ＴＯＬＬ様受容体３の選択的アゴニスト
Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）のアゴニストであるミスマッチ二本鎖リボ核酸を、抗微生物剤、抗増殖剤、および／または免疫刺激剤として、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで用いる。どちらの二本鎖ＲＮＡも構造的に類似であるが、ポリ（Ｉ：Ｃ１１−１４Ｕ）は、ポリ（Ｉ：Ｃ）に比較した際、ＴＬＲ３のより選択的なアゴニストである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、２００８年２月１５日出願の出願第６１／０２９，３０７号、および２００８年５月８日出願の出願第６１／０５１，６０６号の優先権を請求する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、抗感染剤（例えば、少なくとも１以上の細菌、原生動物、またはウイルスによって引き起こされる感染を治療するかまたは防止するため）、抗増殖剤（例えば、少なくとも、ウイルス誘導性癌を含む癌を治療するため）、および／または免疫刺激剤（例えばワクチン接種を伴いまたは伴わずに、免疫を刺激することによって、少なくとも感染性疾患または癌を治療するため）として使用するための、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）のアゴニストを提供することに関する。医学的治療法および薬剤を製造するためのプロセスを提供する。
【０００３】
ポリ（Ｉ：Ｃ）のような二本鎖ＲＮＡがＴＬＲ３アゴニストとして用いられてきている。しかし、薬剤としての有用性は毒性があるために限定されている。したがって、ＴＬＲファミリーに属する他の受容体ではなく、ＴＬＲ３を特異的にターゲティングすることによって、抗感染剤、抗増殖剤、および／または免疫刺激剤として使用可能な改善された薬剤が探索されている。例えば、望ましい薬剤は、ＴＬＲ３によって仲介されるような過剰な炎症促進反応を誘導することなく、初発性のまたは確立された感染を治療し、前癌状態または癌状態を治療するため、増加した治療指数（例えばＬＤ５０をＥＤ５０で割るような、毒性効果を生じる用量を療法効果を生じる用量で割った比）を有するであろう。
【０００４】
二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）は、２’，５’−オリゴアデニル酸シンテターゼ／ＲＮアーゼＬおよびｐ６８プロテインキナーゼ経路を含む、ｄｓＲＮＡ依存性細胞内抗ウイルス防御機構を通じて、自然免疫（例えば宿主防御の産生）を誘発する。しかし、ポリ（Ｉ：Ｃ）はまた、ＴＬＲ３を活性化し、そしてそれによって炎症促進性ケモカインおよびサイトカインの分泌を誘導する。ＷＯ２００６／０６０５１３、３〜４ページを参照されたい。これは、ＴＬＲ３を選択的に活性化して、有益な免疫の発展を仲介するのではなく、有害な炎症プロセスを開始するかまたは増進する可能性もある。ポリ（Ｉ：Ｃ）は、炎症に関連する壊死、全身性炎症反応症候群、感染関連急性サイトカインストーム、ならびに関節リウマチおよび炎症性腸疾患などの慢性自己免疫疾患を引き起こすと考えられる。ＷＯ２００６／０６０５１３は、多様な徴候に対する薬剤としてＴＬＲ３アンタゴニストを使用すると有益であろうと解説する。したがって、本発明において、ＴＬＲ３の選択的アゴニストが薬剤としての使用を見出すことは驚くべきことであった。
【０００５】
ＨＥＭＩＳＰＨＥＲｘ（登録商標）ＢｉｏｐｈａｒｍａのＡＭＰＬＩＧＥＮ（登録商標）ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）は、抗ウイルスおよび免疫刺激特性を持つが、減少した毒性を示す、特異的に形成されたｄｓＲＮＡである。ＡＭＰＬＩＧＥＮ（登録商標）ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）は、多面的活性を通じてウイルスおよび癌細胞増殖を阻害する：該分子は、他のｄｓＲＮＡ分子と同様、２’，５’−オリゴアデニル酸シンテターゼ／ＲＮアーゼＬおよびｐ６８プロテインキナーゼ経路を制御する。本発明者らは、ここで、本発明者らが特異的に形成したｄｓＲＮＡが、ＴＬＲ３の特異的アゴニストとして作用することによって、体内でその効果を仲介することを発見した。驚くべきことに、特定の微生物に対してのみ有効である他の化学療法剤（例えば抗細菌剤ペニシリン、抗ヘルペス剤イドクスウリジン、および抗マラリア剤クロロキン）と異なり、ポリ（Ｉ：Ｃ１１−１４Ｕ）は、免疫系に直接作用することによって、細菌、ウイルス、および原生動物の治療に有効な抗微生物化学療法剤として、広い適用を有することを本発明者らは解説する。ポリ（Ｉ：Ｃ１１−１４Ｕ）の投与は、有害な炎症プロセスの開始または増進など、ポリ（Ｉ：Ｃ）で観察される副作用を回避する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００６／０６０５１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、抗感染剤、抗増殖剤、および／または免疫刺激剤が必要な患者のための治療を提供することである。２つの二本鎖ＲＮＡが構造的に類似であるにもかかわらず、本発明者らが特異的に形成したｄｓＲＮＡは、ポリ（Ｉ：Ｃ）に比較した際、ＴＬＲ３のより選択的なアゴニストである。それによって、選択的ＴＬＲ３アゴニストに対する長年感じられてきた必要性に取り組んでいる。特に感染性疾患、細胞増殖、および／またはワクチン接種に関与する、被験体を治療するための方法および薬剤を作製するためのプロセスを提供する。さらなる目的および利点を以下に記載する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、初発性のまたは確立された微生物感染、異常な細胞増殖によって特徴づけられる病的状態（例えば新生物または腫瘍）を持つ被験体（例えばヒトまたは動物）を治療するため、あるいは少なくとも感染、異常な細胞増殖、または自己免疫もしくは神経変性による細胞損傷によって引き起こされる疾患または状態に関して被験体を治療する免疫刺激剤として、使用可能である。用いるミスマッチ二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の量が、被験体の免疫細胞上のＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）に結合するのに十分であることが好ましい。それによって、自然免疫または適応免疫を誘発することも可能である。特に、ＴＬＲ４のような他のＴｏｌｌ様受容体、またはＲＩＧ−１もしくはｍｄａ−５のようなＲＮＡヘリカーゼを活性化することなく、あるいは非選択的ＴＬＲ３アゴニストであるポリ（Ｉ：Ｃ）で見られるように過剰な炎症促進性反応を誘導することなく、特異的に形成したｄｓＲＮＡを用いて、ＴＬＲ３を活性化することも可能である。
【０００９】
被験体は、少なくとも１以上の細菌、原生動物またはウイルスに感染していてもよい。ＴＬＲ３に結合するのに十分な量の特異的に形成したｄｓＲＮＡを含む薬学的組成物を、被験体に投与する。特異的に形成したｄｓＲＮＡで治療しない被験体に比較した際の、回復時間の減少、免疫増加（例えば、抗体力価、リンパ球増殖、感染細胞の殺傷、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性の増加）、微生物の分裂または増殖の減少、あるいはこれらの任意の組み合わせによってアッセイされるように、被験体の感染は、該投与によって減少するかまたは排除される。治療によって誘導される免疫は、好ましくは該微生物に特異的である。
【００１０】
被験体は、異常な細胞増殖（例えば新生物または腫瘍、他の形質転換細胞）に苦しめられていてもよい。ＴＬＲ３に結合するのに十分な量の特異的に形成したｄｓＲＮＡを含む薬学的組成物を、被験体に投与する。特異的に形成したｄｓＲＮＡで治療しない被験体の状態に比較した際の、罹患率または死亡率の改善、免疫増加（例えば抗体力価、リンパ球増殖、増殖細胞もしくは形質転換細胞の殺傷、またはＮＫ細胞活性の増加）、増殖細胞または形質転換細胞の分裂または増殖の減少、あるいはこれらの任意の組み合わせによってアッセイされるように、被験体の疾患は、該投与によって減少するかまたは排除される。
【００１１】
被験体において、樹状細胞成熟を誘導してもよい。抗原取り込み可能な未成熟樹状細胞を誘導して、抗原を提示しそして適応免疫反応（例えば抗原特異的Ｔ細胞）をプライミングすることが可能な、より成熟した樹状細胞に分化させてもよい。未成熟な樹状細胞から成熟樹状細胞に変換される間、樹状細胞は、少なくとも、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子、同時刺激分子、接着分子、またはケモカイン受容体の細胞表面発現を変化させるか；抗原取り込みを減少させるか；ケモカイン、サイトカイン、またはプロテアーゼ分泌を増加させるか；樹状突起を成長させるか；細胞骨格を再編成するか；あるいはこれらの組み合わせを行いうる。樹状細胞は、血液またはリンパを通じて、炎症部位またはリンパ組織に遊走するよう誘導され、微生物、新生物または腫瘍細胞、あるいは他の形質転換細胞に近接することも可能である。
【００１２】
少なくとも感染または癌に対して、被験体にワクチン接種してもよい。ときに、例えばウイルス誘導性癌では、感染および癌の両方を治療してもよい。ワクチン接種の直前、接種中または接種直後（例えばワクチン接種１０日以内）、ＴＬＲ３に結合するのに十分な量の特異的に形成したｄｓＲＮＡを含む薬学的組成物を、被験体に投与する。それによって、ワクチンまたは樹状細胞調製物に対する免疫反応を刺激する。ワクチンまたは樹状細胞調製物は、殺した、固定した、または弱毒化した全微生物または細胞（例えば、増殖中のまたは形質転換されたもの）；微生物または細胞（例えば、増殖中のまたは形質転換されたもの）の溶解物または精製分画：１以上の単離微生物抗原（例えば、天然の、化学的に合成された、または組換え産生されたもの）；または１以上の単離腫瘍抗原（例えば、天然の、化学的に合成された、または組換え産生されたもの）で構成されてもよい。ある部位でまたはその部位への循環中で、抗原（例えば天然感染または細胞増殖、または脱落（ｓｈｅｄ）抗原中で産生される）を被験体が産生し、そしてそれに対するアジュバントとして作用する特異的に形成したｄｓＲＮＡを投与することによって、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種を達成してもよい。
【００１３】
抗原提示細胞（例えばＢリンパ球、樹状細胞、マクロファージ）および粘膜組織（例えば胃または呼吸上皮）は、体内における、特異的に形成したｄｓＲＮＡの好ましいターゲットである。微生物または腫瘍抗原（単数または複数）を提示してもよく、そして抗原（単数または複数）は、ＴＬＲ３アゴニストとしてのみ作用する特異的に形成したｄｓＲＮＡのみの作用に感受性であるべきである。微生物、癌細胞、または他の形質転換細胞は、ＴＬＲ３アゴニストとしてのみ作用する特異的に形成したｄｓＲＮＡによって活性化される特異的サイトカイン反応パターンに感受性であってもよい。特異的に形成したｄｓＲＮＡは、好ましくは、静脈内注入；皮内、皮下、または筋内注射；鼻内または気管内吸入；あるいは中咽頭または舌下適用によって投与される。
【００１４】
薬剤の使用および作製のためのプロセスもまた提供する。しかし、製品に向けられるクレームは、プロセスの特定の工程が製品クレームにおいて唱えられるのでない限り、必ずしもこれらのプロセスに限定されないことに注目しなければならない。
【００１５】
本発明のさらなる側面は、特定の態様の以下の説明および請求項、ならびにこれらに対する一般化から、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１は、５μｇ α−ＤＥＣ−ｇａｇおよび５０μｇポリ（Ｉ：Ｃ）でのプライム−ブースト免疫が、ワクシニアｇａｇウイルスでの気道曝露に対して防御免疫を提供することを示す。６回の実験：ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウス各々３回（対照Ｉｇ−ｐ２４を除く； ＢＡＬＢ／ｃでｎ＝２）由来の、曝露後の平均±ＳＤとしての（Ａ）平均体重損失および（Ｂ）肺におけるワクシニア・プラーク形成力価。示すワクチンで、マウスを６週間間隔でプライミングし、そしてブーストした。ブースト時にのみ、別の群をα−ＤＥＣ−ｐ２４およびポリ（Ｉ：Ｃ）で免疫した。ブーストの６〜８週間後、マウスを５ｘ１０４ＰＦＵワクシニア−ｇａｇに鼻内曝露した。２つの類似の実験の一方由来の、曝露後の平均±ＳＤとしての（Ｃ）平均体重損失および（Ｄ）肺におけるワクシニア・プラーク形成力価： Ｃ５７ＢＬ／６、ＤＥＣ−２０５−／−、およびＴＬＲ３−／−マウス各５匹を、α−ＤＥＣ−ｐ４１で免疫した。ブーストの６〜８週間後、マウスを５ｘ１０４ＰＦＵワクシニア−ｇａｇに鼻内曝露した。
【図１Ｂ】図１は、５μｇ α−ＤＥＣ−ｇａｇおよび５０μｇポリ（Ｉ：Ｃ）でのプライム−ブースト免疫が、ワクシニアｇａｇウイルスでの気道曝露に対して防御免疫を提供することを示す。６回の実験：ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウス各々３回（対照Ｉｇ−ｐ２４を除く； ＢＡＬＢ／ｃでｎ＝２）由来の、曝露後の平均±ＳＤとしての（Ａ）平均体重損失および（Ｂ）肺におけるワクシニア・プラーク形成力価。示すワクチンで、マウスを６週間間隔でプライミングし、そしてブーストした。ブースト時にのみ、別の群をα−ＤＥＣ−ｐ２４およびポリ（Ｉ：Ｃ）で免疫した。ブーストの６〜８週間後、マウスを５ｘ１０４ＰＦＵワクシニア−ｇａｇに鼻内曝露した。２つの類似の実験の一方由来の、曝露後の平均±ＳＤとしての（Ｃ）平均体重損失および（Ｄ）肺におけるワクシニア・プラーク形成力価： Ｃ５７ＢＬ／６、ＤＥＣ−２０５−／−、およびＴＬＲ３−／−マウス各５匹を、α−ＤＥＣ−ｐ４１で免疫した。ブーストの６〜８週間後、マウスを５ｘ１０４ＰＦＵワクシニア−ｇａｇに鼻内曝露した。
【図１Ｃ】図１は、５μｇ α−ＤＥＣ−ｇａｇおよび５０μｇポリ（Ｉ：Ｃ）でのプライム−ブースト免疫が、ワクシニアｇａｇウイルスでの気道曝露に対して防御免疫を提供することを示す。６回の実験：ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウス各々３回（対照Ｉｇ−ｐ２４を除く； ＢＡＬＢ／ｃでｎ＝２）由来の、曝露後の平均±ＳＤとしての（Ａ）平均体重損失および（Ｂ）肺におけるワクシニア・プラーク形成力価。示すワクチンで、マウスを６週間間隔でプライミングし、そしてブーストした。ブースト時にのみ、別の群をα−ＤＥＣ−ｐ２４およびポリ（Ｉ：Ｃ）で免疫した。ブーストの６〜８週間後、マウスを５ｘ１０４ＰＦＵワクシニア−ｇａｇに鼻内曝露した。２つの類似の実験の一方由来の、曝露後の平均±ＳＤとしての（Ｃ）平均体重損失および（Ｄ）肺におけるワクシニア・プラーク形成力価： Ｃ５７ＢＬ／６、ＤＥＣ−２０５−／−、およびＴＬＲ３−／−マウス各５匹を、α−ＤＥＣ−ｐ４１で免疫した。ブーストの６〜８週間後、マウスを５ｘ１０４ＰＦＵワクシニア−ｇａｇに鼻内曝露した。
【図１Ｄ】図１は、５μｇ α−ＤＥＣ−ｇａｇおよび５０μｇポリ（Ｉ：Ｃ）でのプライム−ブースト免疫が、ワクシニアｇａｇウイルスでの気道曝露に対して防御免疫を提供することを示す。６回の実験：ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウス各々３回（対照Ｉｇ−ｐ２４を除く； ＢＡＬＢ／ｃでｎ＝２）由来の、曝露後の平均±ＳＤとしての（Ａ）平均体重損失および（Ｂ）肺におけるワクシニア・プラーク形成力価。示すワクチンで、マウスを６週間間隔でプライミングし、そしてブーストした。ブースト時にのみ、別の群をα−ＤＥＣ−ｐ２４およびポリ（Ｉ：Ｃ）で免疫した。ブーストの６〜８週間後、マウスを５ｘ１０４ＰＦＵワクシニア−ｇａｇに鼻内曝露した。２つの類似の実験の一方由来の、曝露後の平均±ＳＤとしての（Ｃ）平均体重損失および（Ｄ）肺におけるワクシニア・プラーク形成力価： Ｃ５７ＢＬ／６、ＤＥＣ−２０５−／−、およびＴＬＲ３−／−マウス各５匹を、α−ＤＥＣ−ｐ４１で免疫した。ブーストの６〜８週間後、マウスを５ｘ１０４ＰＦＵワクシニア−ｇａｇに鼻内曝露した。
【図２】図２は、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）が、ＴＬＲ３依存方式で、５μｇ α−ＤＥＣ−ｐ２４ワクチンに対するＣＤ４＋ Ｔ細胞免疫のアジュバントとして作用することを示す。（Ａ）ＣｘＢ６ Ｆ１マウスに、α−ＤＥＣ−ｐ２４に加えて、段階的な用量のポリ（Ｉ：Ｃ）またはポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）またはＰＢＳのいずれかを腹腔内注射し、次いで、６週間後、同じ条件でブーストした。ブースト１週間後に、ＨＩＶ ｇａｇ ｐ１７またはｐ２４混合物に反応して、ＩＦＮ−γを産生し、そして増殖しているＣＤ３＋ＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合を、平均±ＳＤ（ｎ＝４マウス）として示す。（Ｂ）２回投与のα−ＤＥＣ−ｐ２４に加えて、５０μｇポリ（Ｉ：Ｃ）または２５０μｇポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）のいずれかで免疫した、野生型、ＴＬＲ３−／−、およびＭＤＡ５−／−マウス中のＣＤ４＋脾臓細胞による、ＨＩＶ ｇａｇ ｐ２４ペプチドに反応したＩＦＮ−γ分泌。
【図３】図３は、α−ＤＥＣ ｐ２４およびポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）でのプライム−ブースト免疫後のＨＩＶ ｇａｇ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞反応が性質決定されたことを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５μｇのα−ＤＥＣ−ｐ２４および２、１０、または５０μｇポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）あるいはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）いずれかを皮下注射し、次いで、６週間後、同じ条件でブーストした。ブースト時にのみ、さらなる群を５μｇのα−ＤＥＣ−ｐ２４および５０μｇのポリＩＣで免疫した。２週間後、ＨＩＶ ｇａｇ ｐ２４ペプチド混合物に反応した、ゲート処理ＣＤ３＋脾臓Ｔ細胞における、ＩＦＮ−γ＋、ＴＮＦ−α＋、ＩＬ−２＋、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の頻度を分析した。（Ａ）各ワクチン群に関する、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、またはＩＬ−２を産生しているＣＤ４＋ Ｔ細胞の総頻度。（Ｂ）総サイトカイン反応由来の、３種のサイトカインすべて（赤）、任意の２種のサイトカイン（青）、または任意の１種のサイトカイン（緑）を発現しているＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合。各ワクチン群は円グラフによって絵で示される。サイトカイン産生ＣＤ４＋ Ｔ細胞の総頻度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
微生物による感染を治療可能である。微生物は、ヒトまたは動物被験体に感染しうる。感染は、初発性であってもまたは確立されていてもよい。微生物は、細菌、原生動物、またはウイルス：特に疾患を引き起こすもの（すなわち病原性微生物）であってもよい。本明細書において、用語「微生物」（「ｍｉｃｒｏｂｅ」および「ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ」）は交換可能に用いられる。
【００１８】
細菌は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば、炭疽菌（Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ））、バルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）（ヘンセラ菌（Ｂ． ｈｅｎｓｅｌａｅ））、ボルテテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）（例えば、百日咳菌（Ｂ． ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ））、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）（例えば、ライム病ボレリア（Ｂ． ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ））、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）（例えば、ウシ流産菌（Ｂ． ａｂｏｒｔｕｓ））、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）（例えば、ジェジュニ菌（Ｃ． ｊｅｊｕｎｉ））、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）（例えば、肺炎クラミジア（Ｃ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）（例えば、ボツリヌス菌（Ｃ． ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、Ｃ．ディフィシレ（Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌（Ｃ． ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃ． ｔｅｔａｎｉ））、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（例えば、Ｃ．アミコラツム（Ｃ． ａｍｙｃｏｌａｔｕｍ）、ジフテリア菌（Ｃ． ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ））、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）Ｏ１７５：Ｈ７）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、インフルエンザ菌（Ｈ． ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ）（例えば、ピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ））、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（肺炎桿菌（Ｋ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）（例えば、Ｌ．ニューモフィラ（Ｌ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ））、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）（例えば、リステリア菌（Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（例えば、Ｍ．アビウム（Ｍ． ａｖｉｕｍ）、Ｍ．ボビス（Ｍ． ｂｏｖｉｓ）、Ｍ．ブランデリ（Ｍ． ｂｒａｎｄｅｒｉ）、らい菌（Ｍ． ｌｅｐｒａｅ）、結核菌（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）（例えば、Ｍ．ゲニタリウム（Ｍ． ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、肺炎マイコプラズマ（Ｍ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）（例えば、淋菌（Ｎ． ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、ニューモシスチス属（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）（例えば、Ｐ．カリニ（Ｐ． ｃａｒｉｎｉｉ））、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）（例えば、Ｒ．リケッチア（Ｒ． ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、発疹熱リケッチア（Ｒ． ｔｙｐｈｉ））、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（例えば、サルモネラ菌（Ｓ． ｅｎｔｅｒｉｃａ））、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）（例えば、志賀赤痢菌（Ｓ． ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ））、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓ． ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ））、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、肺炎球菌（Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）（例えば、梅毒トレポネーマ（Ｔ． ｐａｌｌｉｄｕｍ））、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）（例えば、コレラ菌（Ｖ． ｃｈｏｌｅｒａｅ）、Ｖ．ブルニフィクス（Ｖ． ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ））、またはエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）（例えば、ペスト菌（Ｖ． ｐｅｓｔｉｓ）の種であってもよい。これらには、グラム陰性またはグラム陽性細菌、クラミジア、スピロヘータ、マイコバクテリア、およびマイコプラズマが含まれる。
【００１９】
原生動物は、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）（例えば、Ｃ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルブム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ））、エントアメーバ属（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）（例えば、赤痢アメーバ（Ｅ． ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ））、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）（例えば、腸鞭毛虫（Ｇ． ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、ランブル鞭毛虫（Ｇ． ｌａｍｂｌｉａ））、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）（例えば、アマゾンリーシュマニア（Ｌ． ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）、ブラジルリーシュマニア（Ｌ． ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉ）、ドノバンリーシュマニア（Ｌ． ｄｏｎｏｖａｎｉ）、メキシコリーシュマニア（Ｌ． ｍｅｘｉｃａｎａ）、熱帯リーシュマニア（Ｌ． ｔｒｏｐｉｃａ））、プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ． ｖｉｖａｘ））、トキソプラズマ属（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）（例えば、トキソプラズマ原虫（Ｔ． ｇｏｎｄｉｉ））、またはトリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）（例えば、ブルセイトリパノソーマ（Ｔ． ｂｒｕｃｉ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔ． ｃｒｕｚｉ））の種であってもよい。
【００２０】
ウイルスは、ヒトおよび動物に感染するＤＮＡまたはＲＮＡウイルスであってもよい。ＤＮＡウイルスには、アデノウイルス科、イリドウイルス科、パピローマウイルス科、ポリオウイルス科、およびポックスウイルス科（Ｉ群二本鎖ＤＮＡウイルス）；パルボウイルス科（ＩＩ群一本鎖ＤＮＡウイルス）に属するものが含まれる。ＲＮＡウイルスには、ビルナウイルス科およびレオウイルス科（ＩＩＩ群二本鎖ＲＮＡウイルス）；アルテリウイルス科、アストロウイルス科、カリシウイルス科、ヘペウイルス科、およびロニウイルス科（ＩＶ群プラス鎖一本鎖ＲＮＡウイルス）；ならびにアレナウイルス科、ボルナウイルス科、ブンヤウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、およびラブドウイルス科（Ｖ群マイナス鎖一本鎖ＲＮＡウイルス）に属するものが含まれる。特異的に形成した二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）はまた、ヘルペスウイルス科由来のＤＮＡウイルス、ならびにフラビウイルス科、ヘパドナウイルス科、オルトミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、レトロウイルス科、およびトガウイルス科由来のＲＮＡウイルスによる感染を治療することが知られ；これらの科のウイルスは、本発明の範囲内に含まれる可能性もまた含まれない可能性もある。
【００２１】
異常な増殖を経ている被験体細胞は、新生物または腫瘍（例えば、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫）、特に腫瘍ウイルス（例えば、形質転換遺伝子または癌原遺伝子を所持するＤＮＡまたはＲＮＡウイルス）によって形質転換されたか、またはそうでなければ癌と関連するウイルスに感染した細胞であってもよい。例えば、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）は、鼻咽頭癌、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、および他のＢ細胞リンパ腫に関連し；ヒトＢ型およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＢＶおよびＨＣＶ）は肝癌に関連し；ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）はカポジ肉腫に関連し；ヒトパピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、またはその組み合わせ）は、子宮頸癌、肛門癌、および性器疣贅に関連し；そしてヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）は、Ｔ細胞白血病またはリンパ腫に関連する。癌には、胃腸系（例えば、食道、結腸、腸、回腸、直腸、肛門、肝臓、膵臓、胃）、尿生殖器系（例えば、膀胱、腎臓、前立腺）、筋骨格系、神経系、肺系（例えば肺）、また生殖器系（例えば、子宮頸部、卵巣、精巣）から生じるものが含まれる。
【００２２】
ポリ（リボイノシン酸）は、部分的に、ポリ（リボシトシン酸１２ウラシル酸）にハイブリダイズし、そしてｒＩｎ・ｒ（Ｃ１２Ｕ）ｎとして示されうる。他の使用可能な特異的に形成したｄｓＲＮＡは、ｎが４〜２９の整数であるポリ（ＣｎＵ）およびポリ（ＣｎＧ）から選択されるコポリヌクレオチドに基づくか、またはポリリボシチジン酸（ｒＣｎ）鎖に沿って非対形成塩基（ウラシルまたはグアニン）を取り込むようにｒＩｎ・ｒＣｎを修飾することによって形成される、ポリリボイノシン酸およびポリリボシチジン酸の複合体のミスマッチ類似体である。あるいは、ミスマッチｄｓＲＮＡは、ポリリボイノシン酸（ｒＩｎ）のリボシル主鎖を修飾することによって、例えば２’−Ｏ−メチルリボシル残基を含めることによって、ｒ（Ｉ）・ｒ（Ｃ）ｄｓＲＮＡに由来してもよい。ミスマッチｄｓＲＮＡを、リジンセルロースなどのＲＮＡ安定化ポリマーと複合体化してもよい。ｒＩｎ・ｒＣｎのこれらのミスマッチ類似体のうち、好ましいものは、一般式ｒＩｎ・ｒ（Ｃ１１−１４Ｕ）ｎのものであり、そして本明細書に援用される米国特許４，０２４，２２２および４，１３０，６４１に記載される。該文献に記載されるｄｓＲＮＡは、一般的に、本発明にしたがって使用するのに適している。米国特許５，２５８，３６９もまた参照されたい。
【００２３】
経腸（例えば、経口、栄養管、浣腸）、局所（例えば、皮膚上で作用するパッチ、直腸または膣中で作用する座薬）、および非経口（例えば、経皮パッチ；皮下、静脈内、筋内、皮内、または腹腔内注射；頬側、舌下、または経粘膜；鼻内または気管内吸入または滴下）を含む、任意の適切な局所または全身性経路によって、特異的に形成したｄｓＲＮＡを投与してもよい。核酸を、吸入のため微粒子化しても、注射または滴下のため、ビヒクル中に溶解しても（例えば滅菌緩衝生理食塩水または水）、あるいはターゲティング化送達のため、リポソームまたは他のキャリアー中に被包してもよい。好ましいのは、抗原提示細胞および上皮上のＴＬＲ３受容体に核酸をターゲティングするキャリアーである。例えば、未成熟樹状細胞を、皮膚、粘膜、またはリンパ組織中で接触させてもよい。好ましい経路は、被験体の状態および年齢、感染性または新生物疾患の性質、ならびに選択した活性成分に応じて多様であってもよいことが認識されるであろう。
【００２４】
核酸の推奨される投薬量は、ウイルス感染または腫瘍負荷を治療する際の、被験体の臨床状態および医師または獣医師の経験に応じるであろう。用量および／または頻度は、医師または獣医師によって被験体の状態に応じて多様でありうるが、７０ｋｇの被験体に、週２回のスケジュールで静脈内注入によって、特異的に形成したｄｓＲＮＡを約２００ｍｇ〜約４００ｍｇで投与してもよい。ＴＬＲ３を発現する細胞または組織、特に抗原提示細胞（例えば樹状細胞およびマクロファージ）および内皮（例えば呼吸器系および胃系）が、核酸送達に好ましい部位である。特異的に形成したｄｓＲＮＡの効果は、ＴＬＲ３遺伝子の突然変異（例えば欠失）、その発現の下方制御（例えばｓｉＲＮＡ）、ＴＬＲ３のリガンド結合部位への競合剤（例えば中和抗体）の結合または受容体アンタゴニスト、あるいはＴＬＲ３シグナル伝達経路の下流構成要素（例えばＭｙＤ８８またはＴＲＩＦ）での干渉によって阻害または遮断可能である。
【００２５】
ＡＭＰＬＩＧＥＮ（登録商標）ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）は、以前は利用可能でなかった免疫系に対するＴＬＲ３活性化の影響を解体する、選択的剤を提供する。ＴＬＲアダプターＭｙＤ８８およびＴＲＩＦのような他の剤は、それぞれ、すべてのＴＬＲまたはＴＬＲ３／ＴＬＲ４によるシグナル伝達を仲介する。したがって、ＭｙＤ８８またはＴＲＩＦを通じたシグナル伝達の活性化または阻害は、その生物学的影響を、ＴＬＲ３によって仲介されるものに限定しない。ＴＬＲ３およびそのシグナル伝達の存在は、ＡＭＰＬＩＧＥＮ（登録商標）ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）が受容体アゴニストとして作用するための必要条件であるため、アゴニストの投与前に、被験体の細胞または組織における、ＴＬＲ３突然変異の非存在、ＴＬＲ３タンパク質の存在、損なわれていないＴＬＲ３仲介性シグナル伝達、あるいはそれらの任意の組み合わせに関してアッセイしてもよい。ＴＬＲ３活性のこうした確認を、アゴニストの投与前、投与中、または投与後に行ってもよい。アゴニストを用いて、他のＴｏｌｌ様受容体またはＲＮＡヘリカーゼを活性化することなく、免疫反応を、ＴＬＲ３の活性化に限定することも可能である。例えば、異常なサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２）産生または同時刺激分子（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６）シグナル伝達が、少なくとも、微生物による感染、異常な細胞増殖、自己免疫損傷、または神経変性から生じている可能性もある。ＴＬＲ３の特異的アゴニストとしてポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）を用いることによって、この異常性を再調節してもよい。抗原（またはそのペプチド類似体）を、１以上の抗原提示細胞の細胞表面に特異的に結合するリガンド（または受容体）（特にエンドソーム−ファゴソーム内在化経路の構成要素）にコンジュゲート化することによって、抗原提示が改善されうる。特異的結合分子は、細胞表面分子に対する抗体、またはその誘導体（例えばＦａｂ、ｓｃＦｖ）であってもよい。
【実施例】
【００２６】
実施例１
ヒト被験体
ヒト患者をインフォームドコンセントとともに登録し、そして血清サイトカインレベルおよび樹状細胞成熟マーカー発現のさらなる分析のための潜在的な志願者として、研究責任者が選択した。患者は新たに登録されても、またはポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）で治療再開してもよかった。
【００２７】
免疫パネルの実行
本発明者らの免疫パネルは、サイトカイン血清レベル（インターフェロン、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２）および血液細胞上の免疫マーカー（ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６）の測定からなる。こうした測定を承諾した患者に関して、最初の２００ｍｇ、およびそれに続く４００ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）注入前、ならびに注入の４±１／２、２４±２、および７２±２時間後に、新規登録被験体およびｐ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）注入で治療再開した被験体から、血液試料を収集した。明記する収集時間は、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）注入間の期間中の時点を含むように選択された。これらの試料に対して免疫パネルを実行した。サイトカイン分析のため、血液試料由来の血清を−７０℃で凍結し、そして研究場所からＨｅｍｉｓｐｈｅｒｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ， Ｉｎｃ．（ニュージャージー州ニューブルンスウィック）に、凍結して輸送した。また、Ｃｅｌｌｄｅｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．（ニュージャージー州フィリップスバーグ）によるＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６のフローサイトメトリー分析のため、ヘパリン処理全血試料を研究部位から周囲温度で一晩かけて輸送した。
【００２８】
製造者の指示にしたがって、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを用いて、インターフェロン（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）および炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０）レベルを測定した。
【００２９】
ＥＬＩＳＡキット
【００３０】
【表１】
【００３１】
キットはＰＢＬ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイおよびＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カリフォルニア州カマリロのものであった。
【００３２】
Ｃｅｌｌｄｅｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．（ニュージャージー州フィリップスバーグ）と、ＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６発現のフローサイトメトリー分析に関して契約した。一晩の輸送後、受け取り１時間以内に血液試料を染色した。細胞マーカー分析および赤血球溶解には、標準的フローサイトメトリー法を使用した。高いＨＬＡ−ＤＲ発現を伴う、単球、リンパ球、およびＮＫ細胞マーカーの低レベル発現に基づいて、樹状細胞を同定した。また、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ１２３発現にしたがって、樹状細胞を性質決定した。側方散乱分析および単球系譜マーカーの発現によって単球を同定した。細胞タイプ同定後、ＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６発現の分析を行った。健康な志願者由来の測定は対照として働き、そしてＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６などの成熟ＤＣに関するマーカー発現の正常な分布およびレベルを示した。
【００３３】
結果
サイトカインレベル：各患者に関するサイトカイン分析の結果を、表１および２に提示する。ブランク標準に比較して、負の吸光度値を有する結果、または製造者によって報告されるようなキットの検出限界（ＤＬ）以下である結果に対する値として、ゼロを用いた。製造者がＤＬを明記しないか、またはＤＬが所定の値未満であると示した場合、すべての結果を用いた。製造者が、予期される正常サイトカイン範囲を提供する場合、参考のためにこれらを含めた。
【００３４】
表１． ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）注入後のインターフェロンレベルの動力学
【００３５】
【表２−１】
【００３６】
【表２−２】
【００３７】
ＮＲ、正常範囲； ＮＰ、キット製造者によって提供されない
表２． ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）注入後のサイトカインレベルの動力学
【００３８】
【表３−１】
【００３９】
【表３−２】
【００４０】
ＮＲ、正常範囲； ＮＰ、キット製造者によって提供されない
平均値および標準偏差（ＳＤ）を計算した。しかし、患者が少数であり、そしてデータにばらつきがあるため、平均値の解釈は限定されている。ベースライン・サイトカインレベルは、患者間で広く多様であった。免疫系活性化の指標の不一致は、慢性疲労症候群（ＣＦＳ）と診断された患者に特徴的であるため、これは驚くべきことではなく、そしてこのため、診断試験を開発することが困難となっている。データ解釈を容易にするため、サイトカインデータを患者ごとに提示する。データの記述的考察を提示する。統計分析は行わなかった。
【００４１】
４人の患者のうち３人では、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γの注入前レベルが上昇しており、そして４人のうち２人では、ＩＦＮ−βの注入前レベルが高かった。ＩＦＮ−αレベルの変化を考慮すると、１人の患者（ＬＤＭ−０１０）は、すべての続く時点で、注入前より低いレベルを有し、１人の患者（ＪＯＧ−０２０）は、すべての時点で、検出不能なレベルを有し、そして２人の患者は、少なくとも１つの注入後時点で、増加したレベルを有した。ＩＦＮ−αの最大増加は、注入前レベルの２％〜１５％上であった。すべての時点でＩＦＮ−αが検出不能レベルであった同じ患者（ＪＯＧ−０２０）ではまた、ＩＦＮ−βレベルも検出不能であった。すべての他の患者は、少なくとも１つの時点で、増加したＩＦＮ−βレベルを有したが、１人の患者（ＤＭＭ−１１１）の増加は、他の患者に関して測定されたレベルより、実質的に低かった（約０．１％）。他の２人の患者のＩＦＮ−βの最大増加は、注入前レベルより４．３％〜１２％高い範囲であった。１人を除き、すべての患者が、少なくとも１つの注入後時点で、ＩＦＮ−γの増加を示した；第四の患者（ＬＤＭ−０１０）は、すべての時点で、検出不能なレベルを有した。患者のうち２人に関しては、ＩＦＮ−γの最大増加は、注入前レベルより３．７％および２１％高い範囲であった。１人の患者（ＤＭＭ−１１１）は、注入４時間後、注入前レベルを超える３９７％の増加を示したが、続く測定値は、注入前ベースライン未満であった。すべての患者が、注入７２時間後までに、注入前レベル以下のＩＮＦ−α、ＩＦＮ−β、およびＩＦＮ−γレベルを有した。
【００４２】
すべての患者は、０〜２０ｐｇ／ｍＬの健康な個体に関して予期される範囲に基づいて、ＴＮＦ−αの正常な注入前レベルを有した。注入前レベルに比較して、すべての患者は、各注入後時点に、ＴＮＦ−αの小さな増加を示したものの、１人の患者（ＤＭＭ−１１１）のレベルは、４時間および２４時間の時点と比較して、７２時間の時点で減少したが、すべての患者が正常範囲内に留まった。最大ＴＮＦ−α増加は、注入前レベルより３２％〜２４１％上の範囲であった。ＴＮＦ−αと同様、各時点でのＩＬ−１０に関する平均結果は、予期される正常濃度より低かった。２人の患者（ＬＤＭ−１０１、ＪＯＧ−０２０）は、予期される範囲内の上昇を示し、そして２人（ＪＬＣ−１０９、ＤＭＭ−１１１）は、予期される濃度を超える増加を有した。１人の患者のみ（ＤＭＭ−１１１）が、７２時間後に、予期される濃度より高いＩＬ−１０レベルを有し；７２時間後のこの患者のＩＬ−１０レベルは、注入前レベルより、３倍高かった。すべての患者で、ＩＬ−１２ｐ７０の注入前レベルが上昇しており（予期される範囲は、０．７９ｐｇ／ｍＬまで）、そして１人を除き、すべての患者が、すべての時点で、注入前レベルより高い増加を維持していた。持続したＩＬ−１２ｐ７０増加を示さない１人の患者（ＤＭ−１１１）では、７２時間の時点で、注入前レベルより２．２％減少した。最大ＩＬ−１２ｐ７０増加は、注入前レベルより３２％〜１５８％高い範囲であった。
【００４３】
４人の患者のうち３人では、ＩＬ−６の注入前レベルが上昇していた。１人の患者（ＪＯＧ−０２０）では、注入前に比較して、すべての続く時点で、ＩＬ−６レベルが減少していた。検出不能なＩＬ−６注入前レベルを持つ１人の患者（ＤＭＭ−１１１）に関しては、レベルは注入４時間後に高レベルに増加し、次いで、ベースラインに戻った。同じ患者は、注入４時間後に、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのピークを示した。１人の患者のみ（ＬＤＭ−０１０）、７２時間後、注入前レベルより高いＩＬ−６レベルを有した。１人の患者のみ（ＤＭＭ−１１１）、注入前に検出可能なＩＬ−１０レベルを有し、そして該レベルは、１ｐｇ／ｍＬ未満の予期される濃度を大きく超えては上昇していなかった。
【００４４】
サイトカイン分析結果によって、ＩＬ−１２ｐ７０の上昇した注入前レベル、およびポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）注入７２時間後の穏やかな増加が示される。しかし、監視した注入後期間に渡って、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、およびＩＦＮ−γレベルには明らかな相違はなく、平均ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０レベルは、各時点で予期される正常範囲内であり、そしてＩＬ−６反応は、４人の患者のうち３人に関して、注入７２時間後までに、注入前レベルまで減少した。結論として、炎症促進性サイトカイン、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−１２を含むサイトカインレベルの調節の実質的なパターンは示されなかった。
【００４５】
樹状細胞成熟マーカー
陽性染色細胞の割合として、そして発現レベル（平均蛍光強度、ＭＦＩ）によって、ＤＣ成熟マーカー分析の結果を報告し、そして別に示さない限り、平均（ＳＤ）として示す。ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）で治療していない健康な志願者に関するデータを比較のために報告する。ＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６データが大きくばらついているため、個体に基づく結果を詳述する表を含める。統計分析は行わなかった。
【００４６】
ＣＤ１２３＋ ＤＣ、ＣＤ１１＋ ＤＣ、および単球の平均（ＳＤ）の割合を表３に提示する。健康な志願者の値を正常値として含めた（表４を参照されたい）。統計分析は行わなかった。健康な志願者には、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）を注入しなかった。ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）注入に比較した明記する時点でのＣＦＳ患者の値を報告する。各時点で、すべての患者に関するすべての測定値に渡って、平均値を計算した。
【００４７】
表３． 細胞集団に対するポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）の影響
【００４８】
【表４】
【００４９】
ａ健康な志願者には、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）を注入しなかった
表４． 健康な志願者における樹状細胞タイプの割合に関する個々の結果
【００５０】
【表５−１】
【００５１】
【表５−２】
【００５２】
【表５−３】
【００５３】
ＣＦＳ患者の注入前の値は、健康な志願者のレベルに匹敵し； ＣＤ１１＋細胞の割合は、平均およびＳＤによって定義されるような、健康な志願者の範囲の下限であった。平均値は、注入４時間後のＣＤ１２３＋細胞に関して、そして注入２４時間後のＣＤ１１＋細胞および単球に関して測定されたものより低かった。試料が少数であるため、１人の患者が経験した変化が、結果に著しく影響する可能性もあった。例えば、患者ＤＭＭ−１１１では、注入前から注入４時間後までに、ＣＤ１２３＋細胞の割合が１０倍低下した（表５を参照されたい）。１つの一貫した変化は、注入２４時間後にＣＦＳ患者によって示される単球の割合の減少であった。単球数は、注入７２時間後までに回復した（表５を参照されたい）。総合して、ＣＤ１２３＋細胞、ＣＤ１１＋細胞、および単球の割合は、わずかに低かったが、健康な志願者の値の範囲から外れなかった。
【００５４】
一般的に、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）での治療は、成熟ＤＣマーカー、ＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６を発現する細胞の割合を減少させ、そしてこれらの発現レベルを増加させた。ＣＦＳ患者は、開始時に、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）を投与されない健康な志願者より低い発現レベルを有する、より多くの陽性細胞を伴う傾向があった。したがって、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）が陽性細胞数を減少させ、そしてＤＣ成熟マーカー発現レベルを増加させる能力があることから、ＣＦＳ患者のプロフィールは、健康な志願者のものにより緊密に似るように、正常化された。
【００５５】
表５． ＣＦＳ患者における樹状細胞タイプの割合に関する個々の結果
【００５６】
【表６−１】
【００５７】
【表６−２】
【００５８】
個々の患者の結果は、表６〜８に示す平均変化を反映する傾向があり、注入２４時間後および７２時間後の時点で、陽性細胞の比率の減少および発現レベルの増加を伴った。このパターンにはいくつかの例外があった。例えば、ＣＤ８０およびＣＤ８６発現細胞の割合は、ＣＤ１１＋細胞中では、ＣＤ１２３＋細胞中と同程度に顕著には減少しなかった。さらに、ＣＦＳ患者由来の単球は、ＣＤ８６を発現する細胞の割合およびＣＤ８６発現レベルに関して、健康な志願者由来のものと類似であった。
【００５９】
表６． ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）注入後、ＣＤ１２３＋樹状細胞中での成熟マーカー発現の動力学
【００６０】
【表７】
【００６１】
ａ健康な志願者にはポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）を投与しなかった；ｂＭＦＩ、平均蛍光強度
表７． ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）注入後、ＣＤ１１＋樹状細胞中での成熟マーカー発現の動力学
【００６２】
【表８】
【００６３】
ａ健康な志願者にはポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）を投与しなかった；ｂＭＦＩ、平均蛍光強度
表８． ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）注入後、単球中での成熟マーカー発現の動力学
【００６４】
【表９】
【００６５】
ａ健康な志願者にはポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）を投与しなかった；ｂＭＦＩ、平均蛍光強度
要約すると、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）注入は、ＣＤ１２３＋ ＤＣ、ＣＤ１１＋ ＤＣ、または単球の数に劇的には影響を及ぼさなかった。ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）治療に続いて、ＣＦＳ患者では、成熟マーカーを発現しているＤＣの割合およびＣＤ成熟マーカー発現レベルが正常化された。これらの傾向、特にＣＤ成熟マーカーの増加は、４人の患者すべてで一貫して観察され、サイトカインレベル調節では認識されない独特のパターンを明らかにした。
【００６６】
実施例２： ｄｓＲＮＡは耐久性および防御性の適応免疫を誘導する
ＣＤ４＋ Ｔｈ１型免疫は、包括的な感染性疾患に対する抵抗性に関連づけられる。ＨＩＶワクチンによって誘導されるＴ細胞免疫の有効性を改善するため、損なわれていないリンパ組織中の樹状細胞（ＤＣ）の機能を直接利用する、タンパク質に基づくアプローチを発展させた。抗原提示の受容体であるＤＥＣ−２０５をターゲティングする抗体によって、抗原性タンパク質を樹状細胞に選択的に送達する。ｄｓＲＮＡは、独立に、アジュバントとして働き、ＤＣをターゲティングするタンパク質が、粘膜表面（すなわち気道）で、防御性ＣＤ４＋ Ｔ細胞反応を誘導するのを可能にする。ｄｓＲＮＡとともに、ＤＥＣをターゲティングするＨＩＶ ｇａｇ ｐ２４を２回投薬した後、免疫ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、防御性機能と相関する定性的特徴を有する。Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２を、同時に、多量に、そして延長された期間、産生する。Ｔ細胞はまた、ＨＩＶ ｇａｇ ｐ２４に反応して増殖し、そしてＩＦＮ−γを分泌し続ける。ポリ（Ｉ：Ｃ）のアジュバントの役割は、ＴＬＲ３およびＭＤＡ５受容体を必要とするが、類似のポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）は、ＴＬＲ３のみを必要とする（以下の結果を参照されたい）。ポリ（Ｉ：Ｃ）およびポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）はどちらも、ＤＣをターゲティングするワクチンとともに用いた場合、安全なアジュバントであり、多重機能性および増殖能のような特徴を持つＣＤ４＋ Ｔｈ１細胞を豊富に誘導する。
【００６７】
Ｔ細胞が仲介する免疫は、ＨＩＶ、マラリア、および結核のような包括的な感染性疾患に対する抵抗性に関連づけられる。非常に重要な構成要素は、ＣＤ４＋ Ｔｈ１ヘルパー細胞であり、該細胞は、多量のＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを産生し、ＭＨＣクラスＩＩ＋ターゲットに対して細胞溶解活性を発揮し、そして機能するＣＤ８＋ Ｔメモリー細胞を維持する。
【００６８】
樹状細胞は、Ｔ細胞に基づく強い反応を誘導する、抗原提示細胞である。例えば、エンドサイトーシス受容体ＤＥＣ−２０５（「ＤＥＣ」）を発現する樹状細胞サブセットにｅｘ ｖｉｖｏで抗原を装填し、そしてマウスに再注入した際、樹状細胞は、主にＩＦＮ−γを産生する抗原特異的ヘルパーＴ細胞を拡大する。ｉｎ ｖｉｖｏで、ＤＥＣ＋樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ産物両方に対して抗原提示を仲介し、それぞれ、キラーおよびＴヘルパー細胞のクローン性拡大を導く。ワクチン設計においてＤＣ生物学をよりよく利用するため、本発明者らは、抗原をエンドサイトーシス受容体ＤＥＣ−２０５に直接ターゲティングするアプローチを開発した。
【００６９】
外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）抗原に対して免疫するためには、樹状細胞は、抗原の取り込みとともに、分化するかまたは成熟しなければならない。この成熟は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）などのパターン認識受容体に対する化学的に定義されたリガンドを含む、アジュバントを用いて達成可能である。ＴＬＲリガンドのタイプは、免疫反応の結果に影響する。マウスおよびサルにおける、抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋免疫に関しては、ＨＩＶ ｇａｇ ｐ４１に対するＴＬＲ７／８リガンドのコンジュゲートを含むＴＬＲリガンドが、活性アジュバントとして働く。
【００７０】
パターン認識受容体のリガンドは、ＤＣをターゲティングするＨＩＶワクチンを用いた、Ｔ細胞に基づく防御免疫のための、潜在的に安全なアジュバントとしては評価されてきていない。ｄｓＲＮＡをアジュバントとして単独で導入して、ｄｓＲＮＡが、ＤＣをターゲティングするワクチンを補助して（ａｄｊｕｖａｎｔ）、現在の基準で質的におよび量的に頑強（ｒｏｂｕｓｔ）であり、そしてまた肺感染モデルにおいて防御性である、ＣＤ４＋ Ｔ細胞免疫を誘導することを示した。
【００７１】
外来タンパク質に対する免疫の発展には、アジュバントの同時投与が必要である。ｄｓＲＮＡは、α−ＤＥＣ−ＨＩＶ ｇａｇ ｐ２４に対して強いＣＤ４＋ Ｔ細胞反応を誘導する優れたアジュバントであることが示されており：すなわち、ＩＦＮ−γを分泌するＴ細胞の頻度は、総ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞の０．２〜６％に相当した。しかし、ワクチンのプライミングおよびブースター用量両方の間にポリ（Ｉ：Ｃ）が必要であった。
【００７２】
当該技術分野に長く感じられてきた必要性は、自然感染またはワクチン接種中の高品質な防御性Ｔ細胞のための基準を定義することである。アジュバントとしてｄｓＲＮＡを用いることによって誘導されたＣＤ４＋ Ｔ細胞の性質を評価するため、α−ＤＥＣ−ｐ２４および段階的な用量のポリ（Ｉ：Ｃ）を６週間に渡って投与した。１つの群にはα−ＤＥＣ−ｐ２４およびポリ（Ｉ：Ｃ）をブースト時にのみ投与した。ブースト２週間後、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、またはＩＬ−２を産生しているｇａｇ特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞の頻度は、２回投与のα−ＤＥＣ−ｐ２４ ｍＡｂおよび５０μｇポリ（Ｉ：Ｃ）で最大であった。
【００７３】
個々のｇａｇ特異的Ｔ細胞が多数のサイトカインを分泌する能力を調べた。こうした多機能Ｔ細胞は、ＨＩＶを含む感染性病原体を選択する防御免疫により効果的に寄与する。α−ＤＥＣ−ｐ２４および５０μｇポリ（Ｉ：Ｃ）でのプライム−ブースト免疫の２週間後、およそ５０％のｇａｇ特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、３つのサイトカイン：ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２すべてを産生する。サイトカイン産生細胞の総頻度は、２回投与のα−ＤＥＣ−ｐ２４および１０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）、または単回投与のα−ＤＥＣ−ｐ２４および５０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）でより少なかった。ｇａｇ反応性細胞によって作製される各サイトカインの量（中央値蛍光強度またはＭＦＩ）を評価したが、これはこのパラメーターが、森林型熱帯リーシュマニア（Ｌ． ｍａｊｏｒ）モデルにおける防御ＣＤ４＋免疫に関する重要な関連要因であるためである。３つのサイトカイン（すなわち、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２）を産生する細胞のＭＦＩは、２つまたは１つのみのサイトカインを産生する細胞のＭＦＩよりも高かった。したがって、α−ＤＥＣ−ｐ２４およびｄｓＲＮＡで誘導したエフェクターＣＤ４＋ Ｔ細胞は、多重機能性および高サイトカイン産生などの優れたＴｈ１免疫と一般に関連する特徴を有する。
【００７４】
α−ＤＥＣ−ｐ２４に加えてポリ（Ｉ：Ｃ）でプライム−ブースト免疫した後の、ＨＩＶ ｇａｇに特異的な、サイトカイン産生（「エフェクター」）ＣＤ４＋ Ｔ細胞の持続を評価するため、ブースト２週間後および７週間後に分析を行った。ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウス各々における３回の実験に関してデータを要約すると、適応エフェクターＣＤ４＋ Ｔ細胞は、少なくとも７週間持続することが示された。興味深いことに、３つのサイトカイン（すなわち、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２）すべてを産生する細胞の割合は、ブースト２週間後から７週間後まで、安定なままであった。したがって、ｄｓＲＮＡで補助したプライム−ブースト免疫後、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞は、数週間持続した。
【００７５】
最近の知見によって、ＣＤ４＋ Ｔｈ１細胞が増殖し、そしてＨＩＶ−１に対してＩＦＮ−γを産生する能力は、低いＨＩＶ−１ ＲＮＡおよびプロウイルスＤＮＡ装填に強く関連することが示されている。したがって、これらのＴ細胞の特徴が、ＤＣをターゲティングするワクチンによって誘導可能であるかどうかを評価した。ブースト２週間後、ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、増殖し、そしてＩＦＮ−γを産生することによって、ｇａｇ ｐ２４に特異的に反応した。陰性対照（すなわちｇａｇ ｐ１７ペプチド混合物）に対しては反応がなかった。２回投与のα−ＤＥＣ−ｐ２４に加えて１０μｇまたは２μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）、あるいは１回投与のα−ＤＥＣ−ｐ２４に加えて５０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）を用いると、反応するＣＤ４＋ Ｔ細胞はより少なくしか見られなかった。したがって、α−ＤＥＣ−ｐ２４およびｄｓＲＮＡでのプライム−ブースト免疫は、増殖するＣＤ４＋ Ｔ細胞を誘導する。
【００７６】
次いで、α−ＤＥＣ−ｐ２４およびポリ（Ｉ：Ｃ）でのプライム−ブースト免疫後の増殖性ＨＩＶ ｇａｇ特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞の持続を評価した。ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウス各々における３回の実験由来の結果から、こうしたＣＤ４＋ Ｔ細胞が脾臓において少なくとも７週間持続することが示された。したがって、α−ＤＥＣ−ｐ２４および５０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）でのプライム・ブーストは、長寿命の増殖性ＩＦＮ−γ分泌性ＣＤ４＋ Ｔ細胞を誘導する。
【００７７】
さらに、ポリ（Ｉ：Ｃ）はまた、α−ＤＥＣ−ｎｅｆに対するＣＤ４＋ Ｔ細胞反応のアジュバントとしても働く。免疫によって、増殖性ＩＦＮ−γ分泌性ＣＤ４＋ Ｔ細胞を誘発した。これらは、ｄｓＲＮＡをアジュバントとして用いると、優れた量および質のＣＤ４＋ Ｔ細胞が、ｎｅｆおよびｇａｇ両方のＨＩＶ抗原に反応することを示す。
【００７８】
ｄｓＲＮＡが、粘膜表面で、長く持続する防御免疫を生成可能であるかどうかを決定するため、ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスにワクチン接種し、そして次いで、該マウスを、α−ＤＥＣ−ｇａｇおよびポリ（Ｉ：Ｃ）でのプライム−ブースト免疫の６〜８週間後、組換えワクシニア−ｇａｇウイルスに鼻内曝露した。最初の防御実験では、単回投与の５０μｇポリ（Ｉ：Ｃ）は、最適防御および肺におけるウイルス力価減少を生じた。ポリ（Ｉ：Ｃ）のこの用量を用いて、より詳細な研究を行った。ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウス各々における３回の実験由来の結果によって、陰性対照（すなわちＰＢＳ）を注射したマウスでは体重が減少し、そして６〜７日に渡って、肺においてウイルスの高い力価（＞１０８ＰＦＵ／ｍｌ）が発展することが示された。体重損失およびウイルス増殖のどちらの基準によっても、２回投与のα−ＤＥＣ−ｐ２４および５０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）は、２回投与の対照Ｉｇ−ｐ２４または１回投与のα−ＤＥＣ−ｐ２４に加えたポリ（Ｉ：Ｃ）に比較して、優れた防御を提供した。したがって、α−ＤＥＣ−ｇａｇおよびｄｓＲＮＡでのプライム−ブースト免疫は、粘膜表面で防御を誘発する。
【００７９】
ワクシニア−ｇａｇに曝露する前に、ワクチン接種したマウスからＣＤ４＋細胞を枯渇させると、ワクシニア曝露によって、ＣＤ４＋ Ｔ細胞が防御に寄与することが検証された。また、ＤＥＣ−／−ヌルマウスでも曝露実験を行った。防御の欠如が観察され、ＤＥＣが、ＤＣをターゲティングする防御免疫を発展させるのに必須であることが示された。しかし、ＴＬＲ３−／−ヌルマウスは、２回投与のα−ＤＥＣ−ｐ４１およびポリ（Ｉ：Ｃ）でのワクチン接種後、ワクシニア−ｇａｇ曝露に対して完全に防御された。したがって、ＴＬＲ３はポリ（Ｉ：Ｃ）をアジュバントとして用いる際には、防御に必要ではないが、ＴＬＲはポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）の作用に必須である。
【００８０】
ポリ（Ｉ：Ｃ）の類似体であるポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）は、高用量であっても最小限の毒性を示すが、ポリ（Ｉ：Ｃ）といくつかの免疫調節特性を共有するため、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）もまた、アジュバント活性に関して評価した。ＣｘＢ６ Ｆ１マウスに２回投与のα−ＤＥＣ−ｐ２４に加えて、増加する用量のポリ（Ｉ：Ｃ）またはポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）を注射した。ＨＩＶ ｇａｇ ｐ２４ペプチドに反応したＣＤ３＋ＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖を、ブースト１週間後に測定した。ｄｓＲＮＡのどちらの型もＣＤ４＋ Ｔ細胞反応を誘導し、これは用量依存性であり、そして抗原特異的であった。
【００８１】
ポリ（Ｉ：Ｃ）およびポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）を用いて、アジュバント活性に必要なパターン認識受容体を決定するため、野生型、ＴＬＲ３−／−ヌル、またはＭＤＡ５−／−ヌル遺伝子バックグラウンドのマウスを比較した。ポリ（Ｉ：Ｃ）は、ＴＬＲ３−／−ヌルマウスにおいてある程度のアジュバント活性を示したが、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）は、驚くべきことに、同じ遺伝子バックグラウンドにおいて、ＣＤ４＋ ＩＦＮ−γ分泌性Ｔ細胞を誘発不能であった。どちらのアジュバントも、ＭＤＡ５−／−ヌルマウスにおいて、反応を誘発した。総合すると、データによって、ＴＬＲ３は、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）のアジュバントの役割に必須であるが、ポリ（Ｉ：Ｃ）は、細胞表面受容体ＴＬＲ３および細胞質ゾルセンサーＭＤＡ５の両方を利用可能でありうることが示される。
【００８２】
樹状細胞は、Ｔ細胞が仲介する免疫の強力な誘導因子である。したがって、これらは、ワクチン効能の改善を模索する際の魅力的なターゲットである。例えば、抗原性タンパク質をＡＰＣ特異的表面分子にターゲティングする抗体とのコンジュゲートによって、抗原性タンパク質を選択的に送達する際、抗原提示および免疫反応は、ターゲティングされていない抗原に比較して、はるかに高い有効性で発展する。本明細書で用いる１つの受容体は、エンドサイトーシス受容体ＤＥＣ−２０５またはＣＤ２０５であり、Ｔ細胞領域中の樹状細胞上で発現される。ｄｓＲＮＡを単独でＤＣ成熟刺激として用い、そして記憶を含む、ＣＤ４＋ Ｔ細胞免疫の性質のいくつかの特徴を研究した。本発明者らのデータによって、ｄｓＲＮＡがプライム−ブースト・タンパク質ワクチンのアジュバントとして働き、優れた質および量の、長寿命でそして防御性のＴｈ１ ＣＤ４＋ Ｔ細胞を誘導する潜在能力が明らかになる。
【００８３】
ｄｓＲＮＡをアジュバントとしたＣＤ４＋ Ｔ細胞反応の性質は、まず、その多重機能性によって示され、すなわち該Ｔ細胞はＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２などの多数のそして多量のサイトカインを産生した。ＤＥＣをターゲティングするワクチンが、ＩＦＮ−γを産生し、そして増殖しているＣＤ４＋ Ｔ細胞を高い頻度で誘導することもまた見出され、これは他のワクチンアプローチによる先行技術では示されていない、Ｔ細胞免疫の特徴であった。増殖性でそして多重機能性のＣＤ４＋ Ｔ細胞の頻度増加は、一般に、Ｔｈ１免疫の価値ある特徴と見なされ、そしてＨＩＶの優れた制御および森林型熱帯リーシュマニアモデルにおけるより優れた防御と関連する。
【００８４】
ＤＣをターゲティングするＨＩＶ ｇａｇ ｐ２４を用いた別の興味深い結果は、ＤＥＣ依存性方式での、ワクシニア−ｇａｇに対して長期に持続する防御性ＣＤ４＋ Ｔ細胞免疫の誘導であった。ワクシニアに対する防御へのＣＤ４＋ Ｔ細胞の寄与を検出した。感染に対する抵抗性におけるＩＦＮ−γの非常に重要な役割を考慮すると、高レベルのＩＦＮ−γ、ならびにＣＤ＋ Ｔｈ１ヘルパー細胞がターゲットとする感染ＭＨＣクラスＩＩ＋によるによる溶解は、どちらも、ｄｓＲＮＡとともにＤＥＣにターゲティングされたタンパク質によって誘導される抵抗性に寄与しうる。
【００８５】
ポリ（Ｉ：Ｃ）は、ＴＬＲ３エンドソームおよびＭＤＡ５細胞質ゾル受容体の両方によって認識されうる。ＴＬＲ３およびＭＤＡ５は、どちらも、ポリ（Ｉ：Ｃ）でのアジュバント作用および防御免疫に寄与することが見出された。対照的に、ＴＬＲ３は、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）のアジュバントの役割に独占的に必要である。さらに、ｄｓＲＮＡは、Ｉ型インターフェロンを誘導し、これが樹状細胞による交差提示およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の生存を促進する。
【００８６】
ｄｓＲＮＡは、マウスにおいてワクチンタンパク質に対する免疫原性を増進するアジュバントとして用いられてきているが、やはり防御性であるＣＤ４＋ Ｔ細胞反応を誘導する能力は、以前立証されていなかった。樹状細胞およびそのエンドサイトーシス受容体ＤＥＣ−２０５への、ｄｓＲＮＡをアジュバントとするワクチンタンパク質のターゲティングは、いくつかの広範囲感染性疾患に対する抵抗性に関連づけられる、Ｔｈ１ ＣＤ４＋ Ｔ細胞免疫の特定の種類の発展を支持するはずである。
【００８７】
本明細書に引用する特許、特許出願、書籍、および他の刊行物は、その全体が本明細書に援用される。
【００８８】
数値範囲に言及する際、範囲内のすべての値もまた記載されることを理解しなければならない（例えば、１〜１０にはまた、１および１０の間のすべての整数値、ならびに２〜１０、１〜５、および３〜８などのすべての中間範囲も含まれる）。用語「約」は、数値量の測定値またはばらつきと関連する統計的不確実性を指すことも可能であり、これは、本発明の操作または特許性に影響を及ぼさないことを当業者は理解するであろう。
【００８９】
請求項およびその法的同等物の範囲の意味内に属するすべての修飾および置換は、請求項の範囲内に含まれるものとする。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を唱える請求項は、他の要素が請求項の範囲内に含まれることを可能にする；本発明はまた、「含む」用語の代わりに、移行句「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」（すなわち、これらが本発明の操作に実質的に影響を及ぼさないのであれば、他の要素を請求項の範囲内に含めることを可能にする）または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」（すなわち、本発明に通常関連する不純物または重要ではない活性以外、請求項に列挙される要素のみを許す）を唱える請求項によっても記載される。これらの３つの移行句いずれかを用いて、本発明が請求可能である。
【００９０】
請求項に明確に唱えられない限り、本明細書に記載する要素が、請求する発明の限定と見なされてはならないことを理解しなければならない。したがって、請求項内に読み込まれる明細書から限定されるのではなく、許諾される請求項が、法的保護の範囲を決定するための基礎である。対照的に、先行技術は、請求する発明を予期するかまたは新規性を破壊する特定の態様の度合いまで、本発明から明確に排除される。
【００９１】
さらに、関連が請求項中に明確に唱えられない限り、請求項の限定間または限定中には、特定の関連はまったく意図されない（例えば、製品クレーム中の構成要素の配置、または方法クレーム中の工程の順序は、そのように明確に述べられていない限り、請求項の限定ではない）。本明細書に開示する個々の要素のあらゆるありうる組み合わせおよび順列が、本発明の側面とみなされる。同様に、本発明の説明の一般化は、本発明の一部と見なされる。
【００９２】
前述から、当業者には、本発明の精神または本質的な特性から逸脱することなく、本発明が他の特定の型で具現化されうることが明らかであろう。本発明に提供される法的保護の範囲は、本明細書によってではなく、付随する請求項によって示されるため、記載する態様は、制限ではなく、例示としてのみ見なされなければならない。
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、２００８年２月１５日出願の出願第６１／０２９，３０７号、および２００８年５月８日出願の出願第６１／０５１，６０６号の優先権を請求する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、抗感染剤（例えば、少なくとも１以上の細菌、原生動物、またはウイルスによって引き起こされる感染を治療するかまたは防止するため）、抗増殖剤（例えば、少なくとも、ウイルス誘導性癌を含む癌を治療するため）、および／または免疫刺激剤（例えばワクチン接種を伴いまたは伴わずに、免疫を刺激することによって、少なくとも感染性疾患または癌を治療するため）として使用するための、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）のアゴニストを提供することに関する。医学的治療法および薬剤を製造するためのプロセスを提供する。
【０００３】
ポリ（Ｉ：Ｃ）のような二本鎖ＲＮＡがＴＬＲ３アゴニストとして用いられてきている。しかし、薬剤としての有用性は毒性があるために限定されている。したがって、ＴＬＲファミリーに属する他の受容体ではなく、ＴＬＲ３を特異的にターゲティングすることによって、抗感染剤、抗増殖剤、および／または免疫刺激剤として使用可能な改善された薬剤が探索されている。例えば、望ましい薬剤は、ＴＬＲ３によって仲介されるような過剰な炎症促進反応を誘導することなく、初発性のまたは確立された感染を治療し、前癌状態または癌状態を治療するため、増加した治療指数（例えばＬＤ５０をＥＤ５０で割るような、毒性効果を生じる用量を療法効果を生じる用量で割った比）を有するであろう。
【０００４】
二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）は、２’，５’−オリゴアデニル酸シンテターゼ／ＲＮアーゼＬおよびｐ６８プロテインキナーゼ経路を含む、ｄｓＲＮＡ依存性細胞内抗ウイルス防御機構を通じて、自然免疫（例えば宿主防御の産生）を誘発する。しかし、ポリ（Ｉ：Ｃ）はまた、ＴＬＲ３を活性化し、そしてそれによって炎症促進性ケモカインおよびサイトカインの分泌を誘導する。ＷＯ２００６／０６０５１３、３〜４ページを参照されたい。これは、ＴＬＲ３を選択的に活性化して、有益な免疫の発展を仲介するのではなく、有害な炎症プロセスを開始するかまたは増進する可能性もある。ポリ（Ｉ：Ｃ）は、炎症に関連する壊死、全身性炎症反応症候群、感染関連急性サイトカインストーム、ならびに関節リウマチおよび炎症性腸疾患などの慢性自己免疫疾患を引き起こすと考えられる。ＷＯ２００６／０６０５１３は、多様な徴候に対する薬剤としてＴＬＲ３アンタゴニストを使用すると有益であろうと解説する。したがって、本発明において、ＴＬＲ３の選択的アゴニストが薬剤としての使用を見出すことは驚くべきことであった。
【０００５】
ＨＥＭＩＳＰＨＥＲｘ（登録商標）ＢｉｏｐｈａｒｍａのＡＭＰＬＩＧＥＮ（登録商標）ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）は、抗ウイルスおよび免疫刺激特性を持つが、減少した毒性を示す、特異的に形成されたｄｓＲＮＡである。ＡＭＰＬＩＧＥＮ（登録商標）ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）は、多面的活性を通じてウイルスおよび癌細胞増殖を阻害する：該分子は、他のｄｓＲＮＡ分子と同様、２’，５’−オリゴアデニル酸シンテターゼ／ＲＮアーゼＬおよびｐ６８プロテインキナーゼ経路を制御する。本発明者らは、ここで、本発明者らが特異的に形成したｄｓＲＮＡが、ＴＬＲ３の特異的アゴニストとして作用することによって、体内でその効果を仲介することを発見した。驚くべきことに、特定の微生物に対してのみ有効である他の化学療法剤（例えば抗細菌剤ペニシリン、抗ヘルペス剤イドクスウリジン、および抗マラリア剤クロロキン）と異なり、ポリ（Ｉ：Ｃ１１−１４Ｕ）は、免疫系に直接作用することによって、細菌、ウイルス、および原生動物の治療に有効な抗微生物化学療法剤として、広い適用を有することを本発明者らは解説する。ポリ（Ｉ：Ｃ１１−１４Ｕ）の投与は、有害な炎症プロセスの開始または増進など、ポリ（Ｉ：Ｃ）で観察される副作用を回避する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００６／０６０５１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、抗感染剤、抗増殖剤、および／または免疫刺激剤が必要な患者のための治療を提供することである。２つの二本鎖ＲＮＡが構造的に類似であるにもかかわらず、本発明者らが特異的に形成したｄｓＲＮＡは、ポリ（Ｉ：Ｃ）に比較した際、ＴＬＲ３のより選択的なアゴニストである。それによって、選択的ＴＬＲ３アゴニストに対する長年感じられてきた必要性に取り組んでいる。特に感染性疾患、細胞増殖、および／またはワクチン接種に関与する、被験体を治療するための方法および薬剤を作製するためのプロセスを提供する。さらなる目的および利点を以下に記載する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、初発性のまたは確立された微生物感染、異常な細胞増殖によって特徴づけられる病的状態（例えば新生物または腫瘍）を持つ被験体（例えばヒトまたは動物）を治療するため、あるいは少なくとも感染、異常な細胞増殖、または自己免疫もしくは神経変性による細胞損傷によって引き起こされる疾患または状態に関して被験体を治療する免疫刺激剤として、使用可能である。用いるミスマッチ二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の量が、被験体の免疫細胞上のＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）に結合するのに十分であることが好ましい。それによって、自然免疫または適応免疫を誘発することも可能である。特に、ＴＬＲ４のような他のＴｏｌｌ様受容体、またはＲＩＧ−１もしくはｍｄａ−５のようなＲＮＡヘリカーゼを活性化することなく、あるいは非選択的ＴＬＲ３アゴニストであるポリ（Ｉ：Ｃ）で見られるように過剰な炎症促進性反応を誘導することなく、特異的に形成したｄｓＲＮＡを用いて、ＴＬＲ３を活性化することも可能である。
【０００９】
被験体は、少なくとも１以上の細菌、原生動物またはウイルスに感染していてもよい。ＴＬＲ３に結合するのに十分な量の特異的に形成したｄｓＲＮＡを含む薬学的組成物を、被験体に投与する。特異的に形成したｄｓＲＮＡで治療しない被験体に比較した際の、回復時間の減少、免疫増加（例えば、抗体力価、リンパ球増殖、感染細胞の殺傷、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性の増加）、微生物の分裂または増殖の減少、あるいはこれらの任意の組み合わせによってアッセイされるように、被験体の感染は、該投与によって減少するかまたは排除される。治療によって誘導される免疫は、好ましくは該微生物に特異的である。
【００１０】
被験体は、異常な細胞増殖（例えば新生物または腫瘍、他の形質転換細胞）に苦しめられていてもよい。ＴＬＲ３に結合するのに十分な量の特異的に形成したｄｓＲＮＡを含む薬学的組成物を、被験体に投与する。特異的に形成したｄｓＲＮＡで治療しない被験体の状態に比較した際の、罹患率または死亡率の改善、免疫増加（例えば抗体力価、リンパ球増殖、増殖細胞もしくは形質転換細胞の殺傷、またはＮＫ細胞活性の増加）、増殖細胞または形質転換細胞の分裂または増殖の減少、あるいはこれらの任意の組み合わせによってアッセイされるように、被験体の疾患は、該投与によって減少するかまたは排除される。
【００１１】
被験体において、樹状細胞成熟を誘導してもよい。抗原取り込み可能な未成熟樹状細胞を誘導して、抗原を提示しそして適応免疫反応（例えば抗原特異的Ｔ細胞）をプライミングすることが可能な、より成熟した樹状細胞に分化させてもよい。未成熟な樹状細胞から成熟樹状細胞に変換される間、樹状細胞は、少なくとも、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子、同時刺激分子、接着分子、またはケモカイン受容体の細胞表面発現を変化させるか；抗原取り込みを減少させるか；ケモカイン、サイトカイン、またはプロテアーゼ分泌を増加させるか；樹状突起を成長させるか；細胞骨格を再編成するか；あるいはこれらの組み合わせを行いうる。樹状細胞は、血液またはリンパを通じて、炎症部位またはリンパ組織に遊走するよう誘導され、微生物、新生物または腫瘍細胞、あるいは他の形質転換細胞に近接することも可能である。
【００１２】
少なくとも感染または癌に対して、被験体にワクチン接種してもよい。ときに、例えばウイルス誘導性癌では、感染および癌の両方を治療してもよい。ワクチン接種の直前、接種中または接種直後（例えばワクチン接種１０日以内）、ＴＬＲ３に結合するのに十分な量の特異的に形成したｄｓＲＮＡを含む薬学的組成物を、被験体に投与する。それによって、ワクチンまたは樹状細胞調製物に対する免疫反応を刺激する。ワクチンまたは樹状細胞調製物は、殺した、固定した、または弱毒化した全微生物または細胞（例えば、増殖中のまたは形質転換されたもの）；微生物または細胞（例えば、増殖中のまたは形質転換されたもの）の溶解物または精製分画：１以上の単離微生物抗原（例えば、天然の、化学的に合成された、または組換え産生されたもの）；または１以上の単離腫瘍抗原（例えば、天然の、化学的に合成された、または組換え産生されたもの）で構成されてもよい。ある部位でまたはその部位への循環中で、抗原（例えば天然感染または細胞増殖、または脱落（ｓｈｅｄ）抗原中で産生される）を被験体が産生し、そしてそれに対するアジュバントとして作用する特異的に形成したｄｓＲＮＡを投与することによって、ｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種を達成してもよい。
【００１３】
抗原提示細胞（例えばＢリンパ球、樹状細胞、マクロファージ）および粘膜組織（例えば胃または呼吸上皮）は、体内における、特異的に形成したｄｓＲＮＡの好ましいターゲットである。微生物または腫瘍抗原（単数または複数）を提示してもよく、そして抗原（単数または複数）は、ＴＬＲ３アゴニストとしてのみ作用する特異的に形成したｄｓＲＮＡのみの作用に感受性であるべきである。微生物、癌細胞、または他の形質転換細胞は、ＴＬＲ３アゴニストとしてのみ作用する特異的に形成したｄｓＲＮＡによって活性化される特異的サイトカイン反応パターンに感受性であってもよい。特異的に形成したｄｓＲＮＡは、好ましくは、静脈内注入；皮内、皮下、または筋内注射；鼻内または気管内吸入；あるいは中咽頭または舌下適用によって投与される。
【００１４】
薬剤の使用および作製のためのプロセスもまた提供する。しかし、製品に向けられるクレームは、プロセスの特定の工程が製品クレームにおいて唱えられるのでない限り、必ずしもこれらのプロセスに限定されないことに注目しなければならない。
【００１５】
本発明のさらなる側面は、特定の態様の以下の説明および請求項、ならびにこれらに対する一般化から、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１は、５μｇ α−ＤＥＣ−ｇａｇおよび５０μｇポリ（Ｉ：Ｃ）でのプライム−ブースト免疫が、ワクシニアｇａｇウイルスでの気道曝露に対して防御免疫を提供することを示す。６回の実験：ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウス各々３回（対照Ｉｇ−ｐ２４を除く； ＢＡＬＢ／ｃでｎ＝２）由来の、曝露後の平均±ＳＤとしての（Ａ）平均体重損失および（Ｂ）肺におけるワクシニア・プラーク形成力価。示すワクチンで、マウスを６週間間隔でプライミングし、そしてブーストした。ブースト時にのみ、別の群をα−ＤＥＣ−ｐ２４およびポリ（Ｉ：Ｃ）で免疫した。ブーストの６〜８週間後、マウスを５ｘ１０４ＰＦＵワクシニア−ｇａｇに鼻内曝露した。２つの類似の実験の一方由来の、曝露後の平均±ＳＤとしての（Ｃ）平均体重損失および（Ｄ）肺におけるワクシニア・プラーク形成力価： Ｃ５７ＢＬ／６、ＤＥＣ−２０５−／−、およびＴＬＲ３−／−マウス各５匹を、α−ＤＥＣ−ｐ４１で免疫した。ブーストの６〜８週間後、マウスを５ｘ１０４ＰＦＵワクシニア−ｇａｇに鼻内曝露した。
【図１Ｂ】図１は、５μｇ α−ＤＥＣ−ｇａｇおよび５０μｇポリ（Ｉ：Ｃ）でのプライム−ブースト免疫が、ワクシニアｇａｇウイルスでの気道曝露に対して防御免疫を提供することを示す。６回の実験：ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウス各々３回（対照Ｉｇ−ｐ２４を除く； ＢＡＬＢ／ｃでｎ＝２）由来の、曝露後の平均±ＳＤとしての（Ａ）平均体重損失および（Ｂ）肺におけるワクシニア・プラーク形成力価。示すワクチンで、マウスを６週間間隔でプライミングし、そしてブーストした。ブースト時にのみ、別の群をα−ＤＥＣ−ｐ２４およびポリ（Ｉ：Ｃ）で免疫した。ブーストの６〜８週間後、マウスを５ｘ１０４ＰＦＵワクシニア−ｇａｇに鼻内曝露した。２つの類似の実験の一方由来の、曝露後の平均±ＳＤとしての（Ｃ）平均体重損失および（Ｄ）肺におけるワクシニア・プラーク形成力価： Ｃ５７ＢＬ／６、ＤＥＣ−２０５−／−、およびＴＬＲ３−／−マウス各５匹を、α−ＤＥＣ−ｐ４１で免疫した。ブーストの６〜８週間後、マウスを５ｘ１０４ＰＦＵワクシニア−ｇａｇに鼻内曝露した。
【図１Ｃ】図１は、５μｇ α−ＤＥＣ−ｇａｇおよび５０μｇポリ（Ｉ：Ｃ）でのプライム−ブースト免疫が、ワクシニアｇａｇウイルスでの気道曝露に対して防御免疫を提供することを示す。６回の実験：ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウス各々３回（対照Ｉｇ−ｐ２４を除く； ＢＡＬＢ／ｃでｎ＝２）由来の、曝露後の平均±ＳＤとしての（Ａ）平均体重損失および（Ｂ）肺におけるワクシニア・プラーク形成力価。示すワクチンで、マウスを６週間間隔でプライミングし、そしてブーストした。ブースト時にのみ、別の群をα−ＤＥＣ−ｐ２４およびポリ（Ｉ：Ｃ）で免疫した。ブーストの６〜８週間後、マウスを５ｘ１０４ＰＦＵワクシニア−ｇａｇに鼻内曝露した。２つの類似の実験の一方由来の、曝露後の平均±ＳＤとしての（Ｃ）平均体重損失および（Ｄ）肺におけるワクシニア・プラーク形成力価： Ｃ５７ＢＬ／６、ＤＥＣ−２０５−／−、およびＴＬＲ３−／−マウス各５匹を、α−ＤＥＣ−ｐ４１で免疫した。ブーストの６〜８週間後、マウスを５ｘ１０４ＰＦＵワクシニア−ｇａｇに鼻内曝露した。
【図１Ｄ】図１は、５μｇ α−ＤＥＣ−ｇａｇおよび５０μｇポリ（Ｉ：Ｃ）でのプライム−ブースト免疫が、ワクシニアｇａｇウイルスでの気道曝露に対して防御免疫を提供することを示す。６回の実験：ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウス各々３回（対照Ｉｇ−ｐ２４を除く； ＢＡＬＢ／ｃでｎ＝２）由来の、曝露後の平均±ＳＤとしての（Ａ）平均体重損失および（Ｂ）肺におけるワクシニア・プラーク形成力価。示すワクチンで、マウスを６週間間隔でプライミングし、そしてブーストした。ブースト時にのみ、別の群をα−ＤＥＣ−ｐ２４およびポリ（Ｉ：Ｃ）で免疫した。ブーストの６〜８週間後、マウスを５ｘ１０４ＰＦＵワクシニア−ｇａｇに鼻内曝露した。２つの類似の実験の一方由来の、曝露後の平均±ＳＤとしての（Ｃ）平均体重損失および（Ｄ）肺におけるワクシニア・プラーク形成力価： Ｃ５７ＢＬ／６、ＤＥＣ−２０５−／−、およびＴＬＲ３−／−マウス各５匹を、α−ＤＥＣ−ｐ４１で免疫した。ブーストの６〜８週間後、マウスを５ｘ１０４ＰＦＵワクシニア−ｇａｇに鼻内曝露した。
【図２】図２は、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）が、ＴＬＲ３依存方式で、５μｇ α−ＤＥＣ−ｐ２４ワクチンに対するＣＤ４＋ Ｔ細胞免疫のアジュバントとして作用することを示す。（Ａ）ＣｘＢ６ Ｆ１マウスに、α−ＤＥＣ−ｐ２４に加えて、段階的な用量のポリ（Ｉ：Ｃ）またはポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）またはＰＢＳのいずれかを腹腔内注射し、次いで、６週間後、同じ条件でブーストした。ブースト１週間後に、ＨＩＶ ｇａｇ ｐ１７またはｐ２４混合物に反応して、ＩＦＮ−γを産生し、そして増殖しているＣＤ３＋ＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合を、平均±ＳＤ（ｎ＝４マウス）として示す。（Ｂ）２回投与のα−ＤＥＣ−ｐ２４に加えて、５０μｇポリ（Ｉ：Ｃ）または２５０μｇポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）のいずれかで免疫した、野生型、ＴＬＲ３−／−、およびＭＤＡ５−／−マウス中のＣＤ４＋脾臓細胞による、ＨＩＶ ｇａｇ ｐ２４ペプチドに反応したＩＦＮ−γ分泌。
【図３】図３は、α−ＤＥＣ ｐ２４およびポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）でのプライム−ブースト免疫後のＨＩＶ ｇａｇ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞反応が性質決定されたことを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５μｇのα−ＤＥＣ−ｐ２４および２、１０、または５０μｇポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）あるいはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）いずれかを皮下注射し、次いで、６週間後、同じ条件でブーストした。ブースト時にのみ、さらなる群を５μｇのα−ＤＥＣ−ｐ２４および５０μｇのポリＩＣで免疫した。２週間後、ＨＩＶ ｇａｇ ｐ２４ペプチド混合物に反応した、ゲート処理ＣＤ３＋脾臓Ｔ細胞における、ＩＦＮ−γ＋、ＴＮＦ−α＋、ＩＬ−２＋、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の頻度を分析した。（Ａ）各ワクチン群に関する、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、またはＩＬ−２を産生しているＣＤ４＋ Ｔ細胞の総頻度。（Ｂ）総サイトカイン反応由来の、３種のサイトカインすべて（赤）、任意の２種のサイトカイン（青）、または任意の１種のサイトカイン（緑）を発現しているＣＤ４＋ Ｔ細胞の割合。各ワクチン群は円グラフによって絵で示される。サイトカイン産生ＣＤ４＋ Ｔ細胞の総頻度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
微生物による感染を治療可能である。微生物は、ヒトまたは動物被験体に感染しうる。感染は、初発性であってもまたは確立されていてもよい。微生物は、細菌、原生動物、またはウイルス：特に疾患を引き起こすもの（すなわち病原性微生物）であってもよい。本明細書において、用語「微生物」（「ｍｉｃｒｏｂｅ」および「ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ」）は交換可能に用いられる。
【００１８】
細菌は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば、炭疽菌（Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ））、バルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）（ヘンセラ菌（Ｂ． ｈｅｎｓｅｌａｅ））、ボルテテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）（例えば、百日咳菌（Ｂ． ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ））、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）（例えば、ライム病ボレリア（Ｂ． ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ））、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）（例えば、ウシ流産菌（Ｂ． ａｂｏｒｔｕｓ））、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）（例えば、ジェジュニ菌（Ｃ． ｊｅｊｕｎｉ））、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）（例えば、肺炎クラミジア（Ｃ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）（例えば、ボツリヌス菌（Ｃ． ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、Ｃ．ディフィシレ（Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌（Ｃ． ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃ． ｔｅｔａｎｉ））、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（例えば、Ｃ．アミコラツム（Ｃ． ａｍｙｃｏｌａｔｕｍ）、ジフテリア菌（Ｃ． ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ））、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）Ｏ１７５：Ｈ７）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、インフルエンザ菌（Ｈ． ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ）（例えば、ピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ））、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（肺炎桿菌（Ｋ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）（例えば、Ｌ．ニューモフィラ（Ｌ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ））、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）（例えば、リステリア菌（Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（例えば、Ｍ．アビウム（Ｍ． ａｖｉｕｍ）、Ｍ．ボビス（Ｍ． ｂｏｖｉｓ）、Ｍ．ブランデリ（Ｍ． ｂｒａｎｄｅｒｉ）、らい菌（Ｍ． ｌｅｐｒａｅ）、結核菌（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）（例えば、Ｍ．ゲニタリウム（Ｍ． ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、肺炎マイコプラズマ（Ｍ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）（例えば、淋菌（Ｎ． ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、ニューモシスチス属（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）（例えば、Ｐ．カリニ（Ｐ． ｃａｒｉｎｉｉ））、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）（例えば、Ｒ．リケッチア（Ｒ． ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、発疹熱リケッチア（Ｒ． ｔｙｐｈｉ））、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（例えば、サルモネラ菌（Ｓ． ｅｎｔｅｒｉｃａ））、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）（例えば、志賀赤痢菌（Ｓ． ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ））、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓ． ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ））、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、肺炎球菌（Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）（例えば、梅毒トレポネーマ（Ｔ． ｐａｌｌｉｄｕｍ））、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）（例えば、コレラ菌（Ｖ． ｃｈｏｌｅｒａｅ）、Ｖ．ブルニフィクス（Ｖ． ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ））、またはエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）（例えば、ペスト菌（Ｖ． ｐｅｓｔｉｓ）の種であってもよい。これらには、グラム陰性またはグラム陽性細菌、クラミジア、スピロヘータ、マイコバクテリア、およびマイコプラズマが含まれる。
【００１９】
原生動物は、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）（例えば、Ｃ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルブム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ））、エントアメーバ属（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）（例えば、赤痢アメーバ（Ｅ． ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ））、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）（例えば、腸鞭毛虫（Ｇ． ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、ランブル鞭毛虫（Ｇ． ｌａｍｂｌｉａ））、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）（例えば、アマゾンリーシュマニア（Ｌ． ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）、ブラジルリーシュマニア（Ｌ． ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉ）、ドノバンリーシュマニア（Ｌ． ｄｏｎｏｖａｎｉ）、メキシコリーシュマニア（Ｌ． ｍｅｘｉｃａｎａ）、熱帯リーシュマニア（Ｌ． ｔｒｏｐｉｃａ））、プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ． ｖｉｖａｘ））、トキソプラズマ属（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）（例えば、トキソプラズマ原虫（Ｔ． ｇｏｎｄｉｉ））、またはトリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）（例えば、ブルセイトリパノソーマ（Ｔ． ｂｒｕｃｉ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔ． ｃｒｕｚｉ））の種であってもよい。
【００２０】
ウイルスは、ヒトおよび動物に感染するＤＮＡまたはＲＮＡウイルスであってもよい。ＤＮＡウイルスには、アデノウイルス科、イリドウイルス科、パピローマウイルス科、ポリオウイルス科、およびポックスウイルス科（Ｉ群二本鎖ＤＮＡウイルス）；パルボウイルス科（ＩＩ群一本鎖ＤＮＡウイルス）に属するものが含まれる。ＲＮＡウイルスには、ビルナウイルス科およびレオウイルス科（ＩＩＩ群二本鎖ＲＮＡウイルス）；アルテリウイルス科、アストロウイルス科、カリシウイルス科、ヘペウイルス科、およびロニウイルス科（ＩＶ群プラス鎖一本鎖ＲＮＡウイルス）；ならびにアレナウイルス科、ボルナウイルス科、ブンヤウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、およびラブドウイルス科（Ｖ群マイナス鎖一本鎖ＲＮＡウイルス）に属するものが含まれる。特異的に形成した二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）はまた、ヘルペスウイルス科由来のＤＮＡウイルス、ならびにフラビウイルス科、ヘパドナウイルス科、オルトミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、レトロウイルス科、およびトガウイルス科由来のＲＮＡウイルスによる感染を治療することが知られ；これらの科のウイルスは、本発明の範囲内に含まれる可能性もまた含まれない可能性もある。
【００２１】
異常な増殖を経ている被験体細胞は、新生物または腫瘍（例えば、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫）、特に腫瘍ウイルス（例えば、形質転換遺伝子または癌原遺伝子を所持するＤＮＡまたはＲＮＡウイルス）によって形質転換されたか、またはそうでなければ癌と関連するウイルスに感染した細胞であってもよい。例えば、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）は、鼻咽頭癌、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、および他のＢ細胞リンパ腫に関連し；ヒトＢ型およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＢＶおよびＨＣＶ）は肝癌に関連し；ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）はカポジ肉腫に関連し；ヒトパピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、またはその組み合わせ）は、子宮頸癌、肛門癌、および性器疣贅に関連し；そしてヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）は、Ｔ細胞白血病またはリンパ腫に関連する。癌には、胃腸系（例えば、食道、結腸、腸、回腸、直腸、肛門、肝臓、膵臓、胃）、尿生殖器系（例えば、膀胱、腎臓、前立腺）、筋骨格系、神経系、肺系（例えば肺）、また生殖器系（例えば、子宮頸部、卵巣、精巣）から生じるものが含まれる。
【００２２】
ポリ（リボイノシン酸）は、部分的に、ポリ（リボシトシン酸１２ウラシル酸）にハイブリダイズし、そしてｒＩｎ・ｒ（Ｃ１２Ｕ）ｎとして示されうる。他の使用可能な特異的に形成したｄｓＲＮＡは、ｎが４〜２９の整数であるポリ（ＣｎＵ）およびポリ（ＣｎＧ）から選択されるコポリヌクレオチドに基づくか、またはポリリボシチジン酸（ｒＣｎ）鎖に沿って非対形成塩基（ウラシルまたはグアニン）を取り込むようにｒＩｎ・ｒＣｎを修飾することによって形成される、ポリリボイノシン酸およびポリリボシチジン酸の複合体のミスマッチ類似体である。あるいは、ミスマッチｄｓＲＮＡは、ポリリボイノシン酸（ｒＩｎ）のリボシル主鎖を修飾することによって、例えば２’−Ｏ−メチルリボシル残基を含めることによって、ｒ（Ｉ）・ｒ（Ｃ）ｄｓＲＮＡに由来してもよい。ミスマッチｄｓＲＮＡを、リジンセルロースなどのＲＮＡ安定化ポリマーと複合体化してもよい。ｒＩｎ・ｒＣｎのこれらのミスマッチ類似体のうち、好ましいものは、一般式ｒＩｎ・ｒ（Ｃ１１−１４Ｕ）ｎのものであり、そして本明細書に援用される米国特許４，０２４，２２２および４，１３０，６４１に記載される。該文献に記載されるｄｓＲＮＡは、一般的に、本発明にしたがって使用するのに適している。米国特許５，２５８，３６９もまた参照されたい。
【００２３】
経腸（例えば、経口、栄養管、浣腸）、局所（例えば、皮膚上で作用するパッチ、直腸または膣中で作用する座薬）、および非経口（例えば、経皮パッチ；皮下、静脈内、筋内、皮内、または腹腔内注射；頬側、舌下、または経粘膜；鼻内または気管内吸入または滴下）を含む、任意の適切な局所または全身性経路によって、特異的に形成したｄｓＲＮＡを投与してもよい。核酸を、吸入のため微粒子化しても、注射または滴下のため、ビヒクル中に溶解しても（例えば滅菌緩衝生理食塩水または水）、あるいはターゲティング化送達のため、リポソームまたは他のキャリアー中に被包してもよい。好ましいのは、抗原提示細胞および上皮上のＴＬＲ３受容体に核酸をターゲティングするキャリアーである。例えば、未成熟樹状細胞を、皮膚、粘膜、またはリンパ組織中で接触させてもよい。好ましい経路は、被験体の状態および年齢、感染性または新生物疾患の性質、ならびに選択した活性成分に応じて多様であってもよいことが認識されるであろう。
【００２４】
核酸の推奨される投薬量は、ウイルス感染または腫瘍負荷を治療する際の、被験体の臨床状態および医師または獣医師の経験に応じるであろう。用量および／または頻度は、医師または獣医師によって被験体の状態に応じて多様でありうるが、７０ｋｇの被験体に、週２回のスケジュールで静脈内注入によって、特異的に形成したｄｓＲＮＡを約２００ｍｇ〜約４００ｍｇで投与してもよい。ＴＬＲ３を発現する細胞または組織、特に抗原提示細胞（例えば樹状細胞およびマクロファージ）および内皮（例えば呼吸器系および胃系）が、核酸送達に好ましい部位である。特異的に形成したｄｓＲＮＡの効果は、ＴＬＲ３遺伝子の突然変異（例えば欠失）、その発現の下方制御（例えばｓｉＲＮＡ）、ＴＬＲ３のリガンド結合部位への競合剤（例えば中和抗体）の結合または受容体アンタゴニスト、あるいはＴＬＲ３シグナル伝達経路の下流構成要素（例えばＭｙＤ８８またはＴＲＩＦ）での干渉によって阻害または遮断可能である。
【００２５】
ＡＭＰＬＩＧＥＮ（登録商標）ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）は、以前は利用可能でなかった免疫系に対するＴＬＲ３活性化の影響を解体する、選択的剤を提供する。ＴＬＲアダプターＭｙＤ８８およびＴＲＩＦのような他の剤は、それぞれ、すべてのＴＬＲまたはＴＬＲ３／ＴＬＲ４によるシグナル伝達を仲介する。したがって、ＭｙＤ８８またはＴＲＩＦを通じたシグナル伝達の活性化または阻害は、その生物学的影響を、ＴＬＲ３によって仲介されるものに限定しない。ＴＬＲ３およびそのシグナル伝達の存在は、ＡＭＰＬＩＧＥＮ（登録商標）ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）が受容体アゴニストとして作用するための必要条件であるため、アゴニストの投与前に、被験体の細胞または組織における、ＴＬＲ３突然変異の非存在、ＴＬＲ３タンパク質の存在、損なわれていないＴＬＲ３仲介性シグナル伝達、あるいはそれらの任意の組み合わせに関してアッセイしてもよい。ＴＬＲ３活性のこうした確認を、アゴニストの投与前、投与中、または投与後に行ってもよい。アゴニストを用いて、他のＴｏｌｌ様受容体またはＲＮＡヘリカーゼを活性化することなく、免疫反応を、ＴＬＲ３の活性化に限定することも可能である。例えば、異常なサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２）産生または同時刺激分子（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６）シグナル伝達が、少なくとも、微生物による感染、異常な細胞増殖、自己免疫損傷、または神経変性から生じている可能性もある。ＴＬＲ３の特異的アゴニストとしてポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）を用いることによって、この異常性を再調節してもよい。抗原（またはそのペプチド類似体）を、１以上の抗原提示細胞の細胞表面に特異的に結合するリガンド（または受容体）（特にエンドソーム−ファゴソーム内在化経路の構成要素）にコンジュゲート化することによって、抗原提示が改善されうる。特異的結合分子は、細胞表面分子に対する抗体、またはその誘導体（例えばＦａｂ、ｓｃＦｖ）であってもよい。
【実施例】
【００２６】
実施例１
ヒト被験体
ヒト患者をインフォームドコンセントとともに登録し、そして血清サイトカインレベルおよび樹状細胞成熟マーカー発現のさらなる分析のための潜在的な志願者として、研究責任者が選択した。患者は新たに登録されても、またはポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）で治療再開してもよかった。
【００２７】
免疫パネルの実行
本発明者らの免疫パネルは、サイトカイン血清レベル（インターフェロン、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２）および血液細胞上の免疫マーカー（ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６）の測定からなる。こうした測定を承諾した患者に関して、最初の２００ｍｇ、およびそれに続く４００ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）注入前、ならびに注入の４±１／２、２４±２、および７２±２時間後に、新規登録被験体およびｐ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）注入で治療再開した被験体から、血液試料を収集した。明記する収集時間は、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）注入間の期間中の時点を含むように選択された。これらの試料に対して免疫パネルを実行した。サイトカイン分析のため、血液試料由来の血清を−７０℃で凍結し、そして研究場所からＨｅｍｉｓｐｈｅｒｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ， Ｉｎｃ．（ニュージャージー州ニューブルンスウィック）に、凍結して輸送した。また、Ｃｅｌｌｄｅｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．（ニュージャージー州フィリップスバーグ）によるＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６のフローサイトメトリー分析のため、ヘパリン処理全血試料を研究部位から周囲温度で一晩かけて輸送した。
【００２８】
製造者の指示にしたがって、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを用いて、インターフェロン（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）および炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０）レベルを測定した。
【００２９】
ＥＬＩＳＡキット
【００３０】
【表１】
【００３１】
キットはＰＢＬ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイおよびＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カリフォルニア州カマリロのものであった。
【００３２】
Ｃｅｌｌｄｅｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．（ニュージャージー州フィリップスバーグ）と、ＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６発現のフローサイトメトリー分析に関して契約した。一晩の輸送後、受け取り１時間以内に血液試料を染色した。細胞マーカー分析および赤血球溶解には、標準的フローサイトメトリー法を使用した。高いＨＬＡ−ＤＲ発現を伴う、単球、リンパ球、およびＮＫ細胞マーカーの低レベル発現に基づいて、樹状細胞を同定した。また、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ１２３発現にしたがって、樹状細胞を性質決定した。側方散乱分析および単球系譜マーカーの発現によって単球を同定した。細胞タイプ同定後、ＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６発現の分析を行った。健康な志願者由来の測定は対照として働き、そしてＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６などの成熟ＤＣに関するマーカー発現の正常な分布およびレベルを示した。
【００３３】
結果
サイトカインレベル：各患者に関するサイトカイン分析の結果を、表１および２に提示する。ブランク標準に比較して、負の吸光度値を有する結果、または製造者によって報告されるようなキットの検出限界（ＤＬ）以下である結果に対する値として、ゼロを用いた。製造者がＤＬを明記しないか、またはＤＬが所定の値未満であると示した場合、すべての結果を用いた。製造者が、予期される正常サイトカイン範囲を提供する場合、参考のためにこれらを含めた。
【００３４】
表１． ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）注入後のインターフェロンレベルの動力学
【００３５】
【表２−１】
【００３６】
【表２−２】
【００３７】
ＮＲ、正常範囲； ＮＰ、キット製造者によって提供されない
表２． ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）注入後のサイトカインレベルの動力学
【００３８】
【表３−１】
【００３９】
【表３−２】
【００４０】
ＮＲ、正常範囲； ＮＰ、キット製造者によって提供されない
平均値および標準偏差（ＳＤ）を計算した。しかし、患者が少数であり、そしてデータにばらつきがあるため、平均値の解釈は限定されている。ベースライン・サイトカインレベルは、患者間で広く多様であった。免疫系活性化の指標の不一致は、慢性疲労症候群（ＣＦＳ）と診断された患者に特徴的であるため、これは驚くべきことではなく、そしてこのため、診断試験を開発することが困難となっている。データ解釈を容易にするため、サイトカインデータを患者ごとに提示する。データの記述的考察を提示する。統計分析は行わなかった。
【００４１】
４人の患者のうち３人では、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γの注入前レベルが上昇しており、そして４人のうち２人では、ＩＦＮ−βの注入前レベルが高かった。ＩＦＮ−αレベルの変化を考慮すると、１人の患者（ＬＤＭ−０１０）は、すべての続く時点で、注入前より低いレベルを有し、１人の患者（ＪＯＧ−０２０）は、すべての時点で、検出不能なレベルを有し、そして２人の患者は、少なくとも１つの注入後時点で、増加したレベルを有した。ＩＦＮ−αの最大増加は、注入前レベルの２％〜１５％上であった。すべての時点でＩＦＮ−αが検出不能レベルであった同じ患者（ＪＯＧ−０２０）ではまた、ＩＦＮ−βレベルも検出不能であった。すべての他の患者は、少なくとも１つの時点で、増加したＩＦＮ−βレベルを有したが、１人の患者（ＤＭＭ−１１１）の増加は、他の患者に関して測定されたレベルより、実質的に低かった（約０．１％）。他の２人の患者のＩＦＮ−βの最大増加は、注入前レベルより４．３％〜１２％高い範囲であった。１人を除き、すべての患者が、少なくとも１つの注入後時点で、ＩＦＮ−γの増加を示した；第四の患者（ＬＤＭ−０１０）は、すべての時点で、検出不能なレベルを有した。患者のうち２人に関しては、ＩＦＮ−γの最大増加は、注入前レベルより３．７％および２１％高い範囲であった。１人の患者（ＤＭＭ−１１１）は、注入４時間後、注入前レベルを超える３９７％の増加を示したが、続く測定値は、注入前ベースライン未満であった。すべての患者が、注入７２時間後までに、注入前レベル以下のＩＮＦ−α、ＩＦＮ−β、およびＩＦＮ−γレベルを有した。
【００４２】
すべての患者は、０〜２０ｐｇ／ｍＬの健康な個体に関して予期される範囲に基づいて、ＴＮＦ−αの正常な注入前レベルを有した。注入前レベルに比較して、すべての患者は、各注入後時点に、ＴＮＦ−αの小さな増加を示したものの、１人の患者（ＤＭＭ−１１１）のレベルは、４時間および２４時間の時点と比較して、７２時間の時点で減少したが、すべての患者が正常範囲内に留まった。最大ＴＮＦ−α増加は、注入前レベルより３２％〜２４１％上の範囲であった。ＴＮＦ−αと同様、各時点でのＩＬ−１０に関する平均結果は、予期される正常濃度より低かった。２人の患者（ＬＤＭ−１０１、ＪＯＧ−０２０）は、予期される範囲内の上昇を示し、そして２人（ＪＬＣ−１０９、ＤＭＭ−１１１）は、予期される濃度を超える増加を有した。１人の患者のみ（ＤＭＭ−１１１）が、７２時間後に、予期される濃度より高いＩＬ−１０レベルを有し；７２時間後のこの患者のＩＬ−１０レベルは、注入前レベルより、３倍高かった。すべての患者で、ＩＬ−１２ｐ７０の注入前レベルが上昇しており（予期される範囲は、０．７９ｐｇ／ｍＬまで）、そして１人を除き、すべての患者が、すべての時点で、注入前レベルより高い増加を維持していた。持続したＩＬ−１２ｐ７０増加を示さない１人の患者（ＤＭ−１１１）では、７２時間の時点で、注入前レベルより２．２％減少した。最大ＩＬ−１２ｐ７０増加は、注入前レベルより３２％〜１５８％高い範囲であった。
【００４３】
４人の患者のうち３人では、ＩＬ−６の注入前レベルが上昇していた。１人の患者（ＪＯＧ−０２０）では、注入前に比較して、すべての続く時点で、ＩＬ−６レベルが減少していた。検出不能なＩＬ−６注入前レベルを持つ１人の患者（ＤＭＭ−１１１）に関しては、レベルは注入４時間後に高レベルに増加し、次いで、ベースラインに戻った。同じ患者は、注入４時間後に、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのピークを示した。１人の患者のみ（ＬＤＭ−０１０）、７２時間後、注入前レベルより高いＩＬ−６レベルを有した。１人の患者のみ（ＤＭＭ−１１１）、注入前に検出可能なＩＬ−１０レベルを有し、そして該レベルは、１ｐｇ／ｍＬ未満の予期される濃度を大きく超えては上昇していなかった。
【００４４】
サイトカイン分析結果によって、ＩＬ−１２ｐ７０の上昇した注入前レベル、およびポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）注入７２時間後の穏やかな増加が示される。しかし、監視した注入後期間に渡って、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、およびＩＦＮ−γレベルには明らかな相違はなく、平均ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０レベルは、各時点で予期される正常範囲内であり、そしてＩＬ−６反応は、４人の患者のうち３人に関して、注入７２時間後までに、注入前レベルまで減少した。結論として、炎症促進性サイトカイン、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−１２を含むサイトカインレベルの調節の実質的なパターンは示されなかった。
【００４５】
樹状細胞成熟マーカー
陽性染色細胞の割合として、そして発現レベル（平均蛍光強度、ＭＦＩ）によって、ＤＣ成熟マーカー分析の結果を報告し、そして別に示さない限り、平均（ＳＤ）として示す。ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）で治療していない健康な志願者に関するデータを比較のために報告する。ＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６データが大きくばらついているため、個体に基づく結果を詳述する表を含める。統計分析は行わなかった。
【００４６】
ＣＤ１２３＋ ＤＣ、ＣＤ１１＋ ＤＣ、および単球の平均（ＳＤ）の割合を表３に提示する。健康な志願者の値を正常値として含めた（表４を参照されたい）。統計分析は行わなかった。健康な志願者には、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）を注入しなかった。ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）注入に比較した明記する時点でのＣＦＳ患者の値を報告する。各時点で、すべての患者に関するすべての測定値に渡って、平均値を計算した。
【００４７】
表３． 細胞集団に対するポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）の影響
【００４８】
【表４】
【００４９】
ａ健康な志願者には、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）を注入しなかった
表４． 健康な志願者における樹状細胞タイプの割合に関する個々の結果
【００５０】
【表５−１】
【００５１】
【表５−２】
【００５２】
【表５−３】
【００５３】
ＣＦＳ患者の注入前の値は、健康な志願者のレベルに匹敵し； ＣＤ１１＋細胞の割合は、平均およびＳＤによって定義されるような、健康な志願者の範囲の下限であった。平均値は、注入４時間後のＣＤ１２３＋細胞に関して、そして注入２４時間後のＣＤ１１＋細胞および単球に関して測定されたものより低かった。試料が少数であるため、１人の患者が経験した変化が、結果に著しく影響する可能性もあった。例えば、患者ＤＭＭ−１１１では、注入前から注入４時間後までに、ＣＤ１２３＋細胞の割合が１０倍低下した（表５を参照されたい）。１つの一貫した変化は、注入２４時間後にＣＦＳ患者によって示される単球の割合の減少であった。単球数は、注入７２時間後までに回復した（表５を参照されたい）。総合して、ＣＤ１２３＋細胞、ＣＤ１１＋細胞、および単球の割合は、わずかに低かったが、健康な志願者の値の範囲から外れなかった。
【００５４】
一般的に、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）での治療は、成熟ＤＣマーカー、ＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６を発現する細胞の割合を減少させ、そしてこれらの発現レベルを増加させた。ＣＦＳ患者は、開始時に、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）を投与されない健康な志願者より低い発現レベルを有する、より多くの陽性細胞を伴う傾向があった。したがって、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）が陽性細胞数を減少させ、そしてＤＣ成熟マーカー発現レベルを増加させる能力があることから、ＣＦＳ患者のプロフィールは、健康な志願者のものにより緊密に似るように、正常化された。
【００５５】
表５． ＣＦＳ患者における樹状細胞タイプの割合に関する個々の結果
【００５６】
【表６−１】
【００５７】
【表６−２】
【００５８】
個々の患者の結果は、表６〜８に示す平均変化を反映する傾向があり、注入２４時間後および７２時間後の時点で、陽性細胞の比率の減少および発現レベルの増加を伴った。このパターンにはいくつかの例外があった。例えば、ＣＤ８０およびＣＤ８６発現細胞の割合は、ＣＤ１１＋細胞中では、ＣＤ１２３＋細胞中と同程度に顕著には減少しなかった。さらに、ＣＦＳ患者由来の単球は、ＣＤ８６を発現する細胞の割合およびＣＤ８６発現レベルに関して、健康な志願者由来のものと類似であった。
【００５９】
表６． ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）注入後、ＣＤ１２３＋樹状細胞中での成熟マーカー発現の動力学
【００６０】
【表７】
【００６１】
ａ健康な志願者にはポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）を投与しなかった；ｂＭＦＩ、平均蛍光強度
表７． ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）注入後、ＣＤ１１＋樹状細胞中での成熟マーカー発現の動力学
【００６２】
【表８】
【００６３】
ａ健康な志願者にはポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）を投与しなかった；ｂＭＦＩ、平均蛍光強度
表８． ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）注入後、単球中での成熟マーカー発現の動力学
【００６４】
【表９】
【００６５】
ａ健康な志願者にはポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）を投与しなかった；ｂＭＦＩ、平均蛍光強度
要約すると、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）注入は、ＣＤ１２３＋ ＤＣ、ＣＤ１１＋ ＤＣ、または単球の数に劇的には影響を及ぼさなかった。ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）治療に続いて、ＣＦＳ患者では、成熟マーカーを発現しているＤＣの割合およびＣＤ成熟マーカー発現レベルが正常化された。これらの傾向、特にＣＤ成熟マーカーの増加は、４人の患者すべてで一貫して観察され、サイトカインレベル調節では認識されない独特のパターンを明らかにした。
【００６６】
実施例２： ｄｓＲＮＡは耐久性および防御性の適応免疫を誘導する
ＣＤ４＋ Ｔｈ１型免疫は、包括的な感染性疾患に対する抵抗性に関連づけられる。ＨＩＶワクチンによって誘導されるＴ細胞免疫の有効性を改善するため、損なわれていないリンパ組織中の樹状細胞（ＤＣ）の機能を直接利用する、タンパク質に基づくアプローチを発展させた。抗原提示の受容体であるＤＥＣ−２０５をターゲティングする抗体によって、抗原性タンパク質を樹状細胞に選択的に送達する。ｄｓＲＮＡは、独立に、アジュバントとして働き、ＤＣをターゲティングするタンパク質が、粘膜表面（すなわち気道）で、防御性ＣＤ４＋ Ｔ細胞反応を誘導するのを可能にする。ｄｓＲＮＡとともに、ＤＥＣをターゲティングするＨＩＶ ｇａｇ ｐ２４を２回投薬した後、免疫ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、防御性機能と相関する定性的特徴を有する。Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２を、同時に、多量に、そして延長された期間、産生する。Ｔ細胞はまた、ＨＩＶ ｇａｇ ｐ２４に反応して増殖し、そしてＩＦＮ−γを分泌し続ける。ポリ（Ｉ：Ｃ）のアジュバントの役割は、ＴＬＲ３およびＭＤＡ５受容体を必要とするが、類似のポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）は、ＴＬＲ３のみを必要とする（以下の結果を参照されたい）。ポリ（Ｉ：Ｃ）およびポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）はどちらも、ＤＣをターゲティングするワクチンとともに用いた場合、安全なアジュバントであり、多重機能性および増殖能のような特徴を持つＣＤ４＋ Ｔｈ１細胞を豊富に誘導する。
【００６７】
Ｔ細胞が仲介する免疫は、ＨＩＶ、マラリア、および結核のような包括的な感染性疾患に対する抵抗性に関連づけられる。非常に重要な構成要素は、ＣＤ４＋ Ｔｈ１ヘルパー細胞であり、該細胞は、多量のＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを産生し、ＭＨＣクラスＩＩ＋ターゲットに対して細胞溶解活性を発揮し、そして機能するＣＤ８＋ Ｔメモリー細胞を維持する。
【００６８】
樹状細胞は、Ｔ細胞に基づく強い反応を誘導する、抗原提示細胞である。例えば、エンドサイトーシス受容体ＤＥＣ−２０５（「ＤＥＣ」）を発現する樹状細胞サブセットにｅｘ ｖｉｖｏで抗原を装填し、そしてマウスに再注入した際、樹状細胞は、主にＩＦＮ−γを産生する抗原特異的ヘルパーＴ細胞を拡大する。ｉｎ ｖｉｖｏで、ＤＥＣ＋樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ産物両方に対して抗原提示を仲介し、それぞれ、キラーおよびＴヘルパー細胞のクローン性拡大を導く。ワクチン設計においてＤＣ生物学をよりよく利用するため、本発明者らは、抗原をエンドサイトーシス受容体ＤＥＣ−２０５に直接ターゲティングするアプローチを開発した。
【００６９】
外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）抗原に対して免疫するためには、樹状細胞は、抗原の取り込みとともに、分化するかまたは成熟しなければならない。この成熟は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）などのパターン認識受容体に対する化学的に定義されたリガンドを含む、アジュバントを用いて達成可能である。ＴＬＲリガンドのタイプは、免疫反応の結果に影響する。マウスおよびサルにおける、抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋免疫に関しては、ＨＩＶ ｇａｇ ｐ４１に対するＴＬＲ７／８リガンドのコンジュゲートを含むＴＬＲリガンドが、活性アジュバントとして働く。
【００７０】
パターン認識受容体のリガンドは、ＤＣをターゲティングするＨＩＶワクチンを用いた、Ｔ細胞に基づく防御免疫のための、潜在的に安全なアジュバントとしては評価されてきていない。ｄｓＲＮＡをアジュバントとして単独で導入して、ｄｓＲＮＡが、ＤＣをターゲティングするワクチンを補助して（ａｄｊｕｖａｎｔ）、現在の基準で質的におよび量的に頑強（ｒｏｂｕｓｔ）であり、そしてまた肺感染モデルにおいて防御性である、ＣＤ４＋ Ｔ細胞免疫を誘導することを示した。
【００７１】
外来タンパク質に対する免疫の発展には、アジュバントの同時投与が必要である。ｄｓＲＮＡは、α−ＤＥＣ−ＨＩＶ ｇａｇ ｐ２４に対して強いＣＤ４＋ Ｔ細胞反応を誘導する優れたアジュバントであることが示されており：すなわち、ＩＦＮ−γを分泌するＴ細胞の頻度は、総ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞の０．２〜６％に相当した。しかし、ワクチンのプライミングおよびブースター用量両方の間にポリ（Ｉ：Ｃ）が必要であった。
【００７２】
当該技術分野に長く感じられてきた必要性は、自然感染またはワクチン接種中の高品質な防御性Ｔ細胞のための基準を定義することである。アジュバントとしてｄｓＲＮＡを用いることによって誘導されたＣＤ４＋ Ｔ細胞の性質を評価するため、α−ＤＥＣ−ｐ２４および段階的な用量のポリ（Ｉ：Ｃ）を６週間に渡って投与した。１つの群にはα−ＤＥＣ−ｐ２４およびポリ（Ｉ：Ｃ）をブースト時にのみ投与した。ブースト２週間後、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、またはＩＬ−２を産生しているｇａｇ特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞の頻度は、２回投与のα−ＤＥＣ−ｐ２４ ｍＡｂおよび５０μｇポリ（Ｉ：Ｃ）で最大であった。
【００７３】
個々のｇａｇ特異的Ｔ細胞が多数のサイトカインを分泌する能力を調べた。こうした多機能Ｔ細胞は、ＨＩＶを含む感染性病原体を選択する防御免疫により効果的に寄与する。α−ＤＥＣ−ｐ２４および５０μｇポリ（Ｉ：Ｃ）でのプライム−ブースト免疫の２週間後、およそ５０％のｇａｇ特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、３つのサイトカイン：ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２すべてを産生する。サイトカイン産生細胞の総頻度は、２回投与のα−ＤＥＣ−ｐ２４および１０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）、または単回投与のα−ＤＥＣ−ｐ２４および５０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）でより少なかった。ｇａｇ反応性細胞によって作製される各サイトカインの量（中央値蛍光強度またはＭＦＩ）を評価したが、これはこのパラメーターが、森林型熱帯リーシュマニア（Ｌ． ｍａｊｏｒ）モデルにおける防御ＣＤ４＋免疫に関する重要な関連要因であるためである。３つのサイトカイン（すなわち、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２）を産生する細胞のＭＦＩは、２つまたは１つのみのサイトカインを産生する細胞のＭＦＩよりも高かった。したがって、α−ＤＥＣ−ｐ２４およびｄｓＲＮＡで誘導したエフェクターＣＤ４＋ Ｔ細胞は、多重機能性および高サイトカイン産生などの優れたＴｈ１免疫と一般に関連する特徴を有する。
【００７４】
α−ＤＥＣ−ｐ２４に加えてポリ（Ｉ：Ｃ）でプライム−ブースト免疫した後の、ＨＩＶ ｇａｇに特異的な、サイトカイン産生（「エフェクター」）ＣＤ４＋ Ｔ細胞の持続を評価するため、ブースト２週間後および７週間後に分析を行った。ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウス各々における３回の実験に関してデータを要約すると、適応エフェクターＣＤ４＋ Ｔ細胞は、少なくとも７週間持続することが示された。興味深いことに、３つのサイトカイン（すなわち、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２）すべてを産生する細胞の割合は、ブースト２週間後から７週間後まで、安定なままであった。したがって、ｄｓＲＮＡで補助したプライム−ブースト免疫後、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞は、数週間持続した。
【００７５】
最近の知見によって、ＣＤ４＋ Ｔｈ１細胞が増殖し、そしてＨＩＶ−１に対してＩＦＮ−γを産生する能力は、低いＨＩＶ−１ ＲＮＡおよびプロウイルスＤＮＡ装填に強く関連することが示されている。したがって、これらのＴ細胞の特徴が、ＤＣをターゲティングするワクチンによって誘導可能であるかどうかを評価した。ブースト２週間後、ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、増殖し、そしてＩＦＮ−γを産生することによって、ｇａｇ ｐ２４に特異的に反応した。陰性対照（すなわちｇａｇ ｐ１７ペプチド混合物）に対しては反応がなかった。２回投与のα−ＤＥＣ−ｐ２４に加えて１０μｇまたは２μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）、あるいは１回投与のα−ＤＥＣ−ｐ２４に加えて５０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）を用いると、反応するＣＤ４＋ Ｔ細胞はより少なくしか見られなかった。したがって、α−ＤＥＣ−ｐ２４およびｄｓＲＮＡでのプライム−ブースト免疫は、増殖するＣＤ４＋ Ｔ細胞を誘導する。
【００７６】
次いで、α−ＤＥＣ−ｐ２４およびポリ（Ｉ：Ｃ）でのプライム−ブースト免疫後の増殖性ＨＩＶ ｇａｇ特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞の持続を評価した。ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウス各々における３回の実験由来の結果から、こうしたＣＤ４＋ Ｔ細胞が脾臓において少なくとも７週間持続することが示された。したがって、α−ＤＥＣ−ｐ２４および５０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）でのプライム・ブーストは、長寿命の増殖性ＩＦＮ−γ分泌性ＣＤ４＋ Ｔ細胞を誘導する。
【００７７】
さらに、ポリ（Ｉ：Ｃ）はまた、α−ＤＥＣ−ｎｅｆに対するＣＤ４＋ Ｔ細胞反応のアジュバントとしても働く。免疫によって、増殖性ＩＦＮ−γ分泌性ＣＤ４＋ Ｔ細胞を誘発した。これらは、ｄｓＲＮＡをアジュバントとして用いると、優れた量および質のＣＤ４＋ Ｔ細胞が、ｎｅｆおよびｇａｇ両方のＨＩＶ抗原に反応することを示す。
【００７８】
ｄｓＲＮＡが、粘膜表面で、長く持続する防御免疫を生成可能であるかどうかを決定するため、ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスにワクチン接種し、そして次いで、該マウスを、α−ＤＥＣ−ｇａｇおよびポリ（Ｉ：Ｃ）でのプライム−ブースト免疫の６〜８週間後、組換えワクシニア−ｇａｇウイルスに鼻内曝露した。最初の防御実験では、単回投与の５０μｇポリ（Ｉ：Ｃ）は、最適防御および肺におけるウイルス力価減少を生じた。ポリ（Ｉ：Ｃ）のこの用量を用いて、より詳細な研究を行った。ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウス各々における３回の実験由来の結果によって、陰性対照（すなわちＰＢＳ）を注射したマウスでは体重が減少し、そして６〜７日に渡って、肺においてウイルスの高い力価（＞１０８ＰＦＵ／ｍｌ）が発展することが示された。体重損失およびウイルス増殖のどちらの基準によっても、２回投与のα−ＤＥＣ−ｐ２４および５０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）は、２回投与の対照Ｉｇ−ｐ２４または１回投与のα−ＤＥＣ−ｐ２４に加えたポリ（Ｉ：Ｃ）に比較して、優れた防御を提供した。したがって、α−ＤＥＣ−ｇａｇおよびｄｓＲＮＡでのプライム−ブースト免疫は、粘膜表面で防御を誘発する。
【００７９】
ワクシニア−ｇａｇに曝露する前に、ワクチン接種したマウスからＣＤ４＋細胞を枯渇させると、ワクシニア曝露によって、ＣＤ４＋ Ｔ細胞が防御に寄与することが検証された。また、ＤＥＣ−／−ヌルマウスでも曝露実験を行った。防御の欠如が観察され、ＤＥＣが、ＤＣをターゲティングする防御免疫を発展させるのに必須であることが示された。しかし、ＴＬＲ３−／−ヌルマウスは、２回投与のα−ＤＥＣ−ｐ４１およびポリ（Ｉ：Ｃ）でのワクチン接種後、ワクシニア−ｇａｇ曝露に対して完全に防御された。したがって、ＴＬＲ３はポリ（Ｉ：Ｃ）をアジュバントとして用いる際には、防御に必要ではないが、ＴＬＲはポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）の作用に必須である。
【００８０】
ポリ（Ｉ：Ｃ）の類似体であるポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）は、高用量であっても最小限の毒性を示すが、ポリ（Ｉ：Ｃ）といくつかの免疫調節特性を共有するため、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）もまた、アジュバント活性に関して評価した。ＣｘＢ６ Ｆ１マウスに２回投与のα−ＤＥＣ−ｐ２４に加えて、増加する用量のポリ（Ｉ：Ｃ）またはポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）を注射した。ＨＩＶ ｇａｇ ｐ２４ペプチドに反応したＣＤ３＋ＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖を、ブースト１週間後に測定した。ｄｓＲＮＡのどちらの型もＣＤ４＋ Ｔ細胞反応を誘導し、これは用量依存性であり、そして抗原特異的であった。
【００８１】
ポリ（Ｉ：Ｃ）およびポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）を用いて、アジュバント活性に必要なパターン認識受容体を決定するため、野生型、ＴＬＲ３−／−ヌル、またはＭＤＡ５−／−ヌル遺伝子バックグラウンドのマウスを比較した。ポリ（Ｉ：Ｃ）は、ＴＬＲ３−／−ヌルマウスにおいてある程度のアジュバント活性を示したが、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）は、驚くべきことに、同じ遺伝子バックグラウンドにおいて、ＣＤ４＋ ＩＦＮ−γ分泌性Ｔ細胞を誘発不能であった。どちらのアジュバントも、ＭＤＡ５−／−ヌルマウスにおいて、反応を誘発した。総合すると、データによって、ＴＬＲ３は、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）のアジュバントの役割に必須であるが、ポリ（Ｉ：Ｃ）は、細胞表面受容体ＴＬＲ３および細胞質ゾルセンサーＭＤＡ５の両方を利用可能でありうることが示される。
【００８２】
樹状細胞は、Ｔ細胞が仲介する免疫の強力な誘導因子である。したがって、これらは、ワクチン効能の改善を模索する際の魅力的なターゲットである。例えば、抗原性タンパク質をＡＰＣ特異的表面分子にターゲティングする抗体とのコンジュゲートによって、抗原性タンパク質を選択的に送達する際、抗原提示および免疫反応は、ターゲティングされていない抗原に比較して、はるかに高い有効性で発展する。本明細書で用いる１つの受容体は、エンドサイトーシス受容体ＤＥＣ−２０５またはＣＤ２０５であり、Ｔ細胞領域中の樹状細胞上で発現される。ｄｓＲＮＡを単独でＤＣ成熟刺激として用い、そして記憶を含む、ＣＤ４＋ Ｔ細胞免疫の性質のいくつかの特徴を研究した。本発明者らのデータによって、ｄｓＲＮＡがプライム−ブースト・タンパク質ワクチンのアジュバントとして働き、優れた質および量の、長寿命でそして防御性のＴｈ１ ＣＤ４＋ Ｔ細胞を誘導する潜在能力が明らかになる。
【００８３】
ｄｓＲＮＡをアジュバントとしたＣＤ４＋ Ｔ細胞反応の性質は、まず、その多重機能性によって示され、すなわち該Ｔ細胞はＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２などの多数のそして多量のサイトカインを産生した。ＤＥＣをターゲティングするワクチンが、ＩＦＮ−γを産生し、そして増殖しているＣＤ４＋ Ｔ細胞を高い頻度で誘導することもまた見出され、これは他のワクチンアプローチによる先行技術では示されていない、Ｔ細胞免疫の特徴であった。増殖性でそして多重機能性のＣＤ４＋ Ｔ細胞の頻度増加は、一般に、Ｔｈ１免疫の価値ある特徴と見なされ、そしてＨＩＶの優れた制御および森林型熱帯リーシュマニアモデルにおけるより優れた防御と関連する。
【００８４】
ＤＣをターゲティングするＨＩＶ ｇａｇ ｐ２４を用いた別の興味深い結果は、ＤＥＣ依存性方式での、ワクシニア−ｇａｇに対して長期に持続する防御性ＣＤ４＋ Ｔ細胞免疫の誘導であった。ワクシニアに対する防御へのＣＤ４＋ Ｔ細胞の寄与を検出した。感染に対する抵抗性におけるＩＦＮ−γの非常に重要な役割を考慮すると、高レベルのＩＦＮ−γ、ならびにＣＤ＋ Ｔｈ１ヘルパー細胞がターゲットとする感染ＭＨＣクラスＩＩ＋によるによる溶解は、どちらも、ｄｓＲＮＡとともにＤＥＣにターゲティングされたタンパク質によって誘導される抵抗性に寄与しうる。
【００８５】
ポリ（Ｉ：Ｃ）は、ＴＬＲ３エンドソームおよびＭＤＡ５細胞質ゾル受容体の両方によって認識されうる。ＴＬＲ３およびＭＤＡ５は、どちらも、ポリ（Ｉ：Ｃ）でのアジュバント作用および防御免疫に寄与することが見出された。対照的に、ＴＬＲ３は、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）のアジュバントの役割に独占的に必要である。さらに、ｄｓＲＮＡは、Ｉ型インターフェロンを誘導し、これが樹状細胞による交差提示およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の生存を促進する。
【００８６】
ｄｓＲＮＡは、マウスにおいてワクチンタンパク質に対する免疫原性を増進するアジュバントとして用いられてきているが、やはり防御性であるＣＤ４＋ Ｔ細胞反応を誘導する能力は、以前立証されていなかった。樹状細胞およびそのエンドサイトーシス受容体ＤＥＣ−２０５への、ｄｓＲＮＡをアジュバントとするワクチンタンパク質のターゲティングは、いくつかの広範囲感染性疾患に対する抵抗性に関連づけられる、Ｔｈ１ ＣＤ４＋ Ｔ細胞免疫の特定の種類の発展を支持するはずである。
【００８７】
本明細書に引用する特許、特許出願、書籍、および他の刊行物は、その全体が本明細書に援用される。
【００８８】
数値範囲に言及する際、範囲内のすべての値もまた記載されることを理解しなければならない（例えば、１〜１０にはまた、１および１０の間のすべての整数値、ならびに２〜１０、１〜５、および３〜８などのすべての中間範囲も含まれる）。用語「約」は、数値量の測定値またはばらつきと関連する統計的不確実性を指すことも可能であり、これは、本発明の操作または特許性に影響を及ぼさないことを当業者は理解するであろう。
【００８９】
請求項およびその法的同等物の範囲の意味内に属するすべての修飾および置換は、請求項の範囲内に含まれるものとする。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を唱える請求項は、他の要素が請求項の範囲内に含まれることを可能にする；本発明はまた、「含む」用語の代わりに、移行句「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」（すなわち、これらが本発明の操作に実質的に影響を及ぼさないのであれば、他の要素を請求項の範囲内に含めることを可能にする）または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」（すなわち、本発明に通常関連する不純物または重要ではない活性以外、請求項に列挙される要素のみを許す）を唱える請求項によっても記載される。これらの３つの移行句いずれかを用いて、本発明が請求可能である。
【００９０】
請求項に明確に唱えられない限り、本明細書に記載する要素が、請求する発明の限定と見なされてはならないことを理解しなければならない。したがって、請求項内に読み込まれる明細書から限定されるのではなく、許諾される請求項が、法的保護の範囲を決定するための基礎である。対照的に、先行技術は、請求する発明を予期するかまたは新規性を破壊する特定の態様の度合いまで、本発明から明確に排除される。
【００９１】
さらに、関連が請求項中に明確に唱えられない限り、請求項の限定間または限定中には、特定の関連はまったく意図されない（例えば、製品クレーム中の構成要素の配置、または方法クレーム中の工程の順序は、そのように明確に述べられていない限り、請求項の限定ではない）。本明細書に開示する個々の要素のあらゆるありうる組み合わせおよび順列が、本発明の側面とみなされる。同様に、本発明の説明の一般化は、本発明の一部と見なされる。
【００９２】
前述から、当業者には、本発明の精神または本質的な特性から逸脱することなく、本発明が他の特定の型で具現化されうることが明らかであろう。本発明に提供される法的保護の範囲は、本明細書によってではなく、付随する請求項によって示されるため、記載する態様は、制限ではなく、例示としてのみ見なされなければならない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）によってのみ仲介される自然免疫を開始する方法であって、他のＴｏｌｌ様受容体またはＲＮＡヘリカーゼを活性化することなく、あるいは１以上の炎症促進性サイトカインを過剰な量で誘導することなく、ＴＬＲ３を活性化するのに十分な量の少なくともポリ（Ｉ：Ｃ１１−１４Ｕ）を、被験体に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
被験体において、自己免疫損傷または神経変性によって開始されている、少なくともサイトカイン産生または同時刺激分子シグナル伝達を、ポリ（Ｉ：Ｃ１１−１４Ｕ）によって再調節する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
微生物に感染した被験体を治療する方法であって、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）に結合し、そして微生物による被験体の感染を減少させるかまたは排除するのに十分な量のポリ（Ｉ：Ｃ１１−１４Ｕ）を含む薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項４】
被験体が、細菌、原生動物、およびウイルスからなる群より選択される微生物に感染している、請求項３記載の方法。
【請求項５】
腫瘍または他の形質転換細胞を所持する被験体を治療する方法であって、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）に結合し、そして被験体における腫瘍または他の形質転換細胞の増殖を減少させるかまたは排除するのに十分な量のポリ（Ｉ：１１−１４Ｕ）を含む薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項６】
被験体が、癌を引き起こすウイルスに感染している、請求項５記載の方法。
【請求項７】
少なくとも、微生物に感染しているか、あるいは腫瘍または他の形質転換細胞を所持する被験体を治療する方法であって、樹状細胞成熟を誘導するのに十分な量のポリ（Ｉ：Ｃ１１−１４Ｕ）を含む薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項８】
微生物または腫瘍に対して被験体にワクチン接種する方法であって、（ｉ）微生物または腫瘍に対する免疫反応を誘導するワクチンまたは樹状細胞調製物、および（ｉｉ）Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）に結合し、そして被験体において、ワクチンまたは樹状細胞調製物の微生物抗原または腫瘍抗原に対する免疫反応を刺激するのに十分な量のポリ（Ｉ：Ｃ１１−１４Ｕ）を含む薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項９】
微生物または癌または他の形質転換細胞が、ＴＬＲ３アゴニストとしてのみ作用するポリ（Ｉ：Ｃ１１−１４Ｕ）の作用のみに感受性である、請求項３〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
微生物または癌または他の形質転換細胞が、ＴＬＲ３アゴニストとしてのみ作用するポリ（Ｉ：Ｃ１１−１４Ｕ）によって活性化される特異的サイトカイン反応パターンに感受性である、請求項３〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
微生物または癌または他の形質転換細胞が、抗原に対する免疫反応を開始するｉｎ ｓｉｔｕターゲットとして、ポリ（Ｉ：Ｃ１１−１４Ｕ）に自然に選択される抗原を発現する、請求項３〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
被験体において、微生物または癌または他の形質転換細胞によって開始されている、少なくともサイトカイン産生または同時刺激分子シグナル伝達を、ポリ（Ｉ：Ｃ１１−１４Ｕ）によって再調節する、請求項３〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
被験体がヒトである、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
ポリ（Ｉ：Ｃ１２−１４Ｕ）を静脈内注入する、請求項１〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
ポリ（Ｉ：Ｃ１１−１４Ｕ）を、皮内、皮下、または筋内注射するか：鼻内または気管内吸入させるか；あるいは中咽頭または舌下適用する、請求項１〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
微生物に感染したか、癌または他の形質転換細胞を所持するか、あるいは微生物、癌細胞、または他の形質転換細胞に対してワクチン接種された被験体の免疫細胞上のＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）に結合する薬剤を製造するための、ミスマッチ二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の使用。
【請求項１】
Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）によってのみ仲介される自然免疫を開始する方法であって、他のＴｏｌｌ様受容体またはＲＮＡヘリカーゼを活性化することなく、あるいは１以上の炎症促進性サイトカインを過剰な量で誘導することなく、ＴＬＲ３を活性化するのに十分な量の少なくともポリ（Ｉ：Ｃ１１−１４Ｕ）を、被験体に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
被験体において、自己免疫損傷または神経変性によって開始されている、少なくともサイトカイン産生または同時刺激分子シグナル伝達を、ポリ（Ｉ：Ｃ１１−１４Ｕ）によって再調節する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
微生物に感染した被験体を治療する方法であって、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）に結合し、そして微生物による被験体の感染を減少させるかまたは排除するのに十分な量のポリ（Ｉ：Ｃ１１−１４Ｕ）を含む薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項４】
被験体が、細菌、原生動物、およびウイルスからなる群より選択される微生物に感染している、請求項３記載の方法。
【請求項５】
腫瘍または他の形質転換細胞を所持する被験体を治療する方法であって、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）に結合し、そして被験体における腫瘍または他の形質転換細胞の増殖を減少させるかまたは排除するのに十分な量のポリ（Ｉ：１１−１４Ｕ）を含む薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項６】
被験体が、癌を引き起こすウイルスに感染している、請求項５記載の方法。
【請求項７】
少なくとも、微生物に感染しているか、あるいは腫瘍または他の形質転換細胞を所持する被験体を治療する方法であって、樹状細胞成熟を誘導するのに十分な量のポリ（Ｉ：Ｃ１１−１４Ｕ）を含む薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項８】
微生物または腫瘍に対して被験体にワクチン接種する方法であって、（ｉ）微生物または腫瘍に対する免疫反応を誘導するワクチンまたは樹状細胞調製物、および（ｉｉ）Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）に結合し、そして被験体において、ワクチンまたは樹状細胞調製物の微生物抗原または腫瘍抗原に対する免疫反応を刺激するのに十分な量のポリ（Ｉ：Ｃ１１−１４Ｕ）を含む薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項９】
微生物または癌または他の形質転換細胞が、ＴＬＲ３アゴニストとしてのみ作用するポリ（Ｉ：Ｃ１１−１４Ｕ）の作用のみに感受性である、請求項３〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
微生物または癌または他の形質転換細胞が、ＴＬＲ３アゴニストとしてのみ作用するポリ（Ｉ：Ｃ１１−１４Ｕ）によって活性化される特異的サイトカイン反応パターンに感受性である、請求項３〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
微生物または癌または他の形質転換細胞が、抗原に対する免疫反応を開始するｉｎ ｓｉｔｕターゲットとして、ポリ（Ｉ：Ｃ１１−１４Ｕ）に自然に選択される抗原を発現する、請求項３〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
被験体において、微生物または癌または他の形質転換細胞によって開始されている、少なくともサイトカイン産生または同時刺激分子シグナル伝達を、ポリ（Ｉ：Ｃ１１−１４Ｕ）によって再調節する、請求項３〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
被験体がヒトである、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
ポリ（Ｉ：Ｃ１２−１４Ｕ）を静脈内注入する、請求項１〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
ポリ（Ｉ：Ｃ１１−１４Ｕ）を、皮内、皮下、または筋内注射するか：鼻内または気管内吸入させるか；あるいは中咽頭または舌下適用する、請求項１〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
微生物に感染したか、癌または他の形質転換細胞を所持するか、あるいは微生物、癌細胞、または他の形質転換細胞に対してワクチン接種された被験体の免疫細胞上のＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）に結合する薬剤を製造するための、ミスマッチ二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の使用。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１１−５２５１６９（Ｐ２０１１−５２５１６９Ａ）
【公表日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４６７９３（Ｐ２０１０−５４６７９３）
【出願日】平成２１年２月１７日（２００９．２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０００９５９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１０２４９６
【国際公開日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【出願人】（５０８１７０４３８）へミスフェリックス・バイオファーマ，インコーポレーテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月１７日（２００９．２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０００９５９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１０２４９６
【国際公開日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【出願人】（５０８１７０４３８）へミスフェリックス・バイオファーマ，インコーポレーテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
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