ＭＡＬＤＩ質量分析におけるマトリックスとしてのシアノ桂皮酸誘導体の使用
本発明は、分析物のＭＡＬＤＩ質量分析におけるマトリックスとしてのシアノ桂皮酸誘導体の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析物のＭＡＬＤＩ質量分析におけるマトリックスとしてのシアノ桂皮酸誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化）は、分子のイオン化のためのプロセスである。１９８０年代に開発されて以来、それは巨大分子およびポリマーおよび生体高分子の質量分析に特に効果的であることが示されている。ＭＡＬＤＩは、マトリックスおよび異なるモル過剰のマトリックスを含む分析物の共結晶化に基づく。選択されるマトリックス物質は、使用されるレーザー波長でエネルギーを吸収する小型の有機分子である。マトリックスは、不揮発性であって熱的に不安定な大型の化合物、例えば、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、合成ポリマーおよび大型の無機化合物などから大規模の無傷気相イオンを生成することを容易にする。マトリックスは、ＭＡＬＤＩ−ＭＳでの分析に適した事実上全ての物質に、すなわち、大型および小型の、不揮発性であって熱的に不安定な化合物、例えば、生物学的高分子など、例えば、タンパク質および脂質、ならびに小型の、有機および無機分析物、例えば、薬物、植物代謝産物および同類のものなどについて使用することができる。主な使用分野はペプチドの分析である。レーザービーム（ＵＶまたはＩＲ−パルスレーザー）を、脱離およびイオン化のためのエネルギー源として使用する。
【０００３】
マトリックスは、レーザー光線エネルギーを吸収し、そのプローブ分子が気相に入る結果として、励起状態でマトリックス−分析物共結晶の一部分を除去するという点で、重要な役割を果たす。マトリックスと分析物との間の相互作用の結果として、分析物イオンが生じ、この分析物イオンは、それらの形成後に静電気によって質量分析計に移され、質量分析計でマトリックスイオンから分離し、個々に検出することができる。
【０００４】
今までは、小型の有機分子は、マトリックス物質として、例えば不安定なプロトンを含む化合物、例えばカルボン酸などとして使用されてきた。最もよく知られたマトリックス化合物は、最も一般的に使用されるα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡまたはＨＣＣＡ）である。ＭＡＬＤＩ−ＭＳで使用されるその他のマトリックスの例はシナピン酸（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシ桂皮酸）または２，５−ジヒドロキシ安息香酸（２，５−ＤＨＢ）である。
【０００５】
Ｂｅａｖｉｓ，Ｒ．Ｃ；Ｃｈａｉｔ，Ｂ．Ｔ．：Ｃｉｎｎａｍｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｓ Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（１９８９），Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ ４３２−４３５には、ヒドロキシもしくはメトキシ置換桂皮酸のＭＡＬＤＩ質量分析におけるマトリックスとしての使用が記載されている。相当するα−シアノ桂皮酸の使用は、ＵＳ ２００２／０１４２９８２ Ａ１号から導くことができる。ＤＥ １０１ ５８ ８６０ Ａ１号およびＤＥ １０３ ２２ ７０１ Ａ１号には、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸または３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸の使用が記載されている。最後に、ＵＳ ２００６／００４０３３４ Ａ１号およびＷＯ ２００６／１２４００３ Ａ１号には、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸の分析物共役誘導体もしくはポリマー共役誘導体に基づくＭＡＬＤＩマトリックスが開示されている。
【０００６】
ＭＡＬＤＩ質量分析に使用することのできるマトリックスは、多数の要件を同時に満たさなければならない。まず、マトリックスは、分析物を（共結晶化により）マトリックス結晶の中に組み込むことができ、かつ、それらをその他の分析物から単離することができなければならない。その上、該マトリックスは、分析物に相溶性であって、真空で安定し、使用するレーザーのレーザー波長を吸収できる溶媒に溶解性である必要がある。さらに、該マトリックスは、レーザー照射によりマトリックスと分析物の同時脱離を引き起こし、分析物イオン化を促進するべきである。
【０００７】
今まで使用したマトリックス化合物に関して、ＭＡＬＤＩ質量分析の特性およびそれに従った性能データは、特に陽イオン、陰イオンおよび二重電荷またはそれ以上の電荷を有するイオンに対するその検出および感受性に関して、なお改良が可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の課題は、ＭＡＬＤＩ質量分析においてマトリックスとして使用することができ、かつ、現状の技術から分かる欠点を少なくとも部分的に克服する化合物を提供することである。特に、課題は、陽イオン、陰イオンおよび二重電荷またはそれ以上の電荷を有するイオンに対する検出および感受性を改良することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題は、一般式：
【化１】
〔式中、Ｘは、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉならびに置換および非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルから選択され；ＹおよびＺは、独立に、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉならびに置換および非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルから選択され；かつ、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、ＳＯ３ＨおよびＣＯＯＲ’（Ｒ’はＣ１−Ｃ１０アルキル）から選択される〕
で表されるシアノ桂皮酸誘導体の、分析物のＭＡＬＤＩ質量分析のためのマトリックスとしての使用により解決される。示される構造式は、シアノ桂皮酸誘導体のあらゆる可能なシス／トランス異性体を含むことが意図される。
【００１０】
Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、メチルまたはＣ２−Ｃ１０アルキルから選択され、ＹおよびＺは、独立に、Ｈ、ＦおよびＣｌから選択されることが好ましい。
【００１１】
また、シアノ桂皮酸誘導体は、２，４−ジフルオロ−シアノ桂皮酸、４−クロロ−シアノ桂皮酸または４−メチルシアノ桂皮酸であることが提案される。
【００１２】
好ましい実施形態では、４−クロロ−シアノ桂皮酸は、陽イオンのＭＡＬＤＩ質量分析のためのマトリックスである。
【００１３】
さらに好ましい実施形態では、２，４−ジフルオロ−シアノ桂皮酸、４−クロロ−シアノ桂皮酸および４−メチル−シアノ桂皮酸は、陰イオンのＭＡＬＤＩ質量分析のためのマトリックスである。
【００１４】
その上、２，４−ジフルオロ−シアノ桂皮酸は、陰イオンおよび陽イオンのＭＡＬＤＩ質量分析のためのマトリックスであることが提案される。
【００１５】
なおさらに好ましい実施形態では、４−メチル−シアノ桂皮酸および４−クロロ−シアノ桂皮酸は、二重荷電イオンのＭＡＬＤＩ質量分析のためのマトリックスである。
【００１６】
また、分析物は消化されたタンパク質またはペプチドであることが好ましい。とは言うものの、未消化のタンパク質、ポリ核酸、糖類および同類のものも分析物として考えられる。
【００１７】
マトリックスが分析物と混合されていることも好ましい。
【００１８】
その上、分析物のマトリックスに対するモル混合比は、１：１，０００〜１：１，０００，０００，０００，好ましくは１：１００，０００〜１：１０，０００，０００であるべきであることが提案される。
【００１９】
また、好ましくは、前記一般式に該当する様々なシアノ桂皮酸誘導体の混合物または前記一般式に該当する少なくとも１種類のシアノ桂皮酸誘導体の混合物が、さらなるマトリックスとともに使用されることも提案される。
【００２０】
最後に、さらなるマトリックスは、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、シナピン酸またはフェルラ酸から選択されることが提案される。
【００２１】
同様に、２−アザ−５−チオチミンまたは３−ヒドロキシピコリン酸をさらなるマトリックスとして使用してよい。
【００２２】
使用されるマトリックス材料を不活性充填剤と混合することも等しく考えられる。
【００２３】
驚くことに、上述されたシアノ桂皮酸誘導体をＭＡＬＤＩ質量分析のマトリックスとして使用する場合、陽イオン、陰イオンおよび二重電荷またはそれ以上の電荷を有するイオンに対する検出および感受性は、実質的に改良され得ることが本発明に従って見出された。
【００２４】
特に、生物学的ポリマー分析物、好ましくはペプチド分析物の感受性の明確な改良が達成された。さらに、本発明に従う使用は、様々なアミノ酸組成のペプチドに対して低い選択性を示し、従って、これまでの場合よりも多くの種類の分析物を分析物混合物中に検出することができることの結果として、ＭＡＬＤＩ質量スペクトルにおける、これまで使用されるマトリックスに対する差別効果を実質的に低下させる。上述のシアノ桂皮酸誘導体のマトリックス混合物を使用することにより、結晶化および分析物化合物のマトリックス結晶の中への組み込みおよび分析物のより効率的なイオン化に関して、特性を最適化することが可能となる。同様に、驚くことに、類似した電子特性をもつ置換基、例えばＮＯ２、ＣＮまたはアセチルなどを含むシアノ桂皮酸誘導体は、本発明に従って使用されるシアノ桂皮酸誘導体ほど良好な結果を達成することがとてもできないことが見出された。
【００２５】
本発明のさらなる特長および利点は、添付される図面とともに、以下の好ましい実施形態の詳細な説明から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】これまで用いられたα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸および新しく使用されるα−シアノ−４−クロロ桂皮酸をマトリックスとして使用する比較において、ＢＳＡタンパク質消化（ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン）の質量スペクトルからの抜粋を示す図である。
【図２】これまで用いられたα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸および新しく使用されるα−シアノ−４−クロロ桂皮酸をマトリックスとして使用する比較において、ＢＳＡタンパク質消化（ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン）の質量スペクトルからの抜粋を示す図である。
【図３】これまで用いられたα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸および新しく使用されるα−シアノ−４−クロロ桂皮酸をマトリックスとして使用する比較において、ＢＳＡタンパク質消化（ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン）の質量スペクトルからの抜粋を示す図である。
【図４】これまで用いられたα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸および新しく使用されるα−シアノ−４−クロロ桂皮酸をマトリックスとして使用する比較において、ＢＳＡタンパク質消化（ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン）の質量スペクトルからの抜粋を示す図である。
【図５】これまで用いられたα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸および新しく使用されるα−シアノ−４−クロロ桂皮酸をマトリックスとして使用する比較において、ＢＳＡタンパク質消化（ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン）の質量スペクトルからの抜粋を示す図である。
【図６】ＢＳＡタンパク質消化のあらゆる検出可能なペプチドを表の形式で記載する図である。
【図７】マトリックスとしてのα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸およびα−シアノ−２，４−ジフルオロ桂皮酸の陰イオンに対する質量スペクトルの比較を示す図である。
【図８】α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸およびα−シアノ−４−メチル桂皮酸を使用する二重荷電イオンに対する質量スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明に従って使用してよいシアノ桂皮酸誘導体は、例えば、クネーフェナーゲル縮合（Ｋｎｏｅｖｅｎａｇｅｌ ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）に従って、対応するアルデヒドとシアノ酢酸（誘導体）の縮合により調製することができる。
【実施例１】
【００２８】
２ｇのシアノ酢酸（１当量、２３．５ｍｍｏｌ）、２．９７ｇのクロロベンズアルデヒド（０．９当量、２１．１ｍｍｏｌ）および３００ｍｇの酢酸アンモニウム（酸に基づいて１５％（ｍ／ｍ））を３０ｍｌのトルエン中で水分離器を用いて還流しながら加熱する。水分離の完了後（約３時間）、混合物を室温まで冷却する。その過程で、生成物は通常結晶形で沈殿する。濾過した後、粗生成物を十分な水で洗浄する。生成物が沈殿しない場合は、混合物を濃縮し、残った固体を十分な水で洗浄する。粗生成物は、アルコール（メタノール）と水の混合物から繰り返し再結晶化させる。さらなる精製は、５０％アセトニトリルを溶媒として使用する、イオン交換（強力な陽イオン交換体）によって起こる。溶出液を室温にて濃縮する。その過程で精製された生成物が結晶形で沈殿する。濾過および真空乾燥後、３．３５ｇ（理論値の７８％）のα−シアノ−４−クロロ桂皮酸が得られる。
【実施例２】
【００２９】
アルデヒドの量に基づいて１．２５倍の量のシアノ酢酸を、ビーカー中で３０℃にて４０ｍｌの水に、シアノ酢酸の量に基づいて１．１倍の量のソーダとともに溶解する。溶液をフラスコに移し、続いて起こる反応は約３０℃で行う。１５ｍｌの水に溶解した水酸化ナトリウム（シアノ酢酸の量に基づいて０．１２５倍の量）をこの溶液に添加する。アルデヒドを（アルデヒドが液体でない場合）できる限り少ない容積のアセトニトリルに溶解し、激しい攪拌を伴って約３０分間にわたって徐々に添加する。２時間攪拌した後、溶液をビーカーに移し、濃塩酸で酸性化する；溶液を氷浴中で冷却し、吸引濾過する。沈殿物を少量の冷水およびトルエン（不溶性である場合）で洗浄し、４０℃にて真空乾燥させる。精製は実施例１のように行う。収率は、理論量の約５０〜７０％である。
【００３０】
シアノ桂皮酸誘導体は、ＭＡＬＤＩ質量分析の適したサンプルを調製するために、標準的な手順を用いて分析物と混合されてよい。
【００３１】
混合の例示的な一方法は、液滴乾燥法（ｄｒｉｅｄ ｄｒｏｐｌｅｔ ｍｅｔｈｏｄ）である。この過程において、マトリックスと分析物を溶解し、同時に（事前混合により）または連続して任意の表面に適用する。溶媒の蒸発により、分析物化合物を含むマトリックスの結晶化がもたらされる。
【００３２】
マトリックスまたはマトリックス混合物を溶解し、分析物を含まない任意の表面に適用する、表面調製法（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を用いてもよい。溶媒の蒸発によりマトリックス化合物の（共）結晶化がもたらされる。溶解した分析物を結晶母体に適用し、その過程で表面に近いマトリックス層だけが溶解することにより、再結晶化による濃縮形態の分析物化合物の封入が引き起こされる。
【００３３】
昇華法は、マトリックスが溶液から結晶化せずに、昇華による気相からの析出により表面に適用されることを除いて、表面調製法に相当する。
【００３４】
最後に、マトリックスおよび分析物を共通の溶媒（混合物）に溶解し、スプレー装置（エアゾール形成）を用いて分散して分布させる「エアブラシ法」が可能である。大きい表面積は、マトリックス／分析物結晶の形成に付随して溶媒の急速な蒸発をもたらす。あるいは、マトリックスを、分析物を含まずに溶解させて、スプレーまたはその他の手段によって調査する表面（織物の一部分など）に適用してもよい。
【００３５】
新規な適用分野は、マトリックスのイオン液体としての調製である：この目的のため、溶解したマトリックスを等モル量のカチオン化可能な（ｃａｔｉｏｎｉｓａｂｌｅ）塩基、例えば、ピリジンまたはジエチルアミンなどと混合し、回転させ、その結果として液体イオンマトリックス膜が生じ、それを分析物溶液とともに任意の表面に適用することができる。
【００３６】
以降、「消化」は、酵素によって特定のアミノ酸位置で切断され、多数の小型のペプチドを生じるタンパク質を意味するために使用される。
【００３７】
Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ ＳＴＲ質量分析計を、行った実験に使用した。
【００３８】
質量分析計は、異なる種類のイオン（分析物イオン、マトリックスイオン）をそれらの質量対電荷比に従って区別する。通常は、ＭＡＬＤＩ中のイオンは１つ（正または負）しか電荷を保有しないので、電荷が１である場合、質量対電荷比はイオンの質量に等しい。スペクトルの横座標は、イオンの質量対電荷比（および従ってほとんどすべての場合において質量）を示し、単位はダルトンまたはｇ／モルである。
【００３９】
より強いシグナル（垂直の線で示され、該線（シグナル）の長さはそのシグナルを引き起こすイオン種の量に相関する）は、個別に質量または質量対電荷比で標識されている。
【００４０】
縦座標のスケールは、関係するスペクトル内で最も強いシグナルによって決まり、最も強いシグナル（使用する機器によって決まる）の絶対値を示す。該スペクトルに示されるあらゆるその他のシグナルは、最も強いシグナルに対して引かれている（縦座標の左側）。縦座標の右側の値は、１つのスペクトルまたは同じ質量分析計のその他のスペクトル内のさらなるシグナルとの比較にのみ意味がある。例えば、図１〜５「ＢＳＡ消化−効果的に適用された１ｆｍｏｌ」の右上の数値は、各々の場合の最も強いシグナルの絶対強度を示す（図１中、新しいマトリックスα−シアノ−４−クロロ桂皮酸を使用する場合、上側のスペクトルにおいて、質量６８９．３７８）。質量ｍ／ｚ＝９２７．４９５のペプチドの相対強度は、ｍ／ｚ＝６８９．３７８の最も強いイオンの強度と比較して８８％（縦座標のスケールの左側から読み取ることができる）であり、従って強度６，１５２絶対単位（ａｂｓ．ｕｎｉｔ）を有する。既知のマトリックスα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸の下側のＣＨＣＡスペクトルにおいて、ｍ／ｚ＝９２７．４９４の同じシグナルの絶対強度は、たった２５３．１単位である（ｍ／ｚ＝６７５．６３５の最も強いシグナルと６２７．０単位に従って計算する。ここで、ｍ／ｚ＝９２７．４９４でのＢＳＡペプチドシグナルの相対強度は４０．３７％である）。この例示的なイオンによって、新規マトリックスは従って絶対強度を約２５倍増大させることを可能にする。このことは、このペプチドが新規マトリックスと一緒に、相当に多くのイオンを形成し、従って測定の容易な著しく強いシグナルを引き起こすことを意味する。この利点は、これまで検出することのできなかった弱いシグナルを、今では例えば図２中のＢＳＡ消化−効果的に適用された１ｆｍｏｌ（９５０−１，１００）に見出すことのできる増幅によって測定することができることである。つまり、新規なマトリックス（上側のスペクトル）は、古いマトリックス（これまでの最良のもの−下側のスペクトル）で検出することができなかった分析物を検出することを可能にする。より正確に分類するため、関係するシグナルを生じるペプチドのアミノ酸組成も大部分のシグナルに加えた（アミノ酸修飾は通例の１文字記号に対応する）。起こり得るペプチド修飾は、後に続く括弧内に示される（ＣＡＭ−Ｃ：システインのカルバミドメチル化、ｐＧｌｕ：ピログルタミン修飾、Ｃ−ｔｅｒｍ．：Ｃ末端断片）。シグナルの後に続く、１Ｄａの質量増加を伴う弱いシグナルは、関係するペプチドの１３Ｃ同位体に起因する。改善された結果は図１〜５の全てから見出すことができる。
【００４１】
図６には、使用したＢＳＡ−タンパク質消化の検出可能なペプチドが全て記載される。検出可能なペプチドの量は、最初に使用されるタンパク質の量によって決まり、そのタンパク質の量はこの場合ごく少量の１ｆｍｏｌであった。上半分は、これまで用いられたＣＨＣＡマトリックス（ＨＣＣＡまたはα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸と同義）を用いて検出可能なペプチドを示す。下半分には、上半分に加えて、新規マトリックスでのみ検出可能なペプチドが全て記載される。このことから、非常に多くの情報の増加が得られることがすぐに分かる。１列目には、関与するペプチドのアミノ酸配列が記載され、さらに２列目にはそれらの質量が示されている。この列では、シグナルの強度および検出能を示すＳ／Ｎ（シグナル対ノイズ）比が示される：種々の理由から、全スペクトルにはわずかなノイズが含まれる、ノイズはたとえ分析物を含まない場合にさえ常に生じるものである。検出されるには、シグナルはノイズよりも高い強度を有さねばならない；そうでなければシグナルを検出することはできない。Ｓ／Ｎ比はコンピュータにより計算され、シグナルがバックグラウンドノイズに対して何倍強いかを示す。これはつまり、Ｓ／Ｎ比が高いほど、シグナルを認識および検出することが容易になることを意味する。３列目には、古いマトリックスに対する新規マトリックスのＳ／Ｎ比が含まれ、１より大きい値は従ってこれらのシグナルのほうが強く、従って検出し易いことを示す。４列目には、絶対強度の比が示され、この場合もやはり原則は、絶対強度が大きいほど、シグナルをそのようなものとして認識することが容易であることである；新規マトリックスが古いマトリックスよりも相当に強いシグナルを生じることがはっきり見出すことができる。
【００４２】
現状の技術よりも相当な改良を表す、図１〜５について考察した結果はまた、それぞれ陰イオンおよび二重荷電イオンに対する図７および８の質量スペクトルにおいても見出すことができる。
【００４３】
上記の説明、請求項および図面に開示される本発明の特徴は、本発明をその最も変化した実施形態において個別にかつ組み合わせて実施するために必要不可欠であり得る。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析物のＭＡＬＤＩ質量分析におけるマトリックスとしてのシアノ桂皮酸誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化）は、分子のイオン化のためのプロセスである。１９８０年代に開発されて以来、それは巨大分子およびポリマーおよび生体高分子の質量分析に特に効果的であることが示されている。ＭＡＬＤＩは、マトリックスおよび異なるモル過剰のマトリックスを含む分析物の共結晶化に基づく。選択されるマトリックス物質は、使用されるレーザー波長でエネルギーを吸収する小型の有機分子である。マトリックスは、不揮発性であって熱的に不安定な大型の化合物、例えば、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、合成ポリマーおよび大型の無機化合物などから大規模の無傷気相イオンを生成することを容易にする。マトリックスは、ＭＡＬＤＩ−ＭＳでの分析に適した事実上全ての物質に、すなわち、大型および小型の、不揮発性であって熱的に不安定な化合物、例えば、生物学的高分子など、例えば、タンパク質および脂質、ならびに小型の、有機および無機分析物、例えば、薬物、植物代謝産物および同類のものなどについて使用することができる。主な使用分野はペプチドの分析である。レーザービーム（ＵＶまたはＩＲ−パルスレーザー）を、脱離およびイオン化のためのエネルギー源として使用する。
【０００３】
マトリックスは、レーザー光線エネルギーを吸収し、そのプローブ分子が気相に入る結果として、励起状態でマトリックス−分析物共結晶の一部分を除去するという点で、重要な役割を果たす。マトリックスと分析物との間の相互作用の結果として、分析物イオンが生じ、この分析物イオンは、それらの形成後に静電気によって質量分析計に移され、質量分析計でマトリックスイオンから分離し、個々に検出することができる。
【０００４】
今までは、小型の有機分子は、マトリックス物質として、例えば不安定なプロトンを含む化合物、例えばカルボン酸などとして使用されてきた。最もよく知られたマトリックス化合物は、最も一般的に使用されるα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡまたはＨＣＣＡ）である。ＭＡＬＤＩ−ＭＳで使用されるその他のマトリックスの例はシナピン酸（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシ桂皮酸）または２，５−ジヒドロキシ安息香酸（２，５−ＤＨＢ）である。
【０００５】
Ｂｅａｖｉｓ，Ｒ．Ｃ；Ｃｈａｉｔ，Ｂ．Ｔ．：Ｃｉｎｎａｍｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｓ Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（１９８９），Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ ４３２−４３５には、ヒドロキシもしくはメトキシ置換桂皮酸のＭＡＬＤＩ質量分析におけるマトリックスとしての使用が記載されている。相当するα−シアノ桂皮酸の使用は、ＵＳ ２００２／０１４２９８２ Ａ１号から導くことができる。ＤＥ １０１ ５８ ８６０ Ａ１号およびＤＥ １０３ ２２ ７０１ Ａ１号には、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸または３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸の使用が記載されている。最後に、ＵＳ ２００６／００４０３３４ Ａ１号およびＷＯ ２００６／１２４００３ Ａ１号には、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸の分析物共役誘導体もしくはポリマー共役誘導体に基づくＭＡＬＤＩマトリックスが開示されている。
【０００６】
ＭＡＬＤＩ質量分析に使用することのできるマトリックスは、多数の要件を同時に満たさなければならない。まず、マトリックスは、分析物を（共結晶化により）マトリックス結晶の中に組み込むことができ、かつ、それらをその他の分析物から単離することができなければならない。その上、該マトリックスは、分析物に相溶性であって、真空で安定し、使用するレーザーのレーザー波長を吸収できる溶媒に溶解性である必要がある。さらに、該マトリックスは、レーザー照射によりマトリックスと分析物の同時脱離を引き起こし、分析物イオン化を促進するべきである。
【０００７】
今まで使用したマトリックス化合物に関して、ＭＡＬＤＩ質量分析の特性およびそれに従った性能データは、特に陽イオン、陰イオンおよび二重電荷またはそれ以上の電荷を有するイオンに対するその検出および感受性に関して、なお改良が可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の課題は、ＭＡＬＤＩ質量分析においてマトリックスとして使用することができ、かつ、現状の技術から分かる欠点を少なくとも部分的に克服する化合物を提供することである。特に、課題は、陽イオン、陰イオンおよび二重電荷またはそれ以上の電荷を有するイオンに対する検出および感受性を改良することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題は、一般式：
【化１】
〔式中、Ｘは、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉならびに置換および非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルから選択され；ＹおよびＺは、独立に、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉならびに置換および非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルから選択され；かつ、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、ＳＯ３ＨおよびＣＯＯＲ’（Ｒ’はＣ１−Ｃ１０アルキル）から選択される〕
で表されるシアノ桂皮酸誘導体の、分析物のＭＡＬＤＩ質量分析のためのマトリックスとしての使用により解決される。示される構造式は、シアノ桂皮酸誘導体のあらゆる可能なシス／トランス異性体を含むことが意図される。
【００１０】
Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、メチルまたはＣ２−Ｃ１０アルキルから選択され、ＹおよびＺは、独立に、Ｈ、ＦおよびＣｌから選択されることが好ましい。
【００１１】
また、シアノ桂皮酸誘導体は、２，４−ジフルオロ−シアノ桂皮酸、４−クロロ−シアノ桂皮酸または４−メチルシアノ桂皮酸であることが提案される。
【００１２】
好ましい実施形態では、４−クロロ−シアノ桂皮酸は、陽イオンのＭＡＬＤＩ質量分析のためのマトリックスである。
【００１３】
さらに好ましい実施形態では、２，４−ジフルオロ−シアノ桂皮酸、４−クロロ−シアノ桂皮酸および４−メチル−シアノ桂皮酸は、陰イオンのＭＡＬＤＩ質量分析のためのマトリックスである。
【００１４】
その上、２，４−ジフルオロ−シアノ桂皮酸は、陰イオンおよび陽イオンのＭＡＬＤＩ質量分析のためのマトリックスであることが提案される。
【００１５】
なおさらに好ましい実施形態では、４−メチル−シアノ桂皮酸および４−クロロ−シアノ桂皮酸は、二重荷電イオンのＭＡＬＤＩ質量分析のためのマトリックスである。
【００１６】
また、分析物は消化されたタンパク質またはペプチドであることが好ましい。とは言うものの、未消化のタンパク質、ポリ核酸、糖類および同類のものも分析物として考えられる。
【００１７】
マトリックスが分析物と混合されていることも好ましい。
【００１８】
その上、分析物のマトリックスに対するモル混合比は、１：１，０００〜１：１，０００，０００，０００，好ましくは１：１００，０００〜１：１０，０００，０００であるべきであることが提案される。
【００１９】
また、好ましくは、前記一般式に該当する様々なシアノ桂皮酸誘導体の混合物または前記一般式に該当する少なくとも１種類のシアノ桂皮酸誘導体の混合物が、さらなるマトリックスとともに使用されることも提案される。
【００２０】
最後に、さらなるマトリックスは、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、シナピン酸またはフェルラ酸から選択されることが提案される。
【００２１】
同様に、２−アザ−５−チオチミンまたは３−ヒドロキシピコリン酸をさらなるマトリックスとして使用してよい。
【００２２】
使用されるマトリックス材料を不活性充填剤と混合することも等しく考えられる。
【００２３】
驚くことに、上述されたシアノ桂皮酸誘導体をＭＡＬＤＩ質量分析のマトリックスとして使用する場合、陽イオン、陰イオンおよび二重電荷またはそれ以上の電荷を有するイオンに対する検出および感受性は、実質的に改良され得ることが本発明に従って見出された。
【００２４】
特に、生物学的ポリマー分析物、好ましくはペプチド分析物の感受性の明確な改良が達成された。さらに、本発明に従う使用は、様々なアミノ酸組成のペプチドに対して低い選択性を示し、従って、これまでの場合よりも多くの種類の分析物を分析物混合物中に検出することができることの結果として、ＭＡＬＤＩ質量スペクトルにおける、これまで使用されるマトリックスに対する差別効果を実質的に低下させる。上述のシアノ桂皮酸誘導体のマトリックス混合物を使用することにより、結晶化および分析物化合物のマトリックス結晶の中への組み込みおよび分析物のより効率的なイオン化に関して、特性を最適化することが可能となる。同様に、驚くことに、類似した電子特性をもつ置換基、例えばＮＯ２、ＣＮまたはアセチルなどを含むシアノ桂皮酸誘導体は、本発明に従って使用されるシアノ桂皮酸誘導体ほど良好な結果を達成することがとてもできないことが見出された。
【００２５】
本発明のさらなる特長および利点は、添付される図面とともに、以下の好ましい実施形態の詳細な説明から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】これまで用いられたα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸および新しく使用されるα−シアノ−４−クロロ桂皮酸をマトリックスとして使用する比較において、ＢＳＡタンパク質消化（ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン）の質量スペクトルからの抜粋を示す図である。
【図２】これまで用いられたα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸および新しく使用されるα−シアノ−４−クロロ桂皮酸をマトリックスとして使用する比較において、ＢＳＡタンパク質消化（ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン）の質量スペクトルからの抜粋を示す図である。
【図３】これまで用いられたα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸および新しく使用されるα−シアノ−４−クロロ桂皮酸をマトリックスとして使用する比較において、ＢＳＡタンパク質消化（ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン）の質量スペクトルからの抜粋を示す図である。
【図４】これまで用いられたα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸および新しく使用されるα−シアノ−４−クロロ桂皮酸をマトリックスとして使用する比較において、ＢＳＡタンパク質消化（ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン）の質量スペクトルからの抜粋を示す図である。
【図５】これまで用いられたα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸および新しく使用されるα−シアノ−４−クロロ桂皮酸をマトリックスとして使用する比較において、ＢＳＡタンパク質消化（ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン）の質量スペクトルからの抜粋を示す図である。
【図６】ＢＳＡタンパク質消化のあらゆる検出可能なペプチドを表の形式で記載する図である。
【図７】マトリックスとしてのα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸およびα−シアノ−２，４−ジフルオロ桂皮酸の陰イオンに対する質量スペクトルの比較を示す図である。
【図８】α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸およびα−シアノ−４−メチル桂皮酸を使用する二重荷電イオンに対する質量スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明に従って使用してよいシアノ桂皮酸誘導体は、例えば、クネーフェナーゲル縮合（Ｋｎｏｅｖｅｎａｇｅｌ ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）に従って、対応するアルデヒドとシアノ酢酸（誘導体）の縮合により調製することができる。
【実施例１】
【００２８】
２ｇのシアノ酢酸（１当量、２３．５ｍｍｏｌ）、２．９７ｇのクロロベンズアルデヒド（０．９当量、２１．１ｍｍｏｌ）および３００ｍｇの酢酸アンモニウム（酸に基づいて１５％（ｍ／ｍ））を３０ｍｌのトルエン中で水分離器を用いて還流しながら加熱する。水分離の完了後（約３時間）、混合物を室温まで冷却する。その過程で、生成物は通常結晶形で沈殿する。濾過した後、粗生成物を十分な水で洗浄する。生成物が沈殿しない場合は、混合物を濃縮し、残った固体を十分な水で洗浄する。粗生成物は、アルコール（メタノール）と水の混合物から繰り返し再結晶化させる。さらなる精製は、５０％アセトニトリルを溶媒として使用する、イオン交換（強力な陽イオン交換体）によって起こる。溶出液を室温にて濃縮する。その過程で精製された生成物が結晶形で沈殿する。濾過および真空乾燥後、３．３５ｇ（理論値の７８％）のα−シアノ−４−クロロ桂皮酸が得られる。
【実施例２】
【００２９】
アルデヒドの量に基づいて１．２５倍の量のシアノ酢酸を、ビーカー中で３０℃にて４０ｍｌの水に、シアノ酢酸の量に基づいて１．１倍の量のソーダとともに溶解する。溶液をフラスコに移し、続いて起こる反応は約３０℃で行う。１５ｍｌの水に溶解した水酸化ナトリウム（シアノ酢酸の量に基づいて０．１２５倍の量）をこの溶液に添加する。アルデヒドを（アルデヒドが液体でない場合）できる限り少ない容積のアセトニトリルに溶解し、激しい攪拌を伴って約３０分間にわたって徐々に添加する。２時間攪拌した後、溶液をビーカーに移し、濃塩酸で酸性化する；溶液を氷浴中で冷却し、吸引濾過する。沈殿物を少量の冷水およびトルエン（不溶性である場合）で洗浄し、４０℃にて真空乾燥させる。精製は実施例１のように行う。収率は、理論量の約５０〜７０％である。
【００３０】
シアノ桂皮酸誘導体は、ＭＡＬＤＩ質量分析の適したサンプルを調製するために、標準的な手順を用いて分析物と混合されてよい。
【００３１】
混合の例示的な一方法は、液滴乾燥法（ｄｒｉｅｄ ｄｒｏｐｌｅｔ ｍｅｔｈｏｄ）である。この過程において、マトリックスと分析物を溶解し、同時に（事前混合により）または連続して任意の表面に適用する。溶媒の蒸発により、分析物化合物を含むマトリックスの結晶化がもたらされる。
【００３２】
マトリックスまたはマトリックス混合物を溶解し、分析物を含まない任意の表面に適用する、表面調製法（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を用いてもよい。溶媒の蒸発によりマトリックス化合物の（共）結晶化がもたらされる。溶解した分析物を結晶母体に適用し、その過程で表面に近いマトリックス層だけが溶解することにより、再結晶化による濃縮形態の分析物化合物の封入が引き起こされる。
【００３３】
昇華法は、マトリックスが溶液から結晶化せずに、昇華による気相からの析出により表面に適用されることを除いて、表面調製法に相当する。
【００３４】
最後に、マトリックスおよび分析物を共通の溶媒（混合物）に溶解し、スプレー装置（エアゾール形成）を用いて分散して分布させる「エアブラシ法」が可能である。大きい表面積は、マトリックス／分析物結晶の形成に付随して溶媒の急速な蒸発をもたらす。あるいは、マトリックスを、分析物を含まずに溶解させて、スプレーまたはその他の手段によって調査する表面（織物の一部分など）に適用してもよい。
【００３５】
新規な適用分野は、マトリックスのイオン液体としての調製である：この目的のため、溶解したマトリックスを等モル量のカチオン化可能な（ｃａｔｉｏｎｉｓａｂｌｅ）塩基、例えば、ピリジンまたはジエチルアミンなどと混合し、回転させ、その結果として液体イオンマトリックス膜が生じ、それを分析物溶液とともに任意の表面に適用することができる。
【００３６】
以降、「消化」は、酵素によって特定のアミノ酸位置で切断され、多数の小型のペプチドを生じるタンパク質を意味するために使用される。
【００３７】
Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ ＳＴＲ質量分析計を、行った実験に使用した。
【００３８】
質量分析計は、異なる種類のイオン（分析物イオン、マトリックスイオン）をそれらの質量対電荷比に従って区別する。通常は、ＭＡＬＤＩ中のイオンは１つ（正または負）しか電荷を保有しないので、電荷が１である場合、質量対電荷比はイオンの質量に等しい。スペクトルの横座標は、イオンの質量対電荷比（および従ってほとんどすべての場合において質量）を示し、単位はダルトンまたはｇ／モルである。
【００３９】
より強いシグナル（垂直の線で示され、該線（シグナル）の長さはそのシグナルを引き起こすイオン種の量に相関する）は、個別に質量または質量対電荷比で標識されている。
【００４０】
縦座標のスケールは、関係するスペクトル内で最も強いシグナルによって決まり、最も強いシグナル（使用する機器によって決まる）の絶対値を示す。該スペクトルに示されるあらゆるその他のシグナルは、最も強いシグナルに対して引かれている（縦座標の左側）。縦座標の右側の値は、１つのスペクトルまたは同じ質量分析計のその他のスペクトル内のさらなるシグナルとの比較にのみ意味がある。例えば、図１〜５「ＢＳＡ消化−効果的に適用された１ｆｍｏｌ」の右上の数値は、各々の場合の最も強いシグナルの絶対強度を示す（図１中、新しいマトリックスα−シアノ−４−クロロ桂皮酸を使用する場合、上側のスペクトルにおいて、質量６８９．３７８）。質量ｍ／ｚ＝９２７．４９５のペプチドの相対強度は、ｍ／ｚ＝６８９．３７８の最も強いイオンの強度と比較して８８％（縦座標のスケールの左側から読み取ることができる）であり、従って強度６，１５２絶対単位（ａｂｓ．ｕｎｉｔ）を有する。既知のマトリックスα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸の下側のＣＨＣＡスペクトルにおいて、ｍ／ｚ＝９２７．４９４の同じシグナルの絶対強度は、たった２５３．１単位である（ｍ／ｚ＝６７５．６３５の最も強いシグナルと６２７．０単位に従って計算する。ここで、ｍ／ｚ＝９２７．４９４でのＢＳＡペプチドシグナルの相対強度は４０．３７％である）。この例示的なイオンによって、新規マトリックスは従って絶対強度を約２５倍増大させることを可能にする。このことは、このペプチドが新規マトリックスと一緒に、相当に多くのイオンを形成し、従って測定の容易な著しく強いシグナルを引き起こすことを意味する。この利点は、これまで検出することのできなかった弱いシグナルを、今では例えば図２中のＢＳＡ消化−効果的に適用された１ｆｍｏｌ（９５０−１，１００）に見出すことのできる増幅によって測定することができることである。つまり、新規なマトリックス（上側のスペクトル）は、古いマトリックス（これまでの最良のもの−下側のスペクトル）で検出することができなかった分析物を検出することを可能にする。より正確に分類するため、関係するシグナルを生じるペプチドのアミノ酸組成も大部分のシグナルに加えた（アミノ酸修飾は通例の１文字記号に対応する）。起こり得るペプチド修飾は、後に続く括弧内に示される（ＣＡＭ−Ｃ：システインのカルバミドメチル化、ｐＧｌｕ：ピログルタミン修飾、Ｃ−ｔｅｒｍ．：Ｃ末端断片）。シグナルの後に続く、１Ｄａの質量増加を伴う弱いシグナルは、関係するペプチドの１３Ｃ同位体に起因する。改善された結果は図１〜５の全てから見出すことができる。
【００４１】
図６には、使用したＢＳＡ−タンパク質消化の検出可能なペプチドが全て記載される。検出可能なペプチドの量は、最初に使用されるタンパク質の量によって決まり、そのタンパク質の量はこの場合ごく少量の１ｆｍｏｌであった。上半分は、これまで用いられたＣＨＣＡマトリックス（ＨＣＣＡまたはα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸と同義）を用いて検出可能なペプチドを示す。下半分には、上半分に加えて、新規マトリックスでのみ検出可能なペプチドが全て記載される。このことから、非常に多くの情報の増加が得られることがすぐに分かる。１列目には、関与するペプチドのアミノ酸配列が記載され、さらに２列目にはそれらの質量が示されている。この列では、シグナルの強度および検出能を示すＳ／Ｎ（シグナル対ノイズ）比が示される：種々の理由から、全スペクトルにはわずかなノイズが含まれる、ノイズはたとえ分析物を含まない場合にさえ常に生じるものである。検出されるには、シグナルはノイズよりも高い強度を有さねばならない；そうでなければシグナルを検出することはできない。Ｓ／Ｎ比はコンピュータにより計算され、シグナルがバックグラウンドノイズに対して何倍強いかを示す。これはつまり、Ｓ／Ｎ比が高いほど、シグナルを認識および検出することが容易になることを意味する。３列目には、古いマトリックスに対する新規マトリックスのＳ／Ｎ比が含まれ、１より大きい値は従ってこれらのシグナルのほうが強く、従って検出し易いことを示す。４列目には、絶対強度の比が示され、この場合もやはり原則は、絶対強度が大きいほど、シグナルをそのようなものとして認識することが容易であることである；新規マトリックスが古いマトリックスよりも相当に強いシグナルを生じることがはっきり見出すことができる。
【００４２】
現状の技術よりも相当な改良を表す、図１〜５について考察した結果はまた、それぞれ陰イオンおよび二重荷電イオンに対する図７および８の質量スペクトルにおいても見出すことができる。
【００４３】
上記の説明、請求項および図面に開示される本発明の特徴は、本発明をその最も変化した実施形態において個別にかつ組み合わせて実施するために必要不可欠であり得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
【化１】
〔式中、Ｘは、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉならびに置換および非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルから選択され；ＹおよびＺは、独立に、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉならびに置換および非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルから選択され；かつ、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、ＳＯ３ＨおよびＣＯＯＲ’（Ｒ’はＣ１−Ｃ１０アルキル）から選択される〕
で表されるシアノ桂皮酸誘導体の、分析物のＭＡＬＤＩ質量分析のためのマトリックスとしての使用。
【請求項２】
Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、メチルまたはＣ２−Ｃ１０アルキルから選択され、ＹおよびＺが、独立に、Ｈ、ＦおよびＣｌから選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記シアノ桂皮酸誘導体が、２，４−ジフルオロ−シアノ桂皮酸、４−クロロ−シアノ桂皮酸または４−メチルシアノ桂皮酸である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
４−クロロシアノ桂皮酸が、陽イオンのＭＡＬＤＩ質量分析のためのマトリックスである、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
２，４−ジフルオロシアノ桂皮酸、４−クロロ−シアノ桂皮酸および４−メチル−シアノ桂皮酸が、陰イオンのＭＡＬＤＩ質量分析のためのマトリックスである、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
２，４−ジフルオロシアノ桂皮酸が、陰イオンおよび陽イオンのＭＡＬＤＩ質量分析のためのマトリックスである、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
４−メチルシアノ桂皮酸および４−クロロ−シアノ桂皮酸が、二重電荷またはそれ以上の電荷を有するイオンのＭＡＬＤＩ質量分析のためのマトリックスである、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記分析物が、消化されたタンパク質またはペプチドである、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記マトリックスが、前記分析物と混合されている、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
前記一般式に該当する様々なシアノ桂皮酸誘導体の混合物または前記一般式に該当する少なくとも１種類のシアノ桂皮酸誘導体の混合物が、さらなるマトリックスとともに使用される、請求項１〜９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
前記さらなるマトリックスが、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、シナピン酸またはフェルラ酸から選択される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１】
一般式
【化１】
〔式中、Ｘは、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉならびに置換および非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルから選択され；ＹおよびＺは、独立に、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉならびに置換および非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルから選択され；かつ、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、ＳＯ３ＨおよびＣＯＯＲ’（Ｒ’はＣ１−Ｃ１０アルキル）から選択される〕
で表されるシアノ桂皮酸誘導体の、分析物のＭＡＬＤＩ質量分析のためのマトリックスとしての使用。
【請求項２】
Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、メチルまたはＣ２−Ｃ１０アルキルから選択され、ＹおよびＺが、独立に、Ｈ、ＦおよびＣｌから選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記シアノ桂皮酸誘導体が、２，４−ジフルオロ−シアノ桂皮酸、４−クロロ−シアノ桂皮酸または４−メチルシアノ桂皮酸である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
４−クロロシアノ桂皮酸が、陽イオンのＭＡＬＤＩ質量分析のためのマトリックスである、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
２，４−ジフルオロシアノ桂皮酸、４−クロロ−シアノ桂皮酸および４−メチル−シアノ桂皮酸が、陰イオンのＭＡＬＤＩ質量分析のためのマトリックスである、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
２，４−ジフルオロシアノ桂皮酸が、陰イオンおよび陽イオンのＭＡＬＤＩ質量分析のためのマトリックスである、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
４−メチルシアノ桂皮酸および４−クロロ−シアノ桂皮酸が、二重電荷またはそれ以上の電荷を有するイオンのＭＡＬＤＩ質量分析のためのマトリックスである、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記分析物が、消化されたタンパク質またはペプチドである、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記マトリックスが、前記分析物と混合されている、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
前記一般式に該当する様々なシアノ桂皮酸誘導体の混合物または前記一般式に該当する少なくとも１種類のシアノ桂皮酸誘導体の混合物が、さらなるマトリックスとともに使用される、請求項１〜９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
前記さらなるマトリックスが、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、シナピン酸またはフェルラ酸から選択される、請求項１０に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１０−５３７２０６（Ｐ２０１０−５３７２０６Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２２１７６（Ｐ２０１０−５２２１７６）
【出願日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＥ２００８／００１１４９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２６８６７
【国際公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【出願人】（５０４３７１６６４）ヨハン ヴォルフガング ゲーテ−ウニヴェルジテート フランクフルト アム マイン (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＥ２００８／００１１４９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２６８６７
【国際公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【出願人】（５０４３７１６６４）ヨハン ヴォルフガング ゲーテ−ウニヴェルジテート フランクフルト アム マイン (5)
【Ｆターム（参考）】
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