ＭＴＩ−ＭＭＰ、ｉＦＩＨ、ＦＩＨ−１によるＨＩＦ−１の制御
【課題】本発明は、ＨＩＦ−１活性の促進又は阻害方法及びＨＩＦ−１活性を促進又は阻害する化合物のスクリーニング方法の提供を目的とする。
【解決手段】本発明は、ＦＨＩ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとの相互作用を増強又は低下させて、ＨＩＦ−１αの活性を促進又は阻害する方法、及びＦＨＩ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとの相互作用を増強又は低下させる化合物を検索して、ＨＩＦ−１活性を促進又は阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【解決手段】本発明は、ＦＨＩ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとの相互作用を増強又は低下させて、ＨＩＦ−１αの活性を促進又は阻害する方法、及びＦＨＩ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとの相互作用を増強又は低下させる化合物を検索して、ＨＩＦ−１活性を促進又は阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＦ−１の活性制御に関する。より詳細には、ＦＩＨ−１を介したＨＩＦ−１の活性制御に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＦ−１は、低酸素に応答して解糖系に必要な遺伝子や血管新生、造血に必要な遺伝子の転写を促進する主要な分子である（非特許文献１）。ＨＩＦ−１は、通常酸素分圧下では不安定なαサブユニットと安定的なβサブユニットの２つのサブユニットから構成される。通常酸素分圧下ではＨＩＦ ｐｒｏｌｙｌ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｓ（ＨＰＨｓ）によってＨＩＦ−１αのプロリン残基に水酸化が起こり、続いてＶｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ Ｌｉｎｄａｕ（ＶＨＬ）がん抑制タンパク質が水酸化プロリンを認識して結合し、その結果ＨＩＦ−１αはユビキチン化されプロテアソームで分解される。このようなタンパクの安定性による量的な制御に加えて、ＨＩＦ−１α自身の転写活性という質的な制御も酸素依存的に行われており、ＦＩＨ（ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ＨＩＦ）−１によりＨＩＦ−１αのＣ末端活性化領域（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ （ＣＡＤ））のアスパラギン残基が水酸化されると転写共役因子であるｐ３００／ＣＢＰと相互作用できなくなり、その結果転写活性が抑制されてしまう（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４及び非特許文献５）。つまり、ＨＰＨｓは量的に、ＦＩＨ−１は質的にＨＩＦ−１αを負に制御している。また、ＨＰＨｓとＦＩＨ−１の酸素分子に対するＫｍ値が異なることから、それぞれの酸素濃度においてＨＩＦ−１αの活性が最適に調整されると考えられている。
【０００３】
ところで、多くの炎症性疾患や癌などの病理的状況では低酸素状態になっていることが多く（非特許文献６、非特許文献７及び非特許文献８）、そのような状況下でも、骨髄球系の細胞及び癌細胞は多くの機能を発揮する必要があり（例えば、細胞運動、種々の遺伝子発現など）、低酸素状況に速やかに適応する必要がある。このような低酸素状況において重要な役割を果たしていると考えられている因子の１つが、ＨＩＦ−１αであり、ＨＩＦ−１αが通常酸素分圧下における骨髄球系細胞の嫌気的解糖系を介したＡＴＰ産生に重要な役割を果たしていることや、癌細胞においても嫌気的解糖系や血管新生に重要な役割を果たしていることが知られている（非特許文献９）。
このような状況において、近年、ＨＩＦ−１の活性抑制による炎症性疾患あるいは癌などの発症及び進行を抑制の可能性について検討が進められている。例えば、ＨＩＦ−１の阻害因子であるＦＩＨ−１の結晶構造に基づいて、ＦＩＨ−１の機能的類似体又はＦＩＨ−１結合因子を検索する方法が開示されいる（特許文献１）。しかしながら、実際に臨床応用可能な機能的類似体又はＦＩＨ−１結合因子は、現在のところ報告されていない。
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｅｍｅｎｚａら，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３；１６７−１７１，２００１
【非特許文献２】Ｋａｓｐｅｒら，ＥＭＢＯ Ｊ ２４；３８４６−３８５８，２００５
【非特許文献３】Ｌａｎｄｏら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １６；１４６６−１４７１，２００２ａ
【非特許文献４】Ｍａｈｏｎら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １５；２６７５−２６８６，２００１
【非特許文献５】Ａｒａｎｙら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９３；１２９６９−１２９７３，１９９６
【非特許文献６】Ｇａｔｅｎｂｙ及びＧｉｌｌｉｅｓ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ４；８９１−８９９，２００４
【非特許文献７】Ｍａｐｐら，Ｂｒ Ｍｅｄ Ｂｕｌｌ ５１；４１９−４３６，１９９５
【非特許文献８】Ｍｅｈｅｎｄａｌｅら，ＦＡＳＥＢ Ｊ ８；１２８５−１２９５，１９９４
【非特許文献９】Ｓｅｍｅｎｚａら，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ３；７２１−７３２，２００３
【特許文献１】ＷＯ２００４／０３５８１２号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＨＩＦ−１αの活性を低下させる方法の提供を目的とする。
また、本発明は、ＨＩＦ−１αの活性を低下させる化合物のスクリーニング方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究を進めた結果、ｉＦＩＨがＭＴ１−ＭＭＰによるＨＩＦ−１αの活性化に必須であること、及びＦＩＨ−１とＭＴ１−ＭＭＰの細胞内ペプチド（以下、ＣＰと称する）及び／又はＦＩＨ−１とｉＦＩＨ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＦＩＨ−１）の相互作用がＨＩＦ−１αの活性化に重要であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
ここで「ＭＴ１−ＭＭＰ」は、膜型のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）に分類される膜タンパク質のことで、プロテアーゼ活性に必要な酵素活性ドメイン（ＣＡＴ）、基質と結合し基質の選択性を担うヘモペキシン様ドメイン（ＨＰＸ）からなる細胞外領域、膜貫領域、２０アミノ酸からなる短い細胞内領域（ＣＰ）の各領域によって構成される。ＭＴ１−ＭＭＰは、単球／マクロファージには発現していることが報告されており、細胞運動に重要な役割を果たしていると考えられている
また「ｉＦＩＨ」は、これまでにＡＰＢＡ３／Ｍｉｎｔ３として知られていた機能未知の因子と同一であるが、ＭＴ１−ＭＭＰのＣＰ領域と相互作用し、ＨＩＦ−１活性制御に重要な役割を果たしていることに関して、本発明者らにより初めて明らかにされた。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１１）に関する。
（１）本発明の第１の態様は、「細胞内のｉＦＩＨタンパク質とＦＩＨ−１タンパク質との相互作用を増強又は低下させて、ＨＩＦ−１αの活性を促進又は阻害する方法」である。
（２）本発明の第２の態様は、「前記ＦＩＨ−１タンパク質がＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰと相互作用している上記（１）に記載の方法」である。
（３）本発明の第３の態様は、「ＲＮＡｉ法によりｉＦＩＨ−１タンパク質の発現を低下させて、ｉＦＩＨタンパク質とＦＩＨ−１との相互作用を低下させる上記（１）に記載の方法」である。
（４）本発明の第４の態様は、「細胞内のＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとＦＩＨ−１タンパク質との相互作用を増強又は低下させて、ＨＩＦ−１αの活性を促進又は阻害する方法」である。
（５）本発明の第５の態様は、「前記ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとＦＩＨ−１タンパク質との相互作用の低下が、配列番号１２で表されるアミノ酸配列で表されるペプチド、又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、ＦＩＨ−１タンパク質と相互作用を行い、かつ、ＦＩＨ−１タンパク質によるＨＩＦ−１αの活性化を阻害しないペプチドによる競合で達成される上記（４）に記載の方法」である。
（６）本発明の第６の態様は、「前記細胞が免疫系の細胞又は腫瘍細胞である上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の方法」である。
（７）本発明の第７の態様は、「ＨＩＦ−１活性を促進又は阻害する化合物をスクリーニング方法であって、
（ａ）被検試料の存在下において、ＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとを接触させる工程、
（ｂ）ＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとの相互作用を検出する工程、及び
（ｃ）被検試料の非存在下において相互作用を検出した場合と比較して、該相互作用が増強又は低下した場合に該被検試料中に該化合物候補が存在すると判断する工程、
を含む方法」である。
（８）本発明の第８の態様は、「ＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとの相互作用をＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとの結合の有無を基準として検出する上記（７）に記載の方法」である。
（９）本発明の第９の態様は、「得られた候補化合物が、細胞内のＨＩＦ−１α活性を促進又は阻害することを確認する工程をさらに含む上記（７）又は（８）に記載の方法」である。
（１０）本発明の第１０の態様は、「上記（７）乃至（９）のいずれかに記載の方法により単離される化合物」である。
（１１）本発明の第１１の態様は、「前記化合物が抗体であることを特徴とする上記（１０）に記載の化合物」である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法を用いると、ＨＩＦ−１αの活性を阻害することができる。
【０００９】
本発明の方法を用いると、ＨＩＦ−１αの活性を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のある実施態様においては、ＦＩＨ−１タンパク質とＭＴ１−ＭＭＰ又はｉＦＩＨタンパク質との相互作用を増強又は低下させる工程が含まれる。
また、本発明の他の実施態様おいては、ＦＩＨ−１タンパク質とＭＴ１−ＭＭＰ又はｉＦＩＨタンパク質との相互作用を増強又は低下させる化合物を検出する工程が含まれる。
従って、以下に、ｉＦＩＨタンパク質、ＭＴ１−ＭＭＰ及びＦＩＨ−１タンパク質並びにこれらをコードする遺伝子の取得方法を説明し、さらに、ＦＩＨ−１タンパク質とＭＴ１−ＭＭＰ又はｉＦＩＨタンパク質との相互作用を増強又は低下させる化合物を検出する工程の説明を行う。
ここで、タンパク質間の相互作用とは、タンパク質同士の結合、構造の変化、修飾、安定性の変化などを含むタンパク質間の作用のことを意味する。
【００１１】
「ｉＦＩＨタンパク質」とは、例えば、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質である。
また、「ＦＩＨ−１タンパク質」とは、例えば、配列番号６又は配列番号７で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質である。
さらに、「ＭＴ１−ＭＭＰ」とは、例えば、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質である。
ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質」とは、「ｉＦＩＨタンパク質」、「ＦＩＨ−１タンパク質」及び「ＭＴ１−ＭＭＰ」に関し、各々、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表わされるアミノ酸配列、配列番号６又は配列番号７で表わされるアミノ酸配列及び配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１で表わされるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、「ｉＦＩＨタンパク質」については、ＦＩＨ−１タンパク質との結合能を有し、「ＦＩＨ−１タンパク質」については、ＨＩＦ−１αの活性を阻害するタンパク質のことである。
あるいは、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表わされるアミノ酸配列、配列番号６又は配列番号７で表わされるアミノ酸配列及び配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１で表わされるアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、「ｉＦＩＨタンパク質」については、ＦＩＨ−１タンパク質との結合能を有し、「ＦＩＨ−１タンパク質」については、ＨＩＦ−１αの活性を阻害するタンパク質のことである。上記アミノ酸の欠失、付加及び置換は、タンパク質をコードする核酸に元々存在した変異であってもよく、また、該核酸を当該技術分野で公知の手法によって改変することによって新たに導入したものであってもよい。該改変は、例えば、特定のアミノ酸残基の置換は、市販のキット（例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｇ（ＴａＫａＲａ社）、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（ＴａＫａＲａ社））等を使用し、Ｇｕｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法により塩基の置換を行なうことによって実施することができる。
【００１２】
「ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ」とは、ＭＴ１−ＭＭＰの細胞内領域（ＣＰ）のことで、例えば、配列番号１２で表されるペプチドと同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなり、ＦＩＨ−１タンパク質との結合能を有するペプチドのことである。
なお、「実質的に同一」の意味は、上記「ｉＦＩＨタンパク質」及び「ＦＩＨ−１タンパク質」の例による。
【００１３】
また、本発明の他の実施態様では、ｉＦＩＨタンパク質、ＦＩＨ−１タンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ（又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ）を細胞外又は細胞内において発現さる工程が含まれるため、これらのタンパク質又はペプチドを発現するための核酸が必要となる。
ヒトのｉＦＩＨタンパク質、ＦＩＨ−１タンパク質及びＭＴ１−ＭＭＰをコードする核酸のヌクレオチド配列は、各々、配列番号１、配列番号５及び配列番号８として知られるヌクレオチド配列からなるＤＮＡのことである。
また、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰをコードする核酸については、例えば、配列番号１２のペプチドをコードする核酸であればいかなる配列であっても使用することができる。
【００１４】
ｉＦＩＨタンパク質をコードする核酸、ＦＩＨ−１をコードする核酸及びＭＴ１−ＭＭＰをコードする核酸は、上記配列番号で表されるヌクレオチド配列に基づいてプローブを作製して、適当なライブラリーを用いて取得することができ、あるいは、該ヌクレオチド配列に基づいて作製したＰＣＲ用のプライマーにより、ＰＣＲ法により取得することもできる。これらの核酸の入手元はヒトの細胞に限定されるものではなく、ヒト以外の哺乳類、例えば、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシなどの細胞又は組織であってもよい。
プローブを用いてハイブリダイゼーション法により核酸を取得する場合、ハイブリダイゼーションの条件としては、当業者の通常の知識に基づいて選択しえる、全ての条件を採用することができる。
一般に、高いストリンジェントな条件でスクリーニングを行うことにより、上記配列番号１、配列番号５及び配列番号８で表される核酸と相同性の高い核酸を取得することができる。
【００１５】
ここで、ストリンジェントな条件とは、当業者によって容易に決定されるハイブリダイゼーション条件のことで、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な実験条件である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補鎖がその融点よりやや低い環境における再アニール能力に依存する。
具体的には、例えば、低ストリンジェントな条件として、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄段階において、３７℃〜４２℃の温度条件下、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で洗浄することなどが上げられる。また、高ストリンジェントな条件として、例えば、洗浄段階において、６５℃、５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で洗浄することなどが挙げられる。
【００１６】
本発明で使用されるタンパク質又はペプチド（限定はしないが、主として、ＭＴ１−ＭＭＰ、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ、ＨＦＩ−１タンパク質、ｉＨＦＩタンパク質、ＨＩＦ−１αなどが含まれる。以下、本発明のタンパク質又はペプチドとする）には、天然に存在するタンパク質のみならず、その断片又は他のペプチド又はタンパク質を融合された形態も含まれる。
ここで、天然のタンパク質と融合されるペプチドとしては、特に限定はされないが、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓタグ、ｃ−ｍｙｃ断片、Ｔ７−タグ、Ｅ−タグなどを挙げることができる。また、融合されるタンパク質としては、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）、ＨＡ（インフルエンザ凝集素）などを挙げることができる。
【００１７】
本発明のタンパク質又はペプチドのリコンビナントは、細胞外及び細胞内において、本発明のタンパク質又はペプチドの活性の変動、又は、本発明のタンパク質又はペプチド間の相互作用の変動を検出するために使用することができる。
本発明のタンパク質又はペプチドのリコンビナントを調製するためには、本発明のタンパク質又はペプチドをコードする核酸（以下、本発明の核酸とする）を組み込んだ発現ベクターを作製する必要がある。このような発現ベクターは、適切なベクターに本発明の核酸を発現可能に連結することにより得ることができる。
ここで使用可能なベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＣＢＤ−Ｃ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０、ＹＩｐ３０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルス、トガウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００１８】
また、使用可能なプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば特に限定されない。
例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター等が挙げられる。
宿主が大腸菌である場合には、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター等が、宿主が枯草菌である場合には、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等が挙げられる。
宿主が酵母である場合には、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が挙げられる。
宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００１９】
本発明の発現ベクターには、プロモーター配列以外にも、選択マーカー、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、ＳＶ４０複製起点（ＳＶ４０ｏｒｉ）などを、適宜連結することができる。
選択マーカーとしては、限定はしないが、ハイグロマイシン耐性マーカー（Ｈｙｇｒ）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ，Ｇ４１８）などが利用可能である。
また、組換えタンパク質の単離・精製を容易にするなどの目的で、本発明のポリペプチドのＮ末端側に適当なシグナル配列を付加してもよい。
宿主が大腸菌である場合にはアルカリホスファターゼシグナル、ＯｍｐＡシグナルなどが利用可能であり、宿主が枯草菌である場合にはα−アミラーゼシグナル配列、ズブチリスシグナル配列などが利用可能であり、宿主が酵母である場合には、α因子シグナル配列、インベルターゼシグナル配列などが利用可能であり、宿主が動物細胞である場合には、例えば、インシュリンシグナル配列、α−インターフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列などが利用可能である。
【００２０】
上述のベクターに対して本発明の核酸を挿入することは、クローニングされたＤＮＡをそのまま、又は所望により制限酵素で消化して、リンカーを付加し、ベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入することにより行うことができる。連結するＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。連結するＤＮＡは、当該ＤＮＡ中にコードされている本発明のポリペプチドが宿主細胞中で発現されるようにベクターに組み込まれることが必要である。
以上の方法により、本発明の核酸含む発現ベクターを構築することができる。
【００２１】
上述のように作製した発現ベクターは、本発明のタンパク質又はペプチドが宿主中に導入する必要がある。ここで、宿主としては、本発明のタンパク質を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（Escherichia coli）等のエシェリシア属、枯草菌（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）等の酵母、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、あるいはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞が挙げられる。
【００２２】
大腸菌へのベクターの導入方法としては、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が利用可能である。酵母への組換えベクターの導入方法としては、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が利用可能である。動物細胞又は動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、カチオン性脂質による方法等が挙げられる。
【００２３】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００２４】
培養は、宿主細胞に適した条件下で行う。例えば、大腸菌を培養する際の培地としては、ＬＢ培地、Ｍ９培地等が好ましい。所望によりプロモーターを効率よく働かせるために、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。大腸菌の場合、培養は通常約１５〜３７℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主が枯草菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。
【００２５】
酵母を培養するための培地としては、ＳＤ培地、ＹＰＤ培地があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が昆虫細胞又は昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、ウシ血清を含むグレース昆虫培地等が挙げられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００２６】
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％のウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地等が用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
また、宿主を動物細胞として形質転換体を調製する方法は、ＨＩＦ−１の機能が関連する疾患に対する遺伝子治療を行うために利用することができる。遺伝子治療の目的で治療対象の細胞において発現させることができる核酸には、限定はしないが、例えば、ｉＦＩＨとＦＩＨ−１との相互作用を阻害する因子（例えば、限定はしないが、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｉＦＩＨと結合するＦＩＨ−１の部分ペプチドなど）、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとＦＩＨ−１との相互作用を阻害する因子（例えば、限定はしないが、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰと結合するＦＩＨ−１の部分ペプチドなど）が含まれる。遺伝子治療の目的で使用されるベクターは、当業者であれば容易に選択することができるが、例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが利用可能である。生体内の細胞への投与はエキソビボ、インビボなどの方法を使用することができる。
【００２７】
本発明のタンパク質又はペプチドのリコンビナントを細胞外で使用する場合には、リコンビナントを発現させた宿主細胞を集め、適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／又は凍結融解などによって細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過により本発明のタンパク質又はペプチドを含む粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に本発明のタンパク質又はペプチドが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清又は抽出液中に含まれる本発明のタンパク質又はペプチドの精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００２８】
本発明には、ｉＦＩＨタンパク質とＦＩＨ−１タンパク質との相互作用を増強又は低下させて、ＨＩＦ−１αの活性を促進又は阻害する方法が含まれる。
ｉＦＩＨタンパク質とＦＩＨ−１タンパク質との相互作用を増強させる方法としては、該相互作用を促進するもの、例えば、ＭＴ１−ＭＭＰ変異体であるＴＭ−ＣＰ（例えば、図１ａを参照のこと）を添加することが挙げられる。
一方、ｉＦＩＨタンパク質とＦＩＨ−１タンパク質との相互作用を低下させる方法としては、ｉＦＩＨの発現を喪失又は低下させ、ＦＩＨ−１との相互作用を喪失又は低下させる方法が含まれる。このような方法には、例えば、ｉＦＩＨに対するアンチセンスヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドなどを目的の細胞内に導入し、ｉＦＩＨの転写を阻害する方法（ＲＮＡｉ法など）などを挙げることができる。アンチセンスヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入は、当業者であれば容易に実施することができ、例えば、細胞内において発現させても、アンチセンスヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを直接細胞内に導入しても、いずれの方法でも実施可能である。また、このようなアンチセンスヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの代わりには、これらの誘導体を使用することもできる。
【００２９】
また、本発明には、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとＦＩＨ−１タンパク質との相互作用を増強又は低下させて、ＨＩＦ−１αの活性を阻害又は促進する方法が含まれる。
ｉＦＩＨタンパク質とＦＩＨ−１タンパク質との相互作用を増強させる方法としては、該相互作用を促進するものを添加することが挙げられる。
一方、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとＦＩＨ−１タンパク質との相互作用を低下させる方法としては、配列番号１２で表されるアミノ酸配列で表されるペプチド、又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、ＦＩＨ−１タンパク質と相互作用を行い、かつ、ＦＩＨ−１タンパク質によるＨＩＦ−１αの活性化を阻害しないペプチドを添加し（又は、該ペプチドを目的の細胞内で発現し）、細胞内におけるＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとＦＩＨ−１タンパク質との相互作用を競合的に阻害する方法などを挙げることができる。
また、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰに変異を導入することができる。変異には、全体を破壊することの他、ＦＩＨ−１タンパク質との相互作用に重要な役割を担っているアミノ酸を置換、欠失させる方法が含まれる。ＦＩＨ−１タンパク質との相互作用に重要なアミノ酸を検索する方法は、当業者により容易に選択することができるが、例えば、アラニンスキャンなどの方法を使用することもできる。例えば、変異を導入するために適したアミノ酸としては、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ（配列番号１２）の第１４番目のアルギニンが好ましい。
【００３０】
また、本発明には、ｉＦＩＨタンパク質とＦＩＨ−１タンパク質との相互作用を増強又は低下させて、ＨＩＦ−１αの活性を促進又は阻害する化合物、並びに、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとＦＩＨ−１タンパク質との相互作用を増強又は低下させて、ＨＩＦ−１αの活性を阻害又は促進する化合物が含まれる。
本発明において、ｉＦＩＨタンパク質とＦＨＩ−１との相互作用、又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとＦＨＩ−１タンパク質との相互作用を喪失又は低下させる化合物には、例えば、ｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰに対する抗体を挙げることもできる。これらの抗体には、例えば、ＦＨＩ−１タンパク質と相互作用するｉＦＩＨタンパク質の部分領域（例えば、Ｎ末端領域）に対する抗体、又はＭＴ１−ＭＭＰの細胞内ペプチド（ＣＰ）に対する抗体などが含まれる。
上記抗体には、例えば、ＦＨＩ−１タンパク質と相互作用するｉＦＩＨタンパク質の部分領域（例えば、Ｎ末端領域）、ＭＴ１−ＭＭＰの細胞内ペプチド（ＣＰ）に対するモノエピトープ特異抗体、ポリエピトープ特異抗体、単一鎖抗体、及びこれらの断片が含まれる。これらの抗体には、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体などが含まれる。
ポリクローナル抗体は、例えば、哺乳類宿主動物に対して、免疫原及びアジュバントの混合物をインジェクトすることにより調製することができる。通常は、免疫原及び／又はアジュバントを宿主動物の皮下又は腹腔内へ複数回インジェクトする。免疫原には本発明のＤＮＡ結合能を保持した可溶性Ｓｐｏ１１タンパク質を使用することができる。アジュバントの例には、完全フロイト及びモノホスホリル脂質Ａ合成−トレハロースジコリノミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）が含まれる。
【００３１】
モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法を用いて調製することができる。
この方法には以下に示す４つの工程が含まれる：（ｉ）宿主動物又は、宿主動物由来のリンパ球を免疫する、（ｉｉ）モノクローナル抗体分泌性（又は潜在的に分泌性）のリンパ球を回収する、（ｉｉｉ）リンパ球を不死化細胞に融合させる、（ｉｖ）所望のモノクローナル抗体を分泌する細胞を選択する。
マウス、ラット、モルモット、ハムスター、又は他の適当な宿主動物が、免疫動物として選択され免疫原がインジェクトされる。或いは、免疫動物から取得したリンパ球をインビトロで免疫化してもよい。ヒト細胞が望ましい場合には、末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）が一般に使用される。しかしながら、他の哺乳類由来の脾臓細胞又はリンパ球がより一般的で好ましい。
【００３２】
免疫後、宿主動物から得られたリンパ球はハイブリドーマ細胞を樹立するために、ポリエチレングリコールなどの融合剤を用いて不死化細胞株と融合する。融合細胞としては、トランスフォーメーションによって不死化されたげっ歯類、ウシ、又はヒトのミエローマ細胞が使用されるか、ラットもしくはマウスのミエローマ細胞株が使用される。細胞融合を行った後、融合しなかったリンパ球及び不死化細胞株の成長又は生存を阻害する一又は複数の基質を含む適切な培地中で細胞を生育させる。通常の技術では、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く親細胞を使用する。この場合、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンがＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻害し、ハイブリドーマの成長を許容する培地（ＨＡＴ培地）に添加される。このようにして得られたハイブリドーマから、所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、該ハイブリドーマが生育する培地から、定法に従い、目的のモノクローナル抗体を取得することができる。
【００３３】
本発明には、ＨＩＦ−１活性を促進又は阻害する化合物をスクリーニング方法であって、
（ａ）被検試料の存在下において、ＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとを接触させる工程、
（ｂ）ＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとの相互作用を検出する工程、及び
（ｃ）被検試料の非存在下において相互作用を検出した場合と比較して、該相互作用が増強又は低下した場合に該被検試料中に該化合物候補が存在すると判断する工程、
を含む方法が含まれる。本実施態様は、ＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質、あるいは、ＦＩＨ−１タンパク質とＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰが相互作用することにより、ＦＩＨ−１タンパク質によるＨＩＦ−１α活性阻害効果が上昇又は低下することに基づいて、これらの相互作用を増強又は低下させる化合物を使用してＨＩＦ−１αの活性を阻害する方法を提供するものである。
【００３４】
このようなスクリーニングはインビトロ又は細胞内の系を用いて実施することができる。細胞内の系を用いる場合には、例えば、ＦＩＨ−１タンパク質とＭＴ１−ＭＭＰ及び／又はｉＦＩＨタンパク質を発現する細胞を被検試料の存在下でインキュベートし、ＨＩＦ−１α活性の変動を検出することにより、スクリーニングを行うことができる。ＨＩＦ−１αの活性の変動は、レポーターアッセイ（例えば、後述の「実施例」の項を参照のこと）により検出することができる。
また、ＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質、あるいは、ＦＩＨ−１タンパク質とＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰが相互作用を低下させる化合物を検出するため、ツーハイブリッドシステム（Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法）を使用してもよい。この場合には、ツーハイブリッド法で得られた候補化合物をさらに、ＨＩＦ−１αの活性の変動を検出する上記細胞の系において再度スクリーニングすることもできる。
【００３５】
本発明のスクリーニングは、例えば、免疫沈降を利用して実施することもできる。被検試料の存在下で、ＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質及び／又はＭＴ１−ＭＭＰ（又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ）とを発現する細胞を調製し、培養後、例えば、細胞抽出物から抗体などを用いてＦＩＨ−１タンパク質を含む複合体を回収し、この複合体内にｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ（又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ）が含まれるかどうかを確認する。ｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ（又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ）の存在の有無は、これらに対する抗体等を使用したイムノブロッティング法などにより確認できる。その結果、ｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ（又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ）の存在が確認されないか、又は被検試料の非存在下において同様な実験を行った場合に比較して、ｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ（又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ）の存在量が有意に減少した場合には、ＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質及、又はＭＴ１−ＭＭＰ（又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ）との相互作用が被検試料により阻害されたものと判断することができる。
その他、免疫沈降法以外の、例えば、抗体カラムなどを利用した免疫的手法によってもスクリーニングを実施することが可能である。
また、本発明のタンパク質又はペプチドを発現する場合に、エピトープタグなどとの融合体として発現させたようなときには、該タグに対する抗体も利用することができる。
【００３６】
さらに、上記免疫的な手法は、細胞を介さずに完全なインビトロの系でも実施可能である。この場合、インビトロにおいて、被検試料の存在下、ＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ（又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ）とをインキュベートし、例えば、ＦＩＨ−１タンパク質に対する抗体（又はタグに対する抗体）でＦＩＨ−１タンパク質を含む複合体をプルダウンなどで回収し、該複合体中のｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ（又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ）の有無を確認する。また、プルダウン法以外にも、抗体カラムを用いることもできる。
【００３７】
本発明の方法によって取得される化合物は（例えば、低分子化合物が以外にも、抗体などの高分子化合物も含まれる）、ＨＩＦ−１αの活性を促進又は阻害することが期待される。従って、これらの化合物は、例えば、虚血性疾患（例えば、梗塞など）での血管新生の促進、又はマクロファージの活性化による免疫療法への利用、あるいは、ＨＩＦ−１αの高活性状態に伴う疾患、障害などの治療に有効であり、生体に対して悪影響を及ぼさない医薬組成物の形態で使用することができる。通常、そのような組成物には、本発明によって取得される化合物の他、薬剤上許容される担体が含まれる。
「薬剤上許容される担体」は、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、アイソトニックに作用して吸着を遅らせる薬剤及びその類似物を含み、薬剤的投与に適するもののことである。該担体及び該担体を希釈するために好ましいものの例には、限定はしないが、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、コラーゲン、ヒト血清アルブミン、有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等などが含まれる。また、リポソーム及び不揮発性油などの非水溶性媒体も用いられる。さらに、本発明の化合物の活性を保護又は促進するような特定の化合物が、該組成物中に包含されていてもよい。
【００３８】
本発明に係る医薬組成物は、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入なども含む）、経皮及び経粘膜への投与を含み、治療上適切な投与経路に適合するように製剤化される。非経口、皮内、又は皮下への適用に使用される溶液又は懸濁液には、限定はしないが、注射用の水などの滅菌的希釈液、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒、ベンジルアルコール又は他のメチルパラベンなどの保存剤、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなどの無痛化剤、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝剤、塩化ナトリウム又はデキストロースなど浸透圧調製のための薬剤を含んでもよい。
ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調製することができる。非経口的標品はアンプル、ガラスもしくはプラスチック製の使い捨てシリンジ又は複数回投与用バイアル中に収納される。
【００３９】
注射に適する医薬組成物には、滅菌された注射可能な溶液又は分散媒を、使用時に調製するための滅菌水溶液（水溶性の）又は分散媒及び滅菌されたパウダーが含まれる。静脈内の投与に関し、適切な担体には生理食塩水、静菌水、又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。注射剤として使用する場合、組成物は滅菌的でなくてはならず、また、シリンジを用いて投与されるために十分な流動性を保持していなくてはならない。該組成物は、調剤及び保存の間、化学変化及び腐食等に対して安定でなくてはならず、細菌及び真菌などの微生物由来のコンタミネーションを防止する必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及び適切な混合物を含む溶媒又は分散媒培地を使用することができる。例えば、レクチンなどのコーティング剤を用い、分散媒においては必要とされる粒子サイズを維持し、界面活性剤を用いることにより適度な流動性が維持される。種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールなどは、微生物のコンタミネーションの防止に対して使用可能である。また、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール及び塩化ナトリウムのような等張性を保つ薬剤が組成物中に含まれてもよい。吸着を遅らせることができる組成物には、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの薬剤が含まれる。
【００４０】
滅菌的な注射可能溶液は、必要な成分を単独で、又は他の成分と組み合わせた後に、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を加え、滅菌することで調製される。一般に、分散媒は、基本的な分散培地及び上述したその他の必要成分を含む滅菌的媒体中に活性化合物を取り込むことにより調製される。滅菌的な注射可能な溶液を調製するための滅菌的パウダーの調製方法には、活性な成分及び滅菌溶液に由来する何れかの所望な成分を含むパウダーを調製する真空乾燥及び凍結乾燥が含まれる。
【００４１】
経口組成物には、不活性な希釈剤又は体内に取り込んでも害を及ぼさない担体が含まれる。経口組成物には、例えば、ゼラチンのカプセル剤に包含されるか、加圧されて錠剤化される。経口的治療のためには、活性化合物は賦形剤と共に取り込まれ、錠剤、トローチ又はカプセル剤の形態で使用される。また、経口組成物は、流動性担体を用いて調製することも可能であり、流動性担体中の該組成物は経口的に適用される。さらに、薬剤的に適合する結合剤、及び／又はアジュバント物質などが包含されてもよい。
錠剤、丸薬、カプセル剤、トローチ及びその類似物は以下の成分又は類似の性質を持つ化合物の何れかを含み得る：微結晶性セルロースのような賦形剤、アラビアゴム、トラガント又はゼラチンなどの結合剤；スターチ又はラクトースなどの、アルギン酸、ＰＲＩＭＯＧＥＬ、又はコーンスターチなどの膨化剤；ステアリン酸マグネシウム又はＳＴＲＲＯＴＥＳなどの潤滑剤；コロイド性シリコン二酸化物などの滑剤；スクロース又はサッカリンなどの甘味剤；又はペパーミント、メチルサリチル酸又はオレンジフレイバーなどの香料添加剤。
【００４２】
本発明の化合物は、植込錠及びマイクロカプセルに封入された送達システムなどの徐放性製剤として、体内から即時に除去されることを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、当業者によって容易に調製することができる。また、リポソームの懸濁液も薬剤的に受容可能な担体として使用することができる。有用なリポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノール（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製される。
【００４３】
本発明の化合物による特定の疾患の予防又は治療において、適切な投与量レベルは、投与される患者の状態、投与方法等に依存するが、当業者であれば、容易に最適化することが可能である。
注射投与の場合は、例えば、一日に患者の体重あたり約０．１μｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましく、一般に一回又は複数回に分けて投与され得るであろう。好ましくは、投与量レベルは、一日に約０．１μｇ／ｋｇから約２５０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは一日に約０．５μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇである。
経口投与の場合は、組成物は、好ましくは１．０から１０００ｍｇの活性成分を含む錠剤の形態で提供され、好ましくは活性成分が１．０，５．０，１０．０，１５．０，２０．０，２５．０，５０．０，７５．０，１００．０，１５０．０，２００．０，２５０．０，３００．０，４００．０，５００．０，６００．０，７５０．０，８００．０，９００．０及び１０００．０ｍｇである。化合物は一日に１〜４回の投与計画で、好ましくは一日に一回又は二回投与される。
【００４４】
医薬組成物又は製剤は、一定の投与量を保障すべく、均一単位投与量により構成されなくてはならない。単位投与量は、患者の治療に有効な一回の投与量を含み、薬剤的に受容可能な担体と共に製剤化された一単位のことである。本発明の単位投与量を決定する場合には、製剤化される化合物の物理的、化学的特徴、期待される治療上の効果、及び該化合物に特有な製剤化における留意事項等により影響を受ける。
【００４５】
本発明の医薬組成物はキットの形態で、容器、パック中に投与の説明書と共に含めることができる。本発明に係る薬剤組成物がキットとして供給される場合、該薬剤組成物のうち異なる構成成分が別々の容器中に包装され、使用直前に混合される。このように構成成分を別々に包装するのは、活性構成成分の機能を失うことなく長期間の貯蔵を可能にするためである。
【００４６】
キット中に含まれる試薬は、構成成分が活性を長期間有効に持続し、容器の材質によって吸着されず、変質を受けないような何れかの種類の容器中に供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性ガスの下において包装されたバッファーを含む。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、又は試薬を保持するために通常用いられる他の何れかの適切な材料などから構成される。他の適切な容器の例には、アンプルなどの類似物質から作られる簡単なボトル、及び内部がアルミニウム又は合金などのホイルで裏打ちされた包装材が含まれる。他の容器には、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ、又はその類似物が含まれる。容器は、皮下用注射針で貫通可能なストッパーを有するボトルなどの無菌のアクセスポートを有する。
【００４７】
また、キットには使用説明書も添付される。当該医薬組成物からな成るキットの使用説明は、紙又は他の材質上に印刷され、及び／又はフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体として供給されてもよい。詳細な使用説明は、キット内に実際に添付されていてもよく、あるいは、キットの製造者又は分配者によって指定され又は電子メール等で通知されるウェブサイトに掲載されていてもよい。
【００４８】
以下に実施例を示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４９】
１．実験材料と実験方法
１−１．プラスミド
マウス ＦＩＨ−１ ｃＤＮＡをマクロファージからＲＴ−ＰＣＲで単離した。また、ヒトＦＩＨ−１及びＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨ ｃＤＮＡは、ＨＥＫ２９３細胞からＲＴ−ＰＣＲで単離した。それぞれのｃＤＮＡは、ｐＥＮＴＲ／Ｄ ＴＯＰＯ ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。 ＦＩＨ−１Ｎ（１−３０２ａａ、配列番号６及び７）、ＡＰＢＡ３−Ｎ／ｉＦＩＨ−Ｎ（１−２１４ａａ、配列番号２、３及び４）及びＡＰＢＡ３−Ｃ／ｉＦＩＨ−Ｃ（２１５−５７５ａａ、配列番号２、３及び４） はそれぞれ単離したｃＤＮＡを基にＰＣＲで作製しｐＥＮＴＲ／Ｄ ＴＯＰＯベクターにクローニングした。Ｍｙｒ−ＡＰＢＡ３−Ｎ／Ｍｙｒ−ｉＦＩＨ−Ｎは、ｖ−ｓｒｃ由来のミリストイル化配列（配列番号１３）（Ｃｒｏｓｓら，１９８４）を開始コドンの前にＰＣＲを用いて挿入し、同様にｐＥＮＴＲ／Ｄ ベクターにクローニングした。マウス及びヒトＭＴ１−ＭＭＰは所属教室で作製されていたＦｕｒｉｎ切断部位の下流にＦＬＡＧタグあるいはＭｙｃタグを挿入したものを使用した。ＭＴ１−ＭＭＰのドメイン欠損変異体（ＣＡＴ（１１２−２８４ａａ）、ＨＰＸ（３１９−５０７ａａ）、ＣＰ（５６２−５８１ａａ）、細胞外領域（１１２−５０７ａａ））、アラニン置換体はＰＣＲを用いて作製し、ｐＥＮＴＲ／Ｄ ＴＯＰＯ ベクターにクローニングした。これらｐＥＮＴＲ／Ｄ ＴＯＰＯベクターにクローニングしたものをＬＲリコンビナーゼを用いてｐｃＤＮＡ３．１、ｐＤＥＳＴ１５、ｐＤＥＳＴ１７、ｐＬｅｎｔｉ６、ｐＡｄベクター（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入して発現ベクターを作製した。
【００５０】
１−２．マウス
ＭＴ１−ＭＭＰ欠損マウス及び野生型マウスは、発明者らによって定法に従って作製されＣ５７ＢＬ／６マウスと１２回戻し交配を行ったヘテロマウスどうしを掛け合わせて作製した。本実験で用いた野生型及びＭＴ１−ＭＭＰ欠損マウスはＳＰＦ環境下で維持され、生後１０−１８日で実験に用いた。
【００５１】
１−３．免疫組織染色
凍結切片を１０μｍの厚さで作製した。４％ パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで５分間固定し、０．０３％ Ｈ２Ｏ２／ＰＢＳで１５分間反応させ内因性のペルオキシダーゼを不活化した。５％ ヤギ血清、３％ ＢＳＡを含むＰＢＳで１時間室温で反応させたのち、抗Ｆ４／８０抗体（ＢＭＡ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）又は抗ＣＤ４５抗体（Ｂｅｃｈｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を４oＣで一晩反応させた。ＰＢＳで洗浄した後、切片をＨｉｓｔｏｆｉｎｅ ＨＲＰ付加抗ラットＩｇＧ抗体（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ）と３０分間反応させ、ＰＢＳで洗浄した後ＤＡＢ溶液で発色させた。
１−４．骨髄由来マクロファージの調整
骨髄由来マクロファージは過去の報告に基づいて行われた（Ｃｅｌａｄａら，１９８４；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，２００２）。マウスの大腿骨、脛骨、及び上腕骨の両端を切断し、ＰＢＳで骨髄細胞を洗いだした。ＰＢＳで３回洗浄した後、骨髄細胞を３０％ Ｌ９２９培養上清と２０％ ＦＢＳを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ， Ｓｉｇｍａ）中で湿潤な環境で５％ ＣＯ２大気中、３７℃で７日間培養し、マクロファージに分化させた。分化させたマクロファージはＬ９２９培養上清を除いた培養液で２４時間培養した後実験に使用した。低酸素実験では分化させたマクロファージを１％ Ｏ２、５％ ＣＯ２大気に設定したＭｏｄｅｌ ９２００インキュベーター（和研薬）で培養して実験に用いた。
【００５２】
１−５．浸潤能及び運動能の解析
マトリゲルに対する浸潤能及びトランスウェルを用いた運動能の解析は過去の報告に基づいて行われた（Ｎｏｎａｋａら，２００５；Ｕｅｄａら，２００３）。８μｍ ポアサイズのトランスウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）をコートしたもの（浸潤能）又はコートしていないもの（運動能）を２４ウェルプレートに装填した。１０ｎｇ／ｍｌのＭＣＰ−１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む ５００μｌのＤＭＥＭを下のチャンバーに入れ、２００μｌの細胞懸濁液（２ｘ１０５ ｃｅｌｌｓ）を上のチャンバーに入れた。細胞を運動能で２時間、浸潤能で６時間それぞれ３７℃で培養した後、下のチャンバーに移動した細胞をギムザ染色液で染色し、細胞を顕微鏡下でカウントした。
１−６．ケモキネシス（ランダム運動）の測定
マクロファージを３５ｍｍガラスディッシュに播種し一晩培養した。１０ｎｇ／ｍｌ のＭＣＰ−１を加え３０分後から、１分ごとに３０分間 Ｌｅｉｃａ ＡＳ ＭＤＷ ｔｉｍｅ−ｌａｐｓｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて細胞の画像を取得した。各時間の細胞の重心の直線移動距離の合計をＩｍａｇｅＪ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＮＩＨ）で解析し細胞の移動距離とした。
【００５３】
１−７．ＡＴＰ濃度の測定
マクロファージのＡＴＰ濃度はＡＴＰ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ ＣＬＳ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて測定した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて試料中のタンパク量を測定し、タンパク量でＡＴＰ量を平均化した。解糖系阻害剤を用いた実験では０．２Ｍ ２−Ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ（ＳＩＧＭＡ）又は超純水を培養液中に加え３時間培養後にＡＴＰを測定した。
【００５４】
１−８．マクロファージ核タンパク中のＨＩＦ−１α及びｐ３００／ＣＢＰの検出
マクロファージの核タンパク質をＮｕｃｌｅａｒ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｋｉｔ（ＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆ）を用いて回収した。ＴｒａｎｓＡＭ ＨＩＦ−１ ｋｉｔ（ＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆ）を用いて１０μｇの核タンパク質を解析した。このキットにはＨＩＦ−１が結合するＨＲＥオリゴヌクレオチドがコーティングされたプレートが含まれている。試料中のＨＩＦ−１の結合は抗ＨＩＦ−１α 抗体を用いて検出した。ｐ３００／ＣＢＰの検出に抗ｐ３００／ＣＢＰ 抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）を使用した。
１−９．レポーターアッセイ
ＨＩＦ−１αの転写活性を解析するためのレポーターアッセイはＬａｎｄｏらの報告を基に改変を加えて行われた（Ｌａｎｄｏら，２００２ｂ）。レポータープラスミドとしてホタルルシフェラーゼ遺伝子の前にｕｐｓｔｒｅａｍ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅを４つ直列に配置し（４ｘＵＡＳ）さらにチミジンキナーゼ（ＴＫ）由来のＴＡＴＡ ｂｏｘを挿入したｐＧＬ３ Ｂａｓｉｃプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）を作製した。ウミシイタケルシフェラーゼを発現するｐＲＬ ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を内部コントロールとして使用した。ＨＥＫ２９３細胞（５ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を２４ウェルプレートに播種し、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて以下の条件でレポータープラスミドを導入した。レポータープラスミド（１００ｎｇ），内部コントロールベクター（１０ｎｇ），Ｇａｌ４ＢＤ−ＣＡＤプラスミド（５０ｎｇ）、ＭＴ１−ＭＭＰ及び変異体、又はＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨ及び変異体発現プラスミド（２００ｎｇ）。ＭＴ１−ＭＭＰとＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨ変異体のＨＩＦ−１αＣＡＤ活性に対する影響を解析する実験ではそれぞれ５０ｎｇずつ遺伝子導入した。遺伝子導入２４時間後にＰＢＳで洗浄した後、ｐａｓｓｉｖｅ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、さらに凍結融解により細胞を破砕した。ライセートのルシフェラーゼ活性はＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＴＤ２０／２０ ルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した。
【００５５】
１−１０．組み換えタンパクの作製
ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＣＰ、ＧＳＴ−ＣＰＲ／Ａ、ＧＳＴ−ＣＰ５、ＧＳＴ−ＣＡＤ、ＧＳＴ−ＦＩＨ−１、ＧＳＴ−ＦＩＨ−１Ｎの作製のため、ＢＬ２１ Ｇｏｌｄ（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ大腸菌株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をｐＤＥＳＴ１５発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で形質転換させ、ＬＢ培地で培養後０．５ｍＭ ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を加えてで３時間、３７oＣで培養した。菌体を遠心で落とした後、ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ ＩＩＩ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を加えた１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／ＰＢＳに懸濁した後超音波破砕を行った。遠心後の上清にグルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を加えて１時間、４℃で反応させた。１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／ＰＢＳで５回洗浄し保存した。
（Ｈｉｓ）６タグ マウスＦＩＨ−１、ＡＰＢＡ３、ＡＰＢＡ３Ｎの作製のため、ＢＬ２１ Ｇｏｌｄ（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ大腸菌株をｐＤＥＳＴ１７発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で形質転換し、ＬＢ培地で培養した後、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを加えて１６時間２０℃で誘導をかけた。菌体をｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ ＩＩＩを加えたＴＢＳに再懸濁し超音波破砕後、上清に１０ｍＭ イミダゾール、 Ｎｉ２＋ 処理したｃｈｅｌａｔｉｏｎ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を加えて１時間、４℃で反応させた。ビーズを５０ｍＭ イミダゾールで５回洗浄した後、結合しているタンパクを５００ｍＭ イミダゾールで溶出し、ＴＢＳで透析した後実験に使用した。
【００５６】
１−１１．ＧＳＴプルダウンアッセイ
グルタチオンセファロース ４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にＧＳＴ融合タンパクを約１０μｇ結合させたものを０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含むｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０）中で３０分間、４℃で混和した。その後、２μｇの（Ｈｉｓ）６−標識ＦＩＨ−１タンパク、０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ペプチド競合実験ではビオチン標識したＣＰペプチドあるいはＣＰの配列をシャッフルしたコントロールペプチド（配列番号１４）（合成はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をビーズに加えた。ローテーターを用いて２時間、４℃で混和した後、ビーズをｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒで４回洗い、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー、βメルカプトエタノールを加えて加熱しタンパクを溶出した。溶出したタンパクをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、抗（Ｈｉｓ）６抗体（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）あるいは抗ＧＳＴ抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ）を用いて検出した。
【００５７】
１−１２．レンチウイルスベクターの作製
レンチウイルスベクターはＶｉｒａＰｏｗｅｒＴＭ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して仕様書に沿って作製した。レンチウイルスの濃縮は過去の報告を基に行った（Ｐｆｅｉｆｅｒら，２０００）。レンチウイルスを含む培養上清を回収し、１，５００ ｇで１０分間遠心した後上清を回収した。０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濾過した後、ウイルス液を７０，０００ ｇで２時間、２１℃で遠心し、上清を除去した。ウイルスを２００μｌのＤＭＥＭで懸濁し、１０倍希釈系列を作製した後、６ウェルプレートに１ｘ１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでまかれたＨｅＬａ細胞に感染させ、４８時間後にブラストサイジンによる薬剤選択を行いウイルス力価を求めた。マクロファージにＭＴ１−ＭＭＰ及び変異体を遺伝子導入する際には、３ ＭＯＩで感染させ、遺伝子の発現を以下の特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲで確認した。
MT1-MMP（センス）；５−ａｔｇｔｃｔｃｃｃｇｃｃｃｃｔｃｇａｃｃ−３’（配列番号１５）
MT1-MMP（アンチセンス）；５’−ａｃａｔｔｇｇｃｃｔｔｇａｔｃｔｃａｇｔ−３’（配列番号１６）
βアクチン（センス）；５’−ｇｃｃａａｃａｃａｇｔｇｃｔｇｔｃｔｇｇ−３’（配列番号１７）
βアクチン（アンチセンス）；５’−ａｔｃｔｇｃｔｇｇａａｇｇｔｇｇａｃａｇ−３’．（配列番号１８）
【００５８】
１−１３．アデノウイルスベクターの作製
ＶｉｒａＰｏｗｅｒＴＭ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてアデノウイルスベクターを作製した。ウイルス力価の測定は説明書の通りに行われ、ウイルス液の１０倍希釈系列作製して２９３Ａ細胞に感染させた後、出来たプラークの数から求めた。
１−１４．イムノブロッティング
細胞を１ｍｌのｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１％ ＮＰ−４０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で融解し、２０，０００ ｇで１５分間、４℃で遠心した。上清を回収しタンパク濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。細胞融解液にＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファーとメルカプトエタノールを加えて加熱した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ゲルからタンパクをＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した後、抗ＭＴ１−ＭＭＰマウス抗体（Ｄａｉｉｃｈｉ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、抗トランスフェリンレセプターマウス抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ｐ３００／ＣＢＰ抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）、抗ｌａｍｉｎＡ／Ｃマウス抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＦＩＨ−１ヤギ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗アクチンマウス抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ 抗体（Ｓｉｇｍａ）、抗Ｍｙｃマウス抗体（Ｒｏｃｈｅ）、抗Ｖ５マウス抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ＡＰＢＡ３ マウス抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と４℃で一晩反応させた。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＨＲＰ付加抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＨＲＰ付加抗ヤギＩｇＧ抗体（ＳＩＧＭＡ）と１時間反応させ、ＰＢＳＴで５回洗浄した後ＥＣＬ ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で発光させバンドを検出した。
【００５９】
１−１５．Ｙｅａｓｔ−Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄスクリーニング
Ｈｙｂｒｉｇｅｎｉｃｓ社の商業サービスを使用し、ＦＩＨ−１をベイトとしてヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーを使用して行われた。
１−１６．ｓｈＲＮＡによる発現抑制実験
使用したｓｈＲＮＡ配列は以下の通りである。
マウスＦＩＨ−１；５’−ｃａｃｃｇｇａｃｃｔｃｇａａｔａｃｃｔｇｃａａｇａｃｇａａｔｃｔｔｇｃａｇｇｔａｔｔｃｇａｇｇｔｃｃｔｔｔｔ−３’（配列番号１９）
ヒトＦＩＨ−１＃１；５’−ｃａｃｃｇｃｔｇａｃｃｇａｃａｃａａａｔｃｔｔｇｔｃｇａａａｃａａｇａｔｔｔｇｔｇｔｃｇｇｔｃａｇｃｔｔｔｔ−３’（配列番号２０）
ヒトＦＩＨ−１＃２；５’−ｃａｃｃｇｇａａｇａｔｔｇｔｃａｔｇｇａｃｔｔｃｔｃｇａａａｇａａｇｔｃｃａｔｇａｃａａｔｃｔｔｃｃｔｔｔｔ−３’（配列番号２１）
マウスＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨ；５’−ｃａｃｃｇｃｃａｇｔｔｃｃｔａｃａｇｇａｇａａｃａｃｇａａｔｇｔｔｃｔｃｃｔｇｔａｇｇａａｃｔｇｇｃ−３’（配列番号２２）
これらの配列をｐＥＮＴＲ／Ｕ６ ＴＯＰＯにクローニングし、ｐＬｅｎｔｉ６ ＢＬＯＣＫｉＴ レンチウイルスベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＬＲリコンビネーションでサブクローニングした。ｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスベクターは上述の通り作製し、ｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスベクターを４０ ＭＯＩで各細胞に導入した。マクロファージは導入後７２時間後に実験に用いた。ＨＥＫ２９３細胞は導入後７２時間後にブラストサイジンによる薬剤選択を１週間続け、その後実験に使用した。
【００６０】
１−１７．ｓｉＲＮＡを用いた発現抑制実験
ｓｉＲＮＡはＢ−ｂｒｉｄｇｅ社によってデザイン、合成されたものを使用した。このｓｉＲＮＡは１遺伝子に対し３種類の異なるｓｉＲＮＡカクテルである。配列は以下の通りである。
ヒトＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨ：
５’−ｇａｕｇｇａａｃｕｕｇａｕｇａｇｕｃａ−３’（配列番号２３）；
５’−ｇｇｇａｇｇｕｇｃａｃｃｕｃｇａｇａａ−３’（配列番号２４）；
５’−ｇｇｕｕｃｕｕｇｇｕｃｃｕｇｕａｕｇａ−３’（配列番号２５）．
コントロールｓｉＲＮＡｓ：
５’−ａｕｃｃｇｃｇｃｇａｕａｇｕａｃｇｕａ−３’（配列番号２６）
５’−ｕｕａｃｇｃｇｕａｇｃｇｕａａｕａｃｇ−３’（配列番号２７）
５’−ｕａｕｕｃｇｃｇｃｇｕａｕａｇｃｇｇｕ−３’（配列番号２８）
ＨＥＫ２９３細胞を１ｘ１０４／ｗｅｌｌで２４ウェルプレートに播種し１０ｎＭ ｓｉＲＮＡ カクテル（３種類のターゲット配列を含む）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて仕様書の通りに導入した。導入後４８時間後にレポーターアッセイを行った。
【００６１】
２．結果
２−１．ＭＴ１−ＭＭＰは細胞内領域（ＣＰ）依存的にＨＩＦ−１αの転写活性を上昇させる。
ＨＩＦ−１αのＣＡＤは、ｐ３００／ＣＢＰとの結合することで転写活性を伝達するので、ＣＡＤの転写活性がＭＴ１−ＭＭＰで制御されるかを検討した。ＣＡＤ自身の転写活性を解析するため、Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合領域とＣＡＤフラグメントを結合させたキメラタンパクを発現するベクターを構築し、ＣＡＤ融合タンパクが結合した際にルシフェラーゼが転写され、ルシフェラーゼの活性を測定する事でＣＡＤの転写活性を測定できるレポーターシステム（Ｌａｎｄｏら，２００２ｂ）を用いた（図１ａ）。ＨＥＫ２９３細胞にレポータープラスミドとＭＴ１−ＭＭＰ発現プラスミドを遺伝子導入すると、ＣＡＤの転写活性がコントロールに比べて約２．３倍に上昇することが明らかとなった（図１ｂ）。さらに、ＨＩＦ−１αのＣＡＤの制御にＭＴ１−ＭＭＰのどのドメインが関与しているかを決定するため、ＭＴ１−ＭＭＰの欠損変異体発現ベクターを導入してレポーターアッセイを行った。その結果、酵素活性ドメイン欠損（ｄＣＡＴ）やヘモペキシン様ドメイン欠損（ｄＨＰＸ）変異体は野生型ＭＴ１−ＭＭＰと同程度にＣＡＤを活性化したが、細胞内領域欠損（ｄＣＰ）変異体ではＣＡＤの活性化は見られなかった（図１ｂ）。また、ＭＴ１−ＭＭＰのＣ末端の膜貫通ドメインからＣＰまでの変異体（ＴＭ−ＣＰ）でもＣＡＤの活性化には十分であった（図１ｂ、ＴＭ−ＣＰ）。
これらの結果からＭＴ１−ＭＭＰが細胞内領域依存的にＨＩＦ−１αのＣＡＤを活性化していることが明らかとなった。さらに、これらのＭＴ１−ＭＭＰ変異体をＭＴ１−ＭＭＰ欠損マクロファージにレンチウイルスベクターに導入したところ、レポーターアッセイの結果と同様にｄＣＰ以外の変異体でＭＴ１−ＭＭＰ欠損マクロファージのＡＴＰ量（図１ｃ）及び細胞運動能（図１ｄ）が回復した。
【００６２】
ＭＴ１−ＭＭＰのＣＰは２０アミノ酸から構成されている（配列番号１２）。そこでどのアミノ酸残基がＣＡＤの制御に必要であるかを解析するため、ＭＴ１−ＭＭＰのＣ末端を４、８、１２、１６、２０アミノ酸ずつ欠損させた変異体を作製した。ＨＥＫ２９３細胞にこれら変異体とレポータープラスミドを遺伝子導入して解析を行った結果、最初の４アミノ酸の欠損（ｄＣＰ１７−２０）はＣＡＤの活性化に影響を及ぼさなかった（図２ａ）。しかし、次の４アミノ酸の欠損（ｄＣＰ１３−２０）から細胞内領域を持たないｄＣＰと同様にＣＡＤの活性化が起こらなかった（図２ａ）。つまり、ＣＰ１３−１６のアミノ酸がＭＴ１−ＭＭＰによるＣＡＤの活性化に重要な役割を果たしていることが考えられた。そこでＣＰ１３−１６の４アミノ酸を全てアラニンに置換した変異体を作製しレポーターアッセイを行った結果、アラニン置換変異体ではＭＴ１−ＭＭＰによるＣＡＤの活性化が起こらなかった（図２ｂ）。さらにＣＰ１３−１６のアミノ酸を一つずつアラニンに置換した変異体を作製し解析をおこなったところ、それぞれのアミノ酸置換体で異なる程度にＣＡＤの活性化能が低下していた。その中でもＣＰ１４のＲ／Ａ置換が最も影響が大きく、ＭＴ１−ＭＭＰのＣＡＤの活性化能がほぼ完全に失われていた（図２ｂ、Ｒ／Ａ）。つまり、ＣＰ１４のアルギニンがＣＡＤの活性化に重要であることが明らかとなった。
【００６３】
２−２．ＦＩＨ−１がＭＴ１−ＭＭＰ依存的なＨＩＦ−１αの制御を仲介する。
ＦＩＨ−１は、現在のところ報告されている唯一のＨＩＦ−１αのＣＡＤの負の調節因子である（Ｌａｎｄｏら，２００２ａ；Ｍａｈｏｎら，２００１）。そこでＨＥＫ２９３細胞でのＭＴ１−ＭＭＰによるＣＡＤの活性化にＦＩＨ−１が関与しているかを検証するため、ｓｈＲＮＡを利用して内因性のＦＩＨ−１の発現量を低下させたＨＥＫ２９３細胞を作製した（図３ａ、ｓｈＦＩＨ−１＃１及び＃２）。ＦＩＨ−１の発現量の低下により、ＨＥＫ２９３でのＣＡＤの活性が約５倍に上昇し（図３ｂ、ｍｏｃｋ）、この状況ではＭＴ１−ＭＭＰによるＣＡＤの活性化は検出されなかった（図３ｂ、ＭＴ１Ｆ，ｄＣＰ）。同様に、野生型及びＭＴ１−ＭＭＰ欠損マクロファージのＦＩＨ−１の発現をｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスベクターを用いて低下させると（図３ｃ）、野生型マクロファージと同程度にまでＭＴ１−ＭＭＰ欠損マクロファージのＡＴＰ量が回復した（図３ｄ）。これらの結果から、ＭＴ１−ＭＭＰがＣＰ依存的にＦＩＨ−１の機能を抑制し、その結果ＨＩＦ−１αの転写活性が上昇していることが示唆された。
続いて、ＭＴ１−ＭＭＰのＣＰとＦＩＨ−１の間に直接的な相互作用があるかを解析するため、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）にＣＰペプチドを結合させた組み替えタンパク（ＧＳＴ−ＣＰ）と（Ｈｉｓ）６標識したＦＩＨ−１を用いたプルダウンアッセイを行った。その結果、ＦＩＨ−１はＧＳＴ−ＣＰと結合したが、ＧＳＴとは結合しなかった（図４ａ）。また、ＧＳＴ−ＣＰとＦＩＨ−１との結合はＣＰペプチドで量依存的に競合され、コントロールペプチドでは競合されなかった（図４ａ、ＣＰ ｐｅｐｔｉｄｅ／ＧＳＴ−ＣＰ；ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｅｐｔｉｄｅ／ＧＳＴ−ＣＰ）。続いて、図２の実験で明らかになったＣＡＤの活性化に重要なＣＰ１４のアルギニンをアラニンに置換したＧＳＴ−ＣＰ（ＧＳＴ−Ｒ／Ａ）とＦＩＨ−１との相互作用をプルダウンアッセイで解析した結果、ＧＳＴ−Ｒ／ＡはＧＳＴ−ＣＰと比べＦＩＨ−１との結合能が著しく低下していた（図４ｂ）。また、Ｒ／Ａ置換したＭＴ１−ＭＭＰ変異体をＭＴ１−ＭＭＰ欠損マクロファージに遺伝子導入したところ、野生型のＭＴ１−ＭＭＰ導入マクロファージではＡＴＰ量の上昇が観察されたが、Ｒ／Ａ変異体を導入してもＡＴＰ産生を上昇させることが出来なかった（図４ｃ）。
以上の結果より、ＦＩＨ−１はＭＴ１−ＭＭＰがＣＰ依存的にＨＩＦ−１αを制御する際のメディエーターであることが明らかとなった。
【００６４】
２−３．ＡＰＢＡ３／Ｍｉｎｔ３はＦＩＨ−１の新規結合因子である。
予備的な実験によりＭＴ１−ＭＭＰのＣＰペプチドは少なくともｉｎ ｖｉｔｒｏでのＦＩＨ−１の機能に影響しなかったことから、ＭＴ１−ＭＭＰが単独で直接ＦＩＨ−１を抑制するのではなく、他の分子の存在を必要とするのではないかという仮説を立て、ｙｅａｓｔ−ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄスクリーニングによりＦＩＨ−１の結合因子を探索した。ｙｅａｓｔ−ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄスクリーニングで得られた候補タンパクとＦＩＨ−１との結合を免疫沈降法で解析した結果、ＡＰＢＡ３／Ｍｉｎｔ−３のみがＦＩＨ−１との安定的な結合を示した（図５ｂ）。ＡＰＢＡ３は、ＡＰＢＡ１のホモログであり、アミロイドベータ前駆タンパクの細胞内領域と結合することが知られている（Ｔａｎａｈａｓｈｉ及びＴａｂｉｒａ，１９９９）。ＡＰＢＡ１、２は、主に神経系で発現しているのに対し、ＡＰＢＡ３は広範な組織での発現が確認されているが（Ｏｋａｍｏｔｏら，２００１；Ｏｋａｍｏｔｏ及びＳｕｄｈｏｆ，１９９８；Ｔａｎａｈａｓｈｉ及びＴａｂｉｒａ，１９９９）、その生物学的な役割については不明である。ＡＰＢＡ３のＣ末端領域はＡＰＢＡ１、２と相同性を持つ１つのＰＴＢドメインと２つのＰＤＺドメインからなるが、Ｎ末端領域は他のＡＰＢＡとは相同性を示さない特有の配列を持つ（図７ａ）。ＡＰＢＡ３はＰＤＺドメインを介してＭＴ５−ＭＭＰの細胞内領域と結合することが報告されている（Ｗａｎｇら，２００４）、ＭＴ１−ＭＭＰの細胞内領域とは明確な結合を示さなかった（図６）。
続いてＦＩＨ−１がＡＰＢＡ３のどの領域と結合するかを解析するため、ＦＬＡＧタグ標識したＡＰＢＡ３のＮ末端、Ｃ末端をそれぞれＭｙｃタグ標識したＦＩＨ−１とＨＥＫ２９３細胞に共発現させて、ライセートを免疫沈降に供した。その結果、ＡＰＢＡ３の全長及びＮ末端ではＦＩＨ−１が共沈降されてきたが、Ｃ末端では共沈降は起こらなかった（図７ｂ）。以上より、ＦＩＨ−１はファミリー間でユニークな領域であるＡＰＢＡ３のＮ末端領域に結合することが明らかとなった。
【００６５】
２−４．ＡＰＢＡ３は、ＦＩＨ−１とＨＩＦ−１αＣＡＤの結合を競合阻害することでＨＩＦ−１αの転写活性を亢進する。
続いてＦＩＨ−１のどの領域がＡＰＢＡ３との結合に必要かをプルダウンアッセイで解析した。ＦＩＨ−１はＣｕｐｉｎ様の構造を持つ酵素活性ドメインとＣ末端側に二量体形成ドメインを有する（図７ａ）。ＦＩＨ−１は、ＨＩＦ−１αとＣ末端側の二量体結合部位で結合し、酵素活性ドメインでＨＩＦ−１αのアスパラギン残基を水酸化する（Ｄａｎｎら，２００２；Ｅｌｋｉｎｓら，２００３；Ｈｅｗｉｔｓｏｎら，２００２；Ｌａｎｃａｓｔｅｒら，２００４）。ＧＳＴ融合ＦＩＨ−１（ＧＳＴ−ＦＩＨ−１）はＨＩＦ−１αのＣＡＤフラグメントと同様にＡＰＢＡ３のＮ末端領域 のフラグメントとも結合した（図７ｃ）。それに対し、Ｃ末端二量体形成ドメインを欠損したＧＳＴ−ＦＩＨ−１（ＧＳＴ−ＦＩＨ−１Ｎ）はＨＩＦ−１αのＣＡＤ、ＡＰＢＡ３のＮ末端領域のどちらとも結合しなかった（図７ｃ）。一方、ＦＩＨ−１のＮ末端側と結合することが知られている Ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ タンパク質（ＶＨＬ）（Ｌｅｅら，２００３）は全長及びＣ末端を欠損したＧＳＴ−ＦＩＨ−１のどちらともと結合が確認された（図７ｃ，ＶＨＬ）。以上の結果より、ＦＩＨ−１のＣ末端の二量体形成ドメインがＡＰＢＡ３及びＨＩＦ−１αＣＡＤとの結合に必要であることが明らかとなった。興味深い事に、ＧＳＴ−ＦＩＨ−１によるＣＡＤフラグメントのプルダウンはＡＰＢＡ３のＮ末端フラグメントによって量依存的に競合阻害がかかったが（図７ｄ）、ＶＨＬではそのような競合阻害は起こらなかった（図７ｅ）。この結果はＨＩＦ−１αＣＡＤとＡＰＢＡ３のＮ末端フラグメントがどちらもＦＩＨ−１との結合に二量体形成ドメインを必要としていることに起因していると考えられた。
【００６６】
ＡＰＢＡ３がＨＩＦ−１αとＦＩＨ−１の結合に競合したので、ＡＰＢＡ３がＨＩＦ−１αの転写活性を抑制するＦＩＨ−１の機能を阻害する可能性が考えられた。そこで、ＨＩＦ−１αの転写活性におけるＡＰＢＡ３の影響をレポーターアッセイを用いて解析した。ＡＰＢＡ３をＨＥＫ２９３細胞に発現させると、ＨＩＦ−１αの活性はコントロール群に比べて劇的に上昇した（図８ａ）。続いてＡＰＢＡ３による ＨＩＦ−１α ＣＡＤの活性化がＦＩＨ−１を介したものかを確認するため、２種類のｓｈＲＮＡ発現ベクターによりＦＩＨ−１の発現を低下させたＨＥＫ２９３細胞を用いてレポーターアッセイを行った（図８ｂ）。その結果、ＦＩＨ−１の発現レベルの減少に従ってコントロール群でのＣＡＤの活性が上昇し、ＡＰＢＡ３を導入した群とほぼ変わらなくなった（図８ａ）。このことからＡＰＢＡ３によるＨＩＦ−１α ＣＡＤの活性化はＦＩＨ−１を介したものであることが明らかとなった。また、ＡＰＢＡ３のどの領域がＨＩＦ−１αＣＡＤの活性化に関係しているかを解析した結果、ＦＩＨ−１と結合するＡＰＢＡ３のＮ末端フラグメントはＨＩＦ−１α ＣＡＤを活性化したが、ＦＩＨ−１と結合しないＣ末端フラグメントはＣＡＤの活性に影響を与えなかった（図８ｃ）。
以上の結果から、ＡＰＢＡ３はＨＩＦ−１αとＦＩＨ−１との結合に競合的に作用し、ＦＩＨ−１によるＨＩＦ−１αの不活性化を阻止しているという考えが支持された。そこでＡＰＢＡ３をその機能に基づいて ”ｉｎｉｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＦＩＨ−１ （ｉＦＩＨ）”と新たに命名した。
【００６７】
２−５．ｉＦＩＨはＭＴ１−ＭＭＰによるＨＩＦ−１αの活性化に必須である。
ＡＰＢＡはＰＤＺドメインを介して膜タンパクの細胞内ドメインに多く見られるＰＤＺ結合配列と結合することで細胞膜に局在することが知られているので（Ｔａｎａｈａｓｈｉ及びＴａｂｉｒａ，１９９９）、ｉＦＩＨはＭＴ１−ＭＭＰによるＦＩＨ−１の抑制のメカニズムを説明する鍵となることが考えられた。そこでＭＴ１−ＭＭＰによるＣＡＤの活性化にｉＦＩＨが必要かどうかを検討した。まず、ＨＥＫ２９３細胞にＭＴ１−ＭＭＰを発現させＨＩＦ−１αの活性が上昇することをレポーターアッセイで確認した（図９ａ）。この過程にｉＦＩＨが関与しているかを解析するため、ｓｉＲＮＡを用いてｉＦＩＨの発現を低下させた（図９ｂ）。ｉＦＩＨの発現減少の影響はコントロール群では明確ではなかったことから、内因性のｉＦＩＨだけではＨＩＦ−１αの活性制御には十分ではないことが示唆された（図９ａ、ｍｏｃｋ）。しかし、ｉＦＩＨの発現減少はＭＴ１−ＭＭＰによるＨＩＦ−１αの活性化をキャンセルした（図９ａ、ＭＴ１Ｆ）。このことからｉＦＩＨはＭＴ１−ＭＭＰによるＨＩＦ−１αＣＡＤの活性化に重要な役割を果たしている事が明らかとなった。しかしながら、ＨＥＫ２９３細胞におけるｉＦＩＨの過剰発現ではＭＴ１−ＭＭＰが無くともＨＩＦ−１αの活性を上昇させるのに対し（図８）、内因性のｉＦＩＨはＨＩＦ−１αの活性にほとんど影響しないという異なった結果が得られた。この原因として発現量の違いが考えられたので、レポーターアッセイを用いてＨＩＦ−１αの活性化におけるｉＦＩＨとＭＴ１−ＭＭＰの関係を低発現量の条件で解析した。
【００６８】
まず、ＭＴ１−ＭＭＰ又はｉＦＩＨ単独ではＨＩＦ−１αの活性をほとんど上昇させない条件を設定した（図１０ａ、ｉＦＩＨ＋ＭＴ１）。この条件で、ｉＦＩＨとＭＴ１−ＭＭＰを共発現させるとＨＩＦ−１α の活性は相乗的に上昇した（図１０ａ、ｉＦＩＨ＋ＭＴ１）。図８ｃで示したように、ｉＦＩＨのＮ末端領域はＦＩＨ−１に結合しＨＩＦ−１αの活性抑制をキャンセルするのに十分である。ところが興味深い事に、ＭＴ１−ＭＭＰはｉＦＩＨ−ＮによるＨＩＦ−１αの活性化には影響を及ぼさなかった（図１０ａ、ｉＦＩＨ−Ｎ＋ＭＴ１）。ｉＦＩＨ−Ｎが欠損しているＣ末端領域は細胞膜への局在に重要であるので（Ｏｋａｍｏｔｏら，２００１）、ｉＦＩＨ−Ｎにミリストイル化シグナル（Ｃｒｏｓｓら，１９８４）を付加し（Ｍｙｒ−ｉＦＩＨ−Ｎ）、細胞膜へ局在できるようにした（図１０ｂ）。するとＭｙｒ−ｉＦＩＨ−ＮはＭＴ１−ＭＭＰと協調的に働いてＣＡＤの活性を上昇させた（図１０ａ、Ｍｙｒ−ｉＦＩＨ−Ｎ）。
以上の結果より、内因性の発現量に近い低発現の条件ではｉＦＩＨ単独ではほとんどＣＡＤを活性化しないがＭＴ１−ＭＭＰが存在することによってＣＡＤを活性化することができること、また、ＭＴ１−ＭＭＰ依存的なｉＦＩＨの制御にはｉＦＩＨが細胞膜に局在することが必要なことが明らかとなった。
【００６９】
前述のマクロファージを用いた実験で、ＭＴ１−ＭＭＰがＦＩＨ−１を抑制することでＡＴＰ産生を促進することを示した（図３）。そこでｉＦＩＨがこのプロセスに関係しているかについて解析した。ｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスベクターを用いてｉＦＩＨの発現量を減少させると、野生型のマクロファージのＡＴＰ量は約５０％程度に低下した（図１１、ＷＴ、ｓｈｉＦＩＨ）。一方、ＭＴ１−ＭＭＰ欠損マクロファージのＡＴＰ量（野生型の約４０％）はｉＦＩＨ−１の発現減少によって影響を受けなかった（図１１、ＭＴ１−／−、ｓｈｉＦＩＨ）。
以上の結果より、ｉＦＩＨはマクロファージにおいてＭＴ１−ＭＭＰによるＡＴＰ産生の制御に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。
【００７０】
２−６．ＭＴ１−ＭＭＰは細胞内領域依存的にｉＦＩＨとＦＩＨ−１との結合を促進する。
これまでの結果から、ｉＦＩＨとＦＩＨ−１との結合がＦＩＨ−１の抑制に重要なこと（図７、８）、ＭＴ１−ＭＭＰによるＦＩＨ−１の抑制にはｉＦＩＨが必要であることが明らかとなった（図１０、１１）。そこで細胞レベルでのＭＴ１−ＭＭＰによるＦＩＨ−１の抑制は、ｉＦＩＨとＦＩＨ−１との結合を促進することによるのではないかと考えられた。この可能性を検証するために、まずＦＬＡＧタグ標識したＦＩＨ−１を安定発現するＨＥＫ２９３細胞を作製し、さらにその細胞にＭｙｃタグ標識したＭＴ１−ＭＭＰ及び細胞内領域を欠損した変異体（ｄＣＰ）を安定発現させた細胞を作製した。セルライセートから抗ＦＬＡＧ抗体ビーズを用いてＦＩＨ−１を免疫沈降し、沈降物中のｉＦＩＨをイムノブロッティングで解析した。その結果、内因性のＦＩＨ−１はどの細胞群でも同程度に共沈降されてきたのに対し、コントロールのＥＧＦＰに比べて、ＭＴ１−ＭＭＰの発現により明確に内因性のｉＦＩＨが共沈降されてきた（図１２）。またこの共沈降の促進にはＭＴ１−ＭＭＰの細胞内領域が重要であった（図１２、ｄＣＰ）。一方、この沈降物中にはＭＴ１−ＭＭＰは検出されなかった。これらの結果により、ＭＴ１−ＭＭＰが細胞内領域依存的にＦＩＨ−１とｉＦＩＨの結合を促進することでＦＩＨ−１の活性を抑制しＨＩＦ−１αを活性化させるというメカニズムが明らかとなった。
【００７１】
参考文献
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【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明は、ＨＩＦ−１の活性を制御する方法及びＨＩＦ−１の活性を制御する化合物のスクリーニング方法を提供する。従って、ＨＩＦ−１が関連する疾患の治療方法及び治療剤の開発に大きく貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、ＨＩＦ−１α ＣＡＤの活性化に必要なＭＴ１−ＭＭＰのドメインの解析結果を示す。（ａ）：上パネル：ＨＩＦ−１αの転写活性をモニターするためのレポーターシステム。ＣＡＤ：ＨＩＦ−１α Ｃ末端転写活性ドメイン：Ｇａｌ４ＢＤ、Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン：ＵＡＳ、Ｇａｌ４結合サイト；ＴＡＴＡ、チミジンキナーゼミニマルプロモーター。下パネル：ＭＴ１−ＭＭＰ 欠損変異体コンストラクト。ＳＰ、シグナルペプチド；Ｐｒｏ、プロペプチド；ＣＡＴ、酵素活性ドメイン；ＨＰＸ、ヘモペキシン様ドメイン；ＴＭ，膜貫通ドメイン；ＣＰ、細胞内領域。ＦＬＡＧタグをＰｒｏとＣＡＴの間に挿入した。ＳＰとＰｒｏは細胞膜へ輸送される途中で切り離される。 （ｂ）：上パネル：ＨＥＫ２９３細胞でのＭＴ１−ＭＭＰコンストラクトのＨＩＦ−１α ＣＡＤレポーター活性における効果。下パネル：ＭＴ１−ＭＭＰコンストラクトの発現をイムノブロッティングで確認した。（ｃ、ｄ）：ＭＴ１−ＭＭＰ欠損変異体をＭＴ１−／− マクロファージに導入した際のＡＴＰ量（ｃ）及び運動能（ｄ）に対する影響の解析。ＭＴ１−／−マクロファージにレンチウイルスベクターでＭＴ１−ＭＭＰ欠損変異体発現遺伝子を導入し、ＭＴ１−ＭＭＰ変異体の発現をＲＴ−ＰＣＲで確認した（ｃ、下パネル）。ＡＴＰ量を遺伝子導入７２時間後に測定した（ｃ、上パネル）。運動能は、マトリゲルをコートしていないトランスウェル上に細胞を撒き２時間後に下のチャンバーに移動した細胞をカウントした（ｄ）。（ｂ−ｄ）データは平均値±標準偏差で示し、スチューデントｔ検定で解析した。＊ｐ＜ ０．０５、＊＊ｐ ＜ ０．０１。
【図２】図２はＭＴ１−ＭＭＰ細胞内領域変異体のＨＩＦ−１α ＣＡＤの活性化能の解析結果を示す。（ａ、ｂ）：ＭＴ１−ＭＭＰの細胞内領域（ＣＰ）変異体のＣＡＤ活性化能の解析。ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ連続欠損変異体（ａ）及びＣＰ１３−１６のアラニン置換変異体（ｂ）のＣＡＤレポーターに対する影響を解析した。コンストラクトを左側のパネルに、ＣＡＤレポーターに対する影響を右のパネルに表示した。各変異体の発現をイムノブロッティングで確認した（下パネル）。データは平均値±標準偏差で示し、スチューデントｔ検定で解析した。＊ｐ＜ ０．０５、＊＊ｐ ＜ ０．０１。
【図３】図３は、ＭＴ１−ＭＭＰによるＨＩＦ−１αの転写活性の上昇はＦＩＨ−１を介したものであることを示す。（ａ）：ＨＥＫ２９３細胞におけるＦＩＨ−１の発現抑制。２つの異なるｓｈＲＮＡ（＃１及び＃２配列）を発現させ、ＦＩＨ−１の発現量をイムノブロティングで解析した。（ｂ）：ＣＡＤレポーター活性におけるｓｈＲＮＡの影響。（ｃ）：ＷＴ及びＭＴ１−／−マクロファージにおけるＦＩＨ−１の発現抑制。マクロファージにレンチウイルスベクターを用いてｓｈＲＮＡを発現させ、ＦＩＨ−１のｍＲＮＡ量をリアルタイムＰＣＲで解析した。（ｄ）：ＷＴ及びＭＴ１−／−マクロファージのＡＴＰ量におけるＦＩＨ−１の発現抑制の影響。ＦＩＨ−１の発現量を減少させることにより、ＷＴ及びＭＴ１−／−マクロファージのＡＴＰ量に変化が無くなった。（ｂ，ｄ）データは平均値±標準偏差で示し、スチューデントｔ検定で解析した。＊＊ｐ ＜ ０．０１。
【図４】図４は、ＭＴ１−ＭＭＰの細胞内領域がＦＩＨ−１に直接結合することを示す。（ａ）：ＭＴ１−ＭＭＰの細胞内領域（ＣＰ）とＦＩＨ−１との直接的結合の解析。Ｉｎインビトロ プルダウンアッセイをＧＳＴ−ＣＰ融合タンパク及び（Ｈｉｓ）６標識したＦＩＨ−１タンパクを用いて行った。ＣＰに結合したＦＩＨ−１をイムノブロッティン（ＩＢ）で検出した。ＦＩＨ−１とＧＳＴ−ＣＰとの結合はＣＰペプチドで競合されたがコントロールペプチドでは競合されなかった。（ｂ）：ＣＰ１４でのＲ／Ａ置換のＣＰ−ＦＩＨ−１結合に対する影響をプルダウンアッセイを用いて解析した。（ｃ）Ｒ／Ａ置換ＭＴ１−ＭＭＰをＭＴ１−／−マクロファージに導入した際のＡＴＰ量に対する影響。マクロファージに図中に示したコンストラクトをレンチウイルスベクターを用いて遺伝子導入した。上パネル：ＲＴ−ＰＣＲによるＭＴ１−／−マクロファージにおけるＭＴ１−ＭＭＰｍＲＮＡの発現の確認。下パネル：ＡＴＰ量。データは平均値±標準偏差で示し、スチューデントｔ検定で解析した。＊ｐ＜ ０．０５。
【図５】図５は、ＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨがＦＩＨ−１と結合することを示す。（ａ）：ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーを用いたＹｅａｓｔ ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄ スクリーニングの後、８つのタンパクをＦＩＨ−１と結合する候補として選んだ。これらのタンパクにＦＬＡＧタグを付加してＨＥＫ２９３細胞に発現させ、Ｍｙｃタグ標識したＦＩＨ−１との結合能を解析した。候補タンパクをセルライセートから抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫沈降（ＩＰ）し（上パネル）、沈降物中の候補タンパクを抗ＦＬＡＧ抗体を用いたイムノブロティング（ＩＢ）で検出した。免疫沈降（ＩＰ）物中のＦＩＨ−１およびセルライセート（ＷＣＬ）中のＦＩＨ−１をイムノブロッティングで検出した（下パネル）。ＦＩＨ−１，ｆａｃｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ＨＩＦ−１；ｍｏｃｋ，ｍｏｃｋ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ；ＡＰＢＡ３，ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｅｍｂｅｒ ３；ＣＣＭ２，ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃａｖｅｒｎｏｕｓ ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ ２；ＥＨＤ１，ＥＨ−ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １；ＭＣＭ４，ｍｉｎｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ４；ＭＲＰＬ３８，ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ３８；ＮＦＫＢＩＡ，ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ｋａｐｐａ ｌｉｇｈｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｇｅｎｅ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｉｎＢ−ｃｅｌｌｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｌｐｈａ；ＰＡＦＡＨ１Ｂ２，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｐｌａｔｅｌｅｔ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ａｃｅｔｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ Ｉｂ ｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ ３０ｋＤａ；ＳＨ３ＢＬＧ１，ＳＨ３−ｄｏｍａｉｎ ＧＲＢ２−ｌｉｋｅ ｅｎｄｏｐｈｉｌｉｎ Ｂ１．ＦＩＨ−１はＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨとのみ共沈降した。（ｂ）：Ｖ５タグ標識した ＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨ とＦＬＡＧタグ標識したＦＩＨ−１をＨＥＫ２９３細胞に発現させた。免疫沈降（ＩＰ）を上述の通りに行い、イムノブロッティング（ＩＢ）を図中に示した抗体を用いて行った。ＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨはＦＩＨ−１と共沈降した。
【図６】図６は、ＭＴ１−ＭＭＰおよびＭＴ５−ＭＭＰの細胞内領域のＧＳＴ融合タンパクを用いたＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨのプルダウンアッセイの結果である。 Ｈｉｓ６標識したＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨをＧＳＴ融合タンパク（ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＭＴ１ＣＰ、ＧＳＴ−ＭＴ５ＣＰ、ＧＳＴ−ＦＩＨ−１）付加セファロースビーズを用いてプルダウンアッセイで解析した。ＧＳＴ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、ＧＳＴ−ＭＴ１ＣＰ，ＭＴ１−ＭＭＰ細胞内領域−ＧＳＴ融合タンパク；ＧＳＴ−ＭＴ５ＣＰ，ＭＴ５−ＭＭＰ細胞内領域−ＧＳＴ融合タンパク；ＧＳＴ−ＦＩＨ−１，ＦＩＨ−１−ＧＳＴ融合タンパク。ビーズに結合したＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨを抗Ｈｉｓ６抗体を用いてイムノブロッティングで検出した（上パネル）。ビーズに付加したＧＳＴタンパクを抗ＧＳＴ抗体で検出した。ＧＳＴ−ＦＩＨ−１がＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨと最もよく結合し、ＧＳＴ−ＭＴ５ＣＰがそれより少なく結合した。この実験条件ではＧＳＴ−ＭＴ１ＣＰとＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨとの結合は検出できなかった。
【図７】図７は、ＡＰＢＡ３とＨＩＦ−１αがＦＩＨ−１と競合的に結合することを示す。（ａ）：ＡＰＢＡ３および各フラグメントの構造：全長（ｆｕｌｌ）、Ｎ末端（Ｎ）及びＣ末端（Ｃ）領域（上パネル）。Ｎ末端領域（Ｎ）には既知のドメイン構造は含まれない。Ｃ末端領域（Ｃ）にはＰＴＢドメイン１つとＰＤＺドメイン２つが含まれる。図中に示した数字はアミノ酸番号を表す。ＦＩＨ−１およびＮ末端フラグメントの構造（下パネル）：ＣＵＰＩＮ；酵素活性を担うｃｕｐｉｎ様ドメイン、黒ボックス；二量体化ドメイン；ＦＩＨ−１Ｎ，Ｎ末端フラグメント。（ｂ）：Ｉｎ Ｍｙｃタグ標識したＦＩＨ−１とＦＬＡＧタグ標識したＡＰＢＡ３の全長（ｆｕｌｌ）、Ｎ末端フラグメント（Ｎ）又はＣ末端フラグメント（Ｃ）をＨＥＫ２９３細胞に発現させた。ＦＬＡＧタグ標識したタンパクを免疫沈降（ＩＰ）し抗ＦＬＡＧ抗体を用いてイムノブロット（ＩＢ）により検出した（上パネル）。沈降物（ＩＰ）およびセルライセート（ＷＣＬ）中のＦＩＨ−１を抗Ｍｙｃ抗体を用いてイムノブロティング（ＩＢ）で検出した（下パネル）。（ｃ）：ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＦＩＨ−１、ＧＳＴ−ＦＩＨ−１Ｎを付加したビーズを用いたプルダウンアッセイ。イムノブロティングによりＨｉｓ６タグ標識したＡＰＢＡ３Ｎフラグメント、ＨＩＦ−１α ＣＡＤ、又はＶＨＬを検出した。（ｄ）：ＧＳＴ−ＦＩＨ−１を付加したビーズを用いてＨｉｓ６タグ標識したＨＩＦ−１αＣＡＤのプルダウンアッセイを図中に示した量のＨｉｓ６標識ＡＰＢＡ３Ｎフラグメント存在下で行った。（ｅ）：ＧＳＴ−ＦＩＨ−１を付加したビーズを用いてＨｉｓ６タグ標識したＶＨＬタンパクのプルダウンアッセイを図中に示した量のＨｉｓ６標識ＡＰＢＡ３Ｎフラグメント存在下で行った。
【図８】図８は、ＡＰＢＡ３がＦＩＨ−１のＨＩＦ−１αに対する転写活性抑制機能を阻害することを示す。（ａ）：ＨＥＫ２９３にＡＰＢＡ３発現コンストラクト（ＡＰＢＡ３、白ボックス）又はコントロールベクター（ｍｏｃｋ、黒ボックス）を遺伝子導入し、相対的ルシフェラーゼ活性を測定した。内因性のＦＩＨ−１の発現をｓｈＲＮＡ配列ｓｈＦＩＨ＃１及びｓｈＦＩＨ＃２を用いて抑制した。ネガティブコントロールとしてβガラクトシダーゼをコードする遺伝子（ＬａｃＺ）に対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＬａｃＺ）を使用した。ＭｏｃｋベクターおよびｓｈＬａｃＺを導入した細胞を１００％とした相対的ルシフェラーゼ活性を示した。（ｂ）：ｓｈＬａｃＺ、ｓｈＦＩＨ＃１、ｓｈＦＩＨ＃２発現ＨＥＫ２９３細胞のＦＩＨ−１の発現をイムノブロッティングで解析した。（ｃ）：ルシフェラーゼの発現を用いてＡＰＢＡ３全長、Ｎ末端、Ｃ末端フラグメントのＨＩＦ−１α ＣＡＤ の転写活性に対する影響を測定した。コントロールベクターを遺伝子導入した細胞を１００％とした相対的ルシフェラーゼ活性を示した。データは平均値±標準偏差（ｎ＝３）で示し、スチューデントｔ検定で解析した。＊＊ｐ ＜ ０．０１。
【図９】図９は、ｉＦＩＨ／ＡＰＢＡ３がＭＴ１−ＭＭＰによるＦＩＨ−１の抑制に必要であることを示す。（ａ）：ｉＦＩＨに対するｓｉＲＮＡ（ｉＦＩＨｓｉＲＮＡ；オープンボックス）又はコントロール用のｓｉＲＮＡ（ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ；黒ボックス）をＨＥＫ２９３細胞に導入した後にＭＴ１−ＭＭＰ（ＭＴ１Ｆ）又はコントロールベクター（ｍｏｃｋ）とレポータープラスミドを遺伝子導入した。コントロールｓｉＲＮＡおよびｍｏｃｋ導入細胞のルシフェラーゼ活性を１００％とした相対的ルシフェラーゼ活性を求めた。データは平均値±標準偏差（ｎ＝３）で示し、スチューデントｔ検定で解析した。＊＊ｐ＜ ０．０１。（ｂ）：イムノブロッティングによりｉＦＩＨ、ＭＴ１−ＭＭＰ、ａｃｔｉｎ （ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）を検出した。
【図１０】図１０は、ｉＦＩＨ／ＡＰＢＡ３がＭＴ１−ＭＭＰと協調的に働くには膜への局在が必要であることを示す。（ａ）：ＭＴ１−ＭＭＰ、ｉＦＩＨ，ｉＦＩＨ Ｎ末端フラグメント（ｉＦＩＨ−Ｎ）をＨＥＫ２９３細胞に共発現させた。ＨＩＦ−１αＣＡＤの活性をルシフェラーゼ活性でモニターし、ｍｏｃｋベクターを導入した細胞のルシフェラーゼ活性を１００％とした相対的ルシフェラーゼ活性を示した（上パネル）。ＭＴ１−ＭＭＰ又はｉＦＩＨの発現をイムノブロッティングで確認した（下パネル）。矢印は内因性のｉＦＩＨである。データは平均値±標準偏差（ｎ＝３）で示し、スチューデントｔ検定で解析した。＊＊ｐ＜０．０１。（ｂ）：ＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨ、ＡＰＢＡ３−Ｎ／ｉＦＩＨ−Ｎ及びＭｙｒ−ＡＰＢＡ３−Ｎ ／Ｍｙｒ−ｉＦＩＨ−Ｎの局在。ＦＬＡＧタグ標識したｉＦＩＨ、ｉＦＩＨ−Ｎ及びＭｙｒ−ｉＦＩＨ−ＮをＨＥＫ２９３細胞に発現させた。これらタンパクの細胞内での局在を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて解析した。核をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で対比染色した。ｉＦＩＨ−Ｎに比べ、Ｍｙｒ−ｉＦＩＨ−Ｎは細胞の周辺部により局在している。
【図１１】図１１は、マクロファージにおいてｉＦＩＨがＭＴ１−ＭＭＰによるＡＴＰ産生の促進に必要であることを示す。ｓｈＲＮＡ用いてＷＴ及びＭＴ１−／−マクロファージのｉＦＩＨの発現を抑制した。ＬａｃＺ遺伝子に対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＬａｃＺ）をネガティブコントロールとして用いた。細胞内ＡＴＰ量を測定し（上パネル）、タンパクの発現を図中に示した抗体を用いてイムノブロッティングで確認した（下パネル）。データは平均値±標準偏差（ｎ＝３）で示し、スチューデントｔ検定で解析した。＊＊ｐ ＜ ０．０１。
【図１２】図１２は、ＭＴ１−ＭＭＰが細胞内領域依存的にＦＩＨ−１とｉＦＩＨとの結合を促進することを示す。ＨＥＫ２９３細胞にＦＬＡＧタグ標識したＦＩＨ−１と、ネガティブコントロール（ＥＧＦＰ）、ＭＴ１−ＭＭＰ（ＭＴ１）、又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ欠損変異体（ｄＣＰ）を共発現させた。セルライセート（ＷＣＬ）および抗ＦＬＡＧ抗体免疫沈降物（ＩＰ）を図中に示した抗体を用いてイムノブロッティングで解析した。内因性のＦＩＨ−１（矢印）がＦＬＡＧ標識したＦＩＨ−１とホモ二量体を形成しているのが観察される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＦ−１の活性制御に関する。より詳細には、ＦＩＨ−１を介したＨＩＦ−１の活性制御に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＦ−１は、低酸素に応答して解糖系に必要な遺伝子や血管新生、造血に必要な遺伝子の転写を促進する主要な分子である（非特許文献１）。ＨＩＦ−１は、通常酸素分圧下では不安定なαサブユニットと安定的なβサブユニットの２つのサブユニットから構成される。通常酸素分圧下ではＨＩＦ ｐｒｏｌｙｌ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｓ（ＨＰＨｓ）によってＨＩＦ−１αのプロリン残基に水酸化が起こり、続いてＶｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ Ｌｉｎｄａｕ（ＶＨＬ）がん抑制タンパク質が水酸化プロリンを認識して結合し、その結果ＨＩＦ−１αはユビキチン化されプロテアソームで分解される。このようなタンパクの安定性による量的な制御に加えて、ＨＩＦ−１α自身の転写活性という質的な制御も酸素依存的に行われており、ＦＩＨ（ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ＨＩＦ）−１によりＨＩＦ−１αのＣ末端活性化領域（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ （ＣＡＤ））のアスパラギン残基が水酸化されると転写共役因子であるｐ３００／ＣＢＰと相互作用できなくなり、その結果転写活性が抑制されてしまう（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４及び非特許文献５）。つまり、ＨＰＨｓは量的に、ＦＩＨ−１は質的にＨＩＦ−１αを負に制御している。また、ＨＰＨｓとＦＩＨ−１の酸素分子に対するＫｍ値が異なることから、それぞれの酸素濃度においてＨＩＦ−１αの活性が最適に調整されると考えられている。
【０００３】
ところで、多くの炎症性疾患や癌などの病理的状況では低酸素状態になっていることが多く（非特許文献６、非特許文献７及び非特許文献８）、そのような状況下でも、骨髄球系の細胞及び癌細胞は多くの機能を発揮する必要があり（例えば、細胞運動、種々の遺伝子発現など）、低酸素状況に速やかに適応する必要がある。このような低酸素状況において重要な役割を果たしていると考えられている因子の１つが、ＨＩＦ−１αであり、ＨＩＦ−１αが通常酸素分圧下における骨髄球系細胞の嫌気的解糖系を介したＡＴＰ産生に重要な役割を果たしていることや、癌細胞においても嫌気的解糖系や血管新生に重要な役割を果たしていることが知られている（非特許文献９）。
このような状況において、近年、ＨＩＦ−１の活性抑制による炎症性疾患あるいは癌などの発症及び進行を抑制の可能性について検討が進められている。例えば、ＨＩＦ−１の阻害因子であるＦＩＨ−１の結晶構造に基づいて、ＦＩＨ−１の機能的類似体又はＦＩＨ−１結合因子を検索する方法が開示されいる（特許文献１）。しかしながら、実際に臨床応用可能な機能的類似体又はＦＩＨ−１結合因子は、現在のところ報告されていない。
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｅｍｅｎｚａら，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３；１６７−１７１，２００１
【非特許文献２】Ｋａｓｐｅｒら，ＥＭＢＯ Ｊ ２４；３８４６−３８５８，２００５
【非特許文献３】Ｌａｎｄｏら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １６；１４６６−１４７１，２００２ａ
【非特許文献４】Ｍａｈｏｎら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １５；２６７５−２６８６，２００１
【非特許文献５】Ａｒａｎｙら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９３；１２９６９−１２９７３，１９９６
【非特許文献６】Ｇａｔｅｎｂｙ及びＧｉｌｌｉｅｓ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ４；８９１−８９９，２００４
【非特許文献７】Ｍａｐｐら，Ｂｒ Ｍｅｄ Ｂｕｌｌ ５１；４１９−４３６，１９９５
【非特許文献８】Ｍｅｈｅｎｄａｌｅら，ＦＡＳＥＢ Ｊ ８；１２８５−１２９５，１９９４
【非特許文献９】Ｓｅｍｅｎｚａら，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ３；７２１−７３２，２００３
【特許文献１】ＷＯ２００４／０３５８１２号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＨＩＦ−１αの活性を低下させる方法の提供を目的とする。
また、本発明は、ＨＩＦ−１αの活性を低下させる化合物のスクリーニング方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究を進めた結果、ｉＦＩＨがＭＴ１−ＭＭＰによるＨＩＦ−１αの活性化に必須であること、及びＦＩＨ−１とＭＴ１−ＭＭＰの細胞内ペプチド（以下、ＣＰと称する）及び／又はＦＩＨ−１とｉＦＩＨ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＦＩＨ−１）の相互作用がＨＩＦ−１αの活性化に重要であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
ここで「ＭＴ１−ＭＭＰ」は、膜型のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）に分類される膜タンパク質のことで、プロテアーゼ活性に必要な酵素活性ドメイン（ＣＡＴ）、基質と結合し基質の選択性を担うヘモペキシン様ドメイン（ＨＰＸ）からなる細胞外領域、膜貫領域、２０アミノ酸からなる短い細胞内領域（ＣＰ）の各領域によって構成される。ＭＴ１−ＭＭＰは、単球／マクロファージには発現していることが報告されており、細胞運動に重要な役割を果たしていると考えられている
また「ｉＦＩＨ」は、これまでにＡＰＢＡ３／Ｍｉｎｔ３として知られていた機能未知の因子と同一であるが、ＭＴ１−ＭＭＰのＣＰ領域と相互作用し、ＨＩＦ−１活性制御に重要な役割を果たしていることに関して、本発明者らにより初めて明らかにされた。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１１）に関する。
（１）本発明の第１の態様は、「細胞内のｉＦＩＨタンパク質とＦＩＨ−１タンパク質との相互作用を増強又は低下させて、ＨＩＦ−１αの活性を促進又は阻害する方法」である。
（２）本発明の第２の態様は、「前記ＦＩＨ−１タンパク質がＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰと相互作用している上記（１）に記載の方法」である。
（３）本発明の第３の態様は、「ＲＮＡｉ法によりｉＦＩＨ−１タンパク質の発現を低下させて、ｉＦＩＨタンパク質とＦＩＨ−１との相互作用を低下させる上記（１）に記載の方法」である。
（４）本発明の第４の態様は、「細胞内のＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとＦＩＨ−１タンパク質との相互作用を増強又は低下させて、ＨＩＦ−１αの活性を促進又は阻害する方法」である。
（５）本発明の第５の態様は、「前記ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとＦＩＨ−１タンパク質との相互作用の低下が、配列番号１２で表されるアミノ酸配列で表されるペプチド、又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、ＦＩＨ−１タンパク質と相互作用を行い、かつ、ＦＩＨ−１タンパク質によるＨＩＦ−１αの活性化を阻害しないペプチドによる競合で達成される上記（４）に記載の方法」である。
（６）本発明の第６の態様は、「前記細胞が免疫系の細胞又は腫瘍細胞である上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の方法」である。
（７）本発明の第７の態様は、「ＨＩＦ−１活性を促進又は阻害する化合物をスクリーニング方法であって、
（ａ）被検試料の存在下において、ＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとを接触させる工程、
（ｂ）ＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとの相互作用を検出する工程、及び
（ｃ）被検試料の非存在下において相互作用を検出した場合と比較して、該相互作用が増強又は低下した場合に該被検試料中に該化合物候補が存在すると判断する工程、
を含む方法」である。
（８）本発明の第８の態様は、「ＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとの相互作用をＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとの結合の有無を基準として検出する上記（７）に記載の方法」である。
（９）本発明の第９の態様は、「得られた候補化合物が、細胞内のＨＩＦ−１α活性を促進又は阻害することを確認する工程をさらに含む上記（７）又は（８）に記載の方法」である。
（１０）本発明の第１０の態様は、「上記（７）乃至（９）のいずれかに記載の方法により単離される化合物」である。
（１１）本発明の第１１の態様は、「前記化合物が抗体であることを特徴とする上記（１０）に記載の化合物」である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法を用いると、ＨＩＦ−１αの活性を阻害することができる。
【０００９】
本発明の方法を用いると、ＨＩＦ−１αの活性を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のある実施態様においては、ＦＩＨ−１タンパク質とＭＴ１−ＭＭＰ又はｉＦＩＨタンパク質との相互作用を増強又は低下させる工程が含まれる。
また、本発明の他の実施態様おいては、ＦＩＨ−１タンパク質とＭＴ１−ＭＭＰ又はｉＦＩＨタンパク質との相互作用を増強又は低下させる化合物を検出する工程が含まれる。
従って、以下に、ｉＦＩＨタンパク質、ＭＴ１−ＭＭＰ及びＦＩＨ−１タンパク質並びにこれらをコードする遺伝子の取得方法を説明し、さらに、ＦＩＨ−１タンパク質とＭＴ１−ＭＭＰ又はｉＦＩＨタンパク質との相互作用を増強又は低下させる化合物を検出する工程の説明を行う。
ここで、タンパク質間の相互作用とは、タンパク質同士の結合、構造の変化、修飾、安定性の変化などを含むタンパク質間の作用のことを意味する。
【００１１】
「ｉＦＩＨタンパク質」とは、例えば、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質である。
また、「ＦＩＨ−１タンパク質」とは、例えば、配列番号６又は配列番号７で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質である。
さらに、「ＭＴ１−ＭＭＰ」とは、例えば、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質である。
ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質」とは、「ｉＦＩＨタンパク質」、「ＦＩＨ−１タンパク質」及び「ＭＴ１−ＭＭＰ」に関し、各々、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表わされるアミノ酸配列、配列番号６又は配列番号７で表わされるアミノ酸配列及び配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１で表わされるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、「ｉＦＩＨタンパク質」については、ＦＩＨ−１タンパク質との結合能を有し、「ＦＩＨ−１タンパク質」については、ＨＩＦ−１αの活性を阻害するタンパク質のことである。
あるいは、配列番号２、配列番号３又は配列番号４で表わされるアミノ酸配列、配列番号６又は配列番号７で表わされるアミノ酸配列及び配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１で表わされるアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、「ｉＦＩＨタンパク質」については、ＦＩＨ−１タンパク質との結合能を有し、「ＦＩＨ−１タンパク質」については、ＨＩＦ−１αの活性を阻害するタンパク質のことである。上記アミノ酸の欠失、付加及び置換は、タンパク質をコードする核酸に元々存在した変異であってもよく、また、該核酸を当該技術分野で公知の手法によって改変することによって新たに導入したものであってもよい。該改変は、例えば、特定のアミノ酸残基の置換は、市販のキット（例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｇ（ＴａＫａＲａ社）、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（ＴａＫａＲａ社））等を使用し、Ｇｕｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法により塩基の置換を行なうことによって実施することができる。
【００１２】
「ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ」とは、ＭＴ１−ＭＭＰの細胞内領域（ＣＰ）のことで、例えば、配列番号１２で表されるペプチドと同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなり、ＦＩＨ−１タンパク質との結合能を有するペプチドのことである。
なお、「実質的に同一」の意味は、上記「ｉＦＩＨタンパク質」及び「ＦＩＨ−１タンパク質」の例による。
【００１３】
また、本発明の他の実施態様では、ｉＦＩＨタンパク質、ＦＩＨ−１タンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ（又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ）を細胞外又は細胞内において発現さる工程が含まれるため、これらのタンパク質又はペプチドを発現するための核酸が必要となる。
ヒトのｉＦＩＨタンパク質、ＦＩＨ−１タンパク質及びＭＴ１−ＭＭＰをコードする核酸のヌクレオチド配列は、各々、配列番号１、配列番号５及び配列番号８として知られるヌクレオチド配列からなるＤＮＡのことである。
また、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰをコードする核酸については、例えば、配列番号１２のペプチドをコードする核酸であればいかなる配列であっても使用することができる。
【００１４】
ｉＦＩＨタンパク質をコードする核酸、ＦＩＨ−１をコードする核酸及びＭＴ１−ＭＭＰをコードする核酸は、上記配列番号で表されるヌクレオチド配列に基づいてプローブを作製して、適当なライブラリーを用いて取得することができ、あるいは、該ヌクレオチド配列に基づいて作製したＰＣＲ用のプライマーにより、ＰＣＲ法により取得することもできる。これらの核酸の入手元はヒトの細胞に限定されるものではなく、ヒト以外の哺乳類、例えば、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシなどの細胞又は組織であってもよい。
プローブを用いてハイブリダイゼーション法により核酸を取得する場合、ハイブリダイゼーションの条件としては、当業者の通常の知識に基づいて選択しえる、全ての条件を採用することができる。
一般に、高いストリンジェントな条件でスクリーニングを行うことにより、上記配列番号１、配列番号５及び配列番号８で表される核酸と相同性の高い核酸を取得することができる。
【００１５】
ここで、ストリンジェントな条件とは、当業者によって容易に決定されるハイブリダイゼーション条件のことで、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な実験条件である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補鎖がその融点よりやや低い環境における再アニール能力に依存する。
具体的には、例えば、低ストリンジェントな条件として、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄段階において、３７℃〜４２℃の温度条件下、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で洗浄することなどが上げられる。また、高ストリンジェントな条件として、例えば、洗浄段階において、６５℃、５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で洗浄することなどが挙げられる。
【００１６】
本発明で使用されるタンパク質又はペプチド（限定はしないが、主として、ＭＴ１−ＭＭＰ、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ、ＨＦＩ−１タンパク質、ｉＨＦＩタンパク質、ＨＩＦ−１αなどが含まれる。以下、本発明のタンパク質又はペプチドとする）には、天然に存在するタンパク質のみならず、その断片又は他のペプチド又はタンパク質を融合された形態も含まれる。
ここで、天然のタンパク質と融合されるペプチドとしては、特に限定はされないが、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓタグ、ｃ−ｍｙｃ断片、Ｔ７−タグ、Ｅ−タグなどを挙げることができる。また、融合されるタンパク質としては、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）、ＨＡ（インフルエンザ凝集素）などを挙げることができる。
【００１７】
本発明のタンパク質又はペプチドのリコンビナントは、細胞外及び細胞内において、本発明のタンパク質又はペプチドの活性の変動、又は、本発明のタンパク質又はペプチド間の相互作用の変動を検出するために使用することができる。
本発明のタンパク質又はペプチドのリコンビナントを調製するためには、本発明のタンパク質又はペプチドをコードする核酸（以下、本発明の核酸とする）を組み込んだ発現ベクターを作製する必要がある。このような発現ベクターは、適切なベクターに本発明の核酸を発現可能に連結することにより得ることができる。
ここで使用可能なベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＣＢＤ−Ｃ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０、ＹＩｐ３０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルス、トガウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００１８】
また、使用可能なプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば特に限定されない。
例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター等が挙げられる。
宿主が大腸菌である場合には、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター等が、宿主が枯草菌である場合には、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等が挙げられる。
宿主が酵母である場合には、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が挙げられる。
宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００１９】
本発明の発現ベクターには、プロモーター配列以外にも、選択マーカー、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、ＳＶ４０複製起点（ＳＶ４０ｏｒｉ）などを、適宜連結することができる。
選択マーカーとしては、限定はしないが、ハイグロマイシン耐性マーカー（Ｈｙｇｒ）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ，Ｇ４１８）などが利用可能である。
また、組換えタンパク質の単離・精製を容易にするなどの目的で、本発明のポリペプチドのＮ末端側に適当なシグナル配列を付加してもよい。
宿主が大腸菌である場合にはアルカリホスファターゼシグナル、ＯｍｐＡシグナルなどが利用可能であり、宿主が枯草菌である場合にはα−アミラーゼシグナル配列、ズブチリスシグナル配列などが利用可能であり、宿主が酵母である場合には、α因子シグナル配列、インベルターゼシグナル配列などが利用可能であり、宿主が動物細胞である場合には、例えば、インシュリンシグナル配列、α−インターフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列などが利用可能である。
【００２０】
上述のベクターに対して本発明の核酸を挿入することは、クローニングされたＤＮＡをそのまま、又は所望により制限酵素で消化して、リンカーを付加し、ベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入することにより行うことができる。連結するＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。連結するＤＮＡは、当該ＤＮＡ中にコードされている本発明のポリペプチドが宿主細胞中で発現されるようにベクターに組み込まれることが必要である。
以上の方法により、本発明の核酸含む発現ベクターを構築することができる。
【００２１】
上述のように作製した発現ベクターは、本発明のタンパク質又はペプチドが宿主中に導入する必要がある。ここで、宿主としては、本発明のタンパク質を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（Escherichia coli）等のエシェリシア属、枯草菌（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）等の酵母、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、あるいはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞が挙げられる。
【００２２】
大腸菌へのベクターの導入方法としては、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が利用可能である。酵母への組換えベクターの導入方法としては、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が利用可能である。動物細胞又は動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、カチオン性脂質による方法等が挙げられる。
【００２３】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００２４】
培養は、宿主細胞に適した条件下で行う。例えば、大腸菌を培養する際の培地としては、ＬＢ培地、Ｍ９培地等が好ましい。所望によりプロモーターを効率よく働かせるために、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。大腸菌の場合、培養は通常約１５〜３７℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主が枯草菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。
【００２５】
酵母を培養するための培地としては、ＳＤ培地、ＹＰＤ培地があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が昆虫細胞又は昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、ウシ血清を含むグレース昆虫培地等が挙げられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００２６】
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％のウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地等が用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
また、宿主を動物細胞として形質転換体を調製する方法は、ＨＩＦ−１の機能が関連する疾患に対する遺伝子治療を行うために利用することができる。遺伝子治療の目的で治療対象の細胞において発現させることができる核酸には、限定はしないが、例えば、ｉＦＩＨとＦＩＨ−１との相互作用を阻害する因子（例えば、限定はしないが、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｉＦＩＨと結合するＦＩＨ−１の部分ペプチドなど）、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとＦＩＨ−１との相互作用を阻害する因子（例えば、限定はしないが、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰと結合するＦＩＨ−１の部分ペプチドなど）が含まれる。遺伝子治療の目的で使用されるベクターは、当業者であれば容易に選択することができるが、例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが利用可能である。生体内の細胞への投与はエキソビボ、インビボなどの方法を使用することができる。
【００２７】
本発明のタンパク質又はペプチドのリコンビナントを細胞外で使用する場合には、リコンビナントを発現させた宿主細胞を集め、適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／又は凍結融解などによって細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過により本発明のタンパク質又はペプチドを含む粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に本発明のタンパク質又はペプチドが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清又は抽出液中に含まれる本発明のタンパク質又はペプチドの精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００２８】
本発明には、ｉＦＩＨタンパク質とＦＩＨ−１タンパク質との相互作用を増強又は低下させて、ＨＩＦ−１αの活性を促進又は阻害する方法が含まれる。
ｉＦＩＨタンパク質とＦＩＨ−１タンパク質との相互作用を増強させる方法としては、該相互作用を促進するもの、例えば、ＭＴ１−ＭＭＰ変異体であるＴＭ−ＣＰ（例えば、図１ａを参照のこと）を添加することが挙げられる。
一方、ｉＦＩＨタンパク質とＦＩＨ−１タンパク質との相互作用を低下させる方法としては、ｉＦＩＨの発現を喪失又は低下させ、ＦＩＨ−１との相互作用を喪失又は低下させる方法が含まれる。このような方法には、例えば、ｉＦＩＨに対するアンチセンスヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドなどを目的の細胞内に導入し、ｉＦＩＨの転写を阻害する方法（ＲＮＡｉ法など）などを挙げることができる。アンチセンスヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入は、当業者であれば容易に実施することができ、例えば、細胞内において発現させても、アンチセンスヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを直接細胞内に導入しても、いずれの方法でも実施可能である。また、このようなアンチセンスヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの代わりには、これらの誘導体を使用することもできる。
【００２９】
また、本発明には、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとＦＩＨ−１タンパク質との相互作用を増強又は低下させて、ＨＩＦ−１αの活性を阻害又は促進する方法が含まれる。
ｉＦＩＨタンパク質とＦＩＨ−１タンパク質との相互作用を増強させる方法としては、該相互作用を促進するものを添加することが挙げられる。
一方、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとＦＩＨ−１タンパク質との相互作用を低下させる方法としては、配列番号１２で表されるアミノ酸配列で表されるペプチド、又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、ＦＩＨ−１タンパク質と相互作用を行い、かつ、ＦＩＨ−１タンパク質によるＨＩＦ−１αの活性化を阻害しないペプチドを添加し（又は、該ペプチドを目的の細胞内で発現し）、細胞内におけるＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとＦＩＨ−１タンパク質との相互作用を競合的に阻害する方法などを挙げることができる。
また、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰに変異を導入することができる。変異には、全体を破壊することの他、ＦＩＨ−１タンパク質との相互作用に重要な役割を担っているアミノ酸を置換、欠失させる方法が含まれる。ＦＩＨ−１タンパク質との相互作用に重要なアミノ酸を検索する方法は、当業者により容易に選択することができるが、例えば、アラニンスキャンなどの方法を使用することもできる。例えば、変異を導入するために適したアミノ酸としては、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ（配列番号１２）の第１４番目のアルギニンが好ましい。
【００３０】
また、本発明には、ｉＦＩＨタンパク質とＦＩＨ−１タンパク質との相互作用を増強又は低下させて、ＨＩＦ−１αの活性を促進又は阻害する化合物、並びに、ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとＦＩＨ−１タンパク質との相互作用を増強又は低下させて、ＨＩＦ−１αの活性を阻害又は促進する化合物が含まれる。
本発明において、ｉＦＩＨタンパク質とＦＨＩ−１との相互作用、又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとＦＨＩ−１タンパク質との相互作用を喪失又は低下させる化合物には、例えば、ｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰに対する抗体を挙げることもできる。これらの抗体には、例えば、ＦＨＩ−１タンパク質と相互作用するｉＦＩＨタンパク質の部分領域（例えば、Ｎ末端領域）に対する抗体、又はＭＴ１−ＭＭＰの細胞内ペプチド（ＣＰ）に対する抗体などが含まれる。
上記抗体には、例えば、ＦＨＩ−１タンパク質と相互作用するｉＦＩＨタンパク質の部分領域（例えば、Ｎ末端領域）、ＭＴ１−ＭＭＰの細胞内ペプチド（ＣＰ）に対するモノエピトープ特異抗体、ポリエピトープ特異抗体、単一鎖抗体、及びこれらの断片が含まれる。これらの抗体には、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体などが含まれる。
ポリクローナル抗体は、例えば、哺乳類宿主動物に対して、免疫原及びアジュバントの混合物をインジェクトすることにより調製することができる。通常は、免疫原及び／又はアジュバントを宿主動物の皮下又は腹腔内へ複数回インジェクトする。免疫原には本発明のＤＮＡ結合能を保持した可溶性Ｓｐｏ１１タンパク質を使用することができる。アジュバントの例には、完全フロイト及びモノホスホリル脂質Ａ合成−トレハロースジコリノミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）が含まれる。
【００３１】
モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法を用いて調製することができる。
この方法には以下に示す４つの工程が含まれる：（ｉ）宿主動物又は、宿主動物由来のリンパ球を免疫する、（ｉｉ）モノクローナル抗体分泌性（又は潜在的に分泌性）のリンパ球を回収する、（ｉｉｉ）リンパ球を不死化細胞に融合させる、（ｉｖ）所望のモノクローナル抗体を分泌する細胞を選択する。
マウス、ラット、モルモット、ハムスター、又は他の適当な宿主動物が、免疫動物として選択され免疫原がインジェクトされる。或いは、免疫動物から取得したリンパ球をインビトロで免疫化してもよい。ヒト細胞が望ましい場合には、末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）が一般に使用される。しかしながら、他の哺乳類由来の脾臓細胞又はリンパ球がより一般的で好ましい。
【００３２】
免疫後、宿主動物から得られたリンパ球はハイブリドーマ細胞を樹立するために、ポリエチレングリコールなどの融合剤を用いて不死化細胞株と融合する。融合細胞としては、トランスフォーメーションによって不死化されたげっ歯類、ウシ、又はヒトのミエローマ細胞が使用されるか、ラットもしくはマウスのミエローマ細胞株が使用される。細胞融合を行った後、融合しなかったリンパ球及び不死化細胞株の成長又は生存を阻害する一又は複数の基質を含む適切な培地中で細胞を生育させる。通常の技術では、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く親細胞を使用する。この場合、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンがＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻害し、ハイブリドーマの成長を許容する培地（ＨＡＴ培地）に添加される。このようにして得られたハイブリドーマから、所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、該ハイブリドーマが生育する培地から、定法に従い、目的のモノクローナル抗体を取得することができる。
【００３３】
本発明には、ＨＩＦ−１活性を促進又は阻害する化合物をスクリーニング方法であって、
（ａ）被検試料の存在下において、ＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとを接触させる工程、
（ｂ）ＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとの相互作用を検出する工程、及び
（ｃ）被検試料の非存在下において相互作用を検出した場合と比較して、該相互作用が増強又は低下した場合に該被検試料中に該化合物候補が存在すると判断する工程、
を含む方法が含まれる。本実施態様は、ＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質、あるいは、ＦＩＨ−１タンパク質とＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰが相互作用することにより、ＦＩＨ−１タンパク質によるＨＩＦ−１α活性阻害効果が上昇又は低下することに基づいて、これらの相互作用を増強又は低下させる化合物を使用してＨＩＦ−１αの活性を阻害する方法を提供するものである。
【００３４】
このようなスクリーニングはインビトロ又は細胞内の系を用いて実施することができる。細胞内の系を用いる場合には、例えば、ＦＩＨ−１タンパク質とＭＴ１−ＭＭＰ及び／又はｉＦＩＨタンパク質を発現する細胞を被検試料の存在下でインキュベートし、ＨＩＦ−１α活性の変動を検出することにより、スクリーニングを行うことができる。ＨＩＦ−１αの活性の変動は、レポーターアッセイ（例えば、後述の「実施例」の項を参照のこと）により検出することができる。
また、ＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質、あるいは、ＦＩＨ−１タンパク質とＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰが相互作用を低下させる化合物を検出するため、ツーハイブリッドシステム（Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法）を使用してもよい。この場合には、ツーハイブリッド法で得られた候補化合物をさらに、ＨＩＦ−１αの活性の変動を検出する上記細胞の系において再度スクリーニングすることもできる。
【００３５】
本発明のスクリーニングは、例えば、免疫沈降を利用して実施することもできる。被検試料の存在下で、ＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質及び／又はＭＴ１−ＭＭＰ（又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ）とを発現する細胞を調製し、培養後、例えば、細胞抽出物から抗体などを用いてＦＩＨ−１タンパク質を含む複合体を回収し、この複合体内にｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ（又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ）が含まれるかどうかを確認する。ｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ（又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ）の存在の有無は、これらに対する抗体等を使用したイムノブロッティング法などにより確認できる。その結果、ｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ（又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ）の存在が確認されないか、又は被検試料の非存在下において同様な実験を行った場合に比較して、ｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ（又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ）の存在量が有意に減少した場合には、ＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質及、又はＭＴ１−ＭＭＰ（又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ）との相互作用が被検試料により阻害されたものと判断することができる。
その他、免疫沈降法以外の、例えば、抗体カラムなどを利用した免疫的手法によってもスクリーニングを実施することが可能である。
また、本発明のタンパク質又はペプチドを発現する場合に、エピトープタグなどとの融合体として発現させたようなときには、該タグに対する抗体も利用することができる。
【００３６】
さらに、上記免疫的な手法は、細胞を介さずに完全なインビトロの系でも実施可能である。この場合、インビトロにおいて、被検試料の存在下、ＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ（又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ）とをインキュベートし、例えば、ＦＩＨ−１タンパク質に対する抗体（又はタグに対する抗体）でＦＩＨ−１タンパク質を含む複合体をプルダウンなどで回収し、該複合体中のｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ（又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ）の有無を確認する。また、プルダウン法以外にも、抗体カラムを用いることもできる。
【００３７】
本発明の方法によって取得される化合物は（例えば、低分子化合物が以外にも、抗体などの高分子化合物も含まれる）、ＨＩＦ−１αの活性を促進又は阻害することが期待される。従って、これらの化合物は、例えば、虚血性疾患（例えば、梗塞など）での血管新生の促進、又はマクロファージの活性化による免疫療法への利用、あるいは、ＨＩＦ−１αの高活性状態に伴う疾患、障害などの治療に有効であり、生体に対して悪影響を及ぼさない医薬組成物の形態で使用することができる。通常、そのような組成物には、本発明によって取得される化合物の他、薬剤上許容される担体が含まれる。
「薬剤上許容される担体」は、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、アイソトニックに作用して吸着を遅らせる薬剤及びその類似物を含み、薬剤的投与に適するもののことである。該担体及び該担体を希釈するために好ましいものの例には、限定はしないが、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、コラーゲン、ヒト血清アルブミン、有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等などが含まれる。また、リポソーム及び不揮発性油などの非水溶性媒体も用いられる。さらに、本発明の化合物の活性を保護又は促進するような特定の化合物が、該組成物中に包含されていてもよい。
【００３８】
本発明に係る医薬組成物は、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入なども含む）、経皮及び経粘膜への投与を含み、治療上適切な投与経路に適合するように製剤化される。非経口、皮内、又は皮下への適用に使用される溶液又は懸濁液には、限定はしないが、注射用の水などの滅菌的希釈液、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒、ベンジルアルコール又は他のメチルパラベンなどの保存剤、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなどの無痛化剤、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝剤、塩化ナトリウム又はデキストロースなど浸透圧調製のための薬剤を含んでもよい。
ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調製することができる。非経口的標品はアンプル、ガラスもしくはプラスチック製の使い捨てシリンジ又は複数回投与用バイアル中に収納される。
【００３９】
注射に適する医薬組成物には、滅菌された注射可能な溶液又は分散媒を、使用時に調製するための滅菌水溶液（水溶性の）又は分散媒及び滅菌されたパウダーが含まれる。静脈内の投与に関し、適切な担体には生理食塩水、静菌水、又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。注射剤として使用する場合、組成物は滅菌的でなくてはならず、また、シリンジを用いて投与されるために十分な流動性を保持していなくてはならない。該組成物は、調剤及び保存の間、化学変化及び腐食等に対して安定でなくてはならず、細菌及び真菌などの微生物由来のコンタミネーションを防止する必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及び適切な混合物を含む溶媒又は分散媒培地を使用することができる。例えば、レクチンなどのコーティング剤を用い、分散媒においては必要とされる粒子サイズを維持し、界面活性剤を用いることにより適度な流動性が維持される。種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールなどは、微生物のコンタミネーションの防止に対して使用可能である。また、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール及び塩化ナトリウムのような等張性を保つ薬剤が組成物中に含まれてもよい。吸着を遅らせることができる組成物には、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの薬剤が含まれる。
【００４０】
滅菌的な注射可能溶液は、必要な成分を単独で、又は他の成分と組み合わせた後に、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を加え、滅菌することで調製される。一般に、分散媒は、基本的な分散培地及び上述したその他の必要成分を含む滅菌的媒体中に活性化合物を取り込むことにより調製される。滅菌的な注射可能な溶液を調製するための滅菌的パウダーの調製方法には、活性な成分及び滅菌溶液に由来する何れかの所望な成分を含むパウダーを調製する真空乾燥及び凍結乾燥が含まれる。
【００４１】
経口組成物には、不活性な希釈剤又は体内に取り込んでも害を及ぼさない担体が含まれる。経口組成物には、例えば、ゼラチンのカプセル剤に包含されるか、加圧されて錠剤化される。経口的治療のためには、活性化合物は賦形剤と共に取り込まれ、錠剤、トローチ又はカプセル剤の形態で使用される。また、経口組成物は、流動性担体を用いて調製することも可能であり、流動性担体中の該組成物は経口的に適用される。さらに、薬剤的に適合する結合剤、及び／又はアジュバント物質などが包含されてもよい。
錠剤、丸薬、カプセル剤、トローチ及びその類似物は以下の成分又は類似の性質を持つ化合物の何れかを含み得る：微結晶性セルロースのような賦形剤、アラビアゴム、トラガント又はゼラチンなどの結合剤；スターチ又はラクトースなどの、アルギン酸、ＰＲＩＭＯＧＥＬ、又はコーンスターチなどの膨化剤；ステアリン酸マグネシウム又はＳＴＲＲＯＴＥＳなどの潤滑剤；コロイド性シリコン二酸化物などの滑剤；スクロース又はサッカリンなどの甘味剤；又はペパーミント、メチルサリチル酸又はオレンジフレイバーなどの香料添加剤。
【００４２】
本発明の化合物は、植込錠及びマイクロカプセルに封入された送達システムなどの徐放性製剤として、体内から即時に除去されることを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、当業者によって容易に調製することができる。また、リポソームの懸濁液も薬剤的に受容可能な担体として使用することができる。有用なリポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノール（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製される。
【００４３】
本発明の化合物による特定の疾患の予防又は治療において、適切な投与量レベルは、投与される患者の状態、投与方法等に依存するが、当業者であれば、容易に最適化することが可能である。
注射投与の場合は、例えば、一日に患者の体重あたり約０．１μｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましく、一般に一回又は複数回に分けて投与され得るであろう。好ましくは、投与量レベルは、一日に約０．１μｇ／ｋｇから約２５０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは一日に約０．５μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇである。
経口投与の場合は、組成物は、好ましくは１．０から１０００ｍｇの活性成分を含む錠剤の形態で提供され、好ましくは活性成分が１．０，５．０，１０．０，１５．０，２０．０，２５．０，５０．０，７５．０，１００．０，１５０．０，２００．０，２５０．０，３００．０，４００．０，５００．０，６００．０，７５０．０，８００．０，９００．０及び１０００．０ｍｇである。化合物は一日に１〜４回の投与計画で、好ましくは一日に一回又は二回投与される。
【００４４】
医薬組成物又は製剤は、一定の投与量を保障すべく、均一単位投与量により構成されなくてはならない。単位投与量は、患者の治療に有効な一回の投与量を含み、薬剤的に受容可能な担体と共に製剤化された一単位のことである。本発明の単位投与量を決定する場合には、製剤化される化合物の物理的、化学的特徴、期待される治療上の効果、及び該化合物に特有な製剤化における留意事項等により影響を受ける。
【００４５】
本発明の医薬組成物はキットの形態で、容器、パック中に投与の説明書と共に含めることができる。本発明に係る薬剤組成物がキットとして供給される場合、該薬剤組成物のうち異なる構成成分が別々の容器中に包装され、使用直前に混合される。このように構成成分を別々に包装するのは、活性構成成分の機能を失うことなく長期間の貯蔵を可能にするためである。
【００４６】
キット中に含まれる試薬は、構成成分が活性を長期間有効に持続し、容器の材質によって吸着されず、変質を受けないような何れかの種類の容器中に供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性ガスの下において包装されたバッファーを含む。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、又は試薬を保持するために通常用いられる他の何れかの適切な材料などから構成される。他の適切な容器の例には、アンプルなどの類似物質から作られる簡単なボトル、及び内部がアルミニウム又は合金などのホイルで裏打ちされた包装材が含まれる。他の容器には、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ、又はその類似物が含まれる。容器は、皮下用注射針で貫通可能なストッパーを有するボトルなどの無菌のアクセスポートを有する。
【００４７】
また、キットには使用説明書も添付される。当該医薬組成物からな成るキットの使用説明は、紙又は他の材質上に印刷され、及び／又はフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体として供給されてもよい。詳細な使用説明は、キット内に実際に添付されていてもよく、あるいは、キットの製造者又は分配者によって指定され又は電子メール等で通知されるウェブサイトに掲載されていてもよい。
【００４８】
以下に実施例を示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４９】
１．実験材料と実験方法
１−１．プラスミド
マウス ＦＩＨ−１ ｃＤＮＡをマクロファージからＲＴ−ＰＣＲで単離した。また、ヒトＦＩＨ−１及びＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨ ｃＤＮＡは、ＨＥＫ２９３細胞からＲＴ−ＰＣＲで単離した。それぞれのｃＤＮＡは、ｐＥＮＴＲ／Ｄ ＴＯＰＯ ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。 ＦＩＨ−１Ｎ（１−３０２ａａ、配列番号６及び７）、ＡＰＢＡ３−Ｎ／ｉＦＩＨ−Ｎ（１−２１４ａａ、配列番号２、３及び４）及びＡＰＢＡ３−Ｃ／ｉＦＩＨ−Ｃ（２１５−５７５ａａ、配列番号２、３及び４） はそれぞれ単離したｃＤＮＡを基にＰＣＲで作製しｐＥＮＴＲ／Ｄ ＴＯＰＯベクターにクローニングした。Ｍｙｒ−ＡＰＢＡ３−Ｎ／Ｍｙｒ−ｉＦＩＨ−Ｎは、ｖ−ｓｒｃ由来のミリストイル化配列（配列番号１３）（Ｃｒｏｓｓら，１９８４）を開始コドンの前にＰＣＲを用いて挿入し、同様にｐＥＮＴＲ／Ｄ ベクターにクローニングした。マウス及びヒトＭＴ１−ＭＭＰは所属教室で作製されていたＦｕｒｉｎ切断部位の下流にＦＬＡＧタグあるいはＭｙｃタグを挿入したものを使用した。ＭＴ１−ＭＭＰのドメイン欠損変異体（ＣＡＴ（１１２−２８４ａａ）、ＨＰＸ（３１９−５０７ａａ）、ＣＰ（５６２−５８１ａａ）、細胞外領域（１１２−５０７ａａ））、アラニン置換体はＰＣＲを用いて作製し、ｐＥＮＴＲ／Ｄ ＴＯＰＯ ベクターにクローニングした。これらｐＥＮＴＲ／Ｄ ＴＯＰＯベクターにクローニングしたものをＬＲリコンビナーゼを用いてｐｃＤＮＡ３．１、ｐＤＥＳＴ１５、ｐＤＥＳＴ１７、ｐＬｅｎｔｉ６、ｐＡｄベクター（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入して発現ベクターを作製した。
【００５０】
１−２．マウス
ＭＴ１−ＭＭＰ欠損マウス及び野生型マウスは、発明者らによって定法に従って作製されＣ５７ＢＬ／６マウスと１２回戻し交配を行ったヘテロマウスどうしを掛け合わせて作製した。本実験で用いた野生型及びＭＴ１−ＭＭＰ欠損マウスはＳＰＦ環境下で維持され、生後１０−１８日で実験に用いた。
【００５１】
１−３．免疫組織染色
凍結切片を１０μｍの厚さで作製した。４％ パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで５分間固定し、０．０３％ Ｈ２Ｏ２／ＰＢＳで１５分間反応させ内因性のペルオキシダーゼを不活化した。５％ ヤギ血清、３％ ＢＳＡを含むＰＢＳで１時間室温で反応させたのち、抗Ｆ４／８０抗体（ＢＭＡ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）又は抗ＣＤ４５抗体（Ｂｅｃｈｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を４oＣで一晩反応させた。ＰＢＳで洗浄した後、切片をＨｉｓｔｏｆｉｎｅ ＨＲＰ付加抗ラットＩｇＧ抗体（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ）と３０分間反応させ、ＰＢＳで洗浄した後ＤＡＢ溶液で発色させた。
１−４．骨髄由来マクロファージの調整
骨髄由来マクロファージは過去の報告に基づいて行われた（Ｃｅｌａｄａら，１９８４；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，２００２）。マウスの大腿骨、脛骨、及び上腕骨の両端を切断し、ＰＢＳで骨髄細胞を洗いだした。ＰＢＳで３回洗浄した後、骨髄細胞を３０％ Ｌ９２９培養上清と２０％ ＦＢＳを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ， Ｓｉｇｍａ）中で湿潤な環境で５％ ＣＯ２大気中、３７℃で７日間培養し、マクロファージに分化させた。分化させたマクロファージはＬ９２９培養上清を除いた培養液で２４時間培養した後実験に使用した。低酸素実験では分化させたマクロファージを１％ Ｏ２、５％ ＣＯ２大気に設定したＭｏｄｅｌ ９２００インキュベーター（和研薬）で培養して実験に用いた。
【００５２】
１−５．浸潤能及び運動能の解析
マトリゲルに対する浸潤能及びトランスウェルを用いた運動能の解析は過去の報告に基づいて行われた（Ｎｏｎａｋａら，２００５；Ｕｅｄａら，２００３）。８μｍ ポアサイズのトランスウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）をコートしたもの（浸潤能）又はコートしていないもの（運動能）を２４ウェルプレートに装填した。１０ｎｇ／ｍｌのＭＣＰ−１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む ５００μｌのＤＭＥＭを下のチャンバーに入れ、２００μｌの細胞懸濁液（２ｘ１０５ ｃｅｌｌｓ）を上のチャンバーに入れた。細胞を運動能で２時間、浸潤能で６時間それぞれ３７℃で培養した後、下のチャンバーに移動した細胞をギムザ染色液で染色し、細胞を顕微鏡下でカウントした。
１−６．ケモキネシス（ランダム運動）の測定
マクロファージを３５ｍｍガラスディッシュに播種し一晩培養した。１０ｎｇ／ｍｌ のＭＣＰ−１を加え３０分後から、１分ごとに３０分間 Ｌｅｉｃａ ＡＳ ＭＤＷ ｔｉｍｅ−ｌａｐｓｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて細胞の画像を取得した。各時間の細胞の重心の直線移動距離の合計をＩｍａｇｅＪ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＮＩＨ）で解析し細胞の移動距離とした。
【００５３】
１−７．ＡＴＰ濃度の測定
マクロファージのＡＴＰ濃度はＡＴＰ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ ＣＬＳ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて測定した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて試料中のタンパク量を測定し、タンパク量でＡＴＰ量を平均化した。解糖系阻害剤を用いた実験では０．２Ｍ ２−Ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ（ＳＩＧＭＡ）又は超純水を培養液中に加え３時間培養後にＡＴＰを測定した。
【００５４】
１−８．マクロファージ核タンパク中のＨＩＦ−１α及びｐ３００／ＣＢＰの検出
マクロファージの核タンパク質をＮｕｃｌｅａｒ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｋｉｔ（ＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆ）を用いて回収した。ＴｒａｎｓＡＭ ＨＩＦ−１ ｋｉｔ（ＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆ）を用いて１０μｇの核タンパク質を解析した。このキットにはＨＩＦ−１が結合するＨＲＥオリゴヌクレオチドがコーティングされたプレートが含まれている。試料中のＨＩＦ−１の結合は抗ＨＩＦ−１α 抗体を用いて検出した。ｐ３００／ＣＢＰの検出に抗ｐ３００／ＣＢＰ 抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）を使用した。
１−９．レポーターアッセイ
ＨＩＦ−１αの転写活性を解析するためのレポーターアッセイはＬａｎｄｏらの報告を基に改変を加えて行われた（Ｌａｎｄｏら，２００２ｂ）。レポータープラスミドとしてホタルルシフェラーゼ遺伝子の前にｕｐｓｔｒｅａｍ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅを４つ直列に配置し（４ｘＵＡＳ）さらにチミジンキナーゼ（ＴＫ）由来のＴＡＴＡ ｂｏｘを挿入したｐＧＬ３ Ｂａｓｉｃプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）を作製した。ウミシイタケルシフェラーゼを発現するｐＲＬ ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を内部コントロールとして使用した。ＨＥＫ２９３細胞（５ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を２４ウェルプレートに播種し、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて以下の条件でレポータープラスミドを導入した。レポータープラスミド（１００ｎｇ），内部コントロールベクター（１０ｎｇ），Ｇａｌ４ＢＤ−ＣＡＤプラスミド（５０ｎｇ）、ＭＴ１−ＭＭＰ及び変異体、又はＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨ及び変異体発現プラスミド（２００ｎｇ）。ＭＴ１−ＭＭＰとＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨ変異体のＨＩＦ−１αＣＡＤ活性に対する影響を解析する実験ではそれぞれ５０ｎｇずつ遺伝子導入した。遺伝子導入２４時間後にＰＢＳで洗浄した後、ｐａｓｓｉｖｅ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、さらに凍結融解により細胞を破砕した。ライセートのルシフェラーゼ活性はＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＴＤ２０／２０ ルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した。
【００５５】
１−１０．組み換えタンパクの作製
ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＣＰ、ＧＳＴ−ＣＰＲ／Ａ、ＧＳＴ−ＣＰ５、ＧＳＴ−ＣＡＤ、ＧＳＴ−ＦＩＨ−１、ＧＳＴ−ＦＩＨ−１Ｎの作製のため、ＢＬ２１ Ｇｏｌｄ（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ大腸菌株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をｐＤＥＳＴ１５発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で形質転換させ、ＬＢ培地で培養後０．５ｍＭ ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を加えてで３時間、３７oＣで培養した。菌体を遠心で落とした後、ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ ＩＩＩ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を加えた１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／ＰＢＳに懸濁した後超音波破砕を行った。遠心後の上清にグルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を加えて１時間、４℃で反応させた。１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／ＰＢＳで５回洗浄し保存した。
（Ｈｉｓ）６タグ マウスＦＩＨ−１、ＡＰＢＡ３、ＡＰＢＡ３Ｎの作製のため、ＢＬ２１ Ｇｏｌｄ（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ大腸菌株をｐＤＥＳＴ１７発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で形質転換し、ＬＢ培地で培養した後、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを加えて１６時間２０℃で誘導をかけた。菌体をｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ ＩＩＩを加えたＴＢＳに再懸濁し超音波破砕後、上清に１０ｍＭ イミダゾール、 Ｎｉ２＋ 処理したｃｈｅｌａｔｉｏｎ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を加えて１時間、４℃で反応させた。ビーズを５０ｍＭ イミダゾールで５回洗浄した後、結合しているタンパクを５００ｍＭ イミダゾールで溶出し、ＴＢＳで透析した後実験に使用した。
【００５６】
１−１１．ＧＳＴプルダウンアッセイ
グルタチオンセファロース ４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にＧＳＴ融合タンパクを約１０μｇ結合させたものを０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含むｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０）中で３０分間、４℃で混和した。その後、２μｇの（Ｈｉｓ）６−標識ＦＩＨ−１タンパク、０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ペプチド競合実験ではビオチン標識したＣＰペプチドあるいはＣＰの配列をシャッフルしたコントロールペプチド（配列番号１４）（合成はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をビーズに加えた。ローテーターを用いて２時間、４℃で混和した後、ビーズをｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒで４回洗い、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー、βメルカプトエタノールを加えて加熱しタンパクを溶出した。溶出したタンパクをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、抗（Ｈｉｓ）６抗体（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）あるいは抗ＧＳＴ抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ）を用いて検出した。
【００５７】
１−１２．レンチウイルスベクターの作製
レンチウイルスベクターはＶｉｒａＰｏｗｅｒＴＭ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して仕様書に沿って作製した。レンチウイルスの濃縮は過去の報告を基に行った（Ｐｆｅｉｆｅｒら，２０００）。レンチウイルスを含む培養上清を回収し、１，５００ ｇで１０分間遠心した後上清を回収した。０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濾過した後、ウイルス液を７０，０００ ｇで２時間、２１℃で遠心し、上清を除去した。ウイルスを２００μｌのＤＭＥＭで懸濁し、１０倍希釈系列を作製した後、６ウェルプレートに１ｘ１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでまかれたＨｅＬａ細胞に感染させ、４８時間後にブラストサイジンによる薬剤選択を行いウイルス力価を求めた。マクロファージにＭＴ１−ＭＭＰ及び変異体を遺伝子導入する際には、３ ＭＯＩで感染させ、遺伝子の発現を以下の特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲで確認した。
MT1-MMP（センス）；５−ａｔｇｔｃｔｃｃｃｇｃｃｃｃｔｃｇａｃｃ−３’（配列番号１５）
MT1-MMP（アンチセンス）；５’−ａｃａｔｔｇｇｃｃｔｔｇａｔｃｔｃａｇｔ−３’（配列番号１６）
βアクチン（センス）；５’−ｇｃｃａａｃａｃａｇｔｇｃｔｇｔｃｔｇｇ−３’（配列番号１７）
βアクチン（アンチセンス）；５’−ａｔｃｔｇｃｔｇｇａａｇｇｔｇｇａｃａｇ−３’．（配列番号１８）
【００５８】
１−１３．アデノウイルスベクターの作製
ＶｉｒａＰｏｗｅｒＴＭ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてアデノウイルスベクターを作製した。ウイルス力価の測定は説明書の通りに行われ、ウイルス液の１０倍希釈系列作製して２９３Ａ細胞に感染させた後、出来たプラークの数から求めた。
１−１４．イムノブロッティング
細胞を１ｍｌのｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１％ ＮＰ−４０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で融解し、２０，０００ ｇで１５分間、４℃で遠心した。上清を回収しタンパク濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。細胞融解液にＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファーとメルカプトエタノールを加えて加熱した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ゲルからタンパクをＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した後、抗ＭＴ１−ＭＭＰマウス抗体（Ｄａｉｉｃｈｉ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、抗トランスフェリンレセプターマウス抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ｐ３００／ＣＢＰ抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）、抗ｌａｍｉｎＡ／Ｃマウス抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＦＩＨ−１ヤギ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗アクチンマウス抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ 抗体（Ｓｉｇｍａ）、抗Ｍｙｃマウス抗体（Ｒｏｃｈｅ）、抗Ｖ５マウス抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ＡＰＢＡ３ マウス抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と４℃で一晩反応させた。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＨＲＰ付加抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＨＲＰ付加抗ヤギＩｇＧ抗体（ＳＩＧＭＡ）と１時間反応させ、ＰＢＳＴで５回洗浄した後ＥＣＬ ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で発光させバンドを検出した。
【００５９】
１−１５．Ｙｅａｓｔ−Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄスクリーニング
Ｈｙｂｒｉｇｅｎｉｃｓ社の商業サービスを使用し、ＦＩＨ−１をベイトとしてヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーを使用して行われた。
１−１６．ｓｈＲＮＡによる発現抑制実験
使用したｓｈＲＮＡ配列は以下の通りである。
マウスＦＩＨ−１；５’−ｃａｃｃｇｇａｃｃｔｃｇａａｔａｃｃｔｇｃａａｇａｃｇａａｔｃｔｔｇｃａｇｇｔａｔｔｃｇａｇｇｔｃｃｔｔｔｔ−３’（配列番号１９）
ヒトＦＩＨ−１＃１；５’−ｃａｃｃｇｃｔｇａｃｃｇａｃａｃａａａｔｃｔｔｇｔｃｇａａａｃａａｇａｔｔｔｇｔｇｔｃｇｇｔｃａｇｃｔｔｔｔ−３’（配列番号２０）
ヒトＦＩＨ−１＃２；５’−ｃａｃｃｇｇａａｇａｔｔｇｔｃａｔｇｇａｃｔｔｃｔｃｇａａａｇａａｇｔｃｃａｔｇａｃａａｔｃｔｔｃｃｔｔｔｔ−３’（配列番号２１）
マウスＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨ；５’−ｃａｃｃｇｃｃａｇｔｔｃｃｔａｃａｇｇａｇａａｃａｃｇａａｔｇｔｔｃｔｃｃｔｇｔａｇｇａａｃｔｇｇｃ−３’（配列番号２２）
これらの配列をｐＥＮＴＲ／Ｕ６ ＴＯＰＯにクローニングし、ｐＬｅｎｔｉ６ ＢＬＯＣＫｉＴ レンチウイルスベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＬＲリコンビネーションでサブクローニングした。ｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスベクターは上述の通り作製し、ｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスベクターを４０ ＭＯＩで各細胞に導入した。マクロファージは導入後７２時間後に実験に用いた。ＨＥＫ２９３細胞は導入後７２時間後にブラストサイジンによる薬剤選択を１週間続け、その後実験に使用した。
【００６０】
１−１７．ｓｉＲＮＡを用いた発現抑制実験
ｓｉＲＮＡはＢ−ｂｒｉｄｇｅ社によってデザイン、合成されたものを使用した。このｓｉＲＮＡは１遺伝子に対し３種類の異なるｓｉＲＮＡカクテルである。配列は以下の通りである。
ヒトＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨ：
５’−ｇａｕｇｇａａｃｕｕｇａｕｇａｇｕｃａ−３’（配列番号２３）；
５’−ｇｇｇａｇｇｕｇｃａｃｃｕｃｇａｇａａ−３’（配列番号２４）；
５’−ｇｇｕｕｃｕｕｇｇｕｃｃｕｇｕａｕｇａ−３’（配列番号２５）．
コントロールｓｉＲＮＡｓ：
５’−ａｕｃｃｇｃｇｃｇａｕａｇｕａｃｇｕａ−３’（配列番号２６）
５’−ｕｕａｃｇｃｇｕａｇｃｇｕａａｕａｃｇ−３’（配列番号２７）
５’−ｕａｕｕｃｇｃｇｃｇｕａｕａｇｃｇｇｕ−３’（配列番号２８）
ＨＥＫ２９３細胞を１ｘ１０４／ｗｅｌｌで２４ウェルプレートに播種し１０ｎＭ ｓｉＲＮＡ カクテル（３種類のターゲット配列を含む）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて仕様書の通りに導入した。導入後４８時間後にレポーターアッセイを行った。
【００６１】
２．結果
２−１．ＭＴ１−ＭＭＰは細胞内領域（ＣＰ）依存的にＨＩＦ−１αの転写活性を上昇させる。
ＨＩＦ−１αのＣＡＤは、ｐ３００／ＣＢＰとの結合することで転写活性を伝達するので、ＣＡＤの転写活性がＭＴ１−ＭＭＰで制御されるかを検討した。ＣＡＤ自身の転写活性を解析するため、Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合領域とＣＡＤフラグメントを結合させたキメラタンパクを発現するベクターを構築し、ＣＡＤ融合タンパクが結合した際にルシフェラーゼが転写され、ルシフェラーゼの活性を測定する事でＣＡＤの転写活性を測定できるレポーターシステム（Ｌａｎｄｏら，２００２ｂ）を用いた（図１ａ）。ＨＥＫ２９３細胞にレポータープラスミドとＭＴ１−ＭＭＰ発現プラスミドを遺伝子導入すると、ＣＡＤの転写活性がコントロールに比べて約２．３倍に上昇することが明らかとなった（図１ｂ）。さらに、ＨＩＦ−１αのＣＡＤの制御にＭＴ１−ＭＭＰのどのドメインが関与しているかを決定するため、ＭＴ１−ＭＭＰの欠損変異体発現ベクターを導入してレポーターアッセイを行った。その結果、酵素活性ドメイン欠損（ｄＣＡＴ）やヘモペキシン様ドメイン欠損（ｄＨＰＸ）変異体は野生型ＭＴ１−ＭＭＰと同程度にＣＡＤを活性化したが、細胞内領域欠損（ｄＣＰ）変異体ではＣＡＤの活性化は見られなかった（図１ｂ）。また、ＭＴ１−ＭＭＰのＣ末端の膜貫通ドメインからＣＰまでの変異体（ＴＭ−ＣＰ）でもＣＡＤの活性化には十分であった（図１ｂ、ＴＭ−ＣＰ）。
これらの結果からＭＴ１−ＭＭＰが細胞内領域依存的にＨＩＦ−１αのＣＡＤを活性化していることが明らかとなった。さらに、これらのＭＴ１−ＭＭＰ変異体をＭＴ１−ＭＭＰ欠損マクロファージにレンチウイルスベクターに導入したところ、レポーターアッセイの結果と同様にｄＣＰ以外の変異体でＭＴ１−ＭＭＰ欠損マクロファージのＡＴＰ量（図１ｃ）及び細胞運動能（図１ｄ）が回復した。
【００６２】
ＭＴ１−ＭＭＰのＣＰは２０アミノ酸から構成されている（配列番号１２）。そこでどのアミノ酸残基がＣＡＤの制御に必要であるかを解析するため、ＭＴ１−ＭＭＰのＣ末端を４、８、１２、１６、２０アミノ酸ずつ欠損させた変異体を作製した。ＨＥＫ２９３細胞にこれら変異体とレポータープラスミドを遺伝子導入して解析を行った結果、最初の４アミノ酸の欠損（ｄＣＰ１７−２０）はＣＡＤの活性化に影響を及ぼさなかった（図２ａ）。しかし、次の４アミノ酸の欠損（ｄＣＰ１３−２０）から細胞内領域を持たないｄＣＰと同様にＣＡＤの活性化が起こらなかった（図２ａ）。つまり、ＣＰ１３−１６のアミノ酸がＭＴ１−ＭＭＰによるＣＡＤの活性化に重要な役割を果たしていることが考えられた。そこでＣＰ１３−１６の４アミノ酸を全てアラニンに置換した変異体を作製しレポーターアッセイを行った結果、アラニン置換変異体ではＭＴ１−ＭＭＰによるＣＡＤの活性化が起こらなかった（図２ｂ）。さらにＣＰ１３−１６のアミノ酸を一つずつアラニンに置換した変異体を作製し解析をおこなったところ、それぞれのアミノ酸置換体で異なる程度にＣＡＤの活性化能が低下していた。その中でもＣＰ１４のＲ／Ａ置換が最も影響が大きく、ＭＴ１−ＭＭＰのＣＡＤの活性化能がほぼ完全に失われていた（図２ｂ、Ｒ／Ａ）。つまり、ＣＰ１４のアルギニンがＣＡＤの活性化に重要であることが明らかとなった。
【００６３】
２−２．ＦＩＨ−１がＭＴ１−ＭＭＰ依存的なＨＩＦ−１αの制御を仲介する。
ＦＩＨ−１は、現在のところ報告されている唯一のＨＩＦ−１αのＣＡＤの負の調節因子である（Ｌａｎｄｏら，２００２ａ；Ｍａｈｏｎら，２００１）。そこでＨＥＫ２９３細胞でのＭＴ１−ＭＭＰによるＣＡＤの活性化にＦＩＨ−１が関与しているかを検証するため、ｓｈＲＮＡを利用して内因性のＦＩＨ−１の発現量を低下させたＨＥＫ２９３細胞を作製した（図３ａ、ｓｈＦＩＨ−１＃１及び＃２）。ＦＩＨ−１の発現量の低下により、ＨＥＫ２９３でのＣＡＤの活性が約５倍に上昇し（図３ｂ、ｍｏｃｋ）、この状況ではＭＴ１−ＭＭＰによるＣＡＤの活性化は検出されなかった（図３ｂ、ＭＴ１Ｆ，ｄＣＰ）。同様に、野生型及びＭＴ１−ＭＭＰ欠損マクロファージのＦＩＨ−１の発現をｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスベクターを用いて低下させると（図３ｃ）、野生型マクロファージと同程度にまでＭＴ１−ＭＭＰ欠損マクロファージのＡＴＰ量が回復した（図３ｄ）。これらの結果から、ＭＴ１−ＭＭＰがＣＰ依存的にＦＩＨ−１の機能を抑制し、その結果ＨＩＦ−１αの転写活性が上昇していることが示唆された。
続いて、ＭＴ１−ＭＭＰのＣＰとＦＩＨ−１の間に直接的な相互作用があるかを解析するため、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）にＣＰペプチドを結合させた組み替えタンパク（ＧＳＴ−ＣＰ）と（Ｈｉｓ）６標識したＦＩＨ−１を用いたプルダウンアッセイを行った。その結果、ＦＩＨ−１はＧＳＴ−ＣＰと結合したが、ＧＳＴとは結合しなかった（図４ａ）。また、ＧＳＴ−ＣＰとＦＩＨ−１との結合はＣＰペプチドで量依存的に競合され、コントロールペプチドでは競合されなかった（図４ａ、ＣＰ ｐｅｐｔｉｄｅ／ＧＳＴ−ＣＰ；ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｅｐｔｉｄｅ／ＧＳＴ−ＣＰ）。続いて、図２の実験で明らかになったＣＡＤの活性化に重要なＣＰ１４のアルギニンをアラニンに置換したＧＳＴ−ＣＰ（ＧＳＴ−Ｒ／Ａ）とＦＩＨ−１との相互作用をプルダウンアッセイで解析した結果、ＧＳＴ−Ｒ／ＡはＧＳＴ−ＣＰと比べＦＩＨ−１との結合能が著しく低下していた（図４ｂ）。また、Ｒ／Ａ置換したＭＴ１−ＭＭＰ変異体をＭＴ１−ＭＭＰ欠損マクロファージに遺伝子導入したところ、野生型のＭＴ１−ＭＭＰ導入マクロファージではＡＴＰ量の上昇が観察されたが、Ｒ／Ａ変異体を導入してもＡＴＰ産生を上昇させることが出来なかった（図４ｃ）。
以上の結果より、ＦＩＨ−１はＭＴ１−ＭＭＰがＣＰ依存的にＨＩＦ−１αを制御する際のメディエーターであることが明らかとなった。
【００６４】
２−３．ＡＰＢＡ３／Ｍｉｎｔ３はＦＩＨ−１の新規結合因子である。
予備的な実験によりＭＴ１−ＭＭＰのＣＰペプチドは少なくともｉｎ ｖｉｔｒｏでのＦＩＨ−１の機能に影響しなかったことから、ＭＴ１−ＭＭＰが単独で直接ＦＩＨ−１を抑制するのではなく、他の分子の存在を必要とするのではないかという仮説を立て、ｙｅａｓｔ−ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄスクリーニングによりＦＩＨ−１の結合因子を探索した。ｙｅａｓｔ−ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄスクリーニングで得られた候補タンパクとＦＩＨ−１との結合を免疫沈降法で解析した結果、ＡＰＢＡ３／Ｍｉｎｔ−３のみがＦＩＨ−１との安定的な結合を示した（図５ｂ）。ＡＰＢＡ３は、ＡＰＢＡ１のホモログであり、アミロイドベータ前駆タンパクの細胞内領域と結合することが知られている（Ｔａｎａｈａｓｈｉ及びＴａｂｉｒａ，１９９９）。ＡＰＢＡ１、２は、主に神経系で発現しているのに対し、ＡＰＢＡ３は広範な組織での発現が確認されているが（Ｏｋａｍｏｔｏら，２００１；Ｏｋａｍｏｔｏ及びＳｕｄｈｏｆ，１９９８；Ｔａｎａｈａｓｈｉ及びＴａｂｉｒａ，１９９９）、その生物学的な役割については不明である。ＡＰＢＡ３のＣ末端領域はＡＰＢＡ１、２と相同性を持つ１つのＰＴＢドメインと２つのＰＤＺドメインからなるが、Ｎ末端領域は他のＡＰＢＡとは相同性を示さない特有の配列を持つ（図７ａ）。ＡＰＢＡ３はＰＤＺドメインを介してＭＴ５−ＭＭＰの細胞内領域と結合することが報告されている（Ｗａｎｇら，２００４）、ＭＴ１−ＭＭＰの細胞内領域とは明確な結合を示さなかった（図６）。
続いてＦＩＨ−１がＡＰＢＡ３のどの領域と結合するかを解析するため、ＦＬＡＧタグ標識したＡＰＢＡ３のＮ末端、Ｃ末端をそれぞれＭｙｃタグ標識したＦＩＨ−１とＨＥＫ２９３細胞に共発現させて、ライセートを免疫沈降に供した。その結果、ＡＰＢＡ３の全長及びＮ末端ではＦＩＨ−１が共沈降されてきたが、Ｃ末端では共沈降は起こらなかった（図７ｂ）。以上より、ＦＩＨ−１はファミリー間でユニークな領域であるＡＰＢＡ３のＮ末端領域に結合することが明らかとなった。
【００６５】
２−４．ＡＰＢＡ３は、ＦＩＨ−１とＨＩＦ−１αＣＡＤの結合を競合阻害することでＨＩＦ−１αの転写活性を亢進する。
続いてＦＩＨ−１のどの領域がＡＰＢＡ３との結合に必要かをプルダウンアッセイで解析した。ＦＩＨ−１はＣｕｐｉｎ様の構造を持つ酵素活性ドメインとＣ末端側に二量体形成ドメインを有する（図７ａ）。ＦＩＨ−１は、ＨＩＦ−１αとＣ末端側の二量体結合部位で結合し、酵素活性ドメインでＨＩＦ−１αのアスパラギン残基を水酸化する（Ｄａｎｎら，２００２；Ｅｌｋｉｎｓら，２００３；Ｈｅｗｉｔｓｏｎら，２００２；Ｌａｎｃａｓｔｅｒら，２００４）。ＧＳＴ融合ＦＩＨ−１（ＧＳＴ−ＦＩＨ−１）はＨＩＦ−１αのＣＡＤフラグメントと同様にＡＰＢＡ３のＮ末端領域 のフラグメントとも結合した（図７ｃ）。それに対し、Ｃ末端二量体形成ドメインを欠損したＧＳＴ−ＦＩＨ−１（ＧＳＴ−ＦＩＨ−１Ｎ）はＨＩＦ−１αのＣＡＤ、ＡＰＢＡ３のＮ末端領域のどちらとも結合しなかった（図７ｃ）。一方、ＦＩＨ−１のＮ末端側と結合することが知られている Ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ タンパク質（ＶＨＬ）（Ｌｅｅら，２００３）は全長及びＣ末端を欠損したＧＳＴ−ＦＩＨ−１のどちらともと結合が確認された（図７ｃ，ＶＨＬ）。以上の結果より、ＦＩＨ−１のＣ末端の二量体形成ドメインがＡＰＢＡ３及びＨＩＦ−１αＣＡＤとの結合に必要であることが明らかとなった。興味深い事に、ＧＳＴ−ＦＩＨ−１によるＣＡＤフラグメントのプルダウンはＡＰＢＡ３のＮ末端フラグメントによって量依存的に競合阻害がかかったが（図７ｄ）、ＶＨＬではそのような競合阻害は起こらなかった（図７ｅ）。この結果はＨＩＦ−１αＣＡＤとＡＰＢＡ３のＮ末端フラグメントがどちらもＦＩＨ−１との結合に二量体形成ドメインを必要としていることに起因していると考えられた。
【００６６】
ＡＰＢＡ３がＨＩＦ−１αとＦＩＨ−１の結合に競合したので、ＡＰＢＡ３がＨＩＦ−１αの転写活性を抑制するＦＩＨ−１の機能を阻害する可能性が考えられた。そこで、ＨＩＦ−１αの転写活性におけるＡＰＢＡ３の影響をレポーターアッセイを用いて解析した。ＡＰＢＡ３をＨＥＫ２９３細胞に発現させると、ＨＩＦ−１αの活性はコントロール群に比べて劇的に上昇した（図８ａ）。続いてＡＰＢＡ３による ＨＩＦ−１α ＣＡＤの活性化がＦＩＨ−１を介したものかを確認するため、２種類のｓｈＲＮＡ発現ベクターによりＦＩＨ−１の発現を低下させたＨＥＫ２９３細胞を用いてレポーターアッセイを行った（図８ｂ）。その結果、ＦＩＨ−１の発現レベルの減少に従ってコントロール群でのＣＡＤの活性が上昇し、ＡＰＢＡ３を導入した群とほぼ変わらなくなった（図８ａ）。このことからＡＰＢＡ３によるＨＩＦ−１α ＣＡＤの活性化はＦＩＨ−１を介したものであることが明らかとなった。また、ＡＰＢＡ３のどの領域がＨＩＦ−１αＣＡＤの活性化に関係しているかを解析した結果、ＦＩＨ−１と結合するＡＰＢＡ３のＮ末端フラグメントはＨＩＦ−１α ＣＡＤを活性化したが、ＦＩＨ−１と結合しないＣ末端フラグメントはＣＡＤの活性に影響を与えなかった（図８ｃ）。
以上の結果から、ＡＰＢＡ３はＨＩＦ−１αとＦＩＨ−１との結合に競合的に作用し、ＦＩＨ−１によるＨＩＦ−１αの不活性化を阻止しているという考えが支持された。そこでＡＰＢＡ３をその機能に基づいて ”ｉｎｉｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＦＩＨ−１ （ｉＦＩＨ）”と新たに命名した。
【００６７】
２−５．ｉＦＩＨはＭＴ１−ＭＭＰによるＨＩＦ−１αの活性化に必須である。
ＡＰＢＡはＰＤＺドメインを介して膜タンパクの細胞内ドメインに多く見られるＰＤＺ結合配列と結合することで細胞膜に局在することが知られているので（Ｔａｎａｈａｓｈｉ及びＴａｂｉｒａ，１９９９）、ｉＦＩＨはＭＴ１−ＭＭＰによるＦＩＨ−１の抑制のメカニズムを説明する鍵となることが考えられた。そこでＭＴ１−ＭＭＰによるＣＡＤの活性化にｉＦＩＨが必要かどうかを検討した。まず、ＨＥＫ２９３細胞にＭＴ１−ＭＭＰを発現させＨＩＦ−１αの活性が上昇することをレポーターアッセイで確認した（図９ａ）。この過程にｉＦＩＨが関与しているかを解析するため、ｓｉＲＮＡを用いてｉＦＩＨの発現を低下させた（図９ｂ）。ｉＦＩＨの発現減少の影響はコントロール群では明確ではなかったことから、内因性のｉＦＩＨだけではＨＩＦ−１αの活性制御には十分ではないことが示唆された（図９ａ、ｍｏｃｋ）。しかし、ｉＦＩＨの発現減少はＭＴ１−ＭＭＰによるＨＩＦ−１αの活性化をキャンセルした（図９ａ、ＭＴ１Ｆ）。このことからｉＦＩＨはＭＴ１−ＭＭＰによるＨＩＦ−１αＣＡＤの活性化に重要な役割を果たしている事が明らかとなった。しかしながら、ＨＥＫ２９３細胞におけるｉＦＩＨの過剰発現ではＭＴ１−ＭＭＰが無くともＨＩＦ−１αの活性を上昇させるのに対し（図８）、内因性のｉＦＩＨはＨＩＦ−１αの活性にほとんど影響しないという異なった結果が得られた。この原因として発現量の違いが考えられたので、レポーターアッセイを用いてＨＩＦ−１αの活性化におけるｉＦＩＨとＭＴ１−ＭＭＰの関係を低発現量の条件で解析した。
【００６８】
まず、ＭＴ１−ＭＭＰ又はｉＦＩＨ単独ではＨＩＦ−１αの活性をほとんど上昇させない条件を設定した（図１０ａ、ｉＦＩＨ＋ＭＴ１）。この条件で、ｉＦＩＨとＭＴ１−ＭＭＰを共発現させるとＨＩＦ−１α の活性は相乗的に上昇した（図１０ａ、ｉＦＩＨ＋ＭＴ１）。図８ｃで示したように、ｉＦＩＨのＮ末端領域はＦＩＨ−１に結合しＨＩＦ−１αの活性抑制をキャンセルするのに十分である。ところが興味深い事に、ＭＴ１−ＭＭＰはｉＦＩＨ−ＮによるＨＩＦ−１αの活性化には影響を及ぼさなかった（図１０ａ、ｉＦＩＨ−Ｎ＋ＭＴ１）。ｉＦＩＨ−Ｎが欠損しているＣ末端領域は細胞膜への局在に重要であるので（Ｏｋａｍｏｔｏら，２００１）、ｉＦＩＨ−Ｎにミリストイル化シグナル（Ｃｒｏｓｓら，１９８４）を付加し（Ｍｙｒ−ｉＦＩＨ−Ｎ）、細胞膜へ局在できるようにした（図１０ｂ）。するとＭｙｒ−ｉＦＩＨ−ＮはＭＴ１−ＭＭＰと協調的に働いてＣＡＤの活性を上昇させた（図１０ａ、Ｍｙｒ−ｉＦＩＨ−Ｎ）。
以上の結果より、内因性の発現量に近い低発現の条件ではｉＦＩＨ単独ではほとんどＣＡＤを活性化しないがＭＴ１−ＭＭＰが存在することによってＣＡＤを活性化することができること、また、ＭＴ１−ＭＭＰ依存的なｉＦＩＨの制御にはｉＦＩＨが細胞膜に局在することが必要なことが明らかとなった。
【００６９】
前述のマクロファージを用いた実験で、ＭＴ１−ＭＭＰがＦＩＨ−１を抑制することでＡＴＰ産生を促進することを示した（図３）。そこでｉＦＩＨがこのプロセスに関係しているかについて解析した。ｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスベクターを用いてｉＦＩＨの発現量を減少させると、野生型のマクロファージのＡＴＰ量は約５０％程度に低下した（図１１、ＷＴ、ｓｈｉＦＩＨ）。一方、ＭＴ１−ＭＭＰ欠損マクロファージのＡＴＰ量（野生型の約４０％）はｉＦＩＨ−１の発現減少によって影響を受けなかった（図１１、ＭＴ１−／−、ｓｈｉＦＩＨ）。
以上の結果より、ｉＦＩＨはマクロファージにおいてＭＴ１−ＭＭＰによるＡＴＰ産生の制御に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。
【００７０】
２−６．ＭＴ１−ＭＭＰは細胞内領域依存的にｉＦＩＨとＦＩＨ−１との結合を促進する。
これまでの結果から、ｉＦＩＨとＦＩＨ−１との結合がＦＩＨ−１の抑制に重要なこと（図７、８）、ＭＴ１−ＭＭＰによるＦＩＨ−１の抑制にはｉＦＩＨが必要であることが明らかとなった（図１０、１１）。そこで細胞レベルでのＭＴ１−ＭＭＰによるＦＩＨ−１の抑制は、ｉＦＩＨとＦＩＨ−１との結合を促進することによるのではないかと考えられた。この可能性を検証するために、まずＦＬＡＧタグ標識したＦＩＨ−１を安定発現するＨＥＫ２９３細胞を作製し、さらにその細胞にＭｙｃタグ標識したＭＴ１−ＭＭＰ及び細胞内領域を欠損した変異体（ｄＣＰ）を安定発現させた細胞を作製した。セルライセートから抗ＦＬＡＧ抗体ビーズを用いてＦＩＨ−１を免疫沈降し、沈降物中のｉＦＩＨをイムノブロッティングで解析した。その結果、内因性のＦＩＨ−１はどの細胞群でも同程度に共沈降されてきたのに対し、コントロールのＥＧＦＰに比べて、ＭＴ１−ＭＭＰの発現により明確に内因性のｉＦＩＨが共沈降されてきた（図１２）。またこの共沈降の促進にはＭＴ１−ＭＭＰの細胞内領域が重要であった（図１２、ｄＣＰ）。一方、この沈降物中にはＭＴ１−ＭＭＰは検出されなかった。これらの結果により、ＭＴ１−ＭＭＰが細胞内領域依存的にＦＩＨ−１とｉＦＩＨの結合を促進することでＦＩＨ−１の活性を抑制しＨＩＦ−１αを活性化させるというメカニズムが明らかとなった。
【００７１】
参考文献
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【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明は、ＨＩＦ−１の活性を制御する方法及びＨＩＦ−１の活性を制御する化合物のスクリーニング方法を提供する。従って、ＨＩＦ−１が関連する疾患の治療方法及び治療剤の開発に大きく貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、ＨＩＦ−１α ＣＡＤの活性化に必要なＭＴ１−ＭＭＰのドメインの解析結果を示す。（ａ）：上パネル：ＨＩＦ−１αの転写活性をモニターするためのレポーターシステム。ＣＡＤ：ＨＩＦ−１α Ｃ末端転写活性ドメイン：Ｇａｌ４ＢＤ、Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン：ＵＡＳ、Ｇａｌ４結合サイト；ＴＡＴＡ、チミジンキナーゼミニマルプロモーター。下パネル：ＭＴ１−ＭＭＰ 欠損変異体コンストラクト。ＳＰ、シグナルペプチド；Ｐｒｏ、プロペプチド；ＣＡＴ、酵素活性ドメイン；ＨＰＸ、ヘモペキシン様ドメイン；ＴＭ，膜貫通ドメイン；ＣＰ、細胞内領域。ＦＬＡＧタグをＰｒｏとＣＡＴの間に挿入した。ＳＰとＰｒｏは細胞膜へ輸送される途中で切り離される。 （ｂ）：上パネル：ＨＥＫ２９３細胞でのＭＴ１−ＭＭＰコンストラクトのＨＩＦ−１α ＣＡＤレポーター活性における効果。下パネル：ＭＴ１−ＭＭＰコンストラクトの発現をイムノブロッティングで確認した。（ｃ、ｄ）：ＭＴ１−ＭＭＰ欠損変異体をＭＴ１−／− マクロファージに導入した際のＡＴＰ量（ｃ）及び運動能（ｄ）に対する影響の解析。ＭＴ１−／−マクロファージにレンチウイルスベクターでＭＴ１−ＭＭＰ欠損変異体発現遺伝子を導入し、ＭＴ１−ＭＭＰ変異体の発現をＲＴ−ＰＣＲで確認した（ｃ、下パネル）。ＡＴＰ量を遺伝子導入７２時間後に測定した（ｃ、上パネル）。運動能は、マトリゲルをコートしていないトランスウェル上に細胞を撒き２時間後に下のチャンバーに移動した細胞をカウントした（ｄ）。（ｂ−ｄ）データは平均値±標準偏差で示し、スチューデントｔ検定で解析した。＊ｐ＜ ０．０５、＊＊ｐ ＜ ０．０１。
【図２】図２はＭＴ１−ＭＭＰ細胞内領域変異体のＨＩＦ−１α ＣＡＤの活性化能の解析結果を示す。（ａ、ｂ）：ＭＴ１−ＭＭＰの細胞内領域（ＣＰ）変異体のＣＡＤ活性化能の解析。ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ連続欠損変異体（ａ）及びＣＰ１３−１６のアラニン置換変異体（ｂ）のＣＡＤレポーターに対する影響を解析した。コンストラクトを左側のパネルに、ＣＡＤレポーターに対する影響を右のパネルに表示した。各変異体の発現をイムノブロッティングで確認した（下パネル）。データは平均値±標準偏差で示し、スチューデントｔ検定で解析した。＊ｐ＜ ０．０５、＊＊ｐ ＜ ０．０１。
【図３】図３は、ＭＴ１−ＭＭＰによるＨＩＦ−１αの転写活性の上昇はＦＩＨ−１を介したものであることを示す。（ａ）：ＨＥＫ２９３細胞におけるＦＩＨ−１の発現抑制。２つの異なるｓｈＲＮＡ（＃１及び＃２配列）を発現させ、ＦＩＨ−１の発現量をイムノブロティングで解析した。（ｂ）：ＣＡＤレポーター活性におけるｓｈＲＮＡの影響。（ｃ）：ＷＴ及びＭＴ１−／−マクロファージにおけるＦＩＨ−１の発現抑制。マクロファージにレンチウイルスベクターを用いてｓｈＲＮＡを発現させ、ＦＩＨ−１のｍＲＮＡ量をリアルタイムＰＣＲで解析した。（ｄ）：ＷＴ及びＭＴ１−／−マクロファージのＡＴＰ量におけるＦＩＨ−１の発現抑制の影響。ＦＩＨ−１の発現量を減少させることにより、ＷＴ及びＭＴ１−／−マクロファージのＡＴＰ量に変化が無くなった。（ｂ，ｄ）データは平均値±標準偏差で示し、スチューデントｔ検定で解析した。＊＊ｐ ＜ ０．０１。
【図４】図４は、ＭＴ１−ＭＭＰの細胞内領域がＦＩＨ−１に直接結合することを示す。（ａ）：ＭＴ１−ＭＭＰの細胞内領域（ＣＰ）とＦＩＨ−１との直接的結合の解析。Ｉｎインビトロ プルダウンアッセイをＧＳＴ−ＣＰ融合タンパク及び（Ｈｉｓ）６標識したＦＩＨ−１タンパクを用いて行った。ＣＰに結合したＦＩＨ−１をイムノブロッティン（ＩＢ）で検出した。ＦＩＨ−１とＧＳＴ−ＣＰとの結合はＣＰペプチドで競合されたがコントロールペプチドでは競合されなかった。（ｂ）：ＣＰ１４でのＲ／Ａ置換のＣＰ−ＦＩＨ−１結合に対する影響をプルダウンアッセイを用いて解析した。（ｃ）Ｒ／Ａ置換ＭＴ１−ＭＭＰをＭＴ１−／−マクロファージに導入した際のＡＴＰ量に対する影響。マクロファージに図中に示したコンストラクトをレンチウイルスベクターを用いて遺伝子導入した。上パネル：ＲＴ−ＰＣＲによるＭＴ１−／−マクロファージにおけるＭＴ１−ＭＭＰｍＲＮＡの発現の確認。下パネル：ＡＴＰ量。データは平均値±標準偏差で示し、スチューデントｔ検定で解析した。＊ｐ＜ ０．０５。
【図５】図５は、ＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨがＦＩＨ−１と結合することを示す。（ａ）：ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーを用いたＹｅａｓｔ ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄ スクリーニングの後、８つのタンパクをＦＩＨ−１と結合する候補として選んだ。これらのタンパクにＦＬＡＧタグを付加してＨＥＫ２９３細胞に発現させ、Ｍｙｃタグ標識したＦＩＨ−１との結合能を解析した。候補タンパクをセルライセートから抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫沈降（ＩＰ）し（上パネル）、沈降物中の候補タンパクを抗ＦＬＡＧ抗体を用いたイムノブロティング（ＩＢ）で検出した。免疫沈降（ＩＰ）物中のＦＩＨ−１およびセルライセート（ＷＣＬ）中のＦＩＨ−１をイムノブロッティングで検出した（下パネル）。ＦＩＨ−１，ｆａｃｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ＨＩＦ−１；ｍｏｃｋ，ｍｏｃｋ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ；ＡＰＢＡ３，ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｅｍｂｅｒ ３；ＣＣＭ２，ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃａｖｅｒｎｏｕｓ ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ ２；ＥＨＤ１，ＥＨ−ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １；ＭＣＭ４，ｍｉｎｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ４；ＭＲＰＬ３８，ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ３８；ＮＦＫＢＩＡ，ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ｋａｐｐａ ｌｉｇｈｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｇｅｎｅ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｉｎＢ−ｃｅｌｌｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｌｐｈａ；ＰＡＦＡＨ１Ｂ２，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｐｌａｔｅｌｅｔ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ａｃｅｔｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍ Ｉｂ ｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ ３０ｋＤａ；ＳＨ３ＢＬＧ１，ＳＨ３−ｄｏｍａｉｎ ＧＲＢ２−ｌｉｋｅ ｅｎｄｏｐｈｉｌｉｎ Ｂ１．ＦＩＨ−１はＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨとのみ共沈降した。（ｂ）：Ｖ５タグ標識した ＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨ とＦＬＡＧタグ標識したＦＩＨ−１をＨＥＫ２９３細胞に発現させた。免疫沈降（ＩＰ）を上述の通りに行い、イムノブロッティング（ＩＢ）を図中に示した抗体を用いて行った。ＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨはＦＩＨ−１と共沈降した。
【図６】図６は、ＭＴ１−ＭＭＰおよびＭＴ５−ＭＭＰの細胞内領域のＧＳＴ融合タンパクを用いたＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨのプルダウンアッセイの結果である。 Ｈｉｓ６標識したＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨをＧＳＴ融合タンパク（ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＭＴ１ＣＰ、ＧＳＴ−ＭＴ５ＣＰ、ＧＳＴ−ＦＩＨ−１）付加セファロースビーズを用いてプルダウンアッセイで解析した。ＧＳＴ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、ＧＳＴ−ＭＴ１ＣＰ，ＭＴ１−ＭＭＰ細胞内領域−ＧＳＴ融合タンパク；ＧＳＴ−ＭＴ５ＣＰ，ＭＴ５−ＭＭＰ細胞内領域−ＧＳＴ融合タンパク；ＧＳＴ−ＦＩＨ−１，ＦＩＨ−１−ＧＳＴ融合タンパク。ビーズに結合したＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨを抗Ｈｉｓ６抗体を用いてイムノブロッティングで検出した（上パネル）。ビーズに付加したＧＳＴタンパクを抗ＧＳＴ抗体で検出した。ＧＳＴ−ＦＩＨ−１がＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨと最もよく結合し、ＧＳＴ−ＭＴ５ＣＰがそれより少なく結合した。この実験条件ではＧＳＴ−ＭＴ１ＣＰとＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨとの結合は検出できなかった。
【図７】図７は、ＡＰＢＡ３とＨＩＦ−１αがＦＩＨ−１と競合的に結合することを示す。（ａ）：ＡＰＢＡ３および各フラグメントの構造：全長（ｆｕｌｌ）、Ｎ末端（Ｎ）及びＣ末端（Ｃ）領域（上パネル）。Ｎ末端領域（Ｎ）には既知のドメイン構造は含まれない。Ｃ末端領域（Ｃ）にはＰＴＢドメイン１つとＰＤＺドメイン２つが含まれる。図中に示した数字はアミノ酸番号を表す。ＦＩＨ−１およびＮ末端フラグメントの構造（下パネル）：ＣＵＰＩＮ；酵素活性を担うｃｕｐｉｎ様ドメイン、黒ボックス；二量体化ドメイン；ＦＩＨ−１Ｎ，Ｎ末端フラグメント。（ｂ）：Ｉｎ Ｍｙｃタグ標識したＦＩＨ−１とＦＬＡＧタグ標識したＡＰＢＡ３の全長（ｆｕｌｌ）、Ｎ末端フラグメント（Ｎ）又はＣ末端フラグメント（Ｃ）をＨＥＫ２９３細胞に発現させた。ＦＬＡＧタグ標識したタンパクを免疫沈降（ＩＰ）し抗ＦＬＡＧ抗体を用いてイムノブロット（ＩＢ）により検出した（上パネル）。沈降物（ＩＰ）およびセルライセート（ＷＣＬ）中のＦＩＨ−１を抗Ｍｙｃ抗体を用いてイムノブロティング（ＩＢ）で検出した（下パネル）。（ｃ）：ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＦＩＨ−１、ＧＳＴ−ＦＩＨ−１Ｎを付加したビーズを用いたプルダウンアッセイ。イムノブロティングによりＨｉｓ６タグ標識したＡＰＢＡ３Ｎフラグメント、ＨＩＦ−１α ＣＡＤ、又はＶＨＬを検出した。（ｄ）：ＧＳＴ−ＦＩＨ−１を付加したビーズを用いてＨｉｓ６タグ標識したＨＩＦ−１αＣＡＤのプルダウンアッセイを図中に示した量のＨｉｓ６標識ＡＰＢＡ３Ｎフラグメント存在下で行った。（ｅ）：ＧＳＴ−ＦＩＨ−１を付加したビーズを用いてＨｉｓ６タグ標識したＶＨＬタンパクのプルダウンアッセイを図中に示した量のＨｉｓ６標識ＡＰＢＡ３Ｎフラグメント存在下で行った。
【図８】図８は、ＡＰＢＡ３がＦＩＨ−１のＨＩＦ−１αに対する転写活性抑制機能を阻害することを示す。（ａ）：ＨＥＫ２９３にＡＰＢＡ３発現コンストラクト（ＡＰＢＡ３、白ボックス）又はコントロールベクター（ｍｏｃｋ、黒ボックス）を遺伝子導入し、相対的ルシフェラーゼ活性を測定した。内因性のＦＩＨ−１の発現をｓｈＲＮＡ配列ｓｈＦＩＨ＃１及びｓｈＦＩＨ＃２を用いて抑制した。ネガティブコントロールとしてβガラクトシダーゼをコードする遺伝子（ＬａｃＺ）に対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＬａｃＺ）を使用した。ＭｏｃｋベクターおよびｓｈＬａｃＺを導入した細胞を１００％とした相対的ルシフェラーゼ活性を示した。（ｂ）：ｓｈＬａｃＺ、ｓｈＦＩＨ＃１、ｓｈＦＩＨ＃２発現ＨＥＫ２９３細胞のＦＩＨ−１の発現をイムノブロッティングで解析した。（ｃ）：ルシフェラーゼの発現を用いてＡＰＢＡ３全長、Ｎ末端、Ｃ末端フラグメントのＨＩＦ−１α ＣＡＤ の転写活性に対する影響を測定した。コントロールベクターを遺伝子導入した細胞を１００％とした相対的ルシフェラーゼ活性を示した。データは平均値±標準偏差（ｎ＝３）で示し、スチューデントｔ検定で解析した。＊＊ｐ ＜ ０．０１。
【図９】図９は、ｉＦＩＨ／ＡＰＢＡ３がＭＴ１−ＭＭＰによるＦＩＨ−１の抑制に必要であることを示す。（ａ）：ｉＦＩＨに対するｓｉＲＮＡ（ｉＦＩＨｓｉＲＮＡ；オープンボックス）又はコントロール用のｓｉＲＮＡ（ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ；黒ボックス）をＨＥＫ２９３細胞に導入した後にＭＴ１−ＭＭＰ（ＭＴ１Ｆ）又はコントロールベクター（ｍｏｃｋ）とレポータープラスミドを遺伝子導入した。コントロールｓｉＲＮＡおよびｍｏｃｋ導入細胞のルシフェラーゼ活性を１００％とした相対的ルシフェラーゼ活性を求めた。データは平均値±標準偏差（ｎ＝３）で示し、スチューデントｔ検定で解析した。＊＊ｐ＜ ０．０１。（ｂ）：イムノブロッティングによりｉＦＩＨ、ＭＴ１−ＭＭＰ、ａｃｔｉｎ （ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）を検出した。
【図１０】図１０は、ｉＦＩＨ／ＡＰＢＡ３がＭＴ１−ＭＭＰと協調的に働くには膜への局在が必要であることを示す。（ａ）：ＭＴ１−ＭＭＰ、ｉＦＩＨ，ｉＦＩＨ Ｎ末端フラグメント（ｉＦＩＨ−Ｎ）をＨＥＫ２９３細胞に共発現させた。ＨＩＦ−１αＣＡＤの活性をルシフェラーゼ活性でモニターし、ｍｏｃｋベクターを導入した細胞のルシフェラーゼ活性を１００％とした相対的ルシフェラーゼ活性を示した（上パネル）。ＭＴ１−ＭＭＰ又はｉＦＩＨの発現をイムノブロッティングで確認した（下パネル）。矢印は内因性のｉＦＩＨである。データは平均値±標準偏差（ｎ＝３）で示し、スチューデントｔ検定で解析した。＊＊ｐ＜０．０１。（ｂ）：ＡＰＢＡ３／ｉＦＩＨ、ＡＰＢＡ３−Ｎ／ｉＦＩＨ−Ｎ及びＭｙｒ−ＡＰＢＡ３−Ｎ ／Ｍｙｒ−ｉＦＩＨ−Ｎの局在。ＦＬＡＧタグ標識したｉＦＩＨ、ｉＦＩＨ−Ｎ及びＭｙｒ−ｉＦＩＨ−ＮをＨＥＫ２９３細胞に発現させた。これらタンパクの細胞内での局在を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて解析した。核をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で対比染色した。ｉＦＩＨ−Ｎに比べ、Ｍｙｒ−ｉＦＩＨ−Ｎは細胞の周辺部により局在している。
【図１１】図１１は、マクロファージにおいてｉＦＩＨがＭＴ１−ＭＭＰによるＡＴＰ産生の促進に必要であることを示す。ｓｈＲＮＡ用いてＷＴ及びＭＴ１−／−マクロファージのｉＦＩＨの発現を抑制した。ＬａｃＺ遺伝子に対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＬａｃＺ）をネガティブコントロールとして用いた。細胞内ＡＴＰ量を測定し（上パネル）、タンパクの発現を図中に示した抗体を用いてイムノブロッティングで確認した（下パネル）。データは平均値±標準偏差（ｎ＝３）で示し、スチューデントｔ検定で解析した。＊＊ｐ ＜ ０．０１。
【図１２】図１２は、ＭＴ１−ＭＭＰが細胞内領域依存的にＦＩＨ−１とｉＦＩＨとの結合を促進することを示す。ＨＥＫ２９３細胞にＦＬＡＧタグ標識したＦＩＨ−１と、ネガティブコントロール（ＥＧＦＰ）、ＭＴ１−ＭＭＰ（ＭＴ１）、又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰ欠損変異体（ｄＣＰ）を共発現させた。セルライセート（ＷＣＬ）および抗ＦＬＡＧ抗体免疫沈降物（ＩＰ）を図中に示した抗体を用いてイムノブロッティングで解析した。内因性のＦＩＨ−１（矢印）がＦＬＡＧ標識したＦＩＨ−１とホモ二量体を形成しているのが観察される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内のｉＦＩＨタンパク質とＦＩＨ−１タンパク質との相互作用を増強又は低下させて、ＨＩＦ−１αの活性を促進又は阻害する方法。
【請求項２】
前記ＦＩＨ−１タンパク質がＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰと相互作用している請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＲＮＡｉ法によりｉＦＩＨ−１タンパク質の発現を低下させて、ｉＦＩＨタンパク質とＦＩＨ−１との相互作用を低下させる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞内のＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとＦＩＨ−１タンパク質との相互作用を増強又は低下させて、ＨＩＦ−１αの活性を促進又は阻害する方法。
【請求項５】
前記ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとＦＩＨ−１タンパク質との相互作用の低下が、配列番号１２で表されるアミノ酸配列で表されるペプチド、又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、ＦＩＨ−１タンパク質と相互作用を行い、かつ、ＦＩＨ−１タンパク質によるＨＩＦ−１αの活性化を阻害しないペプチドによる競合で達成される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が免疫系の細胞又は腫瘍細胞である請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＨＩＦ−１活性を促進又は阻害する化合物をスクリーニング方法であって、
（ａ）被検試料の存在下において、ＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとを接触させる工程、
（ｂ）ＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとの相互作用を検出する工程、及び
（ｃ）被検試料の非存在下において相互作用を検出した場合と比較して、該相互作用が増強又は低下した場合に該被検試料中に該化合物候補が存在すると判断する工程、
を含む方法。
【請求項８】
ＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとの相互作用をＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとの結合の有無を基準として検出する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
得られた候補化合物が、細胞内のＨＩＦ−１α活性を促進又は阻害することを確認する工程をさらに含む請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項７乃至９のいずれかに記載の方法により単離される化合物。
【請求項１１】
前記化合物が抗体であることを特徴とする請求項１０に記載の化合物。
【請求項１】
細胞内のｉＦＩＨタンパク質とＦＩＨ−１タンパク質との相互作用を増強又は低下させて、ＨＩＦ−１αの活性を促進又は阻害する方法。
【請求項２】
前記ＦＩＨ−１タンパク質がＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰと相互作用している請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＲＮＡｉ法によりｉＦＩＨ−１タンパク質の発現を低下させて、ｉＦＩＨタンパク質とＦＩＨ−１との相互作用を低下させる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞内のＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとＦＩＨ−１タンパク質との相互作用を増強又は低下させて、ＨＩＦ−１αの活性を促進又は阻害する方法。
【請求項５】
前記ＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとＦＩＨ−１タンパク質との相互作用の低下が、配列番号１２で表されるアミノ酸配列で表されるペプチド、又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、ＦＩＨ−１タンパク質と相互作用を行い、かつ、ＦＩＨ−１タンパク質によるＨＩＦ−１αの活性化を阻害しないペプチドによる競合で達成される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が免疫系の細胞又は腫瘍細胞である請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＨＩＦ−１活性を促進又は阻害する化合物をスクリーニング方法であって、
（ａ）被検試料の存在下において、ＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとを接触させる工程、
（ｂ）ＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとの相互作用を検出する工程、及び
（ｃ）被検試料の非存在下において相互作用を検出した場合と比較して、該相互作用が増強又は低下した場合に該被検試料中に該化合物候補が存在すると判断する工程、
を含む方法。
【請求項８】
ＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとの相互作用をＦＩＨ−１タンパク質とｉＦＩＨタンパク質又はＭＴ１−ＭＭＰ−ＣＰとの結合の有無を基準として検出する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
得られた候補化合物が、細胞内のＨＩＦ−１α活性を促進又は阻害することを確認する工程をさらに含む請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項７乃至９のいずれかに記載の方法により単離される化合物。
【請求項１１】
前記化合物が抗体であることを特徴とする請求項１０に記載の化合物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１０−１９５６８４（Ｐ２０１０−１９５６８４Ａ）
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１６２２７２（Ｐ２００７−１６２２７２）
【出願日】平成１９年６月２０日（２００７．６．２０）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月２０日（２００７．６．２０）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
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