ＭＥＳＴ活性を測定するための試験系並びにそれを含む方法及び使用
本発明は、ＭＥＳＴ活性を測定するための試験系、ＭＥＳＴのリガンドをスクリーニングするための方法、及びＭＥＳＴリガンド、特にＭＥＳＴ阻害剤の同定のための試験系の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＥＳＴ活性を測定するための試験系、ＭＥＳＴのリガンドをスクリーニングするための方法、及びＭＥＳＴリガンド、特にＭＥＳＴ阻害剤の同定のための試験系の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、過剰な体脂肪が健康に有害な影響を有し得る、例えば減少した平均余命をもたらす程度まで蓄積した医学的状態である。脂肪細胞量の増加として定義される肥満及びそれに伴う末梢組織（例えば筋肉及び肝臓）のインスリン抵抗性は、先進工業国における本質的な健康問題であり、そして途上国でも増加している。肥満及びインスリン抵抗性は、頻繁にメタボリックシンドローム及びＩＩ型糖尿病に至り、従ってこれらの疾患の原因と考えられる。
【０００３】
脂肪細胞量は、脂肪細胞の数の増加（分化）及び／又は脂肪細胞のサイズの増加（細胞あたりの細胞質脂質の増加した量の沈着）により増強される。タンパク質「ＭＥＳＴ」が脂肪細胞サイズの調節に関与すると示唆されている（例えば非特許文献１；２及び３）を参照のこと。
【０００４】
以下の効果が観察されている：
ｉ） ＭＥＳＴのｍＲＮＡレベル及びタンパク質発現が、脂肪餌を与えられた肥満の動物の脂肪組織において劇的に増加する。
ｉｉ） ＭＥＳＴ発現が脂肪細胞のサイズと相関する。
ｉｉｉ） 脂肪組織においてＭＥＳＴを過剰発現したトランスジーンマウスは、増加した脂肪細胞特異的遺伝子発現及び増加した脂肪細胞サイズ（数は増加しない）を示すが、筋肉質量及び非脂肪組織の総質量は減少する。
ｉｖ） 肥満動物への抗糖尿病薬の投与（グリタゾンクラスの「インスリン抵抗性改善薬」）により発現が減少し、それに伴って脂肪細胞サイズが減少し、そしてインスリン感受性が改善された。
ｖ） 培養された脂肪細胞におけるＭＥＳＴの過剰発現は、増加した脂肪細胞分化及び脂肪細胞特異的遺伝子発現をもたらす。
ｖｉ） ＭＥＳＴ ｍＲＮＡ及びタンパク質は、糖尿病及び過体重のヒトの脂肪組織においてのみ検出可能である。
ｖｉｉ） ヒトボディマス指数（肥満の基準として）に影響を及ぼすヒト第７染色体における染色体座（７ｑ３２．３）は、これも第７染色体上にあるＭＥＳＴについて同定された染色体座の近くに位置する（７ｑ３２．２）。
ｖｉｉｉ） ＭＥＳＴ遺伝子を欠失したマウス（ＭＥＳＴ ＫＯマウス）は、（正常な形態で）減少した脂肪組織質量を示す。
ｉｘ） 脂肪富化食餌後のマウスの相対的な肥満の差は、精巣上体脂肪組織におけるＭＥＳＴの発現と相関しており、ここで質量の増加した量は肥満の発生時に既に検出可能であり、従って肥満の病理発生の前兆でありそして原因である。
【０００５】
もともとＭＥＳＴはマウスの癌細胞（ＭＣ１２）からクローン化された。これは胚体中胚葉及び胚体外中胚葉において発現されるが、通常成体組織では発現されない。さらに、ＭＥＳＴは、正常な胚と単為生殖胚（雌性ゲノム由来のみ）とのｃＤＮＡのサブトラクションハイブリダイゼーションによる刷り込み遺伝子の系統的分析において父系のみ発現される遺伝子と同定された。
【０００６】
しかし、ＭＥＳＴの酵素的機能又は生化学的機能はこれまで記載されていない。しかし、その肥満における関連性のために、ＭＥＳＴの調節因子を、特に新しい治療標的として、並びに糖尿病、メタボリックシンドローム及び／又はＩＩ型糖尿病の処置として同定することが望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｆｅｉｔｏｓａ ｅｔ ａｌ．，２００２
【非特許文献２】Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００５
【非特許文献３】Ｎｉｋｏｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、ＭＥＳＴリガンドの同定に使用され得る、ＭＥＳＴ活性を測定するための試験系を開発することが本発明の目的であった。驚くべきことに、アルファ／ベータ折り畳みヒドロラーゼ（リパーゼ、エステラーゼ、セリンプロテアーゼ及びアシルトランスフェラーゼ）のスーパーファミリーにＭＥＳＴが属するということが見出された。グリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼＧＰＡＴ１−４に対するＭＥＳＴの全体的な配列同一性は非常に低い（Ｌｅｈｎｅｒ及びＫｕｋｓｉｓ，１９９６；Ｌｅｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｃｏｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，２００６）。低い配列同一性に起因して、ＭＥＳＴはハイブリダイゼーション又はＰＣＲ（縮重プライマーを使用する）でも、インシリコ配列解析でもかすかに関連したＧＰＡＴアイソフォームと同定されなかった。
【０００９】
しかし、実施例に示されるように、ＭＥＳＴがグリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼとしての活性を有することが今や示されており、この発見に基づいて試験系が開発されている。この発見は、グリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼが脂肪細胞及び他の末梢組織における脂質の合成において律速であり、それにより脂肪細胞のサイズを調節するということと特に関連する。従って、ＭＥＳＴの阻害は、肥満及び糖尿病に関連する治療方法における興味深い標的を提供する。このことは、グリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（例えばＧＰＡＴ １及び３）のファミリーの他のメンバーについて適切な細胞ベースのアッセイ、さらには動物モデルにおいて既に確認されている（Ｔｈｕｒｅｓｓｏｎ，２００４）。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、本発明の第一の局面は、
ｉ） 中胚葉特異的転写物相同体タンパク質（ＭＥＳＴ）又はその機能的に活性な変異体、
ｉｉ） アシル受容体、例えばグリセロール−３−リン酸、
ｉｉｉ） アシル供与体、例えばアシル補酵素Ａ（ＣｏＡ）［ここでアシルは０、１、２又は３つの二重結合を有するＣ14〜Ｃ22アシルである］、及び
ｉｖ） アシル残基をアシルＣｏＡからアシル受容体に転移させるＭＥＳＴの酵素活性を検出するための手段
を含んでなる、ＭＥＳＴ活性を測定するための試験系に関する。
【００１１】
本発明の試験系は、アシル転移酵素ＭＥＳＴの機能及び活性を解明するために使用され得る。詳細には、本試験系は、ＭＥＳＴと相互作用する薬剤、特にＭＥＳＴを活性化又は不活化する薬剤を開発、同定及び／又は特徴付けするために使用され得る。同定された薬剤は興味深い治療薬であり得、これは肥満及び糖尿病のようなＭＥＳＴ関連疾患の処置において使用され得る。
【００１２】
本発明の試験系が適応され得る一連の試験設計は当該分野で公知である。例となる試験に関するさらなる詳細は本発明の方法において示される。本試験系は、場合によりＭＥＳＴと相互作用することが疑われるか相互作用することが公知である薬剤の存在下で、ＭＥＳＴの活性を測定するために使用され得る。当業者は、例えば一般的な方法と関連して必要とされるさらなる薬剤を加えることにより、意図される特定の試験設計に本試験系を適応させることができるだろう。
【００１３】
本発明によれば、試験系はＭＥＳＴの活性を測定するために設計される。ＭＥＳＴは生体分子のアシル化を触媒するアシル転移酵素である。この文脈において、アシル転移酵素は、アシル供与体、特にアシル補酵素Ａ（ＣｏＡ）（例えばパルミトイル−ＣｏＡ又はオレオイル−ＣｏＡ）からアシル受容体、特にグリセロール３−リン酸へのアシル転移を触媒する。
【００１４】
上で詳述したように、本試験系は、アシル転移酵素ＭＥＳＴの酵素活性、すなわちアシル供与体からアシル受容体へのアシル基の転移におけるその活性を測定するために使用される。酵素活性は、一般的に単位時間あたりに転換された基質のモル数＝速度×反応体積として定義される。酵素活性は存在する活性酵素の量の尺度であり、従って条件に依存する。ＳＩ単位はカタールであり、１カタール＝１ｍｏｌ 秒-1であるが、これは非常に大きな単位である。より実用的で一般に使用される値は１酵素単位（ＥＵ）＝１μｍｏｌ 分-1（μ＝マイクロ、ｘ１０-6）。１Ｕは１６．６７ナノカタールに相当する。しかし、アシル転移酵素の酵素活性は、例えば試験しようとする化合物の不在下及び存在下での酵素活性を比較することにより、アシル転移酵素の酵素活性の変化（相対的単位）として測定してもよい。例となる試験設計を実施例４〜６に記載する。
【００１５】
明らかに、酵素活性は（ｉｎ）、酵素の量、酵素の活性化状態、補因子（例えば活性化補助因子又は補助抑制因子）の存在、活性化因子及び阻害剤の存在、並びに塩濃度、温度、ｐＨなどのような周囲条件を含む一連の因子により影響を受ける。通常、酵素活性は標準的な実験室条件で測定され、そして問題の試験系の最適条件に適合され得る。従って、試験系は、有用な治療剤であり得る活性化因子及び阻害剤のような酵素の活性化状態を変化させる分子を検出又は同定するために使用され得る。
【００１６】
第一の構成要素（構成要素ｉ）とも呼ばれる）として、本試験系は中胚葉特異的転写物相同体タンパク質（ＭＥＳＴ）又はその機能的に活性な変異体を含む。
【００１７】
中胚葉特異的転写物相同体タンパク質（ＭＥＳＴ）は父性発現（ｐａｔｅｒｎａｌｌｙ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）遺伝子１タンパク質（ＰＥＧ１）とも呼ばれる。このタンパク質又は遺伝子のさらなる特徴は明細書の導入部分に示される。
【００１８】
これまでにＭＥＳＴの３つのアイソフォームが同定されており、これらは選択的スプライシングにより産生される：アイソフォーム１（識別名：Ｑ５ＥＢ５２−１、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／にてＰｒｏｔｅｉｎ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢを参照のこと）、アイソフォーム２（識別名：Ｑ５ＥＢ５２−２）（ここではアイソフォーム１のアミノ酸１〜９が欠けている）、及びアイソフォーム３（識別名：Ｑ５ＥＢ５２−３）（ここではアイソフォーム１のアミノ酸１〜９及び２１８〜２５１が欠けている）。ヒトＭＥＳＴアイソフォーム１は以下のアミノ酸配列を有する（ＰＲＯ＿００００２８４４１８を参照）：
【００１９】
10 20 30 40 50 60
MVRRDRLRRM REWWVQVGLL AVPLLAAYLH IPPPQLSPAL HSWKSSGKFF TYKGLRIFYQ
70 80 90 100 110 120
DSVGVVGSPE IVVLLHGFPT SSYDWYKIWE GLTLRFHRVI ALDFLGFGFS DKPRPHHYSI
130 140 150 160 170 180
FEQASIVEAL LRHLGLQNRR INLLSHDYGD IVAQELLYRY KQNRSGRLTI KSLCLSNGGI
190 200 210 220 230 240
FPETHRPLLL QKLLKDGGVL SPILTRLMNF FVFSRGLTPV FGPYTRPSES ELWDMWAGIR
250 260 270 280 290 300
NNDGNLVIDS LLQYINQRKK FRRRWVGALA SVTIPIHFIY GPLDPVNPYP EFLELYRKTL
310 320 330
PRSTVSILDD HISHYPQLED PMGFLNAYMG FINSF
（配列番号１）
【００２０】
アイソフォーム１は父方対立遺伝子からのみ発現するが、アイソフォーム２は父方の対立遺伝子及び母方の対立遺伝子の両方から発現する。父系由来対立遺伝子の単一対立遺伝子発現は調べられた全ての胎仔組織（脳、骨格筋、腎臓、副腎、舌、心臓、皮膚及び胎盤を含む）において見られた。
【００２１】
その触媒三連構造（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒｉａｄ）（セリン１４５、ヒスチジン１４６、アスパラギン酸１４７）に起因して、ＭＥＳＴはＡＢ（折り畳み）ヒドロラーゼスーパーファミリー（α／βヒドロラーゼスーパーファミリーとも呼ばれる）に属すると示唆された。しかし、その酵素的又は生化学的機能は以前は解明されていなかった。ＡＢ（折り畳み）ヒドロラーゼスーパーファミリーの公知のメンバーは、重要な生化学的プロセスに関与し、そして種々の疾患に関連することが見出されている。最も大きなタンパク質スーパーファミリーの１つとして、ＡＢヒドロラーゼスーパーファミリーは、適当な関係のないアミノ配列が類似性を有する構造に適合し得る興味深い進化過程を経てきた。５つの明らかに関係のないヒドロラーゼのタンパク質折り畳みは、１９９０年代前半にａ／ｂヒドロラーゼ折り畳みと名付けられた。標準的なａ／ｂヒドロラーゼ折り畳みは８本鎖の平行ａ／ｂ構造で構成される。このファミリーの酵素は、関係のない配列、様々な基質、そして異なる種類の触媒活性を有していてもよい、例えば：カルボン酸エステルヒドロラーゼ、リパーゼ、チオエステルヒドロラーゼ、ペプチドヒドロラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、デハロゲナーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、及びＣ−Ｃ結合開列酵素。
【００２２】
本発明内では、ＭＥＳＴがアシルトランスフェラーゼとしての酵素活性を有すると示すことができた（実施例も参照のこと）。公知のアシルトランスフェラーゼ（特にグリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）１−４）に対する全体の配列類似性が非常に低いので、この発見は特に驚くべきことであった。従って、ＭＥＳＴは遠隔アシルトランスフェラーゼとしてはまだ同定されていない。
【００２３】
本発明によれば、特徴「中胚葉特異的転写物相同体タンパク質」（ＭＥＳＴ）は上記で定義されるようなヒトアイソフォーム１、２及び３を含む天然に存在するいずれかのＭＥＳＴに関する。しかし、上で記載及び説明されるヒトアイソフォーム１（配列番号１を参照のこと）が特に好ましい。
【００２４】
いずれかの天然に存在するＭＥＳＴアイソフォーム又は変異体（例えば種変異体又はスプライス変異体）に加えて、改変されたＭＥＳＴタンパク質を使用してもよい。改変ＭＥ
ＳＴタンパク質又はＭＥＳＴ変異体は、変異体がその生物学的機能、すなわちそのアシル転移活性を維持しているという点で機能的に活性な変異体であるということに留意すべきである。好ましくは、生物学的機能、例えばアシル基の転移の維持は、天然に存在するＭＥＳＴの活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、８０％又は９０％、なおより好ましくは９５％を有すると定義される。生物学的活性は実施例に記載されるように決定され得る。
【００２５】
変異体は、天然に存在するＭＥＳＴタンパク質からなるドメイン及び少なくとも１つのさらなる構成要素を有する分子であり得る。例えば、タンパク質を、精製目的で使用されるタグ（例えば６Ｈｉｓ（又はＨｅｘａＨｉｓ）タグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＨＡタグ、ｃ−ｍｙｃタグ又はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ）のようなマーカーに結合してもよい。例えば、高度に精製されたＭＥＳＴタンパク質又は変異体が必要とされる場合、二重又は多重マーカー（例えば上記のマーカー又はタグの組み合わせ）が使用され得る。この場合、タンパク質は２つ又はそれ以上の分離クロマトグラフィー工程で精製され、各場合に第一のタグ、次いで第二のタグの親和性を利用する。このような二重タグ又はタンデムタグの例は、ＧＳＴ−Ｈｉｓタグ（ポリヒスチジンタグに融合されたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、６ｘＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ（Ｓｔｒｅｐタグに融合された６つのヒスチジン残基）、６ｘＨｉｓ−タグ１００−タグ（哺乳動物ＭＡＰ−キナーゼ２の１２アミノ酸のタンパク質に融合された６つのヒスチジン残基）、８ｘＨｉｓ−ＨＡタグ（赤血球凝集素−エピトープタグに融合された８つのヒスチジン残基）、Ｈｉｓ−ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質に融合されたＨｉｓタグ）、ＦＬＡＧ−ＨＡタグ（血液凝集素−エピトープタグに融合されたＦＬＡＧタグ）、及びＦＬＡＧ−Ｓｔｒｅｐタグ（Ｓｔｒｅｐタグに融合されたＦＬＡＧタグ）である。マーカーはタグ化タンパク質を検出するために使用することができ、ここでは特異的抗体が使用され得る。適切な抗体としては、抗ＨＡ（例えば１２ＣＡ５又は３Ｆ１０）、抗６Ｈｉｓ、抗ｃ−ｍｙｃ及び抗ＧＳＴが挙げられる。さらに、ＭＥＳＴタンパク質は、蛍光マーカー又は放射性マーカーのような異なる分類のマーカーに連結され得、これによりＭＥＳＴの検出が可能になる。さらなる実施態様において、ＭＥＳＴは融合タンパク質の一部であり得、ここで酵素活性を有するタンパク質構成要素のように、第二の部分は検出に使用され得る
本発明の別の実施態様において、ＭＥＳＴ変異体はＭＥＳＴフラグメントであり得、ここでフラグメントもやはりアシル基を転移させることができる。これには短いＣ末端及び／又はＮ末端欠失（例えば多くとも２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１つのアミノ酸）を有するＭＥＳＴタンパク質が含まれ得る。さらに、ＭＥＳＴフラグメントはＭＥＳＴタンパク質について上で詳述されるようにさらに改変され得る。
【００２６】
あるいは又はさらに、ＭＥＳＴタンパク質又は上記のようなその変異体は、特にアシル基の転移に関与しない領域に１つ又はそれ以上のアミノ酸置換を含み得る。しかし、アミノ酸が化学的に関連するアミノ酸で置換される保存的アミノ酸置換が好ましい。典型的な保存的置換は、脂肪族アミノ酸間、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸間、酸性残基を有するアミノ酸間、アミド基を有するアミノ酸間、塩基性残基を有するアミノ酸間、又は芳香族残基を有するアミノ酸間である。置換を有するＭＥＳＴタンパク質又はフラグメント又は変異体は、ＭＥＳＴタンパク質又はフラグメント又は変異体について上で詳述されるように改変され得る。本発明の以下の説明において、ＭＥＳＴに関して示される全ての詳細は、別の記載がなければその機能的に活性な変異体にも関連する。
【００２７】
しかし、最も好ましくは、ＭＥＳＴタンパク質は天然に存在するＭＥＳＴタンパク質であり、なおより好ましくは天然に存在するヒトＭＥＳＴタンパク質（アイソフォーム１、２又は３）又は機能的に活性な変異体Ｔ５７９Ｂ（配列番号１のアミノ酸２〜３３５）又は機能的に活性な変異体Ｔ５８０Ｂ（配列番号１のアミノ酸１１〜３３５）である。アミ
ノ酸１〜１１を除外することができると証明されたという事実のため、以下の変異体のいずれも適切だろうと推測される：配列番号１のアミノ酸３〜３３５、配列番号１のアミノ酸４〜３３５、配列番号１のアミノ酸５〜３３５、配列番号１のアミノ酸６〜３３５、配列番号１のアミノ酸７〜３３５、配列番号１のアミノ酸８〜３３５、配列番号１のアミノ酸９〜３３５又は配列番号１のアミノ酸１０〜３３５。
【００２８】
第二の構成要素（構成要素ｉｉ）とも呼ばれる）として本試験系はアシル受容体を含む。アシル受容体はアシル基がアシル基転移の間に供与される化学化合物である。本発明において、アシル転移はＭＥＳＴにより媒介される。従って、ＭＥＳＴに受容されるいずれかの適切なアシル受容体が使用され得る。アシル受容体の例は典型的に、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール及び特にグリセロール−リン酸及びジヒドロキシアセトンリン酸のようなリン脂質を含む。好ましくは、アシル受容体はグリセロール−リン酸又はジヒドロキシアセトンリン酸、より好ましくはグリセロール３−リン酸である。
【００２９】
第三の構成要素（構成要素ｉｉｉ）とも呼ばれる）として、試験系はアシル供与体、すなわちアシル補酵素Ａ（ＣｏＡ）［ここでアシルは０、１、２又は３つの二重結合を有するＣ14〜Ｃ22アシルである］を含む。
【００３０】
アシルＣｏＡは脂肪酸の代謝に関与する補酵素である。これは生細胞内部で長鎖脂肪酸の末端に補酵素Ａ（ＣｏＡ）が結合するときに形成される一時的な化合物である。アシルＣｏＡは一般式
【化１】
［式中、ＣｏＡは補酵素Ａを表し、そしてＲは１４〜２２個のＣ原子を有する脂肪酸残基を表す］を有する。
【００３１】
補酵素Ａ（ＣｏＡ、ＣｏＡＳＨ、又はＨＳＣｏＡ）は、脂肪酸の合成及び酸化、並びにクエン酸回路におけるピルビン酸の酸化におけるその役割に注目すべき補酵素である。補酵素Ａは化学的にはチオールであるのでカルボン酸と反応してチオエステルを形成することができ、それ故アシル基キャリアとして機能する。それが脂肪酸の転移に役立つ。アシル基に結合していない場合は、通常「ＣｏＡＳＨ」又は「ＨＳＣｏＡ」と呼ばれる。
【００３２】
脂肪酸は、動物又は植物の脂肪、油脂、又はロウから誘導されるか、又はそれにエステル化形態で含有される、脂肪族モノカルボン酸類である。天然脂肪酸は一般的に４〜２８個の炭素を有し（通常は無分枝鎖で偶数）、飽和であっても不飽和であってもよい。
【００３３】
本発明によれば、脂肪酸は飽和（０の二重結合）及び不飽和（１、２又は３つの二重結合）であり得る。それらは長さも様々であり、１４〜２２個の炭素原子、特に１６〜２０個の炭素原子、例えば１６、１８又は２０個の炭素原子を有し得る。
【００３４】
１４〜２２個の炭素原子を有する飽和脂肪酸の例としては、
− ミリスチン酸（テトラデカン酸ＣＨ3（ＣＨ2）12ＣＯＯＨ）、
− ペンタデシル酸（ｐｅｎｔａｄｅｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ）（ペンタデカン酸ＣＨ3（ＣＨ2）13ＣＯＯＨ）、
− パルミチン酸（ヘキサデカン酸ＣＨ3（ＣＨ2）14ＣＯＯＨ）、
− マルガリン酸（ヘプタデカン酸ＣＨ3（ＣＨ2）15ＣＯＯＨ）、
− ステアリン酸（オクタデカン酸ＣＨ3（ＣＨ2）16ＣＯＯＨ）、
− ノナデシル酸（ｎｏｎａｄｅｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ）（ノナデカン酸ＣＨ3（ＣＨ2）17ＣＯＯＨ）、
− アラキジン酸（エイコサン酸ＣＨ3（ＣＨ2）18ＣＯＯＨ）、
− ヘネイコシル酸（ｈｅｎｅｉｃｏｓｙｌｉｃ ａｃｉｄ）（ヘンエイコサン酸ＣＨ3（ＣＨ2）19ＣＯＯＨ）、及び
− ベヘン酸（ドコサン酸ＣＨ3（ＣＨ2）20ＣＯＯＨ）
が挙げられる。
【００３５】
１４〜２２個の炭素原子を有する不飽和脂肪酸の例としては、
− ミリストレイン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）3ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＯＯＨ）、
− ミリストレイン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）3ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＯＯＨ）、
− パルミトレイン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）5ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＯＯＨ）、
− オクタデカ−６−エン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）10ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）4ＣＯＯＨ）、
− オレイン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＯＯＨ）、
− オクタデカ−９−エン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＯＯＨ）、
− オクタデカ−１１−エン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）5ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）9ＣＯＯＨ）、
− リノール酸（ＣＨ3（ＣＨ2）4ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＯＯＨ）、
− α−リノレン酸（ＣＨ3ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＯＯＨ）、
− オクタデカ−６，９，１２−トリエン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）4ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）4ＣＯＯＨ）、
− オクタデカ−８，１０，１２−トリエン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）4ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）6ＣＯＯＨ）、
− オクタデカ−９，１１，１３−トリエン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）３ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＯＯＨ）、
− エイコサ−９−エン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）9ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＯＯＨ）、
− エイコサ−１１−エン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）9ＣＯＯＨ）、
− ドコサ−１１−エン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）9ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）9ＣＯＯＨ）、及び
− エルカ酸（ＣＨ3（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）11ＣＯＯＨ）
が挙げられる。
【００３６】
第四の構成要素（構成要素ｉｖ）とも呼ばれる）として、本試験系はアシルＣｏＡからアシル受容体にアシル残基を転移させるＭＥＳＴの酵素活性を検出するための手段を含む。
【００３７】
ＭＥＳＴの活性の検出に適した手段は、本明細書の全体を通して詳述される。
【００３８】
構成要素ｉ）〜ｉｖ）に加えて、本発明の試験系は１つ又はそれ以上のさらなる構成要素を含み得る。試験設計及び検出方法に依存して、試験系はさらなる構成要素を含み得る。当業者は、試験系を研究設計に適合させることができ、すなわち適切な緩衝剤、補因子又は任意の他の必要な薬剤を選択することができる。場合により、第五の構成要素（（試験）薬剤とも呼ばれる）として、本試験系はアシル転移酵素の活性を変更すると疑われる薬剤を含む。
【００３９】
試験系は、一般的な条件下で適切な、細胞系であっても無細胞系であってもよい。
【００４０】
本発明の好ましい実施態様において、アシルＣｏＡはパルミトイルＣｏＡ又はオレオイル−ＣｏＡ、好ましくはパルミトイルＣｏＡである。
【００４１】
本発明の別の好ましい実施態様において、アシル受容体はグリセロール３−リン酸又はジヒドロキシアセトンリン酸、好ましくはグリセロール３−リン酸である。
【００４２】
従って、アシルＣｏＡとアシル受容体との以下の組み合わせが好ましい：
− アシルＣｏＡがパルミトイルＣｏＡであり、アシル受容体がグリセロール３−リン酸である。
− アシルＣｏＡがパルミトイルＣｏＡであり、アシル受容体がジヒドロキシアセトンリン酸である。
− アシルＣｏＡがオレオイル−ＣｏＡであり、アシル受容体がグリセロール３−リン酸である。
− アシルＣｏＡがオレオイル−ＣｏＡであり、アシル受容体がジヒドロキシアセトンリン酸である。
【００４３】
アシルＣｏＡがパルミトイルＣｏＡであり、アシル受容体がグリセロール３−リン酸である組み合わせが最も好ましい。
【００４４】
１つの好ましい実施態様において、検出可能なマーカーが、アシル残基をアシルＣｏＡからアシル受容体に転移させるＭＥＳＴの酵素活性を検出するために使用される。従って、アシル受容体及び／又はアシルＣｏＡは少なくとも１つの検出可能なマーカーで標識され得る。
【００４５】
マーカー（又は標識）は、別の物質又は物質の複合体の存在を示すことができるいずれかの種類の物質である。マーカーは検出しようとする物質に連結されているか導入されている物質であり得る。検出可能なマーカーは、例えばタンパク質、酵素反応の生成物、第二のメッセンジャー、ＤＮＡなどを検出するために分子生物学及びバイオテクノロジーにおいて使用される。
【００４６】
本発明の好ましい実施態様において、マーカーは放射標識、具体的には3Ｈ、32Ｐ、35Ｓ又は14Ｃ、特に3Ｈである。マーカーは、アシルＣｏＡからアシル受容体に転移させようとするアシル基に結合され得る。転移が起こった後に、標識されたアシルＣｏＡ及び標識されたアシル受容体は、それらの異なる物理的又は化学的特性に基づいて分離され得、そして放射能の量はＭＥＳＴ活性を決定するために定量される。あるいは、アシル受容体を標識してもよい。アシルの転移が起こった後、標識された非アシル化アシル受容体と標識されたアシル化アシル受容体は、それらの異なる物理的又は化学的特性に基づいて分離され得、そして放射能の量を、ＭＥＳＴ活性を決定するために定量する。
【００４７】
本発明のより好ましい実施態様において、パルミトイルＣｏＡは、放射標識されたアシル受容体、特に放射標識されたグリセロール３−リン酸に転移させるために使用される。好ましい標識は3Ｈである。
【００４８】
本発明の別の好ましい実施態様において、マーカーは１つ又はそれ以上の蛍光マーカーである。適切な蛍光マーカーは本発明の方法の文脈において記載される。一般に、放射標識に関して上で示される詳細は、概してマーカーにも適用可能であり、従って蛍光マーカーにも適用可能であり、ここで放射標識が（蛍光）マーカーで置き換えられる。
【００４９】
あるいは、２つの物質又は部分が近接していることを検出するために２つのマーカーが使用され得る。これらのマーカーは、例えば１つの蛍光マーカー及び１つのシンチレータ（例えばシンチレーション近接アッセイのため）であり得、又は２つの蛍光マーカーが（例えばＦＲＥＴのために）使用され得る。一実施例において、アシル基及びアシル受容体
を第一及び第二のマーカーで標識することができた。アシル基がアシルＣｏＡからアシル受容体に転移され、従って標識が近接している場合、エネルギーは第一の標識から第二の標識に転移し、それ故アシル基の転移を検出することができた。適切なマーカーの組み合わせの例としては、
− 例えばマイクロパーティクルに分けられた、ケイ酸イットリウム若しくはポリビニル−トルエンのようなシンチレーターと組み合わされた放射標識3Ｈ、33Ｐ、35Ｓ又は14Ｃ、125Ｉ又は
− ＬＣ−Ｒｅｄ ６１０、ＬＣ−Ｒｅｄ ６４０、ＬＣ−Ｒｅｄ ６７０、ＬＣ−Ｒｅｄ ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンｘイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミン五酢酸又は他のランタニドイオン（ユーロピウム又はテルビウム）のキレートのような受容体蛍光マーカーと組み合わされた、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ−フィコエリトリン、９−アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４−アセトアミド−４'−イソチオシアナトスチルベン−２，２'−ジスルホン酸、７−ジエチルアミノ−３−（４'−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン、スクシンイミジル１−ピレンブチラート、及び４−アセトアミド−４'−イソチオシアナトスチルベン−２，２'−ジスルホン酸誘導体のような供与体蛍光マーカー
が挙げられる。
【００５０】
上記の本発明の試験系は、ＭＥＳＴリガンドをスクリーニングするための方法において使用され得る。
【００５１】
従って、本発明の別の局面は、ＭＥＳＴのリガンドをスクリーニングするための方法に関し、該方法は：
ａ） 上記の本発明の試験系を、アシル受容体へのアシル転移をもたらす条件下で薬剤と接触させる工程、
ｂ） ＭＥＳＴのアシル転移活性を決定する工程、及び
ｃ） コントロールと比較して変更されたＭＥＳＴのアシル転移活性を検出し、それにより物質をＭＥＳＴのリガンドと同定する工程
を含む。
【００５２】
本発明の方法の特徴の定義のために、本発明の試験系の文脈において上で詳述された定義及び実施態様も参照される。
【００５３】
本発明の方法のために、ＭＥＳＴ又はその機能的に活性な変異体を含む試験系を薬剤と接触させる。本発明の試験系で試験される薬剤は、任意の化学的性質の任意の試験物質又は試験化合物であり得る。それは疾患のための薬物又は医薬として既に公知であってもよい。あるいは、それは別の実施態様において治療効果を有することがまだ知られていない公知の化学化合物であってもよく、その化合物は新規であってもそれまで未知の化学化合物であってもよい。薬剤は試験物質又は試験化合物の混合物であってもよい。
【００５４】
本発明のスクリーニング方法の実施態様において、試験物質は化学化合物ライブラリの形態で提供される。化学化合物ライブラリは、多数の化学化合物を含み、そして化学的に合成された分子若しくは天然産物を含む多数の供給源のいずれかから構築されたものであるか、又はコンビナトリアルケミストリー技術により生成されたものである。それらはハイスループットスクリーニングに特に適しており、特定の構造の化学化合物若しくは特定の生物（例えば植物）の化合物で構成され得る。本発明の文脈において、化学化合物ライブラリは、好ましくはタンパク質及びポリペプチド又は有機小分子を含むライブラリである。好ましくは、有機小分子は５００ダルトン未満の大きさであり、特に可溶性でオリゴ
マーでない有機化合物である。
【００５５】
本発明の文脈において、ＭＥＳＴ活性を調節してそれを検出するために適した条件下で一定時間、試験系を薬剤と接触させる。適切な条件としては、例えば含まれるタンパク質の変性を防ぐため、又は存在する場合は生存細胞を維持するために適切な温度及び溶液が挙げられる。適切な条件は、選択された特定の試験系に依存し、そして当業者はその一般的知識に基づいてそれを選択することができるだろう。インキュベーション工程は、約５秒から数時間まで、好ましくは約５分から約２４時間で変動し得る。しかし、インキュベーション時間は、アッセイ形式、マーカー、溶液の体積、濃度などに依存するだろう。通常は、アッセイは周囲温度で行われるが、１０℃〜４０℃のような温度範囲にわたって行うことができる。
【００５６】
試験系を薬剤と接触させた後、試験系に対する薬剤の効果が検出される。以下において、一連の異なる検出系がより詳細に記載される。しかし、当然のことながら、これらは例示であり、他の試験系及び方法も適切であり得る。
【００５７】
薬剤が試験系に特異的で有意な効果を有する場合、その薬剤をＭＥＳＴの調節因子と同定する。本発明の文脈におけるＭＥＳＴの調節因子、特にリガンドは、ＭＥＳＴの活性を変化させる（増加又は減少のいずれでも）薬剤を意味する。好ましくは、ＭＥＳＴ活性は減少される。本発明の文脈において、コントロールと比較して、調節因子と接触されたＭＥＳＴ活性がコントロール（すなわち調節因子／リガンドと接触していないＭＥＳＴ）よりも有意に低い又は高い場合、ＭＥＳＴ活性は調節される、すなわち増加するか又は好ましくは減少する。当業者には、２つの値が互いに有意に異なるか否かを評価する統計学的手順、例えばスチューデントｔ検定又はカイ二乗検定が公知である。さらに、当業者は適切なコントロールを選択する方法を知っている。
【００５８】
コントロールは、意図されない影響（例えばバックグラウンドシグナル）を排除又は最少にすることができるので、試験方法の一部である。対照実験は、特定の系に対する変数の効果を調べるために使用される。対照実験において、一組のサンプルは改変されており（又は改変されたと考えられ）、そして他の組のサンプルは変化を示さないと期待される（ネガティブコントロール）か、又は明確な変化を示すと期待される（ポジティブコントロール）。
【００５９】
好ましい実施態様において、ＭＥＳＴ活性はコントロールの少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、なおより好ましくは少なくとも７５％、そして最も好ましくは少なくとも９０％だけ減少する。
【００６０】
特にハイスループットスクリーニングについて、可能な限り少ない構成要素を含む、非常に容易で着実な検出系を使用することが好ましいかもしれない。本発明の一実施態様において、試験系は構成要素ｉ）〜ｉｖ）及び場合によりＭＥＳＴ活性の潜在的調節因子のみを含み得る。
【００６１】
試験系の構成要素、特に転移させようとするアシル基は、十分な検出又は精製を可能にするための種々の方法で標識され得る。一般的な標識方法が、構成要素の１つ又はそれ以上の官能基を標識するために使用され得る。タンパク質については、これらは例えば、各ポリペプチド鎖のＮ末端及びリジン残基の側鎖に存在する第一級アミノ基；ジスルフィド結合を還元剤で処理することにより、若しくはリジン残基をＳＡＴＡのような試薬で修飾することにより利用可能になったシステイン残基上に存在するスルフヒドリル基；又は通常は抗体のＦｃ領域に存在し、酸化されてカップリングに対して活性なアルデヒド基を生じ得る炭水化物基であり得る。構成要素又はタンパク質は、一連の様々な薬剤、例えばビ
オチン（アビジン−ビオチン化学のため）、酵素、アミン、スルフヒドリル又は他の官能基を標識するための活性化蛍光色素、例えばＦＩＴＣ、フルオレセイン、ローダミン、Ｃｙ色素又はＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｓで標識され得る。放射性標識、例えば3Ｈ、32Ｐ、35Ｓ、125Ｉ又は14Ｃ、さらには一般的な酵素標識、例えばペニシリナーゼ、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼも使用され得る。
【００６２】
本発明の方法に適したいずれかの検出方法が使用され得る。適切な方法は試験系及び試験しようとする薬剤の特徴に依存して選択され得る。
【００６３】
例えば、ＭＥＳＴと薬剤との相互作用が測定され得る。試験系が使用され得、それに対して試験系が適合され得る一連の試験は当該分野で公知である。これは不均一系アッセイでも均一系アッセイでもよい。本明細書で使用される不均一系アッセイは、１つ又はそれ以上の洗浄工程を含むアッセイであるが、均一系アッセイではこのような洗浄工程の必要はない。試薬及び化合物は単に混合されて測定されるのみである。
【００６４】
試験方法は連続的アッセイでも非連続的なアッセイでもよい。
【００６５】
連続的アッセイは最も都合が良く、単一のアッセイはさらなる処理を必要としない反応率をもたらす。多くの異なる型の連続的アッセイが存在する。分光測光アッセイにおいて、反応過程に続いて吸光度の変化が測定される。蛍光は分子が１つの波長の光を異なる波長の光を吸収した後に発する場合である。蛍光測定アッセイは、酵素反応を測定するための生成物と基質の蛍光の差異を利用する。これらのアッセイは一般的に分光測光アッセイよりかなり感受性であるが、不純物により生じる干渉及び露光した場合の多くの蛍光化合物の不安定性に悩まされる。熱量測定は、化学反応により放出又は吸収された熱の測定である。多くの反応はいくらかの熱の変化を含み、そしてマイクロ熱量計を使用すればそれほど多くの酵素又は基質を必要としないので、これらのアッセイは非常に一般的である。これらのアッセイは、いずれかの他の方法で測定することが不可能な反応を測定するために使用することができる。化学発光は、化学反応による光の放射である。いくつかの酵素反応は光を生じ、そしてこれを測定して生成物形成を検出することができる。生じた光は写真用フィルムで数日又は数週間にわたって捕捉することができるのでこれらの型のアッセイは非常に敏感であり得るが、反応により放出された全ての光が検出されるわけではないので定量が困難であり得る。
【００６６】
静的光散乱は、溶液中の高分子の重量平均モル質量及び濃度の積を測定する。測定時間にわたって１つ又はそれ以上の化学種の固定された総濃度と仮定して、散乱シグナルは、溶液の重量平均モル質量の直接的尺度であり、これは複合体が形成するか解離するかによって変動する。それ故、この測定は複合体の化学量論、さらには動力学を定量する。タンパク質動力学の光散乱アッセイは、酵素を必要としない非常に一般的な技術である。
【００６７】
非連続的アッセイは、間隔を置いて酵素反応からサンプルを採取する場合であり、生成物産生又は基質消費の量がこれらのサンプルにおいて測定される。放射測定アッセイは、基質への放射能取り込み又は基質からのその放出を測定する。これらのアッセイにおいて最も頻繁に使用される放射性同位体は、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ及び125Ｉである。放射性同位体は基質の単一原子の特異的標識を可能にすることができるので、これらのアッセイは非常に敏感でかつ特異的である。これらは生化学において頻繁に使用され、そしてしばしば、粗製抽出物（細胞をすすいだ場合に生じる酵素の複雑な混合物）において特定の反応を測定する唯一の方法である。クロマトグラフィーアッセイは、クロマトグラフィーにより反応混合物をその構成要素に分離することにより生成物形成を測定する。これは通常高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行われるが、薄層クロマトグラフィーというより単純な技術も使用することができる。このアプローチは大量の材料を必要とし得るが、その感度は、基質／生成物を放射性タグ又は蛍光タグで標識することにより増加され得る。
【００６８】
一実施態様において、アッセイはＳＰＡ（シンチレーション近接アッセイ）、ＦＲＥＴ
（蛍光共鳴エネルギー移動）アッセイ、ＴＲ−ＦＲＥＴ（時間分解蛍光共鳴エネルギー移動）アッセイ又はＦＰ（蛍光偏光）アッセイである。
【００６９】
ＳＰＡ（シンチレーション近接アッセイ）は、生化学スクリーニングに使用される技術の型であり、均一系における広範囲のプロセスの迅速で感受性の高い測定を可能にする。ＳＰＡに含まれるビーズの種類は、微視的サイズであり、ビーズ自体の中に刺激された場合に光を放出するシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）が存在する。刺激は放射標識分子がビーズと相互作用するときに起こる。この相互作用はビーズの光放射を誘発し、これがシンチレーションカウンタを使用して検出され得る。
【００７０】
より詳細には、放射標識分子がビーズに結合するか近接する場合に光の放射が刺激される。しかし、ビーズが放射標識分子と未結合のままである場合、ビーズは光を放射するように刺激されない。これは、ＳＰＡビーズから遠く離れすぎている場合、未結合の放射能から放出されるエネルギーが希釈され過ぎているため、ビーズはシグナルを生じるように刺激されない。
【００７１】
トリチウムはＳＰＡに非常によく適しているため大いに推奨される。これは非常に短い１．５μｍの水中経路長に起因する。従ってβ粒子がシンチラントビーズから１．５μｍという特定の範囲内似ある場合、シンチラントビーズが光を放射するように刺激するために十分なエネルギーが存在する。その距離が１．５μｍより長い場合、β粒子は不十分なエネルギーのためビーズを刺激するために必要な距離を移動することができない。この方法が広範囲の適用に適用されることを可能にする、利用可能なビーズコーティングの取り合わせ、例えば酵素アッセイ及びラジオイムノアッセイがある。
【００７２】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、二つの発色団間での無放射エネルギー移動を表す。その励起状態にある供与体発色団は、無放射長距離双極子−双極子カップリング機構により、近接している（典型的には＜１０ｎｍ）受容体フルオロフォアにエネルギーを移動させることができる。両方の分子が蛍光性であるので、エネルギー移動はしばしば「蛍光共鳴エネルギー移動」と呼ばれるが、エネルギーは実際には蛍光により移動されるのではない。ＦＲＥＴはタンパク質−薬剤相互作用、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−ＤＮＡ相互作用、及びタンパク質コンホメーション変化を検出及び定量するために有用なツールである。タンパク質の薬剤への結合、タンパク質の別のタンパク質への結合又はタンパク質のＤＮＡへの結合をモニタリングするために、分子の一方を供与体で標識し、そして他方を受容体で標識し、そしてこれらのフルオロフォア標識分子を混合する。それらが未結合状態で存在する場合、供与体を励起すると供与体発光が検出される。分子が結合すると、供与体及び受容体は近接し、そして供与体から受容体への分子間ＦＲＥＴのために受容体発光が主に観察される。ＦＲＥＴに適した隣接物（ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ）は当該分野で公知であり、当業者は両方の抗体に適した標識の組み合わせを選択することができるだろう。供与体及び対応する受容体に関して本明細書で使用される「対応する」は、供与体の励起スペクトルとオーバーラップする発光スペクトルを有する受容体蛍光部分を指す。しかし、両方のシグナルは互いに分離可能であるべきである。従って、受容体の発光スペクトルの極大波長は、好ましくは供与体の励起スペクトルの極大波長より少なくとも３０ｎｍ、より好ましくは少なくとも５０ｎｍ、例えば少なくとも８０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ又は少なくとも１５０ｎｍ大きいものであるべきである。
【００７３】
ＦＲＥＴ技術において種々の受容体蛍光部分と共に使用することができる代表的な供与
体蛍光部分としては、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ−フィコエリトリン、９−アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４−アセトアミド−４'−イソチオシアナトスチルベン−２，２'−ジスルホン酸、７−ジエチルアミノ−３−（４'−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン、スクシンイミジル１−ピレンブチラート、及び４−アセトアミド−４'−イソチオシアナトスチルベン−２，２'−ジスルホン酸誘導体が挙げられる。代表的な受容体蛍光部分としては、使用される供与体蛍光部分によるが、ＬＣ−Ｒｅｄ ６１０、ＬＣ−Ｒｅｄ ６４０、ＬＣ−Ｒｅｄ ６７０、ＬＣ−Ｒｅｄ ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンｘイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミン五酢酸又は他のランタニドイオン（ユーロピウム又はテルビウム）のキレートが挙げられる。供与体及び受容体蛍光部分は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｊｕｎｃｔｉｏｎ Ｃｉｔｙ，ＯＲ）又はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手することができる。
【００７４】
あるいは、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）を本発明の試験系に使用してもよい。ＴＲ−ＦＲＥＴはＴＲＦ（時間分解蛍光）とＦＲＥＴ原理とを兼ね備える。この組み合わせは、ＴＲＦの低いバックグラウンドの利点とＦＲＥＴの均一系アッセイ形式とを組み合わせている。ＦＲＥＴは既に上で記載してきたが、ＴＲＦはランタニド又は長い半減期を有する他の供与体の独特の特性を利用する。ＴＲ−ＦＲＥＴに適した供与体としては、とりわけ、ランタニドキレート（クリプテート）及びいくつかの他の金属リガンド錯体が挙げられ、これらはマイクロ秒〜ミリ秒の時間範囲の蛍光半減期を有し得、従って、マイクロ秒〜ミリ秒の計測でエネルギー移動が起こることも可能にする。蛍光ランタニドキレートは、７０年代後半からエネルギー供与体として使用されてきた。一般的に使用されるランタニドとしては、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）及びジスプロシウム（Ｄｙ）が挙げられる。それらの特異的な光物理的及びスペクトル特性のために、ランタニド錯体は、生物学における蛍光適用に関して多くの興味が持たれている。具体的には、それらはより伝統的なフルオロフォアと比較した場合に、大きなストロークスシフト（ｓｔｒｏｋｅ’ｓ ｓｈｉｆｔ）及び非常長い発光半減期（マイクロ秒からミリ秒）を有する。
【００７５】
通常は、有機発色団は受容体として使用される。これらとしてはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）が挙げられる。ＴＲ−ＦＲＥＴ、さらには受容体に関する適切な詳細はＷＯ９８／１５８３０に記載される。
【００７６】
蛍光偏光（ＦＰ）ベースのアッセイは、溶液中の蛍光基質を励起するために偏光を使用するアッセイである。これらの蛍光基質は溶液中で自由で回転しており、放射光は偏光解消される。基質がより大きな分子、すなわちアシル基に結合した場合、その回転速度は大いに減少し、そして放射光は高度に偏光されたままである。
【００７７】
あるいは、質量分析を使用してもよい。用語「質量分析」は、表面上のサンプルから気相イオンを生成するためにイオン化源を使用し、その気相イオンを質量分析計で検出することを指す。用語「レーザー脱離質量分析」は、表面上のサンプルから気相イオンを生成するためのイオン化源としてレーザーを使用し、そしてその気相イオンを質量分析計で検出することを指す。アシル化されたアシル受容体のような生体分子の質量分析の好ましい方法は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析すなわちＭＡＬＤＩである。ＭＡＬＤＩにおいて、検体は典型的にマトリックス物質と混合され、そのマトリックス物質は乾燥させると検体と共に共結晶化する。マトリックス物質はエネルギー源からエネルギーを吸収し、これが別に不安定な生体分子又は検体を断片化する。別の好ましい方法は、表面増強レーザー脱離／イオン化質量分析、すなわちＳＥＬＤＩである。ＳＥＬＤＩに
おいて、検体が付着された表面は、検体捕捉及び／又は脱離において能動的役割を果たす。本発明の文脈において、サンプルは、クロマトグラフィー又は他の化学的処理を受けていてもよい生物学的サンプル及び適切なマトリックス物質を含む。
【００７８】
質量分析において、「見掛けの分子質量」は、検出されたイオンの分子質量（ダルトン）−対−電荷値（ｍ／ｚ）を指す。見掛けの分子質量がどのように誘導されるかは、使用される質量分析計の型に依存する。飛行時間型質量分析計では、見掛けの分子質量は、イオン化から検出までの時間の関数である。用語「シグナル」は、研究中の生体分子により生じるいずれかの応答を指す。例えば、用語シグナルは、質量分析計の検出器に衝突する生体分子により生じた応答を指す。シグナル強度は生体分子の量又は濃度と相関する。シグナルは２つの値により定義される：記載されるように生成される見掛けの分子質量値及び強度値。質量値は、その生体分子の基本的特徴であるが、強度値は対応する見掛けの分子質量値を有する生体分子の一定の量又は濃度に一致する。従って、「シグナル」は生体分子の特性を常に示す。
【００７９】
本発明の好ましい実施態様において、出発物質のアシル受容体及びアシルＣｏＡのうち少なくとも１つは少なくとも１つの検出可能なマーカーで標識され、そしてここで工程ａ）の後でかつ工程ｂ）の前に、標識された出発物質が標識された生成物アシル化アシル受容体から分離される。この分離は、遠心分離、固定化及び液体の除去などのような一般的な分離工程により行われ得る。あるいは、例えば実施例に記載されるような異なる溶媒及び相分離を使用してこれを行ってもよい。好ましい実施態様において、分離は有機相及び水相の使用によるものであり、ここでアシル化アシル受容体は有機相に蓄積し、そして非アシル化アシル受容体は水相に蓄積する。
【００８０】
本発明の方法の別の好ましい実施態様において、ＭＥＳＴの活性は放射能の検出により決定される。適切なマーカー及び方法は本明細書において詳述される。
【００８１】
本発明の方法の好ましい実施態様において、ＭＥＳＴの活性は蛍光を検出することにより決定される。適切なマーカー及び方法は本明細書において詳述される。
【００８２】
本発明の好ましい実施態様において、ＭＥＳＴのアシル転移活性は、アシルグリセロール３−リン酸、特に標識されたアシルグリセロール３−リン酸の量を決定することによる。
【００８３】
試験は不均一系アッセイでも均一系アッセイでもよい。好ましくは、本方法は均一系アッセイである。本明細書で使用される不均一系アッセイは、１つ又はそれ以上の洗浄工程を含むアッセイであり、一方、均一系アッセイでは、このような洗浄工程の必要はない。試薬及び化合物は混合されそして測定されるのみである。
【００８４】
本発明の好ましい実施態様において、ＭＥＳＴのアシル転移活性は、コントロールと比較して減少され、それによりその物質をＭＥＳＴ阻害剤として同定する。
【００８５】
しかし、本発明のさらにより好ましい実施態様において、この方法は、本質的に実施例において詳述されるように行われる。
【００８６】
この方法は、アシル供与体としてアシルＣｏＡを用いる、放射標識されたアシル受容体（例えば放射標識されたグリセロール３−リン酸、特に［3Ｈ］グリセロール３−リン酸）へのアシルのＭＥＳＴ媒介取り込みに基づく。ＭＥＳＴを反応させた後、標識生成物（すなわちアシル化標識アシル受容体）を、有機溶媒を加えることにより未反応の標識アシル受容体から分離する。相分離により、疎水性物質と両親媒性物質は有機溶媒中に蓄積し
、一方で親水性物質は水相に留まる。上で詳述した方法によれば、アシル化標識アシル受容体は有機相に蓄積し、そして未反応の標識アシル受容体はＭＥＳＴの反応が行われた水相に蓄積する。有機溶媒は、シンチレーションカウンタで生成物の量を検出することを可能にするシンチレータを含んでいてもよい。非常に好ましい実施態様において、ＭＥＳＴ活性は、パルミトイルＣｏＡアシル供与体及びアシル受容体としてグリセロール３−リン酸を使用することにより決定され、ここでパルミテートはＭＥＳＴの存在下でアシル供与体からアシル受容体に転移され、ここでグリセロール３−リン酸は標識されており、特に3Ｈで標識される。記載されるアッセイは均一系アッセイであり、容易でかつ迅速なやり方で行うことができ、そしてハイスループットスクリーニングを可能にする。これはグリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼＧＰＡＴ１−４の活性を決定するために使用される公知の方法（Ｈａｌｄａｒ ａｎｄ Ｖａｎｃｕｒａ，１９９２；Ｙｅｔ ｅｔ
ａｌ．，１９９５，Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，２０００、及びＷｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００８）に基づく。
【００８７】
好ましくは、この方法はハイスループットスクリーニングに適合される。この方法において、多数の化合物が無細胞アッセイ又は全細胞アッセイのいずれでも薬剤に対してスクリーニングされる。典型的には、これらのスクリーニングは自動化ロボットステーションベースの技術を使用して９６ウェルプレートで、又は高密度アレイ（「チップ」）形式で行われる。
【００８８】
本発明の試験系は、細胞、特に哺乳動物細胞、特にヒト細胞又は昆虫細胞を含み得る。適切な細胞の例としては、Ｓｆ９細胞（実施例を参照のこと）が挙げられる。細胞は例えば初代細胞でも細胞株でもよい。しかし場合により、ＭＥＳＴ（実施例を参照のこと）又は効果の検出のために必要とされる構成要素を含むように遺伝子改変されたいずれか他の細胞又は細胞株が使用され得る。好ましい実施態様において、（粗製、分画された又は精製された）細胞膜が使用され得る。インタクトな細胞から細胞膜を生成するための例となる方法は実施例に詳述される。
【００８９】
本発明の好ましい方法において、効果は蛍光により決定される。適切な方法は上で詳述されており、そして本明細書において詳述されるように、蛍光マーカー、ＦＲＥＴ、蛍光偏光を含み得る。
【００９０】
本発明の別の好ましい実施態様において、本方法は、ＭＥＳＴ機能不全を含む疾患の予防及び／又は処置のための薬剤をスクリーニングするために使用される。特に本方法は、肥満及び／又は糖尿病、例えばＩＩ型糖尿病を予防及び／又は処置するための薬剤をスクリーニングするために使用される。
【００９１】
本発明によれば、用語「疾患の予防」は、一般的な疾患を発症する危険性を減少させることに関するが、一方、用語「疾患の処置」は、支配的な疾患状態の症状の寛解、疾患の経過の減速などに関する。予防又は予防措置は、最初の段階で傷害、病的状態又は疾患を回避するやり方である。処置又は治癒は、医学的問題が既に開始した後で適用される。処置は健康問題を処置し、そしてその治癒をもたらし得るが、処置はより頻繁には処置が続く間のみ問題を寛解させる。治癒は、病気を完全逆行させるか医学的問題を永久に終わらせる処置の一部である。
【００９２】
本発明のさらなる局面は、ＭＥＳＴリガンド、特にＭＥＳＴ阻害剤の同定のための本発明の試験系の使用に関する。
【００９３】
リガンドは、生体分子（本明細書ではＭＥＳＴ）に結合して複合体を形成することができる物質である。それはイオン性結合、水素結合、疎水性相互作用及びファン・デル・ワ
ールス力のような分子間力によってＭＥＳＴ上の部位に結合する分子である。ドッキング（会合）は通常可逆性である（解離）。実際に、リガンドとその標的分子との間の不可逆的な共有結合は生物系では稀である。ＭＥＳＴのような酵素に結合するリガンドは、その酵素の酵素活性を変更し得る。リガンドには阻害剤及び活性化因子が含まれる。
【００９４】
酵素阻害剤は、酵素に結合してそれらの活性を減少させる分子である。酵素の活性をブロックすることは代謝の不均衡を正し得るので、多くの薬物は酵素阻害剤である。酵素に結合する全ての分子が阻害剤であるわけではなく；酵素活性化因子は酵素に結合してそれらの酵素活性を増加させる。
【００９５】
阻害剤の結合は、基質が酵素の活性部位に入ることを阻止し得、かつ／又は酵素がその反応を触媒することを妨げる。阻害剤の結合は、可逆的又は不可逆的のいずれかである。不可逆的阻害剤は、通常は酵素と反応してそれを化学的に変化させる。これらの阻害剤は酵素活性に必要な鍵となるアミノ酸残基を改変する。対照的に、可逆的阻害剤は、非共有結合で結合し、これらの阻害剤が酵素、酵素−基質複合体、又は両方のいずれに結合するかによって様々な種類の阻害がもたらされる。
【００９６】
選択的リガンドは、非常に限られた型の標的（例えば酵素）に結合する傾向があるが、非選択的リガンドはいくつかの型の標的に結合する。非選択的である薬物は、所望の効果を生じる物に加えていくつかの他の標的（例えば酵素）に結合するため、それらがより有害な影響を有する傾向がある場合、これは薬理学において重要な役割を果たす。
【００９７】
本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬は変化してもよいので、本発明はこれらに限定されない。さらに、本明細書において使用される用語は、特定の実施態様を記載するのみの目的のためであり、本発明の範囲を限定することを意図されない。本明細書及び添付の特許請求において使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別の指示を示していなければ、複数形への言及を含む。同様に、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」及び「包含する（ｅｎｃｏｍｐａｓｓ）」は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきである。
【００９８】
別の定義がなければ、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語並びにいずれの頭字語も、本発明の分野における当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似するか又は等しいいずれの方法及び材料も本発明の実施において使用され得るが、好ましい方法及び材料は本明細書に記載される。
【００９９】
本発明は以下の実施例によりさらに説明されるが、当然のことながら、実施例は単に説明の目的のためのみに含まれるのであり、他に具体的に示されていなければ、本発明の範囲を限定することを意図されない。
【実施例】
【０１００】
方法
グリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼを測定するためのアッセイは、以下の方式に基づく：
グリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性を、アシル供与体としてのパルミトイルＣｏＡ及びアシル受容体としての放射標識［3Ｈ］グリセロール３−リン酸を用いてパルミテートの取り込みとして決定し、放射標識パルミトイルグリセロール３−リン酸を得た。放射性標識生成物パルミトイルグリセロール３−リン酸を、適切なカウンターで放射能を測定するために、有機溶媒に基づいてシンチレーターを加えることにより放射標識基質と分離した。相を分離した後、シンチレーターで飽和している、有機溶媒相中の放射標識のみ（すなわち、疎水性及び両親媒性物質）を放射標識パルミトイルグリセロー
ル３−リン酸として検出した。アシル化されなかった親水性放射標識グリセロールリン酸は水相に留まっており、従ってシンチレーションカウンターで計数されない。水相から有機相への少量の「交差照射（ｃｒｏｓｓ−ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ）」を、コントロールの空試験値（ＭＥＳＴタンパク質を除いて全ての反応構成要素を含有する）を差し引くことにより全てのＭＥＳＴ反応について補正した。
【０１０１】
以下の溶液をアッセイに使用した：
Ａ） 反応溶液：
９５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ＝７．４（ＭＥＲＣＫ、＃１．０８３８２．２５００）、
５ｍＭ ＭｇＣｌ2（ＳＩＧＭＡ、＃１０４−２０）
２．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ、＃Ａ３８０３）
１２５μＭパルミトイルＣｏＡ（ＳＩＧＭＡ、＃Ｐ９７１６）
１８７．５μＭグリセロール３−リン酸（ＳＩＧＭＡ、＃Ｇ７８８６）
１５０ｎＣｉ／ウェル 3Ｈグリセロール３−リン酸（ＡＲＣ、＃ＡＲＴ０２１９）
Ｂ） 均質化緩衝液：
ＴＥＳ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ＝７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２５０ｍＭスクロース）
＋１０μｇ／ｍＬ ロイペプチン（ＢＩＯＭＯＬ、＃１２１３６）
＋１０μｇ／ｍＬ アプロチニン（Ａｐｒｏｔｉｎｉｎｅ）（ＵＳＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、＃１１３８８）
＋１０μｇ／ｍＬ ペプスタチンＡ（ＢＩＯＭＯＬ、＃１７６４０）
＋１００ｍＭ ペファブロック（ＭＥＲＣＫ、＃１．２４８３９．０５００）
Ｃ） 酵素溶液：
所望の濃度（ＢｉｏＲａｄアッセイによるタンパク質含有量の決定）に調整した均質化緩衝液中のヒト組み換えＭＥＳＴタンパク質（以下のとおり）を発現する昆虫細胞の膜
形式：
９６ウェルプレート（ｗａｌｌａｃ ｉｓｏｐｌａｔｅ ＃６００５０４０）
アッセイ設計
１０μｌ酵素溶液を５０μｌ反応溶液と共に２５℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションをＥｐｐｅｎｄｏｒｆサーモミキサーコンフォートでゆっくりと回転させながら（４５０ｍｉｎ−1）行い、ここでプレートの開口部を保護フィルム（Ｗｈａｔｍａｎ Ｕｎｉ Ｓｅａｌ ７７０４−０００９）で密封した。反応を５μｌ ２００ｍＭグリセロール３−リン酸及び２００μｌシンチレーション液（ｂｅｔａ−ｐｌａｔｅ、＃１２０５−４４０、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を加えることにより停止させ、そして上記のように回転下で２５℃にて１５分間インキュベートした。相分離のために回転せず２５℃での少なくとも１２時間のインキュベーションの後、放射能（ｄｐｍ）をシンチレーションカウンタ（Ｗａｌｌａｃ １４５０ ｍｉｃｒｏ ｂｅｔａ）で測定した。
【０１０２】
酵素溶液（Ｓｆ９昆虫細胞の全ての膜）を以下のように製造した：
Ｓｆ９昆虫細胞を遠心分離によりペレット化して、アリコートで（約７〜９ｇ）凍結させた。必要な場合に、ペレット化Ｓｆ９昆虫細胞を素早く３７℃の水浴で解凍してさらなる処理まで氷上で維持した。その後、それらを１０ｍｌ均質化緩衝液及びさらに懸濁液の製造のため０．５ｍＭ ＤＴＴを入れた５０ｍｌガラスホモジナイザーで均質化した。細胞をテフロン（登録商標）−ガラス（ｔｅｆｌｏｎ−ｉｎ−ｇｌａｓｓ）ホモジナイザー（１０ｘ１５００／分、４℃）で均質化した。ホモジネートをＪＡ２５．５遠心分離チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ ＃３６３６４７）に移し、ＤＴＴを加えた１０ｍｌ均質化緩衝液で希釈し、そして遠心分離（５００ｇ、５分ｍ４℃、冷却遠心機 Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｖａｎｔｉ ＪＡ２５ｌ）ペレット化した。上清を超遠心分離チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ ＃３５５６１８）中に移し、そして遠心分離した（１０００００ｇ、６０分、４℃、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａ ＬＥ−８０Ｋ）。上清を完全に除去した。ペレットを２回注意深く均質化緩衝液で洗浄し、次いで均質化緩衝液に再懸濁させた。酵素溶液をアリコートに分けて液体窒素中で凍結させ、−８０℃で貯蔵した。
【０１０３】
ＭＥＳＴコード導入ベクターの構築を以下のように行った：
ＭＥＳＴタンパク質をコードするｍＲＮＡ（Ｔ５７９Ｂ＝アミノ酸２〜３３５及びＴ５８０Ｂ＝アミノ酸１１〜３３５）（２つの異なる開始コドン、Ｓａｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｋａｎｅｋｏ−Ｉｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５を参照のこと）を、視床下部ｃＤＮＡをテンプレートとして使用してＰＣＲによりクローン化した。ＰＣＲプライマーの一方（５’−ＧＡＧＡＧ ＡＡＴＴＣ ＧＡＴＧＧ ＴＧＣＧＣ ＣＧＡＧＡ ＴＣＧＣＴ Ｔ−３' 配列番号２）はインフレームのＡＴＧ−開始コドンを有するＥｃｏＲＩ制限部位をＭＥＳＴ−ｃＤＮＡの５’末端に含む。第二のＰＣＲプライマー（５’−ＧＡＧＡＧ ＣＧＧＣＣ ＧＣＴＣＡ ＧＡＡＧＧ ＡＧＴＴＧ ＡＴＧＡＡ ＧＣ−３'，配列番号３）は、ＴＧＡ終止コドン及びＮｏｔ１制限部位を３’末端に含む。増幅されたＤＮＡを、昆虫細胞発現ベクターｐＶＬ１３９２（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限部位中に（ｉｎｔｉ）クローン化した。クローン化した遺伝子のアイデンティティを直接ＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１０４】
Ｓｆ９昆虫細胞を以下のように製造及び増殖した：
Ｓｆ９細胞培養、サブクローニング、感染などを含む全ての方法は、文献から公知の方法にしたがって行われた（例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓ及びＳｍｉｔｚ，１９８７を参照のこと）。典型的には、３ｘ１０6 Ｓｆ９細胞（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）をＴ２５瓶で無血清培地（Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ，ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）に播種した。細胞の付着後に、培地をＴＭＮ−ＦＨ昆虫培地（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）と置き換えた。組み換えトランスフェクションベクターを、ほぼ１００％の組み換え効率で組み換えバキュロウイルスを産生するために、不活化直線化ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ ＤＮＡ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）とＳｆ９昆虫細胞中でコトランスフェクトした。得られた組み換えウイルスストックを、組み換えタンパク質発現のためにＳｆ９細胞でさらに増幅した。典型的には細胞を３日後に採取した。
【０１０５】
実施例１： ＭＥＳＴのグリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性−量依存性
この実施例は上で詳述したように行った。具体的には、トランスフェクトされていないか又はＭＥＳＴ（Ｔ５７９Ｂ又はＴ５８０Ｂ）若しくはＧＰＡＴ１のいずれかを発現するようにトランスフェクトされた昆虫細胞（ＳＦ９）を製造した。これらの細胞の粗製膜を得、アシル転移活性を検出するために使用した（６０分のインキュベーション時間）。表１に示されるように、ＭＥＳＴ（Ｔ５７９Ｂ又はＴ５８０Ｂ）でトランスフェクトされた昆虫細胞は、ＧＰＡＴ１の活性を上回りさえする有意なアシル転移活性（試験あたりのｄｐｍ）を示した。さらに、活性がタンパク質の量とともに増加するということが示された。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
実施例２： ＭＥＳＴのグリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性−時間経過
本実施例は上で詳述されるように行われた。具体的には、ＭＥＳＴ（Ｔ５７９Ｂ又はＴ５８０Ｂ）を発現するようにトランスフェクトされた昆虫細胞（ＳＦ９）を製造した。これらの細胞の粗製膜を得て、アシル転移活性（試験ごとにｄｐｍで）を検出するために使用した。表２に示されるように、活性は時間（及び粗製膜の量）とともに増加した。
【０１０８】
【表２】
【０１０９】
実施例３： ＭＥＳＴのグリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性：ＮａＣｌ抽出に対する耐性
本実施例は上で詳述されるように行った。具体的には、トランスフェクトされていないか又はＭＥＳＴ（Ｔ５７９Ｂ又はＴ５８０Ｂ）若しくはＧＰＡＴ（ＧＰＡＴ１、−３又は−４）のいずれかを発現するようにトランスフェクトされた昆虫細胞（ＳＦ９）を製造した。粗製膜を調製し（上記を参照のこと）、そして１Ｍ ＮａＣｌと共に１時間４℃でインキュベートした。遠心分離（１００，０００ ｘ ｇ、６０分、４℃）の後、ペレット及び上清フラクションをアシル転移活性を検出するために使用した。表３に示されるよう
に、ＭＥＳＴ（Ｔ５７９Ｂ又はＴ５８０Ｂ）活性（ｄｐｍ／試験）は、上清フラクションではなくペレット化膜と主に関連していた。このことは、ＭＥＳＴ活性が表在性膜タンパク質ではなく全体に起因するということを示す。
【０１１０】
【表３】
【０１１１】
【表４】
【０１１２】
実施例４： エポキシドヒドロラーゼ阻害剤Ａ００３５６４５５６によるＭＥＳＴの部分的阻害、しかし一般的なリパーゼ阻害剤Ｓ９８７６００では阻害されない
この実験は上で詳述されるように行われた。具体的には、ＭＥＳＴ（Ｔ５７９Ｂ）を発現するようにトランスフェクトされた昆虫細胞（ＳＦ９）から粗製膜を製造し、そしてグリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性（ｄｐｍ／試験）についてＡ００３５６４５５６又はＳ９８７６００の存在下で測定した。表４に示されるように、ＭＥＳＴ活性はエポキシドヒドロラーゼ阻害剤、Ａ００３５６４５５６（＝ＡＵＤＡ；Ｄｏｒｒａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．２００５；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｃａｒｒｏｌｌ ｅｔ
ａｌ．２００８）により部分的に阻害されたが、一般的なリパーゼ阻害剤Ｓ９８７６００（Ｐｅｔｒｙ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｂｅｎ Ａｌｉ ｅｔ ａｌ． ２００４及び２００６）では阻害されなかった。
【０１１３】
【表５】
【０１１４】
実施例５： 競合的基質、類似体ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）によるＭＥＳＴの阻害
この実験は上で詳述されるように行われた。具体的には、ＭＥＳＴ（Ｔ５７９Ｂ）又はＧＰＡＴ（ＧＰＡＴ１、−３又は−４）のいずれかを発現するようにトランスフェクトされた昆虫細胞（ＳＦ９）の粗製膜を製造し、そして競合的基質の類似体ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）の存在下で測定した。表５に示されるように、ＭＥＳＴ活性は濃度依存的様式でＤＨＡＰにより阻害された。
【０１１５】
【表６】
【０１１６】
実施例６： Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）又は高温によるＭＥＳＴのグリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性の完全／部分的阻害
この実験は上で詳述されるように行われた。具体的には、トランスフェクトされていない昆虫細胞（ＳＦ９）又はＭＥＳＴ（Ｔ５７９Ｂ）若しくはＧＰＡＴ（ＧＰＡＴ１、−３又は−４）のいずれかを発現するようにトランスフェクトされた昆虫細胞（ＳＦ９）の粗製膜を製造し、そして１ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）の存在下で１時間又は４１℃で１０分間測定した。表６に示されるように、ＭＥＳＴ活性（及び内在性昆虫細胞グリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性）はＮＥＭにより（完全に）阻害され、そして高温で（部分的に）阻害された。
【０１１７】
【表７】
【０１１８】
結果の概要
組み換えで産生されたヒトＭＥＳＴタンパク質（最初の１１個のアミノ酸が異なる、異なる開始コドンを有する２つの変異体）を、可能性のあるグリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性について適切な試験系（放射標識を使用し、そして公知のアシルトランスフェラーゼにより確認された）において試験した。準備した試験系において、両方の変異体が、濃度依存性及び時間依存性であるグリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性を示した。酵素はタンパク質の組換え体発現の後でＳｆ９細胞から誘導された粗製膜に結合したと思われる。さらに、グリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性は、温度に対して敏感であり、さらには不可逆的阻害剤ＮＥＭ及び競合的基質類似体ＤＨＡＰに対しても敏感である。部分的阻害は、エポキシドヒドロラーゼファミリーのメンバーであるＡ００３５６４５５６について可逆的阻害剤を使用して得ることができた（ＩＣ50 約２００μＭ）。
【０１１９】
参考文献
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＥＳＴ活性を測定するための試験系、ＭＥＳＴのリガンドをスクリーニングするための方法、及びＭＥＳＴリガンド、特にＭＥＳＴ阻害剤の同定のための試験系の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、過剰な体脂肪が健康に有害な影響を有し得る、例えば減少した平均余命をもたらす程度まで蓄積した医学的状態である。脂肪細胞量の増加として定義される肥満及びそれに伴う末梢組織（例えば筋肉及び肝臓）のインスリン抵抗性は、先進工業国における本質的な健康問題であり、そして途上国でも増加している。肥満及びインスリン抵抗性は、頻繁にメタボリックシンドローム及びＩＩ型糖尿病に至り、従ってこれらの疾患の原因と考えられる。
【０００３】
脂肪細胞量は、脂肪細胞の数の増加（分化）及び／又は脂肪細胞のサイズの増加（細胞あたりの細胞質脂質の増加した量の沈着）により増強される。タンパク質「ＭＥＳＴ」が脂肪細胞サイズの調節に関与すると示唆されている（例えば非特許文献１；２及び３）を参照のこと。
【０００４】
以下の効果が観察されている：
ｉ） ＭＥＳＴのｍＲＮＡレベル及びタンパク質発現が、脂肪餌を与えられた肥満の動物の脂肪組織において劇的に増加する。
ｉｉ） ＭＥＳＴ発現が脂肪細胞のサイズと相関する。
ｉｉｉ） 脂肪組織においてＭＥＳＴを過剰発現したトランスジーンマウスは、増加した脂肪細胞特異的遺伝子発現及び増加した脂肪細胞サイズ（数は増加しない）を示すが、筋肉質量及び非脂肪組織の総質量は減少する。
ｉｖ） 肥満動物への抗糖尿病薬の投与（グリタゾンクラスの「インスリン抵抗性改善薬」）により発現が減少し、それに伴って脂肪細胞サイズが減少し、そしてインスリン感受性が改善された。
ｖ） 培養された脂肪細胞におけるＭＥＳＴの過剰発現は、増加した脂肪細胞分化及び脂肪細胞特異的遺伝子発現をもたらす。
ｖｉ） ＭＥＳＴ ｍＲＮＡ及びタンパク質は、糖尿病及び過体重のヒトの脂肪組織においてのみ検出可能である。
ｖｉｉ） ヒトボディマス指数（肥満の基準として）に影響を及ぼすヒト第７染色体における染色体座（７ｑ３２．３）は、これも第７染色体上にあるＭＥＳＴについて同定された染色体座の近くに位置する（７ｑ３２．２）。
ｖｉｉｉ） ＭＥＳＴ遺伝子を欠失したマウス（ＭＥＳＴ ＫＯマウス）は、（正常な形態で）減少した脂肪組織質量を示す。
ｉｘ） 脂肪富化食餌後のマウスの相対的な肥満の差は、精巣上体脂肪組織におけるＭＥＳＴの発現と相関しており、ここで質量の増加した量は肥満の発生時に既に検出可能であり、従って肥満の病理発生の前兆でありそして原因である。
【０００５】
もともとＭＥＳＴはマウスの癌細胞（ＭＣ１２）からクローン化された。これは胚体中胚葉及び胚体外中胚葉において発現されるが、通常成体組織では発現されない。さらに、ＭＥＳＴは、正常な胚と単為生殖胚（雌性ゲノム由来のみ）とのｃＤＮＡのサブトラクションハイブリダイゼーションによる刷り込み遺伝子の系統的分析において父系のみ発現される遺伝子と同定された。
【０００６】
しかし、ＭＥＳＴの酵素的機能又は生化学的機能はこれまで記載されていない。しかし、その肥満における関連性のために、ＭＥＳＴの調節因子を、特に新しい治療標的として、並びに糖尿病、メタボリックシンドローム及び／又はＩＩ型糖尿病の処置として同定することが望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｆｅｉｔｏｓａ ｅｔ ａｌ．，２００２
【非特許文献２】Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００５
【非特許文献３】Ｎｉｋｏｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、ＭＥＳＴリガンドの同定に使用され得る、ＭＥＳＴ活性を測定するための試験系を開発することが本発明の目的であった。驚くべきことに、アルファ／ベータ折り畳みヒドロラーゼ（リパーゼ、エステラーゼ、セリンプロテアーゼ及びアシルトランスフェラーゼ）のスーパーファミリーにＭＥＳＴが属するということが見出された。グリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼＧＰＡＴ１−４に対するＭＥＳＴの全体的な配列同一性は非常に低い（Ｌｅｈｎｅｒ及びＫｕｋｓｉｓ，１９９６；Ｌｅｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｃｏｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，２００６）。低い配列同一性に起因して、ＭＥＳＴはハイブリダイゼーション又はＰＣＲ（縮重プライマーを使用する）でも、インシリコ配列解析でもかすかに関連したＧＰＡＴアイソフォームと同定されなかった。
【０００９】
しかし、実施例に示されるように、ＭＥＳＴがグリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼとしての活性を有することが今や示されており、この発見に基づいて試験系が開発されている。この発見は、グリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼが脂肪細胞及び他の末梢組織における脂質の合成において律速であり、それにより脂肪細胞のサイズを調節するということと特に関連する。従って、ＭＥＳＴの阻害は、肥満及び糖尿病に関連する治療方法における興味深い標的を提供する。このことは、グリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（例えばＧＰＡＴ １及び３）のファミリーの他のメンバーについて適切な細胞ベースのアッセイ、さらには動物モデルにおいて既に確認されている（Ｔｈｕｒｅｓｓｏｎ，２００４）。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、本発明の第一の局面は、
ｉ） 中胚葉特異的転写物相同体タンパク質（ＭＥＳＴ）又はその機能的に活性な変異体、
ｉｉ） アシル受容体、例えばグリセロール−３−リン酸、
ｉｉｉ） アシル供与体、例えばアシル補酵素Ａ（ＣｏＡ）［ここでアシルは０、１、２又は３つの二重結合を有するＣ14〜Ｃ22アシルである］、及び
ｉｖ） アシル残基をアシルＣｏＡからアシル受容体に転移させるＭＥＳＴの酵素活性を検出するための手段
を含んでなる、ＭＥＳＴ活性を測定するための試験系に関する。
【００１１】
本発明の試験系は、アシル転移酵素ＭＥＳＴの機能及び活性を解明するために使用され得る。詳細には、本試験系は、ＭＥＳＴと相互作用する薬剤、特にＭＥＳＴを活性化又は不活化する薬剤を開発、同定及び／又は特徴付けするために使用され得る。同定された薬剤は興味深い治療薬であり得、これは肥満及び糖尿病のようなＭＥＳＴ関連疾患の処置において使用され得る。
【００１２】
本発明の試験系が適応され得る一連の試験設計は当該分野で公知である。例となる試験に関するさらなる詳細は本発明の方法において示される。本試験系は、場合によりＭＥＳＴと相互作用することが疑われるか相互作用することが公知である薬剤の存在下で、ＭＥＳＴの活性を測定するために使用され得る。当業者は、例えば一般的な方法と関連して必要とされるさらなる薬剤を加えることにより、意図される特定の試験設計に本試験系を適応させることができるだろう。
【００１３】
本発明によれば、試験系はＭＥＳＴの活性を測定するために設計される。ＭＥＳＴは生体分子のアシル化を触媒するアシル転移酵素である。この文脈において、アシル転移酵素は、アシル供与体、特にアシル補酵素Ａ（ＣｏＡ）（例えばパルミトイル−ＣｏＡ又はオレオイル−ＣｏＡ）からアシル受容体、特にグリセロール３−リン酸へのアシル転移を触媒する。
【００１４】
上で詳述したように、本試験系は、アシル転移酵素ＭＥＳＴの酵素活性、すなわちアシル供与体からアシル受容体へのアシル基の転移におけるその活性を測定するために使用される。酵素活性は、一般的に単位時間あたりに転換された基質のモル数＝速度×反応体積として定義される。酵素活性は存在する活性酵素の量の尺度であり、従って条件に依存する。ＳＩ単位はカタールであり、１カタール＝１ｍｏｌ 秒-1であるが、これは非常に大きな単位である。より実用的で一般に使用される値は１酵素単位（ＥＵ）＝１μｍｏｌ 分-1（μ＝マイクロ、ｘ１０-6）。１Ｕは１６．６７ナノカタールに相当する。しかし、アシル転移酵素の酵素活性は、例えば試験しようとする化合物の不在下及び存在下での酵素活性を比較することにより、アシル転移酵素の酵素活性の変化（相対的単位）として測定してもよい。例となる試験設計を実施例４〜６に記載する。
【００１５】
明らかに、酵素活性は（ｉｎ）、酵素の量、酵素の活性化状態、補因子（例えば活性化補助因子又は補助抑制因子）の存在、活性化因子及び阻害剤の存在、並びに塩濃度、温度、ｐＨなどのような周囲条件を含む一連の因子により影響を受ける。通常、酵素活性は標準的な実験室条件で測定され、そして問題の試験系の最適条件に適合され得る。従って、試験系は、有用な治療剤であり得る活性化因子及び阻害剤のような酵素の活性化状態を変化させる分子を検出又は同定するために使用され得る。
【００１６】
第一の構成要素（構成要素ｉ）とも呼ばれる）として、本試験系は中胚葉特異的転写物相同体タンパク質（ＭＥＳＴ）又はその機能的に活性な変異体を含む。
【００１７】
中胚葉特異的転写物相同体タンパク質（ＭＥＳＴ）は父性発現（ｐａｔｅｒｎａｌｌｙ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）遺伝子１タンパク質（ＰＥＧ１）とも呼ばれる。このタンパク質又は遺伝子のさらなる特徴は明細書の導入部分に示される。
【００１８】
これまでにＭＥＳＴの３つのアイソフォームが同定されており、これらは選択的スプライシングにより産生される：アイソフォーム１（識別名：Ｑ５ＥＢ５２−１、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／にてＰｒｏｔｅｉｎ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢを参照のこと）、アイソフォーム２（識別名：Ｑ５ＥＢ５２−２）（ここではアイソフォーム１のアミノ酸１〜９が欠けている）、及びアイソフォーム３（識別名：Ｑ５ＥＢ５２−３）（ここではアイソフォーム１のアミノ酸１〜９及び２１８〜２５１が欠けている）。ヒトＭＥＳＴアイソフォーム１は以下のアミノ酸配列を有する（ＰＲＯ＿００００２８４４１８を参照）：
【００１９】
10 20 30 40 50 60
MVRRDRLRRM REWWVQVGLL AVPLLAAYLH IPPPQLSPAL HSWKSSGKFF TYKGLRIFYQ
70 80 90 100 110 120
DSVGVVGSPE IVVLLHGFPT SSYDWYKIWE GLTLRFHRVI ALDFLGFGFS DKPRPHHYSI
130 140 150 160 170 180
FEQASIVEAL LRHLGLQNRR INLLSHDYGD IVAQELLYRY KQNRSGRLTI KSLCLSNGGI
190 200 210 220 230 240
FPETHRPLLL QKLLKDGGVL SPILTRLMNF FVFSRGLTPV FGPYTRPSES ELWDMWAGIR
250 260 270 280 290 300
NNDGNLVIDS LLQYINQRKK FRRRWVGALA SVTIPIHFIY GPLDPVNPYP EFLELYRKTL
310 320 330
PRSTVSILDD HISHYPQLED PMGFLNAYMG FINSF
（配列番号１）
【００２０】
アイソフォーム１は父方対立遺伝子からのみ発現するが、アイソフォーム２は父方の対立遺伝子及び母方の対立遺伝子の両方から発現する。父系由来対立遺伝子の単一対立遺伝子発現は調べられた全ての胎仔組織（脳、骨格筋、腎臓、副腎、舌、心臓、皮膚及び胎盤を含む）において見られた。
【００２１】
その触媒三連構造（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒｉａｄ）（セリン１４５、ヒスチジン１４６、アスパラギン酸１４７）に起因して、ＭＥＳＴはＡＢ（折り畳み）ヒドロラーゼスーパーファミリー（α／βヒドロラーゼスーパーファミリーとも呼ばれる）に属すると示唆された。しかし、その酵素的又は生化学的機能は以前は解明されていなかった。ＡＢ（折り畳み）ヒドロラーゼスーパーファミリーの公知のメンバーは、重要な生化学的プロセスに関与し、そして種々の疾患に関連することが見出されている。最も大きなタンパク質スーパーファミリーの１つとして、ＡＢヒドロラーゼスーパーファミリーは、適当な関係のないアミノ配列が類似性を有する構造に適合し得る興味深い進化過程を経てきた。５つの明らかに関係のないヒドロラーゼのタンパク質折り畳みは、１９９０年代前半にａ／ｂヒドロラーゼ折り畳みと名付けられた。標準的なａ／ｂヒドロラーゼ折り畳みは８本鎖の平行ａ／ｂ構造で構成される。このファミリーの酵素は、関係のない配列、様々な基質、そして異なる種類の触媒活性を有していてもよい、例えば：カルボン酸エステルヒドロラーゼ、リパーゼ、チオエステルヒドロラーゼ、ペプチドヒドロラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、デハロゲナーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、及びＣ−Ｃ結合開列酵素。
【００２２】
本発明内では、ＭＥＳＴがアシルトランスフェラーゼとしての酵素活性を有すると示すことができた（実施例も参照のこと）。公知のアシルトランスフェラーゼ（特にグリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）１−４）に対する全体の配列類似性が非常に低いので、この発見は特に驚くべきことであった。従って、ＭＥＳＴは遠隔アシルトランスフェラーゼとしてはまだ同定されていない。
【００２３】
本発明によれば、特徴「中胚葉特異的転写物相同体タンパク質」（ＭＥＳＴ）は上記で定義されるようなヒトアイソフォーム１、２及び３を含む天然に存在するいずれかのＭＥＳＴに関する。しかし、上で記載及び説明されるヒトアイソフォーム１（配列番号１を参照のこと）が特に好ましい。
【００２４】
いずれかの天然に存在するＭＥＳＴアイソフォーム又は変異体（例えば種変異体又はスプライス変異体）に加えて、改変されたＭＥＳＴタンパク質を使用してもよい。改変ＭＥ
ＳＴタンパク質又はＭＥＳＴ変異体は、変異体がその生物学的機能、すなわちそのアシル転移活性を維持しているという点で機能的に活性な変異体であるということに留意すべきである。好ましくは、生物学的機能、例えばアシル基の転移の維持は、天然に存在するＭＥＳＴの活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、８０％又は９０％、なおより好ましくは９５％を有すると定義される。生物学的活性は実施例に記載されるように決定され得る。
【００２５】
変異体は、天然に存在するＭＥＳＴタンパク質からなるドメイン及び少なくとも１つのさらなる構成要素を有する分子であり得る。例えば、タンパク質を、精製目的で使用されるタグ（例えば６Ｈｉｓ（又はＨｅｘａＨｉｓ）タグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＨＡタグ、ｃ−ｍｙｃタグ又はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ）のようなマーカーに結合してもよい。例えば、高度に精製されたＭＥＳＴタンパク質又は変異体が必要とされる場合、二重又は多重マーカー（例えば上記のマーカー又はタグの組み合わせ）が使用され得る。この場合、タンパク質は２つ又はそれ以上の分離クロマトグラフィー工程で精製され、各場合に第一のタグ、次いで第二のタグの親和性を利用する。このような二重タグ又はタンデムタグの例は、ＧＳＴ−Ｈｉｓタグ（ポリヒスチジンタグに融合されたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、６ｘＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ（Ｓｔｒｅｐタグに融合された６つのヒスチジン残基）、６ｘＨｉｓ−タグ１００−タグ（哺乳動物ＭＡＰ−キナーゼ２の１２アミノ酸のタンパク質に融合された６つのヒスチジン残基）、８ｘＨｉｓ−ＨＡタグ（赤血球凝集素−エピトープタグに融合された８つのヒスチジン残基）、Ｈｉｓ−ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質に融合されたＨｉｓタグ）、ＦＬＡＧ−ＨＡタグ（血液凝集素−エピトープタグに融合されたＦＬＡＧタグ）、及びＦＬＡＧ−Ｓｔｒｅｐタグ（Ｓｔｒｅｐタグに融合されたＦＬＡＧタグ）である。マーカーはタグ化タンパク質を検出するために使用することができ、ここでは特異的抗体が使用され得る。適切な抗体としては、抗ＨＡ（例えば１２ＣＡ５又は３Ｆ１０）、抗６Ｈｉｓ、抗ｃ−ｍｙｃ及び抗ＧＳＴが挙げられる。さらに、ＭＥＳＴタンパク質は、蛍光マーカー又は放射性マーカーのような異なる分類のマーカーに連結され得、これによりＭＥＳＴの検出が可能になる。さらなる実施態様において、ＭＥＳＴは融合タンパク質の一部であり得、ここで酵素活性を有するタンパク質構成要素のように、第二の部分は検出に使用され得る
本発明の別の実施態様において、ＭＥＳＴ変異体はＭＥＳＴフラグメントであり得、ここでフラグメントもやはりアシル基を転移させることができる。これには短いＣ末端及び／又はＮ末端欠失（例えば多くとも２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１つのアミノ酸）を有するＭＥＳＴタンパク質が含まれ得る。さらに、ＭＥＳＴフラグメントはＭＥＳＴタンパク質について上で詳述されるようにさらに改変され得る。
【００２６】
あるいは又はさらに、ＭＥＳＴタンパク質又は上記のようなその変異体は、特にアシル基の転移に関与しない領域に１つ又はそれ以上のアミノ酸置換を含み得る。しかし、アミノ酸が化学的に関連するアミノ酸で置換される保存的アミノ酸置換が好ましい。典型的な保存的置換は、脂肪族アミノ酸間、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸間、酸性残基を有するアミノ酸間、アミド基を有するアミノ酸間、塩基性残基を有するアミノ酸間、又は芳香族残基を有するアミノ酸間である。置換を有するＭＥＳＴタンパク質又はフラグメント又は変異体は、ＭＥＳＴタンパク質又はフラグメント又は変異体について上で詳述されるように改変され得る。本発明の以下の説明において、ＭＥＳＴに関して示される全ての詳細は、別の記載がなければその機能的に活性な変異体にも関連する。
【００２７】
しかし、最も好ましくは、ＭＥＳＴタンパク質は天然に存在するＭＥＳＴタンパク質であり、なおより好ましくは天然に存在するヒトＭＥＳＴタンパク質（アイソフォーム１、２又は３）又は機能的に活性な変異体Ｔ５７９Ｂ（配列番号１のアミノ酸２〜３３５）又は機能的に活性な変異体Ｔ５８０Ｂ（配列番号１のアミノ酸１１〜３３５）である。アミ
ノ酸１〜１１を除外することができると証明されたという事実のため、以下の変異体のいずれも適切だろうと推測される：配列番号１のアミノ酸３〜３３５、配列番号１のアミノ酸４〜３３５、配列番号１のアミノ酸５〜３３５、配列番号１のアミノ酸６〜３３５、配列番号１のアミノ酸７〜３３５、配列番号１のアミノ酸８〜３３５、配列番号１のアミノ酸９〜３３５又は配列番号１のアミノ酸１０〜３３５。
【００２８】
第二の構成要素（構成要素ｉｉ）とも呼ばれる）として本試験系はアシル受容体を含む。アシル受容体はアシル基がアシル基転移の間に供与される化学化合物である。本発明において、アシル転移はＭＥＳＴにより媒介される。従って、ＭＥＳＴに受容されるいずれかの適切なアシル受容体が使用され得る。アシル受容体の例は典型的に、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール及び特にグリセロール−リン酸及びジヒドロキシアセトンリン酸のようなリン脂質を含む。好ましくは、アシル受容体はグリセロール−リン酸又はジヒドロキシアセトンリン酸、より好ましくはグリセロール３−リン酸である。
【００２９】
第三の構成要素（構成要素ｉｉｉ）とも呼ばれる）として、試験系はアシル供与体、すなわちアシル補酵素Ａ（ＣｏＡ）［ここでアシルは０、１、２又は３つの二重結合を有するＣ14〜Ｃ22アシルである］を含む。
【００３０】
アシルＣｏＡは脂肪酸の代謝に関与する補酵素である。これは生細胞内部で長鎖脂肪酸の末端に補酵素Ａ（ＣｏＡ）が結合するときに形成される一時的な化合物である。アシルＣｏＡは一般式
【化１】
［式中、ＣｏＡは補酵素Ａを表し、そしてＲは１４〜２２個のＣ原子を有する脂肪酸残基を表す］を有する。
【００３１】
補酵素Ａ（ＣｏＡ、ＣｏＡＳＨ、又はＨＳＣｏＡ）は、脂肪酸の合成及び酸化、並びにクエン酸回路におけるピルビン酸の酸化におけるその役割に注目すべき補酵素である。補酵素Ａは化学的にはチオールであるのでカルボン酸と反応してチオエステルを形成することができ、それ故アシル基キャリアとして機能する。それが脂肪酸の転移に役立つ。アシル基に結合していない場合は、通常「ＣｏＡＳＨ」又は「ＨＳＣｏＡ」と呼ばれる。
【００３２】
脂肪酸は、動物又は植物の脂肪、油脂、又はロウから誘導されるか、又はそれにエステル化形態で含有される、脂肪族モノカルボン酸類である。天然脂肪酸は一般的に４〜２８個の炭素を有し（通常は無分枝鎖で偶数）、飽和であっても不飽和であってもよい。
【００３３】
本発明によれば、脂肪酸は飽和（０の二重結合）及び不飽和（１、２又は３つの二重結合）であり得る。それらは長さも様々であり、１４〜２２個の炭素原子、特に１６〜２０個の炭素原子、例えば１６、１８又は２０個の炭素原子を有し得る。
【００３４】
１４〜２２個の炭素原子を有する飽和脂肪酸の例としては、
− ミリスチン酸（テトラデカン酸ＣＨ3（ＣＨ2）12ＣＯＯＨ）、
− ペンタデシル酸（ｐｅｎｔａｄｅｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ）（ペンタデカン酸ＣＨ3（ＣＨ2）13ＣＯＯＨ）、
− パルミチン酸（ヘキサデカン酸ＣＨ3（ＣＨ2）14ＣＯＯＨ）、
− マルガリン酸（ヘプタデカン酸ＣＨ3（ＣＨ2）15ＣＯＯＨ）、
− ステアリン酸（オクタデカン酸ＣＨ3（ＣＨ2）16ＣＯＯＨ）、
− ノナデシル酸（ｎｏｎａｄｅｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ）（ノナデカン酸ＣＨ3（ＣＨ2）17ＣＯＯＨ）、
− アラキジン酸（エイコサン酸ＣＨ3（ＣＨ2）18ＣＯＯＨ）、
− ヘネイコシル酸（ｈｅｎｅｉｃｏｓｙｌｉｃ ａｃｉｄ）（ヘンエイコサン酸ＣＨ3（ＣＨ2）19ＣＯＯＨ）、及び
− ベヘン酸（ドコサン酸ＣＨ3（ＣＨ2）20ＣＯＯＨ）
が挙げられる。
【００３５】
１４〜２２個の炭素原子を有する不飽和脂肪酸の例としては、
− ミリストレイン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）3ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＯＯＨ）、
− ミリストレイン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）3ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＯＯＨ）、
− パルミトレイン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）5ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＯＯＨ）、
− オクタデカ−６−エン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）10ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）4ＣＯＯＨ）、
− オレイン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＯＯＨ）、
− オクタデカ−９−エン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＯＯＨ）、
− オクタデカ−１１−エン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）5ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）9ＣＯＯＨ）、
− リノール酸（ＣＨ3（ＣＨ2）4ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＯＯＨ）、
− α−リノレン酸（ＣＨ3ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＯＯＨ）、
− オクタデカ−６，９，１２−トリエン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）4ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）4ＣＯＯＨ）、
− オクタデカ−８，１０，１２−トリエン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）4ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）6ＣＯＯＨ）、
− オクタデカ−９，１１，１３−トリエン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）３ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＯＯＨ）、
− エイコサ−９−エン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）9ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）7ＣＯＯＨ）、
− エイコサ−１１−エン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）9ＣＯＯＨ）、
− ドコサ−１１−エン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）9ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）9ＣＯＯＨ）、及び
− エルカ酸（ＣＨ3（ＣＨ2）7ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）11ＣＯＯＨ）
が挙げられる。
【００３６】
第四の構成要素（構成要素ｉｖ）とも呼ばれる）として、本試験系はアシルＣｏＡからアシル受容体にアシル残基を転移させるＭＥＳＴの酵素活性を検出するための手段を含む。
【００３７】
ＭＥＳＴの活性の検出に適した手段は、本明細書の全体を通して詳述される。
【００３８】
構成要素ｉ）〜ｉｖ）に加えて、本発明の試験系は１つ又はそれ以上のさらなる構成要素を含み得る。試験設計及び検出方法に依存して、試験系はさらなる構成要素を含み得る。当業者は、試験系を研究設計に適合させることができ、すなわち適切な緩衝剤、補因子又は任意の他の必要な薬剤を選択することができる。場合により、第五の構成要素（（試験）薬剤とも呼ばれる）として、本試験系はアシル転移酵素の活性を変更すると疑われる薬剤を含む。
【００３９】
試験系は、一般的な条件下で適切な、細胞系であっても無細胞系であってもよい。
【００４０】
本発明の好ましい実施態様において、アシルＣｏＡはパルミトイルＣｏＡ又はオレオイル−ＣｏＡ、好ましくはパルミトイルＣｏＡである。
【００４１】
本発明の別の好ましい実施態様において、アシル受容体はグリセロール３−リン酸又はジヒドロキシアセトンリン酸、好ましくはグリセロール３−リン酸である。
【００４２】
従って、アシルＣｏＡとアシル受容体との以下の組み合わせが好ましい：
− アシルＣｏＡがパルミトイルＣｏＡであり、アシル受容体がグリセロール３−リン酸である。
− アシルＣｏＡがパルミトイルＣｏＡであり、アシル受容体がジヒドロキシアセトンリン酸である。
− アシルＣｏＡがオレオイル−ＣｏＡであり、アシル受容体がグリセロール３−リン酸である。
− アシルＣｏＡがオレオイル−ＣｏＡであり、アシル受容体がジヒドロキシアセトンリン酸である。
【００４３】
アシルＣｏＡがパルミトイルＣｏＡであり、アシル受容体がグリセロール３−リン酸である組み合わせが最も好ましい。
【００４４】
１つの好ましい実施態様において、検出可能なマーカーが、アシル残基をアシルＣｏＡからアシル受容体に転移させるＭＥＳＴの酵素活性を検出するために使用される。従って、アシル受容体及び／又はアシルＣｏＡは少なくとも１つの検出可能なマーカーで標識され得る。
【００４５】
マーカー（又は標識）は、別の物質又は物質の複合体の存在を示すことができるいずれかの種類の物質である。マーカーは検出しようとする物質に連結されているか導入されている物質であり得る。検出可能なマーカーは、例えばタンパク質、酵素反応の生成物、第二のメッセンジャー、ＤＮＡなどを検出するために分子生物学及びバイオテクノロジーにおいて使用される。
【００４６】
本発明の好ましい実施態様において、マーカーは放射標識、具体的には3Ｈ、32Ｐ、35Ｓ又は14Ｃ、特に3Ｈである。マーカーは、アシルＣｏＡからアシル受容体に転移させようとするアシル基に結合され得る。転移が起こった後に、標識されたアシルＣｏＡ及び標識されたアシル受容体は、それらの異なる物理的又は化学的特性に基づいて分離され得、そして放射能の量はＭＥＳＴ活性を決定するために定量される。あるいは、アシル受容体を標識してもよい。アシルの転移が起こった後、標識された非アシル化アシル受容体と標識されたアシル化アシル受容体は、それらの異なる物理的又は化学的特性に基づいて分離され得、そして放射能の量を、ＭＥＳＴ活性を決定するために定量する。
【００４７】
本発明のより好ましい実施態様において、パルミトイルＣｏＡは、放射標識されたアシル受容体、特に放射標識されたグリセロール３−リン酸に転移させるために使用される。好ましい標識は3Ｈである。
【００４８】
本発明の別の好ましい実施態様において、マーカーは１つ又はそれ以上の蛍光マーカーである。適切な蛍光マーカーは本発明の方法の文脈において記載される。一般に、放射標識に関して上で示される詳細は、概してマーカーにも適用可能であり、従って蛍光マーカーにも適用可能であり、ここで放射標識が（蛍光）マーカーで置き換えられる。
【００４９】
あるいは、２つの物質又は部分が近接していることを検出するために２つのマーカーが使用され得る。これらのマーカーは、例えば１つの蛍光マーカー及び１つのシンチレータ（例えばシンチレーション近接アッセイのため）であり得、又は２つの蛍光マーカーが（例えばＦＲＥＴのために）使用され得る。一実施例において、アシル基及びアシル受容体
を第一及び第二のマーカーで標識することができた。アシル基がアシルＣｏＡからアシル受容体に転移され、従って標識が近接している場合、エネルギーは第一の標識から第二の標識に転移し、それ故アシル基の転移を検出することができた。適切なマーカーの組み合わせの例としては、
− 例えばマイクロパーティクルに分けられた、ケイ酸イットリウム若しくはポリビニル−トルエンのようなシンチレーターと組み合わされた放射標識3Ｈ、33Ｐ、35Ｓ又は14Ｃ、125Ｉ又は
− ＬＣ−Ｒｅｄ ６１０、ＬＣ−Ｒｅｄ ６４０、ＬＣ−Ｒｅｄ ６７０、ＬＣ−Ｒｅｄ ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンｘイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミン五酢酸又は他のランタニドイオン（ユーロピウム又はテルビウム）のキレートのような受容体蛍光マーカーと組み合わされた、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ−フィコエリトリン、９−アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４−アセトアミド−４'−イソチオシアナトスチルベン−２，２'−ジスルホン酸、７−ジエチルアミノ−３−（４'−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン、スクシンイミジル１−ピレンブチラート、及び４−アセトアミド−４'−イソチオシアナトスチルベン−２，２'−ジスルホン酸誘導体のような供与体蛍光マーカー
が挙げられる。
【００５０】
上記の本発明の試験系は、ＭＥＳＴリガンドをスクリーニングするための方法において使用され得る。
【００５１】
従って、本発明の別の局面は、ＭＥＳＴのリガンドをスクリーニングするための方法に関し、該方法は：
ａ） 上記の本発明の試験系を、アシル受容体へのアシル転移をもたらす条件下で薬剤と接触させる工程、
ｂ） ＭＥＳＴのアシル転移活性を決定する工程、及び
ｃ） コントロールと比較して変更されたＭＥＳＴのアシル転移活性を検出し、それにより物質をＭＥＳＴのリガンドと同定する工程
を含む。
【００５２】
本発明の方法の特徴の定義のために、本発明の試験系の文脈において上で詳述された定義及び実施態様も参照される。
【００５３】
本発明の方法のために、ＭＥＳＴ又はその機能的に活性な変異体を含む試験系を薬剤と接触させる。本発明の試験系で試験される薬剤は、任意の化学的性質の任意の試験物質又は試験化合物であり得る。それは疾患のための薬物又は医薬として既に公知であってもよい。あるいは、それは別の実施態様において治療効果を有することがまだ知られていない公知の化学化合物であってもよく、その化合物は新規であってもそれまで未知の化学化合物であってもよい。薬剤は試験物質又は試験化合物の混合物であってもよい。
【００５４】
本発明のスクリーニング方法の実施態様において、試験物質は化学化合物ライブラリの形態で提供される。化学化合物ライブラリは、多数の化学化合物を含み、そして化学的に合成された分子若しくは天然産物を含む多数の供給源のいずれかから構築されたものであるか、又はコンビナトリアルケミストリー技術により生成されたものである。それらはハイスループットスクリーニングに特に適しており、特定の構造の化学化合物若しくは特定の生物（例えば植物）の化合物で構成され得る。本発明の文脈において、化学化合物ライブラリは、好ましくはタンパク質及びポリペプチド又は有機小分子を含むライブラリである。好ましくは、有機小分子は５００ダルトン未満の大きさであり、特に可溶性でオリゴ
マーでない有機化合物である。
【００５５】
本発明の文脈において、ＭＥＳＴ活性を調節してそれを検出するために適した条件下で一定時間、試験系を薬剤と接触させる。適切な条件としては、例えば含まれるタンパク質の変性を防ぐため、又は存在する場合は生存細胞を維持するために適切な温度及び溶液が挙げられる。適切な条件は、選択された特定の試験系に依存し、そして当業者はその一般的知識に基づいてそれを選択することができるだろう。インキュベーション工程は、約５秒から数時間まで、好ましくは約５分から約２４時間で変動し得る。しかし、インキュベーション時間は、アッセイ形式、マーカー、溶液の体積、濃度などに依存するだろう。通常は、アッセイは周囲温度で行われるが、１０℃〜４０℃のような温度範囲にわたって行うことができる。
【００５６】
試験系を薬剤と接触させた後、試験系に対する薬剤の効果が検出される。以下において、一連の異なる検出系がより詳細に記載される。しかし、当然のことながら、これらは例示であり、他の試験系及び方法も適切であり得る。
【００５７】
薬剤が試験系に特異的で有意な効果を有する場合、その薬剤をＭＥＳＴの調節因子と同定する。本発明の文脈におけるＭＥＳＴの調節因子、特にリガンドは、ＭＥＳＴの活性を変化させる（増加又は減少のいずれでも）薬剤を意味する。好ましくは、ＭＥＳＴ活性は減少される。本発明の文脈において、コントロールと比較して、調節因子と接触されたＭＥＳＴ活性がコントロール（すなわち調節因子／リガンドと接触していないＭＥＳＴ）よりも有意に低い又は高い場合、ＭＥＳＴ活性は調節される、すなわち増加するか又は好ましくは減少する。当業者には、２つの値が互いに有意に異なるか否かを評価する統計学的手順、例えばスチューデントｔ検定又はカイ二乗検定が公知である。さらに、当業者は適切なコントロールを選択する方法を知っている。
【００５８】
コントロールは、意図されない影響（例えばバックグラウンドシグナル）を排除又は最少にすることができるので、試験方法の一部である。対照実験は、特定の系に対する変数の効果を調べるために使用される。対照実験において、一組のサンプルは改変されており（又は改変されたと考えられ）、そして他の組のサンプルは変化を示さないと期待される（ネガティブコントロール）か、又は明確な変化を示すと期待される（ポジティブコントロール）。
【００５９】
好ましい実施態様において、ＭＥＳＴ活性はコントロールの少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、なおより好ましくは少なくとも７５％、そして最も好ましくは少なくとも９０％だけ減少する。
【００６０】
特にハイスループットスクリーニングについて、可能な限り少ない構成要素を含む、非常に容易で着実な検出系を使用することが好ましいかもしれない。本発明の一実施態様において、試験系は構成要素ｉ）〜ｉｖ）及び場合によりＭＥＳＴ活性の潜在的調節因子のみを含み得る。
【００６１】
試験系の構成要素、特に転移させようとするアシル基は、十分な検出又は精製を可能にするための種々の方法で標識され得る。一般的な標識方法が、構成要素の１つ又はそれ以上の官能基を標識するために使用され得る。タンパク質については、これらは例えば、各ポリペプチド鎖のＮ末端及びリジン残基の側鎖に存在する第一級アミノ基；ジスルフィド結合を還元剤で処理することにより、若しくはリジン残基をＳＡＴＡのような試薬で修飾することにより利用可能になったシステイン残基上に存在するスルフヒドリル基；又は通常は抗体のＦｃ領域に存在し、酸化されてカップリングに対して活性なアルデヒド基を生じ得る炭水化物基であり得る。構成要素又はタンパク質は、一連の様々な薬剤、例えばビ
オチン（アビジン−ビオチン化学のため）、酵素、アミン、スルフヒドリル又は他の官能基を標識するための活性化蛍光色素、例えばＦＩＴＣ、フルオレセイン、ローダミン、Ｃｙ色素又はＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｓで標識され得る。放射性標識、例えば3Ｈ、32Ｐ、35Ｓ、125Ｉ又は14Ｃ、さらには一般的な酵素標識、例えばペニシリナーゼ、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼも使用され得る。
【００６２】
本発明の方法に適したいずれかの検出方法が使用され得る。適切な方法は試験系及び試験しようとする薬剤の特徴に依存して選択され得る。
【００６３】
例えば、ＭＥＳＴと薬剤との相互作用が測定され得る。試験系が使用され得、それに対して試験系が適合され得る一連の試験は当該分野で公知である。これは不均一系アッセイでも均一系アッセイでもよい。本明細書で使用される不均一系アッセイは、１つ又はそれ以上の洗浄工程を含むアッセイであるが、均一系アッセイではこのような洗浄工程の必要はない。試薬及び化合物は単に混合されて測定されるのみである。
【００６４】
試験方法は連続的アッセイでも非連続的なアッセイでもよい。
【００６５】
連続的アッセイは最も都合が良く、単一のアッセイはさらなる処理を必要としない反応率をもたらす。多くの異なる型の連続的アッセイが存在する。分光測光アッセイにおいて、反応過程に続いて吸光度の変化が測定される。蛍光は分子が１つの波長の光を異なる波長の光を吸収した後に発する場合である。蛍光測定アッセイは、酵素反応を測定するための生成物と基質の蛍光の差異を利用する。これらのアッセイは一般的に分光測光アッセイよりかなり感受性であるが、不純物により生じる干渉及び露光した場合の多くの蛍光化合物の不安定性に悩まされる。熱量測定は、化学反応により放出又は吸収された熱の測定である。多くの反応はいくらかの熱の変化を含み、そしてマイクロ熱量計を使用すればそれほど多くの酵素又は基質を必要としないので、これらのアッセイは非常に一般的である。これらのアッセイは、いずれかの他の方法で測定することが不可能な反応を測定するために使用することができる。化学発光は、化学反応による光の放射である。いくつかの酵素反応は光を生じ、そしてこれを測定して生成物形成を検出することができる。生じた光は写真用フィルムで数日又は数週間にわたって捕捉することができるのでこれらの型のアッセイは非常に敏感であり得るが、反応により放出された全ての光が検出されるわけではないので定量が困難であり得る。
【００６６】
静的光散乱は、溶液中の高分子の重量平均モル質量及び濃度の積を測定する。測定時間にわたって１つ又はそれ以上の化学種の固定された総濃度と仮定して、散乱シグナルは、溶液の重量平均モル質量の直接的尺度であり、これは複合体が形成するか解離するかによって変動する。それ故、この測定は複合体の化学量論、さらには動力学を定量する。タンパク質動力学の光散乱アッセイは、酵素を必要としない非常に一般的な技術である。
【００６７】
非連続的アッセイは、間隔を置いて酵素反応からサンプルを採取する場合であり、生成物産生又は基質消費の量がこれらのサンプルにおいて測定される。放射測定アッセイは、基質への放射能取り込み又は基質からのその放出を測定する。これらのアッセイにおいて最も頻繁に使用される放射性同位体は、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ及び125Ｉである。放射性同位体は基質の単一原子の特異的標識を可能にすることができるので、これらのアッセイは非常に敏感でかつ特異的である。これらは生化学において頻繁に使用され、そしてしばしば、粗製抽出物（細胞をすすいだ場合に生じる酵素の複雑な混合物）において特定の反応を測定する唯一の方法である。クロマトグラフィーアッセイは、クロマトグラフィーにより反応混合物をその構成要素に分離することにより生成物形成を測定する。これは通常高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行われるが、薄層クロマトグラフィーというより単純な技術も使用することができる。このアプローチは大量の材料を必要とし得るが、その感度は、基質／生成物を放射性タグ又は蛍光タグで標識することにより増加され得る。
【００６８】
一実施態様において、アッセイはＳＰＡ（シンチレーション近接アッセイ）、ＦＲＥＴ
（蛍光共鳴エネルギー移動）アッセイ、ＴＲ−ＦＲＥＴ（時間分解蛍光共鳴エネルギー移動）アッセイ又はＦＰ（蛍光偏光）アッセイである。
【００６９】
ＳＰＡ（シンチレーション近接アッセイ）は、生化学スクリーニングに使用される技術の型であり、均一系における広範囲のプロセスの迅速で感受性の高い測定を可能にする。ＳＰＡに含まれるビーズの種類は、微視的サイズであり、ビーズ自体の中に刺激された場合に光を放出するシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）が存在する。刺激は放射標識分子がビーズと相互作用するときに起こる。この相互作用はビーズの光放射を誘発し、これがシンチレーションカウンタを使用して検出され得る。
【００７０】
より詳細には、放射標識分子がビーズに結合するか近接する場合に光の放射が刺激される。しかし、ビーズが放射標識分子と未結合のままである場合、ビーズは光を放射するように刺激されない。これは、ＳＰＡビーズから遠く離れすぎている場合、未結合の放射能から放出されるエネルギーが希釈され過ぎているため、ビーズはシグナルを生じるように刺激されない。
【００７１】
トリチウムはＳＰＡに非常によく適しているため大いに推奨される。これは非常に短い１．５μｍの水中経路長に起因する。従ってβ粒子がシンチラントビーズから１．５μｍという特定の範囲内似ある場合、シンチラントビーズが光を放射するように刺激するために十分なエネルギーが存在する。その距離が１．５μｍより長い場合、β粒子は不十分なエネルギーのためビーズを刺激するために必要な距離を移動することができない。この方法が広範囲の適用に適用されることを可能にする、利用可能なビーズコーティングの取り合わせ、例えば酵素アッセイ及びラジオイムノアッセイがある。
【００７２】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、二つの発色団間での無放射エネルギー移動を表す。その励起状態にある供与体発色団は、無放射長距離双極子−双極子カップリング機構により、近接している（典型的には＜１０ｎｍ）受容体フルオロフォアにエネルギーを移動させることができる。両方の分子が蛍光性であるので、エネルギー移動はしばしば「蛍光共鳴エネルギー移動」と呼ばれるが、エネルギーは実際には蛍光により移動されるのではない。ＦＲＥＴはタンパク質−薬剤相互作用、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−ＤＮＡ相互作用、及びタンパク質コンホメーション変化を検出及び定量するために有用なツールである。タンパク質の薬剤への結合、タンパク質の別のタンパク質への結合又はタンパク質のＤＮＡへの結合をモニタリングするために、分子の一方を供与体で標識し、そして他方を受容体で標識し、そしてこれらのフルオロフォア標識分子を混合する。それらが未結合状態で存在する場合、供与体を励起すると供与体発光が検出される。分子が結合すると、供与体及び受容体は近接し、そして供与体から受容体への分子間ＦＲＥＴのために受容体発光が主に観察される。ＦＲＥＴに適した隣接物（ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ）は当該分野で公知であり、当業者は両方の抗体に適した標識の組み合わせを選択することができるだろう。供与体及び対応する受容体に関して本明細書で使用される「対応する」は、供与体の励起スペクトルとオーバーラップする発光スペクトルを有する受容体蛍光部分を指す。しかし、両方のシグナルは互いに分離可能であるべきである。従って、受容体の発光スペクトルの極大波長は、好ましくは供与体の励起スペクトルの極大波長より少なくとも３０ｎｍ、より好ましくは少なくとも５０ｎｍ、例えば少なくとも８０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ又は少なくとも１５０ｎｍ大きいものであるべきである。
【００７３】
ＦＲＥＴ技術において種々の受容体蛍光部分と共に使用することができる代表的な供与
体蛍光部分としては、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ−フィコエリトリン、９−アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４−アセトアミド−４'−イソチオシアナトスチルベン−２，２'−ジスルホン酸、７−ジエチルアミノ−３−（４'−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン、スクシンイミジル１−ピレンブチラート、及び４−アセトアミド−４'−イソチオシアナトスチルベン−２，２'−ジスルホン酸誘導体が挙げられる。代表的な受容体蛍光部分としては、使用される供与体蛍光部分によるが、ＬＣ−Ｒｅｄ ６１０、ＬＣ−Ｒｅｄ ６４０、ＬＣ−Ｒｅｄ ６７０、ＬＣ−Ｒｅｄ ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンｘイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミン五酢酸又は他のランタニドイオン（ユーロピウム又はテルビウム）のキレートが挙げられる。供与体及び受容体蛍光部分は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｊｕｎｃｔｉｏｎ Ｃｉｔｙ，ＯＲ）又はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手することができる。
【００７４】
あるいは、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）を本発明の試験系に使用してもよい。ＴＲ−ＦＲＥＴはＴＲＦ（時間分解蛍光）とＦＲＥＴ原理とを兼ね備える。この組み合わせは、ＴＲＦの低いバックグラウンドの利点とＦＲＥＴの均一系アッセイ形式とを組み合わせている。ＦＲＥＴは既に上で記載してきたが、ＴＲＦはランタニド又は長い半減期を有する他の供与体の独特の特性を利用する。ＴＲ−ＦＲＥＴに適した供与体としては、とりわけ、ランタニドキレート（クリプテート）及びいくつかの他の金属リガンド錯体が挙げられ、これらはマイクロ秒〜ミリ秒の時間範囲の蛍光半減期を有し得、従って、マイクロ秒〜ミリ秒の計測でエネルギー移動が起こることも可能にする。蛍光ランタニドキレートは、７０年代後半からエネルギー供与体として使用されてきた。一般的に使用されるランタニドとしては、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）及びジスプロシウム（Ｄｙ）が挙げられる。それらの特異的な光物理的及びスペクトル特性のために、ランタニド錯体は、生物学における蛍光適用に関して多くの興味が持たれている。具体的には、それらはより伝統的なフルオロフォアと比較した場合に、大きなストロークスシフト（ｓｔｒｏｋｅ’ｓ ｓｈｉｆｔ）及び非常長い発光半減期（マイクロ秒からミリ秒）を有する。
【００７５】
通常は、有機発色団は受容体として使用される。これらとしてはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）が挙げられる。ＴＲ−ＦＲＥＴ、さらには受容体に関する適切な詳細はＷＯ９８／１５８３０に記載される。
【００７６】
蛍光偏光（ＦＰ）ベースのアッセイは、溶液中の蛍光基質を励起するために偏光を使用するアッセイである。これらの蛍光基質は溶液中で自由で回転しており、放射光は偏光解消される。基質がより大きな分子、すなわちアシル基に結合した場合、その回転速度は大いに減少し、そして放射光は高度に偏光されたままである。
【００７７】
あるいは、質量分析を使用してもよい。用語「質量分析」は、表面上のサンプルから気相イオンを生成するためにイオン化源を使用し、その気相イオンを質量分析計で検出することを指す。用語「レーザー脱離質量分析」は、表面上のサンプルから気相イオンを生成するためのイオン化源としてレーザーを使用し、そしてその気相イオンを質量分析計で検出することを指す。アシル化されたアシル受容体のような生体分子の質量分析の好ましい方法は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析すなわちＭＡＬＤＩである。ＭＡＬＤＩにおいて、検体は典型的にマトリックス物質と混合され、そのマトリックス物質は乾燥させると検体と共に共結晶化する。マトリックス物質はエネルギー源からエネルギーを吸収し、これが別に不安定な生体分子又は検体を断片化する。別の好ましい方法は、表面増強レーザー脱離／イオン化質量分析、すなわちＳＥＬＤＩである。ＳＥＬＤＩに
おいて、検体が付着された表面は、検体捕捉及び／又は脱離において能動的役割を果たす。本発明の文脈において、サンプルは、クロマトグラフィー又は他の化学的処理を受けていてもよい生物学的サンプル及び適切なマトリックス物質を含む。
【００７８】
質量分析において、「見掛けの分子質量」は、検出されたイオンの分子質量（ダルトン）−対−電荷値（ｍ／ｚ）を指す。見掛けの分子質量がどのように誘導されるかは、使用される質量分析計の型に依存する。飛行時間型質量分析計では、見掛けの分子質量は、イオン化から検出までの時間の関数である。用語「シグナル」は、研究中の生体分子により生じるいずれかの応答を指す。例えば、用語シグナルは、質量分析計の検出器に衝突する生体分子により生じた応答を指す。シグナル強度は生体分子の量又は濃度と相関する。シグナルは２つの値により定義される：記載されるように生成される見掛けの分子質量値及び強度値。質量値は、その生体分子の基本的特徴であるが、強度値は対応する見掛けの分子質量値を有する生体分子の一定の量又は濃度に一致する。従って、「シグナル」は生体分子の特性を常に示す。
【００７９】
本発明の好ましい実施態様において、出発物質のアシル受容体及びアシルＣｏＡのうち少なくとも１つは少なくとも１つの検出可能なマーカーで標識され、そしてここで工程ａ）の後でかつ工程ｂ）の前に、標識された出発物質が標識された生成物アシル化アシル受容体から分離される。この分離は、遠心分離、固定化及び液体の除去などのような一般的な分離工程により行われ得る。あるいは、例えば実施例に記載されるような異なる溶媒及び相分離を使用してこれを行ってもよい。好ましい実施態様において、分離は有機相及び水相の使用によるものであり、ここでアシル化アシル受容体は有機相に蓄積し、そして非アシル化アシル受容体は水相に蓄積する。
【００８０】
本発明の方法の別の好ましい実施態様において、ＭＥＳＴの活性は放射能の検出により決定される。適切なマーカー及び方法は本明細書において詳述される。
【００８１】
本発明の方法の好ましい実施態様において、ＭＥＳＴの活性は蛍光を検出することにより決定される。適切なマーカー及び方法は本明細書において詳述される。
【００８２】
本発明の好ましい実施態様において、ＭＥＳＴのアシル転移活性は、アシルグリセロール３−リン酸、特に標識されたアシルグリセロール３−リン酸の量を決定することによる。
【００８３】
試験は不均一系アッセイでも均一系アッセイでもよい。好ましくは、本方法は均一系アッセイである。本明細書で使用される不均一系アッセイは、１つ又はそれ以上の洗浄工程を含むアッセイであり、一方、均一系アッセイでは、このような洗浄工程の必要はない。試薬及び化合物は混合されそして測定されるのみである。
【００８４】
本発明の好ましい実施態様において、ＭＥＳＴのアシル転移活性は、コントロールと比較して減少され、それによりその物質をＭＥＳＴ阻害剤として同定する。
【００８５】
しかし、本発明のさらにより好ましい実施態様において、この方法は、本質的に実施例において詳述されるように行われる。
【００８６】
この方法は、アシル供与体としてアシルＣｏＡを用いる、放射標識されたアシル受容体（例えば放射標識されたグリセロール３−リン酸、特に［3Ｈ］グリセロール３−リン酸）へのアシルのＭＥＳＴ媒介取り込みに基づく。ＭＥＳＴを反応させた後、標識生成物（すなわちアシル化標識アシル受容体）を、有機溶媒を加えることにより未反応の標識アシル受容体から分離する。相分離により、疎水性物質と両親媒性物質は有機溶媒中に蓄積し
、一方で親水性物質は水相に留まる。上で詳述した方法によれば、アシル化標識アシル受容体は有機相に蓄積し、そして未反応の標識アシル受容体はＭＥＳＴの反応が行われた水相に蓄積する。有機溶媒は、シンチレーションカウンタで生成物の量を検出することを可能にするシンチレータを含んでいてもよい。非常に好ましい実施態様において、ＭＥＳＴ活性は、パルミトイルＣｏＡアシル供与体及びアシル受容体としてグリセロール３−リン酸を使用することにより決定され、ここでパルミテートはＭＥＳＴの存在下でアシル供与体からアシル受容体に転移され、ここでグリセロール３−リン酸は標識されており、特に3Ｈで標識される。記載されるアッセイは均一系アッセイであり、容易でかつ迅速なやり方で行うことができ、そしてハイスループットスクリーニングを可能にする。これはグリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼＧＰＡＴ１−４の活性を決定するために使用される公知の方法（Ｈａｌｄａｒ ａｎｄ Ｖａｎｃｕｒａ，１９９２；Ｙｅｔ ｅｔ
ａｌ．，１９９５，Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，２０００、及びＷｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００８）に基づく。
【００８７】
好ましくは、この方法はハイスループットスクリーニングに適合される。この方法において、多数の化合物が無細胞アッセイ又は全細胞アッセイのいずれでも薬剤に対してスクリーニングされる。典型的には、これらのスクリーニングは自動化ロボットステーションベースの技術を使用して９６ウェルプレートで、又は高密度アレイ（「チップ」）形式で行われる。
【００８８】
本発明の試験系は、細胞、特に哺乳動物細胞、特にヒト細胞又は昆虫細胞を含み得る。適切な細胞の例としては、Ｓｆ９細胞（実施例を参照のこと）が挙げられる。細胞は例えば初代細胞でも細胞株でもよい。しかし場合により、ＭＥＳＴ（実施例を参照のこと）又は効果の検出のために必要とされる構成要素を含むように遺伝子改変されたいずれか他の細胞又は細胞株が使用され得る。好ましい実施態様において、（粗製、分画された又は精製された）細胞膜が使用され得る。インタクトな細胞から細胞膜を生成するための例となる方法は実施例に詳述される。
【００８９】
本発明の好ましい方法において、効果は蛍光により決定される。適切な方法は上で詳述されており、そして本明細書において詳述されるように、蛍光マーカー、ＦＲＥＴ、蛍光偏光を含み得る。
【００９０】
本発明の別の好ましい実施態様において、本方法は、ＭＥＳＴ機能不全を含む疾患の予防及び／又は処置のための薬剤をスクリーニングするために使用される。特に本方法は、肥満及び／又は糖尿病、例えばＩＩ型糖尿病を予防及び／又は処置するための薬剤をスクリーニングするために使用される。
【００９１】
本発明によれば、用語「疾患の予防」は、一般的な疾患を発症する危険性を減少させることに関するが、一方、用語「疾患の処置」は、支配的な疾患状態の症状の寛解、疾患の経過の減速などに関する。予防又は予防措置は、最初の段階で傷害、病的状態又は疾患を回避するやり方である。処置又は治癒は、医学的問題が既に開始した後で適用される。処置は健康問題を処置し、そしてその治癒をもたらし得るが、処置はより頻繁には処置が続く間のみ問題を寛解させる。治癒は、病気を完全逆行させるか医学的問題を永久に終わらせる処置の一部である。
【００９２】
本発明のさらなる局面は、ＭＥＳＴリガンド、特にＭＥＳＴ阻害剤の同定のための本発明の試験系の使用に関する。
【００９３】
リガンドは、生体分子（本明細書ではＭＥＳＴ）に結合して複合体を形成することができる物質である。それはイオン性結合、水素結合、疎水性相互作用及びファン・デル・ワ
ールス力のような分子間力によってＭＥＳＴ上の部位に結合する分子である。ドッキング（会合）は通常可逆性である（解離）。実際に、リガンドとその標的分子との間の不可逆的な共有結合は生物系では稀である。ＭＥＳＴのような酵素に結合するリガンドは、その酵素の酵素活性を変更し得る。リガンドには阻害剤及び活性化因子が含まれる。
【００９４】
酵素阻害剤は、酵素に結合してそれらの活性を減少させる分子である。酵素の活性をブロックすることは代謝の不均衡を正し得るので、多くの薬物は酵素阻害剤である。酵素に結合する全ての分子が阻害剤であるわけではなく；酵素活性化因子は酵素に結合してそれらの酵素活性を増加させる。
【００９５】
阻害剤の結合は、基質が酵素の活性部位に入ることを阻止し得、かつ／又は酵素がその反応を触媒することを妨げる。阻害剤の結合は、可逆的又は不可逆的のいずれかである。不可逆的阻害剤は、通常は酵素と反応してそれを化学的に変化させる。これらの阻害剤は酵素活性に必要な鍵となるアミノ酸残基を改変する。対照的に、可逆的阻害剤は、非共有結合で結合し、これらの阻害剤が酵素、酵素−基質複合体、又は両方のいずれに結合するかによって様々な種類の阻害がもたらされる。
【００９６】
選択的リガンドは、非常に限られた型の標的（例えば酵素）に結合する傾向があるが、非選択的リガンドはいくつかの型の標的に結合する。非選択的である薬物は、所望の効果を生じる物に加えていくつかの他の標的（例えば酵素）に結合するため、それらがより有害な影響を有する傾向がある場合、これは薬理学において重要な役割を果たす。
【００９７】
本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬は変化してもよいので、本発明はこれらに限定されない。さらに、本明細書において使用される用語は、特定の実施態様を記載するのみの目的のためであり、本発明の範囲を限定することを意図されない。本明細書及び添付の特許請求において使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別の指示を示していなければ、複数形への言及を含む。同様に、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」及び「包含する（ｅｎｃｏｍｐａｓｓ）」は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきである。
【００９８】
別の定義がなければ、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語並びにいずれの頭字語も、本発明の分野における当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似するか又は等しいいずれの方法及び材料も本発明の実施において使用され得るが、好ましい方法及び材料は本明細書に記載される。
【００９９】
本発明は以下の実施例によりさらに説明されるが、当然のことながら、実施例は単に説明の目的のためのみに含まれるのであり、他に具体的に示されていなければ、本発明の範囲を限定することを意図されない。
【実施例】
【０１００】
方法
グリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼを測定するためのアッセイは、以下の方式に基づく：
グリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性を、アシル供与体としてのパルミトイルＣｏＡ及びアシル受容体としての放射標識［3Ｈ］グリセロール３−リン酸を用いてパルミテートの取り込みとして決定し、放射標識パルミトイルグリセロール３−リン酸を得た。放射性標識生成物パルミトイルグリセロール３−リン酸を、適切なカウンターで放射能を測定するために、有機溶媒に基づいてシンチレーターを加えることにより放射標識基質と分離した。相を分離した後、シンチレーターで飽和している、有機溶媒相中の放射標識のみ（すなわち、疎水性及び両親媒性物質）を放射標識パルミトイルグリセロー
ル３−リン酸として検出した。アシル化されなかった親水性放射標識グリセロールリン酸は水相に留まっており、従ってシンチレーションカウンターで計数されない。水相から有機相への少量の「交差照射（ｃｒｏｓｓ−ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ）」を、コントロールの空試験値（ＭＥＳＴタンパク質を除いて全ての反応構成要素を含有する）を差し引くことにより全てのＭＥＳＴ反応について補正した。
【０１０１】
以下の溶液をアッセイに使用した：
Ａ） 反応溶液：
９５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ＝７．４（ＭＥＲＣＫ、＃１．０８３８２．２５００）、
５ｍＭ ＭｇＣｌ2（ＳＩＧＭＡ、＃１０４−２０）
２．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ、＃Ａ３８０３）
１２５μＭパルミトイルＣｏＡ（ＳＩＧＭＡ、＃Ｐ９７１６）
１８７．５μＭグリセロール３−リン酸（ＳＩＧＭＡ、＃Ｇ７８８６）
１５０ｎＣｉ／ウェル 3Ｈグリセロール３−リン酸（ＡＲＣ、＃ＡＲＴ０２１９）
Ｂ） 均質化緩衝液：
ＴＥＳ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ＝７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２５０ｍＭスクロース）
＋１０μｇ／ｍＬ ロイペプチン（ＢＩＯＭＯＬ、＃１２１３６）
＋１０μｇ／ｍＬ アプロチニン（Ａｐｒｏｔｉｎｉｎｅ）（ＵＳＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、＃１１３８８）
＋１０μｇ／ｍＬ ペプスタチンＡ（ＢＩＯＭＯＬ、＃１７６４０）
＋１００ｍＭ ペファブロック（ＭＥＲＣＫ、＃１．２４８３９．０５００）
Ｃ） 酵素溶液：
所望の濃度（ＢｉｏＲａｄアッセイによるタンパク質含有量の決定）に調整した均質化緩衝液中のヒト組み換えＭＥＳＴタンパク質（以下のとおり）を発現する昆虫細胞の膜
形式：
９６ウェルプレート（ｗａｌｌａｃ ｉｓｏｐｌａｔｅ ＃６００５０４０）
アッセイ設計
１０μｌ酵素溶液を５０μｌ反応溶液と共に２５℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションをＥｐｐｅｎｄｏｒｆサーモミキサーコンフォートでゆっくりと回転させながら（４５０ｍｉｎ−1）行い、ここでプレートの開口部を保護フィルム（Ｗｈａｔｍａｎ Ｕｎｉ Ｓｅａｌ ７７０４−０００９）で密封した。反応を５μｌ ２００ｍＭグリセロール３−リン酸及び２００μｌシンチレーション液（ｂｅｔａ−ｐｌａｔｅ、＃１２０５−４４０、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を加えることにより停止させ、そして上記のように回転下で２５℃にて１５分間インキュベートした。相分離のために回転せず２５℃での少なくとも１２時間のインキュベーションの後、放射能（ｄｐｍ）をシンチレーションカウンタ（Ｗａｌｌａｃ １４５０ ｍｉｃｒｏ ｂｅｔａ）で測定した。
【０１０２】
酵素溶液（Ｓｆ９昆虫細胞の全ての膜）を以下のように製造した：
Ｓｆ９昆虫細胞を遠心分離によりペレット化して、アリコートで（約７〜９ｇ）凍結させた。必要な場合に、ペレット化Ｓｆ９昆虫細胞を素早く３７℃の水浴で解凍してさらなる処理まで氷上で維持した。その後、それらを１０ｍｌ均質化緩衝液及びさらに懸濁液の製造のため０．５ｍＭ ＤＴＴを入れた５０ｍｌガラスホモジナイザーで均質化した。細胞をテフロン（登録商標）−ガラス（ｔｅｆｌｏｎ−ｉｎ−ｇｌａｓｓ）ホモジナイザー（１０ｘ１５００／分、４℃）で均質化した。ホモジネートをＪＡ２５．５遠心分離チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ ＃３６３６４７）に移し、ＤＴＴを加えた１０ｍｌ均質化緩衝液で希釈し、そして遠心分離（５００ｇ、５分ｍ４℃、冷却遠心機 Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｖａｎｔｉ ＪＡ２５ｌ）ペレット化した。上清を超遠心分離チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ ＃３５５６１８）中に移し、そして遠心分離した（１０００００ｇ、６０分、４℃、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａ ＬＥ−８０Ｋ）。上清を完全に除去した。ペレットを２回注意深く均質化緩衝液で洗浄し、次いで均質化緩衝液に再懸濁させた。酵素溶液をアリコートに分けて液体窒素中で凍結させ、−８０℃で貯蔵した。
【０１０３】
ＭＥＳＴコード導入ベクターの構築を以下のように行った：
ＭＥＳＴタンパク質をコードするｍＲＮＡ（Ｔ５７９Ｂ＝アミノ酸２〜３３５及びＴ５８０Ｂ＝アミノ酸１１〜３３５）（２つの異なる開始コドン、Ｓａｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｋａｎｅｋｏ−Ｉｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５を参照のこと）を、視床下部ｃＤＮＡをテンプレートとして使用してＰＣＲによりクローン化した。ＰＣＲプライマーの一方（５’−ＧＡＧＡＧ ＡＡＴＴＣ ＧＡＴＧＧ ＴＧＣＧＣ ＣＧＡＧＡ ＴＣＧＣＴ Ｔ−３' 配列番号２）はインフレームのＡＴＧ−開始コドンを有するＥｃｏＲＩ制限部位をＭＥＳＴ−ｃＤＮＡの５’末端に含む。第二のＰＣＲプライマー（５’−ＧＡＧＡＧ ＣＧＧＣＣ ＧＣＴＣＡ ＧＡＡＧＧ ＡＧＴＴＧ ＡＴＧＡＡ ＧＣ−３'，配列番号３）は、ＴＧＡ終止コドン及びＮｏｔ１制限部位を３’末端に含む。増幅されたＤＮＡを、昆虫細胞発現ベクターｐＶＬ１３９２（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限部位中に（ｉｎｔｉ）クローン化した。クローン化した遺伝子のアイデンティティを直接ＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１０４】
Ｓｆ９昆虫細胞を以下のように製造及び増殖した：
Ｓｆ９細胞培養、サブクローニング、感染などを含む全ての方法は、文献から公知の方法にしたがって行われた（例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓ及びＳｍｉｔｚ，１９８７を参照のこと）。典型的には、３ｘ１０6 Ｓｆ９細胞（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）をＴ２５瓶で無血清培地（Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ，ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）に播種した。細胞の付着後に、培地をＴＭＮ−ＦＨ昆虫培地（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）と置き換えた。組み換えトランスフェクションベクターを、ほぼ１００％の組み換え効率で組み換えバキュロウイルスを産生するために、不活化直線化ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ ＤＮＡ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）とＳｆ９昆虫細胞中でコトランスフェクトした。得られた組み換えウイルスストックを、組み換えタンパク質発現のためにＳｆ９細胞でさらに増幅した。典型的には細胞を３日後に採取した。
【０１０５】
実施例１： ＭＥＳＴのグリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性−量依存性
この実施例は上で詳述したように行った。具体的には、トランスフェクトされていないか又はＭＥＳＴ（Ｔ５７９Ｂ又はＴ５８０Ｂ）若しくはＧＰＡＴ１のいずれかを発現するようにトランスフェクトされた昆虫細胞（ＳＦ９）を製造した。これらの細胞の粗製膜を得、アシル転移活性を検出するために使用した（６０分のインキュベーション時間）。表１に示されるように、ＭＥＳＴ（Ｔ５７９Ｂ又はＴ５８０Ｂ）でトランスフェクトされた昆虫細胞は、ＧＰＡＴ１の活性を上回りさえする有意なアシル転移活性（試験あたりのｄｐｍ）を示した。さらに、活性がタンパク質の量とともに増加するということが示された。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
実施例２： ＭＥＳＴのグリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性−時間経過
本実施例は上で詳述されるように行われた。具体的には、ＭＥＳＴ（Ｔ５７９Ｂ又はＴ５８０Ｂ）を発現するようにトランスフェクトされた昆虫細胞（ＳＦ９）を製造した。これらの細胞の粗製膜を得て、アシル転移活性（試験ごとにｄｐｍで）を検出するために使用した。表２に示されるように、活性は時間（及び粗製膜の量）とともに増加した。
【０１０８】
【表２】
【０１０９】
実施例３： ＭＥＳＴのグリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性：ＮａＣｌ抽出に対する耐性
本実施例は上で詳述されるように行った。具体的には、トランスフェクトされていないか又はＭＥＳＴ（Ｔ５７９Ｂ又はＴ５８０Ｂ）若しくはＧＰＡＴ（ＧＰＡＴ１、−３又は−４）のいずれかを発現するようにトランスフェクトされた昆虫細胞（ＳＦ９）を製造した。粗製膜を調製し（上記を参照のこと）、そして１Ｍ ＮａＣｌと共に１時間４℃でインキュベートした。遠心分離（１００，０００ ｘ ｇ、６０分、４℃）の後、ペレット及び上清フラクションをアシル転移活性を検出するために使用した。表３に示されるよう
に、ＭＥＳＴ（Ｔ５７９Ｂ又はＴ５８０Ｂ）活性（ｄｐｍ／試験）は、上清フラクションではなくペレット化膜と主に関連していた。このことは、ＭＥＳＴ活性が表在性膜タンパク質ではなく全体に起因するということを示す。
【０１１０】
【表３】
【０１１１】
【表４】
【０１１２】
実施例４： エポキシドヒドロラーゼ阻害剤Ａ００３５６４５５６によるＭＥＳＴの部分的阻害、しかし一般的なリパーゼ阻害剤Ｓ９８７６００では阻害されない
この実験は上で詳述されるように行われた。具体的には、ＭＥＳＴ（Ｔ５７９Ｂ）を発現するようにトランスフェクトされた昆虫細胞（ＳＦ９）から粗製膜を製造し、そしてグリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性（ｄｐｍ／試験）についてＡ００３５６４５５６又はＳ９８７６００の存在下で測定した。表４に示されるように、ＭＥＳＴ活性はエポキシドヒドロラーゼ阻害剤、Ａ００３５６４５５６（＝ＡＵＤＡ；Ｄｏｒｒａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．２００５；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｃａｒｒｏｌｌ ｅｔ
ａｌ．２００８）により部分的に阻害されたが、一般的なリパーゼ阻害剤Ｓ９８７６００（Ｐｅｔｒｙ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｂｅｎ Ａｌｉ ｅｔ ａｌ． ２００４及び２００６）では阻害されなかった。
【０１１３】
【表５】
【０１１４】
実施例５： 競合的基質、類似体ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）によるＭＥＳＴの阻害
この実験は上で詳述されるように行われた。具体的には、ＭＥＳＴ（Ｔ５７９Ｂ）又はＧＰＡＴ（ＧＰＡＴ１、−３又は−４）のいずれかを発現するようにトランスフェクトされた昆虫細胞（ＳＦ９）の粗製膜を製造し、そして競合的基質の類似体ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）の存在下で測定した。表５に示されるように、ＭＥＳＴ活性は濃度依存的様式でＤＨＡＰにより阻害された。
【０１１５】
【表６】
【０１１６】
実施例６： Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）又は高温によるＭＥＳＴのグリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性の完全／部分的阻害
この実験は上で詳述されるように行われた。具体的には、トランスフェクトされていない昆虫細胞（ＳＦ９）又はＭＥＳＴ（Ｔ５７９Ｂ）若しくはＧＰＡＴ（ＧＰＡＴ１、−３又は−４）のいずれかを発現するようにトランスフェクトされた昆虫細胞（ＳＦ９）の粗製膜を製造し、そして１ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）の存在下で１時間又は４１℃で１０分間測定した。表６に示されるように、ＭＥＳＴ活性（及び内在性昆虫細胞グリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性）はＮＥＭにより（完全に）阻害され、そして高温で（部分的に）阻害された。
【０１１７】
【表７】
【０１１８】
結果の概要
組み換えで産生されたヒトＭＥＳＴタンパク質（最初の１１個のアミノ酸が異なる、異なる開始コドンを有する２つの変異体）を、可能性のあるグリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性について適切な試験系（放射標識を使用し、そして公知のアシルトランスフェラーゼにより確認された）において試験した。準備した試験系において、両方の変異体が、濃度依存性及び時間依存性であるグリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性を示した。酵素はタンパク質の組換え体発現の後でＳｆ９細胞から誘導された粗製膜に結合したと思われる。さらに、グリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性は、温度に対して敏感であり、さらには不可逆的阻害剤ＮＥＭ及び競合的基質類似体ＤＨＡＰに対しても敏感である。部分的阻害は、エポキシドヒドロラーゼファミリーのメンバーであるＡ００３５６４５５６について可逆的阻害剤を使用して得ることができた（ＩＣ50 約２００μＭ）。
【０１１９】
参考文献
− Ben Ali Y.，Chahinian H.，Petry S.，Muller G.，Carriere F.，
Verger R.，Abousalham A. (2004) Biochemistry 43，9298−9306.
− Ben Ali Y.，Chahinian H.，Petry S.，Muller G.，Lebrun R.,
Verger R.，Carriere F.，Mandrich L.，Rossi M.，Manco G.，Sarda L.，Abousalham A.
(2006) Biochemistry 45，14183−14191，2006
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ci. USA 103，19695−19700.
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− Thuresson E.R. (2004) Curr. Opin. Invest. Drugs 5，411−418.
− Wendel A.A.，Lewin T.M.，Coleman R.A. (2008) Biochim. Biophys. Acta doi:10.1016/j.bbalip.2008.10.010.
− Yet S.−F.，Moon Y.K.，Sul H.S. (1995) Biochemistry 34，7303−7310.
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ） 中胚葉特異的転写物相同体タンパク質（ＭＥＳＴ）又はその機能的に活性な変異体、
ii） アシル受容体、
iii） アシル補酵素Ａ（ＣｏＡ）［ここでアシルは０、１、２又は３つの二重結合を有するＣ14〜Ｃ22アシルである］、及び
iv） アシル残基をアシルＣｏＡからアシル受容体に転移させるＭＥＳＴの酵素活性を検出するための手段
を含んでなる、ＭＥＳＴ活性を測定するための試験系。
【請求項２】
ａ） アシルＣｏＡがパルミトイルＣｏＡ若しくはオレオイル−ＣｏＡ、好ましくはパルミトイルＣｏＡであり；かつ／又は
ｂ） アシル受容体がグリセロール３−リン酸若しくはジヒドロキシアセトンリン酸、好ましくはグリセロール３−リン酸である、
請求項１に記載の試験系。
【請求項３】
アシル受容体及び／又はアシルＣｏＡが、少なくとも１つの検出可能なマーカーで標識される、請求項１又は２に記載の試験系。
【請求項４】
マーカーが放射標識、特に3Ｈ、32Ｐ、35Ｓ又は14Ｃ、とりわけ3Ｈである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の試験系。
【請求項５】
マーカーが１つ又はそれ以上の蛍光マーカーである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の試験系。
【請求項６】
ＭＥＳＴのリガンドをスクリーニングする方法であって：
ａ） 請求項１〜５のいずれか１項に記載の試験系を、グリセロール３−リン酸へのアシル転移に資する条件下で作用物質と接触させる工程；
ｂ） ＭＥＳＴのアシル転移活性を決定する工程；及び
ｃ） コントロールと比較してＭＥＳＴの変化したアシル転移活性を検出し、それによりその物質をＭＥＳＴのリガンドと同定する工程；
を含む、上記方法。
【請求項７】
出発物質のアシル受容体及びアシルＣｏＡのうち少なくとも１つは、少なくとも１つの検出可能なマーカーで標識され、そしてここで工程ａ）の後で工程ｂ）の前に、標識された出発物質が標識された生成物アシル化アシル受容体から分離される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
分離が有機相及び水相の使用によるものである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
活性が放射能を検出することにより決定される、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
活性が蛍光を検出することにより決定される、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＭＥＳＴのアシル転移活性の決定が、アシルグリセロール３−リン酸の量を決定することによるものである、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
方法が均一アッセイである、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ＭＥＳＴのアシル転移活性がコントロールと比較して減少し、それによりその物質をＭＥＳＴ阻害剤として同定する、請求項６〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
方法が、肥満及び／又は糖尿病を予防及び／又は処置するための薬剤についてスクリーニングするために使用される、請求項６又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＭＥＳＴリガンド、特にＭＥＳＴ阻害剤の同定のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の試験系の使用。
【請求項１】
ｉ） 中胚葉特異的転写物相同体タンパク質（ＭＥＳＴ）又はその機能的に活性な変異体、
ii） アシル受容体、
iii） アシル補酵素Ａ（ＣｏＡ）［ここでアシルは０、１、２又は３つの二重結合を有するＣ14〜Ｃ22アシルである］、及び
iv） アシル残基をアシルＣｏＡからアシル受容体に転移させるＭＥＳＴの酵素活性を検出するための手段
を含んでなる、ＭＥＳＴ活性を測定するための試験系。
【請求項２】
ａ） アシルＣｏＡがパルミトイルＣｏＡ若しくはオレオイル−ＣｏＡ、好ましくはパルミトイルＣｏＡであり；かつ／又は
ｂ） アシル受容体がグリセロール３−リン酸若しくはジヒドロキシアセトンリン酸、好ましくはグリセロール３−リン酸である、
請求項１に記載の試験系。
【請求項３】
アシル受容体及び／又はアシルＣｏＡが、少なくとも１つの検出可能なマーカーで標識される、請求項１又は２に記載の試験系。
【請求項４】
マーカーが放射標識、特に3Ｈ、32Ｐ、35Ｓ又は14Ｃ、とりわけ3Ｈである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の試験系。
【請求項５】
マーカーが１つ又はそれ以上の蛍光マーカーである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の試験系。
【請求項６】
ＭＥＳＴのリガンドをスクリーニングする方法であって：
ａ） 請求項１〜５のいずれか１項に記載の試験系を、グリセロール３−リン酸へのアシル転移に資する条件下で作用物質と接触させる工程；
ｂ） ＭＥＳＴのアシル転移活性を決定する工程；及び
ｃ） コントロールと比較してＭＥＳＴの変化したアシル転移活性を検出し、それによりその物質をＭＥＳＴのリガンドと同定する工程；
を含む、上記方法。
【請求項７】
出発物質のアシル受容体及びアシルＣｏＡのうち少なくとも１つは、少なくとも１つの検出可能なマーカーで標識され、そしてここで工程ａ）の後で工程ｂ）の前に、標識された出発物質が標識された生成物アシル化アシル受容体から分離される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
分離が有機相及び水相の使用によるものである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
活性が放射能を検出することにより決定される、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
活性が蛍光を検出することにより決定される、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＭＥＳＴのアシル転移活性の決定が、アシルグリセロール３−リン酸の量を決定することによるものである、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
方法が均一アッセイである、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ＭＥＳＴのアシル転移活性がコントロールと比較して減少し、それによりその物質をＭＥＳＴ阻害剤として同定する、請求項６〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
方法が、肥満及び／又は糖尿病を予防及び／又は処置するための薬剤についてスクリーニングするために使用される、請求項６又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＭＥＳＴリガンド、特にＭＥＳＴ阻害剤の同定のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の試験系の使用。
【公表番号】特表２０１２−５３０５０７（Ｐ２０１２−５３０５０７Ａ）
【公表日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１６７７０（Ｐ２０１２−５１６７７０）
【出願日】平成２２年６月２５日（２０１０．６．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５９０８６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４９７８０
【国際公開日】平成２２年１２月２９日（２０１０．１２．２９）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＥＦＬＯＮ
【出願人】（５０４４５６７９８）サノフイ (433)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月２５日（２０１０．６．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５９０８６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４９７８０
【国際公開日】平成２２年１２月２９日（２０１０．１２．２９）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＥＦＬＯＮ
【出願人】（５０４４５６７９８）サノフイ (433)
【Ｆターム（参考）】
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