Ｔ細胞に遺伝子を導入する方法
本発明は、パラミクソウイルスベクターと活性化したＴ細胞とを接触させる工程を含む、Ｔ細胞に遺伝子を導入する方法を提供する。また本発明は、外来遺伝子が導入されたＴ細胞の製造方法であって、パラミクソウイルスベクターと活性化したＴ細胞とを接触させる工程を含む方法を提供する。また本発明は、この方法により製造された、外来遺伝子が導入されたＴ細胞を提供する。本発明により、効率的な活性化Ｔ細胞特異的な遺伝子送達が可能となり、Ｔ細胞を指向した遺伝子送達による免疫学的な改変戦略への適用が期待される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、Ｔ細胞に遺伝子を導入する方法に関する。
【背景技術】
造血細胞の遺伝的改変は、自己免疫疾患、免疫不全、さらには抗腫瘍免疫の活性化を介した腫瘍に対する治療の魅力的な戦略である。様々な血液細胞の中でもＴリンパ球は、アデノシンデアミナーゼ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ−ｄｅａｍｉｎａｓｅ；ＡＤＡ）欠損症による重症複合型免疫不全（ＡＤＡ−ＳＣＩＤ）に対する遺伝子治療の初期段階から遺伝子送達の標的の１つとされてきた（Ｂｌａｅｓｅ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，２７０：４７５−４８０；Ａｌｔｅｎｓｃｈｍｉｄｔ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，１９９７，７５：２５９−２６６；Ｍｉｓａｋｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００１，３：２４−２７）。しかしながら、レトロウイルスなどの現在使用可能なベクターによる遺伝子送達に対して、Ｔ細胞は比較的抵抗性を示すことが、現在の障壁となっている。
自己免疫疾患、移植後のアロ器官拒絶、または腫瘍などの治療における臨床場面を考えると、活性化Ｔリンパ球のサブセットは遺伝的改変の標的として理想的であるに違いない（Ａｌｔｅｎｓｃｈｍｉｄｔ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，１９９７，７５：２５９−２６６；Ｈｅｇｅ，Ｋ．Ｍ．ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｒ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９６，７：６２９−６３４；Ｔｕｏｈｙ，Ｖ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．，２０００，１０７：２２６−２３２）。遺伝子マーキングに関する初期の臨床報告により、腫瘍抗原により活性化される腫瘍浸潤リンパ球（ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ；ＴＩＬｓ）が、腫瘍を持つ個体内において腫瘍に移動することが実証されたことから、ＴＩＬｓは治療遺伝子を腫瘍へと移動させる理想的な担体ビークルであることが示唆される（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９０，３２３：５７０−５７８）。活性化Ｔリンパ球の類似した特徴は、自己免疫および器官移植においても期待されるものの、その研究はここ１０年ほとんどなされておらず、それは現在のベクターの活性化Ｔ細胞への遺伝子送達の効率が低いことが原因と予想される。
最近では、新しく登場したＴリンパ球への遺伝子送達ビークル、すなわちヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）をベースとするレンチウイルスベクターに多くの注目が集まっているが、これはＨＩＶがＣＤ４リンパ球に指向したトロピズムを持つからである。近年の努力の結果、ベクターゲノムの核へのインポートおよび染色体へのインテグレーションを促進するセントラルＤＮＡフラップを構築することを介して、ＨＩＶの活性化Ｔ細胞への遺伝子送達効率は飛躍的に向上した（従来のＨＩＶベクターでは平均１５％に対して、このベクターでは平均５１％）（Ｄａｒｄａｌｈｏｎ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２００１，８：１９０−１９８）。しかしながら、特にＨＩＶを含む病原性ウイルスをベースとしたレンチウイルスの場合には、潜在的な安全性に関する関心が臨床適用を遅らせている（Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒ，Ｇ．Ｌ．Ｊｒ．ａｎｄ Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌ，Ｆ．，Ｂｌｏｏｄ ２０００，９５：２４９９−２５０４）。より効率的に遺伝子送達が可能で、より安全な他の選択肢を開発する努力を続けることが必要であることは明らかである。
【発明の開示】
Ｔ細胞へ効率的に遺伝子導入が可能なベクターを探し出すため、Ｔ細胞に対して種々の条件でベクターの導入を行い、遺伝子導入効率を測定した。その結果、本発明者らは、パラミクソウイルスベクターが、抗原活性化Ｔ細胞に対して高い遺伝子導入効率を示すことを見いだした。遺伝子導入は活性化Ｔ細胞に特異的、すなわちベクターの遺伝子導入効率はナイーブＴ細胞と比べ活性化Ｔ細胞に対して顕著に高かった。パラミクソウイルスベクターは、抗原活性化Ｔ細胞への遺伝子導入のためのベクターとして好適に用いられる。
Ｔリンパ球を指向した遺伝子治療は、様々な免疫学的疾患に対する治療の可能性を持っているが、これまでのＴ細胞の遺伝子治療においては、複雑な操作を行うにも関わらず遺伝子導入（ジーントランスダクション）の効率が低いことが大きな制約となっていた。本発明により、パラミクソウイルスベクターは、非常に単純な手順で、活性化Ｔ細胞に特異的に外来遺伝子を発現できることが実証され、Ｔ細胞の遺伝子治療における上記の問題を克服することが可能となった。本発明により、活性化Ｔ細胞特異的な遺伝子送達を効率的に実施することが可能となり、免疫疾患におけるＴ細胞を指向した遺伝子送達による改変戦略への適用が期待される。
すなわち本発明は、Ｔ細胞に遺伝子を導入する方法に関し、より具体的には、
（１）Ｔ細胞に遺伝子を導入する方法であって、該遺伝子を保持するパラミクソウイルスベクターと活性化したＴ細胞とを接触させる工程を含む方法、
（２）パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、（１）に記載の方法、
（３）外来遺伝子が導入されたＴ細胞の製造方法であって、該遺伝子を保持するパラミクソウイルスベクターと活性化したＴ細胞とを接触させる工程を含む方法、
（４）パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、（３）に記載の方法、
（５）（３）または（４）に記載の方法により製造された、外来遺伝子が導入されたＴ細胞、
（６）活性化Ｔ細胞への遺伝子送達のために用いる、パラミクソウイルスベクター、
（７）パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、（６）に記載のベクター、に関する。
本発明は、パラミクソウイルスベクターを用いるＴ細胞への遺伝子導入方法を提供する。この方法は、導入したい遺伝子を保持するパラミクソウイルスベクターを、活性化したＴ細胞に接触させる工程を含む方法である。本発明者等は、パラミクソウイルスベクターが極めて高い効率で活性化Ｔ細胞へ遺伝子を導入できることを見出した。ナイーブＴ細胞に対しては、パラミクソウイルスベクターによる遺伝子導入効率は低く、このベクターによる遺伝子導入は、抗原活性化Ｔ細胞に特異的であることが判明した。従って、本発明の方法は、活性化Ｔ細胞への選択的な遺伝子導入に好適に利用することができる。Ｔ細胞は、癌およびその他の疾患の治療において免疫系を制御するための標的として重要であり、本発明の方法はこれら疾患の遺伝子治療に好適に用いられ得る。遺伝子導入は培養液、生理食塩水、血液、体液など所望の生理的水溶液中で行うことができる。
また本発明は、Ｔ細胞に所望の遺伝子を導入する方法であって、（ａ）該Ｔ細胞を活性化させる工程、および（ｂ）該遺伝子を保持するパラミクソウイルスベクターを、活性化させたＴ細胞に接触させる工程、を含む方法を提供する。この方法も、本発明におけるＴ細胞に遺伝子を導入する方法に含まれる。Ｔ細胞は、抗原刺激により活性化することができる。Ｔ細胞を活性化させる工程は、パラミクソウイルスベクターによる効率的な遺伝子導入を可能にする。Ｔ細胞の活性化は、パラミクソウイルスベクターをこのＴ細胞に接触させる前に行ってもよいし、パラミクソウイルスベクターの存在下で行ってもよい。
単純な技術により高い効率で遺伝子送達が起こることは、パラミクソウイルスベクターを介したＴ細胞標的化遺伝子送達の重要な優位性の１つである。以前に報告されているように、レトロウイルスおよびレンチウイルスを介したＴ細胞への遺伝子送達は、最適な遺伝子送達のためには遠心で濃縮しなくてはならず、毒性のある薬剤であるポリブレンなどを必要とする（Ｂｕｎｎｅｌｌ，Ｂ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５，９２：７７３９−７７４３；Ｃｈｕｃｋ，Ａ．Ｓ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１９９６，７：７４３−７５０；Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０００，９６：１３０９−１３１６；Ｆｅｈｓｅ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，１９９８，１０２：５６６−５７４）。一方でパラミクソウイルスベクター溶液は特別な薬剤に助けられることなく、単に添加するだけでより優れた遺伝子送達を達成することができた。さらに、活性化Ｔ細胞へのセンダイウイルスベクター（ＳｅＶ）を介する最適な遺伝子送達は、鼻腔粘膜（ｎａｓａｌ ｍｕｃｏｓａ）（Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０００，１８：９７０−９７３）、血管（ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）（Ｍａｓａｋｉ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２００１，１５：１２９４−１２９６）、網膜組織（ｒｅｔｉｎａｌ ｔｉｓｓｕｅ）（Ｉｋｅｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．，２００２，７５：３９−４８）等で見られた代表的な結果と同様、比較的短い暴露で行うことができた（３０分未満、データ省略）。臨床場面を考えると、パラミクソウイルスベクターを介した遺伝子送達のこれらの特徴は、本発明においても、Ｔリンパ球のｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝的改変を単純化し、操作に依存した細胞生存性の喪失を最小化し得るものである。
本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトリンパ球の細胞濃度を低くするほど、遺伝子導入細胞の比率が低くなることを見いだしたが、この結果はマウス細胞でも見られた。従って、遺伝子導入においては、細胞濃度は比較的高いことが好ましい。細胞濃度は、例えば１×１０６／ｍｌ〜４×１０６／ｍｌ、好ましくは４×１０６／ｍｌ〜８×１０６／ｍｌ、好ましくは８×１０６／ｍｌ〜１×１０７／ｍｌ程度にするとよい。
ＭＯＩは１〜５００の間で投与することが好ましく、より好ましくは２〜３００、さらに好ましくは３〜２００である。ベクターとＴ細胞との接触は短い時間でも十分であり、例えば１分以上、好ましくは３分以上、５分以上、１０分以上、または２０分以上接触させればよく、例えば１〜６０分程度、より特定すれば５分〜３０分程度であってよい。もちろん、それ以上の時間接触させてもよく、例えば数日間またはそれ以上接触させてもよい。
最近、免疫学的シナプス（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｎａｐｓ）を用いて抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、および４−１ＢＢリガンドによりＴ細胞を刺激できるユニバーサルアーティフィシャル抗原提示細胞（ＡＰＣ）システム（Ｍａｕｓ，Ｍ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００２，２０：１４３−１４８）を含む、幾つかの洗練された効率的な技術により、十分な量のＴ細胞株をより容易に調製することが可能となった。そのような技術を組み合わせれば、ＳｅＶに由来するベクター系は、様々な免疫学的疾患に対するＴ細胞指向性の遺伝子治療の臨床適用のための重要な治療的可能性を持つ。
また本発明は、活性化Ｔ細胞に選択的に遺伝子を導入する方法であって、該遺伝子を保持するパラミクソウイルスベクターを、活性化Ｔ細胞およびナイーブＴ細胞を含む細胞集団中に共存させる工程を含む方法を提供する。活性化Ｔ細胞に選択的とは、ナイーブＴ細胞に比べ活性化Ｔ細胞へ有意に遺伝子が導入されることを言う。例えば本発明は、該遺伝子を保持するパラミクソウイルスベクターを、活性化Ｔ細胞およびナイーブＴ細胞を含む細胞集団中に添加する工程を含む方法を提供する。パラミクソウイルスベクターは、ナイーブＴ細胞に比べ活性化Ｔ細胞へ優先的に遺伝子を導入するので、この方法により活性化Ｔ細胞に選択的に遺伝子を導入することができる。あるいは、予めＴ細胞とベクターを共存させておき、その後このＴ細胞を活性化させる処理を行うことにより、活性化されたＴ細胞の選択的にベクターを導入することができる。これらの方法も、本発明におけるＴ細胞に遺伝子を導入する方法に含まれる。
Ｔ細胞はＴリンパ球ともいい、組織主要適合抗原（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）上にのった抗原のペプチド複合体を認識するレセプターであるＴ細胞レセプターを発現したリンパ球である。主として、骨髄の幹細胞より分化し、胸腺にてポジティブセレクション（自己のＭＨＣを認識できるレパーターの選択）、ネガティブセレクション（自己抗原を認識するレパーター排除）を受け、成熟ナイーブＴ細胞として末梢血液、及びリンパ組織に出現する。Ｔ細胞は蛋白抗原、腫瘍抗原、アロ抗原、病原体などから由来するペプチドを認識し、抗原特異的な個体の免疫応答（適応免疫）を発生させる主たるリンパ球であり、ペプチドに対する抗体産生を援助（液性免疫）、あるいはそれ自身が武装化Ｔ細胞となって細胞性免疫を発動する。
活性化Ｔ細胞とは、抗原またはマイトジェンなどの刺激により、増殖分化へと導かれる状態となったＴリンパ球を言う。つまり、Ｔ細胞レセプターの結合、あるいは直接的な酵素活性化により細胞内チロシンリン酸化酵素の活性化、これに続くイノシトールリン脂質代謝の亢進、細胞内カルシウム濃度の上昇を経て、インターロイキン（ＩＬ）−２産生、ＩＬ−２レセプターの発現、及びそれに伴う細胞シグナルにより、ＤＮＡ合成、細胞分裂を開始し、増殖分化しているＴ細胞を言う。活性化時の生体環境により種々のサイトカインを産生する種々のＴ細胞へと分化する。
また、本発明において活性化Ｔ細胞は、好ましくは抗原により活性化されたＴ細胞である。センダイウイルスベクターによる導入は抗原活性化Ｔ細胞に選択的であり、抗原非特異的Ｔ細胞には、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて抗原に応答した特異的Ｔ細胞からバイスタンダーに活性化される場合においては遺伝子導入効率は低い。従って、Ｔ細胞を抗原により活性化することにより、あるいはこれと同等の活性化を行うことにより、ベクターによる遺伝子導入効率を劇的に向上させることができる。
抗原活性化Ｔ細胞とは、先に述べた抗原提示細胞のＭＨＣと、ある特定の抗原由来のペプチドなどとの複合体と適切なアフィニティーのあるＴ細胞レセプターを持ったＴ細胞が、両者の結合を介して、活性化シグナルを伝達したＴ細胞を言い、好ましくは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ等の適切なコレセプターよりのシグナルを伝達する事によって活性化したＴ細胞である。抗原活性化Ｔ細胞は、好ましくは、増殖、芽球化、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γなどの各種サイトカイン産生、Ｆａｓ Ｌｉｇａｎｄ、ｐｅｒｆｏｒｉｎなどの細胞傷害分子発現、及びＣＤ４０ Ｌｉｇａｎｄ等の抗原提示細胞および／またはＢ細胞を活性化するなどの能力を有する。抗原特異的Ｔ細胞はリンパ節等ではＭＨＣとペプチドを提示した抗原提示細胞のもとで、抗原提示細胞の活性化および／またはＢ細胞の活性化、抗体産生刺激を行い、末梢組織の局所ではその産生サイトカインおよび細胞傷害分子による細胞傷害、炎症の促進などの作用により、生体から非自己蛋白、非自己細胞、病原体の排除に主要な作用を及ぼす。
活性化Ｔ細胞は、分画により調製することができる。例えばヒトＴ細胞は、活性化に伴いＣＤ抗原の表現パターンを変化させるという特徴があるため、これにより活性化Ｔ細胞とナイーブＴ細胞とを選別することが可能である。具体的方法として、Ｔ細胞をネガティブセレクションで採取し、活性化Ｔ細胞に表出するＣＤ４５ＲＯに対する抗体を用い、マグネットビーズ分離法あるいはｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙによるソーティングを行うことで、好ましくは、ＣＤ４５ＲＡ及び、ＣＤ６２ＬダブルポジティブＴ細胞はナイーブＴ細胞、それ以外は活性化あるいはメモリーＴ細胞と考えられていることから、両者に対する抗体を用いて、マグネットビーズ分離法あるいはｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙによるソーティングを行うことで、活性化Ｔ細胞あるいはナイーブＴ細胞を分画できる。分画に用いる抗体は、既知の活性化関連マーカーを組み合わせたすべての方法で可能である。また、ケモカインレセプター、サイトカインレセプターなどの活性化Ｔ細胞の中のある特殊な機能をもったポピュレーションを分画する方法も含まれる。分画法に関しては、その他、比重を用いた方法など、既存の方法を含む。
また活性化Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞を抗原刺激により活性化して調製することもできる。例えばナイーブＴ細胞は、抗ＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍｌ）と抗ＣＤ２８抗体（１０μｇ／ｍｌ）を固着させたプレートに以下に述べる濃度で培養することで、好ましくは末梢血単球より分化させた成熟樹状細胞を同時に添加することで活性化させることができる。また、腫瘍抗原による活性化の項で述べるように、樹状細胞とペプチド、あるいは蛋白抗原を添加された培養でも活性化させることができる。
抗原活性化Ｔ細胞の調製は、例えばヒトアロ抗原を用いる場合は、ドナー、レシピエント末梢血を採取し、それぞれを末梢血リンパ球分離液でリンパ球を分離し、それぞれ１×１０７／ｍｌの濃度に調整、ドナー由来の細胞浮遊液を３０Ｇｙの放射線照射を行い、２４穴のプレートに各穴にそれぞれ５００μｌづつ注入し、ヒトＩＬ−２（５〜１００Ｕ／ｍｌ）で約７日間培養することで得られる。継代は約７日間ごとのドナー放射線照射リンパ球で再刺激することで可能である。抗原特異的Ｔ細胞株としては、少なくとも３回の抗原刺激（初回を含め、）を受けたものが望ましい。あるいは、２回の抗原刺激以降は抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体が固着化されたビーズあるいは細胞などを用いて刺激、増殖させたものも、抗原活性化Ｔ細胞に含まれる。
腫瘍抗原などによる活性化の場合は、４回以上の迅速な凍結融解をくり返して腫瘍細胞を溶解した溶液を末梢血より分化させた樹状細胞に添加した後、放射線照射２０Ｇｙ〜３０Ｇｙを照射したものを抗原提示細胞とし、それに末梢血より分離したＴ細胞をＩＬ−２（５〜１００Ｕ／ｍｌ）単独あるいは、その他ＩＬ−７等の至適サイトカインの存在下で７日間共培養、７日ごとの再刺激を３回行うことによって得られる（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ａｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５：９４８２−９４８７）。ここで用いられる樹状細胞は、末梢血単球あるいは骨髄、臍帯血、動化末梢血などの造血幹細胞よりＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４等のサイトカインを用いて増殖分化させる既知の方法により得られたものすべてを含む。
末梢血のＴ細胞の分離は、Ｔ細胞分離液での分離でも良いし、抗原内の有効なペプチドが分かっているならば、ＣｌａｓｓＩあるいはＣｌａｓｓＩＩのテトラマーとペプチド複合体による抗原特異的Ｔ細胞の分離方法により得られたものであってもよい。
活性化Ｔ細胞の調製に関して、以上の他に、既知の特異的抗原が明らかなものに関して、その抗原あるいは抗原由来の蛋白、ペプチドを使用して、Ｔ細胞を活性化する方法により調製することもできる。その他、活性化Ｔ細胞の作成には、レクチン等を用いた非特異的な活性化方法など、既知のＴ細胞活性化方法が使用可能である。本発明において抗原活性化Ｔ細胞には、このようにして得られた細胞も含まれる。
これら活性化されたＴ細胞は、適切な増殖因子、サイトカインと抗原及び抗原提示細胞（フィーダー細胞、分化させた樹状細胞、アーティフィシャルＡＰＣなどを含む）での共培養、または、抗原のない抗原提示細胞などとの共培養で継代が可能である。その他、種々の治療対象疾患にあった継代法を用いてもよい。例えば、感染免疫等に対する移入免疫治療の場合は、抗原で活性化されている最中のＴ細胞は様々なサイトカインを産生しているため、生体内へ移入した際、発熱等の副作用があらわれる可能性が有る。また、移入免疫としてのＴ細胞は生体の感染時にのみその機能を発現すべきである。そのため、抗原で活性化したＴ細胞にパラミクソウイルスベクターを用いて遺伝子導入した後、一旦、抗原のない状態でＡＰＣと共培養で継代し、静止状態の活性化Ｔ細胞（いわゆるメモリーＴ細胞）を継代によって作成する方法等がある。
本発明においてパラミクソウイルスベクターとは、パラミクソウイルスをベースとする感染力を持つウイルス粒子であって、遺伝子を細胞に導入するための担体である。ここで「感染力」とは、パラミクソウイルスベクターが細胞への接着能を保持しており、接着した細胞の内部にベクターに含まれる遺伝子を導入することのできる能力のことを言う。好ましい態様では、本発明のパラミクソウイルスベクターは、ベクターのゲノムＲＮＡ中に外来遺伝子が発現できるように組み込まれている。本発明のパラミクソウイルスベクターは、複製能を有していてもよく、複製能を有さない欠損型ベクターであってもよい。「複製能を有する」とは、ウイルスベクターが宿主細胞に感染した場合、該細胞においてウイルスが複製され、感染性ウイルス粒子が産生されることを指す。
組み換えウイルスとは、組み換えポリヌクレオチドを介して生成したウイルスを言う。組み換えポリヌクレオチドとは、両端または片端が自然の状態と同じようには結合していないポリヌクレオチドを言う。具体的には、組み換えポリヌクレオチドは、人の手によってポリヌクレオチド鎖の結合が改変（切断および／または結合）されたポリヌクレオチドである。組み換えポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド合成、ヌクレアーゼ処理、リガーゼ処理等を組み合わせて、公知の遺伝子組み換え方法により生成させることができる。組み換えウイルスは、遺伝子操作により構築されたウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチドを発現させ、ウイルスを再構築することによって生成することができる。例えば、組換えパラミクソウイルスは、ｃＤＮＡから再構成して生成することができる（Ｙ．Ｎａｇａｉ，Ａ．Ｋａｔｏ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４３，６１３−６２４（１９９９））。
本発明において遺伝子とは遺伝物質を指し、転写単位をコードする核酸を言う。遺伝子はＲＮＡであってもＤＮＡであってもよい。本発明において蛋白質をコードする核酸は、該蛋白質の遺伝子と呼ぶ。また遺伝子は蛋白質をコードしていなくてもよく、例えば遺伝子はリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡなどの機能的ＲＮＡをコードするものであってもよい。遺伝子は天然由来または人為的に設計された配列であり得る。また、本発明において「ＤＮＡ」とは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む。また蛋白質をコードするとは、ポリヌクレオチドが該蛋白質を適当な条件下で発現できるように、該蛋白質のアミノ酸配列をコードするＯＲＦをセンスまたはアンチセンスに含むことを言う。
本発明においてパラミクソウイルスとはパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスまたはその誘導体を指す。パラミクソウイルスは、非分節型ネガティブ鎖ＲＮＡをゲノムに持つウイルスのグループの１つで、パラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）（レスピロウイルス属（パラミクソウイルス属とも言う）、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）およびニューモウイルス亜科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）（ニューモウイルス属およびメタニューモウイルス属を含む）ウイルスを含む。本発明を適用可能なパラミクソウイルスとしては、具体的にはセンダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）、おたふくかぜウイルス（Ｍｕｍｐｓ ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ）、ＲＳウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウイルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウイルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ）、サルパラインフルエンザウイルス（ＳＶ５）、ヒトパラインフルエンザウイルス１，２，３型等が挙げられる。より具体的には、例えば Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ（ＳｅＶ）、ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ−１（ＨＰＩＶ−１）、ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ−３（ＨＰＩＶ−３）、、ｐｈｏｃｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ（ＰＤＶ）、ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ（ＣＤＶ）、ｄｏｌｐｈｉｎ ｍｏｌｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ（ＤＭＶ）、ｐｅｓｔｅ−ｄｅｓ−ｐｅｔｉｔｓ−ｒｕｍｉｎａｎｔｓ ｖｉｒｕｓ（ＰＤＰＲ）、ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ（ＭＶ）、ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ ｖｉｒｕｓ（ＲＰＶ）、Ｈｅｎｄｒａ ｖｉｒｕｓ（Ｈｅｎｄｒａ）、Ｎｉｐａｈ ｖｉｒｕｓ （Ｎｉｐａｈ）、ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ−２（ＨＰＩＶ−２）、ｓｉｍｉａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ５（ＳＶ５）、ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ−４ａ（ＨＰＩＶ−４ａ）、ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ−４ｂ（ＨＰＩＶ−４ｂ）、ｍｕｍｐｓ ｖｉｒｕｓ（Ｍｕｍｐｓ）、およびＮｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ （ＮＤＶ）などが含まれる。より好ましくは、Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ（ＳｅＶ）、ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ−１（ＨＰＩＶ−１）、ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ−３（ＨＰＩＶ−３）、ｐｈｏｃｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ（ＰＤＶ）、ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ（ＣＤＶ）、ｄｏｌｐｈｉｎ ｍｏｌｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ（ＤＭＶ）、ｐｅｓｔｅ−ｄｅｓ−ｐｅｔｉｔｓ−ｒｕｍｉｎａｎｔｓ ｖｉｒｕｓ（ＰＤＰＲ）、ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ（ＭＶ）、ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ ｖｉｒｕｓ（ＲＰＶ）、Ｈｅｎｄｒａ ｖｉｒｕｓ（Ｈｅｎｄｒａ）、およびＮｉｐａｈ ｖｉｒｕｓ（Ｎｉｐａｈ）からなる群より選択されるウイルスが例示できる。本発明のウイルスは、好ましくはパラミクソウイルス亜科（レスピロウイルス属、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）に属するウイルスまたはその誘導体であり、より好ましくはレスピロウイルス属（ｇｅｎｕｓ Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）（パラミクソウィルス属（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）とも言う）に属するウイルスまたはその誘導体である。本発明を適用可能なレスピロウイルス属ウイルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウイルス１型（ＨＰＩＶ−１）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（ＨＰＩＶ−３）、ウシパラインフルエンザウイルス３型（ＢＰＩＶ−３）、センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ；マウスパラインフルエンザウイルス１型とも呼ばれる）、およびサルパラインフルエンザウイルス１０型（ＳＰＩＶ−１０）などが含まれる。本発明においてパラミクソウイルスは、最も好ましくはセンダイウイルスである。これらのウイルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。
パラミクソウイルスベクターはゲノムＲＮＡに搭載遺伝子をアンチセンスにコードしている。ゲノムＲＮＡとは、パラミクソウイルスのウイルス蛋白質と共にリボヌクレオプロテイン（ＲＮＰ）を形成し、該蛋白質によりゲノム中の遺伝子が発現し、このＲＮＡが複製されて娘ＲＮＰが形成される機能を持つＲＮＡである。一般にパラミクソウイルスのゲノムは、３’リーダー領域と５’トレイラー領域の間に、ウイルス遺伝子がアンチセンスとして並んだ構成をしている。各遺伝子のＯＲＦの間には、転写終結配列（Ｅ配列）−介在配列（Ｉ配列）−転写開始配列（Ｓ配列）が存在し、これにより各遺伝子のＯＲＦをコードするＲＮＡが別々のシストロンとして転写される。
パラミクソウイルスのウイルスタンパク質をコードする遺伝子としては、ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子が含まれる。「ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子」とは、それぞれヌクレオキャプシド、ホスホ、マトリックス、フュージョン、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ、およびラージ蛋白質をコードする遺伝子のことを指す。パラミクソウイルス亜科に属する各ウイルスにおける各遺伝子は、一般に次のように表記される。一般に、ＮＰ遺伝子は「Ｎ遺伝子」と表記されることもある。
レスピロウイルス属 ＮＰ Ｐ／Ｃ／Ｖ Ｍ Ｆ ＨＮ − Ｌ
ルブラウイルス属 ＮＰ Ｐ／Ｖ Ｍ Ｆ ＨＮ （ＳＨ）Ｌ
モービリウイルス属 ＮＰ Ｐ／Ｃ／Ｖ Ｍ Ｆ Ｈ − Ｌ
例えばセンダイウイルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号は、ＮＰ遺伝子についてはＭ２９３４３、Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５１３３１，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ１７２１８、Ｐ遺伝子についてはＭ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８３，Ｘ１７００７，Ｘ１７００８、Ｍ遺伝子についてはＤ１１４４６，Ｋ０２７４２，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｕ３１９５６，Ｘ００５８４，Ｘ５３０５６、Ｆ遺伝子についてはＤ００１５２，Ｄ１１４４６，Ｄ１７３３４，Ｄ１７３３５，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００１５２，Ｘ０２１３１、ＨＮ遺伝子についてはＤ２６４７５，Ｍ１２３９７，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８６，Ｘ０２８０８，Ｘ５６１３１、Ｌ遺伝子についてはＤ０００５３，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４０，Ｘ００５８７，Ｘ５８８８６を参照のこと。またその他のウイルスがコードするウイルス遺伝子を例示すれば、Ｎ遺伝子については、ＣＤＶ，ＡＦ０１４９５３；ＤＭＶ，Ｘ７５９６１；ＨＰＩＶ−１，Ｄ０１０７０；ＨＰＩＶ−２，Ｍ５５３２０；ＨＰＩＶ−３，Ｄ１００２５；Ｍａｐｕｅｒａ，Ｘ８５１２８；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１７２；ＭＶ，Ｋ０１７１１；ＮＤＶ，ＡＦ０６４０９１；ＰＤＰＲ，Ｘ７４４４３；ＰＤＶ，Ｘ７５７１７；ＲＰＶ，Ｘ６８３１１；ＳｅＶ，Ｘ０００８７；ＳＶ５，Ｍ８１４４２；およびＴｕｐａｉａ，ＡＦ０７９７８０、Ｐ遺伝子については、ＣＤＶ，Ｘ５１８６９；ＤＭＶ，Ｚ４７７５８；ＨＰＩＶ−１，Ｍ７４０８１；ＨＰＩＶ−３，Ｘ０４７２１；ＨＰＩＶ−４ａ，Ｍ５５９７５；ＨＰＩＶ−４ｂ，Ｍ５５９７６；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１７３；ＭＶ，Ｍ８９９２０；ＮＤＶ，Ｍ２０３０２；ＰＤＶ，Ｘ７５９６０；ＲＰＶ，Ｘ６８３１１；ＳｅＶ，Ｍ３０２０２；ＳＶ５，ＡＦ０５２７５５；およびＴｕｐａｉａ，ＡＦ０７９７８０、Ｃ遺伝子についてはＣＤＶ，ＡＦ０１４９５３；ＤＭＶ，Ｚ４７７５８；ＨＰＩＶ−１．Ｍ７４０８１；ＨＰＩＶ−３，Ｄ０００４７；ＭＶ，ＡＢ０１６１６２；ＲＰＶ，Ｘ６８３１１；ＳｅＶ，ＡＢ００５７９６；およびＴｕｐａｉａ，ＡＦ０７９７８０、Ｍ遺伝子についてはＣＤＶ，Ｍ１２６６９；ＤＭＶ Ｚ３００８７；ＨＰＩＶ−１，Ｓ３８０６７；ＨＰＩＶ−２，Ｍ６２７３４；ＨＰＩＶ−３，Ｄ００１３０；ＨＰＩＶ−４ａ，Ｄ１０２４１；ＨＰＩＶ−４ｂ，Ｄ１０２４２；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１７１；ＭＶ，ＡＢ０１２９４８；ＮＤＶ，ＡＦ０８９８１９；ＰＤＰＲ，Ｚ４７９７７；ＰＤＶ，Ｘ７５７１７；ＲＰＶ，Ｍ３４０１８；ＳｅＶ，Ｕ３１９５６；およびＳＶ５，Ｍ３２２４８、Ｆ遺伝子についてはＣＤＶ，Ｍ２１８４９；ＤＭＶ，ＡＪ２２４７０４；ＨＰＮ−１．Ｍ２２３４７；ＨＰＩＶ−２，Ｍ６０１８２；ＨＰＩＶ−３．Ｘ０５３０３，ＨＰＩＶ−４ａ，Ｄ４９８２１；ＨＰＩＶ−４ｂ，Ｄ４９８２２；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１６９；ＭＶ，ＡＢ００３１７８；ＮＤＶ，ＡＦ０４８７６３；ＰＤＰＲ，Ｚ３７０１７；ＰＤＶ，ＡＪ２２４７０６；ＲＰＶ，Ｍ２１５１４；ＳｅＶ，Ｄ１７３３４；およびＳＶ５，ＡＢ０２１９６２、ＨＮ（ＨまたはＧ）遺伝子についてはＣＤＶ，ＡＦ１１２１８９；ＤＭＶ，ＡＪ２２４７０５；ＨＰＩＶ−１，Ｕ７０９４９８；ＨＰＩＶ−２．Ｄ０００８６５；ＨＰＩＶ−３，ＡＢ０１２１３２；ＨＰＩＶ−４Ａ，Ｍ３４０３３；ＨＰＩＶ−４Ｂ，ＡＢ００６９５４；Ｍｕｍｐｓ，Ｘ９９０４０；ＭＶ，Ｋ０１７１１；ＮＤＶ，ＡＦ２０４８７２；ＰＤＰＲ，Ｚ８１３５８；ＰＤＶ，Ｚ３６９７９；ＲＰＶ，ＡＦ１３２９３４；ＳｅＶ，Ｕ０６４３３；およびＳＶ−５，Ｓ７６８７６が例示できる。但し、各ウイルスは複数の株が知られており、株の違いにより上記に例示した以外の配列からなる遺伝子も存在する。
これらのウイルス蛋白質をコードするＯＲＦおよび外来遺伝子のＯＲＦは、ゲノムＲＮＡにおいて上記のＥ−Ｉ−Ｓ配列を介してアンチセンスに配置される。ゲノムＲＮＡにおいて最も３’に近いＯＲＦは、３’リーダー領域と該ＯＲＦとの間にＳ配列のみが必要であり、ＥおよびＩ配列は必要ない。またゲノムＲＮＡにおいて最も５’に近いＯＲＦは、５’トレイラー領域と該ＯＲＦとの間にＥ配列のみが必要であり、ＩおよびＳ配列は必要ない。また２つのＯＲＦは、例えばＩＲＥＳ等の配列を用いて同一シストロンとして転写させることも可能である。このような場合は、これら２つのＯＲＦの間にはＥ−Ｉ−Ｓ配列は必要ない。野生型のパラミクソウイルスの場合、典型的なＲＮＡゲノムは、３’リーダー領域に続き、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ蛋白質をアンチセンスにコードする６つのＯＲＦが順に並んでおり、それに続いて５’トレイラー領域を他端に有する。本発明のゲノムＲＮＡにおいては、ウイルス遺伝子の配置はこれに限定されるものではないが、好ましくは、野生型ウイルスと同様に、３’リーダー領域に続き、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ蛋白質をコードするＯＲＦが順に並び、それに続いて５’トレイラー領域が配置されることが好ましい。ある種のパラミクソウイルスにおいては、ウイルス遺伝子が異なっているが、そのような場合でも上記と同様に各ウイルス遺伝子を野生型と同様の配置とすることが好ましい。一般にＮ、Ｐ、およびＬ遺伝子を保持しているベクターは、細胞内で自律的にＲＮＡゲノムから遺伝子が発現し、ゲノムＲＮＡが複製される。さらにＦおよびＨＮ遺伝子等のエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子、およびＭ遺伝子の働きにより、感染性のウイルス粒子が形成され、細胞外に放出される。従って、このようなベクターは複製能を有するウイルスベクターとなる。Ｔ細胞に導入したい外来遺伝子は、後述するように、このゲノム中の蛋白質非コード領域に挿入すればよい。
また、本発明のパラミクソウイルスベクターは、野生型パラミクソウイルスが持つ遺伝子のいずれかを欠損したものであってよい。例えば、Ｍ、Ｆ、またはＨＮ遺伝子、あるいはそれらの組み合わせが含まれていないパラミクソウイルスベクターも、本発明のパラミクソウイルスベクターとして好適に用いることができる。このようなウイルスベクターの再構成は、例えば、欠損している遺伝子産物を外来的に供給することにより行うことができる。このようにして製造されたウイルスベクターは、野生型ウイルスと同様に宿主細胞に接着して細胞融合を起こすが、細胞に導入されたベクターゲノムはウイルス遺伝子に欠損を有するため、最初と同じような感染力を持つ娘ウイルス粒子は形成されない。このため、一回限りの遺伝子導入力を持つ安全なウイルスベクターとして有用である。ゲノムから欠損させる遺伝子としては、例えばＦ遺伝子および／またはＨＮ遺伝子が挙げられる。例えば、Ｆ遺伝子が欠損した組み換えパラミクソウイルスベクターゲノムを発現するプラスミドを、Ｆ蛋白質の発現ベクターならびにＮＰ、Ｐ、およびＬ蛋白質の発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフェクションすることにより、ウイルスベクターの再構成を行うことができる（ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０；Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（１４）６５６４−６５６９（２０００））。また、例えば、Ｆ遺伝子が染色体に組み込まれた宿主細胞を用いてウイルスを製造することもできる。これらの蛋白質群は、そのアミノ酸配列はウイルス由来の配列そのままでなくとも、核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異を導入したり、あるいは他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよい。
また、本発明のウイルスベクターとして、ベクターゲノムが由来するウイルスのエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をエンベロープに含むベクターを作製することもできる。例えば、ウイルス再構成の際に、ベクターのベースとなるウイルスのゲノムがコードするエンベロープ蛋白質以外のエンベロープ蛋白質を細胞で発現させることにより、所望のエンベロープ蛋白質を有するウイルスベクターを製造することができる。このような蛋白質に特に制限はない。例えば、他のウイルスのエンベロープ蛋白質、例えば水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧ蛋白質（ＶＳＶ−Ｇ）を挙げることができる。本発明のウイルスベクターには、ＶＳＶ−Ｇ蛋白質などのように、ゲノムが由来するウイルス以外のウイルスに由来するエンベロープ蛋白質を含むシュードタイプウイルスベクターが含まれる。ウイルスのゲノムＲＮＡにはこれらのエンベロープ蛋白質をゲノムにコードされないように設計すれば、ウイルス粒子が細胞に感染した後は、ウイルスベクターからこの蛋白質が発現されることはない。
また、本発明のウイルスベクターは、例えば、エンベロープ表面に特定の細胞に接着しうるような接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質、抗体またはその断片、あるいはこれらの蛋白質を細胞外領域に有し、ウイルスエンベロープ由来のポリペプチドを細胞内領域に有するキメラ蛋白質などを含むものであってもよい。これにより、ベクターのＴ細胞への特異性を制御し得る。これらはウイルスゲノムにコードされていてもよいし、ウイルスベクターの再構成時に、ウイルスゲノム以外の遺伝子（例えば別の発現ベクターまたは宿主染色体上などにある遺伝子）の発現により供給されてもよい。
また本発明のベクターは、例えばウイルス蛋白質による免疫原性を低下させるために、またはＲＮＡの転写効率または複製効率を高めるために、ベクターに含まれる任意のウイルス遺伝子が野生型遺伝子から改変されていてよい。具体的には、例えばパラミクソウイルスベクターにおいては、複製因子であるＮ、Ｐ、およびＬ遺伝子の中の少なくとも一つを改変し、転写または複製の機能を高めることが考えられる。また、エンベロープ蛋白質の１つであるＨＮ蛋白質は、赤血球凝集素であるヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）活性とノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）活性との両者の活性を有するが、例えば前者の活性を弱めることができれば、血液中でのウイルスの安定性を向上させることが可能であろうし、例えば後者の活性を改変することにより、感染能を調節することも可能である。また、Ｆ蛋白質を改変することにより膜融合能を調節することもできる。また、例えば、細胞表面の抗原分子となりうるＦ蛋白質またはＨＮ蛋白質の抗原提示エピトープ等を解析し、これを利用してこれらの蛋白質に関する抗原提示能を弱めたウイルスベクターを作製することもできる。
また本発明のベクターにおいては、アクセサリー遺伝子が欠損したものであってよい。例えばＳｅＶのアクセサリー遺伝子の１つであるＶ遺伝子をノックアウトすることにより、培養細胞における遺伝子発現および複製は障害されることなく、マウス等の宿主に対するＳｅＶの病原性が顕著に減少する（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：７２６６−７２７２；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ Ｊ．１６：５７８−５８７；Ｃｕｒｒａｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ＷＯ０１／０４２７２，ＥＰ１０６７１７９）。このような弱毒化ベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおける毒性のない遺伝子導入用ウイルスベクターとして特に有用である。
パラミクソウイルスは遺伝子導入ベクターとして優れており、宿主細胞の細胞質でのみ転写・複製を行い、ＤＮＡフェーズを持たないため染色体への組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）は起こらない（Ｌａｍｂ，Ｒ．Ａ．ａｎｄ Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ，Ｄ．，Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ ：Ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｆｉｅｌｄｓ ＢＮ，Ｋｎｉｐｅ ＤＭ，Ｈｏｗｌｅｙ ＰＭ，（ｅｄｓ）．Ｆｉｅｌｄｓ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．２．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６，ｐｐ．１１７７−１２０４）。このため染色体異常による癌化および不死化などの安全面における問題が生じない。パラミクソウイルスのこの特徴は、ベクター化した時の安全性に大きく寄与している。異種遺伝子発現の結果では、例えばセンダイウイルス（ＳｅＶ）を連続多代継代しても殆ど塩基の変異が認められず、ゲノムの安定性が高く、挿入異種遺伝子を長期間に渡って安定に発現する事が示されている（Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ ２，４５７−４６６（１９９７））。また、カプシド構造蛋白質を持たないことによる導入遺伝子のサイズまたはパッケージングの柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）など性質上のメリットがある。このように、パラミクソウイルスベクターは、ヒトの遺伝子治療のための高効率ベクターの新しいクラスとなることが示唆される。複製能を有するＳｅＶベクターは、外来遺伝子を少なくとも４ｋｂまで導入可能であり、転写ユニットを付加することによって２種類以上の遺伝子を同時に発現する事も可能である。
またセンダイウイルスは、齧歯類にとっては病原性で肺炎を生じることが知られているが、人に対しては病原性がない。これはまた、野生型センダイウイルスの経鼻的投与によって非ヒト霊長類において重篤な有害作用を示さないというこれまでの報告によっても支持されている（Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １５：５３３−５４０，１９９７）。センダイウイルスのこれらの特徴は、センダイウイルスベクターが、ヒトの治療へ応用できることを示唆し、センダイウイルスベクターが、ヒトＴ細胞を標的とした遺伝子治療の有望な選択肢の一つとなることを結論づけるものである。
本発明のウイルスベクターは、ゲノムＲＮＡ中に外来遺伝子をコードし得る。外来遺伝子を含む組換えパラミクソウイルスベクターは、上記のパラミクソウイルスベクターゲノムに外来遺伝子を挿入することによって得られる。外来遺伝子としては、標的とするＴ細胞において発現させたい所望の遺伝子を用いることができる。外来遺伝子は天然型蛋白質をコードする遺伝子であってもよく、あるいは欠失、置換または挿入により天然型蛋白質を改変した蛋白質をコードする遺伝子であってもよい。外来遺伝子の挿入位置は、例えばウイルスゲノムの蛋白質非コード領域の所望の部位を選択することができ、例えばゲノムＲＮＡの３’リーダー領域と３’端に最も近いウイルス蛋白質ＯＲＦとの間、各ウイルス蛋白質ＯＲＦの間、および／または５’端に最も近いウイルス蛋白質ＯＲＦと５’トレイラー領域の間に挿入することができる。また、ＦまたはＨＮ遺伝子などを欠失するゲノムでは、その欠失領域に外来遺伝子をコードする核酸を挿入することができる。パラミクソウイルスに外来遺伝子を導入する場合は、ゲノムへの挿入断片のポリヌクレオチドの鎖長が６の倍数となるように挿入することが望ましい（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．８，４８２２−４８３０，１９９３）。挿入した外来遺伝子とウイルスＯＲＦとの間には、Ｅ−Ｉ−Ｓ配列が構成されるようにする。Ｅ−Ｉ−Ｓ配列を介して２またはそれ以上の遺伝子をタンデムに並べて挿入することができる。
ベクターに搭載する外来遺伝子の発現レベルは、その遺伝子の上流（ネガティブ鎖の３’側）に付加する転写開始配列の種類により調節することができる（ＷＯ０１／１８２２３）。また、ゲノム上の外来遺伝子の挿入位置によって制御することができ、ネガティブ鎖の３’の近くに挿入するほど発現レベルが高く、５’の近くに挿入するほど発現レベルが低くなる。このように、外来遺伝子の挿入位置は、該遺伝子の所望の発現量を得るために、また前後のウイルス蛋白質をコードする遺伝子との組み合わせが最適となる様に適宜調節することができる。一般に、外来遺伝子の高い発現が得られることが有利と考えられるため、外来遺伝子は、効率の高い転写開始配列に連結し、ネガティブ鎖ゲノムの３’端近くに挿入することが好ましい。具体的には、３’リーダー領域と３’に最も近いウイルス蛋白質ＯＲＦとの間に挿入される。あるいは、３’に一番近いウイルス遺伝子と２番目の遺伝子のＯＲＦの間に挿入してもよい。野生型パラミクソウイルスにおいては、ゲノムの３’に最も近いウイルス蛋白質遺伝子はＮ遺伝子であり、２番目の遺伝子はＰ遺伝子である。逆に、導入遺伝子の高発現が望ましくない場合は、例えばベクターにおける外来遺伝子の挿入位置をネガティブ鎖のなるべく５’側に設定したり、転写開始配列を効率の低いものにするなどして、ウイルスベクターからの発現レベルを低く抑えることで適切な効果が得られるようにすることも可能である。
本発明のベクターを製造するには、哺乳動物細胞においてパラミクソウイルスの成分であるＲＮＰの再構成に必要なウイルス蛋白質、すなわちＮ、Ｐ、およびＬ蛋白質の存在下、パラミクソウイルスのゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡを転写させる。転写によりネガティブ鎖ゲノム（すなわちウイルスゲノムと同じアンチセンス鎖）を生成させてもよく、あるいはポジティブ鎖（ウイルス蛋白質をコードするセンス鎖）を生成させても、ウイルスＲＮＰを再構成することができる。ベクターの再構成効率を高めるには、好ましくはポジティブ鎖を生成させる。ＲＮＡ末端は、天然のウイルスゲノムと同様に３’リーダー配列と５’トレイラー配列の末端をなるべく正確に反映させることが好ましい。転写産物の５’端を正確に制御するためには、例えば転写開始部位としてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ認識配列を利用し、該ＲＮＡポリメラーゼを細胞内で発現させればよい。転写産物の３’端を制御するには、例えば転写産物の３’端に自己切断型リボザイムをコードさせておき、このリボザイムにより正確に３’端が切り出されるようにすることができる（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ Ｊ．１６：５７８−５８７及びＹｕ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ ２：４５７−４６６）。
例えば外来遺伝子を有する組み換えセンダイウイルスベクターは、Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ Ｊ．１６：５７８−５８７及びＹｕ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ ２：４５７−４６６の記載等に準じて、次のようにして構築することができる。
まず、目的の外来遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ試料を用意する。ＤＮＡ試料は、２５ｎｇ／μｌ以上の濃度で電気泳動的に単一のプラスミドと確認できることが好ましい。以下、ＮｏｔＩ部位を利用してウイルスゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡに外来遺伝子を挿入する場合を例にとって説明する。目的とするｃＤＮＡ塩基配列の中にＮｏｔＩ認識部位が含まれる場合は、部位特異的変異導入法などを用いて、コードするアミノ酸配列を変化させないように塩基配列を改変し、ＮｏｔＩ部位を予め除去しておくことが好ましい。この試料から目的の遺伝子断片をＰＣＲにより増幅し回収する。２つのプライマーの５’部分にＮｏｔＩ部位を付加しておくことにより、増幅された断片の両端をＮｏｔＩ部位とする。ウイルスゲノム上に挿入された後の外来遺伝子のＯＲＦとその両側のウイルス遺伝子のＯＲＦとの間にＥ−Ｉ−Ｓ配列が配置されるように、プライマー中にＥ−Ｉ−Ｓ配列を含めるように設計する。
例えば、フォワード側合成ＤＮＡ配列は、ＮｏｔＩによる切断を保証するために５’側に任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはＧＣＧおよびＧＣＣなどのＮｏｔＩ認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはＡＣＴＴ）を選択し、その３’側にＮｏｔＩ認識部位ｇｃｇｇｃｃｇｃを付加し、さらにその３’側にスペーサー配列として任意の９塩基または９に６の倍数を加えた数の塩基を付加し、さらにその３’側に所望のｃＤＮＡの開始コドンＡＴＧからこれを含めてＯＲＦの約２５塩基相当の配列を付加した形態とする。最後の塩基はＧまたはＣとなるように該所望のｃＤＮＡから約２５塩基を選択してフォワード側合成オリゴＤＮＡの３’の末端とすることが好ましい。
リバース側合成ＤＮＡ配列は５’側から任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはＧＣＧおよびＧＣＣなどのＮｏｔＩ認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはＡＣＴＴ）を選択し、その３’側にＮｏｔＩ認識部位ｇｃｇｇｃｃｇｃを付加し、さらにその３’側に長さを調節するための挿入断片のオリゴＤＮＡを付加する。このオリゴＤＮＡの長さは、最終的なＰＣＲ増幅産物のＮｏｔＩ断片の鎖長が６の倍数になるように塩基数を設計する（いわゆる「６のルール（ｒｕｌｅ ｏｆ ｓｉｘ）」；Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８９１−８９９，１９９８；Ｃａｌａｉｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４８２２−４８３０，１９９３；Ｃａｌａｉｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４８２２−４８３０，１９９３）。このプライマーにＥ−Ｉ−Ｓ配列を付加する場合には、挿入断片のオリゴＤＮＡの３’側にセンダイウイルスのＳ配列、Ｉ配列、およびＥ配列の相補鎖配列、好ましくはそれぞれ５’−ＣＴＴＴＣＡＣＣＣＴ−３’（配列番号：１）、５’−ＡＡＧ−３’、および５’−ＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＡＣＧＧ−３’（配列番号：２）を付加し、さらにその３’側に所望のｃＤＮＡ配列の終始コドンから逆に数えて約２５塩基相当の相補鎖の最後の塩基がＧまたはＣになるように長さを選択して配列を付加し、リバース側合成ＤＮＡの３’の末端とする。
ＰＣＲは、Ｔａｑポリメラーゼまたはその他のＤＮＡポリメラーゼを用いる通常の方法を用いることができる。増幅した目的断片はＮｏｔＩで消化した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等のプラスミドベクターのＮｏｔＩ部位に挿入する。得られたＰＣＲ産物の塩基配列をシークエンサーで確認し、正しい配列のプラスミドを選択する。このプラスミドから挿入断片をＮｏｔＩで切り出し、ゲノムｃＤＮＡを含むプラスミドのＮｏｔＩ部位にクローニングする。またプラスミドベクターを介さずにゲノムｃＤＮＡのＮｏｔＩ部位に直接挿入し、組み換えセンダイウイルスｃＤＮＡを得ることも可能である。
例えば、組み換えセンダイウイルスゲノムｃＤＮＡであれば、文献記載の方法に準じて構築することができる（Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ ２：４５７−４６６，１９９７；Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７）。例えば、ＮｏｔＩ制限部位を有する１８ｂｐのスペーサー配列（５’−（Ｇ）−ＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＧ−３’）（配列番号：３）を、クローニングされたセンダイウイルスゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ（＋））のリーダー配列とＮ蛋白質のＯＲＦとの間に挿入し、デルタ肝炎ウイルスのアンチゲノム鎖（ａｎｔｉｇｅｎｏｍｉｃ ｓｔｒａｎｄ）由来の自己開裂リボザイム部位を含むプラスミドｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）を得る（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：２８１３−２８２０）。ｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）のＮｏｔＩ部位に外来遺伝子断片を挿入し、所望の外来遺伝子が組み込まれた組み換えセンダイウイルスｃＤＮＡを得ることができる。
このようにして作製した組み換えパラミクソウイルスのゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡを、上記のウイルス蛋白質（Ｌ、Ｐ、およびＮ）存在下で細胞内で転写させることにより、本発明のベクターを再構成することができる。本発明は、本発明のベクターの製造のための、本発明のベクターのウイルスゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡを提供する。また本発明は、本発明のベクターの製造に適用するための、該ベクターのゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡの使用に関する。組み換えウイルスの再構成は公知の方法を利用して行うことができる（ＷＯ９７／１６５３９；ＷＯ９７／１６５３８；Ｄｕｒｂｉｎ，Ａ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３５：３２３−３３２；Ｗｈｅｌａｎ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：８３８８−８３９２；Ｓｃｈｎｅｌｌ．Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ Ｊ．１３：４１９５−４２０３；Ｒａｄｅｃｋｅ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ Ｊ．１４：５７７３−５７８４；Ｌａｗｓｏｎ，Ｎ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：４４７７−４４８１；Ｇａｒｃｉｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ Ｊ．１４：６０８７−６０９４；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：５６９−５７９；Ｂａｒｏｎ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｔ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２６５−１２７１；Ｂｒｉｄｇｅｎ，Ａ．ａｎｄ Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｒ．Ｍ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１５４００−１５４０４）。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、リンダーペストウイルス、センダイウイルスなどを含むマイナス鎖ＲＮＡウイルスをＤＮＡから再構成させることができる。これらの方法に準じて、本発明のベクターを再構成させることができる。ウイルスベクターＤＮＡにおいて、Ｆ遺伝子、ＨＮ遺伝子、および／またはＭ遺伝子を欠失させた場合には、そのままでは感染性のウイルス粒子を形成しないが、宿主細胞に、これら欠失させた遺伝子および／または他のウイルスのエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子などを別途、細胞に導入し発現させることにより、感染性のウイルス粒子を形成させることが可能である。
具体的な手順は、（ａ）パラミクソウイルスゲノムＲＮＡ（ネガティブ鎖ＲＮＡ）またはその相補鎖（ポジティブ鎖）をコードするｃＤＮＡを、Ｎ、Ｐ、およびＬ蛋白質を発現する細胞で転写させる工程、（ｂ）生成したパラミクソウイルスを含む培養上清を回収する工程、により製造することができる。転写のために、ゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡは適当なプロモーターの下流に連結される。転写されたゲノムＲＮＡはＮ、Ｌ、およびＰ蛋白質の存在下で複製されＲＮＰ複合体を形成する。そしてＭ、ＨＮ、およびＦ蛋白質の存在下でエンベロープに包まれたウイルス粒子が形成される。ゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えばＴ７プロモーターの下流に連結させ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡに転写させる。プロモーターとしては、Ｔ７ポリメラーゼの認識配列を含むもの以外にも所望のプロモーターを利用することができる。あるいは、インビトロで転写させたＲＮＡを細胞にトランスフェクトしてもよい。
ＤＮＡからのゲノムＲＮＡの最初の転写に必要なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ等の酵素は、これを発現するプラスミドまたはウイルスベクターの導入によって供給することができるし、または、例えば細胞の染色体にＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を、発現を誘導できるように組み込んでおき、ウイルス再構成時に発現を誘導することにより供給することもできる。またゲノムＲＮＡ、およびベクター再構成に必要なウイルス蛋白質は、例えばこれらを発現するプラスミドの導入によって供給する。これらのウイルス蛋白質の供給において、野生型またはある種の変異パラミクソウイルスなどのヘルパーウイルスを用いる。
ゲノムＲＮＡを発現するＤＮＡを細胞内に導入する方法には、例えば次のような方法、▲１▼目的の細胞が取り込めるようなＤＮＡ沈殿物を作る方法、▲２▼目的の細胞による取りこみに適し、かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つＤＮＡを含む複合体を作る方法、▲３▼目的の細胞膜に、ＤＮＡ分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスによって瞬間的に開ける方法などがある。
▲２▼としては、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、ＤＯＴＭＡ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ ＃３０１３０５）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＥＲ（Ｒｏｃｈｅ ＃１８１１１６９）などが挙げられる。▲１▼としては例えばリン酸カルシウムを用いたトランスフェクション法が挙げられ、この方法によって細胞内に入ったＤＮＡは貧食小胞に取り込まれるが、核内にも十分な量のＤＮＡが入ることが知られている（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ，Ｊ．，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６；Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ａｎｄ Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，Ｓ．，１９７７，Ｃｅｌｌ １１：２２３）。ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａはトランスファー技術の最適化を検討し、１）細胞と共沈殿物のインキュベーション条件を２〜４％ＣＯ２、３５℃、１５〜２４時間、２）ＤＮＡは直鎖状より環状のものが活性が高く、３）沈殿混液中のＤＮＡ濃度が２０〜３０μｇ／ｍｌのとき最適な沈殿が得られると報告している（Ｃｈｅｎ，Ｃ．ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５）。▲２▼の方法は、一過的なトランスフェクションに適している。古くはＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ ＃Ｄ−９８８５ Ｍ．Ｗ．５×１０５）混液を所望のＤＮＡ濃度比で調製し、トランスフェクションを行う方法が知られている。複合体の多くはエンドソームの中で分解されてしまうため、効果を高めるためにクロロキンを加えることもできる（Ｃａｌｏｓ，Ｍ．Ｐ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：３０１５）。▲３▼の方法は電気穿孔法と呼ばれる方法で、細胞選択性がないという点で▲１▼または▲２▼の方法に比べて汎用性が高い。効率はパルス電流の持続時間、パルスの形、電界（電極間のギャップ、電圧）の強さ、バッファーの導電率、ＤＮＡ濃度、細胞密度の最適条件下で良いとされている。
以上、３つのカテゴリーの中で▲２▼の方法は操作が簡便で多量の細胞を用いて多数の検体を検討することができるので、ベクター再構成のためのＤＮＡの細胞への導入には、トランスフェクション試薬が適している。好適にはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃａｔ Ｎｏ．３０１３０５）、またはＤＯＳＰＥＲ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ Ｎｏ．１８１１１６９）が用いられるが、これらに制限されない。
ｃＤＮＡからのウイルスの再構成は具体的には例えば以下のようにして行うことができる。
２４穴から６穴程度のプラスチックプレートまたは１００ｍｍペトリ皿等で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および抗生物質（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンＧおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を含む最少必須培地（ＭＥＭ）を用いてサル腎臓由来細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２をほぼ１００％コンフルエントになるまで培養し、例えば１μｇ／ｍｌ ｐｓｏｒａｌｅｎ（ソラレン）存在下、紫外線（ＵＶ）照射処理を２０分処理で不活化した、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルスｖＴＦ７−３（Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８１２２−８１２６，１９８６、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：５６９−５７９，１９９６）を２ ＰＦＵ／細胞で感染させる。ソラレンの添加量およびＵＶ照射時間は適宜調整することができる。感染１時間後、２〜６０μｇ、より好ましくは３〜２０μｇの組換えセンダイウイルスのゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡを、ウイルスＲＮＰの生成に必須なトランスに作用するウイルス蛋白質を発現するプラスミド（０．５〜２４μｇのｐＧＥＭ−Ｎ、０．２５〜１２μｇのｐＧＥＭ−Ｐ、および０．５〜２４μｇのｐＧＥＭ−Ｌ）（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：５６９−５７９，１９９６）と共にＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いたリポフェクション法等によりトランスフェクションする。Ｎ、Ｐ、およびＬをコードする発現ベクターの量比は例えば２：１：２とすることが好ましく、プラスミド量は、例えば１〜４μｇのｐＧＥＭ−Ｎ、０．５〜２μｇのｐＧＥＭ−Ｐ、および１〜４μｇのｐＧＥＭ−Ｌ程度で適宜調整する。
トランスフェクションを行った細胞は、所望により１００μｇ／ｍｌのリファンピシン（Ｓｉｇｍａ）及びシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、より好ましくは４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）（Ｓｉｇｍａ）のみを含む血清不含のＭＥＭで培養し、ワクシニアウイルスによる細胞毒性を最少にとどめ、ウイルスの回収率を最大にするように薬剤の最適濃度を設定する（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：５６９−５７９）。トランスフェクションから４８〜７２時間程度培養後、細胞を回収し、凍結融解を３回繰り返して細胞を破砕した後、ＲＮＰを含む破砕物をＬＬＣ−ＭＫ２細胞に再度トランスフェクションして培養する。または、培養上清を回収し、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞の培養液に添加して感染させ培養する。トランスフェクションは、例えばリポフェクトアミンまたはポリカチオニックリポソームなどと共に複合体を形成させて細胞に導入することが可能である。具体的には、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、ＤＯＴＭＡ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ ＃３０１３０５）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＥＲ（Ｒｏｃｈｅ ＃１８１１１６９）などが挙げられる。エンドソーム中での分解を防ぐため、クロロキンを加えることもできる（Ｃａｌｏｓ，Ｍ．Ｐ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：３０１５）。ＲＮＰが導入された細胞では、ＲＮＰからのウイルス遺伝子の発現およびＲＮＰの複製の過程が進行しベクターが増幅する。得られたウイルス溶液を希釈（例えば１０６倍）して再増幅を繰り返すことにより、ワクシニアウイルスｖＴＦ７−３は完全に除去することができる。再増幅は、例えば３回以上繰り返す。得られたベクターは−８０℃で保存することができる。エンベロープ蛋白質をコードする遺伝子を欠損した複製能を持たないウイルスベクターを再構成させるには、エンベロープ蛋白質を発現するＬＬＣ−ＭＫ２細胞をトランスフェクションに使用するか、またはエンベロープ発現プラスミドを共にトランスフェクションすればよい。また、トランスフェクションを行った細胞にエンベロープ蛋白質を発現するＬＬＣ−ＭＫ２細胞を重層して培養することによって欠損型ウイルスベクターを増幅することもできる（国際公開番号ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０参照）。
回収されたウイルスの力価は、例えばＣＩＵ（Ｃｅｌｌ−Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｕｎｉｔ）測定または赤血球凝集活性（ＨＡ）の測定することにより決定することができる（ＷＯ００／７００７０；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：５６９−５７９；Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．＆ Ｋａｎｅｄａ，Ｙ．，Ｈｅｍａｇｇｕｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｊａｐａｎ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ．Ｅｄ．ｂｙ Ｂａｋｅｒ ＡＨ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ：ｐｐ．２９５−３０６，１９９９）。また、ＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）などのマーカー遺伝子を搭載したベクターについては、マーカーを指標に直接的に感染細胞をカウントすることにより力価を定量することができる（例えばＧＦＰ−ＣＩＵとして）。このようにして測定した力価は、ＣＩＵと同等に扱うことができる（ＷＯ００／７００７０）。
ウイルスベクターが再構成する限り、再構成に用いる宿主細胞は特に制限されない。例えば、センダイウイルスベクター等の再構成においては、サル腎由来のＬＬＣＭＫ２細胞およびＣＶ−１細胞、ハムスター腎由来のＢＨＫ細胞などの培養細胞、ヒト由来細胞等を使うことができる。これらの細胞に適当なエンベロープ蛋白質を発現させることで、そのエンベロープを有する感染性ウイルス粒子を得ることもできる。また、大量にセンダイウイルスベクターを得るために、上記の宿主から得られたウイルスベクターを発育鶏卵に感染させ、該ベクターを増幅することができる。鶏卵を使ったウイルスベクターの製造方法は既に開発されている（中西ら編，（１９９３），「神経科学研究の先端技術プロトコールＩＩＩ，分子神経細胞生理学」，厚生社，大阪，ｐｐ．１５３−１７２）。具体的には、例えば、受精卵を培養器に入れ９〜１２日間３７〜３８℃で培養し、胚を成長させる。ウイルスベクターを尿膜腔へ接種し、数日間（例えば３日間）卵を培養してウイルスベクターを増殖させる。培養期間等の条件は、使用する組み換えセンダイウイルスにより変わり得る。その後、ウイルスを含んだ尿液を回収する。尿液からのセンダイウイルスベクターの分離・精製は常法に従って行うことができる（田代眞人，「ウイルス実験プロトコール」，永井、石浜監修，メジカルビュー社，ｐｐ．６８−７３，（１９９５））。
例えば、Ｆ遺伝子を欠失したセンダイウイルスベクターの構築と調製は、以下のように行うことができる（ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０参照）。
〈１〉Ｆ遺伝子欠失型センダイウイルスゲノムｃＤＮＡおよびＦ発現プラスミドの構築
センダイウイルス（ＳｅＶ）全長ゲノムｃＤＮＡ、ｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：２８１３−２８２０）（「ｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）」は「ｐＳｅＶ１８１＋」ともいう）のｃＤＮＡをＳｐｈＩ／ＫｐｎＩで消化してフラグメント（１４６７３ｂｐ）を回収し、ｐＵＣ１８にクローニングしてプラスミドｐＵＣ１８／ＫＳとする。Ｆ遺伝子欠損部位の構築はこのｐＵＣ１８／ＫＳ上で行う。Ｆ遺伝子の欠損は、ＰＣＲ−ライゲーション方法の組み合わせで行い、結果としてＦ遺伝子のＯＲＦ（ＡＴＧ−ＴＧＡ＝１６９８ｂｐ）を除いて例えばａｔｇｃａｔｇｃｃｇｇｃａｇａｔｇａ（配列番号：４）で連結し、Ｆ遺伝子欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ）を構築する。ＰＣＲは、Ｆの上流には［ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ｇｔｔｇａｇｔａｃｔｇｃａａｇａｇｃ／配列番号：５，ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ｔｔｔｇｃｃｇｇｃａｔｇｃａｔｇｔｔｔｃｃｃａａｇｇｇｇａｇａｇｔｔｔｔｇｃａａｃｃ／配列番号：６］、Ｆ遺伝子の下流には［ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ａｔｇｃａｔｇｃｃｇｇｃａｇａｔｇａ／配列番号：７，ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ｔｇｇｇｔｇａａｔｇａｇａｇａａｔｃａｇｃ／配列番号：８］のプライマー対を用いたＰＣＲの産物をＥｃｏＴ２２Ｉで連結する。このように得られたプラスミドをＳａｃＩとＳａｌＩで消化して、Ｆ遺伝子欠損部位を含む領域の断片（４９３１ｂｐ）を回収してｐＵＣ１８にクローニングし、ｐＵＣ１８／ｄＦＳＳとする。このｐＵＣ１８／ｄＦＳＳをＤｒａＩＩＩで消化して、断片を回収してｐＳｅＶ１８＋のＦ遺伝子を含む領域のＤｒａＩＩＩ断片と置き換え、ライゲーションしてプラスミドｐＳｅＶ１８＋／ΔＦを得る。
外来遺伝子は、例えばｐＵＣ１８／ｄＦＳＳのＦ遺伝子欠失部位にある制限酵素ＮｓｉＩおよびＮｇｏ ＭＩＶ部位に挿入する。このためには、例えば外来遺伝子断片を、ＮｓｉＩ−ｔａｉｌｅｄプライマーおよびＮｇｏ ＭＩＶ−ｔａｉｌｅｄプライマーで増幅すればよい。
〈２〉ＳｅＶ−Ｆ蛋白を誘導発現するヘルパー細胞の作製
センダイウイルスのＦ遺伝子（ＳｅＶ−Ｆ）を発現するＣｒｅ／ｌｏｘＰ誘導型発現プラスミドの構築はＳｅＶ−Ｆ遺伝子をＰＣＲで増幅し、Ｃｒｅ ＤＮＡリコンビナーゼにより遺伝子産物が誘導発現されるように設計されたプラスミドｐＣＡＬＮｄｌｗ（Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２，１９９８，ｐ１１１５−１１２１）のユニークサイトＳｗａＩ部位に挿入し、プラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆを構築する。
Ｆ遺伝子欠損ゲノムから感染ウイルス粒子を回収するため、ＳｅＶ−Ｆ蛋白を発現するヘルパー細胞株を樹立する。細胞は、例えばＳｅＶの増殖によく用いられているサル腎臓由来細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を用いることができる。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞は、１０％の熱処理した不動化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリンＧナトリウム５０単位／ｍｌ、およびストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを添加したＭＥＭで３７℃、５％ＣＯ２で培養する。ＳｅＶ−Ｆ遺伝子産物は細胞傷害性を有するため、Ｃｒｅ ＤＮＡリコンビナーゼによりＦ遺伝子産物を誘導発現されるように設計された上記プラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆを、リン酸カルシウム法（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））により、周知のプロトコールに従ってＬＬＣ−ＭＫ２細胞に遺伝子導入を行う。
１０ｃｍプレートを用い、４０％コンフルエントまで生育したＬＬＣ−ＭＫ２細胞に１０μｇのプラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆを導入後、１０ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター中で２４時間培養する。２４時間後に細胞をはがし、１０ｍｌ培地に懸濁後、１０ｃｍシャーレ５枚を用い、５ｍｌ １枚、２ｍｌ ２枚、０．２ｍｌ ２枚に蒔き、Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を１２００μｇ／ｍｌを含む１０ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて培養を行い、２日毎に培地交換しながら、１４日間培養し、遺伝子の安定導入株の選択を行う。該培地により生育してきたＧ４１８に耐性を示す細胞はクローニングリングを用いて回収する。回収した各クローンは１０ｃｍプレートでコンフルエントになるまで拡大培養を続ける。
Ｆ蛋白質の発現誘導は、細胞を６ｃｍシャーレにてコンフルエントまで生育させた後、アデノウイルスＡｘＣＡＮＣｒｅを斉藤らの方法（Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３８１６−３８２１（１９９５）；Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７２，１１１５−１１２１（１９９８））により例えばｍｏｉ＝３で感染させて行う。
〈３〉Ｆ遺伝子欠失ＳｅＶウイルスの再構築及び増幅
上記ｐＳｅＶ１８＋／ΔＦの外来遺伝子が挿入されたプラスミドを以下のようにしてＬＬＣ−ＭＫ２細胞にトランスフェクションする。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで１００ｍｍのシャーレに播く。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによりゲノムＲＮＡの転写を行わせる場合には、細胞培養２４時間後、ソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）と長波長紫外線（３６５ｎｍ）で２０分間処理したＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウイルス（ＰＬＷＵＶ−ＶａｃＴ７：Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３，８１２２−８１２６（１９８６））をＭＯＩ ２程度で室温で１時間感染させる。ワクシニアウイルスへの紫外線照射には、例えば１５ワットバルブを５本が装備されたＵＶ Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（カタログ番号４００６７６（１００Ｖ），ストラタジーン社，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いることができる。細胞を無血清のＭＥＭで洗浄した後、ゲノムＲＮＡを発現するプラスミド、およびパラミクソウイルスのそれぞれＮ、Ｐ、Ｌ、Ｆ、およびＨＮ蛋白質を発現する発現プラスミドを、適当なリポフェクション試薬を用いてこの細胞にトランスフェクトする。プラスミドの量比は、これに限定されないが、好適には順に６：２：１：２：２：２とすることができる。例えば、１２μｇのゲノムＲＮＡを発現するプラスミド、並びにＮ、Ｐ、Ｌ、およびＦプラスＨＮ蛋白質を発現する発現プラスミド（ｐＧＥＭ／ＮＰ，ｐＧＥＭ／Ｐ，ｐＧＥＭ／Ｌ及びｐＧＥＭ／Ｆ−ＨＮ；ＷＯ００／７００７０，Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １，５６９−５７９（１９９６））を、それぞれ１２μｇ，４μｇ，２μｇ，４μｇ及び４μｇ／ｄｉｓｈの量比トランスフェクトする。数時間培養後、血清を含まないＭＥＭで細胞を２回洗浄し、４０μｇ／ｍＬのＣｙｔｏｓｉｎｅ β−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ（ＡｒａＣ：Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含むＭＥＭで培養する。これらの細胞を回収し、ペレットをＯｐｔｉＭＥＭに懸濁する（１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）。凍結融解を３回繰り返してｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ ＤＯＳＰＥＲ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ｍａｎｎｈｅｉｍ）と混合し（１０６ｃｅｌｌｓ／２５μｌ ＤＯＳＰＥＲ）室温で１５分放置した後、上記でクローニングしたＦ発現ヘルパー細胞にトランスフェクション（１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ １２−ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅ）し、血清を含まないＭＥＭ（４０μｇ／ｍｌ ＡｒａＣ，７．５μｇ／ｍｌトリプシンを含む）で培養し、上清を回収する。Ｆ以外の遺伝子、例えばＨＮまたはＭ遺伝子を欠損したウイルスも、これと同様の方法で調製することができる。
ウイルス遺伝子欠損型ベクターを調製する場合、例えば、ベクターに含まれるウイルスゲノム上で欠損しているウイルス遺伝子が異なる２種またはそれ以上のベクターを同じ細胞に導入すれば、それぞれで欠損するウイルス蛋白質が、他のベクターからの発現により供給されるため、互いに相補しあって感染力のあるウイルス粒子が形成され、複製サイクルがまわりウイルスベクターが増幅される。すなわち、２種またはそれ以上の本発明のベクターを、ウイルス蛋白質を相補する組み合わせで接種すれば、それぞれのウイルス遺伝子欠損型ウイルスベクターの混合物を大量かつ低コストで生産することができる。これらのウイルスは、ウイルス遺伝子が欠損しているため、ウイルス遺伝子を欠損していないウイルスに比べゲノムサイズが小さくなりサイズの大きい外来遺伝子を保持することができる。また、ウイルス遺伝子の欠損により増殖性がないこれらのウイルスは細胞外で希釈され共感染の維持が困難であることから、不稔化するため、環境放出管理上の利点がある。
本発明のパラミクソウイルスにより導入する外来遺伝子としては、特に制限はないが、天然の蛋白質としては、例えばホルモン、サイトカイン、増殖因子、受容体、細胞内シグナル分子、酵素、ペプチドなどが挙げられる。蛋白質は分泌蛋白質、膜蛋白質、細胞質蛋白質、核蛋白質などであり得る。人工的な蛋白質としては、例えば、キメラ毒素などの融合蛋白質、ドミナントネガティブ蛋白質（受容体の可溶性分子または膜結合型ドミナントネガティブ受容体を含む）、欠失型の細胞接着分子および細胞表面分子などが挙げられる。また、分泌シグナル、膜局在化シグナル、核移行シグナル等を付加した蛋白質であってもよい。導入遺伝子としてアンチセンスＲＮＡ分子またはＲＮＡ切断型リボザイムなどを発現させて、Ｔ細胞で発現する特定の遺伝子の機能を抑制することもできる。外来遺伝子として疾患の治療用遺伝子を用いてウイルスベクターを調製すれば、このベクターを投与して遺伝子治療を行うことが可能となる。本発明のウイルスベクターの遺伝子治療への応用としては、直接投与による遺伝子発現、間接（ｅｘ ｖｉｖｏ）投与による遺伝子発現のいずれの方法によっても、治療効果を期待できる外来遺伝子もしくは患者の体内で供給が不足している内在遺伝子等を発現させることが可能である。また本発明の方法は、再生医療における遺伝子治療ベクターとしても利用できる。
なお、複製性のパラミクソウイルスベクターを個体または細胞に投与後、治療が完了するなどウイルスベクターの増殖を抑止する必要が生じた際には、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤を投与すれば、宿主に障害を与えずにウイルスベクターの増殖だけを特異的に抑止することもできる。
本明細書に記載したウイルス製造方法に従えば、本発明のウイルスベクターは、例えば１×１０５ＣＩＵ／ｍＬ以上、好ましくは１×１０６ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは５×１０６ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは１×１０７ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは５×１０７ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは１×１０８ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは５×１０８ＣＩＵ／ｍＬ以上の力価でウイルス産生細胞の細胞外液中に放出させることが可能である。ウイルスの力価は、本明細書および他に記載の方法により測定することができる（Ｋｉｙｏｔａｎｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７７（１），６５−７４（１９９０）；ＷＯ００／７００７０）。
回収したパラミクソウイルスベクターは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーション（濾過）、遠心分離、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウイルスベクターが、それが存在する試料中の成分として主要な割合を占めることを言う。典型的には、実質的に純粋なウイルスベクターは、試料中に含まれる全蛋白質（但しキャリアーまたは安定剤として加えた蛋白質は除く）のうち、ウイルスベクター由来の蛋白質の割合が１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上を占めることにより確認することができる。パラミクソウイルスの具体的な精製方法としては、例えばセルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法（特公昭６２−３０７５２号公報、特公昭６２−３３８７９号公報、および特公昭６２−３０７５３号公報）、およびフコース硫酸含有多糖および／またはその分解物に吸着させる方法（ＷＯ９７／３２０１０）等を例示することができる。
ベクターを含む組成物の製造においては、ベクターは必要に応じて薬理学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わせることができる。「薬学的に許容される担体または媒体」とは、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を有意に阻害しない材料である。例えばベクターを生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または培養液などで適宜希釈して組成物とすることができる。ベクターを鶏卵で増殖させた場合等においては尿液を含んでよい。またベクターを含む組成物は、脱イオン水、５％デキストロース水溶液等の担体または媒体を含んでいてもよい。さらに、その他にも、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。また保存剤またはその他の添加剤を添加することができる。本発明のベクターを含む組成物は試薬として、および医薬として有用である。
本発明のベクターを用いたＴ細胞への遺伝子導入は、様々な疾患に対する遺伝子治療に適用することが期待される。このような遺伝子治療には、例えば、遺伝子欠損による細胞での発現の異常を補正するために、また、外来遺伝子を細胞に導入することにより新しい機能を付加させるために、あるいは、ある遺伝子に対して抑制的に働く遺伝子を導入することにより細胞における望ましくない作用を抑制するために行い得る。
本発明の方法は、例えば自己免疫疾患等において拒絶反応を抑制するために有用である。例えばアロ抗原、あるいは自己免疫疾患の原因となる主要な抗原を認識する活性化Ｔ細胞樹立株を用いて、そのＴ細胞に本発明の方法に従って抑制性サイトカイン、例えばＩＬ−１０等を強発現させることによって、生体内のＴ細胞のアロ反応を抑制、あるいは抑制性樹状細胞の誘導により、拒絶反応をコントロールできると予想される。また、本発明の方法によるＴ細胞への遺伝子導入を介した癌治療も期待される。例えば、腫瘍特異的抗原を認識するＴ細胞に血管増殖抑制遺伝子をコードするベクターを導入することにより、局所の腫瘍増殖抑制効果が期待される。あるいは脱髄疾患である多発性硬化症などの場合にはそのターゲットとなる抗原で活性化したＴ細胞を用い、ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅを幹細胞より分化させ得るＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−Ａ）などの遺伝子を導入し、局所でのｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ再生を促し、病勢のコントロールが可能と予想される（Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０００，１０７：２２６−２３２）。その他にも、抗原活性化Ｔ細胞あるいは抗原非特異的活性化Ｔ細胞（抗体またはマイトゲンを使用する活性化Ｔ細胞）を用い、遺伝子導入することにより治療効果が期待されるすべての疾患・傷害に対して、本発明の方法を適用することが可能である。
パラミクソウイルスにより導入された遺伝子の転写は、インターフェロン（ＩＦＮｓ）などの宿主由来の因子により影響を受ける（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００１，７５：３８０２−３８１０）。アロ抗原で刺激したＴ細胞株からは大量のＩＦＮが産生されることから、ＩＦＮ−γなどのＩＦＮがパラミクソウイルスベクターからの遺伝子の転写に影響を与える可能性がある（Ｂｉｒｏｎ，Ｃ．Ａ．ａｎｄ Ｓｅｎ，Ｇ．Ｃ．，Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅ．Ｉｎ：Ｆｉｅｌｄｓ ＢＮ，Ｋｎｉｐｅ ＤＭ，Ｈｏｗｌｅｙ ＰＭ，（ｅｄｓ）．Ｆｉｅｌｄｓ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．２．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６．３２１−３５１）。実際、本発明者らは、ＩＦＮ−γ受容体欠損マウスからのアロ活性化Ｔ細胞株は、３週間以上にわたってＥＧＦＰの比較的高い発現が持続することを見いだした。従って、Ｔ細胞を指向した遺伝子治療において、標的遺伝子の高いレベルの発現が必要な場合には、ＩＦＮ−γのシグナル伝達を抑制することが有効と考えられる。
ベクターの投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法、導入遺伝子等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。投与経路は適宜選択することができる。また局所あるいは全身に投与し得る。投与されるベクターは好ましくは約１０５ＣＩＵ／ｍｌから約１０１１ＣＩＵ／ｍｌ、より好ましくは約１０７ＣＩＵ／ｍｌから約１０９ＣＩＵ／ｍｌ、最も好ましくは約１×１０８ＣＩＵ／ｍｌから約５×１０８ＣＩＵ／ｍｌの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与することが好ましい。ヒトにおいては１回当たりの投与量は２×１０５ＣＩＵ〜２×１０１１ＣＩＵが好ましく、投与回数は、１回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可能であり、１日の投与回数についても同様である。ヒト以外の動物についても、例えば目的の動物とヒトとの体重比または投与標的部位の容積比（例えば平均値）で上記の投与量を換算した量を投与することができる。エクスビボ投与の場合は、体外（例えば試験管またはシャーレ内）でＴ細胞にベクターを接触させる。ＭＯＩは１〜５００の間で投与することが好ましく、より好ましくは２〜３００、さらに好ましくは３〜２００である。本発明のベクターを含む組成物の投与対象としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌなど全ての哺乳動物が含まれる。
【図面の簡単な説明】
図１は、マウスＴ細胞におけるＳｅＶによる遺伝子導入効率を示す図である。活性化またはナイーブＴ細胞における遺伝子導入効率を示す。マウスリンパ球を２．５×１０７ＰＦＵ（ＭＯＩ ６２．５）のＳｅＶ−ＥＧＦＰの存在下または非存在下で２日間培養し、細胞を回収してＡＰＣ結合抗ＣＤ３およびＰＥ結合抗ＣＤ４（上パネル）または抗ＣＤ８（下パネル）抗体で染色した。ドットプロットは、生存しているＣＤ３＋ＣＤ４＋またはＣＤ３＋ＣＤ８＋リンパ球中のそれぞれＣＤ４またはＣＤ８と、ＧＦＰの発現を示す。四分割したそれぞれの右上の隅に、ＥＧＦＰ陽性細胞の割合として遺伝子導入効率を示した。左のパネル：抗体をコートしていないウェルで細胞を培養した。中央のパネル：活性化抗体（抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体）をコートしたウェルで細胞を培養した。右のパネル：活性化抗体（抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体）をコートしたウェルで、ＳｅＶ−ＥＧＦＰなしで細胞を培養した。陰性対照として、ルシフェラーゼを発現するＳｅＶ−ｌｕｃｉと共に培養した細胞からも類似したデータを取得した。４回より多い独立した実験から、再現性のあるデータが得られた。
図２は、Ｔ細胞株へのＳｅＶによる遺伝子導入効率を示す図である。Ｔ細胞株を２．５×１０７ＰＦＵ（ＭＯＩ ６２．５）のＳｅＶ−ＥＧＦＰの存在下または非存在下で２日間培養し、細胞を回収してＡＰＣ結合抗ＣＤ３およびＰＥ結合抗ＣＤ４（上パネル）または抗ＣＤ８（下パネル）抗体で染色した。最も左のパネルのドットプロットは、ゲート（区分）された生存しているリンパ球中のＣＤ３およびＣＤ４またはＣＤ８の発現を示す。それぞれの四分割の割合が示されている。他のパネルのドットプロットはゲートされたＣＤ３陽性の生存リンパ球中のＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞のＥＧＦＰの発現を示す。左から２番目のパネルでは、細胞を照射Ｂ６スティミュレーター（刺激細胞）と共に培養した。３番目のパネルでは、細胞を照射Ｂａｌｂ／ｃスティミュレーター（刺激細胞）と共に培養した。最後のパネルでは、細胞を照射Ｂａｌｂ／ｃスティミュレーター（刺激細胞）と共にＳｅＶ−ＥＧＦＰなしで培養した。４回より多い独立した実験から、再現性のあるデータが得られた。
図３は、ナイーブＴ細胞およびＴ細胞株のアロ抗原特異的活性化における遺伝子導入効率を示す図である。ナイーブ２Ｃリンパ球（上パネル；″１ｘ″の文字）または２ＣＴ細胞株（下パネル；″３ｘ″の文字）を２．５×１０７ＰＦＵのＳｅＶ−ＥＧＦＰの存在下または非存在下で２日間培養し、細胞を回収して、ＡＰＣ結合抗ＣＤ８およびビオチン結合抗クロノタイプＴ細胞レセプターｍＡｂ（１Ｂ２）で染色し、さらにＰＥストレプトアビジンで染色した。一番左のパネルは、ゲートされた生存リンパ球中のＣＤ８＋１Ｂ２＋Ｔ細胞の割合を示す。他のパネルのドットプロットは、生存しているクロノタイプＴ細胞のＥＧＦＰの発現を示す。左から２番目のパネルでは、細胞を照射Ｂ６スティミュレーター（刺激細胞）と共に培養した。３番目のパネルでは、細胞を照射Ｂａｌｂ／ｃスティミュレーター（刺激細胞）と共に培養した。最後のパネルでは、細胞を照射Ｂａｌｂ／ｃスティミュレーター（刺激細胞）と共にＳｅＶ−ＥＧＦＰなしで培養した。２回の独立した実験から、再現性のあるデータが得られた。
図４は、ＳｅＶによる遺伝子導入におけるバイスタンダー活性化の効果を示す図である。５０μｌの２Ｃナイーブリンパ球（１×１０７／ｍｌ）および５０μｌのＢ６ナイーブリンパ球（１×１０７／ｍｌ）を、２．５×１０７ＰＦＵのＳｅＶ−ＥＧＦＰの存在下（Ｘ軸の表示が＋のもの）または非存在下（Ｘ軸の表示が−のもの）、１００μｌの照射したＢａｌｂ／ｃ（黒いバー）、Ｂ６（灰色のバー）、またはＣ３Ｈ（チェックのバー）リンパ球（１×１０７／ｍｌ）またはリンパ球なし（白のバー）で２日間刺激した。ゲートされた生存しているＣＤ８＋１Ｂ２＋Ｔ細胞からＥＧＦＰ陽性細胞の割合を得た。Ｙ軸はＥＧＦＰ陽性のクロノタイプ細胞の割合を示す。個々のデータは３連にしたウェル（ｎ＝３）の平均±標準誤差（ＳＥＭ）として示し、２回の独立した実験で類似した結果を得た。Ｃ３Ｈで刺激した２Ｃ Ｔ細胞とＢａｌｂ／ｃで刺激した２Ｃ Ｔ細胞との間には統計学的有意差（ｐ＜０．０１）があったが、Ｃ３Ｈで刺激した２Ｃ Ｔ細胞とＢ６で刺激した２Ｃ Ｔ細胞との間にはそれがなかった。統計学的有意性は一元配置分散分析法及びＦｉｓｈｅｒ’ｓ ＰＬＳＤ ｔｅｓｔを用いて決定した。
図５は、ＳｅＶ−ＥＧＦＰにより遺伝子導入されたＴ細胞のＧＦＰ発現の維持を示す図である。２Ｃ−ｔｇマウスからのＴ細胞株を、ＳｅＶ−ＥＧＦＰの存在下、Ｂ６（左カラム）またはＢａｌｂ／ｃ（右カラム）の照射したリンパ球で６日間刺激し、遺伝子導入したＴ細胞を新しい培地で洗浄後、ＳｅＶなしで、照射したＢ６またはＢａｌｂ／ｃスティミュレーターで６または７日間再刺激した。ドットプロットは生存しているクロノタイプＴ細胞中のＥＧＦＰの発現を示す。四分割の各右上の隅の数字は、ｄａｙ１３（上パネル）およびｄａｙ２０（中央パネル）におけるＥＧＦＰ陽性または陰性のクロノタイプＴ細胞の割合を示す。陰性対照として、２０日間刺激した非感染２Ｃ Ｔ細胞株からのデータを示した（下パネル）。データは２回の独立した実験の代表例である。
図６は、ヒトＴ細胞へのＳｅＶによる遺伝子導入効率を示す図である。活性化またはナイーブＴ細胞における遺伝子導入効率を示す。２００μｌのヒトリンパ球（４×１０６／ｍｌ）を２．５×１０７ＰＦＵ（ＭＯＩ ３１）のＳｅＶ−ＥＧＦＰの存在下または非存在下、２日間培養し、細胞を回収してＡＰＣ結合抗ＣＤ３およびＰＥ結合抗ＣＤ４（上パネル）または抗ＣＤ８（下パネル）抗体で染色した。ドットプロットは、生存しているＣＤ３＋ＣＤ４＋またはＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球中のそれぞれＣＤ４またはＣＤ８と、ＧＦＰの発現を示す。遺伝子導入効率は、示されているＴ細胞中のＥＧＦＰ陽性細胞の割合として示した。左のパネル：抗体をコートしていないウェルで細胞を培養した。中央のパネル：活性化抗体（抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体）をコートしたウェルで細胞を培養した。右のパネル：活性化抗体（抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体）をコートしたウェルで、ＳｅＶ−ＥＧＦＰなしで細胞を培養した。陰性対照として、ＳｅＶ−ｌｕｃｉと共に培養した細胞からも同様にデータを取得した。四分割の各右隅の数字はその集団の割合を示す。４回より多い独立した実験から、再現性のあるデータが得られた。
図７は、ヒトナイーブまたはメモリー／活性化Ｔ細胞への遺伝子導入の効率を示す図である。新しく単離したＴ細胞を抗体をコートしていないウェルでＳｅＶ−ＥＧＦＰと共に２日間培養し、細胞を回収してＡＰＣ結合抗ＣＤ６２Ｌ、ＰＥ結合抗ＣＤ３、およびビオチン化抗ＣＤ４５ＲＡ抗体で染色し、続いてストレプトアビジンＰｅｒＣＰで染色した。左のパネルで、ドットプロットはゲート（区分）された生存ＣＤ３陽性Ｔ細胞中のＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡの発現を示す。右のパネルで、ドットプロットは、ナイーブＴ細胞であるＣＤ６２ＬｈｉｇｈおよびＣＤ４５ＲＡｈｉｇｈＴ細胞中（上パネル）、またはメモリー／活性化Ｔ細胞であるその他の細胞中（下パネル）のＣＤ３およびＥＧＦＰの発現を示す。健常者ドナーからの３回の実験において再現性のあるデータが得られた。
図８は、ヒトＴ細胞株への遺伝子導入効率を示す図である。ヒトＴ細胞株を図６のようにＳｅＶ−ＥＧＦＰの存在下または非存在下、２日間培養し、図６のように解析した。ＣＤ４（上パネル）あるいはＣＤ８（下パネル）Ｔ細胞中のＥＧＦＰ発現割合を示した。左のパネル；抗体をコートしてないウェルで細胞を培養した。中央パネル；抗体（ヒト抗ＣＤ３およびヒト抗ＣＤ２８抗体）をコートしたウェルで細胞を培養した。右パネル；抗体（ヒト抗ＣＤ３およびヒト抗ＣＤ２８抗体）をコートしたウェルでＳｅＶ−ＥＧＦＰ非存在下に細胞を培養した。
図９は、ナイーブまたは活性化Ｔ細胞へのＳｅＶの侵入（ｅｎｔｒｙ）の評価を示す図である。Ｂ６リンパ球（４×１０６／ｍｌ）をＵＶで不活化したＳｅＶ−ｌｕｃｉの存在下（白および灰色のバー）または非存在下（黒のバー）で３０分３７℃でインキュベートした後、細胞をよく洗浄し、ＳｅＶ−ＥＧＦＰ（ＭＯＩ＝６２．５）を共に３０分３７℃でインキュベートした。細胞を３回洗浄した後、２００μｌの細胞懸濁液（２×１０６／ｍｌ）をマウス抗ＣＤ３およびマウス抗ＣＤ２８抗体をコートした活性化ウェル中でウイルスなしで２日間培養した。陽性対照として、調製した細胞を２．５×１０７ＰＦＵのＳｅＶ−ＥＧＦＰと共に活性化ウェル中で２日間培養した（白いバー）。回収した細胞は、ＡＰＣ結合抗ＣＤ３およびＰＥ結合抗ＣＤ８抗体で染色した。ゲート（区分）した生存ＣＤ３＋ＣＤ４＋またはＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞からＥＧＦＰ陽性細胞の割合を得た。Ｙ軸は、ＥＧＦＰ陽性のＣＤ４（左の３つのバー）またはＣＤ８（右の３つのバー）Ｔ細胞の割合を示す。個々のデータは３連にしたウェル（ｎ＝３）の平均の割合±ＳＥＭとして示した。各群間で統計学的有意差があった（ｐ＜０．０１）。統計学的有意性は一元配置分散分析法及びＦｉｓｈｅｒ’ｓ ＰＬＳＤ ｔｅｓｔを用いて決定した。
図１０は、ナイーブまたは活性化Ｔ細胞へのＳｅＶの侵入（ｅｎｔｒｙ）の評価を示す図である。Ｂ６リンパ球をＳｅＶ−ＥＧＦＰ（ＭＯＩ＝１００）の非存在下（Ｘ軸の一番左のスケール）または存在下（Ｘ軸のその他のスケール）、３０分４℃でインキュベートし、細胞をよく洗浄し、ＳｅＶなしで０、１５、３０、４５、および９０分３７℃でインキュベートした。３回洗浄後、それぞれ図示した期間インキュベートした細胞を、マウス抗ＣＤ３およびマウス抗ＣＤ２８抗体をコートした活性化ウェル中で２日間培養した。細胞を回収し、図９に記載した通りに染色した（ＣＤ４ Ｔ細胞は黒い円、ＣＤ８ Ｔ細胞は黒い四角）。陽性対照として、調製した細胞を２．５×１０７ＰＦＵ（ＭＯＩ＝６２．５）のＳｅＶ−ＥＧＦＰと共に培養した（ＣＤ４ Ｔ細胞は白い円、ＣＤ８ Ｔ細胞は白い四角）。値は３連にしたウェル（ｎ＝３）の平均の割合±ＳＥＭとして示した。ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞の両方において、３７℃０分のインキュベーションにおける値と１５分のインキュベーションにおける値との間に統計学的有意差があった（ｐ＜０．０１）。さらに、３７℃０分のインキュベーションにおける値と９０分のインキュベーションにおける値との間にも統計学的有意差があった（ｐ＜０．０１）。統計学的有意性は一元配置分散分析法及びＦｉｓｈｅｒ’ｓ ＰＬＳＤ ｔｅｓｔを用いて決定した。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、本明細書の一部として組み込まれる。統計的有意性は一元配置分散分析法及びＦｉｓｈｅｒ’ｓ ＰＬＳＤ ｔｅｓｔを用いて決定した。Ｐ＜０．０５を統計的有意とした。
動物
近交系雌Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）（Ｂ６と略記する）、Ｃ３Ｈ（Ｈ−２ｋ）、および雌Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒグレードマウス）はＫＢＴオリエンタル（Ｔｏｓｕ，Ｊａｐａｎ）より得た。クラスＩ ＭＨＣ抗原Ｌｄ反応性Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）のトランスジェニックマウスである２Ｃトランスジェニックマウス（２ｃ−ｔｇ，Ｈ−２ｂ）は文献Ｓｈａ，Ｗ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３５：２７１−２７４に記載されている。マウスは全て人道的に扱い、特定病原菌フリーで維持し、標準的なげっ歯類用の餌および水道水を与えた。７から９週齢のマウスを使用した。動物実験は、九州大学における動物実験倫理委員会（Ｃｏｍｍｉｔｅｅ ｏｆ Ｅｔｈｉｃｓ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）および組み換えＤＮＡ実験委員会（Ｃｏｍｍｉｔｅｅ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）の検査を受け、九州大学の「動物実験ガイドライン」に従って実施した。また、アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）の「研究室動物のケアの原則」（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）および「研究室動物のケアおよび使用のための指針」（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）にも従った。
組み換えＳｅＶの構築
ＥＧＦＰ（クラゲ増強緑色蛍光蛋白質）遺伝子またはホタルルシフェラーゼ遺伝子を持つＳｅＶ（それぞれＳｅＶ−ＥＧＦＰまたはＳｅＶ−ｌｕｃｉ）は、文献の記載の通りに構築した（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ，１９９６，１：５６９−５７９；Ｓａｋａｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９９，４５６：２２１−２２６）。具体的には、ＮｏｔＩ制限酵素部位を含む１８ｂｐのスペーサー配列５’−（Ｇ）−ＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＧ−３’（配列番号：３）を、ＳｅＶのゲノムをコードするｃＤＮＡを含むベクターの５’非翻訳領域とヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子の開始コドンとの間に挿入した。クローン化されたＳｅＶゲノムｃＤＮＡを含むこのベクターには、デルタ肝炎ウイルスのアンチゲノム鎖の自已切断型リボソーム部位も含まれている。ＮｏｔＩ部位と、外来遺伝子の発現のための新しいＳｅＶのＥおよびＳシグナル配列タグのセットを含むプライマーを用いて、ＥＧＦＰ（ＳｅＶ−ＥＧＦＰについて）またはルシフェラーゼ（ＳｅＶ−ｌｕｃｉについて）をコードする全ｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、上記のクローン化したゲノムのＮｏｔＩ部位に挿入した。鋳型となるＳｅＶゲノムの全長は、外来遺伝子を含めて６の倍数の塩基となるようにした（いわゆる″６のルール″（ｒｕｌｅ ｏｆ ｓｉｘ））（Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９８，７２：８９１−８９９）。外来遺伝子を持つ鋳型ＳｅＶゲノム、およびＮ、ホスホ（Ｐ）、およびラージ（Ｌ）蛋白質をコードするプラスミド（それぞれプラスミドｐＧＥＭ−Ｎ，ｐＧＥＭ−Ｐ，およびｐＧＥＭ−Ｌ）を商業的に入手可能なカチオニックリピッドと複合体を形成させ、ワクシニアウイルスｖＴ７−３と共にＣＶ−１またはＬＬＣＭＫ細胞にコトランスフェクトした（Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８６，８３：８１２２−８１２６）。４０時間後、凍結融解を３回繰り返して細胞を破砕し、１０日齢（１０−ｄａｙ−ｏｌｄ）の発育鶏卵の尿嚢（ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ ｃａｖｉｔｙ）に注入した。その後ウイルスを回収し、鶏卵中で２回継代してワクシニアウイルスを除去した。ニワトリ赤血球を用いたヘマグルチネーションアッセイによりウイルスのタイターを決定し（Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．＆ Ｋａｎｅｄａ，Ｙ．，Ｈｅｍａｇｇｕｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｊａｐａｎ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ．Ｅｄ．ｂｙ Ｂａｋｅｒ ＡＨ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ：ｐｐ．２９５−３０６，１９９９）、ウイルスは使用するまで−８０℃で保存した。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）
ビオチン化ヒトＣＤ４５ ＲＡ（ＨＩ１００）ｍＡｂ、アロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ；ＡＰＣ）結合抗マウスＣＤ３（１４５−２Ｃ１１）、マウスＣＤ８（５３−６．７）、およびヒトＣＤ６２Ｌ（ＤＲＥＧ−５６）ｍＡｂ、フィコエリスリン（ＰＥ）結合抗ヒトＣＤ３（ＵＣＨＴ１）、ヒトＣＤ４（ＲＰＡ−Ｔ４）、マウスＣＤ４（ＧＫ１．５）、およびマウスＣＤ８（５３．６７）ｍＡｂ、ＰＥ結合ストレプトアビジン、並びにペリジニンクロロフィルαプロテイン（ｐｅｒＣＰ）結合ストレプトアビジンはＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）より購入した。
ＡＰＣ結合抗ヒトＣＤ３（ＵＣＨＴ１）ｍＡｂはＤＡＫＯ（Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）より購入した。ＰＥ結合抗ヒトＣＤ８（ＮＵ−Ｔｓ／ｃ）ｍＡｂはニチレイ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）より購入した。抗２ＣクロノタイプＴＣＲ決定因子（ａｎｔｉ ２Ｃ ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｃ ＴＣＲ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）ｍＡｂは、本発明者らがハイブリドーマ（１Ｂ２）（Ｓｈａ，Ｗ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３５：２７１−２７４）の培養上清からＨｉＴｒａｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ ＵＫ）を用いて精製し、ＥＺ−ＬｉｎｋＴＭ ＮＨＳ−ＬＣ Ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｌｄ，ＩＬ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いてビオチン化した。
Ｔ細胞の活性化のために、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）より購入した精製抗マウスＣＤ３（１４５−２Ｃ１１）、マウスＣＤ２８（３７．５１）、ヒトＣＤ３（ＨＩＴ３ａ）、抗ヒトＣＤ２８（ＣＤ２８．２）を用いた。
細胞の調製
２０ｍＭ Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ），０．２％ｓｏｄｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ，５０μＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（２−ＭＥ），１０μｇ／ｍｌ ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ，および１０％熱不動化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ａｒｏｒａ，ＯＨ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を加えたＲＰＭＩ １６４０（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）培地を完全培地として用いた。
マウスリンパ球の調製のため、脾臓、リンパ節を回収し完全培地中、氷上に保持した。脾臓およびリンパ節は、培地中、２枚のガラススライドの間で組織断片に圧力をかけて破砕した。細胞懸濁液をステンレスメッシュで濾過し、培地で２回洗浄した。赤血球は塩化アンモニウム炭酸カリウムリシスバッファー（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ ｌｙｓｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を用いてリシスさせた。ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）については、健常者ドナーより血液を採取し、Ｆｉｃｏｌｌ ＰａｑｕｅＴＭ Ｐｌｕｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｗｉｋｓｔｒｏｍｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）によりリンパ球を分離した。標準的なトリパンブルー色素排除アッセイ系を用いて、生存している有核細胞をカウントした。
マウス及びヒトＴ細胞株の樹立
アロ反応性Ｔ細胞株を調製するため、Ｂ６または２Ｃ−ｔｇマウスのリンパ球（５×１０７）を、３０Ｇｙ（１３７Ｃｓ；Ｇａｍｍａｃｅｌｌ ４０，Ａｔｏｍｉｃ Ｅｎｅｒｇｙ ｏｆ Ｃａｎａｄａ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｔｔａｗａ，Ｃａｎａｄａ）を照射したＢａｌｂ／ｃリンパ球（５×１０７）と共に、５０ｍｌフラスコ（３５−３０１４；ＦＡＬＣＯＮ，Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅ，ＮＪ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）中、総量１０ｍｌのＲＰＭＩ １６４０完全培地中で６日間共培養した。活性化したアロ反応性Ｔ細胞は、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｆｕｊｉｏｋａ，Ｊａｐａｎ）を添加して、照射Ｂａｌｂ／ｃリンパ球により週ごとに刺激した。この方法では、Ｂ６から得られるＴ細胞株は、ほとんどがＣＤ８ Ｔ細胞からなることから、ＣＤ４ Ｔ細胞株を得るために、Ｂ６のＣＤ８を枯渇させた（ＣＤ８−ｄｅｐｌｅｔｅｄ）リンパ球を照射リンパ球で刺激した。ＣＤ８を枯渇させたリンパ球の調製のため、新しく単離したリンパ球を抗マウスＣＤ８（Ｌｙｔ−２．２：Ｍｅｉｊｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）ｍＡｂと共に３０分４℃でインキュベートし、続いて Ｌｏｗ−ＴｏｘＴＭ−Ｍ Ｒａｂｂｉｔ ｃｏｍｐｌｅｔｅｎｔ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）と共に５０分３７℃でインキュベートした。３回以上刺激した、Ｂ６または２Ｃ−ｔｇのアロ抗原活性化Ｔ細胞を、マウスＴ細胞株として用いた。
ヒトＴ細胞株を調製するため、ある健康人の末梢血リンパ球（５×１０６）を別の健康人の放射線照射（３０Ｇｙ）末梢血リンパ球（５×１０６）と１０ｎｇ／ｍｌのｈｕｍａｎ ＩＬ−２存在下に１ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０感染培地中で７日間共培養した。その後、７日間ごとに少なくとも２回のリンパ球による再刺激を行ったものをＴ細胞株として使用した。
フローサイトメトリー解析
回収したマウス細胞を遠心分離し、抗マウスＣＤ１６／３２ｍＡｂを産生する培養ハイブリドーマ（２．４Ｇ２；Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ）の上清５０μｌと３０分４℃でインキュベートした。ヒトリンパ球ではこのステップは排除した。細胞を完全培地で洗浄し、ｍＡｂを様々に組み合わせて３０分４℃でインキュベートし、その後完全培地で２回洗浄した。ビオチン化ｍＡｂはＰＥストレプトアビジンまたはＰｅｒＣＰストレプトアビジンで検出した。標識した細胞はＦＡＣＳ ＣａｌｉｂｅｒによりＣｅｌｌＱｕｅｓｔプログラム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＦＬＯＷＪＯプログラム（ＴＲＥＥ ＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて解析した。サイトメーターにアプライする直前に、死細胞を検出して排除するため２５０μｌの細胞懸濁液に１２５ｎｇのｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）を加えた。このステップは、ヒト活性化／メモリーＴ細胞からのナイーブＴ細胞の認識においては除外した。ＥＧＦＰは蛍光１（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ １）で検出した。マウスまたはヒトの実験において、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＰＩ−細胞の集団を生存ＣＤ４ Ｔ細胞と表し、ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＰＩ−細胞の集団を生存ＣＤ８ Ｔ細胞と表した。トランスジェニッククロノタイプＴ細胞であるＣＤ８＋１Ｂ２＋ＰＩ−細胞を生存２ｃＴ細胞と表した。ナイーブヒトＴ細胞または活性化／メモリーヒトＴ細胞は、それぞれＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ３＋細胞としてゲート（区分）されたものまたはＣＤ３＋細胞の中のその他としてゲート（区分）されたものとした（Ｐｉｃｋｅｒ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９３，１５０：１１０５−１１２１；Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９９，７３：６４３０−６４３５）。
マウスまたはヒトＴ細胞へのＳｅＶによる遺伝子送達
活性化またはナイーブＴ細胞における遺伝子導入効率を評価するため、抗マウスＣＤ３ｍＡｂ（１５μｇ／ｍｌ）および抗マウスＣＤ２８ｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）でコートした、あるいはコートしていない９６ウェル平底プレート（３８６０−０９６；ＩＷＡＫＩ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）中で、２００μｌのマウスリンパ球（２×１０６／ｍｌ）の懸濁液を、２．５×１０７ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ（ＰＦＵ）のＳｅＶ−ＥＧＦＰと共に２日間培養した。ヒトリンパ球では、抗ヒトＣＤ３ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）および抗ヒトＣＤ２８ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）でコートした、あるいはコートしていない９６ウェル平底プレート中で、２００μｌのヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）（４×１０６／ｍｌ）またはヒトＴ細胞株（４×１０６／ｍｌ）の懸濁液を、２．５×１０７ＰＦＵのＳｅＶ−ＥＧＦＰと共に２日間培養した。アロ活性化Ｔ細胞株の導入効率の評価では、２．５×１０７ＰＦＵのＳｅＶ−ＥＧＦＰと共に１００μｌのＢ６または２Ｃ−ｔｇマウスのＴ細胞株（２×１０６／ｍｌ）をＢ６またはＢａｌｂ／ｃマウスの３０Ｇｙを照射したリンパ球（１×１０７／ｍｌ）１００μｌと２日間共培養するか、あるいは２００μｌのＢ６または２Ｃ−ｔｇマウスのＴ細胞株（２×１０６／ｍｌ）を抗体（抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体）をコートした９６ウェル平底プレートで２日間、２．５×１０７ＰＦＵのＳｅＶ−ＥＧＦＰと共培養して行った。ナイーブＴ細胞のアロ抗原特異的活性化における遺伝子導入効率の評価では、２Ｃ−ｔｇマウスから新しく単離したリンパ球を用いた。別の実験では、６×１０８ＰＦＵのＳｅＶ−ＥＧＦＰの存在下、２Ｃ−ｔｇマウスからのＴ細胞株（２×１０６／ｍｌ）２．５ｍｌをＢ６またはＢａｌｂ／ｃマウスからの３０Ｇｙ照射リンパ球（１×１０７／ｍｌ）２．５ｍｌで６日間刺激し（３または４日毎に、半分の培地を新しい培地に交換した）、遺伝子導入を行ったＴ細胞を新しい培地で洗浄し、ＳｅＶなしで６または７日間、照射Ｂ６またはＢａｌｂ／ｃリンパ球で再刺激した（再刺激は６または７日毎に行った）。バイスタンダー活性化の効果を評価するためには、５０μｌの２Ｃナイーブリンパ球（１×１０７／ｍｌ）および５０μｌのＢ６ナイーブリンパ球（１×１０７／ｍｌ）の混合液を、２．５×１０７ＰＦＵのＳｅＶ−ＥＧＦＰの存在下、１００μｌの照射Ｂａｌｂ／ｃ、Ｂ６、またはＣ３Ｈリンパ球（１×１０７／ｍｌ）１００μｌで２日間刺激した。
各サンプルを３つのウェルに重複させ、５％ＣＯ２を含む湿大気中で３７℃で培養した。ＳｅＶの感染後４８時間でＥＧＦＰの発現は最大となった。適当な濃度の活性化ｍＡＢまたは最適化した用量のＳｅＶを、タイトレーション実験により決定した。最大の割合でＴ細胞にＥＧＦＰを導入するＳｅＶの最低の用量は、多重感染度（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ＭＯＩ）１２．５であり、５００より高いＭＯＩのＳｅＶはＴ細胞に対して細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）を有していた。
ナイーブまたは活性化Ｔ細胞へのＳｅＶの侵入（ｅｎｔｒｙ）の評価
Ｂ６リンパ球（４×１０６／ｍｌ）を、２０００ｍｊのＵＶ（ＵＶ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で不活化したＳｅＶ−ｌｕｃｉ（５×１０８ＰＦＵ／ｍｌ）の１：１の比での存在下または非存在下、３０分３７℃でインキュベートした後、細胞を完全培地でよく洗浄し、ＳｅＶ−ＥＧＦＰ（２．５×１０８ＰＦＵ／ｍｌ）と１：１の比で３０分３７℃でインキュベートした。３回洗浄した後、２００μｌの細胞懸濁液（２×１０６／ｍｌ）を、抗マウスＣＤ３ｍＡｂ（１５μｇ／ｍｌ）および抗マウスＣＤ２８ｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）でコートした９６ウェル平底プレート中で２日間培養した。最後の洗浄を行った培地中に混入しているＳｅＶは、活性化ウェル中の前処理していないＴ細胞に対してほとんどＥＧＦＰを導入する能力がなかったことから、この洗浄過程は十分であったことが確認された。陽性対照として、調製した細胞を活性化ウェルにて、２．５×１０７ＰＦＵのＳｅＶ−ＥＧＦＰと共に２日間培養した。ナイーブＴ細胞からの接着したＳｅＶの解離を調べるため、１０ｍｌのＢ６リンパ球（２×１０６／ｍｌ）を２×１０９ＰＦＵのＳｅＶ−ＥＧＦＰの存在下または非存在下、３０分４℃でインキュベートし、細胞を完全培地でよく洗浄した後、ＳｅＶなしで０、１５、３０、４５、および９０分３７℃でインキュベートした。３回洗浄した後、細胞を活性化ウェル中で３７℃で２日間培養した。陽性対照として、調製した細胞を２．５×１０７ＰＦＵのＳｅＶ−ＥＧＦＰと共に培養した。
［実施例１］組み換えＳｅＶは高い効率でＥＧＦＰを活性化Ｔ細胞に導入する
センダイウイルスベクターがＴ細胞にＥＧＦＰ遺伝子を導入できるかを調べた。まず、マウスリンパ球をＳｅＶ−ＥＧＦＰ（ＭＯＩ＝６２．５）と共に４８時間培養した。ＥＧＦＰ陽性の非刺激マウスＣＤ３＋ＣＤ４＋またはＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（それぞれＣＤ４ Ｔ細胞またはＣＤ８ Ｔ細胞とも称す）の割合は低かった一方（それぞれ０．５〜１．５％または０．８〜２．０％）、固着化した抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を用いて非特異的に活性化したＣＤ３＋ＣＤ４＋またはＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は高い強度でＥＧＦＰを発現し、ＥＧＦＰ陽性細胞の割合は劇的に上昇した（それぞれ６５〜８５％または７０〜９２％）（図１）。ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞の両方の場合で、ＥＧＦＰ陽性細胞の割合はＳｅＶの用量依存的に上昇し、ＭＯＩが１２．５の時にほぼプラトーのレベルに達した。
次に、抗原で活性化したＴ細胞株への遺伝子送達が可能か否かを調べるため、ｉｎ ｖｉｖｏで免疫することなしに初代培養においてナイーブＴリンパ球が応答し増殖することができるＴ細胞刺激抗原としてアロ抗原を用いた。Ｃ５７ＢＬ／６からの非改変リンパ球とＢａｌｂ／ｃからの照射リンパ球との共培養により生成したＴ細胞株は、ほとんどはＣＤ８ Ｔ細胞からなるため、ＣＤ８ Ｔ細胞を枯渇させたリンパ球を照射した刺激リンパ球と共培養してＣＤ４ Ｔ細胞株を得た。また、これとは別に、２ｃ−ｔｇマウスからのＴ細胞（２ｃＴ細胞）を用いたが、これはＬｄ特異的ＴＣＲを発現するナイーブＴ細胞クローンを大量に持っており、抗原特異的な初代Ｔ細胞の応答における遺伝子導入を観察することが可能であった。期待したように、アロ抗原で刺激したＴ細胞株は、照射を行ったアロジェニックなリンパ球の存在下、ＳｅＶにより効率的にＥＧＦＰが導入された（図２）。さらに、刺激するアロジェニックなリンパ球の非存在下でさえも、活性化Ｔ細胞は効率的に遺伝子導入された（図２）。この効果は、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞の両者で共通していたが、ＥＧＦＰ発現レベルおよび陽性細胞の割合は、ＣＤ８ Ｔ細胞株よりもＣＤ４ Ｔ細胞株の方がわずかに低い傾向があった。これらの知見は、ＳｅＶはＴ細胞に対し、Ｔ細胞が活性化状態にあれば標的遺伝子を送達することができることを示している。
これらの知見をＴ細胞の抗原特異的応答において確認するため、Ｌｄに特異的に応答し、ナイーブな状態でもＣＤ８＋１Ｂ２＋集団としてバルクのリンパ球の中から区別することが可能な、２ｃ−ｔｇマウスからのＴ細胞を用いた。ナイーブ２ｃＴ細胞はアロであるＢａｌｂ／ｃ刺激細胞の存在下でのみＥＧＦＰを非常に強く発現し、シンジェニックであるＢ６刺激細胞ではほとんど発現が見られなかったが、Ｂａｌｂ／ｃ刺激細胞で３回以上刺激し、活性化した２ｃＴ細胞に対しては、Ｂ６あるいはＢａｌｂ／ｃの刺激細胞どちらの存在下でもＳｅＶは効率的にＥＧＦＰを導入した（図３）。それに加え、単純にＴ細胞株をＳｅＶと共にたった３０分３７℃でインキュベートしても、ＥＧＦＰを最大に発現させるのに十分であった（データ省略）。
さらに、ＳｅＶによるこの非常に強い導入が抗原特異的に活性化したＴ細胞に限られるのかを明らかにするため、以下のような実験を行った。非抗原特異的Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの強力なアロ応答のバイスタンダー効果により活性化され得る。Ｃ３ＨスティミュレーターではなくＢａｌｂ／ｃスティミュレーターに応答することができる抗原特異的Ｔ細胞としてナイーブ２ｃＴ細胞を用いた。Ｃ５７ＢＬ／６および２ＣナイーブＴ細胞の混合物からなるレスポンダー（応答細胞）を、Ｂａｌｂ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ３Ｈ刺激細胞、または何もなしに共培養し、２．５×１０７ＰＦＵのＳｅＶ−ＥＧＦＰを培養ウェルに添加した。この培養系において、混合リンパ球培養中でＣ５７ＢＬ／６マウスからのＴ細胞がＣ３Ｈスティミュレーターに強く応答している時に、ＳｅＶ−ＥＧＦＰにより２ｃＴ細胞にＥＧＦＰ遺伝子が導入されるかを調べることができた。Ｃ３Ｈ刺激細胞を用いると、Ｃ５７ＢＬ／６Ｔ細胞のＣ３Ｈスティミュレーターに対する応答は起こっても、２ｃＴ細胞にＥＧＦＰは導入されず、Ｃ５７ＢＬ／６刺激細胞を用いた場合または刺激細胞を何も用いなかった場合と同様であった（図４）。それに対して、Ｂａｌｂ／ｃスティミュレーターを用いた場合、２ｃＴ細胞はＥＧＦＰを非常に強く発現した（図４）。従って、ＳｅＶによるこの遺伝子導入は特異的な抗原で活性化されたＴ細胞に限定されていた。
［実施例２］活性化Ｔ細胞におけるＳｅＶによる導入遺伝子の発現期間
次に、導入遺伝子のｉｎ ｖｉｒｔｏでの維持について調べた。活性化２ｃＴ細胞をセンダイウイルスと共培養し、遺伝子導入されたＴ細胞をＢａｌｂ／ｃスティミュレーターまたはＣ５７ＢＬ／６スティミュレーターとｉｎ ｖｉｔｒｏで維持した。ＥＧＦＰの発現は、４８時間目に発現がピークとなった後は、発現レベルは急速に低下するものの、少なくとも２０日間維持された（図５および省略したデータ）。ＥＧＦＰの発現レベルは、Ｂａｌｂ／ｃスティミュレーターにより抗原再刺激を行っても上昇しなかった。これらの知見は、アロ特異的活性化Ｔ細胞株においても観察された（データ省略）。
［実施例３］活性化ヒトＴ細胞およびＴ細胞株への遺伝子送達
健常者から新しく単離したヒトＰＢＬを２．５×１０７ＰＦＵのＥＧＦＰ発現ＳｅＶベクター（ＭＯＩ＝３０）と共に４８時間培養した。マウスＴ細胞の場合とは対照的にＥＧＦＰの発現強度は比較的低いものの、刺激していないヒトＣＤ３＋ＣＤ４＋およびＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞において比較的高いＥＧＦＰ陽性率が得られた（それぞれ平均＝２３．１％、範囲１５〜４５％、および平均＝３４．０％、範囲１８〜５０％）（図６）。
本発明者らは、活性化／メモリーＴ細胞の集団は、特定病原菌フリー（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ−Ｐａｔｈｏｇｅｎ−Ｆｒｅｅ）の条件下で維持されたマウスリンパ系組織におけるよりも、ヒトＰＢＬにおける方が高いという仮説を立てた。活性化／メモリーＴ細胞からナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋）を識別し、これらの各Ｔ細胞集団のＥＧＦＰの発現を解析した。期待したように、ＥＧＦＰ陽性の活性化／メモリーＴ細胞中のＥＧＦＰ陽性細胞の割合は、ナイーブＴ細胞中のＥＧＦＰ陽性細胞よりもはるかに高く、ナイーブＴ細胞中のＥＧＦＰ陽性細胞の割合は４％よりも低かった（図７）。マウス実験で示したように、既に抗原で活性化したＴ細胞は、抗原刺激がなくても効率良くＥＧＦＰが導入されたことから、活性化／メモリーの表現型を有するＴ細胞中の活性化Ｔ細胞がＥＧＦＰを発現したと考えられた。それに対して、固着化した抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で刺激したＣＤ３＋ＣＤ４＋またはＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は強い強度でＥＧＦＰを発現し、ＥＧＦＰ陽性細胞の割合は高かった（それぞれ範囲３０〜６９％または５０〜７０％）（図６）。
ヒトアロ抗原刺激Ｔ細胞株においては、ＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞ともに固着化抗体存在のもとでは、それぞれ９７％または９８％と非常に効率のよい導入を示した（図８）。このＴ細胞株についても、単純に３０分３７℃のインキュベートでＥＧＦＰを最大に発現させるのに十分であった。
［実施例４］ベクターの接着後のＳｅＶの侵入（ｅｎｔｒｙ）は活性化Ｔ細胞では起こるが、ナイーブＴ細胞では起こらない
ＳｅＶを介した活性化Ｔ細胞特異的な遺伝子送達の考えられる機構を調べた。遺伝子導入の効率に影響し得る要因としては、以下のようなものがありうる。（ｉ）ＳｅＶ特異的なレセプター（Ｍａｒｋｗｅｌｌ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ Ｐａｕｌｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８０，７７：５６９３−５６９７）、（ｉｉ）融合のための考えられるコレセプター（Ｋｕｍａｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９７，７１：６３９８−６４０６；Ｅｇｕｃｈｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００，２７５：１７５４９−１７５５５）、（ｉｉｉ）Ｔ細胞の活性化によるシグナル伝達の誘導、これはＳｅＶが侵入（ｅｎｔｒｙ）した後のＳｅＶの転写に影響し得る（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｉｎ：Ｆｉｅｌｄｓ ＢＮ，Ｋｎｉｐｅ ＤＭ，Ｈｏｗｌｅｙ ＰＭ，（ｅｄｓ）．Ｆｉｅｌｄｓ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．２．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６：１２０５−１２４１）。これらを調べるため、マウスＴ細胞を用いた。活性化したマウスＴリンパ球はＳｅＶにより効率的に遺伝子導入されるが、新しく単離したマウスＴリンパ球はＳｅＶによりほとんど遺伝子導入されないため、マウスＴ細胞を用いたこれらの実験では、活性化／メモリーＴ細胞からナイーブＴ細胞を細胞分離するプロセスは行わなかった。
まず、新しく単離したリンパ球を紫外線（ＵＶ）で不活化したＳｅＶ−ｌｕｃｉ存在下（前処理したナイーブＴ細胞）または非存在下（前処理しないナイーブＴ細胞）で６０分３７℃でインキュベートし、Ｔ細胞の特異的レセプターを干渉させ、ＳｅＶのＨＮのノイラミニダーゼ活性によりシアル酸残基を遊離させた。その後、それらＴ細胞をＳｅＶ−ＥＧＦＰ（ＭＯＩ＝６２．５）と共に３０分３７℃でインキュベートした。続いて、それらＴ細胞を、固着化した抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で刺激し、２日後にＥＧＦＰの発現レベルを調べた。ＳｅＶ−ＥＧＦＰで前処理したナイーブＴ細胞においては、続く活性化におけるＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞のＥＧＦＰ陽性細胞の割合は、それぞれ３５％または５０％となった（図９）。しかしながら、ＵＶで不活化したＳｅＶ−ｌｕｃｉと共にインキュベートすると、活性化Ｔ細胞へのＥＧＦＰの遺伝子導入は妨げられた。不活化ＳｅＶ−ｌｕｃｉとプレインキュベーションしても、活性化の培養期間の間ＳｅＶ−ＥＧＦＰと共にＴ細胞をインキュベートするとほとんどのリンパ球はＥＧＦＰを発現したことから、前処理したＴ細胞でＥＧＦＰが発現しなかったのは、Ｔ細胞の生存が低下したためではない（図９）。この結果は、続くインキュベーション期間においてＳｅＶのための特異的レセプターが回復したためであると考えられる。さらに、最後の洗浄培養液は、改変していない活性化Ｔ細胞にほとんどＥＧＦＰを導入しなかった（データ省略）ことから、洗浄の過程が不十分であった可能性は排除することができた。これらの知見は、ＳｅＶは遺伝子導入のためにＴ細胞上の特異的なレセプターを使用していることを示唆している。
Ｔ細胞とＳｅＶ−ＥＧＦＰとのインキュベーションの時間を決定する予備的な実験において、インキュベーション時間を延ばすと、ＥＧＦＰ陽性Ｔ細胞の割合が低下することが観察された。この観察から、本発明者らはＳｅＶはナイーブＴ細胞に接着することはできるが、恐らくコレセプターの欠損により融合できずに、３７℃というノイラミニダーゼがよく働く温度でのインキュベーションにおいて、自身がもつＨＮのノイラミニダーゼ活性によりナイーブＴ細胞からＳｅＶが離れてしまうという仮説をたてた。そこで、新しく単離したリンパ球を、ノイラミニダーゼがほとんど働かないが、ＳｅＶがシアル酸残基に接着することはできる４℃でＳｅＶ−ＥＧＦＰ（ＭＯＩ＝１００）とインキュベートした後、それらのリンパ球を新しい培地で図示した期間３７℃でインキュベートした（図１０）。その後、細胞を３回洗浄し、それらＴ細胞を固着化した抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で刺激し、２日後、ＧＦＰの発現レベルを調べた。この実験では、全てのＴ細胞が均一に活性化されたことから、データは、細胞のキナーゼ活性などのようなＳｅＶの遺伝子発現に関連する要因には影響されず、侵入（ｅｎｔｒｙ）に関連する要因によってのみ影響を受けた。期待したように、Ｔ細胞を４℃で一度インキュベートした後に活性化すると、ＥＧＦＰ陽性のＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞の割合は、それぞれ５０％または７０％であった。これに対して、４℃のインキュベーションに続いて３７℃でインキュベートすると、ＥＧＦＰ陽性Ｔ細胞の割合は時間依存的に減少した（図１０）。３７℃で９０分のインキュベーションによりＥＧＦＰ陽性Ｔ細胞の割合は最低になり、これは最後の洗浄後の培養液に混入しているＳｅＶと活性化ウェル中で共培養した前処理なしのＴ細胞の割合と同等であった。活性化のための培養期間の間ＳｅＶ−ＥＧＦＰと共にインキュベートした陽性対照のＴ細胞はすべて効率的に遺伝子導入された。さらに、活性化Ｔ細胞を用いた場合、３０分３７℃でインキュベートするだけで、ＥＧＦＰ陽性Ｔ細胞の割合は陽性対照と同じくらい高かった（データ省略）。侵入（ｅｎｔｅｒ）したＳｅＶがナイーブＴ細胞から放出されることはありそうにないことから、これらの現象は、ＳｅＶは活性化Ｔ細胞に侵入（ｅｎｔｅｒ）することができる一方、ナイーブＴ細胞に接着することはできるが融合できないと説明することができる。ベクター粒子は、ナイーブＴリンパ球ではなく活性化Ｔリンパ球に特異的にインターナリゼーション（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ；内部化）が起こる可能性が高い。
【産業上の利用の可能性】
本発明により、Ｔ細胞に効率的に遺伝子を導入することが可能となった。Ｔ細胞への遺伝子導入は、免疫系が関与する様々な疾患の治療にとって重要であることから、これらの疾患における、Ｔ細胞を指向した遺伝子送達による改変戦略への本発明の適用が期待される。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【技術分野】
本発明は、Ｔ細胞に遺伝子を導入する方法に関する。
【背景技術】
造血細胞の遺伝的改変は、自己免疫疾患、免疫不全、さらには抗腫瘍免疫の活性化を介した腫瘍に対する治療の魅力的な戦略である。様々な血液細胞の中でもＴリンパ球は、アデノシンデアミナーゼ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ−ｄｅａｍｉｎａｓｅ；ＡＤＡ）欠損症による重症複合型免疫不全（ＡＤＡ−ＳＣＩＤ）に対する遺伝子治療の初期段階から遺伝子送達の標的の１つとされてきた（Ｂｌａｅｓｅ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，２７０：４７５−４８０；Ａｌｔｅｎｓｃｈｍｉｄｔ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，１９９７，７５：２５９−２６６；Ｍｉｓａｋｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００１，３：２４−２７）。しかしながら、レトロウイルスなどの現在使用可能なベクターによる遺伝子送達に対して、Ｔ細胞は比較的抵抗性を示すことが、現在の障壁となっている。
自己免疫疾患、移植後のアロ器官拒絶、または腫瘍などの治療における臨床場面を考えると、活性化Ｔリンパ球のサブセットは遺伝的改変の標的として理想的であるに違いない（Ａｌｔｅｎｓｃｈｍｉｄｔ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，１９９７，７５：２５９−２６６；Ｈｅｇｅ，Ｋ．Ｍ．ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｒ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９６，７：６２９−６３４；Ｔｕｏｈｙ，Ｖ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．，２０００，１０７：２２６−２３２）。遺伝子マーキングに関する初期の臨床報告により、腫瘍抗原により活性化される腫瘍浸潤リンパ球（ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ；ＴＩＬｓ）が、腫瘍を持つ個体内において腫瘍に移動することが実証されたことから、ＴＩＬｓは治療遺伝子を腫瘍へと移動させる理想的な担体ビークルであることが示唆される（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９０，３２３：５７０−５７８）。活性化Ｔリンパ球の類似した特徴は、自己免疫および器官移植においても期待されるものの、その研究はここ１０年ほとんどなされておらず、それは現在のベクターの活性化Ｔ細胞への遺伝子送達の効率が低いことが原因と予想される。
最近では、新しく登場したＴリンパ球への遺伝子送達ビークル、すなわちヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）をベースとするレンチウイルスベクターに多くの注目が集まっているが、これはＨＩＶがＣＤ４リンパ球に指向したトロピズムを持つからである。近年の努力の結果、ベクターゲノムの核へのインポートおよび染色体へのインテグレーションを促進するセントラルＤＮＡフラップを構築することを介して、ＨＩＶの活性化Ｔ細胞への遺伝子送達効率は飛躍的に向上した（従来のＨＩＶベクターでは平均１５％に対して、このベクターでは平均５１％）（Ｄａｒｄａｌｈｏｎ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２００１，８：１９０−１９８）。しかしながら、特にＨＩＶを含む病原性ウイルスをベースとしたレンチウイルスの場合には、潜在的な安全性に関する関心が臨床適用を遅らせている（Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒ，Ｇ．Ｌ．Ｊｒ．ａｎｄ Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌ，Ｆ．，Ｂｌｏｏｄ ２０００，９５：２４９９−２５０４）。より効率的に遺伝子送達が可能で、より安全な他の選択肢を開発する努力を続けることが必要であることは明らかである。
【発明の開示】
Ｔ細胞へ効率的に遺伝子導入が可能なベクターを探し出すため、Ｔ細胞に対して種々の条件でベクターの導入を行い、遺伝子導入効率を測定した。その結果、本発明者らは、パラミクソウイルスベクターが、抗原活性化Ｔ細胞に対して高い遺伝子導入効率を示すことを見いだした。遺伝子導入は活性化Ｔ細胞に特異的、すなわちベクターの遺伝子導入効率はナイーブＴ細胞と比べ活性化Ｔ細胞に対して顕著に高かった。パラミクソウイルスベクターは、抗原活性化Ｔ細胞への遺伝子導入のためのベクターとして好適に用いられる。
Ｔリンパ球を指向した遺伝子治療は、様々な免疫学的疾患に対する治療の可能性を持っているが、これまでのＴ細胞の遺伝子治療においては、複雑な操作を行うにも関わらず遺伝子導入（ジーントランスダクション）の効率が低いことが大きな制約となっていた。本発明により、パラミクソウイルスベクターは、非常に単純な手順で、活性化Ｔ細胞に特異的に外来遺伝子を発現できることが実証され、Ｔ細胞の遺伝子治療における上記の問題を克服することが可能となった。本発明により、活性化Ｔ細胞特異的な遺伝子送達を効率的に実施することが可能となり、免疫疾患におけるＴ細胞を指向した遺伝子送達による改変戦略への適用が期待される。
すなわち本発明は、Ｔ細胞に遺伝子を導入する方法に関し、より具体的には、
（１）Ｔ細胞に遺伝子を導入する方法であって、該遺伝子を保持するパラミクソウイルスベクターと活性化したＴ細胞とを接触させる工程を含む方法、
（２）パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、（１）に記載の方法、
（３）外来遺伝子が導入されたＴ細胞の製造方法であって、該遺伝子を保持するパラミクソウイルスベクターと活性化したＴ細胞とを接触させる工程を含む方法、
（４）パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、（３）に記載の方法、
（５）（３）または（４）に記載の方法により製造された、外来遺伝子が導入されたＴ細胞、
（６）活性化Ｔ細胞への遺伝子送達のために用いる、パラミクソウイルスベクター、
（７）パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、（６）に記載のベクター、に関する。
本発明は、パラミクソウイルスベクターを用いるＴ細胞への遺伝子導入方法を提供する。この方法は、導入したい遺伝子を保持するパラミクソウイルスベクターを、活性化したＴ細胞に接触させる工程を含む方法である。本発明者等は、パラミクソウイルスベクターが極めて高い効率で活性化Ｔ細胞へ遺伝子を導入できることを見出した。ナイーブＴ細胞に対しては、パラミクソウイルスベクターによる遺伝子導入効率は低く、このベクターによる遺伝子導入は、抗原活性化Ｔ細胞に特異的であることが判明した。従って、本発明の方法は、活性化Ｔ細胞への選択的な遺伝子導入に好適に利用することができる。Ｔ細胞は、癌およびその他の疾患の治療において免疫系を制御するための標的として重要であり、本発明の方法はこれら疾患の遺伝子治療に好適に用いられ得る。遺伝子導入は培養液、生理食塩水、血液、体液など所望の生理的水溶液中で行うことができる。
また本発明は、Ｔ細胞に所望の遺伝子を導入する方法であって、（ａ）該Ｔ細胞を活性化させる工程、および（ｂ）該遺伝子を保持するパラミクソウイルスベクターを、活性化させたＴ細胞に接触させる工程、を含む方法を提供する。この方法も、本発明におけるＴ細胞に遺伝子を導入する方法に含まれる。Ｔ細胞は、抗原刺激により活性化することができる。Ｔ細胞を活性化させる工程は、パラミクソウイルスベクターによる効率的な遺伝子導入を可能にする。Ｔ細胞の活性化は、パラミクソウイルスベクターをこのＴ細胞に接触させる前に行ってもよいし、パラミクソウイルスベクターの存在下で行ってもよい。
単純な技術により高い効率で遺伝子送達が起こることは、パラミクソウイルスベクターを介したＴ細胞標的化遺伝子送達の重要な優位性の１つである。以前に報告されているように、レトロウイルスおよびレンチウイルスを介したＴ細胞への遺伝子送達は、最適な遺伝子送達のためには遠心で濃縮しなくてはならず、毒性のある薬剤であるポリブレンなどを必要とする（Ｂｕｎｎｅｌｌ，Ｂ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５，９２：７７３９−７７４３；Ｃｈｕｃｋ，Ａ．Ｓ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１９９６，７：７４３−７５０；Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０００，９６：１３０９−１３１６；Ｆｅｈｓｅ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，１９９８，１０２：５６６−５７４）。一方でパラミクソウイルスベクター溶液は特別な薬剤に助けられることなく、単に添加するだけでより優れた遺伝子送達を達成することができた。さらに、活性化Ｔ細胞へのセンダイウイルスベクター（ＳｅＶ）を介する最適な遺伝子送達は、鼻腔粘膜（ｎａｓａｌ ｍｕｃｏｓａ）（Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０００，１８：９７０−９７３）、血管（ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）（Ｍａｓａｋｉ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２００１，１５：１２９４−１２９６）、網膜組織（ｒｅｔｉｎａｌ ｔｉｓｓｕｅ）（Ｉｋｅｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．，２００２，７５：３９−４８）等で見られた代表的な結果と同様、比較的短い暴露で行うことができた（３０分未満、データ省略）。臨床場面を考えると、パラミクソウイルスベクターを介した遺伝子送達のこれらの特徴は、本発明においても、Ｔリンパ球のｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝的改変を単純化し、操作に依存した細胞生存性の喪失を最小化し得るものである。
本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトリンパ球の細胞濃度を低くするほど、遺伝子導入細胞の比率が低くなることを見いだしたが、この結果はマウス細胞でも見られた。従って、遺伝子導入においては、細胞濃度は比較的高いことが好ましい。細胞濃度は、例えば１×１０６／ｍｌ〜４×１０６／ｍｌ、好ましくは４×１０６／ｍｌ〜８×１０６／ｍｌ、好ましくは８×１０６／ｍｌ〜１×１０７／ｍｌ程度にするとよい。
ＭＯＩは１〜５００の間で投与することが好ましく、より好ましくは２〜３００、さらに好ましくは３〜２００である。ベクターとＴ細胞との接触は短い時間でも十分であり、例えば１分以上、好ましくは３分以上、５分以上、１０分以上、または２０分以上接触させればよく、例えば１〜６０分程度、より特定すれば５分〜３０分程度であってよい。もちろん、それ以上の時間接触させてもよく、例えば数日間またはそれ以上接触させてもよい。
最近、免疫学的シナプス（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｎａｐｓ）を用いて抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、および４−１ＢＢリガンドによりＴ細胞を刺激できるユニバーサルアーティフィシャル抗原提示細胞（ＡＰＣ）システム（Ｍａｕｓ，Ｍ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００２，２０：１４３−１４８）を含む、幾つかの洗練された効率的な技術により、十分な量のＴ細胞株をより容易に調製することが可能となった。そのような技術を組み合わせれば、ＳｅＶに由来するベクター系は、様々な免疫学的疾患に対するＴ細胞指向性の遺伝子治療の臨床適用のための重要な治療的可能性を持つ。
また本発明は、活性化Ｔ細胞に選択的に遺伝子を導入する方法であって、該遺伝子を保持するパラミクソウイルスベクターを、活性化Ｔ細胞およびナイーブＴ細胞を含む細胞集団中に共存させる工程を含む方法を提供する。活性化Ｔ細胞に選択的とは、ナイーブＴ細胞に比べ活性化Ｔ細胞へ有意に遺伝子が導入されることを言う。例えば本発明は、該遺伝子を保持するパラミクソウイルスベクターを、活性化Ｔ細胞およびナイーブＴ細胞を含む細胞集団中に添加する工程を含む方法を提供する。パラミクソウイルスベクターは、ナイーブＴ細胞に比べ活性化Ｔ細胞へ優先的に遺伝子を導入するので、この方法により活性化Ｔ細胞に選択的に遺伝子を導入することができる。あるいは、予めＴ細胞とベクターを共存させておき、その後このＴ細胞を活性化させる処理を行うことにより、活性化されたＴ細胞の選択的にベクターを導入することができる。これらの方法も、本発明におけるＴ細胞に遺伝子を導入する方法に含まれる。
Ｔ細胞はＴリンパ球ともいい、組織主要適合抗原（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）上にのった抗原のペプチド複合体を認識するレセプターであるＴ細胞レセプターを発現したリンパ球である。主として、骨髄の幹細胞より分化し、胸腺にてポジティブセレクション（自己のＭＨＣを認識できるレパーターの選択）、ネガティブセレクション（自己抗原を認識するレパーター排除）を受け、成熟ナイーブＴ細胞として末梢血液、及びリンパ組織に出現する。Ｔ細胞は蛋白抗原、腫瘍抗原、アロ抗原、病原体などから由来するペプチドを認識し、抗原特異的な個体の免疫応答（適応免疫）を発生させる主たるリンパ球であり、ペプチドに対する抗体産生を援助（液性免疫）、あるいはそれ自身が武装化Ｔ細胞となって細胞性免疫を発動する。
活性化Ｔ細胞とは、抗原またはマイトジェンなどの刺激により、増殖分化へと導かれる状態となったＴリンパ球を言う。つまり、Ｔ細胞レセプターの結合、あるいは直接的な酵素活性化により細胞内チロシンリン酸化酵素の活性化、これに続くイノシトールリン脂質代謝の亢進、細胞内カルシウム濃度の上昇を経て、インターロイキン（ＩＬ）−２産生、ＩＬ−２レセプターの発現、及びそれに伴う細胞シグナルにより、ＤＮＡ合成、細胞分裂を開始し、増殖分化しているＴ細胞を言う。活性化時の生体環境により種々のサイトカインを産生する種々のＴ細胞へと分化する。
また、本発明において活性化Ｔ細胞は、好ましくは抗原により活性化されたＴ細胞である。センダイウイルスベクターによる導入は抗原活性化Ｔ細胞に選択的であり、抗原非特異的Ｔ細胞には、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて抗原に応答した特異的Ｔ細胞からバイスタンダーに活性化される場合においては遺伝子導入効率は低い。従って、Ｔ細胞を抗原により活性化することにより、あるいはこれと同等の活性化を行うことにより、ベクターによる遺伝子導入効率を劇的に向上させることができる。
抗原活性化Ｔ細胞とは、先に述べた抗原提示細胞のＭＨＣと、ある特定の抗原由来のペプチドなどとの複合体と適切なアフィニティーのあるＴ細胞レセプターを持ったＴ細胞が、両者の結合を介して、活性化シグナルを伝達したＴ細胞を言い、好ましくは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ等の適切なコレセプターよりのシグナルを伝達する事によって活性化したＴ細胞である。抗原活性化Ｔ細胞は、好ましくは、増殖、芽球化、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γなどの各種サイトカイン産生、Ｆａｓ Ｌｉｇａｎｄ、ｐｅｒｆｏｒｉｎなどの細胞傷害分子発現、及びＣＤ４０ Ｌｉｇａｎｄ等の抗原提示細胞および／またはＢ細胞を活性化するなどの能力を有する。抗原特異的Ｔ細胞はリンパ節等ではＭＨＣとペプチドを提示した抗原提示細胞のもとで、抗原提示細胞の活性化および／またはＢ細胞の活性化、抗体産生刺激を行い、末梢組織の局所ではその産生サイトカインおよび細胞傷害分子による細胞傷害、炎症の促進などの作用により、生体から非自己蛋白、非自己細胞、病原体の排除に主要な作用を及ぼす。
活性化Ｔ細胞は、分画により調製することができる。例えばヒトＴ細胞は、活性化に伴いＣＤ抗原の表現パターンを変化させるという特徴があるため、これにより活性化Ｔ細胞とナイーブＴ細胞とを選別することが可能である。具体的方法として、Ｔ細胞をネガティブセレクションで採取し、活性化Ｔ細胞に表出するＣＤ４５ＲＯに対する抗体を用い、マグネットビーズ分離法あるいはｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙによるソーティングを行うことで、好ましくは、ＣＤ４５ＲＡ及び、ＣＤ６２ＬダブルポジティブＴ細胞はナイーブＴ細胞、それ以外は活性化あるいはメモリーＴ細胞と考えられていることから、両者に対する抗体を用いて、マグネットビーズ分離法あるいはｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙによるソーティングを行うことで、活性化Ｔ細胞あるいはナイーブＴ細胞を分画できる。分画に用いる抗体は、既知の活性化関連マーカーを組み合わせたすべての方法で可能である。また、ケモカインレセプター、サイトカインレセプターなどの活性化Ｔ細胞の中のある特殊な機能をもったポピュレーションを分画する方法も含まれる。分画法に関しては、その他、比重を用いた方法など、既存の方法を含む。
また活性化Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞を抗原刺激により活性化して調製することもできる。例えばナイーブＴ細胞は、抗ＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍｌ）と抗ＣＤ２８抗体（１０μｇ／ｍｌ）を固着させたプレートに以下に述べる濃度で培養することで、好ましくは末梢血単球より分化させた成熟樹状細胞を同時に添加することで活性化させることができる。また、腫瘍抗原による活性化の項で述べるように、樹状細胞とペプチド、あるいは蛋白抗原を添加された培養でも活性化させることができる。
抗原活性化Ｔ細胞の調製は、例えばヒトアロ抗原を用いる場合は、ドナー、レシピエント末梢血を採取し、それぞれを末梢血リンパ球分離液でリンパ球を分離し、それぞれ１×１０７／ｍｌの濃度に調整、ドナー由来の細胞浮遊液を３０Ｇｙの放射線照射を行い、２４穴のプレートに各穴にそれぞれ５００μｌづつ注入し、ヒトＩＬ−２（５〜１００Ｕ／ｍｌ）で約７日間培養することで得られる。継代は約７日間ごとのドナー放射線照射リンパ球で再刺激することで可能である。抗原特異的Ｔ細胞株としては、少なくとも３回の抗原刺激（初回を含め、）を受けたものが望ましい。あるいは、２回の抗原刺激以降は抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体が固着化されたビーズあるいは細胞などを用いて刺激、増殖させたものも、抗原活性化Ｔ細胞に含まれる。
腫瘍抗原などによる活性化の場合は、４回以上の迅速な凍結融解をくり返して腫瘍細胞を溶解した溶液を末梢血より分化させた樹状細胞に添加した後、放射線照射２０Ｇｙ〜３０Ｇｙを照射したものを抗原提示細胞とし、それに末梢血より分離したＴ細胞をＩＬ−２（５〜１００Ｕ／ｍｌ）単独あるいは、その他ＩＬ−７等の至適サイトカインの存在下で７日間共培養、７日ごとの再刺激を３回行うことによって得られる（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ａｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５：９４８２−９４８７）。ここで用いられる樹状細胞は、末梢血単球あるいは骨髄、臍帯血、動化末梢血などの造血幹細胞よりＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４等のサイトカインを用いて増殖分化させる既知の方法により得られたものすべてを含む。
末梢血のＴ細胞の分離は、Ｔ細胞分離液での分離でも良いし、抗原内の有効なペプチドが分かっているならば、ＣｌａｓｓＩあるいはＣｌａｓｓＩＩのテトラマーとペプチド複合体による抗原特異的Ｔ細胞の分離方法により得られたものであってもよい。
活性化Ｔ細胞の調製に関して、以上の他に、既知の特異的抗原が明らかなものに関して、その抗原あるいは抗原由来の蛋白、ペプチドを使用して、Ｔ細胞を活性化する方法により調製することもできる。その他、活性化Ｔ細胞の作成には、レクチン等を用いた非特異的な活性化方法など、既知のＴ細胞活性化方法が使用可能である。本発明において抗原活性化Ｔ細胞には、このようにして得られた細胞も含まれる。
これら活性化されたＴ細胞は、適切な増殖因子、サイトカインと抗原及び抗原提示細胞（フィーダー細胞、分化させた樹状細胞、アーティフィシャルＡＰＣなどを含む）での共培養、または、抗原のない抗原提示細胞などとの共培養で継代が可能である。その他、種々の治療対象疾患にあった継代法を用いてもよい。例えば、感染免疫等に対する移入免疫治療の場合は、抗原で活性化されている最中のＴ細胞は様々なサイトカインを産生しているため、生体内へ移入した際、発熱等の副作用があらわれる可能性が有る。また、移入免疫としてのＴ細胞は生体の感染時にのみその機能を発現すべきである。そのため、抗原で活性化したＴ細胞にパラミクソウイルスベクターを用いて遺伝子導入した後、一旦、抗原のない状態でＡＰＣと共培養で継代し、静止状態の活性化Ｔ細胞（いわゆるメモリーＴ細胞）を継代によって作成する方法等がある。
本発明においてパラミクソウイルスベクターとは、パラミクソウイルスをベースとする感染力を持つウイルス粒子であって、遺伝子を細胞に導入するための担体である。ここで「感染力」とは、パラミクソウイルスベクターが細胞への接着能を保持しており、接着した細胞の内部にベクターに含まれる遺伝子を導入することのできる能力のことを言う。好ましい態様では、本発明のパラミクソウイルスベクターは、ベクターのゲノムＲＮＡ中に外来遺伝子が発現できるように組み込まれている。本発明のパラミクソウイルスベクターは、複製能を有していてもよく、複製能を有さない欠損型ベクターであってもよい。「複製能を有する」とは、ウイルスベクターが宿主細胞に感染した場合、該細胞においてウイルスが複製され、感染性ウイルス粒子が産生されることを指す。
組み換えウイルスとは、組み換えポリヌクレオチドを介して生成したウイルスを言う。組み換えポリヌクレオチドとは、両端または片端が自然の状態と同じようには結合していないポリヌクレオチドを言う。具体的には、組み換えポリヌクレオチドは、人の手によってポリヌクレオチド鎖の結合が改変（切断および／または結合）されたポリヌクレオチドである。組み換えポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド合成、ヌクレアーゼ処理、リガーゼ処理等を組み合わせて、公知の遺伝子組み換え方法により生成させることができる。組み換えウイルスは、遺伝子操作により構築されたウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチドを発現させ、ウイルスを再構築することによって生成することができる。例えば、組換えパラミクソウイルスは、ｃＤＮＡから再構成して生成することができる（Ｙ．Ｎａｇａｉ，Ａ．Ｋａｔｏ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４３，６１３−６２４（１９９９））。
本発明において遺伝子とは遺伝物質を指し、転写単位をコードする核酸を言う。遺伝子はＲＮＡであってもＤＮＡであってもよい。本発明において蛋白質をコードする核酸は、該蛋白質の遺伝子と呼ぶ。また遺伝子は蛋白質をコードしていなくてもよく、例えば遺伝子はリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡなどの機能的ＲＮＡをコードするものであってもよい。遺伝子は天然由来または人為的に設計された配列であり得る。また、本発明において「ＤＮＡ」とは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む。また蛋白質をコードするとは、ポリヌクレオチドが該蛋白質を適当な条件下で発現できるように、該蛋白質のアミノ酸配列をコードするＯＲＦをセンスまたはアンチセンスに含むことを言う。
本発明においてパラミクソウイルスとはパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスまたはその誘導体を指す。パラミクソウイルスは、非分節型ネガティブ鎖ＲＮＡをゲノムに持つウイルスのグループの１つで、パラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）（レスピロウイルス属（パラミクソウイルス属とも言う）、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）およびニューモウイルス亜科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）（ニューモウイルス属およびメタニューモウイルス属を含む）ウイルスを含む。本発明を適用可能なパラミクソウイルスとしては、具体的にはセンダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）、おたふくかぜウイルス（Ｍｕｍｐｓ ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ）、ＲＳウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウイルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウイルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ）、サルパラインフルエンザウイルス（ＳＶ５）、ヒトパラインフルエンザウイルス１，２，３型等が挙げられる。より具体的には、例えば Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ（ＳｅＶ）、ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ−１（ＨＰＩＶ−１）、ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ−３（ＨＰＩＶ−３）、、ｐｈｏｃｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ（ＰＤＶ）、ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ（ＣＤＶ）、ｄｏｌｐｈｉｎ ｍｏｌｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ（ＤＭＶ）、ｐｅｓｔｅ−ｄｅｓ−ｐｅｔｉｔｓ−ｒｕｍｉｎａｎｔｓ ｖｉｒｕｓ（ＰＤＰＲ）、ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ（ＭＶ）、ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ ｖｉｒｕｓ（ＲＰＶ）、Ｈｅｎｄｒａ ｖｉｒｕｓ（Ｈｅｎｄｒａ）、Ｎｉｐａｈ ｖｉｒｕｓ （Ｎｉｐａｈ）、ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ−２（ＨＰＩＶ−２）、ｓｉｍｉａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ５（ＳＶ５）、ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ−４ａ（ＨＰＩＶ−４ａ）、ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ−４ｂ（ＨＰＩＶ−４ｂ）、ｍｕｍｐｓ ｖｉｒｕｓ（Ｍｕｍｐｓ）、およびＮｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ （ＮＤＶ）などが含まれる。より好ましくは、Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ（ＳｅＶ）、ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ−１（ＨＰＩＶ−１）、ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ−３（ＨＰＩＶ−３）、ｐｈｏｃｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ（ＰＤＶ）、ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ（ＣＤＶ）、ｄｏｌｐｈｉｎ ｍｏｌｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ（ＤＭＶ）、ｐｅｓｔｅ−ｄｅｓ−ｐｅｔｉｔｓ−ｒｕｍｉｎａｎｔｓ ｖｉｒｕｓ（ＰＤＰＲ）、ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ（ＭＶ）、ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ ｖｉｒｕｓ（ＲＰＶ）、Ｈｅｎｄｒａ ｖｉｒｕｓ（Ｈｅｎｄｒａ）、およびＮｉｐａｈ ｖｉｒｕｓ（Ｎｉｐａｈ）からなる群より選択されるウイルスが例示できる。本発明のウイルスは、好ましくはパラミクソウイルス亜科（レスピロウイルス属、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）に属するウイルスまたはその誘導体であり、より好ましくはレスピロウイルス属（ｇｅｎｕｓ Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）（パラミクソウィルス属（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）とも言う）に属するウイルスまたはその誘導体である。本発明を適用可能なレスピロウイルス属ウイルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウイルス１型（ＨＰＩＶ−１）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（ＨＰＩＶ−３）、ウシパラインフルエンザウイルス３型（ＢＰＩＶ−３）、センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ；マウスパラインフルエンザウイルス１型とも呼ばれる）、およびサルパラインフルエンザウイルス１０型（ＳＰＩＶ−１０）などが含まれる。本発明においてパラミクソウイルスは、最も好ましくはセンダイウイルスである。これらのウイルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。
パラミクソウイルスベクターはゲノムＲＮＡに搭載遺伝子をアンチセンスにコードしている。ゲノムＲＮＡとは、パラミクソウイルスのウイルス蛋白質と共にリボヌクレオプロテイン（ＲＮＰ）を形成し、該蛋白質によりゲノム中の遺伝子が発現し、このＲＮＡが複製されて娘ＲＮＰが形成される機能を持つＲＮＡである。一般にパラミクソウイルスのゲノムは、３’リーダー領域と５’トレイラー領域の間に、ウイルス遺伝子がアンチセンスとして並んだ構成をしている。各遺伝子のＯＲＦの間には、転写終結配列（Ｅ配列）−介在配列（Ｉ配列）−転写開始配列（Ｓ配列）が存在し、これにより各遺伝子のＯＲＦをコードするＲＮＡが別々のシストロンとして転写される。
パラミクソウイルスのウイルスタンパク質をコードする遺伝子としては、ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子が含まれる。「ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子」とは、それぞれヌクレオキャプシド、ホスホ、マトリックス、フュージョン、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ、およびラージ蛋白質をコードする遺伝子のことを指す。パラミクソウイルス亜科に属する各ウイルスにおける各遺伝子は、一般に次のように表記される。一般に、ＮＰ遺伝子は「Ｎ遺伝子」と表記されることもある。
レスピロウイルス属 ＮＰ Ｐ／Ｃ／Ｖ Ｍ Ｆ ＨＮ − Ｌ
ルブラウイルス属 ＮＰ Ｐ／Ｖ Ｍ Ｆ ＨＮ （ＳＨ）Ｌ
モービリウイルス属 ＮＰ Ｐ／Ｃ／Ｖ Ｍ Ｆ Ｈ − Ｌ
例えばセンダイウイルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号は、ＮＰ遺伝子についてはＭ２９３４３、Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５１３３１，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ１７２１８、Ｐ遺伝子についてはＭ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８３，Ｘ１７００７，Ｘ１７００８、Ｍ遺伝子についてはＤ１１４４６，Ｋ０２７４２，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｕ３１９５６，Ｘ００５８４，Ｘ５３０５６、Ｆ遺伝子についてはＤ００１５２，Ｄ１１４４６，Ｄ１７３３４，Ｄ１７３３５，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００１５２，Ｘ０２１３１、ＨＮ遺伝子についてはＤ２６４７５，Ｍ１２３９７，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８６，Ｘ０２８０８，Ｘ５６１３１、Ｌ遺伝子についてはＤ０００５３，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４０，Ｘ００５８７，Ｘ５８８８６を参照のこと。またその他のウイルスがコードするウイルス遺伝子を例示すれば、Ｎ遺伝子については、ＣＤＶ，ＡＦ０１４９５３；ＤＭＶ，Ｘ７５９６１；ＨＰＩＶ−１，Ｄ０１０７０；ＨＰＩＶ−２，Ｍ５５３２０；ＨＰＩＶ−３，Ｄ１００２５；Ｍａｐｕｅｒａ，Ｘ８５１２８；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１７２；ＭＶ，Ｋ０１７１１；ＮＤＶ，ＡＦ０６４０９１；ＰＤＰＲ，Ｘ７４４４３；ＰＤＶ，Ｘ７５７１７；ＲＰＶ，Ｘ６８３１１；ＳｅＶ，Ｘ０００８７；ＳＶ５，Ｍ８１４４２；およびＴｕｐａｉａ，ＡＦ０７９７８０、Ｐ遺伝子については、ＣＤＶ，Ｘ５１８６９；ＤＭＶ，Ｚ４７７５８；ＨＰＩＶ−１，Ｍ７４０８１；ＨＰＩＶ−３，Ｘ０４７２１；ＨＰＩＶ−４ａ，Ｍ５５９７５；ＨＰＩＶ−４ｂ，Ｍ５５９７６；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１７３；ＭＶ，Ｍ８９９２０；ＮＤＶ，Ｍ２０３０２；ＰＤＶ，Ｘ７５９６０；ＲＰＶ，Ｘ６８３１１；ＳｅＶ，Ｍ３０２０２；ＳＶ５，ＡＦ０５２７５５；およびＴｕｐａｉａ，ＡＦ０７９７８０、Ｃ遺伝子についてはＣＤＶ，ＡＦ０１４９５３；ＤＭＶ，Ｚ４７７５８；ＨＰＩＶ−１．Ｍ７４０８１；ＨＰＩＶ−３，Ｄ０００４７；ＭＶ，ＡＢ０１６１６２；ＲＰＶ，Ｘ６８３１１；ＳｅＶ，ＡＢ００５７９６；およびＴｕｐａｉａ，ＡＦ０７９７８０、Ｍ遺伝子についてはＣＤＶ，Ｍ１２６６９；ＤＭＶ Ｚ３００８７；ＨＰＩＶ−１，Ｓ３８０６７；ＨＰＩＶ−２，Ｍ６２７３４；ＨＰＩＶ−３，Ｄ００１３０；ＨＰＩＶ−４ａ，Ｄ１０２４１；ＨＰＩＶ−４ｂ，Ｄ１０２４２；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１７１；ＭＶ，ＡＢ０１２９４８；ＮＤＶ，ＡＦ０８９８１９；ＰＤＰＲ，Ｚ４７９７７；ＰＤＶ，Ｘ７５７１７；ＲＰＶ，Ｍ３４０１８；ＳｅＶ，Ｕ３１９５６；およびＳＶ５，Ｍ３２２４８、Ｆ遺伝子についてはＣＤＶ，Ｍ２１８４９；ＤＭＶ，ＡＪ２２４７０４；ＨＰＮ−１．Ｍ２２３４７；ＨＰＩＶ−２，Ｍ６０１８２；ＨＰＩＶ−３．Ｘ０５３０３，ＨＰＩＶ−４ａ，Ｄ４９８２１；ＨＰＩＶ−４ｂ，Ｄ４９８２２；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１６９；ＭＶ，ＡＢ００３１７８；ＮＤＶ，ＡＦ０４８７６３；ＰＤＰＲ，Ｚ３７０１７；ＰＤＶ，ＡＪ２２４７０６；ＲＰＶ，Ｍ２１５１４；ＳｅＶ，Ｄ１７３３４；およびＳＶ５，ＡＢ０２１９６２、ＨＮ（ＨまたはＧ）遺伝子についてはＣＤＶ，ＡＦ１１２１８９；ＤＭＶ，ＡＪ２２４７０５；ＨＰＩＶ−１，Ｕ７０９４９８；ＨＰＩＶ−２．Ｄ０００８６５；ＨＰＩＶ−３，ＡＢ０１２１３２；ＨＰＩＶ−４Ａ，Ｍ３４０３３；ＨＰＩＶ−４Ｂ，ＡＢ００６９５４；Ｍｕｍｐｓ，Ｘ９９０４０；ＭＶ，Ｋ０１７１１；ＮＤＶ，ＡＦ２０４８７２；ＰＤＰＲ，Ｚ８１３５８；ＰＤＶ，Ｚ３６９７９；ＲＰＶ，ＡＦ１３２９３４；ＳｅＶ，Ｕ０６４３３；およびＳＶ−５，Ｓ７６８７６が例示できる。但し、各ウイルスは複数の株が知られており、株の違いにより上記に例示した以外の配列からなる遺伝子も存在する。
これらのウイルス蛋白質をコードするＯＲＦおよび外来遺伝子のＯＲＦは、ゲノムＲＮＡにおいて上記のＥ−Ｉ−Ｓ配列を介してアンチセンスに配置される。ゲノムＲＮＡにおいて最も３’に近いＯＲＦは、３’リーダー領域と該ＯＲＦとの間にＳ配列のみが必要であり、ＥおよびＩ配列は必要ない。またゲノムＲＮＡにおいて最も５’に近いＯＲＦは、５’トレイラー領域と該ＯＲＦとの間にＥ配列のみが必要であり、ＩおよびＳ配列は必要ない。また２つのＯＲＦは、例えばＩＲＥＳ等の配列を用いて同一シストロンとして転写させることも可能である。このような場合は、これら２つのＯＲＦの間にはＥ−Ｉ−Ｓ配列は必要ない。野生型のパラミクソウイルスの場合、典型的なＲＮＡゲノムは、３’リーダー領域に続き、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ蛋白質をアンチセンスにコードする６つのＯＲＦが順に並んでおり、それに続いて５’トレイラー領域を他端に有する。本発明のゲノムＲＮＡにおいては、ウイルス遺伝子の配置はこれに限定されるものではないが、好ましくは、野生型ウイルスと同様に、３’リーダー領域に続き、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ蛋白質をコードするＯＲＦが順に並び、それに続いて５’トレイラー領域が配置されることが好ましい。ある種のパラミクソウイルスにおいては、ウイルス遺伝子が異なっているが、そのような場合でも上記と同様に各ウイルス遺伝子を野生型と同様の配置とすることが好ましい。一般にＮ、Ｐ、およびＬ遺伝子を保持しているベクターは、細胞内で自律的にＲＮＡゲノムから遺伝子が発現し、ゲノムＲＮＡが複製される。さらにＦおよびＨＮ遺伝子等のエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子、およびＭ遺伝子の働きにより、感染性のウイルス粒子が形成され、細胞外に放出される。従って、このようなベクターは複製能を有するウイルスベクターとなる。Ｔ細胞に導入したい外来遺伝子は、後述するように、このゲノム中の蛋白質非コード領域に挿入すればよい。
また、本発明のパラミクソウイルスベクターは、野生型パラミクソウイルスが持つ遺伝子のいずれかを欠損したものであってよい。例えば、Ｍ、Ｆ、またはＨＮ遺伝子、あるいはそれらの組み合わせが含まれていないパラミクソウイルスベクターも、本発明のパラミクソウイルスベクターとして好適に用いることができる。このようなウイルスベクターの再構成は、例えば、欠損している遺伝子産物を外来的に供給することにより行うことができる。このようにして製造されたウイルスベクターは、野生型ウイルスと同様に宿主細胞に接着して細胞融合を起こすが、細胞に導入されたベクターゲノムはウイルス遺伝子に欠損を有するため、最初と同じような感染力を持つ娘ウイルス粒子は形成されない。このため、一回限りの遺伝子導入力を持つ安全なウイルスベクターとして有用である。ゲノムから欠損させる遺伝子としては、例えばＦ遺伝子および／またはＨＮ遺伝子が挙げられる。例えば、Ｆ遺伝子が欠損した組み換えパラミクソウイルスベクターゲノムを発現するプラスミドを、Ｆ蛋白質の発現ベクターならびにＮＰ、Ｐ、およびＬ蛋白質の発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフェクションすることにより、ウイルスベクターの再構成を行うことができる（ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０；Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（１４）６５６４−６５６９（２０００））。また、例えば、Ｆ遺伝子が染色体に組み込まれた宿主細胞を用いてウイルスを製造することもできる。これらの蛋白質群は、そのアミノ酸配列はウイルス由来の配列そのままでなくとも、核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異を導入したり、あるいは他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよい。
また、本発明のウイルスベクターとして、ベクターゲノムが由来するウイルスのエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をエンベロープに含むベクターを作製することもできる。例えば、ウイルス再構成の際に、ベクターのベースとなるウイルスのゲノムがコードするエンベロープ蛋白質以外のエンベロープ蛋白質を細胞で発現させることにより、所望のエンベロープ蛋白質を有するウイルスベクターを製造することができる。このような蛋白質に特に制限はない。例えば、他のウイルスのエンベロープ蛋白質、例えば水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧ蛋白質（ＶＳＶ−Ｇ）を挙げることができる。本発明のウイルスベクターには、ＶＳＶ−Ｇ蛋白質などのように、ゲノムが由来するウイルス以外のウイルスに由来するエンベロープ蛋白質を含むシュードタイプウイルスベクターが含まれる。ウイルスのゲノムＲＮＡにはこれらのエンベロープ蛋白質をゲノムにコードされないように設計すれば、ウイルス粒子が細胞に感染した後は、ウイルスベクターからこの蛋白質が発現されることはない。
また、本発明のウイルスベクターは、例えば、エンベロープ表面に特定の細胞に接着しうるような接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質、抗体またはその断片、あるいはこれらの蛋白質を細胞外領域に有し、ウイルスエンベロープ由来のポリペプチドを細胞内領域に有するキメラ蛋白質などを含むものであってもよい。これにより、ベクターのＴ細胞への特異性を制御し得る。これらはウイルスゲノムにコードされていてもよいし、ウイルスベクターの再構成時に、ウイルスゲノム以外の遺伝子（例えば別の発現ベクターまたは宿主染色体上などにある遺伝子）の発現により供給されてもよい。
また本発明のベクターは、例えばウイルス蛋白質による免疫原性を低下させるために、またはＲＮＡの転写効率または複製効率を高めるために、ベクターに含まれる任意のウイルス遺伝子が野生型遺伝子から改変されていてよい。具体的には、例えばパラミクソウイルスベクターにおいては、複製因子であるＮ、Ｐ、およびＬ遺伝子の中の少なくとも一つを改変し、転写または複製の機能を高めることが考えられる。また、エンベロープ蛋白質の１つであるＨＮ蛋白質は、赤血球凝集素であるヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）活性とノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）活性との両者の活性を有するが、例えば前者の活性を弱めることができれば、血液中でのウイルスの安定性を向上させることが可能であろうし、例えば後者の活性を改変することにより、感染能を調節することも可能である。また、Ｆ蛋白質を改変することにより膜融合能を調節することもできる。また、例えば、細胞表面の抗原分子となりうるＦ蛋白質またはＨＮ蛋白質の抗原提示エピトープ等を解析し、これを利用してこれらの蛋白質に関する抗原提示能を弱めたウイルスベクターを作製することもできる。
また本発明のベクターにおいては、アクセサリー遺伝子が欠損したものであってよい。例えばＳｅＶのアクセサリー遺伝子の１つであるＶ遺伝子をノックアウトすることにより、培養細胞における遺伝子発現および複製は障害されることなく、マウス等の宿主に対するＳｅＶの病原性が顕著に減少する（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：７２６６−７２７２；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ Ｊ．１６：５７８−５８７；Ｃｕｒｒａｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ＷＯ０１／０４２７２，ＥＰ１０６７１７９）。このような弱毒化ベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおける毒性のない遺伝子導入用ウイルスベクターとして特に有用である。
パラミクソウイルスは遺伝子導入ベクターとして優れており、宿主細胞の細胞質でのみ転写・複製を行い、ＤＮＡフェーズを持たないため染色体への組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）は起こらない（Ｌａｍｂ，Ｒ．Ａ．ａｎｄ Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ，Ｄ．，Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ ：Ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｆｉｅｌｄｓ ＢＮ，Ｋｎｉｐｅ ＤＭ，Ｈｏｗｌｅｙ ＰＭ，（ｅｄｓ）．Ｆｉｅｌｄｓ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．２．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６，ｐｐ．１１７７−１２０４）。このため染色体異常による癌化および不死化などの安全面における問題が生じない。パラミクソウイルスのこの特徴は、ベクター化した時の安全性に大きく寄与している。異種遺伝子発現の結果では、例えばセンダイウイルス（ＳｅＶ）を連続多代継代しても殆ど塩基の変異が認められず、ゲノムの安定性が高く、挿入異種遺伝子を長期間に渡って安定に発現する事が示されている（Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ ２，４５７−４６６（１９９７））。また、カプシド構造蛋白質を持たないことによる導入遺伝子のサイズまたはパッケージングの柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）など性質上のメリットがある。このように、パラミクソウイルスベクターは、ヒトの遺伝子治療のための高効率ベクターの新しいクラスとなることが示唆される。複製能を有するＳｅＶベクターは、外来遺伝子を少なくとも４ｋｂまで導入可能であり、転写ユニットを付加することによって２種類以上の遺伝子を同時に発現する事も可能である。
またセンダイウイルスは、齧歯類にとっては病原性で肺炎を生じることが知られているが、人に対しては病原性がない。これはまた、野生型センダイウイルスの経鼻的投与によって非ヒト霊長類において重篤な有害作用を示さないというこれまでの報告によっても支持されている（Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １５：５３３−５４０，１９９７）。センダイウイルスのこれらの特徴は、センダイウイルスベクターが、ヒトの治療へ応用できることを示唆し、センダイウイルスベクターが、ヒトＴ細胞を標的とした遺伝子治療の有望な選択肢の一つとなることを結論づけるものである。
本発明のウイルスベクターは、ゲノムＲＮＡ中に外来遺伝子をコードし得る。外来遺伝子を含む組換えパラミクソウイルスベクターは、上記のパラミクソウイルスベクターゲノムに外来遺伝子を挿入することによって得られる。外来遺伝子としては、標的とするＴ細胞において発現させたい所望の遺伝子を用いることができる。外来遺伝子は天然型蛋白質をコードする遺伝子であってもよく、あるいは欠失、置換または挿入により天然型蛋白質を改変した蛋白質をコードする遺伝子であってもよい。外来遺伝子の挿入位置は、例えばウイルスゲノムの蛋白質非コード領域の所望の部位を選択することができ、例えばゲノムＲＮＡの３’リーダー領域と３’端に最も近いウイルス蛋白質ＯＲＦとの間、各ウイルス蛋白質ＯＲＦの間、および／または５’端に最も近いウイルス蛋白質ＯＲＦと５’トレイラー領域の間に挿入することができる。また、ＦまたはＨＮ遺伝子などを欠失するゲノムでは、その欠失領域に外来遺伝子をコードする核酸を挿入することができる。パラミクソウイルスに外来遺伝子を導入する場合は、ゲノムへの挿入断片のポリヌクレオチドの鎖長が６の倍数となるように挿入することが望ましい（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．８，４８２２−４８３０，１９９３）。挿入した外来遺伝子とウイルスＯＲＦとの間には、Ｅ−Ｉ−Ｓ配列が構成されるようにする。Ｅ−Ｉ−Ｓ配列を介して２またはそれ以上の遺伝子をタンデムに並べて挿入することができる。
ベクターに搭載する外来遺伝子の発現レベルは、その遺伝子の上流（ネガティブ鎖の３’側）に付加する転写開始配列の種類により調節することができる（ＷＯ０１／１８２２３）。また、ゲノム上の外来遺伝子の挿入位置によって制御することができ、ネガティブ鎖の３’の近くに挿入するほど発現レベルが高く、５’の近くに挿入するほど発現レベルが低くなる。このように、外来遺伝子の挿入位置は、該遺伝子の所望の発現量を得るために、また前後のウイルス蛋白質をコードする遺伝子との組み合わせが最適となる様に適宜調節することができる。一般に、外来遺伝子の高い発現が得られることが有利と考えられるため、外来遺伝子は、効率の高い転写開始配列に連結し、ネガティブ鎖ゲノムの３’端近くに挿入することが好ましい。具体的には、３’リーダー領域と３’に最も近いウイルス蛋白質ＯＲＦとの間に挿入される。あるいは、３’に一番近いウイルス遺伝子と２番目の遺伝子のＯＲＦの間に挿入してもよい。野生型パラミクソウイルスにおいては、ゲノムの３’に最も近いウイルス蛋白質遺伝子はＮ遺伝子であり、２番目の遺伝子はＰ遺伝子である。逆に、導入遺伝子の高発現が望ましくない場合は、例えばベクターにおける外来遺伝子の挿入位置をネガティブ鎖のなるべく５’側に設定したり、転写開始配列を効率の低いものにするなどして、ウイルスベクターからの発現レベルを低く抑えることで適切な効果が得られるようにすることも可能である。
本発明のベクターを製造するには、哺乳動物細胞においてパラミクソウイルスの成分であるＲＮＰの再構成に必要なウイルス蛋白質、すなわちＮ、Ｐ、およびＬ蛋白質の存在下、パラミクソウイルスのゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡを転写させる。転写によりネガティブ鎖ゲノム（すなわちウイルスゲノムと同じアンチセンス鎖）を生成させてもよく、あるいはポジティブ鎖（ウイルス蛋白質をコードするセンス鎖）を生成させても、ウイルスＲＮＰを再構成することができる。ベクターの再構成効率を高めるには、好ましくはポジティブ鎖を生成させる。ＲＮＡ末端は、天然のウイルスゲノムと同様に３’リーダー配列と５’トレイラー配列の末端をなるべく正確に反映させることが好ましい。転写産物の５’端を正確に制御するためには、例えば転写開始部位としてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ認識配列を利用し、該ＲＮＡポリメラーゼを細胞内で発現させればよい。転写産物の３’端を制御するには、例えば転写産物の３’端に自己切断型リボザイムをコードさせておき、このリボザイムにより正確に３’端が切り出されるようにすることができる（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ Ｊ．１６：５７８−５８７及びＹｕ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ ２：４５７−４６６）。
例えば外来遺伝子を有する組み換えセンダイウイルスベクターは、Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ Ｊ．１６：５７８−５８７及びＹｕ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ ２：４５７−４６６の記載等に準じて、次のようにして構築することができる。
まず、目的の外来遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ試料を用意する。ＤＮＡ試料は、２５ｎｇ／μｌ以上の濃度で電気泳動的に単一のプラスミドと確認できることが好ましい。以下、ＮｏｔＩ部位を利用してウイルスゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡに外来遺伝子を挿入する場合を例にとって説明する。目的とするｃＤＮＡ塩基配列の中にＮｏｔＩ認識部位が含まれる場合は、部位特異的変異導入法などを用いて、コードするアミノ酸配列を変化させないように塩基配列を改変し、ＮｏｔＩ部位を予め除去しておくことが好ましい。この試料から目的の遺伝子断片をＰＣＲにより増幅し回収する。２つのプライマーの５’部分にＮｏｔＩ部位を付加しておくことにより、増幅された断片の両端をＮｏｔＩ部位とする。ウイルスゲノム上に挿入された後の外来遺伝子のＯＲＦとその両側のウイルス遺伝子のＯＲＦとの間にＥ−Ｉ−Ｓ配列が配置されるように、プライマー中にＥ−Ｉ−Ｓ配列を含めるように設計する。
例えば、フォワード側合成ＤＮＡ配列は、ＮｏｔＩによる切断を保証するために５’側に任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはＧＣＧおよびＧＣＣなどのＮｏｔＩ認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはＡＣＴＴ）を選択し、その３’側にＮｏｔＩ認識部位ｇｃｇｇｃｃｇｃを付加し、さらにその３’側にスペーサー配列として任意の９塩基または９に６の倍数を加えた数の塩基を付加し、さらにその３’側に所望のｃＤＮＡの開始コドンＡＴＧからこれを含めてＯＲＦの約２５塩基相当の配列を付加した形態とする。最後の塩基はＧまたはＣとなるように該所望のｃＤＮＡから約２５塩基を選択してフォワード側合成オリゴＤＮＡの３’の末端とすることが好ましい。
リバース側合成ＤＮＡ配列は５’側から任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはＧＣＧおよびＧＣＣなどのＮｏｔＩ認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはＡＣＴＴ）を選択し、その３’側にＮｏｔＩ認識部位ｇｃｇｇｃｃｇｃを付加し、さらにその３’側に長さを調節するための挿入断片のオリゴＤＮＡを付加する。このオリゴＤＮＡの長さは、最終的なＰＣＲ増幅産物のＮｏｔＩ断片の鎖長が６の倍数になるように塩基数を設計する（いわゆる「６のルール（ｒｕｌｅ ｏｆ ｓｉｘ）」；Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８９１−８９９，１９９８；Ｃａｌａｉｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４８２２−４８３０，１９９３；Ｃａｌａｉｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４８２２−４８３０，１９９３）。このプライマーにＥ−Ｉ−Ｓ配列を付加する場合には、挿入断片のオリゴＤＮＡの３’側にセンダイウイルスのＳ配列、Ｉ配列、およびＥ配列の相補鎖配列、好ましくはそれぞれ５’−ＣＴＴＴＣＡＣＣＣＴ−３’（配列番号：１）、５’−ＡＡＧ−３’、および５’−ＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＡＣＧＧ−３’（配列番号：２）を付加し、さらにその３’側に所望のｃＤＮＡ配列の終始コドンから逆に数えて約２５塩基相当の相補鎖の最後の塩基がＧまたはＣになるように長さを選択して配列を付加し、リバース側合成ＤＮＡの３’の末端とする。
ＰＣＲは、Ｔａｑポリメラーゼまたはその他のＤＮＡポリメラーゼを用いる通常の方法を用いることができる。増幅した目的断片はＮｏｔＩで消化した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等のプラスミドベクターのＮｏｔＩ部位に挿入する。得られたＰＣＲ産物の塩基配列をシークエンサーで確認し、正しい配列のプラスミドを選択する。このプラスミドから挿入断片をＮｏｔＩで切り出し、ゲノムｃＤＮＡを含むプラスミドのＮｏｔＩ部位にクローニングする。またプラスミドベクターを介さずにゲノムｃＤＮＡのＮｏｔＩ部位に直接挿入し、組み換えセンダイウイルスｃＤＮＡを得ることも可能である。
例えば、組み換えセンダイウイルスゲノムｃＤＮＡであれば、文献記載の方法に準じて構築することができる（Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ ２：４５７−４６６，１９９７；Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７）。例えば、ＮｏｔＩ制限部位を有する１８ｂｐのスペーサー配列（５’−（Ｇ）−ＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＧ−３’）（配列番号：３）を、クローニングされたセンダイウイルスゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ（＋））のリーダー配列とＮ蛋白質のＯＲＦとの間に挿入し、デルタ肝炎ウイルスのアンチゲノム鎖（ａｎｔｉｇｅｎｏｍｉｃ ｓｔｒａｎｄ）由来の自己開裂リボザイム部位を含むプラスミドｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）を得る（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：２８１３−２８２０）。ｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）のＮｏｔＩ部位に外来遺伝子断片を挿入し、所望の外来遺伝子が組み込まれた組み換えセンダイウイルスｃＤＮＡを得ることができる。
このようにして作製した組み換えパラミクソウイルスのゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡを、上記のウイルス蛋白質（Ｌ、Ｐ、およびＮ）存在下で細胞内で転写させることにより、本発明のベクターを再構成することができる。本発明は、本発明のベクターの製造のための、本発明のベクターのウイルスゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡを提供する。また本発明は、本発明のベクターの製造に適用するための、該ベクターのゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡの使用に関する。組み換えウイルスの再構成は公知の方法を利用して行うことができる（ＷＯ９７／１６５３９；ＷＯ９７／１６５３８；Ｄｕｒｂｉｎ，Ａ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３５：３２３−３３２；Ｗｈｅｌａｎ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：８３８８−８３９２；Ｓｃｈｎｅｌｌ．Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ Ｊ．１３：４１９５−４２０３；Ｒａｄｅｃｋｅ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ Ｊ．１４：５７７３−５７８４；Ｌａｗｓｏｎ，Ｎ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：４４７７−４４８１；Ｇａｒｃｉｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ Ｊ．１４：６０８７−６０９４；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：５６９−５７９；Ｂａｒｏｎ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｔ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２６５−１２７１；Ｂｒｉｄｇｅｎ，Ａ．ａｎｄ Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｒ．Ｍ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１５４００−１５４０４）。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、リンダーペストウイルス、センダイウイルスなどを含むマイナス鎖ＲＮＡウイルスをＤＮＡから再構成させることができる。これらの方法に準じて、本発明のベクターを再構成させることができる。ウイルスベクターＤＮＡにおいて、Ｆ遺伝子、ＨＮ遺伝子、および／またはＭ遺伝子を欠失させた場合には、そのままでは感染性のウイルス粒子を形成しないが、宿主細胞に、これら欠失させた遺伝子および／または他のウイルスのエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子などを別途、細胞に導入し発現させることにより、感染性のウイルス粒子を形成させることが可能である。
具体的な手順は、（ａ）パラミクソウイルスゲノムＲＮＡ（ネガティブ鎖ＲＮＡ）またはその相補鎖（ポジティブ鎖）をコードするｃＤＮＡを、Ｎ、Ｐ、およびＬ蛋白質を発現する細胞で転写させる工程、（ｂ）生成したパラミクソウイルスを含む培養上清を回収する工程、により製造することができる。転写のために、ゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡは適当なプロモーターの下流に連結される。転写されたゲノムＲＮＡはＮ、Ｌ、およびＰ蛋白質の存在下で複製されＲＮＰ複合体を形成する。そしてＭ、ＨＮ、およびＦ蛋白質の存在下でエンベロープに包まれたウイルス粒子が形成される。ゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えばＴ７プロモーターの下流に連結させ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡに転写させる。プロモーターとしては、Ｔ７ポリメラーゼの認識配列を含むもの以外にも所望のプロモーターを利用することができる。あるいは、インビトロで転写させたＲＮＡを細胞にトランスフェクトしてもよい。
ＤＮＡからのゲノムＲＮＡの最初の転写に必要なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ等の酵素は、これを発現するプラスミドまたはウイルスベクターの導入によって供給することができるし、または、例えば細胞の染色体にＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を、発現を誘導できるように組み込んでおき、ウイルス再構成時に発現を誘導することにより供給することもできる。またゲノムＲＮＡ、およびベクター再構成に必要なウイルス蛋白質は、例えばこれらを発現するプラスミドの導入によって供給する。これらのウイルス蛋白質の供給において、野生型またはある種の変異パラミクソウイルスなどのヘルパーウイルスを用いる。
ゲノムＲＮＡを発現するＤＮＡを細胞内に導入する方法には、例えば次のような方法、▲１▼目的の細胞が取り込めるようなＤＮＡ沈殿物を作る方法、▲２▼目的の細胞による取りこみに適し、かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つＤＮＡを含む複合体を作る方法、▲３▼目的の細胞膜に、ＤＮＡ分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスによって瞬間的に開ける方法などがある。
▲２▼としては、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、ＤＯＴＭＡ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ ＃３０１３０５）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＥＲ（Ｒｏｃｈｅ ＃１８１１１６９）などが挙げられる。▲１▼としては例えばリン酸カルシウムを用いたトランスフェクション法が挙げられ、この方法によって細胞内に入ったＤＮＡは貧食小胞に取り込まれるが、核内にも十分な量のＤＮＡが入ることが知られている（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ，Ｊ．，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６；Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ａｎｄ Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，Ｓ．，１９７７，Ｃｅｌｌ １１：２２３）。ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａはトランスファー技術の最適化を検討し、１）細胞と共沈殿物のインキュベーション条件を２〜４％ＣＯ２、３５℃、１５〜２４時間、２）ＤＮＡは直鎖状より環状のものが活性が高く、３）沈殿混液中のＤＮＡ濃度が２０〜３０μｇ／ｍｌのとき最適な沈殿が得られると報告している（Ｃｈｅｎ，Ｃ．ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５）。▲２▼の方法は、一過的なトランスフェクションに適している。古くはＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ ＃Ｄ−９８８５ Ｍ．Ｗ．５×１０５）混液を所望のＤＮＡ濃度比で調製し、トランスフェクションを行う方法が知られている。複合体の多くはエンドソームの中で分解されてしまうため、効果を高めるためにクロロキンを加えることもできる（Ｃａｌｏｓ，Ｍ．Ｐ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：３０１５）。▲３▼の方法は電気穿孔法と呼ばれる方法で、細胞選択性がないという点で▲１▼または▲２▼の方法に比べて汎用性が高い。効率はパルス電流の持続時間、パルスの形、電界（電極間のギャップ、電圧）の強さ、バッファーの導電率、ＤＮＡ濃度、細胞密度の最適条件下で良いとされている。
以上、３つのカテゴリーの中で▲２▼の方法は操作が簡便で多量の細胞を用いて多数の検体を検討することができるので、ベクター再構成のためのＤＮＡの細胞への導入には、トランスフェクション試薬が適している。好適にはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃａｔ Ｎｏ．３０１３０５）、またはＤＯＳＰＥＲ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ Ｎｏ．１８１１１６９）が用いられるが、これらに制限されない。
ｃＤＮＡからのウイルスの再構成は具体的には例えば以下のようにして行うことができる。
２４穴から６穴程度のプラスチックプレートまたは１００ｍｍペトリ皿等で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および抗生物質（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンＧおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を含む最少必須培地（ＭＥＭ）を用いてサル腎臓由来細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２をほぼ１００％コンフルエントになるまで培養し、例えば１μｇ／ｍｌ ｐｓｏｒａｌｅｎ（ソラレン）存在下、紫外線（ＵＶ）照射処理を２０分処理で不活化した、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルスｖＴＦ７−３（Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８１２２−８１２６，１９８６、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：５６９−５７９，１９９６）を２ ＰＦＵ／細胞で感染させる。ソラレンの添加量およびＵＶ照射時間は適宜調整することができる。感染１時間後、２〜６０μｇ、より好ましくは３〜２０μｇの組換えセンダイウイルスのゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡを、ウイルスＲＮＰの生成に必須なトランスに作用するウイルス蛋白質を発現するプラスミド（０．５〜２４μｇのｐＧＥＭ−Ｎ、０．２５〜１２μｇのｐＧＥＭ−Ｐ、および０．５〜２４μｇのｐＧＥＭ−Ｌ）（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：５６９−５７９，１９９６）と共にＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いたリポフェクション法等によりトランスフェクションする。Ｎ、Ｐ、およびＬをコードする発現ベクターの量比は例えば２：１：２とすることが好ましく、プラスミド量は、例えば１〜４μｇのｐＧＥＭ−Ｎ、０．５〜２μｇのｐＧＥＭ−Ｐ、および１〜４μｇのｐＧＥＭ−Ｌ程度で適宜調整する。
トランスフェクションを行った細胞は、所望により１００μｇ／ｍｌのリファンピシン（Ｓｉｇｍａ）及びシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、より好ましくは４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）（Ｓｉｇｍａ）のみを含む血清不含のＭＥＭで培養し、ワクシニアウイルスによる細胞毒性を最少にとどめ、ウイルスの回収率を最大にするように薬剤の最適濃度を設定する（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：５６９−５７９）。トランスフェクションから４８〜７２時間程度培養後、細胞を回収し、凍結融解を３回繰り返して細胞を破砕した後、ＲＮＰを含む破砕物をＬＬＣ−ＭＫ２細胞に再度トランスフェクションして培養する。または、培養上清を回収し、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞の培養液に添加して感染させ培養する。トランスフェクションは、例えばリポフェクトアミンまたはポリカチオニックリポソームなどと共に複合体を形成させて細胞に導入することが可能である。具体的には、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、ＤＯＴＭＡ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ ＃３０１３０５）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＥＲ（Ｒｏｃｈｅ ＃１８１１１６９）などが挙げられる。エンドソーム中での分解を防ぐため、クロロキンを加えることもできる（Ｃａｌｏｓ，Ｍ．Ｐ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：３０１５）。ＲＮＰが導入された細胞では、ＲＮＰからのウイルス遺伝子の発現およびＲＮＰの複製の過程が進行しベクターが増幅する。得られたウイルス溶液を希釈（例えば１０６倍）して再増幅を繰り返すことにより、ワクシニアウイルスｖＴＦ７−３は完全に除去することができる。再増幅は、例えば３回以上繰り返す。得られたベクターは−８０℃で保存することができる。エンベロープ蛋白質をコードする遺伝子を欠損した複製能を持たないウイルスベクターを再構成させるには、エンベロープ蛋白質を発現するＬＬＣ−ＭＫ２細胞をトランスフェクションに使用するか、またはエンベロープ発現プラスミドを共にトランスフェクションすればよい。また、トランスフェクションを行った細胞にエンベロープ蛋白質を発現するＬＬＣ−ＭＫ２細胞を重層して培養することによって欠損型ウイルスベクターを増幅することもできる（国際公開番号ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０参照）。
回収されたウイルスの力価は、例えばＣＩＵ（Ｃｅｌｌ−Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｕｎｉｔ）測定または赤血球凝集活性（ＨＡ）の測定することにより決定することができる（ＷＯ００／７００７０；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：５６９−５７９；Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．＆ Ｋａｎｅｄａ，Ｙ．，Ｈｅｍａｇｇｕｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｊａｐａｎ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ．Ｅｄ．ｂｙ Ｂａｋｅｒ ＡＨ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ：ｐｐ．２９５−３０６，１９９９）。また、ＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）などのマーカー遺伝子を搭載したベクターについては、マーカーを指標に直接的に感染細胞をカウントすることにより力価を定量することができる（例えばＧＦＰ−ＣＩＵとして）。このようにして測定した力価は、ＣＩＵと同等に扱うことができる（ＷＯ００／７００７０）。
ウイルスベクターが再構成する限り、再構成に用いる宿主細胞は特に制限されない。例えば、センダイウイルスベクター等の再構成においては、サル腎由来のＬＬＣＭＫ２細胞およびＣＶ−１細胞、ハムスター腎由来のＢＨＫ細胞などの培養細胞、ヒト由来細胞等を使うことができる。これらの細胞に適当なエンベロープ蛋白質を発現させることで、そのエンベロープを有する感染性ウイルス粒子を得ることもできる。また、大量にセンダイウイルスベクターを得るために、上記の宿主から得られたウイルスベクターを発育鶏卵に感染させ、該ベクターを増幅することができる。鶏卵を使ったウイルスベクターの製造方法は既に開発されている（中西ら編，（１９９３），「神経科学研究の先端技術プロトコールＩＩＩ，分子神経細胞生理学」，厚生社，大阪，ｐｐ．１５３−１７２）。具体的には、例えば、受精卵を培養器に入れ９〜１２日間３７〜３８℃で培養し、胚を成長させる。ウイルスベクターを尿膜腔へ接種し、数日間（例えば３日間）卵を培養してウイルスベクターを増殖させる。培養期間等の条件は、使用する組み換えセンダイウイルスにより変わり得る。その後、ウイルスを含んだ尿液を回収する。尿液からのセンダイウイルスベクターの分離・精製は常法に従って行うことができる（田代眞人，「ウイルス実験プロトコール」，永井、石浜監修，メジカルビュー社，ｐｐ．６８−７３，（１９９５））。
例えば、Ｆ遺伝子を欠失したセンダイウイルスベクターの構築と調製は、以下のように行うことができる（ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０参照）。
〈１〉Ｆ遺伝子欠失型センダイウイルスゲノムｃＤＮＡおよびＦ発現プラスミドの構築
センダイウイルス（ＳｅＶ）全長ゲノムｃＤＮＡ、ｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：２８１３−２８２０）（「ｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）」は「ｐＳｅＶ１８１＋」ともいう）のｃＤＮＡをＳｐｈＩ／ＫｐｎＩで消化してフラグメント（１４６７３ｂｐ）を回収し、ｐＵＣ１８にクローニングしてプラスミドｐＵＣ１８／ＫＳとする。Ｆ遺伝子欠損部位の構築はこのｐＵＣ１８／ＫＳ上で行う。Ｆ遺伝子の欠損は、ＰＣＲ−ライゲーション方法の組み合わせで行い、結果としてＦ遺伝子のＯＲＦ（ＡＴＧ−ＴＧＡ＝１６９８ｂｐ）を除いて例えばａｔｇｃａｔｇｃｃｇｇｃａｇａｔｇａ（配列番号：４）で連結し、Ｆ遺伝子欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ）を構築する。ＰＣＲは、Ｆの上流には［ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ｇｔｔｇａｇｔａｃｔｇｃａａｇａｇｃ／配列番号：５，ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ｔｔｔｇｃｃｇｇｃａｔｇｃａｔｇｔｔｔｃｃｃａａｇｇｇｇａｇａｇｔｔｔｔｇｃａａｃｃ／配列番号：６］、Ｆ遺伝子の下流には［ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ａｔｇｃａｔｇｃｃｇｇｃａｇａｔｇａ／配列番号：７，ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ｔｇｇｇｔｇａａｔｇａｇａｇａａｔｃａｇｃ／配列番号：８］のプライマー対を用いたＰＣＲの産物をＥｃｏＴ２２Ｉで連結する。このように得られたプラスミドをＳａｃＩとＳａｌＩで消化して、Ｆ遺伝子欠損部位を含む領域の断片（４９３１ｂｐ）を回収してｐＵＣ１８にクローニングし、ｐＵＣ１８／ｄＦＳＳとする。このｐＵＣ１８／ｄＦＳＳをＤｒａＩＩＩで消化して、断片を回収してｐＳｅＶ１８＋のＦ遺伝子を含む領域のＤｒａＩＩＩ断片と置き換え、ライゲーションしてプラスミドｐＳｅＶ１８＋／ΔＦを得る。
外来遺伝子は、例えばｐＵＣ１８／ｄＦＳＳのＦ遺伝子欠失部位にある制限酵素ＮｓｉＩおよびＮｇｏ ＭＩＶ部位に挿入する。このためには、例えば外来遺伝子断片を、ＮｓｉＩ−ｔａｉｌｅｄプライマーおよびＮｇｏ ＭＩＶ−ｔａｉｌｅｄプライマーで増幅すればよい。
〈２〉ＳｅＶ−Ｆ蛋白を誘導発現するヘルパー細胞の作製
センダイウイルスのＦ遺伝子（ＳｅＶ−Ｆ）を発現するＣｒｅ／ｌｏｘＰ誘導型発現プラスミドの構築はＳｅＶ−Ｆ遺伝子をＰＣＲで増幅し、Ｃｒｅ ＤＮＡリコンビナーゼにより遺伝子産物が誘導発現されるように設計されたプラスミドｐＣＡＬＮｄｌｗ（Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２，１９９８，ｐ１１１５−１１２１）のユニークサイトＳｗａＩ部位に挿入し、プラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆを構築する。
Ｆ遺伝子欠損ゲノムから感染ウイルス粒子を回収するため、ＳｅＶ−Ｆ蛋白を発現するヘルパー細胞株を樹立する。細胞は、例えばＳｅＶの増殖によく用いられているサル腎臓由来細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を用いることができる。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞は、１０％の熱処理した不動化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリンＧナトリウム５０単位／ｍｌ、およびストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを添加したＭＥＭで３７℃、５％ＣＯ２で培養する。ＳｅＶ−Ｆ遺伝子産物は細胞傷害性を有するため、Ｃｒｅ ＤＮＡリコンビナーゼによりＦ遺伝子産物を誘導発現されるように設計された上記プラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆを、リン酸カルシウム法（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））により、周知のプロトコールに従ってＬＬＣ−ＭＫ２細胞に遺伝子導入を行う。
１０ｃｍプレートを用い、４０％コンフルエントまで生育したＬＬＣ−ＭＫ２細胞に１０μｇのプラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆを導入後、１０ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター中で２４時間培養する。２４時間後に細胞をはがし、１０ｍｌ培地に懸濁後、１０ｃｍシャーレ５枚を用い、５ｍｌ １枚、２ｍｌ ２枚、０．２ｍｌ ２枚に蒔き、Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を１２００μｇ／ｍｌを含む１０ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて培養を行い、２日毎に培地交換しながら、１４日間培養し、遺伝子の安定導入株の選択を行う。該培地により生育してきたＧ４１８に耐性を示す細胞はクローニングリングを用いて回収する。回収した各クローンは１０ｃｍプレートでコンフルエントになるまで拡大培養を続ける。
Ｆ蛋白質の発現誘導は、細胞を６ｃｍシャーレにてコンフルエントまで生育させた後、アデノウイルスＡｘＣＡＮＣｒｅを斉藤らの方法（Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３８１６−３８２１（１９９５）；Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７２，１１１５−１１２１（１９９８））により例えばｍｏｉ＝３で感染させて行う。
〈３〉Ｆ遺伝子欠失ＳｅＶウイルスの再構築及び増幅
上記ｐＳｅＶ１８＋／ΔＦの外来遺伝子が挿入されたプラスミドを以下のようにしてＬＬＣ−ＭＫ２細胞にトランスフェクションする。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで１００ｍｍのシャーレに播く。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによりゲノムＲＮＡの転写を行わせる場合には、細胞培養２４時間後、ソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）と長波長紫外線（３６５ｎｍ）で２０分間処理したＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウイルス（ＰＬＷＵＶ−ＶａｃＴ７：Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３，８１２２−８１２６（１９８６））をＭＯＩ ２程度で室温で１時間感染させる。ワクシニアウイルスへの紫外線照射には、例えば１５ワットバルブを５本が装備されたＵＶ Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（カタログ番号４００６７６（１００Ｖ），ストラタジーン社，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いることができる。細胞を無血清のＭＥＭで洗浄した後、ゲノムＲＮＡを発現するプラスミド、およびパラミクソウイルスのそれぞれＮ、Ｐ、Ｌ、Ｆ、およびＨＮ蛋白質を発現する発現プラスミドを、適当なリポフェクション試薬を用いてこの細胞にトランスフェクトする。プラスミドの量比は、これに限定されないが、好適には順に６：２：１：２：２：２とすることができる。例えば、１２μｇのゲノムＲＮＡを発現するプラスミド、並びにＮ、Ｐ、Ｌ、およびＦプラスＨＮ蛋白質を発現する発現プラスミド（ｐＧＥＭ／ＮＰ，ｐＧＥＭ／Ｐ，ｐＧＥＭ／Ｌ及びｐＧＥＭ／Ｆ−ＨＮ；ＷＯ００／７００７０，Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １，５６９−５７９（１９９６））を、それぞれ１２μｇ，４μｇ，２μｇ，４μｇ及び４μｇ／ｄｉｓｈの量比トランスフェクトする。数時間培養後、血清を含まないＭＥＭで細胞を２回洗浄し、４０μｇ／ｍＬのＣｙｔｏｓｉｎｅ β−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ（ＡｒａＣ：Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含むＭＥＭで培養する。これらの細胞を回収し、ペレットをＯｐｔｉＭＥＭに懸濁する（１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）。凍結融解を３回繰り返してｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ ＤＯＳＰＥＲ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ｍａｎｎｈｅｉｍ）と混合し（１０６ｃｅｌｌｓ／２５μｌ ＤＯＳＰＥＲ）室温で１５分放置した後、上記でクローニングしたＦ発現ヘルパー細胞にトランスフェクション（１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ １２−ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅ）し、血清を含まないＭＥＭ（４０μｇ／ｍｌ ＡｒａＣ，７．５μｇ／ｍｌトリプシンを含む）で培養し、上清を回収する。Ｆ以外の遺伝子、例えばＨＮまたはＭ遺伝子を欠損したウイルスも、これと同様の方法で調製することができる。
ウイルス遺伝子欠損型ベクターを調製する場合、例えば、ベクターに含まれるウイルスゲノム上で欠損しているウイルス遺伝子が異なる２種またはそれ以上のベクターを同じ細胞に導入すれば、それぞれで欠損するウイルス蛋白質が、他のベクターからの発現により供給されるため、互いに相補しあって感染力のあるウイルス粒子が形成され、複製サイクルがまわりウイルスベクターが増幅される。すなわち、２種またはそれ以上の本発明のベクターを、ウイルス蛋白質を相補する組み合わせで接種すれば、それぞれのウイルス遺伝子欠損型ウイルスベクターの混合物を大量かつ低コストで生産することができる。これらのウイルスは、ウイルス遺伝子が欠損しているため、ウイルス遺伝子を欠損していないウイルスに比べゲノムサイズが小さくなりサイズの大きい外来遺伝子を保持することができる。また、ウイルス遺伝子の欠損により増殖性がないこれらのウイルスは細胞外で希釈され共感染の維持が困難であることから、不稔化するため、環境放出管理上の利点がある。
本発明のパラミクソウイルスにより導入する外来遺伝子としては、特に制限はないが、天然の蛋白質としては、例えばホルモン、サイトカイン、増殖因子、受容体、細胞内シグナル分子、酵素、ペプチドなどが挙げられる。蛋白質は分泌蛋白質、膜蛋白質、細胞質蛋白質、核蛋白質などであり得る。人工的な蛋白質としては、例えば、キメラ毒素などの融合蛋白質、ドミナントネガティブ蛋白質（受容体の可溶性分子または膜結合型ドミナントネガティブ受容体を含む）、欠失型の細胞接着分子および細胞表面分子などが挙げられる。また、分泌シグナル、膜局在化シグナル、核移行シグナル等を付加した蛋白質であってもよい。導入遺伝子としてアンチセンスＲＮＡ分子またはＲＮＡ切断型リボザイムなどを発現させて、Ｔ細胞で発現する特定の遺伝子の機能を抑制することもできる。外来遺伝子として疾患の治療用遺伝子を用いてウイルスベクターを調製すれば、このベクターを投与して遺伝子治療を行うことが可能となる。本発明のウイルスベクターの遺伝子治療への応用としては、直接投与による遺伝子発現、間接（ｅｘ ｖｉｖｏ）投与による遺伝子発現のいずれの方法によっても、治療効果を期待できる外来遺伝子もしくは患者の体内で供給が不足している内在遺伝子等を発現させることが可能である。また本発明の方法は、再生医療における遺伝子治療ベクターとしても利用できる。
なお、複製性のパラミクソウイルスベクターを個体または細胞に投与後、治療が完了するなどウイルスベクターの増殖を抑止する必要が生じた際には、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤を投与すれば、宿主に障害を与えずにウイルスベクターの増殖だけを特異的に抑止することもできる。
本明細書に記載したウイルス製造方法に従えば、本発明のウイルスベクターは、例えば１×１０５ＣＩＵ／ｍＬ以上、好ましくは１×１０６ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは５×１０６ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは１×１０７ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは５×１０７ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは１×１０８ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは５×１０８ＣＩＵ／ｍＬ以上の力価でウイルス産生細胞の細胞外液中に放出させることが可能である。ウイルスの力価は、本明細書および他に記載の方法により測定することができる（Ｋｉｙｏｔａｎｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７７（１），６５−７４（１９９０）；ＷＯ００／７００７０）。
回収したパラミクソウイルスベクターは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーション（濾過）、遠心分離、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウイルスベクターが、それが存在する試料中の成分として主要な割合を占めることを言う。典型的には、実質的に純粋なウイルスベクターは、試料中に含まれる全蛋白質（但しキャリアーまたは安定剤として加えた蛋白質は除く）のうち、ウイルスベクター由来の蛋白質の割合が１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上を占めることにより確認することができる。パラミクソウイルスの具体的な精製方法としては、例えばセルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法（特公昭６２−３０７５２号公報、特公昭６２−３３８７９号公報、および特公昭６２−３０７５３号公報）、およびフコース硫酸含有多糖および／またはその分解物に吸着させる方法（ＷＯ９７／３２０１０）等を例示することができる。
ベクターを含む組成物の製造においては、ベクターは必要に応じて薬理学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わせることができる。「薬学的に許容される担体または媒体」とは、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を有意に阻害しない材料である。例えばベクターを生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または培養液などで適宜希釈して組成物とすることができる。ベクターを鶏卵で増殖させた場合等においては尿液を含んでよい。またベクターを含む組成物は、脱イオン水、５％デキストロース水溶液等の担体または媒体を含んでいてもよい。さらに、その他にも、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。また保存剤またはその他の添加剤を添加することができる。本発明のベクターを含む組成物は試薬として、および医薬として有用である。
本発明のベクターを用いたＴ細胞への遺伝子導入は、様々な疾患に対する遺伝子治療に適用することが期待される。このような遺伝子治療には、例えば、遺伝子欠損による細胞での発現の異常を補正するために、また、外来遺伝子を細胞に導入することにより新しい機能を付加させるために、あるいは、ある遺伝子に対して抑制的に働く遺伝子を導入することにより細胞における望ましくない作用を抑制するために行い得る。
本発明の方法は、例えば自己免疫疾患等において拒絶反応を抑制するために有用である。例えばアロ抗原、あるいは自己免疫疾患の原因となる主要な抗原を認識する活性化Ｔ細胞樹立株を用いて、そのＴ細胞に本発明の方法に従って抑制性サイトカイン、例えばＩＬ−１０等を強発現させることによって、生体内のＴ細胞のアロ反応を抑制、あるいは抑制性樹状細胞の誘導により、拒絶反応をコントロールできると予想される。また、本発明の方法によるＴ細胞への遺伝子導入を介した癌治療も期待される。例えば、腫瘍特異的抗原を認識するＴ細胞に血管増殖抑制遺伝子をコードするベクターを導入することにより、局所の腫瘍増殖抑制効果が期待される。あるいは脱髄疾患である多発性硬化症などの場合にはそのターゲットとなる抗原で活性化したＴ細胞を用い、ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅを幹細胞より分化させ得るＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−Ａ）などの遺伝子を導入し、局所でのｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ再生を促し、病勢のコントロールが可能と予想される（Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０００，１０７：２２６−２３２）。その他にも、抗原活性化Ｔ細胞あるいは抗原非特異的活性化Ｔ細胞（抗体またはマイトゲンを使用する活性化Ｔ細胞）を用い、遺伝子導入することにより治療効果が期待されるすべての疾患・傷害に対して、本発明の方法を適用することが可能である。
パラミクソウイルスにより導入された遺伝子の転写は、インターフェロン（ＩＦＮｓ）などの宿主由来の因子により影響を受ける（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００１，７５：３８０２−３８１０）。アロ抗原で刺激したＴ細胞株からは大量のＩＦＮが産生されることから、ＩＦＮ−γなどのＩＦＮがパラミクソウイルスベクターからの遺伝子の転写に影響を与える可能性がある（Ｂｉｒｏｎ，Ｃ．Ａ．ａｎｄ Ｓｅｎ，Ｇ．Ｃ．，Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅ．Ｉｎ：Ｆｉｅｌｄｓ ＢＮ，Ｋｎｉｐｅ ＤＭ，Ｈｏｗｌｅｙ ＰＭ，（ｅｄｓ）．Ｆｉｅｌｄｓ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．２．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６．３２１−３５１）。実際、本発明者らは、ＩＦＮ−γ受容体欠損マウスからのアロ活性化Ｔ細胞株は、３週間以上にわたってＥＧＦＰの比較的高い発現が持続することを見いだした。従って、Ｔ細胞を指向した遺伝子治療において、標的遺伝子の高いレベルの発現が必要な場合には、ＩＦＮ−γのシグナル伝達を抑制することが有効と考えられる。
ベクターの投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法、導入遺伝子等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。投与経路は適宜選択することができる。また局所あるいは全身に投与し得る。投与されるベクターは好ましくは約１０５ＣＩＵ／ｍｌから約１０１１ＣＩＵ／ｍｌ、より好ましくは約１０７ＣＩＵ／ｍｌから約１０９ＣＩＵ／ｍｌ、最も好ましくは約１×１０８ＣＩＵ／ｍｌから約５×１０８ＣＩＵ／ｍｌの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与することが好ましい。ヒトにおいては１回当たりの投与量は２×１０５ＣＩＵ〜２×１０１１ＣＩＵが好ましく、投与回数は、１回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可能であり、１日の投与回数についても同様である。ヒト以外の動物についても、例えば目的の動物とヒトとの体重比または投与標的部位の容積比（例えば平均値）で上記の投与量を換算した量を投与することができる。エクスビボ投与の場合は、体外（例えば試験管またはシャーレ内）でＴ細胞にベクターを接触させる。ＭＯＩは１〜５００の間で投与することが好ましく、より好ましくは２〜３００、さらに好ましくは３〜２００である。本発明のベクターを含む組成物の投与対象としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌなど全ての哺乳動物が含まれる。
【図面の簡単な説明】
図１は、マウスＴ細胞におけるＳｅＶによる遺伝子導入効率を示す図である。活性化またはナイーブＴ細胞における遺伝子導入効率を示す。マウスリンパ球を２．５×１０７ＰＦＵ（ＭＯＩ ６２．５）のＳｅＶ−ＥＧＦＰの存在下または非存在下で２日間培養し、細胞を回収してＡＰＣ結合抗ＣＤ３およびＰＥ結合抗ＣＤ４（上パネル）または抗ＣＤ８（下パネル）抗体で染色した。ドットプロットは、生存しているＣＤ３＋ＣＤ４＋またはＣＤ３＋ＣＤ８＋リンパ球中のそれぞれＣＤ４またはＣＤ８と、ＧＦＰの発現を示す。四分割したそれぞれの右上の隅に、ＥＧＦＰ陽性細胞の割合として遺伝子導入効率を示した。左のパネル：抗体をコートしていないウェルで細胞を培養した。中央のパネル：活性化抗体（抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体）をコートしたウェルで細胞を培養した。右のパネル：活性化抗体（抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体）をコートしたウェルで、ＳｅＶ−ＥＧＦＰなしで細胞を培養した。陰性対照として、ルシフェラーゼを発現するＳｅＶ−ｌｕｃｉと共に培養した細胞からも類似したデータを取得した。４回より多い独立した実験から、再現性のあるデータが得られた。
図２は、Ｔ細胞株へのＳｅＶによる遺伝子導入効率を示す図である。Ｔ細胞株を２．５×１０７ＰＦＵ（ＭＯＩ ６２．５）のＳｅＶ−ＥＧＦＰの存在下または非存在下で２日間培養し、細胞を回収してＡＰＣ結合抗ＣＤ３およびＰＥ結合抗ＣＤ４（上パネル）または抗ＣＤ８（下パネル）抗体で染色した。最も左のパネルのドットプロットは、ゲート（区分）された生存しているリンパ球中のＣＤ３およびＣＤ４またはＣＤ８の発現を示す。それぞれの四分割の割合が示されている。他のパネルのドットプロットはゲートされたＣＤ３陽性の生存リンパ球中のＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞のＥＧＦＰの発現を示す。左から２番目のパネルでは、細胞を照射Ｂ６スティミュレーター（刺激細胞）と共に培養した。３番目のパネルでは、細胞を照射Ｂａｌｂ／ｃスティミュレーター（刺激細胞）と共に培養した。最後のパネルでは、細胞を照射Ｂａｌｂ／ｃスティミュレーター（刺激細胞）と共にＳｅＶ−ＥＧＦＰなしで培養した。４回より多い独立した実験から、再現性のあるデータが得られた。
図３は、ナイーブＴ細胞およびＴ細胞株のアロ抗原特異的活性化における遺伝子導入効率を示す図である。ナイーブ２Ｃリンパ球（上パネル；″１ｘ″の文字）または２ＣＴ細胞株（下パネル；″３ｘ″の文字）を２．５×１０７ＰＦＵのＳｅＶ−ＥＧＦＰの存在下または非存在下で２日間培養し、細胞を回収して、ＡＰＣ結合抗ＣＤ８およびビオチン結合抗クロノタイプＴ細胞レセプターｍＡｂ（１Ｂ２）で染色し、さらにＰＥストレプトアビジンで染色した。一番左のパネルは、ゲートされた生存リンパ球中のＣＤ８＋１Ｂ２＋Ｔ細胞の割合を示す。他のパネルのドットプロットは、生存しているクロノタイプＴ細胞のＥＧＦＰの発現を示す。左から２番目のパネルでは、細胞を照射Ｂ６スティミュレーター（刺激細胞）と共に培養した。３番目のパネルでは、細胞を照射Ｂａｌｂ／ｃスティミュレーター（刺激細胞）と共に培養した。最後のパネルでは、細胞を照射Ｂａｌｂ／ｃスティミュレーター（刺激細胞）と共にＳｅＶ−ＥＧＦＰなしで培養した。２回の独立した実験から、再現性のあるデータが得られた。
図４は、ＳｅＶによる遺伝子導入におけるバイスタンダー活性化の効果を示す図である。５０μｌの２Ｃナイーブリンパ球（１×１０７／ｍｌ）および５０μｌのＢ６ナイーブリンパ球（１×１０７／ｍｌ）を、２．５×１０７ＰＦＵのＳｅＶ−ＥＧＦＰの存在下（Ｘ軸の表示が＋のもの）または非存在下（Ｘ軸の表示が−のもの）、１００μｌの照射したＢａｌｂ／ｃ（黒いバー）、Ｂ６（灰色のバー）、またはＣ３Ｈ（チェックのバー）リンパ球（１×１０７／ｍｌ）またはリンパ球なし（白のバー）で２日間刺激した。ゲートされた生存しているＣＤ８＋１Ｂ２＋Ｔ細胞からＥＧＦＰ陽性細胞の割合を得た。Ｙ軸はＥＧＦＰ陽性のクロノタイプ細胞の割合を示す。個々のデータは３連にしたウェル（ｎ＝３）の平均±標準誤差（ＳＥＭ）として示し、２回の独立した実験で類似した結果を得た。Ｃ３Ｈで刺激した２Ｃ Ｔ細胞とＢａｌｂ／ｃで刺激した２Ｃ Ｔ細胞との間には統計学的有意差（ｐ＜０．０１）があったが、Ｃ３Ｈで刺激した２Ｃ Ｔ細胞とＢ６で刺激した２Ｃ Ｔ細胞との間にはそれがなかった。統計学的有意性は一元配置分散分析法及びＦｉｓｈｅｒ’ｓ ＰＬＳＤ ｔｅｓｔを用いて決定した。
図５は、ＳｅＶ−ＥＧＦＰにより遺伝子導入されたＴ細胞のＧＦＰ発現の維持を示す図である。２Ｃ−ｔｇマウスからのＴ細胞株を、ＳｅＶ−ＥＧＦＰの存在下、Ｂ６（左カラム）またはＢａｌｂ／ｃ（右カラム）の照射したリンパ球で６日間刺激し、遺伝子導入したＴ細胞を新しい培地で洗浄後、ＳｅＶなしで、照射したＢ６またはＢａｌｂ／ｃスティミュレーターで６または７日間再刺激した。ドットプロットは生存しているクロノタイプＴ細胞中のＥＧＦＰの発現を示す。四分割の各右上の隅の数字は、ｄａｙ１３（上パネル）およびｄａｙ２０（中央パネル）におけるＥＧＦＰ陽性または陰性のクロノタイプＴ細胞の割合を示す。陰性対照として、２０日間刺激した非感染２Ｃ Ｔ細胞株からのデータを示した（下パネル）。データは２回の独立した実験の代表例である。
図６は、ヒトＴ細胞へのＳｅＶによる遺伝子導入効率を示す図である。活性化またはナイーブＴ細胞における遺伝子導入効率を示す。２００μｌのヒトリンパ球（４×１０６／ｍｌ）を２．５×１０７ＰＦＵ（ＭＯＩ ３１）のＳｅＶ−ＥＧＦＰの存在下または非存在下、２日間培養し、細胞を回収してＡＰＣ結合抗ＣＤ３およびＰＥ結合抗ＣＤ４（上パネル）または抗ＣＤ８（下パネル）抗体で染色した。ドットプロットは、生存しているＣＤ３＋ＣＤ４＋またはＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球中のそれぞれＣＤ４またはＣＤ８と、ＧＦＰの発現を示す。遺伝子導入効率は、示されているＴ細胞中のＥＧＦＰ陽性細胞の割合として示した。左のパネル：抗体をコートしていないウェルで細胞を培養した。中央のパネル：活性化抗体（抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体）をコートしたウェルで細胞を培養した。右のパネル：活性化抗体（抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体）をコートしたウェルで、ＳｅＶ−ＥＧＦＰなしで細胞を培養した。陰性対照として、ＳｅＶ−ｌｕｃｉと共に培養した細胞からも同様にデータを取得した。四分割の各右隅の数字はその集団の割合を示す。４回より多い独立した実験から、再現性のあるデータが得られた。
図７は、ヒトナイーブまたはメモリー／活性化Ｔ細胞への遺伝子導入の効率を示す図である。新しく単離したＴ細胞を抗体をコートしていないウェルでＳｅＶ−ＥＧＦＰと共に２日間培養し、細胞を回収してＡＰＣ結合抗ＣＤ６２Ｌ、ＰＥ結合抗ＣＤ３、およびビオチン化抗ＣＤ４５ＲＡ抗体で染色し、続いてストレプトアビジンＰｅｒＣＰで染色した。左のパネルで、ドットプロットはゲート（区分）された生存ＣＤ３陽性Ｔ細胞中のＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡの発現を示す。右のパネルで、ドットプロットは、ナイーブＴ細胞であるＣＤ６２ＬｈｉｇｈおよびＣＤ４５ＲＡｈｉｇｈＴ細胞中（上パネル）、またはメモリー／活性化Ｔ細胞であるその他の細胞中（下パネル）のＣＤ３およびＥＧＦＰの発現を示す。健常者ドナーからの３回の実験において再現性のあるデータが得られた。
図８は、ヒトＴ細胞株への遺伝子導入効率を示す図である。ヒトＴ細胞株を図６のようにＳｅＶ−ＥＧＦＰの存在下または非存在下、２日間培養し、図６のように解析した。ＣＤ４（上パネル）あるいはＣＤ８（下パネル）Ｔ細胞中のＥＧＦＰ発現割合を示した。左のパネル；抗体をコートしてないウェルで細胞を培養した。中央パネル；抗体（ヒト抗ＣＤ３およびヒト抗ＣＤ２８抗体）をコートしたウェルで細胞を培養した。右パネル；抗体（ヒト抗ＣＤ３およびヒト抗ＣＤ２８抗体）をコートしたウェルでＳｅＶ−ＥＧＦＰ非存在下に細胞を培養した。
図９は、ナイーブまたは活性化Ｔ細胞へのＳｅＶの侵入（ｅｎｔｒｙ）の評価を示す図である。Ｂ６リンパ球（４×１０６／ｍｌ）をＵＶで不活化したＳｅＶ−ｌｕｃｉの存在下（白および灰色のバー）または非存在下（黒のバー）で３０分３７℃でインキュベートした後、細胞をよく洗浄し、ＳｅＶ−ＥＧＦＰ（ＭＯＩ＝６２．５）を共に３０分３７℃でインキュベートした。細胞を３回洗浄した後、２００μｌの細胞懸濁液（２×１０６／ｍｌ）をマウス抗ＣＤ３およびマウス抗ＣＤ２８抗体をコートした活性化ウェル中でウイルスなしで２日間培養した。陽性対照として、調製した細胞を２．５×１０７ＰＦＵのＳｅＶ−ＥＧＦＰと共に活性化ウェル中で２日間培養した（白いバー）。回収した細胞は、ＡＰＣ結合抗ＣＤ３およびＰＥ結合抗ＣＤ８抗体で染色した。ゲート（区分）した生存ＣＤ３＋ＣＤ４＋またはＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞からＥＧＦＰ陽性細胞の割合を得た。Ｙ軸は、ＥＧＦＰ陽性のＣＤ４（左の３つのバー）またはＣＤ８（右の３つのバー）Ｔ細胞の割合を示す。個々のデータは３連にしたウェル（ｎ＝３）の平均の割合±ＳＥＭとして示した。各群間で統計学的有意差があった（ｐ＜０．０１）。統計学的有意性は一元配置分散分析法及びＦｉｓｈｅｒ’ｓ ＰＬＳＤ ｔｅｓｔを用いて決定した。
図１０は、ナイーブまたは活性化Ｔ細胞へのＳｅＶの侵入（ｅｎｔｒｙ）の評価を示す図である。Ｂ６リンパ球をＳｅＶ−ＥＧＦＰ（ＭＯＩ＝１００）の非存在下（Ｘ軸の一番左のスケール）または存在下（Ｘ軸のその他のスケール）、３０分４℃でインキュベートし、細胞をよく洗浄し、ＳｅＶなしで０、１５、３０、４５、および９０分３７℃でインキュベートした。３回洗浄後、それぞれ図示した期間インキュベートした細胞を、マウス抗ＣＤ３およびマウス抗ＣＤ２８抗体をコートした活性化ウェル中で２日間培養した。細胞を回収し、図９に記載した通りに染色した（ＣＤ４ Ｔ細胞は黒い円、ＣＤ８ Ｔ細胞は黒い四角）。陽性対照として、調製した細胞を２．５×１０７ＰＦＵ（ＭＯＩ＝６２．５）のＳｅＶ−ＥＧＦＰと共に培養した（ＣＤ４ Ｔ細胞は白い円、ＣＤ８ Ｔ細胞は白い四角）。値は３連にしたウェル（ｎ＝３）の平均の割合±ＳＥＭとして示した。ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞の両方において、３７℃０分のインキュベーションにおける値と１５分のインキュベーションにおける値との間に統計学的有意差があった（ｐ＜０．０１）。さらに、３７℃０分のインキュベーションにおける値と９０分のインキュベーションにおける値との間にも統計学的有意差があった（ｐ＜０．０１）。統計学的有意性は一元配置分散分析法及びＦｉｓｈｅｒ’ｓ ＰＬＳＤ ｔｅｓｔを用いて決定した。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、本明細書の一部として組み込まれる。統計的有意性は一元配置分散分析法及びＦｉｓｈｅｒ’ｓ ＰＬＳＤ ｔｅｓｔを用いて決定した。Ｐ＜０．０５を統計的有意とした。
動物
近交系雌Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）（Ｂ６と略記する）、Ｃ３Ｈ（Ｈ−２ｋ）、および雌Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒグレードマウス）はＫＢＴオリエンタル（Ｔｏｓｕ，Ｊａｐａｎ）より得た。クラスＩ ＭＨＣ抗原Ｌｄ反応性Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）のトランスジェニックマウスである２Ｃトランスジェニックマウス（２ｃ−ｔｇ，Ｈ−２ｂ）は文献Ｓｈａ，Ｗ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３５：２７１−２７４に記載されている。マウスは全て人道的に扱い、特定病原菌フリーで維持し、標準的なげっ歯類用の餌および水道水を与えた。７から９週齢のマウスを使用した。動物実験は、九州大学における動物実験倫理委員会（Ｃｏｍｍｉｔｅｅ ｏｆ Ｅｔｈｉｃｓ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）および組み換えＤＮＡ実験委員会（Ｃｏｍｍｉｔｅｅ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）の検査を受け、九州大学の「動物実験ガイドライン」に従って実施した。また、アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）の「研究室動物のケアの原則」（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）および「研究室動物のケアおよび使用のための指針」（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）にも従った。
組み換えＳｅＶの構築
ＥＧＦＰ（クラゲ増強緑色蛍光蛋白質）遺伝子またはホタルルシフェラーゼ遺伝子を持つＳｅＶ（それぞれＳｅＶ−ＥＧＦＰまたはＳｅＶ−ｌｕｃｉ）は、文献の記載の通りに構築した（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ，１９９６，１：５６９−５７９；Ｓａｋａｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９９，４５６：２２１−２２６）。具体的には、ＮｏｔＩ制限酵素部位を含む１８ｂｐのスペーサー配列５’−（Ｇ）−ＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＧ−３’（配列番号：３）を、ＳｅＶのゲノムをコードするｃＤＮＡを含むベクターの５’非翻訳領域とヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子の開始コドンとの間に挿入した。クローン化されたＳｅＶゲノムｃＤＮＡを含むこのベクターには、デルタ肝炎ウイルスのアンチゲノム鎖の自已切断型リボソーム部位も含まれている。ＮｏｔＩ部位と、外来遺伝子の発現のための新しいＳｅＶのＥおよびＳシグナル配列タグのセットを含むプライマーを用いて、ＥＧＦＰ（ＳｅＶ−ＥＧＦＰについて）またはルシフェラーゼ（ＳｅＶ−ｌｕｃｉについて）をコードする全ｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、上記のクローン化したゲノムのＮｏｔＩ部位に挿入した。鋳型となるＳｅＶゲノムの全長は、外来遺伝子を含めて６の倍数の塩基となるようにした（いわゆる″６のルール″（ｒｕｌｅ ｏｆ ｓｉｘ））（Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９８，７２：８９１−８９９）。外来遺伝子を持つ鋳型ＳｅＶゲノム、およびＮ、ホスホ（Ｐ）、およびラージ（Ｌ）蛋白質をコードするプラスミド（それぞれプラスミドｐＧＥＭ−Ｎ，ｐＧＥＭ−Ｐ，およびｐＧＥＭ−Ｌ）を商業的に入手可能なカチオニックリピッドと複合体を形成させ、ワクシニアウイルスｖＴ７−３と共にＣＶ−１またはＬＬＣＭＫ細胞にコトランスフェクトした（Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８６，８３：８１２２−８１２６）。４０時間後、凍結融解を３回繰り返して細胞を破砕し、１０日齢（１０−ｄａｙ−ｏｌｄ）の発育鶏卵の尿嚢（ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ ｃａｖｉｔｙ）に注入した。その後ウイルスを回収し、鶏卵中で２回継代してワクシニアウイルスを除去した。ニワトリ赤血球を用いたヘマグルチネーションアッセイによりウイルスのタイターを決定し（Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．＆ Ｋａｎｅｄａ，Ｙ．，Ｈｅｍａｇｇｕｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｊａｐａｎ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ．Ｅｄ．ｂｙ Ｂａｋｅｒ ＡＨ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ：ｐｐ．２９５−３０６，１９９９）、ウイルスは使用するまで−８０℃で保存した。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）
ビオチン化ヒトＣＤ４５ ＲＡ（ＨＩ１００）ｍＡｂ、アロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ；ＡＰＣ）結合抗マウスＣＤ３（１４５−２Ｃ１１）、マウスＣＤ８（５３−６．７）、およびヒトＣＤ６２Ｌ（ＤＲＥＧ−５６）ｍＡｂ、フィコエリスリン（ＰＥ）結合抗ヒトＣＤ３（ＵＣＨＴ１）、ヒトＣＤ４（ＲＰＡ−Ｔ４）、マウスＣＤ４（ＧＫ１．５）、およびマウスＣＤ８（５３．６７）ｍＡｂ、ＰＥ結合ストレプトアビジン、並びにペリジニンクロロフィルαプロテイン（ｐｅｒＣＰ）結合ストレプトアビジンはＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）より購入した。
ＡＰＣ結合抗ヒトＣＤ３（ＵＣＨＴ１）ｍＡｂはＤＡＫＯ（Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）より購入した。ＰＥ結合抗ヒトＣＤ８（ＮＵ−Ｔｓ／ｃ）ｍＡｂはニチレイ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）より購入した。抗２ＣクロノタイプＴＣＲ決定因子（ａｎｔｉ ２Ｃ ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｃ ＴＣＲ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）ｍＡｂは、本発明者らがハイブリドーマ（１Ｂ２）（Ｓｈａ，Ｗ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３５：２７１−２７４）の培養上清からＨｉＴｒａｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ ＵＫ）を用いて精製し、ＥＺ−ＬｉｎｋＴＭ ＮＨＳ−ＬＣ Ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｌｄ，ＩＬ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いてビオチン化した。
Ｔ細胞の活性化のために、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）より購入した精製抗マウスＣＤ３（１４５−２Ｃ１１）、マウスＣＤ２８（３７．５１）、ヒトＣＤ３（ＨＩＴ３ａ）、抗ヒトＣＤ２８（ＣＤ２８．２）を用いた。
細胞の調製
２０ｍＭ Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ），０．２％ｓｏｄｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ，５０μＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（２−ＭＥ），１０μｇ／ｍｌ ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ，および１０％熱不動化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ａｒｏｒａ，ＯＨ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を加えたＲＰＭＩ １６４０（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）培地を完全培地として用いた。
マウスリンパ球の調製のため、脾臓、リンパ節を回収し完全培地中、氷上に保持した。脾臓およびリンパ節は、培地中、２枚のガラススライドの間で組織断片に圧力をかけて破砕した。細胞懸濁液をステンレスメッシュで濾過し、培地で２回洗浄した。赤血球は塩化アンモニウム炭酸カリウムリシスバッファー（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ ｌｙｓｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を用いてリシスさせた。ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）については、健常者ドナーより血液を採取し、Ｆｉｃｏｌｌ ＰａｑｕｅＴＭ Ｐｌｕｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｗｉｋｓｔｒｏｍｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）によりリンパ球を分離した。標準的なトリパンブルー色素排除アッセイ系を用いて、生存している有核細胞をカウントした。
マウス及びヒトＴ細胞株の樹立
アロ反応性Ｔ細胞株を調製するため、Ｂ６または２Ｃ−ｔｇマウスのリンパ球（５×１０７）を、３０Ｇｙ（１３７Ｃｓ；Ｇａｍｍａｃｅｌｌ ４０，Ａｔｏｍｉｃ Ｅｎｅｒｇｙ ｏｆ Ｃａｎａｄａ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｔｔａｗａ，Ｃａｎａｄａ）を照射したＢａｌｂ／ｃリンパ球（５×１０７）と共に、５０ｍｌフラスコ（３５−３０１４；ＦＡＬＣＯＮ，Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅ，ＮＪ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）中、総量１０ｍｌのＲＰＭＩ １６４０完全培地中で６日間共培養した。活性化したアロ反応性Ｔ細胞は、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｆｕｊｉｏｋａ，Ｊａｐａｎ）を添加して、照射Ｂａｌｂ／ｃリンパ球により週ごとに刺激した。この方法では、Ｂ６から得られるＴ細胞株は、ほとんどがＣＤ８ Ｔ細胞からなることから、ＣＤ４ Ｔ細胞株を得るために、Ｂ６のＣＤ８を枯渇させた（ＣＤ８−ｄｅｐｌｅｔｅｄ）リンパ球を照射リンパ球で刺激した。ＣＤ８を枯渇させたリンパ球の調製のため、新しく単離したリンパ球を抗マウスＣＤ８（Ｌｙｔ−２．２：Ｍｅｉｊｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）ｍＡｂと共に３０分４℃でインキュベートし、続いて Ｌｏｗ−ＴｏｘＴＭ−Ｍ Ｒａｂｂｉｔ ｃｏｍｐｌｅｔｅｎｔ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）と共に５０分３７℃でインキュベートした。３回以上刺激した、Ｂ６または２Ｃ−ｔｇのアロ抗原活性化Ｔ細胞を、マウスＴ細胞株として用いた。
ヒトＴ細胞株を調製するため、ある健康人の末梢血リンパ球（５×１０６）を別の健康人の放射線照射（３０Ｇｙ）末梢血リンパ球（５×１０６）と１０ｎｇ／ｍｌのｈｕｍａｎ ＩＬ−２存在下に１ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０感染培地中で７日間共培養した。その後、７日間ごとに少なくとも２回のリンパ球による再刺激を行ったものをＴ細胞株として使用した。
フローサイトメトリー解析
回収したマウス細胞を遠心分離し、抗マウスＣＤ１６／３２ｍＡｂを産生する培養ハイブリドーマ（２．４Ｇ２；Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ）の上清５０μｌと３０分４℃でインキュベートした。ヒトリンパ球ではこのステップは排除した。細胞を完全培地で洗浄し、ｍＡｂを様々に組み合わせて３０分４℃でインキュベートし、その後完全培地で２回洗浄した。ビオチン化ｍＡｂはＰＥストレプトアビジンまたはＰｅｒＣＰストレプトアビジンで検出した。標識した細胞はＦＡＣＳ ＣａｌｉｂｅｒによりＣｅｌｌＱｕｅｓｔプログラム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＦＬＯＷＪＯプログラム（ＴＲＥＥ ＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて解析した。サイトメーターにアプライする直前に、死細胞を検出して排除するため２５０μｌの細胞懸濁液に１２５ｎｇのｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）を加えた。このステップは、ヒト活性化／メモリーＴ細胞からのナイーブＴ細胞の認識においては除外した。ＥＧＦＰは蛍光１（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ １）で検出した。マウスまたはヒトの実験において、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＰＩ−細胞の集団を生存ＣＤ４ Ｔ細胞と表し、ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＰＩ−細胞の集団を生存ＣＤ８ Ｔ細胞と表した。トランスジェニッククロノタイプＴ細胞であるＣＤ８＋１Ｂ２＋ＰＩ−細胞を生存２ｃＴ細胞と表した。ナイーブヒトＴ細胞または活性化／メモリーヒトＴ細胞は、それぞれＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ３＋細胞としてゲート（区分）されたものまたはＣＤ３＋細胞の中のその他としてゲート（区分）されたものとした（Ｐｉｃｋｅｒ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９３，１５０：１１０５−１１２１；Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９９，７３：６４３０−６４３５）。
マウスまたはヒトＴ細胞へのＳｅＶによる遺伝子送達
活性化またはナイーブＴ細胞における遺伝子導入効率を評価するため、抗マウスＣＤ３ｍＡｂ（１５μｇ／ｍｌ）および抗マウスＣＤ２８ｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）でコートした、あるいはコートしていない９６ウェル平底プレート（３８６０−０９６；ＩＷＡＫＩ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）中で、２００μｌのマウスリンパ球（２×１０６／ｍｌ）の懸濁液を、２．５×１０７ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ（ＰＦＵ）のＳｅＶ−ＥＧＦＰと共に２日間培養した。ヒトリンパ球では、抗ヒトＣＤ３ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）および抗ヒトＣＤ２８ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）でコートした、あるいはコートしていない９６ウェル平底プレート中で、２００μｌのヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）（４×１０６／ｍｌ）またはヒトＴ細胞株（４×１０６／ｍｌ）の懸濁液を、２．５×１０７ＰＦＵのＳｅＶ−ＥＧＦＰと共に２日間培養した。アロ活性化Ｔ細胞株の導入効率の評価では、２．５×１０７ＰＦＵのＳｅＶ−ＥＧＦＰと共に１００μｌのＢ６または２Ｃ−ｔｇマウスのＴ細胞株（２×１０６／ｍｌ）をＢ６またはＢａｌｂ／ｃマウスの３０Ｇｙを照射したリンパ球（１×１０７／ｍｌ）１００μｌと２日間共培養するか、あるいは２００μｌのＢ６または２Ｃ−ｔｇマウスのＴ細胞株（２×１０６／ｍｌ）を抗体（抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体）をコートした９６ウェル平底プレートで２日間、２．５×１０７ＰＦＵのＳｅＶ−ＥＧＦＰと共培養して行った。ナイーブＴ細胞のアロ抗原特異的活性化における遺伝子導入効率の評価では、２Ｃ−ｔｇマウスから新しく単離したリンパ球を用いた。別の実験では、６×１０８ＰＦＵのＳｅＶ−ＥＧＦＰの存在下、２Ｃ−ｔｇマウスからのＴ細胞株（２×１０６／ｍｌ）２．５ｍｌをＢ６またはＢａｌｂ／ｃマウスからの３０Ｇｙ照射リンパ球（１×１０７／ｍｌ）２．５ｍｌで６日間刺激し（３または４日毎に、半分の培地を新しい培地に交換した）、遺伝子導入を行ったＴ細胞を新しい培地で洗浄し、ＳｅＶなしで６または７日間、照射Ｂ６またはＢａｌｂ／ｃリンパ球で再刺激した（再刺激は６または７日毎に行った）。バイスタンダー活性化の効果を評価するためには、５０μｌの２Ｃナイーブリンパ球（１×１０７／ｍｌ）および５０μｌのＢ６ナイーブリンパ球（１×１０７／ｍｌ）の混合液を、２．５×１０７ＰＦＵのＳｅＶ−ＥＧＦＰの存在下、１００μｌの照射Ｂａｌｂ／ｃ、Ｂ６、またはＣ３Ｈリンパ球（１×１０７／ｍｌ）１００μｌで２日間刺激した。
各サンプルを３つのウェルに重複させ、５％ＣＯ２を含む湿大気中で３７℃で培養した。ＳｅＶの感染後４８時間でＥＧＦＰの発現は最大となった。適当な濃度の活性化ｍＡＢまたは最適化した用量のＳｅＶを、タイトレーション実験により決定した。最大の割合でＴ細胞にＥＧＦＰを導入するＳｅＶの最低の用量は、多重感染度（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ＭＯＩ）１２．５であり、５００より高いＭＯＩのＳｅＶはＴ細胞に対して細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）を有していた。
ナイーブまたは活性化Ｔ細胞へのＳｅＶの侵入（ｅｎｔｒｙ）の評価
Ｂ６リンパ球（４×１０６／ｍｌ）を、２０００ｍｊのＵＶ（ＵＶ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で不活化したＳｅＶ−ｌｕｃｉ（５×１０８ＰＦＵ／ｍｌ）の１：１の比での存在下または非存在下、３０分３７℃でインキュベートした後、細胞を完全培地でよく洗浄し、ＳｅＶ−ＥＧＦＰ（２．５×１０８ＰＦＵ／ｍｌ）と１：１の比で３０分３７℃でインキュベートした。３回洗浄した後、２００μｌの細胞懸濁液（２×１０６／ｍｌ）を、抗マウスＣＤ３ｍＡｂ（１５μｇ／ｍｌ）および抗マウスＣＤ２８ｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）でコートした９６ウェル平底プレート中で２日間培養した。最後の洗浄を行った培地中に混入しているＳｅＶは、活性化ウェル中の前処理していないＴ細胞に対してほとんどＥＧＦＰを導入する能力がなかったことから、この洗浄過程は十分であったことが確認された。陽性対照として、調製した細胞を活性化ウェルにて、２．５×１０７ＰＦＵのＳｅＶ−ＥＧＦＰと共に２日間培養した。ナイーブＴ細胞からの接着したＳｅＶの解離を調べるため、１０ｍｌのＢ６リンパ球（２×１０６／ｍｌ）を２×１０９ＰＦＵのＳｅＶ−ＥＧＦＰの存在下または非存在下、３０分４℃でインキュベートし、細胞を完全培地でよく洗浄した後、ＳｅＶなしで０、１５、３０、４５、および９０分３７℃でインキュベートした。３回洗浄した後、細胞を活性化ウェル中で３７℃で２日間培養した。陽性対照として、調製した細胞を２．５×１０７ＰＦＵのＳｅＶ−ＥＧＦＰと共に培養した。
［実施例１］組み換えＳｅＶは高い効率でＥＧＦＰを活性化Ｔ細胞に導入する
センダイウイルスベクターがＴ細胞にＥＧＦＰ遺伝子を導入できるかを調べた。まず、マウスリンパ球をＳｅＶ−ＥＧＦＰ（ＭＯＩ＝６２．５）と共に４８時間培養した。ＥＧＦＰ陽性の非刺激マウスＣＤ３＋ＣＤ４＋またはＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（それぞれＣＤ４ Ｔ細胞またはＣＤ８ Ｔ細胞とも称す）の割合は低かった一方（それぞれ０．５〜１．５％または０．８〜２．０％）、固着化した抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を用いて非特異的に活性化したＣＤ３＋ＣＤ４＋またはＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は高い強度でＥＧＦＰを発現し、ＥＧＦＰ陽性細胞の割合は劇的に上昇した（それぞれ６５〜８５％または７０〜９２％）（図１）。ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞の両方の場合で、ＥＧＦＰ陽性細胞の割合はＳｅＶの用量依存的に上昇し、ＭＯＩが１２．５の時にほぼプラトーのレベルに達した。
次に、抗原で活性化したＴ細胞株への遺伝子送達が可能か否かを調べるため、ｉｎ ｖｉｖｏで免疫することなしに初代培養においてナイーブＴリンパ球が応答し増殖することができるＴ細胞刺激抗原としてアロ抗原を用いた。Ｃ５７ＢＬ／６からの非改変リンパ球とＢａｌｂ／ｃからの照射リンパ球との共培養により生成したＴ細胞株は、ほとんどはＣＤ８ Ｔ細胞からなるため、ＣＤ８ Ｔ細胞を枯渇させたリンパ球を照射した刺激リンパ球と共培養してＣＤ４ Ｔ細胞株を得た。また、これとは別に、２ｃ−ｔｇマウスからのＴ細胞（２ｃＴ細胞）を用いたが、これはＬｄ特異的ＴＣＲを発現するナイーブＴ細胞クローンを大量に持っており、抗原特異的な初代Ｔ細胞の応答における遺伝子導入を観察することが可能であった。期待したように、アロ抗原で刺激したＴ細胞株は、照射を行ったアロジェニックなリンパ球の存在下、ＳｅＶにより効率的にＥＧＦＰが導入された（図２）。さらに、刺激するアロジェニックなリンパ球の非存在下でさえも、活性化Ｔ細胞は効率的に遺伝子導入された（図２）。この効果は、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞の両者で共通していたが、ＥＧＦＰ発現レベルおよび陽性細胞の割合は、ＣＤ８ Ｔ細胞株よりもＣＤ４ Ｔ細胞株の方がわずかに低い傾向があった。これらの知見は、ＳｅＶはＴ細胞に対し、Ｔ細胞が活性化状態にあれば標的遺伝子を送達することができることを示している。
これらの知見をＴ細胞の抗原特異的応答において確認するため、Ｌｄに特異的に応答し、ナイーブな状態でもＣＤ８＋１Ｂ２＋集団としてバルクのリンパ球の中から区別することが可能な、２ｃ−ｔｇマウスからのＴ細胞を用いた。ナイーブ２ｃＴ細胞はアロであるＢａｌｂ／ｃ刺激細胞の存在下でのみＥＧＦＰを非常に強く発現し、シンジェニックであるＢ６刺激細胞ではほとんど発現が見られなかったが、Ｂａｌｂ／ｃ刺激細胞で３回以上刺激し、活性化した２ｃＴ細胞に対しては、Ｂ６あるいはＢａｌｂ／ｃの刺激細胞どちらの存在下でもＳｅＶは効率的にＥＧＦＰを導入した（図３）。それに加え、単純にＴ細胞株をＳｅＶと共にたった３０分３７℃でインキュベートしても、ＥＧＦＰを最大に発現させるのに十分であった（データ省略）。
さらに、ＳｅＶによるこの非常に強い導入が抗原特異的に活性化したＴ細胞に限られるのかを明らかにするため、以下のような実験を行った。非抗原特異的Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの強力なアロ応答のバイスタンダー効果により活性化され得る。Ｃ３ＨスティミュレーターではなくＢａｌｂ／ｃスティミュレーターに応答することができる抗原特異的Ｔ細胞としてナイーブ２ｃＴ細胞を用いた。Ｃ５７ＢＬ／６および２ＣナイーブＴ細胞の混合物からなるレスポンダー（応答細胞）を、Ｂａｌｂ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ３Ｈ刺激細胞、または何もなしに共培養し、２．５×１０７ＰＦＵのＳｅＶ−ＥＧＦＰを培養ウェルに添加した。この培養系において、混合リンパ球培養中でＣ５７ＢＬ／６マウスからのＴ細胞がＣ３Ｈスティミュレーターに強く応答している時に、ＳｅＶ−ＥＧＦＰにより２ｃＴ細胞にＥＧＦＰ遺伝子が導入されるかを調べることができた。Ｃ３Ｈ刺激細胞を用いると、Ｃ５７ＢＬ／６Ｔ細胞のＣ３Ｈスティミュレーターに対する応答は起こっても、２ｃＴ細胞にＥＧＦＰは導入されず、Ｃ５７ＢＬ／６刺激細胞を用いた場合または刺激細胞を何も用いなかった場合と同様であった（図４）。それに対して、Ｂａｌｂ／ｃスティミュレーターを用いた場合、２ｃＴ細胞はＥＧＦＰを非常に強く発現した（図４）。従って、ＳｅＶによるこの遺伝子導入は特異的な抗原で活性化されたＴ細胞に限定されていた。
［実施例２］活性化Ｔ細胞におけるＳｅＶによる導入遺伝子の発現期間
次に、導入遺伝子のｉｎ ｖｉｒｔｏでの維持について調べた。活性化２ｃＴ細胞をセンダイウイルスと共培養し、遺伝子導入されたＴ細胞をＢａｌｂ／ｃスティミュレーターまたはＣ５７ＢＬ／６スティミュレーターとｉｎ ｖｉｔｒｏで維持した。ＥＧＦＰの発現は、４８時間目に発現がピークとなった後は、発現レベルは急速に低下するものの、少なくとも２０日間維持された（図５および省略したデータ）。ＥＧＦＰの発現レベルは、Ｂａｌｂ／ｃスティミュレーターにより抗原再刺激を行っても上昇しなかった。これらの知見は、アロ特異的活性化Ｔ細胞株においても観察された（データ省略）。
［実施例３］活性化ヒトＴ細胞およびＴ細胞株への遺伝子送達
健常者から新しく単離したヒトＰＢＬを２．５×１０７ＰＦＵのＥＧＦＰ発現ＳｅＶベクター（ＭＯＩ＝３０）と共に４８時間培養した。マウスＴ細胞の場合とは対照的にＥＧＦＰの発現強度は比較的低いものの、刺激していないヒトＣＤ３＋ＣＤ４＋およびＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞において比較的高いＥＧＦＰ陽性率が得られた（それぞれ平均＝２３．１％、範囲１５〜４５％、および平均＝３４．０％、範囲１８〜５０％）（図６）。
本発明者らは、活性化／メモリーＴ細胞の集団は、特定病原菌フリー（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ−Ｐａｔｈｏｇｅｎ−Ｆｒｅｅ）の条件下で維持されたマウスリンパ系組織におけるよりも、ヒトＰＢＬにおける方が高いという仮説を立てた。活性化／メモリーＴ細胞からナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋）を識別し、これらの各Ｔ細胞集団のＥＧＦＰの発現を解析した。期待したように、ＥＧＦＰ陽性の活性化／メモリーＴ細胞中のＥＧＦＰ陽性細胞の割合は、ナイーブＴ細胞中のＥＧＦＰ陽性細胞よりもはるかに高く、ナイーブＴ細胞中のＥＧＦＰ陽性細胞の割合は４％よりも低かった（図７）。マウス実験で示したように、既に抗原で活性化したＴ細胞は、抗原刺激がなくても効率良くＥＧＦＰが導入されたことから、活性化／メモリーの表現型を有するＴ細胞中の活性化Ｔ細胞がＥＧＦＰを発現したと考えられた。それに対して、固着化した抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で刺激したＣＤ３＋ＣＤ４＋またはＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は強い強度でＥＧＦＰを発現し、ＥＧＦＰ陽性細胞の割合は高かった（それぞれ範囲３０〜６９％または５０〜７０％）（図６）。
ヒトアロ抗原刺激Ｔ細胞株においては、ＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞ともに固着化抗体存在のもとでは、それぞれ９７％または９８％と非常に効率のよい導入を示した（図８）。このＴ細胞株についても、単純に３０分３７℃のインキュベートでＥＧＦＰを最大に発現させるのに十分であった。
［実施例４］ベクターの接着後のＳｅＶの侵入（ｅｎｔｒｙ）は活性化Ｔ細胞では起こるが、ナイーブＴ細胞では起こらない
ＳｅＶを介した活性化Ｔ細胞特異的な遺伝子送達の考えられる機構を調べた。遺伝子導入の効率に影響し得る要因としては、以下のようなものがありうる。（ｉ）ＳｅＶ特異的なレセプター（Ｍａｒｋｗｅｌｌ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ Ｐａｕｌｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８０，７７：５６９３−５６９７）、（ｉｉ）融合のための考えられるコレセプター（Ｋｕｍａｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９７，７１：６３９８−６４０６；Ｅｇｕｃｈｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００，２７５：１７５４９−１７５５５）、（ｉｉｉ）Ｔ細胞の活性化によるシグナル伝達の誘導、これはＳｅＶが侵入（ｅｎｔｒｙ）した後のＳｅＶの転写に影響し得る（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｉｎ：Ｆｉｅｌｄｓ ＢＮ，Ｋｎｉｐｅ ＤＭ，Ｈｏｗｌｅｙ ＰＭ，（ｅｄｓ）．Ｆｉｅｌｄｓ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．２．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６：１２０５−１２４１）。これらを調べるため、マウスＴ細胞を用いた。活性化したマウスＴリンパ球はＳｅＶにより効率的に遺伝子導入されるが、新しく単離したマウスＴリンパ球はＳｅＶによりほとんど遺伝子導入されないため、マウスＴ細胞を用いたこれらの実験では、活性化／メモリーＴ細胞からナイーブＴ細胞を細胞分離するプロセスは行わなかった。
まず、新しく単離したリンパ球を紫外線（ＵＶ）で不活化したＳｅＶ−ｌｕｃｉ存在下（前処理したナイーブＴ細胞）または非存在下（前処理しないナイーブＴ細胞）で６０分３７℃でインキュベートし、Ｔ細胞の特異的レセプターを干渉させ、ＳｅＶのＨＮのノイラミニダーゼ活性によりシアル酸残基を遊離させた。その後、それらＴ細胞をＳｅＶ−ＥＧＦＰ（ＭＯＩ＝６２．５）と共に３０分３７℃でインキュベートした。続いて、それらＴ細胞を、固着化した抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で刺激し、２日後にＥＧＦＰの発現レベルを調べた。ＳｅＶ−ＥＧＦＰで前処理したナイーブＴ細胞においては、続く活性化におけるＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞のＥＧＦＰ陽性細胞の割合は、それぞれ３５％または５０％となった（図９）。しかしながら、ＵＶで不活化したＳｅＶ−ｌｕｃｉと共にインキュベートすると、活性化Ｔ細胞へのＥＧＦＰの遺伝子導入は妨げられた。不活化ＳｅＶ−ｌｕｃｉとプレインキュベーションしても、活性化の培養期間の間ＳｅＶ−ＥＧＦＰと共にＴ細胞をインキュベートするとほとんどのリンパ球はＥＧＦＰを発現したことから、前処理したＴ細胞でＥＧＦＰが発現しなかったのは、Ｔ細胞の生存が低下したためではない（図９）。この結果は、続くインキュベーション期間においてＳｅＶのための特異的レセプターが回復したためであると考えられる。さらに、最後の洗浄培養液は、改変していない活性化Ｔ細胞にほとんどＥＧＦＰを導入しなかった（データ省略）ことから、洗浄の過程が不十分であった可能性は排除することができた。これらの知見は、ＳｅＶは遺伝子導入のためにＴ細胞上の特異的なレセプターを使用していることを示唆している。
Ｔ細胞とＳｅＶ−ＥＧＦＰとのインキュベーションの時間を決定する予備的な実験において、インキュベーション時間を延ばすと、ＥＧＦＰ陽性Ｔ細胞の割合が低下することが観察された。この観察から、本発明者らはＳｅＶはナイーブＴ細胞に接着することはできるが、恐らくコレセプターの欠損により融合できずに、３７℃というノイラミニダーゼがよく働く温度でのインキュベーションにおいて、自身がもつＨＮのノイラミニダーゼ活性によりナイーブＴ細胞からＳｅＶが離れてしまうという仮説をたてた。そこで、新しく単離したリンパ球を、ノイラミニダーゼがほとんど働かないが、ＳｅＶがシアル酸残基に接着することはできる４℃でＳｅＶ−ＥＧＦＰ（ＭＯＩ＝１００）とインキュベートした後、それらのリンパ球を新しい培地で図示した期間３７℃でインキュベートした（図１０）。その後、細胞を３回洗浄し、それらＴ細胞を固着化した抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で刺激し、２日後、ＧＦＰの発現レベルを調べた。この実験では、全てのＴ細胞が均一に活性化されたことから、データは、細胞のキナーゼ活性などのようなＳｅＶの遺伝子発現に関連する要因には影響されず、侵入（ｅｎｔｒｙ）に関連する要因によってのみ影響を受けた。期待したように、Ｔ細胞を４℃で一度インキュベートした後に活性化すると、ＥＧＦＰ陽性のＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞の割合は、それぞれ５０％または７０％であった。これに対して、４℃のインキュベーションに続いて３７℃でインキュベートすると、ＥＧＦＰ陽性Ｔ細胞の割合は時間依存的に減少した（図１０）。３７℃で９０分のインキュベーションによりＥＧＦＰ陽性Ｔ細胞の割合は最低になり、これは最後の洗浄後の培養液に混入しているＳｅＶと活性化ウェル中で共培養した前処理なしのＴ細胞の割合と同等であった。活性化のための培養期間の間ＳｅＶ−ＥＧＦＰと共にインキュベートした陽性対照のＴ細胞はすべて効率的に遺伝子導入された。さらに、活性化Ｔ細胞を用いた場合、３０分３７℃でインキュベートするだけで、ＥＧＦＰ陽性Ｔ細胞の割合は陽性対照と同じくらい高かった（データ省略）。侵入（ｅｎｔｅｒ）したＳｅＶがナイーブＴ細胞から放出されることはありそうにないことから、これらの現象は、ＳｅＶは活性化Ｔ細胞に侵入（ｅｎｔｅｒ）することができる一方、ナイーブＴ細胞に接着することはできるが融合できないと説明することができる。ベクター粒子は、ナイーブＴリンパ球ではなく活性化Ｔリンパ球に特異的にインターナリゼーション（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ；内部化）が起こる可能性が高い。
【産業上の利用の可能性】
本発明により、Ｔ細胞に効率的に遺伝子を導入することが可能となった。Ｔ細胞への遺伝子導入は、免疫系が関与する様々な疾患の治療にとって重要であることから、これらの疾患における、Ｔ細胞を指向した遺伝子送達による改変戦略への本発明の適用が期待される。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞に遺伝子を導入する方法であって、該遺伝子を保持するパラミクソウイルスベクターと活性化したＴ細胞とを接触させる工程を含む方法。
【請求項２】
パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
外来遺伝子が導入されたＴ細胞の製造方法であって、該遺伝子を保持するパラミクソウイルスベクターと活性化したＴ細胞とを接触させる工程を含む方法。
【請求項４】
パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項３または４に記載の方法により製造された、外来遺伝子が導入されたＴ細胞。
【請求項６】
活性化Ｔ細胞への遺伝子送達のために用いる、パラミクソウイルスベクター。
【請求項７】
パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項６に記載のベクター。
【請求項１】
Ｔ細胞に遺伝子を導入する方法であって、該遺伝子を保持するパラミクソウイルスベクターと活性化したＴ細胞とを接触させる工程を含む方法。
【請求項２】
パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
外来遺伝子が導入されたＴ細胞の製造方法であって、該遺伝子を保持するパラミクソウイルスベクターと活性化したＴ細胞とを接触させる工程を含む方法。
【請求項４】
パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項３または４に記載の方法により製造された、外来遺伝子が導入されたＴ細胞。
【請求項６】
活性化Ｔ細胞への遺伝子送達のために用いる、パラミクソウイルスベクター。
【請求項７】
パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項６に記載のベクター。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３８０２９
【国際公開日】平成１６年５月６日（２００４．５．６）
【発行日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４６４４１（Ｐ２００４−５４６４４１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１３４７６
【国際出願日】平成１５年１０月２２日（２００３．１０．２２）
【出願人】（５９５１５５１０７）株式会社ディナベック研究所 (22)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年５月６日（２００４．５．６）
【発行日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１３４７６
【国際出願日】平成１５年１０月２２日（２００３．１０．２２）
【出願人】（５９５１５５１０７）株式会社ディナベック研究所 (22)
【Ｆターム（参考）】
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