ＲＮＡｉにおけるオフターゲット表現型の影響を減少させるためのＳｉＲＮＡ配列非依存性修飾フォーマットおよびその安定化型
ｓｉＲＮＡのための修飾ヌクレオチドを含む修飾フォーマットを提供する。本明細書中に提供した修飾フォーマットおよび修飾ヌクレオチドを有する低分子干渉ＲＮＡは、内因性遺伝子のＲＮＡ干渉におけるオフターゲット効果を減少させる。さらなる修飾フォーマットがなされたｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼが豊富な環境に対して安定性を示すことが証明された。予想外に、ストランドバイアスの増加または維持は、内因性ＲＮＡ干渉の効力の維持に必要である一方で、細胞生物学アッセイにおけるオフターゲット効果の減少には十分でない。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学合成したパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドであって、１５〜３０ヌクレオチド長であり、以下の配列非依存性修飾フォーマット（１）、配列非依存性修飾フォーマット（２）、および配列非依存性修飾フォーマット（３）：
（１）５’Ｎｐ−ｍ−ｍ−Ｎｘ−ｍ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｐは０または１であり、ｘは、７、８、９、１０、または１１であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑは、パッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｘ＋ｒ＋４）を示す整数である）、
（２）５’Ｎｐ−ｍ−ｍ−Ｎｙ−ｍ−Ｎｚ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｐは０または１であり、ｙは、７、８、または９であり、ｚは１であるか、ｙは７であり、ｚは２または３であり、ｒは０、１、または２であり、ｑは、パッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｙ＋ｚ＋ｒ＋４）を示す整数である）、
（３）５’ｍ−Ｎ１−ｍ−Ｎｘ−ｍ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｘは、８、９、または１０であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑは、パッセンジャー鎖長マイナス（ｘ＋ｒ＋５）を示す整数である）の１つを含み、
ここで、
各ｍは、独立して、ビシクロヌクレオチドまたはトリシクロヌクレオチドであり、
各ｎは、独立して、デオキシヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであり、
ｍがビシクロヌクレオチドである場合、各Ｎは、独立して、ビシクロヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｍがトリシクロヌクレオチドである場合、各Ｎは、独立して、トリシクロヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
化学合成したパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドおよび１５〜３０ヌクレオチド（少なくとも１２ヌクレオチドのパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドと連続的に相補的な領域）を有するガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドを含み、前記ガイド鎖が標的ｍＲＮＡの少なくとも一部とさらに相補的である、化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項３】
前記パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドが配列非依存性修飾フォーマット（１）（式中、ｐは０であり、ｘは１０であり、ｒは２である）を含む、請求項２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項４】
前記パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドが配列非依存性修飾フォーマット（１）（式中、ｐは０であり、ｘは９または１１であり、ｒは２である）を含む、請求項２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項５】
前記パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドが配列非依存性修飾フォーマット（２）（ｐは０であり、ｙは９であり、ｒは２である）を含む、請求項２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項６】
少なくとも１つのｍが、構造（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）：
【化２】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、またはＮＲであり、ここで、Ｒは水素またはＣ１〜３アルキルであり、
Ｒ３は、ＣＨ２、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＨ２−ＮＲであり、ここで、Ｒは水素またはＣ１〜３アルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、独立して、ヌクレオシド間結合、末端基、または保護基であり、
Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つはヌクレオシド間結合であり、
Ｂは、核酸塩基、核酸塩基誘導体、または核酸塩基アナログである）を有する、請求項２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項７】
前記パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドは、配列非依存性修飾フォーマット（１）（式中、ｐは０であり、ｘは１０であり、ｒは２であり、各ｍは構造（ａ）（式中、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＯであり、Ｒ３はＣＨ２である）を有する）を含む、請求項６に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項８】
前記パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドは、配列非依存性修飾フォーマット（１）（式中、ｐは１であり、ｘは９または１０であり、ｒは２であり、各ｍは構造（ａ）（式中、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＯであり、Ｒ３はＣＨ２である）を有する）を含む、請求項６に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項９】
前記パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドは、配列非依存性修飾フォーマット（３）（式中、ｘは９または１０であり、ｒは２であり、各ｍは構造（ａ）（式中、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＯであり、Ｒ３はＣＨ２である）を有する）を含む、請求項６に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項１０】
前記パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドおよびガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドがヌクレオチドループまたはリンカーループを介して共有結合して低分子ヘアピンオリゴヌクレオチドを形成する、請求項２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項１１】
ｓｉＲＮＡの各３’末端が、独立して、１つ、２つ、または３つのヌクレオチドオーバーハングを有する、請求項２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項１２】
少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホジエステルヌクレオシド間結合以外である、請求項２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項１３】
前記化学合成した低分子干渉ＲＮＡが細胞ターゲティングリガンドとさらに会合する、請求項２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項１４】
５’末端がリン酸置換基、Ｃ１〜１２−アルキル置換基、Ｃ１〜１２−アルキルアミン置換基、Ｃ１〜１２−アルケニル置換基、Ｃ１〜１２−アルキニル置換基、Ｃ１〜１２−シクロアルキル置換基、Ｃ１〜１２−アラルキル置換基、アリール置換基、アシル置換基、またはシリル置換基でさらに誘導体化される、請求項２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項１５】
請求項２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡおよび生物学的に許容可能なキャリアを含む組成物。
【請求項１６】
請求項２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡおよびトランスフェクション剤を含むキット。
【請求項１７】
標的遺伝子を含む細胞を請求項２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡと効力を維持しながらオフターゲット事象を減少させるのに十分な量で接触させる工程を含む、ＲＮＡ干渉による標的遺伝子発現の阻害のためにオフターゲット事象を最小にする方法。
【請求項１８】
前記遺伝子が内因性遺伝子である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記接触が、細胞を含む細胞培養物または細胞を含む組織と化学合成した低分子干渉ＲＮＡとのｉｎ ｖｉｔｒｏ接触である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記接触が、細胞を含む組織、細胞を含む体液、または細胞を含む器官と化学合成した低分子干渉ＲＮＡとのｅｘ ｖｉｖｏ接触である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記接触が、細胞を含む器官または動物と化学合成した低分子干渉ＲＮＡとのｉｎ ｖｉｖｏ接触である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
標的遺伝子を含む細胞を化学合成した低分子干渉ＲＮＡとガイド鎖の効力を維持しながらパッセンジャー鎖による切断を最小にするのに十分な量で接触させる工程を含み、前記低分子干渉ＲＮＡが、
パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドであって、１５〜３０ヌクレオチド長であり、以下の配列非依存性修飾フォーマット（１）、配列非依存性修飾フォーマット（２）、および配列非依存性修飾フォーマット（３）：
（１）５’Ｎｐ−ｍ−ｍ−Ｎｘ−ｍ−ｍ−Ｎｐ−ｎｒ３’（式中、ｐは０または１であり、ｘは、７、８、９、１０、または１１であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑは、パッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｘ＋ｒ＋４）を示す整数であり、
（２）５’Ｎｐ−ｍ−ｍ−Ｎｙ−ｍ−Ｎｚ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｐは０または１であり、ｙは７、８、または９であり、ｚは１であるか、ｙは７であり、ｚは２または３であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑは、パッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｙ＋ｚ＋ｒ＋４）を示す整数であり、
（３）５’ｍ−Ｎ１−ｍ−Ｎｘ−ｍ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｘは、８、９、または１０であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑは、パッセンジャー鎖長マイナス（ｘ＋ｒ＋５）を示す整数である）の１つを含み、
ここで、
各ｍは、独立して、２’−修飾ヌクレオチドであり、
各ｎは、独立して、デオキシヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであり、
各Ｎは、独立して、非修飾ヌクレオチドである、パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチド、および
１５〜３０ヌクレオチド（少なくとも１２ヌクレオチドのパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドと連続的に相補的な領域）を有するガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドであって、前記ガイド鎖が標的ｍＲＮＡの少なくとも一部とさらに相補的である、ガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドを含む、ＲＮＡ干渉による外因的に得られた標的遺伝子の発現阻害におけるパッセンジャー鎖による切断を最小にする方法。
【請求項２３】
前記２’−修飾ヌクレオチドの２’修飾が、Ｈ、ブロモ、クロロ、ヨード、フルオロ、アラビノース高次構造中のフルオロ（ＦＡＮＡ）、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＮ、アジド、またはＯＲ、Ｒ、ＳＲ、ＮＨＲ、もしくはＮ（Ｒ）２（式中、Ｒはアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、オキシアルキル、アルコキシアルキル、またはアルキルアミンであり、アルキル部分はＣ１〜Ｃ６である）を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドであって、１７〜３０ヌクレオチド長であり、以下の配列非依存性修飾フォーマット（４）、フォーマット（５）、およびフォーマット（６）：
（４）５’ｍｐ−Ｎｘ−ｍ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｐが０である場合、ｘは１２であり、ｐが１である場合、ｘは１１であり、ｐが２である場合、ｘは１０であり、ｐが３である場合、ｘは９であり、ｐが４である場合、ｘは８であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑはパッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｘ＋ｒ＋２）を示す整数である）
（５）５’ｍ−ｍ−Ｎｘ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｘは１１であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑはパッセンジャー鎖長マイナス（ｘ＋ｒ＋３）を示す整数である）
（６）５’ｍｐ−Ｎｙ−ｍ−Ｎｚ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｐは３であり、ｙは９であり、ｚは１であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑはパッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｙ＋ｚ＋ｒ＋２）を示す整数である）の１つを含むパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチド、および
１７〜３０ヌクレオチド（少なくとも１２ヌクレオチドのパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドと連続的に相補的な領域）を有するガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドであって、前記ガイド鎖が標的ｍＲＮＡの少なくとも一部とさらに相補的である、ガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドを含み、
ここで、
各ｍは、独立して、ビシクロヌクレオチド、トリシクロヌクレオチド、または２’−修飾ヌクレオチドであり、
各ｎは、独立して、デオキシヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであり、且つオーバーハンギングヌクレオチドであり、
ｍがビシクロヌクレオチドである場合、各Ｎは、独立して、ビシクロヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｍがトリシクロヌクレオチドである場合、各Ｎは、独立して、トリシクロヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｍが２’−修飾ヌクレオチドである場合、各Ｎは、独立して、２’−修飾ヌクレオチド以外のヌクレオチドである、低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項２５】
前記パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドが配列非依存性修飾フォーマット（４）を有し、ｐは２であり、ｘは１０であり、ｒは２であり、各ｎはオーバーハンギングヌクレオチドであり、各ｎは、独立して、修飾ヌクレオチドであり、
ガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドは２つの３’−オーバーハング修飾ヌクレオチドを含み、
各修飾ヌクレオチドは、独立して、ビシクロヌクレオチド、トリシクロヌクレオチド、または２’−修飾ヌクレオチドである、請求項２４に記載の低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項２６】
前記パッセンジャーオリゴヌクレオチドの３’末端から３番目の位置および３’末端から４番目の位置の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドである、請求項２５に記載の低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項２７】
前記長さが１７ヌクレオチドである場合、前記ガイドオリゴヌクレオチドの２位および３位の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドであり、
前記長さが１８ヌクレオチドである場合、前記ガイドオリゴヌクレオチドの２位、３位、および４位の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドであり、
前記長さが１９ヌクレオチドである場合、前記ガイドオリゴヌクレオチドの２位、３位、４位、および５位の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドであり、
前記長さが２０ヌクレオチドである場合、前記ガイドオリゴヌクレオチドの２位、３位、４位、５位、および６位の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドであり、
前記長さが２１〜３０ヌクレオチドである場合、前記ガイドオリゴヌクレオチドの２位、３位、４位、５位、６位、および７位の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドである、請求項２５に記載の低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項２８】
前記パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのｍが、以下の構造（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）：
【化３】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、またはＮＲであり、ここで、Ｒは水素またはＣ１〜３−アルキルであり、
Ｒ３は、ＣＨ２、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＨ２−ＮＲであり、ここで、Ｒは水素またはＣ１〜３−アルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、独立して、ヌクレオシド間結合、末端基、または保護基であり、
Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つはヌクレオシド間結合であり、
Ｂは、核酸塩基、核酸塩基誘導体、または核酸塩基アナログである）を有する、請求項２４、２５、２６、または２７に記載の低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項２９】
前記各修飾ヌクレオチドが、構造（ａ）：
【化４】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、またはＮＲであり、ここで、Ｒは水素またはＣ１〜３−アルキルであり、
Ｒ３は、ＣＨ２、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＨ２−ＮＲであり、ここで、Ｒは水素またはＣ１〜３−アルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、独立して、ヌクレオシド間結合、末端基、または保護基であり、
Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つはヌクレオシド間結合であり、
Ｂは、核酸塩基、核酸塩基誘導体、または核酸塩基アナログである）を有する、請求項２４、２５、２６、または２７に記載の低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項３０】
請求項２４から２９のいずれか１項に記載の低分子干渉ＲＮＡおよび生物学的に許容可能なキャリアを含む組成物。
【請求項３１】
被験体を請求項２５から３０のいずれか１項に記載の低分子干渉ＲＮＡと効力を維持しながらオフターゲット事象を減少させるのに十分な量で接触させる工程を含む、必要とされる被験体におけるＲＮＡ干渉による標的遺伝子発現の阻害のためのオフターゲット事象を減少させる方法。
【請求項３２】
前記接触が血管内注射を介した投与である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２６または２７に記載の低分子干渉ＲＮＡを得る工程であって、各修飾ヌクレオチドが、構造（ａ）：
【化５】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、またはＮＲであり、ここで、Ｒは水素またはＣ１〜３−アルキルであり、
Ｒ３は、ＣＨ２、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＨ２−ＮＲであり、ここで、Ｒは水素またはＣ１〜３−アルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、独立して、ヌクレオシド間結合、末端基、または保護基であり、
Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つはヌクレオシド間結合であり、
Ｂは、核酸塩基、核酸塩基誘導体、または核酸塩基アナログである）を有する、低分子干渉ＲＮＡを得る工程、および
前記低分子干渉ＲＮＡを必要とする被験体にｉｎ ｖｉｖｏで投与する工程であって、投与後、修飾ヌクレオチドを欠く低分子干渉ＲＮＡの量と比較した場合、より大量の前記低分子干渉ＲＮＡがｉｎ ｖｉｖｏで存在する、投与する工程、
を含む、方法。
【請求項１】
化学合成したパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドであって、１５〜３０ヌクレオチド長であり、以下の配列非依存性修飾フォーマット（１）、配列非依存性修飾フォーマット（２）、および配列非依存性修飾フォーマット（３）：
（１）５’Ｎｐ−ｍ−ｍ−Ｎｘ−ｍ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｐは０または１であり、ｘは、７、８、９、１０、または１１であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑは、パッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｘ＋ｒ＋４）を示す整数である）、
（２）５’Ｎｐ−ｍ−ｍ−Ｎｙ−ｍ−Ｎｚ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｐは０または１であり、ｙは、７、８、または９であり、ｚは１であるか、ｙは７であり、ｚは２または３であり、ｒは０、１、または２であり、ｑは、パッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｙ＋ｚ＋ｒ＋４）を示す整数である）、
（３）５’ｍ−Ｎ１−ｍ−Ｎｘ−ｍ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｘは、８、９、または１０であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑは、パッセンジャー鎖長マイナス（ｘ＋ｒ＋５）を示す整数である）の１つを含み、
ここで、
各ｍは、独立して、ビシクロヌクレオチドまたはトリシクロヌクレオチドであり、
各ｎは、独立して、デオキシヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであり、
ｍがビシクロヌクレオチドである場合、各Ｎは、独立して、ビシクロヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｍがトリシクロヌクレオチドである場合、各Ｎは、独立して、トリシクロヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
化学合成したパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドおよび１５〜３０ヌクレオチド（少なくとも１２ヌクレオチドのパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドと連続的に相補的な領域）を有するガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドを含み、前記ガイド鎖が標的ｍＲＮＡの少なくとも一部とさらに相補的である、化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項３】
前記パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドが配列非依存性修飾フォーマット（１）（式中、ｐは０であり、ｘは１０であり、ｒは２である）を含む、請求項２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項４】
前記パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドが配列非依存性修飾フォーマット（１）（式中、ｐは０であり、ｘは９または１１であり、ｒは２である）を含む、請求項２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項５】
前記パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドが配列非依存性修飾フォーマット（２）（ｐは０であり、ｙは９であり、ｒは２である）を含む、請求項２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項６】
少なくとも１つのｍが、構造（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）：
【化２】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、またはＮＲであり、ここで、Ｒは水素またはＣ１〜３アルキルであり、
Ｒ３は、ＣＨ２、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＨ２−ＮＲであり、ここで、Ｒは水素またはＣ１〜３アルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、独立して、ヌクレオシド間結合、末端基、または保護基であり、
Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つはヌクレオシド間結合であり、
Ｂは、核酸塩基、核酸塩基誘導体、または核酸塩基アナログである）を有する、請求項２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項７】
前記パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドは、配列非依存性修飾フォーマット（１）（式中、ｐは０であり、ｘは１０であり、ｒは２であり、各ｍは構造（ａ）（式中、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＯであり、Ｒ３はＣＨ２である）を有する）を含む、請求項６に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項８】
前記パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドは、配列非依存性修飾フォーマット（１）（式中、ｐは１であり、ｘは９または１０であり、ｒは２であり、各ｍは構造（ａ）（式中、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＯであり、Ｒ３はＣＨ２である）を有する）を含む、請求項６に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項９】
前記パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドは、配列非依存性修飾フォーマット（３）（式中、ｘは９または１０であり、ｒは２であり、各ｍは構造（ａ）（式中、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＯであり、Ｒ３はＣＨ２である）を有する）を含む、請求項６に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項１０】
前記パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドおよびガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドがヌクレオチドループまたはリンカーループを介して共有結合して低分子ヘアピンオリゴヌクレオチドを形成する、請求項２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項１１】
ｓｉＲＮＡの各３’末端が、独立して、１つ、２つ、または３つのヌクレオチドオーバーハングを有する、請求項２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項１２】
少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホジエステルヌクレオシド間結合以外である、請求項２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項１３】
前記化学合成した低分子干渉ＲＮＡが細胞ターゲティングリガンドとさらに会合する、請求項２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項１４】
５’末端がリン酸置換基、Ｃ１〜１２−アルキル置換基、Ｃ１〜１２−アルキルアミン置換基、Ｃ１〜１２−アルケニル置換基、Ｃ１〜１２−アルキニル置換基、Ｃ１〜１２−シクロアルキル置換基、Ｃ１〜１２−アラルキル置換基、アリール置換基、アシル置換基、またはシリル置換基でさらに誘導体化される、請求項２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項１５】
請求項２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡおよび生物学的に許容可能なキャリアを含む組成物。
【請求項１６】
請求項２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡおよびトランスフェクション剤を含むキット。
【請求項１７】
標的遺伝子を含む細胞を請求項２に記載の化学合成した低分子干渉ＲＮＡと効力を維持しながらオフターゲット事象を減少させるのに十分な量で接触させる工程を含む、ＲＮＡ干渉による標的遺伝子発現の阻害のためにオフターゲット事象を最小にする方法。
【請求項１８】
前記遺伝子が内因性遺伝子である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記接触が、細胞を含む細胞培養物または細胞を含む組織と化学合成した低分子干渉ＲＮＡとのｉｎ ｖｉｔｒｏ接触である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記接触が、細胞を含む組織、細胞を含む体液、または細胞を含む器官と化学合成した低分子干渉ＲＮＡとのｅｘ ｖｉｖｏ接触である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記接触が、細胞を含む器官または動物と化学合成した低分子干渉ＲＮＡとのｉｎ ｖｉｖｏ接触である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
標的遺伝子を含む細胞を化学合成した低分子干渉ＲＮＡとガイド鎖の効力を維持しながらパッセンジャー鎖による切断を最小にするのに十分な量で接触させる工程を含み、前記低分子干渉ＲＮＡが、
パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドであって、１５〜３０ヌクレオチド長であり、以下の配列非依存性修飾フォーマット（１）、配列非依存性修飾フォーマット（２）、および配列非依存性修飾フォーマット（３）：
（１）５’Ｎｐ−ｍ−ｍ−Ｎｘ−ｍ−ｍ−Ｎｐ−ｎｒ３’（式中、ｐは０または１であり、ｘは、７、８、９、１０、または１１であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑは、パッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｘ＋ｒ＋４）を示す整数であり、
（２）５’Ｎｐ−ｍ−ｍ−Ｎｙ−ｍ−Ｎｚ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｐは０または１であり、ｙは７、８、または９であり、ｚは１であるか、ｙは７であり、ｚは２または３であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑは、パッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｙ＋ｚ＋ｒ＋４）を示す整数であり、
（３）５’ｍ−Ｎ１−ｍ−Ｎｘ−ｍ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｘは、８、９、または１０であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑは、パッセンジャー鎖長マイナス（ｘ＋ｒ＋５）を示す整数である）の１つを含み、
ここで、
各ｍは、独立して、２’−修飾ヌクレオチドであり、
各ｎは、独立して、デオキシヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであり、
各Ｎは、独立して、非修飾ヌクレオチドである、パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチド、および
１５〜３０ヌクレオチド（少なくとも１２ヌクレオチドのパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドと連続的に相補的な領域）を有するガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドであって、前記ガイド鎖が標的ｍＲＮＡの少なくとも一部とさらに相補的である、ガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドを含む、ＲＮＡ干渉による外因的に得られた標的遺伝子の発現阻害におけるパッセンジャー鎖による切断を最小にする方法。
【請求項２３】
前記２’−修飾ヌクレオチドの２’修飾が、Ｈ、ブロモ、クロロ、ヨード、フルオロ、アラビノース高次構造中のフルオロ（ＦＡＮＡ）、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＮ、アジド、またはＯＲ、Ｒ、ＳＲ、ＮＨＲ、もしくはＮ（Ｒ）２（式中、Ｒはアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、オキシアルキル、アルコキシアルキル、またはアルキルアミンであり、アルキル部分はＣ１〜Ｃ６である）を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドであって、１７〜３０ヌクレオチド長であり、以下の配列非依存性修飾フォーマット（４）、フォーマット（５）、およびフォーマット（６）：
（４）５’ｍｐ−Ｎｘ−ｍ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｐが０である場合、ｘは１２であり、ｐが１である場合、ｘは１１であり、ｐが２である場合、ｘは１０であり、ｐが３である場合、ｘは９であり、ｐが４である場合、ｘは８であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑはパッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｘ＋ｒ＋２）を示す整数である）
（５）５’ｍ−ｍ−Ｎｘ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｘは１１であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑはパッセンジャー鎖長マイナス（ｘ＋ｒ＋３）を示す整数である）
（６）５’ｍｐ−Ｎｙ−ｍ−Ｎｚ−ｍ−Ｎｑ−ｎｒ３’（式中、ｐは３であり、ｙは９であり、ｚは１であり、ｒは、０、１、または２であり、ｑはパッセンジャー鎖長マイナス（ｐ＋ｙ＋ｚ＋ｒ＋２）を示す整数である）の１つを含むパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチド、および
１７〜３０ヌクレオチド（少なくとも１２ヌクレオチドのパッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドと連続的に相補的な領域）を有するガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドであって、前記ガイド鎖が標的ｍＲＮＡの少なくとも一部とさらに相補的である、ガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドを含み、
ここで、
各ｍは、独立して、ビシクロヌクレオチド、トリシクロヌクレオチド、または２’−修飾ヌクレオチドであり、
各ｎは、独立して、デオキシヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであり、且つオーバーハンギングヌクレオチドであり、
ｍがビシクロヌクレオチドである場合、各Ｎは、独立して、ビシクロヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｍがトリシクロヌクレオチドである場合、各Ｎは、独立して、トリシクロヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｍが２’−修飾ヌクレオチドである場合、各Ｎは、独立して、２’−修飾ヌクレオチド以外のヌクレオチドである、低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項２５】
前記パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドが配列非依存性修飾フォーマット（４）を有し、ｐは２であり、ｘは１０であり、ｒは２であり、各ｎはオーバーハンギングヌクレオチドであり、各ｎは、独立して、修飾ヌクレオチドであり、
ガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチドは２つの３’−オーバーハング修飾ヌクレオチドを含み、
各修飾ヌクレオチドは、独立して、ビシクロヌクレオチド、トリシクロヌクレオチド、または２’−修飾ヌクレオチドである、請求項２４に記載の低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項２６】
前記パッセンジャーオリゴヌクレオチドの３’末端から３番目の位置および３’末端から４番目の位置の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドである、請求項２５に記載の低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項２７】
前記長さが１７ヌクレオチドである場合、前記ガイドオリゴヌクレオチドの２位および３位の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドであり、
前記長さが１８ヌクレオチドである場合、前記ガイドオリゴヌクレオチドの２位、３位、および４位の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドであり、
前記長さが１９ヌクレオチドである場合、前記ガイドオリゴヌクレオチドの２位、３位、４位、および５位の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドであり、
前記長さが２０ヌクレオチドである場合、前記ガイドオリゴヌクレオチドの２位、３位、４位、５位、および６位の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドであり、
前記長さが２１〜３０ヌクレオチドである場合、前記ガイドオリゴヌクレオチドの２位、３位、４位、５位、６位、および７位の少なくとも１つは修飾ヌクレオチドである、請求項２５に記載の低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項２８】
前記パッセンジャー（センス）オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのｍが、以下の構造（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）：
【化３】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、またはＮＲであり、ここで、Ｒは水素またはＣ１〜３−アルキルであり、
Ｒ３は、ＣＨ２、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＨ２−ＮＲであり、ここで、Ｒは水素またはＣ１〜３−アルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、独立して、ヌクレオシド間結合、末端基、または保護基であり、
Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つはヌクレオシド間結合であり、
Ｂは、核酸塩基、核酸塩基誘導体、または核酸塩基アナログである）を有する、請求項２４、２５、２６、または２７に記載の低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項２９】
前記各修飾ヌクレオチドが、構造（ａ）：
【化４】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、またはＮＲであり、ここで、Ｒは水素またはＣ１〜３−アルキルであり、
Ｒ３は、ＣＨ２、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＨ２−ＮＲであり、ここで、Ｒは水素またはＣ１〜３−アルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、独立して、ヌクレオシド間結合、末端基、または保護基であり、
Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つはヌクレオシド間結合であり、
Ｂは、核酸塩基、核酸塩基誘導体、または核酸塩基アナログである）を有する、請求項２４、２５、２６、または２７に記載の低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項３０】
請求項２４から２９のいずれか１項に記載の低分子干渉ＲＮＡおよび生物学的に許容可能なキャリアを含む組成物。
【請求項３１】
被験体を請求項２５から３０のいずれか１項に記載の低分子干渉ＲＮＡと効力を維持しながらオフターゲット事象を減少させるのに十分な量で接触させる工程を含む、必要とされる被験体におけるＲＮＡ干渉による標的遺伝子発現の阻害のためのオフターゲット事象を減少させる方法。
【請求項３２】
前記接触が血管内注射を介した投与である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２６または２７に記載の低分子干渉ＲＮＡを得る工程であって、各修飾ヌクレオチドが、構造（ａ）：
【化５】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、またはＮＲであり、ここで、Ｒは水素またはＣ１〜３−アルキルであり、
Ｒ３は、ＣＨ２、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＨ２−ＮＲであり、ここで、Ｒは水素またはＣ１〜３−アルキルであり、
Ｒ４およびＲ５は、独立して、ヌクレオシド間結合、末端基、または保護基であり、
Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つはヌクレオシド間結合であり、
Ｂは、核酸塩基、核酸塩基誘導体、または核酸塩基アナログである）を有する、低分子干渉ＲＮＡを得る工程、および
前記低分子干渉ＲＮＡを必要とする被験体にｉｎ ｖｉｖｏで投与する工程であって、投与後、修飾ヌクレオチドを欠く低分子干渉ＲＮＡの量と比較した場合、より大量の前記低分子干渉ＲＮＡがｉｎ ｖｉｖｏで存在する、投与する工程、
を含む、方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図１Ｈ】
【図１Ｉ】
【図１Ｊ】
【図１Ｋ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７】
【図８】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１１Ｆ】
【図１２Ａ−１】
【図１２Ａ−２】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１３Ａ−１】
【図１３Ａ−２】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１５Ｄ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１６Ｄ】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図１Ｈ】
【図１Ｉ】
【図１Ｊ】
【図１Ｋ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７】
【図８】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１１Ｆ】
【図１２Ａ−１】
【図１２Ａ−２】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１３Ａ−１】
【図１３Ａ−２】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１５Ｄ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１６Ｄ】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【公表番号】特表２０１０−５３８６７７（Ｐ２０１０−５３８６７７Ａ）
【公表日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２５９１６（Ｐ２０１０−５２５９１６）
【出願日】平成２０年９月１７日（２００８．９．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７６６７５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０３９１７３
【国際公開日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【出願人】（５０９１３０４１３）アプライド バイオシステムズ， エルエルシー (48)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月１７日（２００８．９．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７６６７５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０３９１７３
【国際公開日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【出願人】（５０９１３０４１３）アプライド バイオシステムズ， エルエルシー (48)
【Ｆターム（参考）】
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