宿主内に注射する場合、急性ＧＶＨＤが発生する。根底にあるどの機構が、これらの２種の注射プロトコールを使用する、異なる疾患結果の原因であるかは、不明のままであるが、ＤＢＡ／２脾細胞移植片内に含まれる細胞によって発現されるサイトカインが慢性ＧＶＨＤの発生を支持し、一方でＣ５７Ｂｌ／６脾細胞移植片内に含まれる細胞によって発現されるサイトカインは急性ＧＶＨＤの発生を支持すると考えられている。Ｔ細胞の抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞：ＡＰＣ）との相互作用を妨害する試薬は、急性と慢性の両方のＧＶＨＤを効率的にブロックする。
【０１２６】
ＫＩＭ−１アンタゴニストは、慢性ＧＶＨＤのマウスモデルにおける免疫学的反応の発達を改変する。慢性ＧＶＨＤをブロックする能力としては、Ｂ細胞活性化およびＢ細胞増殖に対する効果、ならびに分泌ＩｇＧの産生に対する効果が挙げられる。マウスをＫＩＭ−１アンタゴニストまたは改変薬剤、コントロール処置物で腹腔内に（ｉｐ）処置するか、未処置のままにする。４時間後、マウスにＤＢＡ／２マウスから単離した１×１０８個の脾細胞を、静脈内（ｉｖ）に０．５ｍｌの注射を与える。このｉｖ注射されたＤＢＡ／２の脾細胞は、同種移植片を構成していた。移植の２日後、４日後、および６日後に、マウスをＫＩＭ−１アンタゴニストもしくは改変薬剤、またはコントロール処置物で再度処置した。マウスのさらなるコントロール群に、１×１０８個のＢ６Ｄ２Ｆ１脾細胞を受けさせたが、この脾細胞によってＢ６Ｄ２Ｆ１レシピエントにおける疾患は誘導できなかった。あるいは、移植したＢ６Ｄ２Ｆ１マウスおよび未処置のＢ６Ｄ２Ｆ１マウスをコントロールとして使用する。移植の１４日後、このマウスを屠殺し、疾患の証拠ために検査する。
【０１２７】
未処置の移植片レシピエントマウスは、慢性ＧＶＨＤの発生を示す種々の症状を発症する。脾腫大すなわち脾臓の拡大は、ドナーＴ細胞および宿主Ｂ細胞が活性化され、そして細胞数の劇的な増加とともにポリクローナル拡大を起こすことを証明する。サブセットのＢ細胞上のＣＤ６９のような細胞表面タンパク質の出現は、Ｂ細胞の活性化を示す。ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞由来のＬ−セレクチン分子の減少は、Ｔ細胞の活性化の証拠である。血清中へかまたはインビトロでの細胞培養アッセイにおけるＩｇ分子（例えば、ＩｇＧクラス、ＩｇＡクラス、およびＩｇＥクラス）の分泌は、Ｂ細胞が活性化し、そしてＢ細胞のＩｇクラスをスイッチング（ｓｗｉｔｃｈ）したことを示す。この点に関して、血清中またはインビトロでの細胞培養アッセイにおける抗自己Ｉｇの出現は、産生されているＩｇが不適切な自己抗原認識を有することを示す。最終的に、生存率を異なる処置レジメンの結果として測定し得る。ＫＩＭ−１アンタゴニスト（例えば、ＫＩＭ−１−Ｉｇ）を用いる処置は、脾腫大の程度の縮小、リンパ球集団のポリクローナル拡大における縮小、リンパ球活性化を示す細胞表面マーカーの出現または消滅における低下、Ｉｇ分泌の低下、および／または死亡率における低下によって示されるような、慢性ＧＶＨＤの発生のこれらの読み出しを、ブロックする。
【０１２８】
本発明者らは、コントロールマウスを未処置の同種移植片レシピエントマウスと比較して、ＧＶＨＤの際の脾腫大、Ｂ細胞活性化、およびのＩｇ分泌の程度を検査する。抗ＣＤ４０Ｌ ｍＡｂ ＭＲ１をこれらの実施例において陽性コントロールとして使用する。なぜならＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０相互作用をブロックすることは、慢性ＧＶＨＤの発生を妨害する効率的手段であることが以前に示されているからである（Ｄｕｒｉｅら，１９９４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３３３−１３３８）。ＫＩＭ−１アンタゴニストを用いた処置によって影響の及んだ細胞集団を研究するために、移植片注射して１４日後のレシピエントマウスから採取した脾細胞についてＦＡＣＳ分析を行う。１群当たり３〜４匹のマウスからの脾臓細胞を単離し、プールする。レシピエントＢ細胞の活性化は、慢性ＧＶＨＤの決定的な特徴である。慢性ＧＶＨＤを起こすマウスにおいて、Ｂ２００＋ Ｂ細胞の少ないが容易に分かる集団は、活性化マーカーＣＤ６９を発現する。従って、ＣＤ６９発現を疾患の程度の指標として使用する。異なる処置群からのマウスの脾細胞の培養物における全ＩｇＧをまた決定する。なぜなら、Ｂ細胞によるＣＤ６９の発現は、これらの活性化状態を示すからである。
【０１２９】
マウスモデルにおいて、上記の疾患の発生は、Ｔｈ２サイトカインＩｌ−４に依存し、そして抗Ｉｌ−４ ｍＡｂで処置することによってブロックされ得る。このような処置は、宿主Ｂ細胞の拡大および結合する高Ｉｇ産生をブロックする。ＧＶＨＤの発生は、多くの方法において結合される。ドナーＴ細胞集団および宿主Ｂ細胞集団の拡大を脾臓指標（ｉｎｄｅｘ）によって測定し、この脾臓指標は、コントロール（非疾患）マウスに対して標準化された、体重に対する脾臓重量の比である。疾患マウスにおけるＢ細胞の活性化をＢ細胞活性化マーカーの分析を利用して測定する。最終的に、Ｂ細胞活性化の効果は、循環中（例えば、血清中）の、または疾患誘導の数週間後に採取された宿主脾細胞の培養によって産生されるＩｇのレベルにおいて見られる。疾患動物の循環Ｉｇは、抗自己抗体を含む。最終的に、疾患動物は、蓄積したＩｇ沈着による腎臓不全および他の器官不全を起こし、従って、生存率は、疾患活性に関係のある基準である。
【０１３０】
（実施例７：ＳＣＩＤ−ｈｕマウスモデル）
ＳＣＩＤ−ｈｕマウスにおいて、ヒト免疫応答を研究することが、可能である。例えば、ＳＣＩＤマウスに２〜５×１０７個のヒト末梢血単核細胞を腹腔内に注射すると、これらの細胞は、しばらくの間、腸に常駐し、かつ機能し、抗原投与に対して反応する。ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスをヒトＰＢＬで回復（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ）させると、これらのマウスは、脾臓へのヒト細胞（Ｔ、Ｂ、ＡＰＣ）の接種のさらなる利点を有し、この脾臓では、全身性の免疫応答が支持され得る。適切モデルは、Ｂｅｒｎｅｙら，２００１，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７２：１３３−１４０において議論される。免疫応答の他のモデルは、ＳＣＩＤ／ｂｅｉｇｅマウスを使用し、免疫応答のための支持を提供するためのＰＢＬまたは胎児腸間膜リンパ節を含む胎児細胞の同時移植を含む（Ｃａｒｂａｌｌｉｄｏら，２０００，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：１０３−１０６）。
【０１３１】
ＳＣＩＤ−ｈｕまたはＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ｈｕマウスをヒト破傷風（ｔｅｔａｎｕｓ）トキソイド（ＴＴ）を免疫したヒトドナーから単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）で回復させる。そのようにして回復させたＳＣＩＤ−ｈｕマウスは、種々の区画（腹膜を含む）に常駐するヒト細胞を有する。そのようにして回復させたＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ｈｕマウスは、これらの二次リンパ器官（例えば、脾臓）内に含まれる種々の区画において常駐するヒトＴ細胞を有する。ＴＴ、もしくはＴＴの抗原性部分、またはリポソーム、もしくはＴＴを含むリポソームにカップリングした抗原を用いる免疫化によって、一次免疫応答を、これらの回復させたマウスにおいて誘導する。そのようにして回復させ、抗原投与したマウスは、抗原（例えば、ＮＰ、ＤＮＰ、ＫＬＨ、ＯＶＡ、ＨＩＶｇｐｌ２０またはそれらの部分、メラノーマ関連抗原ＧＤ２、およびヒツジムチンは、多くの例のうちのいくつかにすぎない）に対する高い力価（＞１：１０００）のＩｇ応答を生じる。いくつかの例は、Ｉｆｖｅｒｓｏｎら，１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８４：１１１−１１６に示される。そのようにして回復させると、次いでＫＩＭ−１アンタゴニストまたは改変薬剤を用いて処置したマウスは、抗原投与に対する高い力価を示さない。
【０１３２】
別の方法論において、ＳＣＩＤ−ｈｕマウスを胎児ヒトの骨、胸腺、皮膚断片、および腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）を用いて回復させた。ＭＬＮの存在は、ＴＴ免疫化に対する強い免疫応答を支持するために十分である（そして、全てのドナー組織は胎児であることから、これは、厳密に一次免疫応答である）。このモデルは、Ｃａｒｂａｌｌｉｄｏら，２０００，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：１０３−１０６において詳細に議論される。ＴＴ免疫化は、ヒトリンパ球の増殖、および活性化、ならびにＢ細胞によるＩｇＭ分泌およびＩｇＧ分泌を引き起こす。ＫＩＭ−１アンタゴニストまたは改変薬剤を用いてそのようにして回復させたＳＣＩＤマウスの処置は、ヒトリンパ球の増殖および活性化、ならびにＴＴ抗原投与の際の免疫グロブリンの分泌を低下させる。
【０１３３】
これらのモデルまたは他の同様のＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ｈｕモデルもしくはＳＣＩＤ−ｈｕモデルの改変において、二次免疫応答を、例えば遅延型過敏症（ＤＴＨ）の疾患設定において測定する。この実施例において、ＴＴ抗原投与、ＴＴ−免疫個体由来のＰＢＭＣを用いて回復させたＳＣＩＤマウスまたはＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの足蹠に与え、反応における足蹠の腫脹を、測定する。ＤＴＨ反応は、回復させたマウスにおける循環中のヒト記憶Ｔ細胞の存在に依存する（ｒｅｌｙ ｏｎ）。このようなモデルもまた、「トランスビボ（ｔｒａｎｓ ｖｉｖｏ）」モデルにおいてのように、移植患者におけるドナー組織の起こり得る拒絶を検出するために使用され得る。このタイプのアプローチの例は、Ｃａｒｒｏｄｅｇｕａｓら，１９９９，Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６０：６４０−６５１において議論される。ＫＩＭ−１アンタゴニストまたは改変薬剤を用いて、そのようにして回復させたマウスの処置により、ＤＴＨ反応を防ぐ。ＳＣＩＤマウスにおけるヒト疾患反応の他のモデルは、マウスにおける自己免疫患者由来の脾細胞またはＰＢＭＣの移動を含み、それによって、これらのモデルは、疾患の免疫グロブリンおよび他のマーカーの発現を継続する（ＭａｒｔｉｎｏおよびＧｒｉｎａｌｄｉｍ １９９７，Ｉｎ：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ，第３巻Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ（編）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏを参照のこと）。患者由来の自己免疫細胞の移動前のＫＩＭ−１アンタゴニストまたは改変薬剤を用いるこれらのマウスの処置により、自己免疫病理学的な免疫グロブリンまたは他のマーカーの発現を低下する。
【０１３４】
ＳＣＩＤマウスを利用する非常に価値ある方法論は、レシピエントマウスへの疾患組織の異種移植を包含する。乾癬患者またはアトピー性皮膚炎患者由来の皮膚を移動する方法は、例えば、これらの疾患の広く使用されるモデルである。アトピー性皮膚炎は、Ｔｈ２媒介性細胞性免疫疾患であり、このＴｈ２媒介性細胞性免疫疾患は、ＰＢＭＣおよび皮膚の生検（ｂｉｏｐｓｙ）を一緒にレシピエントマウスに移動することによってＳＣＩＤマウスにおいてモデル化され得る。ＫＩＭ−１アンタゴニストまたは改変物（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）を用いるこれらのマウスの処置は、細胞性蓄積および局所的なサイトカイン分泌（これは、皮膚移植におけるリンパ球およびエフェクター細胞（好酸球、好塩基球など）の活性化の徴候（ｅｖｉｄｅｎｃｅ）である）を防ぐ。これは、ドナー患者における皮膚炎を予防における効力の徴候（ｅｖｉｄｅｎｃｅ）である。
【０１３５】
（実施例８：アトピー性疾患の他のマウスモデル）
アレルギー、喘息、気道過感受性（ＡＨＲ）、および他のアトピー性疾患の有用なモデルを、マウスにおいて使用する。例えば、アレルギー性皮膚炎症を、抗原を用いる皮膚上への感作によって誘導する。一つの例において、抗原はアルブミン（ＯＶＡ）である。この感作に対するＴｈ２応答は、皮膚における好酸球の存在、Ｔｈ２サイトカインの皮膚における局所的発現、および吸入抗原に対する気道過感受性（ＡＨＲ）によって示される。好酸球は、初めにＫＩＭ−１アンタゴニストまたは改変物を用いて処置されるＯＶＡ感作マウスの皮膚では存在せず、Ｔｈ２サイトカインのレベルは低下する。繰り返し感作されたマウスは、ＯＶＡ特異的ＩｇＥを産生し、これらの脾細胞は、ＯＶＡを用いるインビトロ刺激の後にＴｈ２サイトカインのＩＬ−４およびＩＬ−５を分泌する。Ｔｈ２免疫応答のこれらの読み出しは、ＫＩＭ−１アンタゴニストまたは改変物を用いる処置の際にブロックされる。あるいは、マウス（例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス）を、抗原のｉ．ｐ．注射で感作し得（０日目）、次いで３週間後（１回）および４週間後（３回：２６日目、２７日目、２８日目など）に鼻腔内での抗原を用いて再抗原投与し得る。これは、肺応答性亢進（ＡＨＲ）を生じ、この肺応答性亢進（ＡＨＲ）は、ＩＬ−１３のようなＴｈ２サイトカインによって媒介される。このＴｈ２免疫応答は、ＫＩＭ−１アンタゴニストまたは改変物を用いる処置の際にブロックされる。
【０１３６】
ＯＶＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックモデル（ＤＯ１１．１０）を使用して、本発明者らは、ＯＶＡ特異的免疫応答を誘導し、次いでＴｈ２ ＯＶＡ特異的Ｔ細胞を未処置のレシピエントに移し、このレシピエントを、次いでＯＶＡエアロゾルで抗原投与する。これらのマウスは、抗原特異的ＡＨＲを急速に発生する。この反応は、マウスをＯＶＡエアロゾル抗原投与の前にＫＩＭ−１アンタゴニストまたは改変物で処理する場合に、ブロックされる。
【０１３７】
メタコリンエアロゾル処置は、肺への好酸球の補充を誘導し、この補充はマウスにおけるＡＨＲを引き起こす。ＫＩＭ−１アンタゴニストまたは改変薬剤を用いるマウスの処置は、ＡＨＲの発生をブロックする。
【０１３８】
（実施例９：コラーゲン誘導性関節炎）
関節炎のこのマウスモデルにおいて、コラーゲンを使用してＴ細胞媒介性のＢ細胞活性化および自己抗体産生（これは、関節を攻撃する）を誘発し、関節リウマチに似た状態を生じる。マウスの種々の系統において、この反応は、ＩｇＧ１の高い力価によって支配される。特に、遺伝子欠損によってＩｌ−１２を欠如したマウス（Ｉｌ−１２ノックアウトマウス：Ｉｌ−１２−／−）において、ＩｇＧ１力価は非常に高く、これらのＡｂは、関節破壊を効率的に媒介する。
【０１３９】
フロイント完全アジュバント中のコラーゲンを用いて以下の２箇所で経皮内に注射によってマウスを処置する：各耳に少量の送達、および肩部の間の皮膚に少量の送達。３週間後、腹腔内経路を使用して、マウスを生理食塩水中の可溶性コラーゲンで追加免疫する。１週間以内に、関節ダメージをノギスを用いて関節の膨潤を測定することおよび抗体力価を測定することによって評価する。疾患発生の過程の際のマウスの処置は、疾患スコアを寛解させる。特に、疾患開始前日の０．１〜１ｍｇ／ｋｇのＫＩＭ−１アンタゴニストまたは改変薬剤を用いる処置、続いてその後の処置は、関節膨潤の低下および免疫グロブリン力価の低下によって評価されるように、疾患発生をブロックする。これは、処置の予防投与過程である。
【０１４０】
誘導後および追加免疫前のＫＩＭ−１アンタゴニストを用いる処置は、関節膨潤の低下および免疫グロブリン力価の低下によって評価されることから、疾患発生を寛解させる。これは、処置の治療的過程である。追加免疫注射後のＫＩＭ−１アンタゴニストまたは改変薬剤を用いる処置は、関節膨潤の低下および免疫グロブリン力価の低下によって評価されるように、疾患発生をブロックする。これは、処置の治療的過程である。
【０１４１】
（実施例１０：ループスのマウスモデル）
ＮＺＢ／Ｗモデルにおいて、ＮＺＢ系統由来のマウスをＮＺＷ系統由来のマウスと交配し、そしてこのＦ１子孫は、経時的にループス様疾患を発生する。疾患の徴候としては、自己抗体およびリウマチ因子の産生が挙げられる。腎臓におけるＩｇ沈着は、大量の産生されるＩｇおよびＲＦに起因し、尿中のタンパク尿によって測定され得るように、経時的に腎臓機能の低下をもたらす。
【０１４２】
ＮＺＢ／Ｗ Ｆ１子孫は、約５ヵ月齢で、その時点で中程度のタンパク尿スコア（ＰＵは２）を伴い、疾患の症状を表し始める。９ヵ月齢までに、このマウスは、最大ＰＵ＝４に達し、そして腎臓不全の結果として疾患になり（ｓｕｃｃｏｍｂ）始める。ＳＮＦ１（ＳＷＲ×ＮＺＢ Ｆ１交配）と呼ばれる別のモデルも同様の動態を伴う。
【０１４３】
マウスを、疾患開始の前日に０．１〜１ｍｇ／ｋｇのＫＩＭ−１アンタゴニストで処置し、続いてその後に処置する。これは、ＰＵスコア、および／または血清中免疫グロブリンの力価を測定すること、および／または脾臓における過形成の免疫組織化学的分析、および／または腎臓における糸球体の構造での免疫複合体沈着および免疫複合体変化の免疫組織化学的分析によって測定されるように、疾患発生をブロックする。
【０１４４】
疾患誘導後の（例えば、５ヵ月で、しかし重症の疾患（すなわちＰＵ＝２〜３）の前の）ＫＩＭ−１アンタゴニストを用いる処置は、疾患発生寛解させるか、または疾患ダメージを回復させる。これは、ＰＵスコア、および／または血清中の免疫グロブリンの力価を測定すること、および／または脾臓における過形成の免疫組織化学的分析、および／または腎臓における糸球体の構造での免疫複合体沈着および免疫複合体変化の免疫組織化学的分析によって測定され得る。
【０１４５】
疾患が重症（ＰＵ＝３〜４）になった後のＫＩＭ−１アンタゴニストを用いる処置は、疾患発生寛解させるか、または疾患ダメージを回復させる。これは、ＰＵスコア、および／または血清中の免疫グロブリンの力価を測定すること、および／または脾臓における過形成の免疫組織化学的分析、および／または腎臓における糸球体の構造での免疫複合体沈着および免疫複合体変化の免疫組織化学的分析によって測定され得る。
【０１４６】
（実施例１１：混合リンパ球反応（ＭＬＲ））
（マウスＭＬＲアッセイおよびＫＩＭ−１の拮抗作用）
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を、以下のとおり行った：脾臓を、滅菌技術を使用してＣ５７Ｂｌ６マウスおよびＢａｌｂ／ｃマウスから単離し、リンパ球を放出するため粗く挽き、次いで赤血球を溶解するため低張液（Ｇｅｙ’ｓ溶液）を用いて処理した。残った細胞を細胞ストレーナー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ ＵＳＡ）に通すことによって残留組織から分離し、そして、次いで滅菌かつ発熱物質なしのＰＢＳで洗浄し、そして細胞をペレット化するために遠心した。これらの細胞をＰＢＳ溶液に２度目の再懸濁し、再度ペレット化し、次いで、完全ＲＰＭＩ培地中に再懸濁した。これらの細胞をカウントし、必要に応じて希釈した。Ｂａｌｂ／ｃリンパ球を刺激細胞として使用するゆえに、これらの細胞を、使用前に３０００ＲＡＤで照射した。
【０１４７】
アッセイを確立するために、刺激細胞を、応答細胞の数（２×１０５／ウェル）に比例した種々の比でウェルに加えた。培地を、示すように、２０μｇ／ｍｌでラット抗ＫＩＭ−１抗体、またはＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質およびコントロール−Ｉｇ融合タンパク質で補填した。培養を３つの同一プレートでセットアップし、各実験条件を、１プレートあたり３ウェルで表した。１枚のプレートを使用して、ＭＴＳアッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ＵＳＡ）を使用して細胞増殖データを出した。その他のプレートを使用して、サイトカイン分析用の上清サンプルを回収した。ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ ＵＳＡ）を使用して、培養上清中のｍＩＦＮγ、ｍＴＮＦ、およびｍＩｌ−２のレベルを測定した。増殖アッセイおよびＥＬＩＳＡから生じた値についての標準誤差は、１０％未満であり、図から省略している。ＩＦＮγについてのポジティブコントロール値からの大きなずれは、注目されるが、一方で培養中のＩｌ−２およびＴＮＦのレベルは、ポジティブコントロールと処置群との間に有意に差はなかった。従って、Ｉｌ−２データおよびＴＮＦデータは省略されている；ＩＦＮγおよび細胞増殖についてのデータは、それぞれ代表的実験について示す。
【０１４８】
ラット抗マウスＫＩＭ−１ ｍＡｂの３Ａ２．５および１Ｈ９．１１を使用するＭＬＲ培養の処理により、上清中に分泌されたＩＦＮγのレベルは有意に低下した（図８）。この効果は、上清中に分泌されたＩｌ−２またはＴＮＦのレベルにおける低下は観察されなかったことから、ＩＦＮγに対して特異的であった。この効果は、細胞増殖アッセイが、培養中の生細胞の数は同程度であったことを示したことから（図９）、これらの培養における細胞数の減少によるものではなかった。
【０１４９】
ＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質を使用するＭＬＲ培養の処理により、上清中に分泌されたＩＦＮγのレベルは有意に低下した（図１０）。この効果は、上清中に分泌されたＩｌ−２またはＴＮＦのレベルにおける低下は注目されなかったことから（データは示さず）、ＩＦＮγに対して特異的であった。この効果は、細胞増殖アッセイが、ＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質で処理した培養中の生細胞の数が未処理のコントロールコントロールに非常に近かったことを示したことから（図１１）、これらの培養における細胞数の減少によるものではなかった。
【０１５０】
（ヒトＭＬＲアッセイおよびＫＩＭ−１の拮抗作用）
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を、以下のとおり行った：末梢血単核細胞を、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）勾配遠心を使用して、健常なヒトのドナーから採取した全血から単離した。次いでこの細胞を滅菌かつ発熱物質なしのＰＢＳで洗浄し、そして遠心して細胞をペレット化した。これらの細胞をＰＢＳ溶液に２度目の再懸濁し、再度ペレット化し、次いで、完全ＲＰＭＩ培地中に再懸濁した。これらの細胞をカウントし、必要に応じて希釈した。ＪＹ細胞（ＡＴＣＣ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ ＵＳＡ）を刺激細胞として使用するゆえに、これらの細胞を、使用前に１００００ＲＡＤで照射した。
【０１５１】
アッセイを確立するために、刺激細胞を、応答細胞の数（２×１０５／ウェル）に比例した種々の比でウェルに加えた。培地を、示されるように２０μｇ／ｍｌでマウス抗ＫＩＭ−１抗体で補填した。培養を３つの同一プレートでセットアップし、各実験条件を、１プレートあたり３ウェルで表した。１枚のプレートを使用して、ＭＴＳアッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ＵＳＡ）を使用して細胞増殖データを出した。その他のプレートを使用してサイトカイン分析用の上清サンプルを回収した。ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ ＵＳＡまたはＲ＋Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ ＵＳＡ）を使用して、培養上清中のｈＩＦＮγ、ｈＴＮＦ、およびｈＩｌ−２のレベルを測定した。増殖アッセイおよびＥＬＩＳＡから生じた値についての標準誤差は、１０％未満であり、図から省略している。ＩＦＮγについてのポジティブコントロール値からの大きなずれは、観察されるが、一方で培養中のＩｌ−２およびＴＮＦのレベルは、ポジティブコントロールと処置群との間に有意に差はなかった。ＴＮＦデータは省略されている；Ｉｌ−２、ＩＦＮγおよび細胞増殖についてのデータは、それぞれ代表的実験について示す。
【０１５２】
マウス抗ヒトＫＩＭ−１ ｍＡｂのＡＵＦ１およびＡＫＧ７を使用するＭＬＲ培養の処理により、上清中に分泌したＩＦＮγのレベルは有意に低下した（図１２Ａ）。この効果は、上清中に分泌したＩｌ−２またはＴＮＦのレベルにおける低下が注目されなかったことから（図１２Ｂ）、ＩＦＮγに対して特異的であった。この効果は、細胞増殖アッセイが培養中の生細胞の数は同程度であったことを示したことから（図１３）、これらの培養における細胞数の減少によるものではなかった。
【０１５３】
（実施例１２：マウス炎症性腸疾患（ＩＢＤ）モデル）
実験マウスにおけるＩＢＤのモデルにおける症状の過程または重症度に影響を及ぼす可溶型形態のＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質の能力。このモデルにおいて、ＤＳＳを、（炎症の発生を引き起こす）大腸（結腸（ｃｏｌｏｎ））を慢性的に刺激した。炎症誘発性メディエータ（例えば、ＩＦＮγ、ＴＮＦ、およびＩｌ−１２）は、マウスモデルおよびヒト患者の両方において、ＩＢＤの発生および重症度にとって重要であることは公知であった（Ｅｇｇｅｒら，２０００，Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ６２：２４０−２４８；Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅら，２０００，Ａｎｎ．Ｍｅｄ．３２：５５２−５６０；Ｂｏｕｍａら，２００３，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：５２１−５３３）。上記に記載するように、ＭＬＲデータは、ＫＩＭ−１調節が炎症誘発性メディエータ（例えば、ＩＦＮγ）の産生に影響し得ることを示唆している。従って、ＫＩＭ−１改変薬剤をインビボにおいて試験した。ＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質が、一以上のリガンドと細胞（例えば、活性化リンパ球または他の免疫細胞）上に発現したＫＩＭ−１との相互作用を妨害することによって作用しているという仮説が立てられた。
【０１５４】
ＩＢＤを、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）モデルを使用してマウスにおいて誘導した（Ｃｏｐｐｅｒら，１９９３，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９：２３８−２４９）。滅菌蒸留水中４．５％ＤＳＳ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ａｕｒｏｒａ ＯＨ ＵＳＡ）の溶液を飲用源として提供した。マウスを、ＤＳＳを導入する直前に体重測定し、その後、毎日体重測定した。またマウスを、下痢の程度について（１：柔らかいペレット、２：緩いペレット、３：明白に流体糞便、４：ひどい失調）およびＣｏｌｏＳｃｒｅｅｎスライド（Ｈｅｌｅｎａ Ｌａｂｓ，Ｂｅａｕｍｏｎｔ ＴＸ ＵＳＡ）を使用して糞便中の血液の存在について（０：なし、１：血液）記録した。少ないが、検出可能な量の血液に、０．５の中間スコアを与えた。０日目、２日目、および５日目に、２００μｇのＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質またはポリクローナルｈＩｇＧコントロール（ＳａｎｄＩｍｍｕｎｅ，Ｓａｎｄｏｚ，Ｇｅｎｅｖａ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてｉｐでマウスに投与した。８日目に、マウスからＤＳＳ水を取り除き、正常の飲用水を与えた。体重および臨床スコアについてのモニタリングを１２日目（この日の時間に実験が終了した）まで継続した。
【０１５５】
ＩＢＤの誘導局面の間（０日目、２日目および５日目）のマウスの処置により、８日目まで累積的体重減少および疾患スコアに対する有意な影響が生じた。従って、マウスからＤＳＳを取り除き、正常飲用水に戻し、これらの回復をモニターした。０日目、２日目および５日目にＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質を受けたマウスは、体重減少の程度（図１４）および臨床スコア（下痢および出血；図１５Ａ）によって示されるように、１１日目には、一貫してより健康であった（回復に３日）。ＫＩＭ−１−Ｉｇ処置した同齢集団におけるずっと少ないマウスは、糞便に血液が存在した（図１５Ｂ）。
【０１５６】
これらのデータは、インビボにおけるＫＩＭ−１調節が急性炎症性状態（例えば、ＤＳＳ後に腸粘膜へのダメージを示す）において防御効果を有することを示唆した。これらの結果は、ＫＩＭ−１アンタゴニストが他の急性炎症性状態または慢性炎症性状態（例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬および膵炎）において有効であることを示唆した。
【０１５７】
他の実施形態は、添付の特許請求の範囲内にある。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明の分野は、医学、免疫学、分子生物学およびタンパク質化学である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ＫＩＭ−１（Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｊｕｒｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）は、Ｉ型細胞膜糖タンパク質（Ｉｃｈｉｍｕｒａら，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：４１３５−４１４２）である。ＫＩＭ−１の細胞外部分（外部ドメイン）は、６個のシステイン免疫グロブリン様ドメインおよびムチン様Ｏグリコシル化タンパク質に特有のＴ／ＳＰリッチドメインを含む。このムチンドメインは、柄のように、細胞表面から離れたＩｇ様ドメインを伸ばす（Ｊｅｎｔｏｆｔ，１９９０，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１５：２９１−２９４）。ＫＩＭ−１は、Ａ型肝炎ウイルスに対するレセプターとして同定されている（Ｋａｐｌａｎら，１９９６，ＥＭＢＯ Ｊ．１５：４２８２−４２９６；ＷＯ ９６／０４３７６；米国特許第５，６２２，８６１号）。二つのヒトＫＩＭ−１スプライス改変体が発見され、一つは肝臓において優勢であり（Ｆｅｉｇｅｌｓｔｏｃｋ，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：６６２１−６６２８）、もう一つは、腎臓において優勢である（前出のＩｃｈｉｍｕｒａら）。
【０００３】
ＫＩＭ−１は、ＴＩＭ（Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン）ファミリーとして公知の遺伝子ファミリーのメンバーである。ＫＩＭ−１に加えて、ヒトにおいてＴＩＭファミリーの少なくとも二つの他のメンバーがある。一つのメンバーは、クローニングされて「２００遺伝子（２００ ｇｅｎｅ）」（特許文献１）と命名されたが、その後、ＴＩＭ−３として公知になった。別のメンバーも、クローニングされて「遺伝子５８（ｇｅｎｅ ５８）」と命名された（特許文献２）。
ＫＩＭ−１は、腎臓ダメージに対する臨床の診断マーカーとして興味を引いている（Ｂａｉｌｌｙら，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３９７３９−３９７４８；Ｈａｎら，２００２，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｌ．６２：２３７−２４４）。ＫＩＭ−１（ＴＩＭ−１）のマウスホモログは、気道反応性亢進の発生に関与していると考えられる遺伝子座内に存在することが報告されている（ＭｃＩｎｔｉｒｅら，２００１，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２：１１０９）。ＴＩＭ−２として公知のマウスタンパク質は、抗原特異的Ｔ細胞のインビボでの発生において役割を果たすことが報告されている（Ｋｕｍａｎｏｇｏｈら，２００２，Ｎａｔｕｒｅ ４１９：６２９−６３３）。ＴＩＭ−３として公知のマウスタンパク質は、マウスにおける免疫応答調節に関連している（Ｍｏｎｎｅｙら，２００２．Ｎａｔｕｒｅ ４１５：５３６−５４１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０００／７３４９８号
【特許文献２】国際公開第９９／３８８８１号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
ＫＩＭ−１アンタゴニストを用いた哺乳動物の処置は、Ｔ細胞と他の免疫系細胞（例えば、樹状細胞、単球マクロファージおよびＢ細胞）との相互作用を変化させ、これによって抗原に対するＩｇＧ応答を強く抑制することが発見されている。さらに、このような処置は、抗原を用いたその後の抗原投与に応答して、記憶Ｂ細胞によるＩｇＧ１産生をほとんどなくすことが発見されている。さらに、ＫＩＭ−１のそのレセプターへの結合の遮断は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、抗原応答に関与する免疫細胞によるＩＦＮ−γの分泌を減少することが発見されている。これらの発見に基づき、本発明は、自己免疫疾患および哺乳動物の免疫系における他の障害の免疫機能を治療的に調節するための方法を提供する。
【０００６】
本発明は、哺乳動物において、Ｔ細胞と第二の細胞（例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ））との間のシグナル伝達を阻害する方法を提供する。この方法は、哺乳動物（例えば、免疫疾患または免疫障害を有する哺乳動物、または組織移植片を受ける準備のある哺乳動物）を同定する工程；ならびに哺乳動物に以下の型の有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストの１つを投与する工程を包含する：（ａ）ＫＩＭ−１ Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｂ）抗ＫＩＭ−１抗体；ならびに（ｃ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメント。
【０００７】
上記のＴ細胞は、活性化Ｔ細胞（例えば、ヘルパーＴ細胞）であり得る。これはＴｈ２細胞またはＴｈ１細胞であり得る。本発明のいくつかの実施形態において、このＴ細胞は、移植されるドナーＴ細胞である。ＡＰＣは、単球、マクロファージ、樹状細胞、またはＢ細胞であり得るが、これらに限定されない。本発明のいくつかの実施形態では、ＡＰＣは、自己抗原を提示している。
【０００８】
好ましくは、上記のＫＩＭ−１アンタゴニストは、可溶性ポリペプチドであり、この可溶性ポリペプチドは、ＫＩＭ−１ Ｉｇドメインに加えてＫＩＭ−１ムチンドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、このポリペプチドは、異種部分（例えば、免疫グロブリン（Ｉｇ）部分、血清アルブミン部分、標的部分、レポーター部分、多量体化部分および精製容易化部分）を含む。好ましい異種部分は、Ｆｃ部分のようなＩｇ部分である。
【０００９】
いくつかの実施形態において、上記のＫＩＭ−１アンタゴニストは、ポリマー（例えば、ポリアルキレングリコール、糖ポリマー、あるいはポリペプチド）に結合体化されたポリペプチドである。好ましいポリマーは、ポリアルキレングリコールであり、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は特に好ましい。このポリマーの平均分子量は、好ましくは、２，０００Ｄａ〜３０，０００Ｄａであり、そしてより好ましくは、５，０００Ｄａ〜２０，０００Ｄａ（例えば、約１０，０００Ｄａ）である。
【００１０】
本発明は、例えば、Ｔｈ２細胞のような活性化Ｔ細胞によって、細胞哺乳動物におけるＢ細胞の活性化を阻害する方法を提供する。この方法は、Ｂ細胞または他のＡＰＣを有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストと接触させる工程、またはこのアンタゴニストが抗ＫＩＭ−１抗体である場合、Ｔ細胞を有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストと接触させる工程を包含する。本発明のいくつかの実施形態において、活性化Ｔ細胞は、移植されるドナーＴ細胞である。
【００１１】
本発明は、哺乳動物における一以上の抗原に対して反応性のＩｇＧのような抗体（例えば、ＩｇＧ１）のサブセットの産生を阻害する方法を提供する。この方法は、有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストは、哺乳動物の免疫系が最初に一以上の抗原を認識する３０分〜３０日前に、投与される。この抗原は、処置される疾患、障害、または状態に応じて、アロ抗原または自己抗原である。
【００１２】
本発明は、自己免疫疾患における疾患再発を阻害する方法を提供する。この方法は、有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する。
【００１３】
本発明は、自己免疫疾患におけるエピトープ拡散を阻害する方法を提供する。この方法は、有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する。
【００１４】
本発明は、Ｔｈ２媒介性疾患（例えば、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、シャーガス病、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ヴェグナー肉芽腫症、結節性多発性動脈炎、急速進行性半月体形成性糸球体腎炎、または移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ））、喘息、アトピー性皮膚炎、気管反応性亢進疾患のようなアトピー性障害および呼吸困難症候群を処置する方法を提供する。この方法は、有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する。
【００１５】
本発明は、ＧＶＨＤを阻害する方法を提供する。この方法は、移植の３０分〜３０日前に有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する。
【００１６】
本発明は、哺乳動物において、リンパ球によるＩＦＮ−γの分泌を阻害する方法を提供する。この方法は、この哺乳動物に有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する。
【００１７】
本発明は、Ｔｈ１ Ｔ細胞エフェクター機能の活性化、ならびにその結果、炎症性状態において起きる細胞性免疫応答を阻害する方法を提供する。このような炎症性状態の例は、炎症性腸疾患である。この方法は、この哺乳動物に有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する。
【００１８】
本発明は、哺乳動物における炎症性疾患または炎症性障害（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎および回腸炎のような炎症性腸疾患）を処置する方法を提供する。この方法は、この哺乳動物に有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「抗ＫＩＭ−１抗体」は、抗体（例えば、全長ＫＩＭ−１ポリペプチドの細胞外部分に特異的に結合するＩｇＧ分子）を意味する。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「全長ヒトＫＩＭ−１ポリペプチド」は、その全体で配列番号１のポリペプチドまたはその全体で配列番号２のポリペプチドを意味する。これらの二つのポリペプチドは、ヒトＫＩＭ−１遺伝子のスプライス改変体を表す。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、「異種部分」は、全長ヒトＫＩＭ−１ポリペプチド内に存在しないアミノ酸配列を意味する。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「ＫＩＭ−１アンタゴニスト」は、（ａ）ＫＩＭ−１ Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｂ）抗ＫＩＭ−１抗体；または（ｃ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントを意味し、これらの各々が、天然に存在するＫＩＭ−１の生物学的活性を、遮断するか、阻害するか、または妨害する。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「ＫＩＭ−１融合タンパク質」は、異種部分に融合されたＫＩＭ−１部分を含む融合タンパク質を意味する。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、「ＫＩＭ−１部分」は、全長ＫＩＭ−１ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントを意味する。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「ＫＩＭ−１ポリペプチド」は、ＫＩＭ−１部分単独またはＫＩＭ−１部分を含む融合タンパク質を意味する。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「ＫＩＭ−１ Ｉｇドメイン」は、そのアミノ末端がアミノ酸２９〜３６であり、そしてそのカルボキシ末端がアミノ酸１０５〜１０７である配列番号１の一部分を意味する。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「ＫＩＭ−１ムチンドメイン」は、そのアミノ末端がアミノ酸１２６〜１３０であり、そしてそのカルボキシ末端がアミノ酸２５５〜２７４である配列番号１の一部分を意味する。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「ＫＩＭ−１膜貫通ドメイン」は、配列番号１のアミノ酸２９０〜３１１を意味する。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「ＫＩＭ−１細胞質ドメイン」は、配列番号１のアミノ酸３１２〜３３４、または配列番号２の３１２〜３５９を意味する。
【００３０】
他に規定されない限り、本明細書中に使用される全ての技術および科学用語は、本発明が関係する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、規定を含める本明細書は、支配する。本明細書中に記載される全ての刊行物、特許および他の参考文献は、参考として援用される。
本明細書中に記載されるものと同様または等価である方法および材料は、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料は、以下に記載される。この材料、方法および例は、単なる例示であり、限定することを意味しない。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明および添付の特許請求の範囲から明らかになる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
哺乳動物における免疫応答に関与するＴ細胞と第二の細胞との間のシグナル伝達を阻害する方法であって、以下：
（ａ）免疫疾患または免疫障害を有する哺乳動物および組織移植片の調整における哺乳動物からなる群から選択される哺乳動物を同定する工程；および
（ｂ）該哺乳動物に以下：（ｉ）ＫＩＭ−１ Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｉｉ）抗ＫＩＭ−１抗体；ならびに（ｉｉｉ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程、
を包含する、方法。
（項目２）
前記第二の細胞が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記Ｔ細胞が、活性化Ｔ細胞である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記Ｔ細胞が、ヘルパーＴ細胞である、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記ヘルパーＴ細胞が、Ｔｈ２細胞である、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記Ｔ細胞が、移植されるドナーＴ細胞である、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記ＡＰＣが、単球、マクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記ＡＰＣが、自己抗原を提示している、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記ポリペプチドが、さらにＫＩＭ−１ムチンドメインを含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記ポリペプチドが、さらに異種部分を含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記異種部分が、免疫グロブリン（Ｉｇ）部分、血清アルブミン部分、標的部分、レポーター部分および精製容易化部分からなる群から選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記異種部分が、Ｉｇ部分である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記Ｉｇ部分が、Ｆｃ部分である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記ポリペプチドが、ポリマーに結合体化される、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記ポリマーが、ポリアルキレングリコール、糖ポリマーおよびポリペプチドからなる群から選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ポリマーが、ポリアルキレングリコールである、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記ポリマーの平均分子量が、２，０００Ｄａ〜３０，０００Ｄａである、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記ポリマーの平均分子量が、５，０００Ｄａ〜２０，０００Ｄａである、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記ポリマーの平均分子量が、約１０，０００Ｄａである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
哺乳動物におけるＢ細胞の活性化を阻害する方法であって、Ｂ細胞を、以下：（ａ）ＫＩＭ−１ Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｂ）抗ＫＩＭ−１抗体；ならびに（ｃ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストと接触させる工程を包含する、方法。
（項目２２）
前記Ｂ細胞の活性化が、活性化Ｔ細胞によって媒介される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記活性化Ｔ細胞が、Ｔｈ２細胞である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記活性化Ｔ細胞が、移植されるドナーＴ細胞である、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
哺乳動物において、一以上の抗原に対する抗体のサブセットの産生を阻害する方法であって、以下（ａ）ＫＩＭ−１ Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｂ）抗ＫＩＭ−１抗体；ならびに（ｃ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
（項目２６）
前記抗体が、ＩｇＧクラスである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記抗体が、ＩｇＧ１サブクラスである、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
有効量の前記ポリペプチドが、前記哺乳動物の免疫系が一以上の抗原を初めて認識する３０分〜３０日前に、該哺乳動物に投与される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記一以上の抗原が、アロ抗原である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記一以上の抗原が、自己抗原である、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記哺乳動物の前記免疫系が、前記一以上の抗原を、自己免疫疾患の過程におけるエピトープ拡散プロセスの一部として、初めて認識する、項目２８に記載の方法。
（項目３２）
自己免疫疾患におけるエピロープ拡散を阻害する方法であって、以下：（ａ）ＫＩＭ−１
Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｂ）抗ＫＩＭ−１抗体；ならびに（ｃ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
（項目３３）
Ｔｈ２細胞媒介性疾患を処置する方法であって、以下：（ａ）ＫＩＭ−１ Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｂ）抗ＫＩＭ−１抗体；ならびに（ｃ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
（項目３４）
前記Ｔｈ２細胞媒介性疾患が、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、シャーガス病、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ヴェグナー肉芽腫症、結節性多発性動脈炎、急速進行性半月体形成性糸球体腎炎、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）および全身性ループス腎炎（ＳＬＥ）からなる群から選択される、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
ＧＶＨＤを阻害する方法であって、以下：（ａ）ＫＩＭ−１ Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｂ）抗ＫＩＭ−１抗体；ならびに（ｃ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
（項目３６）
ＫＩＭ−１ ＩｇドメインおよびＦｃ部分を含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド。
（項目３７）
哺乳動物に有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する、該哺乳動物内のリンパ球によるＩＦＮ−γの分泌を阻害する方法。
（項目３８）
哺乳動物に有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する、該哺乳動物における炎症性疾患または炎症性障害を処置する方法。
（項目３９）
前記炎症性疾患および前記炎症性障害が、炎症性腸疾患である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記炎症性疾患または前記炎症性障害が、急性炎症または慢性炎症である、項目３８に記載の方法。
（項目４１）
前記ヘルパーＴ細胞が、Ｔｈ１細胞である、項目４に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１（先行技術）は、ヒトＫＩＭ−１ポリペプチドの二つの天然に存在するスプライス改変体の略図である。この二つのアミノ酸配列は、残基３２３まで同一である。シグナル配列（残基１〜２０）を下線で示す。膜貫通ドメイン（残基２９０〜３１１）を二重下線により示す。
【図２】図２（先行技術）は、３５９個のアミノ酸のヒトＫＩＭ−１スプライス改変体の略図である。シグナル配列および膜貫通ドメインを、黒い影で示す。Ｉｇドメイン上のシステイン残基を「Ｃ」により示す。逆三角形は、Ｎ−グリカン結合点を示す。ムチンドメインに相当するＴＳＰリッチドメインを黒い太枠で示す。
【図３】図３は、ヒツジ赤血球で一次抗原投与を受けたＢａｌｂ／ｃマウスにおいて、１４日目に測定した免疫グロブリン力価をまとめたヒストグラムである（実験１）。
【図４】図４は、ヒツジ赤血球で一次抗原投与を受けたＢａｌｂ／ｃマウスにおいて、１４日目に測定した免疫グロブリン力価をまとめたヒストグラムである（実験２）。
【図５】図５は、ヒツジ赤血球で一次抗原投与を受けたＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて、７日目に測定された免疫グロブリン力価をまとめたヒストグラムである。
【図６】図６は、実験１由来のマウスにおいて、一次抗原投与（図３）から完全に回復させ、次いで再抗原投与した後、測定した免疫グロブリン力価をまとめたヒストグラムである。免疫グロブリン力価を、再抗原投与して３日後に測定した。
【図７】図７は、実験２由来のマウスにおいて、一次抗原投与（図４）から完全に回復させ、次いで再抗原投与した後、測定した免疫グロブリン力価をまとめたヒストグラムである。免疫グロブリン力価を、再抗原投与した３日後に測定した。
【図８】図８は、マウスＭＬＲ培養におけるＩＦＮγ産生に関するデータをまとめたヒストグラムである。照射Ｂａｌｂ／ｃ脾細胞をＣ５７Ｂｌ６マウス由来の脾細胞を刺激するために使用した。培養にて４８時間後、その上清を回収し、ＩＦＮγレベルを測定するために使用した。インキュベーションの際のｍＡｂ ３Ａ２およびｍＡｂ １Ｈ９用いた培養物の処理よって、上清中に分泌されたＩＦＮγのレベルは有意に低下した。
【図９】図９は、マウスＭＬＲ培養における細胞増殖に関するデータをまとめたヒストグラムである。照射Ｂａｌｂ／ｃ脾細胞をＣ５７Ｂｌ６マウス由来の脾細胞を刺激するために使用した。培養にて７２時間後、生体色素（ｖｉｔａｌ ｄｙｅ）を培養物に添加して、１〜４時間にわたり発色させた。３日の培養期間の間、抗ＫＩＭ−１抗体用いた培養物の処理によって、細胞増殖は影響されなかった。
【図１０】図１０は、マウスＭＬＲ培養におけるＩＦＮγ産生に関するデータをまとめたヒストグラムである。照射Ｂａｌｂ／ｃ脾細胞を、Ｃ５７Ｂｌ６マウス由来の脾細胞を刺激するために使用した。培養にて４８時間後、その上清を回収して、ＩＦＮγレベルを測定するために使用した。インキュベーションの際のＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質を用いた培養物の処理によって、上清中に分泌されたＩＦＮγのレベルは有意に低下した。
【図１１】図１１は、マウスＭＬＲ培養における細胞増殖に関するデータをまとめたヒストグラムである。照射Ｂａｌｂ／ｃ脾細胞を、Ｃ５７Ｂｌ６マウス由来の脾細胞を刺激するために使用した。培養にて７２時間後、生体色素を培養物に添加して、１〜４時間にわたり発色させた。３日の培養期間の間、ＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質を用いた培養物の処理によって、細胞増殖は影響されなかった。
【図１２】図１２Ａおよび図１２Ｂは、ヒトＭＬＲ培養におけるＩＦＮγ産生に関するデータをまとめたヒストグラムである。照射ＪＹ細胞を、健常人のドナー由来の末梢血単核細胞を刺激するために使用した。培養にて５日後、その上清を回収して、ＩＦＮγレベルおよびＩｌ−２レベルを測定するために使用した。インキュベーションの際のｍＡｂ ＡＵＦ１およびｍＡｂ ＡＫＧ７を用いた培養物の処理によって、上清中に分泌されたＩＦＮγのレベルは有意に低下したが（図１２Ａ）、一方で産生したＩｌ−２のレベルは、変わらないままであった（図１２Ｂ）。
【図１３】図１３は、ヒトＭＬＲ培養における細胞増殖に関するデータをまとめたヒストグラムである。照射ＪＹ細胞を、健常人のドナー由来の末梢血単核細胞を刺激するために使用した。培養にて６日後、生体色素を培養物に添加して、１〜４時間にわたり発色させた。６日の培養期間の間、抗ヒトＫＩＭ−１ ｍＡｂを用いた培養物の処理によって、細胞増殖は有意にもたされなかった。
【図１４】図１４は、マウスにおいて、炎症性腸疾患の誘導後の体重減少に関するデータをまとめたヒストグラムである。雌性のＢａｌｂ／ｃマウスをデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）に暴露した。８日後、マウスをただの水に換え戻して、ＤＳＳ暴露から回復させた。三日後、マウスを体重測定した。この体重を、実験の開始時の体重に対する百分率として計算した。ＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質を用いた処理によって、体重スコアにおける改善で示すように、マウスに対して有意な防御が与えられた。１０マウス／グループであった。平均等価（ｅｑｕｉｖｉｌｅｎｃｅ）試験により、＞ｐ＝０．０００１の有意差が得られた。
【図１５】図１５Ａおよび図１５Ｂは、マウスにおいて、炎症性腸疾患の誘導後の臨床スコアデータをまとめたヒストグラムである。３日の回復期間後、マウスを下痢および糞便中の血液の存在について評価した。ＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質を用いて処理したマウスは、未処置のグループまたはコントロール−Ｉｇ処理のグループより有意に優れたスコアを有した（図１５Ａ）。これは、部分的に、糞石における血液の存在を有した有意により少ないマウスがよるものであった（図１５Ｂ）。平均等価試験により、ＫＩＭ−１−Ｉｇ処置した同齢集団と比較して、未処理のコントロールの臨床スコアにおいて差異についての有意な値（ｐ＝０．０５）が得られた。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
（発明の詳細な説明）
ネイティブなヒトＫＩＭ−１遺伝子は、少なくとも部分的には組織依存的なスプライス変化に依存して３３４アミノ酸または３５９アミノ酸（配列番号１）を含むポリペプチド（図１）をコードする。両方の配列とも以下を含む：シグナル配列、Ｉｇドメイン、ムチンドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン。
【００３３】
可溶性のダイマー化ＫＩＭ−１外部ドメイン−Ｆｃ融合タンパク質（マウスＫＩＭ−１外部ドメインおよびヒトＦｃ部分を含む各モノマー）ならびに認識される動物モデル（マウスのＳＲＢＣ反応）を使用して、本発明者らは、哺乳動物の免疫応答の著明な変化を成し遂げた。理論に縛られる意図はないが、本発明者らは、観察結果を融合タンパク質がＫＩＭ−１アンタゴニストのように作用し、この拮抗作用は、Ｔ細胞とＡＰＣとの間のＫＩＭ−１媒介性シグナル伝達の相互作用を妨害することを示すものとして解釈する。この妨害の下流の効果は、哺乳動物の免疫反応の有用な調節を含む。このような調節は、自己免疫疾患ならびに哺乳動物の免疫系が、Ｔ細胞細胞傷害または免疫グロブリン反応のいずれかを介して、不適切な標的を攻撃する他の疾患および障害を処置するために使用され得る。免疫系調節が有益である疾患または障害の例としては、関節炎、全身性エリテマトーデス（ｅｒｙｔｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ）（ＳＬＥまたはループスとしてもまた公知）および移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
本発明の方法において、可溶性ＫＩＭ−１アンタゴニストポリペプチドまたはＫＩＭ−１ブロッキング抗体（あるいは抗原結合性抗体フラグメント）は、予備形成されたポリペプチドとして直接投与され得る。あるいは、それは、核酸ベクター（このポリペプチドをコードし、そして発現する）を介して非直接的に投与され得る。いずれの方法にせよ、この結果は、ＫＩＭ−１媒介性のＴ細胞上の効果（Ｔ細胞活性化およびＴ細胞増殖刺激を含める）を拮抗することである。Ｔ細胞上に位置するＫＩＭ−１のこの拮抗作用は、Ｔ細胞それ自体の破壊的作用をブロックすることによって、直接的に、所望の治療効果を達成し得る。さらに、この拮抗作用は、Ｂ細胞の活性化Ｔ細胞媒介性の活性化を阻害して、それによって有害な抗体産生を減少させることによって、間接的に、所望の治療効果を達成し得る。
【００３５】
自己免疫疾患および特定のタイプの病原性感染を含める種々の疾患において、ダメージは自己抗体反応（すなわち、自己抗原を認識する抗体の産生）から生じる。本発明は、Ｔ細胞活性化およびＴ細胞分化を妨害することによって、このようなダメージを減少させるための方法および分子を提供する。これは、次いで、Ｂ細胞による特異的免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１）の産生および分泌を妨害する活性化Ｔ細胞媒介性のＢ細胞活性化を妨害する。従って、自己抗体反応によって特徴付けられる任意の疾患または障害は、本発明の方法および分子を使用することによって、処置され得る。
【００３６】
特定の自己免疫疾患が処置される場合、抗原への暴露ならびに免疫系反応は、一過性である。これは、有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストの投与が、一以上の抗原に対する免疫応答の後に続く再活性化を阻害する際の緩解をもたらす。この方法において、本発明は、疾患再発をブロックするために使用され得る。特定の自己免疫疾患が処置される場合、哺乳動物の免疫系は、一以上の抗原を、自己免疫疾患の過程におけるエピトープ拡散プロセスの一部として、初めて認識する。
【００３７】
移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）におけるダメージの多くは、一旦、例えば、骨髄移植において、移植される場合、（宿主抗原に対して）宿主において活性化されたドナーＴ細胞の作用から、直接的に生じる。Ｔ細胞活性化を妨害するこの能力によって、本発明は、ＧＶＨＤを阻害するために有用である。活性化ドナーＴ細胞の直接的作用からのダメージに加えて、ＧＶＨＤにおいて、抗体媒介性成分もまたある。この抗体媒介性成分は、自己抗体産生Ｂ細胞を活性化するドナーＴ細胞の活性化に依存することから、本発明は、ＧＶＨＤにおいて自己抗体媒介性ダメージおよび細胞性免疫媒介性ダメージを減少させる。
【００３８】
（抗体媒介性自己免疫疾患）
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ；ループス）は、細胞内抗原（例えば、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよびヒストン）に対して指向される高レベルの自己抗体によって特徴付けられるＴＨ−２媒介性自己免疫障害である。これらの特徴を考えると、ループスは、本発明に従って処置され得る自己免疫疾患を例示する。
【００３９】
本発明による処置に適した他の器官特異的疾患または全身性自己免疫疾患の例としては、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、グレーブス病、シャーガス病、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ヴェグナー肉芽腫症、結節性多発性動脈炎および急性進行性半月体形成性糸球体腎炎が挙げられる。例えば、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉら、１９９６、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ、第三版（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ）を参照のこと。さらに、一旦、Ｔ細胞細胞傷害性活性によって媒介されると考えると、慢性関節リウマチ（ＲＡ）が、Ｂ細胞および／または抗体成分を有することは、現在公知であり（Ｌｅａｎｄｒｏら，２００２，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．，６１：８６３−８６６；Ｄｅ Ｖｉｔａら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４６：２０２９−２０３３；Ｔｓｕｊｉら，２００２，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６：１２７７−１２９０）、従って、本発明による処置に適している。
【００４０】
いくつかの病原性感染薬剤に対する正常な免疫応答は、有害な自己抗体応答を誘発する。一つの例は、シャーガス病であり、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉで慢性的に感染したヒトおよび実験動物において発生する炎症性心筋症である。抗自己抗体は、シャーガス病患者の血清中に存在し（Ｂａｃｈ−Ｅｌｉａｓら、１９９８、Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．Ｒｅｓ．８４：７９６−７９９；Ｔｉｂｂｅｔｔｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１４９３−１４９９）、従って、この疾患は、本発明による処置に適している。
【００４１】
感染から生じる自己抗体による細胞の破壊の別の例は、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）であり、この自己抗体は、（ＦｃレセプターまたはＣ３ｂレセプターを有する補体または食細胞によって）血小板破壊を引き起こし、出血を導き得る。ＩＴＰは、本発明による処置に適している。
【００４２】
（移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ））
ＧＶＨＤは、本発明の方法を使用して処置され得るＴ細胞媒介性状態を例示する。ＧＶＨＤは、Ｔ細胞が宿主抗原を外来抗原として認識する場合に、惹起される。ヒト患者において、しばしば、骨髄移植（ＢＭＴ）の致命的結果となるＧＶＨＤは、急性または慢性であり得る。ＧＶＨＤの急性形態および慢性形態は、それぞれ、抗原特異的なＴｈ１応答およびＴｈ２応答の発生を例示する。急性ＧＶＨＤは、ＢＭＴ後はじめの２ヵ月以内に発症し、そして、皮膚、腸、肝臓および他の器官に対するドナー細胞傷害性Ｔ細胞媒介性ダメージによって特徴付けられる。慢性ＧＶＨＤは、より遅く現れ（ＢＭＴ後１００日以上）、そして自己抗体を含む免疫グロブリン（Ｉｇ）の過剰産生、ならびにＩｇ沈着によって引き起こされる皮膚、腎臓および他の器官へダメージによって特徴付けられる。急性ＧＶＨＤ患者の約９０％は、慢性ＧＶＨＤを発生するようになる。慢性ＧＶＨＤは、Ｔｈ２ Ｔ細胞媒介性疾患であるように思われる（Ｄｅ Ｗｉｔら，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：３６１−３６６）。急性ＧＶＨＤは、Ｔｈ１媒介性疾患である（Ｋｒｅｎｇｅｒら，１９９６，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．１５：５０−７３；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら，１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：６８９−６９９）。Ｔ細胞細胞傷害は、急性ＧＶＨＤ特有である。ドナーの抗宿主細胞傷害の結果は、種々の方法において見られ得る。第一に、宿主リンパ球は、急速に破壊され、これによって、急性ＧＶＨＤを発症しているマウスは、大いに免疫抑制されている。第二に、ドナーリンパ球は、移植され、宿主の脾臓において拡大し、そしてこれらの細胞傷害活性は、ドナー細胞によって（外来として）認識され得る宿主抗原を発現する細胞株を利用することによって、インビトロで、直接測定され得る。第三に、この疾患は、さらなる組織にとって、致死性になり、そして細胞集団は、破壊される。
【００４３】
慢性ＧＶＨＤは、宿主組織および宿主細胞の抗体媒介性破壊から生じ、「ＳＬＥ様」ＧＶＨＤと呼ばれている。徴候としては、自己抗体形成、種々の器官（腎臓、肝臓）におけるＩｇ沈着、皮膚発疹、リンパ系の過形成、シェーグレン様病変、強皮症様病変、多発動脈炎および他の病理が挙げられる。この疾患は、自己抗体形成によって、部分的に媒介される。前述のことを考えると、慢性ＧＶＨＤは、本発明による処置に適している。
【００４４】
（他のＴｈ２関連疾患）
アトピー障害は、活性化Ｔ細胞およびＡＰＣを含む免疫系細胞による、サイトカイン、ケモカイン、およびＴｈ２応答に特有な他の分子（例えば、とりわけＩＬ−４サイトカイン、ＩＬ−５サイトカインおよびＩＬ−１３サイトカイン）の発現によって特徴付けられる。従って、このようなアトピー障害は、Ｔｈ２応答の発生を拮抗する方法（例えば、本発明のＫＩＭ−１アンタゴニスト）による処置を受け入れる。アトピー障害としては、喘息（気道過敏症および気道困難症候群）およびアトピー皮膚炎のような病理が挙げられる。本発明は、アトピー障害を阻害する方法を提供する。この方法は、有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する。
【００４５】
（活性化リンパ球、ＡＰＣおよび炎症誘発性サイトカインによって媒介される炎症性疾患および炎症性障害）
マウスモデル系およびヒトモデル系における混合リンパ球反応アッセイ（ＭＬＲ）を用いて、本発明者らは、（例えば、抗ＫＩＭ−１ ｍＡｂまたはＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質を用いる）ＫＩＭ−１のそのレセプターへの結合の遮断は、反応細胞によるＩＦＮγの分泌を減少させることを示している。従って、ＫＩＭ−１アンタゴニストは、ＩＦＮγにより媒介される任意の疾患または障害を処置するために使用され得る。
【００４６】
ＩＦＮγは、免疫応答において、重要なサイトカインである。これは、炎症性かつ免疫プロセスの発現および程度に対し多面発現（ｐｌｅｏｔｒｏｐｉｃ）効果を有する（Ｂｏｅｈｍら１９９７，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５：７４９−７９５）。ＩＦＮγ産生の欠乏は、抗ウイルス性応答および抗細菌性応答を縮小し、炎症性応答を減弱する。ＫＩＭ−１アンタゴニストは、ＩＦＮγ産生が過剰か、または不適切な疾患または障害において、ＩＦＮγ産生を減少させるために、有利に使用され得る。このような疾患または障害の例としては、自己免疫疾患、大腸炎および慢性炎症が挙げられる。
【００４７】
ＩＦＮγは、Ｔ細胞活性化およびＢ細胞応答の鍵成分である。これは、Ｔ細胞エフェクター細胞発生（例えば、Ｉｌ−４との交差調節を介して）およびＢ細胞活性化（例えば、ＭＨＣ媒介性抗原提示およびＢ７分子の発現の調節を介して）に影響する。ＩＦＮγは、Ｔｈ１ Ｔ細胞媒介性免疫応答の重要な成分である。ＩＦＮγは、他の免疫系構成要素（例えば、マクロファージおよび好中球）に対し、明白な効果を有する。これは、これらの免疫系構成要素の活性化および有毒なエフェクター分子の放出を刺激する。
【００４８】
ＩＦＮγは、組織常在性細胞型に対し、強力な効果を有する。内皮は、ＩＦＮγによって活性化される。ＩＦＮγで刺激される場合、患部組織に常在性細胞（例えば、慢性関節リウマチにおける滑膜細胞）は、ＴＮＦおよび他のサイトカイン、ＭＣＰ−１および他のケモカインならびに有毒なエフェクター分子（例えば、一酸化窒素）を分泌する。ＩＦＮγによって媒介されるこれらの後者の機能の全ては、炎症の際に、組織内へ細胞輸送に影響する。
【００４９】
実施例５（以下）に示されるように、ＫＩＭ−１のそのレセプターへの結合の遮断は、ＳＲＢＣモデル系におけるＩｇＧ１産生を減少させるか、またはなくさせる。ＭＬＲアッセイにおいて、本発明者らは、ＫＩＭ−１のそのレセプターへの結合の遮断が、リンパ球によるＩＦＮγ産生を減少させることを発見している。理論に縛られる意図はないが、ＩｇＧ１産生における減少およびＩＦＮγ産生の減少が、ＫＩＭ−１遮断の二つの別々の効果を表し得、直接的に関連し得ないことは、注目される。従って、ＫＩＭ−１アンタゴニストが、本発明による免疫機能を調節するために使用される場合、ＫＩＭ−１アンタゴニストは、二つの別々の作用機構を介して、有益な効果を提供し得る。
【００５０】
（融合タンパク質および結合体化ポリペプチド）
本発明のいくつかの実施形態は、ＫＩＭ−１アンタゴニストポリペプチドを含み、ＫＩＭ−１部分は、異種部分に融合されて、ＫＩＭ−１融合タンパク質を形成する。ＫＩＭ−１融合タンパク質は、ＫＩＭ−１部分単独とは対照的に、種々の目的を達成するために使用され得る。このような目的としては、例えば、血清半減期の上昇、バイオアベイラビリティーの改善、特異的器官または組織型へのインビボターゲティング、組換え発現効率の改善、宿主細胞分泌の改善および精製の容易さが挙げられる。達成する目的に依存して、異種部分は、不活性であってもよく、または生物学的に活性でもよい。また、異種部分は、ＫＩＭ−１部分に安定的に融合されるか、あるいはインビトロまたはインビボにて切断可能なように選択され得る。種々の目的を達成する異種部分は、当該分野において公知である。
【００５１】
ＫＩＭ−１融合タンパク質の発現の代わりとして、選択された異種部分が、予備形成され得、そしてＫＩＭ−１部分に化学的に結合され得る。ほとんどの場合、選択された異種部分は、ＫＩＭ−１部分に融合されるか、または結合されるかにかかわらず、同様に機能する。従って、異種アミノ酸配列の以下の議論において、他に記載されない場合、異種配列は、融合タンパク質の形態で、あるいは化学的結合として、ＫＩＭ−１部分に連結され得ることを理解すべきである。
【００５２】
薬理学的に活性なポリペプチド（例えば、ＫＩＭ−１ポリペプチド）は、しばしば、迅速なインビボクリアランスを示すことから、身体内で、治療的に有効な濃度を達成するためには、大量の用量を必要とする。さらに、約２０ｋＤａより小さいポリペプチドは、潜在的に、糸球体濾過を受け、時折、腎毒性を導く。比較的小さいポリペプチド（例えば、ＫＩＭ−１フラグメント）の融合物または結合体は、利用されて、このような腎毒性の危険性を低下させ得るか、または回避し得る。治療的ポリペプチドのインビボ安定性（すなわち血清半減期）を上昇するための種々の異種アミノ酸配列（すなわち、ポリペプチド部分、すなわち「キャリア」）は、公知である。
【００５３】
その長い半減期、広範なインビボ分布および酵素学的または免疫学的機能の欠如によって、基本的に全長ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）あるいはＨＳＡフラグメントは、異種部分に好ましい。方法および材料の適用（例えば、Ｙｅｈら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１９０４−１９０８およびＳｙｅｄら，１９９７，Ｂｌｏｏｄ ８９：３２４３−３２５２に教示されるもの）を通じて、ＨＳＡは、使用されてＫＩＭ−１融合タンパク質、またはＫＩＭ−１部分によって薬理学的活性を示し、かつインビボでの安定性の有意な上昇（例えば、１０倍〜１００倍より高い）を示す結合体を形成し得る。好ましくは、ＨＳＡのＮ末端は、ＫＩＭ−１部分のＣ末端に融合される。ＨＳＡは天然に分泌されるタンパク質であることから、ＫＩＭ−１融合タンパク質が真核細胞の（例えば、哺乳動物の）発現系で産生される場合、ＨＳＡシグナル配列は、細胞培養培地中へのＫＩＭ−１融合タンパク質の分泌物を得るために利用され得る。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態は、ＫＩＭ−１ポリペプチドを利用し、ＫＩＭ−１部分はＦｃ領域（すなわち、Ｉｇ重鎖定常領域のＣ末端部分）に融合される。ＫＩＭ−１−Ｆｃ融合物の潜在的利点としては、溶解性、インビボ安定性および多価性（例えば、二量体化）が挙げられる。使用されるＦｃ領域は、ＩｇＡ Ｆｃ領域、ＩｇＤ Ｆｃ領域またはＩｇＧ Ｆｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）であり得る。あるいは、使用されるＦｃ領域は、ＩｇＥ Ｆｃ領域、またはＩｇＭ Ｆｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４）であり得る。ＩｇＧ Ｆｃ領域は、好ましい（例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）。Ｆｃ融合物をコードするＤＮＡを構築および発現するための材料ならびに方法は、当該分野において公知であり、過度の実験なしでＫＩＭ−１融合物を得るために適用され得る。
【００５５】
好ましくは、ＫＩＭ−１−Ｆｃ融合物は、方向性をもって構築され、ＫＩＭ−１部分は、融合タンパク質のアミノ末端部分を形成する。この方向性をもったＦｃ融合物の構築および発現の例については、例えば、Ｗａｌｌｎｅｒら，米国特許第５，５４７，８５３（ｐＳＡＢ１５２）を参照のこと。あるいは、この融合物は、逆の方向性をもって構築され得、すなわち、ＫＩＭ−１部分は、この融合物のカルボキシ末端部分を形成する。この方向性の例および議論については、例えば、Ｌｏら，米国特許第５，５４１，０８７号を参照のこと。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態は、Ｌｏら，米国特許第５，５４１，０８７号に従って、ＫＩＭ−１免疫融合ＤＮＡを構築することによって得られるＫＩＭ−１融合タンパク質を利用する。免疫融合ＤＮＡは、分泌カセットをコードするポリヌクレオチドを含む。この分泌カセットは、シグナル配列、免疫グロブリンＦｃ領域および分泌カセットの３’末端に融合されるＫＩＭ−１部分を（５’から３’方向で）コードする配列を含む。ＤＮＡは、宿主細胞において、高レベルで発現され得、融合タンパク質は、効率的に産生され、宿主細胞から分泌される。この分泌免疫融合物は、宿主細胞の溶解を必要とせずに、培養培地から回収され得る。
【００５７】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ配列は、ＫＩＭ−１部分と異種部分との間のタンパク分解性切断部位をコードする。切断部位は、コードされる融合タンパク質のタンパク分解性切断部位（従って、標的タンパク質からＦｃドメインを分離する）のために提供される。有用なタンパク分解性切断部位は、タンパク質分解酵素（例えば、トリプシン、プラスミン、エンテロキナーゼ Ｋ）で認識されるアミノ酸配列を含む。
【００５８】
ＫＩＭ−１ポリペプチド構築物は、複製可能な発現ベクターに組込まれ得る。有用なベクターとしては、直鎖状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミドなどが挙げられる。例示的な発現ベクターは、ｐＳＡＢ１５２（Ｗａｌｌｎｅｒら，米国特許第５，５４７，８５３号）。別の例示的な発現ベクターは、ｐｄＣであり、このｐｄＣ内の免疫融合ＤＮＡの転写は、ヒトサイトメガロウイルスのエンハンサーおよびプロモーターの制御下に置かれる（Ｌｏら，１９９１，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０８８：７１２；およびＬｏら，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：４９５−５００）。適切な宿主細胞は、ＫＩＭ−１ポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換され得るか、またはトランスフェクトされ得、そしてその宿主細胞は、ＫＩＭ−１ポリペプチドの発現および分泌のために使用される。好ましい宿主細胞としては、不死のハイブリドーマ細胞、ミエローマ細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｈｅｌａ細胞およびＣＯＳ細胞が挙げられる。
【００５９】
完全にインタクトで野生型のＦｃ領域は、本発明によるＦｃ融合タンパク質において、通常は不必要でかつ望まれていないエフェクター機能を示す。従って、特定の結合部位は、好ましくは、ＫＩＭ−１−Ｆｃ融合タンパク質の構築の際に、Ｆｃ領域から欠失させられる。例えば、軽鎖との同時発現は、不必要であることから、重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ（Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔら，１９８７，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ８：１１１−１１４））に対する結合部位は、ＩｇＥのＦｃ領域から欠失させられて、これにより、この部位は、融合タンパク質の効率的な分泌を妨害しない。同様に、免疫グロブリンの軽鎖への結合の原因であるＦｃ領域内のシステイン残基は、欠失されるか、または別のアミノ酸で置換されるべきであり、これにより、これらのシステイン残基は、このＦｃ領域が免疫融合物として産生されるときに、Ｆｃ領域の正しい折りたたみを妨害しない。膜貫通ドメイン配列（例えば、ＩｇＭで存在する膜貫通ドメイン）は、欠失されるべきである。
【００６０】
ＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、好ましい。あるいは、免疫グロブリンγの他のサブクラス（γ−２、γ−３およびγ−４）のＦｃ領域は、分泌カセットで使用され得る。分泌カセットにおいて好ましく使用される免疫グロブリンγー１のＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、ヒンジ領域（少なくとも一部）、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む。いくつかの実施形態において、免疫グロブリンγー１のＦｃ領域は、ヒンジ領域の一部およびＣＨ３領域を含むが、ＣＨ２領域を含まないＣＨ２欠失Ｆｃである。ＣＨ２欠失Ｆｃは、Ｇｉｌｌｉｅｓら，１９９０，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，１：４７により記載されている。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭのＦｃ領域が、使用される。
【００６１】
ＫＩＭ−１−Ｆｃ融合タンパク質は、いくつかの異なる構造において構築され得る。一つの構造では、ＫＩＭ−１部分のＣ末端は、Ｆｃ部分のＮ末端に直接融合される。わずかに異なる構造では、短いリンカー（例えば、２〜１０個のアミノ酸）が、ＫＩＭ−１部分のＣ末端とＦｃ領域のＮ末端の融合物の間に組み込まれる。このようなリンカーは、高次構造的な可撓性を提供し、この可撓性は、いくつかの状況において、生物学的活性を改善させ得る。ヒンジ領域の十分な部分がＦｃ部分において保持される場合、ＫＩＭ−１−Ｆｃ融合物は、二量体化し、従って、二価の分子を形成する。単量体のＦｃ融合物の同質集団は、単一特異性で二価の二量体を産生する。それぞれ異なる特異性を有する二つの単量体のＦｃ領域の混合物は、二重特異性で二価の二量体を産生する。
【００６２】
ＫＩＭ−１結合体は、当該分野において公知の方法を用いて構築され得る。相当するアミノ反応基およびチオール反応基を含む多くの架橋剤の任意のものが、ＫＩＭ−１を血清アルブミンに連結するために使用され得る。適したリンカーの例としては、チオール反応性マレイミドを挿入するアミン反応性架橋剤が挙げられる。これらのリンカーとしては、例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳまたはＧＭＢＳが挙げられる。他の適したリンカーは、チオール反応性ハロアセテート基を挿入する。これらのリンカーとしては、例えば、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢが挙げられ、そして還元可能な結合を作製するために、スルフヒドリル基と反応するための保護チオールまたは非保護チオールを提供するリンカーとしては、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡまたはＳＡＴＰ（これらの全ては、市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））がある。当業者は、ＫＩＭ−１のＮ末端を血清アルブミンと連結する代わりの戦略を同様に想像し得る。
【００６３】
当業者は、ＫＩＭ−１ポリペプチドのＮ末端または血清アルブミン上のチオール部分で標的にされない血清アルブミンへの結合体を作り出し得る。例えば、ＫＩＭ−１−アルブミン融合物は、遺伝子操作技術を用いて作り出され得、ＫＩＭ−１部分は、ＫＩＭ−１のアミノ末端（Ｎ−ｔｅｒ）、カルボキシ末端（Ｃ−ｔｅｒ）または両方の末端で、血清アルブミン遺伝子に融合される。
【００６４】
ＫＩＭ−１ポリペプチドの他の誘導体は、改変されたＫＩＭ−１またはＫＩＭ−１のフラグメントの他のタンパク質またはポリペプチドとの共有結合性結合体、あるいは凝集的結合体（例えば、さらなるＮ末端またはＣ末端として組換え培養での合成による）を含む。例えば、結合体化ペプチドは、タンパク質の輸送を、同時翻訳でか、あるいは翻訳後に、合成部位から細胞膜または細胞壁の内側か、または外側の機能部位に方向付けるタンパク質のＮ末端の領域でのシグナル（またはリーダー）ポリペプチド配列（例えば、酵母α因子リーダー）であり得る。ＫＩＭ−１ポリペプチドは、ＫＩＭ−１部分の精製または同定を容易にするために、異種のペプチドに融合され得る（例えば、ヒスチジン／ＫＩＭ−１融合物）。ＫＩＭ−１部分はまた、ペプチドＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号）（Ｈｏｐｐら，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４）に連結され得る。この配列は、より高い抗原性であり、特異的モノクローナル抗体によって可逆的に結合されるエピトープを提供する。結果として、この配列は、アッセイおよび発現された組換えタンパク質の精製を容易にする。この配列は、ウシ粘膜エンテロキナーゼによって、Ａｓｐ−Ｌｙｓ対形成の直後の残基で、特異的に切断される。
【００６５】
遺伝子融合構築物を利用する発現系は、細菌内のタンパク質産生を向上するために使用されている。融合タンパク質のアミノ末端融合パートナーのように非常に高レベルで正常に発現される細菌タンパク質を利用することは、このメッセージの効率的な転写および翻訳、ならびにある場合では、この融合タンパク質の分泌および可溶化を保証することに役立つ（Ｓｍｉｔｈら，１９８８ Ｇｅｎｅ ６７：３１；前出のＨｏｐｐら；Ｌａ Ｖａｌｌｉｅら，１９９３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１８７）。
【００６６】
（結合体化ポリマー（ポリペプチド以外））
本発明のいくつかの実施形態は、ＫＩＭ−１ポリペプチドを含み、一以上のポリマーが、ＫＩＭ−１ポリペプチドに結合体化される（共有結合的に連結される）。このような結合に適したポリマーの例としては、ポリペプチド（上記で議論される）、糖ポリマーおよびポリアルキレングリコール鎖が挙げられる。代表的に、必ずでもないが、ポリマーは、以下の一以上を改善する目的のために、ＫＩＭ−１ポリペプチドに結合体化される：溶解性、安定性またはバイオアベイラビリティー。
【００６７】
ＫＩＭ−１ポリペプチドへの結合のためのポリマーの好ましいクラスは、ポリアルキレングリコールである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、好ましいポリアルキレングリコールである。ＰＥＧ部分（例えば、１〜６個のＰＥＧポリマー）は、ＫＩＭ−１ポリペプチド単独と比較して、血清半減期を上昇するために、各ＫＩＭ−１ポリペプチドに結合体化され得る。ＰＥＧ部分は、非抗原性であり、そして基本的に生物学的に不活性である。本発明の実施において使用されるＰＥＧ部分は、分枝状または非分枝状であり得る。
【００６８】
ＫＩＭ−１ポリペプチドに結合されるＰＥＧ部分の数および個々のＰＥＧ鎖の分子量は、種々であり得る。概して、ポリマーの分子量は高分子になるほど、ポリペプチドに結合されるポリマー鎖は少なくなる。好ましくは、ＰＥＧの平均分子量は、２ｋＤａ〜１００ｋＤａである。より好ましくは、平均分子量は、５ｋＤａ〜２０ｋＤａであり、最も好ましくは、８ｋＤａ〜１２ｋＤａである。
【００６９】
ポリマー（例えば、ＰＥＧ）は、任意の適した、ポリペプチド上の露出した反応基を介して、ＫＩＭ−１ポリペプチドに連結され得る。この露出した反応基は、例えば、Ｎ末端アミノ基または内部のリジン残基のεアミノ基か、もしくは両方であり得る。天然に存在するリジン残基は、この目的のために利用され得るか、またはリジン残基は、ＫＩＭ−１アミノ酸配列内に設計され得る。活性化ポリマーは、ＫＩＭ−１ポリペプチド上の任意の遊離のアミノ基で反応し得、共有結合的に連結され得る。（利用可能な場合）ＫＩＭ−１の遊離のカルボキシル基、適切に活性化したカルボニル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、イミダゾール基、参加した炭水化物部分およびメルカプト基もまた、ポリマー付着のための反応基として使用され得る。
【００７０】
好ましくは、結合反応において、ポリペプチド濃度に依存して、一モルのポリペプチド当たり約１．０〜約１０モルの活性化ポリマーが使用される。通常、選択した比は、反応を最大限に引き出しつつ、一方でＫＩＭ−１部分の所望の薬理学的活性を損ない得る（しばしば非特異的）副反応を最小限に抑えるバランスを表す。好ましくは、ＫＩＭ−１ポリペプチドの生物学的活性のうちの少なくとも５０％が保持され、最も好ましくは、約１００％が保持される。
【００７１】
ポリマーは、従来の化学を用いてＫＩＭ−１ポリペプチドに結合体化され得る。例えば、ポリアルキレングリコール部分は、ＫＩＭ−１ポリペプチドのリジンεアミノ基にカップリングされ得る。このリジン側鎖の結合は、Ｎ−ヒドロキシルスクシニミド（ＮＨＳ）活性エステル（例えば、ＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（ＳＳ−ＰＥＧ）およびＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ−ＰＥＧ））を用いて行われる。適したポリアルキレングリコール部分としては、例えば、カルボキシメチル−ＮＨＳ、ノルロイシン−ＮＨＳ、ＳＣ−ＰＥＧ、トレシレート、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾールおよびＰＮＰカルボネートが挙げられる。これらの試薬は、市販されている。さらなるアミン反応ＰＥＧリンカーは、スクシンイミジル部分と置換され得る。これらのリンカーとしては、例えば、イソチオシアネート、ニトロフェニルカルボネート、エポキシドおよびベンゾトリアゾールカルボネートが挙げられる。好ましくは、条件は、反応の（ｏｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ）選択性および進行性を最大限引き出すために選択される。反応条件のこのような最適化は、当該分野における通常の技術内である。
【００７２】
ＰＥＧ化は、当該分野で公知の任意のＰＥＧ化反応によって行われ得る。例えば、Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，３：４−１０，１９９２；公開欧州特許出願第ＥＰ ０ １５４ ３１６号および公開同第ＥＰ ０ ４０１ ３８４号を参照のこと。ＰＥＧ化は、反応性のポリエチレングリコール分子（または類似の反応性の水溶性ポリマー）用いるアシル化反応またはアルキル化反応を使用して行われ得る。
【００７３】
概して、アシル化によるＰＥＧ化は、ポリエチレングリコールの活性エステル誘導体を反応させることを含む。任意の反応性ＰＥＧ分子が、ＰＥＧ化に使用され得る。好ましい活性化ＰＥＧエステルは、Ｎヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）にＰＥＧエステル化される。本明細書中で使用される場合、「アシル化」は、治療用タンパク質と水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）との間の以下のタイプの結合（ｌｉｎｋａｇｅ）を含む：アミド、カルバメート、ウレタンなど。例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０，１９９４を参照のこと。反応パラメータは、ＫＩＭ−１ポリペプチドにダメージを与えるか、または不活性化する温度、溶媒、ｐＨの条件を回避するように選択されるべきである。
【００７４】
好ましくは、連結する結合は、アミドである。好ましくは、生じる生成物のうちの少なくとも９５％は、モノＰＥＧ化、ジＰＥＧ化、またはトリＰＥＧ化である。しかしながら、高度のＰＥＧ化を有するいくつかの種は、使用される特定の反応条件に依存する量で形成され得る。必要に応じて、精製ＰＥＧ化種は、従来の精製法（例えば、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび電気泳動を含む）によって、混合物（特に未反応種）から分離される。
【００７５】
アルキル化によるＰＥＧ化は、概して、還元剤の存在下で、ＰＥＧの末端のアルデヒド誘導体をＫＩＭ−１と反応させる工程を包含する。さらに、反応条件を操作して、実質的にＫＩＭ−１のＮ末端のα−アミノ基だけのＰＥＧ化を支持し得る（すなわち、モノ−ＰＥＧ化タンパク質）。モノ−ＰＥＧ化またはポリ−ＰＥＧ化のいずれかの場合においても、ＰＥＧ基は、好ましくは、−ＣＨ２−ＮＨ−基を介して、タンパク質に結合される。−ＣＨ２−基に特に関連して、このタイプの結合は、「アルキル」結合として公知である。
【００７６】
モノ−ＰＥＧ化産物を生産するため還元アルキル化を介した誘導体化は、誘導体化に利用可能な異なるタイプの第１級アミノ基（リジン対Ｎ末端）の差次的な反応を利用する。この反応は、リジン残基のε−アミノ基とこのタンパク質のＮ末端残基のα−アミノ基との間のｐＫａの差を利用するｐＨで行われる。このような選択性の誘導体化によって、アルデヒドのような反応基を含む水溶性ポリマーのタンパク質への付着は、制御される：ポリマーとの結合は、主にタンパク質のＮ末端で起こり、他の反応基（例えば、リジン側鎖アミノ基）の大きな改変は起きない。
【００７７】
アシル化アプローチおよびアルキル化アプローチの両方で使用されるポリマー分子は、上記に記載されるような水溶性ポリマーから選択され得る。この選択されるポリマーは、単一の反応基（例えば、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒド）を有するように修飾されるべきであり、好ましくは、これにより、ポリマー化度は、本方法で提供されるように、制御され得る。例示的な反応性ＰＥＧアルデヒドは、水に対して安定であるポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドであるか、またはこのモノＣ１−Ｃ１０アルコキシ誘導体もしくはモノＣ１−Ｃ１０アリールオキシアリールオキシ誘導体（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）である。このポリマーは、分枝状または非分枝状であり得る。アシル化反応について、選択されるポリマーは、単一の反応性エステル基を有するべきである。還元アルキル化について、選択されるポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有すべきである。概して、水溶性ポリマーは、天然に存在するグリコシル残基から選択され得る。なぜなら、これらの水溶性ポリマーは、通常、哺乳動物組換え発現系によってより都合よく作製されるからである。
【００７８】
ＰＥＧ化ＫＩＭ−１を調製するための方法は、概して、（ａ）分子が一以上のＰＥＧ基に結合される条件下で、ＫＩＭ−１タンパク質またはＫＩＭ−１ポリペプチドをポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステル誘導体または反応性アルデヒド誘導体）と反応させる工程および（ｂ）反応生成物を得る工程を包含する。概して、アシル化反応についての最適な反応条件は、公知のパラメータおよび所望の結果に基づき、個別的に決定される。例えば、ＰＥＧ：タンパク質の比が大きくなるほど、ポリ−ＰＥＧ化産物の割合は大きくなる。
【００７９】
モノ−ポリマー／ＫＩＭ−１の実質的に同種の集団を実質的に産生するための還元アルキル化は、（ａ）ＫＩＭ−１のアミノ末端のα−アミノ基の選択的改変を可能にする（ｐｅｎ−ｎｉｔ）適したｐＨで、還元アルキル化条件下においてＫＩＭ−１ポリペプチドを反応性ＰＥＧ分子と反応させる工程；および（ｂ）反応生成物を得る工程を包含する。
【００８０】
モノ−ポリマー／ＫＩＭ−１ポリペプチドの実質的に同種の集団について、還元アルキル化反応条件は、水溶性のポリマー部分のＫＩＭ−１のＮ末端への選択的結合を可能にする条件である。このような反応条件は、概して、リジンアミノ基とＮ末端のα−アミノ基との間のｐＫａの差を提供する（ｐＫａは、アミノ基の５０％がプロトン化され、５０％はプロトン化されないｐＨである）。このｐＨはまた、使用されるタンパク質に対するポリマーの比に影響する。概して、ｐＨが低い場合、タンパク質に対して大過剰のポリマーが所望される（すなわち、Ｎ末端のα−アミノ基がより小さい反応性になるほど、最適条件を達成するためにより多くのポリマーが必要とされる）。ｐＨが高い場合、ポリマー：タンパク質の比は、それほど大きくなくてよい。（なぜなら、より反応性の高い基が利用可能なので、より少ないポリマー分子が必要とされるからである）。本発明のために、好ましいｐＨは３〜９の範囲であり、より好ましくは、３〜６の範囲である。
【００８１】
ＫＩＭ−１ポリペプチドは、タグ（例えば、タンパク分解によって、後で放出され得る部分）を含み得る。従って、リジン部分は、初めに改変されるＨｉｓタグを、リジンおよびＮ末端の両方と反応するトラウト試薬（Ｔｒａｕｔ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｐｉｅｒｃｅ）のような低分子量リンカーと反応させ、次いで、このｈｉｓタグを放出することによって選択的に改変され得る。次いで、このポリペプチドは、チオール反応性ヘッド基（例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基または遊離のＳＨもしくは保護ＳＨ）を含むＰＥＧで選択的に改変され得る改変のＳＨ基を含む。
【００８２】
トラウト試薬（Ｔｒａｕｔ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔ）は、ＰＥＧ結合のための特異的部位を設置する任意のリンカーで置換され得る。一例として、トラウト試薬（Ｔｒａｕｔ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔ）は、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡまたはＳＡＴＰ（全てＰｉｅｒｃｅから市販）で置換され得る。同様に、このタンパク質を、マレイミド基を挿入するアミン反応性リンカー（例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ，ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳまたはＧＭＢＳ）、ハロアセテート基を挿入するアミン反応性リンカー（ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ）またはビニルスルホン基を挿入するアミン反応性リンカーと反応させ得、そして、結果生じる生成物を遊離のＳＨを含むＰＥＧと反応させ得る。使用されるリンカーの大きさの唯一の限定は、リンカーがＮ末端タグの後での除去をブロックし得ないことである。
【００８３】
いくつかの実施形態において、ポリアルキレングリコール部分は、ＫＩＭ−１ポリペプチドのシステイン基にカップリングされる。カップリングは、例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基およびチオール基を利用してもたらされ得る。
【００８４】
必要に応じて、ＫＩＭ−１ポリペプチドは、不安定な結合を介してポリエチレングリコール部分に結合体化される。この不安定な結合は、例えば、生化学的加水分解、タンパク質分解またはスルフヒドリル切断において、切断され得る。例えば、この結合は、インビボでの（生理的）条件下において、切断され得る。
【００８５】
この反応は、反応基がＮ末端のαアミノ基上にある場合、好ましくは、約ｐＨ ５〜８（例えば、ｐＨ ５、６、７または８）で、生物学的活性物質を不活性ポリマーと反応させるために使用される任意の適した方法によって起こり得る。概して、このプロセスは、活性化ポリマーを調製する工程およびこの後に、タンパク質をこの活性化ポリマーと反応させ、処方物にとって適した可溶性タンパク質を産生する工程を包含する。
【００８６】
ＫＩＭ−１ポリペプチド上の一以上の部位が、ポリマーにカップリングされ得る。例えば、一つか、二つか、三つか、四つか、または五つのＰＥＧ部分が、ポリペプチドに結合され得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、アミノ末端に結合される。
【００８７】
（抗ＫＩＭ−１抗体）
本発明に従って使用される抗ＫＩＭ−１抗体またはその抗原結合性フラグメントは、種々のタイプの分子の任意のものであり得、この種々のタイプの分子としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆｄフラグメント、ｄＡｂフラグメント、および相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
本明細書中で使用される場合：Ｆｄは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるフラグメントを意味し；Ｆｖは、抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるフラグメントを意味し；そしてｄＡｂはＶＨドメインからなるフラグメントを意味する（Ｗａｒｄら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）。本明細書中で使用される場合、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬ領域およびＶＨ領域が、これらを一本鎖タンパク質鎖としての作製を可能にする合成リンカーを介して対形成されて一価の分子を形成する抗体を意味する（Ｂｉｒｄら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３）。本明細書中で使用される場合、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、短すぎて同一鎖上の二つのドメイン間で対形成できないリンカーを用いて、従ってこれらのドメインを、別の鎖の相補的なドメインと対形成させ、そして二つの抗原結合部位を作製して、一本ポリペプチド鎖で発現される二重特異性抗体を意味する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８；およびＰｏｌｊａｋら，１９９４，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３を参照のこと）。
【００８９】
概して、抗体を得るための適用可能な方法は、当該分野で公知である。抗ＫＩＭ−１抗体の作製にとって有用な方法および材料の概説については、例えば、Ｈａｒｌｏｗら，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｙｅｌｔｏｎら，１９８１，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５０：６５７−８０．；ならびにＡｕｓｕｂｅｌら，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ）を参照のこと。抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合特性は、種々の従来の方法（例えばラジオイムノアッセイ、免疫ブロットアッセイおよびＥＬＩＳＡ）の任意のもの利用して、当業者によって決定され得る。本発明の抗体を産生するための他の適した技術は、インビトロでのＫＩＭ−１ポリペプチドへのリンパ球の暴露、またはファージベクターまたは同様のベクターにおける抗体ライブラリーのスクリーニングを包含する。例えば、Ｈｕｓｅら，１９８９．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１を参照のこと。
【００９０】
（ベクター）
本発明は、ＫＩＭ−１ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを提供する。ベクターおよび本発明の核酸が作動可能に連結される発現制御配列の選択は、所望の機能的特性（例えば、タンパク質発現、および形質転換される宿主細胞）に依存する。本発明のベクターは、ｒＤＮＡ分子に含まれる構造遺伝子の複製または宿主染色体内への挿入、そして好ましくはまた、発現も指向することを少なくとも可能であり得る。
【００９１】
作動可能に連結されるコード配列の発現を調節することにとって有用な発現制御エレメントは、当該分野において公知である。例としては、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、および他の調節性エレメントが挙げられるが、これらに限定されない。誘導性プロモーターが使用される場合、誘導性プロモーターは、例えば、宿主細胞培地における栄養状態の変化、または温度変化によって、制御され得る。
【００９２】
ベクターは、原核生物レプリコン（すなわち、原核生物の宿主細胞（例えば、ＤＮＡ配列で形質転換される細菌宿主細胞）において、染色体外性の組換えＤＮＡ分子の自律複製および維持を指向する能力を有するＤＮＡ配列）を含み得る。このようなレプリコンは、当該分野において周知である。さらに、原核生物レプリコンを含むベクターはまた、遺伝子の発現が、検出可能なマーカー（例えば、薬剤耐性）をもたらす上記遺伝子を含み得る。代表的な薬剤耐性遺伝子は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対して耐性をもたらす遺伝子である。
【００９３】
原核生物レプリコンを含むベクターは、細菌宿主細胞において、コード遺伝子配列の発現を指向するための原核生物プロモーターまたはバクテリオファージプロモーターをさらに含み得る。細菌宿主に適合性のプロモーター配列は、代表的に、本発明のＤＮＡセグメントの挿入に都合のよい制限部位を含むプラスミドベクター内で提供される。このようなベクタープラスミドの例は、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ｐＰＬおよびｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。任意の適した原核生物宿主は、本発明のタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を発現するために使用され得る。
【００９４】
真核生物細胞発現ベクターは、当該分野で公知であり、そして市販されている。代表的に、このようなベクターは、所望のＤＮＡセグメントの挿入に都合のよい制限部位を含む。例示的なベクターとしては、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ），ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），ｐＴＤＴｌ（ＡＴＣＣ ３１２５５）が挙げられる。
【００９５】
真核生物細胞発現ベクターはまた、選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子）を含み得る。好ましい薬剤耐性遺伝子は、ネオマイシン耐性（すなわち、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１））をもたらす。
【００９６】
抗体または抗体フラグメントを発現するために、部分的な軽鎖および重鎖、または全長の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは、発現ベクター内に挿入される。発現ベクターとしては、プラスミド、レトロウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来のエピソームなどが挙げられる。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞に適合性であるように選択される。抗体の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子は、別々のベクター内に挿入され得る。いくつかの実施形態において、両方の遺伝子は、同一の発現ベクター内に挿入される。
【００９７】
都合のよいベクターは、機能的に完全なヒトのＣＨ免疫グロブリン配列またはＣＬ免疫グロブリン配列をコードするベクターである。好ましくは、制限部位は操作されて、それにより、上記に記載されるように、任意のＶＨまたはＶＬ配列が容易に挿入され得、そして発現され得る。このようなベクターにおいて、スプライシングは、挿入されたＪ領域のスプライシングドナー部位とヒトＣ領域の前にあるスプライシングアクセプター部位との間で通常起こし、ヒトＣＨエキソン内に生じるスプライス領域にもまた生じる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域下流の天然の染色体部位で起こる。組換え発現ベクターはまた、宿主細胞から抗体鎖の分泌を容易にするシグナルペプチドをコードし得る。
【００９８】
哺乳動物の宿主細胞発現のための好ましい調節配列は、哺乳動物細胞において、高レベルのタンパク質発現を指向するウイルス性エレメント（例えば、レトロウイルス性ＬＴＲ由来のプロモーターおよびエンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーターおよびエンハンサー（例えば、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーターおよびエンハンサー（例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス由来のプロモーターおよびエンハンサー（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマ由来のプロモーターおよびエンハンサーならびに強力な哺乳動物プロモーター（例えば、天然の免疫グロブリンプロモーターおよびアクチンプロモーター））を含む。ウイルス性調節エレメントおよびその配列のさらなる説明については、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉによる米国特許第５，１６８，０６２号、Ｂｅｌｌらによる同第４，５１０，２４５号およびＳｃｈａｆｆｎｅｒらによる同第４，９６８，６１５号を参照のこと。
【００９９】
組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択マーカー遺伝子を保有し得る。この選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、全てＡｘｅｌらによる米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号および同第５，１７９，０１７号を参照のこと）。例えば、代表的に、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞で、薬剤（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキセート）に対する耐性をもたらす。好ましい選択マーカー遺伝子としては、（メトトレキセート選択／増幅を用いるｄｈｆｒ−宿主細胞における使用については）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子および（Ｇ４１８選択については）ｎｅｏ遺伝子が挙げられる。
【０１００】
ＫＩＭ−１ポリペプチドおよび抗ＫＩＭ−１抗体をコードする核酸分子、ならびにこれらの核酸分子を含むベクターは、適した宿主細胞の形質転換のために使用され得る。哺乳動物細胞内への外来性ＤＮＡの導入のための方法は、当該分野において周知であり、この方法としては、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内ポリヌクレオチドの封入、および核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが挙げられる。さらに、核酸分子は、ウイルスベクターにより哺乳動物内へ導入され得る。
【０１０１】
宿主細胞の形質導入は、使用されるベクターおよび宿主細胞に適した従来の方法によって成し遂げられ得る。原核生物宿主細胞の形質転換に関しては、エレクトロポレーション法および塩処理法が使用され得る（Ｃｏｈｅｎら，１９７２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２１１０−２１１４）。脊椎動物細胞の形質転換に関しては、エレクトロポレーション法、カチオン性脂質または塩処理法が使用され得る。例えば、Ｇｒａｈａｍら，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６−４６７；Ｗｉｇｌｅｒら，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１３７３−１３７６）を参照のこと。
【０１０２】
宿主細胞は、原核生物か、または真核生物であり得る。好ましい真核生物宿主細胞としては、酵母および哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。有用な真核宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ６１）、ＮＩＨ Ｓｗｉｓｓマウス胚細胞ＮＩＨ−３Ｔ３（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１６５８）、およびベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）が挙げられる。発現用の宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該分野で公知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から市販される多くの不死化細胞株を含む。これらとしては、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝臓癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、および多くの他の細胞株が挙げられる。
【０１０３】
産生細胞株からのポリペプチドの発現は、公知技術を利用して向上され得る。例えば、グルタミン合成酵素（ＧＳ）系は、通常、特定の条件下で発現を向上するために使用される。例えば、欧州特許第０２１６８４６号、同第０２５６０５５号、および同０３２３９９７号ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号を参照のこと。
【０１０４】
（処方物）
ＫＩＭ−１ポリペプチド、抗ＫＩＭ−１抗体、または抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントを含有する組成物は、適した薬学的に受容可能なキャリアを含有し得る。例えば、これらの組成物は、作用部位への送達のために設計された調製物内への活性化合物の加工を容易にする賦形剤および／または助剤を含有し得る。非経口投与のための適した処方物としては、水溶性形態における活性化合物の水溶液（例えば、水溶性塩）を含む。さらに、適切な油性注射懸濁液としての活性化合物の懸濁液が投与され得る。適切な親油性溶媒または親油性ビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド）が挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘性を増大させる物質を含み得、これらの物質は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよびデキストランを含む。必要に応じて、懸濁液はまた、安定剤を含み得る。リポソームはまた、本発明の分子を細胞または間質領域内へ封入するために使用され得る。例示的な薬学的に受容可能なキャリアとしては、生理学的に適合性溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなどが挙げられる。いくつかの実施形態において、組成物は等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール）、ソルビトール、塩化ナトリウム）を含有する。いくつかの実施形態において、組成物は、薬学的に受容可能な物質（例えば、潤滑性物質または少量の補助物質（例えば、潤滑剤または乳化剤）、防腐剤または緩衝液を含み、これらは活性成分の有効期間または有効性を向上させる。
【０１０５】
本発明の組成物は、種々の形態であり得、この形態としては、例えば、液体の、半流動性のおよび固形の投薬形態（例えば、液体溶液（例えば、注射液および輸液）、分散系または懸濁液）が挙げられる。好ましい形態は、投与の意図する様態および治療用途に依存する。いくつかの実施形態において、組成物は、注射液または輸液（例えば、ヒトの受動免疫のために使用されるものに類似した組成物）の形態である。
【０１０６】
この組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散系、リポソーム、または高薬剤濃度に適した他の規則構造として処方され得る。滅菌注射液は、必要量の活性成分を、適切な上記で列挙された成分の一つまたは組み合わせを有する溶媒内へ組み込み、必要な場合は続いて濾過滅菌することによって調製され得る。概して、分散系は、活性成分を、基本分散媒および上記で列挙された成分由来の必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル内へ組み込むことによって調製される。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、この事前に濾過滅菌溶液から、活性成分ならびに任意のさらなる所望の成分の粉末を得る真空乾燥および凍結乾燥であり、溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーディングの使用、分散の場合における必要な特定サイズの維持および界面活性物質の使用によって維持され得る。注射組成物の長期吸収は、組成物内に吸収を遅延する薬剤（例えば、モノステアレート塩およびゲラチン）を含有することによって、もたらされ得る。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、活性成分は、制御開放処方またはデバイスを用いて処方される。このような処方およびデバイスの例としては、移植、経皮貼布、およびマイクロカプセル化送達システムが挙げられる。生分解性、かつ生体適合性ポリマーが使用される（例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）。このような処方およびデバイスの調製のための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９７８，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，（編），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。
【０１０８】
補充性活性化合物もまた、組成物内に組み込まれ得る。いくつかの実施形態において、ＫＩＭ−１ポリペプチド、抗ＫＩＭ−１抗体またはこのフラグメントは、第二の免疫調節剤（例えば、ＢＡＦＦ−Ｒ−Ｉｇ、ＬＴβ−Ｒ−Ｉｇ、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、抗ＣＤ４０Ｌ、または抗ＣＤ２０モノクローナル抗体）とともに同時投与される。
【０１０９】
投薬レジメンは、最適の所望の反応を提供するように調整され得る。例えば、単回の大量瞬時投与（ｂｏｌｕｓ）は、投与されてもよく、数回の分割用量は、時間をかけて投与されてもよく、また用量は、治療状況の緊急性によって示されるように、比例的に減少しても、上昇してもよい。投与の容易さのための投薬単位形態において非経口的組成物を処方することは都合がよく、そして本明細書中使用される場合の投薬単位形態の均一性は、処置される哺乳動物の被験体についての単回投薬として適した物理的に不連続の単位を意味し、各単位は必要とされる薬学的キャリアに関連して所望の治療効果を生じるように計算された活性化合物の所定量を含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、ＫＩＭ−１ポリペプチドのための治療的有効用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。いくつかの実施形態おいては、治療的有効用量は、０．５〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲である。いくつかの実施形態おいては、治療的有効用量は、１．０〜１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約５ｍｇ／ｋｇ）の範囲である。治療的有効用量の決定はまた、インビトロで、適切な（治療的）時間にわたって、標的細胞（変性剤に依存性のＫＩＭ−１陽性細胞またはＫＩＭ−１レセプター陽性細胞）をコーティングするために必要な変性剤の濃度を測定するインビトロ実験を行うことによって評価され得る。ＦＡＣＳおよびＥＬＩＳＡレセプター−リガンド結合アッセイは、細胞コーティング反応をモニターするために使用され得る。このようなインビトロでの結合アッセイの結果に基づき、適した変性剤濃度の範囲が選択され得る。
【０１１１】
本発明の分子は、薬学的に受容可能な無毒の賦形剤またはキャリアとの混合によって薬学的組成物内に処方され得る。このような組成物は、特に、液体溶液または液体懸濁液の形態で、非経口投与での使用のために調製され得る。この組成物は、単位用量形態で投与され得、そして任意の適した方法によって調製され得る。このような方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９８０）を参照のこと。
【０１１２】
液体投薬形態としては、薬学的に受容可能な溶液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、および懸濁液が挙げられる。活性化合物に加えて、この液体投薬形態は、水、エチルアルコール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタン脂肪酸エステル、およびこれらの混合物を含む不活性成分を含み得る。
【０１１３】
注射用貯蔵処方物は、生分解性ポリマー（例えば、ポリ乳酸−ポリ糖脂質）において、薬物のマイクロカプセル化マトリックスを形成することによって作製され得る。ポリマーに対する薬剤の比、使用されるポリマーの性質に依存して、薬剤放出の速度は、制御され得る。他の例示的な生分解性ポリマーとしては、ポリオルトエステルおよびポリ無水物が挙げられる。貯蔵注射用処方物はまた、薬剤をリポソーム、または体組織に適合性のマイクロエマルジョン内に閉じ込めることによって調製され得る。
【実施例】
【０１１４】
本発明は、以下の実施例により示される。これらの実施例は、例示的な目的のためだけに提供されるのであって、決して本発明の範囲または内容を限定するものとして解釈すべきでない。
【０１１５】
（実施例１：ヒトＫＩＭ−１細胞外ドメイン−Ｆｃ構築物（ｐＨＩ１０５））
ヒトＫＩＭ−１の細胞外ドメイン（残基１〜２９０）をヒトＩｇＧ１（ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３）Ｆｃ部分に融合し、そしてｐＥＡＧ３４７（Ｂｉｏｇｅｎ哺乳動物発現プラスミド）内へクローン化した。このプラスミドは、構成的発現のための直列型プロモーターおよび安定的に発現する細胞株のメトトレキセート選択のためのジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含んでいた。このコードされた融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりであった：
【０１１６】
【表１】
このシグナル配列を下線で示す。Ｆｃヒンジを囲みで示す。
【０１１７】
（実施例２：ヒトＫＩＭ１ＥＣＤｍｕｃｉｎΔ−Ｆｃ（ｐＨＩ１００））
ヒトＩｇＧ１（ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３）のＦｃ部分に融合したヒトＫＩＭ−１の残基１〜１２９をコードするＤＮＡをｐＥＡＧ３４７（構成的発現のための直列型プロモーターおよび安定的に発現する細胞株のメトトレキセート選択のためのジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含むＢｉｏｇｅｎ哺乳動物発現プラスミド）内にクローン化した。このコードされた融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりであった：
【０１１８】
【表２】
（実施例３：ヒトＫＩＭ１ＥＣＤ−６×Ｈｉｓ（ｐＶＢ６０２））
ヒトＫＩＭ−１の細胞外ドメイン（残基１〜２９０）を、６個のヒスチジン残基の繰り返しを含む短いＣ末端ペプチド［ＶＥＨＨＨＨＨＨ］に融合し、ｐＣＡ１２５（哺乳動物細胞における一過性構成的発現のためのＣＭＶプロモーターを含むＢＩＯＧＥＮ哺乳動物発現プラスミド）内にクローン化した。このコードされた融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりであった：
【０１１９】
【表３】
（実施例４：マウスＫＩＭ−１−Ｆｃ融合物）
ＮｏｔＩ部位およびＳａｌＩ部位に隣接したマウスｋｉｍ−１のＰＣＲ増幅外部ドメインを（ＳａｌＩ−ＮｏｔＩフラグメントとしてＥＡＧ４０９から単離した）ヒトＩｇＧ１Ｆｃに融合し、Ｅｂｎａ２９３細胞発現ベクターＣＨ２６９内にクローン化し（構築物ＰＥＭ０７３−６）、およびＣＨＯ細胞発現ベクターｐＶ９０内にクローン化した（構築物ＰＥＭ０７８−１）。ＳａｌＩ部位は、ｋｉｍ１とＦｃとの間の接合部にある。融合タンパク質についてのＯＲＦの得られるヌクレオチド配列は、以下のとおりであった（大文字はＳａｌＩ部位）：
【０１２０】
【表４】
ｍｕｋｉｍ−１外部ドメイン−ヒトＦｃの翻訳配列は、以下のとおりであった。ＳａｌＩにより生じる二つの接合アミノ酸を太字で示す：
【０１２１】
【表５】
（実施例５：マウスＳＲＢＣモデルにおけるＫＩＭ−１−Ｆｃ融合物）
ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）に対するげっ歯類の免疫応答は、コンピテントＴ細胞のＡＰＣおよびＢ細胞との相互作用に依存する。従って、抗ＳＲＢＣ反応は、リンパ球およびＡＰＣ上の細胞性タンパク質が免疫応答の発生および成熟に果たす役割を検査するための有用なモデルである。マウスにおける抗ＳＲＢＣ反応は、ＩｇＭおよび種々のＩｇＧアイソタイプ（高レベルのＩｇＧ１アイソタイプを含み、同様に見られるかなりのレベルのＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂも伴う）の産生からなる。ＩｇＧ１は、Ｔｈ２媒介性免疫応答によって誘導されるアイソタイプであると考えられ、Ｔｈ２媒介性免疫応答は、Ｉｌ−４、Ｉｌ−５、およびＩｌ−１３のようなサイトカインの発現によって特徴付けられる。ＩｇＧ２ａアイソタイプおよびＩｇＧ２ｂアイソタイプは、Ｔｈ１誘導性）免疫応答により特徴的なものであり、Ｉｌ−１２の発現と関連がある。最後に、ＩｇＧ３アイソタイプは、Ｔ細胞非依存性免疫応答に典型的なものである。４つの全てのアイソタイプは抗ＳＲＢＣ反応において表される。
【０１２２】
抗ＳＲＢＣ反応の経過を、Ｔ細胞におけるＫＩＭ−１依存性活性を妨害するようにマウスＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質（ｍＫＩＭ−１−Ｉｇ）で処置したマウスにおいて追った。マウスを抗原投与前日（Ｄ−１）に１５０μｇｓ／マウスｍＫＩＭ−１−Ｉｇを用いて処置し、０日目に１００μｌのＰＢＳ中１０％溶液のＳＲＢＣ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｅｒｕｍ Ｃｏｍｐａｎｙ）で抗原投与し、次いで３日目および６日目に１５０μｇのｍＫＩＭ−１−Ｉｇを用いて再度処理した。マウスを、免疫後、７日目、１４日目、２１日目、および３０日目に血清サンプル用に採血し、抗ＳＲＢＣ抗体力価を、赤血球凝集アッセイを用いて測定した。このアッセイは、（ＩｇＭについて）抗体の五量体構造または（Ｉｇクラスについて）第三の種の抗イディオタイプ抗血清の存在に基づきＳＲＢＣを架橋し、そしてクラスター形成する（「凝集」（ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｅ））抗体の能力に依存した。
【０１２３】
簡潔には、プロトコールは以下のとおりであった。血清サンプルを、測定するアイソタイプに依存して適切なように（１：１５〜１：２００）希釈し、次いで反応の日に、Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）＃３７９５）から購入した９６ウェルアッセイプレートを用いて１：２工程で力価測定した。ＩｇＭアッセイについては、この血清サンプルを二連でアッセイした。グルコース−ＰＢＳ（Ｇ−ＰＢＳ）中の２５μｌの１０％ＳＲＢＣをウェルに加え、そして凝集反応を、３７℃１時間にわたり展開した。Ｉｇアッセイについて、血清サンプルを三連でプレート内にロードし、希釈した。Ｇ−ＰＢＳ中に希釈した２５μｌの１％２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）を各血清サンプルの一連に加え、次いでこのプレートを３７℃で３０分にわたりインキュベートした。これは、ＩｇＭ五量体を一緒に保持する全てのジスルフィド結合を破壊し、従って任意のＩｇＭ骨格をなくすためになされた。次いで２５μｌのＧ−ＰＢＳ中１０％ＳＲＢＣおよび２５μｌの抗イディオタイプ抗血清（ヤギ抗マウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、またはＩｇＧ３（全てＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓより））のＧ−ＰＢＳ中１：２５０希釈を各三連の初めの２連に加え、サブタイプが存在する抗ＳＲＢＣ ＩｇＧを架橋した。各三連の第三のウェルを未架橋のままにし、２−メルカプトエタノール処理を逃れ得た任意の残存ＩｇＭ活性についてのコントロールとして供した。このプレートを３７℃で１時間にわたりインキュベートした。全てのアッセイプレートを４℃一晩放置し、記録および撮影する前に生じた赤血球凝集を安定化した。全ての力価を陽性の赤血球凝集読み出し（ｒｅａｄｏｕｔ）を生じる最後の希釈として記録した。
【０１２４】
ｍＫＩＭ−１−Ｉｇ処理の抗ＳＲＢＣ反応に対する効果をＳＲＢＣで抗原投与していないか、またはＳＲＢＣで抗原投与したが、抗ＣＤ４０Ｌ、非特異的ポリクローナルｈＩｇＧ、もしくはＰＢＳで投与したマウスのコントロール群と比較した。非抗原投与および抗ＣＤ４０Ｌ処置したマウスは、予想どおり抗ＳＲＢＣ反応を有さなかった。ＳＲＢＣが与えられたマウスおよびＰＢＳまたはｈＩｇＧのいずれかで投与されたマウスは試験されたＩｇの全てのクラスに対する強い抗体力価を有した。対照的にｍＫＩＭ−１−Ｉｇで処置されたマウスは、ＩｇＧ１抗ＳＲＢＣアイソタイプにおいて非常に著しいかつ特異的欠陥を有した。Ｂａｌｂ／ｃ系統のマウスを使用した２つの非依存性実験において、著しく欠陥的レベルのＩｇＧ１抗ＳＢＲＣを検出した（図３および図４）。抗ＳＲＢＣ反応の誘導７日後、ＩｇＧ１力価は、コントロール処置マウスよりｍＫＩＭ−１−Ｉｇ処置マウスにおいて平均して７０％低かった。抗ＳＲＢＣ反応の誘導１４日後まで、ＩｇＧ１力価は、８５％を超えるまで減少した。同様の欠陥は、Ｃ５７Ｂｌ／６系統のマウスを用いた１つの実験において観察された（図５）。Ｂａｌｂ／ｃマウスおよびＣ５７Ｂｌ／６マウスを、これらの免疫応答において異なる傾向を有し、Ｂａｌｂ／ｃマウスは、主にＴｈ２媒介性応答を有するとして特徴づけられ、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスでは、Ｔｈ１媒介性応答を有すると考えられた。従って、これらのマウス系統において、マウスＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質のＩｇＧ１アイソタイプ産生をブロックする能力により、系統における固有のＴｈ傾向は無効にされた。驚いたことに、ｍＫＩＭ−１−Ｉｇ処置の効果は、第二の応答まで拡大し、そのため、ＩｇＧ１は、後のＳＲＢＣ抗原投与に応答して、記憶Ｂ細胞によって産生されなかった（図６および図７）。
【０１２５】
（実施例６：移植片対宿主病（ＧＶＨＤ））
ＧＶＨＤは、Ｆ１への親の細胞移植レジメンを使用して、マウスでモデルとされる。マウスのＤＢＡ２系統由来の脾細胞を（ＤＢＡ２×Ｃ５７Ｂｌ／６）Ｆ１マウス（Ｂ６Ｄ２Ｆ１と呼ばれる）にｉｖで注射する。この注射した脾細胞は移植片を構成し、そしてＤＢＡ２マウスは、その移植片のドナーである。移植片を受けるＦ１マウスは、宿主である。移植片に存在するドナーＴ細胞は、宿主細胞上の半分のＭＨＣマーカー（ハプロタイプ）を外来として認識する。なぜなら、他（Ｃ５７Ｂｌ／６親）に由来するからである。これは、宿主が生じるＧＶＨＤに対するドナーＴ細胞応答を誘導する。ＤＢＡ／２親の脾細胞をＢ６Ｄ２Ｆ１宿主内に注射する場合、慢性ＧＶＨＤが発生する。対照的に、Ｃ５７Ｂｌ／６脾細胞をＢ６Ｄ２Ｆ１宿主内に注射する場合、急性ＧＶＨＤが発生する。根底にあるどの機構が、これらの２種の注射プロトコールを使用する、異なる疾患結果の原因であるかは、不明のままであるが、ＤＢＡ／２脾細胞移植片内に含まれる細胞によって発現されるサイトカインが慢性ＧＶＨＤの発生を支持し、一方でＣ５７Ｂｌ／６脾細胞移植片内に含まれる細胞によって発現されるサイトカインは急性ＧＶＨＤの発生を支持すると考えられている。Ｔ細胞の抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞：ＡＰＣ）との相互作用を妨害する試薬は、急性と慢性の両方のＧＶＨＤを効率的にブロックする。
【０１２６】
ＫＩＭ−１アンタゴニストは、慢性ＧＶＨＤのマウスモデルにおける免疫学的反応の発達を改変する。慢性ＧＶＨＤをブロックする能力としては、Ｂ細胞活性化およびＢ細胞増殖に対する効果、ならびに分泌ＩｇＧの産生に対する効果が挙げられる。マウスをＫＩＭ−１アンタゴニストまたは改変薬剤、コントロール処置物で腹腔内に（ｉｐ）処置するか、未処置のままにする。４時間後、マウスにＤＢＡ／２マウスから単離した１×１０８個の脾細胞を、静脈内（ｉｖ）に０．５ｍｌの注射を与える。このｉｖ注射されたＤＢＡ／２の脾細胞は、同種移植片を構成していた。移植の２日後、４日後、および６日後に、マウスをＫＩＭ−１アンタゴニストもしくは改変薬剤、またはコントロール処置物で再度処置した。マウスのさらなるコントロール群に、１×１０８個のＢ６Ｄ２Ｆ１脾細胞を受けさせたが、この脾細胞によってＢ６Ｄ２Ｆ１レシピエントにおける疾患は誘導できなかった。あるいは、移植したＢ６Ｄ２Ｆ１マウスおよび未処置のＢ６Ｄ２Ｆ１マウスをコントロールとして使用する。移植の１４日後、このマウスを屠殺し、疾患の証拠ために検査する。
【０１２７】
未処置の移植片レシピエントマウスは、慢性ＧＶＨＤの発生を示す種々の症状を発症する。脾腫大すなわち脾臓の拡大は、ドナーＴ細胞および宿主Ｂ細胞が活性化され、そして細胞数の劇的な増加とともにポリクローナル拡大を起こすことを証明する。サブセットのＢ細胞上のＣＤ６９のような細胞表面タンパク質の出現は、Ｂ細胞の活性化を示す。ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞由来のＬ−セレクチン分子の減少は、Ｔ細胞の活性化の証拠である。血清中へかまたはインビトロでの細胞培養アッセイにおけるＩｇ分子（例えば、ＩｇＧクラス、ＩｇＡクラス、およびＩｇＥクラス）の分泌は、Ｂ細胞が活性化し、そしてＢ細胞のＩｇクラスをスイッチング（ｓｗｉｔｃｈ）したことを示す。この点に関して、血清中またはインビトロでの細胞培養アッセイにおける抗自己Ｉｇの出現は、産生されているＩｇが不適切な自己抗原認識を有することを示す。最終的に、生存率を異なる処置レジメンの結果として測定し得る。ＫＩＭ−１アンタゴニスト（例えば、ＫＩＭ−１−Ｉｇ）を用いる処置は、脾腫大の程度の縮小、リンパ球集団のポリクローナル拡大における縮小、リンパ球活性化を示す細胞表面マーカーの出現または消滅における低下、Ｉｇ分泌の低下、および／または死亡率における低下によって示されるような、慢性ＧＶＨＤの発生のこれらの読み出しを、ブロックする。
【０１２８】
本発明者らは、コントロールマウスを未処置の同種移植片レシピエントマウスと比較して、ＧＶＨＤの際の脾腫大、Ｂ細胞活性化、およびのＩｇ分泌の程度を検査する。抗ＣＤ４０Ｌ ｍＡｂ ＭＲ１をこれらの実施例において陽性コントロールとして使用する。なぜならＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０相互作用をブロックすることは、慢性ＧＶＨＤの発生を妨害する効率的手段であることが以前に示されているからである（Ｄｕｒｉｅら，１９９４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３３３−１３３８）。ＫＩＭ−１アンタゴニストを用いた処置によって影響の及んだ細胞集団を研究するために、移植片注射して１４日後のレシピエントマウスから採取した脾細胞についてＦＡＣＳ分析を行う。１群当たり３〜４匹のマウスからの脾臓細胞を単離し、プールする。レシピエントＢ細胞の活性化は、慢性ＧＶＨＤの決定的な特徴である。慢性ＧＶＨＤを起こすマウスにおいて、Ｂ２００＋ Ｂ細胞の少ないが容易に分かる集団は、活性化マーカーＣＤ６９を発現する。従って、ＣＤ６９発現を疾患の程度の指標として使用する。異なる処置群からのマウスの脾細胞の培養物における全ＩｇＧをまた決定する。なぜなら、Ｂ細胞によるＣＤ６９の発現は、これらの活性化状態を示すからである。
【０１２９】
マウスモデルにおいて、上記の疾患の発生は、Ｔｈ２サイトカインＩｌ−４に依存し、そして抗Ｉｌ−４ ｍＡｂで処置することによってブロックされ得る。このような処置は、宿主Ｂ細胞の拡大および結合する高Ｉｇ産生をブロックする。ＧＶＨＤの発生は、多くの方法において結合される。ドナーＴ細胞集団および宿主Ｂ細胞集団の拡大を脾臓指標（ｉｎｄｅｘ）によって測定し、この脾臓指標は、コントロール（非疾患）マウスに対して標準化された、体重に対する脾臓重量の比である。疾患マウスにおけるＢ細胞の活性化をＢ細胞活性化マーカーの分析を利用して測定する。最終的に、Ｂ細胞活性化の効果は、循環中（例えば、血清中）の、または疾患誘導の数週間後に採取された宿主脾細胞の培養によって産生されるＩｇのレベルにおいて見られる。疾患動物の循環Ｉｇは、抗自己抗体を含む。最終的に、疾患動物は、蓄積したＩｇ沈着による腎臓不全および他の器官不全を起こし、従って、生存率は、疾患活性に関係のある基準である。
【０１３０】
（実施例７：ＳＣＩＤ−ｈｕマウスモデル）
ＳＣＩＤ−ｈｕマウスにおいて、ヒト免疫応答を研究することが、可能である。例えば、ＳＣＩＤマウスに２〜５×１０７個のヒト末梢血単核細胞を腹腔内に注射すると、これらの細胞は、しばらくの間、腸に常駐し、かつ機能し、抗原投与に対して反応する。ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスをヒトＰＢＬで回復（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ）させると、これらのマウスは、脾臓へのヒト細胞（Ｔ、Ｂ、ＡＰＣ）の接種のさらなる利点を有し、この脾臓では、全身性の免疫応答が支持され得る。適切モデルは、Ｂｅｒｎｅｙら，２００１，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７２：１３３−１４０において議論される。免疫応答の他のモデルは、ＳＣＩＤ／ｂｅｉｇｅマウスを使用し、免疫応答のための支持を提供するためのＰＢＬまたは胎児腸間膜リンパ節を含む胎児細胞の同時移植を含む（Ｃａｒｂａｌｌｉｄｏら，２０００，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：１０３−１０６）。
【０１３１】
ＳＣＩＤ−ｈｕまたはＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ｈｕマウスをヒト破傷風（ｔｅｔａｎｕｓ）トキソイド（ＴＴ）を免疫したヒトドナーから単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）で回復させる。そのようにして回復させたＳＣＩＤ−ｈｕマウスは、種々の区画（腹膜を含む）に常駐するヒト細胞を有する。そのようにして回復させたＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ｈｕマウスは、これらの二次リンパ器官（例えば、脾臓）内に含まれる種々の区画において常駐するヒトＴ細胞を有する。ＴＴ、もしくはＴＴの抗原性部分、またはリポソーム、もしくはＴＴを含むリポソームにカップリングした抗原を用いる免疫化によって、一次免疫応答を、これらの回復させたマウスにおいて誘導する。そのようにして回復させ、抗原投与したマウスは、抗原（例えば、ＮＰ、ＤＮＰ、ＫＬＨ、ＯＶＡ、ＨＩＶｇｐｌ２０またはそれらの部分、メラノーマ関連抗原ＧＤ２、およびヒツジムチンは、多くの例のうちのいくつかにすぎない）に対する高い力価（＞１：１０００）のＩｇ応答を生じる。いくつかの例は、Ｉｆｖｅｒｓｏｎら，１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８４：１１１−１１６に示される。そのようにして回復させると、次いでＫＩＭ−１アンタゴニストまたは改変薬剤を用いて処置したマウスは、抗原投与に対する高い力価を示さない。
【０１３２】
別の方法論において、ＳＣＩＤ−ｈｕマウスを胎児ヒトの骨、胸腺、皮膚断片、および腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）を用いて回復させた。ＭＬＮの存在は、ＴＴ免疫化に対する強い免疫応答を支持するために十分である（そして、全てのドナー組織は胎児であることから、これは、厳密に一次免疫応答である）。このモデルは、Ｃａｒｂａｌｌｉｄｏら，２０００，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：１０３−１０６において詳細に議論される。ＴＴ免疫化は、ヒトリンパ球の増殖、および活性化、ならびにＢ細胞によるＩｇＭ分泌およびＩｇＧ分泌を引き起こす。ＫＩＭ−１アンタゴニストまたは改変薬剤を用いてそのようにして回復させたＳＣＩＤマウスの処置は、ヒトリンパ球の増殖および活性化、ならびにＴＴ抗原投与の際の免疫グロブリンの分泌を低下させる。
【０１３３】
これらのモデルまたは他の同様のＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ｈｕモデルもしくはＳＣＩＤ−ｈｕモデルの改変において、二次免疫応答を、例えば遅延型過敏症（ＤＴＨ）の疾患設定において測定する。この実施例において、ＴＴ抗原投与、ＴＴ−免疫個体由来のＰＢＭＣを用いて回復させたＳＣＩＤマウスまたはＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの足蹠に与え、反応における足蹠の腫脹を、測定する。ＤＴＨ反応は、回復させたマウスにおける循環中のヒト記憶Ｔ細胞の存在に依存する（ｒｅｌｙ ｏｎ）。このようなモデルもまた、「トランスビボ（ｔｒａｎｓ ｖｉｖｏ）」モデルにおいてのように、移植患者におけるドナー組織の起こり得る拒絶を検出するために使用され得る。このタイプのアプローチの例は、Ｃａｒｒｏｄｅｇｕａｓら，１９９９，Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６０：６４０−６５１において議論される。ＫＩＭ−１アンタゴニストまたは改変薬剤を用いて、そのようにして回復させたマウスの処置により、ＤＴＨ反応を防ぐ。ＳＣＩＤマウスにおけるヒト疾患反応の他のモデルは、マウスにおける自己免疫患者由来の脾細胞またはＰＢＭＣの移動を含み、それによって、これらのモデルは、疾患の免疫グロブリンおよび他のマーカーの発現を継続する（ＭａｒｔｉｎｏおよびＧｒｉｎａｌｄｉｍ １９９７，Ｉｎ：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ，第３巻Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ（編）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏを参照のこと）。患者由来の自己免疫細胞の移動前のＫＩＭ−１アンタゴニストまたは改変薬剤を用いるこれらのマウスの処置により、自己免疫病理学的な免疫グロブリンまたは他のマーカーの発現を低下する。
【０１３４】
ＳＣＩＤマウスを利用する非常に価値ある方法論は、レシピエントマウスへの疾患組織の異種移植を包含する。乾癬患者またはアトピー性皮膚炎患者由来の皮膚を移動する方法は、例えば、これらの疾患の広く使用されるモデルである。アトピー性皮膚炎は、Ｔｈ２媒介性細胞性免疫疾患であり、このＴｈ２媒介性細胞性免疫疾患は、ＰＢＭＣおよび皮膚の生検（ｂｉｏｐｓｙ）を一緒にレシピエントマウスに移動することによってＳＣＩＤマウスにおいてモデル化され得る。ＫＩＭ−１アンタゴニストまたは改変物（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）を用いるこれらのマウスの処置は、細胞性蓄積および局所的なサイトカイン分泌（これは、皮膚移植におけるリンパ球およびエフェクター細胞（好酸球、好塩基球など）の活性化の徴候（ｅｖｉｄｅｎｃｅ）である）を防ぐ。これは、ドナー患者における皮膚炎を予防における効力の徴候（ｅｖｉｄｅｎｃｅ）である。
【０１３５】
（実施例８：アトピー性疾患の他のマウスモデル）
アレルギー、喘息、気道過感受性（ＡＨＲ）、および他のアトピー性疾患の有用なモデルを、マウスにおいて使用する。例えば、アレルギー性皮膚炎症を、抗原を用いる皮膚上への感作によって誘導する。一つの例において、抗原はアルブミン（ＯＶＡ）である。この感作に対するＴｈ２応答は、皮膚における好酸球の存在、Ｔｈ２サイトカインの皮膚における局所的発現、および吸入抗原に対する気道過感受性（ＡＨＲ）によって示される。好酸球は、初めにＫＩＭ−１アンタゴニストまたは改変物を用いて処置されるＯＶＡ感作マウスの皮膚では存在せず、Ｔｈ２サイトカインのレベルは低下する。繰り返し感作されたマウスは、ＯＶＡ特異的ＩｇＥを産生し、これらの脾細胞は、ＯＶＡを用いるインビトロ刺激の後にＴｈ２サイトカインのＩＬ−４およびＩＬ−５を分泌する。Ｔｈ２免疫応答のこれらの読み出しは、ＫＩＭ−１アンタゴニストまたは改変物を用いる処置の際にブロックされる。あるいは、マウス（例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス）を、抗原のｉ．ｐ．注射で感作し得（０日目）、次いで３週間後（１回）および４週間後（３回：２６日目、２７日目、２８日目など）に鼻腔内での抗原を用いて再抗原投与し得る。これは、肺応答性亢進（ＡＨＲ）を生じ、この肺応答性亢進（ＡＨＲ）は、ＩＬ−１３のようなＴｈ２サイトカインによって媒介される。このＴｈ２免疫応答は、ＫＩＭ−１アンタゴニストまたは改変物を用いる処置の際にブロックされる。
【０１３６】
ＯＶＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックモデル（ＤＯ１１．１０）を使用して、本発明者らは、ＯＶＡ特異的免疫応答を誘導し、次いでＴｈ２ ＯＶＡ特異的Ｔ細胞を未処置のレシピエントに移し、このレシピエントを、次いでＯＶＡエアロゾルで抗原投与する。これらのマウスは、抗原特異的ＡＨＲを急速に発生する。この反応は、マウスをＯＶＡエアロゾル抗原投与の前にＫＩＭ−１アンタゴニストまたは改変物で処理する場合に、ブロックされる。
【０１３７】
メタコリンエアロゾル処置は、肺への好酸球の補充を誘導し、この補充はマウスにおけるＡＨＲを引き起こす。ＫＩＭ−１アンタゴニストまたは改変薬剤を用いるマウスの処置は、ＡＨＲの発生をブロックする。
【０１３８】
（実施例９：コラーゲン誘導性関節炎）
関節炎のこのマウスモデルにおいて、コラーゲンを使用してＴ細胞媒介性のＢ細胞活性化および自己抗体産生（これは、関節を攻撃する）を誘発し、関節リウマチに似た状態を生じる。マウスの種々の系統において、この反応は、ＩｇＧ１の高い力価によって支配される。特に、遺伝子欠損によってＩｌ−１２を欠如したマウス（Ｉｌ−１２ノックアウトマウス：Ｉｌ−１２−／−）において、ＩｇＧ１力価は非常に高く、これらのＡｂは、関節破壊を効率的に媒介する。
【０１３９】
フロイント完全アジュバント中のコラーゲンを用いて以下の２箇所で経皮内に注射によってマウスを処置する：各耳に少量の送達、および肩部の間の皮膚に少量の送達。３週間後、腹腔内経路を使用して、マウスを生理食塩水中の可溶性コラーゲンで追加免疫する。１週間以内に、関節ダメージをノギスを用いて関節の膨潤を測定することおよび抗体力価を測定することによって評価する。疾患発生の過程の際のマウスの処置は、疾患スコアを寛解させる。特に、疾患開始前日の０．１〜１ｍｇ／ｋｇのＫＩＭ−１アンタゴニストまたは改変薬剤を用いる処置、続いてその後の処置は、関節膨潤の低下および免疫グロブリン力価の低下によって評価されるように、疾患発生をブロックする。これは、処置の予防投与過程である。
【０１４０】
誘導後および追加免疫前のＫＩＭ−１アンタゴニストを用いる処置は、関節膨潤の低下および免疫グロブリン力価の低下によって評価されることから、疾患発生を寛解させる。これは、処置の治療的過程である。追加免疫注射後のＫＩＭ−１アンタゴニストまたは改変薬剤を用いる処置は、関節膨潤の低下および免疫グロブリン力価の低下によって評価されるように、疾患発生をブロックする。これは、処置の治療的過程である。
【０１４１】
（実施例１０：ループスのマウスモデル）
ＮＺＢ／Ｗモデルにおいて、ＮＺＢ系統由来のマウスをＮＺＷ系統由来のマウスと交配し、そしてこのＦ１子孫は、経時的にループス様疾患を発生する。疾患の徴候としては、自己抗体およびリウマチ因子の産生が挙げられる。腎臓におけるＩｇ沈着は、大量の産生されるＩｇおよびＲＦに起因し、尿中のタンパク尿によって測定され得るように、経時的に腎臓機能の低下をもたらす。
【０１４２】
ＮＺＢ／Ｗ Ｆ１子孫は、約５ヵ月齢で、その時点で中程度のタンパク尿スコア（ＰＵは２）を伴い、疾患の症状を表し始める。９ヵ月齢までに、このマウスは、最大ＰＵ＝４に達し、そして腎臓不全の結果として疾患になり（ｓｕｃｃｏｍｂ）始める。ＳＮＦ１（ＳＷＲ×ＮＺＢ Ｆ１交配）と呼ばれる別のモデルも同様の動態を伴う。
【０１４３】
マウスを、疾患開始の前日に０．１〜１ｍｇ／ｋｇのＫＩＭ−１アンタゴニストで処置し、続いてその後に処置する。これは、ＰＵスコア、および／または血清中免疫グロブリンの力価を測定すること、および／または脾臓における過形成の免疫組織化学的分析、および／または腎臓における糸球体の構造での免疫複合体沈着および免疫複合体変化の免疫組織化学的分析によって測定されるように、疾患発生をブロックする。
【０１４４】
疾患誘導後の（例えば、５ヵ月で、しかし重症の疾患（すなわちＰＵ＝２〜３）の前の）ＫＩＭ−１アンタゴニストを用いる処置は、疾患発生寛解させるか、または疾患ダメージを回復させる。これは、ＰＵスコア、および／または血清中の免疫グロブリンの力価を測定すること、および／または脾臓における過形成の免疫組織化学的分析、および／または腎臓における糸球体の構造での免疫複合体沈着および免疫複合体変化の免疫組織化学的分析によって測定され得る。
【０１４５】
疾患が重症（ＰＵ＝３〜４）になった後のＫＩＭ−１アンタゴニストを用いる処置は、疾患発生寛解させるか、または疾患ダメージを回復させる。これは、ＰＵスコア、および／または血清中の免疫グロブリンの力価を測定すること、および／または脾臓における過形成の免疫組織化学的分析、および／または腎臓における糸球体の構造での免疫複合体沈着および免疫複合体変化の免疫組織化学的分析によって測定され得る。
【０１４６】
（実施例１１：混合リンパ球反応（ＭＬＲ））
（マウスＭＬＲアッセイおよびＫＩＭ−１の拮抗作用）
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を、以下のとおり行った：脾臓を、滅菌技術を使用してＣ５７Ｂｌ６マウスおよびＢａｌｂ／ｃマウスから単離し、リンパ球を放出するため粗く挽き、次いで赤血球を溶解するため低張液（Ｇｅｙ’ｓ溶液）を用いて処理した。残った細胞を細胞ストレーナー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ ＵＳＡ）に通すことによって残留組織から分離し、そして、次いで滅菌かつ発熱物質なしのＰＢＳで洗浄し、そして細胞をペレット化するために遠心した。これらの細胞をＰＢＳ溶液に２度目の再懸濁し、再度ペレット化し、次いで、完全ＲＰＭＩ培地中に再懸濁した。これらの細胞をカウントし、必要に応じて希釈した。Ｂａｌｂ／ｃリンパ球を刺激細胞として使用するゆえに、これらの細胞を、使用前に３０００ＲＡＤで照射した。
【０１４７】
アッセイを確立するために、刺激細胞を、応答細胞の数（２×１０５／ウェル）に比例した種々の比でウェルに加えた。培地を、示すように、２０μｇ／ｍｌでラット抗ＫＩＭ−１抗体、またはＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質およびコントロール−Ｉｇ融合タンパク質で補填した。培養を３つの同一プレートでセットアップし、各実験条件を、１プレートあたり３ウェルで表した。１枚のプレートを使用して、ＭＴＳアッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ＵＳＡ）を使用して細胞増殖データを出した。その他のプレートを使用して、サイトカイン分析用の上清サンプルを回収した。ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ ＵＳＡ）を使用して、培養上清中のｍＩＦＮγ、ｍＴＮＦ、およびｍＩｌ−２のレベルを測定した。増殖アッセイおよびＥＬＩＳＡから生じた値についての標準誤差は、１０％未満であり、図から省略している。ＩＦＮγについてのポジティブコントロール値からの大きなずれは、注目されるが、一方で培養中のＩｌ−２およびＴＮＦのレベルは、ポジティブコントロールと処置群との間に有意に差はなかった。従って、Ｉｌ−２データおよびＴＮＦデータは省略されている；ＩＦＮγおよび細胞増殖についてのデータは、それぞれ代表的実験について示す。
【０１４８】
ラット抗マウスＫＩＭ−１ ｍＡｂの３Ａ２．５および１Ｈ９．１１を使用するＭＬＲ培養の処理により、上清中に分泌されたＩＦＮγのレベルは有意に低下した（図８）。この効果は、上清中に分泌されたＩｌ−２またはＴＮＦのレベルにおける低下は観察されなかったことから、ＩＦＮγに対して特異的であった。この効果は、細胞増殖アッセイが、培養中の生細胞の数は同程度であったことを示したことから（図９）、これらの培養における細胞数の減少によるものではなかった。
【０１４９】
ＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質を使用するＭＬＲ培養の処理により、上清中に分泌されたＩＦＮγのレベルは有意に低下した（図１０）。この効果は、上清中に分泌されたＩｌ−２またはＴＮＦのレベルにおける低下は注目されなかったことから（データは示さず）、ＩＦＮγに対して特異的であった。この効果は、細胞増殖アッセイが、ＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質で処理した培養中の生細胞の数が未処理のコントロールコントロールに非常に近かったことを示したことから（図１１）、これらの培養における細胞数の減少によるものではなかった。
【０１５０】
（ヒトＭＬＲアッセイおよびＫＩＭ−１の拮抗作用）
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を、以下のとおり行った：末梢血単核細胞を、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）勾配遠心を使用して、健常なヒトのドナーから採取した全血から単離した。次いでこの細胞を滅菌かつ発熱物質なしのＰＢＳで洗浄し、そして遠心して細胞をペレット化した。これらの細胞をＰＢＳ溶液に２度目の再懸濁し、再度ペレット化し、次いで、完全ＲＰＭＩ培地中に再懸濁した。これらの細胞をカウントし、必要に応じて希釈した。ＪＹ細胞（ＡＴＣＣ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ ＵＳＡ）を刺激細胞として使用するゆえに、これらの細胞を、使用前に１００００ＲＡＤで照射した。
【０１５１】
アッセイを確立するために、刺激細胞を、応答細胞の数（２×１０５／ウェル）に比例した種々の比でウェルに加えた。培地を、示されるように２０μｇ／ｍｌでマウス抗ＫＩＭ−１抗体で補填した。培養を３つの同一プレートでセットアップし、各実験条件を、１プレートあたり３ウェルで表した。１枚のプレートを使用して、ＭＴＳアッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ＵＳＡ）を使用して細胞増殖データを出した。その他のプレートを使用してサイトカイン分析用の上清サンプルを回収した。ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ ＵＳＡまたはＲ＋Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ ＵＳＡ）を使用して、培養上清中のｈＩＦＮγ、ｈＴＮＦ、およびｈＩｌ−２のレベルを測定した。増殖アッセイおよびＥＬＩＳＡから生じた値についての標準誤差は、１０％未満であり、図から省略している。ＩＦＮγについてのポジティブコントロール値からの大きなずれは、観察されるが、一方で培養中のＩｌ−２およびＴＮＦのレベルは、ポジティブコントロールと処置群との間に有意に差はなかった。ＴＮＦデータは省略されている；Ｉｌ−２、ＩＦＮγおよび細胞増殖についてのデータは、それぞれ代表的実験について示す。
【０１５２】
マウス抗ヒトＫＩＭ−１ ｍＡｂのＡＵＦ１およびＡＫＧ７を使用するＭＬＲ培養の処理により、上清中に分泌したＩＦＮγのレベルは有意に低下した（図１２Ａ）。この効果は、上清中に分泌したＩｌ−２またはＴＮＦのレベルにおける低下が注目されなかったことから（図１２Ｂ）、ＩＦＮγに対して特異的であった。この効果は、細胞増殖アッセイが培養中の生細胞の数は同程度であったことを示したことから（図１３）、これらの培養における細胞数の減少によるものではなかった。
【０１５３】
（実施例１２：マウス炎症性腸疾患（ＩＢＤ）モデル）
実験マウスにおけるＩＢＤのモデルにおける症状の過程または重症度に影響を及ぼす可溶型形態のＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質の能力。このモデルにおいて、ＤＳＳを、（炎症の発生を引き起こす）大腸（結腸（ｃｏｌｏｎ））を慢性的に刺激した。炎症誘発性メディエータ（例えば、ＩＦＮγ、ＴＮＦ、およびＩｌ−１２）は、マウスモデルおよびヒト患者の両方において、ＩＢＤの発生および重症度にとって重要であることは公知であった（Ｅｇｇｅｒら，２０００，Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ６２：２４０−２４８；Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅら，２０００，Ａｎｎ．Ｍｅｄ．３２：５５２−５６０；Ｂｏｕｍａら，２００３，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：５２１−５３３）。上記に記載するように、ＭＬＲデータは、ＫＩＭ−１調節が炎症誘発性メディエータ（例えば、ＩＦＮγ）の産生に影響し得ることを示唆している。従って、ＫＩＭ−１改変薬剤をインビボにおいて試験した。ＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質が、一以上のリガンドと細胞（例えば、活性化リンパ球または他の免疫細胞）上に発現したＫＩＭ−１との相互作用を妨害することによって作用しているという仮説が立てられた。
【０１５４】
ＩＢＤを、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）モデルを使用してマウスにおいて誘導した（Ｃｏｐｐｅｒら，１９９３，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９：２３８−２４９）。滅菌蒸留水中４．５％ＤＳＳ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ａｕｒｏｒａ ＯＨ ＵＳＡ）の溶液を飲用源として提供した。マウスを、ＤＳＳを導入する直前に体重測定し、その後、毎日体重測定した。またマウスを、下痢の程度について（１：柔らかいペレット、２：緩いペレット、３：明白に流体糞便、４：ひどい失調）およびＣｏｌｏＳｃｒｅｅｎスライド（Ｈｅｌｅｎａ Ｌａｂｓ，Ｂｅａｕｍｏｎｔ ＴＸ ＵＳＡ）を使用して糞便中の血液の存在について（０：なし、１：血液）記録した。少ないが、検出可能な量の血液に、０．５の中間スコアを与えた。０日目、２日目、および５日目に、２００μｇのＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質またはポリクローナルｈＩｇＧコントロール（ＳａｎｄＩｍｍｕｎｅ，Ｓａｎｄｏｚ，Ｇｅｎｅｖａ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてｉｐでマウスに投与した。８日目に、マウスからＤＳＳ水を取り除き、正常の飲用水を与えた。体重および臨床スコアについてのモニタリングを１２日目（この日の時間に実験が終了した）まで継続した。
【０１５５】
ＩＢＤの誘導局面の間（０日目、２日目および５日目）のマウスの処置により、８日目まで累積的体重減少および疾患スコアに対する有意な影響が生じた。従って、マウスからＤＳＳを取り除き、正常飲用水に戻し、これらの回復をモニターした。０日目、２日目および５日目にＫＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質を受けたマウスは、体重減少の程度（図１４）および臨床スコア（下痢および出血；図１５Ａ）によって示されるように、１１日目には、一貫してより健康であった（回復に３日）。ＫＩＭ−１−Ｉｇ処置した同齢集団におけるずっと少ないマウスは、糞便に血液が存在した（図１５Ｂ）。
【０１５６】
これらのデータは、インビボにおけるＫＩＭ−１調節が急性炎症性状態（例えば、ＤＳＳ後に腸粘膜へのダメージを示す）において防御効果を有することを示唆した。これらの結果は、ＫＩＭ−１アンタゴニストが他の急性炎症性状態または慢性炎症性状態（例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬および膵炎）において有効であることを示唆した。
【０１５７】
他の実施形態は、添付の特許請求の範囲内にある。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における免疫応答に関与するＴ細胞と第二の細胞との間のシグナル伝達を阻害する方法であって、以下：
（ａ）免疫疾患または免疫障害を有する哺乳動物および組織移植片の調整における哺乳動物からなる群から選択される哺乳動物を同定する工程；および
（ｂ）該哺乳動物に以下：（ｉ）ＫＩＭ−１ Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｉｉ）抗ＫＩＭ−１抗体；ならびに（ｉｉｉ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記第二の細胞が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｔ細胞が、活性化Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｔ細胞が、ヘルパーＴ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ヘルパーＴ細胞が、Ｔｈ２細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｔ細胞が、移植されるドナーＴ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＡＰＣが、単球、マクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＡＰＣが、自己抗原を提示している、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、さらにＫＩＭ−１ムチンドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、さらに異種部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記異種部分が、免疫グロブリン（Ｉｇ）部分、血清アルブミン部分、標的部分、レポーター部分および精製容易化部分からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記異種部分が、Ｉｇ部分である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｉｇ部分が、Ｆｃ部分である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、ポリマーに結合体化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリマーが、ポリアルキレングリコール、糖ポリマーおよびポリペプチドからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリマーが、ポリアルキレングリコールである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリマーの平均分子量が、２，０００Ｄａ〜３０，０００Ｄａである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリマーの平均分子量が、５，０００Ｄａ〜２０，０００Ｄａである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリマーの平均分子量が、約１０，０００Ｄａである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物におけるＢ細胞の活性化を阻害する方法であって、Ｂ細胞を、以下：（ａ）ＫＩＭ−１ Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｂ）抗ＫＩＭ−１抗体；ならびに（ｃ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストと接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２２】
前記Ｂ細胞の活性化が、活性化Ｔ細胞によって媒介される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記活性化Ｔ細胞が、Ｔｈ２細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記活性化Ｔ細胞が、移植されるドナーＴ細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
哺乳動物において、一以上の抗原に対する抗体のサブセットの産生を阻害する方法であって、以下（ａ）ＫＩＭ−１ Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｂ）抗ＫＩＭ−１抗体；ならびに（ｃ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
前記抗体が、ＩｇＧクラスである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体が、ＩｇＧ１サブクラスである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
有効量の前記ポリペプチドが、前記哺乳動物の免疫系が一以上の抗原を初めて認識する３０分〜３０日前に、該哺乳動物に投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記一以上の抗原が、アロ抗原である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記一以上の抗原が、自己抗原である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳動物の前記免疫系が、前記一以上の抗原を、自己免疫疾患の過程におけるエピトープ拡散プロセスの一部として、初めて認識する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
自己免疫疾患におけるエピロープ拡散を阻害する方法であって、以下：（ａ）ＫＩＭ−１
Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｂ）抗ＫＩＭ−１抗体；ならびに（ｃ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項３３】
Ｔｈ２細胞媒介性疾患を処置する方法であって、以下：（ａ）ＫＩＭ−１ Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｂ）抗ＫＩＭ−１抗体；ならびに（ｃ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項３４】
前記Ｔｈ２細胞媒介性疾患が、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、シャーガス病、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ヴェグナー肉芽腫症、結節性多発性動脈炎、急速進行性半月体形成性糸球体腎炎、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）および全身性ループス腎炎（ＳＬＥ）からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＧＶＨＤを阻害する方法であって、以下：（ａ）ＫＩＭ−１ Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｂ）抗ＫＩＭ−１抗体；ならびに（ｃ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項３６】
ＫＩＭ−１ ＩｇドメインおよびＦｃ部分を含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド。
【請求項３７】
哺乳動物に有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する、該哺乳動物内のリンパ球によるＩＦＮ−γの分泌を阻害する方法。
【請求項３８】
哺乳動物に有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する、該哺乳動物における炎症性疾患または炎症性障害を処置する方法。
【請求項３９】
前記炎症性疾患および前記炎症性障害が、炎症性腸疾患である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記炎症性疾患または前記炎症性障害が、急性炎症または慢性炎症である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記ヘルパーＴ細胞が、Ｔｈ１細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項１】
哺乳動物における免疫応答に関与するＴ細胞と第二の細胞との間のシグナル伝達を阻害する方法であって、以下：
（ａ）免疫疾患または免疫障害を有する哺乳動物および組織移植片の調整における哺乳動物からなる群から選択される哺乳動物を同定する工程；および
（ｂ）該哺乳動物に以下：（ｉ）ＫＩＭ−１ Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｉｉ）抗ＫＩＭ−１抗体；ならびに（ｉｉｉ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記第二の細胞が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｔ細胞が、活性化Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｔ細胞が、ヘルパーＴ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ヘルパーＴ細胞が、Ｔｈ２細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｔ細胞が、移植されるドナーＴ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＡＰＣが、単球、マクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＡＰＣが、自己抗原を提示している、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、さらにＫＩＭ−１ムチンドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、さらに異種部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記異種部分が、免疫グロブリン（Ｉｇ）部分、血清アルブミン部分、標的部分、レポーター部分および精製容易化部分からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記異種部分が、Ｉｇ部分である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｉｇ部分が、Ｆｃ部分である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、ポリマーに結合体化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリマーが、ポリアルキレングリコール、糖ポリマーおよびポリペプチドからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリマーが、ポリアルキレングリコールである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリマーの平均分子量が、２，０００Ｄａ〜３０，０００Ｄａである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリマーの平均分子量が、５，０００Ｄａ〜２０，０００Ｄａである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリマーの平均分子量が、約１０，０００Ｄａである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物におけるＢ細胞の活性化を阻害する方法であって、Ｂ細胞を、以下：（ａ）ＫＩＭ−１ Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｂ）抗ＫＩＭ−１抗体；ならびに（ｃ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストと接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２２】
前記Ｂ細胞の活性化が、活性化Ｔ細胞によって媒介される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記活性化Ｔ細胞が、Ｔｈ２細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記活性化Ｔ細胞が、移植されるドナーＴ細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
哺乳動物において、一以上の抗原に対する抗体のサブセットの産生を阻害する方法であって、以下（ａ）ＫＩＭ−１ Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｂ）抗ＫＩＭ−１抗体；ならびに（ｃ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
前記抗体が、ＩｇＧクラスである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体が、ＩｇＧ１サブクラスである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
有効量の前記ポリペプチドが、前記哺乳動物の免疫系が一以上の抗原を初めて認識する３０分〜３０日前に、該哺乳動物に投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記一以上の抗原が、アロ抗原である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記一以上の抗原が、自己抗原である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳動物の前記免疫系が、前記一以上の抗原を、自己免疫疾患の過程におけるエピトープ拡散プロセスの一部として、初めて認識する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
自己免疫疾患におけるエピロープ拡散を阻害する方法であって、以下：（ａ）ＫＩＭ−１
Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｂ）抗ＫＩＭ−１抗体；ならびに（ｃ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項３３】
Ｔｈ２細胞媒介性疾患を処置する方法であって、以下：（ａ）ＫＩＭ−１ Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｂ）抗ＫＩＭ−１抗体；ならびに（ｃ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項３４】
前記Ｔｈ２細胞媒介性疾患が、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、シャーガス病、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ヴェグナー肉芽腫症、結節性多発性動脈炎、急速進行性半月体形成性糸球体腎炎、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）および全身性ループス腎炎（ＳＬＥ）からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＧＶＨＤを阻害する方法であって、以下：（ａ）ＫＩＭ−１ Ｉｇドメインを含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド；（ｂ）抗ＫＩＭ−１抗体；ならびに（ｃ）抗ＫＩＭ−１抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項３６】
ＫＩＭ−１ ＩｇドメインおよびＦｃ部分を含み、かつ膜貫通ドメインおよびＫＩＭ−１細胞質ドメインを欠くポリペプチド。
【請求項３７】
哺乳動物に有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する、該哺乳動物内のリンパ球によるＩＦＮ−γの分泌を阻害する方法。
【請求項３８】
哺乳動物に有効量のＫＩＭ−１アンタゴニストを投与する工程を包含する、該哺乳動物における炎症性疾患または炎症性障害を処置する方法。
【請求項３９】
前記炎症性疾患および前記炎症性障害が、炎症性腸疾患である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記炎症性疾患または前記炎症性障害が、急性炎症または慢性炎症である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記ヘルパーＴ細胞が、Ｔｈ１細胞である、請求項４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１０−２８０７２８（Ｐ２０１０−２８０７２８Ａ）
【公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２１１４２６（Ｐ２０１０−２１１４２６）
【出願日】平成２２年９月２１日（２０１０．９．２１）
【分割の表示】特願２００４−５６５７１７（Ｐ２００４−５６５７１７）の分割
【原出願日】平成１５年１２月２９日（２００３．１２．２９）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月２１日（２０１０．９．２１）
【分割の表示】特願２００４−５６５７１７（Ｐ２００４−５６５７１７）の分割
【原出願日】平成１５年１２月２９日（２００３．１２．２９）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
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