ＲＮＡの抽出方法
酸性溶液と、細胞やウィルスを破壊するための溶解を初めに行わずに全血を含む生物サンプルから核酸を遊離させることのできる固相結合材料の使用を含む、生物サンプルからのＲＮＡの迅速で簡便な抽出と単離のための方法と材料である。細胞やウィルスの溶解のための洗浄剤やカオトロピック物質は不要であり、使用されない。本発明の方法を用いて、ウィルス、バクテリア及びホ乳類のゲノムＲＮＡが単離される。本方法により単離されたＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲなどの下流のプロセスにおける使用に適している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体由来の材料からの核酸、特にリボ核酸の簡便な捕捉・抽出方法に有用な材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
医学研究、医療診断、薬剤探索に応用される現代分子生物学の方法論において、リボ核酸（ＲＮＡ）の研究が採用されることが増えてきている。ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、およびリボソーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）として存在する。ノーザンブロッティング、リボヌクレアーゼ防御法およびＲＴ−ＰＣＲといったいくつかの現代分子生物学の技法は、分析の前に、分解していない純粋なＲＮＡが単離されることを必要とする。特定のｍＲＮＡ配列の存在やｍＲＮＡの発現量の研究は一般的なものになった。ｍＲＮＡの分析、特にマイクロアレイを使ったものは分子生物学研究において非常に強力なツールである。サンプル中のｍＲＮＡ配列の量を測定することで、個々の遺伝子の正もしくは負の制御が測定される。ｍＲＮＡの量は外部刺激や疾病の状態の相関として評価することができる。例えば、ｐ５３ｍＲＮＡの量の変化は様々な細胞タイプにおけるガンと明確に関連付けられてきた。
【０００３】
加えて、ＨＩＶ、ＨＣＶ、西ナイル熱ウィルス、ウマ脳炎ウィルスおよびエボラウィルスを含む、ヒトの健康に多大な影響を与える多くのウィルスがＲＮＡゲノムを有する。体液や組織からウィルスＲＮＡを素早く、きれいに抽出できることはウィルス研究と感染病の診断と治療において重要である。
【０００４】
現在のＲＮＡ抽出法は、多様な技法の１つである細胞の破壊、即ち溶解する方法から始まり、ＲＮＡを溶液中に遊離させ、そして内在性ＲＮａｓｅによる分解からＲＮＡを保護する。溶解はＲＮＡを、ＤＮＡやタンパク質とともに遊離させるが、次の段階でＲＮＡはこれらから分離されなくてはならない。その後、ＲＮＡは溶解するよう処理されるか、または沈殿するよう処理される。細胞溶解、ＲＮＡの溶解およびＲＮａｓｅ阻害を同時に行うためにカオトロピックなグアニジウム塩を使用することは、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８，５２９４−５２９９（１９７９）に開示されている。他の方法では、低ｐＨ中でフェノール／クロロホルムにより抽出をすることにより、可溶化ＲＮＡをタンパク質とＤＮＡから分離する（Ｄ．Ｍ．Ｗａｌｌａｃｅ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１５，３３−４１（１９８７））。一般的に使用されるワンステップＲＮＡ単離法は、４Ｍのグアニジウム塩、酢酸ナトリウム（ｐＨ４）、フェノールおよびクロロホルム／イソアミルアルコールで連続的に細胞を処理することを含む。サンプルは遠心され、ＲＮＡはアルコールの添加により上層から沈殿する（Ｐ．Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６−１５９（１９８７））。米国特許４，８４３，１５５には、フェノールと酸性ｐＨのグアニジウム塩の安定した混合物が細胞に加えられる方法が記載されている。クロロホルムによる相分離の後、水性相中のＲＮＡはアルコールを加えての沈殿により回収される。
【０００５】
他の方法としては、熱したフェノールを細胞懸濁液に加えることによるアルコール沈殿（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２））、細胞を溶解、細胞質中のＲＮＡを遊離させるためのアニオン性または非イオン性界面活性剤の使用、およびバナジルリボ核酸複合体およびジエチルピロカーボネートなどのＲＮａｓｅ阻害剤の使用（Ｌ．Ｇ．Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ，“Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ”ａｎｄ“ＲＮＡ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ：Ｍｉｎｉ Ｍｅｔｈｏｄ”ｉｎ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１３０−１３８（１９９１））が挙げられる。
【０００６】
ガラスや他の固相に結合させることによる生物試料からのＤＮＡとＲＮＡの両方の単離方法は、米国特許５，２３４，８０９（Ｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ）に開示されている。血清や尿などの生物試料中に存在する細胞は、ＥＤＴＡと界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中のグアニジウムチオシアネートの高濃度（＞５Ｍ）溶液にさらすことで溶解される。ＤＮＡおよびＲＮＡと可逆的な複合体を形成する珪藻土もしくはシリカ粒子とインキュベーションすることにより、ＤＮＡおよびＲＮＡは生物試料から精製された。
【０００７】
Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ米国特許５，１５５，０１８には、ＤＮＡ、タンパク質、炭水化物や他の細胞の構成材料も含むことのできる、生物学的に活性のあるＲＮＡを生物試料から単離、精製するための手順が提供されている。ＲＮＡは、高濃度で酸性のカオトロピック塩からなる結合溶液の存在下において、生物試料を細かく分解されたガラスまたは珪藻土と接触させることにより単離される。これらの条件のもと、ＲＮＡは選択的にシリカ粒子材料と結合することが主張されているが、その後にＤＮＡを除去するため固体材料をエタノール塩溶液で処理することも開示されている。その後、他の研究者により、ＤＮＡによるコンタミネーションが起こることが確かめられた。粒子に結合したＲＮＡは、サンプル中に含まれる他の生体物質から容易に分離することができる。粒子に結合したＲＮＡは、非特異的に吸着した物質を除くために洗浄されることが好ましい。結合したＲＮＡは希釈した塩緩衝液による溶出で粒子から遊離され、十分に純粋で、生物学的に活性のあるＲＮＡが回収される。ＲＮＡの選択的な結合という主張には疑義があるが、溶出液中のＤＮＡを破壊するためにヌクレアーゼを加えることもまた開示されている。Ｋｕｒｏｉｔａ ｅｔ ａｌ．米国特許５，９９０，３０２には、サンプル、カオトロオープ、リチウム塩、酸性溶液、核酸キャリアーを混合することによるＧｉｌｌｅｓｐｉｒｅのＲＮＡ単離法の派生法が提供されている。Ｅｋｅｎｂｅｒｇ米国特許６，２１８，５３１にはＲＮＡをシリカ固相に結合させる前にクリアーな溶解液を形成するため、ＲＮＡと混入物質を含む溶液を希釈緩衝液と混合するという、もうひとつの発展型が提供されている。洗浄は、ＤＮＡとタンパク質の沈殿によって影響を受ける。希釈緩衝液は水であってもよいが、中性ｐＨのＳＳＣのような緩衝液や塩を含むものが好ましく、ＳＤＳのような洗浄剤を含むことがさらに好ましい。
【０００８】
１価のカチオン性界面活性剤の単量体が細胞を溶解するのと同時に、溶液からＲＮＡとＤＮＡを沈殿させることができることが米国特許５，０１０，１８３と５，９８５，５７２に記載されている。これらの特許文献中においてＲＮＡは初め不溶性にされる。’１８３特許の方法において、４０％尿素と他の添加剤を含む第四級アンモニウム界面活性剤が細胞懸濁液に加えられ、その混合物が遠心される。ペレットはエタノール中に再懸濁され、そこから核酸は塩を加えることにより沈殿する。
【０００９】
Ｍｉｃｈｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．米国特許６，３５５，７９２には、６．５より低いｐＨの緩衝液で液体サンプルを酸性化し、その酸性溶液を水酸基を有する無機酸化物材料と接触させ、核酸が結合した固体材料を液体から分離し、かつ、ｐＨが７．５〜１１、好ましくは８〜８．５のアルカリ溶液によって溶出することによる核酸の単離方法が開示されている。この酸性溶液は、イオン性洗浄剤、カオトロープを含まず、いずれのイオンも０．２Ｍ未満である。実施例は、捕捉前に核酸が溶液中に遊離していることを前提とする方法を使用することを反映している。
【００１０】
ＷＯ００／６６７８３と欧州特許１２０６５７１Ｂ１には、核酸を含むと思われるサンプルを７より低いｐＨの下、水溶性で弱塩基性のポリマーと接触させ、サンプル中に存在するすべての核酸が結合した弱塩基性のポリマーの水不溶性沈殿を形成し、その水不溶性沈殿をサンプルから分離し、沈殿物を塩基と接触させて溶液のｐＨを７よりも上げ、それにより核酸を弱塩基性のポリマーから遊離することによる、水溶性サンプル中の遊離した、細胞外の核酸を単離する方法が開示されている。該ポリマーは、酸性ｐＨではプロトン化されｐＨを上げると中和されるアミン基を含む。
【００１１】
Ｂａｃｋｕｓ ｅｔ ａｌ．米国特許５，５８２，９８８と欧州特許０７０７０７７Ｂ１には、７より低いｐＨの下、核酸を含むと思われる溶解液を、溶解液中の核酸すべてと結合して弱塩基性のポリマーの水不溶性沈殿を形成するのに十分な量の水溶性かつ弱塩基性のポリマーと接触させること、その水不溶性沈殿を溶解液から分離すること、また、その沈殿を塩基に接触させて溶液のｐＨを７よりも上げ、それにより前記核酸を前記弱塩基性のポリマーから遊離すること、という手順を含む溶解液からの核酸を得るための方法が開示されている。
【００１２】
Ｈｅａｔｈ米国特許５，９７３，１３７には、アニオン性洗浄剤、キレート剤、６より低いｐＨの緩衝液からなる細胞溶解試薬でサンプルを処理することによって、生物サンプルからほとんど分解されていないＲＮＡを単離するための方法が開示されている。アニオン性洗浄剤の役割は、タンパク質を変性させることであると言われているのに加えて、細胞を溶解し、そして／またはタンパク質と脂質を可溶化することであると言われている。全血からＲＮＡを単離するとき、赤血球細胞はＮＨ４Ｃｌ、ＮａＨＣＯ３およびＥＤＴＡを含む試薬によって初めに溶解され、白血球細胞は分離され、タンパク質−ＤＮＡ沈殿試薬の存在の下、溶解される。後者は代表的には高濃度の酢酸や塩酸などのナトリウム塩またはカリウム塩溶液である。最後の段階として、ＲＮＡを含む上清は低級アルコールの添加により沈殿させられる。酵母やグラム陽性バクテリアからのＲＮＡの単離は、核酸を遊離させるための調整として細胞を消化するために、細胞を溶解する酵素、グリセロール、塩化カルシウムの使用をさらに必要とする。
【００１３】
Ｃｏｌｌｉｓ米国特許５，９７３，１３８には、酸性溶液中における常磁性粒子の懸濁液に対しての核酸の可逆的な結合のための方法が開示されている。この方法で開示された粒子は、むき出しの鉄酸化物、鉄硫化物もしくは鉄塩化物であった。酸性溶液は粒子の鉄分の正への帯電を促進し、それにより、核酸の負に荷電したリン酸基への結合を増進すると言われている。関連する米国特許６，４３３，１６０には、酸性溶液がグリシンＨＣｌを含む、類似した方法が開示されている。
【００１４】
Ｂｈｉｋｈａｂｈａｉ米国特許６，４１０，２７４には、ａ）細胞の溶解、ｂ）二価金属イオンによる染色体ＤＮＡとＲＮＡの大部分の沈殿、ｃ）沈殿の除去、ｄ）アニオン交換樹脂による溶解液の精製（ｐＨ４〜６の酸性の緩衝液を使用し、続けてよりアルカリ性の緩衝液を使用）、第二のイオン交換樹脂によるプラスミドのさらなる精製、を含む、不溶性マトリックス上での分離によるプラスミドＤＮＡの精製方法が開示されている。
【００１５】
Ｃｒｏｓ ｅｔ ａｌ．米国特許６，７３７，２３５には、カチオン基を有する親水性で橋かけ架橋されたポリアクリルアミドポリマーを含む、もしくはそれに被覆された粒子を用いた核酸の単離方法が開示されている。カチオン基は、低ｐＨにおけるポリマー上のアミン基のプロトン化により形成される。核酸は低ｐＨで低イオン強度の緩衝液中で結合し、高イオン強度の緩衝液中で遊離する。ポリマーは、２５〜４５度の低い臨界溶解温度を有していなくてはならない。脱着は、アルカリ性ｐＨとより高い温度によっても促進される。
【００１６】
Ｓｉｍｍｓ米国特許６，８７５，８５７には、非イオン性界面活性剤ＩＧＥＰＡＬ、ＥＤＴＡ、アニオン性界面活性剤ＳＤＳおよび高濃度の２−メルカプトエタノールを含む試薬混合物を用いた、植物試料からのＲＮＡの単離方法とその試薬が開示されている。
【００１７】
Ｓｐｒｅｎｇｅｒ−Ｈａｕｓｓｅｌｓ米国特許７，００５，２６６には、サンプルをホモジェナイズし、その後にホモジェナイズされたサンプルを、ｐＨが２〜７で、１００ｍＭより高い塩濃度で、ポリビニルピロリジンなどのフェノール中和物質、必要に応じて洗浄剤およびキレート剤を含む溶液で処理して、溶解液を形成することによる、核酸処理酵素阻害剤（例えばｓｔｏｏｌ）を含むサンプルからの核酸の精製、安定化または単離のための方法が開示されている。この溶解液はその後従来のシリカ系の固相材料により処理される。
【００１８】
いくつかの特許と出願に、結合材上のアミン基のプロトン化状態を変化させる結合溶液と溶出溶液との間のｐＨの変化により調節される、結合材への核酸の可逆的な捕捉が開示されている。例えば、米国特許６，２７０，９７０、６，３１０，１９９、５，６５２，３４８、５，９４５，５２０、ＷＯ９６／０９１１６、ＷＯ９９／０２９７０３、欧州特許１２３４８３２Ａ３、１０３６０８２Ｂ１、米国出願公開２００１／００１８５１３、２００３／０００８３２０、２００３／００５４３９５がある。同様に、Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．米国特許６，４４７，７６４には、カチオン中でプロトン化された、橋かけ架橋されてないポリマー微細粒子に対する可逆的な結合、溶媒からのそれらの分離、アニオン性有機物の遊離のためのｐＨの上昇による粒子の脱プロトン化、による、核酸を含むアニオン性有機物の水性環境からの単離方法が開示されている。
【００１９】
Ｋａｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．米国特許５，６６５，５８２には、可逆的なポリマーの固体支持体への設置、可逆的なリンカーのポリマーへの接着、結合組成物による生物試料の可逆的なリンカーへの結合、からなる、生物試料の固体支持体への可逆的なアンカー方法が開示されている。該結合組成物は核酸、抗体、抗イディオタイプ抗体またはプロテインＡを含み、可逆的に生物試料を固体支持体にアンカーする。生物試料は核酸であってもよい。
【００２０】
Ｂｕｒｇｏｙｎｅ米国特許５，７５６，１２６には、遺伝子試料サンプルの保存のための乾燥固体媒体が開示されている。この媒体は、固体マトリックスと該マトリックスに吸着した混合物を含む。この混合物は、弱塩基、キレート剤、アニオン性洗浄剤を含む。
【００２１】
Ｆｏｍｏｖｓｋａｉａ ｅｔ ａｌ．米国特許６，７４６，８４１には、アニオン性界面活性剤で被覆された、細胞溶解用固体マトリックスを含む乾燥した基体を提供すること、サンプルを上記基体に適用させること、核酸を捕捉すること、を部分的に含む核酸の精製方法が開示されている。ＲＮＡの捕捉への使用は特に開示も例示もされていない。
【００２２】
Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．米国出願公開２００４００１４７０３には、第四級アンモニウム塩または第四級ホスホニウム塩化合物と、有機カルボン酸、アンモニウム硫酸塩または酸性ｐＨのリン酸塩などのプロトンドナーを含む混合物によるＲＮＡの安定化が開示されている。
【００２３】
ＧＢ ２４１９５９４Ａ１には、アミノ界面活性剤と場合により非イオン性界面活性剤によって核酸を安定化することが開示されている。
【００２４】
Ａｕｇｅｌｌｏ米国特許６，６０２，７１８、６，６１７，１７０、６，８２１，７８９、米国出願公開２００５／０１５３２９２には、遺伝子の発現誘導や核酸分解の抑制もしくは防止による、全血などの生物試料、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡを保存する方法が開示されている。遺伝子の発現誘導防止剤は、安定剤、酸性物質を含んでいてもよい。カチオン性洗浄剤は好ましい安定剤である。後者の試薬は細胞を溶解し、洗浄剤との複合体として核酸の沈殿を引き起こす。
【００２５】
米国特許６，９１６，６０８Ｂ２には、アルコールおよび／またはケトンをジメチルスルフォキシドとの混合物として含む核酸を安定化するための混合物と方法が開示されている。
【００２６】
米国特許６，２０４，３７５と６，５２８，６４１には、ｐＨ４〜８のアンモニウム硫酸塩などの塩溶液を細胞に加えることにより、細胞のＲＮＡ成分を安定化する方法が開示されている。塩溶液は、細胞を透過し、細胞のタンパク質を伴うＲＮＡの沈殿を引き起こし、ＲＮＡを核に近寄らせないようにして、分解を防ぐ。
【００２７】
上記のＲＮＡの単離方法の、多くの段階を含み煩わしいという性質が医療行為におけるＲＮＡの使用を面倒なものにしている。ＲＮＡの単離方法は、ＲＮＡをＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼにより分解される前に、細胞のタンパク質やＤＮＡから分離することの困難さに打ち勝つ必要がある。これらのヌクレアーゼは、保護されてないＲＮＡを素早く分解するのに十分な量の血中に存在する。従って、細胞からのＲＮＡの単離方法はＲＮａｓｅによる分解を防ぐことができるものでなくてはならない。本技術分野において、素早く、シンプルな、生物試料からのＲＮＡの抽出方法への要求は今も存在している。そのような方法は、ＲＮＡの加水分解と分解を最小にし、様々な分析や下流のプロセスにおいて使用することが出来る。
【００２８】
米国出願公開２００５／０１０６５７６、２００５／０１０６５７７、２００５／０１０６５８９、２００５／０１０６６０２、２００５／０１３６４７７、２００６／０２３４２５１には、生物試料からのＲＮＡを含む核酸の抽出のための方法、材料が開示されている。この方法は、細胞やウィルスの破砕のために独自なクラスの固体材料を使用し、化学的な溶解処理を必要としない。
【００２９】
発明の要約
ひとつの側面において、本発明は、酸性溶液と固相結合材料の使用を含む、生物サンプルからのＲＮＡの迅速で簡便な抽出と単離のための新規な方法を提供する。本発明の実施において使用される固相結合材料は、細胞やウィルスを破壊するために初めにいかなる予備的な溶解も行うことなく、生物サンプルから核酸を遊離させることができる。前記固相結合材料は、第四級アンモニウム基、第四級ホスホニウム基、第三級スルホニウム基を含んでいてもよい。
【００３０】
他の側面においては、本発明は、マトリックス部分と、第四級アンモニウム、第四級ホスホニウムおよび第三級スルホニウム基から選択されるオニウム基と、を含み、さらに前記マトリックス部と前記オニウム基とを介する切断可能なリンカーとを含む固相結合材料と酸性溶液の使用を含む、生物サンプルからのＲＮＡの抽出および／または精製のための方法を提供する。
【００３１】
発明の詳細な説明
定義
アルキル−１個以上の水素原子以外の置換基で置換されていてもよい、１〜２０個の炭素原子を含む、分岐した、直鎖状のまたは環状の炭化水素基。ここで使用される低級アルキルとは８個までの炭素原子を含むアルキル基のことを言う。
アラルキル−アリール基で置換されたアルキル基。
アリール−１個以上の水素以外の置換基で置換されていてもよい、１から５個の炭素環式芳香族環を含む、芳香族環含有基。
生物材料−全血、抗血液凝固処理された全血、血漿、血清、組織、細胞、細胞成分、ウィルスを含む。
細胞材料−無傷細胞または、動物、植物またはバクテリア由来の無傷細胞を含む組織を含む材料。細胞は無傷であっても、活発に代謝をしている細胞であっても、アポトーシスを起こしている細胞であっても、死んでいる細胞であってもよい。
細胞核酸成分−細胞材料中に見出される核酸であり、ゲノムＤＮＡやＲＮＡ、また、ウィルスやプラスミドを含む感染性物質からの核酸など他の核酸であってもよい。
磁性粒子−粒子、微粒子、またはビーズであって外部の磁界に反応するものである。粒子はそれ自身磁気を帯びていても、常磁性であっても、超常磁性であってもよい。超常磁性体または強磁性体材料を使用したとき、外部の磁石または磁界に引き寄せられることができる。粒子は、磁気に反応性があり、１以上の非磁気反応性層に囲まれている、固体の中心部分を有することができる。磁気反応部は互い違いに周りを取り巻く層であってもよく、または磁気反応部が非磁気反応中心部分の中に配された粒子であってもよい。
核酸−ポリヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡなどの合成ＤＮＡ類似体であってもよい。一本鎖の化合物、および、これら３つのタイプの鎖のうちのいずれの組み合わせの二本鎖の化合物もこの用語の範囲に含まれる。
遊離、溶出−溶液もしくは混合物との接触により、固相結合材料の表面または細孔に結合した材料の大部分を除去すること
ＲＮＡ−メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を含むが、これらに限定されるものではない。
サンプル−核酸を含んでいる、もしくは含むと考えられる液体。本発明の方法において使用されることのできる代表的なサンプルは、集められた血液標本において通常みられるような抗凝固処理されたものであってもよい血液、血漿、血清、尿、精液、唾液などの体液、細胞培養液、組織抽出物などを含む。他のタイプのサンプルとして、溶剤、海水、工業用水サンプル、食物サンプル、土壌や水などの環境サンプル、植物試料、真核生物、バクテリア、プラスミド、ウィルス、カビ、原核生物由来の細胞が含まれる。
固相（結合）材料−核酸分子を誘引することのできる表面を有する材料。材料は、粒子、微小粒子、ナノ粒子、繊維、ビーズ、メンブレン、フィルター、またはテストチューブやマイクロウェルなどの支持体といった形であってよい。
置換された−基上の１個以上の水素原子が、水素原子以外の置換基で置き換えられたことを指す。置換基について言及するときに、他に明確な示唆がないときは複数箇所での置換も存在しうることを意図していることに注意すべきである。
【００３２】
本発明は迅速で簡便な、生物サンプルからのＲＮＡを得るための方法に関する。本方法は、固相結合材料と、サンプルに含まれる核酸の供給源からＲＮＡが遊離してくる酸性溶液を用いる。上記固相結合材料は、細胞やウィルスを破壊するために初めにいかなる予備的な溶解も行うことなく、生物サンプルから直接ＲＮＡを遊離させることのできるものが選択される。固相結合材料の作用を介してＲＮＡが直接酸性環境中に遊離し、その後遊離したＲＮＡが酸性条件下、固相結合材料に迅速に捕捉されることにより、分解は最小限に抑えられる。さらに本発明者は、グアニジウム塩、高濃度カオトロープ、ＲＮａｓｅ阻害タンパク質または抗体などのＲＮａｓｅ不活性化物質または不活性化タンパク質の添加に頼ることなく、活性ＲＮａｓｅを含むサンプルからリボ核酸を回収することができることを見出した。
【００３３】
実際、本方法は、タンパク質−ＲＮＡ複合体、無傷細胞およびウィルスからＲＮＡを捕捉、抽出するのに有用である。核酸を含むいずれの生物サンプルからも、特には無傷細胞とウィルスから、本発明のプロセスに従ってＲＮＡを抽出することができる。一般的なこれらの材料として、バクテリア培養液またはペレット、血液、尿、細胞、体液例えば、尿、唾液、精液、ＣＳＦ、血液、血漿、血清、組織ホモジェネートなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の方法は、他のいずれの予備的な手順に供する必要なしに、生細胞、死細胞、アポトーシスを起こしている無傷細胞、組織、培養されたバクテリア、植物や動物の培養細胞系列を含むサンプルに適用可能である。特に、予備的な破壊、溶解は一切行う必要がない。懸濁液中の細胞、例えば生物の液体や細胞培養液からのＲＮＡの抽出は、例えば、細胞を低速遠心でペレットにして培地を廃棄することから始めることができる。本技術分野において公知である組織破壊法、例えば手動のホモジェナイザーやＷａｒｉｎｇ ｂｌｅｎｄｅｒや他の組織ホモジェナイザーなどの自動化されたものを用いたホモジェナイズにより、無傷組織や器官からＲＮＡを抽出することができる。ホモジェナイズされたものはチーズクロスなどの粗いフィルターに通されるか、または低速遠心されて大きい粒子状物質が除かれる。
【００３４】
本発明の方法は迅速であり、代表的にはたった数分しか要しない。重要なことに、本方法により得られたＲＮＡは、逆転写酵素の単独使用や、逆転写の後に続いてのポリメラーゼ連鎖反応増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮＡブロット分析やｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳など、医療や他の下流での使用に有用であるほどに十分に純粋なものである。有利なことに、本方法の使用の前に細胞を単離する必要が無く、簡便な装置のみが本方法の実施に必要である。本発明の方法に従ってサンプルを処理する前に、予備的な溶解やエタノール沈殿のステップは不要である。細胞やウィルスの溶解のための洗浄剤やカオトロープ物質は不要であり、使用されない。
【００３５】
本発明の一実施形態において、ＲＮＡを含む選択された生物サンプル、例えば細胞および／またはウィルスを含む液体は酸性溶液と簡単に混ぜ、混合物を形成する。サンプルと酸性溶液はたった数秒間混合物中で接触させるだけでよい。他の手順は必要ない。混合物の形成と同時に、または形成の後に、混合物は、細胞やウィルスを破壊するために初めにいかなる予備的な溶解も行うことなく、生物サンプルから直接ＲＮＡを遊離させることのできるものとして選択される固相結合材料と一緒にされる。固相材料である粒子の作用を介してＲＮＡが直接酸性環境中に遊離し、その後遊離したＲＮＡが酸性条件下、該粒子に迅速に捕捉されることにより、ＲＮＡの破壊は最小限に抑えられる。上清は除かれ、核酸を含む固相結合材料は、場合により１回以上溶液で洗浄される。所望により、その後固相結合材料は、ＲＮＡを分離するために溶出に供される。一実施形態において、アルカリ溶液が固相結合材料からＲＮＡを溶出するのに使用される。代表的には、本目的に望ましいアルカリの濃度は最低１０−４Ｍであり、好ましくは、１ｍＭから約１Ｍの間である。
【００３６】
他の実施形態において、本発明の方法は、必要であれば、アウリントリカルボン酸、ＤＴＴ、ＤＥＰＣなどのＲＮａｓｅ阻害剤を用いることができる。当業者はこの目的のために他のＲＮａｓｅ阻害剤を選択することもできる。
【００３７】
すべての手順は連続して単一の容器内や単一の支持体上で迅速に行うことができ、遠心機など特殊な装置は必要ない。本方法は連続的にまたは並列して多数のサンプルを処理するための自動化されたプラットフォームに適用可能である。すべての結合、洗浄ステップは、好ましくは短時間で行われ、好ましくは１分以内である。洗浄ステップは、好ましくは１０秒以内で行うことができる。溶出は１分を超えない時間で行われるのが好ましい。例えば、ＲＮＡを含む１００μＬのサンプルは１．５ｍＬ微小遠心チューブ内で１００μＬの酸性溶液と混合され、ボルテックスで簡単に攪拌される。酸性溶液中の磁性結合微小粒子がその後加えられ、混合物は３０秒ボルテックスされる。上清は、磁性ラック上で粒子から分離される。粒子は２００μＬの酸性溶液で２回洗浄され、２００μＬの水で２回洗浄される。洗浄された粒子はアルカリ溶出液中で１分間ボルテックスにより攪拌され、ＲＮＡが溶出される。
【００３８】
固相材料
一実施形態において、本発明のＲＮＡ抽出法は、素早くＲＮＡを結合させるための固相結合材料を使用し、それによりサンプル中の他の構成物質からのＲＮＡの分離を可能にする。固相結合材料は、細胞やウィルスを破壊するために初めにいかなる予備的な溶解も行うことなく、生物サンプルから直接核酸を遊離させることのできるものが選択される。本発明の方法中の核酸結合のための材料は、サイズ、形状、有孔性および機械的性状が明確に定められたマトリックスを含む。前記マトリックスは粒子、微小粒子、繊維、ビーズ、メンブレンや、テストチューブやマイクロウェルなどの他の支持体といった形状であってもよい。多数の特有の材料とそれらの調製法が本出願人の米国特許出願の出願公開２００５／０１０６５７６、２００５／０１０６５７７、２００５／０１０６５８９、２００５／０１０６６０２、２００５／０１３６４７７、２００６／０２３４２５１に記載されている。
【００３９】
一実施形態において、固相結合材料はさらにその表面もしくは表面近辺に、様々な長さの核酸分子の捕捉と結合を可能にする、共有結合により結合した核酸結合部分を含む。表面というのは、固相結合材料の外部周辺部だけでなく、固相結合材料内のアクセス可能なすべての多孔部分も意味する。
【００４０】
他の実施形態において、固相結合材料はさらにその表面もしくは表面近辺に、様々な長さの核酸分子の捕捉と結合を可能にする、非共有結合により結合した核酸結合部分を含む。非共有結合により結合した核酸結合部分は、反対に荷電した固体表面の残基に対する静電気的引力もしくは、表面との疎水性相互作用により、固体マトリックスと結合する。
【００４１】
共有結合または非共有結合により結合した核酸結合基を有するこれらのマトリックスの材料は、任意適当な物質とすることができる。好ましいマトリックスの材料は、シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマー、不溶性多糖および金属、金属酸化物、金属硫化物から選択される金属性材料、並びにシリカ、ガラス、合成ポリマーや不溶性多糖により被覆された磁性反応材料、から選択される。例示される材料は、細胞を破砕して核酸を誘引する役割を果たす、表面に共有結合した機能的官能基により被覆もしくは機能付与されたシリカベース材料を含む。表面が適当に機能付与された炭化水素ベース材料、並びにこの表面の機能性を有する重合体も例示に含まれる。核酸結合基として働く表面の機能的な官能基は、細胞構造の完全性を破壊することができ、固体支持体への核酸の誘引を引き起こすことのできるいずれの基でもよい。そのような官能基は、ヒドロキシル、シラノール、カルボキシル、アミノ、アンモニウム、第四級アンモニウム、第四級ホスホニウム塩、以下に記載される第三級スルホニウム塩タイプの材料を含むがこれらに限定はされない。中でも第四級アンモニウム、第四級ホスホニウムまたは第三級スルホニウム塩基を有する材料が好ましい。
【００４２】
様々なものに適用するために、固相材料は粒子の形状であることが好ましい。粒子は約５０μｍよりも小さいサイズであることが好ましく、約１０μｍより小さいことがより好ましい。微小な粒子はより速く溶液中に分散し、より大きい表面／体積率を有する。より大きな粒子とビーズもまた、重力沈殿や遠心分離が採用される方法においては有用である。２以上のサイズの異なる粒子の混合物は、いくつかの使用例においては有利となり得る。
【００４３】
さらに固相結合材料は、通常常磁性もしくは超磁性の微小粒子の形態である、磁性反応部分を含むことができる。該磁性反応部分は、磁界による誘引および操作を可能にする。そのような磁性微小粒子は一般的に、通常、吸着又は共有結合による結合層に囲まれて磁性部分が防護されている、磁性金属酸化物または金属硫化物のコアを含む。核酸結合基は、該層に共有結合により結合することができ、その結果、固相結合材料表面を覆う。磁性金属酸化物コアは、好ましくは鉄酸化物または鉄硫化物であり、鉄は２価でも３価でも両方であってもよい。有機ポリマー層内に取り囲まれた磁性粒子が、例えば、米国特許４，６５４，２６７、５，４１１，７３０、５，０９１，２０６、非特許文献Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，４０（１９９９），８１３７−８１４０、に開示されている。数種類の異なったタイプの殻を有する、被覆された磁性粒子が市販されている。この殻は、米国出願公開２００５／０１０６５７６、２００５／０１０６５７７、２００５／０１０６５８９、２００５／０１０６６０２、２００５／０１３６４７７、２００６／０２３４２５１に教示されているように、機能付与されている。
【００４４】
市販されている磁性シリカ又は磁性ポリマー粒子は、本発明において有用な磁性固相結合材料の調製の開始物質として使用可能である。表面にカルボキシル基を有する適当なタイプのポリマー粒子が、商品名ＳｅｒａＭａｇ（登録商標）（Ｓｅｒａｄｙｎ）、ＢｉｏＭａｇ（登録商標）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）として知られている。適当なタイプの磁性シリカ粒子が商品名ＭａｇｎｅＳｉｌ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）として知られている。表面にカルボキシル基またはアミノ基を有する磁性シリカ粒子はＣｈｅｍｉｃｅｌｌ ＧｍｂＨ（Ｂｅｒｌｉｎ）から入手可能である。
【００４５】
片方の末端にトリアルコキシシラン基を有するリンカー基は、金属性材料またはシリカやガラス被覆の磁性粒子など被覆された金属性材料の表面に接着可能である。トリアルコキシシラン化合物は、式Ｒ１−Ｓｉ（ＯＲ）３で表わされ、式中Ｒは低級アルキルであり、Ｒ１は直鎖、分岐鎖、環から選ばれる有機基であり、１から１００個の原子を含むものが好ましい。これら原子は好ましくは、Ｃ、Ｈ、Ｂ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｐ、ハロゲン、アルカリ金属、から選択される。代表的なＲ１基は３−アミノプロピル、２−シアノエチルおよび２−カルボキシエチルに加えて、以下でより詳細に説明される切断可能な残基を有する基である。好適な実施形態において、トリアルコキシシラン化合物は、切断可能な中央部と反応性の末端部を有し、末端部においては、反応性基は第三級アミン、第三級ホスフィンまたは有機スルフィドとの反応により一段階で第四級または第三級オニウム塩に変換可能である。
【００４６】
かかるリンカー基は、金属性粒子やガラス、シリカ被覆された金属性粒子の表面に、フッ素イオンを用いたプロセスにより導入可能であることが明らかにされてきた。反応は低級アルコール、トルエンなどの芳香族溶媒を含む、有機溶媒中で行うことができる。適当なフッ素源は、そのような有機溶媒に対して相当の溶解性を有し、フッ化セシウムとフッ化テトラアルキルアンモニウム塩が挙げられる。
【００４７】
本発明の方法において有用な固相結合材料中に含有される核酸結合（ＮＡＢ）基は、２つの作用を果たすことができる。ＮＡＢ基は様々な長さと塩基組成や塩基配列を有する核酸、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを誘引、結合する。また、ＮＡＢ基はある程度において、核酸を細胞の囲いから遊離させる働きをすることができる。核酸結合基として、例えば、カルボキシル、アミン、第三級または第四級オニウム基またはこれらのうち２以上の基が混合したもの、が挙げられる。アミン基はＮＨ２、アルキルアミンおよびジアルキルアミン基であってよい。好ましい核酸結合基として、第四級トリアルキルアンモニウム基（−ＮＲ３＋）を含む第三級または第四級オニウム基（-ＱＲ２＋またはＱＲ３＋）、トリアルキルホスホニウムまたはトリアリールホスホニウムまたはアルキル−、アリール−ホスホニウム基が混ざったものを含むホスホニウム基（−ＰＲ３＋）、および第三級スルホニウム基（−ＳＲ２＋）が挙げられる。固相結合材料はここで記載されている核酸結合基を２種類以上含有することができる。２種以上のサイズの粒子の混合物を使用することができる。ＮＡＢ基を有するかもしくは有さない、様々な他の固相結合材料と、上記固相結合材料の混合物も使用することができる。第三級、第四級オニウム基（ＱＲ２＋またはＱＲ３＋）であって、式中Ｒ基が４個以上の炭素原子のアルキル基を表わすものを有する固相材料は、核酸との結合において特に効果的であるが、１個の炭素原子のアルキル基もアリール基と同程度に有用である。そのような固相材料は、非常に強く結合核酸を保持し、本願発明の技術分野において既知の、溶出に用いられるほとんどの条件下では、核酸の除去や溶出は起きない。低、高両方のイオン強度の、既知の殆どの溶出条件は、結合核酸の除去には効果的ではない。ＤＥＡＥやＰＥＩ基を含む従来の陰イオン交換樹脂とは違い、第三級または第四級オニウム固相材料は、反応溶液のｐＨに関わらず正に荷電したままである。
【００４８】
好適な実施形態においては、選択的に切断可能な結合を介して核酸結合基がマトリックスに結合した固相結合材料が使用される。該結合を切断することにより、いかなる結合核酸も固相材料から効果的に引き離される。該結合は、特異的に切断可能な結合を切断するのが目的の核酸を破壊することのない、化学的な手段、酵素による手段、または光化学的な手段、もしくは他のいずれの手段によっても、切断することができる。そのような切断可能な固相材料は、上記で記載したマトリックスを含む固体支持部を含む。核酸の誘引と結合のための核酸結合（ＮＡＢ）部は、切断可能なリンカー部によって、固体支持部の表面に結合される。切断可能なリンカーを有する適当な材料は、米国特許出願公開２００５／０１０６５７６、２００５／０１０６５７７、２００５／０１０６５８９、２００５／０１０６６０２、２００５／０１３６４７７、２００６／０２３４２５１に記載されており、これらは引用文献とされている。
【００４９】
切断可能なリンカー部は好適には、直鎖、分岐鎖、環、から選択される有機基であり、１から１００個の原子を含む。該原子は好ましくは、Ｃ、Ｈ、Ｂ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｐ、ハロゲン、アルカリ金属から選択される。リンカー基の例として、加水分解により切断可能な基が挙げられる。カルボン酸エステル、カルボン酸無水物、チオエステル、カーボネートエステル、チオカーボネートエステル、ウレタン、イミド、スルホンアミド、スルホンイミド、スルホネートエステルも例として含まれる。好適実施形態において、切断可能な結合は水性のアルカリ溶液により処理される。ホスフィンやエタンチオール、メルカプトエタノール、ＤＴＴなどのチオールなど様々な試薬により切断される、ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合といった、還元的に切断を受ける基が、他のクラスのリンカー基の例として挙げられる。他の代表的な基として、ペルオキシド（Ｏ−Ｏ）結合を有する有機基が挙げられる。ペルオキシド結合は、チオール、アミンおよびホスフィンにより切断可能である。他の代表的な切断可能な基として、酵素により切断可能なリンカー基が挙げられる。例として、エステラーゼやハイドロラーゼにより切断されるエステル、プロテアーゼやペプチダーゼにより切断されるアミドやペプチド、グリコシダーゼにより切断されるグリコシド基が挙げられる。他の切断可能な基の代表例として、切断可能な１，２−ジオキセタン部分が挙げられる。そのような材料として、熱により分解し、または、化学的な試薬もしくは酵素試薬により断片化するジオキセタン部分が挙げられる。保護基を除去し、オキシアニオンを生成すると、ジオキセタン環の分解が促進される。断片化は、周知のプロセスに従って、Ｃ−Ｃ結合に加えて、ペルオキシドのＯ−Ｏ結合の切断により起こる。切断可能なジオキセタンは多数の特許文献、非特許文献に記載されている。代表的な例が、米国特許４，９５２，７０７、５，７０７，５５９、５，５７８，２５３、６，０３６，８９２、６，２２８，６５３、６，４６１，８７６に記載されている。
【００５０】
他の切断可能なリンカー基として、不安定な１，２−ジオキセタン部分に変換することができる電子豊富なＣ−Ｃ二重結合が挙げられる。Ｏ、Ｓ又はＮ原子による１つ以上の置換基が、二重結合上に結合する。一重項酸素と電子豊富な二重結合との反応により不安定な１，２−ジオキセタン環基を形成し、ジオキセタン環基は室温で速やかに断片化して２つのカルボニル断片を生成する。
【００５１】
切断可能なリンカー基を保持する他の基の固相材料は、米国特許６，８５８，７３３、６，８７２，８２８に記載されているように、切断可能な部分としてケテンジチオアセタールを有する。ケテンジチオアセタールは、ペルオキシダーゼと過酸化水素による酸化反応で二重結合が切断される。
【００５２】
切断可能な部分は、アクリダン環上に置換基を有する類似体も含めて、図示する構造をとることができる。図中、Ｒａ、ＲｂとＲｃはそれぞれ１から約５０個の、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ、ハロゲン原子から選ばれる非水素原子を含む有機基であり、ＲａとＲｂは結合して環を形成していてもよい。他の多くの切断可能な基は当業者にとり明白である。他の切断可能なリンカー基を有する固相材料のクラスとして、ニトロ置換芳香族エーテルやエステルなどの、光により切断可能なリンカー基を有するものが挙げられる。オルト−ニトロベンジルエステルは、紫外線による周知の反応によって切断される。
【００５３】
酸性溶液
本発明の方法で使用される酸性溶液は、通常、中性ｐＨ以下のｐＨを有するいずれの水溶液も包含する。溶液は、好ましくは１〜５のｐＨを有し、さらに好ましくは約２〜４のｐＨである。酸は有機でも、無機でもよい。塩酸、硫酸、過塩素酸などの無機酸は有用である。モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸およびアミノ酸を含む有機酸、及びそれらの塩を使用することができる。代表的な酸として、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、クエン酸、グリシンおよびアラニンが挙げられる。塩は、いずれの水溶性の対イオンも有することができ、好ましくはアルカリ金属、アルカリ土類イオンである。遷移金属塩を含む酸性溶液も本発明の実施に使用することができる。好ましい遷移金属として、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｚｎ塩を挙げることができる。
【００５４】
化学的な溶解によるＲＮＡの抽出のための他の方法とは違い、本方法の酸性溶液は、洗浄剤や、グアニジウム塩等のカオトロピック物質などの化学的な溶解試薬を含有しない。ＤＭＦ、ＤＭＳＯなどの、これら両方の能力の中で機能する有機溶媒も使用しない。他の溶性の添加物を加えず、固相結合材料と組合わせた酸性溶液は、サンプルにＲＮａｓｅが含まれてさえいれば、該サンプルから無傷のＲＮＡを十分に抽出することができる。
【００５５】
サンプルと酸性溶液は、サンプルおよび酸性溶液の混合物と固相とを一緒にするステップと同時に混ぜることができる。サンプルおよび酸性溶液の混合物と固相との混合は、固相を酸性溶液に加えることにより行われる。他の方法として、サンプルは先ず初めに酸性溶液と混ぜられ、混合物を形成し、その後固相と該混合物を一緒にする。
【００５６】
洗浄溶液
本発明の実施において有用な洗浄溶液は、使用するならば、結合ＲＮＡからそれ以外の構成物質を除くのを補助することができる。一実施形態において、洗浄溶液は、結合ステップで使われた酸性溶液と同様もしくはそれに類似したものとすることができる。おそらく残存ＲＮａｓｅ活性を取り除くために、酸性溶液で洗浄することが都合の良いということが明らかにされている。溶出前に酸を中和すべく、水や中性ｐＨの緩衝液でのさらなる洗浄を行うことができる。水と緩衝液は、ＲＮａｓｅ活性を有さないように調製や処理を施されなくてはならない。
【００５７】
溶出試薬
一実施形態において、結合ＲＮＡを溶液中に遊離させる試薬と固相とを接触させることにより、結合ＲＮＡは固相から溶出される。該溶液は、遊離されたＲＮＡを溶解し、十分に保護する必要がある。溶液中に溶出されたＲＮＡは下流の分子生物学のプロセスに適用可能なものである必要がある。他の実施形態において、固相結合材料から核酸を遊離する試薬は、固相結合材料にある切断可能なリンカー基の切断により、溶出されたＲＮＡを下流の分子生物学のプロセスに適用可能なものにしている。該試薬は、好ましくは、少なくとも１０−４Ｍの強アルカリの水溶液である。アルカリ金属水酸化物、アンモニウム水酸化物、テトラアルキルアンモニウム水酸化物、アルカリ金属カーボネートおよびアルカリ金属酸化物の、濃度が少なくとも１０−４Ｍの溶液が、切断された固相からＲＮＡを迅速に切断・溶出するのに効果的である。切断可能な基がジスルフィド（Ｓ−Ｓ）基であるとき、溶出／切断試薬は、例えば、エタンチオール、メルカプトエタノール、ＤＴＴなどのチオール等、ジスルフィド還元試薬を含有する。切断可能な基がペルオキシド（Ｏ−Ｏ）結合であるとき、溶出／切断試薬は、例えば、チオール、アミン、ホスフィンなどの還元剤を含有する。切断可能な基が酵素により切断されるものであるとき、溶出／切断試薬は適当な酵素を含有する。エステルはエステラーゼもしくはハイドロラーゼを必要とし、アミドもしくはペプチド結合はプロテアーゼまたはペプチダーゼを必要とし、グリコシド基はグリコシダーゼを必要とする。切断可能な基が１，２−ジオキセタン部分であるとき、該ジオキセタンは熱により切断され、溶出試薬は上記のアルカリ溶液であってよい。切断可能な基が誘発可能な１，２−ジオキセタン部分であるとき、溶出／切断試薬は、保護基を除去して不安定なオキシアニオンを生成するのを介して基の切断を誘導する、化学的もしくは酵素的な試薬を含有する。切断可能な基が不安定な１，２−ジオキセタンに変換可能な電子豊富なＣ−Ｃ二重結合であるとき、溶出／切断試薬は、光感受性色素などの１重項酸素発生源を含有する。そのような色素は、可視光と酸素分子と反応して１重項の活性化した酸素を生成することが当業者に知られており、そのような色素としては、ローズベンガル、エオシンＹ、アリザリンレッドＳ、コンゴレッドおよびオレンジＧ、フルオレセイン色素、ローダミン色素、エリスロシンＢ、クロロフィリン３ナトリウム塩、ヘミン塩、ヘマトポルフィリン、メチレンブルー、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン、フラーレンがある。
【００５８】
他の実施形態において、第四級オニウムＮＡＢ基を有する固相結合材料からＲＮＡを遊離するための試薬は、米国特許出願の出願公開２００５／０１０６５８９に開示された組成物から選択される。
【００５９】
溶出ステップは室温で行うことができるが、いずれの好都合な温度であってもよい。溶出温度は、本方法の核酸単離法の成否にとり重要ではない。周囲環境と同じ温度が好ましいが、温度を上げると溶出効率が上がる場合がある。
【００６０】
発明のキット
他の実施形態において、本発明の方法を実施するためのキットが提供される。本発明に従ってサンプルからリボ核酸を単離するためのキットは、いかなる予備的な溶解もせずに、生物サンプルから直接核酸を遊離させることのできるものとして選択された、少なくとも１つの固相結合材料と酸性溶液を含む。固相結合材料は、粒子、微小粒子、磁性粒子、繊維、ビーズ、メンブレン、テストチューブやマイクロウェルなどの他の支持体といった形態をとることができるマトリックスを含む。マトリックスは、共有結合または非共有結合により、場合によっては切断可能なリンカーを介して核酸結合部と結合される。
【００６１】
核酸結合部は、カルボキシル基、ＮＨ２基、アルキルアミン基、ジアルキルアミン基、トリアルキルアンモニウム基を含む第四級アンモニウム基、トリアルキルホスホニウム基を含む第四級ホスホニウム基、トリアリールホスホニウム、混合アルキル・アリールホスホニウム基、第三級スルホニウム基から選択される、１以上のタイプの基を含む。
【００６２】
本発明のキットの１つの要素を構成する酸性溶液は、通常、中性以下のｐＨの水溶液のいずれをも含む。好ましくは溶液は１〜５のｐＨを有し、さらに好ましくは約２〜４である。酸は無機であっても有機であってもよい。塩酸、硫酸、過塩素酸などの無機酸は有用である。モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、アミノ酸を含む有機酸及びそれらの塩も使用することができる。代表的な酸として、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、クエン酸、グリシン、アラニンが挙げられる。塩は、いずれの水溶性の対イオンも有することができ、好ましくはアルカリ金属、アルカリ土類金属である。遷移金属塩を含む酸性溶液も本発明の実施に使用することができる。好ましい遷移金属として、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｏ、ＣｕおよびＺｎ塩を挙げることができる。
【００６３】
キットはさらに溶出試薬と、１以上の任意の洗浄緩衝液と、従来のものと同様のキットの他の構成物、例えば使用説明書、手順、緩衝液、希釈液、を含んでいてもよい。溶出試薬は、少なくとも１０−４Ｍ、好ましくは約１ｍＭ〜約１Ｍからの濃度のアルカリ金属水酸化物溶液またはアンモニウム水酸化物溶液などの強アルカリ水溶液、エタンチオール、メルカプトエタノールまたはＤＴＴを含むチオールなどのジスルフィド還元剤、チオール、アミンまたはホスフィンなどの過酸化物還元剤、エステラーゼ、ハイドロラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、グリコシダーゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素、から選択することができる。固相結合材料が電子豊富なアルケン基などの、１重項酸素発生源との反応により切断可能なリンカーを含む実施形態においては、キットに、上述の光感受性色素を含めることができる。
【実施例】
【００６４】
実施例１ ＲＮＡの単離に有用な固相材料
トリブチルホスホニウムＮＡＢ基と切断可能なアリルチオエステル結合により、機能付与された磁性粒子の合成
ａ）磁鉄鉱の調製。５Ｌのフラスコ内で、３Ｌの水（ｔｙｐｅ１）中にアルゴンガスを１時間注入した。アルゴン雰囲気下、濃縮されたＮＨ４ＯＨ（２８％，１８０ｍＬ）を加えた。１Ｍ ＨＣｌ中の２Ｍ ＦｅＣｌ２ ５０ｍＬと、１Ｍ ＨＣｌ中の１Ｍ ＦｅＣｌ３ ２００ｍＬとの混合物を、漏斗により約１時間以上かけて加えた。固体を、５００〜６００ｍＬを外部にディスク状の磁石をつけたフラスコに注ぎ、各回毎にデカントで上清を廃棄することにより２つのフラスコに集めた。固体を、５００〜６００ｍＬの水（ｔｙｐｅ１）の中で超音波により分散させ、その後磁石で引き寄せて、上清を廃棄することにより洗浄した。上清のｐＨが約８．５以下になるまでこのプロセスを繰り返した。２つのフラスコの内容物を一緒にし、磁鉄鉱を合計約５００ｍＬ中に貯蔵した。
ｂ）５００ｍＬフラスコに３−メチルアミノプロピルトリメチルシラン（１４９．８ｇ）を加え、アルゴンを除いた。氷浴中にフラスコを設置した後、アクリロイロキシトリメチルシラン（１１９．６ｇ）をシリンジを通してゆっくりと加えた。反応液を５分間攪拌し、氷浴を除き、攪拌を２時間続けた。生成物をさらなる精製をすることなく使用した。
ｃ）磁鉄鉱の被覆。５．０ｇの磁鉄鉱を含有するステップａ）からの磁鉄鉱スラリーを１４０ｍＬの水（ｔｙｐｅ１）で希釈し、混合物を超音波処理した。エタノール（１．２５Ｌ）を１５分後に加えた。濃縮されたＮＨ４ＯＨ（２８％，１８０ｍＬ）を３０〜４５分後に加えた。エタノールに溶解した、ステップｂ）からの１．５ｇのシリルエステルと１３．５ｇのＳｉ（ＯＥｔ）４を三回に分けて９０分以上かけて反応液に加えた。２０〜３０ｍＬのエタノールに溶解した３．７５ｇのシリルエステル化合物をその後加え、混合物を攪拌し、９０分間超音波処理した。攪拌は一晩続けた。混合物は２個の１Ｌフラスコに５００ｍＬずつ移し、粒子は磁気によって分離した。固体は２５０ｍＬメタノールで４回、２５０ｍＬの水（ｔｙｐｅ１）で２回、水（ｔｙｐｅ１）で希釈したｐＨ１のＨＣｌ ２５０ｍＬで１回（混合物を磁石に接触させる前に１０分間）、２５０ｍＬの水（ｔｙｐｅ１）で４回、２５０ｍＬのメタノールで４回、次いで２５０ｍＬのアセトンで２回、連続的に洗浄した。固体は一晩空気乾燥した。このステップの間にシリルエステルの加水分解が起こり、カルボン酸基が生成した。
ｄ）前ステップで得られた、カルボン酸で機能付与された磁性粒子（１．０ｇ）を、３０ｍＬの塩化チオニル中に入れ、４時間還流した。過剰の塩化チオニルを磁性固体からデカントした。粒子をＣＨ２Ｃｌ２で数回洗浄し、次のステップに回した。
ｅ）５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に懸濁された、酸性の塩化物イオンで機能付与された粒子を０．２２ｇの１，４−ベンゼンジチオールと０．５２ｍＬのジイソプロピルエチルアミンで処理した。混合物を５分間超音波処理し、オービタルシェイカーで一晩振盪した。固体は磁気による分離を利用して、ＣＨ２Ｃｌ２、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ３ＯＨ、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２で連続的に洗浄した。固体を一晩空気乾燥した。
ｆ）これまでのステップの粒子（約０．９ｇ）と２５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２の混合物を０．８１ｇのトリブチルホスフィンで処理した。混合物を５分間超音波処理し、オービタルシェイカーで一晩振盪した。固体は磁気による分離を利用して、ＣＨ２Ｃｌ２、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ３ＯＨ、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２で連続的に洗浄した。固体は一晩空気乾燥した。
ｇ）これまでのステップの粒子 （約０．８ｇ）と２５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２の混合物を０．２５ｇの４−塩化クロロメチルベンゾイルと０．５２ｍＬのジイソプロピルエチルアミンで処理した。混合物を５分間超音波処理し、オービタルシェイカーで一晩振盪した。固体はＣＨ２Ｃｌ２、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ３ＯＨ、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２で連続的に洗浄した。固体を集めて、一晩空気乾燥した。
ｈ）これまでのステップの粒子（約０．７ｇ）と２５ｍＬｌのＣＨ２Ｃｌ２の混合物を０．４１ｇのトリブチルホスフィンで処理した。混合物を５分間超音波処理し、オービタルシェイカーで計７日間振盪した。固体は磁気による分離を利用して、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ３ＯＨで洗浄した。固体を集めて、乾燥した。
【００６５】
実施例２ より大きな粒子サイズの固相材料
トリブチルホスホニウムＮＡＢと切断可能なアリールチオエステル結合により機能付与された磁性粒子の合成
ａ）５００ｍＬフラスコに３−メチルアミノプロピルトリメトキシシラン（１４９．８ｇ）を入れ、アルゴンでパージした。フラスコを氷浴に設置した後、シリンジを介してゆっくりとアクリロイロキシトリメチルシラン（１１９．６ｇ）を加えた。反応液を５分間攪拌し、氷浴を除き、更に攪拌を２時間続けた。生成物はそれ以上精製することなく使用した。
ｂ）市販の磁鉄鉱（Ｓｔｒｅｍ ｃａｔ．Ｎｏ９３−２６１６ １−５μｍ）５．０ｇを１４０ｍＬの水（ｔｙｐｅ１）と１．２５Ｌのエタノールで希釈した。濃縮したＮＨ４ＯＨ（２８％，１７０ｍＬ）を３０〜４５分後に加えた。エタノールに溶解した、ステップｂ）からの１．５ｇのシリルエステルと１３．５ｇのＳｉ（ＯＥｔ）４を三回に分けて９０分以上かけて反応液に加えた。２０〜３０ｍＬのエタノールに溶解した３．７５ｇのシリルエステル化合物をその後加え、混合物を攪拌し、９０分間超音波処理した。攪拌は一晩続けた。混合物は２個の１Ｌフラスコに５００ｍＬずつ移し、粒子は磁気によって分離した。固体は２５０ｍＬメタノールで４回、２５０ｍＬの水（ｔｙｐｅ１）で２回、水（ｔｙｐｅ１）で希釈したｐＨ１のＨＣｌ ２５０ｍＬで１回（混合物を磁石に接触させる前に１０分間）、２５０ｍＬの水（ｔｙｐｅ１）で４回、２５０ｍＬのメタノールで４回、次いで２５０ｍＬのアセトンで２回、連続的に洗浄した。固体は一晩空気乾燥した。このステップの間にシリルエステルの加水分解が起こり、カルボン酸基が生成した。
ｄ）前ステップで得られた、カルボン酸で機能付与された磁性粒子（１．０ｇ）を、３０ｍＬの塩化チオニル中に入れ、４時間還流した。過剰の塩化チオニルを磁性固体からデカントした。粒子をＣＨ２ＣＬ２で数回洗浄し、次のステップに回した。
ｅ）５０ｍＬのＣＨ２ＣＬ２に懸濁された、酸性の塩化物イオンで機能付与された粒子を０．２２ｇの１，４−ベンゼンジチオールと０．５２ｍＬのジイソプロピルエチルアミンで処理した。混合物を５分間超音波処理し、オービタルシェイカーで一晩振盪した。固体は磁気による分離を利用して、ＣＨ２Ｃｌ２、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ３ＯＨ、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２で連続的に洗浄した。固体を一晩空気乾燥した。
ｆ）これまでのステップの粒子（約０．９ｇ）と２５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２の混合物を０．８１ｇのトリブチルホスフィンで処理した。混合物を５分間超音波処理し、オービタルシェイカーで一晩振盪した。固体は磁気による分離を利用して、ＣＨ２Ｃｌ２、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ３ＯＨ、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２で連続的に洗浄した。固体は一晩空気乾燥した。
ｇ）これまでのステップの粒子（約０．８ｇ）と２５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２の混合物を０．２５ｇの塩化４−クロロメチルベンゾイルと０．５２ｍＬのジイソプロピルエチルアミンで処理した。混合物を５分間超音波処理し、オービタルシェイカーで一晩振盪した。固体は１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ３ＯＨ、で連続的に洗浄した。固体を集めて、一晩空気乾燥した。
ｈ）これまでのステップの粒子（約０．７ｇ）と２５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２の混合物を０．４１ｇのトリブチルホスフィンで処理した。混合物を５分間超音波処理し、オービタルシェイカーで計７日間振盪した。固体は磁気による分離を利用して、ＣＨ２Ｃｌ２、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ３ＯＨ、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２で連続して洗浄した。固体を集めて、乾燥した。
【００６６】
実施例３ 機能付与した磁性ポリマーの合成
２５ｍｇの固体を含む、ビーズ（Ｄｙｎａｌ ｍａｇｎｅｔｉｃ ＣＯＯＨ ビーズ，Ｌｏｔ Ｎｏ．Ｇ３６７１０）の一部を磁石を用いてデカントした。ビーズをその後、１ｍＬの水で３回、１ｍＬのＣＨ３ＣＮで３回洗い、４時間乾燥した。ビーズを１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に懸濁し、２８．８ｍｇのＥＤＣを加えて３０分間振盪した。１，４−ベンゼンジチオール（３０ｍｇ）を混合物に加えた。チューブを１分間超音波処理し、一晩振盪した。上清を除き、ビーズを磁石を利用して、１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回、１ｍＬの１：１ ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２で１回、１ｍＬのＭｅＯＨで４回、１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回洗浄した。
ビーズを１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に懸濁し、１４０μＬのトリブチルホスフィンを加えた。反応液を１分間ボルテックスし、計３日間振盪した。磁石の上に置きながら溶媒をデカントした。ビーズは磁気を用いて、１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回、１ｍＬの１：１ ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２で１回、１ｍＬのＭｅＯＨで４回、１ｍＬの１：１ ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２で１回、１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回洗浄した。
１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の、これまでのステップの粒子の混合物（約２５ｍｇ）を２ｍｇの塩化４−クロロメチルベンゾイルと５２μＬのジイソプロピルエチルアミンで処理した。混合物を１０秒ボルテックスし、５分間超音波処理し、オービタルシェイカーで一晩振盪した。固体を磁石による分離を利用して、１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回、１ｍＬの１：１ ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２で１回、１ｍＬのＭｅＯＨで４回、１ｍＬの１：１ ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２で１回、１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回、連続的に洗浄した。
これまでのステップの粒子の混合物（２５ｍｇ）と１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２を３０ｍｇのトリブチルホスフィンで処理した。混合物を２分間超音波処理し、オービタルシェイカーで計６日間振盪した。固体は磁石による分離を利用して、１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回、１ｍＬのＭｅＯＨで３回、１ｍＬの水で２回、連続的に洗浄した。１ｍＬの水を加えて、ビーズ（２５ｍｇ／ｍＬ）のストックソリューションとした。
【００６７】
実施例４ 機能付与した磁性ポリマーの合成
２×０．５３５ｍＬのＳｅｒａ−Ｍａｇ（登録商標）磁性カルボキシレート修飾微小粒子の懸濁液（Ｓｅｒａｄｙｎ）（合計５０ｍｇの粒子を含む）から磁性粒子を磁気を用いて集め、上清をデカントした。次に、ビーズを１ｍＬの水で３回、１ｍＬのＣＨ３ＣＮで３回、１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で３回洗浄した。ビーズを３．６ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に懸濁し、６０ｍｇのＥＤＣを加えて３０分間振盪した。
リンカーの調製：１，４−ベンゼンジチオール（１１．９７ｇ）を３００ｍＬに溶解し、溶液を−７８℃に冷却した。８．８６ｇの４−クロロメチルベンゾイルクロライドと３．８ｍＬのピリジンを１００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解した溶液を１時間以上かけて滴下した。反応溶液を室温まで暖め、一晩放置した。検査の後、１ｇの不純物を含んだ固体生成物を洗浄して２００ｍｇの純粋な生成物を得た。ろ過クロマトグラフィーによって追加分を単離することができた。
リンカー（６０ｍｇ）の４００μＬのＤＭＦ溶液を混合物に加えた。チューブを１分間超音波処理し、一晩振盪した。ビーズを２５ｍｇずつに分けてその後の処理を行った。上清を除き、ビーズを磁気を用いながら、１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回、１ｍＬの１：１ ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２で１回、１ｍＬのＭｅＯＨで４回、１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回洗浄した。
粒子は１０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で懸濁し、７５μＬのトリブチルホスフィンを加えた。反応混合物を１分間ボルテックスし、計７日間振盪した。ビーズを２５ｍｇずつに分けてその後の処理を行った。磁石の上に置きながら、溶媒をデカントした。ビーズは磁気を用いながら、１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で３回、１ｍＬの１：１ ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２で１回、１ｍＬのＭｅＯＨで４回、１ｍＬの水で２回洗浄した。１ｍＬの水を加えて、ビーズ（２５ｍｇ／ｍＬ）のストックソリューションとした。
【００６８】
実施例５ ＲＮＡの抽出に有用な酸性溶液
ＲＮＡの回収における本方法の有用性を示し、いくつかの条件と試薬の相対的な効率性を評価するために、簡単な試験システムを用いた。１００μＬの試験溶液と１００μＬのウシ胎児血清（ＦＢＳ）とを混合した。１μｇ／μＬのルシフェラーゼＲＮＡ２μＬを加え、混合物を１分間ボルテックスにより混合した。１００μＬの試験溶液に入った実施例１の粒子２ｍｇの懸濁液と該混合物とを一緒にし、３０秒間ボルテックスにより混合した。磁性ラック上で粒子から液体を除き、粒子は、２００μＬの試験溶液で２回、２００μＬの０．１％ ＤＥＰＣ処理水で２回、連続的に洗浄した。５０ｍＭのＮａＯＨ ５０μＬと該粒子とを一緒にし、１分間ボルテックスにより混合し、溶出液を除くことにより、ＲＮＡを抽出した。初めの結合反応からの上清は、溶液から除かれ粒子に結合したＲＮＡの量を決定するため、エチジウム染色ゲルと、蛍光染色により分析した。溶出液は、本方法により抽出されたＲＮＡの量と質を決定するためエチジウム染色ゲルと蛍光染色により分析した。下記の溶液の使用によりＲＮＡの定量的結合と、多量の結合ＲＮＡの溶出が得られた。
試験溶液 ｐＨ 試験溶液 ｐＨ
クエン酸ナトリウム０．３Ｍ ４．０ グリシン ０．３Ｍ ３．０
クエン酸ナトリウム０．３Ｍ ３．５ グリシン ０．３Ｍ ２．５
クエン酸ナトリウム０．３Ｍ ３．０ グリシン ０．０５Ｍ ２．５
クエン酸ナトリウム０．０５Ｍ ３．０ グルタミン酸ナトリウム０．３Ｍ ４．０
酢酸カリウム ０．３Ｍ ４．０ グルタミン酸ナトリウム０．３Ｍ ３．２
酢酸カリウム ０．０５Ｍ ４．０ コハク酸ナトリウム ０．３Ｍ ４．０
酢酸カリウム ０．３Ｍ ３．７ コハク酸ナトリウム ０．３Ｍ ３．８
酢酸ナトリウム ０．３Ｍ ４．０
【００６９】
実施例６ 大腸菌培養液からのＲＮＡの抽出
培地中で生育している大腸菌からのＲＮＡ回収における本方法の有用性を示し、いくつかの条件と試薬の相対的な効率性を評価するために簡単な試験システムを用いた。
２００μＬの大腸菌培養液をペレットにし、培地を除いた。ペレットを２００μＬの試験溶液及び２ｍｇの実施例１の粒子と一緒にし、３０秒間ボルテックスして混合した。磁性ラック上で粒子から液体を除き、粒子を２００μＬの洗浄溶液で２回、２００μＬの０．１％ＤＥＰＣ処理水で２回洗浄した。粒子を５０ｍＭ ＮａＯＨおよび２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．８の溶液５０μＬと混合し、１分間ボルテックス混合し、液体を除くことにより、ＲＮＡを単離した。初めの結合反応からの上清は、溶液から除かれ粒子に結合したＲＮＡの量を決定するため、エチジウム染色ゲルと、蛍光染色により分析した。溶出液は、本方法により抽出されたＲＮＡの量と質を決定するためエチジウム染色ゲルと蛍光染色により分析した。下記の溶液の使用により多量の無傷ＲＮＡを回収することができた。一方、ペレットの結合と粒子の洗浄を０．１％ ＤＥＰＣ処理水のもとで行なったときは、分解したＲＮＡしか取り出せなかった。
試験溶液 洗浄溶液
酢酸 ０．０５Ｍ クエン酸ナトリウム ０．３Ｍ ｐＨ ３
酢酸 ０．１Ｍ クエン酸ナトリウム ０．３Ｍ ｐＨ ３
酢酸 ０．２Ｍ クエン酸ナトリウム ０．３Ｍ ｐＨ ３
トリフルオロ酢酸 ０．０５Ｍ トリフルオロ酢酸 ０．０５Ｍ
トリフルオロ酢酸 ０．１Ｍ トリフルオロ酢酸 ０．１Ｍ
トリフルオロ酢酸 ０．２Ｍ トリフルオロ酢酸 ０．２Ｍ
【００７０】
実施例７ 大腸菌培養液からのＲＮＡ抽出のための追加の条件
下記の試験酸性溶液を用いて、実施例６の方法に従って大腸菌からの単離を行なっても、電気泳動ゲルのパターンで裏付けられるように無傷のＲＮＡが得られた。
試験溶液
酢酸亜鉛 ０．０５Ｍ＋０．１Ｍ 酢酸アンモニウム ｐＨ４．０
メチルトリブチルホスホニウム メトスルフェート ０．１Ｍ−１Ｍ
クエン酸ナトリウム０．０５Ｍ ｐＨ３
【００７１】
実施例８ Ａｒｍｏｒｅｄ ＲＮＡからのＲＮＡの抽出
Ａｒｍｏｒｅｄ ＲＮＡ（登録商標）（Ａｍｂｉｏｎ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）はタンパク質で被覆されたｓｓＲＮＡであり、擬似的なウィルス粒子に相当する。ｇａｇ領域からの配列とウィルス被覆タンパク質を含む、ＨＩＶ−Ｂ配列のＡｒｍｏｒｅｄ ＲＮＡを、本発明方法が複雑なサンプルからＲＮＡを単離できるかを試すために使用した。
血漿中のＡｒｍｏｒｅｄ ＲＮＡからＲＮＡを抽出する代表的な方法は下記の通りである。５μＬのＡｒｍｏｒｅｄ ＲＮＡ（５００００コピーを含有する）と１００μＬのＥＤＴＡ抗凝固処理血漿（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．，Ｋｅｒｒｖｉｌｌｅ）からなる１０５μＬの溶液を１００μＬの試験溶液（例えば、５０ｍＭ酢酸カリウム、ｐＨ４．０）と混ぜ、ボルテックスで簡単に混合した。１分後、混合物を５０ｍＭ、ｐＨ４．０の酢酸カリウム１００μＬ中の実施例１の粒子２ｍｇと一緒にし、スラリーを３０秒間ボルテックスにより混合した。磁性ラック上で粒子を分離し、２００μＬの酢酸カリウム５０ｍＭ、ｐＨ４．０で２回、２００μＬの０．１％ＤＥＰＣ処理水で２回洗浄した。粒子を５０μＬの５０ｍＭ ＮａＯＨと１分間ボルテックス混合し、溶液を除くことにより、ＲＮＡを溶出した。１０５μＬの血漿／Ａｒｍｏｒｅｄ ＲＮＡを、試験溶液の代わりに２００μＬの０．１％ＤＥＰＣ処理水及び２ｍｇの粒子と混ぜたものをコントロールとし、比較例とした。
ＲＮＡ含有溶出液は、ｇａｇ遺伝子断片を増幅するためのプライマーセットを用いてＲＴ−ＰＣＲにかけた。増幅反応と検出は、ｉＣｙｃｌｅｒ 装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎを含むｉＳｃｒｉｐｔ Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により行なった。
下記試験溶液が、水のコントロールより有意に低いＣＴ値により裏付けられる、増幅可能なＲＮＡの回収を可能にした。
試験溶液
酢酸カリウム ０．３Ｍ ｐＨ４．０
酢酸カリウム ０．０５Ｍ ｐＨ４．０
酢酸 ０．０５Ｍ
酢酸 ０．２Ｍ
トリフルオロ酢酸 ０．０５Ｍ
ピリジニウムＨＣｌ ０．０５Ｍ
塩酸 ０．０２５Ｍ
テトラブチルホスホニウム塩酸塩 ０．０５Ｍ
酢酸カリウム ０．０５Ｍ ＋ 酢酸 ０．０５Ｍ
酢酸亜鉛 ０．０５Ｍ ｐＨ４．０
酢酸カリウム ０．０５Ｍ，ｐＨ４．０＋トリフルオロ酢酸 ０．０５Ｍ
５０：５０ ｐＨ １．８
７０：３０ ｐＨ ２．１
８０：２０ ｐＨ ２．５
酢酸亜鉛 ０．０５Ｍ，ｐＨ４．０＋トリフルオロ酢酸 ０．０５Ｍ（８０：２０）
酢酸マグネシウム ０．０５Ｍ ｐＨ４．０
酢酸アンモニウム ０．０５Ｍ
酢酸テトラブチルアンモニウム ０．０５Ｍ
酢酸テトラエチルアンモニウム ０．０５Ｍ
酢酸亜鉛 ０．０５Ｍ，ｐＨ４．０＋トリフルオロ酢酸（ｐＨ２．０，２．５，３．０，３．５）
酢酸亜鉛 ０．０５Ｍ＋グリシン ０．０５Ｍ ｐＨ３．３
酢酸亜鉛 ０．０５Ｍ＋クエン酸ナトリウム ０．０５Ｍ ｐＨ３．３
酢酸亜鉛 ０．０５Ｍ＋クエン酸ナトリウム ０．０５Ｍ ｐＨ４．２
塩化亜鉛 ０．０５Ｍ＋グリシン ０．０５Ｍ ｐＨ２．７５
塩化亜鉛 ０．０５Ｍ＋クエン酸ナトリウム ０．０５Ｍ ｐＨ２．５
【００７２】
実施例９ Ａｒｍｏｒｅｄ ＲＮＡからのＲＮＡの抽出
他の方法として、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を血漿の代わりに用いられた。１０５μＬのＦＢＳ／Ａｒｍｏｒｅｄ ＲＮＡを、試験溶液の代わりに２００μＬの０．１％ＤＥＰＣ処理水及び２ｍｇの粒子と混ぜたものをコントロールとし、比較例とした。実施例４の記載と同様に、ＲＮＡを含む溶出液をＲＴ−ＰＣＲにより分析した。下記のものと実施例４の試験溶液のほとんどは、水のコントロールより有意に低いＣＴ値により裏付けられる、増幅可能なＲＮＡの回収を可能にした。
試験溶液
グリシン ０．０５Ｍ ｐＨ２．５
グリシン ０．３Ｍ ｐＨ２．５
グリシン ０．３Ｍ ｐＨ３．０
クエン酸ナトリウム ０．３Ｍ ｐＨ３．５
クエン酸ナトリウム ０．１Ｍ ｐＨ３．５
クエン酸ナトリウム ０．３Ｍ ｐＨ３．０
【００７３】
実施例１０
血漿中のＡｒｍｏｒｅｄ ＲＮＡの単離と増幅のための実施例８の方法を、実施例１、２、３、及び４それぞれの固相材料を様々な酸性溶液とともに用いて成功裏に行なった。
固相 酸性溶液
実施例１ 酢酸コバルト ０．０５Ｍ，ｐＨ４．０
実施例１ 酢酸マンガン ０．０５Ｍ，ｐＨ４．０
実施例１ 酢酸コバルト ０．０５Ｍ＋酢酸カリウム０．０５Ｍ，ｐＨ４．０
実施例２ 酢酸カリウム ０．０５Ｍ，ｐＨ４．０
実施例２ 酢酸亜鉛 ０．０５Ｍ，ｐＨ４．０
実施例３ 酢酸亜鉛 ０．０５Ｍ，ｐＨ４．０
実施例４ 酢酸亜鉛 ０．０５Ｍ，ｐＨ４．０
【００７４】
実施例１１ 血漿からのＨＩＶ ＲＮＡの抽出と分析
本発明の方法を、ＨＩＶ陽性の血漿をＥＤＴＡ抗凝固処理して得た血液からＲＮＡを抽出するのに用いた。サンプルは、ＣＯＢＡＳ ＡＭＰＬＩＣＯＲ ＨＩＶ−１ ＭＯＮＩＴＯＲ ＴＥＳＴ ｖｅｒ．１．５（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）を使ってＨＩＶ ＲＮＡが存在するかを試験した。この試験は、ＲＮＡのｃＤＮＡコピーへの逆転写を行い、ｇａｇ遺伝子の高度に保存された領域内の１５５塩基対の配列をＰＣＲにより増幅し、ビオチン標識したアンプリコンを磁性粒子に結合したオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせ、ビオチン標識にアビジンーセイヨウワサビ ペルオキシダーゼ結合体を結合させ、ＴＭＢを用いて比色定量検出を行なうことによりＨＩＶ−１ ＲＮＡの量を調べる、自動化されたＲＴ−ＰＣＲである。
キットと共に提供されるサンプルの調製方法は、下記の通り本発明を使用したものに置き換えられた。
【００７５】
ＨＩＶ ＲＮＡ抽出の手順
１．２ｍｇの実施例１の粒子が１００μＬの５０ｍＭ ＫＯＡｃ，ｐＨ４中に懸濁したスラリーを調製した。
２．１００μＬの５０ｍＭ ＫＯＡｃ，ｐＨ４を１００μＬの血漿に加えた。ボルテックスミキサーにかけ、室温で１分間インキュベートした。
３．血漿溶液を該ビーズ懸濁液に加え、混合物を３０秒ボルテックスで混合した。
４．上清を取り除き、２００μＬの５０ｍＭ ＫＯＡｃ，ｐＨ４を加えて５秒間ボルテックスした。
５．ステップ４を再度行なった。
６．上清を取り除き、２００μＬの０．１％ＤＥＰＣ処理水を加えて５秒間ボルテックスした。
７．ステップ６を再度行なった。
８．残存しているバッファーをすべて取り除いた。５０μＬの５０ｍＭ ＮａＯＨを加えて１分間ボルテックスした。
９．溶出液を新しい１．５ｍＬチューブに移した。
１０．１５０μＬの０．１％ＤＥＰＣ処理水を粒子に加えて１分間ボルテックスし、第二の溶出液とした。
１１．第二の溶出液を初めの溶出液と一緒にした。
１２．まとめた溶出液をＨＩＶ−１ ＭＯＮＩＴＯＲ Ｔｅｓｔ，ｖｅｒ．１．５にかけた。
ＣＯＢＡＳ ＡＭＰＬＩＣＯＲで増幅を行なった後、ハイブリダイゼーション、抗体結合、段階希釈を検出の前に行なった。上記のプロトコルを使用すると、１．８８×１０５粒子／ｍＬのＨＩＶを含むことが分かっている血漿標本の分析では、１：７２９希釈でＥＬＩＳＡにおいて検出が可能であった。
【００７６】
実施例１２ ヒト全血からのＲＮＡの抽出
ヒト全血からのＲＮＡ回収における本方法の有用性を示すために簡単な試験システムを用いた。様々な条件と試薬の相対的な効率を評価するために、無傷ＲＮＡを保持するであろう新たに採血した血液のモデルとして、培養したヒトＴリンパ球細胞（Ｊｕｒｋａｔ）を全血（ＣＰＤ抗凝固処理）に加えた。
７×１０５のＪｕｒｋａｔ細胞をペレットにし、培地を除いた。ペレットを１００μＬのヒト全血と混合した。該血液を、実施例１または２の粒子を２ｍｇ含有する１００μＬの試験溶液に加え、３０秒ボルテックスで混合した。磁性ラック上で粒子から液体を除き、粒子を、５００μＬの洗浄溶液で２回、５００μＬの０．１％ＤＥＰＣ処理水で２回、連続して洗浄した。粒子を５０ｍＭ ＮａＯＨと２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０の溶液５０μＬと混合し、１分間ボルテックスにかけ、溶液を取り出すことでＲＮＡを単離した。溶出液を５０μＬの１００ｍＭ 酢酸亜鉛，ｐＨ４で中和し、実施例１または２の粒子２ｍｇを含有する１００μＬの試験溶液と混合して３０秒ボルテックスにかけることで、新たなビーズと再結合させた。磁性ラック上で粒子から液体を除き、粒子を、５００μＬの洗浄溶液で２回、５００μＬの０．１％ＤＥＰＣ処理水で２回、連続的に洗浄した。粒子を５０ｍＭ ＮａＯＨと２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０の溶液５０μＬと混合し、１分間ボルテックスにかけ、溶液を取り出すことでＲＮＡを単離した。
ＲＮＡを含む溶出液をＧＡＤＰＨ、１８Ｓ遺伝子のＲＮＡとＤＮＡを増幅させるためのプライマーセットを用いた、ＲＴ−ＰＣＲとＰＣＲにかけた。増幅反応と検出は、ｉＣｙｃｌｅｒ 装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎを含むｉＳｃｒｉｐｔ Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により行なった。ポジティブな増幅結果が得られた（ＲＴ−ＰＣＲのＣＴ＜ＰＣＲのＣＴ）。
固相 酸性溶液
実施例１ 酢酸亜鉛 ０．０５Ｍ，ｐＨ４．０
実施例１ ３，３−ジメチルグルタル酸 ０．０５Ｍ，ｐＨ３．２
実施例２ 酢酸亜鉛 ０．０５Ｍ，ｐＨ４．０
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体由来の材料からの核酸、特にリボ核酸の簡便な捕捉・抽出方法に有用な材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
医学研究、医療診断、薬剤探索に応用される現代分子生物学の方法論において、リボ核酸（ＲＮＡ）の研究が採用されることが増えてきている。ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、およびリボソーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）として存在する。ノーザンブロッティング、リボヌクレアーゼ防御法およびＲＴ−ＰＣＲといったいくつかの現代分子生物学の技法は、分析の前に、分解していない純粋なＲＮＡが単離されることを必要とする。特定のｍＲＮＡ配列の存在やｍＲＮＡの発現量の研究は一般的なものになった。ｍＲＮＡの分析、特にマイクロアレイを使ったものは分子生物学研究において非常に強力なツールである。サンプル中のｍＲＮＡ配列の量を測定することで、個々の遺伝子の正もしくは負の制御が測定される。ｍＲＮＡの量は外部刺激や疾病の状態の相関として評価することができる。例えば、ｐ５３ｍＲＮＡの量の変化は様々な細胞タイプにおけるガンと明確に関連付けられてきた。
【０００３】
加えて、ＨＩＶ、ＨＣＶ、西ナイル熱ウィルス、ウマ脳炎ウィルスおよびエボラウィルスを含む、ヒトの健康に多大な影響を与える多くのウィルスがＲＮＡゲノムを有する。体液や組織からウィルスＲＮＡを素早く、きれいに抽出できることはウィルス研究と感染病の診断と治療において重要である。
【０００４】
現在のＲＮＡ抽出法は、多様な技法の１つである細胞の破壊、即ち溶解する方法から始まり、ＲＮＡを溶液中に遊離させ、そして内在性ＲＮａｓｅによる分解からＲＮＡを保護する。溶解はＲＮＡを、ＤＮＡやタンパク質とともに遊離させるが、次の段階でＲＮＡはこれらから分離されなくてはならない。その後、ＲＮＡは溶解するよう処理されるか、または沈殿するよう処理される。細胞溶解、ＲＮＡの溶解およびＲＮａｓｅ阻害を同時に行うためにカオトロピックなグアニジウム塩を使用することは、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８，５２９４−５２９９（１９７９）に開示されている。他の方法では、低ｐＨ中でフェノール／クロロホルムにより抽出をすることにより、可溶化ＲＮＡをタンパク質とＤＮＡから分離する（Ｄ．Ｍ．Ｗａｌｌａｃｅ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１５，３３−４１（１９８７））。一般的に使用されるワンステップＲＮＡ単離法は、４Ｍのグアニジウム塩、酢酸ナトリウム（ｐＨ４）、フェノールおよびクロロホルム／イソアミルアルコールで連続的に細胞を処理することを含む。サンプルは遠心され、ＲＮＡはアルコールの添加により上層から沈殿する（Ｐ．Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６−１５９（１９８７））。米国特許４，８４３，１５５には、フェノールと酸性ｐＨのグアニジウム塩の安定した混合物が細胞に加えられる方法が記載されている。クロロホルムによる相分離の後、水性相中のＲＮＡはアルコールを加えての沈殿により回収される。
【０００５】
他の方法としては、熱したフェノールを細胞懸濁液に加えることによるアルコール沈殿（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２））、細胞を溶解、細胞質中のＲＮＡを遊離させるためのアニオン性または非イオン性界面活性剤の使用、およびバナジルリボ核酸複合体およびジエチルピロカーボネートなどのＲＮａｓｅ阻害剤の使用（Ｌ．Ｇ．Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ，“Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ”ａｎｄ“ＲＮＡ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ：Ｍｉｎｉ Ｍｅｔｈｏｄ”ｉｎ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１３０−１３８（１９９１））が挙げられる。
【０００６】
ガラスや他の固相に結合させることによる生物試料からのＤＮＡとＲＮＡの両方の単離方法は、米国特許５，２３４，８０９（Ｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ）に開示されている。血清や尿などの生物試料中に存在する細胞は、ＥＤＴＡと界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中のグアニジウムチオシアネートの高濃度（＞５Ｍ）溶液にさらすことで溶解される。ＤＮＡおよびＲＮＡと可逆的な複合体を形成する珪藻土もしくはシリカ粒子とインキュベーションすることにより、ＤＮＡおよびＲＮＡは生物試料から精製された。
【０００７】
Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ米国特許５，１５５，０１８には、ＤＮＡ、タンパク質、炭水化物や他の細胞の構成材料も含むことのできる、生物学的に活性のあるＲＮＡを生物試料から単離、精製するための手順が提供されている。ＲＮＡは、高濃度で酸性のカオトロピック塩からなる結合溶液の存在下において、生物試料を細かく分解されたガラスまたは珪藻土と接触させることにより単離される。これらの条件のもと、ＲＮＡは選択的にシリカ粒子材料と結合することが主張されているが、その後にＤＮＡを除去するため固体材料をエタノール塩溶液で処理することも開示されている。その後、他の研究者により、ＤＮＡによるコンタミネーションが起こることが確かめられた。粒子に結合したＲＮＡは、サンプル中に含まれる他の生体物質から容易に分離することができる。粒子に結合したＲＮＡは、非特異的に吸着した物質を除くために洗浄されることが好ましい。結合したＲＮＡは希釈した塩緩衝液による溶出で粒子から遊離され、十分に純粋で、生物学的に活性のあるＲＮＡが回収される。ＲＮＡの選択的な結合という主張には疑義があるが、溶出液中のＤＮＡを破壊するためにヌクレアーゼを加えることもまた開示されている。Ｋｕｒｏｉｔａ ｅｔ ａｌ．米国特許５，９９０，３０２には、サンプル、カオトロオープ、リチウム塩、酸性溶液、核酸キャリアーを混合することによるＧｉｌｌｅｓｐｉｒｅのＲＮＡ単離法の派生法が提供されている。Ｅｋｅｎｂｅｒｇ米国特許６，２１８，５３１にはＲＮＡをシリカ固相に結合させる前にクリアーな溶解液を形成するため、ＲＮＡと混入物質を含む溶液を希釈緩衝液と混合するという、もうひとつの発展型が提供されている。洗浄は、ＤＮＡとタンパク質の沈殿によって影響を受ける。希釈緩衝液は水であってもよいが、中性ｐＨのＳＳＣのような緩衝液や塩を含むものが好ましく、ＳＤＳのような洗浄剤を含むことがさらに好ましい。
【０００８】
１価のカチオン性界面活性剤の単量体が細胞を溶解するのと同時に、溶液からＲＮＡとＤＮＡを沈殿させることができることが米国特許５，０１０，１８３と５，９８５，５７２に記載されている。これらの特許文献中においてＲＮＡは初め不溶性にされる。’１８３特許の方法において、４０％尿素と他の添加剤を含む第四級アンモニウム界面活性剤が細胞懸濁液に加えられ、その混合物が遠心される。ペレットはエタノール中に再懸濁され、そこから核酸は塩を加えることにより沈殿する。
【０００９】
Ｍｉｃｈｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．米国特許６，３５５，７９２には、６．５より低いｐＨの緩衝液で液体サンプルを酸性化し、その酸性溶液を水酸基を有する無機酸化物材料と接触させ、核酸が結合した固体材料を液体から分離し、かつ、ｐＨが７．５〜１１、好ましくは８〜８．５のアルカリ溶液によって溶出することによる核酸の単離方法が開示されている。この酸性溶液は、イオン性洗浄剤、カオトロープを含まず、いずれのイオンも０．２Ｍ未満である。実施例は、捕捉前に核酸が溶液中に遊離していることを前提とする方法を使用することを反映している。
【００１０】
ＷＯ００／６６７８３と欧州特許１２０６５７１Ｂ１には、核酸を含むと思われるサンプルを７より低いｐＨの下、水溶性で弱塩基性のポリマーと接触させ、サンプル中に存在するすべての核酸が結合した弱塩基性のポリマーの水不溶性沈殿を形成し、その水不溶性沈殿をサンプルから分離し、沈殿物を塩基と接触させて溶液のｐＨを７よりも上げ、それにより核酸を弱塩基性のポリマーから遊離することによる、水溶性サンプル中の遊離した、細胞外の核酸を単離する方法が開示されている。該ポリマーは、酸性ｐＨではプロトン化されｐＨを上げると中和されるアミン基を含む。
【００１１】
Ｂａｃｋｕｓ ｅｔ ａｌ．米国特許５，５８２，９８８と欧州特許０７０７０７７Ｂ１には、７より低いｐＨの下、核酸を含むと思われる溶解液を、溶解液中の核酸すべてと結合して弱塩基性のポリマーの水不溶性沈殿を形成するのに十分な量の水溶性かつ弱塩基性のポリマーと接触させること、その水不溶性沈殿を溶解液から分離すること、また、その沈殿を塩基に接触させて溶液のｐＨを７よりも上げ、それにより前記核酸を前記弱塩基性のポリマーから遊離すること、という手順を含む溶解液からの核酸を得るための方法が開示されている。
【００１２】
Ｈｅａｔｈ米国特許５，９７３，１３７には、アニオン性洗浄剤、キレート剤、６より低いｐＨの緩衝液からなる細胞溶解試薬でサンプルを処理することによって、生物サンプルからほとんど分解されていないＲＮＡを単離するための方法が開示されている。アニオン性洗浄剤の役割は、タンパク質を変性させることであると言われているのに加えて、細胞を溶解し、そして／またはタンパク質と脂質を可溶化することであると言われている。全血からＲＮＡを単離するとき、赤血球細胞はＮＨ４Ｃｌ、ＮａＨＣＯ３およびＥＤＴＡを含む試薬によって初めに溶解され、白血球細胞は分離され、タンパク質−ＤＮＡ沈殿試薬の存在の下、溶解される。後者は代表的には高濃度の酢酸や塩酸などのナトリウム塩またはカリウム塩溶液である。最後の段階として、ＲＮＡを含む上清は低級アルコールの添加により沈殿させられる。酵母やグラム陽性バクテリアからのＲＮＡの単離は、核酸を遊離させるための調整として細胞を消化するために、細胞を溶解する酵素、グリセロール、塩化カルシウムの使用をさらに必要とする。
【００１３】
Ｃｏｌｌｉｓ米国特許５，９７３，１３８には、酸性溶液中における常磁性粒子の懸濁液に対しての核酸の可逆的な結合のための方法が開示されている。この方法で開示された粒子は、むき出しの鉄酸化物、鉄硫化物もしくは鉄塩化物であった。酸性溶液は粒子の鉄分の正への帯電を促進し、それにより、核酸の負に荷電したリン酸基への結合を増進すると言われている。関連する米国特許６，４３３，１６０には、酸性溶液がグリシンＨＣｌを含む、類似した方法が開示されている。
【００１４】
Ｂｈｉｋｈａｂｈａｉ米国特許６，４１０，２７４には、ａ）細胞の溶解、ｂ）二価金属イオンによる染色体ＤＮＡとＲＮＡの大部分の沈殿、ｃ）沈殿の除去、ｄ）アニオン交換樹脂による溶解液の精製（ｐＨ４〜６の酸性の緩衝液を使用し、続けてよりアルカリ性の緩衝液を使用）、第二のイオン交換樹脂によるプラスミドのさらなる精製、を含む、不溶性マトリックス上での分離によるプラスミドＤＮＡの精製方法が開示されている。
【００１５】
Ｃｒｏｓ ｅｔ ａｌ．米国特許６，７３７，２３５には、カチオン基を有する親水性で橋かけ架橋されたポリアクリルアミドポリマーを含む、もしくはそれに被覆された粒子を用いた核酸の単離方法が開示されている。カチオン基は、低ｐＨにおけるポリマー上のアミン基のプロトン化により形成される。核酸は低ｐＨで低イオン強度の緩衝液中で結合し、高イオン強度の緩衝液中で遊離する。ポリマーは、２５〜４５度の低い臨界溶解温度を有していなくてはならない。脱着は、アルカリ性ｐＨとより高い温度によっても促進される。
【００１６】
Ｓｉｍｍｓ米国特許６，８７５，８５７には、非イオン性界面活性剤ＩＧＥＰＡＬ、ＥＤＴＡ、アニオン性界面活性剤ＳＤＳおよび高濃度の２−メルカプトエタノールを含む試薬混合物を用いた、植物試料からのＲＮＡの単離方法とその試薬が開示されている。
【００１７】
Ｓｐｒｅｎｇｅｒ−Ｈａｕｓｓｅｌｓ米国特許７，００５，２６６には、サンプルをホモジェナイズし、その後にホモジェナイズされたサンプルを、ｐＨが２〜７で、１００ｍＭより高い塩濃度で、ポリビニルピロリジンなどのフェノール中和物質、必要に応じて洗浄剤およびキレート剤を含む溶液で処理して、溶解液を形成することによる、核酸処理酵素阻害剤（例えばｓｔｏｏｌ）を含むサンプルからの核酸の精製、安定化または単離のための方法が開示されている。この溶解液はその後従来のシリカ系の固相材料により処理される。
【００１８】
いくつかの特許と出願に、結合材上のアミン基のプロトン化状態を変化させる結合溶液と溶出溶液との間のｐＨの変化により調節される、結合材への核酸の可逆的な捕捉が開示されている。例えば、米国特許６，２７０，９７０、６，３１０，１９９、５，６５２，３４８、５，９４５，５２０、ＷＯ９６／０９１１６、ＷＯ９９／０２９７０３、欧州特許１２３４８３２Ａ３、１０３６０８２Ｂ１、米国出願公開２００１／００１８５１３、２００３／０００８３２０、２００３／００５４３９５がある。同様に、Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．米国特許６，４４７，７６４には、カチオン中でプロトン化された、橋かけ架橋されてないポリマー微細粒子に対する可逆的な結合、溶媒からのそれらの分離、アニオン性有機物の遊離のためのｐＨの上昇による粒子の脱プロトン化、による、核酸を含むアニオン性有機物の水性環境からの単離方法が開示されている。
【００１９】
Ｋａｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．米国特許５，６６５，５８２には、可逆的なポリマーの固体支持体への設置、可逆的なリンカーのポリマーへの接着、結合組成物による生物試料の可逆的なリンカーへの結合、からなる、生物試料の固体支持体への可逆的なアンカー方法が開示されている。該結合組成物は核酸、抗体、抗イディオタイプ抗体またはプロテインＡを含み、可逆的に生物試料を固体支持体にアンカーする。生物試料は核酸であってもよい。
【００２０】
Ｂｕｒｇｏｙｎｅ米国特許５，７５６，１２６には、遺伝子試料サンプルの保存のための乾燥固体媒体が開示されている。この媒体は、固体マトリックスと該マトリックスに吸着した混合物を含む。この混合物は、弱塩基、キレート剤、アニオン性洗浄剤を含む。
【００２１】
Ｆｏｍｏｖｓｋａｉａ ｅｔ ａｌ．米国特許６，７４６，８４１には、アニオン性界面活性剤で被覆された、細胞溶解用固体マトリックスを含む乾燥した基体を提供すること、サンプルを上記基体に適用させること、核酸を捕捉すること、を部分的に含む核酸の精製方法が開示されている。ＲＮＡの捕捉への使用は特に開示も例示もされていない。
【００２２】
Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．米国出願公開２００４００１４７０３には、第四級アンモニウム塩または第四級ホスホニウム塩化合物と、有機カルボン酸、アンモニウム硫酸塩または酸性ｐＨのリン酸塩などのプロトンドナーを含む混合物によるＲＮＡの安定化が開示されている。
【００２３】
ＧＢ ２４１９５９４Ａ１には、アミノ界面活性剤と場合により非イオン性界面活性剤によって核酸を安定化することが開示されている。
【００２４】
Ａｕｇｅｌｌｏ米国特許６，６０２，７１８、６，６１７，１７０、６，８２１，７８９、米国出願公開２００５／０１５３２９２には、遺伝子の発現誘導や核酸分解の抑制もしくは防止による、全血などの生物試料、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡを保存する方法が開示されている。遺伝子の発現誘導防止剤は、安定剤、酸性物質を含んでいてもよい。カチオン性洗浄剤は好ましい安定剤である。後者の試薬は細胞を溶解し、洗浄剤との複合体として核酸の沈殿を引き起こす。
【００２５】
米国特許６，９１６，６０８Ｂ２には、アルコールおよび／またはケトンをジメチルスルフォキシドとの混合物として含む核酸を安定化するための混合物と方法が開示されている。
【００２６】
米国特許６，２０４，３７５と６，５２８，６４１には、ｐＨ４〜８のアンモニウム硫酸塩などの塩溶液を細胞に加えることにより、細胞のＲＮＡ成分を安定化する方法が開示されている。塩溶液は、細胞を透過し、細胞のタンパク質を伴うＲＮＡの沈殿を引き起こし、ＲＮＡを核に近寄らせないようにして、分解を防ぐ。
【００２７】
上記のＲＮＡの単離方法の、多くの段階を含み煩わしいという性質が医療行為におけるＲＮＡの使用を面倒なものにしている。ＲＮＡの単離方法は、ＲＮＡをＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼにより分解される前に、細胞のタンパク質やＤＮＡから分離することの困難さに打ち勝つ必要がある。これらのヌクレアーゼは、保護されてないＲＮＡを素早く分解するのに十分な量の血中に存在する。従って、細胞からのＲＮＡの単離方法はＲＮａｓｅによる分解を防ぐことができるものでなくてはならない。本技術分野において、素早く、シンプルな、生物試料からのＲＮＡの抽出方法への要求は今も存在している。そのような方法は、ＲＮＡの加水分解と分解を最小にし、様々な分析や下流のプロセスにおいて使用することが出来る。
【００２８】
米国出願公開２００５／０１０６５７６、２００５／０１０６５７７、２００５／０１０６５８９、２００５／０１０６６０２、２００５／０１３６４７７、２００６／０２３４２５１には、生物試料からのＲＮＡを含む核酸の抽出のための方法、材料が開示されている。この方法は、細胞やウィルスの破砕のために独自なクラスの固体材料を使用し、化学的な溶解処理を必要としない。
【００２９】
発明の要約
ひとつの側面において、本発明は、酸性溶液と固相結合材料の使用を含む、生物サンプルからのＲＮＡの迅速で簡便な抽出と単離のための新規な方法を提供する。本発明の実施において使用される固相結合材料は、細胞やウィルスを破壊するために初めにいかなる予備的な溶解も行うことなく、生物サンプルから核酸を遊離させることができる。前記固相結合材料は、第四級アンモニウム基、第四級ホスホニウム基、第三級スルホニウム基を含んでいてもよい。
【００３０】
他の側面においては、本発明は、マトリックス部分と、第四級アンモニウム、第四級ホスホニウムおよび第三級スルホニウム基から選択されるオニウム基と、を含み、さらに前記マトリックス部と前記オニウム基とを介する切断可能なリンカーとを含む固相結合材料と酸性溶液の使用を含む、生物サンプルからのＲＮＡの抽出および／または精製のための方法を提供する。
【００３１】
発明の詳細な説明
定義
アルキル−１個以上の水素原子以外の置換基で置換されていてもよい、１〜２０個の炭素原子を含む、分岐した、直鎖状のまたは環状の炭化水素基。ここで使用される低級アルキルとは８個までの炭素原子を含むアルキル基のことを言う。
アラルキル−アリール基で置換されたアルキル基。
アリール−１個以上の水素以外の置換基で置換されていてもよい、１から５個の炭素環式芳香族環を含む、芳香族環含有基。
生物材料−全血、抗血液凝固処理された全血、血漿、血清、組織、細胞、細胞成分、ウィルスを含む。
細胞材料−無傷細胞または、動物、植物またはバクテリア由来の無傷細胞を含む組織を含む材料。細胞は無傷であっても、活発に代謝をしている細胞であっても、アポトーシスを起こしている細胞であっても、死んでいる細胞であってもよい。
細胞核酸成分−細胞材料中に見出される核酸であり、ゲノムＤＮＡやＲＮＡ、また、ウィルスやプラスミドを含む感染性物質からの核酸など他の核酸であってもよい。
磁性粒子−粒子、微粒子、またはビーズであって外部の磁界に反応するものである。粒子はそれ自身磁気を帯びていても、常磁性であっても、超常磁性であってもよい。超常磁性体または強磁性体材料を使用したとき、外部の磁石または磁界に引き寄せられることができる。粒子は、磁気に反応性があり、１以上の非磁気反応性層に囲まれている、固体の中心部分を有することができる。磁気反応部は互い違いに周りを取り巻く層であってもよく、または磁気反応部が非磁気反応中心部分の中に配された粒子であってもよい。
核酸−ポリヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡなどの合成ＤＮＡ類似体であってもよい。一本鎖の化合物、および、これら３つのタイプの鎖のうちのいずれの組み合わせの二本鎖の化合物もこの用語の範囲に含まれる。
遊離、溶出−溶液もしくは混合物との接触により、固相結合材料の表面または細孔に結合した材料の大部分を除去すること
ＲＮＡ−メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を含むが、これらに限定されるものではない。
サンプル−核酸を含んでいる、もしくは含むと考えられる液体。本発明の方法において使用されることのできる代表的なサンプルは、集められた血液標本において通常みられるような抗凝固処理されたものであってもよい血液、血漿、血清、尿、精液、唾液などの体液、細胞培養液、組織抽出物などを含む。他のタイプのサンプルとして、溶剤、海水、工業用水サンプル、食物サンプル、土壌や水などの環境サンプル、植物試料、真核生物、バクテリア、プラスミド、ウィルス、カビ、原核生物由来の細胞が含まれる。
固相（結合）材料−核酸分子を誘引することのできる表面を有する材料。材料は、粒子、微小粒子、ナノ粒子、繊維、ビーズ、メンブレン、フィルター、またはテストチューブやマイクロウェルなどの支持体といった形であってよい。
置換された−基上の１個以上の水素原子が、水素原子以外の置換基で置き換えられたことを指す。置換基について言及するときに、他に明確な示唆がないときは複数箇所での置換も存在しうることを意図していることに注意すべきである。
【００３２】
本発明は迅速で簡便な、生物サンプルからのＲＮＡを得るための方法に関する。本方法は、固相結合材料と、サンプルに含まれる核酸の供給源からＲＮＡが遊離してくる酸性溶液を用いる。上記固相結合材料は、細胞やウィルスを破壊するために初めにいかなる予備的な溶解も行うことなく、生物サンプルから直接ＲＮＡを遊離させることのできるものが選択される。固相結合材料の作用を介してＲＮＡが直接酸性環境中に遊離し、その後遊離したＲＮＡが酸性条件下、固相結合材料に迅速に捕捉されることにより、分解は最小限に抑えられる。さらに本発明者は、グアニジウム塩、高濃度カオトロープ、ＲＮａｓｅ阻害タンパク質または抗体などのＲＮａｓｅ不活性化物質または不活性化タンパク質の添加に頼ることなく、活性ＲＮａｓｅを含むサンプルからリボ核酸を回収することができることを見出した。
【００３３】
実際、本方法は、タンパク質−ＲＮＡ複合体、無傷細胞およびウィルスからＲＮＡを捕捉、抽出するのに有用である。核酸を含むいずれの生物サンプルからも、特には無傷細胞とウィルスから、本発明のプロセスに従ってＲＮＡを抽出することができる。一般的なこれらの材料として、バクテリア培養液またはペレット、血液、尿、細胞、体液例えば、尿、唾液、精液、ＣＳＦ、血液、血漿、血清、組織ホモジェネートなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の方法は、他のいずれの予備的な手順に供する必要なしに、生細胞、死細胞、アポトーシスを起こしている無傷細胞、組織、培養されたバクテリア、植物や動物の培養細胞系列を含むサンプルに適用可能である。特に、予備的な破壊、溶解は一切行う必要がない。懸濁液中の細胞、例えば生物の液体や細胞培養液からのＲＮＡの抽出は、例えば、細胞を低速遠心でペレットにして培地を廃棄することから始めることができる。本技術分野において公知である組織破壊法、例えば手動のホモジェナイザーやＷａｒｉｎｇ ｂｌｅｎｄｅｒや他の組織ホモジェナイザーなどの自動化されたものを用いたホモジェナイズにより、無傷組織や器官からＲＮＡを抽出することができる。ホモジェナイズされたものはチーズクロスなどの粗いフィルターに通されるか、または低速遠心されて大きい粒子状物質が除かれる。
【００３４】
本発明の方法は迅速であり、代表的にはたった数分しか要しない。重要なことに、本方法により得られたＲＮＡは、逆転写酵素の単独使用や、逆転写の後に続いてのポリメラーゼ連鎖反応増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮＡブロット分析やｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳など、医療や他の下流での使用に有用であるほどに十分に純粋なものである。有利なことに、本方法の使用の前に細胞を単離する必要が無く、簡便な装置のみが本方法の実施に必要である。本発明の方法に従ってサンプルを処理する前に、予備的な溶解やエタノール沈殿のステップは不要である。細胞やウィルスの溶解のための洗浄剤やカオトロープ物質は不要であり、使用されない。
【００３５】
本発明の一実施形態において、ＲＮＡを含む選択された生物サンプル、例えば細胞および／またはウィルスを含む液体は酸性溶液と簡単に混ぜ、混合物を形成する。サンプルと酸性溶液はたった数秒間混合物中で接触させるだけでよい。他の手順は必要ない。混合物の形成と同時に、または形成の後に、混合物は、細胞やウィルスを破壊するために初めにいかなる予備的な溶解も行うことなく、生物サンプルから直接ＲＮＡを遊離させることのできるものとして選択される固相結合材料と一緒にされる。固相材料である粒子の作用を介してＲＮＡが直接酸性環境中に遊離し、その後遊離したＲＮＡが酸性条件下、該粒子に迅速に捕捉されることにより、ＲＮＡの破壊は最小限に抑えられる。上清は除かれ、核酸を含む固相結合材料は、場合により１回以上溶液で洗浄される。所望により、その後固相結合材料は、ＲＮＡを分離するために溶出に供される。一実施形態において、アルカリ溶液が固相結合材料からＲＮＡを溶出するのに使用される。代表的には、本目的に望ましいアルカリの濃度は最低１０−４Ｍであり、好ましくは、１ｍＭから約１Ｍの間である。
【００３６】
他の実施形態において、本発明の方法は、必要であれば、アウリントリカルボン酸、ＤＴＴ、ＤＥＰＣなどのＲＮａｓｅ阻害剤を用いることができる。当業者はこの目的のために他のＲＮａｓｅ阻害剤を選択することもできる。
【００３７】
すべての手順は連続して単一の容器内や単一の支持体上で迅速に行うことができ、遠心機など特殊な装置は必要ない。本方法は連続的にまたは並列して多数のサンプルを処理するための自動化されたプラットフォームに適用可能である。すべての結合、洗浄ステップは、好ましくは短時間で行われ、好ましくは１分以内である。洗浄ステップは、好ましくは１０秒以内で行うことができる。溶出は１分を超えない時間で行われるのが好ましい。例えば、ＲＮＡを含む１００μＬのサンプルは１．５ｍＬ微小遠心チューブ内で１００μＬの酸性溶液と混合され、ボルテックスで簡単に攪拌される。酸性溶液中の磁性結合微小粒子がその後加えられ、混合物は３０秒ボルテックスされる。上清は、磁性ラック上で粒子から分離される。粒子は２００μＬの酸性溶液で２回洗浄され、２００μＬの水で２回洗浄される。洗浄された粒子はアルカリ溶出液中で１分間ボルテックスにより攪拌され、ＲＮＡが溶出される。
【００３８】
固相材料
一実施形態において、本発明のＲＮＡ抽出法は、素早くＲＮＡを結合させるための固相結合材料を使用し、それによりサンプル中の他の構成物質からのＲＮＡの分離を可能にする。固相結合材料は、細胞やウィルスを破壊するために初めにいかなる予備的な溶解も行うことなく、生物サンプルから直接核酸を遊離させることのできるものが選択される。本発明の方法中の核酸結合のための材料は、サイズ、形状、有孔性および機械的性状が明確に定められたマトリックスを含む。前記マトリックスは粒子、微小粒子、繊維、ビーズ、メンブレンや、テストチューブやマイクロウェルなどの他の支持体といった形状であってもよい。多数の特有の材料とそれらの調製法が本出願人の米国特許出願の出願公開２００５／０１０６５７６、２００５／０１０６５７７、２００５／０１０６５８９、２００５／０１０６６０２、２００５／０１３６４７７、２００６／０２３４２５１に記載されている。
【００３９】
一実施形態において、固相結合材料はさらにその表面もしくは表面近辺に、様々な長さの核酸分子の捕捉と結合を可能にする、共有結合により結合した核酸結合部分を含む。表面というのは、固相結合材料の外部周辺部だけでなく、固相結合材料内のアクセス可能なすべての多孔部分も意味する。
【００４０】
他の実施形態において、固相結合材料はさらにその表面もしくは表面近辺に、様々な長さの核酸分子の捕捉と結合を可能にする、非共有結合により結合した核酸結合部分を含む。非共有結合により結合した核酸結合部分は、反対に荷電した固体表面の残基に対する静電気的引力もしくは、表面との疎水性相互作用により、固体マトリックスと結合する。
【００４１】
共有結合または非共有結合により結合した核酸結合基を有するこれらのマトリックスの材料は、任意適当な物質とすることができる。好ましいマトリックスの材料は、シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマー、不溶性多糖および金属、金属酸化物、金属硫化物から選択される金属性材料、並びにシリカ、ガラス、合成ポリマーや不溶性多糖により被覆された磁性反応材料、から選択される。例示される材料は、細胞を破砕して核酸を誘引する役割を果たす、表面に共有結合した機能的官能基により被覆もしくは機能付与されたシリカベース材料を含む。表面が適当に機能付与された炭化水素ベース材料、並びにこの表面の機能性を有する重合体も例示に含まれる。核酸結合基として働く表面の機能的な官能基は、細胞構造の完全性を破壊することができ、固体支持体への核酸の誘引を引き起こすことのできるいずれの基でもよい。そのような官能基は、ヒドロキシル、シラノール、カルボキシル、アミノ、アンモニウム、第四級アンモニウム、第四級ホスホニウム塩、以下に記載される第三級スルホニウム塩タイプの材料を含むがこれらに限定はされない。中でも第四級アンモニウム、第四級ホスホニウムまたは第三級スルホニウム塩基を有する材料が好ましい。
【００４２】
様々なものに適用するために、固相材料は粒子の形状であることが好ましい。粒子は約５０μｍよりも小さいサイズであることが好ましく、約１０μｍより小さいことがより好ましい。微小な粒子はより速く溶液中に分散し、より大きい表面／体積率を有する。より大きな粒子とビーズもまた、重力沈殿や遠心分離が採用される方法においては有用である。２以上のサイズの異なる粒子の混合物は、いくつかの使用例においては有利となり得る。
【００４３】
さらに固相結合材料は、通常常磁性もしくは超磁性の微小粒子の形態である、磁性反応部分を含むことができる。該磁性反応部分は、磁界による誘引および操作を可能にする。そのような磁性微小粒子は一般的に、通常、吸着又は共有結合による結合層に囲まれて磁性部分が防護されている、磁性金属酸化物または金属硫化物のコアを含む。核酸結合基は、該層に共有結合により結合することができ、その結果、固相結合材料表面を覆う。磁性金属酸化物コアは、好ましくは鉄酸化物または鉄硫化物であり、鉄は２価でも３価でも両方であってもよい。有機ポリマー層内に取り囲まれた磁性粒子が、例えば、米国特許４，６５４，２６７、５，４１１，７３０、５，０９１，２０６、非特許文献Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，４０（１９９９），８１３７−８１４０、に開示されている。数種類の異なったタイプの殻を有する、被覆された磁性粒子が市販されている。この殻は、米国出願公開２００５／０１０６５７６、２００５／０１０６５７７、２００５／０１０６５８９、２００５／０１０６６０２、２００５／０１３６４７７、２００６／０２３４２５１に教示されているように、機能付与されている。
【００４４】
市販されている磁性シリカ又は磁性ポリマー粒子は、本発明において有用な磁性固相結合材料の調製の開始物質として使用可能である。表面にカルボキシル基を有する適当なタイプのポリマー粒子が、商品名ＳｅｒａＭａｇ（登録商標）（Ｓｅｒａｄｙｎ）、ＢｉｏＭａｇ（登録商標）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）として知られている。適当なタイプの磁性シリカ粒子が商品名ＭａｇｎｅＳｉｌ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）として知られている。表面にカルボキシル基またはアミノ基を有する磁性シリカ粒子はＣｈｅｍｉｃｅｌｌ ＧｍｂＨ（Ｂｅｒｌｉｎ）から入手可能である。
【００４５】
片方の末端にトリアルコキシシラン基を有するリンカー基は、金属性材料またはシリカやガラス被覆の磁性粒子など被覆された金属性材料の表面に接着可能である。トリアルコキシシラン化合物は、式Ｒ１−Ｓｉ（ＯＲ）３で表わされ、式中Ｒは低級アルキルであり、Ｒ１は直鎖、分岐鎖、環から選ばれる有機基であり、１から１００個の原子を含むものが好ましい。これら原子は好ましくは、Ｃ、Ｈ、Ｂ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｐ、ハロゲン、アルカリ金属、から選択される。代表的なＲ１基は３−アミノプロピル、２−シアノエチルおよび２−カルボキシエチルに加えて、以下でより詳細に説明される切断可能な残基を有する基である。好適な実施形態において、トリアルコキシシラン化合物は、切断可能な中央部と反応性の末端部を有し、末端部においては、反応性基は第三級アミン、第三級ホスフィンまたは有機スルフィドとの反応により一段階で第四級または第三級オニウム塩に変換可能である。
【００４６】
かかるリンカー基は、金属性粒子やガラス、シリカ被覆された金属性粒子の表面に、フッ素イオンを用いたプロセスにより導入可能であることが明らかにされてきた。反応は低級アルコール、トルエンなどの芳香族溶媒を含む、有機溶媒中で行うことができる。適当なフッ素源は、そのような有機溶媒に対して相当の溶解性を有し、フッ化セシウムとフッ化テトラアルキルアンモニウム塩が挙げられる。
【００４７】
本発明の方法において有用な固相結合材料中に含有される核酸結合（ＮＡＢ）基は、２つの作用を果たすことができる。ＮＡＢ基は様々な長さと塩基組成や塩基配列を有する核酸、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを誘引、結合する。また、ＮＡＢ基はある程度において、核酸を細胞の囲いから遊離させる働きをすることができる。核酸結合基として、例えば、カルボキシル、アミン、第三級または第四級オニウム基またはこれらのうち２以上の基が混合したもの、が挙げられる。アミン基はＮＨ２、アルキルアミンおよびジアルキルアミン基であってよい。好ましい核酸結合基として、第四級トリアルキルアンモニウム基（−ＮＲ３＋）を含む第三級または第四級オニウム基（-ＱＲ２＋またはＱＲ３＋）、トリアルキルホスホニウムまたはトリアリールホスホニウムまたはアルキル−、アリール−ホスホニウム基が混ざったものを含むホスホニウム基（−ＰＲ３＋）、および第三級スルホニウム基（−ＳＲ２＋）が挙げられる。固相結合材料はここで記載されている核酸結合基を２種類以上含有することができる。２種以上のサイズの粒子の混合物を使用することができる。ＮＡＢ基を有するかもしくは有さない、様々な他の固相結合材料と、上記固相結合材料の混合物も使用することができる。第三級、第四級オニウム基（ＱＲ２＋またはＱＲ３＋）であって、式中Ｒ基が４個以上の炭素原子のアルキル基を表わすものを有する固相材料は、核酸との結合において特に効果的であるが、１個の炭素原子のアルキル基もアリール基と同程度に有用である。そのような固相材料は、非常に強く結合核酸を保持し、本願発明の技術分野において既知の、溶出に用いられるほとんどの条件下では、核酸の除去や溶出は起きない。低、高両方のイオン強度の、既知の殆どの溶出条件は、結合核酸の除去には効果的ではない。ＤＥＡＥやＰＥＩ基を含む従来の陰イオン交換樹脂とは違い、第三級または第四級オニウム固相材料は、反応溶液のｐＨに関わらず正に荷電したままである。
【００４８】
好適な実施形態においては、選択的に切断可能な結合を介して核酸結合基がマトリックスに結合した固相結合材料が使用される。該結合を切断することにより、いかなる結合核酸も固相材料から効果的に引き離される。該結合は、特異的に切断可能な結合を切断するのが目的の核酸を破壊することのない、化学的な手段、酵素による手段、または光化学的な手段、もしくは他のいずれの手段によっても、切断することができる。そのような切断可能な固相材料は、上記で記載したマトリックスを含む固体支持部を含む。核酸の誘引と結合のための核酸結合（ＮＡＢ）部は、切断可能なリンカー部によって、固体支持部の表面に結合される。切断可能なリンカーを有する適当な材料は、米国特許出願公開２００５／０１０６５７６、２００５／０１０６５７７、２００５／０１０６５８９、２００５／０１０６６０２、２００５／０１３６４７７、２００６／０２３４２５１に記載されており、これらは引用文献とされている。
【００４９】
切断可能なリンカー部は好適には、直鎖、分岐鎖、環、から選択される有機基であり、１から１００個の原子を含む。該原子は好ましくは、Ｃ、Ｈ、Ｂ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｐ、ハロゲン、アルカリ金属から選択される。リンカー基の例として、加水分解により切断可能な基が挙げられる。カルボン酸エステル、カルボン酸無水物、チオエステル、カーボネートエステル、チオカーボネートエステル、ウレタン、イミド、スルホンアミド、スルホンイミド、スルホネートエステルも例として含まれる。好適実施形態において、切断可能な結合は水性のアルカリ溶液により処理される。ホスフィンやエタンチオール、メルカプトエタノール、ＤＴＴなどのチオールなど様々な試薬により切断される、ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合といった、還元的に切断を受ける基が、他のクラスのリンカー基の例として挙げられる。他の代表的な基として、ペルオキシド（Ｏ−Ｏ）結合を有する有機基が挙げられる。ペルオキシド結合は、チオール、アミンおよびホスフィンにより切断可能である。他の代表的な切断可能な基として、酵素により切断可能なリンカー基が挙げられる。例として、エステラーゼやハイドロラーゼにより切断されるエステル、プロテアーゼやペプチダーゼにより切断されるアミドやペプチド、グリコシダーゼにより切断されるグリコシド基が挙げられる。他の切断可能な基の代表例として、切断可能な１，２−ジオキセタン部分が挙げられる。そのような材料として、熱により分解し、または、化学的な試薬もしくは酵素試薬により断片化するジオキセタン部分が挙げられる。保護基を除去し、オキシアニオンを生成すると、ジオキセタン環の分解が促進される。断片化は、周知のプロセスに従って、Ｃ−Ｃ結合に加えて、ペルオキシドのＯ−Ｏ結合の切断により起こる。切断可能なジオキセタンは多数の特許文献、非特許文献に記載されている。代表的な例が、米国特許４，９５２，７０７、５，７０７，５５９、５，５７８，２５３、６，０３６，８９２、６，２２８，６５３、６，４６１，８７６に記載されている。
【００５０】
他の切断可能なリンカー基として、不安定な１，２−ジオキセタン部分に変換することができる電子豊富なＣ−Ｃ二重結合が挙げられる。Ｏ、Ｓ又はＮ原子による１つ以上の置換基が、二重結合上に結合する。一重項酸素と電子豊富な二重結合との反応により不安定な１，２−ジオキセタン環基を形成し、ジオキセタン環基は室温で速やかに断片化して２つのカルボニル断片を生成する。
【００５１】
切断可能なリンカー基を保持する他の基の固相材料は、米国特許６，８５８，７３３、６，８７２，８２８に記載されているように、切断可能な部分としてケテンジチオアセタールを有する。ケテンジチオアセタールは、ペルオキシダーゼと過酸化水素による酸化反応で二重結合が切断される。
【００５２】
切断可能な部分は、アクリダン環上に置換基を有する類似体も含めて、図示する構造をとることができる。図中、Ｒａ、ＲｂとＲｃはそれぞれ１から約５０個の、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ、ハロゲン原子から選ばれる非水素原子を含む有機基であり、ＲａとＲｂは結合して環を形成していてもよい。他の多くの切断可能な基は当業者にとり明白である。他の切断可能なリンカー基を有する固相材料のクラスとして、ニトロ置換芳香族エーテルやエステルなどの、光により切断可能なリンカー基を有するものが挙げられる。オルト−ニトロベンジルエステルは、紫外線による周知の反応によって切断される。
【００５３】
酸性溶液
本発明の方法で使用される酸性溶液は、通常、中性ｐＨ以下のｐＨを有するいずれの水溶液も包含する。溶液は、好ましくは１〜５のｐＨを有し、さらに好ましくは約２〜４のｐＨである。酸は有機でも、無機でもよい。塩酸、硫酸、過塩素酸などの無機酸は有用である。モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸およびアミノ酸を含む有機酸、及びそれらの塩を使用することができる。代表的な酸として、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、クエン酸、グリシンおよびアラニンが挙げられる。塩は、いずれの水溶性の対イオンも有することができ、好ましくはアルカリ金属、アルカリ土類イオンである。遷移金属塩を含む酸性溶液も本発明の実施に使用することができる。好ましい遷移金属として、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｚｎ塩を挙げることができる。
【００５４】
化学的な溶解によるＲＮＡの抽出のための他の方法とは違い、本方法の酸性溶液は、洗浄剤や、グアニジウム塩等のカオトロピック物質などの化学的な溶解試薬を含有しない。ＤＭＦ、ＤＭＳＯなどの、これら両方の能力の中で機能する有機溶媒も使用しない。他の溶性の添加物を加えず、固相結合材料と組合わせた酸性溶液は、サンプルにＲＮａｓｅが含まれてさえいれば、該サンプルから無傷のＲＮＡを十分に抽出することができる。
【００５５】
サンプルと酸性溶液は、サンプルおよび酸性溶液の混合物と固相とを一緒にするステップと同時に混ぜることができる。サンプルおよび酸性溶液の混合物と固相との混合は、固相を酸性溶液に加えることにより行われる。他の方法として、サンプルは先ず初めに酸性溶液と混ぜられ、混合物を形成し、その後固相と該混合物を一緒にする。
【００５６】
洗浄溶液
本発明の実施において有用な洗浄溶液は、使用するならば、結合ＲＮＡからそれ以外の構成物質を除くのを補助することができる。一実施形態において、洗浄溶液は、結合ステップで使われた酸性溶液と同様もしくはそれに類似したものとすることができる。おそらく残存ＲＮａｓｅ活性を取り除くために、酸性溶液で洗浄することが都合の良いということが明らかにされている。溶出前に酸を中和すべく、水や中性ｐＨの緩衝液でのさらなる洗浄を行うことができる。水と緩衝液は、ＲＮａｓｅ活性を有さないように調製や処理を施されなくてはならない。
【００５７】
溶出試薬
一実施形態において、結合ＲＮＡを溶液中に遊離させる試薬と固相とを接触させることにより、結合ＲＮＡは固相から溶出される。該溶液は、遊離されたＲＮＡを溶解し、十分に保護する必要がある。溶液中に溶出されたＲＮＡは下流の分子生物学のプロセスに適用可能なものである必要がある。他の実施形態において、固相結合材料から核酸を遊離する試薬は、固相結合材料にある切断可能なリンカー基の切断により、溶出されたＲＮＡを下流の分子生物学のプロセスに適用可能なものにしている。該試薬は、好ましくは、少なくとも１０−４Ｍの強アルカリの水溶液である。アルカリ金属水酸化物、アンモニウム水酸化物、テトラアルキルアンモニウム水酸化物、アルカリ金属カーボネートおよびアルカリ金属酸化物の、濃度が少なくとも１０−４Ｍの溶液が、切断された固相からＲＮＡを迅速に切断・溶出するのに効果的である。切断可能な基がジスルフィド（Ｓ−Ｓ）基であるとき、溶出／切断試薬は、例えば、エタンチオール、メルカプトエタノール、ＤＴＴなどのチオール等、ジスルフィド還元試薬を含有する。切断可能な基がペルオキシド（Ｏ−Ｏ）結合であるとき、溶出／切断試薬は、例えば、チオール、アミン、ホスフィンなどの還元剤を含有する。切断可能な基が酵素により切断されるものであるとき、溶出／切断試薬は適当な酵素を含有する。エステルはエステラーゼもしくはハイドロラーゼを必要とし、アミドもしくはペプチド結合はプロテアーゼまたはペプチダーゼを必要とし、グリコシド基はグリコシダーゼを必要とする。切断可能な基が１，２−ジオキセタン部分であるとき、該ジオキセタンは熱により切断され、溶出試薬は上記のアルカリ溶液であってよい。切断可能な基が誘発可能な１，２−ジオキセタン部分であるとき、溶出／切断試薬は、保護基を除去して不安定なオキシアニオンを生成するのを介して基の切断を誘導する、化学的もしくは酵素的な試薬を含有する。切断可能な基が不安定な１，２−ジオキセタンに変換可能な電子豊富なＣ−Ｃ二重結合であるとき、溶出／切断試薬は、光感受性色素などの１重項酸素発生源を含有する。そのような色素は、可視光と酸素分子と反応して１重項の活性化した酸素を生成することが当業者に知られており、そのような色素としては、ローズベンガル、エオシンＹ、アリザリンレッドＳ、コンゴレッドおよびオレンジＧ、フルオレセイン色素、ローダミン色素、エリスロシンＢ、クロロフィリン３ナトリウム塩、ヘミン塩、ヘマトポルフィリン、メチレンブルー、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン、フラーレンがある。
【００５８】
他の実施形態において、第四級オニウムＮＡＢ基を有する固相結合材料からＲＮＡを遊離するための試薬は、米国特許出願の出願公開２００５／０１０６５８９に開示された組成物から選択される。
【００５９】
溶出ステップは室温で行うことができるが、いずれの好都合な温度であってもよい。溶出温度は、本方法の核酸単離法の成否にとり重要ではない。周囲環境と同じ温度が好ましいが、温度を上げると溶出効率が上がる場合がある。
【００６０】
発明のキット
他の実施形態において、本発明の方法を実施するためのキットが提供される。本発明に従ってサンプルからリボ核酸を単離するためのキットは、いかなる予備的な溶解もせずに、生物サンプルから直接核酸を遊離させることのできるものとして選択された、少なくとも１つの固相結合材料と酸性溶液を含む。固相結合材料は、粒子、微小粒子、磁性粒子、繊維、ビーズ、メンブレン、テストチューブやマイクロウェルなどの他の支持体といった形態をとることができるマトリックスを含む。マトリックスは、共有結合または非共有結合により、場合によっては切断可能なリンカーを介して核酸結合部と結合される。
【００６１】
核酸結合部は、カルボキシル基、ＮＨ２基、アルキルアミン基、ジアルキルアミン基、トリアルキルアンモニウム基を含む第四級アンモニウム基、トリアルキルホスホニウム基を含む第四級ホスホニウム基、トリアリールホスホニウム、混合アルキル・アリールホスホニウム基、第三級スルホニウム基から選択される、１以上のタイプの基を含む。
【００６２】
本発明のキットの１つの要素を構成する酸性溶液は、通常、中性以下のｐＨの水溶液のいずれをも含む。好ましくは溶液は１〜５のｐＨを有し、さらに好ましくは約２〜４である。酸は無機であっても有機であってもよい。塩酸、硫酸、過塩素酸などの無機酸は有用である。モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、アミノ酸を含む有機酸及びそれらの塩も使用することができる。代表的な酸として、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、クエン酸、グリシン、アラニンが挙げられる。塩は、いずれの水溶性の対イオンも有することができ、好ましくはアルカリ金属、アルカリ土類金属である。遷移金属塩を含む酸性溶液も本発明の実施に使用することができる。好ましい遷移金属として、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｏ、ＣｕおよびＺｎ塩を挙げることができる。
【００６３】
キットはさらに溶出試薬と、１以上の任意の洗浄緩衝液と、従来のものと同様のキットの他の構成物、例えば使用説明書、手順、緩衝液、希釈液、を含んでいてもよい。溶出試薬は、少なくとも１０−４Ｍ、好ましくは約１ｍＭ〜約１Ｍからの濃度のアルカリ金属水酸化物溶液またはアンモニウム水酸化物溶液などの強アルカリ水溶液、エタンチオール、メルカプトエタノールまたはＤＴＴを含むチオールなどのジスルフィド還元剤、チオール、アミンまたはホスフィンなどの過酸化物還元剤、エステラーゼ、ハイドロラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、グリコシダーゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素、から選択することができる。固相結合材料が電子豊富なアルケン基などの、１重項酸素発生源との反応により切断可能なリンカーを含む実施形態においては、キットに、上述の光感受性色素を含めることができる。
【実施例】
【００６４】
実施例１ ＲＮＡの単離に有用な固相材料
トリブチルホスホニウムＮＡＢ基と切断可能なアリルチオエステル結合により、機能付与された磁性粒子の合成
ａ）磁鉄鉱の調製。５Ｌのフラスコ内で、３Ｌの水（ｔｙｐｅ１）中にアルゴンガスを１時間注入した。アルゴン雰囲気下、濃縮されたＮＨ４ＯＨ（２８％，１８０ｍＬ）を加えた。１Ｍ ＨＣｌ中の２Ｍ ＦｅＣｌ２ ５０ｍＬと、１Ｍ ＨＣｌ中の１Ｍ ＦｅＣｌ３ ２００ｍＬとの混合物を、漏斗により約１時間以上かけて加えた。固体を、５００〜６００ｍＬを外部にディスク状の磁石をつけたフラスコに注ぎ、各回毎にデカントで上清を廃棄することにより２つのフラスコに集めた。固体を、５００〜６００ｍＬの水（ｔｙｐｅ１）の中で超音波により分散させ、その後磁石で引き寄せて、上清を廃棄することにより洗浄した。上清のｐＨが約８．５以下になるまでこのプロセスを繰り返した。２つのフラスコの内容物を一緒にし、磁鉄鉱を合計約５００ｍＬ中に貯蔵した。
ｂ）５００ｍＬフラスコに３−メチルアミノプロピルトリメチルシラン（１４９．８ｇ）を加え、アルゴンを除いた。氷浴中にフラスコを設置した後、アクリロイロキシトリメチルシラン（１１９．６ｇ）をシリンジを通してゆっくりと加えた。反応液を５分間攪拌し、氷浴を除き、攪拌を２時間続けた。生成物をさらなる精製をすることなく使用した。
ｃ）磁鉄鉱の被覆。５．０ｇの磁鉄鉱を含有するステップａ）からの磁鉄鉱スラリーを１４０ｍＬの水（ｔｙｐｅ１）で希釈し、混合物を超音波処理した。エタノール（１．２５Ｌ）を１５分後に加えた。濃縮されたＮＨ４ＯＨ（２８％，１８０ｍＬ）を３０〜４５分後に加えた。エタノールに溶解した、ステップｂ）からの１．５ｇのシリルエステルと１３．５ｇのＳｉ（ＯＥｔ）４を三回に分けて９０分以上かけて反応液に加えた。２０〜３０ｍＬのエタノールに溶解した３．７５ｇのシリルエステル化合物をその後加え、混合物を攪拌し、９０分間超音波処理した。攪拌は一晩続けた。混合物は２個の１Ｌフラスコに５００ｍＬずつ移し、粒子は磁気によって分離した。固体は２５０ｍＬメタノールで４回、２５０ｍＬの水（ｔｙｐｅ１）で２回、水（ｔｙｐｅ１）で希釈したｐＨ１のＨＣｌ ２５０ｍＬで１回（混合物を磁石に接触させる前に１０分間）、２５０ｍＬの水（ｔｙｐｅ１）で４回、２５０ｍＬのメタノールで４回、次いで２５０ｍＬのアセトンで２回、連続的に洗浄した。固体は一晩空気乾燥した。このステップの間にシリルエステルの加水分解が起こり、カルボン酸基が生成した。
ｄ）前ステップで得られた、カルボン酸で機能付与された磁性粒子（１．０ｇ）を、３０ｍＬの塩化チオニル中に入れ、４時間還流した。過剰の塩化チオニルを磁性固体からデカントした。粒子をＣＨ２Ｃｌ２で数回洗浄し、次のステップに回した。
ｅ）５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に懸濁された、酸性の塩化物イオンで機能付与された粒子を０．２２ｇの１，４−ベンゼンジチオールと０．５２ｍＬのジイソプロピルエチルアミンで処理した。混合物を５分間超音波処理し、オービタルシェイカーで一晩振盪した。固体は磁気による分離を利用して、ＣＨ２Ｃｌ２、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ３ＯＨ、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２で連続的に洗浄した。固体を一晩空気乾燥した。
ｆ）これまでのステップの粒子（約０．９ｇ）と２５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２の混合物を０．８１ｇのトリブチルホスフィンで処理した。混合物を５分間超音波処理し、オービタルシェイカーで一晩振盪した。固体は磁気による分離を利用して、ＣＨ２Ｃｌ２、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ３ＯＨ、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２で連続的に洗浄した。固体は一晩空気乾燥した。
ｇ）これまでのステップの粒子 （約０．８ｇ）と２５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２の混合物を０．２５ｇの４−塩化クロロメチルベンゾイルと０．５２ｍＬのジイソプロピルエチルアミンで処理した。混合物を５分間超音波処理し、オービタルシェイカーで一晩振盪した。固体はＣＨ２Ｃｌ２、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ３ＯＨ、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２で連続的に洗浄した。固体を集めて、一晩空気乾燥した。
ｈ）これまでのステップの粒子（約０．７ｇ）と２５ｍＬｌのＣＨ２Ｃｌ２の混合物を０．４１ｇのトリブチルホスフィンで処理した。混合物を５分間超音波処理し、オービタルシェイカーで計７日間振盪した。固体は磁気による分離を利用して、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ３ＯＨで洗浄した。固体を集めて、乾燥した。
【００６５】
実施例２ より大きな粒子サイズの固相材料
トリブチルホスホニウムＮＡＢと切断可能なアリールチオエステル結合により機能付与された磁性粒子の合成
ａ）５００ｍＬフラスコに３−メチルアミノプロピルトリメトキシシラン（１４９．８ｇ）を入れ、アルゴンでパージした。フラスコを氷浴に設置した後、シリンジを介してゆっくりとアクリロイロキシトリメチルシラン（１１９．６ｇ）を加えた。反応液を５分間攪拌し、氷浴を除き、更に攪拌を２時間続けた。生成物はそれ以上精製することなく使用した。
ｂ）市販の磁鉄鉱（Ｓｔｒｅｍ ｃａｔ．Ｎｏ９３−２６１６ １−５μｍ）５．０ｇを１４０ｍＬの水（ｔｙｐｅ１）と１．２５Ｌのエタノールで希釈した。濃縮したＮＨ４ＯＨ（２８％，１７０ｍＬ）を３０〜４５分後に加えた。エタノールに溶解した、ステップｂ）からの１．５ｇのシリルエステルと１３．５ｇのＳｉ（ＯＥｔ）４を三回に分けて９０分以上かけて反応液に加えた。２０〜３０ｍＬのエタノールに溶解した３．７５ｇのシリルエステル化合物をその後加え、混合物を攪拌し、９０分間超音波処理した。攪拌は一晩続けた。混合物は２個の１Ｌフラスコに５００ｍＬずつ移し、粒子は磁気によって分離した。固体は２５０ｍＬメタノールで４回、２５０ｍＬの水（ｔｙｐｅ１）で２回、水（ｔｙｐｅ１）で希釈したｐＨ１のＨＣｌ ２５０ｍＬで１回（混合物を磁石に接触させる前に１０分間）、２５０ｍＬの水（ｔｙｐｅ１）で４回、２５０ｍＬのメタノールで４回、次いで２５０ｍＬのアセトンで２回、連続的に洗浄した。固体は一晩空気乾燥した。このステップの間にシリルエステルの加水分解が起こり、カルボン酸基が生成した。
ｄ）前ステップで得られた、カルボン酸で機能付与された磁性粒子（１．０ｇ）を、３０ｍＬの塩化チオニル中に入れ、４時間還流した。過剰の塩化チオニルを磁性固体からデカントした。粒子をＣＨ２ＣＬ２で数回洗浄し、次のステップに回した。
ｅ）５０ｍＬのＣＨ２ＣＬ２に懸濁された、酸性の塩化物イオンで機能付与された粒子を０．２２ｇの１，４−ベンゼンジチオールと０．５２ｍＬのジイソプロピルエチルアミンで処理した。混合物を５分間超音波処理し、オービタルシェイカーで一晩振盪した。固体は磁気による分離を利用して、ＣＨ２Ｃｌ２、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ３ＯＨ、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２で連続的に洗浄した。固体を一晩空気乾燥した。
ｆ）これまでのステップの粒子（約０．９ｇ）と２５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２の混合物を０．８１ｇのトリブチルホスフィンで処理した。混合物を５分間超音波処理し、オービタルシェイカーで一晩振盪した。固体は磁気による分離を利用して、ＣＨ２Ｃｌ２、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ３ＯＨ、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２で連続的に洗浄した。固体は一晩空気乾燥した。
ｇ）これまでのステップの粒子（約０．８ｇ）と２５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２の混合物を０．２５ｇの塩化４−クロロメチルベンゾイルと０．５２ｍＬのジイソプロピルエチルアミンで処理した。混合物を５分間超音波処理し、オービタルシェイカーで一晩振盪した。固体は１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ３ＯＨ、で連続的に洗浄した。固体を集めて、一晩空気乾燥した。
ｈ）これまでのステップの粒子（約０．７ｇ）と２５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２の混合物を０．４１ｇのトリブチルホスフィンで処理した。混合物を５分間超音波処理し、オービタルシェイカーで計７日間振盪した。固体は磁気による分離を利用して、ＣＨ２Ｃｌ２、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ３ＯＨ、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２で連続して洗浄した。固体を集めて、乾燥した。
【００６６】
実施例３ 機能付与した磁性ポリマーの合成
２５ｍｇの固体を含む、ビーズ（Ｄｙｎａｌ ｍａｇｎｅｔｉｃ ＣＯＯＨ ビーズ，Ｌｏｔ Ｎｏ．Ｇ３６７１０）の一部を磁石を用いてデカントした。ビーズをその後、１ｍＬの水で３回、１ｍＬのＣＨ３ＣＮで３回洗い、４時間乾燥した。ビーズを１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に懸濁し、２８．８ｍｇのＥＤＣを加えて３０分間振盪した。１，４−ベンゼンジチオール（３０ｍｇ）を混合物に加えた。チューブを１分間超音波処理し、一晩振盪した。上清を除き、ビーズを磁石を利用して、１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回、１ｍＬの１：１ ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２で１回、１ｍＬのＭｅＯＨで４回、１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回洗浄した。
ビーズを１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に懸濁し、１４０μＬのトリブチルホスフィンを加えた。反応液を１分間ボルテックスし、計３日間振盪した。磁石の上に置きながら溶媒をデカントした。ビーズは磁気を用いて、１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回、１ｍＬの１：１ ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２で１回、１ｍＬのＭｅＯＨで４回、１ｍＬの１：１ ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２で１回、１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回洗浄した。
１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の、これまでのステップの粒子の混合物（約２５ｍｇ）を２ｍｇの塩化４−クロロメチルベンゾイルと５２μＬのジイソプロピルエチルアミンで処理した。混合物を１０秒ボルテックスし、５分間超音波処理し、オービタルシェイカーで一晩振盪した。固体を磁石による分離を利用して、１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回、１ｍＬの１：１ ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２で１回、１ｍＬのＭｅＯＨで４回、１ｍＬの１：１ ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２で１回、１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回、連続的に洗浄した。
これまでのステップの粒子の混合物（２５ｍｇ）と１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２を３０ｍｇのトリブチルホスフィンで処理した。混合物を２分間超音波処理し、オービタルシェイカーで計６日間振盪した。固体は磁石による分離を利用して、１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回、１ｍＬのＭｅＯＨで３回、１ｍＬの水で２回、連続的に洗浄した。１ｍＬの水を加えて、ビーズ（２５ｍｇ／ｍＬ）のストックソリューションとした。
【００６７】
実施例４ 機能付与した磁性ポリマーの合成
２×０．５３５ｍＬのＳｅｒａ−Ｍａｇ（登録商標）磁性カルボキシレート修飾微小粒子の懸濁液（Ｓｅｒａｄｙｎ）（合計５０ｍｇの粒子を含む）から磁性粒子を磁気を用いて集め、上清をデカントした。次に、ビーズを１ｍＬの水で３回、１ｍＬのＣＨ３ＣＮで３回、１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で３回洗浄した。ビーズを３．６ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に懸濁し、６０ｍｇのＥＤＣを加えて３０分間振盪した。
リンカーの調製：１，４−ベンゼンジチオール（１１．９７ｇ）を３００ｍＬに溶解し、溶液を−７８℃に冷却した。８．８６ｇの４−クロロメチルベンゾイルクロライドと３．８ｍＬのピリジンを１００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解した溶液を１時間以上かけて滴下した。反応溶液を室温まで暖め、一晩放置した。検査の後、１ｇの不純物を含んだ固体生成物を洗浄して２００ｍｇの純粋な生成物を得た。ろ過クロマトグラフィーによって追加分を単離することができた。
リンカー（６０ｍｇ）の４００μＬのＤＭＦ溶液を混合物に加えた。チューブを１分間超音波処理し、一晩振盪した。ビーズを２５ｍｇずつに分けてその後の処理を行った。上清を除き、ビーズを磁気を用いながら、１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回、１ｍＬの１：１ ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２で１回、１ｍＬのＭｅＯＨで４回、１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回洗浄した。
粒子は１０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で懸濁し、７５μＬのトリブチルホスフィンを加えた。反応混合物を１分間ボルテックスし、計７日間振盪した。ビーズを２５ｍｇずつに分けてその後の処理を行った。磁石の上に置きながら、溶媒をデカントした。ビーズは磁気を用いながら、１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で３回、１ｍＬの１：１ ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２で１回、１ｍＬのＭｅＯＨで４回、１ｍＬの水で２回洗浄した。１ｍＬの水を加えて、ビーズ（２５ｍｇ／ｍＬ）のストックソリューションとした。
【００６８】
実施例５ ＲＮＡの抽出に有用な酸性溶液
ＲＮＡの回収における本方法の有用性を示し、いくつかの条件と試薬の相対的な効率性を評価するために、簡単な試験システムを用いた。１００μＬの試験溶液と１００μＬのウシ胎児血清（ＦＢＳ）とを混合した。１μｇ／μＬのルシフェラーゼＲＮＡ２μＬを加え、混合物を１分間ボルテックスにより混合した。１００μＬの試験溶液に入った実施例１の粒子２ｍｇの懸濁液と該混合物とを一緒にし、３０秒間ボルテックスにより混合した。磁性ラック上で粒子から液体を除き、粒子は、２００μＬの試験溶液で２回、２００μＬの０．１％ ＤＥＰＣ処理水で２回、連続的に洗浄した。５０ｍＭのＮａＯＨ ５０μＬと該粒子とを一緒にし、１分間ボルテックスにより混合し、溶出液を除くことにより、ＲＮＡを抽出した。初めの結合反応からの上清は、溶液から除かれ粒子に結合したＲＮＡの量を決定するため、エチジウム染色ゲルと、蛍光染色により分析した。溶出液は、本方法により抽出されたＲＮＡの量と質を決定するためエチジウム染色ゲルと蛍光染色により分析した。下記の溶液の使用によりＲＮＡの定量的結合と、多量の結合ＲＮＡの溶出が得られた。
試験溶液 ｐＨ 試験溶液 ｐＨ
クエン酸ナトリウム０．３Ｍ ４．０ グリシン ０．３Ｍ ３．０
クエン酸ナトリウム０．３Ｍ ３．５ グリシン ０．３Ｍ ２．５
クエン酸ナトリウム０．３Ｍ ３．０ グリシン ０．０５Ｍ ２．５
クエン酸ナトリウム０．０５Ｍ ３．０ グルタミン酸ナトリウム０．３Ｍ ４．０
酢酸カリウム ０．３Ｍ ４．０ グルタミン酸ナトリウム０．３Ｍ ３．２
酢酸カリウム ０．０５Ｍ ４．０ コハク酸ナトリウム ０．３Ｍ ４．０
酢酸カリウム ０．３Ｍ ３．７ コハク酸ナトリウム ０．３Ｍ ３．８
酢酸ナトリウム ０．３Ｍ ４．０
【００６９】
実施例６ 大腸菌培養液からのＲＮＡの抽出
培地中で生育している大腸菌からのＲＮＡ回収における本方法の有用性を示し、いくつかの条件と試薬の相対的な効率性を評価するために簡単な試験システムを用いた。
２００μＬの大腸菌培養液をペレットにし、培地を除いた。ペレットを２００μＬの試験溶液及び２ｍｇの実施例１の粒子と一緒にし、３０秒間ボルテックスして混合した。磁性ラック上で粒子から液体を除き、粒子を２００μＬの洗浄溶液で２回、２００μＬの０．１％ＤＥＰＣ処理水で２回洗浄した。粒子を５０ｍＭ ＮａＯＨおよび２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．８の溶液５０μＬと混合し、１分間ボルテックス混合し、液体を除くことにより、ＲＮＡを単離した。初めの結合反応からの上清は、溶液から除かれ粒子に結合したＲＮＡの量を決定するため、エチジウム染色ゲルと、蛍光染色により分析した。溶出液は、本方法により抽出されたＲＮＡの量と質を決定するためエチジウム染色ゲルと蛍光染色により分析した。下記の溶液の使用により多量の無傷ＲＮＡを回収することができた。一方、ペレットの結合と粒子の洗浄を０．１％ ＤＥＰＣ処理水のもとで行なったときは、分解したＲＮＡしか取り出せなかった。
試験溶液 洗浄溶液
酢酸 ０．０５Ｍ クエン酸ナトリウム ０．３Ｍ ｐＨ ３
酢酸 ０．１Ｍ クエン酸ナトリウム ０．３Ｍ ｐＨ ３
酢酸 ０．２Ｍ クエン酸ナトリウム ０．３Ｍ ｐＨ ３
トリフルオロ酢酸 ０．０５Ｍ トリフルオロ酢酸 ０．０５Ｍ
トリフルオロ酢酸 ０．１Ｍ トリフルオロ酢酸 ０．１Ｍ
トリフルオロ酢酸 ０．２Ｍ トリフルオロ酢酸 ０．２Ｍ
【００７０】
実施例７ 大腸菌培養液からのＲＮＡ抽出のための追加の条件
下記の試験酸性溶液を用いて、実施例６の方法に従って大腸菌からの単離を行なっても、電気泳動ゲルのパターンで裏付けられるように無傷のＲＮＡが得られた。
試験溶液
酢酸亜鉛 ０．０５Ｍ＋０．１Ｍ 酢酸アンモニウム ｐＨ４．０
メチルトリブチルホスホニウム メトスルフェート ０．１Ｍ−１Ｍ
クエン酸ナトリウム０．０５Ｍ ｐＨ３
【００７１】
実施例８ Ａｒｍｏｒｅｄ ＲＮＡからのＲＮＡの抽出
Ａｒｍｏｒｅｄ ＲＮＡ（登録商標）（Ａｍｂｉｏｎ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）はタンパク質で被覆されたｓｓＲＮＡであり、擬似的なウィルス粒子に相当する。ｇａｇ領域からの配列とウィルス被覆タンパク質を含む、ＨＩＶ−Ｂ配列のＡｒｍｏｒｅｄ ＲＮＡを、本発明方法が複雑なサンプルからＲＮＡを単離できるかを試すために使用した。
血漿中のＡｒｍｏｒｅｄ ＲＮＡからＲＮＡを抽出する代表的な方法は下記の通りである。５μＬのＡｒｍｏｒｅｄ ＲＮＡ（５００００コピーを含有する）と１００μＬのＥＤＴＡ抗凝固処理血漿（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．，Ｋｅｒｒｖｉｌｌｅ）からなる１０５μＬの溶液を１００μＬの試験溶液（例えば、５０ｍＭ酢酸カリウム、ｐＨ４．０）と混ぜ、ボルテックスで簡単に混合した。１分後、混合物を５０ｍＭ、ｐＨ４．０の酢酸カリウム１００μＬ中の実施例１の粒子２ｍｇと一緒にし、スラリーを３０秒間ボルテックスにより混合した。磁性ラック上で粒子を分離し、２００μＬの酢酸カリウム５０ｍＭ、ｐＨ４．０で２回、２００μＬの０．１％ＤＥＰＣ処理水で２回洗浄した。粒子を５０μＬの５０ｍＭ ＮａＯＨと１分間ボルテックス混合し、溶液を除くことにより、ＲＮＡを溶出した。１０５μＬの血漿／Ａｒｍｏｒｅｄ ＲＮＡを、試験溶液の代わりに２００μＬの０．１％ＤＥＰＣ処理水及び２ｍｇの粒子と混ぜたものをコントロールとし、比較例とした。
ＲＮＡ含有溶出液は、ｇａｇ遺伝子断片を増幅するためのプライマーセットを用いてＲＴ−ＰＣＲにかけた。増幅反応と検出は、ｉＣｙｃｌｅｒ 装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎを含むｉＳｃｒｉｐｔ Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により行なった。
下記試験溶液が、水のコントロールより有意に低いＣＴ値により裏付けられる、増幅可能なＲＮＡの回収を可能にした。
試験溶液
酢酸カリウム ０．３Ｍ ｐＨ４．０
酢酸カリウム ０．０５Ｍ ｐＨ４．０
酢酸 ０．０５Ｍ
酢酸 ０．２Ｍ
トリフルオロ酢酸 ０．０５Ｍ
ピリジニウムＨＣｌ ０．０５Ｍ
塩酸 ０．０２５Ｍ
テトラブチルホスホニウム塩酸塩 ０．０５Ｍ
酢酸カリウム ０．０５Ｍ ＋ 酢酸 ０．０５Ｍ
酢酸亜鉛 ０．０５Ｍ ｐＨ４．０
酢酸カリウム ０．０５Ｍ，ｐＨ４．０＋トリフルオロ酢酸 ０．０５Ｍ
５０：５０ ｐＨ １．８
７０：３０ ｐＨ ２．１
８０：２０ ｐＨ ２．５
酢酸亜鉛 ０．０５Ｍ，ｐＨ４．０＋トリフルオロ酢酸 ０．０５Ｍ（８０：２０）
酢酸マグネシウム ０．０５Ｍ ｐＨ４．０
酢酸アンモニウム ０．０５Ｍ
酢酸テトラブチルアンモニウム ０．０５Ｍ
酢酸テトラエチルアンモニウム ０．０５Ｍ
酢酸亜鉛 ０．０５Ｍ，ｐＨ４．０＋トリフルオロ酢酸（ｐＨ２．０，２．５，３．０，３．５）
酢酸亜鉛 ０．０５Ｍ＋グリシン ０．０５Ｍ ｐＨ３．３
酢酸亜鉛 ０．０５Ｍ＋クエン酸ナトリウム ０．０５Ｍ ｐＨ３．３
酢酸亜鉛 ０．０５Ｍ＋クエン酸ナトリウム ０．０５Ｍ ｐＨ４．２
塩化亜鉛 ０．０５Ｍ＋グリシン ０．０５Ｍ ｐＨ２．７５
塩化亜鉛 ０．０５Ｍ＋クエン酸ナトリウム ０．０５Ｍ ｐＨ２．５
【００７２】
実施例９ Ａｒｍｏｒｅｄ ＲＮＡからのＲＮＡの抽出
他の方法として、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を血漿の代わりに用いられた。１０５μＬのＦＢＳ／Ａｒｍｏｒｅｄ ＲＮＡを、試験溶液の代わりに２００μＬの０．１％ＤＥＰＣ処理水及び２ｍｇの粒子と混ぜたものをコントロールとし、比較例とした。実施例４の記載と同様に、ＲＮＡを含む溶出液をＲＴ−ＰＣＲにより分析した。下記のものと実施例４の試験溶液のほとんどは、水のコントロールより有意に低いＣＴ値により裏付けられる、増幅可能なＲＮＡの回収を可能にした。
試験溶液
グリシン ０．０５Ｍ ｐＨ２．５
グリシン ０．３Ｍ ｐＨ２．５
グリシン ０．３Ｍ ｐＨ３．０
クエン酸ナトリウム ０．３Ｍ ｐＨ３．５
クエン酸ナトリウム ０．１Ｍ ｐＨ３．５
クエン酸ナトリウム ０．３Ｍ ｐＨ３．０
【００７３】
実施例１０
血漿中のＡｒｍｏｒｅｄ ＲＮＡの単離と増幅のための実施例８の方法を、実施例１、２、３、及び４それぞれの固相材料を様々な酸性溶液とともに用いて成功裏に行なった。
固相 酸性溶液
実施例１ 酢酸コバルト ０．０５Ｍ，ｐＨ４．０
実施例１ 酢酸マンガン ０．０５Ｍ，ｐＨ４．０
実施例１ 酢酸コバルト ０．０５Ｍ＋酢酸カリウム０．０５Ｍ，ｐＨ４．０
実施例２ 酢酸カリウム ０．０５Ｍ，ｐＨ４．０
実施例２ 酢酸亜鉛 ０．０５Ｍ，ｐＨ４．０
実施例３ 酢酸亜鉛 ０．０５Ｍ，ｐＨ４．０
実施例４ 酢酸亜鉛 ０．０５Ｍ，ｐＨ４．０
【００７４】
実施例１１ 血漿からのＨＩＶ ＲＮＡの抽出と分析
本発明の方法を、ＨＩＶ陽性の血漿をＥＤＴＡ抗凝固処理して得た血液からＲＮＡを抽出するのに用いた。サンプルは、ＣＯＢＡＳ ＡＭＰＬＩＣＯＲ ＨＩＶ−１ ＭＯＮＩＴＯＲ ＴＥＳＴ ｖｅｒ．１．５（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）を使ってＨＩＶ ＲＮＡが存在するかを試験した。この試験は、ＲＮＡのｃＤＮＡコピーへの逆転写を行い、ｇａｇ遺伝子の高度に保存された領域内の１５５塩基対の配列をＰＣＲにより増幅し、ビオチン標識したアンプリコンを磁性粒子に結合したオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせ、ビオチン標識にアビジンーセイヨウワサビ ペルオキシダーゼ結合体を結合させ、ＴＭＢを用いて比色定量検出を行なうことによりＨＩＶ−１ ＲＮＡの量を調べる、自動化されたＲＴ−ＰＣＲである。
キットと共に提供されるサンプルの調製方法は、下記の通り本発明を使用したものに置き換えられた。
【００７５】
ＨＩＶ ＲＮＡ抽出の手順
１．２ｍｇの実施例１の粒子が１００μＬの５０ｍＭ ＫＯＡｃ，ｐＨ４中に懸濁したスラリーを調製した。
２．１００μＬの５０ｍＭ ＫＯＡｃ，ｐＨ４を１００μＬの血漿に加えた。ボルテックスミキサーにかけ、室温で１分間インキュベートした。
３．血漿溶液を該ビーズ懸濁液に加え、混合物を３０秒ボルテックスで混合した。
４．上清を取り除き、２００μＬの５０ｍＭ ＫＯＡｃ，ｐＨ４を加えて５秒間ボルテックスした。
５．ステップ４を再度行なった。
６．上清を取り除き、２００μＬの０．１％ＤＥＰＣ処理水を加えて５秒間ボルテックスした。
７．ステップ６を再度行なった。
８．残存しているバッファーをすべて取り除いた。５０μＬの５０ｍＭ ＮａＯＨを加えて１分間ボルテックスした。
９．溶出液を新しい１．５ｍＬチューブに移した。
１０．１５０μＬの０．１％ＤＥＰＣ処理水を粒子に加えて１分間ボルテックスし、第二の溶出液とした。
１１．第二の溶出液を初めの溶出液と一緒にした。
１２．まとめた溶出液をＨＩＶ−１ ＭＯＮＩＴＯＲ Ｔｅｓｔ，ｖｅｒ．１．５にかけた。
ＣＯＢＡＳ ＡＭＰＬＩＣＯＲで増幅を行なった後、ハイブリダイゼーション、抗体結合、段階希釈を検出の前に行なった。上記のプロトコルを使用すると、１．８８×１０５粒子／ｍＬのＨＩＶを含むことが分かっている血漿標本の分析では、１：７２９希釈でＥＬＩＳＡにおいて検出が可能であった。
【００７６】
実施例１２ ヒト全血からのＲＮＡの抽出
ヒト全血からのＲＮＡ回収における本方法の有用性を示すために簡単な試験システムを用いた。様々な条件と試薬の相対的な効率を評価するために、無傷ＲＮＡを保持するであろう新たに採血した血液のモデルとして、培養したヒトＴリンパ球細胞（Ｊｕｒｋａｔ）を全血（ＣＰＤ抗凝固処理）に加えた。
７×１０５のＪｕｒｋａｔ細胞をペレットにし、培地を除いた。ペレットを１００μＬのヒト全血と混合した。該血液を、実施例１または２の粒子を２ｍｇ含有する１００μＬの試験溶液に加え、３０秒ボルテックスで混合した。磁性ラック上で粒子から液体を除き、粒子を、５００μＬの洗浄溶液で２回、５００μＬの０．１％ＤＥＰＣ処理水で２回、連続して洗浄した。粒子を５０ｍＭ ＮａＯＨと２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０の溶液５０μＬと混合し、１分間ボルテックスにかけ、溶液を取り出すことでＲＮＡを単離した。溶出液を５０μＬの１００ｍＭ 酢酸亜鉛，ｐＨ４で中和し、実施例１または２の粒子２ｍｇを含有する１００μＬの試験溶液と混合して３０秒ボルテックスにかけることで、新たなビーズと再結合させた。磁性ラック上で粒子から液体を除き、粒子を、５００μＬの洗浄溶液で２回、５００μＬの０．１％ＤＥＰＣ処理水で２回、連続的に洗浄した。粒子を５０ｍＭ ＮａＯＨと２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０の溶液５０μＬと混合し、１分間ボルテックスにかけ、溶液を取り出すことでＲＮＡを単離した。
ＲＮＡを含む溶出液をＧＡＤＰＨ、１８Ｓ遺伝子のＲＮＡとＤＮＡを増幅させるためのプライマーセットを用いた、ＲＴ−ＰＣＲとＰＣＲにかけた。増幅反応と検出は、ｉＣｙｃｌｅｒ 装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎを含むｉＳｃｒｉｐｔ Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により行なった。ポジティブな増幅結果が得られた（ＲＴ−ＰＣＲのＣＴ＜ＰＣＲのＣＴ）。
固相 酸性溶液
実施例１ 酢酸亜鉛 ０．０５Ｍ，ｐＨ４．０
実施例１ ３，３−ジメチルグルタル酸 ０．０５Ｍ，ｐＨ３．２
実施例２ 酢酸亜鉛 ０．０５Ｍ，ｐＨ４．０
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞もしくはウィルスを１以上含む生物サンプルからリボ核酸を抽出する方法において、
ａ）サンプルを酸性溶液と接触させ、混合物を形成すること、
ｂ）初めにいかなる予備的な溶解も行うことなく、生物サンプルから直接リボ核酸を遊離させることのできるものとして選択された固相結合材料と、前記混合物とを混合し、混合の際、カオトロピック剤や洗浄剤を溶解を行なうために使用せず、混合することによって前記固相結合材料が細胞およびウィルスの溶解を引き起こしてリボ核酸を遊離させること、
ｃ）前記固相結合材料上にリボ核酸を結合させること、
を含むことを特徴とするリボ核酸の抽出方法。
【請求項２】
ｄ）リボ核酸が結合した前記固相結合材料からサンプルを分離すること、
ｅ）１以上の洗浄溶液によって前記固相結合材料を任意に洗浄すること、
ｆ）前記固相結合材料と、溶液中に結合ＲＮＡを遊離させるための試薬とを接触させることにより、該固相結合材料から前記結合リボ核酸を溶出させること、
をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルと前記酸性溶液との混合物の形成ステップを、前記混合物と前記固相結合材料との混合ステップと同時に行う請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルと前記酸性溶液との混合物を、前記混合物と前記固相結合材料との混合ステップより前に形成する請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記固相結合材料が、粒子、微小粒子、繊維、ビーズ、メンブレン、テストチューブおよびマイクロウェルから選択される請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記固相結合材料が、マトリックス部と核酸結合部とを含む請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記マトリックス部が、シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマー、不溶性多糖、金属、金属酸化物および金属硫化物から選択される請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記マトリックス部が、シリカ、ガラス、合成ポリマー又は不溶性多糖により被覆された磁気反応性材料から選択される請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記固相結合材料が、直径が１０μｍ未満である微小粒子を含む請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記微小粒子が磁気反応性である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
２以上のサイズの粒子の混合物を使用する請求項９記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１のサイズの粒子が核酸結合部を有し、少なくとも１の他のサイズの粒子が核酸結合部を有していない請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
リボ核酸の捕捉と結合を可能にする、共有結合により結合された核酸結合部を前記固相結合材料がさらに含む請求項６記載の方法。
【請求項１４】
リボ核酸の捕捉と結合を可能にする、非共有結合により会合させられた核酸結合部を前記固相材料がさらに含む請求項６記載の方法。
【請求項１５】
共有結合により導入され、ヒドロキシル基、シラノール基、カルボキシル基、アミノ基、アンモニウム基、第四級アンモニウム塩基、第四級ホスホニウム塩基および第三級スルホニウム塩基から選択される表面官能基であって、細胞を破壊し、核酸を誘引する役割を果たす表面官能基で機能付与されたシリカベースの材料を前記固相結合材料がさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項１６】
共有結合により導入され、ヒドロキシル基、シラノール基、カルボキシル基、アミノ基、アンモニウム基、第四級アンモニウム塩基、第四級ホスホニウム塩基および第三級スルホニウム塩基から選択される表面官能基であって、細胞を破壊し、核酸を誘引する役割を果たす表面官能基を有するポリマー材料を前記固相結合材料がさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項１７】
カルボキシル基、ＮＨ２基、アルキルアミン基、ジアルキルアミン基、第三級又は第四級オニウム基、もしくはこれらの基の１超過の混合物から選択される複数の核酸結合基から前記核酸結合部が構成される請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
第四級トリアルキルアンモニウム、第四級トリアルキルホスホニウム、第四級トリアリールホスホニウム、アルキル・アリール基が混合した第四級ホスホニウム基および第三級スルホニウム基から選択される複数の核酸結合基から前記核酸結合部が構成される請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸結合基が、基内のアルキル基がそれぞれ４個以上の炭素原子を有し、細胞とウィルスの溶解を引き起こしてリボ核酸を遊離させる、第四級トリアルキルアンモニウム基および第四級トリアルキルホスホニウム基から選択される請求項１３記載の方法。
【請求項２０】
前記固相結合材料が、選択的に切断可能な結合を通じてマトリックスに結び付けられた核酸結合基を含む請求項６記載の方法。
【請求項２１】
前記酸性溶液が、ｐＨが１〜５の範囲である水溶液を含む請求項１記載の方法。
【請求項２２】
前記酸性溶液が、ｐＨが２〜４の範囲である水溶液を含む請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記酸性溶液が、ピリジニウム塩、無機酸、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、アミノ酸、及びそれらのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、遷移金属塩、ＮＨ４＋塩、第四級アンモニウム塩、第四級ホスホニウム塩から選択される有機又は無機酸の水溶液を含む請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
結合したリボ核酸を前記固相結合材料から遊離するための試薬が、１ｍＭから１Ｍの濃度のアルカリを有するアルカリ性溶液を含む請求項２記載の方法。
【請求項２５】
前記固相結合材料が、磁性粒子マトリックスに切断可能なアリールチオエステル結合を介して結合されているトリブチルホスホニウム核酸結合基を有する磁性粒子を含む請求項１記載の方法。
【請求項２６】
前記固相結合材料が下記式、
（式中、Ｍは共有結合で結び付けられたリンカー基で機能付与されたシリカベースの磁性粒子である）で表わされる請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記生物サンプルが、バクテリアの培養液、バクテリアの培養液からペレットにされた細胞、血液、血漿、血清、尿、唾液、精液、ＣＳＦ、植物細胞、動物細胞及び組織ホモジェネートから選択される請求項１記載の方法。
【請求項２８】
バクテリアの培養液、バクテリアの培養液からペレットにされた細胞、血液、血漿、血清、尿、唾液、精液、ＣＳＦ、植物細胞、動物細胞及び組織ホモジェネートから選択され、１以上の細胞またはウィルスを含有する生物サンプルからリボ核酸を抽出する、リボ核酸の抽出方法において、
ａ）ピリジニウム塩、無機酸、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、アミノ酸、及びそれらのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、亜鉛塩、ＮＨ４＋塩、第四級アンモニウム塩、第四級ホスホニウム塩から選択される有機又は無機酸の水溶液を含み、ｐＨが１〜５である酸性溶液と前記サンプルとを接触させて混合液を形成すること、
ｂ）マトリックス部と核酸結合部を含み、初めにいかなる予備的な溶解も行うことなく、生物サンプルから直接リボ核酸を遊離させることのできるものとして選択された固相結合材料と、前記混合物とを混合し、混合の際、カオトロピック剤や洗浄剤を溶解を行なうために使用せず、混合することによって前記核酸結合基が細胞およびウィルスの溶解を引き起こしてリボ核酸を遊離させること、
ｃ）前記固相結合材料上にリボ核酸を結合させること、
を含むことを特徴とするリボ核酸の抽出方法。
【請求項２９】
前記固相結合材料が、磁性粒子マトリックスに切断可能なアリールチオエステル結合を介して結合されているトリブチルホスホニウム核酸結合基を有する磁性粒子を含む請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記固相材料が、下記式、
（式中、Ｍは共有結合で結び付けられたリンカー基で機能付与されたシリカベースの磁性粒子である）で表わされる請求項２９の方法。
【請求項３１】
ｄ）リボ核酸が結合した前記固相結合材料からサンプルを分離すること、
ｅ）１以上の洗浄溶液によって前記固相結合材料を任意に洗浄すること、
ｆ）前記固相結合材料と、１ｍＭから１Ｍの濃度のアルカリを有するアルカリ溶液を含む試薬とを接触させて前記結合ＲＮＡを溶液中に遊離することにより、前記固相結合材料から前記結合リボ核酸を溶出させること、
をさらに含む請求項３０の方法。
【請求項３２】
バクテリアの培養液、バクテリアの培養液からペレットにされた細胞、血液、血漿、血清、尿、唾液、精液、ＣＳＦ、植物細胞、動物細胞及び組織ホモジェネートから選択され、１以上の細胞またはウィルスを含有する生物サンプルからリボ核酸を単離する、リボ核酸の単離方法において、
ａ）ピリジニウム塩、無機酸、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、アミノ酸、及びそれらのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、遷移金属塩、ＮＨ４＋塩、第四級アンモニウム塩、第四級ホスホニウム塩から選択される有機又は無機酸の水溶液を含み、ｐＨが１〜５である酸性溶液と前記サンプルを接触させて混合液を形成すること、
ｂ）磁性粒子マトリックスに切断可能なアリールチオエステル結合を介して結合されているトリブチルホスホニウム核酸結合基を有する磁性粒子を含む固相結合材料であって、初めにいかなる予備的な溶解も行なうことなく、生物サンプルから直接リボ核酸を遊離させることのできるものとして選択された固相結合材料と、前記混合物とを混合し、混合の際、カオトロピック剤や洗浄剤を溶解を行なうために使用せず、混合することによって前記核酸結合基が細胞およびウィルスの溶解を引き起こしてリボ核酸を遊離させること、
ｃ）前記固相結合材料上にリボ核酸を結合させること、
ｄ）リボ核酸が結合した前記固相結合材料からサンプルを分離すること、
ｅ）１以上の洗浄溶液によって前記固相結合材料を任意に洗浄すること、
ｆ）選択的に切断可能な結合を切断試薬により切断することによりリボ核酸を前記固相結合材料から遊離すること、
を含むことを特徴とするリボ核酸の単離方法。
【請求項３３】
前記切断可能な結合が、加水分解により切断可能な基、ジスルフィド基、ペルオキシド結合、エステラーゼ、ハイドロラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、及びグリコシダーゼから選択される酵素により切断可能な基、切断可能な１，２−ジオキセタン部分、電子豊富なＣ−Ｃ二重結合であって二重結合が少なくとも１つの酸素、硫黄、窒素原子に結びついたもの、ケテンジチオアセタール化合物、ニトロ置換芳香族エーテル及び同エステルから選択される光により切断可能なリンカー基、から選択される請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記加水分解により切断可能な基が、カルボン酸エステル、カルボン酸無水物、チオエステル、炭酸エステル、チオカーボネートエステル、ウレタン、イミド、スルホンアミド、スルホンイミド、スルホネートエステルから選択される請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記加水分解により切断可能な結合が、１ｍＭから１Ｍの濃度のアルカリを有するアルカリ溶液を含む試薬との反応により切断される請求項３４記載の方法。
【請求項１】
細胞もしくはウィルスを１以上含む生物サンプルからリボ核酸を抽出する方法において、
ａ）サンプルを酸性溶液と接触させ、混合物を形成すること、
ｂ）初めにいかなる予備的な溶解も行うことなく、生物サンプルから直接リボ核酸を遊離させることのできるものとして選択された固相結合材料と、前記混合物とを混合し、混合の際、カオトロピック剤や洗浄剤を溶解を行なうために使用せず、混合することによって前記固相結合材料が細胞およびウィルスの溶解を引き起こしてリボ核酸を遊離させること、
ｃ）前記固相結合材料上にリボ核酸を結合させること、
を含むことを特徴とするリボ核酸の抽出方法。
【請求項２】
ｄ）リボ核酸が結合した前記固相結合材料からサンプルを分離すること、
ｅ）１以上の洗浄溶液によって前記固相結合材料を任意に洗浄すること、
ｆ）前記固相結合材料と、溶液中に結合ＲＮＡを遊離させるための試薬とを接触させることにより、該固相結合材料から前記結合リボ核酸を溶出させること、
をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルと前記酸性溶液との混合物の形成ステップを、前記混合物と前記固相結合材料との混合ステップと同時に行う請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルと前記酸性溶液との混合物を、前記混合物と前記固相結合材料との混合ステップより前に形成する請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記固相結合材料が、粒子、微小粒子、繊維、ビーズ、メンブレン、テストチューブおよびマイクロウェルから選択される請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記固相結合材料が、マトリックス部と核酸結合部とを含む請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記マトリックス部が、シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマー、不溶性多糖、金属、金属酸化物および金属硫化物から選択される請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記マトリックス部が、シリカ、ガラス、合成ポリマー又は不溶性多糖により被覆された磁気反応性材料から選択される請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記固相結合材料が、直径が１０μｍ未満である微小粒子を含む請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記微小粒子が磁気反応性である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
２以上のサイズの粒子の混合物を使用する請求項９記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１のサイズの粒子が核酸結合部を有し、少なくとも１の他のサイズの粒子が核酸結合部を有していない請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
リボ核酸の捕捉と結合を可能にする、共有結合により結合された核酸結合部を前記固相結合材料がさらに含む請求項６記載の方法。
【請求項１４】
リボ核酸の捕捉と結合を可能にする、非共有結合により会合させられた核酸結合部を前記固相材料がさらに含む請求項６記載の方法。
【請求項１５】
共有結合により導入され、ヒドロキシル基、シラノール基、カルボキシル基、アミノ基、アンモニウム基、第四級アンモニウム塩基、第四級ホスホニウム塩基および第三級スルホニウム塩基から選択される表面官能基であって、細胞を破壊し、核酸を誘引する役割を果たす表面官能基で機能付与されたシリカベースの材料を前記固相結合材料がさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項１６】
共有結合により導入され、ヒドロキシル基、シラノール基、カルボキシル基、アミノ基、アンモニウム基、第四級アンモニウム塩基、第四級ホスホニウム塩基および第三級スルホニウム塩基から選択される表面官能基であって、細胞を破壊し、核酸を誘引する役割を果たす表面官能基を有するポリマー材料を前記固相結合材料がさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項１７】
カルボキシル基、ＮＨ２基、アルキルアミン基、ジアルキルアミン基、第三級又は第四級オニウム基、もしくはこれらの基の１超過の混合物から選択される複数の核酸結合基から前記核酸結合部が構成される請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
第四級トリアルキルアンモニウム、第四級トリアルキルホスホニウム、第四級トリアリールホスホニウム、アルキル・アリール基が混合した第四級ホスホニウム基および第三級スルホニウム基から選択される複数の核酸結合基から前記核酸結合部が構成される請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸結合基が、基内のアルキル基がそれぞれ４個以上の炭素原子を有し、細胞とウィルスの溶解を引き起こしてリボ核酸を遊離させる、第四級トリアルキルアンモニウム基および第四級トリアルキルホスホニウム基から選択される請求項１３記載の方法。
【請求項２０】
前記固相結合材料が、選択的に切断可能な結合を通じてマトリックスに結び付けられた核酸結合基を含む請求項６記載の方法。
【請求項２１】
前記酸性溶液が、ｐＨが１〜５の範囲である水溶液を含む請求項１記載の方法。
【請求項２２】
前記酸性溶液が、ｐＨが２〜４の範囲である水溶液を含む請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記酸性溶液が、ピリジニウム塩、無機酸、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、アミノ酸、及びそれらのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、遷移金属塩、ＮＨ４＋塩、第四級アンモニウム塩、第四級ホスホニウム塩から選択される有機又は無機酸の水溶液を含む請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
結合したリボ核酸を前記固相結合材料から遊離するための試薬が、１ｍＭから１Ｍの濃度のアルカリを有するアルカリ性溶液を含む請求項２記載の方法。
【請求項２５】
前記固相結合材料が、磁性粒子マトリックスに切断可能なアリールチオエステル結合を介して結合されているトリブチルホスホニウム核酸結合基を有する磁性粒子を含む請求項１記載の方法。
【請求項２６】
前記固相結合材料が下記式、
（式中、Ｍは共有結合で結び付けられたリンカー基で機能付与されたシリカベースの磁性粒子である）で表わされる請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記生物サンプルが、バクテリアの培養液、バクテリアの培養液からペレットにされた細胞、血液、血漿、血清、尿、唾液、精液、ＣＳＦ、植物細胞、動物細胞及び組織ホモジェネートから選択される請求項１記載の方法。
【請求項２８】
バクテリアの培養液、バクテリアの培養液からペレットにされた細胞、血液、血漿、血清、尿、唾液、精液、ＣＳＦ、植物細胞、動物細胞及び組織ホモジェネートから選択され、１以上の細胞またはウィルスを含有する生物サンプルからリボ核酸を抽出する、リボ核酸の抽出方法において、
ａ）ピリジニウム塩、無機酸、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、アミノ酸、及びそれらのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、亜鉛塩、ＮＨ４＋塩、第四級アンモニウム塩、第四級ホスホニウム塩から選択される有機又は無機酸の水溶液を含み、ｐＨが１〜５である酸性溶液と前記サンプルとを接触させて混合液を形成すること、
ｂ）マトリックス部と核酸結合部を含み、初めにいかなる予備的な溶解も行うことなく、生物サンプルから直接リボ核酸を遊離させることのできるものとして選択された固相結合材料と、前記混合物とを混合し、混合の際、カオトロピック剤や洗浄剤を溶解を行なうために使用せず、混合することによって前記核酸結合基が細胞およびウィルスの溶解を引き起こしてリボ核酸を遊離させること、
ｃ）前記固相結合材料上にリボ核酸を結合させること、
を含むことを特徴とするリボ核酸の抽出方法。
【請求項２９】
前記固相結合材料が、磁性粒子マトリックスに切断可能なアリールチオエステル結合を介して結合されているトリブチルホスホニウム核酸結合基を有する磁性粒子を含む請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記固相材料が、下記式、
（式中、Ｍは共有結合で結び付けられたリンカー基で機能付与されたシリカベースの磁性粒子である）で表わされる請求項２９の方法。
【請求項３１】
ｄ）リボ核酸が結合した前記固相結合材料からサンプルを分離すること、
ｅ）１以上の洗浄溶液によって前記固相結合材料を任意に洗浄すること、
ｆ）前記固相結合材料と、１ｍＭから１Ｍの濃度のアルカリを有するアルカリ溶液を含む試薬とを接触させて前記結合ＲＮＡを溶液中に遊離することにより、前記固相結合材料から前記結合リボ核酸を溶出させること、
をさらに含む請求項３０の方法。
【請求項３２】
バクテリアの培養液、バクテリアの培養液からペレットにされた細胞、血液、血漿、血清、尿、唾液、精液、ＣＳＦ、植物細胞、動物細胞及び組織ホモジェネートから選択され、１以上の細胞またはウィルスを含有する生物サンプルからリボ核酸を単離する、リボ核酸の単離方法において、
ａ）ピリジニウム塩、無機酸、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、アミノ酸、及びそれらのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、遷移金属塩、ＮＨ４＋塩、第四級アンモニウム塩、第四級ホスホニウム塩から選択される有機又は無機酸の水溶液を含み、ｐＨが１〜５である酸性溶液と前記サンプルを接触させて混合液を形成すること、
ｂ）磁性粒子マトリックスに切断可能なアリールチオエステル結合を介して結合されているトリブチルホスホニウム核酸結合基を有する磁性粒子を含む固相結合材料であって、初めにいかなる予備的な溶解も行なうことなく、生物サンプルから直接リボ核酸を遊離させることのできるものとして選択された固相結合材料と、前記混合物とを混合し、混合の際、カオトロピック剤や洗浄剤を溶解を行なうために使用せず、混合することによって前記核酸結合基が細胞およびウィルスの溶解を引き起こしてリボ核酸を遊離させること、
ｃ）前記固相結合材料上にリボ核酸を結合させること、
ｄ）リボ核酸が結合した前記固相結合材料からサンプルを分離すること、
ｅ）１以上の洗浄溶液によって前記固相結合材料を任意に洗浄すること、
ｆ）選択的に切断可能な結合を切断試薬により切断することによりリボ核酸を前記固相結合材料から遊離すること、
を含むことを特徴とするリボ核酸の単離方法。
【請求項３３】
前記切断可能な結合が、加水分解により切断可能な基、ジスルフィド基、ペルオキシド結合、エステラーゼ、ハイドロラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、及びグリコシダーゼから選択される酵素により切断可能な基、切断可能な１，２−ジオキセタン部分、電子豊富なＣ−Ｃ二重結合であって二重結合が少なくとも１つの酸素、硫黄、窒素原子に結びついたもの、ケテンジチオアセタール化合物、ニトロ置換芳香族エーテル及び同エステルから選択される光により切断可能なリンカー基、から選択される請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記加水分解により切断可能な基が、カルボン酸エステル、カルボン酸無水物、チオエステル、炭酸エステル、チオカーボネートエステル、ウレタン、イミド、スルホンアミド、スルホンイミド、スルホネートエステルから選択される請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記加水分解により切断可能な結合が、１ｍＭから１Ｍの濃度のアルカリを有するアルカリ溶液を含む試薬との反応により切断される請求項３４記載の方法。
【公表番号】特表２００９−５２５７６１（Ｐ２００９−５２５７６１Ａ）
【公表日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５４４９６（Ｐ２００８−５５４４９６）
【出願日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６１８２６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９２９１６
【国際公開日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【出願人】（５０４２３６５４７）ルミゲン インク (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６１８２６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９２９１６
【国際公開日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【出願人】（５０４２３６５４７）ルミゲン インク (4)
【Ｆターム（参考）】
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