Ｘ線／コンピュータ断層撮影用のナノ粒子系造影剤及びその製造方法
本発明は一般に、ナノ粒子コアとナノ粒子コアの周囲に配置されたナノシェルとを含んでなるコア／シェル型ナノ粒子であって、凝集体においてナノ粒子コア及びナノシェルがＸ線／コンピュータ断層撮影（ＣＴ）に際して造影剤として機能し得るコア／シェル型ナノ粒子を形成するようなものに関する。通例、かかるコア／シェル型ナノ粒子系Ｘ線ＣＴ用造影剤は、さらに造影剤を疾患部位に対してターゲティングするためのターゲティング化学種を含んでいる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にはＸ線／コンピュータ断層撮影で使用するための造影剤に関し、さらに詳しくはナノ粒子系造影剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヨウ素化安息香酸誘導体は、静脈内ヨウ素注射に伴うリスクファクターや副作用にもかかわらず、標準的なＸ線／コンピュータ断層撮影（ＣＴ）用造影剤として使用され続けている。さらに、かかる標準的なＣＴ用造影剤は通例低分子量であり、人体から非常に急速に消失することが知られており、したがってこれらの造影剤を疾患部位に対してターゲティングすることは難しい（Ｓｈｉ−Ｂａｏ Ｙｕ ａｎｄ Ａｌａｎ Ｄ．Ｗａｔｓｏｎ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９９，９９，２３５３−２３７７）。
【０００３】
文献には、ＣＴイメージング用のガドリニウム（Ｇｄ）又はヨウ素（Ｉ）を含む実験的ナノ粒子系が記載されている。しかし、かかる系では、標的組織又はその近傍まで送達され得る重原子は比較的少数でしかない。かかるアプローチには、ヨウ素化分子をリポソームに封入するリポソームアプローチ（Ｌｅｉｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｒａｄｉｏｌ．２００１，３６（６），３０３−３０８）、並びにＧ−４ Ｓｔａｒｂｕｒｓｔ（登録商標）ポリアミドアミド（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーにヨウ素原子をコンジュゲートする樹枝状アプローチ（Ｙｏｒｄａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００２，２（６），５９５−５９９）がある。いずれのアプローチでも、せいぜい２〜３百個の重金属（即ち、ガドリニウム）原子が送達されるにすぎない。
【０００４】
送達される重金属原子を増やす試みとして、かかる重金属のナノ粒子を使用するものがあった。国際公開第０３／０７５９６１号及び同第２００５／０５１４３５号を参照されたい。元素態（ゼロ価）金属種のナノ粒子は最も高い密度（重金属原子の数／体積）を有するものの、確実な合成や酸化による不安定性などに問題がある。金のような不活性金属のナノ粒子（例えば、国際公開第０３／０７５９６１号に記載されたもの）では、これらの問題を解決できるが、費用効果があまりよくない。
【０００５】
国際公開第０７／０５５９９５号（Ｂｏｎｉｔａｔｅｂｕｓ ｅｔ ａｌ．）には、ナノ粒子コア及びナノ粒子シェルの少なくとも一方が活性造影剤材料を含むコア／シェル型ナノ粒子が記載されている。
【０００６】
以上の点から、新規ＣＴ用造影剤、特に確実な合成、コスト削減、画像コントラスト増強、血中半減期の増大、毒性の低下、放射線量の減少及びターゲティング能力の１以上の点で性能の向上及び利益をもたらすことができる造影剤に対するニーズが存在し続けている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０３／０７５９６１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００５／０５１４３５号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０７／０５５９９５号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０３／０１６２１７号パンフレット
【特許文献５】米国特許第５９８９５８０号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｈｉ−Ｂａｏ Ｙｕ ａｎｄ Ａｌａｎ Ｄ．Ｗａｔｓｏｎ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９９，９９，２３５３−２３７７．
【非特許文献２】Ｌｅｉｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｒａｄｉｏｌ．２００１，３６（６），３０３−３０８．
【非特許文献３】Ｙｏｒｄａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００２，２（６），５９５−５９９．
【非特許文献４】Ｃｈａｎ Ｄ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｎｔａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１９９９，１５（３），２１９−２２２．
【非特許文献５】Ｉｗａｓａｋｉ，Ｋｅｎｔａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｙ Ｂ，２００４，１０８（３２），１１９４６−１１９５２．
【非特許文献６】Ｗａｎｇ，Ｃｈｕｎ ｅｔ ａｌ．，ＣｏｌｌｏｉｄｓａｎｄＳｕｒｆａｃｅｓ，Ｂ：Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，２００５，４６（４），２５５−２６０．
【非特許文献７】Ｋａｎｎａｎ，Ｂａｌａｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖａｃｕｕｍ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂ：Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｍｅｔｅｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ−−Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ，ａｎｄ Ｐｈｅｎｏｍｅｎａ，２００５，２３（４），１３６４−１３７０．
【非特許文献８】Ｐａｐｒａ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．ＵＳＡ，２００１，１７（５），１４５７−１４６０．
【非特許文献９】Ａｇｒａｗａｌ Ｍｕｋｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ：Ｔｈｅ ＡＣＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅｓ ａｎｄ Ｃｏｌｌｏｉｄｓ，２００８，２４（３），１０１３−１０１８．
【非特許文献１０】Ａｎｔａｌｅｋ，Ｂｒｉａｎ，Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，Ｐａｒｔ Ａ：Ｂｒｉｄｇｉｎｇ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００７，３０Ａ（５），２１９−２３５．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は一般に、ナノ粒子コアとナノ粒子コアの周囲に配置されたナノシェルとを含んでなるコア／シェル型ナノ粒子であって、凝集体においてナノ粒子コア及びナノシェルがＸ線イメージング（特にコンピュータ断層撮影（ＣＴ）イメージング）時に造影剤として機能し得るコア／シェル型ナノ粒子を形成するようなものに関する。
【００１０】
本発明は、タンタル（Ｔａ）を非ゼロ価状態で含む能動ナノ粒子コアと、ナノ粒子コアの周囲に配置された受動ナノシェルとを含んでなる造影剤であって、凝集体において能動ナノ粒子コア及び受動ナノシェルがＣＴイメージング時に造影剤として機能し得るコア／シェル型ナノ粒子を形成するような造影剤に関する。
【００１１】
ある実施形態では、Ｘ線／コンピュータ断層撮影用造影液が本明細書中に記載される実施形態のいずれかに係る造影剤の集合体（ｅｎｓｅｍｂｌｅ）を含んでなり、集合体の平均粒径は約１０ｎｍ以下、好ましくは約３ｎｍ以下である。
【００１２】
ある実施形態では、本発明は上述の造影剤のいずれかを製造する方法に関する。ある実施形態では、本発明はＣＴにおけるかかる造影剤の使用方法に関する。
【００１３】
ある実施形態では、本発明は、Ｘ線／コンピュータ断層撮影用造影剤の製造方法であって、タンタルを含む第１の前駆体材料を用意する段階と、第１の前駆体材料から、タンタルを非ゼロ価状態で含む活性コアを形成する段階と、第２の前駆体材料を用意する段階と、第２の前駆体材料から不活性シェルを形成する段階であって、不活性シェルはコア及びシェルがコア／シェル型ナノ粒子を形成するようにしてコアの周囲に配置される段階とを含んでなる方法に関する。
【００１４】
本発明は、ナノ粒子アプローチを使用することで、比較的多数の高密度で高減衰性のタンタル原子を分子状態で送達してＣＴのコントラスト増強を向上させる。ある実施形態では、本発明はＣＴ造影剤による特定疾患部位のターゲティングを可能にする。ある実施形態では、本発明はマクロファージによるＣＴ用造影剤の取込みを可能にする。ある実施形態では、本発明は血中半減期の増大したＣＴ用造影剤を提供する。
【００１５】
以上、本発明の以下の詳細な説明を理解しやすくするため、本発明の特徴をむしろ大まかに略述した。本発明の請求の範囲の主題を構成する本発明のさらなる特徴や利点については、以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明及びその利点を一層完全に理解できるように、以下、図面を参照しながら本発明を説明する。
【図１】図１は、構成部分間の関係を示すためコア／シェル型ナノ粒子を一般に示す断面図である。
【図２】図２は、本発明に従って活性コアと不活性シェルとを含むコア／シェル型ナノ粒子の断面図である。
【図３】図３は、本発明のある実施形態に従ってコア／シェル型ナノ粒子をコンピュータ断層撮影用造影剤として使用する方法を流れ図で示す。
【図４】図４は、本発明のある実施形態に従って酸化タンタルコアとポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーシェルとを含む活性コア／不活性シェル型ナノ粒子の集合体の粒径分布をプロットしたグラフである。
【図５】図５は、本発明のある実施形態に従って酸化タンタルとＰＥＧポリマーシェルとを含む活性コア／不活性シェル型ナノ粒子のＴＥＭ画像である。
【図６】図６は、本発明のある実施形態に従って酸化タンタルコアとクエン酸リガンドシェルとを含む活性コア／不活性シェル型ナノ粒子の集合体の粒径分布をプロットしたグラフである。
【図７】図７は、本発明のある実施形態に従って酸化タンタルコアとクエン酸リガンドシェルとを含む活性コア／不活性シェル型ナノ粒子のＴＥＭ画像である。
【図８】図８は、酸化タンタルコアとＰＥＧポリマーシェルとを含む活性コア／不活性シェル型ナノ粒子及び酸化タンタルコアとクエン酸リガンドシェルとを含む活性コア／不活性シェル型ナノ粒子に関し、生細胞の百分率をタンタルのモル量に対してプロットしたグラフである。
【図９】図９は、本発明のある実施形態に従って溶液中のＣ３ａを検出するためのＣ３ａ標準曲線をプロットしたグラフである。
【図１０】図１０は、本発明のある実施形態に従って酸化タンタルコアとグルコースシェル、ＥＤＴＡシェル及びＰＥＧシェルの各々とを含む活性コア／不活性シェル型ナノ粒子並びに各種の対照品に関するＣ３ａの棒グラフである。
【図１１】図１１は、本発明のある実施形態に従って酸化タンタルコアとＰＥＧシェルとを含む活性コア／不活性シェル型ナノ粒子を注射したラットのコンピュータ断層撮影画像である。
【図１２】図１２は、本発明のある実施形態に従って酸化タンタルコアとＰＥＧシェルとを含む活性コア／不活性シェル型ナノ粒子を注射したラットの様々な時点における一連のコンピュータ断層撮影画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は一般に、ナノ粒子コアとナノ粒子コアの周囲に配置されたナノシェルとを含んでなるコア／シェル型ナノ粒子であって、凝集体においてナノ粒子コア及びナノシェルが特にＣＴに際してＸ線造影剤として機能し得るコア／シェル型ナノ粒子を形成するようなものに関する。
【００１８】
図面全般に関して述べれば、これらの図面は本発明の特定の実施形態を説明する目的で示すものであって、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではないことを理解されたい。
【００１９】
本明細書中で使用する用語の大部分は当業者にとって自明であろうが、本発明の理解を容易にするため、以下の定義を示しておく。しかし、明確に定義されていない場合、各用語は当業者に現在受け入れられている意味をもつものと解釈すべきであることを理解されたい。
【００２０】
本明細書中で定義され、またコンピュータ体軸断層撮影法又はコンピュータ支援断層撮影法（ＣＡＴ）及び体切片Ｘ線撮影法としても知られる「コンピュータ断層撮影法」（「ＣＴ」と略す）は、単一の回転軸に沿って撮影された多数の一連の二次元Ｘ線画像から、デジタル処理を用いて対象物（又は被検体）の内部の三次元画像を生成する断層撮影を用いた医用イメージング方法である。本明細書中ではコンピュータ断層撮影に焦点を合わせて論じるが、当業者であれば、かかる議論が一般にあらゆるタイプのＸ線イメージングに適用可能であることが理解されよう。
【００２１】
本明細書中で定義され、またコントラスト剤としても知られる「造影剤」は、入射するＸ線を有意に減衰させて、検査対象体積を通過するＸ線を低減させることができる材料を含む薬剤である。ＣＴ画像を再構築し、通常の後処理を行った後には、このようなＸ線減衰の増大は検査対象体積の密度の増加として解釈され、その結果、画像中においてはバックグラウンド組織に対して造影剤を含む体積のコントラスト増強が生じる。本明細書中での議論は一般にあらゆる形態のＸ線イメージングに適用可能であるので、本明細書中では本発明の造影剤を一般に「Ｘ線／コンピュータ断層撮影用造影剤」という。この用語は、「コンピュータ断層撮影（ＣＴ）用造影剤」と互換的に使用される。
【００２２】
コア／シェル型ナノ粒子のコア成分及びシェル成分について「活性」及び「不活性」という用語を用いた場合、これらの用語はその成分がＣＴイメージングにおいてコントラスト増強を生み出す能力を意味する。通常のＣＴスキャナーは、約１０〜約１４０ｋｅＶという広いＸ線エネルギースペクトルを使用している。当業者であればわかるように、特定の材料を通過するＸ線の単位長さ当たりの減衰量は線形減衰係数として表される。ＣＴイメージングにおいて典型的なＸ線エネルギースペクトルでは、材料の減衰度は光電吸収効果及びコンプトン散乱効果によって支配される。さらに、線形減衰係数は、入射Ｘ線のエネルギー、材料の密度（モル濃度に関係する）、及び材料の原子番号（Ｚ）の関数であることがよく知られている。異種原子の分子化合物又は混合物については、「有効原子番号」Ｚeffを構成元素の原子番号の関数として計算することができる。化学式が知られている化合物の有効原子番号は、次式で求められる。
【００２３】
【数１】
【００２４】
式中、Ｚkは単体元素の原子番号、Ｐは単体元素の総量、Ｗfkは分子の総分子量に対する単体元素の重量分率（モル濃度に関係する）である。ＣＴイメージングのための入射Ｘ線エネルギーの最適量は撮影対象物のサイズの関数であって、名目値から大きく変動することはないと予測される。また、造影剤材料の線形減衰係数は材料の密度に直線的に依存することも公知である。即ち、材料の密度を増大させたり、或いは造影剤材料のモル濃度を増加させたりすれば、線形減衰係数を増大させることができる。しかし、患者への造影剤材料の注射やそれに付随する有害な効果といった実際的な面から、達成し得るモル濃度には限界がある。したがって、造影剤候補材料を有効原子番号に従って分けるのは合理的である。モル濃度を約５０ｍＭとしたときの典型的なＣＴエネルギースペクトルについての代表的な材料のＣＴコントラスト増強のシミュレーションに基づけば、有効原子番号が３４以上の材料では、約３０ハウンスフィールド単位（ＨＵ）という適切なコントラスト増強、即ち水より３％高いコントラストが得られると推定される。したがって、本発明者らは、ＣＴ用造影剤候補材料を、有効原子番号が３４未満（即ち、Ｚeff＜３４）であれば不活性であり、有効原子番号が３４以上（即ち、Ｚeff≧３４）であれば活性であると定義した。例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅ １．Ｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｐｓｙｃｈｏｐｈｙｓｉｃｓ，Ｅｄｓ．Ｊ．Ｂｅｕｔｅｌ，Ｈ．Ｌ．Ｋｕｎｄｅｌ，Ｒ．Ｌ．Ｖａｎ Ｍｅｔｔｅｒ，ＳＰＩＥ Ｐｒｅｓｓ，２０００の第１章を参照されたい。
【００２５】
本明細書中で定義される「ナノ粒子」は、約１〜約５００ｎｍの平均粒径を有する粒子であり、ナノ粒子コア及びコア／シェル型ナノ粒子凝集体を述べる場合に使用できる。かかるナノ粒子は球状であっても不規則形状であってもよく、特に上記粒度範囲の小さい方の末端では分子錯体と区別される。本明細書中で定義される「ナノシェル」は、コア／シェル型ナノ粒子のシェル領域のことである。かかるナノシェルはナノ粒子コアの周囲に配置されているが、下地であるナノ粒子コアのトポグラフィーに一致する場合としない場合がある。
【００２６】
上述の通り、また図１について述べれば、本発明のある実施形態は、（ａ）ナノ粒子コア１０１と（ｂ）ナノ粒子コアの周囲に配置されたナノシェル１０２とを含んでなる造影剤であって、凝集体においてナノ粒子コア及びナノシェルがコンピュータ断層撮影イメージング（一般にはＸ線イメージング）時に造影剤として機能し得るコア／シェル型ナノ粒子１００を形成するようなものに関する。図１には完全に球形のコア／シェル型ナノ粒子の断面を示してあるが、かかるコア／シェル型ナノ粒子は不規則な形状を有していてもよい。
【００２７】
ある実施形態では、上述の造影剤はさらに１種以上のターゲティング剤を含んでいる。かかるターゲティング剤は、造影剤を被検体の身体の特定疾患部位に対してターゲティングするために有用である。通例、ターゲティング剤は抗体（例えば、ＩｇＧ）又は他のペプチドであるが、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）その他の適当な化学種であってもよい。一般に、ターゲティング剤はナノ粒子コア及びナノ粒子コアの周囲に配置されたナノシェルの一方又は両方に結合される。かかる結合は、通例、特に限定されないが、ペプチド結合、ジスルフィド結合、イソチオ尿素結合、イソ尿素結合、スルホンアミド結合、アミン結合、カルバメート結合、アミジン結合、ホスホラミデート結合、チオエーテル結合、アリールアミン結合、アリールチオエーテル結合、エーテル結合、ヒドラゾン結合、トリアゾール結合、オキシム結合及びこれらの組合せのような結合からなる。例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６の第２章を参照されたい。
【００２８】
ある実施形態では、上述のＣＴ用造影剤は、コア／シェル型ナノ粒子の表面電荷の制御及び／又はマクロファージ取込みを誘起する官能基（例えば、ポリビニルスルフェート）の付与により、マクロファージ取込みのために最適化される。
【００２９】
ＣＴ用造影剤／コントラスト剤として使用するための本明細書中に記載されたコア／シェル型ナノ粒子については、ナノ粒子コアは普通には約１〜約１００ｎｍ、さらに普通には約２〜約８０ｎｍ、最も普通には約２〜約２０ｎｍの平均粒径を有する。ナノ粒子コアの周囲に配置されたナノシェルは、普通には約０．５〜約１００ｎｍの平均厚さを有する。したがって、造影剤のナノ粒子コアとナノシェルとの凝集体は、普通には約２〜約５００ｎｍ、さらに普通には約２〜約１００ｎｍ、最も普通には約３〜約２０ｎｍの平均粒径を有する。
【００３０】
ナノ粒子コア及びナノシェルの凝集体は、哺乳類の腎臓（通例はヒトの腎臓）によって排出可能であるのが望ましい場合があることが理解されよう。したがって、造影剤のナノ粒子コア及びナノシェルの凝集体は、普通には約１〜約２０ｎｍ、さらに普通には約２〜約１２ｎｍ、最も普通には約３〜約８ｎｍの平均粒径を有し得る。
【００３１】
ある実施形態では、Ｘ線／コンピュータ断層撮影用造影剤は、本明細書中に記載される実施形態のいずれかに係る造影剤の集合体を含んでいて、集合体の平均粒径は約１０ｎｍ以下、さらに普通には約７ｎｍ以下、さらに普通には約６ｎｍ以下、最も普通には約３ｎｍ以下である。
【００３２】
活性コア／不活性シェル型ナノ粒子
図２について述べれば、本発明は、ナノ粒子コア２０１とナノ粒子コアの周囲に配置されたナノシェル２０２とを含んでなる造影剤２００であって、凝集体においてナノ粒子コア及びナノシェルがＣＴイメージング時に造影剤として機能し得るコア／シェル型ナノ粒子２００を形成するようなものに関する。
【００３３】
上述のナノ粒子コア２０１を構成する材料は、それがＣＴでコントラストを増強するための活性材料（Ｚeff≧３４）を含み、活性材料は非ゼロ価状態のタンタルからなるという点で限定されている。ナノ粒子コアは、通例、特に限定されないが酸化タンタルのような材料からなっている。限定ではなく例示を目的として述べれば、Ｔａ2Ｏ5に関する有効原子番号（Ｚeff）は約６９である。
【００３４】
ナノシェル２０２を構成する材料は特に限定されないが、一般に活性ＣＴ用造影剤材料からなることはなく（Ｚeff＜３４）、また一般にナノ粒子コアの周囲に配置できなければならない。好適なかかる材料には、特に限定されないが、リガンド、オリゴマー、ポリマー、クラスター、炭水化物種、官能化シリカ及びこれらの組合せがある。例えば、好適なシェル材料には、特に限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリメタクリレート、ポリビニルスルフェート、ポリビニルピロリジノン、クエン酸イオン、リンゴ酸イオン、グリコール酸イオン、シラン及びこれらの組合せがある。
【００３５】
ある実施形態に従えば、ナノシェルを構成する材料は水溶性である。別法として又は併せて、ある実施形態に従えば、ナノシェルを構成する材料は生体適合性である。
【００３６】
ナノシェルは、好ましくはジエチルホスファトエチルトリエトキシシラン（ＰＨＳ）又は２−［メトキシ（ポリ−エチレノキシ）プロピル］トリメトキシシラン（ＰＥＧシラン５５０）を含む。
【００３７】
製造方法
ある実施形態では、本発明は、ＣＴ用途において上述のタイプの造影剤のいずれか又はすべてを製造する方法に関する。
【００３８】
かかる方法は、（ａ）タンタルを含む第１の前駆体材料を用意する段階と、（ｂ）第１の前駆体材料から、タンタルを非ゼロ価状態で含む活性コアを形成する段階と、（ｃ）第２の前駆体材料を用意する段階と、（ｄ）第２の前駆体材料から不活性シェルを形成する段階であって、不活性シェルはコア及びシェルがコア／シェル型ナノ粒子を形成するようにしてコアの周囲に配置される段階とを含んでなる。ある実施形態では、不活性シェルは第２の前駆体材料から導かれる水溶性材料を含む。別法として又は併せて、ある実施形態では、かかる方法はさらにナノ粒子の平均粒径を調節する段階を含んでいる。
【００３９】
段階の順序及び／又は組合せを変化させ得ることが理解されよう。即ち、ある実施形態に従えば、段階（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を順次段階として実施することで活性コア及び第２の前駆体からナノ粒子が形成される。限定ではなく例示を目的として述べれば、ある実施形態では、第１の前駆体はタンタルを非ゼロ価状態で含み、コアは同じ非ゼロ価状態でタンタルの酸化物を含み、段階（ｂ）は第１の前駆体の加水分解を含む。ある実施形態では、第１の前駆体はタンタルの塩（例えば、アルコキシド又はハロゲン化物）を含み、加水分解は第１の前駆体、酸、及び水又は水類似体（例えば、酸化重水素）をアルコール溶媒中で混合すれば進行する。水又は水類似体は加水分解を開始させる。酸とタンタルとのモル比を選択することでナノ粒子コアの粒度を調節できる。ある実施形態に従えば、コアがタンタルの酸化物を含む場合、Ｓｉ−Ｏ結合を介してコアにケイ素含有材料が結合される。ある実施形態に従えば、シロキサンは重合性の基を含むが、これに限定されるものではない。重合は、酸で誘発される縮合重合によって進行し得る。別法として、ある実施形態に従えば、コア上にポリマーを物理吸着させることができる。上述の実施形態のいずれかに従えば、ポリマーは水溶性かつ生体適合性であり得る。好適なポリマーには、特に限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリメタクリレート、ポリビニルスルフェート、ポリビニルピロリジノン及びこれらの組合せがある。
【００４０】
別法として、ある実施形態に従えば、段階（ａ）及び（ｃ）が同時に実施される結果、段階（ｂ）及び（ｄ）を同時に実施することで第１及び第２の前駆体からナノ粒子が直接に形成される。限定ではなく例示を目的として述べれば、ある実施形態に従えば、第１の前駆体はタンタルをゼロ価状態で含み、コアはタンタルの酸化物であり、段階（ｂ）及び（ｄ）は一緒になって第１及び第２の前駆体を塩基性水溶液に添加する段階を含む。ある実施形態に従えば、塩基性溶液は約９以上のｐＨを有する。例えば段階（ａ）及び（ｃ）を組み合わせることによる同一段階でのコア及びシェルの同時形成は、意外な発見である。さらに、本発明者らは意外にも、例えばこの直接製法を用いて非金属コアの周囲に配置されたリガンド系シェルを形成するため、金属ナノ粒子に関して公知の交換反応（例えば、金ナノ粒子上へのクエン酸シェル形成に関与する反応）が使用できることを発見した。シェルがリガンドを含む場合、第１の前駆体はリガンド試薬を含み得る。例えば、リガンドがクエン酸イオンのようなカルボン酸陰イオンである場合、リガンド試薬は関連するカルボン酸である。好適な代替リガンド試薬には、特に限定されないが、糖、アルコール、ポリアルデヒド及びこれらの組合せがある。グルコースは、非常に小さいナノ粒子の製造を可能にする例である。他の好適な試薬には、特に限定されないが、グリコール酸及びリンゴ酸がある。ある実施形態に従えば、ナノ粒子の粒径はリガンドの正体及び／又は量の選択によって調節される。
【００４１】
上述の実施形態のいずれかと組み合わせて、ある実施形態では、Ｘ線／コンピュータ断層撮影用製剤（例えば、複数の造影剤を含むもの）の製造方法は、コア／シェル型ナノ粒子の集合体を形成する段階を含む。この場合、集合体の平均粒径は約１０ｎｍ以下、さらに普通には約７ｎｍ以下、最も普通には約６ｎｍ以下である。ある実施形態では、平均粒径は約３ｎｍ以下である。ある実施形態に従えば、平均粒径は集合体中のナノ粒子を哺乳類の腎臓（例えば、ヒトの腎臓）によって微粒子状態で実質的に排出可能とするように選択されることが理解されよう。
【００４２】
集合体の平均粒径は、溶解状態のナノ粒子の粒度分布を調節するために適した任意の技法を用いて調節できる。したがって、ある実施形態では、上述の集合体を形成する段階は、溶解状態の原料集合体を粒度の異なる２以上の母集団に分けるプロセスに原料集合体を通過させる分別段階を含んでいる。例えば各種の濾過プロセスを含め、いくつかの好適な分別技法が当技術分野で知られている。粒子含有流体を（例えば、遠心力その他の手段によって生じるような）加圧力の下でフィルター膜に向けて直接に押しやる通常濾過が普通の技法である。別の好適な技法は、流れの一部を膜に通過させるために役立つ圧力を加えながら、膜の表面に沿って流体を接線方向にポンプ輸送する接線流濾過である。この技法では、通常濾過の場合と異なり、保持された大きい粒子が膜の表面に蓄積することなく接線流によって掃去される。このような掃去効果は、極めて微粒子状の集合体の効率的な粒度ベース分離を達成する点でしばしば有利である。好適な技法の別の例はダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）であり、これは濾液が除去されるに従ってプロセス流に緩衝液を添加する接線流濾過プロセスの一種である。当業者はこれらのプロセスに精通しており、それを使用してナノ粒子集合体の所望粒度分布を得る方法にも精通している。ある実施形態では、原料ナノ粒子集合体を分別することで、上述の範囲のいずれかに従った平均粒径を有するナノ粒子の生成物集合体が得られる。
【００４３】
ある実施形態では、Ｘ線／コンピュータ断層撮影用製剤を精製することで、製剤の性能を妨害し又はその他のやり方で低下させることがある望ましくない化学種が除去される。この目的には透析のような技法が好適である。さらに、ダイアフィルトレーションのような技法が１つの処理段階でナノ粒子溶液を効果的に精製及び分別することが証明されている。例えば、Ｓｗｅｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６，ｖｏｌ．１２８，ｐｐ ３１９０−３１９７を参照されたい。
【００４４】
使用方法
ある実施形態では、本発明は、ＣＴ用途において上述のタイプの造影剤のいずれか又はすべてを使用する方法に関する。図３について述べれば、かかる方法は、通例、（段階３０１）活性コンピュータ断層撮影用造影剤材料を含むコア／シェル型ナノ粒子であって、各コア／シェル型ナノ粒子はナノ粒子コアとナノ粒子コアの周囲に配置されたナノシェルとを含むコア／シェル型ナノ粒子の所定量を用意する段階と、（段階３０２）コア／シェル型ナノ粒子を哺乳類被検体に投与する段階と、（段階３０３）コア／シェル型ナノ粒子が造影剤として役立つように、コンピュータ断層撮影に従って被検体にＸ線を照射する段階とを含んでいる。多くのかかる実施形態では、かかるコア／シェル型ナノ粒子はさらにターゲティング剤を含んでいる結果、造影剤を被検体の身体の特定疾患部位に対してターゲティングすることができる。ある実施形態では、上述のコア／シェル型ナノ粒子は、血液中に残存し得る限りにおいて血液プール剤である。
【００４５】
上述の造影剤を使用するための上述した方法では、コア／シェル型ナノ粒子は、一般に約５ハウンスフィールド単位以上で約５０００ハウンスフィールド単位以下、さらに詳しくは約１００ハウンスフィールド単位以上で約５０００ハウンスフィールド単位以下のＣＴ信号を与える。
【実施例】
【００４６】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を実証するために示す。当業者には、以下の実施例で開示される方法は単に本発明の例示的な実施形態を表すにすぎないことが理解されるはずである。しかし当業者であれば、本明細書の開示内容を参考にすることで、本発明の技術思想及び技術的範囲を逸脱することなく、ここに記載された特定の実施形態に対して数多くの変更を加えることができ、それでも同等又は同様な結果が得られることが理解されるはずである。
【００４７】
実施例１
この実施例は、本発明のある実施形態に従い、ＣＴ用造影剤をいかにして製造できるかを例示するために役立つ。この特定の実施例では、酸化タンタルの活性コアにポリマーの不活性シェルが結合される。さらに、この特定の実施例では、シェルはコアを形成した後にコアの周囲に形成される。
【００４８】
この実施例は、Ｘ線イメージング用のＴａ2Ｏ5ナノ粒子の製造を例示する。窒素下において３４ｍｌのｎ−プロパノール、０．４４ｍｌのイソ酪酸及び０．５ｍｌの酸化重水素を記載の順序で混合し、室温で３０分間撹拌した。タンタルエトキシド（１．８７ｇ）を急速にではあるが滴下状態で添加し、窒素下で撹拌を１８時間続けた。タンタルエトキシドはＴａ(Ｖ)、即ち非ゼロ価状態である＋５価状態のタンタルを含んでいる。２−［メトキシ（ポリ−エチレノキシ）プロピル］トリメトキシシラン（ＰＥＧシラン５５０、４．８３２ｇ）を４０ｍｌのｎ−プロパノール溶液として撹拌混合物に添加し、反応物を空気中で１時間還流させた。室温に冷却した後、ＨＣｌ（１２５μｌ、０．１Ｍ）を添加し、反応物を一晩撹拌した。脱イオン水（４０ｍｌ）を添加し、混合物を撹拌し、次いですべての揮発分を除去して透明で無色乃至わずかに黄色のゲル状生成物を得た。静脈内注射用としてナノ粒子を精製するため、生成物を脱イオン水中に可溶化し、１００ｎｍの膜で濾過した。水中で１２時間の透析（３５００〜８０００ＭＷＣＯの透析チューブ）を行い、１００ｎｍで濾過し、次いで凍結乾燥によって水を除去することで、約２２％ｗｔ／ｗｔのタンタルを含むオフホワイトの沈殿を得た。食塩水（０．９％ＮａＣｌ）を用いて１．８Ｍという高いタンタル濃度の溶液を調製した。
【００４９】
図４は、この実施例に従って製造したナノ粒子の集合体について、通常のＤＬＳで測定した粒径分布を示しており、集合体の平均粒径が７ｎｍであることを表している。図５は、この実施例に従って製造したナノ粒子のＴＥＭ画像を示している。
【００５０】
実施例２
この実施例は、本発明のある実施形態に従い、ＣＴ用造影剤をいかにして製造できるかを例示するために役立つ。この特定の実施例では、酸化タンタルの活性コアにポリマーの不活性シェルが結合される。さらに、この特定の実施例では、シェルはコアを形成した後にコアの周囲に形成される。
【００５１】
この実施例は、Ｘ線イメージング用のＴａ2Ｏ5ナノ粒子の製造を例示する。窒素下において３４ｍｌのｎ−プロパノール、０．４４ｍｌのイソ酪酸及び０．５ｍｌの酸化重水素を記載の順序で混合し、室温で３０分間撹拌した。タンタルエトキシド（１．８７ｇ）を急速にではあるが滴下状態で添加し、窒素下で撹拌を１８時間続けた。タンタルエトキシドはＴａ(Ｖ)、即ち非ゼロ価状態である＋５価状態のタンタルを含んでいる。次に、ジエチルホスファトエチルトリエトキシシラン（ＰＨＳ、３ｇ）を４０ｍｌのｎ−プロパノール溶液として混合物に添加し、反応物を空気中で１．５時間還流させた。室温に冷却した後、水酸化アンモニウム（２５０μｌ、０．１Ｍ）を添加し、反応物を一晩撹拌した。次に、脱イオン水（４０ｍｌ）を撹拌しながら反応物に添加し、次いで塩酸（１０ｍｌ、１．２Ｍ）を添加し、５０℃で２日間反応させた。冷却後、反応物を水酸化アンモニウムでｐＨ約７〜８に中和し、１００ｎｍの膜で濾過した。すべての揮発分を除去して生成物を得た。静脈内注射用としてナノ粒子を精製するため、生成物を脱イオン水（ｐＨ７．５〜８）中に可溶化し、１００ｎｍの膜で濾過し、水中で１２時間透析し（３５００〜８０００ＭＷＣＯの透析チューブ）、凍結乾燥することで、約３０％ｗｔ／ｗｔのタンタルを含む純白の沈殿を得た。ＩＲ（ヌジョールマル，ＮａＣｌ板，ｃｍ-1）：１４５４（非常に強い），１４１３（弱い），１３７６（強い），１２９６（弱い），１２７４（弱い），１２１８（強い），１１７０（中位），１０２９（非常に強い），９６４（非常に強い），７８２（中位）。ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：31Ｐ，３７．４（広い）；1Ｈ（広がり共鳴），４．１６，１．８８，１．３７，０．８５。
【００５２】
実施例３
この実施例は、本発明のある実施形態に従い、ＣＴ用造影剤をいかにして製造できるかを例示するために役立つ。この特定の実施例では、酸化タンタルの活性コアにクエン酸リガンドの不活性シェルが結合される。さらに、この特定の実施例では、シェルはコアと一緒に形成される。
【００５３】
この実施例では、タンタル粉末（３２５メッシュ、Ａｌｄｒｉｃｈ社）からのＴａ2Ｏ5ナノ粒子の直接製造が記載される。タンタル粉末はＴａ(０)、即ちゼロ価状態のタンタルを含んでいた。２０ｍｌの３０％過酸化水素及び５ｍｌの水酸化アンモニウム溶液（水中の２８〜３０％ＮＨ3）を混合することで溶液を調製した。二つ口フラスコ内においてこれらを窒素下で混合し、氷浴で冷却した。続いて、Ｔａ粉末（５ｍｍｏｌ、０．９０７ｇ）の添加を行い、混合物を２時間撹拌した（小規模では磁気撹拌を使用できるが、大規模では機械的撹拌機の方が適当であり得る）。次いで、クエン酸（１５ｍｍｏｌ、３．１５２ｇ）を添加し、フラスコに凝縮器を取り付けた。スラリーを８０℃で１８時間加熱した。次いで、反応物を放冷し、残留するタンタル粉末を中位グレードガラスフリットで濾別した。濾液をロトエバポレーションによる水の除去で濃縮した。次いで、残った着色溶液をｐＨ７．２に緩衝した水溶液中において３．５Ｋカットオフで透析した。得られた溶液をナノ粒子について分析した。所望ならば、ナノ粒子を凍結乾燥によって単離してもよい。
【００５４】
図６は、この実施例に従って製造したナノ粒子の集合体について、通常のＤＬＳで測定した粒径分布を示しており、集合体の平均粒径が７ｎｍであることを表している。図７は、この実施例に従って製造したナノ粒子のＴＥＭ画像を示している。
【００５５】
実施例４
この実施例は、本発明のある実施形態に従い、ＣＴ用造影剤をいかにして使用できるかを例示するために役立つ。この特定の実施例では、活性コア／不活性シェル型ナノ粒子に関する細胞生存度試験により、試験期間にわたって細胞生存度がほとんど低下しないことが実証される。
【００５６】
ＴＨＰ１単球（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−７１）をＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＢＳ培地で１×１０6細胞／ｍＬの最終密度に希釈し、５００μＬの細胞を２４ウェルプレートの各ウェル内にアリコート化した。無菌濾過した酸化タンタルナノ粒子（１００ｍＭ Ｔａ）をピペットでウェルに加えた。対照ウェルについては、５０μＬの無菌０．９％食塩水（陰性対照）又は８０μＬの３０％過酸化水素（陽性対照）を細胞に添加した。添加後、プレートを静かに渦動させ、標準条件（３７℃、５％二酸化炭素、１００％湿度）下で細胞を培養した。
【００５７】
インキュベーション後、細胞をピペットで遠心管に移し、２０℃で５分間３００×ｇで遠心し、培地を静かに吸引して除去した。細胞を５００μＬの１Ｘ ＰＢＳで洗浄し、静かに渦動させ、２０℃で５分間３００×ｇで遠心した。細胞を洗浄し、緩衝液を静かに吸引して除去した。製造者のプロトコル（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ＦＬＵＯＳキット、Ｒｏｃｈｅ社）に従い、（インキュベーション緩衝液、アネキシンＶ−フルオレセイン及びヨウ化プロピジウムを含む）Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ＦＬＵＯＳアッセイ緩衝液を調製し、１００μＬを各管に加えた。細胞を含む管を静かに渦動させ、室温で１５分間インキュベートした。さらに３００μＬのインキュベーション緩衝液を各管に加えた後、フローサイトメトリー分析を行った。
【００５８】
アネキシンＶ−フルオレセインのみに対して陽性（アポトーシス細胞）、アネキシンＶ−フルオレセイン及びヨウ化プロピジウムに対して陽性（壊死細胞）、並びに両方に対して陰性（生細胞）である細胞の数を測定した。
【００５９】
図８について述べれば、０．１ｍＭまでのＴａを含むすべての酸化タンタル製剤が示すアポトーシス細胞又は壊死細胞の数は無視できる程度であり、ナノ粒子への３時間の暴露後における細胞生存度の低下はないことを表している。
【００６０】
実施例５
この実施例は、本発明のある実施形態に従い、ＣＴ用造影剤をいかにして使用できるかを例示するために役立つ。この特定の実施例では、活性コア／不活性シェル型ナノ粒子の補体活性化試験により、未処理血清又は食塩水処理血清に比べてＣ３ａの目立った増加はないことが実証される。
【００６１】
ヒトの血漿及び血清を販売業者（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ社）から購入した。血清を単離するため、全血を血清管内に吸い込み、室温で３０〜４５分間凝固させた。試料を２０００×ｇで１０分間遠心し、直ちに血清を−７０℃で凍結した。試料をドライアイス上で一晩輸送し、−７０℃で貯蔵した。
【００６２】
血清を水浴中において３７℃で数分間融解した。２５０μＬの血清を２４ウェルプレートの個々のウェルに加えた。無菌の試験試料（Ｔａ剤、食塩水及びコブラ毒因子）を血清に加えて３００μＬの最終体積にした。２４ウェルプレートをインキュベーター（３７℃）に移し、時々撹拌しながら３０分間インキュベートした。
【００６３】
図９について述べれば、製造者のプロトコル（Ｃ３ａアッセイ、Ｑｕｉｄｅｌ社）に従い、原液及び希釈液を調製してＣ３ａ標準曲線及び高／低Ｃ３ａ試料を作成した。
【００６４】
３０分のインキュベーション後にＣ３ａ産生を停止させるため、３７．５ｍＭのクエン酸ナトリウムを各ウェルに加え、０．５μＬの血清（試験試料を含むもの及び含まないもの）をエッペンドルフ管中の１．５ｍＬのキット試料緩衝液に移した。管を静かに３回転倒させて血清及び試料緩衝液を混合し、次いで１００μＬの希釈血清をＣ３ａ試験ストリップの個々のウェルに加え、室温で６０分間インキュベートした。ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄した（１回当たり２００μＬの洗浄緩衝液、ウェル内に洗浄緩衝液を１回当たり１分間）。１００μＬのＣ３ａコンジュゲート溶液を添加し、得られた混合物を室温で６０分間インキュベートした。洗浄プロトコル（３回洗浄、１回当たり２００μＬの洗浄緩衝液、ウェル内に洗浄緩衝液を１回当たり１分間）を繰り返し、次いで１００μＬの基質を各ウェルに加えた。１５分間インキュベートした後、１００μＬの停止溶液を加え、９６ウェルＵＶプレートリーダー上で４５０ｎｍの吸光度を測定した。Ｃ３ａレベルをＣ３ａ標準曲線から計算した。
【００６５】
図１０は、分析から得られたデータを示している。詳しくは、図１０は、ＰＥＧシェル、ＥＤＴＡシェル、クエン酸シェル及びグルコースシェルの各々を有する酸化タンタルコアを血清中でインキュベートすることで得られた試験データを示している。一部の化合物（Ｔａ ＥＤＴＡ）はＣ３ａレベルを低下させたものの、未処理血清又は食塩水処理血清に比べてＣ３ａの増加を示したものはない。１００ｍＭまでのＴａの添加によるＣ３ａレベルの顕著な増加は認められない。全Ｔａ含有量を求めるためには、ＩＣＰ−ＭＳによる元素分析を使用した。
【００６６】
実施例６
この実施例は、本発明のある実施形態に従い、コントラストを増強するためにコア／シェル型ナノ粒子系のＣＴ用造影剤をいかにして使用できるかをさらに例示するために役立つ。
【００６７】
すべてのイメージング試験は、８ｋＶ及び取得時間４分のパラメーターを用いるＥＸｐｌｏｒｅ ＬｏｃｕｓマイクロＣＴイメージングシステム上で実施した。
【００６８】
体重約１６０ｇの雌のＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉラットをケタミン／ジアゼパムのＩＰ注射で麻酔した。ＩＶカテーテル（２４ゲージ）を尾静脈内に配置し、２００μＬの無菌食塩水でフラッシュした。次いで、マイクロＣＴ上でリブケージの基底から膀胱までラットを撮影した（注射前スキャン）。スキャンの直後、カテーテルを通して１ｍＬの２１０ｍｇ Ｔａ／ｍＬ酸化タンタル−ＰＥＧ５５０造影剤をラットに注射し、前回のスキャンの完了後にスキャンした。
【００６９】
図１２について述べれば、最大強度投影を用いて１／２解像度で画像を再構成して観察した。注射直後、腹部大動脈、大静脈及び腎動脈にコントラストが認められた。注射後１４分以内に、造影剤は（膀胱に排出されるので）腎臓及び尿管に認められた。膀胱のコントラストは、注射後２３分以内に顕著となった。やはり図１２について述べれば、ＣＴイメージング試験は６〜１４分の血中クリアランスを示し、次いで３０分以内に膀胱への腎排出を示している。
【００７０】
注射後６０分間にわたってラットを撮影し、次いでケージに戻した。２４時間後、ラットを再び撮影したが、膀胱又は腎臓に残留コントラストは認められなかった。注射したラットにいかなる副作用も認められなかった。
【００７１】
図１１は、Ｔａ2Ｏ5及びＰＥＧシェルを含むナノ粒子を用いてマイクロＣＴイメージングで得られた腹部大動脈画像を示している。
【００７２】
実施例７
この実施例は、本発明のある実施形態に従い、コア／シェル型ナノ粒子の集合体の平均粒径を濾過によりいかにして調節できるかをさらに例示するために役立つ。さらに、この実施例では、様々な粒度の溶液を実験室用ラット被検体に投与した。
【００７３】
大きい酸化タンタル粒子を除去する方法として、通常濾過（ＮＦ）モードで１００ｎｍ又は２０ｎｍの膜フィルターを使用する代わりに、接線流濾過（ＴＦＦ）を使用した。大きいナノ粒子を除去するためのＴＦＦプロセスでは、１００ｋＤ〜１０ｋＤの範囲内のＴＦＦ適合性分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）フィルターを使用した。記載範囲（１００ｋＤ〜１０ｋＤ ＭＷＣＯ）のフィルターの透過液（ｐｅｒｍｅａｔｅ）は小さい酸化タンタルナノ粒子を含んでいた。
【００７４】
低分子量不純物、塩などを除去することで前記透過液中の小さい酸化タンタルナノ粒子を精製するための方法としても、透析の代わりにＴＦＦを使用した。不純物を除去するためのＴＦＦプロセスでは、１０ｋＤ〜５ｋＤの範囲内の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）フィルターを使用した。記載範囲（１０ｋＤ〜５ｋＤ ＭＷＣＯ）のフィルターの保留液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）は、精製された小さい酸化タンタルナノ粒子を含んでいた。
【００７５】
さらに、順次段階で酸化タンタルナノ粒子を粒度分別及び精製するための方法としてＴＦＦを使用した。例えば、３０ｋＤ ＭＷＣＯフィルターを用いるＴＦＦで多分散酸化タンタルナノ粒子を処理することで、約６ｎｍの粒子を保留する（保留液）と共に約３ｎｍの粒子を通過させた（透過液）。次いで、約３ｎｍの粒子を含む透過液は、１０ｋＤ又は５ｋＤ ＭＷＣＯフィルターを用いるＴＦＦプロセスでは保留液として作用した。
【００７６】
ＴＦＦは、通常濾過（膜濾過又は遠心濾過）技法と透析技法との組合せで達成できるよりも高い純度で選択粒度のナノ粒子を製造するための効率的でスケーラブルな方法である。
【００７７】
上述した方法に従って相異なる公称平均粒度（２０ｎｍ、６ｎｍ及び３ｎｍ）をそれぞれ有する３種のナノ粒子溶液を調製し、同一用量レベルで実験室用ラット被検体に投与した。所定の時間後、ラットの腎臓を分析して（ｍｇ Ｔａ／ｇ腎臓試料として算出される）保持粒子の濃度を求めた。結果は、粒子クリアランスが平均粒度の強い関数であることを表している。腎臓に関しては、６ｎｍ粒子の濃度は２０ｎｍ粒子の濃度より約２０％低く、３ｎｍ粒子の濃度は２０ｎｍ粒子の濃度より約５０％低かった。
【００７８】
上述の実施形態に関して上記に記載した構造、機能及び動作の一部は本発明を実施する上で必須ではなく、例示的な実施形態を十分に説明するためにのみ示されていることが理解されよう。さらに、上記に引用した特許や刊行物の特定の構造、機能及び動作は本発明と組み合わせて実施できるものの、これらは本発明を実施する上で必須ではないことも理解されよう。さらに、特記しない限り、方法の複数の段階は、特に限定されないが同時に実施することを含め、任意の組合せ及び／又は順序で実施できることも理解されよう。したがって本発明は、請求の範囲で定義される本発明の技術思想及び技術的範囲から実際に逸脱することなく、上記に記載したのとは異なるやり方で実施できることを理解すべきである。
【符号の説明】
【００７９】
１００ コア／シェル型ナノ粒子
１０１ ナノ粒子コア
１０２ ナノシェル
２００ コア／シェル型ナノ粒子
２０１ 活性ナノ粒子コア
２０２ 不活性ナノシェル
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にはＸ線／コンピュータ断層撮影で使用するための造影剤に関し、さらに詳しくはナノ粒子系造影剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヨウ素化安息香酸誘導体は、静脈内ヨウ素注射に伴うリスクファクターや副作用にもかかわらず、標準的なＸ線／コンピュータ断層撮影（ＣＴ）用造影剤として使用され続けている。さらに、かかる標準的なＣＴ用造影剤は通例低分子量であり、人体から非常に急速に消失することが知られており、したがってこれらの造影剤を疾患部位に対してターゲティングすることは難しい（Ｓｈｉ−Ｂａｏ Ｙｕ ａｎｄ Ａｌａｎ Ｄ．Ｗａｔｓｏｎ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９９，９９，２３５３−２３７７）。
【０００３】
文献には、ＣＴイメージング用のガドリニウム（Ｇｄ）又はヨウ素（Ｉ）を含む実験的ナノ粒子系が記載されている。しかし、かかる系では、標的組織又はその近傍まで送達され得る重原子は比較的少数でしかない。かかるアプローチには、ヨウ素化分子をリポソームに封入するリポソームアプローチ（Ｌｅｉｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｒａｄｉｏｌ．２００１，３６（６），３０３−３０８）、並びにＧ−４ Ｓｔａｒｂｕｒｓｔ（登録商標）ポリアミドアミド（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーにヨウ素原子をコンジュゲートする樹枝状アプローチ（Ｙｏｒｄａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００２，２（６），５９５−５９９）がある。いずれのアプローチでも、せいぜい２〜３百個の重金属（即ち、ガドリニウム）原子が送達されるにすぎない。
【０００４】
送達される重金属原子を増やす試みとして、かかる重金属のナノ粒子を使用するものがあった。国際公開第０３／０７５９６１号及び同第２００５／０５１４３５号を参照されたい。元素態（ゼロ価）金属種のナノ粒子は最も高い密度（重金属原子の数／体積）を有するものの、確実な合成や酸化による不安定性などに問題がある。金のような不活性金属のナノ粒子（例えば、国際公開第０３／０７５９６１号に記載されたもの）では、これらの問題を解決できるが、費用効果があまりよくない。
【０００５】
国際公開第０７／０５５９９５号（Ｂｏｎｉｔａｔｅｂｕｓ ｅｔ ａｌ．）には、ナノ粒子コア及びナノ粒子シェルの少なくとも一方が活性造影剤材料を含むコア／シェル型ナノ粒子が記載されている。
【０００６】
以上の点から、新規ＣＴ用造影剤、特に確実な合成、コスト削減、画像コントラスト増強、血中半減期の増大、毒性の低下、放射線量の減少及びターゲティング能力の１以上の点で性能の向上及び利益をもたらすことができる造影剤に対するニーズが存在し続けている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０３／０７５９６１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００５／０５１４３５号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０７／０５５９９５号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０３／０１６２１７号パンフレット
【特許文献５】米国特許第５９８９５８０号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｈｉ−Ｂａｏ Ｙｕ ａｎｄ Ａｌａｎ Ｄ．Ｗａｔｓｏｎ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９９，９９，２３５３−２３７７．
【非特許文献２】Ｌｅｉｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｒａｄｉｏｌ．２００１，３６（６），３０３−３０８．
【非特許文献３】Ｙｏｒｄａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００２，２（６），５９５−５９９．
【非特許文献４】Ｃｈａｎ Ｄ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｎｔａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１９９９，１５（３），２１９−２２２．
【非特許文献５】Ｉｗａｓａｋｉ，Ｋｅｎｔａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｙ Ｂ，２００４，１０８（３２），１１９４６−１１９５２．
【非特許文献６】Ｗａｎｇ，Ｃｈｕｎ ｅｔ ａｌ．，ＣｏｌｌｏｉｄｓａｎｄＳｕｒｆａｃｅｓ，Ｂ：Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，２００５，４６（４），２５５−２６０．
【非特許文献７】Ｋａｎｎａｎ，Ｂａｌａｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖａｃｕｕｍ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂ：Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｍｅｔｅｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ−−Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ，ａｎｄ Ｐｈｅｎｏｍｅｎａ，２００５，２３（４），１３６４−１３７０．
【非特許文献８】Ｐａｐｒａ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．ＵＳＡ，２００１，１７（５），１４５７−１４６０．
【非特許文献９】Ａｇｒａｗａｌ Ｍｕｋｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ：Ｔｈｅ ＡＣＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅｓ ａｎｄ Ｃｏｌｌｏｉｄｓ，２００８，２４（３），１０１３−１０１８．
【非特許文献１０】Ａｎｔａｌｅｋ，Ｂｒｉａｎ，Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，Ｐａｒｔ Ａ：Ｂｒｉｄｇｉｎｇ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００７，３０Ａ（５），２１９−２３５．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は一般に、ナノ粒子コアとナノ粒子コアの周囲に配置されたナノシェルとを含んでなるコア／シェル型ナノ粒子であって、凝集体においてナノ粒子コア及びナノシェルがＸ線イメージング（特にコンピュータ断層撮影（ＣＴ）イメージング）時に造影剤として機能し得るコア／シェル型ナノ粒子を形成するようなものに関する。
【００１０】
本発明は、タンタル（Ｔａ）を非ゼロ価状態で含む能動ナノ粒子コアと、ナノ粒子コアの周囲に配置された受動ナノシェルとを含んでなる造影剤であって、凝集体において能動ナノ粒子コア及び受動ナノシェルがＣＴイメージング時に造影剤として機能し得るコア／シェル型ナノ粒子を形成するような造影剤に関する。
【００１１】
ある実施形態では、Ｘ線／コンピュータ断層撮影用造影液が本明細書中に記載される実施形態のいずれかに係る造影剤の集合体（ｅｎｓｅｍｂｌｅ）を含んでなり、集合体の平均粒径は約１０ｎｍ以下、好ましくは約３ｎｍ以下である。
【００１２】
ある実施形態では、本発明は上述の造影剤のいずれかを製造する方法に関する。ある実施形態では、本発明はＣＴにおけるかかる造影剤の使用方法に関する。
【００１３】
ある実施形態では、本発明は、Ｘ線／コンピュータ断層撮影用造影剤の製造方法であって、タンタルを含む第１の前駆体材料を用意する段階と、第１の前駆体材料から、タンタルを非ゼロ価状態で含む活性コアを形成する段階と、第２の前駆体材料を用意する段階と、第２の前駆体材料から不活性シェルを形成する段階であって、不活性シェルはコア及びシェルがコア／シェル型ナノ粒子を形成するようにしてコアの周囲に配置される段階とを含んでなる方法に関する。
【００１４】
本発明は、ナノ粒子アプローチを使用することで、比較的多数の高密度で高減衰性のタンタル原子を分子状態で送達してＣＴのコントラスト増強を向上させる。ある実施形態では、本発明はＣＴ造影剤による特定疾患部位のターゲティングを可能にする。ある実施形態では、本発明はマクロファージによるＣＴ用造影剤の取込みを可能にする。ある実施形態では、本発明は血中半減期の増大したＣＴ用造影剤を提供する。
【００１５】
以上、本発明の以下の詳細な説明を理解しやすくするため、本発明の特徴をむしろ大まかに略述した。本発明の請求の範囲の主題を構成する本発明のさらなる特徴や利点については、以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明及びその利点を一層完全に理解できるように、以下、図面を参照しながら本発明を説明する。
【図１】図１は、構成部分間の関係を示すためコア／シェル型ナノ粒子を一般に示す断面図である。
【図２】図２は、本発明に従って活性コアと不活性シェルとを含むコア／シェル型ナノ粒子の断面図である。
【図３】図３は、本発明のある実施形態に従ってコア／シェル型ナノ粒子をコンピュータ断層撮影用造影剤として使用する方法を流れ図で示す。
【図４】図４は、本発明のある実施形態に従って酸化タンタルコアとポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーシェルとを含む活性コア／不活性シェル型ナノ粒子の集合体の粒径分布をプロットしたグラフである。
【図５】図５は、本発明のある実施形態に従って酸化タンタルとＰＥＧポリマーシェルとを含む活性コア／不活性シェル型ナノ粒子のＴＥＭ画像である。
【図６】図６は、本発明のある実施形態に従って酸化タンタルコアとクエン酸リガンドシェルとを含む活性コア／不活性シェル型ナノ粒子の集合体の粒径分布をプロットしたグラフである。
【図７】図７は、本発明のある実施形態に従って酸化タンタルコアとクエン酸リガンドシェルとを含む活性コア／不活性シェル型ナノ粒子のＴＥＭ画像である。
【図８】図８は、酸化タンタルコアとＰＥＧポリマーシェルとを含む活性コア／不活性シェル型ナノ粒子及び酸化タンタルコアとクエン酸リガンドシェルとを含む活性コア／不活性シェル型ナノ粒子に関し、生細胞の百分率をタンタルのモル量に対してプロットしたグラフである。
【図９】図９は、本発明のある実施形態に従って溶液中のＣ３ａを検出するためのＣ３ａ標準曲線をプロットしたグラフである。
【図１０】図１０は、本発明のある実施形態に従って酸化タンタルコアとグルコースシェル、ＥＤＴＡシェル及びＰＥＧシェルの各々とを含む活性コア／不活性シェル型ナノ粒子並びに各種の対照品に関するＣ３ａの棒グラフである。
【図１１】図１１は、本発明のある実施形態に従って酸化タンタルコアとＰＥＧシェルとを含む活性コア／不活性シェル型ナノ粒子を注射したラットのコンピュータ断層撮影画像である。
【図１２】図１２は、本発明のある実施形態に従って酸化タンタルコアとＰＥＧシェルとを含む活性コア／不活性シェル型ナノ粒子を注射したラットの様々な時点における一連のコンピュータ断層撮影画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は一般に、ナノ粒子コアとナノ粒子コアの周囲に配置されたナノシェルとを含んでなるコア／シェル型ナノ粒子であって、凝集体においてナノ粒子コア及びナノシェルが特にＣＴに際してＸ線造影剤として機能し得るコア／シェル型ナノ粒子を形成するようなものに関する。
【００１８】
図面全般に関して述べれば、これらの図面は本発明の特定の実施形態を説明する目的で示すものであって、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではないことを理解されたい。
【００１９】
本明細書中で使用する用語の大部分は当業者にとって自明であろうが、本発明の理解を容易にするため、以下の定義を示しておく。しかし、明確に定義されていない場合、各用語は当業者に現在受け入れられている意味をもつものと解釈すべきであることを理解されたい。
【００２０】
本明細書中で定義され、またコンピュータ体軸断層撮影法又はコンピュータ支援断層撮影法（ＣＡＴ）及び体切片Ｘ線撮影法としても知られる「コンピュータ断層撮影法」（「ＣＴ」と略す）は、単一の回転軸に沿って撮影された多数の一連の二次元Ｘ線画像から、デジタル処理を用いて対象物（又は被検体）の内部の三次元画像を生成する断層撮影を用いた医用イメージング方法である。本明細書中ではコンピュータ断層撮影に焦点を合わせて論じるが、当業者であれば、かかる議論が一般にあらゆるタイプのＸ線イメージングに適用可能であることが理解されよう。
【００２１】
本明細書中で定義され、またコントラスト剤としても知られる「造影剤」は、入射するＸ線を有意に減衰させて、検査対象体積を通過するＸ線を低減させることができる材料を含む薬剤である。ＣＴ画像を再構築し、通常の後処理を行った後には、このようなＸ線減衰の増大は検査対象体積の密度の増加として解釈され、その結果、画像中においてはバックグラウンド組織に対して造影剤を含む体積のコントラスト増強が生じる。本明細書中での議論は一般にあらゆる形態のＸ線イメージングに適用可能であるので、本明細書中では本発明の造影剤を一般に「Ｘ線／コンピュータ断層撮影用造影剤」という。この用語は、「コンピュータ断層撮影（ＣＴ）用造影剤」と互換的に使用される。
【００２２】
コア／シェル型ナノ粒子のコア成分及びシェル成分について「活性」及び「不活性」という用語を用いた場合、これらの用語はその成分がＣＴイメージングにおいてコントラスト増強を生み出す能力を意味する。通常のＣＴスキャナーは、約１０〜約１４０ｋｅＶという広いＸ線エネルギースペクトルを使用している。当業者であればわかるように、特定の材料を通過するＸ線の単位長さ当たりの減衰量は線形減衰係数として表される。ＣＴイメージングにおいて典型的なＸ線エネルギースペクトルでは、材料の減衰度は光電吸収効果及びコンプトン散乱効果によって支配される。さらに、線形減衰係数は、入射Ｘ線のエネルギー、材料の密度（モル濃度に関係する）、及び材料の原子番号（Ｚ）の関数であることがよく知られている。異種原子の分子化合物又は混合物については、「有効原子番号」Ｚeffを構成元素の原子番号の関数として計算することができる。化学式が知られている化合物の有効原子番号は、次式で求められる。
【００２３】
【数１】
【００２４】
式中、Ｚkは単体元素の原子番号、Ｐは単体元素の総量、Ｗfkは分子の総分子量に対する単体元素の重量分率（モル濃度に関係する）である。ＣＴイメージングのための入射Ｘ線エネルギーの最適量は撮影対象物のサイズの関数であって、名目値から大きく変動することはないと予測される。また、造影剤材料の線形減衰係数は材料の密度に直線的に依存することも公知である。即ち、材料の密度を増大させたり、或いは造影剤材料のモル濃度を増加させたりすれば、線形減衰係数を増大させることができる。しかし、患者への造影剤材料の注射やそれに付随する有害な効果といった実際的な面から、達成し得るモル濃度には限界がある。したがって、造影剤候補材料を有効原子番号に従って分けるのは合理的である。モル濃度を約５０ｍＭとしたときの典型的なＣＴエネルギースペクトルについての代表的な材料のＣＴコントラスト増強のシミュレーションに基づけば、有効原子番号が３４以上の材料では、約３０ハウンスフィールド単位（ＨＵ）という適切なコントラスト増強、即ち水より３％高いコントラストが得られると推定される。したがって、本発明者らは、ＣＴ用造影剤候補材料を、有効原子番号が３４未満（即ち、Ｚeff＜３４）であれば不活性であり、有効原子番号が３４以上（即ち、Ｚeff≧３４）であれば活性であると定義した。例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅ １．Ｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｐｓｙｃｈｏｐｈｙｓｉｃｓ，Ｅｄｓ．Ｊ．Ｂｅｕｔｅｌ，Ｈ．Ｌ．Ｋｕｎｄｅｌ，Ｒ．Ｌ．Ｖａｎ Ｍｅｔｔｅｒ，ＳＰＩＥ Ｐｒｅｓｓ，２０００の第１章を参照されたい。
【００２５】
本明細書中で定義される「ナノ粒子」は、約１〜約５００ｎｍの平均粒径を有する粒子であり、ナノ粒子コア及びコア／シェル型ナノ粒子凝集体を述べる場合に使用できる。かかるナノ粒子は球状であっても不規則形状であってもよく、特に上記粒度範囲の小さい方の末端では分子錯体と区別される。本明細書中で定義される「ナノシェル」は、コア／シェル型ナノ粒子のシェル領域のことである。かかるナノシェルはナノ粒子コアの周囲に配置されているが、下地であるナノ粒子コアのトポグラフィーに一致する場合としない場合がある。
【００２６】
上述の通り、また図１について述べれば、本発明のある実施形態は、（ａ）ナノ粒子コア１０１と（ｂ）ナノ粒子コアの周囲に配置されたナノシェル１０２とを含んでなる造影剤であって、凝集体においてナノ粒子コア及びナノシェルがコンピュータ断層撮影イメージング（一般にはＸ線イメージング）時に造影剤として機能し得るコア／シェル型ナノ粒子１００を形成するようなものに関する。図１には完全に球形のコア／シェル型ナノ粒子の断面を示してあるが、かかるコア／シェル型ナノ粒子は不規則な形状を有していてもよい。
【００２７】
ある実施形態では、上述の造影剤はさらに１種以上のターゲティング剤を含んでいる。かかるターゲティング剤は、造影剤を被検体の身体の特定疾患部位に対してターゲティングするために有用である。通例、ターゲティング剤は抗体（例えば、ＩｇＧ）又は他のペプチドであるが、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）その他の適当な化学種であってもよい。一般に、ターゲティング剤はナノ粒子コア及びナノ粒子コアの周囲に配置されたナノシェルの一方又は両方に結合される。かかる結合は、通例、特に限定されないが、ペプチド結合、ジスルフィド結合、イソチオ尿素結合、イソ尿素結合、スルホンアミド結合、アミン結合、カルバメート結合、アミジン結合、ホスホラミデート結合、チオエーテル結合、アリールアミン結合、アリールチオエーテル結合、エーテル結合、ヒドラゾン結合、トリアゾール結合、オキシム結合及びこれらの組合せのような結合からなる。例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６の第２章を参照されたい。
【００２８】
ある実施形態では、上述のＣＴ用造影剤は、コア／シェル型ナノ粒子の表面電荷の制御及び／又はマクロファージ取込みを誘起する官能基（例えば、ポリビニルスルフェート）の付与により、マクロファージ取込みのために最適化される。
【００２９】
ＣＴ用造影剤／コントラスト剤として使用するための本明細書中に記載されたコア／シェル型ナノ粒子については、ナノ粒子コアは普通には約１〜約１００ｎｍ、さらに普通には約２〜約８０ｎｍ、最も普通には約２〜約２０ｎｍの平均粒径を有する。ナノ粒子コアの周囲に配置されたナノシェルは、普通には約０．５〜約１００ｎｍの平均厚さを有する。したがって、造影剤のナノ粒子コアとナノシェルとの凝集体は、普通には約２〜約５００ｎｍ、さらに普通には約２〜約１００ｎｍ、最も普通には約３〜約２０ｎｍの平均粒径を有する。
【００３０】
ナノ粒子コア及びナノシェルの凝集体は、哺乳類の腎臓（通例はヒトの腎臓）によって排出可能であるのが望ましい場合があることが理解されよう。したがって、造影剤のナノ粒子コア及びナノシェルの凝集体は、普通には約１〜約２０ｎｍ、さらに普通には約２〜約１２ｎｍ、最も普通には約３〜約８ｎｍの平均粒径を有し得る。
【００３１】
ある実施形態では、Ｘ線／コンピュータ断層撮影用造影剤は、本明細書中に記載される実施形態のいずれかに係る造影剤の集合体を含んでいて、集合体の平均粒径は約１０ｎｍ以下、さらに普通には約７ｎｍ以下、さらに普通には約６ｎｍ以下、最も普通には約３ｎｍ以下である。
【００３２】
活性コア／不活性シェル型ナノ粒子
図２について述べれば、本発明は、ナノ粒子コア２０１とナノ粒子コアの周囲に配置されたナノシェル２０２とを含んでなる造影剤２００であって、凝集体においてナノ粒子コア及びナノシェルがＣＴイメージング時に造影剤として機能し得るコア／シェル型ナノ粒子２００を形成するようなものに関する。
【００３３】
上述のナノ粒子コア２０１を構成する材料は、それがＣＴでコントラストを増強するための活性材料（Ｚeff≧３４）を含み、活性材料は非ゼロ価状態のタンタルからなるという点で限定されている。ナノ粒子コアは、通例、特に限定されないが酸化タンタルのような材料からなっている。限定ではなく例示を目的として述べれば、Ｔａ2Ｏ5に関する有効原子番号（Ｚeff）は約６９である。
【００３４】
ナノシェル２０２を構成する材料は特に限定されないが、一般に活性ＣＴ用造影剤材料からなることはなく（Ｚeff＜３４）、また一般にナノ粒子コアの周囲に配置できなければならない。好適なかかる材料には、特に限定されないが、リガンド、オリゴマー、ポリマー、クラスター、炭水化物種、官能化シリカ及びこれらの組合せがある。例えば、好適なシェル材料には、特に限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリメタクリレート、ポリビニルスルフェート、ポリビニルピロリジノン、クエン酸イオン、リンゴ酸イオン、グリコール酸イオン、シラン及びこれらの組合せがある。
【００３５】
ある実施形態に従えば、ナノシェルを構成する材料は水溶性である。別法として又は併せて、ある実施形態に従えば、ナノシェルを構成する材料は生体適合性である。
【００３６】
ナノシェルは、好ましくはジエチルホスファトエチルトリエトキシシラン（ＰＨＳ）又は２−［メトキシ（ポリ−エチレノキシ）プロピル］トリメトキシシラン（ＰＥＧシラン５５０）を含む。
【００３７】
製造方法
ある実施形態では、本発明は、ＣＴ用途において上述のタイプの造影剤のいずれか又はすべてを製造する方法に関する。
【００３８】
かかる方法は、（ａ）タンタルを含む第１の前駆体材料を用意する段階と、（ｂ）第１の前駆体材料から、タンタルを非ゼロ価状態で含む活性コアを形成する段階と、（ｃ）第２の前駆体材料を用意する段階と、（ｄ）第２の前駆体材料から不活性シェルを形成する段階であって、不活性シェルはコア及びシェルがコア／シェル型ナノ粒子を形成するようにしてコアの周囲に配置される段階とを含んでなる。ある実施形態では、不活性シェルは第２の前駆体材料から導かれる水溶性材料を含む。別法として又は併せて、ある実施形態では、かかる方法はさらにナノ粒子の平均粒径を調節する段階を含んでいる。
【００３９】
段階の順序及び／又は組合せを変化させ得ることが理解されよう。即ち、ある実施形態に従えば、段階（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を順次段階として実施することで活性コア及び第２の前駆体からナノ粒子が形成される。限定ではなく例示を目的として述べれば、ある実施形態では、第１の前駆体はタンタルを非ゼロ価状態で含み、コアは同じ非ゼロ価状態でタンタルの酸化物を含み、段階（ｂ）は第１の前駆体の加水分解を含む。ある実施形態では、第１の前駆体はタンタルの塩（例えば、アルコキシド又はハロゲン化物）を含み、加水分解は第１の前駆体、酸、及び水又は水類似体（例えば、酸化重水素）をアルコール溶媒中で混合すれば進行する。水又は水類似体は加水分解を開始させる。酸とタンタルとのモル比を選択することでナノ粒子コアの粒度を調節できる。ある実施形態に従えば、コアがタンタルの酸化物を含む場合、Ｓｉ−Ｏ結合を介してコアにケイ素含有材料が結合される。ある実施形態に従えば、シロキサンは重合性の基を含むが、これに限定されるものではない。重合は、酸で誘発される縮合重合によって進行し得る。別法として、ある実施形態に従えば、コア上にポリマーを物理吸着させることができる。上述の実施形態のいずれかに従えば、ポリマーは水溶性かつ生体適合性であり得る。好適なポリマーには、特に限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリメタクリレート、ポリビニルスルフェート、ポリビニルピロリジノン及びこれらの組合せがある。
【００４０】
別法として、ある実施形態に従えば、段階（ａ）及び（ｃ）が同時に実施される結果、段階（ｂ）及び（ｄ）を同時に実施することで第１及び第２の前駆体からナノ粒子が直接に形成される。限定ではなく例示を目的として述べれば、ある実施形態に従えば、第１の前駆体はタンタルをゼロ価状態で含み、コアはタンタルの酸化物であり、段階（ｂ）及び（ｄ）は一緒になって第１及び第２の前駆体を塩基性水溶液に添加する段階を含む。ある実施形態に従えば、塩基性溶液は約９以上のｐＨを有する。例えば段階（ａ）及び（ｃ）を組み合わせることによる同一段階でのコア及びシェルの同時形成は、意外な発見である。さらに、本発明者らは意外にも、例えばこの直接製法を用いて非金属コアの周囲に配置されたリガンド系シェルを形成するため、金属ナノ粒子に関して公知の交換反応（例えば、金ナノ粒子上へのクエン酸シェル形成に関与する反応）が使用できることを発見した。シェルがリガンドを含む場合、第１の前駆体はリガンド試薬を含み得る。例えば、リガンドがクエン酸イオンのようなカルボン酸陰イオンである場合、リガンド試薬は関連するカルボン酸である。好適な代替リガンド試薬には、特に限定されないが、糖、アルコール、ポリアルデヒド及びこれらの組合せがある。グルコースは、非常に小さいナノ粒子の製造を可能にする例である。他の好適な試薬には、特に限定されないが、グリコール酸及びリンゴ酸がある。ある実施形態に従えば、ナノ粒子の粒径はリガンドの正体及び／又は量の選択によって調節される。
【００４１】
上述の実施形態のいずれかと組み合わせて、ある実施形態では、Ｘ線／コンピュータ断層撮影用製剤（例えば、複数の造影剤を含むもの）の製造方法は、コア／シェル型ナノ粒子の集合体を形成する段階を含む。この場合、集合体の平均粒径は約１０ｎｍ以下、さらに普通には約７ｎｍ以下、最も普通には約６ｎｍ以下である。ある実施形態では、平均粒径は約３ｎｍ以下である。ある実施形態に従えば、平均粒径は集合体中のナノ粒子を哺乳類の腎臓（例えば、ヒトの腎臓）によって微粒子状態で実質的に排出可能とするように選択されることが理解されよう。
【００４２】
集合体の平均粒径は、溶解状態のナノ粒子の粒度分布を調節するために適した任意の技法を用いて調節できる。したがって、ある実施形態では、上述の集合体を形成する段階は、溶解状態の原料集合体を粒度の異なる２以上の母集団に分けるプロセスに原料集合体を通過させる分別段階を含んでいる。例えば各種の濾過プロセスを含め、いくつかの好適な分別技法が当技術分野で知られている。粒子含有流体を（例えば、遠心力その他の手段によって生じるような）加圧力の下でフィルター膜に向けて直接に押しやる通常濾過が普通の技法である。別の好適な技法は、流れの一部を膜に通過させるために役立つ圧力を加えながら、膜の表面に沿って流体を接線方向にポンプ輸送する接線流濾過である。この技法では、通常濾過の場合と異なり、保持された大きい粒子が膜の表面に蓄積することなく接線流によって掃去される。このような掃去効果は、極めて微粒子状の集合体の効率的な粒度ベース分離を達成する点でしばしば有利である。好適な技法の別の例はダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）であり、これは濾液が除去されるに従ってプロセス流に緩衝液を添加する接線流濾過プロセスの一種である。当業者はこれらのプロセスに精通しており、それを使用してナノ粒子集合体の所望粒度分布を得る方法にも精通している。ある実施形態では、原料ナノ粒子集合体を分別することで、上述の範囲のいずれかに従った平均粒径を有するナノ粒子の生成物集合体が得られる。
【００４３】
ある実施形態では、Ｘ線／コンピュータ断層撮影用製剤を精製することで、製剤の性能を妨害し又はその他のやり方で低下させることがある望ましくない化学種が除去される。この目的には透析のような技法が好適である。さらに、ダイアフィルトレーションのような技法が１つの処理段階でナノ粒子溶液を効果的に精製及び分別することが証明されている。例えば、Ｓｗｅｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６，ｖｏｌ．１２８，ｐｐ ３１９０−３１９７を参照されたい。
【００４４】
使用方法
ある実施形態では、本発明は、ＣＴ用途において上述のタイプの造影剤のいずれか又はすべてを使用する方法に関する。図３について述べれば、かかる方法は、通例、（段階３０１）活性コンピュータ断層撮影用造影剤材料を含むコア／シェル型ナノ粒子であって、各コア／シェル型ナノ粒子はナノ粒子コアとナノ粒子コアの周囲に配置されたナノシェルとを含むコア／シェル型ナノ粒子の所定量を用意する段階と、（段階３０２）コア／シェル型ナノ粒子を哺乳類被検体に投与する段階と、（段階３０３）コア／シェル型ナノ粒子が造影剤として役立つように、コンピュータ断層撮影に従って被検体にＸ線を照射する段階とを含んでいる。多くのかかる実施形態では、かかるコア／シェル型ナノ粒子はさらにターゲティング剤を含んでいる結果、造影剤を被検体の身体の特定疾患部位に対してターゲティングすることができる。ある実施形態では、上述のコア／シェル型ナノ粒子は、血液中に残存し得る限りにおいて血液プール剤である。
【００４５】
上述の造影剤を使用するための上述した方法では、コア／シェル型ナノ粒子は、一般に約５ハウンスフィールド単位以上で約５０００ハウンスフィールド単位以下、さらに詳しくは約１００ハウンスフィールド単位以上で約５０００ハウンスフィールド単位以下のＣＴ信号を与える。
【実施例】
【００４６】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を実証するために示す。当業者には、以下の実施例で開示される方法は単に本発明の例示的な実施形態を表すにすぎないことが理解されるはずである。しかし当業者であれば、本明細書の開示内容を参考にすることで、本発明の技術思想及び技術的範囲を逸脱することなく、ここに記載された特定の実施形態に対して数多くの変更を加えることができ、それでも同等又は同様な結果が得られることが理解されるはずである。
【００４７】
実施例１
この実施例は、本発明のある実施形態に従い、ＣＴ用造影剤をいかにして製造できるかを例示するために役立つ。この特定の実施例では、酸化タンタルの活性コアにポリマーの不活性シェルが結合される。さらに、この特定の実施例では、シェルはコアを形成した後にコアの周囲に形成される。
【００４８】
この実施例は、Ｘ線イメージング用のＴａ2Ｏ5ナノ粒子の製造を例示する。窒素下において３４ｍｌのｎ−プロパノール、０．４４ｍｌのイソ酪酸及び０．５ｍｌの酸化重水素を記載の順序で混合し、室温で３０分間撹拌した。タンタルエトキシド（１．８７ｇ）を急速にではあるが滴下状態で添加し、窒素下で撹拌を１８時間続けた。タンタルエトキシドはＴａ(Ｖ)、即ち非ゼロ価状態である＋５価状態のタンタルを含んでいる。２−［メトキシ（ポリ−エチレノキシ）プロピル］トリメトキシシラン（ＰＥＧシラン５５０、４．８３２ｇ）を４０ｍｌのｎ−プロパノール溶液として撹拌混合物に添加し、反応物を空気中で１時間還流させた。室温に冷却した後、ＨＣｌ（１２５μｌ、０．１Ｍ）を添加し、反応物を一晩撹拌した。脱イオン水（４０ｍｌ）を添加し、混合物を撹拌し、次いですべての揮発分を除去して透明で無色乃至わずかに黄色のゲル状生成物を得た。静脈内注射用としてナノ粒子を精製するため、生成物を脱イオン水中に可溶化し、１００ｎｍの膜で濾過した。水中で１２時間の透析（３５００〜８０００ＭＷＣＯの透析チューブ）を行い、１００ｎｍで濾過し、次いで凍結乾燥によって水を除去することで、約２２％ｗｔ／ｗｔのタンタルを含むオフホワイトの沈殿を得た。食塩水（０．９％ＮａＣｌ）を用いて１．８Ｍという高いタンタル濃度の溶液を調製した。
【００４９】
図４は、この実施例に従って製造したナノ粒子の集合体について、通常のＤＬＳで測定した粒径分布を示しており、集合体の平均粒径が７ｎｍであることを表している。図５は、この実施例に従って製造したナノ粒子のＴＥＭ画像を示している。
【００５０】
実施例２
この実施例は、本発明のある実施形態に従い、ＣＴ用造影剤をいかにして製造できるかを例示するために役立つ。この特定の実施例では、酸化タンタルの活性コアにポリマーの不活性シェルが結合される。さらに、この特定の実施例では、シェルはコアを形成した後にコアの周囲に形成される。
【００５１】
この実施例は、Ｘ線イメージング用のＴａ2Ｏ5ナノ粒子の製造を例示する。窒素下において３４ｍｌのｎ−プロパノール、０．４４ｍｌのイソ酪酸及び０．５ｍｌの酸化重水素を記載の順序で混合し、室温で３０分間撹拌した。タンタルエトキシド（１．８７ｇ）を急速にではあるが滴下状態で添加し、窒素下で撹拌を１８時間続けた。タンタルエトキシドはＴａ(Ｖ)、即ち非ゼロ価状態である＋５価状態のタンタルを含んでいる。次に、ジエチルホスファトエチルトリエトキシシラン（ＰＨＳ、３ｇ）を４０ｍｌのｎ−プロパノール溶液として混合物に添加し、反応物を空気中で１．５時間還流させた。室温に冷却した後、水酸化アンモニウム（２５０μｌ、０．１Ｍ）を添加し、反応物を一晩撹拌した。次に、脱イオン水（４０ｍｌ）を撹拌しながら反応物に添加し、次いで塩酸（１０ｍｌ、１．２Ｍ）を添加し、５０℃で２日間反応させた。冷却後、反応物を水酸化アンモニウムでｐＨ約７〜８に中和し、１００ｎｍの膜で濾過した。すべての揮発分を除去して生成物を得た。静脈内注射用としてナノ粒子を精製するため、生成物を脱イオン水（ｐＨ７．５〜８）中に可溶化し、１００ｎｍの膜で濾過し、水中で１２時間透析し（３５００〜８０００ＭＷＣＯの透析チューブ）、凍結乾燥することで、約３０％ｗｔ／ｗｔのタンタルを含む純白の沈殿を得た。ＩＲ（ヌジョールマル，ＮａＣｌ板，ｃｍ-1）：１４５４（非常に強い），１４１３（弱い），１３７６（強い），１２９６（弱い），１２７４（弱い），１２１８（強い），１１７０（中位），１０２９（非常に強い），９６４（非常に強い），７８２（中位）。ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ，ｐｐｍ）：31Ｐ，３７．４（広い）；1Ｈ（広がり共鳴），４．１６，１．８８，１．３７，０．８５。
【００５２】
実施例３
この実施例は、本発明のある実施形態に従い、ＣＴ用造影剤をいかにして製造できるかを例示するために役立つ。この特定の実施例では、酸化タンタルの活性コアにクエン酸リガンドの不活性シェルが結合される。さらに、この特定の実施例では、シェルはコアと一緒に形成される。
【００５３】
この実施例では、タンタル粉末（３２５メッシュ、Ａｌｄｒｉｃｈ社）からのＴａ2Ｏ5ナノ粒子の直接製造が記載される。タンタル粉末はＴａ(０)、即ちゼロ価状態のタンタルを含んでいた。２０ｍｌの３０％過酸化水素及び５ｍｌの水酸化アンモニウム溶液（水中の２８〜３０％ＮＨ3）を混合することで溶液を調製した。二つ口フラスコ内においてこれらを窒素下で混合し、氷浴で冷却した。続いて、Ｔａ粉末（５ｍｍｏｌ、０．９０７ｇ）の添加を行い、混合物を２時間撹拌した（小規模では磁気撹拌を使用できるが、大規模では機械的撹拌機の方が適当であり得る）。次いで、クエン酸（１５ｍｍｏｌ、３．１５２ｇ）を添加し、フラスコに凝縮器を取り付けた。スラリーを８０℃で１８時間加熱した。次いで、反応物を放冷し、残留するタンタル粉末を中位グレードガラスフリットで濾別した。濾液をロトエバポレーションによる水の除去で濃縮した。次いで、残った着色溶液をｐＨ７．２に緩衝した水溶液中において３．５Ｋカットオフで透析した。得られた溶液をナノ粒子について分析した。所望ならば、ナノ粒子を凍結乾燥によって単離してもよい。
【００５４】
図６は、この実施例に従って製造したナノ粒子の集合体について、通常のＤＬＳで測定した粒径分布を示しており、集合体の平均粒径が７ｎｍであることを表している。図７は、この実施例に従って製造したナノ粒子のＴＥＭ画像を示している。
【００５５】
実施例４
この実施例は、本発明のある実施形態に従い、ＣＴ用造影剤をいかにして使用できるかを例示するために役立つ。この特定の実施例では、活性コア／不活性シェル型ナノ粒子に関する細胞生存度試験により、試験期間にわたって細胞生存度がほとんど低下しないことが実証される。
【００５６】
ＴＨＰ１単球（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−７１）をＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＢＳ培地で１×１０6細胞／ｍＬの最終密度に希釈し、５００μＬの細胞を２４ウェルプレートの各ウェル内にアリコート化した。無菌濾過した酸化タンタルナノ粒子（１００ｍＭ Ｔａ）をピペットでウェルに加えた。対照ウェルについては、５０μＬの無菌０．９％食塩水（陰性対照）又は８０μＬの３０％過酸化水素（陽性対照）を細胞に添加した。添加後、プレートを静かに渦動させ、標準条件（３７℃、５％二酸化炭素、１００％湿度）下で細胞を培養した。
【００５７】
インキュベーション後、細胞をピペットで遠心管に移し、２０℃で５分間３００×ｇで遠心し、培地を静かに吸引して除去した。細胞を５００μＬの１Ｘ ＰＢＳで洗浄し、静かに渦動させ、２０℃で５分間３００×ｇで遠心した。細胞を洗浄し、緩衝液を静かに吸引して除去した。製造者のプロトコル（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ＦＬＵＯＳキット、Ｒｏｃｈｅ社）に従い、（インキュベーション緩衝液、アネキシンＶ−フルオレセイン及びヨウ化プロピジウムを含む）Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ＦＬＵＯＳアッセイ緩衝液を調製し、１００μＬを各管に加えた。細胞を含む管を静かに渦動させ、室温で１５分間インキュベートした。さらに３００μＬのインキュベーション緩衝液を各管に加えた後、フローサイトメトリー分析を行った。
【００５８】
アネキシンＶ−フルオレセインのみに対して陽性（アポトーシス細胞）、アネキシンＶ−フルオレセイン及びヨウ化プロピジウムに対して陽性（壊死細胞）、並びに両方に対して陰性（生細胞）である細胞の数を測定した。
【００５９】
図８について述べれば、０．１ｍＭまでのＴａを含むすべての酸化タンタル製剤が示すアポトーシス細胞又は壊死細胞の数は無視できる程度であり、ナノ粒子への３時間の暴露後における細胞生存度の低下はないことを表している。
【００６０】
実施例５
この実施例は、本発明のある実施形態に従い、ＣＴ用造影剤をいかにして使用できるかを例示するために役立つ。この特定の実施例では、活性コア／不活性シェル型ナノ粒子の補体活性化試験により、未処理血清又は食塩水処理血清に比べてＣ３ａの目立った増加はないことが実証される。
【００６１】
ヒトの血漿及び血清を販売業者（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ社）から購入した。血清を単離するため、全血を血清管内に吸い込み、室温で３０〜４５分間凝固させた。試料を２０００×ｇで１０分間遠心し、直ちに血清を−７０℃で凍結した。試料をドライアイス上で一晩輸送し、−７０℃で貯蔵した。
【００６２】
血清を水浴中において３７℃で数分間融解した。２５０μＬの血清を２４ウェルプレートの個々のウェルに加えた。無菌の試験試料（Ｔａ剤、食塩水及びコブラ毒因子）を血清に加えて３００μＬの最終体積にした。２４ウェルプレートをインキュベーター（３７℃）に移し、時々撹拌しながら３０分間インキュベートした。
【００６３】
図９について述べれば、製造者のプロトコル（Ｃ３ａアッセイ、Ｑｕｉｄｅｌ社）に従い、原液及び希釈液を調製してＣ３ａ標準曲線及び高／低Ｃ３ａ試料を作成した。
【００６４】
３０分のインキュベーション後にＣ３ａ産生を停止させるため、３７．５ｍＭのクエン酸ナトリウムを各ウェルに加え、０．５μＬの血清（試験試料を含むもの及び含まないもの）をエッペンドルフ管中の１．５ｍＬのキット試料緩衝液に移した。管を静かに３回転倒させて血清及び試料緩衝液を混合し、次いで１００μＬの希釈血清をＣ３ａ試験ストリップの個々のウェルに加え、室温で６０分間インキュベートした。ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄した（１回当たり２００μＬの洗浄緩衝液、ウェル内に洗浄緩衝液を１回当たり１分間）。１００μＬのＣ３ａコンジュゲート溶液を添加し、得られた混合物を室温で６０分間インキュベートした。洗浄プロトコル（３回洗浄、１回当たり２００μＬの洗浄緩衝液、ウェル内に洗浄緩衝液を１回当たり１分間）を繰り返し、次いで１００μＬの基質を各ウェルに加えた。１５分間インキュベートした後、１００μＬの停止溶液を加え、９６ウェルＵＶプレートリーダー上で４５０ｎｍの吸光度を測定した。Ｃ３ａレベルをＣ３ａ標準曲線から計算した。
【００６５】
図１０は、分析から得られたデータを示している。詳しくは、図１０は、ＰＥＧシェル、ＥＤＴＡシェル、クエン酸シェル及びグルコースシェルの各々を有する酸化タンタルコアを血清中でインキュベートすることで得られた試験データを示している。一部の化合物（Ｔａ ＥＤＴＡ）はＣ３ａレベルを低下させたものの、未処理血清又は食塩水処理血清に比べてＣ３ａの増加を示したものはない。１００ｍＭまでのＴａの添加によるＣ３ａレベルの顕著な増加は認められない。全Ｔａ含有量を求めるためには、ＩＣＰ−ＭＳによる元素分析を使用した。
【００６６】
実施例６
この実施例は、本発明のある実施形態に従い、コントラストを増強するためにコア／シェル型ナノ粒子系のＣＴ用造影剤をいかにして使用できるかをさらに例示するために役立つ。
【００６７】
すべてのイメージング試験は、８ｋＶ及び取得時間４分のパラメーターを用いるＥＸｐｌｏｒｅ ＬｏｃｕｓマイクロＣＴイメージングシステム上で実施した。
【００６８】
体重約１６０ｇの雌のＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉラットをケタミン／ジアゼパムのＩＰ注射で麻酔した。ＩＶカテーテル（２４ゲージ）を尾静脈内に配置し、２００μＬの無菌食塩水でフラッシュした。次いで、マイクロＣＴ上でリブケージの基底から膀胱までラットを撮影した（注射前スキャン）。スキャンの直後、カテーテルを通して１ｍＬの２１０ｍｇ Ｔａ／ｍＬ酸化タンタル−ＰＥＧ５５０造影剤をラットに注射し、前回のスキャンの完了後にスキャンした。
【００６９】
図１２について述べれば、最大強度投影を用いて１／２解像度で画像を再構成して観察した。注射直後、腹部大動脈、大静脈及び腎動脈にコントラストが認められた。注射後１４分以内に、造影剤は（膀胱に排出されるので）腎臓及び尿管に認められた。膀胱のコントラストは、注射後２３分以内に顕著となった。やはり図１２について述べれば、ＣＴイメージング試験は６〜１４分の血中クリアランスを示し、次いで３０分以内に膀胱への腎排出を示している。
【００７０】
注射後６０分間にわたってラットを撮影し、次いでケージに戻した。２４時間後、ラットを再び撮影したが、膀胱又は腎臓に残留コントラストは認められなかった。注射したラットにいかなる副作用も認められなかった。
【００７１】
図１１は、Ｔａ2Ｏ5及びＰＥＧシェルを含むナノ粒子を用いてマイクロＣＴイメージングで得られた腹部大動脈画像を示している。
【００７２】
実施例７
この実施例は、本発明のある実施形態に従い、コア／シェル型ナノ粒子の集合体の平均粒径を濾過によりいかにして調節できるかをさらに例示するために役立つ。さらに、この実施例では、様々な粒度の溶液を実験室用ラット被検体に投与した。
【００７３】
大きい酸化タンタル粒子を除去する方法として、通常濾過（ＮＦ）モードで１００ｎｍ又は２０ｎｍの膜フィルターを使用する代わりに、接線流濾過（ＴＦＦ）を使用した。大きいナノ粒子を除去するためのＴＦＦプロセスでは、１００ｋＤ〜１０ｋＤの範囲内のＴＦＦ適合性分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）フィルターを使用した。記載範囲（１００ｋＤ〜１０ｋＤ ＭＷＣＯ）のフィルターの透過液（ｐｅｒｍｅａｔｅ）は小さい酸化タンタルナノ粒子を含んでいた。
【００７４】
低分子量不純物、塩などを除去することで前記透過液中の小さい酸化タンタルナノ粒子を精製するための方法としても、透析の代わりにＴＦＦを使用した。不純物を除去するためのＴＦＦプロセスでは、１０ｋＤ〜５ｋＤの範囲内の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）フィルターを使用した。記載範囲（１０ｋＤ〜５ｋＤ ＭＷＣＯ）のフィルターの保留液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）は、精製された小さい酸化タンタルナノ粒子を含んでいた。
【００７５】
さらに、順次段階で酸化タンタルナノ粒子を粒度分別及び精製するための方法としてＴＦＦを使用した。例えば、３０ｋＤ ＭＷＣＯフィルターを用いるＴＦＦで多分散酸化タンタルナノ粒子を処理することで、約６ｎｍの粒子を保留する（保留液）と共に約３ｎｍの粒子を通過させた（透過液）。次いで、約３ｎｍの粒子を含む透過液は、１０ｋＤ又は５ｋＤ ＭＷＣＯフィルターを用いるＴＦＦプロセスでは保留液として作用した。
【００７６】
ＴＦＦは、通常濾過（膜濾過又は遠心濾過）技法と透析技法との組合せで達成できるよりも高い純度で選択粒度のナノ粒子を製造するための効率的でスケーラブルな方法である。
【００７７】
上述した方法に従って相異なる公称平均粒度（２０ｎｍ、６ｎｍ及び３ｎｍ）をそれぞれ有する３種のナノ粒子溶液を調製し、同一用量レベルで実験室用ラット被検体に投与した。所定の時間後、ラットの腎臓を分析して（ｍｇ Ｔａ／ｇ腎臓試料として算出される）保持粒子の濃度を求めた。結果は、粒子クリアランスが平均粒度の強い関数であることを表している。腎臓に関しては、６ｎｍ粒子の濃度は２０ｎｍ粒子の濃度より約２０％低く、３ｎｍ粒子の濃度は２０ｎｍ粒子の濃度より約５０％低かった。
【００７８】
上述の実施形態に関して上記に記載した構造、機能及び動作の一部は本発明を実施する上で必須ではなく、例示的な実施形態を十分に説明するためにのみ示されていることが理解されよう。さらに、上記に引用した特許や刊行物の特定の構造、機能及び動作は本発明と組み合わせて実施できるものの、これらは本発明を実施する上で必須ではないことも理解されよう。さらに、特記しない限り、方法の複数の段階は、特に限定されないが同時に実施することを含め、任意の組合せ及び／又は順序で実施できることも理解されよう。したがって本発明は、請求の範囲で定義される本発明の技術思想及び技術的範囲から実際に逸脱することなく、上記に記載したのとは異なるやり方で実施できることを理解すべきである。
【符号の説明】
【００７９】
１００ コア／シェル型ナノ粒子
１０１ ナノ粒子コア
１０２ ナノシェル
２００ コア／シェル型ナノ粒子
２０１ 活性ナノ粒子コア
２０２ 不活性ナノシェル
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）タンタル（Ｔａ）を非ゼロ価状態で含む活性ナノ粒子コアと、
ｂ）ナノ粒子コアの周囲に配置された不活性ナノシェルと
を含んでなるＸ線／コンピュータ断層撮影用造影剤であって、凝集体において活性ナノ粒子コア及び不活性ナノシェルがＸ線／コンピュータ断層撮影イメージングで造影剤として機能し得るコア／シェル型ナノ粒子を形成するようなＸ線／コンピュータ断層撮影用造影剤。
【請求項２】
活性ナノ粒子コアが酸化タンタルを含む、請求項１記載のＸ線／コンピュータ断層撮影用造影剤。
【請求項３】
活性ナノ粒子コアがＴａ2Ｏ5を含む、請求項１又は請求項２記載のＸ線／コンピュータ断層撮影用造影剤。
【請求項４】
ナノ粒子が約１〜約２０ｎｍの平均粒径を有する、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載のＸ線／コンピュータ断層撮影用造影剤。
【請求項５】
ナノ粒子が約２〜約１２ｎｍの平均粒径を有する、請求項４記載のＸ線／コンピュータ断層撮影用造影剤。
【請求項６】
ナノ粒子が約３〜約８ｎｍの平均粒径を有する、請求項５記載のＸ線／コンピュータ断層撮影用造影剤。
【請求項７】
ナノシェルが水溶性かつ生体適合性の材料を含む、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載のＸ線／コンピュータ断層撮影用造影剤。
【請求項８】
ナノシェルが、リガンド、オリゴマー、ポリマー、クラスター、炭水化物種、官能化シリカ及びこれらの組合せからなる群から選択される材料を含む、請求項７記載のＸ線／コンピュータ断層撮影用造影剤。
【請求項９】
ナノシェルがポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリメタクリレート、ポリビニルスルフェート、ポリビニルピロリジノン、クエン酸イオン、リンゴ酸イオン、グリコール酸イオン、シラン及びこれらの組合せからなる群から選択される材料を含む、請求項８記載のＸ線／コンピュータ断層撮影用造影剤。
【請求項１０】
ナノシェルがジエチルホスファトエチルトリエトキシシラン（ＰＨＳ）及び２−［メトキシ（ポリ−エチレノキシ）プロピル］トリメトキシシラン（ＰＥＧシラン５５０）から選択される材料を含む、請求項９記載のＸ線／コンピュータ断層撮影用造影剤。
【請求項１１】
請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の造影剤の集合体を含んでなるＸ線／コンピュータ断層撮影用造影液であって、集合体の平均粒径が約１０ｎｍ以下である、Ｘ線／コンピュータ断層撮影用造影液。
【請求項１２】
集合体の平均粒径が約７ｎｍ以下である、請求項１１記載のＸ線／コンピュータ断層撮影用造影液。
【請求項１３】
集合体の平均粒径が約６ｎｍ以下である、請求項１２記載のＸ線／コンピュータ断層撮影用造影液。
【請求項１４】
集合体の平均粒径が約３ｎｍ以下である、請求項１３記載のＸ線／コンピュータ断層撮影用造影液。
【請求項１５】
Ｘ線／コンピュータ断層撮影用造影剤の製造方法であって、
ａ）タンタルを含む第１の前駆体材料を用意する段階と、
ｂ）第１の前駆体材料から、タンタルを非ゼロ価状態で含む活性コアを形成する段階と、
ｃ）第２の前駆体材料を用意する段階と、
ｄ）第２の前駆体材料から不活性シェルを形成する段階であって、不活性シェルはコア及びシェルがコア／シェル型ナノ粒子を形成するようにしてコアの周囲に配置される段階と
を含んでなる方法。
【請求項１６】
第１の前駆体がタンタルの塩を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
第１の前駆体がタンタルのアルコキシド又はハロゲン化物を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
活性コアがＴａ2Ｏ5を含む、請求項１５乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
不活性シェルが第２の前駆体材料から導かれる水溶性材料を含む、請求項１５乃至請求項１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
第２の前駆体材料が重合性シランを含み、不活性シェルがポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリメタクリレート、ポリビニルスルフェート、ポリビニルピロリジノン及びこれらの組合せからなる群から選択されるポリマーを含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
不活性シェルがジエチルホスファトエチルトリエトキシシラン（ＰＨＳ）及び２−［メトキシ（ポリ−エチレノキシ）プロピル］トリメトキシシラン（ＰＥＧシラン５５０）から選択される材料を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
段階（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を順次段階として実施することで活性コア及び第２の前駆体からナノ粒子が形成される、請求項１５乃至請求項２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
第２の前駆体がカルボン酸を含み、不活性シェルがクエン酸イオン、グリコール酸イオン及びリンゴ酸イオンからなる群から選択されるカルボン酸陰イオンを含む、請求項１５乃至請求項２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
段階（ａ）及び（ｃ）が同時に実施される結果、段階（ｂ）及び（ｄ）を同時に実施することで第１及び第２の前駆体からナノ粒子が直接に形成される、請求項１５乃至請求項２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
段階（ｂ）及び（ｄ）が一緒になって、第１及び第２の前駆体を酸化性水溶液に添加する段階を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
さらに、接線流濾過、ダイアフィルトレーション及び通常濾過によってナノ粒子の平均粒径を選択する段階を含む、請求項１５乃至請求項２５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
請求項１５乃至請求項２６のいずれか１項記載の方法に従って製造されるコア／シェル型ナノ粒子の集合体を形成する段階を含んでなるＸ線／コンピュータ断層撮影用製剤の製造方法であって、コア／シェル型ナノ粒子の集合体の平均粒径が集合体中のナノ粒子を哺乳類の腎臓によって実質的に排出可能とするように選択される、方法。
【請求項２８】
ナノ粒子の平均粒径が約１０ｎｍ未満、好ましくは約３ｎｍ未満である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
さらに、透析、接線流濾過又はダイアフィルトレーションの使用によって集合体を精製する段階を含む、請求項２５乃至請求項２８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１】
ａ）タンタル（Ｔａ）を非ゼロ価状態で含む活性ナノ粒子コアと、
ｂ）ナノ粒子コアの周囲に配置された不活性ナノシェルと
を含んでなるＸ線／コンピュータ断層撮影用造影剤であって、凝集体において活性ナノ粒子コア及び不活性ナノシェルがＸ線／コンピュータ断層撮影イメージングで造影剤として機能し得るコア／シェル型ナノ粒子を形成するようなＸ線／コンピュータ断層撮影用造影剤。
【請求項２】
活性ナノ粒子コアが酸化タンタルを含む、請求項１記載のＸ線／コンピュータ断層撮影用造影剤。
【請求項３】
活性ナノ粒子コアがＴａ2Ｏ5を含む、請求項１又は請求項２記載のＸ線／コンピュータ断層撮影用造影剤。
【請求項４】
ナノ粒子が約１〜約２０ｎｍの平均粒径を有する、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載のＸ線／コンピュータ断層撮影用造影剤。
【請求項５】
ナノ粒子が約２〜約１２ｎｍの平均粒径を有する、請求項４記載のＸ線／コンピュータ断層撮影用造影剤。
【請求項６】
ナノ粒子が約３〜約８ｎｍの平均粒径を有する、請求項５記載のＸ線／コンピュータ断層撮影用造影剤。
【請求項７】
ナノシェルが水溶性かつ生体適合性の材料を含む、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載のＸ線／コンピュータ断層撮影用造影剤。
【請求項８】
ナノシェルが、リガンド、オリゴマー、ポリマー、クラスター、炭水化物種、官能化シリカ及びこれらの組合せからなる群から選択される材料を含む、請求項７記載のＸ線／コンピュータ断層撮影用造影剤。
【請求項９】
ナノシェルがポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリメタクリレート、ポリビニルスルフェート、ポリビニルピロリジノン、クエン酸イオン、リンゴ酸イオン、グリコール酸イオン、シラン及びこれらの組合せからなる群から選択される材料を含む、請求項８記載のＸ線／コンピュータ断層撮影用造影剤。
【請求項１０】
ナノシェルがジエチルホスファトエチルトリエトキシシラン（ＰＨＳ）及び２−［メトキシ（ポリ−エチレノキシ）プロピル］トリメトキシシラン（ＰＥＧシラン５５０）から選択される材料を含む、請求項９記載のＸ線／コンピュータ断層撮影用造影剤。
【請求項１１】
請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の造影剤の集合体を含んでなるＸ線／コンピュータ断層撮影用造影液であって、集合体の平均粒径が約１０ｎｍ以下である、Ｘ線／コンピュータ断層撮影用造影液。
【請求項１２】
集合体の平均粒径が約７ｎｍ以下である、請求項１１記載のＸ線／コンピュータ断層撮影用造影液。
【請求項１３】
集合体の平均粒径が約６ｎｍ以下である、請求項１２記載のＸ線／コンピュータ断層撮影用造影液。
【請求項１４】
集合体の平均粒径が約３ｎｍ以下である、請求項１３記載のＸ線／コンピュータ断層撮影用造影液。
【請求項１５】
Ｘ線／コンピュータ断層撮影用造影剤の製造方法であって、
ａ）タンタルを含む第１の前駆体材料を用意する段階と、
ｂ）第１の前駆体材料から、タンタルを非ゼロ価状態で含む活性コアを形成する段階と、
ｃ）第２の前駆体材料を用意する段階と、
ｄ）第２の前駆体材料から不活性シェルを形成する段階であって、不活性シェルはコア及びシェルがコア／シェル型ナノ粒子を形成するようにしてコアの周囲に配置される段階と
を含んでなる方法。
【請求項１６】
第１の前駆体がタンタルの塩を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
第１の前駆体がタンタルのアルコキシド又はハロゲン化物を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
活性コアがＴａ2Ｏ5を含む、請求項１５乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
不活性シェルが第２の前駆体材料から導かれる水溶性材料を含む、請求項１５乃至請求項１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
第２の前駆体材料が重合性シランを含み、不活性シェルがポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリメタクリレート、ポリビニルスルフェート、ポリビニルピロリジノン及びこれらの組合せからなる群から選択されるポリマーを含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
不活性シェルがジエチルホスファトエチルトリエトキシシラン（ＰＨＳ）及び２−［メトキシ（ポリ−エチレノキシ）プロピル］トリメトキシシラン（ＰＥＧシラン５５０）から選択される材料を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
段階（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を順次段階として実施することで活性コア及び第２の前駆体からナノ粒子が形成される、請求項１５乃至請求項２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
第２の前駆体がカルボン酸を含み、不活性シェルがクエン酸イオン、グリコール酸イオン及びリンゴ酸イオンからなる群から選択されるカルボン酸陰イオンを含む、請求項１５乃至請求項２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
段階（ａ）及び（ｃ）が同時に実施される結果、段階（ｂ）及び（ｄ）を同時に実施することで第１及び第２の前駆体からナノ粒子が直接に形成される、請求項１５乃至請求項２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
段階（ｂ）及び（ｄ）が一緒になって、第１及び第２の前駆体を酸化性水溶液に添加する段階を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
さらに、接線流濾過、ダイアフィルトレーション及び通常濾過によってナノ粒子の平均粒径を選択する段階を含む、請求項１５乃至請求項２５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
請求項１５乃至請求項２６のいずれか１項記載の方法に従って製造されるコア／シェル型ナノ粒子の集合体を形成する段階を含んでなるＸ線／コンピュータ断層撮影用製剤の製造方法であって、コア／シェル型ナノ粒子の集合体の平均粒径が集合体中のナノ粒子を哺乳類の腎臓によって実質的に排出可能とするように選択される、方法。
【請求項２８】
ナノ粒子の平均粒径が約１０ｎｍ未満、好ましくは約３ｎｍ未満である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
さらに、透析、接線流濾過又はダイアフィルトレーションの使用によって集合体を精製する段階を含む、請求項２５乃至請求項２８のいずれか１項記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１０−５１６７８２（Ｐ２０１０−５１６７８２Ａ）
【公表日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４７４３７（Ｐ２００９−５４７４３７）
【出願日】平成２０年１月２５日（２００８．１．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５２００７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９２０５９
【国際公開日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【出願人】（３９００４１５４２）ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ (6,332)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＲＡＬ ＥＬＥＣＴＲＩＣ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月２５日（２００８．１．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５２００７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９２０５９
【国際公開日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【出願人】（３９００４１５４２）ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ (6,332)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＲＡＬ ＥＬＥＣＴＲＩＣ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
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