Ｌ−スレオニン生成変異微生物及びそれを使用したＬ−スレオニンの製造方法
本発明は、突然変異誘発源の処理のような無作為的変異技法ではない、部位特異的変異技法のみを使用して製作された高濃度、高収率のＬ−スレオニン生成変異微生物とその製造方法及び前記微生物を使用したＬ−スレオニンの製造方法に関するものである。本発明の微生物を使用すると、高収率のＬ−スレオニンを生成することができ、Ｌ−スレオニン生成微生物の遺伝特性に対する正確な情報を知ることができるので追加的な菌株開発とその生理現象に対する理解を容易にする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高収率のＬ−スレオニン生成変異微生物及び該微生物を使用したＬ−スレオニンの製造方法に関するもので、より詳細には、突然変異誘発源の処理のような無作為的変異技法ではない、部位特異的変異技法のみを使用して製作された高濃度、高収率のＬ−スレオニン生成変異微生物、その製造方法及び前記微生物を使用したＬ−スレオニンの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−スレオニンは、微生物醗酵技術によって生産されていて、大膓菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、セラチア菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ）の野生株から突然変異誘発源の処理による選別過程を通じて誘導された突然変異株を使用して生産されている。例えば、大韓民国特許登録第１１５３９３号には、無作為突然変異誘発源の一種であるＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを大膓菌属微生物に処理して、６−ジメチルアミノプリン、９−アザアデニン、８−アザジアミノプリン等のプリン類似体に対する耐性を付与して、Ｌ−スレオニンを生産する微生物を選別する方法が記述されていて、韓国登録特許第１６８７１９号には、セラチア属細菌の野生株から突然変異誘発源を使用してリジン類似体のＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システインに対する耐性と抗生物質の一種であるリファムピシン（Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ）に対する耐性付与を通じて、Ｌ−スレオニンを生産する微生物を選別する方法に対して記述されている。また、日本特許公開第２２４６８４／８３号には、ブレビバクテリウム属に属して、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン及びα−アミノ−β−ヒドロキシバレリン酸に対する耐性を有して、Ｌ−イソロイシン及びＬ−リジン栄養要求性微生物を使用する方法が記述されている。
【０００３】
一方、遺伝子組換え技術が発展するにつれて、無作為的突然変異法によって開発された Ｌ−スレオニン生産株を対象に部位特異的な遺伝子置換、遺伝子増幅及び欠失などを導入してより向上したＬ−スレオニン生産株の開発に対する技術が報告されている。例えば、大韓民国登録特許第３９７４２３号には、反復的な突然変異誘発と選別過程を通じて製作されたメチオニン要求性、スレオニン類似体（α−アミノ−β−ヒドロキシバレリン酸）に対する耐性、リジン類似体（Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン）に対する耐性、及びイソロイシン類似体（例、α−アミノブチル酸）に対する耐性などを有するＬ−スレオニン生産株を遺伝工学的技法を使用してホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）遺伝子とスレオニンオペロンを染色体ＤＮＡ中の特定部位に１コピー以上挿入したことを特徴とする微生物による、Ｌ−スレオニン生産方法が記述されていて、この外にも前記のような突然変異株に遺伝子組換え技術を適用したＬ−スレオニン生産菌株の開発技術に対して多くの報告がある（ＵＳ２００５／００３２１７８、ＵＳ２００４／０２１４２９４、ＵＳ００５９３９３０７）。
【０００４】
しかし、上述したすべての公知の方法は、無作為的変異を起こす突然変異誘発源の処理によって製作された菌株を根幹にして開発されたため、様々な決定的な短所を有している。突然変異誘発源の処理と菌株選別過程を通じて高収率のＬ−スレオニン生産菌株の開発が可能だったことは事実だが、選別された生産菌株は突然変異誘発源処理過程で不可欠に隋伴する多数の無作為変異等によって、一般的にその母菌株に比較して菌体成長速度の低下、糖消耗速度の低下及び外部環境変化に対する耐性減少などのアミノ酸の産業的生産に不利な様々な生理的特性を有するようになる。また、突然変異誘発源の処理によって生じた確認しにくい多数の変異等によって追加的な菌株開発に多くの難しさが存在し、なによりも生産性を向上させるには限界が付きまとうという短所がある。
【０００５】
そのため、最近では遺伝工学の発展とともに微生物染色体の全体塩基配列が明かされるようになり、上述した無作為突然変異法の問題点を克服するために、無作為的突然変異法を排除した新しい試みが行われている。反復的な無作為突然変異法によって開発されたリジン生産コリネ型細菌とｗｉｌｄ−ｔｙｐｅコリネ型細菌間の比較遺伝体研究を使用して、リジン生産に有利な主要変異のみを選別して、それを使用した高収率のリジン生産菌株開発に関する研究が報告されたことがある（Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｊ．等，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００３年，第５８巻，２１７頁，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍ．等，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００６年，第７２巻，７８３頁）。
【０００６】
また、ベロニカ（Ｖｅｒｏｎｉｋａ）等は、コリネ型細菌を使用して遺伝子ｉｌｖＡとｐａｎＢを不活性化して、Ｌ−バリン生合成に関与するオペロン（ｉｌｖＢＮＣ）を増幅した後、ｉｌｖＮ遺伝子に存在するフィードバック阻害を除去して、１３０ｍＭのＬ−バリンを生成したと報告したことがある（Ｖｅｒｏｎｉｋａ等，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００５年，第７１巻，２０７頁）。また、コリネ型細菌を使用して合理的デザイン（ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ）による８６ｍＭのＬ−セリン生成に関する研究も発表された（Ｐｅｔｅｒｓ−Ｗｅｎｄｉｓｃｈ 等，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００５年，第７１巻，７１３９頁）。それらは、すべて無作為的突然変異法を排除してｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎによる部位特異的変異だけで菌株開発を遂行した研究結果であるが、前述したリジン生産菌株を除きすべて産業的に使用可能性が非常に低い低収率の研究結果である。また、いまだにｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎによる菌株開発を通じて高収率のＬ−スレオニンを生成した例は、報告されたことがない。
【０００７】
ゆえに、既存の無作為突然変異法による菌株開発が有する短所を排除することができるｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ方法による高収率のＬ−スレオニン生産菌株の開発が切実に求められている。
【０００８】
以上のことに鑑みて、本発明者等は、既存の無作為突然変異法による菌株が有する短所を克服することができる変異微生物を開発しようと鋭意努力した結果、部位特異的な突然変異技法のみを使用して、Ｌ−スレオニン生成変異微生物を製造し、該微生物を使用して、高収率、高濃度のＬ−スレオニンを生産することができるということを確認して、本発明を完成した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
結局、本発明の目的は、部位特異的変異のみを使用することを特徴とする高収率、高濃度のＬ−スレオニン生成変異微生物の製造方法を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記方法で製造された高収率、高濃度のＬ−スレオニン生成変異微生物及び該微生物を培養することを特徴とする、Ｌ−スレオニンの製造方法を提供することである。
【００１１】
前記目的を達成するために本発明は、部位特異的変異技法で（ａ）ｌａｃオペロンのリプレッサー（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）をコードする遺伝子、ホモセリンＯ−スクシニル転移酵素をコードする遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びＬ−スレオニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失：（ｂ）アスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩの活性阻害を防ぐための、アスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩをコードする遺伝子の変異；（ｃ）Ｌ−スレオニンオペロンプロモーターまたはアセチルコーエーシンターゼのプロモーターのストロングプロモーターへの置換を誘導することを特徴とする高濃度及び高収率のＬ−スレオニン生成変異微生物の製造方法を提供する。
【００１２】
本発明は、また、前記方法で製造された変異微生物にＬ−スレオニンオペロン遺伝子、スレオニンエクスポーター（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｅｘｐｏｒｔｅｒ）をコードする遺伝子、スレオニンとホモセリンのエクスポーターをコードする遺伝子及びホモセリンとホモセリンラクトン（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｌａｃｔｏｎｅ）のエクスポーターをコードする遺伝子からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を含有するベクターを導入することを特徴とする組換え変異微生物の製造方法を提供する。
【００１３】
本発明は、また、（ａ）ｌａｃオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子、ホモセリンＯ−スクシニル転移酵素をコードする遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びＬ−スレオニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が欠失されていて、（ｂ）アスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩの活性阻害を防ぐためにアスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩをコードする遺伝子が変異されていて、（ｃ）Ｌ−スレオニンオペロンのプロモーターまたはアセチルコーエーシンターゼのプロモーターがストロングプロモーターに置換されていることを特徴とする高濃度及び高収率のＬ−スレオニン生成変異微生物を提供する。
【００１４】
本発明は、また、前記変異微生物にＬ−スレオニンオペロン遺伝子、スレオニンエクスポーター（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｅｘｐｏｒｔｅｒ）をコードする遺伝子、スレオニンとホモセリンのエクスポーターをコードする遺伝子及びホモセリンとホモセリンラクトン（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｌａｃｔｏｎｅ）のエクスポーターをコードする遺伝子からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を含むベクターが導入されていることを特徴とする組換え変異微生物を提供する。
【００１５】
本発明は、また、（ａ）ｌａｃオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子、ホモセリンＯ−スクシニル転移酵素をコードする遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びＬ−スレオニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が欠失されていて、（ｂ）アスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩの活性阻害を防ぐためにアスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩをコードする遺伝子が変異されていて、（ｃ）Ｌ−スレオニンオペロンのプロモーターまたはアセチルコーエーシンターゼのプロモーターがストロングプロモーターに置換されていることを特徴とする高濃度及び高収率のＬ−スレオニン生成変異微生物を提供する。
【００１６】
本発明は、また、前記変異微生物にＬ−スレオニンオペロン遺伝子、スレオニンエクスポーターをコードする遺伝子、スレオニンとホモセリンのエクスポーターをコードする遺伝子及びホモセリンとホモセリンラクトンのエクスポーターをコードする遺伝子からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を含むベクターが導入されていることを特徴とする組換え変異微生物を提供する。
【００１７】
本発明は、また、ｌｏｘ６６遺伝子、ｌｏｘ７１遺伝子及び抗生剤耐性標式遺伝子を同時に含むワンステップ不活性化用ベクターを提供する。
【００１８】
本発明は、また、前記微生物を培養することを特徴とするＬ−スレオニンの製造方法を提供する。
【００１９】
本発明の他の特徴及び具現例は、次の詳細な説明及び添付された特許請求の範囲からさらに明らかになるだろう。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
一観点で、本発明は、部位特異的変異技法で（ａ）ｌａｃオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子、ホモセリンＯ−スクシニル転移酵素をコードする遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びＬ−スレオニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失：（ｂ）アスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩの活性阻害を防ぐための、アスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩをコードする遺伝子の変異；（ｃ）Ｌ−スレオニンオペロンプロモーターまたはアセチルコーエーシンターゼのプロモーターのストロングプロモーターへの置換を誘導することを特徴とする高濃度及び高収率のＬ−スレオニン生成変異微生物の製造方法に関するものである。
【００２１】
本発明による変異微生物の製造方法において、グリオキシレートシャントの発現を抑制する調節タンパク質をコードする遺伝子及びスレオニン／セリントランスポーターをコードする遺伝子を欠失させる場合、Ｌ−スレオニン生成能を増加させることができる。同時に、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーターをストロングプロモーターに置換する場合にもＬ−スレオニン生成能を増加させることができる。
【００２２】
他の観点で、本発明は、前記方法で製造された変異微生物にＬ−スレオニンオペロン遺伝子、スレオニンエクスポーターをコードする遺伝子、スレオニンとホモセリンのエクスポーターをコードする遺伝子及びホモセリンとホモセリンラクトンのエクスポーターをコードする遺伝子からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を含むベクターを導入させることを特徴とする、組換え変異微生物の製造方法に関するものである。
【００２３】
また他の観点で、本発明は、（ａ）ｌａｃオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子、ホモセリンＯ−スクシニル転移酵素をコードする遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びＬ−スレオニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が欠失されていて、（ｂ）アスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩの活性阻害を防ぐためにアスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩをコードする遺伝子が変異されていて、（ｃ）Ｌ−スレオニンオペロンのプロモーターまたはアセチルコーエーシンターゼのプロモーターがストロングプロモーターに置換されていることを特徴とする、高濃度及び高収率のＬ−スレオニン生成変異微生物に関するものである。
【００２４】
本発明において、前記微生物は、バクテリア、酵母及びカビからなる群から選択されることを特徴とすることができ、前記バクテリアは、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属及び大膓菌からなる群から選択されることを特徴とできる。
【００２５】
本発明による変異微生物は、グリオキシレートシャントの発現を抑制する調節タンパク質をコードする遺伝子及びスレオニン／セリントランスポーターをコードする遺伝子がさらに欠失していることを特徴とでき、同時にホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーターがストロングプロモーターで追加に置換されていることを特徴とできる。
【００２６】
本発明において、前記ストロングプロモーターは、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターからなる群から選択されることを特徴とできる。
【００２７】
また他の観点で、本発明は、前記変異微生物にＬ−スレオニンオペロン遺伝子、スレオニンエクスポーターをコードする遺伝子、スレオニンとホモセリンのエクスポーターをコードする遺伝子及びホモセリンとホモセリンラクトンのエクスポーターをコードする遺伝子からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を含むベクターが導入されていることを特徴とする組換え変異微生物に関するものである。
【００２８】
また他の観点で、本発明は、（ａ）ｌａｃオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子、ホモセリンＯ−スクシニル転移酵素をコードする遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びＬ−スレオニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が欠失されていて、（ｂ）アスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩの活性阻害を防ぐためにアスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩをコードする遺伝子が変異されていて、（ｃ）Ｌ−スレオニンオペロンのプロモーターまたはアセチルコーエーシンターゼのプロモーターがストロングプロモーターに置換されていることを特徴とする、高濃度及び高収率のＬ−スレオニン生成変異微生物に関するものである。
【００２９】
本発明において、前記微生物は、バクテリア、酵母及びカビからなる群から選択されることを特徴にでき、前記バクテリアは、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属及び大膓菌からなる群から選択されることを特徴にできる。
【００３０】
本発明による変異微生物は、グリオキシレートシャントの発現を抑制する調節タンパク質をコードする遺伝子及びスレオニン／セリントランスポーターをコードする遺伝子がさらに欠失されていることを特徴にでき、同時にホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーターがストロングプロモーターにさらに置換されていることを特徴にできる。
【００３１】
本発明において、前記ストロングプロモーターは、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターからなる群から選択されることを特徴にできる。
【００３２】
また他の観点で、本発明は、前記変異微生物にＬ−スレオニンオペロン遺伝子、スレオニンエクスポーターをコードする遺伝子、スレオニンとホモセリンのエクスポーターをコードする遺伝子及びホモセリンとホモセリンラクトンのエクスポーターをコードする遺伝子からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を含むベクターが導入されていることを特徴とする組換え変異微生物に関するものである。
【００３３】
本発明において、変異微生物の母微生物は、Ｌ−スレオニンを生産することができ、無作為的変異を有していない微生物なら原核微生物及び真核微生物のいずれでも使用することができる。
【００３４】
例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、コリネバクテリウム属及びブレビバクテリウム属に属する微生物菌株を含むことができ、腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科に属する微生物であることが好ましく、さらに好ましくは大腸菌属に属する微生物である。
【００３５】
また、前記無作為的突然変異を誘発する変異源は、当業界に公知された物理的または化学的方法に使用されるすべての物質を含む。例えば、物理的方法に使用されるものとしては、Ｘ線または紫外線などを含んだすべての無作為的突然変異を起こすことができるものなどであり、化学的方法に使用される物質としては、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｎｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ，ＮＴＧ）、ジエチルスルファート及びエチルアミンなどを含んだすべての化学変異剤である。
【００３６】
本発明の変異微生物は、部位特異的変異によってＬ−スレオニン生成に関与する主要調節機序であるフィードバック阻害と減衰機序（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）が除去され、Ｌ−スレオニン生合成経路と競争的な経路に該当するリジン生合成経路、メチオニン生合成経路、及びスレオニン分解経路などが不活性化され、Ｌ−スレオニンから生成されるＬ−イソロイシンの生合成経路が弱化され、Ｌ−スレオニン生合成関連オペロンの元来のプロモーターとアッテネータ（ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ）を含んだ部位がストロングプロモーターに置換されたことを特徴とする。
【００３７】
本発明の他の様態としては、前記変異微生物はＬ−スレオニンの生合成の重要前駆物質であるオキサロアセテートの増大のためにｉｃｌＲの不活性化と染色体上のｐｐｃ遺伝子の元来のプロモーターがストロングプロモーターに置換されたことを特徴とする。また、前記微生物は、Ｌ−スレオニンオペロンと細胞内のＬ−スレオニンの排出と係わるｒｈｔＣ、ｒｈｔＡ、及びｒｈｔＢなどの遺伝子がすべて組換えベクターに挿入され、それらの活性が強化されたことを特徴とする。
【００３８】
本発明において、リジン生合成経路の不活性化は、Ｌ−リジン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子であるｌｙｓＡ（ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅをコードする遺伝子）の不活性化によることを特徴とし、メチオニン生合成経路の不活性化は、Ｌ−メチオニン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子であるｍｅｔＡ（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ Ｏ−ｓｕｃｃｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅをコードする遺伝子）の不活性化によることを特徴とし、スレオニン分解経路の不活性化は、遺伝子ｔｄｈ（Ｌ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅをコードする遺伝子）とｔｄｃＣ（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ／ｓｅｒｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒをコードする遺伝子）の不活性化によることを特徴とする。
【００３９】
また、Ｌ−イソロイシンの生合成経路の弱化は、遺伝子ｉｌｖＡ（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅをコードする遺伝子）の部位特異的変異によってそのタンパク質の酵素活性が弱化されたことを特徴とする。
【００４０】
本発明において、前記不活性化された遺伝子というのは、宿主内の該当の遺伝子と配列相同性を有しているポリヌクレオチド配列を含むが、欠失、置換、切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）及び逆位のような突然変異が導入されて活性あるタンパク質産物を発現することができないポリヌクレオチド配列を意味する。前記不活性化された遺伝子またはその断片を宿主細胞内で導入する過程は例えば、形質転換、接合、形質導入または電気穿孔によって行うことができるが、それらに限定されるものではない。
【００４１】
また他の観点で本発明は、ｌｏｘ６６遺伝子、ｌｏｘ７１遺伝子及び抗生剤耐性標式遺伝子を同時に含むワンステップ不活性化用ベクターに関するものである。本発明において、前記ベクターはｐＭｌｏｘＣであることを特徴とする。
【００４２】
また他の観点で本発明は、前記Ｌ−スレオニン高生成能を有する変異微生物を培養することを特徴とするＬ−スレオニンの製造方法に関するものである。
【００４３】
本発明によるＬ−スレオニンの製造方法において、前記微生物の培養過程は当業界に知られた適当な培地と培養条件によって成され得る。このような培養過程は、当業者なら選択した菌株によって容易に調整して使用することができる。前記培養方法の例には、回分式、連続式及び流加式培養が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００４４】
また、培養物からのＬ−スレオニンの分離は、当業界に知られた通常的な方法によって分離することができる。このような分離方法には、遠心分離、ろ過、イオン交換クロマトグラフィー及び結晶化などの方法が使用できる。例えば、培養物を低速遠心分離してバイオマスを除去して得られた上澄み液をイオン交換クロマトグラフィーを通じて分離することができるが、それらの例に限定されるものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
実施例
以下、本発明を実施例によってより詳細に説明する。これら実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないということは、当業界で通常の知識を有する者において自明なことである。
【００４６】
下記の実施例では、大膓菌Ｗ３１１０に部位特異的な遺伝子変異を導入して、高濃度のＬ−スレオニンを生産する菌株を製作したが、他の大膓菌及び微生物を使用して同一な遺伝子を部位特異的に欠失及び変異させて高濃度、高収率のＬ−スレオニン生産菌株を製造することは、当業界で通常の知識を有した者において自明だろう。
実施例１：Ｌ−スレオニン高生成微生物の製作
１−１：ｐＳａｃＨＲ０６の製作
ｔｈｒＡのフィードバック阻害を除去するために、染色体ＤＮＡの特定塩基または塩基の置換のためにバシラス・サブチリス来由のｓａｃＢ相同性組換え技法（Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９２年，第１７４巻，５４６２頁）を使用する目的でｐＳａｃＨＲ０６ベクターを製作した（図１）。
【００４７】
まず、ｐＵＣ１９ベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、米国）のアムピシリンに対する耐性特性をカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）に対する耐性特性に置換するためにｐＵＣ１９をＮｄｅＩ及びＡｈｄＩで切断して得た１．５ｋｂ切片をｐＡＣＹＣ１７７ベクター（Ｎｅｗ−Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、米国）をＳｔｕＩで切断して得た１．３ｋｂ切片とライゲーションさせてｐＵＣ１９ＫＭベクターを製作した。
【００４８】
次に、前記ｐＵＣ１９ＫＭベクターをＰｖｕＩＩで切断して得た２．５ｋｂ切片とｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）ベクターをＰｖｕＩＩで切断して得た４００ｂｐ切片をライゲーションしてｐＵＣ１９ＫＫＳベクターを得た。前記ｐＵＣ１９ＫＫＳベクターのＤＮＡ複製原点を容易に除去するために、配列番号１／２のプライマーとｐＵＣ１９ベクター鋳型を使用してＰＣＲを遂行した。その結果、同一な切断酵素の認識部位を両末端に各々有していて、ＤＮＡ複製基点を有するＤＮＡ切片を獲得した。前記切片をＳａｌＩ及びＤｒａＩＩＩで切断して、ｐＵＣ１９ＫＫＳベクターをＳａｌＩ及びＤｒａＩＩＩで切断して得た１．５ｋｂ切片とライゲーションさせてｐＵＣ１９Ｋベクターを製作した。前記ｐＵＣ１９Ｋベクターにバシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｓａｃＢ遺伝子を導入するためにバシラス・サブチリスのゲノムＤＮＡを鋳型にして、配列番号３／４のプライマーを使用してＰＣＲを遂行してｓａｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片を合成し、該合成されたＤＮＡ断片及びｐＵＣ１９ＫベクターをＸｂａＩ及びＳｐｅＩで切断した後、ライゲーションしてｓａｃＢ遺伝子を有するｐＳａｃＨＲ０６ベクターを製作した（図１）。
【００４９】
ｐＳａｃＨＲ０６ベクターは、バシラス・サブチリス来由のｓａｃＢ遺伝子を有し、制限酵素を使用して容易にＤＮＡ複製原点を除去して、またライゲーションを遂行することができるので、ｓａｃＢポジティブセレクションに使用可能である。
配列番号1(pucoriup):5’-agccgtcgacgctagcgcatgcacgcgtgtgcacccatgggacg
tcctcactgactcgctgcgctc-3’
配列番号2(pucorido):5’-ggctcacaacgtggctagcgacgtcgtgcacccatgggttccac
tgagcgtcagacc-3
配列番号3(sacBf):5’-actctctagacgcgggtttgttactgataa-3’
配列番号4(sacBr):5’-gctagatatcaggatatcggcattttcttt-3’
１−２：大膓菌Ｗ３１１０からｌａｃＩ遺伝子の欠失
大膓菌Ｗ３１１０（ＡＴＴＣ３９９３６）で配列番号５及び配列番号６のプライマーを使用したワンステップ不活性化（ｏｎｅ ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）方法（Ｗａｒｎｅｒ等，ＰＮＡＳ，２０００年，第６巻，６６４０頁）を使用して、ｌａｃオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子で、ラクトース分解を担当するｌａｃオペロンの転写を抑制する機能を有するｌａｃＩ遺伝子を欠失させて、抗生剤耐性を除去して、大膓菌Ｗ３１１０ΔｌａｃＩを製作した。
配列番号5(lacI_1stup):5’-gtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtg
tctcttagattgcagcattacacgtcttg-3’
配列番号6(lacI_1stdo):5’-tcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgc
attaatgcacttaacggctgacatggg-3’
１−３：ｔｈｒＡのフィードバック阻害除去
１−１で製作した相同性組換えベクターであるｐＳａｃＨＲ０６と１−２で製作した5Ｗ３１１０ΔｌａｃＩを使用してリー等の研究発表（Ｌｅｅ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００３年、第１８５巻，５４４２頁）を参考にして、アスパルトキナーゼＩ（ａｓｐａｒｔｏｋｉｎａｓｅ Ｉ）をコードするｔｈｒＡのフィードバック阻害を除去した。
【００５０】
大膓菌Ｗ３１１０（ＡＴＴＣ３９９３６）の染色体ＤＮＡを公知の方法で分離及び精製して（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９年）、それを鋳型に使用して配列番号７／８のプライマー対と配列番号９／１０のプライマー対を各々使用してＰＣＲを遂行した後、修得された二つのＰＣＲ切片を同一な濃度で混ぜて鋳型にして、配列番号７／１０のプライマーを使用してオーバーラッピングＰＣＲを遂行した。前記方法で得た１２７９ｂｐのＰＣＲ断片をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ酵素で切断して、やはりＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ酵素で切断したｐＳａｃＨＲ０６に挿入した後、塩基配列を分析して、ｔｈｒＡの１０３４番目塩基（Ｃ）が（Ｔ）に置換されたことを確認した。
【００５１】
前記修得したベクターをＮｈｅＩ酵素で切断して、複製原点を欠失させた後、セルフライゲーションさせて、５Ｗ３１１０ΔｌａｃＩコンピタント細胞でエレクトロポレーションした。次に、ｓａｃＢポジティブセレクション方法によってｔｈｒＡのフィードバック阻害が除去された菌株を修得した。
【００５２】
配列番号7(thrA1):5’-acgcggatccatcgccattatggccggcgtattagaagc-3’
配列番号8(thrA2):5’-gattgcgtaatcagcaccacgaaaatacgggcgcgtgacatcg-3’
配列番号9(thrA3):5’-cgatgtcacgcgcccgtattttcgtggtgctgattacgcaatc-3’
配列番号10(thrA4):5’-cacgcgtcgacctggaagtgcagttaacaatgaccggg-3’
１−４：ｌｙｓＣのフィードバック阻害除去
前記１−３のｔｈｒＡのフィードバック阻害が除去された菌株にすでに発表された研究結果（Ｏｇａｗａ−Ｍｙｙａｔａ等，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１年，第６５巻，１１４９頁）を参考にして、アスパルトキナーゼＩＩＩ（ａｓｐａｒｔｏｋｉｎａｓｅ ＩＩＩ）をコードする遺伝子であるｌｙｓＣのフィードバック阻害を除去した。大膓菌Ｗ３１１０（ＡＴＴＣ３９９３６）の染色体ＤＮＡを鋳型に使用して、配列番号１１／１２のプライマー対と配列番号１３／１４のプライマー対を各々使用してＰＣＲを遂行した後、修得された二つのＰＣＲ断片を同一な濃度で混ぜて鋳型にして、配列番号１１／１４のプライマー対を使用してオーバーラッピングＰＣＲを遂行した。前記方法で得た１４８４ｂｐのＰＣＲ断片をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで切断して、やはりＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ酵素で切断したｐＳａｃＨＲ０６に挿入した後、塩基配列を分析して、ｌｙｓＣの１０５５番目塩基（Ｃ）が（Ｔ）に置換されたことを確認した。
【００５３】
前記修得したベクターをＮｈｅＩ酵素で切断して、複製原点を欠失させた後、セルフライゲーションさせて、前記１−３で製作したｔｈｒＡのフィードバック阻害が除去された大膓菌のコンピタント細胞（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）にエレクトロポレーションした。次に、ｓａｃＢポジティブセレクション方法によってｌｙｓＣのフィードバック阻害が除去された菌株を修得した。
配列番号11(lysC1):5’-ctgatgtcgaccctgctgtttgttgagatcctgcgc-3’
配列番号12(lysC2):5’-ggttgaaccggtggtatcaaggataatgccacgctcacttctg-3’
配列番号13(lysC3):5’-cagaagtgagcgtggcattaatccttgataccaccggttcaacc-3’
配列番号14(lysC4):5’-ccagctaaatgacgcttcaggatccggtttataag-3’
１−５：Ｌ−スレオニンオペロン（ｔｈｒＡＢＣ）のプロモーター置換
１−４で製作されたｔｈｒＡ遺伝子とｌｙｓＣ遺伝子のフィードバック阻害が除去された大膓菌Ｗ３１１０で、減衰機序（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）による転写発現調節を除去するためにアッテネータ（ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ）配列を含むスレオニンオペロンのプロモーターを強力なプロモーターであるｔａｃプロモーターに置換した。
【００５４】
そのために配列番号１５／１６のプライマー対を大膓菌Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを遂行して７２５ｂｐのＰＣＲ断片を獲得した後、該断片をＰｖｕＩＩとＳｐｈＩで切断して、切断した断片をｐＫＫ２２３−３ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、米国）の該当酵素切断部位にクローニングした。
【００５５】
一方、配列番号１７／１８のプライマーを使用してＰＣＲを遂行して７０５ｂｐのＰＣＲ断片を獲得した後、ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで切断してそれを同一な酵素で切断したｐＫＫ２２３−３とライゲーションさせて、クローニングを遂行した。前記ベクターの塩基配列を分析した後、ＰｖｕＩＩ及びＰｓｔＩで切断した断片を同一な酵素で切断したｐＳａｃＨＲ０６ベクターとライゲーションした後、ｔｈｒＡ遺伝子とｌｙｓＣ遺伝子のフィードバック阻害が除去された大膓菌Ｗ３１１０に形質転換させてアッテネータを含むプロモーターがｔａｃプロモーターに置換された大膓菌を製作した。
配列番号15(thrAT1):5’-gcagccagctgtagcgatctgcggattgtcgatagt -3’
配列番号16(thrAT2):5’-caggagcatgccagaagctgctatcagacactcttt-3’
配列番号17(thrAT3):5’-cagcagaattcatgcgagtgttgaagttcggcggta -3’
配列番号18(thrAT4):5’-cagagctgcagtccgtccaaatctcgcaacaatcgg-3’
１−６：ｌｙｓＡ、ｍｅｔＡ、ｔｄｈ、及びｉｃｌＲ遺伝子の欠失
前記の１−５で修得されたｌａｃＩ遺伝子とｔｈｒＡ及びｌｙｓＣのフィードバック阻害除去されてｔｈｒＡＢＣオペロンのプロモーターがｔａｃプロモーターに置換されたＷ３１１０でｌｙｓＡ、ｍｅｔＡ、ｔｄｈ、及びｉｃｌＲ遺伝子をワンステップ不活性化方法（Ｗａｒｎｅｒ等，ＰＮＡＳ，２０００年，第６巻，６６４０頁）によって欠損させて、抗生剤耐性付与標式遺伝子を除去した。
【００５６】
ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）をコードする遺伝子であるｌｙｓＡ欠失菌株を製作するため、配列番号１９／２０のプライマー対とｐＫＤ４プラスミド（Ｗａｒｎｅｒ等，ＰＮＡＳ，２０００年，第６巻，６６４０頁）を使用してＰＣＲ反応を遂行して、その結果獲得したＤＮＡ断片をｐＫＤ４６（Ｗａｒｎｅｒ等，ＰＮＡＳ，２０００年，第６巻，６６４０頁，ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＹ０４８７４６）を含むｌａｃＩ遺伝子とｔｈｒＡ及びｌｙｓＣのフィードバック阻害除去されｔｈｒＡＢＣオペロンのプロモーターがｔａｃプロモーターに置換されたＷ３１１０のコンピタント細胞にエレクトロポレーションした。以後、カナマイシン耐性を示す細胞株を対象にＰＣＲ反応を遂行して、ｌｙｓＡ遺伝子の欠失有無を確認してｐＣＰ２０プラスミド（Ｗａｒｎｅｒ等，ＰＮＡＳ，２０００年，第６巻，６６４０頁）を導入して抗生剤耐性標式遺伝子を除去した。
配列番号19(KOlysA1):5’-atgccacattcactgttcagcaccgataccgatctcaccgccgaa
aatctgattgcagcattacacgtcttg -3’
配列番号20(KOlysA2):5’-gttgataaggaacagaaagcccaccgcccgcagaaatagcctg
taaatcccacttaacggctgacatggga-3’
ホモセリンＯ−スクシニル転移酵素（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ Ｏ−ｓｕｃｃｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をコードする遺伝子であるｍｅｔＡ遺伝子が欠失された菌株を製作するために、配列番号２１／２２のプライマーを使用してワンステップ不活性化方法でｍｅｔＡ遺伝子を欠損させて抗生剤耐性付与標式遺伝子を除去した。
配列番号21(KOmetA1):5’-gtgtgccggacgagctacccgccgtcaatttcttgcgtgaagaa
aacgtctttgtgattgcagcattacacgtcttg -3’
配列番号22(KOmetA2):5’-cgggatggcccgtcacaaaggcaatgcgcttatctttactggca
aacagacacttaacggctgacatggga-3’
Ｌ−スレオニンデヒドロゲナーゼ（Ｌ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子であるｔｄｈ欠失菌株製作のために、配列番号２３／２４のプライマー対を使用してワンステップ不活性化方法で、ｔｄｈ遺伝子を欠損させて抗生剤耐性付与標式遺伝子を除去した。
配列番号23(KOtdh1):5’-atgaaagcgttatccaaactgaaagcggaagagggcatctggat
gaccgagattgcagcattacacgtcttg-3’
配列番号24(KOtdh2):5’-atcactttggtccagtcgatagacatatcagacggcggaataccc
agcatcacttaacggctgacatggga-3’
グリオキシレートシャント（ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ ｓｈｕｎｔ）の発現を抑制する調節タンパク質をコードする遺伝子ｉｃｌＲの欠失菌株製作のために、配列番号２５／２６のプライマー対を使用して、ワンステップ不活性化方法でｉｃｌＲ遺伝子を欠損して抗生剤耐性付与標式遺伝子を除去した。
配列番号25(KOiclR1):5’-tgaaaatgatttccacgatacagaaaaaagagactgtcatggtc
gcacccgattgcagcattacacgtcttg-3’
配列番号26(KOiclR2):5’-atagaaattgcggcaaacggttcacggtgctcatcgaaaatac
acgctgccacttaacggctgacatggga-3’
１−７：スレオニンデヒドラターゼの活性が弱化された菌株の製作
Ｌ−スレオニンを基質にして生成されるＬ−イソロイシンの生成量を減らして、Ｌ−スレオニンの生成量を増大させるための目的で、リー等の研究発表（Ｌｅｅ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００３年，第１８５巻，５４４２頁）を参考にして、該当経路の一番目酵素であるスレオニンデヒドラターゼ（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）をコードするｉｌｖＡ遺伝子に部位特異的変異を作って製作された菌株の成長が培地中に添加されるＬ−イソロイシンの濃度によって大きく左右されることを確認した。
【００５７】
まず、大膓菌Ｗ３１１０（ＡＴＴＣ３９９３６）の染色体ＤＮＡを鋳型に使用して配列番号２７／２８のプライマー対を使用してワンステップ不活性化方法でｉｌｖＡ遺伝子を欠失させた後、クロラムフェニコールに対する耐性を示す細胞株を選別して、ＰＣＲ反応でｉｌｖＡ遺伝子が欠失されたことを確認した。
【００５８】
一方、大膓菌Ｗ３１１０（ＡＴＴＣ３９９３６）の染色体ＤＮＡを鋳型に使用して配列番号２９／３０のプライマー対及び配列番号３１／３２のプライマー対を使用して各々ＰＣＲを遂行して６４８ｂｐと６７６ｂｐのＤＮＡ断片を修得し、それらを同一濃度で混ぜて鋳型にして、配列番号２９／３２のプライマーを使用してオーバーラッピングＰＣＲを遂行した。前記ＰＣＲ反応で得られた１２８７ｂｐのＰＣＲ断片をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ酵素で切断して、やはりＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ酵素で切断したｐＳａｃＨＲ０６に挿入した後、塩基配列を分析して、ｉｌｖＡの２９０番目塩基（Ｃ）が（Ｔ）に置換されたことを確認した。前記修得したベクターをＮｈｅＩ酵素で切断して、複製原点を欠失させた後、セルフライゲーションさせて、前記１−６で製作した変異菌株のコンピタント細胞（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）にエレクトロポレーションした。次に、ｓａｃＢ ポジティブセレクション（Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９２年，第１７４巻，５４６２頁）方法とクロラムフェニコールに対する感受性によって選別してその結果、スレオニンデヒドラターゼ活性が低下された菌株を獲得した。
配列番号27(KOilvA1):5’-atcgccagccagtgcacagctttaagctgcgcggcgcatacgcc
atgatggattgcagcattacacgtcttg-3'
配列番号28(KOilvA2):5’-cccctgctgctgtgacagttcgatcgctttggctttcgcttcat
caaagtcacttaacggctgacatggga-3'
配列番号29(ilvA1):5’-gacgggatccgcaaagcctgtgcgctgatcaccgacgg-3’
配列番号30(ilvA2):5’-cacgcctaaccgcgcagaaaaaaacgcgacgccctgcg-3’
配列番号31(ilvA3):5’-cgcagggcgtcgcgtttttttctgcgcggttaggcgtg-3’
配列番号32(ilvA4):5’-caggtactgcagaccggaaagaatatgcgccagccgttcg-3'
１−８：プラスミドｐＭｌｏｘＣの製造
ワンステップ不活性化で遺伝子を欠失させる場合、一つの遺伝子欠失ごとに染色体ＤＮＡにリコンビナーゼの認知部位であるＦＲＴまたはｌｏｘＰ配列が１個ずつ残るようになる。その結果、連続的な多数の遺伝子欠失を遂行時に目的としない部位の欠失が起きて変異菌株製作に困難があった（Ｎａｇｙ Ａ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ，２０００年，第２６巻，９９頁）。スズキ等は、このような問題点を解決するための方案として、ｌｏｘ７１とｌｏｘ６６と命名したｍｕｔａｔ ｌｏｘＰを使用した、改善された遺伝子欠失方法を提示したことがある（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５年，第７１巻，８４７２頁）。それで、本発明者等はそれをさらに容易に使用できるようにｌｏｘ７１とｌｏｘ６６を一緒に導入した新規のベクターであるｐＭｌｏｘＣを製造した。
【００５９】
それのために、ｐＵＧ６プラスミド（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９６年，第２４巻，２５１９頁）をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＶで切断して２，４２７ｂｐのＤＮＡ切片を得て、配列番号３３／３４のプライマー対を使用してｐＡＣＹＣ１８４プラスミド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、米国）を鋳型にＰＣＲを遂行して１１００ｂｐのＰＣＲ断片を修得した。それら断片を各々ＥｃｏＲＶ／ＨｉｎｄＩＩＩとＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩで切断した後、ライゲーションしてｐＭｌｏｘＣを製作した（図２）。
配列番号33(ECmulox_up):5’-atataagctt taccgttcgtatagcatacattatacgaa
gttatctgccctgaaccgacgaccg-3’
配列番号34(ECmulox_do):5’-aattcccggg taccgttcgtataatgtatgctatacgaagt
tatgcatcacccgacgcactttgc -3’
１−９：ｔｄｃＣ遺伝子の欠失
スレオニン／セリントランスポーターをコードする遺伝子であるｔｄｃＣが欠失した菌株を製作するために、前記１−８で製作したｐＭｌｏｘＣベクターを鋳型にして、配列番号３５／３６のプライマー対を使用してＰＣＲ反応を遂行し、修得したＤＮＡ断片を分離精製して、前記精製されたＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号３７／３８のプライマー対を使用してＰＣＲ反応を遂行した。
【００６０】
その結果、修得したＤＮＡ断片を使用して前記記述したワンステップ不活性化方法で ｔｄｃＣ遺伝子を欠損させて、抗生剤耐性付与標式遺伝子を除去した。
配列番号35(KOtdcC1):5’-gcgtaaatcagataccacatggacgttaggcttgtttggtacggc
aatcgtaggtgacactatagaacgcg-3’
配列番号36(KOtdcC3):5’-ccagtgtaatcgcgaacgttgttttggtaccggtcatggacgcaa
agtggtagtggatctgatgggtacc-3’
配列番号37(KOtdcC2):5’-atgagtacttcagatagcattgtatccagccagacaaaacaatcg
tcctggcgtaaatcagataccacat-3’
配列番号38(KOtdcC4):5’-gaagaaagatttgaagatagccacgagtgcgatgatggaagcc
gcatattccagtgtaatcgcgaacgt-3’
１−１０：ｐｐｃ遺伝子のプロモーター置換
染色体上のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするｐｐｃ遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに交替して酵素活性が増大した菌株を製作した。ｐｐｃのプロモーター置換のために前記製作したｐＭｌｏｘＣプラスミドを鋳型に配列番号３９／４０のプライマーを使用してＰＣＲ反応を遂行し、修得したＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号４１／４２のプライマー対を使用してＰＣＲ反応を遂行した。その結果修得したＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号４３／４４のプライマー対でＰＣＲ反応を遂行した。その結果得られた最終のＤＮＡ断片を使用して前記記述したワンステップ不活性化方法と同一方法でｐｐｃ遺伝子に挿入した後、抗生剤耐性標式遺伝子を除去してｐｐｃの元来のプロモーターより強力なｔｒｃプロモーターに交替された菌株を製作した。
配列番号39(FPppc1):5’-ctgcgggcaaccatgcgcaaggggtttccctctcctgcgcgat
Gctgggttaggtgacactatagaacgcg-3'
配列番号40(RPppc1):5’-tctgcgctttggcttccgccatgttggccggagacagagtaaac
aggcagctaaaggcaaagaac-3'
配列番号41(FPppc2):5’-attaagttcactgaccgatgcggaaaaacgcaaaggcgtggtg
gcctgttctgcgggcaaccatgcgcaa-3’
配列番号42(RPppc2):5’-ctgcgggcaaccatgcgcaaggggtttccctctcctgcgcgat
gctgggttaggtgacactatagaacgcg-3’
配列番号43(FPppc3):5’-ggcagctaaaggcaaagaacatcaccactgcaaccatcagca
tgcttagtggatctgatgggtacc-3’
配列番号44(RPppc3):5’-attaagttcactgaccgatgcggaaaaacgcaaaggcgtgtggc
ctgttctgcgggcaaccatgcgcaa-3’
１−１１：ａｃｓ遺伝子のプロモーター置換
スレオニン生成菌株をフェドバッチ（Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）培養する時に生成される酢酸を減少させるための目的で、染色体上のアセチルコーエーシンターゼをコードするａｃｓ遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに交替して酵素活性が増大した菌株を製作した。ａｃｓのプロモーター置換のために前記製作したｐＭｌｏｘＣプラスミドを鋳型に配列番号４５／４６のプライマーを使用してＰＣＲ反応を遂行し、修得したＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号４７／４８のプライマー対を使用してＰＣＲ反応を遂行した。前記ＰＣＲ反応に修得したＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号４９／５０のプライマー対でＰＣＲ反応を遂行し、得られた最終ＤＮＡ断片を使用して前記記述したワンステップ不活性化方法と同一方法でａｃｓ遺伝子に挿入した後、抗生剤耐性標式遺伝子を除去してａｃｓの元来のプロモーターより強力なｔｒｃプロモーターに交替した菌株を製作した。
配列番号45(FPacs1):5’-gcccctatgtgtaacaaataaccacactgtgaatgttgtctaggt
gacactatagaacgcg-3’
配列番号46(RPacs1):5’-tgttatccgctcacaattccacacattatacgagccggatgatta
attgtcaacagctagtggatctgatgggtacc-3’
配列番号47(FPacs2):5’-tcacgacagtaaccgcacctacactgtcatgacattgctcgccc
ctatgtgtaacaaata-3’
配列番号48(RPacs2):5’-cgatgttggcaggaatggtgtgtttgtgaatttggctcatggtctg
tttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattcc-3’
配列番号49(FPacs3):5’-cgaattgcgccattgttgcaatggcggtttttattgtttttcacg
acagtaaccgcacct-3’
配列番号50(RPacs3):5’-ttgttgatacatcgcctcgtactgctgagggtttatcaggcaacgg
tctgcgatgttggcaggaatggtg-3’
１−１２：ｐＢＲＴｈｒＥベクターの製作
（１）ｐＫＫＴｈｒＡＢＣベクターの製作
Ｌ−スレオニン生合成において一番重要なＬ−スレオニン生合成関連オペロン（ｔｈｒＡＢＣ）を含むベクターをクローニングするために、前記１−３で製作したｔｈｒＡのフィードバック阻害が解除された変異株の染色体ＤＮＡを鋳型にして、配列番号５１／５２のプライマー対を使用してＰＣＲ反応を遂行した。その結果、合成されたＤＮＡ断片をＸｍａＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断して、該切断した断片を同一な制限酵素で処理したｐＫＫ２２３−３ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，米国）にクローニングして塩基配列を分析し、９．４ｋｂのＬ−スレオニン生合成関連オペロン（ｔｈｒＡＢＣ）を含むｐＫＫＴｈｒＡＢＣベクターを製作した。
配列番号51(Thr_Xma):5’-gttgcccgggatgcgagtgttgaagttcgg-3’
配列番号52(Thr_Hin):5’-gcgtcaagcttcggcggttgttattctccgc-3’
（２）ｐＢＲＴｈｒＡＢＣベクターの製作
前記製作したｐＫＫＴｈｒＡＢＣベクターのプラスミド安定性を高めるために、ｐＢＲ３２２ベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、米国）をＮｄｅＩとＳａｌＩで切断してｒｏｐ遺伝子を含む１．６ｋｂのＤＮＡ切片を獲得し、前記（１）で製作したｐＫＫＴｈｒＡＢＣベクターを同じ酵素で切断して、７．８ｋｂのＤＮＡ切片を獲得した後、それらをライゲーションして、９．４ｋｂのｐＢＲＴｈｒＡＢＣベクターを製作した （図３）。
（３）ｐＢＲｔｈｒＲベクターの製作
前記製作したｐＢＲＴｈｒＡＢＣベクターにスレオニンエクスポーター（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｅｘｐｏｒｔｅｒ）をコードするｒｈｔＣを導入するために、まず大膓菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型にして、配列番号５３及び配列番号５４のプライマー対を使用してＰＣＲ反応を遂行した後、修得されたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断して、同一な酵素で切断したｐＵＣ１９ベクターにクローニングした後、塩基配列を分析してｐＵＣ１９ｒｈｔＣベクターを製作した。以後、前記（２）で製作したｐＢＲＴｈｒＡＢＣベクターとｐＵＣ１９ｒｈｔＣベクターをＢａｍＨＩとＳｐｈＩで同時に切断してクローニングして最終的に１０．７ｋｂのｐＢＲＴｈｒＲベクターを製作した （図４）。
配列番号53(FrhtCEcBa):5’-ctgagaattcggatccagatggctgaacagatgc -3’
配列番号54(RrhtCHiBg):5’-cctacaagcttagatctcaaagcagatgaaggcgc -3’
（４）ｐＢＲｔｈｒＲ２ベクターの製作
前記製作されたｐＢＲＴｈｒＲベクターにスレオニンとホモセリンのエクスポーターとして知られたｒｈｔＡを導入するために、まず大膓菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型にして、配列番号５５及び配列番号５６のプライマー対を使用してＰＣＲ反応を遂行した後、修得されたＤＮＡ断片をＭｌｕＩとＳａｌＩで切断して、前記（３）で製作したｐＢＲＴｈｒＲベクターを同一な酵素で切断してクローニングした後、塩基配列を分析して、１１．１ｋｂのｒｈｔＡが導入されたｐＢＲＴｈｒＲ２ベクターを製作した。
配列番号55(FrhtAMlu):5’-ctgaacgcgtgaactgcgtaagtattacg-3’
配列番号56(FrhtASalPst):5’-ctgacgtcgacctgcagaccatgcagaaatgtaaat -3'
（５）ｐＢＲｔｈｒＥベクターの製作
前記製作されたｐＢＲＴｈｒＲ２ベクターにホモセリン（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ）とホモセリンラクトン（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｌａｃｔｏｎｅ）のエクスポーターと推定されるｒｈｔＢ導入するために、まず大膓菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型にして、配列番号５７及び配列番号５８のプライマー対を使用してＰＣＲ反応を遂行した後、修得されたＤＮＡ断片をＰｓｔＩとＥａｇＩで切断して、同一な酵素で切断したｐＢＲＴｈｒＲ２プラスミドにクローニングした後、塩基配列を確認して、１１．７ｋｂのｒｈｔＢが導入されたｐＢＲＴｈｒＥベクターを製作した（図５）。
配列番号57(FrhtBPst):5’-cgtagctgcagtccacaccagtaaactctg-3’
配列番号58(FrhtBEagAat):5’-catttcggccggacgtcagtcggataaggcgtttac-3’
１−１３：Ｌ−スレオニン生成微生物の製作
前記１−１から１−１１の過程を通じてｔｈｒＡとｌｙｓＣのフィードバック阻害が除去されてスレオニンオペロンのプロモーターがｔａｃプロモーターに置換され、ｌａｃＩ、ｍｅｔＡ、ｌｙｓＡ、及びｔｄｈ遺伝子が欠失された大膓菌ＴＨ０８菌株に、前記１−１２で製作したｐＢＲＴｈｒＲプラスミドを形質導入してＴＨＲ０８菌株を製作した。以後、前記ＴＨ０８菌株のｐｐｃプロモーターがｔｒｃプロモーターに置換されて、ｉｃｌＲとｔｄｃＣ遺伝子が欠失して製作された大膓菌ＴＨ２７菌株に、前記１−１２で製作されたｐＢＲＴｈｒＲとｐＢＲＴｈｒＥのベクターを各々導入してＬ−スレオニン生成微生物ＴＨＲ２７とＴＨＥ２７を製作した。
【００６１】
前記ＴＨ２７菌株のａｃｓ遺伝子のプロモーターをｔｒｃプロモーターに置換して製作された大膓菌ＴＨ２８菌株に前記ｐＢＲＴｈｒＥベクターを導入して、Ｌ−スレオニン生成微生物ＴＨＥ２８を製作した（表１及び図６）。
表１：本発明のスレオニン生成変異微生物
【００６２】
【表１】
【００６３】
実施例２：Ｌ−スレオニン生成微生物ＴＨＲ０８を使用したＬ−スレオニンの製造
前記実施例１で製作したＴＨＲ０８のＬ−スレオニン生成能を確認するために母菌株である大膓菌Ｗ３１１０とＴＨＲ０８菌株のＬ−スレオニン生成能を同じ条件で比較した。前記二つの菌株をアムピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）が５０μｇ／ｍｌ添加されたＬＢ平板培地で継代培養してそれを表２の力価培地に接種して２５０ｒｐｍ、３１℃で４８時間培養した。以後、培養液に存在するＬ−スレオニンの濃度をＨＰＬＣで測定した。
【００６４】
その結果、表３に示したように、Ｗ３１１０野生菌株では生成されなかった Ｌ−スレオニンがＴＨＲ０８菌株では１７．８〜１８．４ｇ／ｌ生成されることを確認した。
表２：Ｌ−スレオニン力価培地組成
【００６５】
【表２】
【００６６】
＊微量メタル溶液（蒸留水１リットル当り１０ｇ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．３５ｇ ＣａＣｌ２、２．２５ｇ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、１ｇ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．１０６ｇ（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、０．２３ｇ Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、３５％ ＨＣｌ １０ｍｌ含有）
表３：菌株別Ｌースレオニン生成量
【００６７】
【表３】
【００６８】
実施例３：Ｌ−スレオニン生成微生物ＴＨＲ２７及びＴＨＥ２７を使用したＬ−スレオニンの製造
前記実施例１で製作した微生物ＴＨＲ２７とＴＨＥ２７のＬ−スレオニン生成能を確認するために、それら微生物をアムピシリンが５０μｇ／ｍｌ添加されたＬＢ平板培地で選別した。選別した菌株を５ｇ／ｌグルコース、０．１５ｇ／ｌ Ｌ−メチオニン、０．２２ｇ／ｌ Ｌ−リジンを含む５０ｍｌのＬＢ培地が入っている５００ｍｌサカグチフラスコ４個に各々１％ずつ接種して３１℃で１２時間、毎分２５０回往復振蕩培養して全培養液を獲得した。Ｌ−スレオニンの生産のために表４の組成を有する生産培地を５ｌ小型醗酵槽に１．８ｌ入れて、前記修得した全培養液２００ｍｌを醗酵槽に接種して酸素分圧４０％を維持するように撹拌速度を自動で調節して３１℃で培地中の添加されたブドウ糖濃度が０ｇ／ｌになるまで培養した。
【００６９】
ここで、ｐＨはアンモニア水を使用して６．０〜６．５に維持した。醗酵終了後醗酵液内のＬ−スレオニン蓄積量は、表５のとおりである。表５に示したように、Ｌ−スレオニン生産量は、母菌株であるＴＨＲ０８菌株は９．２ｇ／ｌである一方、それから製作された残りの菌株は１１．２〜１１．９ｇ／ｌの向上した結果を示した。この結果を基に濃度が母菌株対比２１．７〜２９．４％程度向上したことを観察した。
表４：Ｌ−スレオニン生産培地
【００７０】
【表４】
【００７１】
＊ 微量メタル溶液（蒸留水１リットル当り１０ｇ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．３５ｇ ＣａＣｌ２、２．２５ｇ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、１ｇ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．１０６ｇ（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、０．２３ｇ Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、３５％ ＨＣｌ １０ｍｌ含有）
表５：Ｌースレオニン生成量
【００７２】
【表５】
【００７３】
実施例４：Ｌ−スレオニン生成微生物ＴＨＥ２７及びＴＨＥ２８のフェドバッチ培養を使用した Ｌ−スレオニンの製造
前記実施例１で製作した微生物ＴＨＥ２７とＴＨＥ２８のＬ−スレオニン生成能をフェドバッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）培養で確認するためにそれら微生物をアムピシリンが５０μｇ／ｍｌ添加されたＬＢ平板培地で選別した。選別した菌株を５ｇ／ｌグルコース、０．１５ｇ／ｌ Ｌ−メチオニン、０．２２ｇ／ｌ Ｌ−リジンを含む５０ｍｌのＬＢ培地が入っている５００ｍｌサカグチフラスコ４個に各々１％ずつ接種して３１℃で１２時間の間、毎分２５０回往復振盪培養して全培養液を獲得した。Ｌ−スレオニンの生産のために表４の組成を有するスレオニン生産培地を５Ｌ小型醗酵槽に１．８ｌ入れて、前記修得した全培養液２００ｍｌを醗酵槽に接種して酸素分圧４０％を維持するように撹拌速度を自動で調節して、３１℃で培地中の添加されたブドウ糖濃度が１ｇ／ｌ未満に減少すると、スレオニン添加培地（表６）を１４回まで添加して培養した。ここで、ｐＨはアンモニア水を使用して６．０〜６．５に維持した。
【００７４】
醗酵終了後、醗酵液内のＬ−スレオニン蓄積量は表７のとおりである。表７に示したように、Ｌ−スレオニン生産量は、ＴＨＥ２７菌株は７７．１ｇ／ｌである一方、それから製作されたＴＨＥ２８菌株は８２．４ｇ／ｌの向上した結果を示し、主要副産物であるアセテートの場合、ＴＨＥ２７菌株は７．８５ｇ／ｌを生成した一方、ＴＨＥ２８菌株は２．３５ｇ／ｌで、母菌株に比較して約７０％が減少した結果を示した。その結果、培養時間も５６．１時間から５０時間に約１０．９％短縮され、Ｌ−スレオニンの生産性が約２０．４％増加する結果を示した。
表６：Ｌ−スレオニン添加培地
【００７５】
【表６】
【００７６】
表７：Ｌースレオニン生成量
【００７７】
【表７】
【産業上の利用可能性】
【００７８】
以上で詳しく説明して立証したように、本発明は、部位特異的変異技法だけで製作されたＬ−スレオニン高生成能を有する変異微生物及び該変異微生物を使用したＬ−スレオニンの製造方法を提供する効果がある。本発明の微生物を使用すると、高収率のＬ−スレオニンを生成することができ、Ｌ−スレオニン生成微生物の遺伝特性に対する正確な情報を知ることができるので追加的な菌株開発とその生理現象に対する理解を容易にできる。
【００７９】
以上で本発明内容の特定部分を詳しく記述しましたが、当業界の通常の知識を有する者において、このような具体的技術は単に好ましい実施様態であるだけであり、それによって本発明の範囲が制限されるものではないことは、明白だろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付された請求項とそれらの等価物によって定義される。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】ｐＳａｃＨＲ０６ベクターの製作過程を示した図である。
【図２】ｌｏｘ６６とｌｏｘ７１及び抗生剤クロラムフェニコール耐性付与遺伝子を有している組換えベクターｐＭｌｏｘＣの系列地図を示した図である。
【図３】ｔｈｒＡＢＣオペロンを含む組換えベクターｐＢＲＴｈｒＡＢＣの製作過程を示した図である。
【図４】ｔｈｒＡＢＣオペロンを含み、ｒｈｔＣを有している組換えベクターｐＢＲＴｈｒＲの製作過程を示した図である。
【図５】ｔｈｒＡＢＣオペロンを含み、ｒｈｔＣ、ｒｈｔＢ、及びｒｈｔＡを有する組換えベクターｐＢＲＴｈｒＥの製作過程を示した図である。
【図６】大膓菌野生菌株Ｗ３１１０から目的遺伝子のみを操作して本発明によるＬ−スレオニン生成微生物を製作する過程を示した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高収率のＬ−スレオニン生成変異微生物及び該微生物を使用したＬ−スレオニンの製造方法に関するもので、より詳細には、突然変異誘発源の処理のような無作為的変異技法ではない、部位特異的変異技法のみを使用して製作された高濃度、高収率のＬ−スレオニン生成変異微生物、その製造方法及び前記微生物を使用したＬ−スレオニンの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−スレオニンは、微生物醗酵技術によって生産されていて、大膓菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、セラチア菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ）の野生株から突然変異誘発源の処理による選別過程を通じて誘導された突然変異株を使用して生産されている。例えば、大韓民国特許登録第１１５３９３号には、無作為突然変異誘発源の一種であるＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを大膓菌属微生物に処理して、６−ジメチルアミノプリン、９−アザアデニン、８−アザジアミノプリン等のプリン類似体に対する耐性を付与して、Ｌ−スレオニンを生産する微生物を選別する方法が記述されていて、韓国登録特許第１６８７１９号には、セラチア属細菌の野生株から突然変異誘発源を使用してリジン類似体のＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システインに対する耐性と抗生物質の一種であるリファムピシン（Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ）に対する耐性付与を通じて、Ｌ−スレオニンを生産する微生物を選別する方法に対して記述されている。また、日本特許公開第２２４６８４／８３号には、ブレビバクテリウム属に属して、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン及びα−アミノ−β−ヒドロキシバレリン酸に対する耐性を有して、Ｌ−イソロイシン及びＬ−リジン栄養要求性微生物を使用する方法が記述されている。
【０００３】
一方、遺伝子組換え技術が発展するにつれて、無作為的突然変異法によって開発された Ｌ−スレオニン生産株を対象に部位特異的な遺伝子置換、遺伝子増幅及び欠失などを導入してより向上したＬ−スレオニン生産株の開発に対する技術が報告されている。例えば、大韓民国登録特許第３９７４２３号には、反復的な突然変異誘発と選別過程を通じて製作されたメチオニン要求性、スレオニン類似体（α−アミノ−β−ヒドロキシバレリン酸）に対する耐性、リジン類似体（Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン）に対する耐性、及びイソロイシン類似体（例、α−アミノブチル酸）に対する耐性などを有するＬ−スレオニン生産株を遺伝工学的技法を使用してホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）遺伝子とスレオニンオペロンを染色体ＤＮＡ中の特定部位に１コピー以上挿入したことを特徴とする微生物による、Ｌ−スレオニン生産方法が記述されていて、この外にも前記のような突然変異株に遺伝子組換え技術を適用したＬ−スレオニン生産菌株の開発技術に対して多くの報告がある（ＵＳ２００５／００３２１７８、ＵＳ２００４／０２１４２９４、ＵＳ００５９３９３０７）。
【０００４】
しかし、上述したすべての公知の方法は、無作為的変異を起こす突然変異誘発源の処理によって製作された菌株を根幹にして開発されたため、様々な決定的な短所を有している。突然変異誘発源の処理と菌株選別過程を通じて高収率のＬ−スレオニン生産菌株の開発が可能だったことは事実だが、選別された生産菌株は突然変異誘発源処理過程で不可欠に隋伴する多数の無作為変異等によって、一般的にその母菌株に比較して菌体成長速度の低下、糖消耗速度の低下及び外部環境変化に対する耐性減少などのアミノ酸の産業的生産に不利な様々な生理的特性を有するようになる。また、突然変異誘発源の処理によって生じた確認しにくい多数の変異等によって追加的な菌株開発に多くの難しさが存在し、なによりも生産性を向上させるには限界が付きまとうという短所がある。
【０００５】
そのため、最近では遺伝工学の発展とともに微生物染色体の全体塩基配列が明かされるようになり、上述した無作為突然変異法の問題点を克服するために、無作為的突然変異法を排除した新しい試みが行われている。反復的な無作為突然変異法によって開発されたリジン生産コリネ型細菌とｗｉｌｄ−ｔｙｐｅコリネ型細菌間の比較遺伝体研究を使用して、リジン生産に有利な主要変異のみを選別して、それを使用した高収率のリジン生産菌株開発に関する研究が報告されたことがある（Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｊ．等，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００３年，第５８巻，２１７頁，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍ．等，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００６年，第７２巻，７８３頁）。
【０００６】
また、ベロニカ（Ｖｅｒｏｎｉｋａ）等は、コリネ型細菌を使用して遺伝子ｉｌｖＡとｐａｎＢを不活性化して、Ｌ−バリン生合成に関与するオペロン（ｉｌｖＢＮＣ）を増幅した後、ｉｌｖＮ遺伝子に存在するフィードバック阻害を除去して、１３０ｍＭのＬ−バリンを生成したと報告したことがある（Ｖｅｒｏｎｉｋａ等，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００５年，第７１巻，２０７頁）。また、コリネ型細菌を使用して合理的デザイン（ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ）による８６ｍＭのＬ−セリン生成に関する研究も発表された（Ｐｅｔｅｒｓ−Ｗｅｎｄｉｓｃｈ 等，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００５年，第７１巻，７１３９頁）。それらは、すべて無作為的突然変異法を排除してｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎによる部位特異的変異だけで菌株開発を遂行した研究結果であるが、前述したリジン生産菌株を除きすべて産業的に使用可能性が非常に低い低収率の研究結果である。また、いまだにｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎによる菌株開発を通じて高収率のＬ−スレオニンを生成した例は、報告されたことがない。
【０００７】
ゆえに、既存の無作為突然変異法による菌株開発が有する短所を排除することができるｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ方法による高収率のＬ−スレオニン生産菌株の開発が切実に求められている。
【０００８】
以上のことに鑑みて、本発明者等は、既存の無作為突然変異法による菌株が有する短所を克服することができる変異微生物を開発しようと鋭意努力した結果、部位特異的な突然変異技法のみを使用して、Ｌ−スレオニン生成変異微生物を製造し、該微生物を使用して、高収率、高濃度のＬ−スレオニンを生産することができるということを確認して、本発明を完成した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
結局、本発明の目的は、部位特異的変異のみを使用することを特徴とする高収率、高濃度のＬ−スレオニン生成変異微生物の製造方法を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記方法で製造された高収率、高濃度のＬ−スレオニン生成変異微生物及び該微生物を培養することを特徴とする、Ｌ−スレオニンの製造方法を提供することである。
【００１１】
前記目的を達成するために本発明は、部位特異的変異技法で（ａ）ｌａｃオペロンのリプレッサー（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）をコードする遺伝子、ホモセリンＯ−スクシニル転移酵素をコードする遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びＬ−スレオニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失：（ｂ）アスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩの活性阻害を防ぐための、アスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩをコードする遺伝子の変異；（ｃ）Ｌ−スレオニンオペロンプロモーターまたはアセチルコーエーシンターゼのプロモーターのストロングプロモーターへの置換を誘導することを特徴とする高濃度及び高収率のＬ−スレオニン生成変異微生物の製造方法を提供する。
【００１２】
本発明は、また、前記方法で製造された変異微生物にＬ−スレオニンオペロン遺伝子、スレオニンエクスポーター（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｅｘｐｏｒｔｅｒ）をコードする遺伝子、スレオニンとホモセリンのエクスポーターをコードする遺伝子及びホモセリンとホモセリンラクトン（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｌａｃｔｏｎｅ）のエクスポーターをコードする遺伝子からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を含有するベクターを導入することを特徴とする組換え変異微生物の製造方法を提供する。
【００１３】
本発明は、また、（ａ）ｌａｃオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子、ホモセリンＯ−スクシニル転移酵素をコードする遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びＬ−スレオニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が欠失されていて、（ｂ）アスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩの活性阻害を防ぐためにアスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩをコードする遺伝子が変異されていて、（ｃ）Ｌ−スレオニンオペロンのプロモーターまたはアセチルコーエーシンターゼのプロモーターがストロングプロモーターに置換されていることを特徴とする高濃度及び高収率のＬ−スレオニン生成変異微生物を提供する。
【００１４】
本発明は、また、前記変異微生物にＬ−スレオニンオペロン遺伝子、スレオニンエクスポーター（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｅｘｐｏｒｔｅｒ）をコードする遺伝子、スレオニンとホモセリンのエクスポーターをコードする遺伝子及びホモセリンとホモセリンラクトン（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｌａｃｔｏｎｅ）のエクスポーターをコードする遺伝子からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を含むベクターが導入されていることを特徴とする組換え変異微生物を提供する。
【００１５】
本発明は、また、（ａ）ｌａｃオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子、ホモセリンＯ−スクシニル転移酵素をコードする遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びＬ−スレオニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が欠失されていて、（ｂ）アスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩの活性阻害を防ぐためにアスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩをコードする遺伝子が変異されていて、（ｃ）Ｌ−スレオニンオペロンのプロモーターまたはアセチルコーエーシンターゼのプロモーターがストロングプロモーターに置換されていることを特徴とする高濃度及び高収率のＬ−スレオニン生成変異微生物を提供する。
【００１６】
本発明は、また、前記変異微生物にＬ−スレオニンオペロン遺伝子、スレオニンエクスポーターをコードする遺伝子、スレオニンとホモセリンのエクスポーターをコードする遺伝子及びホモセリンとホモセリンラクトンのエクスポーターをコードする遺伝子からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を含むベクターが導入されていることを特徴とする組換え変異微生物を提供する。
【００１７】
本発明は、また、ｌｏｘ６６遺伝子、ｌｏｘ７１遺伝子及び抗生剤耐性標式遺伝子を同時に含むワンステップ不活性化用ベクターを提供する。
【００１８】
本発明は、また、前記微生物を培養することを特徴とするＬ−スレオニンの製造方法を提供する。
【００１９】
本発明の他の特徴及び具現例は、次の詳細な説明及び添付された特許請求の範囲からさらに明らかになるだろう。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
一観点で、本発明は、部位特異的変異技法で（ａ）ｌａｃオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子、ホモセリンＯ−スクシニル転移酵素をコードする遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びＬ−スレオニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失：（ｂ）アスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩの活性阻害を防ぐための、アスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩをコードする遺伝子の変異；（ｃ）Ｌ−スレオニンオペロンプロモーターまたはアセチルコーエーシンターゼのプロモーターのストロングプロモーターへの置換を誘導することを特徴とする高濃度及び高収率のＬ−スレオニン生成変異微生物の製造方法に関するものである。
【００２１】
本発明による変異微生物の製造方法において、グリオキシレートシャントの発現を抑制する調節タンパク質をコードする遺伝子及びスレオニン／セリントランスポーターをコードする遺伝子を欠失させる場合、Ｌ−スレオニン生成能を増加させることができる。同時に、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーターをストロングプロモーターに置換する場合にもＬ−スレオニン生成能を増加させることができる。
【００２２】
他の観点で、本発明は、前記方法で製造された変異微生物にＬ−スレオニンオペロン遺伝子、スレオニンエクスポーターをコードする遺伝子、スレオニンとホモセリンのエクスポーターをコードする遺伝子及びホモセリンとホモセリンラクトンのエクスポーターをコードする遺伝子からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を含むベクターを導入させることを特徴とする、組換え変異微生物の製造方法に関するものである。
【００２３】
また他の観点で、本発明は、（ａ）ｌａｃオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子、ホモセリンＯ−スクシニル転移酵素をコードする遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びＬ−スレオニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が欠失されていて、（ｂ）アスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩの活性阻害を防ぐためにアスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩをコードする遺伝子が変異されていて、（ｃ）Ｌ−スレオニンオペロンのプロモーターまたはアセチルコーエーシンターゼのプロモーターがストロングプロモーターに置換されていることを特徴とする、高濃度及び高収率のＬ−スレオニン生成変異微生物に関するものである。
【００２４】
本発明において、前記微生物は、バクテリア、酵母及びカビからなる群から選択されることを特徴とすることができ、前記バクテリアは、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属及び大膓菌からなる群から選択されることを特徴とできる。
【００２５】
本発明による変異微生物は、グリオキシレートシャントの発現を抑制する調節タンパク質をコードする遺伝子及びスレオニン／セリントランスポーターをコードする遺伝子がさらに欠失していることを特徴とでき、同時にホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーターがストロングプロモーターで追加に置換されていることを特徴とできる。
【００２６】
本発明において、前記ストロングプロモーターは、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターからなる群から選択されることを特徴とできる。
【００２７】
また他の観点で、本発明は、前記変異微生物にＬ−スレオニンオペロン遺伝子、スレオニンエクスポーターをコードする遺伝子、スレオニンとホモセリンのエクスポーターをコードする遺伝子及びホモセリンとホモセリンラクトンのエクスポーターをコードする遺伝子からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を含むベクターが導入されていることを特徴とする組換え変異微生物に関するものである。
【００２８】
また他の観点で、本発明は、（ａ）ｌａｃオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子、ホモセリンＯ−スクシニル転移酵素をコードする遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びＬ−スレオニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が欠失されていて、（ｂ）アスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩの活性阻害を防ぐためにアスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩをコードする遺伝子が変異されていて、（ｃ）Ｌ−スレオニンオペロンのプロモーターまたはアセチルコーエーシンターゼのプロモーターがストロングプロモーターに置換されていることを特徴とする、高濃度及び高収率のＬ−スレオニン生成変異微生物に関するものである。
【００２９】
本発明において、前記微生物は、バクテリア、酵母及びカビからなる群から選択されることを特徴にでき、前記バクテリアは、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属及び大膓菌からなる群から選択されることを特徴にできる。
【００３０】
本発明による変異微生物は、グリオキシレートシャントの発現を抑制する調節タンパク質をコードする遺伝子及びスレオニン／セリントランスポーターをコードする遺伝子がさらに欠失されていることを特徴にでき、同時にホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーターがストロングプロモーターにさらに置換されていることを特徴にできる。
【００３１】
本発明において、前記ストロングプロモーターは、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターからなる群から選択されることを特徴にできる。
【００３２】
また他の観点で、本発明は、前記変異微生物にＬ−スレオニンオペロン遺伝子、スレオニンエクスポーターをコードする遺伝子、スレオニンとホモセリンのエクスポーターをコードする遺伝子及びホモセリンとホモセリンラクトンのエクスポーターをコードする遺伝子からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を含むベクターが導入されていることを特徴とする組換え変異微生物に関するものである。
【００３３】
本発明において、変異微生物の母微生物は、Ｌ−スレオニンを生産することができ、無作為的変異を有していない微生物なら原核微生物及び真核微生物のいずれでも使用することができる。
【００３４】
例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、コリネバクテリウム属及びブレビバクテリウム属に属する微生物菌株を含むことができ、腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科に属する微生物であることが好ましく、さらに好ましくは大腸菌属に属する微生物である。
【００３５】
また、前記無作為的突然変異を誘発する変異源は、当業界に公知された物理的または化学的方法に使用されるすべての物質を含む。例えば、物理的方法に使用されるものとしては、Ｘ線または紫外線などを含んだすべての無作為的突然変異を起こすことができるものなどであり、化学的方法に使用される物質としては、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｎｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ，ＮＴＧ）、ジエチルスルファート及びエチルアミンなどを含んだすべての化学変異剤である。
【００３６】
本発明の変異微生物は、部位特異的変異によってＬ−スレオニン生成に関与する主要調節機序であるフィードバック阻害と減衰機序（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）が除去され、Ｌ−スレオニン生合成経路と競争的な経路に該当するリジン生合成経路、メチオニン生合成経路、及びスレオニン分解経路などが不活性化され、Ｌ−スレオニンから生成されるＬ−イソロイシンの生合成経路が弱化され、Ｌ−スレオニン生合成関連オペロンの元来のプロモーターとアッテネータ（ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ）を含んだ部位がストロングプロモーターに置換されたことを特徴とする。
【００３７】
本発明の他の様態としては、前記変異微生物はＬ−スレオニンの生合成の重要前駆物質であるオキサロアセテートの増大のためにｉｃｌＲの不活性化と染色体上のｐｐｃ遺伝子の元来のプロモーターがストロングプロモーターに置換されたことを特徴とする。また、前記微生物は、Ｌ−スレオニンオペロンと細胞内のＬ−スレオニンの排出と係わるｒｈｔＣ、ｒｈｔＡ、及びｒｈｔＢなどの遺伝子がすべて組換えベクターに挿入され、それらの活性が強化されたことを特徴とする。
【００３８】
本発明において、リジン生合成経路の不活性化は、Ｌ−リジン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子であるｌｙｓＡ（ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅをコードする遺伝子）の不活性化によることを特徴とし、メチオニン生合成経路の不活性化は、Ｌ−メチオニン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子であるｍｅｔＡ（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ Ｏ−ｓｕｃｃｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅをコードする遺伝子）の不活性化によることを特徴とし、スレオニン分解経路の不活性化は、遺伝子ｔｄｈ（Ｌ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅをコードする遺伝子）とｔｄｃＣ（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ／ｓｅｒｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒをコードする遺伝子）の不活性化によることを特徴とする。
【００３９】
また、Ｌ−イソロイシンの生合成経路の弱化は、遺伝子ｉｌｖＡ（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅをコードする遺伝子）の部位特異的変異によってそのタンパク質の酵素活性が弱化されたことを特徴とする。
【００４０】
本発明において、前記不活性化された遺伝子というのは、宿主内の該当の遺伝子と配列相同性を有しているポリヌクレオチド配列を含むが、欠失、置換、切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）及び逆位のような突然変異が導入されて活性あるタンパク質産物を発現することができないポリヌクレオチド配列を意味する。前記不活性化された遺伝子またはその断片を宿主細胞内で導入する過程は例えば、形質転換、接合、形質導入または電気穿孔によって行うことができるが、それらに限定されるものではない。
【００４１】
また他の観点で本発明は、ｌｏｘ６６遺伝子、ｌｏｘ７１遺伝子及び抗生剤耐性標式遺伝子を同時に含むワンステップ不活性化用ベクターに関するものである。本発明において、前記ベクターはｐＭｌｏｘＣであることを特徴とする。
【００４２】
また他の観点で本発明は、前記Ｌ−スレオニン高生成能を有する変異微生物を培養することを特徴とするＬ−スレオニンの製造方法に関するものである。
【００４３】
本発明によるＬ−スレオニンの製造方法において、前記微生物の培養過程は当業界に知られた適当な培地と培養条件によって成され得る。このような培養過程は、当業者なら選択した菌株によって容易に調整して使用することができる。前記培養方法の例には、回分式、連続式及び流加式培養が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００４４】
また、培養物からのＬ−スレオニンの分離は、当業界に知られた通常的な方法によって分離することができる。このような分離方法には、遠心分離、ろ過、イオン交換クロマトグラフィー及び結晶化などの方法が使用できる。例えば、培養物を低速遠心分離してバイオマスを除去して得られた上澄み液をイオン交換クロマトグラフィーを通じて分離することができるが、それらの例に限定されるものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
実施例
以下、本発明を実施例によってより詳細に説明する。これら実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないということは、当業界で通常の知識を有する者において自明なことである。
【００４６】
下記の実施例では、大膓菌Ｗ３１１０に部位特異的な遺伝子変異を導入して、高濃度のＬ−スレオニンを生産する菌株を製作したが、他の大膓菌及び微生物を使用して同一な遺伝子を部位特異的に欠失及び変異させて高濃度、高収率のＬ−スレオニン生産菌株を製造することは、当業界で通常の知識を有した者において自明だろう。
実施例１：Ｌ−スレオニン高生成微生物の製作
１−１：ｐＳａｃＨＲ０６の製作
ｔｈｒＡのフィードバック阻害を除去するために、染色体ＤＮＡの特定塩基または塩基の置換のためにバシラス・サブチリス来由のｓａｃＢ相同性組換え技法（Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９２年，第１７４巻，５４６２頁）を使用する目的でｐＳａｃＨＲ０６ベクターを製作した（図１）。
【００４７】
まず、ｐＵＣ１９ベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、米国）のアムピシリンに対する耐性特性をカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）に対する耐性特性に置換するためにｐＵＣ１９をＮｄｅＩ及びＡｈｄＩで切断して得た１．５ｋｂ切片をｐＡＣＹＣ１７７ベクター（Ｎｅｗ−Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、米国）をＳｔｕＩで切断して得た１．３ｋｂ切片とライゲーションさせてｐＵＣ１９ＫＭベクターを製作した。
【００４８】
次に、前記ｐＵＣ１９ＫＭベクターをＰｖｕＩＩで切断して得た２．５ｋｂ切片とｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）ベクターをＰｖｕＩＩで切断して得た４００ｂｐ切片をライゲーションしてｐＵＣ１９ＫＫＳベクターを得た。前記ｐＵＣ１９ＫＫＳベクターのＤＮＡ複製原点を容易に除去するために、配列番号１／２のプライマーとｐＵＣ１９ベクター鋳型を使用してＰＣＲを遂行した。その結果、同一な切断酵素の認識部位を両末端に各々有していて、ＤＮＡ複製基点を有するＤＮＡ切片を獲得した。前記切片をＳａｌＩ及びＤｒａＩＩＩで切断して、ｐＵＣ１９ＫＫＳベクターをＳａｌＩ及びＤｒａＩＩＩで切断して得た１．５ｋｂ切片とライゲーションさせてｐＵＣ１９Ｋベクターを製作した。前記ｐＵＣ１９Ｋベクターにバシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｓａｃＢ遺伝子を導入するためにバシラス・サブチリスのゲノムＤＮＡを鋳型にして、配列番号３／４のプライマーを使用してＰＣＲを遂行してｓａｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片を合成し、該合成されたＤＮＡ断片及びｐＵＣ１９ＫベクターをＸｂａＩ及びＳｐｅＩで切断した後、ライゲーションしてｓａｃＢ遺伝子を有するｐＳａｃＨＲ０６ベクターを製作した（図１）。
【００４９】
ｐＳａｃＨＲ０６ベクターは、バシラス・サブチリス来由のｓａｃＢ遺伝子を有し、制限酵素を使用して容易にＤＮＡ複製原点を除去して、またライゲーションを遂行することができるので、ｓａｃＢポジティブセレクションに使用可能である。
配列番号1(pucoriup):5’-agccgtcgacgctagcgcatgcacgcgtgtgcacccatgggacg
tcctcactgactcgctgcgctc-3’
配列番号2(pucorido):5’-ggctcacaacgtggctagcgacgtcgtgcacccatgggttccac
tgagcgtcagacc-3
配列番号3(sacBf):5’-actctctagacgcgggtttgttactgataa-3’
配列番号4(sacBr):5’-gctagatatcaggatatcggcattttcttt-3’
１−２：大膓菌Ｗ３１１０からｌａｃＩ遺伝子の欠失
大膓菌Ｗ３１１０（ＡＴＴＣ３９９３６）で配列番号５及び配列番号６のプライマーを使用したワンステップ不活性化（ｏｎｅ ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）方法（Ｗａｒｎｅｒ等，ＰＮＡＳ，２０００年，第６巻，６６４０頁）を使用して、ｌａｃオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子で、ラクトース分解を担当するｌａｃオペロンの転写を抑制する機能を有するｌａｃＩ遺伝子を欠失させて、抗生剤耐性を除去して、大膓菌Ｗ３１１０ΔｌａｃＩを製作した。
配列番号5(lacI_1stup):5’-gtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtg
tctcttagattgcagcattacacgtcttg-3’
配列番号6(lacI_1stdo):5’-tcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgc
attaatgcacttaacggctgacatggg-3’
１−３：ｔｈｒＡのフィードバック阻害除去
１−１で製作した相同性組換えベクターであるｐＳａｃＨＲ０６と１−２で製作した5Ｗ３１１０ΔｌａｃＩを使用してリー等の研究発表（Ｌｅｅ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００３年、第１８５巻，５４４２頁）を参考にして、アスパルトキナーゼＩ（ａｓｐａｒｔｏｋｉｎａｓｅ Ｉ）をコードするｔｈｒＡのフィードバック阻害を除去した。
【００５０】
大膓菌Ｗ３１１０（ＡＴＴＣ３９９３６）の染色体ＤＮＡを公知の方法で分離及び精製して（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９年）、それを鋳型に使用して配列番号７／８のプライマー対と配列番号９／１０のプライマー対を各々使用してＰＣＲを遂行した後、修得された二つのＰＣＲ切片を同一な濃度で混ぜて鋳型にして、配列番号７／１０のプライマーを使用してオーバーラッピングＰＣＲを遂行した。前記方法で得た１２７９ｂｐのＰＣＲ断片をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ酵素で切断して、やはりＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ酵素で切断したｐＳａｃＨＲ０６に挿入した後、塩基配列を分析して、ｔｈｒＡの１０３４番目塩基（Ｃ）が（Ｔ）に置換されたことを確認した。
【００５１】
前記修得したベクターをＮｈｅＩ酵素で切断して、複製原点を欠失させた後、セルフライゲーションさせて、５Ｗ３１１０ΔｌａｃＩコンピタント細胞でエレクトロポレーションした。次に、ｓａｃＢポジティブセレクション方法によってｔｈｒＡのフィードバック阻害が除去された菌株を修得した。
【００５２】
配列番号7(thrA1):5’-acgcggatccatcgccattatggccggcgtattagaagc-3’
配列番号8(thrA2):5’-gattgcgtaatcagcaccacgaaaatacgggcgcgtgacatcg-3’
配列番号9(thrA3):5’-cgatgtcacgcgcccgtattttcgtggtgctgattacgcaatc-3’
配列番号10(thrA4):5’-cacgcgtcgacctggaagtgcagttaacaatgaccggg-3’
１−４：ｌｙｓＣのフィードバック阻害除去
前記１−３のｔｈｒＡのフィードバック阻害が除去された菌株にすでに発表された研究結果（Ｏｇａｗａ−Ｍｙｙａｔａ等，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１年，第６５巻，１１４９頁）を参考にして、アスパルトキナーゼＩＩＩ（ａｓｐａｒｔｏｋｉｎａｓｅ ＩＩＩ）をコードする遺伝子であるｌｙｓＣのフィードバック阻害を除去した。大膓菌Ｗ３１１０（ＡＴＴＣ３９９３６）の染色体ＤＮＡを鋳型に使用して、配列番号１１／１２のプライマー対と配列番号１３／１４のプライマー対を各々使用してＰＣＲを遂行した後、修得された二つのＰＣＲ断片を同一な濃度で混ぜて鋳型にして、配列番号１１／１４のプライマー対を使用してオーバーラッピングＰＣＲを遂行した。前記方法で得た１４８４ｂｐのＰＣＲ断片をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで切断して、やはりＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ酵素で切断したｐＳａｃＨＲ０６に挿入した後、塩基配列を分析して、ｌｙｓＣの１０５５番目塩基（Ｃ）が（Ｔ）に置換されたことを確認した。
【００５３】
前記修得したベクターをＮｈｅＩ酵素で切断して、複製原点を欠失させた後、セルフライゲーションさせて、前記１−３で製作したｔｈｒＡのフィードバック阻害が除去された大膓菌のコンピタント細胞（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）にエレクトロポレーションした。次に、ｓａｃＢポジティブセレクション方法によってｌｙｓＣのフィードバック阻害が除去された菌株を修得した。
配列番号11(lysC1):5’-ctgatgtcgaccctgctgtttgttgagatcctgcgc-3’
配列番号12(lysC2):5’-ggttgaaccggtggtatcaaggataatgccacgctcacttctg-3’
配列番号13(lysC3):5’-cagaagtgagcgtggcattaatccttgataccaccggttcaacc-3’
配列番号14(lysC4):5’-ccagctaaatgacgcttcaggatccggtttataag-3’
１−５：Ｌ−スレオニンオペロン（ｔｈｒＡＢＣ）のプロモーター置換
１−４で製作されたｔｈｒＡ遺伝子とｌｙｓＣ遺伝子のフィードバック阻害が除去された大膓菌Ｗ３１１０で、減衰機序（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）による転写発現調節を除去するためにアッテネータ（ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ）配列を含むスレオニンオペロンのプロモーターを強力なプロモーターであるｔａｃプロモーターに置換した。
【００５４】
そのために配列番号１５／１６のプライマー対を大膓菌Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを遂行して７２５ｂｐのＰＣＲ断片を獲得した後、該断片をＰｖｕＩＩとＳｐｈＩで切断して、切断した断片をｐＫＫ２２３−３ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、米国）の該当酵素切断部位にクローニングした。
【００５５】
一方、配列番号１７／１８のプライマーを使用してＰＣＲを遂行して７０５ｂｐのＰＣＲ断片を獲得した後、ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで切断してそれを同一な酵素で切断したｐＫＫ２２３−３とライゲーションさせて、クローニングを遂行した。前記ベクターの塩基配列を分析した後、ＰｖｕＩＩ及びＰｓｔＩで切断した断片を同一な酵素で切断したｐＳａｃＨＲ０６ベクターとライゲーションした後、ｔｈｒＡ遺伝子とｌｙｓＣ遺伝子のフィードバック阻害が除去された大膓菌Ｗ３１１０に形質転換させてアッテネータを含むプロモーターがｔａｃプロモーターに置換された大膓菌を製作した。
配列番号15(thrAT1):5’-gcagccagctgtagcgatctgcggattgtcgatagt -3’
配列番号16(thrAT2):5’-caggagcatgccagaagctgctatcagacactcttt-3’
配列番号17(thrAT3):5’-cagcagaattcatgcgagtgttgaagttcggcggta -3’
配列番号18(thrAT4):5’-cagagctgcagtccgtccaaatctcgcaacaatcgg-3’
１−６：ｌｙｓＡ、ｍｅｔＡ、ｔｄｈ、及びｉｃｌＲ遺伝子の欠失
前記の１−５で修得されたｌａｃＩ遺伝子とｔｈｒＡ及びｌｙｓＣのフィードバック阻害除去されてｔｈｒＡＢＣオペロンのプロモーターがｔａｃプロモーターに置換されたＷ３１１０でｌｙｓＡ、ｍｅｔＡ、ｔｄｈ、及びｉｃｌＲ遺伝子をワンステップ不活性化方法（Ｗａｒｎｅｒ等，ＰＮＡＳ，２０００年，第６巻，６６４０頁）によって欠損させて、抗生剤耐性付与標式遺伝子を除去した。
【００５６】
ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）をコードする遺伝子であるｌｙｓＡ欠失菌株を製作するため、配列番号１９／２０のプライマー対とｐＫＤ４プラスミド（Ｗａｒｎｅｒ等，ＰＮＡＳ，２０００年，第６巻，６６４０頁）を使用してＰＣＲ反応を遂行して、その結果獲得したＤＮＡ断片をｐＫＤ４６（Ｗａｒｎｅｒ等，ＰＮＡＳ，２０００年，第６巻，６６４０頁，ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＹ０４８７４６）を含むｌａｃＩ遺伝子とｔｈｒＡ及びｌｙｓＣのフィードバック阻害除去されｔｈｒＡＢＣオペロンのプロモーターがｔａｃプロモーターに置換されたＷ３１１０のコンピタント細胞にエレクトロポレーションした。以後、カナマイシン耐性を示す細胞株を対象にＰＣＲ反応を遂行して、ｌｙｓＡ遺伝子の欠失有無を確認してｐＣＰ２０プラスミド（Ｗａｒｎｅｒ等，ＰＮＡＳ，２０００年，第６巻，６６４０頁）を導入して抗生剤耐性標式遺伝子を除去した。
配列番号19(KOlysA1):5’-atgccacattcactgttcagcaccgataccgatctcaccgccgaa
aatctgattgcagcattacacgtcttg -3’
配列番号20(KOlysA2):5’-gttgataaggaacagaaagcccaccgcccgcagaaatagcctg
taaatcccacttaacggctgacatggga-3’
ホモセリンＯ−スクシニル転移酵素（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ Ｏ−ｓｕｃｃｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をコードする遺伝子であるｍｅｔＡ遺伝子が欠失された菌株を製作するために、配列番号２１／２２のプライマーを使用してワンステップ不活性化方法でｍｅｔＡ遺伝子を欠損させて抗生剤耐性付与標式遺伝子を除去した。
配列番号21(KOmetA1):5’-gtgtgccggacgagctacccgccgtcaatttcttgcgtgaagaa
aacgtctttgtgattgcagcattacacgtcttg -3’
配列番号22(KOmetA2):5’-cgggatggcccgtcacaaaggcaatgcgcttatctttactggca
aacagacacttaacggctgacatggga-3’
Ｌ−スレオニンデヒドロゲナーゼ（Ｌ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子であるｔｄｈ欠失菌株製作のために、配列番号２３／２４のプライマー対を使用してワンステップ不活性化方法で、ｔｄｈ遺伝子を欠損させて抗生剤耐性付与標式遺伝子を除去した。
配列番号23(KOtdh1):5’-atgaaagcgttatccaaactgaaagcggaagagggcatctggat
gaccgagattgcagcattacacgtcttg-3’
配列番号24(KOtdh2):5’-atcactttggtccagtcgatagacatatcagacggcggaataccc
agcatcacttaacggctgacatggga-3’
グリオキシレートシャント（ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ ｓｈｕｎｔ）の発現を抑制する調節タンパク質をコードする遺伝子ｉｃｌＲの欠失菌株製作のために、配列番号２５／２６のプライマー対を使用して、ワンステップ不活性化方法でｉｃｌＲ遺伝子を欠損して抗生剤耐性付与標式遺伝子を除去した。
配列番号25(KOiclR1):5’-tgaaaatgatttccacgatacagaaaaaagagactgtcatggtc
gcacccgattgcagcattacacgtcttg-3’
配列番号26(KOiclR2):5’-atagaaattgcggcaaacggttcacggtgctcatcgaaaatac
acgctgccacttaacggctgacatggga-3’
１−７：スレオニンデヒドラターゼの活性が弱化された菌株の製作
Ｌ−スレオニンを基質にして生成されるＬ−イソロイシンの生成量を減らして、Ｌ−スレオニンの生成量を増大させるための目的で、リー等の研究発表（Ｌｅｅ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００３年，第１８５巻，５４４２頁）を参考にして、該当経路の一番目酵素であるスレオニンデヒドラターゼ（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）をコードするｉｌｖＡ遺伝子に部位特異的変異を作って製作された菌株の成長が培地中に添加されるＬ−イソロイシンの濃度によって大きく左右されることを確認した。
【００５７】
まず、大膓菌Ｗ３１１０（ＡＴＴＣ３９９３６）の染色体ＤＮＡを鋳型に使用して配列番号２７／２８のプライマー対を使用してワンステップ不活性化方法でｉｌｖＡ遺伝子を欠失させた後、クロラムフェニコールに対する耐性を示す細胞株を選別して、ＰＣＲ反応でｉｌｖＡ遺伝子が欠失されたことを確認した。
【００５８】
一方、大膓菌Ｗ３１１０（ＡＴＴＣ３９９３６）の染色体ＤＮＡを鋳型に使用して配列番号２９／３０のプライマー対及び配列番号３１／３２のプライマー対を使用して各々ＰＣＲを遂行して６４８ｂｐと６７６ｂｐのＤＮＡ断片を修得し、それらを同一濃度で混ぜて鋳型にして、配列番号２９／３２のプライマーを使用してオーバーラッピングＰＣＲを遂行した。前記ＰＣＲ反応で得られた１２８７ｂｐのＰＣＲ断片をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ酵素で切断して、やはりＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ酵素で切断したｐＳａｃＨＲ０６に挿入した後、塩基配列を分析して、ｉｌｖＡの２９０番目塩基（Ｃ）が（Ｔ）に置換されたことを確認した。前記修得したベクターをＮｈｅＩ酵素で切断して、複製原点を欠失させた後、セルフライゲーションさせて、前記１−６で製作した変異菌株のコンピタント細胞（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）にエレクトロポレーションした。次に、ｓａｃＢ ポジティブセレクション（Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９２年，第１７４巻，５４６２頁）方法とクロラムフェニコールに対する感受性によって選別してその結果、スレオニンデヒドラターゼ活性が低下された菌株を獲得した。
配列番号27(KOilvA1):5’-atcgccagccagtgcacagctttaagctgcgcggcgcatacgcc
atgatggattgcagcattacacgtcttg-3'
配列番号28(KOilvA2):5’-cccctgctgctgtgacagttcgatcgctttggctttcgcttcat
caaagtcacttaacggctgacatggga-3'
配列番号29(ilvA1):5’-gacgggatccgcaaagcctgtgcgctgatcaccgacgg-3’
配列番号30(ilvA2):5’-cacgcctaaccgcgcagaaaaaaacgcgacgccctgcg-3’
配列番号31(ilvA3):5’-cgcagggcgtcgcgtttttttctgcgcggttaggcgtg-3’
配列番号32(ilvA4):5’-caggtactgcagaccggaaagaatatgcgccagccgttcg-3'
１−８：プラスミドｐＭｌｏｘＣの製造
ワンステップ不活性化で遺伝子を欠失させる場合、一つの遺伝子欠失ごとに染色体ＤＮＡにリコンビナーゼの認知部位であるＦＲＴまたはｌｏｘＰ配列が１個ずつ残るようになる。その結果、連続的な多数の遺伝子欠失を遂行時に目的としない部位の欠失が起きて変異菌株製作に困難があった（Ｎａｇｙ Ａ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ，２０００年，第２６巻，９９頁）。スズキ等は、このような問題点を解決するための方案として、ｌｏｘ７１とｌｏｘ６６と命名したｍｕｔａｔ ｌｏｘＰを使用した、改善された遺伝子欠失方法を提示したことがある（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５年，第７１巻，８４７２頁）。それで、本発明者等はそれをさらに容易に使用できるようにｌｏｘ７１とｌｏｘ６６を一緒に導入した新規のベクターであるｐＭｌｏｘＣを製造した。
【００５９】
それのために、ｐＵＧ６プラスミド（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９６年，第２４巻，２５１９頁）をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＶで切断して２，４２７ｂｐのＤＮＡ切片を得て、配列番号３３／３４のプライマー対を使用してｐＡＣＹＣ１８４プラスミド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、米国）を鋳型にＰＣＲを遂行して１１００ｂｐのＰＣＲ断片を修得した。それら断片を各々ＥｃｏＲＶ／ＨｉｎｄＩＩＩとＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩで切断した後、ライゲーションしてｐＭｌｏｘＣを製作した（図２）。
配列番号33(ECmulox_up):5’-atataagctt taccgttcgtatagcatacattatacgaa
gttatctgccctgaaccgacgaccg-3’
配列番号34(ECmulox_do):5’-aattcccggg taccgttcgtataatgtatgctatacgaagt
tatgcatcacccgacgcactttgc -3’
１−９：ｔｄｃＣ遺伝子の欠失
スレオニン／セリントランスポーターをコードする遺伝子であるｔｄｃＣが欠失した菌株を製作するために、前記１−８で製作したｐＭｌｏｘＣベクターを鋳型にして、配列番号３５／３６のプライマー対を使用してＰＣＲ反応を遂行し、修得したＤＮＡ断片を分離精製して、前記精製されたＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号３７／３８のプライマー対を使用してＰＣＲ反応を遂行した。
【００６０】
その結果、修得したＤＮＡ断片を使用して前記記述したワンステップ不活性化方法で ｔｄｃＣ遺伝子を欠損させて、抗生剤耐性付与標式遺伝子を除去した。
配列番号35(KOtdcC1):5’-gcgtaaatcagataccacatggacgttaggcttgtttggtacggc
aatcgtaggtgacactatagaacgcg-3’
配列番号36(KOtdcC3):5’-ccagtgtaatcgcgaacgttgttttggtaccggtcatggacgcaa
agtggtagtggatctgatgggtacc-3’
配列番号37(KOtdcC2):5’-atgagtacttcagatagcattgtatccagccagacaaaacaatcg
tcctggcgtaaatcagataccacat-3’
配列番号38(KOtdcC4):5’-gaagaaagatttgaagatagccacgagtgcgatgatggaagcc
gcatattccagtgtaatcgcgaacgt-3’
１−１０：ｐｐｃ遺伝子のプロモーター置換
染色体上のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするｐｐｃ遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに交替して酵素活性が増大した菌株を製作した。ｐｐｃのプロモーター置換のために前記製作したｐＭｌｏｘＣプラスミドを鋳型に配列番号３９／４０のプライマーを使用してＰＣＲ反応を遂行し、修得したＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号４１／４２のプライマー対を使用してＰＣＲ反応を遂行した。その結果修得したＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号４３／４４のプライマー対でＰＣＲ反応を遂行した。その結果得られた最終のＤＮＡ断片を使用して前記記述したワンステップ不活性化方法と同一方法でｐｐｃ遺伝子に挿入した後、抗生剤耐性標式遺伝子を除去してｐｐｃの元来のプロモーターより強力なｔｒｃプロモーターに交替された菌株を製作した。
配列番号39(FPppc1):5’-ctgcgggcaaccatgcgcaaggggtttccctctcctgcgcgat
Gctgggttaggtgacactatagaacgcg-3'
配列番号40(RPppc1):5’-tctgcgctttggcttccgccatgttggccggagacagagtaaac
aggcagctaaaggcaaagaac-3'
配列番号41(FPppc2):5’-attaagttcactgaccgatgcggaaaaacgcaaaggcgtggtg
gcctgttctgcgggcaaccatgcgcaa-3’
配列番号42(RPppc2):5’-ctgcgggcaaccatgcgcaaggggtttccctctcctgcgcgat
gctgggttaggtgacactatagaacgcg-3’
配列番号43(FPppc3):5’-ggcagctaaaggcaaagaacatcaccactgcaaccatcagca
tgcttagtggatctgatgggtacc-3’
配列番号44(RPppc3):5’-attaagttcactgaccgatgcggaaaaacgcaaaggcgtgtggc
ctgttctgcgggcaaccatgcgcaa-3’
１−１１：ａｃｓ遺伝子のプロモーター置換
スレオニン生成菌株をフェドバッチ（Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）培養する時に生成される酢酸を減少させるための目的で、染色体上のアセチルコーエーシンターゼをコードするａｃｓ遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに交替して酵素活性が増大した菌株を製作した。ａｃｓのプロモーター置換のために前記製作したｐＭｌｏｘＣプラスミドを鋳型に配列番号４５／４６のプライマーを使用してＰＣＲ反応を遂行し、修得したＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号４７／４８のプライマー対を使用してＰＣＲ反応を遂行した。前記ＰＣＲ反応に修得したＤＮＡ断片を鋳型にして、配列番号４９／５０のプライマー対でＰＣＲ反応を遂行し、得られた最終ＤＮＡ断片を使用して前記記述したワンステップ不活性化方法と同一方法でａｃｓ遺伝子に挿入した後、抗生剤耐性標式遺伝子を除去してａｃｓの元来のプロモーターより強力なｔｒｃプロモーターに交替した菌株を製作した。
配列番号45(FPacs1):5’-gcccctatgtgtaacaaataaccacactgtgaatgttgtctaggt
gacactatagaacgcg-3’
配列番号46(RPacs1):5’-tgttatccgctcacaattccacacattatacgagccggatgatta
attgtcaacagctagtggatctgatgggtacc-3’
配列番号47(FPacs2):5’-tcacgacagtaaccgcacctacactgtcatgacattgctcgccc
ctatgtgtaacaaata-3’
配列番号48(RPacs2):5’-cgatgttggcaggaatggtgtgtttgtgaatttggctcatggtctg
tttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattcc-3’
配列番号49(FPacs3):5’-cgaattgcgccattgttgcaatggcggtttttattgtttttcacg
acagtaaccgcacct-3’
配列番号50(RPacs3):5’-ttgttgatacatcgcctcgtactgctgagggtttatcaggcaacgg
tctgcgatgttggcaggaatggtg-3’
１−１２：ｐＢＲＴｈｒＥベクターの製作
（１）ｐＫＫＴｈｒＡＢＣベクターの製作
Ｌ−スレオニン生合成において一番重要なＬ−スレオニン生合成関連オペロン（ｔｈｒＡＢＣ）を含むベクターをクローニングするために、前記１−３で製作したｔｈｒＡのフィードバック阻害が解除された変異株の染色体ＤＮＡを鋳型にして、配列番号５１／５２のプライマー対を使用してＰＣＲ反応を遂行した。その結果、合成されたＤＮＡ断片をＸｍａＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断して、該切断した断片を同一な制限酵素で処理したｐＫＫ２２３−３ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，米国）にクローニングして塩基配列を分析し、９．４ｋｂのＬ−スレオニン生合成関連オペロン（ｔｈｒＡＢＣ）を含むｐＫＫＴｈｒＡＢＣベクターを製作した。
配列番号51(Thr_Xma):5’-gttgcccgggatgcgagtgttgaagttcgg-3’
配列番号52(Thr_Hin):5’-gcgtcaagcttcggcggttgttattctccgc-3’
（２）ｐＢＲＴｈｒＡＢＣベクターの製作
前記製作したｐＫＫＴｈｒＡＢＣベクターのプラスミド安定性を高めるために、ｐＢＲ３２２ベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、米国）をＮｄｅＩとＳａｌＩで切断してｒｏｐ遺伝子を含む１．６ｋｂのＤＮＡ切片を獲得し、前記（１）で製作したｐＫＫＴｈｒＡＢＣベクターを同じ酵素で切断して、７．８ｋｂのＤＮＡ切片を獲得した後、それらをライゲーションして、９．４ｋｂのｐＢＲＴｈｒＡＢＣベクターを製作した （図３）。
（３）ｐＢＲｔｈｒＲベクターの製作
前記製作したｐＢＲＴｈｒＡＢＣベクターにスレオニンエクスポーター（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｅｘｐｏｒｔｅｒ）をコードするｒｈｔＣを導入するために、まず大膓菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型にして、配列番号５３及び配列番号５４のプライマー対を使用してＰＣＲ反応を遂行した後、修得されたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断して、同一な酵素で切断したｐＵＣ１９ベクターにクローニングした後、塩基配列を分析してｐＵＣ１９ｒｈｔＣベクターを製作した。以後、前記（２）で製作したｐＢＲＴｈｒＡＢＣベクターとｐＵＣ１９ｒｈｔＣベクターをＢａｍＨＩとＳｐｈＩで同時に切断してクローニングして最終的に１０．７ｋｂのｐＢＲＴｈｒＲベクターを製作した （図４）。
配列番号53(FrhtCEcBa):5’-ctgagaattcggatccagatggctgaacagatgc -3’
配列番号54(RrhtCHiBg):5’-cctacaagcttagatctcaaagcagatgaaggcgc -3’
（４）ｐＢＲｔｈｒＲ２ベクターの製作
前記製作されたｐＢＲＴｈｒＲベクターにスレオニンとホモセリンのエクスポーターとして知られたｒｈｔＡを導入するために、まず大膓菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型にして、配列番号５５及び配列番号５６のプライマー対を使用してＰＣＲ反応を遂行した後、修得されたＤＮＡ断片をＭｌｕＩとＳａｌＩで切断して、前記（３）で製作したｐＢＲＴｈｒＲベクターを同一な酵素で切断してクローニングした後、塩基配列を分析して、１１．１ｋｂのｒｈｔＡが導入されたｐＢＲＴｈｒＲ２ベクターを製作した。
配列番号55(FrhtAMlu):5’-ctgaacgcgtgaactgcgtaagtattacg-3’
配列番号56(FrhtASalPst):5’-ctgacgtcgacctgcagaccatgcagaaatgtaaat -3'
（５）ｐＢＲｔｈｒＥベクターの製作
前記製作されたｐＢＲＴｈｒＲ２ベクターにホモセリン（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ）とホモセリンラクトン（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｌａｃｔｏｎｅ）のエクスポーターと推定されるｒｈｔＢ導入するために、まず大膓菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型にして、配列番号５７及び配列番号５８のプライマー対を使用してＰＣＲ反応を遂行した後、修得されたＤＮＡ断片をＰｓｔＩとＥａｇＩで切断して、同一な酵素で切断したｐＢＲＴｈｒＲ２プラスミドにクローニングした後、塩基配列を確認して、１１．７ｋｂのｒｈｔＢが導入されたｐＢＲＴｈｒＥベクターを製作した（図５）。
配列番号57(FrhtBPst):5’-cgtagctgcagtccacaccagtaaactctg-3’
配列番号58(FrhtBEagAat):5’-catttcggccggacgtcagtcggataaggcgtttac-3’
１−１３：Ｌ−スレオニン生成微生物の製作
前記１−１から１−１１の過程を通じてｔｈｒＡとｌｙｓＣのフィードバック阻害が除去されてスレオニンオペロンのプロモーターがｔａｃプロモーターに置換され、ｌａｃＩ、ｍｅｔＡ、ｌｙｓＡ、及びｔｄｈ遺伝子が欠失された大膓菌ＴＨ０８菌株に、前記１−１２で製作したｐＢＲＴｈｒＲプラスミドを形質導入してＴＨＲ０８菌株を製作した。以後、前記ＴＨ０８菌株のｐｐｃプロモーターがｔｒｃプロモーターに置換されて、ｉｃｌＲとｔｄｃＣ遺伝子が欠失して製作された大膓菌ＴＨ２７菌株に、前記１−１２で製作されたｐＢＲＴｈｒＲとｐＢＲＴｈｒＥのベクターを各々導入してＬ−スレオニン生成微生物ＴＨＲ２７とＴＨＥ２７を製作した。
【００６１】
前記ＴＨ２７菌株のａｃｓ遺伝子のプロモーターをｔｒｃプロモーターに置換して製作された大膓菌ＴＨ２８菌株に前記ｐＢＲＴｈｒＥベクターを導入して、Ｌ−スレオニン生成微生物ＴＨＥ２８を製作した（表１及び図６）。
表１：本発明のスレオニン生成変異微生物
【００６２】
【表１】
【００６３】
実施例２：Ｌ−スレオニン生成微生物ＴＨＲ０８を使用したＬ−スレオニンの製造
前記実施例１で製作したＴＨＲ０８のＬ−スレオニン生成能を確認するために母菌株である大膓菌Ｗ３１１０とＴＨＲ０８菌株のＬ−スレオニン生成能を同じ条件で比較した。前記二つの菌株をアムピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）が５０μｇ／ｍｌ添加されたＬＢ平板培地で継代培養してそれを表２の力価培地に接種して２５０ｒｐｍ、３１℃で４８時間培養した。以後、培養液に存在するＬ−スレオニンの濃度をＨＰＬＣで測定した。
【００６４】
その結果、表３に示したように、Ｗ３１１０野生菌株では生成されなかった Ｌ−スレオニンがＴＨＲ０８菌株では１７．８〜１８．４ｇ／ｌ生成されることを確認した。
表２：Ｌ−スレオニン力価培地組成
【００６５】
【表２】
【００６６】
＊微量メタル溶液（蒸留水１リットル当り１０ｇ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．３５ｇ ＣａＣｌ２、２．２５ｇ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、１ｇ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．１０６ｇ（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、０．２３ｇ Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、３５％ ＨＣｌ １０ｍｌ含有）
表３：菌株別Ｌースレオニン生成量
【００６７】
【表３】
【００６８】
実施例３：Ｌ−スレオニン生成微生物ＴＨＲ２７及びＴＨＥ２７を使用したＬ−スレオニンの製造
前記実施例１で製作した微生物ＴＨＲ２７とＴＨＥ２７のＬ−スレオニン生成能を確認するために、それら微生物をアムピシリンが５０μｇ／ｍｌ添加されたＬＢ平板培地で選別した。選別した菌株を５ｇ／ｌグルコース、０．１５ｇ／ｌ Ｌ−メチオニン、０．２２ｇ／ｌ Ｌ−リジンを含む５０ｍｌのＬＢ培地が入っている５００ｍｌサカグチフラスコ４個に各々１％ずつ接種して３１℃で１２時間、毎分２５０回往復振蕩培養して全培養液を獲得した。Ｌ−スレオニンの生産のために表４の組成を有する生産培地を５ｌ小型醗酵槽に１．８ｌ入れて、前記修得した全培養液２００ｍｌを醗酵槽に接種して酸素分圧４０％を維持するように撹拌速度を自動で調節して３１℃で培地中の添加されたブドウ糖濃度が０ｇ／ｌになるまで培養した。
【００６９】
ここで、ｐＨはアンモニア水を使用して６．０〜６．５に維持した。醗酵終了後醗酵液内のＬ−スレオニン蓄積量は、表５のとおりである。表５に示したように、Ｌ−スレオニン生産量は、母菌株であるＴＨＲ０８菌株は９．２ｇ／ｌである一方、それから製作された残りの菌株は１１．２〜１１．９ｇ／ｌの向上した結果を示した。この結果を基に濃度が母菌株対比２１．７〜２９．４％程度向上したことを観察した。
表４：Ｌ−スレオニン生産培地
【００７０】
【表４】
【００７１】
＊ 微量メタル溶液（蒸留水１リットル当り１０ｇ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．３５ｇ ＣａＣｌ２、２．２５ｇ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、１ｇ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．１０６ｇ（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、０．２３ｇ Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、３５％ ＨＣｌ １０ｍｌ含有）
表５：Ｌースレオニン生成量
【００７２】
【表５】
【００７３】
実施例４：Ｌ−スレオニン生成微生物ＴＨＥ２７及びＴＨＥ２８のフェドバッチ培養を使用した Ｌ−スレオニンの製造
前記実施例１で製作した微生物ＴＨＥ２７とＴＨＥ２８のＬ−スレオニン生成能をフェドバッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）培養で確認するためにそれら微生物をアムピシリンが５０μｇ／ｍｌ添加されたＬＢ平板培地で選別した。選別した菌株を５ｇ／ｌグルコース、０．１５ｇ／ｌ Ｌ−メチオニン、０．２２ｇ／ｌ Ｌ−リジンを含む５０ｍｌのＬＢ培地が入っている５００ｍｌサカグチフラスコ４個に各々１％ずつ接種して３１℃で１２時間の間、毎分２５０回往復振盪培養して全培養液を獲得した。Ｌ−スレオニンの生産のために表４の組成を有するスレオニン生産培地を５Ｌ小型醗酵槽に１．８ｌ入れて、前記修得した全培養液２００ｍｌを醗酵槽に接種して酸素分圧４０％を維持するように撹拌速度を自動で調節して、３１℃で培地中の添加されたブドウ糖濃度が１ｇ／ｌ未満に減少すると、スレオニン添加培地（表６）を１４回まで添加して培養した。ここで、ｐＨはアンモニア水を使用して６．０〜６．５に維持した。
【００７４】
醗酵終了後、醗酵液内のＬ−スレオニン蓄積量は表７のとおりである。表７に示したように、Ｌ−スレオニン生産量は、ＴＨＥ２７菌株は７７．１ｇ／ｌである一方、それから製作されたＴＨＥ２８菌株は８２．４ｇ／ｌの向上した結果を示し、主要副産物であるアセテートの場合、ＴＨＥ２７菌株は７．８５ｇ／ｌを生成した一方、ＴＨＥ２８菌株は２．３５ｇ／ｌで、母菌株に比較して約７０％が減少した結果を示した。その結果、培養時間も５６．１時間から５０時間に約１０．９％短縮され、Ｌ−スレオニンの生産性が約２０．４％増加する結果を示した。
表６：Ｌ−スレオニン添加培地
【００７５】
【表６】
【００７６】
表７：Ｌースレオニン生成量
【００７７】
【表７】
【産業上の利用可能性】
【００７８】
以上で詳しく説明して立証したように、本発明は、部位特異的変異技法だけで製作されたＬ−スレオニン高生成能を有する変異微生物及び該変異微生物を使用したＬ−スレオニンの製造方法を提供する効果がある。本発明の微生物を使用すると、高収率のＬ−スレオニンを生成することができ、Ｌ−スレオニン生成微生物の遺伝特性に対する正確な情報を知ることができるので追加的な菌株開発とその生理現象に対する理解を容易にできる。
【００７９】
以上で本発明内容の特定部分を詳しく記述しましたが、当業界の通常の知識を有する者において、このような具体的技術は単に好ましい実施様態であるだけであり、それによって本発明の範囲が制限されるものではないことは、明白だろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付された請求項とそれらの等価物によって定義される。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】ｐＳａｃＨＲ０６ベクターの製作過程を示した図である。
【図２】ｌｏｘ６６とｌｏｘ７１及び抗生剤クロラムフェニコール耐性付与遺伝子を有している組換えベクターｐＭｌｏｘＣの系列地図を示した図である。
【図３】ｔｈｒＡＢＣオペロンを含む組換えベクターｐＢＲＴｈｒＡＢＣの製作過程を示した図である。
【図４】ｔｈｒＡＢＣオペロンを含み、ｒｈｔＣを有している組換えベクターｐＢＲＴｈｒＲの製作過程を示した図である。
【図５】ｔｈｒＡＢＣオペロンを含み、ｒｈｔＣ、ｒｈｔＢ、及びｒｈｔＡを有する組換えベクターｐＢＲＴｈｒＥの製作過程を示した図である。
【図６】大膓菌野生菌株Ｗ３１１０から目的遺伝子のみを操作して本発明によるＬ−スレオニン生成微生物を製作する過程を示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
部位特異的変異技法で下記の変異を誘導することを特徴とする高濃度及び高収率のＬ−スレオニン生成変異微生物の製造方法：
（ａ）ｌａｃオペロンのリプレッサー（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）をコードする遺伝子、ホモセリンＯ−スクシニル転移酵素をコードする遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びＬ−スレオニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失：
（ｂ）アスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩの活性阻害を防ぐための、アスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩをコードする遺伝子の変異；及び
（ｃ）Ｌ−スレオニンオペロンプロモーターまたはアセチルコーエーシンターゼのプロモーターのストロングプロモーターへの置換。
【請求項２】
前記微生物が、バクテリア、酵母及びカビからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の変異微生物の製造方法。
【請求項３】
前記バクテリアが、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属及び大膓菌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の変異微生物の製造方法。
【請求項４】
グリオキシレートシャントの発現を抑制する調節タンパク質をコードする遺伝子の欠失及びスレオニン／セリントランスポーターをコードする遺伝子の欠失をさらに含む、請求項１に記載の変異微生物の製造方法。
【請求項５】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーターをストロングプロモーターに置換することをさらに含む、請求項１に記載の変異微生物の製造方法。
【請求項６】
前記ストロングプロモーターが、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１または請求項５に記載の変異微生物の製造方法。
【請求項７】
請求項１乃至請求項５のいずれか１項の方法で製造された変異微生物に、Ｌ−スレオニンオペロン遺伝子、スレオニンエクスポーター（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｅｘｐｏｒｔｅｒ）をコードする遺伝子、スレオニンとホモセリンのエクスポーターをコードする遺伝子及びホモセリンとホモセリンラクトン（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｌａｃｔｏｎｅ）のエックスポーターをコードする遺伝子からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を含むベクターを導入させることを特徴とする組換え変異微生物の製造方法。
【請求項８】
（ａ）ｌａｃオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子、ホモセリンＯ−スクシニル転移酵素をコードする遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びＬ−スレオニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が欠失されていて、（ｂ）アスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩの活性阻害を防ぐためにアスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩをコードする遺伝子が変異されていて、（ｃ）Ｌ−スレオニンオペロンのプロモーターまたはアセチルコーエーシンターゼのプロモーターがストロングプロモーターに置換されていることを特徴とする高濃度及び高収率のＬ−スレオニン生成変異微生物。
【請求項９】
前記微生物が、バクテリア、酵母及びカビからなる群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載の変異微生物。
【請求項１０】
前記バクテリアが、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属及び大膓菌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の変異微生物。
【請求項１１】
グリオキシレートシャントの発現を抑制する調節タンパク質をコードする遺伝子の欠失及びスレオニン／セリントランスポーターをコードする遺伝子の欠失をさらに含む、請求項８に記載の変異微生物。
【請求項１２】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーターをストロングプロモーターに置換することをさらに含む、請求項８に記載の変異微生物。
【請求項１３】
前記ストロングプロモーターが、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターからなる群から選択されることを特徴とする、請求項８または請求項１２に記載の変異微生物。
【請求項１４】
請求項８乃至請求項１２のいずれか１項の変異微生物に、Ｌ−スレオニンオペロン遺伝子、スレオニンエクスポーターをコードする遺伝子、スレオニンとホモセリンのエクスポーターをコードする遺伝子及びホモセリンとホモセリンラクトンのエクスポーターをコードする遺伝子からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を含むベクターが導入されていることを特徴とする組換え変異微生物。
【請求項１５】
（ａ）ｌａｃオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子、ホモセリンＯ−スクシニル転移酵素をコードする遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びＬ−スレオニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が欠失されていて、（ｂ）アスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩの活性阻害を防ぐためにアスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩをコードする遺伝子が変異されていて、（ｃ）Ｌ−スレオニンオペロンのプロモーター及びアセチルコーエーシンターゼのプロモーターがストロングプロモーターに置換されていることを特徴とする高濃度及び高収率のＬ−スレオニン生成変異微生物。
【請求項１６】
前記微生物が、バクテリア、酵母及びカビからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１５に記載の変異微生物。
【請求項１７】
前記バクテリアが、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属及び大膓菌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１６に記載の変異微生物。
【請求項１８】
グリオキシレートシャントの発現を抑制する調節タンパク質をコードする遺伝子の欠失及びスレオニン／セリントランスポーターをコードする遺伝子の欠失をさらに含む、請求項１５に記載の変異微生物。
【請求項１９】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーターをストロングプロモーターに置換することをさらに含む、請求項１５に記載の変異微生物。
【請求項２０】
前記ストロングプロモーターが、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１５または請求項１９に記載の変異微生物。
【請求項２１】
請求項１５乃至請求項１９のいずれか１項の変異微生物に、Ｌ−スレオニンオペロン遺伝子、スレオニンエクスポーターをコードする遺伝子、スレオニンとホモセリンのエクスポーターをコードする遺伝子及びホモセリンとホモセリンラクトンのエクスポーターをコードする遺伝子からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を含むベクターが導入していることを特徴とする組換え変異微生物。
【請求項２２】
ｌｏｘ６６遺伝子、ｌｏｘ７１遺伝子及び抗生剤耐性標式遺伝子を同時に含むワンステップ不活性化用ベクター。
【請求項２３】
前記ベクターが、ｐＭｌｏｘＣであることを特徴とする、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】
請求項８または請求項１５の微生物を培養することを特徴とするＬ−スレオニンの製造方法。
【請求項２５】
請求項１４の微生物を培養することを特徴とするＬ−スレオニンの製造方法。
【請求項２６】
請求項２１の微生物を培養することを特徴とするＬ−スレオニンの製造方法。
【請求項１】
部位特異的変異技法で下記の変異を誘導することを特徴とする高濃度及び高収率のＬ−スレオニン生成変異微生物の製造方法：
（ａ）ｌａｃオペロンのリプレッサー（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）をコードする遺伝子、ホモセリンＯ−スクシニル転移酵素をコードする遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びＬ−スレオニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失：
（ｂ）アスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩの活性阻害を防ぐための、アスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩをコードする遺伝子の変異；及び
（ｃ）Ｌ−スレオニンオペロンプロモーターまたはアセチルコーエーシンターゼのプロモーターのストロングプロモーターへの置換。
【請求項２】
前記微生物が、バクテリア、酵母及びカビからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の変異微生物の製造方法。
【請求項３】
前記バクテリアが、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属及び大膓菌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の変異微生物の製造方法。
【請求項４】
グリオキシレートシャントの発現を抑制する調節タンパク質をコードする遺伝子の欠失及びスレオニン／セリントランスポーターをコードする遺伝子の欠失をさらに含む、請求項１に記載の変異微生物の製造方法。
【請求項５】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーターをストロングプロモーターに置換することをさらに含む、請求項１に記載の変異微生物の製造方法。
【請求項６】
前記ストロングプロモーターが、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１または請求項５に記載の変異微生物の製造方法。
【請求項７】
請求項１乃至請求項５のいずれか１項の方法で製造された変異微生物に、Ｌ−スレオニンオペロン遺伝子、スレオニンエクスポーター（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｅｘｐｏｒｔｅｒ）をコードする遺伝子、スレオニンとホモセリンのエクスポーターをコードする遺伝子及びホモセリンとホモセリンラクトン（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｌａｃｔｏｎｅ）のエックスポーターをコードする遺伝子からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を含むベクターを導入させることを特徴とする組換え変異微生物の製造方法。
【請求項８】
（ａ）ｌａｃオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子、ホモセリンＯ−スクシニル転移酵素をコードする遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びＬ−スレオニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が欠失されていて、（ｂ）アスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩの活性阻害を防ぐためにアスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩをコードする遺伝子が変異されていて、（ｃ）Ｌ−スレオニンオペロンのプロモーターまたはアセチルコーエーシンターゼのプロモーターがストロングプロモーターに置換されていることを特徴とする高濃度及び高収率のＬ−スレオニン生成変異微生物。
【請求項９】
前記微生物が、バクテリア、酵母及びカビからなる群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載の変異微生物。
【請求項１０】
前記バクテリアが、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属及び大膓菌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の変異微生物。
【請求項１１】
グリオキシレートシャントの発現を抑制する調節タンパク質をコードする遺伝子の欠失及びスレオニン／セリントランスポーターをコードする遺伝子の欠失をさらに含む、請求項８に記載の変異微生物。
【請求項１２】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーターをストロングプロモーターに置換することをさらに含む、請求項８に記載の変異微生物。
【請求項１３】
前記ストロングプロモーターが、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターからなる群から選択されることを特徴とする、請求項８または請求項１２に記載の変異微生物。
【請求項１４】
請求項８乃至請求項１２のいずれか１項の変異微生物に、Ｌ−スレオニンオペロン遺伝子、スレオニンエクスポーターをコードする遺伝子、スレオニンとホモセリンのエクスポーターをコードする遺伝子及びホモセリンとホモセリンラクトンのエクスポーターをコードする遺伝子からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を含むベクターが導入されていることを特徴とする組換え変異微生物。
【請求項１５】
（ａ）ｌａｃオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子、ホモセリンＯ−スクシニル転移酵素をコードする遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びＬ−スレオニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が欠失されていて、（ｂ）アスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩの活性阻害を防ぐためにアスパルトキナーゼＩ及びアスパルトキナーゼＩＩＩをコードする遺伝子が変異されていて、（ｃ）Ｌ−スレオニンオペロンのプロモーター及びアセチルコーエーシンターゼのプロモーターがストロングプロモーターに置換されていることを特徴とする高濃度及び高収率のＬ−スレオニン生成変異微生物。
【請求項１６】
前記微生物が、バクテリア、酵母及びカビからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１５に記載の変異微生物。
【請求項１７】
前記バクテリアが、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属及び大膓菌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１６に記載の変異微生物。
【請求項１８】
グリオキシレートシャントの発現を抑制する調節タンパク質をコードする遺伝子の欠失及びスレオニン／セリントランスポーターをコードする遺伝子の欠失をさらに含む、請求項１５に記載の変異微生物。
【請求項１９】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーターをストロングプロモーターに置換することをさらに含む、請求項１５に記載の変異微生物。
【請求項２０】
前記ストロングプロモーターが、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１５または請求項１９に記載の変異微生物。
【請求項２１】
請求項１５乃至請求項１９のいずれか１項の変異微生物に、Ｌ−スレオニンオペロン遺伝子、スレオニンエクスポーターをコードする遺伝子、スレオニンとホモセリンのエクスポーターをコードする遺伝子及びホモセリンとホモセリンラクトンのエクスポーターをコードする遺伝子からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を含むベクターが導入していることを特徴とする組換え変異微生物。
【請求項２２】
ｌｏｘ６６遺伝子、ｌｏｘ７１遺伝子及び抗生剤耐性標式遺伝子を同時に含むワンステップ不活性化用ベクター。
【請求項２３】
前記ベクターが、ｐＭｌｏｘＣであることを特徴とする、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】
請求項８または請求項１５の微生物を培養することを特徴とするＬ−スレオニンの製造方法。
【請求項２５】
請求項１４の微生物を培養することを特徴とするＬ−スレオニンの製造方法。
【請求項２６】
請求項２１の微生物を培養することを特徴とするＬ−スレオニンの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００９−５１７０８８（Ｐ２００９−５１７０８８Ａ）
【公表日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０４１３１（Ｐ２００９−５０４１３１）
【出願日】平成１９年７月２日（２００７．７．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００３２００
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１１７０８
【国際公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【出願人】（５０８０４７６６８）コリア アドバンスド インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジー (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月２日（２００７．７．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００３２００
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１１７０８
【国際公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【出願人】（５０８０４７６６８）コリア アドバンスド インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジー (9)
【Ｆターム（参考）】
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