本発明の実施形態は、多量体産物（治療抗体など）を含むポリペプチド発現のためのベクター構築物および方法に関する。
特定の構築物により、シングルオープンリーディングフレーム（ｓＯＲＦ）から発現産物を生成することが可能である。１つの実施形態は、シングルオープンリーディングフレームインサートを含む１つ以上の組換えタンパク質産物を生成するための単離または精製された発現ベクターであって、前記インサートが、シグナルペプチドをコードするシグナルペプチド核酸配列、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列、第１のタンパク質切断部位をコードする第１の介在核酸配列であって、前記第１のタンパク質切断部位が、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）のｌｏｎプロテアーゼ遺伝子またはパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）もしくはメタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）のｋｌｂＡ遺伝子のインテインセグメントまたはインテインセグメント由来の改変インテインセグメントによって提供される、第１のタンパク質切断部位をコードする第１の介在核酸配列、および第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列を含む、単離または精製された発現ベクターを提供する。構築物および方法の一定の実施形態は、パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、またはパイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）ＯＴ３のｌｏｎプロテアーゼ遺伝子のインテインセグメント、またはパイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）またはメタノコッカス・ヤナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）のｋｌｂＡ遺伝子のインテインセグメント、または他のインテインセグメントを使用する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
シングルオープンリーディングフレームインサートを含む１つ以上の組換えタンパク質産物を生成するための単離または精製された発現ベクターであって、前記インサートが、以下：
（ａ）シグナルペプチドをコードするシグナルペプチド核酸配列、
（ｂ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列、
（ｃ）第１のタンパク質切断部位をコードする第１の介在核酸配列であって、前記第１のタンパク質切断部位が、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）のｌｏｎプロテアーゼ遺伝子またはパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）もしくはメタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）のｋｌｂＡ遺伝子のインテインセグメントまたは前記インテインセグメント由来の改変インテインセグメントによって提供される、第１のタンパク質切断部位をコードする第１の介在核酸配列および
（ｄ）第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列
を含み、
前記第１のタンパク質切断部位をコードする第１の介在核酸配列が、前記第１の核酸配列と前記第２の核酸配列との間に作動可能に配置され、
前記シグナルペプチドをコードするシグナルペプチド核酸配列が、前記第１の核酸配列の前に作動可能に配置され、
前記発現ベクターが、前記第１のタンパク質切断部位で切断可能なシングルオープンリーディングフレームポリペプチドを発現することができる、単離または精製された発現ベクター。
【請求項２】
前記第１のタンパク質切断部位が、パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、またはパイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）ＯＴ３のｌｏｎプロテアーゼ遺伝子のインテインセグメント、またはパイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、またはメタノコッカス・ヤナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）のｋｌｂＡ遺伝子のインテインセグメント、または前記各インテインセグメント由来の改変インテインセグメントによって提供される、請求項１の発現ベクター。
【請求項３】
インテインセグメントまたは改変インテインセグメントが、リジン、セリンであるが、ヒスチジンではない最後から２番目の残基をコードする、請求項１の発現ベクター。
【請求項４】
前記インテインセグメントまたは改変インテインセグメントが、切断可能であるが、前記第１のポリペプチドの前記第２のポリペプチドへのライゲーションを完了できない、請求項１の発現ベクター。
【請求項５】
前記第１のタンパク質切断部位が、配列番号１、３、４、６、７、５５、３５、３７および３９からなる群から選択される配列を含むインテインセグメントおよび前記インテインセグメント由来の改変インテインセグメントによって提供される、請求項１の発現ベクター。
【請求項６】
第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが多量体アセンブリ可能である、請求項１から５のいずれかの発現ベクター。
【請求項７】
前記第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの少なくとも１つが細胞外分泌可能である、請求項１から６のいずれかの発現ベクター。
【請求項８】
前記第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの少なくとも１つが哺乳動物起源である、請求項１から７のいずれかの発現ベクター。
【請求項９】
前記第１のポリペプチドが免疫グロブリン重鎖またはこの重鎖の機能的フラグメントを含み、前記第２のポリペプチドが免疫グロブリン軽鎖またはこの軽鎖の機能的フラグメントを含み、前記第１のポリペプチドが前記第２のポリペプチドの上流に存在する、請求項１から８のいずれかの発現ベクター。
【請求項１０】
たった１つの前記シグナルペプチド核酸配列を含む、請求項１から９のいずれかの発現ベクター。
【請求項１１】
第３のポリペプチドをコードする第３の核酸配列および第２のタンパク質切断部位をコードする第２の介在核酸配列をさらに含み、該第２の介在核酸配列および第３の核酸配列がこの順序で、前記第２の核酸配列の後に作動可能に配置される、請求項１から１０のいずれかの発現ベクター。
【請求項１２】
前記第１および前記第２のポリペプチドが、ＴＮＦα（腫瘍壊死因子−α）、エリスロポエチン受容体、ＲＳＶ、ＥＬ／セレクチン、インターロイキン−１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１８、インターロイキン−２３、インターロイキン−３３、ＣＤ８１、ＣＤ１９、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＥＧＦＲ、ＣＸＣＬ−１３、ＧＬＰ−１Ｒ、プロスタグランジンＥ２およびアミロイドβからなる群から選択される抗原への結合を指示する抗原特異性を有する機能的抗体または他の抗原認識分子を含む、請求項１から１１のいずれかの発現ベクター。
【請求項１３】
第１および第２のポリペプチドが、Ｄ２Ｅ７、ＥＬ２４６、ＡＢＴ−００７、ＡＢＴ−３２５またはＡＢＴ−８７４の抗体由来の免疫グロブリン鎖対を含む、請求項１から１２のいずれかの発現ベクター。
【請求項１４】
第１および第２のポリペプチドが、Ｄ２Ｅ７、ＥＬ２４６、ＡＢＴ−００７、ＡＢＴ−３２５、ＡＢＴ−８７４または他の抗体の類似のセグメント由来の免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖のセグメントからそれぞれ独立して選択される、請求項１から１３のいずれかの発現ベクター。
【請求項１５】
前記ベクターが、前記インサートのプロモーター調節エレメントをさらに含む、請求項１から１４のいずれかの発現ベクター。
【請求項１６】
前記プロモーター調節エレメントが誘導性または構成性である、請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
前記プロモーター調節エレメントが組織特異的である、請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
前記プロモーターがアデノウイルス主要後期プロモーターを含む、請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれかに記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
前記宿主細胞が原核細胞である、請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
前記宿主細胞がエシュリキア・コライ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
前記宿主細胞が真核細胞である、請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
前記真核細胞が、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞および真菌細胞からなる群から選択される、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
前記真核細胞が、哺乳動物細胞、トリ細胞および昆虫細胞からなる群から選択される動物細胞である、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞株である、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞またはジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損ＣＨＯ細胞である、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
前記宿主細胞がＣＯＳ細胞またはＨＥＫ細胞である、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
前記酵母細胞がサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
前記宿主細胞がスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９昆虫細胞である、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
組換えポリタンパク質または複数のタンパク質を産生する方法であって、請求項１９の宿主細胞をベクタータンパク質を発現させるのに十分な条件下にて培養培地中で培養することを含む、方法。
【請求項３２】
前記ベクタータンパク質を回収および／または精製することをさらに含む、請求項３１の方法。
【請求項３３】
前記複数のタンパク質が多量体アセンブリ可能である、請求項３１から３２のいずれかの方法。
【請求項３４】
組換えポリタンパク質または複数のタンパク質が生物学的に機能的および／または治療的である、請求項３１から３３のいずれかの方法。
【請求項３５】
組換え産物の産生方法であって、該産物が免疫グロブリンタンパク質またはタンパク質の機能的フラグメント、アセンブリされた抗体または他の抗原認識分子であり、請求項１９に記載の宿主細胞を該組換え産物を産出するのに十分な条件下にて培養培地中で培養することを含む、方法。
【請求項３６】
請求項３１から３５のいずれかの方法に従って産生されたタンパク質。
【請求項３７】
請求項３１から３６のいずれかの方法に従って産生されたポリタンパク質。
【請求項３８】
請求項３１から３７のいずれかの方法に従って産生されたアセンブリされた免疫グロブリン、アセンブリされた他の抗原認識分子または各免疫グロブリン鎖もしくはこれらの機能的フラグメント。
【請求項３９】
腫瘍壊死因子−α、エリスロポエチン受容体、ＲＳＶ、ＥＬ／セレクチン、インターロイキン−１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１８、インターロイキン−２３、インターロイキン−３３、ＣＤ８１、ＣＤ１９、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＥＧＦＲ、プロスタグランジンＥ２、ＣＸＣＬ−１３、ＧＬＰ−１Ｒまたはアミロイドβへの特異的抗原結合をもたらすか寄与する能力が存在する、請求項３８に記載の免疫グロブリン、他の抗原認識分子または各免疫グロブリン鎖もしくはこれらの機能的フラグメント。
【請求項４０】
免疫グロブリンがＤ２Ｅ７またはＡＢＴ−８７４であるか、機能的フラグメントがそれぞれ前記免疫グロブリンのフラグメントである、請求項３９に記載の免疫グロブリンまたはグロブリンの機能的フラグメント。
【請求項４１】
請求項３６から４０のいずれかに記載の治療有効量のタンパク質および医薬的に許容可能なキャリアを含む、医薬的組成物。
【請求項４２】
タグをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１から１８のいずれかの発現ベクター。
【請求項４３】
前記介在核酸配列がタグをさらにコードする、請求項１から１８のいずれかの発現ベクター。
【請求項４４】
ベクターが、請求項１から１８のいずれかのベクターであり、および軽鎖シグナルペプチドをコードするセグメントをさらに含む、請求項１から４３の発現ベクター、該ベクターを有する宿主細胞、ベクター発現産物、医薬的組成物、ならびに／または作製方法もしくは使用方法。
【請求項４５】
コードされた軽鎖シグナルペプチドが、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２６およびＨ２Ｇからなる群から選択されるκ軽鎖シグナルペプチドである、請求項４４のベクター、宿主細胞、ベクター発現産物、医薬的組成物および／または作製方法もしくは使用方法。
【請求項４６】
コードされた軽鎖シグナルペプチドが、ＶＫＩＩκ軽鎖シグナルペプチドＡ１８（配列番号８２（アミノ酸配列ＭＲＬＰＡＱＬＬＧＬＬＭＬＷＩＰＧＳＳＡ））である、請求項４４のベクター、宿主細胞、ベクター発現産物、医薬的組成物および／または作製方法もしくは使用方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【公表番号】特表２０１３−５０９１８８（Ｐ２０１３−５０９１８８Ａ）
【公表日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３７０６１（Ｐ２０１２−５３７０６１）
【出願日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５４４７５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５３６９９
【国際公開日】平成２３年５月５日（２０１１．５．５）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】