ＰＮＨ型白血球の検出方法
【課題】ＰＮＨ型白血球を検出すること。
【解決手段】本発明は生体試料中のＰＮＨ型血球、特にＰＮＨ型白血球を検出する方法を提供する。また本発明は、生体試料中のＰＮＨ型白血球を検出する工程を含む、骨髄不全症候群の検査方法を提供する。本発明の方法は、多彩な病態を持つ骨髄不全症候群の中で、特に免疫病態の存在を正確に検出することができる極めて有用な方法である。それゆえ免疫抑制療法のみでも改善しうる骨髄不全に対して、不用意に不適切な治療を行うことが避けられるので、臨床分野において極めて利用価値が高い。
【解決手段】本発明は生体試料中のＰＮＨ型血球、特にＰＮＨ型白血球を検出する方法を提供する。また本発明は、生体試料中のＰＮＨ型白血球を検出する工程を含む、骨髄不全症候群の検査方法を提供する。本発明の方法は、多彩な病態を持つ骨髄不全症候群の中で、特に免疫病態の存在を正確に検出することができる極めて有用な方法である。それゆえ免疫抑制療法のみでも改善しうる骨髄不全に対して、不用意に不適切な治療を行うことが避けられるので、臨床分野において極めて利用価値が高い。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＮＨ型白血球の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄不全とは、血球減少を呈する疾患のうち、その原因が血球の破壊の亢進や、骨髄の占拠性病変による二次的な造血障害ではなく、造血幹細胞の量的・質的異常のために血球産生が持続的に減少した状態のことをいう。骨髄不全には、薬剤性再生不良性貧血（ａｐｌａｓｔｉｃ ａｎｅｍｉａ、ＡＡ）などの二次性造血障害のほか、骨髄異形成症候群（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＭＤＳ）、不応性貧血（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ａｎｅｍｉａ、ＲＡ）、発作性夜間血色素尿症（ｐａｒｏｘｙｓｍａｌ ｎｏｃｔｕｒｎａｌ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｕｒｉａ、ＰＮＨ）などの特発性の造血障害が含まれる。これらの疾患は互いの境界が必ずしも明瞭ではなく、相互に移行することがある。またこれらの疾患には、自己免疫障害による造血障害と造血幹細胞自身の異常による造血障害とが混在しており、骨髄不全はこれらを総称して骨髄不全症候群と総称される場合もある。
【０００３】
ところで骨髄不全に対するプライマリーケアにおいてもっとも重要なポイントは、免疫抑制療法のみでも改善する可能性の高い骨髄不全に対して、不用意に毒性の強い治療をしないことである。そのためには骨髄不全の患者や骨髄不全疑いの患者において、予め免疫病態を正確に診断する必要がある。すなわち臨床の現場においては、（１）自己免疫的障害による骨髄不全；つまり免疫抑制療法を中心とする薬物療法によって治療可能な骨髄不全と（２）薬物療法では治療できない；すなわち造血幹細胞自身の異常による造血障害であり、造血幹細胞移植を必要とする骨髄不全とを正しく鑑別することが重要であり、この判別を正確に行うことができる方法が求められている。
【０００４】
骨髄不全における免疫病態の診断方法のうち、最も簡便で信頼のおける検査は末梢血におけるＰＮＨ形質の血球（ＰＮＨ型血球）の検出である。ＰＮＨ型血球とはＧＰＩ（Ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）アンカー型膜蛋白質を欠く血球であり、これらはＰＩＧＡ遺伝子に突然変異を来した異常造血幹細胞に由来する。
ＰＮＨ型の異常血球は健常者の末梢血中にもごくわずかに存在するが、正常の造血幹細胞に比べて増殖能が高いわけではないので、一定の割合（０．００３％）以上に増えることはない（非特許文献１）。一方で正常造血幹細胞に対する免疫学的な障害が存在する環境においては、ＰＮＨ型の幹細胞は正常幹細胞に比べてＴ細胞による障害を受けにくいため、ＰＮＨ型血球が相対的に増加すると考えられている。
【０００５】
ＰＮＨ型血球陽性のＡＡは、陰性のＡＡに比べてＡＴＧ・シクロスポリン併用療法の奏効率が有意に高く、また長期予後も良好であることが示されている（非特許文献２）。またＰＮＨ血球増加ＲＡの患者においては、非増加ＲＡの患者に比べてシクロスポリン療法の奏効率が高く、白血病への移行率が低い傾向が認められる（非特許文献３）。すなわちＰＮＨ型血球は、自己免疫障害による骨髄不全症例に限って発現していることが理解できる。
以上のことから、ＲＡやＡＡといった骨髄不全症例において治療方針を決定する上で、ＰＮＨ型血球の検出を臨床前段階において正確に行うことは極めて重要であることがわかる。
【０００６】
ＰＮＨ型血球の有無は、通常、血算に用いられる残りの血液などを用い、血球表面抗原をフローサイトメトリーの手法で検出することによって容易に判別することができる。しかしながら現在一般的に行われている、血球表面抗原に対する抗体を用いたフローサイトメトリーによる血球の検査方法（以下、「従来法」と記載）では、０．０１％未満のＰＮＨ型血球を正確に検出することは極めて困難である。これは、当業者であれば誰でも０．０１％未満という超微量なＰＮＨ型血球を検出可能なわけではなく、ＰＮＨ型血球の検出には高いレベルでフローサイトメトリーに習熟していることが必要であるからである。特に抗体を使用する以上、フローサイトメトリーには非特異的なノイズが生じるため、僅かなＰＮＨ型血球のシグナルに対する当該ノイズを除去すべく、本来のＰＮＨ型血球のシグナルと当該ノイズとを主観的かつ経験的な判断に基づいて区別しなければならないという問題点もあった。
【０００７】
ＡＡ患者を対象としてＰＮＨ型血球を従来法で検出した海外の報告では、ＰＮＨ型血球の増加がみられる例の割合は３０％前後と低率であることが開示されている（非特許文献４）。しかしながら、これらの報告ではＰＮＨ型血球検出の特異性が低いため、健常者でも１％までのＰＮＨ型血球が検出されており、さらにＰＮＨ型血球が増加しているＡＡ患者と健常者との間には明確な境界が示されていない。このような特異性の低さが、ＰＮＨ型血球の増加が３０％前後のＡＡ患者にしか認められなかった原因であった。
【０００８】
以前本発明者らは、ＦＩＴＣでラベルした抗ＣＤ５５抗体・抗ＣＤ５９抗体と、ＰＥでラベルした抗ＣＤ１１ｂ抗体（顆粒球用）または抗グリコフォリンＡ抗体（赤血球用）を用いて、細胞のゲーティングを工夫すれば、健常者におけるＰＮＨ型血球の割合とＡＡ等のＰＮＨ増加例におけるＰＮＨ型血球の割合との境界を、０．００３％まで下げることが可能であることを開示している（非特許文献２）。この方法（以下、「高感度法」と記載）は従来法と比して特異性・感度が高いため、再生不良性貧血患者の６割においてＰＮＨ型血球の増加を検出することができた。しかしこの方法では、調べる血球の種類に応じて異なる抗体を用いる必要があるため、多種類の血球系統でＰＮＨ型血球を検出するのが煩雑であった。さらに、採血から時間が経った検体では、血球に対する抗体の結合性が低下するため、真のＰＮＨ型血球だけを算定するためには、習熟した担当者による主観的かつ経験的な判断が必要であった。そのため、フローサイトメトリーに習熟していない者であっても、正確かつ迅速にどの系統の血球であってもＰＮＨ型血球を検出できる方法が求められていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ａｒａｔｅｎ ＤＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９９；９６：５２０９−５２１４．
【非特許文献２】Ｓｕｇｉｍｏｒｉ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００６；１０７：１３０８−１３１４．
【非特許文献３】Ｗａｎｇ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００２；１００：３８９７−３９０２．
【非特許文献４】Ｍａｃｉｅｊｅｗｓｋｉ ＪＰ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ， ２００２；１１５：１０１５−１０２２．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
骨髄不全症候群の免疫病態を治療前段階で正確に診断することができる方法が望まれている。具体的には、ＰＮＨ型血球、特にＰＮＨ型顆粒球および単球を簡便な方法で正確に検出できる方法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、顆粒球抗原（ＣＤ１１ｂ）、単球抗原（ＣＤ３３）などといった白血球表面抗原に対する抗体とＦＬＡＥＲとを組み合わせたフローサイトメトリーを行うことによって、血球中の微量のＰＮＨ型白血球（ＰＮＨ型顆粒球、ＰＮＨ型単球など）を簡便かつ正確に定量することができることを初めて見出した。特に当該フローサイトメトリーにおける波形処理をデジタル化して行うことで、従来の抗ＧＰＩ−ＡＰ抗体法を用いた場合に主観的な判断が要求されていたＰＮＨ型白血球の判別を、誰でもできるようになることを見出した。
本発明者らはこれらの知見に基づいてさらに鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち本発明は、
［１］ＦＬＡＥＲおよび少なくとも一種の抗白血球表面抗原抗体を用いてフローサイトメトリーを行うことを含む、ＰＮＨ型白血球の検出方法；
［２］フローサイトメトリーにおける波形処理がデジタル化されている、［１］に記載の方法；
［３］抗白血球表面抗原抗体が、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ３抗体からなる群、あるいは抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体および抗ＣＤ５６抗体からなる群から選択される、［１］または［２］に記載の方法；
［４］二種類以上のＰＮＨ型白血球を同時に検出することを特徴とする、［３］に記載の方法；
［５］ＦＬＡＥＲおよび抗白血球表面抗原抗体を用いてフローサイトメトリーを行うことを含む、骨髄不全症候群の検査方法；
［６］フローサイトメトリーにおける波形処理がデジタル化されている、［５］に記載の方法；
［７］抗白血球表面抗原抗体が、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ３抗体からなる群、あるいは抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体および抗ＣＤ５６抗体からなる群から選択される、［５］または［６］に記載の方法；
［８］骨髄不全症候群が自己免疫性であると診断できる、［５］〜［７］のいずれか一に記載の方法；
［９］自己免疫性骨髄不全症候群と造血幹細胞異常性骨髄不全症候群の判別方法である、［５］〜［７］のいずれか一に記載の方法；
［１０］骨髄不全症候群に対する免疫抑制療法の適否の判別方法である、［５］〜［９］のいずれか一に記載の方法；
などに関する。
【発明の効果】
【００１３】
ＰＮＨ型白血球は健常者の末梢血中にもごくわずかに存在しているが、その割合は、通常、全体の０．００１％程度に過ぎない。このため、ＰＮＨ型白血球が増加しているか否かを判定するためには０．００１％オーダーのＰＮＨ型白血球を正確に定量する必要がある。ＰＮＨ型白血球はＧＰＩアンカー型膜蛋白質が「欠失」している血球であるため、従来は、抗ＧＰＩアンカー型膜蛋白抗体が結合しないという性質を利用してこの血球を検出していた。しかし、細胞の抗体処理の過程で傷んだ細胞は抗ＧＰＩアンカー型膜蛋白抗体との結合性が弱くなるため、フローサイトメトリーのドットグラム上で、真のＰＮＨ型白血球とは位置が異なるものの、ＰＮＨ型白血球と紛らわしいところに位置するようになる。このような偽のＰＮＨ白血球集団を真のＰＮＨ型白血球と判別するには多くの経験に基づいた主観的な判断が必要であった。
【００１４】
本発明の方法はこれらの問題を一挙に解決し、簡便かつ正確にＰＮＨ型白血球を検出可能にするものである。本発明の方法を適用することによって、ＰＮＨ型白血球の検出における（１）非特異的反応に基づくノイズの発生が抑制されるだけでなく、（２）ＰＮＨ型白血球の細胞集団がドットグラム上に明瞭に描出される。これにより、ＰＮＨ型白血球の検出に携わる者のフローサイトメトリーへの習熟度合いに関係なく、多くの施設でＰＮＨ型白血球を容易に検出することが可能となる。さらに白血球に特徴的な各表面抗原に対する抗体と組み合わせることで、（３）どのような種類のＰＮＨ型白血球（ＰＮＨ型顆粒球、ＰＮＨ型単球、ＰＮＨ型リンパ球など）でも一度に検出することが可能である。
当該検出方法を利用することで、骨髄不全症候群の免疫病態を診断することができる。ＰＮＨ型白血球は自己免疫性の骨髄不全症例において有意に増加することから、本発明の方法により、自己免疫性の骨髄不全症候群を、造血幹細胞自身の異常に基づく骨髄不全と鑑別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１−１】本発明の方法を使用して、ＰＮＨ型顆粒球を検出するためのゲーティングを示す図である。
【図１−２】本発明の方法を使用して、健常人５０例を対象にＰＮＨ型顆粒球の閾値について解析した結果である。
【図２−１】本発明の方法を使用して、ＰＮＨ型単球を検出するためのゲーティングを示す図である。
【図２−２】本発明の方法を使用して、健常人５０例を対象にＰＮＨ型単球の閾値について解析した結果である。
【図２−３】本発明の方法を使用してＰＮＨ型Ｔ細胞（ａ〜ｃ）、ＰＮＨ型Ｂ細胞（ｄ）およびＰＮＨ型ＮＫ細胞（ｅ）を検出した結果である。
【図２−４】本発明の方法を使用してＰＮＨ型Ｔ細胞（ａ〜ｃ）、ＰＮＨ型Ｂ細胞（ｄ）およびＰＮＨ型ＮＫ細胞（ｅ）の閾値について解析した結果である。
【図３】ＰＮＨ型白血球の検出精度について、本発明の方法（Ｃ法）と、従来法（Ａ法）および高感度検出法（Ｂ法）とを比較した図である。
【図４】高感度検出法によりＰＮＨ型赤血球を検出した結果である。
【図５】ＡＡ患者において、ＰＮＨ型白血球の有無が免疫抑制療法の奏効率や生存率に影響することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１．ＰＮＨ型血球の検出方法
本明細書における「ＰＮＨ型白血球」とは、ＰＩＧＡ遺伝子に変異を来した造血幹細胞に由来するＧＰＩアンカー型膜蛋白質欠失白血球のことをいう。ＰＩＧＡ遺伝子においては、通常、一定の割合で突然変異が発生することから健常者でもごく少数のＰＩＧＡ変異幹細胞を有するが、健常者の骨髄に存在するこの変異造血幹細胞は静止期に留まり続けるため、この幹細胞由来のＰＮＨ型白血球が末梢血中に検出されることはない（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１２：２１６０−２１６２（２００８））。
一方、正常造血幹細胞に対する免疫学的な障害が存在する環境（例えば自己免疫性の骨髄不全症例）では、ＰＩＧＡ遺伝子に変異を来した造血幹細胞はＧＰＩアンカー型膜蛋白質を欠失しているため、正常幹細胞に比べてＴ細胞による障害を受けにくい。このような環境ではＰＩＧＡ変異幹細胞が生き残るため、ＰＮＨ型白血球が相対的に増加すると考えられる。
とはいえ、このような症例においてもＰＮＨ型白血球は血球全体の僅か０．１％前後しか存在しないため、ＰＮＨ型白血球の検出には極めて高感度のフローサイトメトリーを用いる必要がある。本発明の検出方法は、このような微量ＰＮＨ型白血球の検出に特に適したフローサイトメトリーの新たな手段を提供するものである。
【００１７】
上記「ＧＰＩアンカー型膜蛋白」とは、ＧＰＩアンカーと呼ばれる、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、グルコサミン（ＧｌｃＮ）、３つのマンノース（Ｍａｎ）、エタノールアミンリン酸（ＥｔＮ−Ｐ）からなる糖脂質部分に結合して膜表面上に発現する蛋白質全般をいい、現在までに１００種類以上の分子が同定されている。あらゆるＧＰＩアンカー型膜蛋白において、上記糖脂質部分は高い割合で保存されている。ＰＩＧＡ遺伝子に変異を来した造血幹細胞由来の血球はＧＰＩアンカーを製造できず、結果的にＧＰＩアンカー型膜蛋白を産生できなくなっている。
【００１８】
血球において高発現しているＧＰＩアンカー型膜蛋白は血球の種類によって異なる発現パターンを示す。例えば補体制御蛋白質であるＣＤ５５、ＣＤ５９（全血球）、ＨＲＦ（赤血球、血小板）；酵素蛋白質であるアセチルコリンエステラーゼ（赤血球）、アルカリホスファターゼ（好中球）；受容体であるＣＤ１４（単球）、ＣＤ１６（好中球）；接着分子であるＣＤ４８（Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、活性化血小板）、ＣＤ５８（赤血球、顆粒球、リンパ球）、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ（好中球）；ＣＤ７３（Ｂ細胞）、ＣＤ８７（単球、好中球）などが挙げられる。
後述する「ＦＬＡＥＲ（フレア、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ−Ｌａｂｅｌｅｄ ｉｎａｃｔｉｖｅ ｔｏｘｉｎ Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ）」はこれらのＧＰＩアンカー型膜蛋白に結合する。
【００１９】
本明細書において「ＦＬＡＥＲ」とは、細胞表面上のＧＰＩアンカー型蛋白質のＧＰＩアンカー部分、即ち糖脂質部分と特異的に結合する細菌由来の毒素であり、具体的には「遺伝子組換えエロリジン」と呼ばれる種類の蛍光細菌蛋白質である。ＦＬＡＥＲは、ＧＰＩアンカー型蛋白質の蛋白質部分をエピトープとするモノクローナル抗体と異なり、ＧＰＩアンカー部分をエピトープとするため、理論上ほとんどすべてのＧＰＩアンカー型膜蛋白質を認識することができる。
したがってＦＬＡＥＲが結合しない（ＦＬＡＥＲで染色されない）白血球は、ＧＰＩアンカー型膜蛋白（たとえばＣＤ５９）を欠損している白血球として認識されるので、ＰＮＨ型白血球であると判断することができる。
ＦＬＡＥＲには液状とパウダー状の２種類があるが、液状ＦＬＡＥＲであることが望ましい。本発明の方法では、液状ＦＬＡＥＲの方が安定した結果を得ることができる。ＦＬＡＥＲは通常４８８ｎｍで励起し、５３０／３０ｎｍの蛍光を発する。
【００２０】
本明細書において「抗白血球表面抗原抗体」とは、ＦＬＡＥＲと併用しうる抗体であって、各血球系統に特異的に発現している細胞抗原に対する抗体であることが望ましい。本発明においては、例えば、ＰＮＨ型顆粒球を検出する場合は抗ＣＤ１１ｂ抗体を、ＰＮＨ型単球を検出する場合は抗ＣＤ３３抗体を、ＰＮＨ型Ｔ細胞を検出する場合は抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ４抗体または抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ８抗体を、ＰＮＨ型Ｂ細胞を検出する場合は抗ＣＤ１９抗体、そしてＰＮＨ型ＮＫ細胞を検出する場合は抗ＣＤ５６抗体を用いることが好ましい。
また好ましくは、これらの抗体は二つのグループに分けられる。抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ３抗体からなる群は、ＰＮＨ型顆粒球とＰＮＨ型単球を同時に検出するために用いられる。一方で抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体および抗ＣＤ５６抗体からなる群は、ＰＮＨ型のＢ細胞とＴ細胞とＮＫ細胞を同時に検出するために用いられる。
本発明の方法によれば、上記二つのグループのいずれかを選択し、その一種以上の抗体を用いることによって、二種類以上のＰＮＨ型白血球を同時に検出することも可能である。
これらの抗体のクラスは特に限定されず、また市販のものを用いてもよい。
【００２１】
本発明の方法では、フローサイトメトリーを行う前に生体試料から血球成分を得、さらに当該血球成分をＦＬＡＥＲおよび上記抗白血球表面抗原抗体で処理する。
【００２２】
本発明の方法に用いられ得る生体試料としては血球成分を含む限り特に限定されないが、好ましくは血液（特に末梢血）、リンパ液であり、より好ましくはＥＤＴＡまたはヘパリンが添加された末梢血である。
【００２３】
生体試料から血球成分を得る方法としては特に限定されないが、例えば赤血球以外の血球成分を得る場合は、一定速度で遠心分離操作した全血に塩化アンモニウム、炭酸水素カリウム、ＥＤＴＡ・４Ｎａを含む溶血試薬を加えて赤血球を溶血する方法が挙げられる。
【００２４】
一方、血液から赤血球を得るためには、例えば、上記の遠心分離前に取り分けた血液から血漿成分を除き、赤血球層にリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）を加える。これにより赤血球浮遊液が得られる。
【００２５】
得られた血球をＦＬＡＥＲおよび抗白血球表面抗原抗体で処理する方法としては特に限定されず、血球の量、ＦＬＡＥＲ量、抗白血球表面抗体の処理時間、処理温度などの種々の処理条件は、検出するＰＮＨ型白血球の種類やフローサイトメトリーの条件などに合わせて適宜決定することができる。しかしながら、本発明の方法により高感度でＰＮＨ型白血球を検出すべく、本明細書の実施例に記載の処理条件によって実施することが望ましい。
【００２６】
抗白血球表面抗原抗体は、後のフローサイトメトリーにおける検出のために、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ＡＰＣ（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＰＥ−Ｃｙ７、ＡＰＣ、ＡＰＣ−Ｈ７などの蛍光色素や蛍光物質で標識されているものを用いることができる。
【００２７】
またＦＬＡＥＲおよび抗体で処理する際、後述するヒストグラムにおけるゲーティング工程や分析工程において死細胞を除去する目的で、細胞検出マーカーを同時に反応させても良い。一般的には、死細胞を特異的なマーカーを用いて検出し、それらをゲーティングで除外する方法が採用される。死細胞検出マーカーとしては、死細胞ＤＮＡのシトシン−グアニン塩基対の間に結合する７−アミノアクチノマイシン（７−ＡＡＤ）やＡＴ（アデニン・チミン）に富んだ領域に結合するＤＡＰＩなどが挙げられる。これらを指標に後述するゲーティングを行うことによって、不適格な細胞をさらに除去することができ、本発明の目的を達成することができる。
【００２８】
上記蛍光色素や蛍光物質は、検出する白血球の種類や細胞数、フローサイトメトリーの条件設定等によって適宜選択されるが、少なくとも同時に多種類の細胞を検出する目的で複数の抗体等を用いる場合には、それぞれの抗体や細胞検出マーカー等に対して異なる種類の蛍光色素を用いてもよい。
例えばフローサイトメーターとしてＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）を用いる場合、ＰＥ、ＦＩＴＣ、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＰＥ−Ｃｙ７、ＡＰＣ、ＡＰＣ−Ｈ７などの蛍光色素や蛍光物質でそれぞれラベルした複数の抗体や細胞検出マーカー等を同時に用いることが可能である。
【００２９】
これらの操作により、ＦＬＡＥＲおよび一種以上の抗白血球表面抗原抗体が結合した血球の懸濁液（以下「細胞懸濁液」と記載する場合がある）が得られる。
【００３０】
次いで、ＦＬＡＥＲおよび抗白血球表面抗原抗体で処理された血球を検体として、フローサイトメトリーを行う。
フローサイトメトリーの手法としては特に限定されないが、波形処理がデジタル化される（つまり「デジタル波形処理方式」を採用する）フローサイトメーターを用いることが望ましい。
すなわち、本発明における好ましい「フローサイトメトリー」とは、デジタル波形処理（「デジタル波形処理方式」）が可能なフローサイトメーターを用いて行うフローサイトメトリーを意味する。なお、本明細書中、フローサイトメトリーに用いられる機器のことをフローサイトメーターと称する。
【００３１】
本明細書における「デジタル波形処理方式」とは、ＰＭＴ（ｐｈｏｔｏ ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ ｔｕｂｅ）検出器から得られた蛍光パルスシグナルを各種方法によってＡＤ変換し、得られた値を解析することをいう。ＡＤ変換とは、アナログ信号をデジタル信号へ変換することをいう。
特に後述するように、フローサイトメトリーとしてＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）を採用した場合の「デジタル波形処理方式」としては、例えば上記蛍光パルスシグナルを直接２６２，１４４チャネルの解像度でリニアデータにＡＤ変換し、その後Ｌｏｇ対数換算及び蛍光補正（逆行列処理）によって数値演算処理プロセッサー（ｄｉｇｉｔａｌ ｓｉｇｎａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｒ；ＤＳＰ）によって解析することをいう。
【００３２】
本発明の方法は、ＦＬＡＥＲおよび抗白血球表面抗原抗体と、デジタル波形処理が可能なフローサイトメトリーとを組み合わせることが、ＰＮＨ型白血球の検出に最も適した手段であることを初めて見出したことに基づいて完成したものである。
【００３３】
上記デジタル波形処理方式を実現できるフローサイトメーターとしては、例えば、ＦＡＣＳＣａｎｔｏやＢＤ ＬＳＲ２、ＦＡＣＳＡｒｉａなどが挙げられるが、なかでもＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）が好ましい。ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）は、使用方法が簡便化されているので、多くの検体を取り扱う一般臨床技師にも扱いやすく本発明の方法に最も適したフローサイトメーターであると言える。以下、ＦＡＣＳＣａｎｔｏを一例として、フローサイトメーターについて説明する。
【００３４】
フローサイトメーターに付す血球懸濁液は単一（細胞非集合）の懸濁液として調製し、血球一個ずつをレーザー光に通過させる。
細胞懸濁液には死細胞やデブリスが含まれており、これらはフローサイトメトリーにおけるノイズを発生させる原因となる。また正しいデータを得るためには細胞は一個ずつフローされる必要がある。したがって上記懸濁液をフローサイトメーターに付す前には、細胞懸濁液中の細胞はできるだけ一つずつの細胞に均一化したうえ、死細胞やデブリスなどの不純物はできるだけ除去することが望ましい。均一化には自体公知の一般的手法を適用でき、例えば細胞懸濁液のフィルタリングや、ボルテックス操作などを各操作のプロトコールに準じて行う。
フィルタリングに用いられるフィルターとしては、死細胞の集塊やデブリスが除けるメッシュサイズを有するものであれば特に限定されないが、例えばポア径（４０μｍ）のナイロンメッシュが挙げられる。
フローサイトメーターに付す前には、再度デブリスや細胞塊が残っていないかどうかを視認し、残っていれば改めて上記フィルターに通すことが望ましい。
【００３５】
細胞懸濁液中の細胞一つずつをレーザー光に通過させるべく、フローサイトメトリーにおいては、単一の細胞が連続して流れるサンプル液流とそれを包むシース液流とからなるサンプルコアを形成する必要がある。上記サンプルコア内で一個の細胞がビーム中央を通過するように流れを調節し、かつ一度に複数の細胞が照射されないよう、レーザー光はできるだけ集束させて強度を高めることが好ましい。
【００３６】
レーザー光の強度は、ビーム中心部から縁に行くに従って弱くなるため、感度及び分解能を高めるため、全ての細胞が同じ経路でビーム中心部を通るのが好ましい。そのため、上記サンプルコアの直径は小さいほど好ましい。これらの設定は、当業者であればどのようなフローサイトメーターを用いた場合でも適宜設定可能である。
【００３７】
上記サンプルコアの流速は特に限定されず、感度、分解能、処理速度などの関係で当業者が適宜設定することが可能であるが、本発明が微量のＰＮＨ型白血球の検出を目的としている関係上、できるだけ低速であることが望ましい。
特にフローサイトメータとしてＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）を用いた場合、上記サンプルフローの値を制御するシース圧（上記シース液の入った容器に対する圧力）は４．５ｐｓｉに固定されているが、サンプル流への圧力は数値化（ｐｓｉ）されておらず、サンプルが吸引される量がＬｏｗ＝１０μＬ／ｍｉｎ、Ｍｅｄ＝６０μＬ／ｍｉｎ、Ｈｉｇｈ＝１２０μＬ／ｍｉｎになるように、またシース液＝１８ｍＬ／ｍｉｎになるようにサンプル吸引中のチューブ内の圧が調節されている。
測定時のフロー速度は、１００〜３００細胞／秒が好ましく、特に１００〜２００細胞／秒であることが好ましい。
【００３８】
上記サンプルコアの流れはシース圧により制御され、上記サンプルコアの直径はシース圧とサンプル圧の差によって制御される。例えば、サンプル圧を一定に維持したまま、シース圧を高くすることによって上記サンプル・コアの流れを速め、サンプルコア直径が小さくなる。これらの設定は、どのようなフローサイトメーターを用いた場合でも適宜設定可能である。
【００３９】
フローサイトメトリーの光源として用いるレーザーは、血球および血球に結合したＦＬＡＥＲや抗白血球表面抗原抗体を変質させず、且つ血球から散乱光が発生する限り、アルゴンレーザー、ヘリウムネオンレーザー、ヘリウムカドミニウムレーザー、半導体レーザー、光励起半導体レーザー等、公知のいかなるレーザーであっても用いることもできる。
ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）ではデュアルレーザー・セパレートビームスポット方式に加えてオプティカルゲルを用いる事で蛍光の漏れ込みを最小限にしている。また、従来の直列方式、または分岐光学方式で複数の蛍光色素を同時に検出する場合には、蛍光シグナルの強度は光学システムの検出器に達するまでに透過する光学フィルターの数に比例して減衰するという問題があったが、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）ではオクタゴン・トライゴン蛍光検出システムを採用することでこの問題を克服している。
【００４０】
ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）ではデジタル波形処理によるフルマトリックス・コンペンセーションを実現している。マルチカラー解析では、波長幅をもつ蛍光シグナルが近接すればするほど隣接した蛍光検出器でもその蛍光シグナルが検出されてしまう、いわゆる「蛍光の漏れ込み」が起こるため、これを補正するコンペンセーションは不可欠である。従来のアナログ方式ではパルス信号をシグナル処理の過程で蛍光補正回路にて漏れ蛍光係数をパルス信号から減算して補正を行っていたが、この方法は特に４種類以上のマルチカラー解析では補正能力に限界があることから、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）では、逆行列を使用して数学的に補正を行うフルマトリックス・コンペンセーション・システムを採用している。具体的には、ＰＭＴ検出器から得られた蛍光パルスシグナルを直接２６２，１４４チャネルの解像度でリニアデータにＡＤ変換し、その後Ｌｏｇ対数換算および蛍光補正（逆行列処理）により数値演算処理プロセッサーにて解析する。
【００４１】
本発明の検出方法では、目的とするＰＮＨ型白血球を検出すべく、個々の細胞の測定パラメータをプロットし、ヒストグラムを作製する。
パラメータ数は１パラメータでもよいし、２パラメータ以上であってもよいが、本発明の方法では少なくともＦＬＡＥＲと抗白血球表面抗原抗体の２つを検出するので、２パラメータ以上のヒストグラム（サイトグラム）を用いることが望ましい。複数の抗体を用いて多種類の細胞に対する測定を同時に行う場合は、例えばリストモードデータを用いてパラメータの組合せを変え、異なるヒストグラムをその都度得ればよい。
分析対象となる測定パラメータとしては、以下のパラメータが挙げられる。
（１）前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ、ＦＳＣ）
（２）側方散乱光（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ、ＳＳＣ）
（３）７−ＡＤＤ（ＤＡＰＩ）
（４）蛍光（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ、ＦＬ）
【００４２】
本明細書中、「ゲーティング」とは、サンプルの中の関心のある細胞集団だけを選び出し、その細胞のみのヒストグラムを作ることをいう（「ゲートを設定する」ともいう）。前方散乱光／側方散乱光プロットによるゲーティングだけでなく、蛍光パラメーターを利用し、検索対象の細胞集団にゲーティングを行い、解析集団への絞り込みに活用することができる。
ゲーティングに用いられる蛍光パラメーターの少なくとも一つは、ＦＬＡＥＲである。前述のとおりＦＬＡＥＲはＧＰＩアンカー型膜蛋白質を検出するために用いられる。また少なくとも一つは、上記抗白血球表面抗原抗体（蛍光色素などで標識されたもの）に由来する。
【００４３】
上記２以上の蛍光パラメーター（少なくともＦＬＡＥＲの蛍光及び抗体の蛍光）について表示された２次元画面上の細胞クラスターにゲートを設定することで個々の細胞集団を分取する。この場合、例えば顆粒球を解析するならば、以下のような操作を行う。
（１）ＦＳＣ−Ａ（Ａｒｅａ：パルス面積）とＳＳＣ−Ａで展開し、顆粒球、単球、リンパ球からなる白血球領域にゲートをかける；
（２）ＦＳＣ−Ｗ（Ｗｉｄｔｈ：パルス幅）とＦＳＣ−Ｈ（Ｈｉｇｈｔ：パルス高）で展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外する；
（３）ＳＳＣ−ＷとＳＳＣ−Ｈで展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外する；
（４）死細胞を除外する（７−ＡＡＤ陽性細胞やＤＡＰＩ陰性細胞にゲートをかける）；
（５）顆粒球領域にゲートをかける；
（６）ＣＤ１１ｂ強陽性細胞にゲートをかける；
（７）（１）〜（６）により導きだされた細胞が純粋な成熟顆粒球と定義される。この細胞群におけるＦＬＡＥＲ発現を解析する。
【００４４】
なお本明細書中、このようにゲーティングされたヒストグラムのことを「ゲーティングされたヒストグラム」または「ゲートがかけられたヒストグラム」という。
【００４５】
最後に、ゲーティングされたヒストグラムにおいてリージョンを設定することで、リージョン内の細胞についての統計的情報を入手可能である。
ここで「リージョン」とは、目的とする細胞集団に着目した解析（クラスター解析）を行うために、データを絞り込むために設定した領域をいう。またリージョンを目的とする細胞集団ごとに設定することを「リージョンの設定」という。
リージョンの設定は種々の方法や条件式を利用して行われるが、これらの方法や条件式は当業者に公知であり、目的によって適宜設定することが可能である。
【００４６】
抗白血球表面抗原抗体として抗ＣＤ１１ｂ抗体を用い、ＰＮＨ型顆粒球を検出する場合、ＰＮＨ型顆粒球の集団は、
（１）ＦＬＡＥＲへの反応性が低く；
（２）抗ＣＤ１１ｂ抗体に反応する；
という特徴を有するので、ＦＬＡＥＲ（Ｘ軸）と抗ＣＤ１１ｂ抗体（Ｙ軸）との２パラメータヒストグラム上における左上の領域に現れる。
このヒストグラム上で左上領域に観察される細胞集団に対してリージョンを設定することで、得られたＰＮＨ型白血球の統計学的情報を入手することができる。
【００４７】
同様にＰＮＨ型単球の集団、ＰＮＨ型Ｔ細胞の集団、ＰＮＨ型Ｂ細胞の集団、ＰＮＨ型ＮＫ細胞の集団などは、
（１）ＦＬＡＥＲへの反応性が低く；
（２）各細胞特異的な細胞表面抗原に対する抗体に反応する；
という特徴を有するので、ＦＬＡＥＲ（Ｘ軸）と抗細胞表面抗原抗体（Ｙ軸）との２パラメータヒストグラム上における左上の領域に現れる。各細胞に特異的な細胞表面抗原に対する抗体については、前記したとおりである。
このヒストグラム上で左上領域に観察される細胞集団に対してリージョンを設定することでも、得られたＰＮＨ型白血球の統計学的情報を入手することができる。
【００４８】
本発明の方法により得られたドットグラムでは、目的とするＰＮＨ型白血球の集団はその他の白血球の集団と明確に区別される。
【００４９】
本発明の方法により得られる結果は、従来行われてきたＰＮＨ型血球の検出方法と比べ、以下の点において顕著な効果を示している。
（１）ＧＰＩアンカー型膜蛋白質の陰性細胞（ＰＮＨ型白血球）の集団がヒストグラム上で明瞭に描出されるため、従来法と比べ視認しやすい。
（２）ＧＰＩアンカー型膜蛋白質の陰性細胞（ＰＮＨ型白血球）の集団がヒストグラム上で集塊を形成し、陽性細胞の集団と明確に分離して描出されるため、左上領域に観察される細胞数を確認するだけでＰＮＨ型白血球の増加があるかどうかが判定できる。
（３）死細胞に起因するノイズや非特異的な結合に由来するノイズが極めて少なく、主観的な判断でノイズを省く必要が無い。
【００５０】
ところで、本発明の方法において用いられるデジタル波形処理可能なフローサイトメトリーや液状ＦＬＡＥＲはどのような施設でも手に入るため、高精度でのＰＮＨ型白血球検出を目指して種々の条件設定を検討することは他の施設においても行われうると考えられる。ところがデジタル波形処理可能なフローサイトメトリーと液状ＦＬＡＥＲを用いてＰＮＨ型白血球を検出した例はこれまで報告されておらず、また本発明の方法によれば、単にこれらの条件設定を検討したことだけでは予想だにし得ないほど、ヒストグラム上において、従来法からの劇的な変化が認められるのである。
つまるところ、従来の高感度フローサイトメトリー法では本発明の方法と同じ感度・特異性で微少ＰＮＨ型白血球を検出することは不可能であったが、本発明によって、どのような施設でも高感度で微少ＰＮＨ型白血球を検出することができ、かつこれは何度でも簡単に再現できることが期待される。
本発明では、本発明者等が鋭意検討した結果、「ＰＮＨ型白血球を検出する」という目的に対して、「ＦＬＡＥＲ」および「抗白血球表面抗原抗体」を、フローサイトメトリー、特に「波形処理がデジタル化された」フローサイトメトリーで行うという、極めてシンプルな条件を採用するに至った。しかしながらこの条件を採用することにより、従来法では予想だにし得ないほど、微量なＰＮＨ型白血球を自動的に検出できるようになったのである。特に、従来法の汎用化を妨げていた「偽のＰＮＨ型白血球」の主観による除外が可能となったことは、ＰＮＨ型血球の検出法における画期的な進歩ということができる。
【００５１】
さらに本発明の方法によれば、波形処理がデジタル化されたフローサイトメトリーやＦＬＡＥＲなどの新しい機器試薬を用いることに加えて、従来法においてＰＮＨ型血球を検出する際に行ってきた細胞処理やゲーティングなどにおける条件設定を加えることによって、より正確に０．００３％前後のＰＮＨ型白血球を検出できるのである。これらの詳細な条件設定は、本願実施例に詳細に記載されている。
【００５２】
なお、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）を用いてフローサイトメトリーを行う場合は、フローサイトメトリー操作の前に、フローサイトメーターのコンペンセーションを行うことが望ましい。
この場合、各抗体の陽性細胞集団の相対的蛍光強度が１×１０４〜１×１０５程度になるよう電圧を設定し、各蛍光抗体単独で染色した細胞（陽性コントロール）を未染色の細胞（陰性コントロール）と混ぜ合わせた検体を順番に流す。その時に陽性細胞集団にポジティブゲートをかけておく。全てのコンペンセーション用検体を流してから、Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎボタンを押しコンペンセーションを行う（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）では自動的に蛍光補正されるので、マニュアルで蛍光補正をする必要がない）。
【００５３】
２．骨髄不全症候群の検査方法
前記したように、骨髄不全症候群には、自己免疫的な障害によるものと造血幹細胞自身の異常によるものの２種類が混在している。骨髄不全症候群の治療に際しては、このような病態に即した治療を選択することが肝要である。
正常造血幹細胞に対する免疫学的な障害が存在する環境においては、ＰＮＨ型の幹細胞は正常幹細胞に比べてＴ細胞による障害を受けにくいため、ＰＮＨ型白血球は相対的に増加する。したがって対象におけるＰＮＨ型白血球を検出することで、対象が自己免疫的な骨髄不全に陥っているか否かを判断することができる。
本発明は、ＦＬＡＥＲおよび抗白血球表面抗原抗体を用いてフローサイトメトリーを行うという骨髄不全症候群の新たな検査方法を提供するものである。
【００５４】
本発明の方法の対象となる疾患は、骨髄不全症候群のなかでも、自己免疫的障害により生ずる骨髄不全症候群（以下、「自己免疫性骨髄不全症候群」と称する）に属する疾患であり、特に再生不良性貧血と再生不良性貧血との鑑別が困難な芽球が少ないタイプの低リスク骨髄異形成症候群とである。これらの疾患においてＰＮＨ型白血球が検出されれば、対象が自己免疫的な骨髄不全に陥っていると診断できる。一方、造血幹細胞自身の異常による骨髄不全症候群ではＰＮＨ型白血球の増加がみられることはない。すなわち本発明は、自己免疫性骨髄不全症候群の検査方法を提供するものである。
【００５５】
また血液中の網状赤血球数、血小板数、白血球数等の低下から骨髄不全症候群が疑われる対象において、本発明の方法によりＰＮＨ型白血球が検出されれば、当該対象は自己免疫性の骨髄不全症候群を発症している可能性が高く、造血幹細胞の異常に基づく骨髄不全症候群の可能性は低いと診断することができる。
一方、本発明の方法によってもＰＮＨ型白血球を検出することができなければ、当該対象は自己免疫性の骨髄不全症候群を発症している可能性は低く、造血幹細胞の異常に基づく骨髄不全症候群の可能性が高いと判断することができる。
すなわち本発明は、対象における骨髄不全症候群が自己免疫性か造血幹細胞異常性かを判別する方法を提供する。
【００５６】
また血液中の網状赤血球数、血小板数、白血球数等の低下から、骨髄不全症候群が疑われる対象患者において、本発明の方法によりＰＮＨ型白血球が検出されれば、当該対象は免疫抑制療法によって改善する可能性が高いと判断することもできる。一方、本発明の方法によりＰＮＨ型白血球を検出することができなければ、当該対象における免疫抑制療法の奏効率は高くはないと判断することもできる。
すなわち本発明は、骨髄不全症候群に対する免疫抑制療法の適否の判別方法を提供する。
【００５７】
なお前述のとおり、健常者でも微量のＰＮＨ型白血球は検出されるのであるが、本発明の方法によれば、健常者と骨髄不全症候群との間でのＰＮＨ型白血球量の閾値を設定することも可能である。
【００５８】
本明細書中において、「自己免疫性骨髄不全症候群」とは、造血幹細胞が自己のリンパ球や抗体等により攻撃され減少することに起因する骨髄不全症候群を意味し、免疫抑制療法によって回復が見込まれる骨髄不全症候群のことをいう。このような疾患としては、例えば再生不良性貧血や低リスク骨髄異形成症候群の一部が挙げられる。
また本明細書中において、「造血幹細胞異常性骨髄不全症候群」とは、造血幹細胞が後天的な遺伝子異常により増殖・分化しないようになることに起因する骨髄不全症候群を意味し、免疫抑制療法によって回復が見込まれない骨髄不全症候群のことをいう。このような疾患としては、例えば骨髄異形成症候群、低形成白血病などが挙げられる。
【００５９】
本発明の方法を適用することができる対象はヒトである。さらに好ましくは、汎血球減少を呈するヒトである。また本発明の方法に用いられ得る生体試料は、ヒト由来の末梢血に限られる。
【実施例】
【００６０】
以下に本発明の実施例、比較例、参考例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。
【００６１】
（機器の説明）
本発明で用いたフローサイトメーターであるＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）は、ベクトン・ディキンソン社製のものである。
【００６２】
（実施例１）生体試料の処理
生体試料として末梢血を採用し、以下の操作を行うことで末梢血から白血球の細胞浮遊液を採取した。
（１）４℃に保存されたＥＤＴＡ−２Ｎａ末梢血７ｍＬから、別途ＰＮＨ型赤血球の検出用に２ｍＬを別のファルコンチューブに移し、４℃で保存した。残りのＥＤＴＡ−２Ｎａ血５ｍＬをそのまま２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、血漿部分を除去した。
（２）ペレットに５−１０倍量のＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１Ｌ中に塩化アンモニウム８．２６ｇ、炭酸水素カリウム１．０ｇ、４ＮＡ（ＥＤＴＡ・４Ｎａ）０．０３７ｇを含む溶液）を加えて転倒混和したのち８分間室温で静置した。この間、適宜転倒混和して溶血が進んでいることを確認した。
（３）５００ｇで１分間遠心分離(ＫＵＢＯＴＡ社製 SEROMATIC IIのｓｅｌｅｃｔｉｏｎ３)し、ペレットを残して上清をアスピレーターで除去した。
（４）再度５−１０倍量のＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを加えて適宜転倒混和しながら５分間室温に置いた。溶血不十分の場合は計１５分まで操作を延長した。
（５）５００ｇで１分間遠心分離(ＫＵＢＯＴＡ社製 SEROMATIC IIのｓｅｌｅｃｔｉｏｎ３)し、ペレットを残して上清をアスピレーターで除去した。
（６）ブロッキングのため、０．５％ＢＳＡ＋ＰＢＳを１４０μＬ加えてｖｏｒｔｅｘしたのち１０分間室温で静置した。
検体が採取後２４時間以内であればブロッキングは不要とする。
これを細胞浮遊液として、以下の実験を行った。
【００６３】
（実施例２）ＦＬＡＥＲおよび抗体とのインキュベーション
以下の操作を行い、フローサイトメトリーに付すサンプルを作製した。
（１）５ｍＬのファルコンチューブを２本用意し、実施例１で得られた細胞浮遊液から正確に５０μＬずつを取り、それぞれのチューブの底に静置した。この際チューブの壁に浮遊液がつかないように注意した。
（２）１本のチューブに、ＦＬＡＥＲ（１０〜６Ｍ、Ｐｉｎｅｗｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ社製）６μＬ、抗ＣＤ１１ｂ−ＰＥ（５０ ｕｇ／ｍＬ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）４μＬ、７ＡＡＤ（５０ ｕｇ／ｍＬ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）４μＬ、抗ＣＤ４５−ＰＥ−Ｃｙ７（５０μｇ／ｍＬ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）４μＬ、抗ＣＤ３３−ＡＰＣ（６．２５μｇ／ｍＬ、ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社製）４μＬ、抗ＣＤ３−ＡＰＣ−Ｈ７（２００μｇ／ｍＬ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）４μＬを加えた。他方のチューブは陰性対照として用い、ＦＬＡＥＲ以外の抗体をそれぞれ加えた。この時点で後に洗浄に用いるＰＢＳを室温に戻しておいた。これらの操作は暗室（少なくとも蛍光灯は消した部屋内）で行った。また、試薬チューブの盖を開けたまま放置しないことに留意した。
（３）混合液をｖｏｒｔｅｘした後、各チューブを遮光して、４℃の冷蔵庫内で２０分静置した。
（４）各チューブにＰＢＳ３ｍＬを加えて５００ｇで１分間遠心分離（ＫＵＢＯＴＡ社製 ＳＥＲＯＭＡＴＩＣ ＩＩのｓｅｌｅｃｔｉｏｎ３）した。次いで、ペレットを残して上清をアスピレーターで除去した。
（５）各チューブをラックの編み目にこすりつけるなどして震盪（ペレットをほぐす意味がある）し、ＰＢＳを４００μＬずつ加えた。
（６）軽くピペッティングしてからナイロンメッシュフィルターに通して死細胞の集塊を除去した後、新しいチューブに移してこれをフローサイトメトリー解析に付した。
【００６４】
（実施例３）フローサイトメトリー
（Ｉ）コンペンセーション
コンペンセーション用の検体は４℃保存されていた前日の健常者由来残余血を用いて行った。
（１）コンペンセーション用に何も加えない細胞浮遊液５０μＬをＰＢＳ ４００ｍＬで希釈した検体（以下、「ｕｎｓｔａｉｎｅｄ検体」と記載）、そして実施例２（２）に記載の各蛍光抗体を単独で加えた検体（以下、「蛍光抗体単独検体」などと記載）を用意した。なおＦＬＡＥＲ検体、ＣＤ４５検体にはｕｎｓｔａｉｎｅｄ検体を５０μＬずつそれぞれ加えた。
（２）順番にＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）に付し、データを保存した。細胞数は７ＡＡＤのみ２×１０４、他は５×１０３であった。
（３）ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）のコンペンセーションボタンを押し自動補正を行った。
【００６５】
（ＩＩ）ゲーティング
以下の方法により顆粒球領域に対するゲーティングを行った。
（１）ＦＳＣ−ＡとＳＳＣ−Ａで展開し、顆粒球、単球、リンパ球からなる白血球領域にゲートをかけた。
（２）ＦＳＣ−ＷとＦＳＣ−Ｈで展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外した。
（３）ＳＳＣ−ＷとＳＳＣ−Ｈで展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外した。
（４）７−ＡＡＤ陽性の死細胞を除外した。
（５）細胞構造の複雑性と大きさから類推される顆粒球領域にＣＤ４５およびＳＳＣ−Ａでゲートをかけた。
（６）ＣＤ１１ｂ強陽性の細胞にゲートをかけた。
【００６６】
（１）−（６）の操作により導きだされた細胞を、純粋な成熟顆粒球と定義することができる。次にこの細胞群におけるＦＬＡＥＲ発現を解析した。
【００６７】
（ＩＩＩ）分析
縦軸に白血球系統マーカー（顆粒球：ＣＤ１１ｂ、単球：ＣＤ３３、リンパ球：ＣＤ３）を、横軸にＦＬＡＥＲをとってヒストグラムを展開した場合、ＰＮＨ型血球はＵｐｐｅｒ Ｌｅｆｔ（ＵＬ）領域に展開される。このＵＬ領域内にある細胞をＰＮＨ型顆粒球として、その割合を（ＵＬの細胞数／ＵＲ（Ｕｐｐｅｒ Ｒｉｇｈｔ）の細胞数＋ＵＬの細胞数）×１００（％）によって計算した。この計算を行うべく、上記方法によりＰＮＨ型顆粒球についてゲートをかけた結果を図１−１に示す。
一方、健常人５０例を対象とした同様のＰＮＨ型顆粒球のフローサイトメトリー解析により、骨髄不全症候群におけるＰＮＨ型細胞の有意増加は、ＰＮＨ型顆粒球０．００３％以上と定義することができた。結果を図１−２に示す。
【００６８】
（実施例４）ＰＮＨ型単球の検出
実施例１および２と同様の方法で末梢血からフローサイトメトリーに付すサンプルを作製した後、実施例３（Ｉ）に記載のコンペンセーションを行ったＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）に対し当該サンプルを付した。次いで以下の方法によりゲーティングを行い、ＰＮＨ型単球を検出した。
【００６９】
（１）ＦＳＣ−ＡとＳＳＣ−Ａで展開し、顆粒球、単球、リンパ球からなる白血球領域にゲートをかけた。
（２）ＦＳＣ−ＷとＦＳＣ−Ｈで展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外した。
（３）ＳＳＣ−ＷとＳＳＣ−Ｈで展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外した。
（４）７−ＡＡＤ陽性死細胞を除外した。
（５）単球領域にゲートをかけた。
（６）ＣＤ３３強陽性細胞にゲートをかけた。
【００７０】
（１）−（６）の操作により導きだされた細胞を、純粋な成熟単球と定義することができる。この細胞群におけるＦＬＡＥＲ発現を実施例３（ＩＩＩ）と同様の方法で解析した。この計算を行うべく、上記方法によりＰＮＨ型単球についてゲートをかけた結果を図２−１に示す。
一方、健常人５０例を対象とした同様のＰＮＨ型単球のフローサイトメトリー解析により、骨髄不全症候群におけるＰＮＨ型細胞の有意増加は、ＰＮＨ型単球０．０５％以上と定義することができた。結果を図２−２に示す。
【００７１】
（実施例５）ＰＮＨ型Ｔリンパ球の検出
実施例１および２と同様の方法で末梢血からフローサイトメトリーに付すサンプルを作製した後、実施例３（Ｉ）に記載のコンペンセーションを行ったＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）に対し当該サンプルを付した。次いで以下の方法によりゲーティングを行い、ＰＮＨ型Ｔリンパ球を検出した。
【００７２】
（１）ＦＳＣ−ＡとＳＳＣ−Ａで展開し、顆粒球、単球、リンパ球からなる白血球領域にゲートをかけた。
（２）ＦＳＣ−ＷとＦＳＣ−Ｈで展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外した。
（３）ＳＳＣ−ＷとＳＳＣ−Ｈで展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外した。
（４）リンパ球領域にゲートをかけた。
（５）ＣＤ３強陽性細胞にゲートをかけた。
（６）必要に応じて、さらにＣＤ８、ＣＤ４陽性細胞にそれぞれゲートをかけた。
【００７３】
（１）−（６）の操作により導きだされた細胞を、純粋な成熟リンパ球と定義することができる。この細胞群におけるＦＬＡＥＲ発現を実施例３（ＩＩＩ）と同様の方法で解析した。ＣＤ３陽性Ｔリンパ球におけるＦＬＡＥＲ解析結果を図２−３ａに、ＣＤ３陽性Ｔリンパ球をさらにＣＤ８陽性Ｔリンパ球、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球に分けてＦＬＡＥＲ解析を行った結果を２−３ｂおよび２−３ｃにそれぞれ示す。
一方、実施例３（ＩＩＩ）に記載の方法と同様の方法で健常人５０例以上を対象としたＰＮＨ型Ｔリンパ球の解析により、骨髄不全症候群におけるＰＮＨ型細胞の有意増加は、ＰＮＨ型Ｔリンパ球０．１％以上と定義することができた。結果を図２−４ａ、２−４ｂおよび２−４ｃに示す。
【００７４】
（実施例６）ＰＮＨ型Ｂ細胞の検出
実施例１および２と同様の方法で末梢血からフローサイトメトリーに付すサンプルを作製した後、実施例３（Ｉ）に記載のコンペンセーションを行ったＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）に対し当該サンプルを付した。次いで以下の方法によりゲーティングを行い、Ｂ細胞を検出した。
【００７５】
（１）ＦＳＣ−ＡとＳＳＣ−Ａで展開し、顆粒球、単球、リンパ球からなる白血球領域にゲートをかけた。
（２）ＦＳＣ−ＷとＦＳＣ−Ｈで展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外した。
（３）ＳＳＣ−ＷとＳＳＣ−Ｈで展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外した。
（４）リンパ球領域にゲートをかけた。
（５）ＣＤ１９強陽性細胞にゲートをかけた。
【００７６】
（１）−（５）の操作により導きだされた細胞を、純粋な成熟Ｂ細胞と定義することができる。この細胞群におけるＦＬＡＥＲ発現を実施例３（ＩＩＩ）と同様の方法で解析した。結果を図２−３ｄに示す。
また健常人５０例以上を対象としたＰＮＨ型Ｂ細胞の解析により、骨髄不全症候群におけるＰＮＨ型細胞の有意増加は、ＰＮＨ型Ｂ細胞０．０５％以上と定義することができた。結果を図２−４ｄに示す。
【００７７】
（実施例７）ＰＮＨ型ＮＫ細胞の検出
実施例１および２と同様の方法で末梢血からフローサイトメトリーに付すサンプルを作製した後、実施例３（Ｉ）に記載のコンペンセーションを行ったＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）に対し当該サンプルを付した。次いで以下の方法によりゲーティングを行い、ＮＫ細胞を検出した。
【００７８】
（１）ＦＳＣ−ＡとＳＳＣ−Ａで展開し、顆粒球、単球、リンパ球からなる白血球領域にゲートをかけた。
（２）ＦＳＣ−ＷとＦＳＣ−Ｈで展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外した。
（３）ＳＳＣ−ＷとＳＳＣ−Ｈで展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外した。
（４）リンパ球領域にゲートをかけた。
（５）ＣＤ３強陽性細胞にゲートをかけた。
（６）ＣＤ５６陽性細胞にゲートをかけた。
【００７９】
（１）−（６）の操作により導きだされた細胞を、純粋な成熟ＮＫ細胞と定義することができる。この細胞群におけるＦＬＡＥＲ発現を実施例３（ＩＩＩ）と同様の方法で解析した。結果を図２−３ｅに示す。
また健常人５０例以上を対象としたＰＮＨ型ＮＫ細胞の解析により、骨髄不全症候群におけるＰＮＨ型細胞の有意増加は、ＰＮＨ型ＮＫ細胞０．３％以上と定義することができた。結果を図２−４ｅに示す。
【００８０】
（比較例１）従来法によるＰＮＨ型血球の検出（ＦＬＡＥＲおよびデジタル波形処理可能なフローサイトメーターを用いない場合）
従来、ＰＮＨ型血球の検出にはＣＤ５９のｓｉｎｇｌｅ−ｃｏｌｏｒフローサイトメトリーかＣＤ５５−ＰＥ、ＣＤ５９−ＦＩＴＣによるｔｗｏ−ｃｏｌｏｒフローサイトメトリーが施行されてきた。
またこの場合、フローサイトメーターとしては、デジタル波形処理を採用していない機種（ＦＡＣＳｃａｎ、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒなど）を使用していた。
このように、ＦＬＡＥＲおよびデジタル波形処理可能なフローサイトメーターを用いない従来法によりＰＮＨ型血球の検出を試みた。結果を図３に示す（図３のＡ法）。
比較例１の方法ではＵＬ領域における細胞集団が集塊を形成せず、領域が不明確であるのでＰＮＨ型血球検出における感度や特異性が低く、微量なＰＮＨ型血球を正確に検出することができなかった。
【００８１】
（比較例２）抗体型高感度法によるＰＮＨ型白血球の検出（デジタル波形処理可能なフローサイトメーターを用いるが、ＦＬＡＥＲを用いない場合）
次に、ＦＬＡＥＲを用いずにＦＡＣＳＣａｎｔｏと抗体を用いてＰＮＨ型白血球の検出を試みた。結果を図３に示す（図３のＢ法）。
比較例２の方法では、比較例１の方法よりは比較的明瞭であるものの、ＵＬ領域における細胞集団が依然として集塊を形成せず、領域が不明確であった。したがって比較例２の方法でもＰＮＨ型白血球検出における感度や特異性は依然として低く、微量なＰＮＨ型白血球を正確に検出することができなかった。
一方、本発明の方法（図３のＣ法）によれば、ＵＬ領域における細胞集団が集塊を形成し、ＰＮＨ陽性細胞とＰＮＨ陰性細胞との領域が明瞭であった。したがって本発明の方法によれば、微量なＰＮＨ型白血球を簡単な手技で正確に検出できることがわかった。
【００８２】
（参考例１）抗体型高感度法を用いたＰＮＨ型赤血球の検出（デジタル波形処理可能なフローサイトメーターを用いるが、ＦＬＡＥＲを用いない場合）
（Ｉ）赤血球浮遊液の調製
生体試料として末梢血を採用し、以下の操作を行うことで末梢血から赤血球の細胞浮遊液を採取した。
（１）実施例１で別途保存しておいたＥＤＴＡ−２Ｎａ血２ｍＬ入りファルコンチューブを２０００ｒｐｍで１０分間遠心した。
（２）この間にＰＢＳ２ｍＬを入れたファルコンチューブを用意した。
（３）（１）のチューブより血漿を除去した後、赤血球層を５０μＬ採取した。これを（２）のファルコンチューブに加えて３−５％赤血球浮遊液として以下の実験を行った。
【００８３】
（ＩＩ）赤血球と抗体とのインキュベーション
以下の操作を行い、フローサイトメトリーに付すサンプルを作製した。
（１）新しいファルコンチューブを２本用意し、（Ｉ）で得られた赤血球浮遊液５０μＬを各チューブの底に静置した。
（２）抗ＣＤ５５−ＦＩＴＣ（２００μｇ／ｍＬ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）と同量のＣＤ５９−ＦＩＴＣ（２００μｇ／ｍＬ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）とを加え、抗体混合液を用意した（以下、抗ＣＤ５５／抗ＣＤ５９−ＦＩＴＣと記載する）。
（３）ＣＤ５５／ＣＤ５９−ＦＩＴＣ ４μＬ、ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎＡ−ＰＥ４μＬを一方の赤血球浮遊液に、ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ−ＦＩＴＣ４μＬとｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎＡ−ＰＥ ４μＬを他方の赤血球浮遊液（陰性対照となる）に加え、各混合液をｖｏｒｔｅｘした。次いで各チューブを遮光して、４℃の冷蔵庫内で２５分間静置した。
（４）各チューブにＰＢＳ ３ｍＬを加えて、軽く撹拌した。ついで５００ｇで４分間遠心分離し、ペレットを残して上清をアスピレーターで除去した。
（５）ペレットにＰＢＳ ６００μＬを加え、スポイトで数回ピペッティングした後、ナイロンメッシュフィルターを通して死細胞の集塊を除去した後、新しいチューブに検体を移してこれをフローサイトメトリー解析に付した。
【００８４】
（ＩＩＩ）フローサイトメトリー
コンペンセーションは実施例３（Ｉ）と同様に、ｕｎｓｔａｉｎｅｄ検体と各蛍光抗体単独検体をＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）に順番に流した後、コンペンセーションボタンを押し、自動補正を行った。
【００８５】
次いで、以下の方法により赤血球領域に対するゲーティングを行った。
【００８６】
（１）ＦＳＣ−ＡとＳＳＣ−Ａで展開し、赤血球領域にゲートをかけた。
（２）ＦＳＣ−ＷとＦＳＣ−Ｈで展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外した。
（３）ＳＳＣ−ＷとＳＳＣ−Ｈで展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外した。
（４）Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ強陽性細胞にゲートをかけた。
【００８７】
（１）−（４）により導きだされた細胞が純粋な成熟赤血球と定義することができる。次にこの細胞群におけるＣＤ５５／ＣＤ５９を解析した。
【００８８】
縦軸に赤血球系統マーカー（ＧｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎＡ）、横軸にＣＤ５５／ＣＤ５９をとってヒストグラムを展開した場合、ＰＮＨ型赤血球はＵｐｐｅｒ Ｌｅｆｔ（ＵＬ）領域に展開される。このＵＬ領域内にある細胞をＰＮＨ型赤血球として、その割合を（ＵＬ／ＵＲ＋ＲＬ）×１００（％）によって計算した。この計算を行うべく、上記方法によりＰＮＨ型赤血球にゲートをかけた結果を図４に示す。ＰＮＨ型血球の陽性症例では、ＵＬ領域に１．３％のＰＮＨ型赤血球が存在した。
一方、この実験を健常人５０例を対象として詳細に解析することにより、骨髄不全症候群におけるＰＮＨ型細胞の有意増加はＰＮＨ型赤血球０．００５％以上と定義することができた。
【００８９】
（参考例２）ＰＮＨ型血球の有無による免疫抑制療法の奏効率・生存率の相違
Ｂｌｏｏｄ．２００６；１０７：１３０８−１３１４に記載の方法と同様の方法で、ＰＮＨ型血球の有無により再生不良性貧血患者における免疫抑制療法の奏効率やその後の生存率がどのように変化するかを調べた。結果を図５に示す。
ＰＮＨ型血球陽性の再生不良性貧血患者では、陰性の患者に比べてＡＴＧ＋シクロスポリン療法が奏効しやすく（図５Ａ）、また生存率が有意に高いこと（図５Ｂ）が分かった。
【００９０】
これらの結果から、本発明の方法によりＰＮＨ型白血球の存在を検出できることが理解できる。また本発明の方法を適用することによって、骨髄不全症候群の免疫病態を診断することができる。従って本発明の検査方法をＲＡやＡＡといった骨髄不全症例の治療方針の判断材料の一つとして採用することにより、対象患者が免疫抑制療法の適応対象か否かを判別することができる。その結果、骨髄不全症例の診療において、個々の患者に最適な治療を選択することが可能になることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明は、極めて微量のＰＮＨ型白血球を簡便かつ正確に検出可能にする方法である。本発明の方法を適用することによって、
（１）ＰＮＨ型白血球の検出における非特異的反応に基づくノイズの発生が抑制される。
（２）またＧＰＩアンカー型膜蛋白質を有さない細胞集団が、ヒストグラム上に明瞭に描出される。これにより、ＰＮＨ型白血球の検出に携わる者のフローサイトメトリーへの習熟度合いに関係なく、多くの施設でＰＮＨ型白血球を容易に検出することが可能となる。
（３）さらに白血球に特徴的な各表面抗原に対する抗体と組み合わせることで、どのような種類のＰＮＨ型白血球（ＰＮＨ型顆粒球、ＰＮＨ型単球など）でも一度に検出することが可能である。
【００９２】
また当該検出方法を利用することで、骨髄不全症候群の診断も行うことができる。特にＰＮＨ型白血球は自己免疫性の骨髄不全症例において有意に増加するので、本発明の方法により自己免疫性の骨髄不全症候群と造血幹細胞自身の異常による骨髄不全症候群とを判別することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＮＨ型白血球の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄不全とは、血球減少を呈する疾患のうち、その原因が血球の破壊の亢進や、骨髄の占拠性病変による二次的な造血障害ではなく、造血幹細胞の量的・質的異常のために血球産生が持続的に減少した状態のことをいう。骨髄不全には、薬剤性再生不良性貧血（ａｐｌａｓｔｉｃ ａｎｅｍｉａ、ＡＡ）などの二次性造血障害のほか、骨髄異形成症候群（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＭＤＳ）、不応性貧血（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ａｎｅｍｉａ、ＲＡ）、発作性夜間血色素尿症（ｐａｒｏｘｙｓｍａｌ ｎｏｃｔｕｒｎａｌ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｕｒｉａ、ＰＮＨ）などの特発性の造血障害が含まれる。これらの疾患は互いの境界が必ずしも明瞭ではなく、相互に移行することがある。またこれらの疾患には、自己免疫障害による造血障害と造血幹細胞自身の異常による造血障害とが混在しており、骨髄不全はこれらを総称して骨髄不全症候群と総称される場合もある。
【０００３】
ところで骨髄不全に対するプライマリーケアにおいてもっとも重要なポイントは、免疫抑制療法のみでも改善する可能性の高い骨髄不全に対して、不用意に毒性の強い治療をしないことである。そのためには骨髄不全の患者や骨髄不全疑いの患者において、予め免疫病態を正確に診断する必要がある。すなわち臨床の現場においては、（１）自己免疫的障害による骨髄不全；つまり免疫抑制療法を中心とする薬物療法によって治療可能な骨髄不全と（２）薬物療法では治療できない；すなわち造血幹細胞自身の異常による造血障害であり、造血幹細胞移植を必要とする骨髄不全とを正しく鑑別することが重要であり、この判別を正確に行うことができる方法が求められている。
【０００４】
骨髄不全における免疫病態の診断方法のうち、最も簡便で信頼のおける検査は末梢血におけるＰＮＨ形質の血球（ＰＮＨ型血球）の検出である。ＰＮＨ型血球とはＧＰＩ（Ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）アンカー型膜蛋白質を欠く血球であり、これらはＰＩＧＡ遺伝子に突然変異を来した異常造血幹細胞に由来する。
ＰＮＨ型の異常血球は健常者の末梢血中にもごくわずかに存在するが、正常の造血幹細胞に比べて増殖能が高いわけではないので、一定の割合（０．００３％）以上に増えることはない（非特許文献１）。一方で正常造血幹細胞に対する免疫学的な障害が存在する環境においては、ＰＮＨ型の幹細胞は正常幹細胞に比べてＴ細胞による障害を受けにくいため、ＰＮＨ型血球が相対的に増加すると考えられている。
【０００５】
ＰＮＨ型血球陽性のＡＡは、陰性のＡＡに比べてＡＴＧ・シクロスポリン併用療法の奏効率が有意に高く、また長期予後も良好であることが示されている（非特許文献２）。またＰＮＨ血球増加ＲＡの患者においては、非増加ＲＡの患者に比べてシクロスポリン療法の奏効率が高く、白血病への移行率が低い傾向が認められる（非特許文献３）。すなわちＰＮＨ型血球は、自己免疫障害による骨髄不全症例に限って発現していることが理解できる。
以上のことから、ＲＡやＡＡといった骨髄不全症例において治療方針を決定する上で、ＰＮＨ型血球の検出を臨床前段階において正確に行うことは極めて重要であることがわかる。
【０００６】
ＰＮＨ型血球の有無は、通常、血算に用いられる残りの血液などを用い、血球表面抗原をフローサイトメトリーの手法で検出することによって容易に判別することができる。しかしながら現在一般的に行われている、血球表面抗原に対する抗体を用いたフローサイトメトリーによる血球の検査方法（以下、「従来法」と記載）では、０．０１％未満のＰＮＨ型血球を正確に検出することは極めて困難である。これは、当業者であれば誰でも０．０１％未満という超微量なＰＮＨ型血球を検出可能なわけではなく、ＰＮＨ型血球の検出には高いレベルでフローサイトメトリーに習熟していることが必要であるからである。特に抗体を使用する以上、フローサイトメトリーには非特異的なノイズが生じるため、僅かなＰＮＨ型血球のシグナルに対する当該ノイズを除去すべく、本来のＰＮＨ型血球のシグナルと当該ノイズとを主観的かつ経験的な判断に基づいて区別しなければならないという問題点もあった。
【０００７】
ＡＡ患者を対象としてＰＮＨ型血球を従来法で検出した海外の報告では、ＰＮＨ型血球の増加がみられる例の割合は３０％前後と低率であることが開示されている（非特許文献４）。しかしながら、これらの報告ではＰＮＨ型血球検出の特異性が低いため、健常者でも１％までのＰＮＨ型血球が検出されており、さらにＰＮＨ型血球が増加しているＡＡ患者と健常者との間には明確な境界が示されていない。このような特異性の低さが、ＰＮＨ型血球の増加が３０％前後のＡＡ患者にしか認められなかった原因であった。
【０００８】
以前本発明者らは、ＦＩＴＣでラベルした抗ＣＤ５５抗体・抗ＣＤ５９抗体と、ＰＥでラベルした抗ＣＤ１１ｂ抗体（顆粒球用）または抗グリコフォリンＡ抗体（赤血球用）を用いて、細胞のゲーティングを工夫すれば、健常者におけるＰＮＨ型血球の割合とＡＡ等のＰＮＨ増加例におけるＰＮＨ型血球の割合との境界を、０．００３％まで下げることが可能であることを開示している（非特許文献２）。この方法（以下、「高感度法」と記載）は従来法と比して特異性・感度が高いため、再生不良性貧血患者の６割においてＰＮＨ型血球の増加を検出することができた。しかしこの方法では、調べる血球の種類に応じて異なる抗体を用いる必要があるため、多種類の血球系統でＰＮＨ型血球を検出するのが煩雑であった。さらに、採血から時間が経った検体では、血球に対する抗体の結合性が低下するため、真のＰＮＨ型血球だけを算定するためには、習熟した担当者による主観的かつ経験的な判断が必要であった。そのため、フローサイトメトリーに習熟していない者であっても、正確かつ迅速にどの系統の血球であってもＰＮＨ型血球を検出できる方法が求められていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ａｒａｔｅｎ ＤＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９９；９６：５２０９−５２１４．
【非特許文献２】Ｓｕｇｉｍｏｒｉ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００６；１０７：１３０８−１３１４．
【非特許文献３】Ｗａｎｇ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００２；１００：３８９７−３９０２．
【非特許文献４】Ｍａｃｉｅｊｅｗｓｋｉ ＪＰ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ， ２００２；１１５：１０１５−１０２２．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
骨髄不全症候群の免疫病態を治療前段階で正確に診断することができる方法が望まれている。具体的には、ＰＮＨ型血球、特にＰＮＨ型顆粒球および単球を簡便な方法で正確に検出できる方法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、顆粒球抗原（ＣＤ１１ｂ）、単球抗原（ＣＤ３３）などといった白血球表面抗原に対する抗体とＦＬＡＥＲとを組み合わせたフローサイトメトリーを行うことによって、血球中の微量のＰＮＨ型白血球（ＰＮＨ型顆粒球、ＰＮＨ型単球など）を簡便かつ正確に定量することができることを初めて見出した。特に当該フローサイトメトリーにおける波形処理をデジタル化して行うことで、従来の抗ＧＰＩ−ＡＰ抗体法を用いた場合に主観的な判断が要求されていたＰＮＨ型白血球の判別を、誰でもできるようになることを見出した。
本発明者らはこれらの知見に基づいてさらに鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち本発明は、
［１］ＦＬＡＥＲおよび少なくとも一種の抗白血球表面抗原抗体を用いてフローサイトメトリーを行うことを含む、ＰＮＨ型白血球の検出方法；
［２］フローサイトメトリーにおける波形処理がデジタル化されている、［１］に記載の方法；
［３］抗白血球表面抗原抗体が、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ３抗体からなる群、あるいは抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体および抗ＣＤ５６抗体からなる群から選択される、［１］または［２］に記載の方法；
［４］二種類以上のＰＮＨ型白血球を同時に検出することを特徴とする、［３］に記載の方法；
［５］ＦＬＡＥＲおよび抗白血球表面抗原抗体を用いてフローサイトメトリーを行うことを含む、骨髄不全症候群の検査方法；
［６］フローサイトメトリーにおける波形処理がデジタル化されている、［５］に記載の方法；
［７］抗白血球表面抗原抗体が、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ３抗体からなる群、あるいは抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体および抗ＣＤ５６抗体からなる群から選択される、［５］または［６］に記載の方法；
［８］骨髄不全症候群が自己免疫性であると診断できる、［５］〜［７］のいずれか一に記載の方法；
［９］自己免疫性骨髄不全症候群と造血幹細胞異常性骨髄不全症候群の判別方法である、［５］〜［７］のいずれか一に記載の方法；
［１０］骨髄不全症候群に対する免疫抑制療法の適否の判別方法である、［５］〜［９］のいずれか一に記載の方法；
などに関する。
【発明の効果】
【００１３】
ＰＮＨ型白血球は健常者の末梢血中にもごくわずかに存在しているが、その割合は、通常、全体の０．００１％程度に過ぎない。このため、ＰＮＨ型白血球が増加しているか否かを判定するためには０．００１％オーダーのＰＮＨ型白血球を正確に定量する必要がある。ＰＮＨ型白血球はＧＰＩアンカー型膜蛋白質が「欠失」している血球であるため、従来は、抗ＧＰＩアンカー型膜蛋白抗体が結合しないという性質を利用してこの血球を検出していた。しかし、細胞の抗体処理の過程で傷んだ細胞は抗ＧＰＩアンカー型膜蛋白抗体との結合性が弱くなるため、フローサイトメトリーのドットグラム上で、真のＰＮＨ型白血球とは位置が異なるものの、ＰＮＨ型白血球と紛らわしいところに位置するようになる。このような偽のＰＮＨ白血球集団を真のＰＮＨ型白血球と判別するには多くの経験に基づいた主観的な判断が必要であった。
【００１４】
本発明の方法はこれらの問題を一挙に解決し、簡便かつ正確にＰＮＨ型白血球を検出可能にするものである。本発明の方法を適用することによって、ＰＮＨ型白血球の検出における（１）非特異的反応に基づくノイズの発生が抑制されるだけでなく、（２）ＰＮＨ型白血球の細胞集団がドットグラム上に明瞭に描出される。これにより、ＰＮＨ型白血球の検出に携わる者のフローサイトメトリーへの習熟度合いに関係なく、多くの施設でＰＮＨ型白血球を容易に検出することが可能となる。さらに白血球に特徴的な各表面抗原に対する抗体と組み合わせることで、（３）どのような種類のＰＮＨ型白血球（ＰＮＨ型顆粒球、ＰＮＨ型単球、ＰＮＨ型リンパ球など）でも一度に検出することが可能である。
当該検出方法を利用することで、骨髄不全症候群の免疫病態を診断することができる。ＰＮＨ型白血球は自己免疫性の骨髄不全症例において有意に増加することから、本発明の方法により、自己免疫性の骨髄不全症候群を、造血幹細胞自身の異常に基づく骨髄不全と鑑別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１−１】本発明の方法を使用して、ＰＮＨ型顆粒球を検出するためのゲーティングを示す図である。
【図１−２】本発明の方法を使用して、健常人５０例を対象にＰＮＨ型顆粒球の閾値について解析した結果である。
【図２−１】本発明の方法を使用して、ＰＮＨ型単球を検出するためのゲーティングを示す図である。
【図２−２】本発明の方法を使用して、健常人５０例を対象にＰＮＨ型単球の閾値について解析した結果である。
【図２−３】本発明の方法を使用してＰＮＨ型Ｔ細胞（ａ〜ｃ）、ＰＮＨ型Ｂ細胞（ｄ）およびＰＮＨ型ＮＫ細胞（ｅ）を検出した結果である。
【図２−４】本発明の方法を使用してＰＮＨ型Ｔ細胞（ａ〜ｃ）、ＰＮＨ型Ｂ細胞（ｄ）およびＰＮＨ型ＮＫ細胞（ｅ）の閾値について解析した結果である。
【図３】ＰＮＨ型白血球の検出精度について、本発明の方法（Ｃ法）と、従来法（Ａ法）および高感度検出法（Ｂ法）とを比較した図である。
【図４】高感度検出法によりＰＮＨ型赤血球を検出した結果である。
【図５】ＡＡ患者において、ＰＮＨ型白血球の有無が免疫抑制療法の奏効率や生存率に影響することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１．ＰＮＨ型血球の検出方法
本明細書における「ＰＮＨ型白血球」とは、ＰＩＧＡ遺伝子に変異を来した造血幹細胞に由来するＧＰＩアンカー型膜蛋白質欠失白血球のことをいう。ＰＩＧＡ遺伝子においては、通常、一定の割合で突然変異が発生することから健常者でもごく少数のＰＩＧＡ変異幹細胞を有するが、健常者の骨髄に存在するこの変異造血幹細胞は静止期に留まり続けるため、この幹細胞由来のＰＮＨ型白血球が末梢血中に検出されることはない（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１２：２１６０−２１６２（２００８））。
一方、正常造血幹細胞に対する免疫学的な障害が存在する環境（例えば自己免疫性の骨髄不全症例）では、ＰＩＧＡ遺伝子に変異を来した造血幹細胞はＧＰＩアンカー型膜蛋白質を欠失しているため、正常幹細胞に比べてＴ細胞による障害を受けにくい。このような環境ではＰＩＧＡ変異幹細胞が生き残るため、ＰＮＨ型白血球が相対的に増加すると考えられる。
とはいえ、このような症例においてもＰＮＨ型白血球は血球全体の僅か０．１％前後しか存在しないため、ＰＮＨ型白血球の検出には極めて高感度のフローサイトメトリーを用いる必要がある。本発明の検出方法は、このような微量ＰＮＨ型白血球の検出に特に適したフローサイトメトリーの新たな手段を提供するものである。
【００１７】
上記「ＧＰＩアンカー型膜蛋白」とは、ＧＰＩアンカーと呼ばれる、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、グルコサミン（ＧｌｃＮ）、３つのマンノース（Ｍａｎ）、エタノールアミンリン酸（ＥｔＮ−Ｐ）からなる糖脂質部分に結合して膜表面上に発現する蛋白質全般をいい、現在までに１００種類以上の分子が同定されている。あらゆるＧＰＩアンカー型膜蛋白において、上記糖脂質部分は高い割合で保存されている。ＰＩＧＡ遺伝子に変異を来した造血幹細胞由来の血球はＧＰＩアンカーを製造できず、結果的にＧＰＩアンカー型膜蛋白を産生できなくなっている。
【００１８】
血球において高発現しているＧＰＩアンカー型膜蛋白は血球の種類によって異なる発現パターンを示す。例えば補体制御蛋白質であるＣＤ５５、ＣＤ５９（全血球）、ＨＲＦ（赤血球、血小板）；酵素蛋白質であるアセチルコリンエステラーゼ（赤血球）、アルカリホスファターゼ（好中球）；受容体であるＣＤ１４（単球）、ＣＤ１６（好中球）；接着分子であるＣＤ４８（Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、活性化血小板）、ＣＤ５８（赤血球、顆粒球、リンパ球）、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ（好中球）；ＣＤ７３（Ｂ細胞）、ＣＤ８７（単球、好中球）などが挙げられる。
後述する「ＦＬＡＥＲ（フレア、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ−Ｌａｂｅｌｅｄ ｉｎａｃｔｉｖｅ ｔｏｘｉｎ Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ）」はこれらのＧＰＩアンカー型膜蛋白に結合する。
【００１９】
本明細書において「ＦＬＡＥＲ」とは、細胞表面上のＧＰＩアンカー型蛋白質のＧＰＩアンカー部分、即ち糖脂質部分と特異的に結合する細菌由来の毒素であり、具体的には「遺伝子組換えエロリジン」と呼ばれる種類の蛍光細菌蛋白質である。ＦＬＡＥＲは、ＧＰＩアンカー型蛋白質の蛋白質部分をエピトープとするモノクローナル抗体と異なり、ＧＰＩアンカー部分をエピトープとするため、理論上ほとんどすべてのＧＰＩアンカー型膜蛋白質を認識することができる。
したがってＦＬＡＥＲが結合しない（ＦＬＡＥＲで染色されない）白血球は、ＧＰＩアンカー型膜蛋白（たとえばＣＤ５９）を欠損している白血球として認識されるので、ＰＮＨ型白血球であると判断することができる。
ＦＬＡＥＲには液状とパウダー状の２種類があるが、液状ＦＬＡＥＲであることが望ましい。本発明の方法では、液状ＦＬＡＥＲの方が安定した結果を得ることができる。ＦＬＡＥＲは通常４８８ｎｍで励起し、５３０／３０ｎｍの蛍光を発する。
【００２０】
本明細書において「抗白血球表面抗原抗体」とは、ＦＬＡＥＲと併用しうる抗体であって、各血球系統に特異的に発現している細胞抗原に対する抗体であることが望ましい。本発明においては、例えば、ＰＮＨ型顆粒球を検出する場合は抗ＣＤ１１ｂ抗体を、ＰＮＨ型単球を検出する場合は抗ＣＤ３３抗体を、ＰＮＨ型Ｔ細胞を検出する場合は抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ４抗体または抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ８抗体を、ＰＮＨ型Ｂ細胞を検出する場合は抗ＣＤ１９抗体、そしてＰＮＨ型ＮＫ細胞を検出する場合は抗ＣＤ５６抗体を用いることが好ましい。
また好ましくは、これらの抗体は二つのグループに分けられる。抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ３抗体からなる群は、ＰＮＨ型顆粒球とＰＮＨ型単球を同時に検出するために用いられる。一方で抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体および抗ＣＤ５６抗体からなる群は、ＰＮＨ型のＢ細胞とＴ細胞とＮＫ細胞を同時に検出するために用いられる。
本発明の方法によれば、上記二つのグループのいずれかを選択し、その一種以上の抗体を用いることによって、二種類以上のＰＮＨ型白血球を同時に検出することも可能である。
これらの抗体のクラスは特に限定されず、また市販のものを用いてもよい。
【００２１】
本発明の方法では、フローサイトメトリーを行う前に生体試料から血球成分を得、さらに当該血球成分をＦＬＡＥＲおよび上記抗白血球表面抗原抗体で処理する。
【００２２】
本発明の方法に用いられ得る生体試料としては血球成分を含む限り特に限定されないが、好ましくは血液（特に末梢血）、リンパ液であり、より好ましくはＥＤＴＡまたはヘパリンが添加された末梢血である。
【００２３】
生体試料から血球成分を得る方法としては特に限定されないが、例えば赤血球以外の血球成分を得る場合は、一定速度で遠心分離操作した全血に塩化アンモニウム、炭酸水素カリウム、ＥＤＴＡ・４Ｎａを含む溶血試薬を加えて赤血球を溶血する方法が挙げられる。
【００２４】
一方、血液から赤血球を得るためには、例えば、上記の遠心分離前に取り分けた血液から血漿成分を除き、赤血球層にリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）を加える。これにより赤血球浮遊液が得られる。
【００２５】
得られた血球をＦＬＡＥＲおよび抗白血球表面抗原抗体で処理する方法としては特に限定されず、血球の量、ＦＬＡＥＲ量、抗白血球表面抗体の処理時間、処理温度などの種々の処理条件は、検出するＰＮＨ型白血球の種類やフローサイトメトリーの条件などに合わせて適宜決定することができる。しかしながら、本発明の方法により高感度でＰＮＨ型白血球を検出すべく、本明細書の実施例に記載の処理条件によって実施することが望ましい。
【００２６】
抗白血球表面抗原抗体は、後のフローサイトメトリーにおける検出のために、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ＡＰＣ（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＰＥ−Ｃｙ７、ＡＰＣ、ＡＰＣ−Ｈ７などの蛍光色素や蛍光物質で標識されているものを用いることができる。
【００２７】
またＦＬＡＥＲおよび抗体で処理する際、後述するヒストグラムにおけるゲーティング工程や分析工程において死細胞を除去する目的で、細胞検出マーカーを同時に反応させても良い。一般的には、死細胞を特異的なマーカーを用いて検出し、それらをゲーティングで除外する方法が採用される。死細胞検出マーカーとしては、死細胞ＤＮＡのシトシン−グアニン塩基対の間に結合する７−アミノアクチノマイシン（７−ＡＡＤ）やＡＴ（アデニン・チミン）に富んだ領域に結合するＤＡＰＩなどが挙げられる。これらを指標に後述するゲーティングを行うことによって、不適格な細胞をさらに除去することができ、本発明の目的を達成することができる。
【００２８】
上記蛍光色素や蛍光物質は、検出する白血球の種類や細胞数、フローサイトメトリーの条件設定等によって適宜選択されるが、少なくとも同時に多種類の細胞を検出する目的で複数の抗体等を用いる場合には、それぞれの抗体や細胞検出マーカー等に対して異なる種類の蛍光色素を用いてもよい。
例えばフローサイトメーターとしてＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）を用いる場合、ＰＥ、ＦＩＴＣ、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＰＥ−Ｃｙ７、ＡＰＣ、ＡＰＣ−Ｈ７などの蛍光色素や蛍光物質でそれぞれラベルした複数の抗体や細胞検出マーカー等を同時に用いることが可能である。
【００２９】
これらの操作により、ＦＬＡＥＲおよび一種以上の抗白血球表面抗原抗体が結合した血球の懸濁液（以下「細胞懸濁液」と記載する場合がある）が得られる。
【００３０】
次いで、ＦＬＡＥＲおよび抗白血球表面抗原抗体で処理された血球を検体として、フローサイトメトリーを行う。
フローサイトメトリーの手法としては特に限定されないが、波形処理がデジタル化される（つまり「デジタル波形処理方式」を採用する）フローサイトメーターを用いることが望ましい。
すなわち、本発明における好ましい「フローサイトメトリー」とは、デジタル波形処理（「デジタル波形処理方式」）が可能なフローサイトメーターを用いて行うフローサイトメトリーを意味する。なお、本明細書中、フローサイトメトリーに用いられる機器のことをフローサイトメーターと称する。
【００３１】
本明細書における「デジタル波形処理方式」とは、ＰＭＴ（ｐｈｏｔｏ ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ ｔｕｂｅ）検出器から得られた蛍光パルスシグナルを各種方法によってＡＤ変換し、得られた値を解析することをいう。ＡＤ変換とは、アナログ信号をデジタル信号へ変換することをいう。
特に後述するように、フローサイトメトリーとしてＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）を採用した場合の「デジタル波形処理方式」としては、例えば上記蛍光パルスシグナルを直接２６２，１４４チャネルの解像度でリニアデータにＡＤ変換し、その後Ｌｏｇ対数換算及び蛍光補正（逆行列処理）によって数値演算処理プロセッサー（ｄｉｇｉｔａｌ ｓｉｇｎａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｒ；ＤＳＰ）によって解析することをいう。
【００３２】
本発明の方法は、ＦＬＡＥＲおよび抗白血球表面抗原抗体と、デジタル波形処理が可能なフローサイトメトリーとを組み合わせることが、ＰＮＨ型白血球の検出に最も適した手段であることを初めて見出したことに基づいて完成したものである。
【００３３】
上記デジタル波形処理方式を実現できるフローサイトメーターとしては、例えば、ＦＡＣＳＣａｎｔｏやＢＤ ＬＳＲ２、ＦＡＣＳＡｒｉａなどが挙げられるが、なかでもＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）が好ましい。ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）は、使用方法が簡便化されているので、多くの検体を取り扱う一般臨床技師にも扱いやすく本発明の方法に最も適したフローサイトメーターであると言える。以下、ＦＡＣＳＣａｎｔｏを一例として、フローサイトメーターについて説明する。
【００３４】
フローサイトメーターに付す血球懸濁液は単一（細胞非集合）の懸濁液として調製し、血球一個ずつをレーザー光に通過させる。
細胞懸濁液には死細胞やデブリスが含まれており、これらはフローサイトメトリーにおけるノイズを発生させる原因となる。また正しいデータを得るためには細胞は一個ずつフローされる必要がある。したがって上記懸濁液をフローサイトメーターに付す前には、細胞懸濁液中の細胞はできるだけ一つずつの細胞に均一化したうえ、死細胞やデブリスなどの不純物はできるだけ除去することが望ましい。均一化には自体公知の一般的手法を適用でき、例えば細胞懸濁液のフィルタリングや、ボルテックス操作などを各操作のプロトコールに準じて行う。
フィルタリングに用いられるフィルターとしては、死細胞の集塊やデブリスが除けるメッシュサイズを有するものであれば特に限定されないが、例えばポア径（４０μｍ）のナイロンメッシュが挙げられる。
フローサイトメーターに付す前には、再度デブリスや細胞塊が残っていないかどうかを視認し、残っていれば改めて上記フィルターに通すことが望ましい。
【００３５】
細胞懸濁液中の細胞一つずつをレーザー光に通過させるべく、フローサイトメトリーにおいては、単一の細胞が連続して流れるサンプル液流とそれを包むシース液流とからなるサンプルコアを形成する必要がある。上記サンプルコア内で一個の細胞がビーム中央を通過するように流れを調節し、かつ一度に複数の細胞が照射されないよう、レーザー光はできるだけ集束させて強度を高めることが好ましい。
【００３６】
レーザー光の強度は、ビーム中心部から縁に行くに従って弱くなるため、感度及び分解能を高めるため、全ての細胞が同じ経路でビーム中心部を通るのが好ましい。そのため、上記サンプルコアの直径は小さいほど好ましい。これらの設定は、当業者であればどのようなフローサイトメーターを用いた場合でも適宜設定可能である。
【００３７】
上記サンプルコアの流速は特に限定されず、感度、分解能、処理速度などの関係で当業者が適宜設定することが可能であるが、本発明が微量のＰＮＨ型白血球の検出を目的としている関係上、できるだけ低速であることが望ましい。
特にフローサイトメータとしてＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）を用いた場合、上記サンプルフローの値を制御するシース圧（上記シース液の入った容器に対する圧力）は４．５ｐｓｉに固定されているが、サンプル流への圧力は数値化（ｐｓｉ）されておらず、サンプルが吸引される量がＬｏｗ＝１０μＬ／ｍｉｎ、Ｍｅｄ＝６０μＬ／ｍｉｎ、Ｈｉｇｈ＝１２０μＬ／ｍｉｎになるように、またシース液＝１８ｍＬ／ｍｉｎになるようにサンプル吸引中のチューブ内の圧が調節されている。
測定時のフロー速度は、１００〜３００細胞／秒が好ましく、特に１００〜２００細胞／秒であることが好ましい。
【００３８】
上記サンプルコアの流れはシース圧により制御され、上記サンプルコアの直径はシース圧とサンプル圧の差によって制御される。例えば、サンプル圧を一定に維持したまま、シース圧を高くすることによって上記サンプル・コアの流れを速め、サンプルコア直径が小さくなる。これらの設定は、どのようなフローサイトメーターを用いた場合でも適宜設定可能である。
【００３９】
フローサイトメトリーの光源として用いるレーザーは、血球および血球に結合したＦＬＡＥＲや抗白血球表面抗原抗体を変質させず、且つ血球から散乱光が発生する限り、アルゴンレーザー、ヘリウムネオンレーザー、ヘリウムカドミニウムレーザー、半導体レーザー、光励起半導体レーザー等、公知のいかなるレーザーであっても用いることもできる。
ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）ではデュアルレーザー・セパレートビームスポット方式に加えてオプティカルゲルを用いる事で蛍光の漏れ込みを最小限にしている。また、従来の直列方式、または分岐光学方式で複数の蛍光色素を同時に検出する場合には、蛍光シグナルの強度は光学システムの検出器に達するまでに透過する光学フィルターの数に比例して減衰するという問題があったが、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）ではオクタゴン・トライゴン蛍光検出システムを採用することでこの問題を克服している。
【００４０】
ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）ではデジタル波形処理によるフルマトリックス・コンペンセーションを実現している。マルチカラー解析では、波長幅をもつ蛍光シグナルが近接すればするほど隣接した蛍光検出器でもその蛍光シグナルが検出されてしまう、いわゆる「蛍光の漏れ込み」が起こるため、これを補正するコンペンセーションは不可欠である。従来のアナログ方式ではパルス信号をシグナル処理の過程で蛍光補正回路にて漏れ蛍光係数をパルス信号から減算して補正を行っていたが、この方法は特に４種類以上のマルチカラー解析では補正能力に限界があることから、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）では、逆行列を使用して数学的に補正を行うフルマトリックス・コンペンセーション・システムを採用している。具体的には、ＰＭＴ検出器から得られた蛍光パルスシグナルを直接２６２，１４４チャネルの解像度でリニアデータにＡＤ変換し、その後Ｌｏｇ対数換算および蛍光補正（逆行列処理）により数値演算処理プロセッサーにて解析する。
【００４１】
本発明の検出方法では、目的とするＰＮＨ型白血球を検出すべく、個々の細胞の測定パラメータをプロットし、ヒストグラムを作製する。
パラメータ数は１パラメータでもよいし、２パラメータ以上であってもよいが、本発明の方法では少なくともＦＬＡＥＲと抗白血球表面抗原抗体の２つを検出するので、２パラメータ以上のヒストグラム（サイトグラム）を用いることが望ましい。複数の抗体を用いて多種類の細胞に対する測定を同時に行う場合は、例えばリストモードデータを用いてパラメータの組合せを変え、異なるヒストグラムをその都度得ればよい。
分析対象となる測定パラメータとしては、以下のパラメータが挙げられる。
（１）前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ、ＦＳＣ）
（２）側方散乱光（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ、ＳＳＣ）
（３）７−ＡＤＤ（ＤＡＰＩ）
（４）蛍光（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ、ＦＬ）
【００４２】
本明細書中、「ゲーティング」とは、サンプルの中の関心のある細胞集団だけを選び出し、その細胞のみのヒストグラムを作ることをいう（「ゲートを設定する」ともいう）。前方散乱光／側方散乱光プロットによるゲーティングだけでなく、蛍光パラメーターを利用し、検索対象の細胞集団にゲーティングを行い、解析集団への絞り込みに活用することができる。
ゲーティングに用いられる蛍光パラメーターの少なくとも一つは、ＦＬＡＥＲである。前述のとおりＦＬＡＥＲはＧＰＩアンカー型膜蛋白質を検出するために用いられる。また少なくとも一つは、上記抗白血球表面抗原抗体（蛍光色素などで標識されたもの）に由来する。
【００４３】
上記２以上の蛍光パラメーター（少なくともＦＬＡＥＲの蛍光及び抗体の蛍光）について表示された２次元画面上の細胞クラスターにゲートを設定することで個々の細胞集団を分取する。この場合、例えば顆粒球を解析するならば、以下のような操作を行う。
（１）ＦＳＣ−Ａ（Ａｒｅａ：パルス面積）とＳＳＣ−Ａで展開し、顆粒球、単球、リンパ球からなる白血球領域にゲートをかける；
（２）ＦＳＣ−Ｗ（Ｗｉｄｔｈ：パルス幅）とＦＳＣ−Ｈ（Ｈｉｇｈｔ：パルス高）で展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外する；
（３）ＳＳＣ−ＷとＳＳＣ−Ｈで展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外する；
（４）死細胞を除外する（７−ＡＡＤ陽性細胞やＤＡＰＩ陰性細胞にゲートをかける）；
（５）顆粒球領域にゲートをかける；
（６）ＣＤ１１ｂ強陽性細胞にゲートをかける；
（７）（１）〜（６）により導きだされた細胞が純粋な成熟顆粒球と定義される。この細胞群におけるＦＬＡＥＲ発現を解析する。
【００４４】
なお本明細書中、このようにゲーティングされたヒストグラムのことを「ゲーティングされたヒストグラム」または「ゲートがかけられたヒストグラム」という。
【００４５】
最後に、ゲーティングされたヒストグラムにおいてリージョンを設定することで、リージョン内の細胞についての統計的情報を入手可能である。
ここで「リージョン」とは、目的とする細胞集団に着目した解析（クラスター解析）を行うために、データを絞り込むために設定した領域をいう。またリージョンを目的とする細胞集団ごとに設定することを「リージョンの設定」という。
リージョンの設定は種々の方法や条件式を利用して行われるが、これらの方法や条件式は当業者に公知であり、目的によって適宜設定することが可能である。
【００４６】
抗白血球表面抗原抗体として抗ＣＤ１１ｂ抗体を用い、ＰＮＨ型顆粒球を検出する場合、ＰＮＨ型顆粒球の集団は、
（１）ＦＬＡＥＲへの反応性が低く；
（２）抗ＣＤ１１ｂ抗体に反応する；
という特徴を有するので、ＦＬＡＥＲ（Ｘ軸）と抗ＣＤ１１ｂ抗体（Ｙ軸）との２パラメータヒストグラム上における左上の領域に現れる。
このヒストグラム上で左上領域に観察される細胞集団に対してリージョンを設定することで、得られたＰＮＨ型白血球の統計学的情報を入手することができる。
【００４７】
同様にＰＮＨ型単球の集団、ＰＮＨ型Ｔ細胞の集団、ＰＮＨ型Ｂ細胞の集団、ＰＮＨ型ＮＫ細胞の集団などは、
（１）ＦＬＡＥＲへの反応性が低く；
（２）各細胞特異的な細胞表面抗原に対する抗体に反応する；
という特徴を有するので、ＦＬＡＥＲ（Ｘ軸）と抗細胞表面抗原抗体（Ｙ軸）との２パラメータヒストグラム上における左上の領域に現れる。各細胞に特異的な細胞表面抗原に対する抗体については、前記したとおりである。
このヒストグラム上で左上領域に観察される細胞集団に対してリージョンを設定することでも、得られたＰＮＨ型白血球の統計学的情報を入手することができる。
【００４８】
本発明の方法により得られたドットグラムでは、目的とするＰＮＨ型白血球の集団はその他の白血球の集団と明確に区別される。
【００４９】
本発明の方法により得られる結果は、従来行われてきたＰＮＨ型血球の検出方法と比べ、以下の点において顕著な効果を示している。
（１）ＧＰＩアンカー型膜蛋白質の陰性細胞（ＰＮＨ型白血球）の集団がヒストグラム上で明瞭に描出されるため、従来法と比べ視認しやすい。
（２）ＧＰＩアンカー型膜蛋白質の陰性細胞（ＰＮＨ型白血球）の集団がヒストグラム上で集塊を形成し、陽性細胞の集団と明確に分離して描出されるため、左上領域に観察される細胞数を確認するだけでＰＮＨ型白血球の増加があるかどうかが判定できる。
（３）死細胞に起因するノイズや非特異的な結合に由来するノイズが極めて少なく、主観的な判断でノイズを省く必要が無い。
【００５０】
ところで、本発明の方法において用いられるデジタル波形処理可能なフローサイトメトリーや液状ＦＬＡＥＲはどのような施設でも手に入るため、高精度でのＰＮＨ型白血球検出を目指して種々の条件設定を検討することは他の施設においても行われうると考えられる。ところがデジタル波形処理可能なフローサイトメトリーと液状ＦＬＡＥＲを用いてＰＮＨ型白血球を検出した例はこれまで報告されておらず、また本発明の方法によれば、単にこれらの条件設定を検討したことだけでは予想だにし得ないほど、ヒストグラム上において、従来法からの劇的な変化が認められるのである。
つまるところ、従来の高感度フローサイトメトリー法では本発明の方法と同じ感度・特異性で微少ＰＮＨ型白血球を検出することは不可能であったが、本発明によって、どのような施設でも高感度で微少ＰＮＨ型白血球を検出することができ、かつこれは何度でも簡単に再現できることが期待される。
本発明では、本発明者等が鋭意検討した結果、「ＰＮＨ型白血球を検出する」という目的に対して、「ＦＬＡＥＲ」および「抗白血球表面抗原抗体」を、フローサイトメトリー、特に「波形処理がデジタル化された」フローサイトメトリーで行うという、極めてシンプルな条件を採用するに至った。しかしながらこの条件を採用することにより、従来法では予想だにし得ないほど、微量なＰＮＨ型白血球を自動的に検出できるようになったのである。特に、従来法の汎用化を妨げていた「偽のＰＮＨ型白血球」の主観による除外が可能となったことは、ＰＮＨ型血球の検出法における画期的な進歩ということができる。
【００５１】
さらに本発明の方法によれば、波形処理がデジタル化されたフローサイトメトリーやＦＬＡＥＲなどの新しい機器試薬を用いることに加えて、従来法においてＰＮＨ型血球を検出する際に行ってきた細胞処理やゲーティングなどにおける条件設定を加えることによって、より正確に０．００３％前後のＰＮＨ型白血球を検出できるのである。これらの詳細な条件設定は、本願実施例に詳細に記載されている。
【００５２】
なお、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）を用いてフローサイトメトリーを行う場合は、フローサイトメトリー操作の前に、フローサイトメーターのコンペンセーションを行うことが望ましい。
この場合、各抗体の陽性細胞集団の相対的蛍光強度が１×１０４〜１×１０５程度になるよう電圧を設定し、各蛍光抗体単独で染色した細胞（陽性コントロール）を未染色の細胞（陰性コントロール）と混ぜ合わせた検体を順番に流す。その時に陽性細胞集団にポジティブゲートをかけておく。全てのコンペンセーション用検体を流してから、Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎボタンを押しコンペンセーションを行う（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）では自動的に蛍光補正されるので、マニュアルで蛍光補正をする必要がない）。
【００５３】
２．骨髄不全症候群の検査方法
前記したように、骨髄不全症候群には、自己免疫的な障害によるものと造血幹細胞自身の異常によるものの２種類が混在している。骨髄不全症候群の治療に際しては、このような病態に即した治療を選択することが肝要である。
正常造血幹細胞に対する免疫学的な障害が存在する環境においては、ＰＮＨ型の幹細胞は正常幹細胞に比べてＴ細胞による障害を受けにくいため、ＰＮＨ型白血球は相対的に増加する。したがって対象におけるＰＮＨ型白血球を検出することで、対象が自己免疫的な骨髄不全に陥っているか否かを判断することができる。
本発明は、ＦＬＡＥＲおよび抗白血球表面抗原抗体を用いてフローサイトメトリーを行うという骨髄不全症候群の新たな検査方法を提供するものである。
【００５４】
本発明の方法の対象となる疾患は、骨髄不全症候群のなかでも、自己免疫的障害により生ずる骨髄不全症候群（以下、「自己免疫性骨髄不全症候群」と称する）に属する疾患であり、特に再生不良性貧血と再生不良性貧血との鑑別が困難な芽球が少ないタイプの低リスク骨髄異形成症候群とである。これらの疾患においてＰＮＨ型白血球が検出されれば、対象が自己免疫的な骨髄不全に陥っていると診断できる。一方、造血幹細胞自身の異常による骨髄不全症候群ではＰＮＨ型白血球の増加がみられることはない。すなわち本発明は、自己免疫性骨髄不全症候群の検査方法を提供するものである。
【００５５】
また血液中の網状赤血球数、血小板数、白血球数等の低下から骨髄不全症候群が疑われる対象において、本発明の方法によりＰＮＨ型白血球が検出されれば、当該対象は自己免疫性の骨髄不全症候群を発症している可能性が高く、造血幹細胞の異常に基づく骨髄不全症候群の可能性は低いと診断することができる。
一方、本発明の方法によってもＰＮＨ型白血球を検出することができなければ、当該対象は自己免疫性の骨髄不全症候群を発症している可能性は低く、造血幹細胞の異常に基づく骨髄不全症候群の可能性が高いと判断することができる。
すなわち本発明は、対象における骨髄不全症候群が自己免疫性か造血幹細胞異常性かを判別する方法を提供する。
【００５６】
また血液中の網状赤血球数、血小板数、白血球数等の低下から、骨髄不全症候群が疑われる対象患者において、本発明の方法によりＰＮＨ型白血球が検出されれば、当該対象は免疫抑制療法によって改善する可能性が高いと判断することもできる。一方、本発明の方法によりＰＮＨ型白血球を検出することができなければ、当該対象における免疫抑制療法の奏効率は高くはないと判断することもできる。
すなわち本発明は、骨髄不全症候群に対する免疫抑制療法の適否の判別方法を提供する。
【００５７】
なお前述のとおり、健常者でも微量のＰＮＨ型白血球は検出されるのであるが、本発明の方法によれば、健常者と骨髄不全症候群との間でのＰＮＨ型白血球量の閾値を設定することも可能である。
【００５８】
本明細書中において、「自己免疫性骨髄不全症候群」とは、造血幹細胞が自己のリンパ球や抗体等により攻撃され減少することに起因する骨髄不全症候群を意味し、免疫抑制療法によって回復が見込まれる骨髄不全症候群のことをいう。このような疾患としては、例えば再生不良性貧血や低リスク骨髄異形成症候群の一部が挙げられる。
また本明細書中において、「造血幹細胞異常性骨髄不全症候群」とは、造血幹細胞が後天的な遺伝子異常により増殖・分化しないようになることに起因する骨髄不全症候群を意味し、免疫抑制療法によって回復が見込まれない骨髄不全症候群のことをいう。このような疾患としては、例えば骨髄異形成症候群、低形成白血病などが挙げられる。
【００５９】
本発明の方法を適用することができる対象はヒトである。さらに好ましくは、汎血球減少を呈するヒトである。また本発明の方法に用いられ得る生体試料は、ヒト由来の末梢血に限られる。
【実施例】
【００６０】
以下に本発明の実施例、比較例、参考例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。
【００６１】
（機器の説明）
本発明で用いたフローサイトメーターであるＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）は、ベクトン・ディキンソン社製のものである。
【００６２】
（実施例１）生体試料の処理
生体試料として末梢血を採用し、以下の操作を行うことで末梢血から白血球の細胞浮遊液を採取した。
（１）４℃に保存されたＥＤＴＡ−２Ｎａ末梢血７ｍＬから、別途ＰＮＨ型赤血球の検出用に２ｍＬを別のファルコンチューブに移し、４℃で保存した。残りのＥＤＴＡ−２Ｎａ血５ｍＬをそのまま２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、血漿部分を除去した。
（２）ペレットに５−１０倍量のＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１Ｌ中に塩化アンモニウム８．２６ｇ、炭酸水素カリウム１．０ｇ、４ＮＡ（ＥＤＴＡ・４Ｎａ）０．０３７ｇを含む溶液）を加えて転倒混和したのち８分間室温で静置した。この間、適宜転倒混和して溶血が進んでいることを確認した。
（３）５００ｇで１分間遠心分離(ＫＵＢＯＴＡ社製 SEROMATIC IIのｓｅｌｅｃｔｉｏｎ３)し、ペレットを残して上清をアスピレーターで除去した。
（４）再度５−１０倍量のＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを加えて適宜転倒混和しながら５分間室温に置いた。溶血不十分の場合は計１５分まで操作を延長した。
（５）５００ｇで１分間遠心分離(ＫＵＢＯＴＡ社製 SEROMATIC IIのｓｅｌｅｃｔｉｏｎ３)し、ペレットを残して上清をアスピレーターで除去した。
（６）ブロッキングのため、０．５％ＢＳＡ＋ＰＢＳを１４０μＬ加えてｖｏｒｔｅｘしたのち１０分間室温で静置した。
検体が採取後２４時間以内であればブロッキングは不要とする。
これを細胞浮遊液として、以下の実験を行った。
【００６３】
（実施例２）ＦＬＡＥＲおよび抗体とのインキュベーション
以下の操作を行い、フローサイトメトリーに付すサンプルを作製した。
（１）５ｍＬのファルコンチューブを２本用意し、実施例１で得られた細胞浮遊液から正確に５０μＬずつを取り、それぞれのチューブの底に静置した。この際チューブの壁に浮遊液がつかないように注意した。
（２）１本のチューブに、ＦＬＡＥＲ（１０〜６Ｍ、Ｐｉｎｅｗｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ社製）６μＬ、抗ＣＤ１１ｂ−ＰＥ（５０ ｕｇ／ｍＬ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）４μＬ、７ＡＡＤ（５０ ｕｇ／ｍＬ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）４μＬ、抗ＣＤ４５−ＰＥ−Ｃｙ７（５０μｇ／ｍＬ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）４μＬ、抗ＣＤ３３−ＡＰＣ（６．２５μｇ／ｍＬ、ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社製）４μＬ、抗ＣＤ３−ＡＰＣ−Ｈ７（２００μｇ／ｍＬ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）４μＬを加えた。他方のチューブは陰性対照として用い、ＦＬＡＥＲ以外の抗体をそれぞれ加えた。この時点で後に洗浄に用いるＰＢＳを室温に戻しておいた。これらの操作は暗室（少なくとも蛍光灯は消した部屋内）で行った。また、試薬チューブの盖を開けたまま放置しないことに留意した。
（３）混合液をｖｏｒｔｅｘした後、各チューブを遮光して、４℃の冷蔵庫内で２０分静置した。
（４）各チューブにＰＢＳ３ｍＬを加えて５００ｇで１分間遠心分離（ＫＵＢＯＴＡ社製 ＳＥＲＯＭＡＴＩＣ ＩＩのｓｅｌｅｃｔｉｏｎ３）した。次いで、ペレットを残して上清をアスピレーターで除去した。
（５）各チューブをラックの編み目にこすりつけるなどして震盪（ペレットをほぐす意味がある）し、ＰＢＳを４００μＬずつ加えた。
（６）軽くピペッティングしてからナイロンメッシュフィルターに通して死細胞の集塊を除去した後、新しいチューブに移してこれをフローサイトメトリー解析に付した。
【００６４】
（実施例３）フローサイトメトリー
（Ｉ）コンペンセーション
コンペンセーション用の検体は４℃保存されていた前日の健常者由来残余血を用いて行った。
（１）コンペンセーション用に何も加えない細胞浮遊液５０μＬをＰＢＳ ４００ｍＬで希釈した検体（以下、「ｕｎｓｔａｉｎｅｄ検体」と記載）、そして実施例２（２）に記載の各蛍光抗体を単独で加えた検体（以下、「蛍光抗体単独検体」などと記載）を用意した。なおＦＬＡＥＲ検体、ＣＤ４５検体にはｕｎｓｔａｉｎｅｄ検体を５０μＬずつそれぞれ加えた。
（２）順番にＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）に付し、データを保存した。細胞数は７ＡＡＤのみ２×１０４、他は５×１０３であった。
（３）ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）のコンペンセーションボタンを押し自動補正を行った。
【００６５】
（ＩＩ）ゲーティング
以下の方法により顆粒球領域に対するゲーティングを行った。
（１）ＦＳＣ−ＡとＳＳＣ−Ａで展開し、顆粒球、単球、リンパ球からなる白血球領域にゲートをかけた。
（２）ＦＳＣ−ＷとＦＳＣ−Ｈで展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外した。
（３）ＳＳＣ−ＷとＳＳＣ−Ｈで展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外した。
（４）７−ＡＡＤ陽性の死細胞を除外した。
（５）細胞構造の複雑性と大きさから類推される顆粒球領域にＣＤ４５およびＳＳＣ−Ａでゲートをかけた。
（６）ＣＤ１１ｂ強陽性の細胞にゲートをかけた。
【００６６】
（１）−（６）の操作により導きだされた細胞を、純粋な成熟顆粒球と定義することができる。次にこの細胞群におけるＦＬＡＥＲ発現を解析した。
【００６７】
（ＩＩＩ）分析
縦軸に白血球系統マーカー（顆粒球：ＣＤ１１ｂ、単球：ＣＤ３３、リンパ球：ＣＤ３）を、横軸にＦＬＡＥＲをとってヒストグラムを展開した場合、ＰＮＨ型血球はＵｐｐｅｒ Ｌｅｆｔ（ＵＬ）領域に展開される。このＵＬ領域内にある細胞をＰＮＨ型顆粒球として、その割合を（ＵＬの細胞数／ＵＲ（Ｕｐｐｅｒ Ｒｉｇｈｔ）の細胞数＋ＵＬの細胞数）×１００（％）によって計算した。この計算を行うべく、上記方法によりＰＮＨ型顆粒球についてゲートをかけた結果を図１−１に示す。
一方、健常人５０例を対象とした同様のＰＮＨ型顆粒球のフローサイトメトリー解析により、骨髄不全症候群におけるＰＮＨ型細胞の有意増加は、ＰＮＨ型顆粒球０．００３％以上と定義することができた。結果を図１−２に示す。
【００６８】
（実施例４）ＰＮＨ型単球の検出
実施例１および２と同様の方法で末梢血からフローサイトメトリーに付すサンプルを作製した後、実施例３（Ｉ）に記載のコンペンセーションを行ったＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）に対し当該サンプルを付した。次いで以下の方法によりゲーティングを行い、ＰＮＨ型単球を検出した。
【００６９】
（１）ＦＳＣ−ＡとＳＳＣ−Ａで展開し、顆粒球、単球、リンパ球からなる白血球領域にゲートをかけた。
（２）ＦＳＣ−ＷとＦＳＣ−Ｈで展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外した。
（３）ＳＳＣ−ＷとＳＳＣ−Ｈで展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外した。
（４）７−ＡＡＤ陽性死細胞を除外した。
（５）単球領域にゲートをかけた。
（６）ＣＤ３３強陽性細胞にゲートをかけた。
【００７０】
（１）−（６）の操作により導きだされた細胞を、純粋な成熟単球と定義することができる。この細胞群におけるＦＬＡＥＲ発現を実施例３（ＩＩＩ）と同様の方法で解析した。この計算を行うべく、上記方法によりＰＮＨ型単球についてゲートをかけた結果を図２−１に示す。
一方、健常人５０例を対象とした同様のＰＮＨ型単球のフローサイトメトリー解析により、骨髄不全症候群におけるＰＮＨ型細胞の有意増加は、ＰＮＨ型単球０．０５％以上と定義することができた。結果を図２−２に示す。
【００７１】
（実施例５）ＰＮＨ型Ｔリンパ球の検出
実施例１および２と同様の方法で末梢血からフローサイトメトリーに付すサンプルを作製した後、実施例３（Ｉ）に記載のコンペンセーションを行ったＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）に対し当該サンプルを付した。次いで以下の方法によりゲーティングを行い、ＰＮＨ型Ｔリンパ球を検出した。
【００７２】
（１）ＦＳＣ−ＡとＳＳＣ−Ａで展開し、顆粒球、単球、リンパ球からなる白血球領域にゲートをかけた。
（２）ＦＳＣ−ＷとＦＳＣ−Ｈで展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外した。
（３）ＳＳＣ−ＷとＳＳＣ−Ｈで展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外した。
（４）リンパ球領域にゲートをかけた。
（５）ＣＤ３強陽性細胞にゲートをかけた。
（６）必要に応じて、さらにＣＤ８、ＣＤ４陽性細胞にそれぞれゲートをかけた。
【００７３】
（１）−（６）の操作により導きだされた細胞を、純粋な成熟リンパ球と定義することができる。この細胞群におけるＦＬＡＥＲ発現を実施例３（ＩＩＩ）と同様の方法で解析した。ＣＤ３陽性Ｔリンパ球におけるＦＬＡＥＲ解析結果を図２−３ａに、ＣＤ３陽性Ｔリンパ球をさらにＣＤ８陽性Ｔリンパ球、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球に分けてＦＬＡＥＲ解析を行った結果を２−３ｂおよび２−３ｃにそれぞれ示す。
一方、実施例３（ＩＩＩ）に記載の方法と同様の方法で健常人５０例以上を対象としたＰＮＨ型Ｔリンパ球の解析により、骨髄不全症候群におけるＰＮＨ型細胞の有意増加は、ＰＮＨ型Ｔリンパ球０．１％以上と定義することができた。結果を図２−４ａ、２−４ｂおよび２−４ｃに示す。
【００７４】
（実施例６）ＰＮＨ型Ｂ細胞の検出
実施例１および２と同様の方法で末梢血からフローサイトメトリーに付すサンプルを作製した後、実施例３（Ｉ）に記載のコンペンセーションを行ったＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）に対し当該サンプルを付した。次いで以下の方法によりゲーティングを行い、Ｂ細胞を検出した。
【００７５】
（１）ＦＳＣ−ＡとＳＳＣ−Ａで展開し、顆粒球、単球、リンパ球からなる白血球領域にゲートをかけた。
（２）ＦＳＣ−ＷとＦＳＣ−Ｈで展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外した。
（３）ＳＳＣ−ＷとＳＳＣ−Ｈで展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外した。
（４）リンパ球領域にゲートをかけた。
（５）ＣＤ１９強陽性細胞にゲートをかけた。
【００７６】
（１）−（５）の操作により導きだされた細胞を、純粋な成熟Ｂ細胞と定義することができる。この細胞群におけるＦＬＡＥＲ発現を実施例３（ＩＩＩ）と同様の方法で解析した。結果を図２−３ｄに示す。
また健常人５０例以上を対象としたＰＮＨ型Ｂ細胞の解析により、骨髄不全症候群におけるＰＮＨ型細胞の有意増加は、ＰＮＨ型Ｂ細胞０．０５％以上と定義することができた。結果を図２−４ｄに示す。
【００７７】
（実施例７）ＰＮＨ型ＮＫ細胞の検出
実施例１および２と同様の方法で末梢血からフローサイトメトリーに付すサンプルを作製した後、実施例３（Ｉ）に記載のコンペンセーションを行ったＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）に対し当該サンプルを付した。次いで以下の方法によりゲーティングを行い、ＮＫ細胞を検出した。
【００７８】
（１）ＦＳＣ−ＡとＳＳＣ−Ａで展開し、顆粒球、単球、リンパ球からなる白血球領域にゲートをかけた。
（２）ＦＳＣ−ＷとＦＳＣ−Ｈで展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外した。
（３）ＳＳＣ−ＷとＳＳＣ−Ｈで展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外した。
（４）リンパ球領域にゲートをかけた。
（５）ＣＤ３強陽性細胞にゲートをかけた。
（６）ＣＤ５６陽性細胞にゲートをかけた。
【００７９】
（１）−（６）の操作により導きだされた細胞を、純粋な成熟ＮＫ細胞と定義することができる。この細胞群におけるＦＬＡＥＲ発現を実施例３（ＩＩＩ）と同様の方法で解析した。結果を図２−３ｅに示す。
また健常人５０例以上を対象としたＰＮＨ型ＮＫ細胞の解析により、骨髄不全症候群におけるＰＮＨ型細胞の有意増加は、ＰＮＨ型ＮＫ細胞０．３％以上と定義することができた。結果を図２−４ｅに示す。
【００８０】
（比較例１）従来法によるＰＮＨ型血球の検出（ＦＬＡＥＲおよびデジタル波形処理可能なフローサイトメーターを用いない場合）
従来、ＰＮＨ型血球の検出にはＣＤ５９のｓｉｎｇｌｅ−ｃｏｌｏｒフローサイトメトリーかＣＤ５５−ＰＥ、ＣＤ５９−ＦＩＴＣによるｔｗｏ−ｃｏｌｏｒフローサイトメトリーが施行されてきた。
またこの場合、フローサイトメーターとしては、デジタル波形処理を採用していない機種（ＦＡＣＳｃａｎ、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒなど）を使用していた。
このように、ＦＬＡＥＲおよびデジタル波形処理可能なフローサイトメーターを用いない従来法によりＰＮＨ型血球の検出を試みた。結果を図３に示す（図３のＡ法）。
比較例１の方法ではＵＬ領域における細胞集団が集塊を形成せず、領域が不明確であるのでＰＮＨ型血球検出における感度や特異性が低く、微量なＰＮＨ型血球を正確に検出することができなかった。
【００８１】
（比較例２）抗体型高感度法によるＰＮＨ型白血球の検出（デジタル波形処理可能なフローサイトメーターを用いるが、ＦＬＡＥＲを用いない場合）
次に、ＦＬＡＥＲを用いずにＦＡＣＳＣａｎｔｏと抗体を用いてＰＮＨ型白血球の検出を試みた。結果を図３に示す（図３のＢ法）。
比較例２の方法では、比較例１の方法よりは比較的明瞭であるものの、ＵＬ領域における細胞集団が依然として集塊を形成せず、領域が不明確であった。したがって比較例２の方法でもＰＮＨ型白血球検出における感度や特異性は依然として低く、微量なＰＮＨ型白血球を正確に検出することができなかった。
一方、本発明の方法（図３のＣ法）によれば、ＵＬ領域における細胞集団が集塊を形成し、ＰＮＨ陽性細胞とＰＮＨ陰性細胞との領域が明瞭であった。したがって本発明の方法によれば、微量なＰＮＨ型白血球を簡単な手技で正確に検出できることがわかった。
【００８２】
（参考例１）抗体型高感度法を用いたＰＮＨ型赤血球の検出（デジタル波形処理可能なフローサイトメーターを用いるが、ＦＬＡＥＲを用いない場合）
（Ｉ）赤血球浮遊液の調製
生体試料として末梢血を採用し、以下の操作を行うことで末梢血から赤血球の細胞浮遊液を採取した。
（１）実施例１で別途保存しておいたＥＤＴＡ−２Ｎａ血２ｍＬ入りファルコンチューブを２０００ｒｐｍで１０分間遠心した。
（２）この間にＰＢＳ２ｍＬを入れたファルコンチューブを用意した。
（３）（１）のチューブより血漿を除去した後、赤血球層を５０μＬ採取した。これを（２）のファルコンチューブに加えて３−５％赤血球浮遊液として以下の実験を行った。
【００８３】
（ＩＩ）赤血球と抗体とのインキュベーション
以下の操作を行い、フローサイトメトリーに付すサンプルを作製した。
（１）新しいファルコンチューブを２本用意し、（Ｉ）で得られた赤血球浮遊液５０μＬを各チューブの底に静置した。
（２）抗ＣＤ５５−ＦＩＴＣ（２００μｇ／ｍＬ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）と同量のＣＤ５９−ＦＩＴＣ（２００μｇ／ｍＬ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）とを加え、抗体混合液を用意した（以下、抗ＣＤ５５／抗ＣＤ５９−ＦＩＴＣと記載する）。
（３）ＣＤ５５／ＣＤ５９−ＦＩＴＣ ４μＬ、ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎＡ−ＰＥ４μＬを一方の赤血球浮遊液に、ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ−ＦＩＴＣ４μＬとｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎＡ−ＰＥ ４μＬを他方の赤血球浮遊液（陰性対照となる）に加え、各混合液をｖｏｒｔｅｘした。次いで各チューブを遮光して、４℃の冷蔵庫内で２５分間静置した。
（４）各チューブにＰＢＳ ３ｍＬを加えて、軽く撹拌した。ついで５００ｇで４分間遠心分離し、ペレットを残して上清をアスピレーターで除去した。
（５）ペレットにＰＢＳ ６００μＬを加え、スポイトで数回ピペッティングした後、ナイロンメッシュフィルターを通して死細胞の集塊を除去した後、新しいチューブに検体を移してこれをフローサイトメトリー解析に付した。
【００８４】
（ＩＩＩ）フローサイトメトリー
コンペンセーションは実施例３（Ｉ）と同様に、ｕｎｓｔａｉｎｅｄ検体と各蛍光抗体単独検体をＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）に順番に流した後、コンペンセーションボタンを押し、自動補正を行った。
【００８５】
次いで、以下の方法により赤血球領域に対するゲーティングを行った。
【００８６】
（１）ＦＳＣ−ＡとＳＳＣ−Ａで展開し、赤血球領域にゲートをかけた。
（２）ＦＳＣ−ＷとＦＳＣ−Ｈで展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外した。
（３）ＳＳＣ−ＷとＳＳＣ−Ｈで展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外した。
（４）Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ強陽性細胞にゲートをかけた。
【００８７】
（１）−（４）により導きだされた細胞が純粋な成熟赤血球と定義することができる。次にこの細胞群におけるＣＤ５５／ＣＤ５９を解析した。
【００８８】
縦軸に赤血球系統マーカー（ＧｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎＡ）、横軸にＣＤ５５／ＣＤ５９をとってヒストグラムを展開した場合、ＰＮＨ型赤血球はＵｐｐｅｒ Ｌｅｆｔ（ＵＬ）領域に展開される。このＵＬ領域内にある細胞をＰＮＨ型赤血球として、その割合を（ＵＬ／ＵＲ＋ＲＬ）×１００（％）によって計算した。この計算を行うべく、上記方法によりＰＮＨ型赤血球にゲートをかけた結果を図４に示す。ＰＮＨ型血球の陽性症例では、ＵＬ領域に１．３％のＰＮＨ型赤血球が存在した。
一方、この実験を健常人５０例を対象として詳細に解析することにより、骨髄不全症候群におけるＰＮＨ型細胞の有意増加はＰＮＨ型赤血球０．００５％以上と定義することができた。
【００８９】
（参考例２）ＰＮＨ型血球の有無による免疫抑制療法の奏効率・生存率の相違
Ｂｌｏｏｄ．２００６；１０７：１３０８−１３１４に記載の方法と同様の方法で、ＰＮＨ型血球の有無により再生不良性貧血患者における免疫抑制療法の奏効率やその後の生存率がどのように変化するかを調べた。結果を図５に示す。
ＰＮＨ型血球陽性の再生不良性貧血患者では、陰性の患者に比べてＡＴＧ＋シクロスポリン療法が奏効しやすく（図５Ａ）、また生存率が有意に高いこと（図５Ｂ）が分かった。
【００９０】
これらの結果から、本発明の方法によりＰＮＨ型白血球の存在を検出できることが理解できる。また本発明の方法を適用することによって、骨髄不全症候群の免疫病態を診断することができる。従って本発明の検査方法をＲＡやＡＡといった骨髄不全症例の治療方針の判断材料の一つとして採用することにより、対象患者が免疫抑制療法の適応対象か否かを判別することができる。その結果、骨髄不全症例の診療において、個々の患者に最適な治療を選択することが可能になることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明は、極めて微量のＰＮＨ型白血球を簡便かつ正確に検出可能にする方法である。本発明の方法を適用することによって、
（１）ＰＮＨ型白血球の検出における非特異的反応に基づくノイズの発生が抑制される。
（２）またＧＰＩアンカー型膜蛋白質を有さない細胞集団が、ヒストグラム上に明瞭に描出される。これにより、ＰＮＨ型白血球の検出に携わる者のフローサイトメトリーへの習熟度合いに関係なく、多くの施設でＰＮＨ型白血球を容易に検出することが可能となる。
（３）さらに白血球に特徴的な各表面抗原に対する抗体と組み合わせることで、どのような種類のＰＮＨ型白血球（ＰＮＨ型顆粒球、ＰＮＨ型単球など）でも一度に検出することが可能である。
【００９２】
また当該検出方法を利用することで、骨髄不全症候群の診断も行うことができる。特にＰＮＨ型白血球は自己免疫性の骨髄不全症例において有意に増加するので、本発明の方法により自己免疫性の骨髄不全症候群と造血幹細胞自身の異常による骨髄不全症候群とを判別することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＬＡＥＲおよび少なくとも一種の抗白血球表面抗原抗体を用いてフローサイトメトリーを行うことを含む、ＰＮＨ型白血球の検出方法。
【請求項２】
フローサイトメトリーにおける波形処理がデジタル化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗白血球表面抗原抗体が、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ３抗体からなる群、あるいは抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体および抗ＣＤ５６抗体からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
二種類以上のＰＮＨ型白血球を同時に検出することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＦＬＡＥＲおよび抗白血球表面抗原抗体を用いてフローサイトメトリーを行うことを含む、骨髄不全症候群の検査方法。
【請求項１】
ＦＬＡＥＲおよび少なくとも一種の抗白血球表面抗原抗体を用いてフローサイトメトリーを行うことを含む、ＰＮＨ型白血球の検出方法。
【請求項２】
フローサイトメトリーにおける波形処理がデジタル化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗白血球表面抗原抗体が、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ３抗体からなる群、あるいは抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体および抗ＣＤ５６抗体からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
二種類以上のＰＮＨ型白血球を同時に検出することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＦＬＡＥＲおよび抗白血球表面抗原抗体を用いてフローサイトメトリーを行うことを含む、骨髄不全症候群の検査方法。
【図１−１】
【図１−２】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図３】
【図４】
【図５】
【図１−２】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−１２２９５４（Ｐ２０１２−１２２９５４Ａ）
【公開日】平成２４年６月２８日（２０１２．６．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２７５８７８（Ｐ２０１０−２７５８７８）
【出願日】平成２２年１２月１０日（２０１０．１２．１０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２２年９月２５日 社団法人 日本血液学会主催の「第７２回日本血液学会学術集会」において文書（スライド）をもって発表および平成２２年９月３０日 社団法人 日本血液学会発行の「社団法人日本血液学会 臨床血液 第５１巻 第９号」に発表
【出願人】（５０４１６０７８１）国立大学法人金沢大学 (282)
【公開日】平成２４年６月２８日（２０１２．６．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１０日（２０１０．１２．１０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２２年９月２５日 社団法人 日本血液学会主催の「第７２回日本血液学会学術集会」において文書（スライド）をもって発表および平成２２年９月３０日 社団法人 日本血液学会発行の「社団法人日本血液学会 臨床血液 第５１巻 第９号」に発表
【出願人】（５０４１６０７８１）国立大学法人金沢大学 (282)
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