ＲＮＡに基づくウイルスベクター系を提供するペスチウイルスレプリコン
本発明は、複製能を欠損するように操作され、それにより、感染性を欠如し、さらに、外来遺伝子を含むようになったペスチウイルスのレプリコン、特に、ブタコレラウイルスのレプリコンに関する。本発明のレプリコンは、その複製に必要とされる全ての遺伝情報を含むが、ウイルス構造タンパク質Ｅ１、Ｅ２、Ｅｒｎｓ又はＣタンパク質をコードする遺伝子のうちの少なくとも一つの必須のコドン又は全てのコドンを欠如し、その結果、感染性のウイルス粒子を作製できない。細胞におけるインターフェロン誘導経路をもはや制御し得ない修飾Ｎｐｒｏタンパク質をコードする変異遺伝子を用いて、特定のレプリコンが作製される。別の特定のレプリコンは、全ての構造タンパク質、ｐ７タンパク質及びＮＳ２タンパク質をコードする遺伝子を欠いており、且つ、形質導入細胞中で細胞病原性を有する。本発明のレプリコンは、裸のＲＮＡ又は任意の形態の送達ビヒクル中にパッケージされたＲＮＡとして、哺乳類（例えば、ヒト）において、ワクチン接種、遺伝子送達及び遺伝子治療用途のために使用し得る新規なベクター系を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染性ウイルス粒子を形成する能力を欠如するように操作され、さらに、外来遺伝子を含むようになったペスチウイルスのレプリコン、特に、ブタコレラウイルスのレプリコンに関する。これらのレプリコンは、裸のＲＮＡとして、又は、適当な微粒子送達ビヒクル中にパッケージされたＲＮＡ（例えば、ペスチウイルス中に入れられたレプリコン）として、哺乳類（例えば、ヒト）において、ワクチン接種、遺伝子送達及び遺伝子治療用途のために使用し得る新規なベクター系を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）
ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）は、ブタ及びイノシシにおける、感染性の高い疾患の原因物質であるが、ヒトに対しては全く無害である。ＣＳＦＶは、ウシウイルス性下痢症ウイルス及びヒツジのボーダー病ウイルスと共に、フラビウイルス科のペスチウイルス属に属する。フラビウイルス科に属する他のものとしては、フラビウイルス属（原型：黄熱病ウイルス）及びヘパシウイルス属（Ｃ型肝炎ウイルス）である。
【０００３】
ペスチウイルスは、５’及び３’非翻訳領域に隣接する１つの大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、正の極性を有する一本鎖の１２．３ｋｂのＲＮＡゲノムを含む、小さなエンベロープを有するウイルスである。このＯＲＦは、ＮＨ２−Ｎｐｒｏ−Ｃ−Ｅｒｎｓ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ−ＣＯＯＨ（図１Ａ）の順番で、４つの構造タンパク質及び８つの非構造（ＮＳ）タンパク質から構成されるポリタンパク質をコードする。ビリオンの構造要素には、キャプシドタンパク質Ｃと、３つのエンベロープ糖タンパク質Ｅｒｎｓ、Ｅ１、及びＥ２を含む。リーダー自己タンパク質分解酵素Ｎｐｒｏ並びにＥｒｎｓ（リボヌクレアーゼ活性を有する糖タンパク質であり、共に分泌され、ウイルスに付随する）は、ペスチウイルス属に固有である。Ｎｐｒｏは、ウイルスの複製には必要とされないアクセサリータンパク質ではあるが、生来の免疫反応を干渉するその能力により、ウイルスの病原性における役割を有すると考えられている。さらに、Ｎｐｒｏは、自分自身を切断して、新生ウイルスポリタンパク質を生成し、それによって、キャプシドタンパク質Ｃのアミノ末端を生成する自己タンパク質分解酵素である。タンパク質ＮＳ３〜ＮＳ５Ｂは、ウイルスＲＮＡの複製のためには十分であり、ＲＮＡ複製複合体を形成すると考えられる。切断されないＮＳ２−ＮＳ３並びにｐ７は、ウイルス粒子形成のために必要である。
【０００４】
ＲＮＡウイルスのゲノムの操作は、対応するｃＤＮＡクローンが、好ましくは、プラスミド中に挿入され、細菌細胞中で遺伝情報の安定的伝搬が利用可能な場合にのみ可能である。これらのクローンは、ウイルスＲＮＡが複製し、最終的に、感染性ウイルスの生成をもたらす感受性細胞中へとトランスフェクトし得る真正の感染性ウイルスＲＮＡのインビトロ転写を可能にするように設計される。過去１５年間以上にわたり、フラビウイルス科の多くのウイルス（例えば、ペスチウイルス）のためのｃＤＮＡクローンが確立されてきた。
【０００５】
ペスチウイルスｃＤＮＡクローンの開発に続き、安定的に挿入されたクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を伴うＡｌｆｏｒｔ／１８７株（Ｒｕｇｇｌｉら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０，３４７８−３４８７，１９９６）由来の組み換えＣＳＦＶが作製され（Ｍｏｓｅｒら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２，５３１８−５３２２，１９９８）、ウイルス複製に影響を与えることなく、外来遺伝子を、Ｎｐｒｏタンパク質と融合させて発現させ得ることが示された。また、ＣＳＦＶ中の全Ｎｐｒｏ遺伝子をマウスユビキチン遺伝子と置換することは、ウイルスの複製能を損なわなかった（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２，７６８１−７６８４，１９９８）。
【０００６】
ＣＳＦＶレプリコン
定義により、レプリコンとは、宿主細胞中で自律的に複製する分子を表す。したがって、標準的なＣＳＦＶの全長ＲＮＡゲノムは、原型ＣＳＦＶレプリコンである。操作されたＣＳＦＶのｃＤＮＡを用いた研究が、ＲＮＡ複製のために必要とされるウイルスタンパク質を決定するために行われた。これにより、複製複合体が、５つのタンパク質ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂから構成されることが結論付けられた。上記研究後、構造タンパク質、Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１、又はＥ２のうちの１つのみ又は複数に対するコード配列を欠如する人工レプリコンを作製した（Ｆｒｅｙら，Ｖｅｔ Ｒｅｓ ３７，６５５−７０，２００６）。かかるレプリコンは、ウイルスの欠如している構造タンパク質をそれぞれ構成的に発現する細胞系統において補完される必要があり、これにより、欠陥を有する（レプリコン）ゲノムを担持するウイルス粒子のレスキューを可能にする。これらの欠陥を有するＣＳＦＶ粒子は、ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）と呼ばれる。
【０００７】
ワクチンとしてのＣＳＦＶレプリコン
ＶＲＰの形態のＣＳＦＶレプリコンを、ヒト又はその他の哺乳類に対するワクチン接種のためのベクターとしてではなく、ブタのＣＳＦＶに対する実験的ワクチンとして使用した。ＶＲＰは、ウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子のうちの少なくとも１つ中に特定の欠失を有する、サブゲノムＲＮＡを含む感染性ビリオンである。かかるＲＮＡは、宿主細胞中で複製し、コードされたウイルスタンパク質を発現する。しかしながら、エンベロープタンパク質のうちの少なくとも１つの欠損によって、ＶＲＰは子孫ＶＲＰを生成できない。Ｅｒｎｓ又はＥ２遺伝子のいずれかを欠くゲノムを担持するＶＲＰが、生弱毒化非伝染性ＣＳＦワクチンとして最近提案されている。ＶＲＰを非経口的にワクチン接種したブタに対する、伝染性の高いＣＳＦＶを用いた抗原投与接種によって、Ｅｒｎｓ遺伝子を欠如するＶＲＰが防御的であり得ることが示されている（Ｆｒｅｙら，Ｖｅｔ Ｒｅｓ ３７，６５５−７０，２００６）。これらのＶＲＰワクチンが、液性免疫及び細胞性免疫の両方を誘導する能力を有することも知られている。
【０００８】
今日使用されている多くのワクチンは、不活性化ウイルスに基づいており、これらは、細胞性の防御機構をほとんど又は全く発現させずに、液性免疫に有利に働く傾向がある。このことは、遊離ウイルス及びある程度ウイルスが感染した細胞を、抗体の作用によって除去することを可能にし得るが、抗体は、身体の全ての部分におけるウイルスと相互作用することはできない。小さな病巣のウイルス感染細胞の除去を確かにし得るのが細胞性免疫である。したがって、あるワクチンが、液性免疫及び細胞性免疫の両方を誘導し得る場合には、より確実な免疫防御の可能性が見込まれる。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、感染性のウイルス粒子を形成する能力を欠如するように操作され（図１Ｂ〜１Ｇ）、さらに、外来遺伝子を含むようになったペスチウイルスのレプリコン、特に、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）のレプリコンに関する。このレプリコンは、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）中にトランスフェクトした場合に、これらの細胞中で複製する能力を保持する。
【００１０】
特に、このレプリコンは、ウイルス粒子を形成するために必要とされる１つ又はそれ以上の構造タンパク質をコードする必須のコドン又は全てのコドンを欠く。ＣＳＦＶの構造タンパク質は、キャプシドタンパク質Ｃ並びに３つのエンベロープ糖タンパク質のＥｒｎｓ、Ｅ１、及びＥ２である。しかしながら、対象となる任意の外来遺伝子の発現のために設計されたレプリコンは、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）中でのその複製に必要とされる全ての遺伝情報を保持する。対象となる外来遺伝子は、外来タンパク質をコードする完全な遺伝子であっても、外来タンパク質の一部をコードするヌクレオチド配列であってもよい。外来遺伝子は、例えば、ウイルスコード配列、好ましくは、Ｎｐｒｏ遺伝子内の配列の、５’末端に、又は、バイシストロニックゲノムを構成している場合、Ｎｐｒｏ遺伝子の３’末端に挿入してもよい（図２Ｂ〜２Ｅ）。
【００１１】
特定の形態のレプリコンは、さらに、Ｎｐｒｏ遺伝子中に変異コドン、例えば、Ｎｐｒｏのアミノ酸位置１１２番におけるシステインからアルギニンへの置換（Ｃ１１２Ｒ）、又は、アミノ酸位置１３６番におけるアスパラギン酸からアスパラギンへの置換（Ｄ１３６Ｎ）を含み、その結果、コードされた変異体Ｎｐｒｏタンパク質（図１及び２中、Ｎｐｒｏ’と記載する）は、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）誘導を干渉する能力を喪失している。さらに特定の形態のレプリコンの場合は、Ｉ型ＩＦＮ誘導を干渉し得るタンパク質をもはやコードしないレプリコンを作製するという同様の目的のために、Ｎｐｒｏ遺伝子は欠失されている（ΔＮｐｒｏ ＣＳＦＶレプリコン）。
【００１２】
さらに別の特定の形態のレプリコンは、非構造タンパク質ＮＳ２に対する必須のコドン、又は、さらなるヌクレオチドによって物理的に分離されているＮＳ２及びＮＳ３をコードする遺伝子を欠如しており、結果として、このレプリコンは細胞病原性である。特に、ＣからＮＳ２までの全ての配列が欠如していてもよい（ΔＣ−ＮＳ２ ＣＳＦＶレプリコン）（図１Ｇ）。細胞病原性の表現型は、細胞傷害性免疫防御の誘導に関して有利であり得ると言えよう。
【００１３】
本発明のレプリコンは、裸のＲＮＡとして、又は、適当な微粒子送達ビヒクルを伴うＲＮＡ（例えば、ペスチウイルス中にパッケージされたレプリコン）として、哺乳類（例えば、ヒト）において、ワクチン接種、遺伝子送達及び遺伝子治療用途のために使用し得る新規なベクター系を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、ペスチウイルスレプリコン単独、又は、ワクチンとしての用途価値を有する外来遺伝子をコードする適当な微粒子送達ビヒクルを伴うペスチウイルスレプリコンを含む医薬組成物に関する。したがって、本発明は、レプリコン単独、又は、適当な微粒子送達ビヒクルを伴うレプリコンを投与することによる、感染性物質により引き起こされる疾患の予防方法に関連し、この場合、レプリコン中に組み込まれている外来遺伝子は、感染性物質に対して免疫性を付与する遺伝子産物をコードする。
【００１５】
さらに、本発明は、レプリコン単独、又は、適当な微粒子送達ビヒクルを伴うレプリコンを投与することによる、欠損遺伝子により引き起こされる疾患の治療方法に関連し、この場合、レプリコン中に組み込まれる外来遺伝子は、疾患に関連する機能性遺伝子である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＣＳＦＶ ｖＡ１８７−１の標準的な全長且つ欠陥を有するゲノム（レプリコン）の概略図。５’−及び３’−ＵＴＲ（非翻訳領域）は、黒色の直線で表され、オープンリーディングフレームは、図示されるように、構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードする個々のウイルス遺伝子から構成される四角形（灰色）として示され、非構造Ｎｐｒｏタンパク質をコードする遺伝子は、黒色の四角形として示される。用語Ｎｐｒｏ’とは、コドンが変異しているＮｐｒｏタンパク質のことをいう。（Ａ）標準的な全長ＣＳＦＶゲノムの遺伝子配列の概略図。（Ｂ）〜（Ｇ）レプリコンの複製を損なうことなく、選択された遺伝子が欠失しているＣＳＦＶレプリコン構築物の例：（Ｂ）Ｅｒｎｓ遺伝子を欠如しているＣＳＦＶレプリコン（ΔＥｒｎｓレプリコン）；（Ｃ）Ｅ１遺伝子を欠如しているＣＳＦＶレプリコン（ΔＥ１レプリコン）；（Ｄ）Ｅ２遺伝子を欠如しているＣＳＦＶレプリコン（ΔＥ２レプリコン）；（Ｅ）Ｃ遺伝子を欠如しているＣＳＦＶレプリコン（ΔＣレプリコン）；（Ｆ）Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１及びＥ２遺伝子を欠如しているＣＳＦＶレプリコン（ΔＣ−Ｅ２レプリコン）；（Ｇ）Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１、Ｅ２及びＮＳ２遺伝子を欠如しているＣＳＦＶレプリコン（ΔＣ−ＮＳ２レプリコン−細胞病原性又はｃｐレプリコン）。
【図２】標準的な全長ＣＳＦＶ ｖＡ１８７−１ゲノムの概略図（A）、並びに、異種遺伝子（対象遺伝子「Ｇｅｎｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（ＧｏＩ）」）が、モノシストロニック構築物（Ｂ，Ｄ）及びバイシストロニック構築物（Ｃ，Ｅ）中に挿入されている、この構築物（Ｂ〜Ｅ）に由来する欠陥を有するゲノム（レプリコン）の例。色の濃淡及び用語は図１中の通りであり、ＧｏＩは、縞模様の四角形として示されている。モノシストロニック構築物の場合、これは、Ｎｐｒｏ遺伝子の５’末端に位置する最初の１２ヌクレオチド中に配置されている。バイシストロニック構築物の場合、ＧｏＩは、Ｎｐｒｏ遺伝子の直ぐ下流に配置されている。バイシストロニック構築物のために必要とされるＥＭＣＶ ＩＲＥＳは、挿入されたＧｏＩの３’末端に黒色の実線として示されている。
【図３】ブタ及びヒトの細胞両方におけるＩＦＮ−α／β誘導の調節に対するＣＳＦＶ Ｎｐｒｏタンパク質の重要性。ＩＦＮ−α／β誘導に対するＣＳＦＶ又はＣＳＦＶレプリコンによる調節は、Ｎｐｒｏタンパク質依存的であり、Ｎｐｒｏ遺伝子が、全長ウイルスゲノムから又はレプリコンから欠失している場合（ｖＡ１８７−ΔＮｐｒｏ）には、存在しない。ＩＦＮ−α／β誘導に対するＮｐｒｏ−依存性調節はまた、２つの独立したアミノ酸変化（各構築物中、Ｎｐｒｏ（Ｃ１１２Ｒ）又はＮｐｒｏ（Ｄ１３６Ｎ））のいずれかによりノックアウトされ得る。（Ａ）ブタ腎臓細胞ＰＫ−１５細胞を、ｘ軸に示されるように、偽感染（「Ｍ」）させ、又は、２ ＴＣＩＤ５０／細胞のＭＯＩにて、ＣＳＦＶ ｖＡ１８７−１を用いて感染させ、又は、Ｎｐｒｏ遺伝子を欠如するｖＡ１８７−１由来の変異体（ｖＡ１８７−ΔＮｐｒｏ）、若しくは、Ｎｐｒｏのアミノ酸位置１１２番にシステインからアルギニンへの置換を有するｖＡ１８７−１由来の変異体（ｖＡ１８７−ΔＮｐｒｏ（Ｃ１１２Ｒ））、若しくは、アミノ酸位置１３６番にアスパラギン酸からアスパラギンへの置換を有するｖＡ１８７−１由来の変異体（ｖＡ１８７−ΔＮｐｒｏ（Ｏ１３６Ｎ））を用いて感染させた。Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−α／β）の生物活性を、定量のために、Ｍｘ／ＣＡＴレポーター遺伝子アッセイ、及び、基準物質としてブタＩＦＮ−αを用いて、細胞培養上清中、１ｍｌあたりの単位（ｙ軸）として測定した。検出限界は、２Ｕ／ｍｌである。（Ｂ）ヒト胎児腎細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｘ軸に示されるように、３種類のプラスミド：ヒトＩＦＮ−βプロモーター活性に対して、ホタルルシフェラーゼレポータープラスミドｐ１２５Ｌｕｃ（Ｒｕｇｇｌｉら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３４０，２６５−２７６，２００５）；（正規化のために）ウミシイタケルシフェラーゼの構成的発現に対して、プラスミドｐｈＲＬ−ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ）；並びに、Ｎｐｒｏ（Ｎｐｒｏ）又は変異Ｎｐｒｏ（Ｎｐｒｏ（Ｃ１１２Ｒ）、Ｎｐｒｏ（Ｄ１３６Ｎ））タンパク質の発現に対するプラスミド、の混合物を用いて、２連のウェル中でトランスフェクトした。「Ｃ」とは、キャプシドタンパク質Ｃをコードする発現プラスミドを用いたトランスフェクションのことを指し、「Ｖ」とは、Ｎｐｒｏの発現のために使用されるが、Ｎｐｒｏ遺伝子を欠如するプラスミドを用いたトランスフェクションのことを指す。ＩＦＮ−βを誘導させるために、２４時間後に、一方のウェルを、２ｘ１０５個の細胞あたり、４００ｎｇのポリ（ＩＣ）を用いてさらにトランスフェクトし、もう一方のウェルを偽トランスフェクトした。１８時間後に、誘導性ホタルルシフェラーゼ活性を、構成的に発現されるウミシイタケルシフェラーゼ活性を用いて正規化し、偽処理した細胞に対するポリ（ＩＣ）処理した細胞の相対誘導比（「Ｉ」）を計算した。結果は、標準偏差を表すエラーバーを有する３つの独立した誘導比の平均である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、感染性ウイルス粒子を形成する能力を欠如するように操作され、外来遺伝子をさらに含む、ペスチウイルスのレプリコン、特に、ブタコレラウイルスのレプリコンに関する。このレプリコンは、哺乳類細胞中に導入された時に、その細胞中で複製する能力を保持する。
【００１８】
「レプリコン」は、宿主細胞中で自律的に複製する分子である。本発明の目的のための、「レプリコン」は、細胞中での複製のために必要とされる全てのヌクレオチドを含む、対応するウイルス（ペスチウイルスレプリコンの場合、ペスチウイルス）由来のＲＮＡである。「由来する」とは、そのレプリコンが、ゲノムの非翻訳５’−及び３’−末端領域、並びに、対応するウイルスのＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂをコードする領域の全てのヌクレオチドを依然として含むが、複製を干渉しないさらなるヌクレオチドを含んでもよいことを意味する。
【００１９】
本発明のレプリコンは、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）に由来するのが好ましい。ＣＳＦＶレプリコンは、それが、ヒトには感染しないか、さもなければ、ヒトには害を及ぼさない動物ウイルスに由来するという事実により、ヒトへ適用するための外来遺伝子物質の担体としての利点を提供する。ＲＮＡ分子と同様に、それは、細胞の細胞質中では複製するが、核内では複製しない。したがって、ウイルスＤＮＡの場合と同様に、それは、ヒト、又はその他の動物、又はそれらの細胞に対してリスクをもたらさない。さらに、本発明のレプリコンは、担持された外来遺伝子を、機能的に活性を有し、且つ、完全なタンパク質へと翻訳し得るが、感染性の子孫ウイルスを生成するために複製することはできず、さらに別の安全的成分が本発明のレプリコンによって提供される。翻訳されたタンパク質によって、レプリコンは、治療的又は予防的用途のために利用し得るタンパク質をコードする遺伝子を送達し得るという利点を提供する。さらに、送達された遺伝子は、免疫系によるプロセシングのために、タンパク質へと翻訳し得る。レプリコンは、免疫系の樹状細胞中で複製し、タンパク質を翻訳する。このことは、免疫反応の発現をもたらし、免疫系へのかかるタンパク質の提示に極めて重要である。したがって、本レプリコンは、ワクチンとしての高い可能性を提供し、かかるワクチンは、本発明の主題でもある。
【００２０】
特定の例として、ルシフェラーゼ遺伝子又はインフルエンザウイルス赤血球凝集素遺伝子を担持する、ブタコレラウイルス由来の本発明のレプリコンが、ワクチン送達系としての用途で使用することができることが、以下、本明細書において示される。特定の例において、外来遺伝子物質は、Ｎｐｒｏの自己タンパク質分解活性を維持するために、レプリコンのＮｐｒｏ遺伝子の５’末端近くに挿入される（すなわち、モノシストロニックレプリコンを作製する）。モノシストロニックレプリコンの翻訳時、対象となる外来タンパク質は、Ｎｐｒｏポリペプチド中に組み込まれた融合タンパク質として合成される。或いは、外来遺伝子は、Ｎｐｒｏ遺伝子の直ぐ下流に挿入される。この場合、外来遺伝子に続いて、終止コドン、及び、ＥＭＣ（脳心筋炎）ウイルス（ＥＭＣＶ）由来のＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）が並び、これにより、残りのウイルスポリタンパク質の翻訳が可能となる。したがって、このタイプのレプリコンは、バイシストロニックであり、第１のシストロンは、Nｐｒｏ遺伝子及び対象となる外来遺伝子から構成され、第２のシストロンは、レプリコンの残りの遺伝情報を担持する。バイシストロニックレプリコンの翻訳時、Nｐｒｏの自己タンパク質分解活性によって、対象となる真正の外来タンパク質を生じる。
【００２１】
特に、本発明のレプリコンは、感染性ウイルス粒子の形成に必要とされる構造タンパク質をコードする遺伝子中の必須のコドン又は全てのコドンを欠如する。かかる構造タンパク質は、キャプシドタンパク質Ｃと、３つのエンベロープ糖タンパク質Ｅｒｎｓ、Ｅ１、及びＥ２である。４つの構造タンパク質Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１、及びＥ２のうちの１つのみが欠陥を有する又は欠如している可能性もあり、又は、２つ、３つ又は全ての構造タンパク質が欠陥を有する且つ／又は欠如している可能性もある。「必須のコドン」とは、かかるコドンが欠如している場合に、その結果、コードされたタンパク質が欠陥を有し、構造タンパク質として、特に、構造タンパク質Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１、又はＥ２として機能することができないことを意味する。
【００２２】
本発明のレプリコンは、外来遺伝子を担持する。「外来遺伝子」は、少なくとも８個のアミノ酸からなる、例えば、８〜２０００個のアミノ酸、好ましくは、２０個以上のアミノ酸、特に１００個以上のアミノ酸からなる外来ポリペプチドをコードする完全な外来遺伝子又は外来ヌクレオチド配列である。「外来」とは、対応する遺伝子又はヌクレオチド配列が、ペスチウイルス中には見られないが、別の供給源から切り出され、レプリコン中に導入されるか、又は最初から構築されて、レプリコン中に導入されることを示す。特定の外来遺伝子の例は、治療タンパク質（例えば、インスリン等のホルモン類、ＧＭ−ＣＳＦ１等のサイトカイン類、レチナールデヒドロゲナーゼ等の酵素類、ＴＮＦ受容体等のサイトカイン受容体）、並びに、疾患を引き起こす感染性物質中に存在するタンパク質、特に、疾患を引き起こすウイルス（例えば、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全症ウイルスＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウイルスＨＣＶ、Ｂ型肝炎ウイルスＨＢＶ、ハシカウイルス、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ等）、細菌（例えば、ボルデテラ属、ボレリア属）、又は、寄生虫（例えば、プラスモジウム属）及び真菌（例えば、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガタス）等の表面タンパク質、並びに、毒素（例えば、破傷風トキソイド）をコードする遺伝子である。さらに、上記した物質の公知の免疫原性エピトープのいずれか、例えば、インフルエンザウイルスＨＡ糖タンパク質、ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質、又はＨＣＶ Ｅ糖タンパク質の免疫優勢エピトープ、をコードするヌクレオチドを導入してもよい。
【００２３】
外来遺伝子は、例えば、ウイルスのコード配列の５’末端、Ｎｐｒｏ遺伝子の５’末端の最初の１２ヌクレオチド中、又は、Ｎｐｒｏ遺伝子の直ぐ下流に挿入してもよい。或いは、外来遺伝子は、ウイルスゲノムのその他の部位、例えば、３’ＮＴＲの開始部に挿入してもよい。図２中に示されるようにして挿入された外来遺伝子（対象遺伝子：Ｇｅｎｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，「ＧｏＩ」）を有するモノシストロニック及びバイシストロニックレプリコンが好ましい。しかしながら、本発明は、図２のΔＥｒｎｓ又はΔＣ−ＮＳ２構築物には限定されない。対応するモノシストロニック及びバイシストロニック構築物ΔＥ１、ΔＥ２、ΔＣ及びΔＣ−Ｅ２（図１Ｃ〜Ｆ参照）、又は、構造遺伝子の部分的欠失を有する構築物、又は、構造遺伝子の欠失のその他の組み合わせを有する構築物についても意図される。
【００２４】
バイシストロニックレプリコンは、Ｎｐｒｏがそれ自体をそのカルボキシ末端で切断し、下流のタンパク質を分離するという能力によって、レプリコンから真正の外来タンパク質を合成できるという利点を提供する。融合タンパク質として外来配列が発現されるモノシストロニックレプリコンは、短いペプチド又は免疫原性の低いペプチドについて発現を考慮した時、有利であり得る。
【００２５】
レプリコンは、Ｉ型インターフェロンの誘導経路を阻害するというその遺伝子産物の能力の点から見て活性形態又は不活性形態であるＮｐｒｏ遺伝子を担持するように構築する。この構成において、レプリコンは、Ｎｐｒｏ遺伝子を欠如していてもよく（ΔＮｐｒｏ ＣＳＦＶレプリコン）、又は、例えば、Ｎｐｒｏのアミノ酸位置１１２番における、システインからアルギニンへの置換（Ｃ１１２Ｒ）、若しくは、アミノ酸位置１３６番における、アスパラギン酸からアスパラギンへの置換（Ｄ１３６Ｎ）を導入することにより、変異したＮｐｒｏ遺伝子（図１及び２中ではＮｐｒｏ’と示される）を有していてもよい。後者の場合、各変異それ自体が、Ｎｐｒｏ遺伝子産物のその他の機能を変えることなく、Ｉ型インターフェロンの誘導経路を阻害するというＮｐｒｏ遺伝子産物の能力を無効にする。しかしながら、両位置におけるＮｐｒｏ遺伝子の変異は、Ｎｐｒｏ遺伝子産物のその他の機能に影響を与えることなく、復帰変異の可能性に関して、変異体の安定性をさらに増大させる。用途に応じて、不活性なＮｐｒｏ遺伝子産物を有するレプリコンが、抗ウイルス剤及び／又は免疫調節タンパク質としての機能の点から見て、Ｉ型インターフェロン誘導に関して価値を有することになる。かかる用途は、レプリコンの機能に関して、例えば、ワクチンとしての価値を有する。一方、治療物質をコードする遺伝子を送達するレプリコンが、Ｉ型インターフェロンを誘導しないことがより望ましい場合もある。かかるレプリコンのためには、コードされる治療物質が、Ｉ型インターフェロンの誘導に続く面倒な事態を伴うことなく、活性を有し得る、活性Ｎｐｒｏが望ましい。
【００２６】
特定の形態のレプリコンは、Ｃ〜ＮＳ２をコードする配列を欠如し（ΔＣ−ＮＳ２）、したがって、細胞病原性である。死にかけている細胞は、細胞傷害性防御の誘導に関して重要な働きである交差提示のために免疫系を特に引き付けることが示されているように、このことは有利である（Ｒａｃａｎｅｌｌｉら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０，４７−５８，２００４）。１つ又はそれ以上の構造タンパク質遺伝子が存在するが、ＮＳ２タンパク質がもはや機能的でないように、ＮＳ２をコードする遺伝子が必須又は全てのコドンを欠如しているか、又は、ＮＳ２及びＮＳ３をコードする遺伝子が、さらなるヌクレオチド、例えば、ＩＲＥＳによって物理的に分離している細胞病原性レプリコンを作製してもよい。
【００２７】
対象となる任意の外来遺伝子の発現のために設計されたレプリコンは、哺乳類細胞中、特に、ヒト細胞中でのその複製に必要とされる全ての遺伝情報を保持する。このレプリコンは、宿主細胞の細胞質中で複製することから、宿主細胞の核の分裂の必要性、宿主ゲノム中への組み込み、又は、ワクチンとしてのＤＮＡベクターの使用に伴うその他の望ましくない効果を回避する。このレプリコンは、治療的又は予防的用途のためのタンパク質への、挿入された異種遺伝子の翻訳を引き起こす。
【００２８】
実施例中に記載される特定のレプリコンは、ＣＳＦＶ株Ａｌｆｏｒｔ／１８７のプラスミドｃＤＮＡクローンｐＡ１８７−１に基づいている。プラスミドｐＡ１８７−１は、ウイルスゲノム配列の直ぐ上流に、Ｔ７プロモーターと、ゲノム配列の３’末端に、固有のＳｒｆｌ制限部位を含む。したがって、ＳｒｆｌによるプラスミドＤＮＡの線条化、続くランオフ転写によって、真正のウイルスＲＮＡの合成が可能となる。Ｒｕｇｇｌｉら（Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０，３４７８−８７，１９９６）によって示されるように、このＲＮＡは、ブタ腎細胞系統（例えば、ＳＫ−６細胞）中で試験したところ、感染性を有しており、細胞へのトランスフェクション後に、感染性の子孫ウイルスの合成を引き起こす。しかしながら、この公知のＲＮＡは、外来遺伝子を担持せず、ＣＳＦＶ株Ａｌｆｏｒｔ／１８７の遺伝子のみをコードしている。
【００２９】
本発明において、外来遺伝子がレプリコン中に導入される。レプリコンＲＮＡは、意図される用途、すなわち、免疫反応の促進という観点から見た、免疫系の細胞中、特に樹状細胞中での複製能又は翻訳能について試験する。外来遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を担持する本発明のレプリコンは、実際、ブタ樹状細胞中へトランスフェクション後に、機能的ルシフェラーゼタンパク質を翻訳する。
【００３０】
試験した本発明の特定のレプリコンは、４つのウイルス構造タンパク質Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１若しくはＥ２のうちのいずれか１つをコードする配列を欠如するか、又は、４つのウイルス構造タンパク質Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１及びＥ２の全てをコードする配列を欠如する。細胞病原性レプリコンは、さらに、非構造タンパク質ｐ７及びＮＳ２をコードする遺伝子を欠如する。全てのレプリコンは、ｐＡ１８７−１から得られる公知の感染性ＲＮＡと同様の手段によって得られる。レプリコンのサイズに対する限定は予期されない。これらのレプリコンは、真核細胞中へのトランスフェクション後に、複製するが、構造タンパク質の欠如により、感染性ウイルスは生成されない。それぞれのタンパク質を発現するように安定的に形質導入された細胞系統中でレプリコンをパッケージすることは、依然として可能である。
【００３１】
図１は、レプリコンの構築のために使用され得る欠失の例を示す。図２は、対象遺伝子（ＧｏＩ）がどのようにレプリコンゲノム中に挿入され得るのかについての例を示す。この場合、図は、外来タンパク質の発現のために設計された、モノシストロニック又はバイシストロニックの２つの形態のレプリコンの例を示す。２つの形態のそれぞれに対して、図は、構造遺伝子領域における欠失の例についても示しており、単一の遺伝子、Eｒｎｓ遺伝子の欠失が例示されている。複数の遺伝子の欠失が使用されている例も示されている（ＣからＮＳ２を含む遺伝子の欠失）。依然として活性ＮＳ２をコードするレプリコンはいずれも、非細胞病原性である。細胞病原性レプリコンを作製するためには、図１Ｇ及び図２Ｄ、Ｅに示されるように、ＮＳ２におけるさらなる欠失が必要とされる。
【００３２】
図１及び２はまた、２つの形態のＮｐｒｏ遺伝子：インタクトなＮｐｒｏ遺伝子（その遺伝子産物は、Ｉ型ＩＦＮ産生を誘導するという細胞の能力を損なう）、又は、変異Ｎｐｒｏ遺伝子（Ｎｐｒｏ’遺伝子）（その遺伝子産物は、Ｉ型ＩＦＮの誘導を干渉することはできない）、を表す。Ｎｐｒｏ遺伝子を有しない構築物を使用した場合は、Ｉ型ＩＦＮ産生に対する細胞の誘導性に及ぼす影響という観点から見て、変異Ｎｐｒｏ遺伝子を有する構築物を使用した場合と同様の結果を示す。
【００３３】
ＧｏＩ挿入物の位置は、レプリコン遺伝子自体の複製及び翻訳を干渉してはならない。この外来遺伝子のための好ましい位置は、ウイルスコード配列の５’末端、Ｎｐｒｏ遺伝子内、又はＮｐｒｏ遺伝子の３’末端に近い位置への挿入である。挿入された外来遺伝子がレプリコン構築物中で許容されないという任意のリスクを回避するために、これらの挿入位置が選択される。これらの位置の外来遺伝子の存在は、レプリコンの複製及び翻訳を干渉しない。
【００３４】
以下に記載される特定の例において、モノシストロニック又はバイシストロニックレプリコン構築物は、ルシフェラーゼ遺伝子又はインフルエンザウイルスＨＡ遺伝子等の外来遺伝子配列の挿入のための固有のＮｏｔＩ部位を有する。モノシストロニックレプリコンの場合、挿入は、ＮｐｒｏのＮ末端部分内で起こる。このようにして、Ｎｐｒｏの１１個のＮ末端アミノ酸、次に、残基Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ、外来タンパク質、残基Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ、及びＮｐｒｏの残りのＣ末端部分（アミノ酸残基１５〜１６８）から構成される融合タンパク質が作製される。この位置への挿入は、Ｎｐｒｏの２つの機能、すなわち、新生ポリタンパク質からのＮｐｒｏの切断を担う自己タンパク質分解活性、及び、細胞中でのＩ型ＩＦＮの誘導の干渉という観点から見た、生来の免疫反応に対する干渉、のいずれにも影響を及ぼさない。
【００３５】
以下に記載される特定のバイシストロニックレプリコンの例において、外来遺伝子は、Ｎｐｒｏ遺伝子の直ぐ後に挿入され、終止コドン、及び、残りのウイルスポリタンパク質（Ｃ〜ＮＳ５Ｂ又はＮＳ３〜ＮＳ５Ｂ）の翻訳開始のための、ピコルナウイルスである脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が続く。このベクターの重要な特徴は、真正の外来タンパク質が発現され得る一方で、モノシストロニックレプリコンにおいては、それは、Ｎｐｒｏタンパク質との融合タンパク質として合成されることである。
【００３６】
Nｐｒｏ遺伝子を含む特定のモノシストロニック及びバイシストロニック構築物が、レプリコンの翻訳及び複製を障害することなく作製されている。レプリコンは、レプリコンの機能に従うことなく、この部位において遺伝子操作することができる。
【００３７】
外来遺伝子挿入物は、機能を維持し、レプリコンにより安定して発現される必要がある。さらに、この挿入物は、ペスチウイルスレプリコン遺伝子の正しい働きを、特に、それらの複製及びそれらがコードする遺伝子の翻訳という観点から見た正しい働きを干渉してはならない。本発明は、（ｉ）レプリコン中での外来遺伝子挿入物の認容性、（ｉｉ）コードされたタンパク質へのその正しい翻訳という観点から見た、外来遺伝子による機能の保持、（ｉｉｉ）外来遺伝子挿入物内に含まれる場合、大きな遺伝情報の挿入後、レプリコンによる機能の保持、を示す解決法を提供する。
【００３８】
ペスチウイルスレプリコンは、ワクチンとしての高い可能性を有する。それらは非感染性であり（感染性ウイルスを生じない）、したがって、非伝染性であるという事実により、それらは、安全なワクチンのための重要な条件も満たす。
【００３９】
本発明はまた、活性成分としての、本明細書中に上記されるようなペスチウイルスレプリコンと、任意で、薬学的に許容し得る成分をさらに含む医薬組成物に関する。温血動物、特にヒトに対する、腸内投与、例えば、経鼻、口腔、直腸、又は、特に経口投与のための組成物、並びに、非経口的投与（特に好ましい）、例えば、静脈内、筋肉内又は皮下投与のための組成物が好ましい。
【００４０】
医薬調製物（例えば、ワクチン）中でのレプリコンの使用のために、レプリコンは、裸のＲＮＡとして使用してもよい。このことは、ＲＮａｓｅによる分解に対するＲＮＡの保護、例えば、ＲＮＡキャッピングによる保護、を必要とする。或いは、ペスチウイルスレプリコンを、適当な微粒子送達ビヒクルと伴わせてもよい。これらは、ＲＮＡの保護を促進し得る一方で、ＲＮＡがそのコードタンパク質を翻訳し得る細胞へのＲＮＡの送達の効率増大を促進し得る。この目的のために、ＲＮＡは、後者のタイプを作製する時に、微粒子送達ビヒクル中に封入するか、又は、予め形成された粒子中に添加する。それぞれの場合において、ＲＮＡ及び粒子の補完的添加を利用することにより、ＲＮＡの粒子との相互作用を増加させることができる。或いは、ＲＮＡは、ポリエチレングリコール修飾粒子表面等のリンカーを介して、粒子と物理的に結合させることができる。ＲＮＡ送達の可能性を有するかかる粒子ビヒクルの例は、リポソーム、マイクロ粒子、ナノ粒子又はナノカプセルである。薬物担体としてのリポソーム、マイクロ粒子、ナノ粒子又はナノカプセルは、当技術分野において周知であり、これらは、本発明において、微粒子送達ビヒクルと考えられる。
【００４１】
上記微粒子送達ビヒクルは、ペスチウイルスの構造タンパク質を組み込むように改変してもよい。この意味において、考えられる別の微粒子送達ビヒクルは、本発明のレプリコンを含むウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）である。ウイルスレプリコン粒子は、ペスチウイルスの構造タンパク質から構成される。かかるウイルスレプリコン粒子は、本発明のレプリコンによっては適切な状態でコードされない構造タンパク質を発現する細胞系統中で、本発明のレプリコンを培養することにより取得し得る。得られたウイルスレプリコン粒子は、次に、医薬調製物中で使用してもよいし、哺乳類に適用してもよい。ウイルスレプリコン粒子の一部である本発明のレプリコンの特徴は、ウイルスレプリコン粒子は感染性ではないが、複製して、ウイルスレプリコン粒子の送達点において外来遺伝子を発現することを確実なものにする。
しかしながら、さらなる修飾を有しないＣＳＦＶ粒子に基づくＶＲＰは、ＣＳＦＶ自体はヒト細胞に感染しないことから、ヒト細胞を標的とする効率的送達ビヒクルであるという可能性は低い。かかるＶＲＰは、ヒト細胞への標的化を促進するタンパク質又はタンパク質配列を含むように改変される。考えられる例は、ヘパラン硫酸構造及びマンノシル化を標的とするためのテトラリジンペプチドの組み込み、又は、Ｃ型レクチン受容体の標的化を促進するためのＮ−アセチルグルコサミン誘導体の添加である。
【００４２】
本発明のペスチウイルスレプリコン粒子の調製のために考えられる細胞系統は、本発明のレプリコンによってはコードされないか、又は、欠陥を有する形態でのみコードされる構造タンパク質を提供するように、安定的に形質導入されているブタ又はヒト細胞系統である。かかるウイルスレプリコン粒子は、それらが感染性ウイルス粒子へと複製することができないという点で安全である。
【００４３】
医薬組成物は、ペスチウイルスレプリコンのみを、又は、適当な微粒子送達ビヒクルを伴い、好ましくは、薬学的に許容し得る担体と共に、ペスチウイルスレプリコンを含む。ペスチウイルスレプリコンの投与量は、治療する疾患、種、その年齢、体重、個々の状態、個々の薬物体内動態データ、及び投与様式によって左右される。
【００４４】
非経口的投与のためには、ペスチウイルスレプリコンの溶液が好ましく、懸濁液又は分散液、特に、例えば、ペスチウイルスレプリコンのみを、又は、マンニトール等の担体と共に含む、用時調製し得る、凍結乾燥させた組成物の場合には、等張性水溶液、分散液又は懸濁液も好ましい。医薬組成物は、滅菌してもよく、且つ／又は、添加剤、例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤、及び／又は、乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調切するための塩、及び／又は、バッファーを含んでもよく、それ自体公知の様式で、例えば、従来の溶解及び凍結乾燥工程によって調製される。前記溶液又は懸濁液は、増粘剤、典型的には、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、又は、ゼラチン類を、又は可溶化剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）も含んでよい。好ましい保存剤は、例えば、アスコルビン酸等の抗酸化剤、又は、ソルビン酸若しくは安息香酸等の殺菌剤である。
【００４５】
油中懸濁液は、油成分として、注射用として慣例的な、植物油、合成油、半合成油を含む。そのような物のうち、酸成分として、８〜２２個、特に、１２〜２２個の炭素原子を有する長鎖脂肪酸含む液体脂肪酸エステルが、特記され得る。これらの脂肪酸エステルのアルコール成分は、最大６個の炭素原子を有し、一価又は多価であり、例えば、一価、二価又は三価のアルコール、特に、グリコール及びグリセロールである。脂肪酸エステルの混合物としては、綿実油、アーモンドオイル、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油、大豆油及び落花生油等の植物性油が特に有用である。
【００４６】
注射用調製物の製造は、例えば、アンプル又はバイアル中への充填時、及び、容器の密閉時のように、通常は無菌条件下で行われる。例えば、非経口的投与のために使用される溶液は、輸液として使用することもできる。
【００４７】
考えられる特定の医薬組成物は、ワクチンであり、この場合、本発明のレプリコンは、疾患を引き起こす感染性粒子中に存在するタンパク質、特に、疾患を引き起こすウイルス、細菌、若しくはその他の感染性物質の表面タンパク質、又はその他の公知の免疫原性エピトープをコードする。かかるワクチンは、ワクチン中に通常使用されるアジュバント、抗菌ペプチド、及び、適応的免疫反応を容易にし得る、且つ／又は、強化し得る免疫刺激性核酸を含んでもよい。例えば、レプリコンによってコードされるＧＭ−ＣＳＦ、又は、油性アジュバント、ＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチド、リポペプチド、免疫調節性ペプチド等の公知の免疫調節成分中に含まれる若しくは免疫調節性成分と一緒に存在するレプリコン処方物等が挙げられる。
【００４８】
さらに、本発明は、本発明のペスチウイルスレプリコンを投与する工程を含む、感染性物質により引き起こされる疾患に対する予防方法に関し、この場合、前記の外来遺伝子は、感染性物質に対して免疫性を付与する遺伝子産物をコードする。考えられる特定の疾患は、例えば、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ハシカウイルス、ＲＳＶ、ボルデテラ属、ボレリア属、プラスモジウム属、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガタス、破傷風トキソイド等によって引き起こされる疾患である。本発明の方法において、投与されるペスチウイルスレプリコンは、上記した感染性物質に由来する適当なエピトープ又は遺伝子産物を含む。
【００４９】
さらに、本発明は、レプリコンのみを、又は、適当な微粒子送達ビヒクルを伴って、投与することによる、欠陥を有する遺伝子により引き起こされる疾患の治療方法に関し、この場合、レプリコン中に組み込まれる外来遺伝子は、疾患に関連する機能性遺伝子である。例えば、冠動脈疾患の治療のための、血管新生を促進する血管新生タンパク質であるＦＧＦ４；内耳治療のためのカリウムチャンネル遺伝子；ＸＳＣＩＤ、ＡＤＡ欠損ＳＣＩＤ及び慢性肉芽腫症を有する患者のための遺伝子治療；肝臓でのＨＭＢシンターゼ発現を促進するためのアルファ１Ｍｅ／アルファ１ＡＴｐ；肺外傷に対する肺血管の反応を調節するための、アンジオポイエチン−１による遺伝子治療等が挙げられる。
【実施例】
【００５０】
実施例１：ＣＳＦＶレプリコンの構築
ＣＳＦＶレプリコンは、標的細胞中で複製することができるが、インビトロにおいては特別の「パッケージング」細胞系統中で増殖させることによって補助しないかぎり、感染性ウイルスを生成することができない。このことは、Ｅ１タンパク質、又はＥ２タンパク質、又はＥｒｎｓタンパク質、又はＣタンパク質、或いは、それらの組み合わせ又は部分以外のペスチウイルスの全ての構造タンパク質をレプリコンが発現することを特徴とする。
【００５１】
プラスミド構築物
変異ＣＳＦＶゲノムは、全長ｃＤＮＡクローンｐＡ１８７−１に基づいて構築する。プラスミドは、大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で増幅し、プラスミドＤＮＡは、Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ ＤＮＡ精製システム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ）を用いて精製する。これらの構築物は、全長ｃＤＮＡクローンｐＡ１８７−１の公開されている配列に基づく（Ｒｕｇｇｌｉら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０，３４７８−３４８７，１９９６）。全長ウイルスｃＤＮＡを含むプラスミドは、Ｓｒｆ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて線条化し、フェノール−クロロホルムによる抽出及びエタノールによる沈殿により精製する。ペレットは、最終濃度５００ｎｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ不含Ｈ２Ｏ中で再懸濁する。インビトロ転写は、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて実施する。サプライヤーの教示の通り、１．５μｇの線条化プラスミドＤＮＡ、１３μｌの転写バッファー、各７．５ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、及びＵＴＰ、並びに２μｌのＴ７ポリメラーゼ−ＲＮａｓｅ阻害剤混合物を含有する２０μｌの反応混合物を、３７℃でインキュベートする。テンプレートＤＮＡの除去のために、次に、この反応混合物を、２単位のＤＮａｓｅＩの存在下で、１５分間、３７℃でインキュベートする。転写反応からのＲＮＡを、５００ｍＭ 酢酸アンモニウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、及び１容量のイソプロパノールの存在下で、フェノール−クロロホルムによる抽出及びエタノールによる沈殿により精製する。或いは、ＤＮａｓｅＩによる切断後、転写産物を、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−４００ ＨＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製し、ＧｅｎｅＱｕａｎｔ ＩＩ光度計（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて定量する。
【００５２】
レプリコン構築物
Ｅｒｎｓ遺伝子を欠如する（或いは、Ｅ１、若しくはＥ２、若しくはＣ、又はこれらの任意の組み合わせを欠如する）ウイルスｃＤＮＡを、レプリコンとして使用する（図１）。モノシストロニック構築物のために、外来遺伝子（例えば、インフルエンザウイルスＨＡ遺伝子）は、Ｎｐｒｏ遺伝子のアミノ末端領域中に導入された唯一のＮｏｔｌ部位中に挿入される。得られた融合タンパク質は、７３９個のアミノ酸（ａａ）を有し、Ｎｐｒｏ’（ａａ １−１１）−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＨＡ（ａａ １−５６８）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｎｐｒｏ’（ａａ １５−１６８）から構成される。Ｎｐｒｏの既知の活性−例えば、自己タンパク質分解酵素活性、１型ＩＦＮ−誘導経路の干渉、及び、インターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）の分解−は維持される。１型ＩＦＮの誘導又は産生を調節しないレプリコンを作製するために、Ｃ１１２Ｒ又はＤ１３６Ｎに対する変異をＮｐｒｏ’’配列中に導入することにより、様々な構築物が得られる。
【００５３】
Ｅｒｎｓ遺伝子を欠如するバイシストロニックなウイルスｃＤＮＡ遺伝子もまた、レプリコンとして使用される（Ｅ２又はＣの欠失も可能である）。第１のシストロンは、フレーム中で外来遺伝子（インフルエンザウイルスＨＡ遺伝子）と融合したＮｐｒｏ遺伝子、その後に、残りのウイルスポリタンパク質（Ｃ〜ＮＳ５Ｂ）の翻訳を開始するＥＭＣＶ ＩＲＥＳを含む。このレプリコンからは、Ｎｐｒｏ及びインフルエンザウイルスＨＡ遺伝子の両方が、それらの真正の形態で発現される。Ｎｐｒｏ、自己タンパク質分解酵素の活性、及び、１型ＩＦＮの誘導又は産生の調節は維持される。１型ＩＦＮの誘導又は産生を調節しないレプリコンを作製するために、Ｃ１１２Ｒ又はＤ１３６Ｎに対する変異をＮｐｒｏ配列中に導入することにより、様々な構築物が得られる。或いは、Ｎｐｒｏは、コード配列の大部分を欠失させることにより、Ｃ末端を切断することができる。このことにより、再度、１型ＩＦＮの誘導又は産生を調節する能力を失ったレプリコンが生成される。次に、残りのＮ末端のＮｐｒｏ配列を、外来遺伝子産物であるインフルエンザウイルスＨＡタンパク質への融合物として発現させる。
【００５４】
実施例２：細胞病原性及び非細胞病原性のブタコレラウイルスのＲＮＡレプリコン
プラスミド構築物
図１Ｇ中に示されるものにより例示される変異ＣＳＦＶゲノムは、全長ｃＤＮＡクローンｐＡ１８７−１（Ｒｕｇｇｌｉら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０，３４７８−３４８７，１９９６）に基づいて構築する。プラスミドＤＮＡ構築物は、大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で増幅する。制限酵素は、Ｓｒｆ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）以外は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社による。プラスミドＤＮＡは、Ｗｉｚａｒｄ Ｍｉｎｉ−又はＭａｘｉｐｒｅｐキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製する。逆転写（ＲＴ）及びＰＣＲのために使用されるプライマーは、公開されている（Ｒｕｇｇｌｉら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０，３４７８−３４８７，１９９６）。これらの変異ＣＳＦＶゲノムの起源は、公開されている（Ｍｏｓｅｒら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３，７７８７−７７９４，１９９９）。
【００５５】
インビトロ転写及びエレクトロポレーション
ＳｒｆＩ １２２９８−又はＮｒｕｌ １１３０１−線条化プラスミドからのインビトロ転写を、Ｔ７ Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行う。ＤＮａｓｅＩによる切断後、転写産物を、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−４００ ＨＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製し、ＧｅｎｅＱｕａｎｔ ＩＩ光度計（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて定量する。ＳＫ−６細胞を、２度洗浄し、氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で再懸濁する。０．８ｍｌの容量中、合計２ｘ１０７個の細胞を、１５μｇのＲＮＡと混合し、０．４ｃｍのキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移して直ぐに、４５０Ｖ及び５００μＦの条件で、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）セットを用いてエレクトロポレーションを行う。或いは、１０７細胞／ｍｌの密度の０．４ｍｌの細胞懸濁液を、５ｍｇのＲＮＡと混合し、０．２ｃｍのキュベット中に移して、２００Ｖ及び５００μＦの条件で、２度、エレクトロポレーションを行う。エレクトロポレーション後、細胞懸濁液を、室温にて１０分間維持し、次に、５％（ｖ／ｖ）ウシ血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ変法Ｅａｇｌｅ培地中に希釈して、播種し、エレクトロポレーション後の様々な時間における分析のために回収する。
【００５６】
ＲＮＡ分析
全ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ）を用いて、エレクトロポレーションを行った５ｘ１０６個の細胞から抽出する。ＲＮＡ濃度に関係なく、エレクトロポレーションした細胞の数に基づいてサンプルを標準化するために、各サンプルの３分の１を、ノーザンブロッティングのために使用する。ノーザンブロッティング及びハイブリダイゼーションは、３２Ｐ−標識されたリボプローブ：ＣＳＦＶ Ａｌｆｏｒｔ／１８７ゲノムのプラス鎖ウイルスＲＮＡの検出のための、ＪＬ１、これは、３’−末端の２０４ヌクレオチド（ｎｔ）に対して相補的である、又は、マイナス鎖ＲＮＡの検出のための、ＧＭ、ＣＳＦＶ Ａｌｆｏｒｔ／１８７ゲノムのｎｔ３２７〜５８２に相当する、いずれかを用いて行う。ＲＴ反応は、Ｅｘｐａｎｄ ＲＴキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、プライマーＨＲ３、及び、続くｃＤＮＡ精製のためにＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−４００ ＨＲカラムを用いて行う。ＰＣＲのためには、Ｅｘｐａｎｄ ｌｏｎｇ−ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、又は、１ｋｂよりも短い断片のためには、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用する。
【００５７】
タンパク質分析
ＳＫ−６細胞を、低張緩衝液（２０ｍＭ ＭＯＰＳ［モルホリノプロパンスルホン酸］、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００［ｐＨ６．５］）中で溶解し、抽出物をウェスタンブロッティングのために使用する。ブタ抗ペスチウイルス高力価血清Ｎ８Ｔ１２及びペスチウイルスＮＳ３タンパク質に対するＭＡｂ ４９ＤＥが、ＮＳ３タンパク質検出のために役立つ。
【００５８】
レプリコンＲＮＡのパッケージング
欠陥を有するゲノムと共に全長ヘルパーＡ１８７−ＣＡＴ ＲＮＡをエレクトロポレーションした後、培養液の凍結融解によりウイルスを回収する前に、４８時間、５ｘ１０６個のＳＫ−６細胞をインキュベートする。低速での遠心分離後、前日に播種した２ｘ１０６個のＳＫ−６細胞を感染させるために、１ｍｌの希釈していない上清を使用し、接種材料を１時間後に交換する。細胞培養液のアリコートを、ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲのために、感染させてから４８時間後に回収する。
【００５９】
実施例３：ＣＳＦＶ欠失変異体の構築
Ｅ２欠失変異体
Ｅ２欠失変異体、例えば、ｐＡ１８７−Ｅ２ｄｅｌ３７３及びｐＡ１８７−Ｅ２ｄｅｌ６８、は、以下の通りにして構築される（Ｍａｕｒｅｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２３，３３１８−３３２８，２００５）。それらの概略図を図１Ｄに示す。Ｅ２の３７３アミノ酸をコードする完全なＥ２遺伝子（ＣＳＦＶ ｖＡ１８７−１ゲノムのヌクレオチド２４４１−３５５９）又はＥ２の６８アミノ酸をコードするヌクレオチド３２４８−３４５１、いずれかの欠失が、テンプレートとしてｃＤＮＡプラスミドクローンｐＡ１８７−１を使用するＰＣＲに基づく部位特異的突然誘発法により得られる。ヌクレオチド番号は、ｖＡ１８７−１のゲノムについて参照している（ＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号Ｘ８７９３９）。それらの５’末端において２０ヌクレオチドのオーバラップを有する２つの相補的オリゴヌクレオチドプライマー、並びに、所要の欠失に相当する５’及び３’配列が使用される。各ＰＣＲ断片を作製するために、２つの突然変異誘発プライマーそれぞれを、各欠失の上流又は下流に位置する配列に相当する正方向又は逆方向プライマーと共に使用される。この反応は、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏポリメラーゼを用いて、２０〜３０回の増幅サイクル行う。アセンブリのために、２つのＰＣＲ断片を、アガロースゲル電気泳動により単離し、予想される融合産物に隣接する各プライマーを用いて、さらに３０サイクルのＰＣＲに供する。その後、アガロースゲルからの精製及びプラスミドｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中への挿入前に、５’末端がアデノシル化されたＰＣＲ産物を得るために、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、１５分間、７２℃にて、添加する。各挿入物は、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ ＤＹＥｎａｍｉｃダイレクトサイクル配列決定キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して配列決定し、ｅ−Ｓｅｑ及びＡｌｉｇｎＩＲソフトウェア（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＬＩ−ＣＯＲ ４２００配列決定装置を使用することにより分析する。所要の制限断片を、ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯサブクローンから単離し、Ｅ２欠失変異体を得るために、全長ｃＤＮＡクローンｐＡ１８７−１中の対応する配列と置換するために使用する。ＲＮＡの特異的感染性（ＲＮＡ１μｇあたりの感染単位（ＩＵ）として表される）を、インビトロ合成したＣＳＦＶ ＲＮＡについて使用する感染中心アッセイにおいて決定する（以下参照）。
【００６０】
Ｅｒｎｓ欠失変異体
２２７アミノ酸をコードする完全なＥｒｎｓ遺伝子（ＣＳＦＶ ｖＡ１８７−１ゲノムのヌクレオチド１１７５−１８５５）の欠失が、ＰＣＲに基づく部位特異的突然誘発法により得られる（Ｆｒｅｙら，Ｖｅｔ Ｒｅｓ ３７，６５５−７０，２００６）。それらの概略図を図１Ｂに示す。変異ｐＡ１８７ｄｅｌＥｒｎｓを得るために、Ｅｒｎｓ欠失を含むＰＣＲ断片を、全長ｃＤＮＡクローンｐＡ１８７−１中の対応する領域と置換するために使用する。ＳｒｆＩによって線条化したｐＡ１８７ｄｅｌＥｒｎｓのランオフ・インビトロ転写を行う。
【００６１】
欠失変異体ＲＮＡの特性決定
インビトロ合成したＲＮＡ（１０μｇ）を、エレクトロポレーションすることによりＳＫ−６細胞中に入れる。エレクトロポレーションした細胞の１０分の１を、抗ＮＳ３ ｍＡｂ Ｃ１６又は抗Ｅ２ ｍＡｂ ＨＣ／ＴＣ２６を用いた免疫ペルオキシダーゼアッセイ又は免疫蛍光アッセイによる染色のために、２４穴プレートの２つのウェルに播種する。ＲＮＡの特異的感染性（インビトロ合成したＣＳＦＶ ＲＮＡに対して使用。ＲＮＡ１μｇあたりの感染単位（ＩＵ）として表される。）を、感染中心アッセイにおいて決定する。このようにして、エレクトロポレーションした細胞の１０分の１を、２ｍｌのＥＭＥＭ−ＨＳ中で希釈し、６穴プレートに播種して、連続希釈する。３７℃にて３日間のインキュベーション後、細胞を固定化し、陽性の細胞を、抗ＮＳ３ ｍＡｂ Ｃ１６又は抗Ｅ２ ｍＡｂ ＨＣ／ＴＣ２６を用いた免疫ペルオキシダーゼアッセイ又は免疫蛍光アッセイにより可視化させる。
【００６２】
ＣＳＦＶ−ＶＲＰの欠失変異体の特性決定
レプリコン自体の構築に加えて、所要の場合には、ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）を作製することも可能である。変異ＲＮＡを、エレクトロポレーションにより、ウイルスのＥ２又はＥｒｎｓタンパク質を安定して発現する「補完細胞系統」であるＳＫ−６細胞中に入れ、ＣＳＦＶウイルスレプリコン粒子（ＣＳＦＶ−ＶＲＰ）と呼ばれる、変異ＲＮＡがパッケージされたウイルス様粒子を作製する。ＣＳＦＶレプリコンが補完細胞中で安定していることを検証するために、ＣＳＦＶ−ＶＲＰゲノム（＝レプリコン）の各領域を、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、配列決定を行う。この目的のために、ＶＲＰを感染させたＳＫ−６細胞培養のＴｒｉｚｏｌ抽出（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、細胞質ＲＮＡを得る。ＲＴ−ＰＣＲは、Ｅｘｐａｎｄ逆転写酵素（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）及びＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行う。Ｅ２欠失変異体のために使用されるプライマーは、ｃＤＮＡ合成に対しては、ＺＲ４（ＣＳＦＶゲノムのヌクレオチド４１７８−４１４８）であり、ＰＣＲに対しては、ＭＬ５（ヌクレオチド２１９６−２２１３）／ＺＲ５（ヌクレオチド３８９２−３８６２）である。これらのプライマーは、Ｅ２遺伝子の隣接領域中に位置し、ＳＫ−６（補完）細胞中に含まれるＥ２とアニールするとは予想されない。Ｅｒｎｓ欠失変異体のために使用されるプライマーは、ｃＤＮＡ合成に対しては、ＰＲ１（ＣＳＦＶ Ａｌｆ／１８７ゲノムのヌクレオチド６４５４−６４３４）であり、ＰＣＲに対しては、ＭＬ１（ヌクレオチド９９２−１０２２）／ＭＲ３（ヌクレオチド１９５６−１９４０）である。後の２つのプライマーは、ウイルスゲノム上のＥｒｎｓ遺伝子の隣接領域に位置し、したがって、ＳＫ−６（補完）細胞中に含まれるＥｒｎｓＤＮＡとアニールするとは予想されない。増幅したＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動により特性決定する。
【００６３】
実施例４：ＣＳＦＶリーダープロテイナーゼＮｐｒｏがレプリコンの複製には必要とされないことの立証
Ｎｐｒｏがレプリコン、したがって、ウイルスの生存能力に必須でないことを確かめるために、変異ＣＳＦＶゲノム ｖＡ１８７−Ｕｂｉを構築し、この場合、Ｎｐｒｏ遺伝子は、プラスミドｐＴＭ３／ＨＣＶ／Ｕｂｉ−ＮＳ５Ｂから放出されたマウスユビキチン遺伝子と置換されている（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７２，７６８１−８４，１９９８）。感染性ｖＡ１８７−Ｕｂｉウイルスの作製のために、ｐＡ１８７−Ｕｂｉ ＤＮＡを、ＳｒｆＩを用いて線条化し、次いで、インビトロＲＮＡ転写、及び、ＲＮＡをブタＳＫ−６細胞中へリポフェクチンする。トランスフェクションの４８時間後、免疫ペルオキシダーゼアッセイにより、ウイルスエンベロープタンパク質Ｅ２の発現について、細胞を試験する。ウイルスＲＮＡの分析は、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲによる。
【００６４】
２つのさらなる変異体が作製されている：Ｎｐｒｏ遺伝子が、残基メチオニン及びグリシンと置換されている、ＣＳＦＶ ｖＡ１８７−ΔＮｐｒｏ；ｐＥｙ−３７ ｃＤＮＡクローン中のＮｐｒｏ遺伝子を欠失させることによる、ｖＡ１８７−ΔＮｐｒｏと類似する、ＣＳＦＶ ｖＥｙ−ΔＮｐｒｏ（Ｒｕｇｇｌｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７７，７６４５−５４，２００３）。任意のこれらのウイルスにおけるＮｐｒｏの置換は、ウイルスが複製するのを妨げない。ｖＡ１８７−Ｕｂｉウイルス（ｖＡ１８７−ΔＮｐｒｏ−Ｕｂｉ又はΔＮｐｒｏ−Ｕｂｉウイルスとも呼ばれる）は、非インターフェロン産生ＳＫ−６細胞を使用する場合、親ｖＡ１８７−１ウイルスの力価と同様の力価まで複製する。ΔＮｐｒｏウイルスは、インターフェロン産生ＰＫ−１５細胞中及びブタマクロファージ中でも複製する。これらの細胞においては、複製サイクル中、より長い誘導期が存在し、親ウイルスと比較して、１ｍｌあたり１．５〜２ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０低い力価が得られる。それにもかかわらず、ΔＮｐｒｏウイルスは、明らかに複製可能である。このより低い力価は、Ｉ型インターフェロンの誘導を調節し得ないことによる（以下実施例５参照）。
【００６５】
実施例５：細胞による抗ウイルス防御に対するＮｐｒｏ依存性の干渉に関して、ＣＳＦＶリーダープロテイナーゼＮｐｒｏを含む、及び、含まないレプリコンの特性決定
ｖＡ１８７−Ｕｂｉウイルス（ΔＮｐｒｏ−Ｕｂｉウイルスとも呼ばれる）は、ｖＡ１８７−ΔＮｐｒｏ及びｖＥｙ−ΔＮｐｒｏ（実施例４参照）と共に、細胞による抗ウイルス防御の調節におけるＮｐｒｏの役割を示すために使用されている（Ｒｕｇｇｌｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７７，７６４５−５４，２００３）。マクロファージは、偽感染させるか、又は、標準的なＣＳＦＶ若しくは変異ウイルスのいずれかにより感染させ、次に、インターフェロン（ＩＦＮ）誘導物質であるポリ（ＩＣ）を用いて細胞を刺激する。細胞は、ウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡを用いてエレクトロポレーションすることも可能である。感染させた細胞培養からの上清を、Ｍｘ／ＣＡＴレポーター遺伝子アッセイのいずれかにおいて、抗ウイルス活性について試験する。同じ結果が両アッセイ中で得られた。
【００６６】
標準的なＣＳＦＶは、抗ウイルス活性又はＩ型ＩＦＮ産生を誘導しない（図３Ａ；ｖＡ１８７−１）。ウイルスのＮｐｒｏ遺伝子が欠失している場合（ｖＡ１８７−ΔＮｐｒｏ）、又は、Ｎｐｒｏ遺伝子が位置１１２番（ｖＡ１８７−Ｎｐｒｏ（Ｃ１１２Ｒ））若しくは１３６番（ｖＡ１８７−Ｎｐｒｏ（Ｄｌ３６Ｎ））において変異している場合、今度は、ウイルスは、Ｉ型ＩＦＮ産生を誘導する（図３Ａ）。この所見は、Ｉ型ＩＦＮの誘導をもたらす細胞経路を調節するＮｐｒｏタンパク質の能力による（Ｒｕｇｇｌｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７７，７６４５−５４，２００３）。このことは、インタクトなＮｐｒｏタンパク質、又は、Ｎｐｒｏのアミノ酸位置１１２番におけるシステインからアルギニンへの置換（Ｎｐｒｏ（Ｃ１１２Ｒ））若しくは位置１３６番におけるアスパラギン酸からアスパラギンへの置換（Ｎｐｒｏ（Ｄ，３６Ｎ））を有する変異体をコードするプラスミドのトランスフェクションを利用することにより、確認されている。マクロファージを、ポリ（ＩＣ）を用いて刺激する場合、１ｍｌあたり４０ＵまでのＩ型ＩＦＮを検出することができる。マクロファージ中におけるＣＳＦＶ感染の存在は、このポリ（ＩＣ）によるＩＦＮの誘導により消失し得るが、ΔＮｐｒｏ及び変異Ｎｐｒｏウイルスは、ポリ（ＩＣ）によるＩ型ＩＦＮの誘導を干渉し得ない。同様に、細胞（例えば、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞）を、Ｎｐｒｏタンパク質をコードする構築物を用いてトランスフェクトした場合、ポリ（ＩＣ）によるＩ型ＩＦＮの誘導に対する阻害が生じる（図３Ｂ）。Ｎｐｒｏタンパク質の変異体（Ｎｐｒｏ（Ｃ１１２Ｒ）；（Ｎｐｒｏ（Ｄ１３６Ｎ））をコードする構築物を用いて細胞をトランスフェクトした場合、細胞は、Ｉ型ＩＦＮの産生に関してポリ（ＩＣ）に反応する能力を取り戻す（図３Ｂ）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染性ウイルス粒子を形成する能力を欠如するように操作され、さらに、外来遺伝子を含むようになったペスチウイルスのレプリコン、特に、ブタコレラウイルスのレプリコンに関する。これらのレプリコンは、裸のＲＮＡとして、又は、適当な微粒子送達ビヒクル中にパッケージされたＲＮＡ（例えば、ペスチウイルス中に入れられたレプリコン）として、哺乳類（例えば、ヒト）において、ワクチン接種、遺伝子送達及び遺伝子治療用途のために使用し得る新規なベクター系を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）
ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）は、ブタ及びイノシシにおける、感染性の高い疾患の原因物質であるが、ヒトに対しては全く無害である。ＣＳＦＶは、ウシウイルス性下痢症ウイルス及びヒツジのボーダー病ウイルスと共に、フラビウイルス科のペスチウイルス属に属する。フラビウイルス科に属する他のものとしては、フラビウイルス属（原型：黄熱病ウイルス）及びヘパシウイルス属（Ｃ型肝炎ウイルス）である。
【０００３】
ペスチウイルスは、５’及び３’非翻訳領域に隣接する１つの大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、正の極性を有する一本鎖の１２．３ｋｂのＲＮＡゲノムを含む、小さなエンベロープを有するウイルスである。このＯＲＦは、ＮＨ２−Ｎｐｒｏ−Ｃ−Ｅｒｎｓ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ−ＣＯＯＨ（図１Ａ）の順番で、４つの構造タンパク質及び８つの非構造（ＮＳ）タンパク質から構成されるポリタンパク質をコードする。ビリオンの構造要素には、キャプシドタンパク質Ｃと、３つのエンベロープ糖タンパク質Ｅｒｎｓ、Ｅ１、及びＥ２を含む。リーダー自己タンパク質分解酵素Ｎｐｒｏ並びにＥｒｎｓ（リボヌクレアーゼ活性を有する糖タンパク質であり、共に分泌され、ウイルスに付随する）は、ペスチウイルス属に固有である。Ｎｐｒｏは、ウイルスの複製には必要とされないアクセサリータンパク質ではあるが、生来の免疫反応を干渉するその能力により、ウイルスの病原性における役割を有すると考えられている。さらに、Ｎｐｒｏは、自分自身を切断して、新生ウイルスポリタンパク質を生成し、それによって、キャプシドタンパク質Ｃのアミノ末端を生成する自己タンパク質分解酵素である。タンパク質ＮＳ３〜ＮＳ５Ｂは、ウイルスＲＮＡの複製のためには十分であり、ＲＮＡ複製複合体を形成すると考えられる。切断されないＮＳ２−ＮＳ３並びにｐ７は、ウイルス粒子形成のために必要である。
【０００４】
ＲＮＡウイルスのゲノムの操作は、対応するｃＤＮＡクローンが、好ましくは、プラスミド中に挿入され、細菌細胞中で遺伝情報の安定的伝搬が利用可能な場合にのみ可能である。これらのクローンは、ウイルスＲＮＡが複製し、最終的に、感染性ウイルスの生成をもたらす感受性細胞中へとトランスフェクトし得る真正の感染性ウイルスＲＮＡのインビトロ転写を可能にするように設計される。過去１５年間以上にわたり、フラビウイルス科の多くのウイルス（例えば、ペスチウイルス）のためのｃＤＮＡクローンが確立されてきた。
【０００５】
ペスチウイルスｃＤＮＡクローンの開発に続き、安定的に挿入されたクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を伴うＡｌｆｏｒｔ／１８７株（Ｒｕｇｇｌｉら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０，３４７８−３４８７，１９９６）由来の組み換えＣＳＦＶが作製され（Ｍｏｓｅｒら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２，５３１８−５３２２，１９９８）、ウイルス複製に影響を与えることなく、外来遺伝子を、Ｎｐｒｏタンパク質と融合させて発現させ得ることが示された。また、ＣＳＦＶ中の全Ｎｐｒｏ遺伝子をマウスユビキチン遺伝子と置換することは、ウイルスの複製能を損なわなかった（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２，７６８１−７６８４，１９９８）。
【０００６】
ＣＳＦＶレプリコン
定義により、レプリコンとは、宿主細胞中で自律的に複製する分子を表す。したがって、標準的なＣＳＦＶの全長ＲＮＡゲノムは、原型ＣＳＦＶレプリコンである。操作されたＣＳＦＶのｃＤＮＡを用いた研究が、ＲＮＡ複製のために必要とされるウイルスタンパク質を決定するために行われた。これにより、複製複合体が、５つのタンパク質ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂから構成されることが結論付けられた。上記研究後、構造タンパク質、Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１、又はＥ２のうちの１つのみ又は複数に対するコード配列を欠如する人工レプリコンを作製した（Ｆｒｅｙら，Ｖｅｔ Ｒｅｓ ３７，６５５−７０，２００６）。かかるレプリコンは、ウイルスの欠如している構造タンパク質をそれぞれ構成的に発現する細胞系統において補完される必要があり、これにより、欠陥を有する（レプリコン）ゲノムを担持するウイルス粒子のレスキューを可能にする。これらの欠陥を有するＣＳＦＶ粒子は、ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）と呼ばれる。
【０００７】
ワクチンとしてのＣＳＦＶレプリコン
ＶＲＰの形態のＣＳＦＶレプリコンを、ヒト又はその他の哺乳類に対するワクチン接種のためのベクターとしてではなく、ブタのＣＳＦＶに対する実験的ワクチンとして使用した。ＶＲＰは、ウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子のうちの少なくとも１つ中に特定の欠失を有する、サブゲノムＲＮＡを含む感染性ビリオンである。かかるＲＮＡは、宿主細胞中で複製し、コードされたウイルスタンパク質を発現する。しかしながら、エンベロープタンパク質のうちの少なくとも１つの欠損によって、ＶＲＰは子孫ＶＲＰを生成できない。Ｅｒｎｓ又はＥ２遺伝子のいずれかを欠くゲノムを担持するＶＲＰが、生弱毒化非伝染性ＣＳＦワクチンとして最近提案されている。ＶＲＰを非経口的にワクチン接種したブタに対する、伝染性の高いＣＳＦＶを用いた抗原投与接種によって、Ｅｒｎｓ遺伝子を欠如するＶＲＰが防御的であり得ることが示されている（Ｆｒｅｙら，Ｖｅｔ Ｒｅｓ ３７，６５５−７０，２００６）。これらのＶＲＰワクチンが、液性免疫及び細胞性免疫の両方を誘導する能力を有することも知られている。
【０００８】
今日使用されている多くのワクチンは、不活性化ウイルスに基づいており、これらは、細胞性の防御機構をほとんど又は全く発現させずに、液性免疫に有利に働く傾向がある。このことは、遊離ウイルス及びある程度ウイルスが感染した細胞を、抗体の作用によって除去することを可能にし得るが、抗体は、身体の全ての部分におけるウイルスと相互作用することはできない。小さな病巣のウイルス感染細胞の除去を確かにし得るのが細胞性免疫である。したがって、あるワクチンが、液性免疫及び細胞性免疫の両方を誘導し得る場合には、より確実な免疫防御の可能性が見込まれる。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、感染性のウイルス粒子を形成する能力を欠如するように操作され（図１Ｂ〜１Ｇ）、さらに、外来遺伝子を含むようになったペスチウイルスのレプリコン、特に、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）のレプリコンに関する。このレプリコンは、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）中にトランスフェクトした場合に、これらの細胞中で複製する能力を保持する。
【００１０】
特に、このレプリコンは、ウイルス粒子を形成するために必要とされる１つ又はそれ以上の構造タンパク質をコードする必須のコドン又は全てのコドンを欠く。ＣＳＦＶの構造タンパク質は、キャプシドタンパク質Ｃ並びに３つのエンベロープ糖タンパク質のＥｒｎｓ、Ｅ１、及びＥ２である。しかしながら、対象となる任意の外来遺伝子の発現のために設計されたレプリコンは、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）中でのその複製に必要とされる全ての遺伝情報を保持する。対象となる外来遺伝子は、外来タンパク質をコードする完全な遺伝子であっても、外来タンパク質の一部をコードするヌクレオチド配列であってもよい。外来遺伝子は、例えば、ウイルスコード配列、好ましくは、Ｎｐｒｏ遺伝子内の配列の、５’末端に、又は、バイシストロニックゲノムを構成している場合、Ｎｐｒｏ遺伝子の３’末端に挿入してもよい（図２Ｂ〜２Ｅ）。
【００１１】
特定の形態のレプリコンは、さらに、Ｎｐｒｏ遺伝子中に変異コドン、例えば、Ｎｐｒｏのアミノ酸位置１１２番におけるシステインからアルギニンへの置換（Ｃ１１２Ｒ）、又は、アミノ酸位置１３６番におけるアスパラギン酸からアスパラギンへの置換（Ｄ１３６Ｎ）を含み、その結果、コードされた変異体Ｎｐｒｏタンパク質（図１及び２中、Ｎｐｒｏ’と記載する）は、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）誘導を干渉する能力を喪失している。さらに特定の形態のレプリコンの場合は、Ｉ型ＩＦＮ誘導を干渉し得るタンパク質をもはやコードしないレプリコンを作製するという同様の目的のために、Ｎｐｒｏ遺伝子は欠失されている（ΔＮｐｒｏ ＣＳＦＶレプリコン）。
【００１２】
さらに別の特定の形態のレプリコンは、非構造タンパク質ＮＳ２に対する必須のコドン、又は、さらなるヌクレオチドによって物理的に分離されているＮＳ２及びＮＳ３をコードする遺伝子を欠如しており、結果として、このレプリコンは細胞病原性である。特に、ＣからＮＳ２までの全ての配列が欠如していてもよい（ΔＣ−ＮＳ２ ＣＳＦＶレプリコン）（図１Ｇ）。細胞病原性の表現型は、細胞傷害性免疫防御の誘導に関して有利であり得ると言えよう。
【００１３】
本発明のレプリコンは、裸のＲＮＡとして、又は、適当な微粒子送達ビヒクルを伴うＲＮＡ（例えば、ペスチウイルス中にパッケージされたレプリコン）として、哺乳類（例えば、ヒト）において、ワクチン接種、遺伝子送達及び遺伝子治療用途のために使用し得る新規なベクター系を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、ペスチウイルスレプリコン単独、又は、ワクチンとしての用途価値を有する外来遺伝子をコードする適当な微粒子送達ビヒクルを伴うペスチウイルスレプリコンを含む医薬組成物に関する。したがって、本発明は、レプリコン単独、又は、適当な微粒子送達ビヒクルを伴うレプリコンを投与することによる、感染性物質により引き起こされる疾患の予防方法に関連し、この場合、レプリコン中に組み込まれている外来遺伝子は、感染性物質に対して免疫性を付与する遺伝子産物をコードする。
【００１５】
さらに、本発明は、レプリコン単独、又は、適当な微粒子送達ビヒクルを伴うレプリコンを投与することによる、欠損遺伝子により引き起こされる疾患の治療方法に関連し、この場合、レプリコン中に組み込まれる外来遺伝子は、疾患に関連する機能性遺伝子である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＣＳＦＶ ｖＡ１８７−１の標準的な全長且つ欠陥を有するゲノム（レプリコン）の概略図。５’−及び３’−ＵＴＲ（非翻訳領域）は、黒色の直線で表され、オープンリーディングフレームは、図示されるように、構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードする個々のウイルス遺伝子から構成される四角形（灰色）として示され、非構造Ｎｐｒｏタンパク質をコードする遺伝子は、黒色の四角形として示される。用語Ｎｐｒｏ’とは、コドンが変異しているＮｐｒｏタンパク質のことをいう。（Ａ）標準的な全長ＣＳＦＶゲノムの遺伝子配列の概略図。（Ｂ）〜（Ｇ）レプリコンの複製を損なうことなく、選択された遺伝子が欠失しているＣＳＦＶレプリコン構築物の例：（Ｂ）Ｅｒｎｓ遺伝子を欠如しているＣＳＦＶレプリコン（ΔＥｒｎｓレプリコン）；（Ｃ）Ｅ１遺伝子を欠如しているＣＳＦＶレプリコン（ΔＥ１レプリコン）；（Ｄ）Ｅ２遺伝子を欠如しているＣＳＦＶレプリコン（ΔＥ２レプリコン）；（Ｅ）Ｃ遺伝子を欠如しているＣＳＦＶレプリコン（ΔＣレプリコン）；（Ｆ）Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１及びＥ２遺伝子を欠如しているＣＳＦＶレプリコン（ΔＣ−Ｅ２レプリコン）；（Ｇ）Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１、Ｅ２及びＮＳ２遺伝子を欠如しているＣＳＦＶレプリコン（ΔＣ−ＮＳ２レプリコン−細胞病原性又はｃｐレプリコン）。
【図２】標準的な全長ＣＳＦＶ ｖＡ１８７−１ゲノムの概略図（A）、並びに、異種遺伝子（対象遺伝子「Ｇｅｎｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（ＧｏＩ）」）が、モノシストロニック構築物（Ｂ，Ｄ）及びバイシストロニック構築物（Ｃ，Ｅ）中に挿入されている、この構築物（Ｂ〜Ｅ）に由来する欠陥を有するゲノム（レプリコン）の例。色の濃淡及び用語は図１中の通りであり、ＧｏＩは、縞模様の四角形として示されている。モノシストロニック構築物の場合、これは、Ｎｐｒｏ遺伝子の５’末端に位置する最初の１２ヌクレオチド中に配置されている。バイシストロニック構築物の場合、ＧｏＩは、Ｎｐｒｏ遺伝子の直ぐ下流に配置されている。バイシストロニック構築物のために必要とされるＥＭＣＶ ＩＲＥＳは、挿入されたＧｏＩの３’末端に黒色の実線として示されている。
【図３】ブタ及びヒトの細胞両方におけるＩＦＮ−α／β誘導の調節に対するＣＳＦＶ Ｎｐｒｏタンパク質の重要性。ＩＦＮ−α／β誘導に対するＣＳＦＶ又はＣＳＦＶレプリコンによる調節は、Ｎｐｒｏタンパク質依存的であり、Ｎｐｒｏ遺伝子が、全長ウイルスゲノムから又はレプリコンから欠失している場合（ｖＡ１８７−ΔＮｐｒｏ）には、存在しない。ＩＦＮ−α／β誘導に対するＮｐｒｏ−依存性調節はまた、２つの独立したアミノ酸変化（各構築物中、Ｎｐｒｏ（Ｃ１１２Ｒ）又はＮｐｒｏ（Ｄ１３６Ｎ））のいずれかによりノックアウトされ得る。（Ａ）ブタ腎臓細胞ＰＫ−１５細胞を、ｘ軸に示されるように、偽感染（「Ｍ」）させ、又は、２ ＴＣＩＤ５０／細胞のＭＯＩにて、ＣＳＦＶ ｖＡ１８７−１を用いて感染させ、又は、Ｎｐｒｏ遺伝子を欠如するｖＡ１８７−１由来の変異体（ｖＡ１８７−ΔＮｐｒｏ）、若しくは、Ｎｐｒｏのアミノ酸位置１１２番にシステインからアルギニンへの置換を有するｖＡ１８７−１由来の変異体（ｖＡ１８７−ΔＮｐｒｏ（Ｃ１１２Ｒ））、若しくは、アミノ酸位置１３６番にアスパラギン酸からアスパラギンへの置換を有するｖＡ１８７−１由来の変異体（ｖＡ１８７−ΔＮｐｒｏ（Ｏ１３６Ｎ））を用いて感染させた。Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−α／β）の生物活性を、定量のために、Ｍｘ／ＣＡＴレポーター遺伝子アッセイ、及び、基準物質としてブタＩＦＮ−αを用いて、細胞培養上清中、１ｍｌあたりの単位（ｙ軸）として測定した。検出限界は、２Ｕ／ｍｌである。（Ｂ）ヒト胎児腎細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｘ軸に示されるように、３種類のプラスミド：ヒトＩＦＮ−βプロモーター活性に対して、ホタルルシフェラーゼレポータープラスミドｐ１２５Ｌｕｃ（Ｒｕｇｇｌｉら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３４０，２６５−２７６，２００５）；（正規化のために）ウミシイタケルシフェラーゼの構成的発現に対して、プラスミドｐｈＲＬ−ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ）；並びに、Ｎｐｒｏ（Ｎｐｒｏ）又は変異Ｎｐｒｏ（Ｎｐｒｏ（Ｃ１１２Ｒ）、Ｎｐｒｏ（Ｄ１３６Ｎ））タンパク質の発現に対するプラスミド、の混合物を用いて、２連のウェル中でトランスフェクトした。「Ｃ」とは、キャプシドタンパク質Ｃをコードする発現プラスミドを用いたトランスフェクションのことを指し、「Ｖ」とは、Ｎｐｒｏの発現のために使用されるが、Ｎｐｒｏ遺伝子を欠如するプラスミドを用いたトランスフェクションのことを指す。ＩＦＮ−βを誘導させるために、２４時間後に、一方のウェルを、２ｘ１０５個の細胞あたり、４００ｎｇのポリ（ＩＣ）を用いてさらにトランスフェクトし、もう一方のウェルを偽トランスフェクトした。１８時間後に、誘導性ホタルルシフェラーゼ活性を、構成的に発現されるウミシイタケルシフェラーゼ活性を用いて正規化し、偽処理した細胞に対するポリ（ＩＣ）処理した細胞の相対誘導比（「Ｉ」）を計算した。結果は、標準偏差を表すエラーバーを有する３つの独立した誘導比の平均である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、感染性ウイルス粒子を形成する能力を欠如するように操作され、外来遺伝子をさらに含む、ペスチウイルスのレプリコン、特に、ブタコレラウイルスのレプリコンに関する。このレプリコンは、哺乳類細胞中に導入された時に、その細胞中で複製する能力を保持する。
【００１８】
「レプリコン」は、宿主細胞中で自律的に複製する分子である。本発明の目的のための、「レプリコン」は、細胞中での複製のために必要とされる全てのヌクレオチドを含む、対応するウイルス（ペスチウイルスレプリコンの場合、ペスチウイルス）由来のＲＮＡである。「由来する」とは、そのレプリコンが、ゲノムの非翻訳５’−及び３’−末端領域、並びに、対応するウイルスのＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂをコードする領域の全てのヌクレオチドを依然として含むが、複製を干渉しないさらなるヌクレオチドを含んでもよいことを意味する。
【００１９】
本発明のレプリコンは、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）に由来するのが好ましい。ＣＳＦＶレプリコンは、それが、ヒトには感染しないか、さもなければ、ヒトには害を及ぼさない動物ウイルスに由来するという事実により、ヒトへ適用するための外来遺伝子物質の担体としての利点を提供する。ＲＮＡ分子と同様に、それは、細胞の細胞質中では複製するが、核内では複製しない。したがって、ウイルスＤＮＡの場合と同様に、それは、ヒト、又はその他の動物、又はそれらの細胞に対してリスクをもたらさない。さらに、本発明のレプリコンは、担持された外来遺伝子を、機能的に活性を有し、且つ、完全なタンパク質へと翻訳し得るが、感染性の子孫ウイルスを生成するために複製することはできず、さらに別の安全的成分が本発明のレプリコンによって提供される。翻訳されたタンパク質によって、レプリコンは、治療的又は予防的用途のために利用し得るタンパク質をコードする遺伝子を送達し得るという利点を提供する。さらに、送達された遺伝子は、免疫系によるプロセシングのために、タンパク質へと翻訳し得る。レプリコンは、免疫系の樹状細胞中で複製し、タンパク質を翻訳する。このことは、免疫反応の発現をもたらし、免疫系へのかかるタンパク質の提示に極めて重要である。したがって、本レプリコンは、ワクチンとしての高い可能性を提供し、かかるワクチンは、本発明の主題でもある。
【００２０】
特定の例として、ルシフェラーゼ遺伝子又はインフルエンザウイルス赤血球凝集素遺伝子を担持する、ブタコレラウイルス由来の本発明のレプリコンが、ワクチン送達系としての用途で使用することができることが、以下、本明細書において示される。特定の例において、外来遺伝子物質は、Ｎｐｒｏの自己タンパク質分解活性を維持するために、レプリコンのＮｐｒｏ遺伝子の５’末端近くに挿入される（すなわち、モノシストロニックレプリコンを作製する）。モノシストロニックレプリコンの翻訳時、対象となる外来タンパク質は、Ｎｐｒｏポリペプチド中に組み込まれた融合タンパク質として合成される。或いは、外来遺伝子は、Ｎｐｒｏ遺伝子の直ぐ下流に挿入される。この場合、外来遺伝子に続いて、終止コドン、及び、ＥＭＣ（脳心筋炎）ウイルス（ＥＭＣＶ）由来のＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）が並び、これにより、残りのウイルスポリタンパク質の翻訳が可能となる。したがって、このタイプのレプリコンは、バイシストロニックであり、第１のシストロンは、Nｐｒｏ遺伝子及び対象となる外来遺伝子から構成され、第２のシストロンは、レプリコンの残りの遺伝情報を担持する。バイシストロニックレプリコンの翻訳時、Nｐｒｏの自己タンパク質分解活性によって、対象となる真正の外来タンパク質を生じる。
【００２１】
特に、本発明のレプリコンは、感染性ウイルス粒子の形成に必要とされる構造タンパク質をコードする遺伝子中の必須のコドン又は全てのコドンを欠如する。かかる構造タンパク質は、キャプシドタンパク質Ｃと、３つのエンベロープ糖タンパク質Ｅｒｎｓ、Ｅ１、及びＥ２である。４つの構造タンパク質Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１、及びＥ２のうちの１つのみが欠陥を有する又は欠如している可能性もあり、又は、２つ、３つ又は全ての構造タンパク質が欠陥を有する且つ／又は欠如している可能性もある。「必須のコドン」とは、かかるコドンが欠如している場合に、その結果、コードされたタンパク質が欠陥を有し、構造タンパク質として、特に、構造タンパク質Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１、又はＥ２として機能することができないことを意味する。
【００２２】
本発明のレプリコンは、外来遺伝子を担持する。「外来遺伝子」は、少なくとも８個のアミノ酸からなる、例えば、８〜２０００個のアミノ酸、好ましくは、２０個以上のアミノ酸、特に１００個以上のアミノ酸からなる外来ポリペプチドをコードする完全な外来遺伝子又は外来ヌクレオチド配列である。「外来」とは、対応する遺伝子又はヌクレオチド配列が、ペスチウイルス中には見られないが、別の供給源から切り出され、レプリコン中に導入されるか、又は最初から構築されて、レプリコン中に導入されることを示す。特定の外来遺伝子の例は、治療タンパク質（例えば、インスリン等のホルモン類、ＧＭ−ＣＳＦ１等のサイトカイン類、レチナールデヒドロゲナーゼ等の酵素類、ＴＮＦ受容体等のサイトカイン受容体）、並びに、疾患を引き起こす感染性物質中に存在するタンパク質、特に、疾患を引き起こすウイルス（例えば、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全症ウイルスＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウイルスＨＣＶ、Ｂ型肝炎ウイルスＨＢＶ、ハシカウイルス、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ等）、細菌（例えば、ボルデテラ属、ボレリア属）、又は、寄生虫（例えば、プラスモジウム属）及び真菌（例えば、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガタス）等の表面タンパク質、並びに、毒素（例えば、破傷風トキソイド）をコードする遺伝子である。さらに、上記した物質の公知の免疫原性エピトープのいずれか、例えば、インフルエンザウイルスＨＡ糖タンパク質、ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質、又はＨＣＶ Ｅ糖タンパク質の免疫優勢エピトープ、をコードするヌクレオチドを導入してもよい。
【００２３】
外来遺伝子は、例えば、ウイルスのコード配列の５’末端、Ｎｐｒｏ遺伝子の５’末端の最初の１２ヌクレオチド中、又は、Ｎｐｒｏ遺伝子の直ぐ下流に挿入してもよい。或いは、外来遺伝子は、ウイルスゲノムのその他の部位、例えば、３’ＮＴＲの開始部に挿入してもよい。図２中に示されるようにして挿入された外来遺伝子（対象遺伝子：Ｇｅｎｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，「ＧｏＩ」）を有するモノシストロニック及びバイシストロニックレプリコンが好ましい。しかしながら、本発明は、図２のΔＥｒｎｓ又はΔＣ−ＮＳ２構築物には限定されない。対応するモノシストロニック及びバイシストロニック構築物ΔＥ１、ΔＥ２、ΔＣ及びΔＣ−Ｅ２（図１Ｃ〜Ｆ参照）、又は、構造遺伝子の部分的欠失を有する構築物、又は、構造遺伝子の欠失のその他の組み合わせを有する構築物についても意図される。
【００２４】
バイシストロニックレプリコンは、Ｎｐｒｏがそれ自体をそのカルボキシ末端で切断し、下流のタンパク質を分離するという能力によって、レプリコンから真正の外来タンパク質を合成できるという利点を提供する。融合タンパク質として外来配列が発現されるモノシストロニックレプリコンは、短いペプチド又は免疫原性の低いペプチドについて発現を考慮した時、有利であり得る。
【００２５】
レプリコンは、Ｉ型インターフェロンの誘導経路を阻害するというその遺伝子産物の能力の点から見て活性形態又は不活性形態であるＮｐｒｏ遺伝子を担持するように構築する。この構成において、レプリコンは、Ｎｐｒｏ遺伝子を欠如していてもよく（ΔＮｐｒｏ ＣＳＦＶレプリコン）、又は、例えば、Ｎｐｒｏのアミノ酸位置１１２番における、システインからアルギニンへの置換（Ｃ１１２Ｒ）、若しくは、アミノ酸位置１３６番における、アスパラギン酸からアスパラギンへの置換（Ｄ１３６Ｎ）を導入することにより、変異したＮｐｒｏ遺伝子（図１及び２中ではＮｐｒｏ’と示される）を有していてもよい。後者の場合、各変異それ自体が、Ｎｐｒｏ遺伝子産物のその他の機能を変えることなく、Ｉ型インターフェロンの誘導経路を阻害するというＮｐｒｏ遺伝子産物の能力を無効にする。しかしながら、両位置におけるＮｐｒｏ遺伝子の変異は、Ｎｐｒｏ遺伝子産物のその他の機能に影響を与えることなく、復帰変異の可能性に関して、変異体の安定性をさらに増大させる。用途に応じて、不活性なＮｐｒｏ遺伝子産物を有するレプリコンが、抗ウイルス剤及び／又は免疫調節タンパク質としての機能の点から見て、Ｉ型インターフェロン誘導に関して価値を有することになる。かかる用途は、レプリコンの機能に関して、例えば、ワクチンとしての価値を有する。一方、治療物質をコードする遺伝子を送達するレプリコンが、Ｉ型インターフェロンを誘導しないことがより望ましい場合もある。かかるレプリコンのためには、コードされる治療物質が、Ｉ型インターフェロンの誘導に続く面倒な事態を伴うことなく、活性を有し得る、活性Ｎｐｒｏが望ましい。
【００２６】
特定の形態のレプリコンは、Ｃ〜ＮＳ２をコードする配列を欠如し（ΔＣ−ＮＳ２）、したがって、細胞病原性である。死にかけている細胞は、細胞傷害性防御の誘導に関して重要な働きである交差提示のために免疫系を特に引き付けることが示されているように、このことは有利である（Ｒａｃａｎｅｌｌｉら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０，４７−５８，２００４）。１つ又はそれ以上の構造タンパク質遺伝子が存在するが、ＮＳ２タンパク質がもはや機能的でないように、ＮＳ２をコードする遺伝子が必須又は全てのコドンを欠如しているか、又は、ＮＳ２及びＮＳ３をコードする遺伝子が、さらなるヌクレオチド、例えば、ＩＲＥＳによって物理的に分離している細胞病原性レプリコンを作製してもよい。
【００２７】
対象となる任意の外来遺伝子の発現のために設計されたレプリコンは、哺乳類細胞中、特に、ヒト細胞中でのその複製に必要とされる全ての遺伝情報を保持する。このレプリコンは、宿主細胞の細胞質中で複製することから、宿主細胞の核の分裂の必要性、宿主ゲノム中への組み込み、又は、ワクチンとしてのＤＮＡベクターの使用に伴うその他の望ましくない効果を回避する。このレプリコンは、治療的又は予防的用途のためのタンパク質への、挿入された異種遺伝子の翻訳を引き起こす。
【００２８】
実施例中に記載される特定のレプリコンは、ＣＳＦＶ株Ａｌｆｏｒｔ／１８７のプラスミドｃＤＮＡクローンｐＡ１８７−１に基づいている。プラスミドｐＡ１８７−１は、ウイルスゲノム配列の直ぐ上流に、Ｔ７プロモーターと、ゲノム配列の３’末端に、固有のＳｒｆｌ制限部位を含む。したがって、ＳｒｆｌによるプラスミドＤＮＡの線条化、続くランオフ転写によって、真正のウイルスＲＮＡの合成が可能となる。Ｒｕｇｇｌｉら（Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０，３４７８−８７，１９９６）によって示されるように、このＲＮＡは、ブタ腎細胞系統（例えば、ＳＫ−６細胞）中で試験したところ、感染性を有しており、細胞へのトランスフェクション後に、感染性の子孫ウイルスの合成を引き起こす。しかしながら、この公知のＲＮＡは、外来遺伝子を担持せず、ＣＳＦＶ株Ａｌｆｏｒｔ／１８７の遺伝子のみをコードしている。
【００２９】
本発明において、外来遺伝子がレプリコン中に導入される。レプリコンＲＮＡは、意図される用途、すなわち、免疫反応の促進という観点から見た、免疫系の細胞中、特に樹状細胞中での複製能又は翻訳能について試験する。外来遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を担持する本発明のレプリコンは、実際、ブタ樹状細胞中へトランスフェクション後に、機能的ルシフェラーゼタンパク質を翻訳する。
【００３０】
試験した本発明の特定のレプリコンは、４つのウイルス構造タンパク質Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１若しくはＥ２のうちのいずれか１つをコードする配列を欠如するか、又は、４つのウイルス構造タンパク質Ｃ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１及びＥ２の全てをコードする配列を欠如する。細胞病原性レプリコンは、さらに、非構造タンパク質ｐ７及びＮＳ２をコードする遺伝子を欠如する。全てのレプリコンは、ｐＡ１８７−１から得られる公知の感染性ＲＮＡと同様の手段によって得られる。レプリコンのサイズに対する限定は予期されない。これらのレプリコンは、真核細胞中へのトランスフェクション後に、複製するが、構造タンパク質の欠如により、感染性ウイルスは生成されない。それぞれのタンパク質を発現するように安定的に形質導入された細胞系統中でレプリコンをパッケージすることは、依然として可能である。
【００３１】
図１は、レプリコンの構築のために使用され得る欠失の例を示す。図２は、対象遺伝子（ＧｏＩ）がどのようにレプリコンゲノム中に挿入され得るのかについての例を示す。この場合、図は、外来タンパク質の発現のために設計された、モノシストロニック又はバイシストロニックの２つの形態のレプリコンの例を示す。２つの形態のそれぞれに対して、図は、構造遺伝子領域における欠失の例についても示しており、単一の遺伝子、Eｒｎｓ遺伝子の欠失が例示されている。複数の遺伝子の欠失が使用されている例も示されている（ＣからＮＳ２を含む遺伝子の欠失）。依然として活性ＮＳ２をコードするレプリコンはいずれも、非細胞病原性である。細胞病原性レプリコンを作製するためには、図１Ｇ及び図２Ｄ、Ｅに示されるように、ＮＳ２におけるさらなる欠失が必要とされる。
【００３２】
図１及び２はまた、２つの形態のＮｐｒｏ遺伝子：インタクトなＮｐｒｏ遺伝子（その遺伝子産物は、Ｉ型ＩＦＮ産生を誘導するという細胞の能力を損なう）、又は、変異Ｎｐｒｏ遺伝子（Ｎｐｒｏ’遺伝子）（その遺伝子産物は、Ｉ型ＩＦＮの誘導を干渉することはできない）、を表す。Ｎｐｒｏ遺伝子を有しない構築物を使用した場合は、Ｉ型ＩＦＮ産生に対する細胞の誘導性に及ぼす影響という観点から見て、変異Ｎｐｒｏ遺伝子を有する構築物を使用した場合と同様の結果を示す。
【００３３】
ＧｏＩ挿入物の位置は、レプリコン遺伝子自体の複製及び翻訳を干渉してはならない。この外来遺伝子のための好ましい位置は、ウイルスコード配列の５’末端、Ｎｐｒｏ遺伝子内、又はＮｐｒｏ遺伝子の３’末端に近い位置への挿入である。挿入された外来遺伝子がレプリコン構築物中で許容されないという任意のリスクを回避するために、これらの挿入位置が選択される。これらの位置の外来遺伝子の存在は、レプリコンの複製及び翻訳を干渉しない。
【００３４】
以下に記載される特定の例において、モノシストロニック又はバイシストロニックレプリコン構築物は、ルシフェラーゼ遺伝子又はインフルエンザウイルスＨＡ遺伝子等の外来遺伝子配列の挿入のための固有のＮｏｔＩ部位を有する。モノシストロニックレプリコンの場合、挿入は、ＮｐｒｏのＮ末端部分内で起こる。このようにして、Ｎｐｒｏの１１個のＮ末端アミノ酸、次に、残基Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ、外来タンパク質、残基Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ、及びＮｐｒｏの残りのＣ末端部分（アミノ酸残基１５〜１６８）から構成される融合タンパク質が作製される。この位置への挿入は、Ｎｐｒｏの２つの機能、すなわち、新生ポリタンパク質からのＮｐｒｏの切断を担う自己タンパク質分解活性、及び、細胞中でのＩ型ＩＦＮの誘導の干渉という観点から見た、生来の免疫反応に対する干渉、のいずれにも影響を及ぼさない。
【００３５】
以下に記載される特定のバイシストロニックレプリコンの例において、外来遺伝子は、Ｎｐｒｏ遺伝子の直ぐ後に挿入され、終止コドン、及び、残りのウイルスポリタンパク質（Ｃ〜ＮＳ５Ｂ又はＮＳ３〜ＮＳ５Ｂ）の翻訳開始のための、ピコルナウイルスである脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が続く。このベクターの重要な特徴は、真正の外来タンパク質が発現され得る一方で、モノシストロニックレプリコンにおいては、それは、Ｎｐｒｏタンパク質との融合タンパク質として合成されることである。
【００３６】
Nｐｒｏ遺伝子を含む特定のモノシストロニック及びバイシストロニック構築物が、レプリコンの翻訳及び複製を障害することなく作製されている。レプリコンは、レプリコンの機能に従うことなく、この部位において遺伝子操作することができる。
【００３７】
外来遺伝子挿入物は、機能を維持し、レプリコンにより安定して発現される必要がある。さらに、この挿入物は、ペスチウイルスレプリコン遺伝子の正しい働きを、特に、それらの複製及びそれらがコードする遺伝子の翻訳という観点から見た正しい働きを干渉してはならない。本発明は、（ｉ）レプリコン中での外来遺伝子挿入物の認容性、（ｉｉ）コードされたタンパク質へのその正しい翻訳という観点から見た、外来遺伝子による機能の保持、（ｉｉｉ）外来遺伝子挿入物内に含まれる場合、大きな遺伝情報の挿入後、レプリコンによる機能の保持、を示す解決法を提供する。
【００３８】
ペスチウイルスレプリコンは、ワクチンとしての高い可能性を有する。それらは非感染性であり（感染性ウイルスを生じない）、したがって、非伝染性であるという事実により、それらは、安全なワクチンのための重要な条件も満たす。
【００３９】
本発明はまた、活性成分としての、本明細書中に上記されるようなペスチウイルスレプリコンと、任意で、薬学的に許容し得る成分をさらに含む医薬組成物に関する。温血動物、特にヒトに対する、腸内投与、例えば、経鼻、口腔、直腸、又は、特に経口投与のための組成物、並びに、非経口的投与（特に好ましい）、例えば、静脈内、筋肉内又は皮下投与のための組成物が好ましい。
【００４０】
医薬調製物（例えば、ワクチン）中でのレプリコンの使用のために、レプリコンは、裸のＲＮＡとして使用してもよい。このことは、ＲＮａｓｅによる分解に対するＲＮＡの保護、例えば、ＲＮＡキャッピングによる保護、を必要とする。或いは、ペスチウイルスレプリコンを、適当な微粒子送達ビヒクルと伴わせてもよい。これらは、ＲＮＡの保護を促進し得る一方で、ＲＮＡがそのコードタンパク質を翻訳し得る細胞へのＲＮＡの送達の効率増大を促進し得る。この目的のために、ＲＮＡは、後者のタイプを作製する時に、微粒子送達ビヒクル中に封入するか、又は、予め形成された粒子中に添加する。それぞれの場合において、ＲＮＡ及び粒子の補完的添加を利用することにより、ＲＮＡの粒子との相互作用を増加させることができる。或いは、ＲＮＡは、ポリエチレングリコール修飾粒子表面等のリンカーを介して、粒子と物理的に結合させることができる。ＲＮＡ送達の可能性を有するかかる粒子ビヒクルの例は、リポソーム、マイクロ粒子、ナノ粒子又はナノカプセルである。薬物担体としてのリポソーム、マイクロ粒子、ナノ粒子又はナノカプセルは、当技術分野において周知であり、これらは、本発明において、微粒子送達ビヒクルと考えられる。
【００４１】
上記微粒子送達ビヒクルは、ペスチウイルスの構造タンパク質を組み込むように改変してもよい。この意味において、考えられる別の微粒子送達ビヒクルは、本発明のレプリコンを含むウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）である。ウイルスレプリコン粒子は、ペスチウイルスの構造タンパク質から構成される。かかるウイルスレプリコン粒子は、本発明のレプリコンによっては適切な状態でコードされない構造タンパク質を発現する細胞系統中で、本発明のレプリコンを培養することにより取得し得る。得られたウイルスレプリコン粒子は、次に、医薬調製物中で使用してもよいし、哺乳類に適用してもよい。ウイルスレプリコン粒子の一部である本発明のレプリコンの特徴は、ウイルスレプリコン粒子は感染性ではないが、複製して、ウイルスレプリコン粒子の送達点において外来遺伝子を発現することを確実なものにする。
しかしながら、さらなる修飾を有しないＣＳＦＶ粒子に基づくＶＲＰは、ＣＳＦＶ自体はヒト細胞に感染しないことから、ヒト細胞を標的とする効率的送達ビヒクルであるという可能性は低い。かかるＶＲＰは、ヒト細胞への標的化を促進するタンパク質又はタンパク質配列を含むように改変される。考えられる例は、ヘパラン硫酸構造及びマンノシル化を標的とするためのテトラリジンペプチドの組み込み、又は、Ｃ型レクチン受容体の標的化を促進するためのＮ−アセチルグルコサミン誘導体の添加である。
【００４２】
本発明のペスチウイルスレプリコン粒子の調製のために考えられる細胞系統は、本発明のレプリコンによってはコードされないか、又は、欠陥を有する形態でのみコードされる構造タンパク質を提供するように、安定的に形質導入されているブタ又はヒト細胞系統である。かかるウイルスレプリコン粒子は、それらが感染性ウイルス粒子へと複製することができないという点で安全である。
【００４３】
医薬組成物は、ペスチウイルスレプリコンのみを、又は、適当な微粒子送達ビヒクルを伴い、好ましくは、薬学的に許容し得る担体と共に、ペスチウイルスレプリコンを含む。ペスチウイルスレプリコンの投与量は、治療する疾患、種、その年齢、体重、個々の状態、個々の薬物体内動態データ、及び投与様式によって左右される。
【００４４】
非経口的投与のためには、ペスチウイルスレプリコンの溶液が好ましく、懸濁液又は分散液、特に、例えば、ペスチウイルスレプリコンのみを、又は、マンニトール等の担体と共に含む、用時調製し得る、凍結乾燥させた組成物の場合には、等張性水溶液、分散液又は懸濁液も好ましい。医薬組成物は、滅菌してもよく、且つ／又は、添加剤、例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤、及び／又は、乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調切するための塩、及び／又は、バッファーを含んでもよく、それ自体公知の様式で、例えば、従来の溶解及び凍結乾燥工程によって調製される。前記溶液又は懸濁液は、増粘剤、典型的には、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、又は、ゼラチン類を、又は可溶化剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）も含んでよい。好ましい保存剤は、例えば、アスコルビン酸等の抗酸化剤、又は、ソルビン酸若しくは安息香酸等の殺菌剤である。
【００４５】
油中懸濁液は、油成分として、注射用として慣例的な、植物油、合成油、半合成油を含む。そのような物のうち、酸成分として、８〜２２個、特に、１２〜２２個の炭素原子を有する長鎖脂肪酸含む液体脂肪酸エステルが、特記され得る。これらの脂肪酸エステルのアルコール成分は、最大６個の炭素原子を有し、一価又は多価であり、例えば、一価、二価又は三価のアルコール、特に、グリコール及びグリセロールである。脂肪酸エステルの混合物としては、綿実油、アーモンドオイル、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油、大豆油及び落花生油等の植物性油が特に有用である。
【００４６】
注射用調製物の製造は、例えば、アンプル又はバイアル中への充填時、及び、容器の密閉時のように、通常は無菌条件下で行われる。例えば、非経口的投与のために使用される溶液は、輸液として使用することもできる。
【００４７】
考えられる特定の医薬組成物は、ワクチンであり、この場合、本発明のレプリコンは、疾患を引き起こす感染性粒子中に存在するタンパク質、特に、疾患を引き起こすウイルス、細菌、若しくはその他の感染性物質の表面タンパク質、又はその他の公知の免疫原性エピトープをコードする。かかるワクチンは、ワクチン中に通常使用されるアジュバント、抗菌ペプチド、及び、適応的免疫反応を容易にし得る、且つ／又は、強化し得る免疫刺激性核酸を含んでもよい。例えば、レプリコンによってコードされるＧＭ−ＣＳＦ、又は、油性アジュバント、ＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチド、リポペプチド、免疫調節性ペプチド等の公知の免疫調節成分中に含まれる若しくは免疫調節性成分と一緒に存在するレプリコン処方物等が挙げられる。
【００４８】
さらに、本発明は、本発明のペスチウイルスレプリコンを投与する工程を含む、感染性物質により引き起こされる疾患に対する予防方法に関し、この場合、前記の外来遺伝子は、感染性物質に対して免疫性を付与する遺伝子産物をコードする。考えられる特定の疾患は、例えば、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ハシカウイルス、ＲＳＶ、ボルデテラ属、ボレリア属、プラスモジウム属、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガタス、破傷風トキソイド等によって引き起こされる疾患である。本発明の方法において、投与されるペスチウイルスレプリコンは、上記した感染性物質に由来する適当なエピトープ又は遺伝子産物を含む。
【００４９】
さらに、本発明は、レプリコンのみを、又は、適当な微粒子送達ビヒクルを伴って、投与することによる、欠陥を有する遺伝子により引き起こされる疾患の治療方法に関し、この場合、レプリコン中に組み込まれる外来遺伝子は、疾患に関連する機能性遺伝子である。例えば、冠動脈疾患の治療のための、血管新生を促進する血管新生タンパク質であるＦＧＦ４；内耳治療のためのカリウムチャンネル遺伝子；ＸＳＣＩＤ、ＡＤＡ欠損ＳＣＩＤ及び慢性肉芽腫症を有する患者のための遺伝子治療；肝臓でのＨＭＢシンターゼ発現を促進するためのアルファ１Ｍｅ／アルファ１ＡＴｐ；肺外傷に対する肺血管の反応を調節するための、アンジオポイエチン−１による遺伝子治療等が挙げられる。
【実施例】
【００５０】
実施例１：ＣＳＦＶレプリコンの構築
ＣＳＦＶレプリコンは、標的細胞中で複製することができるが、インビトロにおいては特別の「パッケージング」細胞系統中で増殖させることによって補助しないかぎり、感染性ウイルスを生成することができない。このことは、Ｅ１タンパク質、又はＥ２タンパク質、又はＥｒｎｓタンパク質、又はＣタンパク質、或いは、それらの組み合わせ又は部分以外のペスチウイルスの全ての構造タンパク質をレプリコンが発現することを特徴とする。
【００５１】
プラスミド構築物
変異ＣＳＦＶゲノムは、全長ｃＤＮＡクローンｐＡ１８７−１に基づいて構築する。プラスミドは、大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で増幅し、プラスミドＤＮＡは、Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ ＤＮＡ精製システム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ）を用いて精製する。これらの構築物は、全長ｃＤＮＡクローンｐＡ１８７−１の公開されている配列に基づく（Ｒｕｇｇｌｉら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０，３４７８−３４８７，１９９６）。全長ウイルスｃＤＮＡを含むプラスミドは、Ｓｒｆ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて線条化し、フェノール−クロロホルムによる抽出及びエタノールによる沈殿により精製する。ペレットは、最終濃度５００ｎｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ不含Ｈ２Ｏ中で再懸濁する。インビトロ転写は、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて実施する。サプライヤーの教示の通り、１．５μｇの線条化プラスミドＤＮＡ、１３μｌの転写バッファー、各７．５ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、及びＵＴＰ、並びに２μｌのＴ７ポリメラーゼ−ＲＮａｓｅ阻害剤混合物を含有する２０μｌの反応混合物を、３７℃でインキュベートする。テンプレートＤＮＡの除去のために、次に、この反応混合物を、２単位のＤＮａｓｅＩの存在下で、１５分間、３７℃でインキュベートする。転写反応からのＲＮＡを、５００ｍＭ 酢酸アンモニウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、及び１容量のイソプロパノールの存在下で、フェノール−クロロホルムによる抽出及びエタノールによる沈殿により精製する。或いは、ＤＮａｓｅＩによる切断後、転写産物を、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−４００ ＨＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製し、ＧｅｎｅＱｕａｎｔ ＩＩ光度計（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて定量する。
【００５２】
レプリコン構築物
Ｅｒｎｓ遺伝子を欠如する（或いは、Ｅ１、若しくはＥ２、若しくはＣ、又はこれらの任意の組み合わせを欠如する）ウイルスｃＤＮＡを、レプリコンとして使用する（図１）。モノシストロニック構築物のために、外来遺伝子（例えば、インフルエンザウイルスＨＡ遺伝子）は、Ｎｐｒｏ遺伝子のアミノ末端領域中に導入された唯一のＮｏｔｌ部位中に挿入される。得られた融合タンパク質は、７３９個のアミノ酸（ａａ）を有し、Ｎｐｒｏ’（ａａ １−１１）−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＨＡ（ａａ １−５６８）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｎｐｒｏ’（ａａ １５−１６８）から構成される。Ｎｐｒｏの既知の活性−例えば、自己タンパク質分解酵素活性、１型ＩＦＮ−誘導経路の干渉、及び、インターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）の分解−は維持される。１型ＩＦＮの誘導又は産生を調節しないレプリコンを作製するために、Ｃ１１２Ｒ又はＤ１３６Ｎに対する変異をＮｐｒｏ’’配列中に導入することにより、様々な構築物が得られる。
【００５３】
Ｅｒｎｓ遺伝子を欠如するバイシストロニックなウイルスｃＤＮＡ遺伝子もまた、レプリコンとして使用される（Ｅ２又はＣの欠失も可能である）。第１のシストロンは、フレーム中で外来遺伝子（インフルエンザウイルスＨＡ遺伝子）と融合したＮｐｒｏ遺伝子、その後に、残りのウイルスポリタンパク質（Ｃ〜ＮＳ５Ｂ）の翻訳を開始するＥＭＣＶ ＩＲＥＳを含む。このレプリコンからは、Ｎｐｒｏ及びインフルエンザウイルスＨＡ遺伝子の両方が、それらの真正の形態で発現される。Ｎｐｒｏ、自己タンパク質分解酵素の活性、及び、１型ＩＦＮの誘導又は産生の調節は維持される。１型ＩＦＮの誘導又は産生を調節しないレプリコンを作製するために、Ｃ１１２Ｒ又はＤ１３６Ｎに対する変異をＮｐｒｏ配列中に導入することにより、様々な構築物が得られる。或いは、Ｎｐｒｏは、コード配列の大部分を欠失させることにより、Ｃ末端を切断することができる。このことにより、再度、１型ＩＦＮの誘導又は産生を調節する能力を失ったレプリコンが生成される。次に、残りのＮ末端のＮｐｒｏ配列を、外来遺伝子産物であるインフルエンザウイルスＨＡタンパク質への融合物として発現させる。
【００５４】
実施例２：細胞病原性及び非細胞病原性のブタコレラウイルスのＲＮＡレプリコン
プラスミド構築物
図１Ｇ中に示されるものにより例示される変異ＣＳＦＶゲノムは、全長ｃＤＮＡクローンｐＡ１８７−１（Ｒｕｇｇｌｉら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０，３４７８−３４８７，１９９６）に基づいて構築する。プラスミドＤＮＡ構築物は、大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で増幅する。制限酵素は、Ｓｒｆ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）以外は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社による。プラスミドＤＮＡは、Ｗｉｚａｒｄ Ｍｉｎｉ−又はＭａｘｉｐｒｅｐキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製する。逆転写（ＲＴ）及びＰＣＲのために使用されるプライマーは、公開されている（Ｒｕｇｇｌｉら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０，３４７８−３４８７，１９９６）。これらの変異ＣＳＦＶゲノムの起源は、公開されている（Ｍｏｓｅｒら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３，７７８７−７７９４，１９９９）。
【００５５】
インビトロ転写及びエレクトロポレーション
ＳｒｆＩ １２２９８−又はＮｒｕｌ １１３０１−線条化プラスミドからのインビトロ転写を、Ｔ７ Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行う。ＤＮａｓｅＩによる切断後、転写産物を、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−４００ ＨＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製し、ＧｅｎｅＱｕａｎｔ ＩＩ光度計（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて定量する。ＳＫ−６細胞を、２度洗浄し、氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で再懸濁する。０．８ｍｌの容量中、合計２ｘ１０７個の細胞を、１５μｇのＲＮＡと混合し、０．４ｃｍのキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移して直ぐに、４５０Ｖ及び５００μＦの条件で、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）セットを用いてエレクトロポレーションを行う。或いは、１０７細胞／ｍｌの密度の０．４ｍｌの細胞懸濁液を、５ｍｇのＲＮＡと混合し、０．２ｃｍのキュベット中に移して、２００Ｖ及び５００μＦの条件で、２度、エレクトロポレーションを行う。エレクトロポレーション後、細胞懸濁液を、室温にて１０分間維持し、次に、５％（ｖ／ｖ）ウシ血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ変法Ｅａｇｌｅ培地中に希釈して、播種し、エレクトロポレーション後の様々な時間における分析のために回収する。
【００５６】
ＲＮＡ分析
全ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ）を用いて、エレクトロポレーションを行った５ｘ１０６個の細胞から抽出する。ＲＮＡ濃度に関係なく、エレクトロポレーションした細胞の数に基づいてサンプルを標準化するために、各サンプルの３分の１を、ノーザンブロッティングのために使用する。ノーザンブロッティング及びハイブリダイゼーションは、３２Ｐ−標識されたリボプローブ：ＣＳＦＶ Ａｌｆｏｒｔ／１８７ゲノムのプラス鎖ウイルスＲＮＡの検出のための、ＪＬ１、これは、３’−末端の２０４ヌクレオチド（ｎｔ）に対して相補的である、又は、マイナス鎖ＲＮＡの検出のための、ＧＭ、ＣＳＦＶ Ａｌｆｏｒｔ／１８７ゲノムのｎｔ３２７〜５８２に相当する、いずれかを用いて行う。ＲＴ反応は、Ｅｘｐａｎｄ ＲＴキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、プライマーＨＲ３、及び、続くｃＤＮＡ精製のためにＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−４００ ＨＲカラムを用いて行う。ＰＣＲのためには、Ｅｘｐａｎｄ ｌｏｎｇ−ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、又は、１ｋｂよりも短い断片のためには、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用する。
【００５７】
タンパク質分析
ＳＫ−６細胞を、低張緩衝液（２０ｍＭ ＭＯＰＳ［モルホリノプロパンスルホン酸］、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００［ｐＨ６．５］）中で溶解し、抽出物をウェスタンブロッティングのために使用する。ブタ抗ペスチウイルス高力価血清Ｎ８Ｔ１２及びペスチウイルスＮＳ３タンパク質に対するＭＡｂ ４９ＤＥが、ＮＳ３タンパク質検出のために役立つ。
【００５８】
レプリコンＲＮＡのパッケージング
欠陥を有するゲノムと共に全長ヘルパーＡ１８７−ＣＡＴ ＲＮＡをエレクトロポレーションした後、培養液の凍結融解によりウイルスを回収する前に、４８時間、５ｘ１０６個のＳＫ−６細胞をインキュベートする。低速での遠心分離後、前日に播種した２ｘ１０６個のＳＫ−６細胞を感染させるために、１ｍｌの希釈していない上清を使用し、接種材料を１時間後に交換する。細胞培養液のアリコートを、ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲのために、感染させてから４８時間後に回収する。
【００５９】
実施例３：ＣＳＦＶ欠失変異体の構築
Ｅ２欠失変異体
Ｅ２欠失変異体、例えば、ｐＡ１８７−Ｅ２ｄｅｌ３７３及びｐＡ１８７−Ｅ２ｄｅｌ６８、は、以下の通りにして構築される（Ｍａｕｒｅｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２３，３３１８−３３２８，２００５）。それらの概略図を図１Ｄに示す。Ｅ２の３７３アミノ酸をコードする完全なＥ２遺伝子（ＣＳＦＶ ｖＡ１８７−１ゲノムのヌクレオチド２４４１−３５５９）又はＥ２の６８アミノ酸をコードするヌクレオチド３２４８−３４５１、いずれかの欠失が、テンプレートとしてｃＤＮＡプラスミドクローンｐＡ１８７−１を使用するＰＣＲに基づく部位特異的突然誘発法により得られる。ヌクレオチド番号は、ｖＡ１８７−１のゲノムについて参照している（ＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号Ｘ８７９３９）。それらの５’末端において２０ヌクレオチドのオーバラップを有する２つの相補的オリゴヌクレオチドプライマー、並びに、所要の欠失に相当する５’及び３’配列が使用される。各ＰＣＲ断片を作製するために、２つの突然変異誘発プライマーそれぞれを、各欠失の上流又は下流に位置する配列に相当する正方向又は逆方向プライマーと共に使用される。この反応は、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏポリメラーゼを用いて、２０〜３０回の増幅サイクル行う。アセンブリのために、２つのＰＣＲ断片を、アガロースゲル電気泳動により単離し、予想される融合産物に隣接する各プライマーを用いて、さらに３０サイクルのＰＣＲに供する。その後、アガロースゲルからの精製及びプラスミドｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中への挿入前に、５’末端がアデノシル化されたＰＣＲ産物を得るために、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、１５分間、７２℃にて、添加する。各挿入物は、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ ＤＹＥｎａｍｉｃダイレクトサイクル配列決定キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して配列決定し、ｅ−Ｓｅｑ及びＡｌｉｇｎＩＲソフトウェア（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＬＩ−ＣＯＲ ４２００配列決定装置を使用することにより分析する。所要の制限断片を、ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯサブクローンから単離し、Ｅ２欠失変異体を得るために、全長ｃＤＮＡクローンｐＡ１８７−１中の対応する配列と置換するために使用する。ＲＮＡの特異的感染性（ＲＮＡ１μｇあたりの感染単位（ＩＵ）として表される）を、インビトロ合成したＣＳＦＶ ＲＮＡについて使用する感染中心アッセイにおいて決定する（以下参照）。
【００６０】
Ｅｒｎｓ欠失変異体
２２７アミノ酸をコードする完全なＥｒｎｓ遺伝子（ＣＳＦＶ ｖＡ１８７−１ゲノムのヌクレオチド１１７５−１８５５）の欠失が、ＰＣＲに基づく部位特異的突然誘発法により得られる（Ｆｒｅｙら，Ｖｅｔ Ｒｅｓ ３７，６５５−７０，２００６）。それらの概略図を図１Ｂに示す。変異ｐＡ１８７ｄｅｌＥｒｎｓを得るために、Ｅｒｎｓ欠失を含むＰＣＲ断片を、全長ｃＤＮＡクローンｐＡ１８７−１中の対応する領域と置換するために使用する。ＳｒｆＩによって線条化したｐＡ１８７ｄｅｌＥｒｎｓのランオフ・インビトロ転写を行う。
【００６１】
欠失変異体ＲＮＡの特性決定
インビトロ合成したＲＮＡ（１０μｇ）を、エレクトロポレーションすることによりＳＫ−６細胞中に入れる。エレクトロポレーションした細胞の１０分の１を、抗ＮＳ３ ｍＡｂ Ｃ１６又は抗Ｅ２ ｍＡｂ ＨＣ／ＴＣ２６を用いた免疫ペルオキシダーゼアッセイ又は免疫蛍光アッセイによる染色のために、２４穴プレートの２つのウェルに播種する。ＲＮＡの特異的感染性（インビトロ合成したＣＳＦＶ ＲＮＡに対して使用。ＲＮＡ１μｇあたりの感染単位（ＩＵ）として表される。）を、感染中心アッセイにおいて決定する。このようにして、エレクトロポレーションした細胞の１０分の１を、２ｍｌのＥＭＥＭ−ＨＳ中で希釈し、６穴プレートに播種して、連続希釈する。３７℃にて３日間のインキュベーション後、細胞を固定化し、陽性の細胞を、抗ＮＳ３ ｍＡｂ Ｃ１６又は抗Ｅ２ ｍＡｂ ＨＣ／ＴＣ２６を用いた免疫ペルオキシダーゼアッセイ又は免疫蛍光アッセイにより可視化させる。
【００６２】
ＣＳＦＶ−ＶＲＰの欠失変異体の特性決定
レプリコン自体の構築に加えて、所要の場合には、ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）を作製することも可能である。変異ＲＮＡを、エレクトロポレーションにより、ウイルスのＥ２又はＥｒｎｓタンパク質を安定して発現する「補完細胞系統」であるＳＫ−６細胞中に入れ、ＣＳＦＶウイルスレプリコン粒子（ＣＳＦＶ−ＶＲＰ）と呼ばれる、変異ＲＮＡがパッケージされたウイルス様粒子を作製する。ＣＳＦＶレプリコンが補完細胞中で安定していることを検証するために、ＣＳＦＶ−ＶＲＰゲノム（＝レプリコン）の各領域を、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、配列決定を行う。この目的のために、ＶＲＰを感染させたＳＫ−６細胞培養のＴｒｉｚｏｌ抽出（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、細胞質ＲＮＡを得る。ＲＴ−ＰＣＲは、Ｅｘｐａｎｄ逆転写酵素（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）及びＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行う。Ｅ２欠失変異体のために使用されるプライマーは、ｃＤＮＡ合成に対しては、ＺＲ４（ＣＳＦＶゲノムのヌクレオチド４１７８−４１４８）であり、ＰＣＲに対しては、ＭＬ５（ヌクレオチド２１９６−２２１３）／ＺＲ５（ヌクレオチド３８９２−３８６２）である。これらのプライマーは、Ｅ２遺伝子の隣接領域中に位置し、ＳＫ−６（補完）細胞中に含まれるＥ２とアニールするとは予想されない。Ｅｒｎｓ欠失変異体のために使用されるプライマーは、ｃＤＮＡ合成に対しては、ＰＲ１（ＣＳＦＶ Ａｌｆ／１８７ゲノムのヌクレオチド６４５４−６４３４）であり、ＰＣＲに対しては、ＭＬ１（ヌクレオチド９９２−１０２２）／ＭＲ３（ヌクレオチド１９５６−１９４０）である。後の２つのプライマーは、ウイルスゲノム上のＥｒｎｓ遺伝子の隣接領域に位置し、したがって、ＳＫ−６（補完）細胞中に含まれるＥｒｎｓＤＮＡとアニールするとは予想されない。増幅したＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動により特性決定する。
【００６３】
実施例４：ＣＳＦＶリーダープロテイナーゼＮｐｒｏがレプリコンの複製には必要とされないことの立証
Ｎｐｒｏがレプリコン、したがって、ウイルスの生存能力に必須でないことを確かめるために、変異ＣＳＦＶゲノム ｖＡ１８７−Ｕｂｉを構築し、この場合、Ｎｐｒｏ遺伝子は、プラスミドｐＴＭ３／ＨＣＶ／Ｕｂｉ−ＮＳ５Ｂから放出されたマウスユビキチン遺伝子と置換されている（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７２，７６８１−８４，１９９８）。感染性ｖＡ１８７−Ｕｂｉウイルスの作製のために、ｐＡ１８７−Ｕｂｉ ＤＮＡを、ＳｒｆＩを用いて線条化し、次いで、インビトロＲＮＡ転写、及び、ＲＮＡをブタＳＫ−６細胞中へリポフェクチンする。トランスフェクションの４８時間後、免疫ペルオキシダーゼアッセイにより、ウイルスエンベロープタンパク質Ｅ２の発現について、細胞を試験する。ウイルスＲＮＡの分析は、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲによる。
【００６４】
２つのさらなる変異体が作製されている：Ｎｐｒｏ遺伝子が、残基メチオニン及びグリシンと置換されている、ＣＳＦＶ ｖＡ１８７−ΔＮｐｒｏ；ｐＥｙ−３７ ｃＤＮＡクローン中のＮｐｒｏ遺伝子を欠失させることによる、ｖＡ１８７−ΔＮｐｒｏと類似する、ＣＳＦＶ ｖＥｙ−ΔＮｐｒｏ（Ｒｕｇｇｌｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７７，７６４５−５４，２００３）。任意のこれらのウイルスにおけるＮｐｒｏの置換は、ウイルスが複製するのを妨げない。ｖＡ１８７−Ｕｂｉウイルス（ｖＡ１８７−ΔＮｐｒｏ−Ｕｂｉ又はΔＮｐｒｏ−Ｕｂｉウイルスとも呼ばれる）は、非インターフェロン産生ＳＫ−６細胞を使用する場合、親ｖＡ１８７−１ウイルスの力価と同様の力価まで複製する。ΔＮｐｒｏウイルスは、インターフェロン産生ＰＫ−１５細胞中及びブタマクロファージ中でも複製する。これらの細胞においては、複製サイクル中、より長い誘導期が存在し、親ウイルスと比較して、１ｍｌあたり１．５〜２ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０低い力価が得られる。それにもかかわらず、ΔＮｐｒｏウイルスは、明らかに複製可能である。このより低い力価は、Ｉ型インターフェロンの誘導を調節し得ないことによる（以下実施例５参照）。
【００６５】
実施例５：細胞による抗ウイルス防御に対するＮｐｒｏ依存性の干渉に関して、ＣＳＦＶリーダープロテイナーゼＮｐｒｏを含む、及び、含まないレプリコンの特性決定
ｖＡ１８７−Ｕｂｉウイルス（ΔＮｐｒｏ−Ｕｂｉウイルスとも呼ばれる）は、ｖＡ１８７−ΔＮｐｒｏ及びｖＥｙ−ΔＮｐｒｏ（実施例４参照）と共に、細胞による抗ウイルス防御の調節におけるＮｐｒｏの役割を示すために使用されている（Ｒｕｇｇｌｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７７，７６４５−５４，２００３）。マクロファージは、偽感染させるか、又は、標準的なＣＳＦＶ若しくは変異ウイルスのいずれかにより感染させ、次に、インターフェロン（ＩＦＮ）誘導物質であるポリ（ＩＣ）を用いて細胞を刺激する。細胞は、ウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡを用いてエレクトロポレーションすることも可能である。感染させた細胞培養からの上清を、Ｍｘ／ＣＡＴレポーター遺伝子アッセイのいずれかにおいて、抗ウイルス活性について試験する。同じ結果が両アッセイ中で得られた。
【００６６】
標準的なＣＳＦＶは、抗ウイルス活性又はＩ型ＩＦＮ産生を誘導しない（図３Ａ；ｖＡ１８７−１）。ウイルスのＮｐｒｏ遺伝子が欠失している場合（ｖＡ１８７−ΔＮｐｒｏ）、又は、Ｎｐｒｏ遺伝子が位置１１２番（ｖＡ１８７−Ｎｐｒｏ（Ｃ１１２Ｒ））若しくは１３６番（ｖＡ１８７−Ｎｐｒｏ（Ｄｌ３６Ｎ））において変異している場合、今度は、ウイルスは、Ｉ型ＩＦＮ産生を誘導する（図３Ａ）。この所見は、Ｉ型ＩＦＮの誘導をもたらす細胞経路を調節するＮｐｒｏタンパク質の能力による（Ｒｕｇｇｌｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７７，７６４５−５４，２００３）。このことは、インタクトなＮｐｒｏタンパク質、又は、Ｎｐｒｏのアミノ酸位置１１２番におけるシステインからアルギニンへの置換（Ｎｐｒｏ（Ｃ１１２Ｒ））若しくは位置１３６番におけるアスパラギン酸からアスパラギンへの置換（Ｎｐｒｏ（Ｄ，３６Ｎ））を有する変異体をコードするプラスミドのトランスフェクションを利用することにより、確認されている。マクロファージを、ポリ（ＩＣ）を用いて刺激する場合、１ｍｌあたり４０ＵまでのＩ型ＩＦＮを検出することができる。マクロファージ中におけるＣＳＦＶ感染の存在は、このポリ（ＩＣ）によるＩＦＮの誘導により消失し得るが、ΔＮｐｒｏ及び変異Ｎｐｒｏウイルスは、ポリ（ＩＣ）によるＩ型ＩＦＮの誘導を干渉し得ない。同様に、細胞（例えば、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞）を、Ｎｐｒｏタンパク質をコードする構築物を用いてトランスフェクトした場合、ポリ（ＩＣ）によるＩ型ＩＦＮの誘導に対する阻害が生じる（図３Ｂ）。Ｎｐｒｏタンパク質の変異体（Ｎｐｒｏ（Ｃ１１２Ｒ）；（Ｎｐｒｏ（Ｄ１３６Ｎ））をコードする構築物を用いて細胞をトランスフェクトした場合、細胞は、Ｉ型ＩＦＮの産生に関してポリ（ＩＣ）に反応する能力を取り戻す（図３Ｂ）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染性ウイルスの形成に必要とされる１つ又はそれ以上の構造タンパク質に対する必須のコドンを欠如し、外来遺伝子を担持する、ペスチウイルスレプリコン。
【請求項２】
感染性ウイルスの形成に必要とされる１つ又はそれ以上の構造タンパク質に対する全てのコドンを欠如する、請求項１に記載のレプリコン。
【請求項３】
前記外来遺伝子が、Ｎｐｒｏ遺伝子内、又は、Ｎｐｒｏ遺伝子の３’末端に挿入される、請求項１又は２に記載のレプリコン。
【請求項４】
非構造タンパク質ＮＳ２に対するコドンを欠如する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のレプリコン。
【請求項５】
ＮＳ２及びＮＳ３をコードする遺伝子が、さらなるヌクレオチドによって物理的に分離されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のレプリコン。
【請求項６】
前記Ｎｐｒｏ遺伝子が、変異しているか又は欠失している、請求項１〜５のいずれか１項に記載のレプリコン。
【請求項７】
ヒト細胞中にトランスフェクトされた場合に、該ヒト細胞中で複製する能力を保持する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のレプリコン。
【請求項８】
前記ペスチウイルスがブタコレラウイルスである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のレプリコン。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のレプリコンを含んでなる微粒子送達ビヒクル。
【請求項１０】
ペスチウイルスの構造タンパク質からなる、請求項９に記載の微粒子送達ビヒクル。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のレプリコン又は請求項９若しくは１０に記載の微粒子送達ビヒクルを含んでなる医薬組成物。
【請求項１２】
ワクチンである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のレプリコン、又は、請求項９若しくは１０に記載の微粒子送達ビヒクルを投与することによる、遺伝子の欠如により引き起こされる疾患の治療方法であって、前記外来遺伝子が前記欠如する遺伝子である、前記治療方法。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のレプリコン、又は、請求項９若しくは１０に記載の微粒子送達ビヒクルを投与することによる、感染性物質により引き起こされる疾患の予防方法であって、前記外来遺伝子が、前記感染性物質又は疾患原因成分に対して免疫性を与える遺伝子産物をコードする、前記予防方法。
【請求項１】
感染性ウイルスの形成に必要とされる１つ又はそれ以上の構造タンパク質に対する必須のコドンを欠如し、外来遺伝子を担持する、ペスチウイルスレプリコン。
【請求項２】
感染性ウイルスの形成に必要とされる１つ又はそれ以上の構造タンパク質に対する全てのコドンを欠如する、請求項１に記載のレプリコン。
【請求項３】
前記外来遺伝子が、Ｎｐｒｏ遺伝子内、又は、Ｎｐｒｏ遺伝子の３’末端に挿入される、請求項１又は２に記載のレプリコン。
【請求項４】
非構造タンパク質ＮＳ２に対するコドンを欠如する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のレプリコン。
【請求項５】
ＮＳ２及びＮＳ３をコードする遺伝子が、さらなるヌクレオチドによって物理的に分離されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のレプリコン。
【請求項６】
前記Ｎｐｒｏ遺伝子が、変異しているか又は欠失している、請求項１〜５のいずれか１項に記載のレプリコン。
【請求項７】
ヒト細胞中にトランスフェクトされた場合に、該ヒト細胞中で複製する能力を保持する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のレプリコン。
【請求項８】
前記ペスチウイルスがブタコレラウイルスである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のレプリコン。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のレプリコンを含んでなる微粒子送達ビヒクル。
【請求項１０】
ペスチウイルスの構造タンパク質からなる、請求項９に記載の微粒子送達ビヒクル。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のレプリコン又は請求項９若しくは１０に記載の微粒子送達ビヒクルを含んでなる医薬組成物。
【請求項１２】
ワクチンである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のレプリコン、又は、請求項９若しくは１０に記載の微粒子送達ビヒクルを投与することによる、遺伝子の欠如により引き起こされる疾患の治療方法であって、前記外来遺伝子が前記欠如する遺伝子である、前記治療方法。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のレプリコン、又は、請求項９若しくは１０に記載の微粒子送達ビヒクルを投与することによる、感染性物質により引き起こされる疾患の予防方法であって、前記外来遺伝子が、前記感染性物質又は疾患原因成分に対して免疫性を与える遺伝子産物をコードする、前記予防方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１１−５２１６５４（Ｐ２０１１−５２１６５４Ａ）
【公表日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１２０１０（Ｐ２０１１−５１２０１０）
【出願日】平成２１年５月３０日（２００９．５．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００３８９２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４６８６７
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５１０３１９９６０）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月３０日（２００９．５．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００３８９２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４６８６７
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５１０３１９９６０）
【Ｆターム（参考）】
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