ＶＥＧＦのためのＥＬＩＳＡ
【課題】患者の血流または他の生物学的サンプルにおける血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）活性は、癌、糖尿病、心臓の異常およびその他の病変における診断および予後の指標となる。
【解決手段】動物モデルおよび患者由来の生物学的サンプルにおけるＶＥＧＦ型のレベルを検出可能とし、診断／予後の指標として利用可能である、ＶＥＧＦを抗原とする抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法およびキットを提供する。
【解決手段】動物モデルおよび患者由来の生物学的サンプルにおけるＶＥＧＦ型のレベルを検出可能とし、診断／予後の指標として利用可能である、ＶＥＧＦを抗原とする抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法およびキットを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年１０月４日に出願された米国仮出願第６０／８２８２０３号の優先権とその利益を享受するものであり、その明細書の全てをここに含める。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、癌、心血管、その他の病変を有する患者の診断および予後の方法として使用可能な、ＶＥＧＦの一部の集団を検出するためのイムノアッセイに関する。
【０００３】
血管形成が種々の疾患の発病機序に関与していることは、もはや確立されている。これらは、固形腫瘍、増殖網膜症または加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）のような眼球内新生血管症候群、関節リウマチ、および乾癬を含む（Folkman et al. J. Biol. Chem. 267:10931-10934 (1992); Klagsbrun et al. Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991); およびGarner A, Vascular diseases. In: Pathobiology of ocular disease. A dynamic approach. Garner A, Klintworth GK, Eds. 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710）。固形腫瘍の場合、新血管形成により、通常細胞と比べて、腫瘍細胞に生育優位性および増殖自律性を獲得させる。かくして、腫瘍部位における微小血管の密度と、乳癌および他の一部の腫瘍における患者生存率との間には関連性が認められる（Weidner et al. N Engl J Med 324:1-6 (1991); Horak et al. Lancet 340: 1120-1124 (1992); およびMacchiarini et al. Lancet 340: 145-146 (1992)）。
【０００４】
血管形成の正の調節因子に関する調査は、例えばａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ-α、ＴＧＦ-β、ＨＧＦ、ＴＮＦ-α、アンギオジェニン、ＩＬ-８等を含む多くの候補をもたらした（Folkman et al., supra, and Klagsbrun et al., 上掲）。これまでに同定されている負の調節因子の一部は、トロンボスポンジン（Good et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:6624-6628 (1990)）、プロラクチンの１６キロダルトンＮ末端フラグメント（Clapp et al. Endocrinology, 133: 1292-1299 (1993)）、アンギオスタチン（O'Reilly et al. CeU 79:315-328 (1994)）およびエンドスタチン（O'Reilly et al. Cell 88:277-285 (1996)）を含む。
【０００５】
ここ数年にわたる研究により、正常および異常な血管形成の調節における血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の重要な役割が確立されてきた（Ferrara et al. Endocr. Rev. 18:4-25 (1997)）。単一のＶＥＧＦ対立遺伝子の欠損が胚性致死性を生じるとの知見は、血管系の発達および分化において、このファクターが欠くことのできない役割を演じることを示唆するものである（Ferrara et al., 上掲）。
【０００６】
さらに、ＶＥＧＦは、腫瘍および眼内疾患に関与する新血管形成の重要なメディエーターであることが示された（Ferrara et al., 上掲）。ＶＥＧＦのｍＲＮＡは、調べた多くのヒト腫瘍で過剰発現されている（Berkman et al. J Clin Invest 91 :153-159 (1993); Brown et al. Human Pathol. 26:86-91 (1995); Brown et al. Cancer Res. 53:4727-4735 (1993); Mattern et al. Brit. J. Cancer. 73:931-934 (1996); および Dvorak et al. Am J. Pathol. 146:1029-1039 (1995)）。また、眼球液体中のＶＥＧＦ濃度は、糖尿病患者および他の虚血性網膜症患者における血管の活発な増殖の存在とも密接に関連している（Aiello et al. N. Engl. J. Med. 331 : 1480-1487 (1994)）。さらに、急性黄斑変性（ＡＭＤ）を患っている患者の脈絡膜新生血管膜におけるＶＥＧＦの局在が示されている（Lopez et al. Invest. Qphtalmo. Vis. Sci. 37:855-868 (1996)）。
【０００７】
ＶＥＧＦは組織毎に製造され、循環系に進入してその生物学的効果を及ぼす必要はないが、むしろパラクリン調節因子として局所的に作用する。Yang et al. J. Pharm. Exp. Ther. 284: 103 (1998)による最近の研究では、循環系からのｒｈＶＥＧＦ１６５のクリアランスが非常に早いことが見出されており、循環系の内因性ＶＥＧＦはＶＥＧＦの連続的合成の結果であることが示唆されている。さらに、循環ＶＥＧＦレベルと全身腫瘍組織量との関連を示す試みがなされ、ＶＥＧＦレベルが可能性のある予後マーカーであることを示唆している（Ferrari and Scagliotti Eur. J. Cancer 32A:2368 (1996); Gasparini et al. J1 Natl. Cancer Inst. 89: 139 (1997); Kohn Cancer 80:2219 (1997); Baccala et al. Urology 51 :327 (1998); Fujisaki et al. Am. J. Gastroenterol. 93:249 (1998)）。正確にＶＥＧＦを測定する能力は、血管開通、月経周期、虚血、糖尿病、癌、眼内疾患等の多くの生物学的プロセスにおけるその潜在的役割を理解する上で重要である。
【０００８】
検出不可なレベルから高レベルまで、正常者および患者における内因性ＶＥＧＦの濃度は広範囲にわたって相違することが報告されている。内因性ＶＥＧＦレベルを測定する能力は、敏感で特異的なアッセイの能力に依存する。ＶＥＧＦのための比色分析、化学発光、および蛍光分析をベースとする酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が報告されている（Houck et al., 上掲, (1992); Yeo et al. Clin. Chem. 38:71 (1992); Kondo et al. Biochim. Biophys. Acta 1221 :211 (1994); Baker et al. Obstet. Gynecol. 86:815 (1995); Hanatani et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:1958 (1995); Leith and Michelson Cell Prolif. 28:415 (1995); Shifren et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 81:3112 (1996); Takano et al. Cancer Res. 56:2185 (1996); Toi et al. Cancer 77:1101 (1996); Brekken et al. Cancer Res. 58:1952 (1998); Obermair et al. Br. J. Cancer 77: 1870-1874 (1998); Webb et al. Clin. Sci. 94:395-404 (1998)）。
【０００９】
例えば、Houckら(1992、上掲)は、内因性ＶＥＧＦレベルを検出するには十分な感度ではないかもしれないｎｇ／ｍｌの感度を有する比色ＥＬＩＳＡについて記述している。Yeoら(1992、上掲)は、２サイト時間分解蛍光免疫測定法について記述しているが、ＶＥＧＦは正常血清中には検出されていない（Yeo et al. Cancer Res. 53:2912(1993)）。Bakerら(1995、上掲)は、この蛍光免疫測定法の修正版を用いて、妊婦の血漿中における検出可能なＶＥＧＦのレベルについて報告しており、子癇前症の女性でより高レベルであることを報告している。妊婦における同様のデータが、ラジオイムノアッセイを使用したAnthony et al. Ann. Clin. Biochem. 34:276 (1997)によって報告されている。Hanataniら(1995、上掲)は、循環するＶＥＧＦを測定することが可能な化学発光ＥＬＩＳＡを開発し、３０人の正常な個人（男女）の血清において、８−３６ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦレベルを報告している。Brekkenら(1998、上掲)は、ＶＥＧＦ単独またはＶＥＧＦ：Ｆｌｋ-１複合体に結合親和性を有する抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイについて記載している。
【００１０】
ＶＥＧＦ検出のためのＥＬＩＳＡキットは、R&D Systems(Minneapolis, MN)から商業的に入手可能である。R&D VEGF ELISAキットはサンドイッチアッセイに使用されており、モノクローナル抗体が標的ＶＥＧＦ抗原を捕獲するために使用され、ポリクローナル抗体がＶＥＧＦを検出するために使用される。Webb et al. 上掲 (1998). See, also, e.g., Obermair et ah, 上掲 (1998)。
【００１１】
Keyt et al. J. Biol. Chem. 271 :7788-7795 (1996); Keyt et al. J. Biol. Chem. 271 :5638 (1996); およびShifren et al., 上掲 (1996)も、二重モノクローナル抗体対に基づく比色ＥＬＩＳＡを開発した。このＥＬＩＳＡは癌患者において高いＶＥＧＦレベルを検出することができたが、正常な個体におけるＶＥＧＦの内因性レベルを測定するのに必要な感度には欠けている。Rodriguez et al. J. Immunol. Methods 219:45 (1998) は、純粋な血漿または血清において１０ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦ感度をもたらす２サイト蛍光分析ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡについて記述している。しかしながら、この蛍光分析アッセイは、ＶＥＧＦの十分に完全な１６５／１６５種および１６５／１１０種を検出する（ＶＥＧＦ１６５／１６５はタンパク質分解によって３つの別の形態、すなわち１６５／１１０ヘテロダイマー、１１０／１１０ホモダイマー、および５５アミノ酸Ｃ末端フラグメントに切断され得ることが報告されている（Keyt et al. J. Biol. Chem. 271 :7788-7795 (1996); Keck et al. Arch. Biochem. Biophvs. 344: 103-113 (1997))）。
【００１２】
かくして、現存するＥＬＩＳＡよりも動物モデルまたは患者の生物学的サンプルにおけるＶＥＧＦのより高度な測定可能レベルを検出し、かつ／またはＶＥＧＦの種々のアイソフォームを測定可能な診断および予後アッセイを開発する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ferrara et al. Endocr. Rev. 18:4-25 (1997)
【発明の概要】
【００１４】
生物学的サンプルにおけるＶＥＧＦ型を検出するための、ＶＥＧＦを抗原とする抗体−サンドイッチＥＬＩＳＡ法を開発した。ここに提供するＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡは、ＶＥＧＦアイソフォームおよび１１０より大きいＶＥＧＦのフラグメント（“ＶＥＧＦ１１０＋”）を検出することが可能である。また、そのためのキットも提供する。
例えば、生物学的サンプルにおける、１１０アミノ酸より大きい選択的血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）型（“ＶＥＧＦ１１０＋”）を検出する方法は、以下の工程：
（ａ）生物学的サンプルを固形支持体に固定された捕獲試薬と接触させてインキュベートする工程であって、ここで前記捕獲試薬がヒトＶＥＧＦに対する抗体５Ｃ３と同じエピトープを認識し、前記モノクローナル抗体がヒトＶＥＧＦの１１０より大きい残基に特異的に結合する、工程；
（ｂ）固定された捕獲試薬から生物学的サンプルを分離する工程；
（ｃ）固定された捕獲試薬−標的分子複合体を、ＶＥＧＦのＫＤＲおよび／またはＦＬＴ１レセプター結合ドメインに結合する検出可能抗体と接触させる工程；および
（ｄ）検出可能抗体のための検出手段を用いて捕獲試薬に結合したＶＥＧＦ１１０＋のレベルを測定する工程
を含む。ある実施態様では、検出可能抗体が、ＶＥＧＦ１−１１０中のエピトープに結合する。ある実施態様では、異なるタイプのＶＥＧＦを検出するために、対比ＥＬＩＳＡを実施することができる。ある実施態様では、生物学的サンプル（例えば、腫瘍サンプルまたは腫瘍溶解物、血漿、血清、または尿など）が被験者から単離される。
【００１５】
ある実施態様において、捕獲試薬は５Ｃ３モノクローナル抗体である。ある実施態様において、固定された捕獲試薬がマイクロタイタープレート上にコートされる。ある実施態様において、検出可能抗体がモノクローナル抗体である。ある実施態様において、検出可能抗体がマウスモノクローナル抗体である。ある実施態様において、固定化されたモノクローナル抗体がＭＡｂ ５Ｃ３であり、かつ、検出可能抗体がＭＡｂ Ａ４．６．１である。ある実施態様では、検出可能抗体が直接的に検出可能である。ある実施態様においては、検出可能抗体が比色試薬によって増幅される。ある実施態様では、検出可能抗体がビオチン化され、検出手段がアビジンまたはストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよび３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンである。
【００１６】
本発明のある実施態様においては、被験者が血管の、糖尿病の、または癌の患者であり、測定工程（ｄ）が正常な個体と比べたＶＥＧＦレベルを調べるために標準曲線と比較することをさらに含む。
【００１７】
キットも提供される。例えば、生物学的サンプル中の１１０アミノ酸より大きい血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）型（ＶＥＧＦ１１０＋）を検出するためのイムノアッセイキットは、
（ａ）捕獲試薬として、ヒトＶＥＧＦに対する抗体、ここで前記モノクローナル抗体がヒトＶＥＧＦの１１０より大きい残基に特異的に結合する；および
（ｂ）検出試薬として、ＶＥＧＦのＫＤＲおよび／またはＦＬＴ１レセプター結合ドメインに結合する検出可能抗体
を含むことができる。ある実施態様においては、検出可能抗体はＶＥＧＦ１−１１０中のエピトープに結合する。ある実施態様では、キットが捕獲試薬用の固形支持体をさらに含む。例えば、捕獲試薬は固形支持体（例えばマイクロタイタープレート）上に固定され得る。ある実施態様では、検出可能抗体の検出手段（例えば比色手段、蛍光手段など）をさらに含む。ある実施態様では、キットは抗原標準として精製されたＶＥＧＦをさらに含む。本発明のある実施態様においては、一以上の追加的なＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡを、ＶＥＧＦ１１０＋ＥＬＩＳＡとの対比研究のために行うことができる。ある実施態様においては、キットは、マウスモノクローナル抗体ＭＡｂ ５Ｃ３である捕獲試薬モノクローナル抗体、およびＭＡｂ Ａ４．６．１である検出可能抗体を含む。
【００１８】
さらに別の実施態様においては、本発明は抗ＶＥＧＦ抗体５Ｃ３を提供する（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７７３７の下に寄託されているハイブリドーマから入手可能または産生される）。また本発明は、ＶＥＧＦ１−１１０に結合せず、ハイブリドーマ細胞株ＰＴＡ−７７３７によって産生されるモノクローナル抗体と同一のＶＥＧＦ１１０＋エピトープに結合する抗体を提供する。ある実施態様においては、本発明の抗体は検出可能な標識に接合されている。ある実施態様では、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７７３７の下に寄託されているハイブリドーマ５Ｃ３．１．１が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１のパネルＡ、ＢおよびＣは、組み換えＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１２１（１）（製造元であるＲ＆Ｄシステムによるとカルボキシ末端から約９アミノ酸を欠失している切断物）、ＶＥＧＦ１２１（２）（Pepro Techから入手）、ＶＥＧＦ１１０（ＶＥＧＦのプラスミン消化により生成されたＮ末端フラグメント）、およびＶＥＧＦ８−１０９（ＶＥＧＦ１６５のアミノ酸８−１０９を有する人工ＶＥＧＦ）分子の、種々のＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡによる検出を示す。（Ａ）コート用に３．５Ｆ８を用い、検出用にビオチニル化Ａ４．６．１を用いたＥＬＩＳＡ Ａ。（Ｂ）コート用にＡ４．６．１を用い、検出用にビオチニル化２Ｅ３を用いたＥＬＩＳＡ Ｂ。（Ｃ）コート用に５Ｃ３を用い、検出用にビオチニル化Ａ４．６．１を用いたＥＬＩＳＡ Ｃ。
【００２０】
【図２】図２は、プロービングに３．５Ｆ８（左）またはＡ４．６．１（右）を用いた、Ａ６７３細胞により産生されたＶＥＧＦのタンパク質ブロッティングを示す。サンプルは、Ａ４．６．１アフィニティーカラムを用いてＡ６７３細胞のならし培地から精製したＶＥＧＦ（レーン１）、およびE.coliにより産生された組み換えＶＥＧＦタンパク質ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１２１（製造元であるＲ＆Ｄシステムによるとカルボキシ末端から約９アミノ酸を欠失）およびＶＥＧＦ８−１０９（それぞれレーン２、３および４）である。
【００２１】
【図３】図３は、３つのＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡで使用した抗体の推定される結合部位を示すＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１１０（ＶＥＧＦのプラスミン消化によって生成するＮ末端フラグメント）の略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明を詳細に説明する前に、本発明が特定の組成物または生物学的システムに限定されず、当然に変更可能であることを理解すべきである。また、ここで用いる用語が、特定の実施態様のみを記述するためのものであり、限定を意図していないことも理解すべきである。本明細書および請求の範囲で用いるように、単数形“a”、“an”および“the”は、その内容が明示しない限り、複数の指示対象を含む。かくして、例えば、“a molecule”は、任意に二以上の分子の組合せ等を含む。
【００２３】
ここで使用する用語“ＶＥＧＦ”は、Leung et al. Science 246:1306 (1989), Houck et al. MoL Endocrin. 5: 1806 (1991), およびNeufeld et al., 上掲に記載されているように１６５-アミノ酸血管内皮細胞増殖因子、および関連する１２１-、１４５-、１８９-および２０６-アミノ酸血管内皮細胞増殖因子、並びに、これらの増殖因子の天然に発生するアレルおよび被処理形態を指す。また、例えば、米国特許第６０５７４２８号の図１ＡおよびＢも参照のこと。活性ＶＥＧＦフラグメントは、最初の１１０アミノ酸を生じるプラスミン切断によりＥＣＭ結合ＶＥＧＦから放出され得る（例えば、Keyt BA, et al.,: The carboxyl-terminal domain (111-165) of vascular endothelial growth factor is critical for its mitogenic potency. J Biol Chem. 271 : 7788-7795 (1996)を参照）。ここで使用する“ＶＥＧＦ１１０＋”は、（Ｎ末端から）１１０アミノ酸より大きいＶＥＧＦフラグメントを指すが、最初の１１０アミノ酸またはより小さいフラグメントを含まない（例えばＶＥＧＦ８−１０９）。
【００２４】
用語“検出”は、標的分子の定性的測定および定量的測定の両方を含む最も広い意味で使用される。ある態様において、ここに記載する検出方法は、生物学的サンプルにおけるＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦの僅かな存在を同定するために使用される。別の態様では、この方法は、サンプルにおけるＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦが検出可能なレベルであるかどうか調べるために用いられる。さらに別の態様では、この方法は、サンプルにおけるＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦを定量するため、さらには、異なるサンプルのＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦレベルを比較するために使用され得る。
【００２５】
“生物学的サンプル”という用語は、あらゆる動物、しかし好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの身体のサンプルを指す。ある実施態様では、かかる生物学的サンプルは、血管の、糖尿病の、または癌の患者に由来する。かかるサンプルは、血清、血漿、硝子体液、リンパ液、滑液、卵胞液、精液、羊水、乳汁、全血、尿、脳脊髄液、唾液、痰、涙、汗、粘液、腫瘍溶解物および組織培養液のような生物学的体液、並びに、ホモジナイズした組織、腫瘍組織のような組織抽出物および細胞抽出物を含む。ある実施態様では、サンプルは、あらゆる動物に由来する身体サンプルであり、ある実施態様では、哺乳動物に由来し、ある実施態様では、ヒトに由来する。ある実施態様において、かかる生物学的サンプルは、臨床患者に由来する。
【００２６】
用語“検出可能抗体”は、検出手段により増幅された標識を介して直接的に、あるいは、例えば標識された別の抗体を介して間接的に、検出され得る抗体を指す。直接標識のために、典型的には、抗体は、ある手段によって検出可能な分子に接合されている。
【００２７】
用語“検出手段”は、ここではＥＬＩＳＡにおいて検出可能抗体の存在を検出するために使用される分子または技術を指し、マイクロタイタープレートに捕獲された標識のような固定化された標識を増幅する検出剤を含む。ある実施態様では、検出手段はアビジンまたはストレプトアビジン-ＨＲＰのような比色検出剤である。
【００２８】
用語“捕獲試薬”は、サンプル中の標的分子に結合して捕獲することができる試薬を指し、かくして適切な条件下において捕獲試薬−標的分子複合体がサンプルから分離され得る。典型的には、捕獲試薬は固定化されているか、または固定化され得る。サンドイッチイムノアッセイでは、捕獲試薬が、好ましくは標的抗原に対する一種の抗体または種々の抗体の混合物である。
【００２９】
ここで使用する用語“抗体”は最も広い意味において用いられ、特に、完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも二つの完全な抗体から形成された多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、ならびに所望の生物学的活性を示す限り抗体フラグメントにわたる。
【００３０】
“抗体フラグメント”は、完全な抗体の一部、好ましくは、その抗原結合領域または可変領域を含有する一部を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ジアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）；線状抗体；単鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される複数特異性抗体が挙げられる。
【００３１】
ここでの目的では、“完全な抗体”とは、重鎖-および軽鎖可変ドメインおよびＦｃ領域を含む抗体である。
【００３２】
“ネイティブな抗体”は、通常約１５０，０００ダルトンのヘテロ４量体糖タンパク質であり、２つの同一な軽（Ｌ）鎖および２つの同一な重（Ｈ）鎖から構成される。各軽鎖は、１つの共有結合のジスルフィド結合によって重鎖に連結され、一方、ジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変化する。各重鎖および軽鎖もまた、一様に間隔をあけた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、後に、多数の定常ドメインが続く可変ドメイン（ＶＨ）を一端に有する。各軽鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＬ）を、そして他方の端に定常ドメインを有し；この軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列され、そして軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列される。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられている。
【００３３】
ここで用いる用語“モノクローナル抗体”とは、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわちこの集団を含む個々の抗体が、少量で存在し得る天然に存在する可能性のある変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原性部位に対して指向し、高度に特異的である。さらに、典型的に、異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を含む、慣用的な（ポリクローナル）抗体調製物と対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリンによって汚染されていない点で有利である。この修飾語句“モノクローナル”は、実質的に均質な抗体の集団から得られるような抗体の特徴を示し、そして任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または組換えＤＮＡ法によって作製され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。“モノクローナル抗体”はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される技術を使用するファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
【００３４】
本明細書中におけるモノクローナル抗体は、特に、“キメラ”抗体（免疫グロブリン）を含む。キメラの抗体において、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるか、あるいは相同であるが、残りの鎖は、別の種に由来するか、または別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにこれらが所望される生物学的活性を示す限りは、このような抗体のフラグメントにおける対応する配列と同一であるか、あるいは相同である（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書中において関心の向けられるキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザルまたはカニクイザルのような旧世界ザル）由来の可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列（米国特許第５６９３７８０号）を含む“霊長類化”抗体を含む。
【００３５】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の“ヒト化”形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、ヒト免疫グロブリンにおいて、レシピエントの超可変領域残基は、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）（例えば、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類）由来の超可変領域残基により置換される。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒトの残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体において見出されない残基を含有し得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに洗練するためになされる。一般的には、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、可変ドメインにおいて、全てまたは実質的に全ての超可変領域は、非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に対応し、そして全てまたは実質的に全てのＦＲは、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体はまた、必要に応じて、少なくとも一部の免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域を含む。さらに詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525(1986); Reichmann et al., Nature 332:323-329(1988); およびPresta、Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)を参照のこと。ある実施態様において、ヒト化５Ｃ３抗体が、ここに記載された方法で提供および使用される。
【００３６】
用語“可変”とは、可変ドメインの特定の部分が、抗体間の配列において広範囲にわたって異なる事実をいい、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性において使用される。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均一に分布するわけではない。これは、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方において、超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブの重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、４つのＦＲを含み、βシート形態を概ね帯び、３つの超可変領域によって連結され、βシート構造と連結するループを形成し、ある場合には、βシート構造の一部を形成する。各鎖における超可変領域は、他の鎖由来の超可変領域と共に、ＦＲに非常に近接して一緒に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service. National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与するわけではないが、種々のエフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与）を示す。
【００３７】
抗体のパパイン消化は、各々が、単一の抗原結合部位を有する“Ｆａｂ”フラグメントと称される２つの同一の抗原結合フラグメント、および残りの“Ｆｃ”フラグメントを生成し、この名前“Ｆｃ”は、容易に結晶化するその能力を反映している。ペプチン処理によって、２つの抗原結合部位を有し、そしてなおも抗原と架橋結合し得るＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じる。
【００３８】
“Ｆｖ”は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、密接な非共有結合的な会合による、１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインのダイマーからなる。これは、各可変ドメインの３つの超可変領域が、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面上の抗原結合部位を規定するように相互作用するような配置にある。ひとまとめにすると、６つの超可変領域が、抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかし、１つの可変ドメイン（または抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）であっても抗原を認識しそして結合する能力を有するが、これは結合部位全体よりも低い親和性である。
【００３９】
Ｆａｂフラグメントもまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に数個の残基を付加している点で、Ｆａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書中において、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一つのフリーのチオール基を保有するＦａｂ’を示す。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、本来、ヒンジシステインをその間に有するＦａｂ’フラグメントの対として生成された。抗体フラグメントの他の化学カップリングもまた、公知である。
【００４０】
任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の“軽鎖”が、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに異なる型の内の一方に割り当てられ得る。
【００４１】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体は異なるクラスに割り当てられ得る。完全な抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、そしてこれらのうちのいくつかは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２のサブクラス（アイソタイプ）にさらに分けられ得る。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および３次元配置が、周知である。
【００４２】
“単鎖Ｆｖ”または“ｓｃＦｖ”抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含有し、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のために所望の構造を形成することを可能にするＶＨドメインおよびＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含有する。ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６９−３１５頁（１９９４）を参照のこと。
【００４３】
用語“超可変領域”は、本明細書中に使用される場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、“相補性決定領域”または“ＣＤＲ”由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインにおいて残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおいて３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））を含むか、そして／または“超可変ループ”由来の残基（例えば、軽鎖可変ドメインにおいて残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、および９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおいて２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。“フレームワーク”または“ＦＲ”の残基は、本明細書中に規定されるような超可変領域の残基以外の可変ドメイン残基である。
【００４４】
処置の目的のために“哺乳動物”は、哺乳動物として分類される任意の動物をいい、ヒト、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）および家畜（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）、ならびに動物園の動物、娯楽動物または愛玩動物（例えば、イヌ、ウマ、ヒツジ、ネコ、ブタ、乳牛など）を含む。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。
【００４５】
用語“癌”、“癌性”および“悪性”は、典型的には無秩序な細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態をいうか、または示す。癌の例としては、限定されないが、腺癌を含む癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病が挙げられる。かかる癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌、肺癌（肺の小細胞癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、および肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜の癌、肝細胞の癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃまたはｓｔｏｍａｃｈ）癌（胃腸癌を含む）、消化管間質癌、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌（例えば肝癌およびヘパトーマ）、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌，結腸直腸癌、直腸癌、子宮内膜または子宮の癌腫、唾液腺癌腫、腎臓（ｋｉｄｎｅｙまたはｒｅｎａｌ）癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部の癌、甲状腺癌、基底細胞癌、精巣癌、食道癌、肝細胞（ｈｅｐａｔｉｃ）癌腫、軟部組織の肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌腫、中皮腫、多発性骨髄腫、ならびに種々の型の頭部および頚部の癌、ならびにＢ細胞リンパ腫（例えば、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中等悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中等悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度非分割小細胞ＮＨＬ；大きな腫瘍の（ｂｕｌｋｙ ｄｉｓｅａｓｅ）ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症）；ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリーセル白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後リンパ球増殖症障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫と関連する異常な脈管増殖（脳腫瘍と関連するものなど）、ならびにメグス症候群が挙げられる。
【００４６】
“血管の”及び“心血管の”という語法は、相互交換可能に使用され、血管形成及び／又は心血管新生を刺激する徴候、及び血管形成及び／又は心血管新生を阻害する徴候を持つ患者を記述する。このような疾患には、例えば、アテローム性動脈硬化、高血圧、炎症性脈管炎、レーノー病及びレーノー現象、動脈瘤、及び動脈再狭窄などの動脈の病気；血栓静脈炎、リンパ管炎、及びリンパ浮腫などの静脈及びリンパ管の疾患；及び他の血管疾患、例えば、末梢血管病、ＡＭＤ、血管腫瘍のような癌、例えば血管腫(毛細管及び海綿状)、グロムス腫瘍、毛細管拡張症、細菌性血管腫症、血管内皮腫、血管肉腫、血管外皮細胞腫、カポジ肉腫、リンパ管腫及びリンパ管肉腫、腫瘍血管形成などの癌、創傷、火傷、及び他に損傷を被った組織などの外傷、移植固定、瘢痕化、虚血再潅流傷害、慢性関節リュウマチ、脳血管の病気、急性腎不全などの腎臓病、及び骨粗鬆症が含まれる。また、狭心症、急性心筋梗塞などの心筋梗塞、心肥大、及びうっ血性心不全（ＣＨＦ）などの心不全も含まれる。
【００４７】
“糖尿病”という用語は、インスリンの不適当な生産又は利用を含む糖質代謝の進行性疾患を示し、高血糖及び糖尿により特徴付けられる。この用語は、例えば、Ｉ型及びＩＩ型及びインスリン耐性糖尿病、例えば、メンデンホール症候群、ウェルナー症候群、妖精症（leprechaunism）糖尿病、脂肪萎縮性糖尿病、及び他の脂肪萎縮など全ての形態の糖尿病を含む。
【００４８】
“アフィニティー精製された”という用語は、アフィニティークロマトグラフィーカラムを通して溶出することにより物質を精製することを示す。
【００４９】
ＥＬＩＳＡ
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、ホモ二量体糖タンパク質であり、成長段階および腫瘍に関連する病的血管新生における血管形成の重要な血管新生因子である。ＶＥＧＦの発現は、低酸素状態に反応して、並びに、可能性として、成長因子、ホルモンおよび癌遺伝子のような他の因子に反応して、促進される（例えばFerrara N: Vascular endothelial growth factor: Basic science and clinical progress . Endocrine Reviews 25: 581-611 (2004)を参照）。ヒトＶＥＧＦ遺伝子はイントロンによって分断された８つのエキソンを有する。選択的RNAスプライシングにより、単量体当たり１２１、１６５、１８９及び２０６個のアミノ酸を有する少なくとも４つの主なアイソフォームが生成される（例えば、Houck KA, et al.,: The vascular endothelial growth factor family: identification of a fourth molecular species and characterization of alternative splicing of RNA. MoI Endocrinol 5: 1806-1814 (1991); 並びにTischer E, et al.,: The human gene for vascular endothelial growth factor. Multiple protein forms are encoded through alternative exon splicing. J Biol Chem 266: 11947-11954 (1991)）。単量体当たり１４５個のアミノ酸（例えばPoltorak Z., et al.,: VEGF145, a secreted vascular endothelial growth factor isoform that binds to extracellular matrix. J Biol Chem 272: 7151-7158 (1997)）および１８３個のアミノ酸（例えばJingjing L, et al.,: Human Muller cells express VEGF 183, a novel spliced variant of vascular endothelial growth factor. Invest Ophthalmol Vis Sci 40:752-759 (1999)を参照）を有するアイソフォームを含む頻度の低いアイソフォームも報告されている。全てのＶＥＧＦアイソフォームが、二つのレセプターチロシンキナーゼ、ＶＥＧＦＲ−１（例えばDe Vries C, et al.,: The fins-like tyrosine kinase, a receptor for vascular endothelial growth factor. Science 255:989-991 (1992)を参照）およびＶＥＧＦＲ−２（例えばTerman BI, et al.,: Identification of a new endothelial cell growth factor receptor tyrosine kinase. Oncogene 6: 1677-1683 (1991)を参照）に結合する。ＶＥＧＦ１６５は、ニューロピリンとも相互作用する（例えばSoker S. et al.,: Neuropilin-1 is expressed by endothelial and tumor cells as an isoform-specific receptor for vascular endothelial growth factor. Cell 92: 735-745 (1998)を参照）。ＶＥＧＦ１８９およびＶＥＧＦ２０６は高い親和性でヘパリンに結合し、ほとんど細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に隔離される。ＶＥＧＦ１６５は中度の親和性でヘパリンに結合し、一部は可溶性であり、一部は細胞表面およびＥＣＭに結合する。ＶＥＧＦ１２１はヘパリンに結合せず、制限されることなく可溶性である。ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１６５は、逆転写ＰＣＲ解析により乳房および卵巣の癌腫瘍試料および細胞株において最も優勢に発現されるバリアントであることが見出されたが、ＶＥＧＦ２０６の発現は検出されなかった。ＶＥＧＦ１８３およびＶＥＧ１８９発現はその細胞株において検出不可能または低レベルであることが見出され、一部の腫瘍試料において検出された（例えば、Stimpfl M, et al.,: Vascular Endothelial growth factor splice variants and their prognostic value in breast and ovarian cancer. Clinical Cancer Research 8: 2253-2259 (2002)を参照）。
【００５０】
活性ＶＥＧＦフラグメントは、最初の１１０アミノ酸を生じるプラスミン切断によりＥＣＭ結合ＶＥＧＦから放出され得る（例えばKeyt BA, et al., The carboxyl-terminal domain (111-165) of vascular endothelial growth factor is critical for its mitogenic potency . J Biol Chem. 271 : 7788-7795 (1996)を参照）。これは、血管形成の生理的および病的なプロセスにおけるＶＥＧＦのバイオアベイラビリティを局所的に制御するメカニズムかもしれない。例えば、Houck KA, et al. Dual regulation of vascular endothelial growth factor bioavailability by genetic and proteolytic mechanisms. J Biol Chem 1992;267:26031-26037 (1992); Keyt BA, et al. The carboxy -terminal domain (111-165) of vascular endothelial growth factor is critical for its mitogenic potency. J Biol Chem. 271 :7788-7795 (1996); およびRoth D, et al. Plasmin modulates vascular endothelial growth factor- A-mediated angiogenesis during wound repair. Am Pathology 168: 670-684. (10-12) (2006)を参照。しかしながら、生物学的サンプルにおけるＶＥＧＦ１１０濃度については未だ報告されたことがない。活性ＶＥＧＦフラグメントは、マトリクス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）切断によってもＥＣＭ結合ＶＥＧＦから放出されるかもしれない。これは、卵巣癌患者由来の腹水における１−１１０にさらに付加のアミノ酸を有する分解されたＶＥＧＦフラグメントの発見によって支持されている。プラスミンとＭＭＰ３の両方が腹水中に検出されている。例えば、Lee S, Shahla MJ, et al. Processing of VEGF-A by matrix metalloproteinases regulates bioavailability and vascular patterning in tumors. J Cell Biology 169:681-691 (2005)を参照。
【００５１】
種々の抗原に対する酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）は、比色分析、化学発光および蛍光定量法に基づくものを含む。ＥＬＩＳＡは、血漿および尿のサンプルにける微量の薬剤および他の抗原性成分の測定に成功裏に利用されており、抽出工程を含まず、簡便に実施できる。ここに記述するアッセイは、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ１１０＋のための捕獲試薬としての抗体および検出可能抗体を利用するＥＬＩＳＡである。一部の実施態様においては、ＥＬＩＳＡは細胞ベースである。アッセイの第一工程において、ＶＥＧＦを含有もしくはＶＥＧＦ１１０＋を含有することが疑われる生物学的サンプルを捕獲（またはコート）抗体と接触させかつインキュベートして、捕獲抗体がＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ１１０＋を捕獲または結合して、検出工程において検出可能な状態にする。検出工程は検出可能抗体の使用を含み、この検出可能抗体は、結合したＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ１１０＋の何れかと接触した際に、存在するならば、指向されたタンパク質と結合し、検出手段が抗体上の標識、かくしてＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ１１０＋の存在または存在量を検出するために使用される。このＥＬＩＳＡは、全ＶＥＧＦ（例えば、米国特許第６８５５５０８号；ここに記載されている事項および当該技術分野で公知の事項）またはＶＥＧＦのアイソフォームを認識して存在するＶＥＧＦのタイプを調べるＥＬＩＳＡに匹敵する。
【００５２】
例えば、ある実施態様では、アッセイは以下のステップを利用する。
【００５３】
第一のステップ
【００５４】
ここでのアッセイの第一ステップにおいて、生物学的サンプルは、固定化された捕獲（又はコート）試薬と接触され、共にインキュベートされるが、捕獲試薬は抗−ＶＥＧＦモノクローナル抗体である。この抗体は何らかの動物種に由来するが、好ましくは、モノクローナル抗体はマウス又はラットモノクローナル抗体で、さらに好ましくはマウスで、最も好ましくはここに記載するハイブリドーマから誘導されるＭＡｂ ５Ｃ３である。従って、特定の好ましい実施態様において、固定化されたモノクローナル抗体はマウスモノクローナル抗体で、最も好ましくはＭＡｂ ５Ｃ３である。通常、固定化は、アッセイ手順前に、水に不溶なマトリクスもしくは表面への吸着（米国特許第３，７２０，７６０号）又は非共有結合性もしくは共有結合性の共役により（例えば、米国特許第３，６４５，８５２号又はRotmans等, J. Immuno. Methods 57:87-98 (1983)中に記述されるように、硝酸及び還元剤などの試薬による担体の事前の活性化を伴う又は伴わない、グルタルアルデヒド又はカルボジイミドのクロスリンクを用いて）、或いはアッセイの後、例えば、免疫沈降法などの方法により、捕獲試薬を不溶化することにより達成される。
【００５５】
固定化に使用される固相は、実質的に水に不溶性でイムノメトリック（immunometric）アッセイにおいて有用な不活性な担体又はキャリアの何れかで、例えば、表面、粒子、多孔性マトリクスなどの形態の担体を含む。通常使用される担体の例には、小さなシート、セファデックス、塩化ビニル、プラスチックビーズ、及びポリエチレン製、ポリプロピレン製、ポリスチレン製のアッセイプレート又は試験管、及び９６−ウェルマイクロプレートを含む同等なもの、並びにろ紙、アガロース、クロスリンクデキストラン、及び他の多糖類などの粒子性物質が含まれる。あるいは、臭化シアンにより活性化された糖質などの反応性を有する水に不溶なマトリクス、及び米国特許第３，９６９，２８７号；３，６９１，０１６号；４，１９５，１２８号；４，２４７，６４２号；４，２２９，５３７号；及び４，３３０，４４０号中に記述される反応性基質は、捕獲試薬の固定化に適切に用いられる。好ましい実施態様において、固定化される捕獲試薬はマイクロタイタープレート上にコートされ、特に、使用されるのに好ましい固相は、一度に幾つものサンプルを分析するために使用し得るマルチウェルマイクロタイタープレートである。例えば、Nune MaxisorbまたはImmulonとして市販されているようなマイクロテスト９６ウェルＥＬＩＳＡプレートである。一部の実施態様では、このプレートは、NUNC MAXISORBTMまたはIMMULONTMとして市販されているようなMICROTESTTMまたはMAXISORPTM９６ウェルＥＬＩＳＡプレートである。
【００５６】
固相は、上述したように捕獲試薬でコートされ、非共有結合又は共有結合的相互作用又は所望の物理的な結合により連結される。吸着のための技術には、米国特許第４，３７６，１１０号及びこの中の引用文献中に記述されるものが含まれる。共有結合の場合、プレート又はその他の固相は、室温で１時間など当該技術分野において周知の条件下で捕獲試薬と共にクロスリンク剤とインキュベートされる。
【００５７】
一般に、捕獲試薬を固相基質へ吸着させるために用いられるクロスリンク剤は、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシニミジルプロピオン酸）などのジスクシニミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、及びビス−Ｎ−マレイミド−１．８−オクタンなどの二官能性マレイミドを含む。メチル−３−[(p-アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミド酸塩などの誘導体薬剤は、光の存在下においてクロスリンクを形成することができる光活性化可能中間体を産生する。
【００５８】
９６−ウェルプレートが利用される場合、それらは典型的には捕獲試薬でコートされる（典型的には、0.05Ｍ 炭酸ナトリウムなどのバッファー中で、少なくとも約１０時間、より好ましくは少なくとも一晩、約4-20℃で、より好ましくは約4-8℃、及び約8-12のｐＨ、より好ましくは約9-10及び最も好ましくは約9.6におけるインキュベーションにより希釈される）。さらに短いコート時間が望ましい場合、例えば９６−ウェルプレートを室温で２時間かけてコートすることができる。プレートは、アッセイ自体に先んじて長期間積み重ねて保存し、コートされていてもよく、その後、アッセイは手動、半自動、又はロボットを使用することによる自動的な形式で幾つかのサンプルに対し同時に実施され得る。
【００５９】
次に、典型的には、コートされたプレートは、フリーなリガンドのプレートウェル上の過剰な部位に対する不要な結合を防ぐために、結合部位に非特異的に結合させ、飽和させるブロッキング剤で処理される。この目的に対し適当なブロッキング剤の例には、例えば、ゼラチン、ウシ血清アルブミン、卵アルブミン、カゼイン、及び脱脂ミルクなどが含まれる。典型的には、ブロッキング処理は外界温度の条件下で1-4時間、好ましくは約1から３時間、あるいは０−４℃で一晩行われる。
【００６０】
コート及びブロッキングの後、適切に希釈されたＶＥＧＦ標準物質（精製ＶＥＧＦ）又は分析される生物学的サンプルは固定化相へ添加される。好ましい希釈率は、体積にして約1-15％で、好ましくは約10％である。この目的に対する希釈のために使用されてもよいバッファーは、（a）0.5 % BSA, 0.05 % TWEEN20TM界面活性剤（P20), 0.05 % PROCLINTM300抗生物質, 5 mM EDTA, 0.25 % Chaps界面活性剤, 0.2 % β-ガンマグロブリン, 及び0.35 M NaClを含むPBS；(b)0.5 % ウシ血清アルブミン, 0.05 % ポリソルバート20, 5 mM EDTA, 0.25 % Chaps, 0.2 % ウシβ-ガンマグロブリン, 及び0.35 M NaClを含むPBSでpH7.4；(c)0.5 % BSA, 0.05 % P20, 及び0.05 % PROCLINTM300 を含むPBSでpH7；(d)0.5 % BSA, 0.05 % P20, 0.05 % PROCLINTM300, 5 mM EDTA, 及び0.35 M NaClを含むPBSでpH6.35；(e)0.5 % BSA, 0.05 % P20, 0.05 % PROCLINTM300, 5 mM EDTA, 0.2 % β-ガンマグロブリン, 及び0.35 M NaClを含むPBS；及び(f)0.5 % BSA, 0.05 % P20, 0.05 % PROCLINTM300, 5 mM EDTA, 0.25 % Chaps, 及び0.35 M NaClを含むPBS, pH7.4、を含む。PROCLINTM300は保存剤として作用し、TWEEN20TMは非特異的な結合を除去するために界面活性剤として作用する。
【００６１】
一般に、捕獲試薬の濃度は、生物学的サンプルの必要な希釈を考慮にいれたＶＥＧＦの対象の濃度範囲により決定され、捕獲試薬の最終濃度は、一般に対象の範囲においてアッセイ感度を最大にするために経験的に決定されるであろう。
【００６２】
サンプル及び固定化された捕獲試薬のインキュベーション条件は、アッセイの感度を最大にし、解離を最小にするように選択される。好ましくは、インキュベーションは、約0℃から約40℃の範囲内であり、好ましくは、約20から25℃で、完全に一定の温度で達成される。インキュベーションの時間は、第一に温度に依存し、感度の悪いアッセイを避けるために一般に約１０時間を超えない。好ましくは、インキュベーション時間は、約0.5から３時間であり、より好ましくは遊離ＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦの捕獲試薬に対する結合を最大にするために室温で1.5-3時間である。生物学的体液中でタンパク質分解酵素がＶＥＧＦを分解することを妨げるために、タンパク質分解酵素阻害剤が添加される場合、インキュベーションの持続時間はさらに長くてもよい。
【００６３】
この段階で、インキュベーション混合物のpHは、通常、約4-9.5の範囲内であり、好ましくは約6-9の範囲内、より好ましくは7-8の範囲内、最も好ましくはアッセイ（ＥＬＩＳＡ）希釈液のpHが7.4である。インキュベーションバッファーのpHは、捕獲されるべきＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦに対する捕獲試薬の特異的な結合の有意なレベルを維持するために選択される。このステップ間、種々のバッファーが所望のpHを達成及び維持するために使用されるが、それらにはホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス塩酸塩又はトリスリン酸塩、酢酸塩、バルビタール、及び類似のものが含まれる。使用される特定のバッファーが、本発明にとって重要というわけではないが、個々のアッセイにおいて使用されるバッファーがその他のバッファーより好ましいほうがよい。
【００６４】
第二のステップ
【００６５】
ここでのアッセイ方法の任意の第二のステップにおいて、生物学的サンプルは、捕獲されなかった分子を除去するために、固定化された捕獲試薬から分離（好ましくは洗浄により）される。一般に、洗浄のために用いられる溶液は、考慮すべき事項により決定されるpHを持つバッファー（洗浄バッファー）であり、約6-9の好ましいpHの範囲を持つインキュベーションのステップのための上述のバッファーである。洗浄は３回又はそれ以上行われる。一般に、洗浄温度は、冷蔵庫の温度レベルから中程度の温度範囲であり、アッセイの期間中維持される一定温度であって、典型的には約0-40℃、より好ましくは約4-30℃である。例えば、洗浄バッファーは洗浄前に貯蔵庫内4℃の氷中に置かれ、プレート洗浄機がこのステップで利用され得る。また、捕獲されたＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦが後のステップにおいてある程度解離することに懸念がある場合は、結合したばかりのＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦが捕獲試薬に共有結合的に接着されることを可能にするために、クロスリンク剤又は他に適する薬剤がこの段階で添加されてもよい。
【００６６】
第三のステップ
【００６７】
次のステップでは、正確な温度及び使用される検出手段に主として依存する二物質を接触させるための時間を用いて、固定化された捕獲試薬を検出可能抗体に接触させるが、好ましくは約20-40℃の温度、より好ましくは約20-25℃で行う。例えば、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼと3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンが検出手段として使用される場合、ある実施態様では、シグナルを最大に増幅させるために、接触が行われる（例えば、約1時間又はそれ以上）。好ましくは、予想される遊離ＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦの最大濃度（上述）に対して過剰モル濃度の抗体が、洗浄後、プレートへ添加される。この抗体は直接的又は間接的に検出可能である。検出可能抗体がポリクローナル又はモノクローナル抗体の場合、ある実施態様では、検出抗体はモノクローナル抗体であり、ある実施態様ではマウス、ある実施態様ではMAb A4.6.1である。また、検出可能抗体は直接検出可能であり、ある実施態様では比色標識を有し、別の実施態様では蛍光標識を有する。より好ましくは検出可能抗体はビオチン化され、検出手段はアビジン又はストレプトアビジン-ペルオキシダーゼと3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンである。検出手段の読み出しは蛍光または比色法によるものとすることができる。抗体の親和性は、少量の遊離ＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦが検出されるべく十分に高くなくてはならないが、ＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦが捕獲試薬から引き離されるほど高くはない。
【００６８】
第四のステップ
【００６９】
アッセイ方法の最終ステップにおいて、この時点で捕獲試薬に結合されている遊離ＶＥＧＦのレベルは検出可能抗体に対する検出手段を用いて測定される。生物学的サンプルが血管の、糖尿病の、又は癌の患者由来である場合、好ましくは、測定のステップは、上述の３つステップの結果生じる反応を、正常個体と比較してＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦのレベルを決定するための標準曲線と比較することを含むか、あるいは、好ましくは、上述の３つステップの結果生じる反応を、種々のアイソフォームまたは全ＶＥＧＦを認識する別のＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡと比較して、ＥＬＩＳＡ同士を比較し、任意に正常個体と比較した場合の、ＶＥＧＦタイプのレベルを調べることを含む。
【００７０】
抗体産生
【００７１】
一般に、ＶＥＧＦに対するポリクローナル抗体は、ＶＥＧＦとアジュバントを複数回皮下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)注射することにより、動物に産生される。免疫化されている種において免疫原性であるタンパク質、例えばスカシガイヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する結合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する結合)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２ 、又はＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ、を使用して、ＶＥＧＦ又は標的となるアミノ酸配列を含むフラグメントを結合させることが有用である。ここでＲとＲ１は異なったアルキル基である。
【００７２】
コート抗体又は検出可能抗体として使用される抗体は、マウス、霊長類、ウサギ目の動物、ヤギ、ウサギ、ラット、チキン、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ又はブタなど何れか都合の良い脊椎動物から得られる。また、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)；Neuberger等, Nature 312:604 (1984)；Takeda等, Nature 314:452 (1985)；１９９８年１０月１５日発行の国際公開第９８/４５３３１号、並びに上述中に示される更なる文献中に記述されているように、キメラ又はヒト化抗体も使用され得る。
【００７３】
動物を、例えば、1mg又は1μｇのコンジュゲート（それぞれウサギ又はマウスの場合）を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、免疫原性コンジュゲート又はその誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、該動物を、不完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、血清が抗−ＶＥＧＦ力価についてアッセイされる。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、ＶＥＧＦのコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なったクロスリンク剤を介してコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。また、コンジュゲートはタンパク融合体として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。ポリクローナル抗体の生産方法は、Davis等によるMicrobiology, 3rd Edition, (Harper & Row, New York, New York,1980)などの多くの免疫学のテキスト本に記述されている。
【００７４】
モノクローナル抗体は、免疫化された動物から脾臓を回収し、定法により細胞を不死化し、例えば、ミエローマ細胞との融合又はエプステインバーウィルスの形質転換より調製され、所望の抗体を発現するクローンをスクリーニングする。Kofler及びMilstein, Eur. J. Immunol. 6:511 (1976)を参照のこと。モノクローナル抗体、又はFab又は(Fab)2フラグメントなどのモノクローナル抗体の抗原結合領域は、二者択一的に組換え法により生産される。
【００７５】
好適な抗体の例には、目的のタンパク質に対して既知のＲＩＡｓにおいて既に利用されているもの、例えば本明細書の冒頭に記載した参考文献に記載されているようなＶＥＧＦに対する抗体が含まれる。
【００７６】
ある実施態様では、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７７３７の下に寄託されたハイブリドーマによって産生または入手可能な抗ＶＥＧＦ抗体５Ｃ３が、任意に他の抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１と共に、使用される。本発明は、ＶＥＧＦ１−１１０に結合せず、ハイブリドーマ細胞株ＰＴＡ−７７３７によって産生されるモノクローナル抗体と同じＶＥＧＦ１１０＋エピトープに結合する抗体も提供する。ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７７３７の下に寄託されたハイブリドーマ５Ｃ３．１．１が提供される。
【００７７】
検出
【００７８】
固定化された捕獲試薬に添加される抗体は、直接標識されるか、又は過剰の一次抗体を洗い流した後、一次抗体の動物種のIgGに対して作製された標識化二次抗体の過剰なモル濃度を添加することにより間接的に検出されるであろう。後者の間接的アッセイの場合、一次抗体に対する標識化抗血清が、標識化された抗体をインサイツで生じるようにサンプルに添加される。
【００７９】
一次又は二次抗体の何れかに使用される標識は遊離のＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦの抗体への結合を干渉しない任意の検出可能な機能性を有する。適切な標識の例には、イムノアッセイにおける使用に関し既知の多くの標識であって、蛍光色素、化学発光、及び放射活性標識などの直接検出される成分、並びに、酵素など、検出されるべく反応し又は誘導体化された成分などが含まれる。このような標識の例は、放射性同位体である32P, 14C, 125I, 3H及び131I、希土類キレートなどのフルオロフォアー、又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、アンベリフェロン（umbelliferone）、例えばホタルルシフェラーゼ及びバクテリアルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）などのルシフェラーゼ、ルシフェリン、2.3-ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリフォスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース-６-ホスフェートデヒドロゲナーゼなどのサッカライドオキシダーゼ、HRPなどの色素前駆体を酸化するためにハイドロジェンペルオキシドを使用する酵素とカップルされるウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなどのヘテロサイクリックオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、又はミクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、MUGと共に用いるビオチン／ストレプトアビジン-β-ガラクトシダーゼ、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカル、及び類似物質などである。上で述べたように、蛍光定量的検出が一例である。
【００８０】
これらの標識を共有結合的にタンパク質又はポリペプチドと結合させるためには、従来の方法が利用できる。例えば、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、ビス-イミデート、ビス-ジアゾ化ベンジジン、及びその類似物質などのカップリング剤が、上述の蛍光性、化学発光性、及び酵素的な標識で抗体をタグ化するのに用いられる。例えば、米国特許３，９４０，４７５号（蛍光定量法）及び３，６４５，０９０号（酵素法）；Hunter等, Nature 144:945 (1962)；David等, Biochemistry 13:1014-1021 (1974)；Pain等, J. Immunol. Methods 40:219-230 (1981)；及びNygren J. Histochem. and Cytochem. 30:407-412 (1982)を参照のこと。一部の実施態様では、ここでの標識は、8pg/ml濃度に対する増幅性及び感度を増大させる蛍光性を有し、さらに好ましくはシグナルを増幅するためのビオチン並びにストレプトアビジン-β-ガラクトシダーゼ及びMUGである。ある実施態様では、比色標識が使用され、例えば、検出可能抗体がビオチニル化され、検出手段がアビジンまたはストレプトアビジン−ペルオキシダーゼと3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンである。
【００８１】
酵素を含むこのような標識の抗体への結合は、イムノアッセイ技術分野における当業者にとって、標準的な操作可能な方法である。例えば、O'Sullivan等, "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay", in Methods in Enzymology, ed. J.J.Langone 及びH. Van Vunakis, Vol.73 (Academic Press, New York, New York, 1981), pp147-166を参照のこと。
【００８２】
最終的な標識化抗体を添加した後、結合した抗体の量は、結合していない過剰な標識化抗体を洗浄により除去した後、標識に適した検出方法を用いて付着した標識の量を測定し、測定量を生物学的サンプル中の遊離ＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦの量を関係づけることにより決定される。例えば、酵素法の場合、発色及び測定された呈色の量は、ＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦの存在量の直接的な測定値となる。特に、HRPが標識である場合、呈色は、450nmの吸収における基質3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンを利用して検出される。
【００８３】
一例では、非標識一次抗体に対して作製された酵素標識二次抗体が固定化相から洗浄された後、呈色又は化学発光は酵素の基質と共に固定化された捕獲試薬とインキュベートすることにより発色され測定される。その後、遊離ＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦ濃度の量は、平行して行われる標準物質ＶＥＧＦによる呈色又は化学発光と比較することにより計算される。
【００８４】
キット
【００８５】
都合上、本発明のアッセイ方法はキットの形式で提供され得る。このようなキットは以下の基本的な成分を含んだ組合せで包装される：
（a）ヒトＶＥＧＦ分子に対するモノクローナル抗体で構成され、モノクローナル抗体がＶＥＧＦ１１０＋を認識する捕獲試薬；及び
（b）ＶＥＧＦのＫＤＲ及びＦＬＴ１レセプター結合ドメインと結合する検出可能抗体（標識化又は非標識化）で構成される検出試薬。これらの基本成分は上述部分にて定義されている。ある実施態様では、検出試薬はＶＥＧＦ１−１１０のエピトープに結合する検出可能抗体を含む。
【００８６】
好ましくは、キットはさらに捕獲試薬のための固体担体を含み、分離された成分として提供されるか又は既に捕獲試薬が固定化されている。それ故、キット中の捕獲抗体は固体担体上に固定化され、又はキットに含まれるか若しくはキットとは別に提供されるような担体上に固定化される。
【００８７】
好ましくは、捕獲試薬はマイクロタイタープレート上にコートされる。検出可能試薬は、直接検出される標識化抗体、又は異なる動物種で産生された非標識抗体に対する標識抗体により検出される非標識抗体である。標識が酵素である場合、通常、キットは基質と酵素に必要とされるコファクター含み、標識は検出可能な発色団を提供する色素前駆体のフルオロフォアーである。検出試薬が非標識の場合、キットはさらに、非標識抗体に対して作製された標識化抗体などの検出可能抗体に対する検出手段を含み、好ましくは蛍光定量的検出形式である。標識が酵素の場合には、通常、キットはその酵素に必要な基質および補因子を含み、標識がフルオロフォアーである場合には、検出可能な発色団を提供する色素前駆体を含み、標識がビオチンである場合には、アビジン、ストレプトアビジンまたはＨＲＰに結合したストレプトアビジンのようなアビジンまたはＭＵＧと共に用いるβガラクトシダーゼを含む。
【００８８】
特定の実施態様において、捕獲試薬はモノクローナル抗体であり、好ましくは齧歯類、より好ましくはマウスまたはラット、さらに好ましくはマウスのものであり、最も好ましくはＭＡｂ ５Ｃ３である。一部の実施態様では、検出可能抗体はビオチニル化モノクローナル抗体であり、モノクローナル抗体が齧歯類、より好ましくはマウスまたはラット、さらに好ましくはマウスのものであり、最も好ましくはＭＡｂ Ａ４．６．１である。一部の実施態様では、捕獲試薬はキットに固定化されている。
【００８９】
一部の実施態様では、キットは、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ１１０＋の種々の形態を検出するための、ここに記載する比較研究用多重ＥＬＩＳＡを含むことができる。
【００９０】
また、キットは典型的にはアッセイを実施するための説明書を含み、及び／又は抗原標準物質としてのＶＥＧＦ（例えば、精製ＶＥＧＦ、好ましくは組換体として生産されたＶＥＧＦ、およびＶＥＧＦ１１０）、並びに安定化剤などの他の添加剤、洗浄及びインキュベーションバッファー、及びこれらと同種のものを含む。
【００９１】
ＶＥＧＦに対する標準物質の例は、Genentech, Inc., South San Francisco. Californiaおよびここに記載する会社および方法から入手可能な哺乳類細胞中で生産された組換体ヒトＶＥＧＦである。
【００９２】
キットの構成成分は、アッセイの感度を実質的に最大化する試薬溶液濃度を提供するために適当に変動させた種々の試薬の相対量により、予め決定された量比で提供されるであろう。特に、試薬は、通常は凍結乾燥され、賦形剤を含み、溶解後、テストサンプルと混合するために適切な濃度を有する試薬溶液を提供する乾燥粉末として提供される。
材料の寄託
【００９３】
以下の材料を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, １０８０１ ユニバーシティ・ブルバード、マナッサス、バージニア２０１１０−２２０９米国(ＡＴＣＣ)に寄託した：
５Ｃ３．１．１は、２００６年７月１９日にＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７７３７の下に寄託した。
【表Ａ】
【００９４】
これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存培養物が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、何れが最初に来ようとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
【００９５】
本出願の譲受人は、寄託した材料の培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと速やかに取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
【００９６】
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの材料の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に変形することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【００９７】
以下に記載する実施例および実施態様は例示目的でのみ提供されるものであり、それらを踏まえた種々の変更または修正が当業者に示唆され、本出願の精神および範囲ならびに添付の請求の範囲に含まれるものと解される。ここに引用される全ての刊行物、特許および特許出願を、全ての目的のためにその全体を参考として本明細書に援用する。
【実施例】
【００９８】
実施例１
選択的RNAスプライシングにより種々のアイソフォームとして発現される血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、腫瘍血管形成に重要な役割を演じることが知られている。ＶＥＧＦ１６５および全ＶＥＧＦの濃度を測定し、ＶＥＧＦのプラスミン消化によって生じた活性フラグメントであるＶＥＧＦ１１０の相対量を評価した。ＥＬＩＳＡ Ａ（ＶＥＧＦ１６５−２０６ ＥＬＩＳＡ）は、ＶＥＧＦ１６５およびより長いアイソフォームであるがＶＥＧＦ１２１ではないものを検出する。ＥＬＩＳＡ Ｂ（ＶＥＧＦ１１０−２０６ ＥＬＩＳＡ）は、ＶＥＧＦ１６５およびアイソフォームＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１１０を検出する。ＥＬＩＳＡ Ｃ（ＶＥＧＦ１２１−２０６ ＥＬＩＳＡ）は、ＶＥＧＦ１６５およびより長いアイソフォーム、ＶＥＧＦ１２１並びにＶＥＧＦ１１０より長い分子量を有するがＶＥＧＦ１１０ではないＶＥＧＦフラグメント（ここでは“ＶＥＧＦ１１０＋”と称する）を検出する。
【００９９】
材料と方法
【０１００】
試薬と細胞：
組み換えＶＥＧＦ１６５（Genentech）、ＶＥＧＦ１２１（Pepro Tech, Rocky Hill, New Jersey）、ＶＥＧＦ８−１０９（ＶＥＧＦ１６５のアミノ酸８−１０９からなる）および切断ＶＥＧＦ１２１（R&D Systems, Minneapolis, MN）をE.coliで産生した。切断ＶＥＧＦ１２１は質量分析で完全なＮ末端を有するが、２６ｋＤａの質量を有し、製造者によるところのカルボキシ末端から約９アミノ酸の切断と一致する。これは、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した場合に、ＶＥＧＦ１１０とＶＥＧＦ１２１との間に移動する。ＶＥＧＦ１１０は、ＶＥＧＦ１６５のプラスミン消化によって調製された（Keyt BA, et al.,: The carboxyl-terminal domain (111-165) of vascular endothelial growth factor is critical for its mitogenic potency. J Biol Chem. 271 : 7788-7795 (1996)）。質量分析で測定した分子量は２５３９０であり、理論質量２５３８９と一致した。濃度はビシンコニン酸法を用いて測定した（Pierce, Rockford, IL）。ＶＥＧＦ８−１０９、ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１６５の濃度計算に使用した分子量は、それぞれ２３．８、２８．９および３８．２ＫＤａであった。モノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１、３．５Ｆ８、２Ｅ３および５Ｃ３は、マウスをＣＨＯ細胞で産生したＶＥＧＦ１６５で免疫することによって生成した（Kim KJ, et al.,: The vascular endothelial growth factor proteins: Identification of biologically relevant regions by neutralizing monoclonal antibodies. Growth Factors 7: 53-64 (1992)）。乳房細胞株ＳＫ−ＢＲ−３、ＢＴ−４７４、Ｔ−４７ＤおよびＭＣＦ−７並びに卵巣細胞株ＥＳ−２、ＯＶＣＡＲ−３およびＳＫ−ＯＶ−３（American Type Culture Collection, Rockville, MD）は、３７℃にて、加湿された５％ＣＯ２インキュベーターにおいてＲＰＭＩ、２ｍＭのＬグルタミンおよび１０％ＦＢＳ（ただしＯＶＣＡＲ−３については２０％）で生育した。
【０１０１】
Ａ６７３細胞の馴化培地におけるＶＥＧＦの精製：
Ａ６７３細胞（American Type Culture Collection）を５０：５０ Ｆ１２／ＤＭＥＭ、２ｍＭ Ｌグルタミンおよび５％ＦＢＳにおいて６０％の密集度まで生育し、次いで、無血清培地（Genentech）において密集度まで生育した。ＶＥＧＦを、ＣＮＢｒ活性化セファロース（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）を用いて調製したＡ４．６．１−セファロースカラムを用いて上清から精製した。カラム溶出液と組み換えＶＥＧＦコントロール（１レーンあたり０．２μｇ）を還元条件下で１８％トリス−グリシンゲル（Invitrogen, Carlsbad, CA）で泳動させ、ニトロセルロースにブロットした。このブロットを、３％ウシ血清アルブミンを含む０．５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ Trition100でブロックし、２００ｎｇ／ｍｌの３．５Ｆ８またはＡ４．６．１でプローブし、次いで、２ｎｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＦｃ−ＨＲＰ（Jackson ImmunoResearch）を適用した。シグナルをSuperSignal West Dura（Pierce）を用いて発現させ、Ｘ線フィルムに記録した。
【０１０２】
ＶＥＧＦ濃度を測定するためのＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ
【０１０３】
ＥＬＩＳＡ Ａ（ＶＥＧＦ１６５−２０６ＥＬＩＳＡ）。
他に言及しない限り、蛍光ＥＬＩＳＡ Ａをサンプル中のＶＥＧＦを測定するために用いた。蛍光ＥＬＩＳＡ Ａは、コート用に３．５Ｆ８を用い、検出用にビオチニル化Ａ４．６．１およびその後にストレプトアビジン−βガラクトシダーゼを用い、基質として４−メチル−ウンベリフェリル−β−D−ガラクトシドを用いた（Rodriguez CR, et al.,: A sensitive fluorometric enzyme-linked immunosorbent assay that measures vascular endothelial growth factorl65 in human plasma. J Immunol Methods 219: 45-55 (1998)）。ＶＥＧＦ１６５スタンダードは１−１２８ｐｇ／ｍＬまたは０．０２６−３．３５ｐＭであった。比色ＥＬＩＳＡ Ａは、以下のＥＬＩＳＡ Ｃに使用したプロトコールに従って、コート用に３．５Ｆ８を用い、検出用にビオチニル化Ａ４．６．１を用いた。ＶＥＧＦ１６５スタンダードは１．６−２００ｐｇ／ｍＬであった。
【０１０４】
ＥＬＩＳＡ Ｂ（ＶＥＧＦ１１０−２０６ＥＬＩＳＡ）（以前にはＶＥＧＦ１２１−２０６ＥＬＩＳＡと称されていた。Konecny GE, et al.,: Association between HER-2/neu and Vascular Endothelial Growth Factor Expression Predicts Clinical Outcome in Primary Breast Cancer Patients. Clinical Cancer Research, 10: 1706-1716 (2004)）：MaxiSorp９６ウェルマイクロウェルプレートを、５０ｍMの炭酸塩バッファーｐH９．６中の０．５μｇ／ｍｌの抗体Ａ４．６．１を用いて、４℃で一晩、１００μｌ／ウェルでコートした。このステップの後と、その後の０．０５％のポリソルバート２０を含有するｐＨ７．４のＰＢＳを用いた室温インキュベーションステップの間において、プレートを洗浄した。プレートを、ＰＢＳ（１５０μｌ／ウェル）中の０．５％ウシ血清アルブミン、１０ｐｐｍのProclinTM300(Supelco, Belleconte, PA)を用いて１時間かけてブロックした。０．５％のウシ血清アルブミン、０．０５％のポリソルバート２０、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．２５％のＣＨＡＰＳ、０．２％のウシγグロブリン（Sigma, St. Louis, MO）および０．３５ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）（サンプルバッファー）中の二重または三重の連続希釈法におけるＶＥＧＦスタンダード（二重の連続希釈法において１．５６−２００ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５または０．０４０９−５．２４ｐＭのＶＥＧＦ）および連続希釈サンプル（最小１：１０希釈）をプレートに加え（１００μｌ／ウェル）、２時間インキュベートした。結合したＶＥＧＦをプレート上で１時間にわたってビオチニル化２Ｅ３（またはＶＥＧＦのレセプター結合ドメインに結合する別の抗体）、その後ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Amersham, Copenhagen, Denmark）で３０分間、ビオチニル−チラミド(tyramide)（ELAST ELISA amplification SYstem, Perkin Elmer Life Sciences Inc., MA）で１５分間、およびストレプトアビジン−ＨＲＰで３０分間インキュベートすることにより検出した。基質ＴＭＢ（3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン）（Kirkegaard & Perry Laboratories）を添加し、１Ｍのリン酸を加えることにより反応を停止させた。吸収をTitertekスタッカーリーダー（ICN, Costa Mesa, CA）で４５０ｎｍで読み取った。滴定曲線を、４パラメーター回帰曲線フィッティングプログラム（KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA）を用いて適合させた。標準曲線の範囲に入るデータ点を、そのサンプルにおける推定ＶＥＧＦ濃度を算出するために用いた。１０％ヒトＥＤＴＡ血漿（Golden West Biologicals Inc., Temecula, CA）中の１．５６−２００ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５の回収は、この研究に用いた１０％血漿における推定２．１ｐｇ／ｍｌの内因性ＶＥＧＦを差し引きした後で９２−１２０％であった。
【０１０５】
ＥＬＩＳＡ Ｃ（ＶＥＧＦ１２１−２０６ＥＬＩＳＡ）：
マイクロウェルプレートを、１μｇ／ｍｌの抗ＶＥＧＦ ５Ｃ３抗体を用いてコートし、上述の通りブロックした。ＶＥＧＦスタンダード（二重の連続希釈法において４．００−５１２ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５または０．１０５−１３．４ｐＭのＶＥＧＦ）およびサンプルバッファー中の連続希釈サンプルをプレートに加えた。これらのプレートを２時間インキュベートした。結合したＶＥＧＦを、ビオチニル化Ａ４．６．１を加え、次いでストレプトアビジン−ＨＲＰおよび基質としてのＴＭＢを加えて検出した。上記の通り、プレートを読み取り、データを解析した。１０％血漿中の４．００−５１２ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５の回収は、この研究に用いた１０％血漿における推定１．６ｐｇ／ｍｌの内因性ＶＥＧＦを差し引きした後で７７−１０１％であった。
【０１０６】
結果と考察
【０１０７】
ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ：
上記のＥＬＩＳＡ Ａはコート用に３．５Ｆ８を用い、検出用にビオチニル化Ａ４．６．１を用いている（Rodriguez CR, et al.,: A sensitive fluorometric enzyme-linked immunosorbent assay that measures vascular endothelial growth factor 165 in human plasma. J Immunol Methods 219: 45-55, 1998）。これは、ＶＥＧＦ１６５（ＶＥＧＦ１６５）を検出するが、R&D Systemsから入手できカルボキシ末端から約９アミノ酸を欠いているＶＥＧＦ１２１（１）（ＶＥＧＦ１２１（１））およびPeproTechから入手できるＶＥＧＦ１２１（２）（ＶＥＧＦ１２１（２））を検出しない（図１Ａ）。３．５Ｆ８はＶＥＧＦ１６５に結合するが、BIAcoreのＶＥＧＦ１２１には結合しない。Ａ４．６．１は、全てのアイソフォームおよびＶＥＧＦ１１０に存在するレセプター結合ドメイン（Kim KJ, et al.,: The vascular endothelial growth factor proteins: Identification of biologically relevant regions by neutralizing monoclonal antibodies . Growth Factors 7: 53-64, 1992）に結合する。３．５Ｆ８は、恐らく、ＶＥＧＦ１２１に存在しないアミノ酸１１６および１１８の近傍に結合する。５Ｃ３は、恐らく、ＶＥＧＦ１１０に存在しないアミノ酸１１１−１１３の近傍に結合する（図３）。ＥＬＩＳＡ Ａは、恐らくＶＥＧＦ１８３、ＶＥＧＦ１８９およびＶＥＧＦ２０６を含むＶＥＧＦ１６５配列を含むＶＥＧＦアイソフォームを検出することができる（Stimpfl M, et al.,: Vascular Endothelial growth factor splice variants and their prognostic value in breast and ovarian cancer. Clinical Cancer Research 8: 2253-2259, 2002を参照）。ＥＬＩＳＡ Ｂ（以前にはＶＥＧＦ１２１−２０６ＥＬＩＳＡと称されていた。Konecny GE, et al.,: Association between HER-2/neu and Vascular Endothelial Growth Factor Expression Predicts Clinical Outcome in Primary Breast Cancer Patients. Clinical Cancer Research, 10: 1706-1716 (2004)）はコート用にＡ４．６．１を用い、検出用にビオチニル化２Ｅ３を用いる。Ａ４．６．１および２Ｅ３は、３つ全ての分子に存在するレセプター結合ドメインに結合する。例えば、Kim KJ, et al. The vascular endothelial growth factor proteins: Identification of biologically relevant regions by neutralizing monoclonal antibodies. Growth Factors 7:53-64 (1992); およびMuller YA, et al. Vascular endothelial growth factor: Crystal structure and functional mapping of the kinase domain receptor binding site. Proc Natl Acad Sci USA 94:7192-7197 (1997)を参照。これらの領域に結合する他の抗体も使用することができる。このＥＬＩＳＡは、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１２１、切断されたＶＥＧＦ１２１（カルボキシ末端から約９アミノ酸を欠失）、ＶＥＧＦ１１０およびＶＥＧＦ８−１０９を同等に十分に検出する（図１Ｂ）。このＥＬＩＳＡは、マトリクス・メタロプロテイナーゼ消化により生じたＶＥＧＦ１１０よりも大きいフラグメントを含む全ＶＥＧＦを検出することができる。ここに記述するＥＬＩＳＡ Ｃは、コート用に５Ｃ３を用い、検出用にビオチニル化Ａ４．６．１を用い、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１２１、および切断されたＶＥＧＦ１２１を同等に十分に検出するが、ＶＥＧＦ１１０またはＶＥＧＦ８−１０９を検出しない（図１Ｃ）。５Ｃ３はＶＥＧＦ１２１に結合するが、BIAcoreによるＶＥＧＦ８−１０９には結合しない。このＥＬＩＳＡは、ＶＥＧＦ１１０およびより小さいフラグメントを除いて、ＶＥＧＦ１１０−２０６によって検出された全てのＶＥＧＦ分子を検出することができる。
【０１０８】
ＥＬＩＳＡ Ａ、ＥＬＩＳＡ Ｂ、およびＥＬＩＳＡ Ｃの感度は、最小で１：１０希釈を用いて、サンプル中のＶＥＧＦについてそれぞれ１０、１６および４０ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５（または種々のＶＥＧＦアイソフォームおよびフラグメントについて０．２６、０．４１および１．０５ｐＭ）であった。ＥＬＩＳＡ ＢおよびＥＬＩＳＡ Ｃは再現性があった（表１および２）。ＥＬＩＳＡ ＢおよびＥＬＩＳＡ Ｃは、ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ−Ａ）に特異的であった。５０ｎｇ／ｍｌまでの濃度のＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄはバックグラウンドシグナルを与えるだけであった。インスリン様成長因子Ｉ、成長ホルモン、組み換え神経成長因子、腫瘍壊死因子（Genentech）、血小板由来増殖因子ＡＢ、胎盤成長因子、形質転換成長因子β１（R&D Systems）（２００ｎｇ／ｍｌまで）はバックグラウンドシグナルを与えるだけであった。ヘパリン（Leo Laboratories, Bucks, UK and Dublin, Ireland）（１００Ｕ／ｍｌまで）はこのアッセイにおいて意味のある効果を有していなかった。
【０１０９】
表１。ＥＬＩＳＡ Ｂ（ＶＥＧＦ１１０−２０６ ＥＬＩＳＡ）：標準のレンジはバッファー中に１．５６−２００ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５（０．０４０９−５．２４ｐＭのＶＥＧＦ）であった。ブランクと比較した１．５６ｐｇ／ｍｌのスタンダードのＯＤ比は１．３７±０．１１であった。ＣＶは変動係数である。
【表１】
ａ中および高コントロールは、ヒトＥＤＴＡ血漿に組み換えＶＥＧＦ１６５を添加することにより調製した。血漿が内因性ＶＥＧＦを含んでいたことから、低コントロールは、７０％血漿中にＶＥＧＦ１６５を添加することにより調製した。コントロールを１：１０で希釈し、３４の独立したアッセイにおいて二重に分析した。
【０１１０】
表２。ＥＬＩＳＡ Ｃ（ＶＥＧＦ１２１−２０６ ＥＬＩＳＡ）。標準のレンジは４．００−５１２ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５（０．１０５−１３．４ｐＭのＶＥＧＦ）であった。ブランクと比較した４ｐｇ／ｍｌのスタンダードのＯＤ比は２．７２±０．３７であった。ＣＶは変動係数である。
【表２】
ａコントロールは、ヒトＥＤＴＡ血漿に組み換えＶＥＧＦ１６５を添加することにより調製した。これらを１：１０で希釈し、１５の独立したアッセイにおいて二重に分析した。
【０１１１】
細胞株の馴化培地中のＶＥＧＦ：
ＶＥＧＦ１６５ ｃＤＮＡ（Mengら,2000）でトランスフェクトした６つの安定なＣＨＯクローンの馴化培地を、標準としてE.coliで産生された非グリコシル化ＶＥＧＦを使用する３種のＥＬＩＳＡで測定した。６つの安定なＣＨＯクローンの馴化培地中のグリコシル化組み換えＶＥＧＦ１６５は、３つのＥＬＩＳＡで非常に類似した濃度を示した。ＥＬＩＳＡ Ｂで測定した濃度は、それぞれ、２８、６３、６４、４３、３．８および３．２ｎＭであった。ＥＬＩＳＡ Ｂで測定されたＶＥＧＦ濃度と比較したＥＬＩＳＡ ＡおよびＥＬＩＳＡ Ｃで測定されたＶＥＧＦ濃度の比率は、それぞれ０．９０±０．０８および１．０８±０．１０であった。それゆえ、３つのＥＬＩＳＡはグリコシル化ＶＥＧＦを同じように良好に定量し、培養条件下でＶＥＧＦ１６５のタンパク質分解は殆ど無かった。
【０１１２】
ＥＬＩＳＡ Ａ、ＥＬＩＳＡ ＢおよびＥＬＩＳＡ Ｃで測定したＡ６７３細胞馴化培地中のＶＥＧＦ濃度は、それぞれ０．１５、０．２９および０．２４ｎＭであった。ＥＬＩＳＡ Ａで測定した濃度はより低く、ＶＥＧＦ１２１が存在することを示唆していた。ＶＥＧＦをＡ４．６．１アフィニティーカラムを用いて馴化培地から精製し、蛋白ブロッティングで分析すると、グリコシル化および非グリコシル化ＶＥＧＦ１６５と思われる二つのバンドが３．５Ｆ８によって検出された。下方のバンドはE.coliで産生されたＶＥＧＦ１６５と同じ移動度であった（図２左）。Ｎ−グリカナーゼ処理により上方のバンドは下方のバンドに転換された。グリコシル化（推定される非グリコシル化ＶＥＧＦ１６５バンドと部分的に重複する）および非グリコシル化ＶＥＧＦ１２１と思われる二つのさらなる低分子量バンドがＡ４．６．１によって検出された（図２右）。下方のバンドはE.coliで産生された精製ＶＥＧＦ１２１と同じ移動度であり、Ｎ−グリカナーゼ処理により上方のバンドは下方のバンドに転換された。
【０１１３】
ＥＬＩＳＡ Ｂで測定した乳房細胞株ＳＫ−ＢＲ−３、ＢＴ−４７４、Ｔ−４７ＤおよびＭＣＦ−７由来の馴化培地におけるＶＥＧＦ濃度は、それぞれ３．６、１６、１３および１３ｐＭであった。ＥＬＩＳＡ Ｂで測定したＶＥＧＦ濃度に対するＥＬＩＳＡ Ａで測定したＶＥＧＦ濃度の比率はそれぞれ０．４９、０．４２、０．４３および０．３８（すなわち、４９％、４２％、４３％または３８％）であり、これらの各細胞株におけるＶＥＧＦ１６５の発現である４３、３５、４０および４１％（Stimpfl M, et al.,: Vascular Endothelial growth factor splice variants and their prognostic value in breast and ovarian cancer. Clinical Cancer Research 8: 2253-2259, 2002）と一致していた。ＥＬＩＳＡ Ｂで測定したＶＥＧＦ濃度に対するＥＬＩＳＡ Ｃで測定したＶＥＧＦ濃度の比率はこれらの細胞株で１．１−１．２であり、ＶＥＧＦ１１０が殆ど存在しないことを示している。ＥＬＩＳＡ Ｂで測定した卵巣細胞株ＥＳ−２、ＯＶＣＡＲ−３およびＳＫ−ＯＶ−３由来の馴化培地におけるＶＥＧＦ濃度は、それぞれ３２、１１および２０ｐＭであった。ＥＬＩＳＡ Ｂで測定したＶＥＧＦ濃度に対するＥＬＩＳＡ Ａで測定したＶＥＧＦ濃度の比率は、それぞれ０．２４、０．２０および０．３２（すなわち、２４％、２０％および３２％）であり、これらの各細胞株におけるＶＥＧＦ１６５の発現が３８、４２および２４％（Stimpfl et al.,上掲）であることと対比される。ＥＬＩＳＡ Ｂで測定したＶＥＧＦ濃度に対するＥＬＩＳＡ Ｃで測定したＶＥＧＦ濃度の比率はこれらの細胞株で０．６４−０．７９であり、ＶＥＧＦ１１０（またはそれよりも小さいフラグメント）が存在するかもしれないことを示している。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年１０月４日に出願された米国仮出願第６０／８２８２０３号の優先権とその利益を享受するものであり、その明細書の全てをここに含める。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、癌、心血管、その他の病変を有する患者の診断および予後の方法として使用可能な、ＶＥＧＦの一部の集団を検出するためのイムノアッセイに関する。
【０００３】
血管形成が種々の疾患の発病機序に関与していることは、もはや確立されている。これらは、固形腫瘍、増殖網膜症または加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）のような眼球内新生血管症候群、関節リウマチ、および乾癬を含む（Folkman et al. J. Biol. Chem. 267:10931-10934 (1992); Klagsbrun et al. Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991); およびGarner A, Vascular diseases. In: Pathobiology of ocular disease. A dynamic approach. Garner A, Klintworth GK, Eds. 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710）。固形腫瘍の場合、新血管形成により、通常細胞と比べて、腫瘍細胞に生育優位性および増殖自律性を獲得させる。かくして、腫瘍部位における微小血管の密度と、乳癌および他の一部の腫瘍における患者生存率との間には関連性が認められる（Weidner et al. N Engl J Med 324:1-6 (1991); Horak et al. Lancet 340: 1120-1124 (1992); およびMacchiarini et al. Lancet 340: 145-146 (1992)）。
【０００４】
血管形成の正の調節因子に関する調査は、例えばａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ-α、ＴＧＦ-β、ＨＧＦ、ＴＮＦ-α、アンギオジェニン、ＩＬ-８等を含む多くの候補をもたらした（Folkman et al., supra, and Klagsbrun et al., 上掲）。これまでに同定されている負の調節因子の一部は、トロンボスポンジン（Good et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:6624-6628 (1990)）、プロラクチンの１６キロダルトンＮ末端フラグメント（Clapp et al. Endocrinology, 133: 1292-1299 (1993)）、アンギオスタチン（O'Reilly et al. CeU 79:315-328 (1994)）およびエンドスタチン（O'Reilly et al. Cell 88:277-285 (1996)）を含む。
【０００５】
ここ数年にわたる研究により、正常および異常な血管形成の調節における血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の重要な役割が確立されてきた（Ferrara et al. Endocr. Rev. 18:4-25 (1997)）。単一のＶＥＧＦ対立遺伝子の欠損が胚性致死性を生じるとの知見は、血管系の発達および分化において、このファクターが欠くことのできない役割を演じることを示唆するものである（Ferrara et al., 上掲）。
【０００６】
さらに、ＶＥＧＦは、腫瘍および眼内疾患に関与する新血管形成の重要なメディエーターであることが示された（Ferrara et al., 上掲）。ＶＥＧＦのｍＲＮＡは、調べた多くのヒト腫瘍で過剰発現されている（Berkman et al. J Clin Invest 91 :153-159 (1993); Brown et al. Human Pathol. 26:86-91 (1995); Brown et al. Cancer Res. 53:4727-4735 (1993); Mattern et al. Brit. J. Cancer. 73:931-934 (1996); および Dvorak et al. Am J. Pathol. 146:1029-1039 (1995)）。また、眼球液体中のＶＥＧＦ濃度は、糖尿病患者および他の虚血性網膜症患者における血管の活発な増殖の存在とも密接に関連している（Aiello et al. N. Engl. J. Med. 331 : 1480-1487 (1994)）。さらに、急性黄斑変性（ＡＭＤ）を患っている患者の脈絡膜新生血管膜におけるＶＥＧＦの局在が示されている（Lopez et al. Invest. Qphtalmo. Vis. Sci. 37:855-868 (1996)）。
【０００７】
ＶＥＧＦは組織毎に製造され、循環系に進入してその生物学的効果を及ぼす必要はないが、むしろパラクリン調節因子として局所的に作用する。Yang et al. J. Pharm. Exp. Ther. 284: 103 (1998)による最近の研究では、循環系からのｒｈＶＥＧＦ１６５のクリアランスが非常に早いことが見出されており、循環系の内因性ＶＥＧＦはＶＥＧＦの連続的合成の結果であることが示唆されている。さらに、循環ＶＥＧＦレベルと全身腫瘍組織量との関連を示す試みがなされ、ＶＥＧＦレベルが可能性のある予後マーカーであることを示唆している（Ferrari and Scagliotti Eur. J. Cancer 32A:2368 (1996); Gasparini et al. J1 Natl. Cancer Inst. 89: 139 (1997); Kohn Cancer 80:2219 (1997); Baccala et al. Urology 51 :327 (1998); Fujisaki et al. Am. J. Gastroenterol. 93:249 (1998)）。正確にＶＥＧＦを測定する能力は、血管開通、月経周期、虚血、糖尿病、癌、眼内疾患等の多くの生物学的プロセスにおけるその潜在的役割を理解する上で重要である。
【０００８】
検出不可なレベルから高レベルまで、正常者および患者における内因性ＶＥＧＦの濃度は広範囲にわたって相違することが報告されている。内因性ＶＥＧＦレベルを測定する能力は、敏感で特異的なアッセイの能力に依存する。ＶＥＧＦのための比色分析、化学発光、および蛍光分析をベースとする酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が報告されている（Houck et al., 上掲, (1992); Yeo et al. Clin. Chem. 38:71 (1992); Kondo et al. Biochim. Biophys. Acta 1221 :211 (1994); Baker et al. Obstet. Gynecol. 86:815 (1995); Hanatani et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:1958 (1995); Leith and Michelson Cell Prolif. 28:415 (1995); Shifren et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 81:3112 (1996); Takano et al. Cancer Res. 56:2185 (1996); Toi et al. Cancer 77:1101 (1996); Brekken et al. Cancer Res. 58:1952 (1998); Obermair et al. Br. J. Cancer 77: 1870-1874 (1998); Webb et al. Clin. Sci. 94:395-404 (1998)）。
【０００９】
例えば、Houckら(1992、上掲)は、内因性ＶＥＧＦレベルを検出するには十分な感度ではないかもしれないｎｇ／ｍｌの感度を有する比色ＥＬＩＳＡについて記述している。Yeoら(1992、上掲)は、２サイト時間分解蛍光免疫測定法について記述しているが、ＶＥＧＦは正常血清中には検出されていない（Yeo et al. Cancer Res. 53:2912(1993)）。Bakerら(1995、上掲)は、この蛍光免疫測定法の修正版を用いて、妊婦の血漿中における検出可能なＶＥＧＦのレベルについて報告しており、子癇前症の女性でより高レベルであることを報告している。妊婦における同様のデータが、ラジオイムノアッセイを使用したAnthony et al. Ann. Clin. Biochem. 34:276 (1997)によって報告されている。Hanataniら(1995、上掲)は、循環するＶＥＧＦを測定することが可能な化学発光ＥＬＩＳＡを開発し、３０人の正常な個人（男女）の血清において、８−３６ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦレベルを報告している。Brekkenら(1998、上掲)は、ＶＥＧＦ単独またはＶＥＧＦ：Ｆｌｋ-１複合体に結合親和性を有する抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイについて記載している。
【００１０】
ＶＥＧＦ検出のためのＥＬＩＳＡキットは、R&D Systems(Minneapolis, MN)から商業的に入手可能である。R&D VEGF ELISAキットはサンドイッチアッセイに使用されており、モノクローナル抗体が標的ＶＥＧＦ抗原を捕獲するために使用され、ポリクローナル抗体がＶＥＧＦを検出するために使用される。Webb et al. 上掲 (1998). See, also, e.g., Obermair et ah, 上掲 (1998)。
【００１１】
Keyt et al. J. Biol. Chem. 271 :7788-7795 (1996); Keyt et al. J. Biol. Chem. 271 :5638 (1996); およびShifren et al., 上掲 (1996)も、二重モノクローナル抗体対に基づく比色ＥＬＩＳＡを開発した。このＥＬＩＳＡは癌患者において高いＶＥＧＦレベルを検出することができたが、正常な個体におけるＶＥＧＦの内因性レベルを測定するのに必要な感度には欠けている。Rodriguez et al. J. Immunol. Methods 219:45 (1998) は、純粋な血漿または血清において１０ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦ感度をもたらす２サイト蛍光分析ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡについて記述している。しかしながら、この蛍光分析アッセイは、ＶＥＧＦの十分に完全な１６５／１６５種および１６５／１１０種を検出する（ＶＥＧＦ１６５／１６５はタンパク質分解によって３つの別の形態、すなわち１６５／１１０ヘテロダイマー、１１０／１１０ホモダイマー、および５５アミノ酸Ｃ末端フラグメントに切断され得ることが報告されている（Keyt et al. J. Biol. Chem. 271 :7788-7795 (1996); Keck et al. Arch. Biochem. Biophvs. 344: 103-113 (1997))）。
【００１２】
かくして、現存するＥＬＩＳＡよりも動物モデルまたは患者の生物学的サンプルにおけるＶＥＧＦのより高度な測定可能レベルを検出し、かつ／またはＶＥＧＦの種々のアイソフォームを測定可能な診断および予後アッセイを開発する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ferrara et al. Endocr. Rev. 18:4-25 (1997)
【発明の概要】
【００１４】
生物学的サンプルにおけるＶＥＧＦ型を検出するための、ＶＥＧＦを抗原とする抗体−サンドイッチＥＬＩＳＡ法を開発した。ここに提供するＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡは、ＶＥＧＦアイソフォームおよび１１０より大きいＶＥＧＦのフラグメント（“ＶＥＧＦ１１０＋”）を検出することが可能である。また、そのためのキットも提供する。
例えば、生物学的サンプルにおける、１１０アミノ酸より大きい選択的血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）型（“ＶＥＧＦ１１０＋”）を検出する方法は、以下の工程：
（ａ）生物学的サンプルを固形支持体に固定された捕獲試薬と接触させてインキュベートする工程であって、ここで前記捕獲試薬がヒトＶＥＧＦに対する抗体５Ｃ３と同じエピトープを認識し、前記モノクローナル抗体がヒトＶＥＧＦの１１０より大きい残基に特異的に結合する、工程；
（ｂ）固定された捕獲試薬から生物学的サンプルを分離する工程；
（ｃ）固定された捕獲試薬−標的分子複合体を、ＶＥＧＦのＫＤＲおよび／またはＦＬＴ１レセプター結合ドメインに結合する検出可能抗体と接触させる工程；および
（ｄ）検出可能抗体のための検出手段を用いて捕獲試薬に結合したＶＥＧＦ１１０＋のレベルを測定する工程
を含む。ある実施態様では、検出可能抗体が、ＶＥＧＦ１−１１０中のエピトープに結合する。ある実施態様では、異なるタイプのＶＥＧＦを検出するために、対比ＥＬＩＳＡを実施することができる。ある実施態様では、生物学的サンプル（例えば、腫瘍サンプルまたは腫瘍溶解物、血漿、血清、または尿など）が被験者から単離される。
【００１５】
ある実施態様において、捕獲試薬は５Ｃ３モノクローナル抗体である。ある実施態様において、固定された捕獲試薬がマイクロタイタープレート上にコートされる。ある実施態様において、検出可能抗体がモノクローナル抗体である。ある実施態様において、検出可能抗体がマウスモノクローナル抗体である。ある実施態様において、固定化されたモノクローナル抗体がＭＡｂ ５Ｃ３であり、かつ、検出可能抗体がＭＡｂ Ａ４．６．１である。ある実施態様では、検出可能抗体が直接的に検出可能である。ある実施態様においては、検出可能抗体が比色試薬によって増幅される。ある実施態様では、検出可能抗体がビオチン化され、検出手段がアビジンまたはストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよび３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンである。
【００１６】
本発明のある実施態様においては、被験者が血管の、糖尿病の、または癌の患者であり、測定工程（ｄ）が正常な個体と比べたＶＥＧＦレベルを調べるために標準曲線と比較することをさらに含む。
【００１７】
キットも提供される。例えば、生物学的サンプル中の１１０アミノ酸より大きい血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）型（ＶＥＧＦ１１０＋）を検出するためのイムノアッセイキットは、
（ａ）捕獲試薬として、ヒトＶＥＧＦに対する抗体、ここで前記モノクローナル抗体がヒトＶＥＧＦの１１０より大きい残基に特異的に結合する；および
（ｂ）検出試薬として、ＶＥＧＦのＫＤＲおよび／またはＦＬＴ１レセプター結合ドメインに結合する検出可能抗体
を含むことができる。ある実施態様においては、検出可能抗体はＶＥＧＦ１−１１０中のエピトープに結合する。ある実施態様では、キットが捕獲試薬用の固形支持体をさらに含む。例えば、捕獲試薬は固形支持体（例えばマイクロタイタープレート）上に固定され得る。ある実施態様では、検出可能抗体の検出手段（例えば比色手段、蛍光手段など）をさらに含む。ある実施態様では、キットは抗原標準として精製されたＶＥＧＦをさらに含む。本発明のある実施態様においては、一以上の追加的なＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡを、ＶＥＧＦ１１０＋ＥＬＩＳＡとの対比研究のために行うことができる。ある実施態様においては、キットは、マウスモノクローナル抗体ＭＡｂ ５Ｃ３である捕獲試薬モノクローナル抗体、およびＭＡｂ Ａ４．６．１である検出可能抗体を含む。
【００１８】
さらに別の実施態様においては、本発明は抗ＶＥＧＦ抗体５Ｃ３を提供する（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７７３７の下に寄託されているハイブリドーマから入手可能または産生される）。また本発明は、ＶＥＧＦ１−１１０に結合せず、ハイブリドーマ細胞株ＰＴＡ−７７３７によって産生されるモノクローナル抗体と同一のＶＥＧＦ１１０＋エピトープに結合する抗体を提供する。ある実施態様においては、本発明の抗体は検出可能な標識に接合されている。ある実施態様では、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７７３７の下に寄託されているハイブリドーマ５Ｃ３．１．１が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１のパネルＡ、ＢおよびＣは、組み換えＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１２１（１）（製造元であるＲ＆Ｄシステムによるとカルボキシ末端から約９アミノ酸を欠失している切断物）、ＶＥＧＦ１２１（２）（Pepro Techから入手）、ＶＥＧＦ１１０（ＶＥＧＦのプラスミン消化により生成されたＮ末端フラグメント）、およびＶＥＧＦ８−１０９（ＶＥＧＦ１６５のアミノ酸８−１０９を有する人工ＶＥＧＦ）分子の、種々のＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡによる検出を示す。（Ａ）コート用に３．５Ｆ８を用い、検出用にビオチニル化Ａ４．６．１を用いたＥＬＩＳＡ Ａ。（Ｂ）コート用にＡ４．６．１を用い、検出用にビオチニル化２Ｅ３を用いたＥＬＩＳＡ Ｂ。（Ｃ）コート用に５Ｃ３を用い、検出用にビオチニル化Ａ４．６．１を用いたＥＬＩＳＡ Ｃ。
【００２０】
【図２】図２は、プロービングに３．５Ｆ８（左）またはＡ４．６．１（右）を用いた、Ａ６７３細胞により産生されたＶＥＧＦのタンパク質ブロッティングを示す。サンプルは、Ａ４．６．１アフィニティーカラムを用いてＡ６７３細胞のならし培地から精製したＶＥＧＦ（レーン１）、およびE.coliにより産生された組み換えＶＥＧＦタンパク質ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１２１（製造元であるＲ＆Ｄシステムによるとカルボキシ末端から約９アミノ酸を欠失）およびＶＥＧＦ８−１０９（それぞれレーン２、３および４）である。
【００２１】
【図３】図３は、３つのＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡで使用した抗体の推定される結合部位を示すＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１１０（ＶＥＧＦのプラスミン消化によって生成するＮ末端フラグメント）の略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明を詳細に説明する前に、本発明が特定の組成物または生物学的システムに限定されず、当然に変更可能であることを理解すべきである。また、ここで用いる用語が、特定の実施態様のみを記述するためのものであり、限定を意図していないことも理解すべきである。本明細書および請求の範囲で用いるように、単数形“a”、“an”および“the”は、その内容が明示しない限り、複数の指示対象を含む。かくして、例えば、“a molecule”は、任意に二以上の分子の組合せ等を含む。
【００２３】
ここで使用する用語“ＶＥＧＦ”は、Leung et al. Science 246:1306 (1989), Houck et al. MoL Endocrin. 5: 1806 (1991), およびNeufeld et al., 上掲に記載されているように１６５-アミノ酸血管内皮細胞増殖因子、および関連する１２１-、１４５-、１８９-および２０６-アミノ酸血管内皮細胞増殖因子、並びに、これらの増殖因子の天然に発生するアレルおよび被処理形態を指す。また、例えば、米国特許第６０５７４２８号の図１ＡおよびＢも参照のこと。活性ＶＥＧＦフラグメントは、最初の１１０アミノ酸を生じるプラスミン切断によりＥＣＭ結合ＶＥＧＦから放出され得る（例えば、Keyt BA, et al.,: The carboxyl-terminal domain (111-165) of vascular endothelial growth factor is critical for its mitogenic potency. J Biol Chem. 271 : 7788-7795 (1996)を参照）。ここで使用する“ＶＥＧＦ１１０＋”は、（Ｎ末端から）１１０アミノ酸より大きいＶＥＧＦフラグメントを指すが、最初の１１０アミノ酸またはより小さいフラグメントを含まない（例えばＶＥＧＦ８−１０９）。
【００２４】
用語“検出”は、標的分子の定性的測定および定量的測定の両方を含む最も広い意味で使用される。ある態様において、ここに記載する検出方法は、生物学的サンプルにおけるＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦの僅かな存在を同定するために使用される。別の態様では、この方法は、サンプルにおけるＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦが検出可能なレベルであるかどうか調べるために用いられる。さらに別の態様では、この方法は、サンプルにおけるＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦを定量するため、さらには、異なるサンプルのＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦレベルを比較するために使用され得る。
【００２５】
“生物学的サンプル”という用語は、あらゆる動物、しかし好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの身体のサンプルを指す。ある実施態様では、かかる生物学的サンプルは、血管の、糖尿病の、または癌の患者に由来する。かかるサンプルは、血清、血漿、硝子体液、リンパ液、滑液、卵胞液、精液、羊水、乳汁、全血、尿、脳脊髄液、唾液、痰、涙、汗、粘液、腫瘍溶解物および組織培養液のような生物学的体液、並びに、ホモジナイズした組織、腫瘍組織のような組織抽出物および細胞抽出物を含む。ある実施態様では、サンプルは、あらゆる動物に由来する身体サンプルであり、ある実施態様では、哺乳動物に由来し、ある実施態様では、ヒトに由来する。ある実施態様において、かかる生物学的サンプルは、臨床患者に由来する。
【００２６】
用語“検出可能抗体”は、検出手段により増幅された標識を介して直接的に、あるいは、例えば標識された別の抗体を介して間接的に、検出され得る抗体を指す。直接標識のために、典型的には、抗体は、ある手段によって検出可能な分子に接合されている。
【００２７】
用語“検出手段”は、ここではＥＬＩＳＡにおいて検出可能抗体の存在を検出するために使用される分子または技術を指し、マイクロタイタープレートに捕獲された標識のような固定化された標識を増幅する検出剤を含む。ある実施態様では、検出手段はアビジンまたはストレプトアビジン-ＨＲＰのような比色検出剤である。
【００２８】
用語“捕獲試薬”は、サンプル中の標的分子に結合して捕獲することができる試薬を指し、かくして適切な条件下において捕獲試薬−標的分子複合体がサンプルから分離され得る。典型的には、捕獲試薬は固定化されているか、または固定化され得る。サンドイッチイムノアッセイでは、捕獲試薬が、好ましくは標的抗原に対する一種の抗体または種々の抗体の混合物である。
【００２９】
ここで使用する用語“抗体”は最も広い意味において用いられ、特に、完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも二つの完全な抗体から形成された多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、ならびに所望の生物学的活性を示す限り抗体フラグメントにわたる。
【００３０】
“抗体フラグメント”は、完全な抗体の一部、好ましくは、その抗原結合領域または可変領域を含有する一部を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ジアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）；線状抗体；単鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される複数特異性抗体が挙げられる。
【００３１】
ここでの目的では、“完全な抗体”とは、重鎖-および軽鎖可変ドメインおよびＦｃ領域を含む抗体である。
【００３２】
“ネイティブな抗体”は、通常約１５０，０００ダルトンのヘテロ４量体糖タンパク質であり、２つの同一な軽（Ｌ）鎖および２つの同一な重（Ｈ）鎖から構成される。各軽鎖は、１つの共有結合のジスルフィド結合によって重鎖に連結され、一方、ジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変化する。各重鎖および軽鎖もまた、一様に間隔をあけた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、後に、多数の定常ドメインが続く可変ドメイン（ＶＨ）を一端に有する。各軽鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＬ）を、そして他方の端に定常ドメインを有し；この軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列され、そして軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列される。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられている。
【００３３】
ここで用いる用語“モノクローナル抗体”とは、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわちこの集団を含む個々の抗体が、少量で存在し得る天然に存在する可能性のある変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原性部位に対して指向し、高度に特異的である。さらに、典型的に、異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を含む、慣用的な（ポリクローナル）抗体調製物と対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリンによって汚染されていない点で有利である。この修飾語句“モノクローナル”は、実質的に均質な抗体の集団から得られるような抗体の特徴を示し、そして任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または組換えＤＮＡ法によって作製され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。“モノクローナル抗体”はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される技術を使用するファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
【００３４】
本明細書中におけるモノクローナル抗体は、特に、“キメラ”抗体（免疫グロブリン）を含む。キメラの抗体において、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるか、あるいは相同であるが、残りの鎖は、別の種に由来するか、または別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにこれらが所望される生物学的活性を示す限りは、このような抗体のフラグメントにおける対応する配列と同一であるか、あるいは相同である（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書中において関心の向けられるキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザルまたはカニクイザルのような旧世界ザル）由来の可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列（米国特許第５６９３７８０号）を含む“霊長類化”抗体を含む。
【００３５】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の“ヒト化”形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、ヒト免疫グロブリンにおいて、レシピエントの超可変領域残基は、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）（例えば、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類）由来の超可変領域残基により置換される。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒトの残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体において見出されない残基を含有し得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに洗練するためになされる。一般的には、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、可変ドメインにおいて、全てまたは実質的に全ての超可変領域は、非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に対応し、そして全てまたは実質的に全てのＦＲは、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体はまた、必要に応じて、少なくとも一部の免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域を含む。さらに詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525(1986); Reichmann et al., Nature 332:323-329(1988); およびPresta、Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)を参照のこと。ある実施態様において、ヒト化５Ｃ３抗体が、ここに記載された方法で提供および使用される。
【００３６】
用語“可変”とは、可変ドメインの特定の部分が、抗体間の配列において広範囲にわたって異なる事実をいい、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性において使用される。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均一に分布するわけではない。これは、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方において、超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブの重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、４つのＦＲを含み、βシート形態を概ね帯び、３つの超可変領域によって連結され、βシート構造と連結するループを形成し、ある場合には、βシート構造の一部を形成する。各鎖における超可変領域は、他の鎖由来の超可変領域と共に、ＦＲに非常に近接して一緒に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service. National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与するわけではないが、種々のエフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与）を示す。
【００３７】
抗体のパパイン消化は、各々が、単一の抗原結合部位を有する“Ｆａｂ”フラグメントと称される２つの同一の抗原結合フラグメント、および残りの“Ｆｃ”フラグメントを生成し、この名前“Ｆｃ”は、容易に結晶化するその能力を反映している。ペプチン処理によって、２つの抗原結合部位を有し、そしてなおも抗原と架橋結合し得るＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じる。
【００３８】
“Ｆｖ”は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、密接な非共有結合的な会合による、１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインのダイマーからなる。これは、各可変ドメインの３つの超可変領域が、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面上の抗原結合部位を規定するように相互作用するような配置にある。ひとまとめにすると、６つの超可変領域が、抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかし、１つの可変ドメイン（または抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）であっても抗原を認識しそして結合する能力を有するが、これは結合部位全体よりも低い親和性である。
【００３９】
Ｆａｂフラグメントもまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に数個の残基を付加している点で、Ｆａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書中において、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一つのフリーのチオール基を保有するＦａｂ’を示す。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、本来、ヒンジシステインをその間に有するＦａｂ’フラグメントの対として生成された。抗体フラグメントの他の化学カップリングもまた、公知である。
【００４０】
任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の“軽鎖”が、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに異なる型の内の一方に割り当てられ得る。
【００４１】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体は異なるクラスに割り当てられ得る。完全な抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、そしてこれらのうちのいくつかは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２のサブクラス（アイソタイプ）にさらに分けられ得る。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および３次元配置が、周知である。
【００４２】
“単鎖Ｆｖ”または“ｓｃＦｖ”抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含有し、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のために所望の構造を形成することを可能にするＶＨドメインおよびＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含有する。ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６９−３１５頁（１９９４）を参照のこと。
【００４３】
用語“超可変領域”は、本明細書中に使用される場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、“相補性決定領域”または“ＣＤＲ”由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインにおいて残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおいて３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））を含むか、そして／または“超可変ループ”由来の残基（例えば、軽鎖可変ドメインにおいて残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、および９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおいて２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。“フレームワーク”または“ＦＲ”の残基は、本明細書中に規定されるような超可変領域の残基以外の可変ドメイン残基である。
【００４４】
処置の目的のために“哺乳動物”は、哺乳動物として分類される任意の動物をいい、ヒト、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）および家畜（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）、ならびに動物園の動物、娯楽動物または愛玩動物（例えば、イヌ、ウマ、ヒツジ、ネコ、ブタ、乳牛など）を含む。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。
【００４５】
用語“癌”、“癌性”および“悪性”は、典型的には無秩序な細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態をいうか、または示す。癌の例としては、限定されないが、腺癌を含む癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病が挙げられる。かかる癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌、肺癌（肺の小細胞癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、および肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜の癌、肝細胞の癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃまたはｓｔｏｍａｃｈ）癌（胃腸癌を含む）、消化管間質癌、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌（例えば肝癌およびヘパトーマ）、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌，結腸直腸癌、直腸癌、子宮内膜または子宮の癌腫、唾液腺癌腫、腎臓（ｋｉｄｎｅｙまたはｒｅｎａｌ）癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部の癌、甲状腺癌、基底細胞癌、精巣癌、食道癌、肝細胞（ｈｅｐａｔｉｃ）癌腫、軟部組織の肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌腫、中皮腫、多発性骨髄腫、ならびに種々の型の頭部および頚部の癌、ならびにＢ細胞リンパ腫（例えば、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中等悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中等悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度非分割小細胞ＮＨＬ；大きな腫瘍の（ｂｕｌｋｙ ｄｉｓｅａｓｅ）ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症）；ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリーセル白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後リンパ球増殖症障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫と関連する異常な脈管増殖（脳腫瘍と関連するものなど）、ならびにメグス症候群が挙げられる。
【００４６】
“血管の”及び“心血管の”という語法は、相互交換可能に使用され、血管形成及び／又は心血管新生を刺激する徴候、及び血管形成及び／又は心血管新生を阻害する徴候を持つ患者を記述する。このような疾患には、例えば、アテローム性動脈硬化、高血圧、炎症性脈管炎、レーノー病及びレーノー現象、動脈瘤、及び動脈再狭窄などの動脈の病気；血栓静脈炎、リンパ管炎、及びリンパ浮腫などの静脈及びリンパ管の疾患；及び他の血管疾患、例えば、末梢血管病、ＡＭＤ、血管腫瘍のような癌、例えば血管腫(毛細管及び海綿状)、グロムス腫瘍、毛細管拡張症、細菌性血管腫症、血管内皮腫、血管肉腫、血管外皮細胞腫、カポジ肉腫、リンパ管腫及びリンパ管肉腫、腫瘍血管形成などの癌、創傷、火傷、及び他に損傷を被った組織などの外傷、移植固定、瘢痕化、虚血再潅流傷害、慢性関節リュウマチ、脳血管の病気、急性腎不全などの腎臓病、及び骨粗鬆症が含まれる。また、狭心症、急性心筋梗塞などの心筋梗塞、心肥大、及びうっ血性心不全（ＣＨＦ）などの心不全も含まれる。
【００４７】
“糖尿病”という用語は、インスリンの不適当な生産又は利用を含む糖質代謝の進行性疾患を示し、高血糖及び糖尿により特徴付けられる。この用語は、例えば、Ｉ型及びＩＩ型及びインスリン耐性糖尿病、例えば、メンデンホール症候群、ウェルナー症候群、妖精症（leprechaunism）糖尿病、脂肪萎縮性糖尿病、及び他の脂肪萎縮など全ての形態の糖尿病を含む。
【００４８】
“アフィニティー精製された”という用語は、アフィニティークロマトグラフィーカラムを通して溶出することにより物質を精製することを示す。
【００４９】
ＥＬＩＳＡ
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、ホモ二量体糖タンパク質であり、成長段階および腫瘍に関連する病的血管新生における血管形成の重要な血管新生因子である。ＶＥＧＦの発現は、低酸素状態に反応して、並びに、可能性として、成長因子、ホルモンおよび癌遺伝子のような他の因子に反応して、促進される（例えばFerrara N: Vascular endothelial growth factor: Basic science and clinical progress . Endocrine Reviews 25: 581-611 (2004)を参照）。ヒトＶＥＧＦ遺伝子はイントロンによって分断された８つのエキソンを有する。選択的RNAスプライシングにより、単量体当たり１２１、１６５、１８９及び２０６個のアミノ酸を有する少なくとも４つの主なアイソフォームが生成される（例えば、Houck KA, et al.,: The vascular endothelial growth factor family: identification of a fourth molecular species and characterization of alternative splicing of RNA. MoI Endocrinol 5: 1806-1814 (1991); 並びにTischer E, et al.,: The human gene for vascular endothelial growth factor. Multiple protein forms are encoded through alternative exon splicing. J Biol Chem 266: 11947-11954 (1991)）。単量体当たり１４５個のアミノ酸（例えばPoltorak Z., et al.,: VEGF145, a secreted vascular endothelial growth factor isoform that binds to extracellular matrix. J Biol Chem 272: 7151-7158 (1997)）および１８３個のアミノ酸（例えばJingjing L, et al.,: Human Muller cells express VEGF 183, a novel spliced variant of vascular endothelial growth factor. Invest Ophthalmol Vis Sci 40:752-759 (1999)を参照）を有するアイソフォームを含む頻度の低いアイソフォームも報告されている。全てのＶＥＧＦアイソフォームが、二つのレセプターチロシンキナーゼ、ＶＥＧＦＲ−１（例えばDe Vries C, et al.,: The fins-like tyrosine kinase, a receptor for vascular endothelial growth factor. Science 255:989-991 (1992)を参照）およびＶＥＧＦＲ−２（例えばTerman BI, et al.,: Identification of a new endothelial cell growth factor receptor tyrosine kinase. Oncogene 6: 1677-1683 (1991)を参照）に結合する。ＶＥＧＦ１６５は、ニューロピリンとも相互作用する（例えばSoker S. et al.,: Neuropilin-1 is expressed by endothelial and tumor cells as an isoform-specific receptor for vascular endothelial growth factor. Cell 92: 735-745 (1998)を参照）。ＶＥＧＦ１８９およびＶＥＧＦ２０６は高い親和性でヘパリンに結合し、ほとんど細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に隔離される。ＶＥＧＦ１６５は中度の親和性でヘパリンに結合し、一部は可溶性であり、一部は細胞表面およびＥＣＭに結合する。ＶＥＧＦ１２１はヘパリンに結合せず、制限されることなく可溶性である。ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１６５は、逆転写ＰＣＲ解析により乳房および卵巣の癌腫瘍試料および細胞株において最も優勢に発現されるバリアントであることが見出されたが、ＶＥＧＦ２０６の発現は検出されなかった。ＶＥＧＦ１８３およびＶＥＧ１８９発現はその細胞株において検出不可能または低レベルであることが見出され、一部の腫瘍試料において検出された（例えば、Stimpfl M, et al.,: Vascular Endothelial growth factor splice variants and their prognostic value in breast and ovarian cancer. Clinical Cancer Research 8: 2253-2259 (2002)を参照）。
【００５０】
活性ＶＥＧＦフラグメントは、最初の１１０アミノ酸を生じるプラスミン切断によりＥＣＭ結合ＶＥＧＦから放出され得る（例えばKeyt BA, et al., The carboxyl-terminal domain (111-165) of vascular endothelial growth factor is critical for its mitogenic potency . J Biol Chem. 271 : 7788-7795 (1996)を参照）。これは、血管形成の生理的および病的なプロセスにおけるＶＥＧＦのバイオアベイラビリティを局所的に制御するメカニズムかもしれない。例えば、Houck KA, et al. Dual regulation of vascular endothelial growth factor bioavailability by genetic and proteolytic mechanisms. J Biol Chem 1992;267:26031-26037 (1992); Keyt BA, et al. The carboxy -terminal domain (111-165) of vascular endothelial growth factor is critical for its mitogenic potency. J Biol Chem. 271 :7788-7795 (1996); およびRoth D, et al. Plasmin modulates vascular endothelial growth factor- A-mediated angiogenesis during wound repair. Am Pathology 168: 670-684. (10-12) (2006)を参照。しかしながら、生物学的サンプルにおけるＶＥＧＦ１１０濃度については未だ報告されたことがない。活性ＶＥＧＦフラグメントは、マトリクス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）切断によってもＥＣＭ結合ＶＥＧＦから放出されるかもしれない。これは、卵巣癌患者由来の腹水における１−１１０にさらに付加のアミノ酸を有する分解されたＶＥＧＦフラグメントの発見によって支持されている。プラスミンとＭＭＰ３の両方が腹水中に検出されている。例えば、Lee S, Shahla MJ, et al. Processing of VEGF-A by matrix metalloproteinases regulates bioavailability and vascular patterning in tumors. J Cell Biology 169:681-691 (2005)を参照。
【００５１】
種々の抗原に対する酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）は、比色分析、化学発光および蛍光定量法に基づくものを含む。ＥＬＩＳＡは、血漿および尿のサンプルにける微量の薬剤および他の抗原性成分の測定に成功裏に利用されており、抽出工程を含まず、簡便に実施できる。ここに記述するアッセイは、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ１１０＋のための捕獲試薬としての抗体および検出可能抗体を利用するＥＬＩＳＡである。一部の実施態様においては、ＥＬＩＳＡは細胞ベースである。アッセイの第一工程において、ＶＥＧＦを含有もしくはＶＥＧＦ１１０＋を含有することが疑われる生物学的サンプルを捕獲（またはコート）抗体と接触させかつインキュベートして、捕獲抗体がＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ１１０＋を捕獲または結合して、検出工程において検出可能な状態にする。検出工程は検出可能抗体の使用を含み、この検出可能抗体は、結合したＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ１１０＋の何れかと接触した際に、存在するならば、指向されたタンパク質と結合し、検出手段が抗体上の標識、かくしてＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ１１０＋の存在または存在量を検出するために使用される。このＥＬＩＳＡは、全ＶＥＧＦ（例えば、米国特許第６８５５５０８号；ここに記載されている事項および当該技術分野で公知の事項）またはＶＥＧＦのアイソフォームを認識して存在するＶＥＧＦのタイプを調べるＥＬＩＳＡに匹敵する。
【００５２】
例えば、ある実施態様では、アッセイは以下のステップを利用する。
【００５３】
第一のステップ
【００５４】
ここでのアッセイの第一ステップにおいて、生物学的サンプルは、固定化された捕獲（又はコート）試薬と接触され、共にインキュベートされるが、捕獲試薬は抗−ＶＥＧＦモノクローナル抗体である。この抗体は何らかの動物種に由来するが、好ましくは、モノクローナル抗体はマウス又はラットモノクローナル抗体で、さらに好ましくはマウスで、最も好ましくはここに記載するハイブリドーマから誘導されるＭＡｂ ５Ｃ３である。従って、特定の好ましい実施態様において、固定化されたモノクローナル抗体はマウスモノクローナル抗体で、最も好ましくはＭＡｂ ５Ｃ３である。通常、固定化は、アッセイ手順前に、水に不溶なマトリクスもしくは表面への吸着（米国特許第３，７２０，７６０号）又は非共有結合性もしくは共有結合性の共役により（例えば、米国特許第３，６４５，８５２号又はRotmans等, J. Immuno. Methods 57:87-98 (1983)中に記述されるように、硝酸及び還元剤などの試薬による担体の事前の活性化を伴う又は伴わない、グルタルアルデヒド又はカルボジイミドのクロスリンクを用いて）、或いはアッセイの後、例えば、免疫沈降法などの方法により、捕獲試薬を不溶化することにより達成される。
【００５５】
固定化に使用される固相は、実質的に水に不溶性でイムノメトリック（immunometric）アッセイにおいて有用な不活性な担体又はキャリアの何れかで、例えば、表面、粒子、多孔性マトリクスなどの形態の担体を含む。通常使用される担体の例には、小さなシート、セファデックス、塩化ビニル、プラスチックビーズ、及びポリエチレン製、ポリプロピレン製、ポリスチレン製のアッセイプレート又は試験管、及び９６−ウェルマイクロプレートを含む同等なもの、並びにろ紙、アガロース、クロスリンクデキストラン、及び他の多糖類などの粒子性物質が含まれる。あるいは、臭化シアンにより活性化された糖質などの反応性を有する水に不溶なマトリクス、及び米国特許第３，９６９，２８７号；３，６９１，０１６号；４，１９５，１２８号；４，２４７，６４２号；４，２２９，５３７号；及び４，３３０，４４０号中に記述される反応性基質は、捕獲試薬の固定化に適切に用いられる。好ましい実施態様において、固定化される捕獲試薬はマイクロタイタープレート上にコートされ、特に、使用されるのに好ましい固相は、一度に幾つものサンプルを分析するために使用し得るマルチウェルマイクロタイタープレートである。例えば、Nune MaxisorbまたはImmulonとして市販されているようなマイクロテスト９６ウェルＥＬＩＳＡプレートである。一部の実施態様では、このプレートは、NUNC MAXISORBTMまたはIMMULONTMとして市販されているようなMICROTESTTMまたはMAXISORPTM９６ウェルＥＬＩＳＡプレートである。
【００５６】
固相は、上述したように捕獲試薬でコートされ、非共有結合又は共有結合的相互作用又は所望の物理的な結合により連結される。吸着のための技術には、米国特許第４，３７６，１１０号及びこの中の引用文献中に記述されるものが含まれる。共有結合の場合、プレート又はその他の固相は、室温で１時間など当該技術分野において周知の条件下で捕獲試薬と共にクロスリンク剤とインキュベートされる。
【００５７】
一般に、捕獲試薬を固相基質へ吸着させるために用いられるクロスリンク剤は、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシニミジルプロピオン酸）などのジスクシニミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、及びビス−Ｎ−マレイミド−１．８−オクタンなどの二官能性マレイミドを含む。メチル−３−[(p-アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミド酸塩などの誘導体薬剤は、光の存在下においてクロスリンクを形成することができる光活性化可能中間体を産生する。
【００５８】
９６−ウェルプレートが利用される場合、それらは典型的には捕獲試薬でコートされる（典型的には、0.05Ｍ 炭酸ナトリウムなどのバッファー中で、少なくとも約１０時間、より好ましくは少なくとも一晩、約4-20℃で、より好ましくは約4-8℃、及び約8-12のｐＨ、より好ましくは約9-10及び最も好ましくは約9.6におけるインキュベーションにより希釈される）。さらに短いコート時間が望ましい場合、例えば９６−ウェルプレートを室温で２時間かけてコートすることができる。プレートは、アッセイ自体に先んじて長期間積み重ねて保存し、コートされていてもよく、その後、アッセイは手動、半自動、又はロボットを使用することによる自動的な形式で幾つかのサンプルに対し同時に実施され得る。
【００５９】
次に、典型的には、コートされたプレートは、フリーなリガンドのプレートウェル上の過剰な部位に対する不要な結合を防ぐために、結合部位に非特異的に結合させ、飽和させるブロッキング剤で処理される。この目的に対し適当なブロッキング剤の例には、例えば、ゼラチン、ウシ血清アルブミン、卵アルブミン、カゼイン、及び脱脂ミルクなどが含まれる。典型的には、ブロッキング処理は外界温度の条件下で1-4時間、好ましくは約1から３時間、あるいは０−４℃で一晩行われる。
【００６０】
コート及びブロッキングの後、適切に希釈されたＶＥＧＦ標準物質（精製ＶＥＧＦ）又は分析される生物学的サンプルは固定化相へ添加される。好ましい希釈率は、体積にして約1-15％で、好ましくは約10％である。この目的に対する希釈のために使用されてもよいバッファーは、（a）0.5 % BSA, 0.05 % TWEEN20TM界面活性剤（P20), 0.05 % PROCLINTM300抗生物質, 5 mM EDTA, 0.25 % Chaps界面活性剤, 0.2 % β-ガンマグロブリン, 及び0.35 M NaClを含むPBS；(b)0.5 % ウシ血清アルブミン, 0.05 % ポリソルバート20, 5 mM EDTA, 0.25 % Chaps, 0.2 % ウシβ-ガンマグロブリン, 及び0.35 M NaClを含むPBSでpH7.4；(c)0.5 % BSA, 0.05 % P20, 及び0.05 % PROCLINTM300 を含むPBSでpH7；(d)0.5 % BSA, 0.05 % P20, 0.05 % PROCLINTM300, 5 mM EDTA, 及び0.35 M NaClを含むPBSでpH6.35；(e)0.5 % BSA, 0.05 % P20, 0.05 % PROCLINTM300, 5 mM EDTA, 0.2 % β-ガンマグロブリン, 及び0.35 M NaClを含むPBS；及び(f)0.5 % BSA, 0.05 % P20, 0.05 % PROCLINTM300, 5 mM EDTA, 0.25 % Chaps, 及び0.35 M NaClを含むPBS, pH7.4、を含む。PROCLINTM300は保存剤として作用し、TWEEN20TMは非特異的な結合を除去するために界面活性剤として作用する。
【００６１】
一般に、捕獲試薬の濃度は、生物学的サンプルの必要な希釈を考慮にいれたＶＥＧＦの対象の濃度範囲により決定され、捕獲試薬の最終濃度は、一般に対象の範囲においてアッセイ感度を最大にするために経験的に決定されるであろう。
【００６２】
サンプル及び固定化された捕獲試薬のインキュベーション条件は、アッセイの感度を最大にし、解離を最小にするように選択される。好ましくは、インキュベーションは、約0℃から約40℃の範囲内であり、好ましくは、約20から25℃で、完全に一定の温度で達成される。インキュベーションの時間は、第一に温度に依存し、感度の悪いアッセイを避けるために一般に約１０時間を超えない。好ましくは、インキュベーション時間は、約0.5から３時間であり、より好ましくは遊離ＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦの捕獲試薬に対する結合を最大にするために室温で1.5-3時間である。生物学的体液中でタンパク質分解酵素がＶＥＧＦを分解することを妨げるために、タンパク質分解酵素阻害剤が添加される場合、インキュベーションの持続時間はさらに長くてもよい。
【００６３】
この段階で、インキュベーション混合物のpHは、通常、約4-9.5の範囲内であり、好ましくは約6-9の範囲内、より好ましくは7-8の範囲内、最も好ましくはアッセイ（ＥＬＩＳＡ）希釈液のpHが7.4である。インキュベーションバッファーのpHは、捕獲されるべきＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦに対する捕獲試薬の特異的な結合の有意なレベルを維持するために選択される。このステップ間、種々のバッファーが所望のpHを達成及び維持するために使用されるが、それらにはホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス塩酸塩又はトリスリン酸塩、酢酸塩、バルビタール、及び類似のものが含まれる。使用される特定のバッファーが、本発明にとって重要というわけではないが、個々のアッセイにおいて使用されるバッファーがその他のバッファーより好ましいほうがよい。
【００６４】
第二のステップ
【００６５】
ここでのアッセイ方法の任意の第二のステップにおいて、生物学的サンプルは、捕獲されなかった分子を除去するために、固定化された捕獲試薬から分離（好ましくは洗浄により）される。一般に、洗浄のために用いられる溶液は、考慮すべき事項により決定されるpHを持つバッファー（洗浄バッファー）であり、約6-9の好ましいpHの範囲を持つインキュベーションのステップのための上述のバッファーである。洗浄は３回又はそれ以上行われる。一般に、洗浄温度は、冷蔵庫の温度レベルから中程度の温度範囲であり、アッセイの期間中維持される一定温度であって、典型的には約0-40℃、より好ましくは約4-30℃である。例えば、洗浄バッファーは洗浄前に貯蔵庫内4℃の氷中に置かれ、プレート洗浄機がこのステップで利用され得る。また、捕獲されたＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦが後のステップにおいてある程度解離することに懸念がある場合は、結合したばかりのＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦが捕獲試薬に共有結合的に接着されることを可能にするために、クロスリンク剤又は他に適する薬剤がこの段階で添加されてもよい。
【００６６】
第三のステップ
【００６７】
次のステップでは、正確な温度及び使用される検出手段に主として依存する二物質を接触させるための時間を用いて、固定化された捕獲試薬を検出可能抗体に接触させるが、好ましくは約20-40℃の温度、より好ましくは約20-25℃で行う。例えば、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼと3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンが検出手段として使用される場合、ある実施態様では、シグナルを最大に増幅させるために、接触が行われる（例えば、約1時間又はそれ以上）。好ましくは、予想される遊離ＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦの最大濃度（上述）に対して過剰モル濃度の抗体が、洗浄後、プレートへ添加される。この抗体は直接的又は間接的に検出可能である。検出可能抗体がポリクローナル又はモノクローナル抗体の場合、ある実施態様では、検出抗体はモノクローナル抗体であり、ある実施態様ではマウス、ある実施態様ではMAb A4.6.1である。また、検出可能抗体は直接検出可能であり、ある実施態様では比色標識を有し、別の実施態様では蛍光標識を有する。より好ましくは検出可能抗体はビオチン化され、検出手段はアビジン又はストレプトアビジン-ペルオキシダーゼと3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンである。検出手段の読み出しは蛍光または比色法によるものとすることができる。抗体の親和性は、少量の遊離ＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦが検出されるべく十分に高くなくてはならないが、ＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦが捕獲試薬から引き離されるほど高くはない。
【００６８】
第四のステップ
【００６９】
アッセイ方法の最終ステップにおいて、この時点で捕獲試薬に結合されている遊離ＶＥＧＦのレベルは検出可能抗体に対する検出手段を用いて測定される。生物学的サンプルが血管の、糖尿病の、又は癌の患者由来である場合、好ましくは、測定のステップは、上述の３つステップの結果生じる反応を、正常個体と比較してＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦのレベルを決定するための標準曲線と比較することを含むか、あるいは、好ましくは、上述の３つステップの結果生じる反応を、種々のアイソフォームまたは全ＶＥＧＦを認識する別のＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡと比較して、ＥＬＩＳＡ同士を比較し、任意に正常個体と比較した場合の、ＶＥＧＦタイプのレベルを調べることを含む。
【００７０】
抗体産生
【００７１】
一般に、ＶＥＧＦに対するポリクローナル抗体は、ＶＥＧＦとアジュバントを複数回皮下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)注射することにより、動物に産生される。免疫化されている種において免疫原性であるタンパク質、例えばスカシガイヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する結合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する結合)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２ 、又はＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ、を使用して、ＶＥＧＦ又は標的となるアミノ酸配列を含むフラグメントを結合させることが有用である。ここでＲとＲ１は異なったアルキル基である。
【００７２】
コート抗体又は検出可能抗体として使用される抗体は、マウス、霊長類、ウサギ目の動物、ヤギ、ウサギ、ラット、チキン、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ又はブタなど何れか都合の良い脊椎動物から得られる。また、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)；Neuberger等, Nature 312:604 (1984)；Takeda等, Nature 314:452 (1985)；１９９８年１０月１５日発行の国際公開第９８/４５３３１号、並びに上述中に示される更なる文献中に記述されているように、キメラ又はヒト化抗体も使用され得る。
【００７３】
動物を、例えば、1mg又は1μｇのコンジュゲート（それぞれウサギ又はマウスの場合）を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、免疫原性コンジュゲート又はその誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、該動物を、不完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、血清が抗−ＶＥＧＦ力価についてアッセイされる。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、ＶＥＧＦのコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なったクロスリンク剤を介してコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。また、コンジュゲートはタンパク融合体として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。ポリクローナル抗体の生産方法は、Davis等によるMicrobiology, 3rd Edition, (Harper & Row, New York, New York,1980)などの多くの免疫学のテキスト本に記述されている。
【００７４】
モノクローナル抗体は、免疫化された動物から脾臓を回収し、定法により細胞を不死化し、例えば、ミエローマ細胞との融合又はエプステインバーウィルスの形質転換より調製され、所望の抗体を発現するクローンをスクリーニングする。Kofler及びMilstein, Eur. J. Immunol. 6:511 (1976)を参照のこと。モノクローナル抗体、又はFab又は(Fab)2フラグメントなどのモノクローナル抗体の抗原結合領域は、二者択一的に組換え法により生産される。
【００７５】
好適な抗体の例には、目的のタンパク質に対して既知のＲＩＡｓにおいて既に利用されているもの、例えば本明細書の冒頭に記載した参考文献に記載されているようなＶＥＧＦに対する抗体が含まれる。
【００７６】
ある実施態様では、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７７３７の下に寄託されたハイブリドーマによって産生または入手可能な抗ＶＥＧＦ抗体５Ｃ３が、任意に他の抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１と共に、使用される。本発明は、ＶＥＧＦ１−１１０に結合せず、ハイブリドーマ細胞株ＰＴＡ−７７３７によって産生されるモノクローナル抗体と同じＶＥＧＦ１１０＋エピトープに結合する抗体も提供する。ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７７３７の下に寄託されたハイブリドーマ５Ｃ３．１．１が提供される。
【００７７】
検出
【００７８】
固定化された捕獲試薬に添加される抗体は、直接標識されるか、又は過剰の一次抗体を洗い流した後、一次抗体の動物種のIgGに対して作製された標識化二次抗体の過剰なモル濃度を添加することにより間接的に検出されるであろう。後者の間接的アッセイの場合、一次抗体に対する標識化抗血清が、標識化された抗体をインサイツで生じるようにサンプルに添加される。
【００７９】
一次又は二次抗体の何れかに使用される標識は遊離のＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦの抗体への結合を干渉しない任意の検出可能な機能性を有する。適切な標識の例には、イムノアッセイにおける使用に関し既知の多くの標識であって、蛍光色素、化学発光、及び放射活性標識などの直接検出される成分、並びに、酵素など、検出されるべく反応し又は誘導体化された成分などが含まれる。このような標識の例は、放射性同位体である32P, 14C, 125I, 3H及び131I、希土類キレートなどのフルオロフォアー、又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、アンベリフェロン（umbelliferone）、例えばホタルルシフェラーゼ及びバクテリアルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）などのルシフェラーゼ、ルシフェリン、2.3-ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリフォスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース-６-ホスフェートデヒドロゲナーゼなどのサッカライドオキシダーゼ、HRPなどの色素前駆体を酸化するためにハイドロジェンペルオキシドを使用する酵素とカップルされるウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなどのヘテロサイクリックオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、又はミクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、MUGと共に用いるビオチン／ストレプトアビジン-β-ガラクトシダーゼ、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカル、及び類似物質などである。上で述べたように、蛍光定量的検出が一例である。
【００８０】
これらの標識を共有結合的にタンパク質又はポリペプチドと結合させるためには、従来の方法が利用できる。例えば、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、ビス-イミデート、ビス-ジアゾ化ベンジジン、及びその類似物質などのカップリング剤が、上述の蛍光性、化学発光性、及び酵素的な標識で抗体をタグ化するのに用いられる。例えば、米国特許３，９４０，４７５号（蛍光定量法）及び３，６４５，０９０号（酵素法）；Hunter等, Nature 144:945 (1962)；David等, Biochemistry 13:1014-1021 (1974)；Pain等, J. Immunol. Methods 40:219-230 (1981)；及びNygren J. Histochem. and Cytochem. 30:407-412 (1982)を参照のこと。一部の実施態様では、ここでの標識は、8pg/ml濃度に対する増幅性及び感度を増大させる蛍光性を有し、さらに好ましくはシグナルを増幅するためのビオチン並びにストレプトアビジン-β-ガラクトシダーゼ及びMUGである。ある実施態様では、比色標識が使用され、例えば、検出可能抗体がビオチニル化され、検出手段がアビジンまたはストレプトアビジン−ペルオキシダーゼと3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンである。
【００８１】
酵素を含むこのような標識の抗体への結合は、イムノアッセイ技術分野における当業者にとって、標準的な操作可能な方法である。例えば、O'Sullivan等, "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay", in Methods in Enzymology, ed. J.J.Langone 及びH. Van Vunakis, Vol.73 (Academic Press, New York, New York, 1981), pp147-166を参照のこと。
【００８２】
最終的な標識化抗体を添加した後、結合した抗体の量は、結合していない過剰な標識化抗体を洗浄により除去した後、標識に適した検出方法を用いて付着した標識の量を測定し、測定量を生物学的サンプル中の遊離ＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦの量を関係づけることにより決定される。例えば、酵素法の場合、発色及び測定された呈色の量は、ＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦの存在量の直接的な測定値となる。特に、HRPが標識である場合、呈色は、450nmの吸収における基質3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンを利用して検出される。
【００８３】
一例では、非標識一次抗体に対して作製された酵素標識二次抗体が固定化相から洗浄された後、呈色又は化学発光は酵素の基質と共に固定化された捕獲試薬とインキュベートすることにより発色され測定される。その後、遊離ＶＥＧＦ１１０＋またはＶＥＧＦ濃度の量は、平行して行われる標準物質ＶＥＧＦによる呈色又は化学発光と比較することにより計算される。
【００８４】
キット
【００８５】
都合上、本発明のアッセイ方法はキットの形式で提供され得る。このようなキットは以下の基本的な成分を含んだ組合せで包装される：
（a）ヒトＶＥＧＦ分子に対するモノクローナル抗体で構成され、モノクローナル抗体がＶＥＧＦ１１０＋を認識する捕獲試薬；及び
（b）ＶＥＧＦのＫＤＲ及びＦＬＴ１レセプター結合ドメインと結合する検出可能抗体（標識化又は非標識化）で構成される検出試薬。これらの基本成分は上述部分にて定義されている。ある実施態様では、検出試薬はＶＥＧＦ１−１１０のエピトープに結合する検出可能抗体を含む。
【００８６】
好ましくは、キットはさらに捕獲試薬のための固体担体を含み、分離された成分として提供されるか又は既に捕獲試薬が固定化されている。それ故、キット中の捕獲抗体は固体担体上に固定化され、又はキットに含まれるか若しくはキットとは別に提供されるような担体上に固定化される。
【００８７】
好ましくは、捕獲試薬はマイクロタイタープレート上にコートされる。検出可能試薬は、直接検出される標識化抗体、又は異なる動物種で産生された非標識抗体に対する標識抗体により検出される非標識抗体である。標識が酵素である場合、通常、キットは基質と酵素に必要とされるコファクター含み、標識は検出可能な発色団を提供する色素前駆体のフルオロフォアーである。検出試薬が非標識の場合、キットはさらに、非標識抗体に対して作製された標識化抗体などの検出可能抗体に対する検出手段を含み、好ましくは蛍光定量的検出形式である。標識が酵素の場合には、通常、キットはその酵素に必要な基質および補因子を含み、標識がフルオロフォアーである場合には、検出可能な発色団を提供する色素前駆体を含み、標識がビオチンである場合には、アビジン、ストレプトアビジンまたはＨＲＰに結合したストレプトアビジンのようなアビジンまたはＭＵＧと共に用いるβガラクトシダーゼを含む。
【００８８】
特定の実施態様において、捕獲試薬はモノクローナル抗体であり、好ましくは齧歯類、より好ましくはマウスまたはラット、さらに好ましくはマウスのものであり、最も好ましくはＭＡｂ ５Ｃ３である。一部の実施態様では、検出可能抗体はビオチニル化モノクローナル抗体であり、モノクローナル抗体が齧歯類、より好ましくはマウスまたはラット、さらに好ましくはマウスのものであり、最も好ましくはＭＡｂ Ａ４．６．１である。一部の実施態様では、捕獲試薬はキットに固定化されている。
【００８９】
一部の実施態様では、キットは、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ１１０＋の種々の形態を検出するための、ここに記載する比較研究用多重ＥＬＩＳＡを含むことができる。
【００９０】
また、キットは典型的にはアッセイを実施するための説明書を含み、及び／又は抗原標準物質としてのＶＥＧＦ（例えば、精製ＶＥＧＦ、好ましくは組換体として生産されたＶＥＧＦ、およびＶＥＧＦ１１０）、並びに安定化剤などの他の添加剤、洗浄及びインキュベーションバッファー、及びこれらと同種のものを含む。
【００９１】
ＶＥＧＦに対する標準物質の例は、Genentech, Inc., South San Francisco. Californiaおよびここに記載する会社および方法から入手可能な哺乳類細胞中で生産された組換体ヒトＶＥＧＦである。
【００９２】
キットの構成成分は、アッセイの感度を実質的に最大化する試薬溶液濃度を提供するために適当に変動させた種々の試薬の相対量により、予め決定された量比で提供されるであろう。特に、試薬は、通常は凍結乾燥され、賦形剤を含み、溶解後、テストサンプルと混合するために適切な濃度を有する試薬溶液を提供する乾燥粉末として提供される。
材料の寄託
【００９３】
以下の材料を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, １０８０１ ユニバーシティ・ブルバード、マナッサス、バージニア２０１１０−２２０９米国(ＡＴＣＣ)に寄託した：
５Ｃ３．１．１は、２００６年７月１９日にＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７７３７の下に寄託した。
【表Ａ】
【００９４】
これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存培養物が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、何れが最初に来ようとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
【００９５】
本出願の譲受人は、寄託した材料の培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと速やかに取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
【００９６】
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの材料の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に変形することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【００９７】
以下に記載する実施例および実施態様は例示目的でのみ提供されるものであり、それらを踏まえた種々の変更または修正が当業者に示唆され、本出願の精神および範囲ならびに添付の請求の範囲に含まれるものと解される。ここに引用される全ての刊行物、特許および特許出願を、全ての目的のためにその全体を参考として本明細書に援用する。
【実施例】
【００９８】
実施例１
選択的RNAスプライシングにより種々のアイソフォームとして発現される血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、腫瘍血管形成に重要な役割を演じることが知られている。ＶＥＧＦ１６５および全ＶＥＧＦの濃度を測定し、ＶＥＧＦのプラスミン消化によって生じた活性フラグメントであるＶＥＧＦ１１０の相対量を評価した。ＥＬＩＳＡ Ａ（ＶＥＧＦ１６５−２０６ ＥＬＩＳＡ）は、ＶＥＧＦ１６５およびより長いアイソフォームであるがＶＥＧＦ１２１ではないものを検出する。ＥＬＩＳＡ Ｂ（ＶＥＧＦ１１０−２０６ ＥＬＩＳＡ）は、ＶＥＧＦ１６５およびアイソフォームＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１１０を検出する。ＥＬＩＳＡ Ｃ（ＶＥＧＦ１２１−２０６ ＥＬＩＳＡ）は、ＶＥＧＦ１６５およびより長いアイソフォーム、ＶＥＧＦ１２１並びにＶＥＧＦ１１０より長い分子量を有するがＶＥＧＦ１１０ではないＶＥＧＦフラグメント（ここでは“ＶＥＧＦ１１０＋”と称する）を検出する。
【００９９】
材料と方法
【０１００】
試薬と細胞：
組み換えＶＥＧＦ１６５（Genentech）、ＶＥＧＦ１２１（Pepro Tech, Rocky Hill, New Jersey）、ＶＥＧＦ８−１０９（ＶＥＧＦ１６５のアミノ酸８−１０９からなる）および切断ＶＥＧＦ１２１（R&D Systems, Minneapolis, MN）をE.coliで産生した。切断ＶＥＧＦ１２１は質量分析で完全なＮ末端を有するが、２６ｋＤａの質量を有し、製造者によるところのカルボキシ末端から約９アミノ酸の切断と一致する。これは、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した場合に、ＶＥＧＦ１１０とＶＥＧＦ１２１との間に移動する。ＶＥＧＦ１１０は、ＶＥＧＦ１６５のプラスミン消化によって調製された（Keyt BA, et al.,: The carboxyl-terminal domain (111-165) of vascular endothelial growth factor is critical for its mitogenic potency. J Biol Chem. 271 : 7788-7795 (1996)）。質量分析で測定した分子量は２５３９０であり、理論質量２５３８９と一致した。濃度はビシンコニン酸法を用いて測定した（Pierce, Rockford, IL）。ＶＥＧＦ８−１０９、ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１６５の濃度計算に使用した分子量は、それぞれ２３．８、２８．９および３８．２ＫＤａであった。モノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１、３．５Ｆ８、２Ｅ３および５Ｃ３は、マウスをＣＨＯ細胞で産生したＶＥＧＦ１６５で免疫することによって生成した（Kim KJ, et al.,: The vascular endothelial growth factor proteins: Identification of biologically relevant regions by neutralizing monoclonal antibodies. Growth Factors 7: 53-64 (1992)）。乳房細胞株ＳＫ−ＢＲ−３、ＢＴ−４７４、Ｔ−４７ＤおよびＭＣＦ−７並びに卵巣細胞株ＥＳ−２、ＯＶＣＡＲ−３およびＳＫ−ＯＶ−３（American Type Culture Collection, Rockville, MD）は、３７℃にて、加湿された５％ＣＯ２インキュベーターにおいてＲＰＭＩ、２ｍＭのＬグルタミンおよび１０％ＦＢＳ（ただしＯＶＣＡＲ−３については２０％）で生育した。
【０１０１】
Ａ６７３細胞の馴化培地におけるＶＥＧＦの精製：
Ａ６７３細胞（American Type Culture Collection）を５０：５０ Ｆ１２／ＤＭＥＭ、２ｍＭ Ｌグルタミンおよび５％ＦＢＳにおいて６０％の密集度まで生育し、次いで、無血清培地（Genentech）において密集度まで生育した。ＶＥＧＦを、ＣＮＢｒ活性化セファロース（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）を用いて調製したＡ４．６．１−セファロースカラムを用いて上清から精製した。カラム溶出液と組み換えＶＥＧＦコントロール（１レーンあたり０．２μｇ）を還元条件下で１８％トリス−グリシンゲル（Invitrogen, Carlsbad, CA）で泳動させ、ニトロセルロースにブロットした。このブロットを、３％ウシ血清アルブミンを含む０．５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ Trition100でブロックし、２００ｎｇ／ｍｌの３．５Ｆ８またはＡ４．６．１でプローブし、次いで、２ｎｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＦｃ−ＨＲＰ（Jackson ImmunoResearch）を適用した。シグナルをSuperSignal West Dura（Pierce）を用いて発現させ、Ｘ線フィルムに記録した。
【０１０２】
ＶＥＧＦ濃度を測定するためのＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ
【０１０３】
ＥＬＩＳＡ Ａ（ＶＥＧＦ１６５−２０６ＥＬＩＳＡ）。
他に言及しない限り、蛍光ＥＬＩＳＡ Ａをサンプル中のＶＥＧＦを測定するために用いた。蛍光ＥＬＩＳＡ Ａは、コート用に３．５Ｆ８を用い、検出用にビオチニル化Ａ４．６．１およびその後にストレプトアビジン−βガラクトシダーゼを用い、基質として４−メチル−ウンベリフェリル−β−D−ガラクトシドを用いた（Rodriguez CR, et al.,: A sensitive fluorometric enzyme-linked immunosorbent assay that measures vascular endothelial growth factorl65 in human plasma. J Immunol Methods 219: 45-55 (1998)）。ＶＥＧＦ１６５スタンダードは１−１２８ｐｇ／ｍＬまたは０．０２６−３．３５ｐＭであった。比色ＥＬＩＳＡ Ａは、以下のＥＬＩＳＡ Ｃに使用したプロトコールに従って、コート用に３．５Ｆ８を用い、検出用にビオチニル化Ａ４．６．１を用いた。ＶＥＧＦ１６５スタンダードは１．６−２００ｐｇ／ｍＬであった。
【０１０４】
ＥＬＩＳＡ Ｂ（ＶＥＧＦ１１０−２０６ＥＬＩＳＡ）（以前にはＶＥＧＦ１２１−２０６ＥＬＩＳＡと称されていた。Konecny GE, et al.,: Association between HER-2/neu and Vascular Endothelial Growth Factor Expression Predicts Clinical Outcome in Primary Breast Cancer Patients. Clinical Cancer Research, 10: 1706-1716 (2004)）：MaxiSorp９６ウェルマイクロウェルプレートを、５０ｍMの炭酸塩バッファーｐH９．６中の０．５μｇ／ｍｌの抗体Ａ４．６．１を用いて、４℃で一晩、１００μｌ／ウェルでコートした。このステップの後と、その後の０．０５％のポリソルバート２０を含有するｐＨ７．４のＰＢＳを用いた室温インキュベーションステップの間において、プレートを洗浄した。プレートを、ＰＢＳ（１５０μｌ／ウェル）中の０．５％ウシ血清アルブミン、１０ｐｐｍのProclinTM300(Supelco, Belleconte, PA)を用いて１時間かけてブロックした。０．５％のウシ血清アルブミン、０．０５％のポリソルバート２０、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．２５％のＣＨＡＰＳ、０．２％のウシγグロブリン（Sigma, St. Louis, MO）および０．３５ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）（サンプルバッファー）中の二重または三重の連続希釈法におけるＶＥＧＦスタンダード（二重の連続希釈法において１．５６−２００ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５または０．０４０９−５．２４ｐＭのＶＥＧＦ）および連続希釈サンプル（最小１：１０希釈）をプレートに加え（１００μｌ／ウェル）、２時間インキュベートした。結合したＶＥＧＦをプレート上で１時間にわたってビオチニル化２Ｅ３（またはＶＥＧＦのレセプター結合ドメインに結合する別の抗体）、その後ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Amersham, Copenhagen, Denmark）で３０分間、ビオチニル−チラミド(tyramide)（ELAST ELISA amplification SYstem, Perkin Elmer Life Sciences Inc., MA）で１５分間、およびストレプトアビジン−ＨＲＰで３０分間インキュベートすることにより検出した。基質ＴＭＢ（3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン）（Kirkegaard & Perry Laboratories）を添加し、１Ｍのリン酸を加えることにより反応を停止させた。吸収をTitertekスタッカーリーダー（ICN, Costa Mesa, CA）で４５０ｎｍで読み取った。滴定曲線を、４パラメーター回帰曲線フィッティングプログラム（KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA）を用いて適合させた。標準曲線の範囲に入るデータ点を、そのサンプルにおける推定ＶＥＧＦ濃度を算出するために用いた。１０％ヒトＥＤＴＡ血漿（Golden West Biologicals Inc., Temecula, CA）中の１．５６−２００ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５の回収は、この研究に用いた１０％血漿における推定２．１ｐｇ／ｍｌの内因性ＶＥＧＦを差し引きした後で９２−１２０％であった。
【０１０５】
ＥＬＩＳＡ Ｃ（ＶＥＧＦ１２１−２０６ＥＬＩＳＡ）：
マイクロウェルプレートを、１μｇ／ｍｌの抗ＶＥＧＦ ５Ｃ３抗体を用いてコートし、上述の通りブロックした。ＶＥＧＦスタンダード（二重の連続希釈法において４．００−５１２ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５または０．１０５−１３．４ｐＭのＶＥＧＦ）およびサンプルバッファー中の連続希釈サンプルをプレートに加えた。これらのプレートを２時間インキュベートした。結合したＶＥＧＦを、ビオチニル化Ａ４．６．１を加え、次いでストレプトアビジン−ＨＲＰおよび基質としてのＴＭＢを加えて検出した。上記の通り、プレートを読み取り、データを解析した。１０％血漿中の４．００−５１２ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５の回収は、この研究に用いた１０％血漿における推定１．６ｐｇ／ｍｌの内因性ＶＥＧＦを差し引きした後で７７−１０１％であった。
【０１０６】
結果と考察
【０１０７】
ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ：
上記のＥＬＩＳＡ Ａはコート用に３．５Ｆ８を用い、検出用にビオチニル化Ａ４．６．１を用いている（Rodriguez CR, et al.,: A sensitive fluorometric enzyme-linked immunosorbent assay that measures vascular endothelial growth factor 165 in human plasma. J Immunol Methods 219: 45-55, 1998）。これは、ＶＥＧＦ１６５（ＶＥＧＦ１６５）を検出するが、R&D Systemsから入手できカルボキシ末端から約９アミノ酸を欠いているＶＥＧＦ１２１（１）（ＶＥＧＦ１２１（１））およびPeproTechから入手できるＶＥＧＦ１２１（２）（ＶＥＧＦ１２１（２））を検出しない（図１Ａ）。３．５Ｆ８はＶＥＧＦ１６５に結合するが、BIAcoreのＶＥＧＦ１２１には結合しない。Ａ４．６．１は、全てのアイソフォームおよびＶＥＧＦ１１０に存在するレセプター結合ドメイン（Kim KJ, et al.,: The vascular endothelial growth factor proteins: Identification of biologically relevant regions by neutralizing monoclonal antibodies . Growth Factors 7: 53-64, 1992）に結合する。３．５Ｆ８は、恐らく、ＶＥＧＦ１２１に存在しないアミノ酸１１６および１１８の近傍に結合する。５Ｃ３は、恐らく、ＶＥＧＦ１１０に存在しないアミノ酸１１１−１１３の近傍に結合する（図３）。ＥＬＩＳＡ Ａは、恐らくＶＥＧＦ１８３、ＶＥＧＦ１８９およびＶＥＧＦ２０６を含むＶＥＧＦ１６５配列を含むＶＥＧＦアイソフォームを検出することができる（Stimpfl M, et al.,: Vascular Endothelial growth factor splice variants and their prognostic value in breast and ovarian cancer. Clinical Cancer Research 8: 2253-2259, 2002を参照）。ＥＬＩＳＡ Ｂ（以前にはＶＥＧＦ１２１−２０６ＥＬＩＳＡと称されていた。Konecny GE, et al.,: Association between HER-2/neu and Vascular Endothelial Growth Factor Expression Predicts Clinical Outcome in Primary Breast Cancer Patients. Clinical Cancer Research, 10: 1706-1716 (2004)）はコート用にＡ４．６．１を用い、検出用にビオチニル化２Ｅ３を用いる。Ａ４．６．１および２Ｅ３は、３つ全ての分子に存在するレセプター結合ドメインに結合する。例えば、Kim KJ, et al. The vascular endothelial growth factor proteins: Identification of biologically relevant regions by neutralizing monoclonal antibodies. Growth Factors 7:53-64 (1992); およびMuller YA, et al. Vascular endothelial growth factor: Crystal structure and functional mapping of the kinase domain receptor binding site. Proc Natl Acad Sci USA 94:7192-7197 (1997)を参照。これらの領域に結合する他の抗体も使用することができる。このＥＬＩＳＡは、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１２１、切断されたＶＥＧＦ１２１（カルボキシ末端から約９アミノ酸を欠失）、ＶＥＧＦ１１０およびＶＥＧＦ８−１０９を同等に十分に検出する（図１Ｂ）。このＥＬＩＳＡは、マトリクス・メタロプロテイナーゼ消化により生じたＶＥＧＦ１１０よりも大きいフラグメントを含む全ＶＥＧＦを検出することができる。ここに記述するＥＬＩＳＡ Ｃは、コート用に５Ｃ３を用い、検出用にビオチニル化Ａ４．６．１を用い、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１２１、および切断されたＶＥＧＦ１２１を同等に十分に検出するが、ＶＥＧＦ１１０またはＶＥＧＦ８−１０９を検出しない（図１Ｃ）。５Ｃ３はＶＥＧＦ１２１に結合するが、BIAcoreによるＶＥＧＦ８−１０９には結合しない。このＥＬＩＳＡは、ＶＥＧＦ１１０およびより小さいフラグメントを除いて、ＶＥＧＦ１１０−２０６によって検出された全てのＶＥＧＦ分子を検出することができる。
【０１０８】
ＥＬＩＳＡ Ａ、ＥＬＩＳＡ Ｂ、およびＥＬＩＳＡ Ｃの感度は、最小で１：１０希釈を用いて、サンプル中のＶＥＧＦについてそれぞれ１０、１６および４０ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５（または種々のＶＥＧＦアイソフォームおよびフラグメントについて０．２６、０．４１および１．０５ｐＭ）であった。ＥＬＩＳＡ ＢおよびＥＬＩＳＡ Ｃは再現性があった（表１および２）。ＥＬＩＳＡ ＢおよびＥＬＩＳＡ Ｃは、ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ−Ａ）に特異的であった。５０ｎｇ／ｍｌまでの濃度のＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄはバックグラウンドシグナルを与えるだけであった。インスリン様成長因子Ｉ、成長ホルモン、組み換え神経成長因子、腫瘍壊死因子（Genentech）、血小板由来増殖因子ＡＢ、胎盤成長因子、形質転換成長因子β１（R&D Systems）（２００ｎｇ／ｍｌまで）はバックグラウンドシグナルを与えるだけであった。ヘパリン（Leo Laboratories, Bucks, UK and Dublin, Ireland）（１００Ｕ／ｍｌまで）はこのアッセイにおいて意味のある効果を有していなかった。
【０１０９】
表１。ＥＬＩＳＡ Ｂ（ＶＥＧＦ１１０−２０６ ＥＬＩＳＡ）：標準のレンジはバッファー中に１．５６−２００ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５（０．０４０９−５．２４ｐＭのＶＥＧＦ）であった。ブランクと比較した１．５６ｐｇ／ｍｌのスタンダードのＯＤ比は１．３７±０．１１であった。ＣＶは変動係数である。
【表１】
ａ中および高コントロールは、ヒトＥＤＴＡ血漿に組み換えＶＥＧＦ１６５を添加することにより調製した。血漿が内因性ＶＥＧＦを含んでいたことから、低コントロールは、７０％血漿中にＶＥＧＦ１６５を添加することにより調製した。コントロールを１：１０で希釈し、３４の独立したアッセイにおいて二重に分析した。
【０１１０】
表２。ＥＬＩＳＡ Ｃ（ＶＥＧＦ１２１−２０６ ＥＬＩＳＡ）。標準のレンジは４．００−５１２ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５（０．１０５−１３．４ｐＭのＶＥＧＦ）であった。ブランクと比較した４ｐｇ／ｍｌのスタンダードのＯＤ比は２．７２±０．３７であった。ＣＶは変動係数である。
【表２】
ａコントロールは、ヒトＥＤＴＡ血漿に組み換えＶＥＧＦ１６５を添加することにより調製した。これらを１：１０で希釈し、１５の独立したアッセイにおいて二重に分析した。
【０１１１】
細胞株の馴化培地中のＶＥＧＦ：
ＶＥＧＦ１６５ ｃＤＮＡ（Mengら,2000）でトランスフェクトした６つの安定なＣＨＯクローンの馴化培地を、標準としてE.coliで産生された非グリコシル化ＶＥＧＦを使用する３種のＥＬＩＳＡで測定した。６つの安定なＣＨＯクローンの馴化培地中のグリコシル化組み換えＶＥＧＦ１６５は、３つのＥＬＩＳＡで非常に類似した濃度を示した。ＥＬＩＳＡ Ｂで測定した濃度は、それぞれ、２８、６３、６４、４３、３．８および３．２ｎＭであった。ＥＬＩＳＡ Ｂで測定されたＶＥＧＦ濃度と比較したＥＬＩＳＡ ＡおよびＥＬＩＳＡ Ｃで測定されたＶＥＧＦ濃度の比率は、それぞれ０．９０±０．０８および１．０８±０．１０であった。それゆえ、３つのＥＬＩＳＡはグリコシル化ＶＥＧＦを同じように良好に定量し、培養条件下でＶＥＧＦ１６５のタンパク質分解は殆ど無かった。
【０１１２】
ＥＬＩＳＡ Ａ、ＥＬＩＳＡ ＢおよびＥＬＩＳＡ Ｃで測定したＡ６７３細胞馴化培地中のＶＥＧＦ濃度は、それぞれ０．１５、０．２９および０．２４ｎＭであった。ＥＬＩＳＡ Ａで測定した濃度はより低く、ＶＥＧＦ１２１が存在することを示唆していた。ＶＥＧＦをＡ４．６．１アフィニティーカラムを用いて馴化培地から精製し、蛋白ブロッティングで分析すると、グリコシル化および非グリコシル化ＶＥＧＦ１６５と思われる二つのバンドが３．５Ｆ８によって検出された。下方のバンドはE.coliで産生されたＶＥＧＦ１６５と同じ移動度であった（図２左）。Ｎ−グリカナーゼ処理により上方のバンドは下方のバンドに転換された。グリコシル化（推定される非グリコシル化ＶＥＧＦ１６５バンドと部分的に重複する）および非グリコシル化ＶＥＧＦ１２１と思われる二つのさらなる低分子量バンドがＡ４．６．１によって検出された（図２右）。下方のバンドはE.coliで産生された精製ＶＥＧＦ１２１と同じ移動度であり、Ｎ−グリカナーゼ処理により上方のバンドは下方のバンドに転換された。
【０１１３】
ＥＬＩＳＡ Ｂで測定した乳房細胞株ＳＫ−ＢＲ−３、ＢＴ−４７４、Ｔ−４７ＤおよびＭＣＦ−７由来の馴化培地におけるＶＥＧＦ濃度は、それぞれ３．６、１６、１３および１３ｐＭであった。ＥＬＩＳＡ Ｂで測定したＶＥＧＦ濃度に対するＥＬＩＳＡ Ａで測定したＶＥＧＦ濃度の比率はそれぞれ０．４９、０．４２、０．４３および０．３８（すなわち、４９％、４２％、４３％または３８％）であり、これらの各細胞株におけるＶＥＧＦ１６５の発現である４３、３５、４０および４１％（Stimpfl M, et al.,: Vascular Endothelial growth factor splice variants and their prognostic value in breast and ovarian cancer. Clinical Cancer Research 8: 2253-2259, 2002）と一致していた。ＥＬＩＳＡ Ｂで測定したＶＥＧＦ濃度に対するＥＬＩＳＡ Ｃで測定したＶＥＧＦ濃度の比率はこれらの細胞株で１．１−１．２であり、ＶＥＧＦ１１０が殆ど存在しないことを示している。ＥＬＩＳＡ Ｂで測定した卵巣細胞株ＥＳ−２、ＯＶＣＡＲ−３およびＳＫ−ＯＶ−３由来の馴化培地におけるＶＥＧＦ濃度は、それぞれ３２、１１および２０ｐＭであった。ＥＬＩＳＡ Ｂで測定したＶＥＧＦ濃度に対するＥＬＩＳＡ Ａで測定したＶＥＧＦ濃度の比率は、それぞれ０．２４、０．２０および０．３２（すなわち、２４％、２０％および３２％）であり、これらの各細胞株におけるＶＥＧＦ１６５の発現が３８、４２および２４％（Stimpfl et al.,上掲）であることと対比される。ＥＬＩＳＡ Ｂで測定したＶＥＧＦ濃度に対するＥＬＩＳＡ Ｃで測定したＶＥＧＦ濃度の比率はこれらの細胞株で０．６４−０．７９であり、ＶＥＧＦ１１０（またはそれよりも小さいフラグメント）が存在するかもしれないことを示している。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
（ａ）生物学的サンプルを固形支持体に固定された捕獲試薬と接触させてインキュベートする工程であって、ここで前記捕獲試薬がヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する抗体５Ｃ３と同じエピトープを認識する抗体であり、前記モノクローナル抗体がヒトＶＥＧＦの１１０より大きい残基に特異的に結合する、工程；
（ｂ）固定された捕獲試薬から生物学的サンプルを分離する工程；
（ｃ）固定された捕獲試薬−標的分子複合体を、ＶＥＧＦのＫＤＲおよび／またはＦＬＴ１レセプター結合ドメインに結合する、もしくはＶＥＧＦ１−１１０におけるエピトープに結合する検出可能抗体と接触させる工程；および
（ｄ）検出可能抗体のための検出手段を用いて捕獲試薬に結合したＶＥＧＦ１１０＋のレベルを測定する工程；
を含む、生物学的サンプルにおける選択的血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）型（ＶＥＧＦ１１０＋）を検出する方法。
【請求項２】
生物学的サンプルが被験者から単離される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
被験者が血管の、糖尿病の、または癌の患者であり、測定工程（ｄ）が標準曲線と比較して正常な個体と比べたＶＥＧＦレベルを調べることをさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
生物学的サンプルが、腫瘍溶解物、血漿、血清、または尿である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
捕獲試薬が５Ｃ３モノクローナル抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
固定された捕獲試薬がマイクロタイタープレート上にコートされる、請求項１記載の方法。
【請求項７】
検出可能抗体が直接的に検出可能である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
検出可能抗体が蛍光試薬によって増幅される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
検出可能抗体がビオチン化され、検出手段がアビジンまたはストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよび３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
検出可能抗体がモノクローナル抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
検出可能抗体がマウスモノクローナル抗体である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
固定化されたモノクローナル抗体がＭＡｂ ５Ｃ３であり、かつ、検出可能抗体がＭＡｂ Ａ４．６．１である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）捕獲試薬として、ヒトＶＥＧＦに対する抗体、ここで前記モノクローナル抗体がヒトＶＥＧＦの１１０より大きい残基に特異的に結合する；および
（ｂ）検出試薬として、ＶＥＧＦのＫＤＲおよび／またはＦＬＴ１レセプター結合ドメインに結合する、もしくはＶＥＧＦ１−１１０におけるエピトープに結合する検出可能抗体；
を含む、生物学的サンプル中のＶＥＧＦ１１０＋を検出するためのイムノアッセイキット。
【請求項１４】
捕獲試薬用の固形支持体をさらに含む、請求項１３記載のキット。
【請求項１５】
捕獲試薬が固形支持体上に固定される、請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
捕獲試薬がマイクロタイタープレート上にコートされる、請求項１５記載のキット。
【請求項１７】
検出可能抗体の検出手段をさらに含む、請求項１６記載のキット。
【請求項１８】
検出手段が比色的である、請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
抗原標準として精製されたＶＥＧＦをさらに含む、請求項１３記載のキット。
【請求項２０】
捕獲試薬抗体がマウスモノクローナル抗体ＭＡｂ ５Ｃ３であり、検出可能抗体がＭＡｂ Ａ４．６．１である、請求項１３記載のキット。
【請求項２１】
寄託番号ＰＴＡ−７７３７の下に寄託されているハイブリドーマ５Ｃ３．１．１から入手可能（または産生される）抗体５Ｃ３。
【請求項２２】
検出可能な標識に接合した請求項２１記載の抗体。
【請求項２３】
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７７３７の下に寄託されているハイブリドーマ５Ｃ３．１．１。
【請求項２４】
ＶＥＧＦ１１０に結合せず、ハイブリドーマ細胞株ＰＴＡ−７７３７によって産生されるモノクローナル抗体と同一のエピトープに結合する抗体。
【請求項２５】
検出可能な標識に接合した請求項２４記載のモノクローナル抗体。
【請求項１】
以下の工程：
（ａ）生物学的サンプルを固形支持体に固定された捕獲試薬と接触させてインキュベートする工程であって、ここで前記捕獲試薬がヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する抗体５Ｃ３と同じエピトープを認識する抗体であり、前記モノクローナル抗体がヒトＶＥＧＦの１１０より大きい残基に特異的に結合する、工程；
（ｂ）固定された捕獲試薬から生物学的サンプルを分離する工程；
（ｃ）固定された捕獲試薬−標的分子複合体を、ＶＥＧＦのＫＤＲおよび／またはＦＬＴ１レセプター結合ドメインに結合する、もしくはＶＥＧＦ１−１１０におけるエピトープに結合する検出可能抗体と接触させる工程；および
（ｄ）検出可能抗体のための検出手段を用いて捕獲試薬に結合したＶＥＧＦ１１０＋のレベルを測定する工程；
を含む、生物学的サンプルにおける選択的血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）型（ＶＥＧＦ１１０＋）を検出する方法。
【請求項２】
生物学的サンプルが被験者から単離される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
被験者が血管の、糖尿病の、または癌の患者であり、測定工程（ｄ）が標準曲線と比較して正常な個体と比べたＶＥＧＦレベルを調べることをさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
生物学的サンプルが、腫瘍溶解物、血漿、血清、または尿である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
捕獲試薬が５Ｃ３モノクローナル抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
固定された捕獲試薬がマイクロタイタープレート上にコートされる、請求項１記載の方法。
【請求項７】
検出可能抗体が直接的に検出可能である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
検出可能抗体が蛍光試薬によって増幅される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
検出可能抗体がビオチン化され、検出手段がアビジンまたはストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよび３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
検出可能抗体がモノクローナル抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
検出可能抗体がマウスモノクローナル抗体である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
固定化されたモノクローナル抗体がＭＡｂ ５Ｃ３であり、かつ、検出可能抗体がＭＡｂ Ａ４．６．１である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）捕獲試薬として、ヒトＶＥＧＦに対する抗体、ここで前記モノクローナル抗体がヒトＶＥＧＦの１１０より大きい残基に特異的に結合する；および
（ｂ）検出試薬として、ＶＥＧＦのＫＤＲおよび／またはＦＬＴ１レセプター結合ドメインに結合する、もしくはＶＥＧＦ１−１１０におけるエピトープに結合する検出可能抗体；
を含む、生物学的サンプル中のＶＥＧＦ１１０＋を検出するためのイムノアッセイキット。
【請求項１４】
捕獲試薬用の固形支持体をさらに含む、請求項１３記載のキット。
【請求項１５】
捕獲試薬が固形支持体上に固定される、請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
捕獲試薬がマイクロタイタープレート上にコートされる、請求項１５記載のキット。
【請求項１７】
検出可能抗体の検出手段をさらに含む、請求項１６記載のキット。
【請求項１８】
検出手段が比色的である、請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
抗原標準として精製されたＶＥＧＦをさらに含む、請求項１３記載のキット。
【請求項２０】
捕獲試薬抗体がマウスモノクローナル抗体ＭＡｂ ５Ｃ３であり、検出可能抗体がＭＡｂ Ａ４．６．１である、請求項１３記載のキット。
【請求項２１】
寄託番号ＰＴＡ−７７３７の下に寄託されているハイブリドーマ５Ｃ３．１．１から入手可能（または産生される）抗体５Ｃ３。
【請求項２２】
検出可能な標識に接合した請求項２１記載の抗体。
【請求項２３】
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７７３７の下に寄託されているハイブリドーマ５Ｃ３．１．１。
【請求項２４】
ＶＥＧＦ１１０に結合せず、ハイブリドーマ細胞株ＰＴＡ−７７３７によって産生されるモノクローナル抗体と同一のエピトープに結合する抗体。
【請求項２５】
検出可能な標識に接合した請求項２４記載のモノクローナル抗体。
【図２】
【図３】
【図３】
【公表番号】特表２０１０−５０６１７１（Ｐ２０１０−５０６１７１Ａ）
【公表日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３１５８１（Ｐ２００９−５３１５８１）
【出願日】平成１９年１０月３日（２００７．１０．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３１０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６０７７７
【国際公開日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【出願人】（５０９０１２６２５）ジェネンテック インコーポレイテッド (357)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月３日（２００７．１０．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３１０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６０７７７
【国際公開日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【出願人】（５０９０１２６２５）ジェネンテック インコーポレイテッド (357)
【Ｆターム（参考）】
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