ｃＤＮＡ合成方法
ｍＲＮＡのキャップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有するｃＤＮＡを合成する方法であって、（ｉ）キャップ構造を有するｍＲＮＡを含むＲＮＡ混合物に、二本鎖ＤＮＡプライマーをアニールする工程、（ｉｉ）二本鎖ＤＮＡプライマーから逆転写酵素により第一鎖ｃＤＮＡを合成してｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体を調製する工程、および（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体のｃＤＮＡを含むＤＮＡ鎖の３’端と５’端を、リガーゼを用いて連結し環状化する工程、を含む方法。微量のＲＮＡから、少ない工程で、転写開始点ヌクレオチドからの連続配列を有する完全長ｃＤＮＡを効率的に合成することを可能とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
この出願の発明は、ｃＤＮＡの合成方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、ｍＲＮＡのキャップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有するｃＤＮＡを、簡便かつ高効率で合成する新しい方法に関するものである。
【背景技術】
ゲノムプロジェクトによって、ヒト、マウス、イネ、線虫、酵母など様々な生物の全遺伝子情報を網羅するゲノムＤＮＡ（染色体ＤＮＡ）の全長配列がほぼ決定された。これらのゲノムの全長配列から期待されることは、遺伝子がコードしている蛋白質の一次構造に関する情報と、遺伝子の発現を調節している発現制御領域（プロモーター、エンハンサー、サプレッサー等）に関する情報である。これら二つの情報をゲノム配列から抽出するためには、染色体ＤＮＡの遺伝子領域から転写されるｍＲＮＡの配列情報が必須であるが、このｍＲＮＡの配列情報を解析するためには、ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ：ｃＤＮＡ）が通常用いられている。特に、前記二つの情報を得るためには、遺伝子転写領域から正確に転写され、かつ、蛋白質コード領域の全てを含むｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ（完全長ｃＤＮＡ）を取得する必要がある。
通常、完全長ｃＤＮＡに対しては、二つの条件が設定されている。一つは、ゲノムＤＮＡの転写開始点から始まる配列を有することである。転写開始点から正しく転写されたｍＲＮＡの５’端には「キャップ構造」が付加される。このキャップ構造は、７？メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）が転写開始点ヌクレオチドに５’−５’三リン酸橋を介して結合したものであり、このキャップ構造を有するｍＲＮＡに対して相補的なｃＤＮＡは完全長ｃＤＮＡの一つの条件を満たすことになる。もう一つの指標は、ｍＲＮＡにおける「ポリ（Ａ）テール」の存在である。このポリ（Ａ）テールは、ゲノムＤＮＡから転写されたｍＲＮＡの３’端に核内で付加される数十から２００個のアデニン（Ａ）連続配列である。従って、５’側にキャップ構造を有し、３’側にポリ（Ａ）テールを有するｍＲＮＡを鋳型として正確に合成されたｃＤＮＡは、完全長ｃＤＮＡの二つの条件（転写開始点から始まり、蛋白質コード領域の全てをカバーする）を満たすことになる。
ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応により合成することができるが、染色体ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡは細胞内で、あるいは細胞外への抽出およびＤＮＡ鎖への合成過程で様々な分解反応に曝されるため、完全長ｃＤＮＡの合成は容易ではない。また、ｍＲＮＡを鋳型とする逆転写反応は、ｍＲＮＡの３’側にプライマーオリゴヌクレオチドをアニールさせ、このプライマーからｍＲＮＡの５’方向へＤＮＡ鎖（第一鎖ｃＤＮＡ）を合成する。従って、例えば、ポリ（Ａ）テールにプライマー（オリゴｄＴ）をアニールすれば、ポリ（Ａ）テールをカバーするｃＤＮＡは比較的容易に得ることができる。しかしながら、この方法は、プライマーからキャップ構造までの完全長ｃＤＮＡ合成を保証しない。ｍＲＮＡが分解していたり、ＤＮＡ鎖の合成反応が途中で中断することが頻繁に生じるためである。事実、現在までにＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ）として膨大な数の配列情報が報告されているが、これらは分解したｍＲＮＡから生成した不完全ｃＤＮＡや、ＤＮＡ合成反応が中断された不完全ｃＤＮＡに由来するものが大半である。
そこで、ｍＲＮＡの５’端に存在するキャップ構造までの配列を含む完全長ｃＤＮＡを合成する方法が数多く提案されている。これらの方法は、原理に基づき次の４つに大きく分類することができる。
（１）テーリング法
キャップ部位まで伸長した第一鎖ｃＤＮＡに、末端転移酵素によってホモオリゴマーテールを付加する方法であり、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法（非特許文献１）やＰｒｕｉｔｔ法（非特許文献２）がこれに含まれる。付加したテールの数を厳密に制御することができないため、数が多すぎると塩基配列の解析が困難になる等の問題点を有している。
逆転写酵素の末端転移酵素活性によって第一鎖ｃＤＮＡの３’端に付加したｄＣテールを利用する鋳型スイッチ法（特許文献１）もこのテーリング法に含まれる。この際、付加されるｄＣの数は、３〜５個と記載されている（非特許文献３）。
（２）リンカーライゲーション法
第一鎖ｃＤＮＡを合成後、アルカリ処理やＲＮａｓｅＨ処理によってｍＲＮＡを分解除去した後、一本鎖ｃＤＮＡの３’端に、配列既知の一本鎖オリゴヌクレオチドリンカーをＴ４ ＲＮＡリガーゼを用いて連結する方法である（非特許文献４）。一本鎖ｃＤＮＡが二次構造を形成するため高品質のｃＤＮＡライブラリーを作製するには向かない。
（３）オリゴキャッピング法
キャップ構造をオリゴマーで置換する方法である。オリゴマーとして、ＲＮＡオリゴマー（非特許文献５）やＤＮＡ−ＲＮＡキメラオリゴマーを用いる方法（例えば、この出願の発明者らによる特許文献１、非特許文献６）が報告されている。原理的には、完全長ｃＤＮＡのみが合成されるはずであるが、約５−１０μｇという多量のポリ（Ａ）＋ＲＮＡを必要とし、ｍＲＮＡを処理する工程が多く、この段階で分解されたｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡが含まれる場合もある。ｍＲＮＡの分解を抑えるために、全ＲＮＡを出発材料とすることにより、完全長率を９０％以上とした例もあるが、工程数は変わらない（特許文献２）。
過ヨウ素酸酸化反応によってキャップ構造の糖を開裂した後、合成オリゴマーを付加する方法（特許文献３）もこの方法に含まれる。
（４）キャップトラッピング法
キャップ構造を有するｍＲＮＡを選別して鋳型とする方法であり、抗キャップ抗体によって選別したｍＲＮＡを鋳型にする方法（非特許文献７）や、過ヨウ素酸酸化反応によってキャップ構造の糖を開裂した後、ビオチンを付加し、アビジン固定化担体で選別したｍＲＮＡを鋳型として用いる方法（非特許文献８）などがある。
【特許文献１】：米国特許第５，９６２，２７２号
【特許文献２】：特許３３３７７４８号
【特許文献３】：国際公開第０１／０４２８６号パンフレット
【特許文献４】：米国特許第６，０２２，７１５号
【非特許文献１】：Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１６１−１７０，１９８２．
【非特許文献２】：Ｐｒｕｉｔｔ，Ｓ．Ｃ．，Ｇｅｎｅ ６６：１２１−１３４，１９８８．
【非特許文献３】：ＣＬＯＮＴＥＣＨｎｉｑｕｅｓ，Ｊｕｌｙ １９９７，ｐ．２６．
【非特許文献４】：Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｊ．，Ｄｅｌｏｒｔ，Ｊ．，ａｎｄ Ｍａｌｌｅｔ，Ｊ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：５２２７−５２３２，１９９１．
【非特許文献５】：Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ ａｎｄ Ｓｕｇａｎｏ，Ｓ．Ｇｅｎｅ １３８：１７１−１７４，１９９４．
【非特許文献６】：Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １５０：２４３−２５０，１９９４．
【非特許文献７】：Ｅｄｅｒｙ，Ｉ，Ｃｈｕ，Ｌ．Ｌ．，Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎ．，ａｎｄ Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：３３６３−３３７１，１９９５．
【非特許文献８】：Ｃａｒｎｉｎｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３７：３２７−３３６，１９９６．
【発明の開示】
前記のいずれの従来方法によっても完全長ｃＤＮＡの合成は可能である。しかしながら、合成されたｃＤＮＡのうち、完全長ｃＤＮＡが占める割合がどれだけ多くとも、分解したｍＲＮＡに由来する不完全ｃＤＮＡや、ＤＮＡ合成が途中で中断して生成した不完全ｃＤＮＡも必ず含まれる。このため、合成されたｃＤＮＡがキャップ構造を有する完全長ｍＲＮＡに由来するものであるか否かを判定する必要がある。一般的には、同じ５’端配列を有するクローンが複数個存在すれば、それらは完全長ｍＲＮＡに由来するものである可能性は高いが、断定はできない。とりわけ、複数の転写開始点を有する遺伝子の場合には、完全長ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡクローンであるか、５’端が欠失した分解産物由来のクローンであるかを決定することは極めて困難である。
従って、完全長ｃＤＮＡを高い割合で合成し、かつ転写開始点から始まる配列を有していることを識別することのできるｃＤＮＡ合成方法が求められている。
また、前記のいずれの従来方法も、多くの工程を必要とするという問題点を有している。例えば、特許文献１のオリゴキャッピング法は、確実にキャップ部位からの塩基配列を含むｃＤＮＡを合成可能であるという点において優れた方法ではあるが、ｃＤＮＡの合成までに８工程を要する。工程の増大は、ｃＤＮＡの合成収率の低下や、時間や労力、コストの増加といった問題を引き起こす。
さらに、従来法のいくつかはＰＣＲによる増幅工程を含んでいる（非特許文献４、５）。しかしながら、ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼはポリメラーゼ反応時に鋳型と異なるヌクレオチドを取り込む頻度が高いため、ｃＤＮＡ配列中に人工的な変異を生成するという問題点を有していた。
従って、微量のＲＮＡから、ＰＣＲを使用せずに少ない工程で完全長ｃＤＮＡの合成を可能とする方法が求められていた。
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、以下の条件：
（１）１μｇオーダーの全ＲＮＡを出発材料とすること；
（２）ＰＣＲを使用しないこと；
（３）できるだけ少ない工程であること；
（４）転写開始点ヌクレオチドからの連続配列を有することが保証された完全長ｃＤＮＡを９０％以上の高収率で合成すること、
を満たす方法を提供することを課題としている。従来方法の中には、これらの要件をすべて満たすものはない。
前記の課題を解決するための第１の発明は、ｍＲＮＡのキャップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有するｃＤＮＡを合成する方法であって、
（ｉ）キャップ構造を有するｍＲＮＡを含むＲＮＡ混合物に、二本鎖ＤＮＡプライマーをアニールする工程、
（ｉｉ）二本鎖ＤＮＡプライマーから逆転写酵素により第一鎖ｃＤＮＡを合成してｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体を調製する工程、および
（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体のｃＤＮＡを含むＤＮＡ鎖の３’端と５’端を、リガーゼを用いて連結し環状化する工程、
を含むことを特徴とする方法である。
この第１発明の方法においては、キャップ構造を有するｍＲＮＡが細胞抽出物中に含まれていること、またはキャップ構造を有するｍＲＮＡがインビトロ転写によって合成されたものであることをそれぞれ好ましい態様としている。
またこの第１発明の方法においては、二本鎖ＤＮＡプライマーのプライマー配列が、キャップ構造を有するｍＲＮＡの部分配列に相補的な配列を含むこと、またはキャップ構造を有するｍＲＮＡのポリ（Ａ）配列に相補的なオリゴｄＴを含むことをそれぞれ好ましい態様としている。
さらにこの第１発明の方法においては、リガーゼがＴ４ ＲＮＡリガーゼであることを別の好ましい態様としている。
この第１発明の方法においては、工程（ｉｉ）と工程（ｉｉｉ）の間に、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体を制限酵素で切断することにより、二本鎖ＤＮＡプライマーの端部に５’突出末端あるいは平滑末端を生成する工程（ｉｉ’）を含むことを別の好ましい形態としている。
第２発明は、前記第１発明の方法に加え、さらに以下の工程：
（ｉｖ）ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体のＲＮＡ鎖をＤＮＡ鎖に置換して第二鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
を含むことを特徴とするｃＤＮＡ合成方法である。
この第２発明の方法においては、二本鎖ＤＮＡプライマーが複製オリジン、または複製オリジンとｃＤＮＡ発現用プロモーターを含んでいることを好ましい態様としている。
この第２発明の方法によって、合成された二本鎖ｃＤＮＡを含むクローンが得られる。
この第２発明の方法は、さらには以下の工程：
（ｖ）第一鎖ｃＤＮＡと第二鎖ｃＤＮＡとからなる二本鎖ｃＤＮＡをベクターＤＮＡの一部とする工程、
を含むことを別の好ましい態様としている。これによって、合成された二本鎖ｃＤＮＡがベクターにクローニングされる。
第３発明は、前記第２発明の方法によって合成された二本鎖ｃＤＮＡを含むクローンの集団であって、５’端にヌクレオチド（ｄＴ）ｎ ｄＧ（ｎ＝０〜５）を有し、これに連続してｍＲＮＡのキャップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有するｃＤＮＡのクローンを６０％以上含むことを特徴とするｃＤＮＡライブラリーである。
第４発明は、前記第３発明のｃＤＮＡライブラリーのクローンから、ｍＲＮＡのキャップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有するｃＤＮＡのクローンを選択する方法であって、５’端ヌクレオチドが（ｄＴ）ｎ ｄＧ（ｎ＝０〜５）であるｃＤＮＡを含むクローンを目的クローンとする方法である。
第５発明は、プライマー部分がオリゴ（ｄＴ）ｎ（ｎ＝１５〜１００）からなり、プライマー側の末端部分に８塩基認識制限酵素切断部位ＲＥ１を有し、もう一方の末端部に８塩基認識制限酵素切断部位ＲＥ２と５’突出末端あるいは平滑末端を生成する制限酵素部位ＲＥ３を有する二本鎖ＤＮＡプライマーである。
第５発明の二本鎖ＤＮＡプライマーは、複製オリジン、または複製オリジンとｃＤＮＡ発現用プロモーターを含んでいることを好ましい態様としている。そして、この第５発明の二本鎖ＤＮＡプライマーの具体例は、配列番号２の塩基配列を有するｐＧＣＡＰ１０由来のベクタープライマーである。
第６発明は、二本鎖ＤＮＡプライマー、逆転写酵素と反応緩衝液、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼと反応緩衝液、キャップ付加モデルｍＲＮＡを含むｃＤＮＡ合成用試薬キットである。
前記のとおりの発明は、少なくとも
（ｉ）ｍＲＮＡへの二本鎖ＤＮＡプライマーのアニール、
（ｉｉ）第一鎖ｃＤＮＡの合成によるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体の調製、および
（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体のｃＤＮＡを含むＤＮＡ鎖の３’端と５’端の連結、
という三段階の工程によって、ｍＲＮＡのキャップ構造に連続する塩基配列を有するｃＤＮＡを高効率で合成する方法である。
すなわちこの発明は、キャップ構造を有するｍＲＮＡが鋳型となる場合には、前記工程（ｉｉ）によって、キャップ構造の塩基が「Ｇ」の場合には「ｄＣ」［または５’−ｄＣ（ｄＡ）ｎ−３’（ｎ＝１−５）］が第一鎖ｃＤＮＡの３’端に付加されることを見いだして完成された。キャップ構造の塩基が「Ａ」の場合には「ｄＴ」［または５’−ｄＴ（ｄＡ）ｎ−３’（ｎ＝１−５）］が第一鎖ｃＤＮＡの３’端に付加されることから、付加されるヌクレオチドはキャップ構造の塩基に相補的な塩基を有するものであることが示された。また、キャップ構造を有さないＲＮＡを鋳型にした場合には、第一鎖ｃＤＮＡの３’端に余分なヌクレオチドの付加は認められなかった。したがって、ｃＤＮＡの５’端に余分な「ｄＧ」［または５’−（ｄＴ）ｎ ｄＧ−３’（ｎ＝１−５）］が存在する場合には、このｃＤＮＡはキャップ構造を有するｍＲＮＡに由来する完全長ｃＤＮＡであると判定できる。逆転写酵素の反応条件によっては、余分な「ｄＧ」が２個以上付加する場合もあるので（非特許文献３）、一般的にはｃＤＮＡの５’端に（ｄＮ）ｎ ｄＧ（ｄＮはｄＴまたはｄＧ、ｎ＝０〜５）が存在する場合には、このｃＤＮＡはキャップ構造を有するｍＲＮＡに由来する完全長ｃＤＮＡであると判定できる。ただし、余分な「ｄＧ」が２個以上付加する場合、どれが余分な「ｄＧ」なのか判定が困難なので、実施例のように余分な「ｄＧ」が１個付加する条件で行なうのが好ましい。
なお、鋳型スイッチ法では３〜５個のｄＣが付加されると記載されているが（非特許文献３）、この発明の実施例の条件下においては、そのような複数個のｄＣ付加は認められなかった。また、逆転写酵素の末端転移酵素様活性により、第一鎖ｃＤＮＡの３’端に優先的にｄＣが一個付加されるという報告があるが（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｗ．Ｍ．ａｎｄ Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｍ．Ｗ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：ｅ３１，１９９９）、その機構に関する報告はない。さらに、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロデュプレックス（この発明におけるキャップ構造を有さないＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスに相当する）に逆転写酵素を作用させると、ＤＮＡの３’端の９０％に一個のヌクレオチド（「ｄＡ」あるいは「ｄＧ」あるいは「ｄＣ」あるいは「ｄＴ」）が付加するという報告があるが（Ｃｈｅｎ，Ｄ．ａｎｄ Ｐａｔｔｏｎ，Ｊ．Ｔ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３０：５７４−５８２，２００１）、この発明の実施例の条件下においては、そのような付加はほとんど認められなかった。
なお、この発明において、「ヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ；またはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）を言う。以下の説明において、前記のヌクレオチドはそれぞれ単に「Ａ」、「Ｇ」、「Ｃ」、「Ｕ」、または「ｄＡ」、「ｄＧ」、「ｄＣ」、「ｄＴ」と記載することがある。また「相補的」とは、前記ヌクレオチドの「Ａ」または「ｄＡ」と「Ｕ」または「ｄＴ」、「Ｇ」または「ｄＧ」と「Ｃ」または「ｄＣ」との水素結合による対合を意味する。
また、「二本鎖ＤＮＡプライマー」とは、二本鎖ＤＮＡの片方のＤＮＡ鎖の３’端が突出しており、この突出した部分の塩基配列が鋳型ｍＲＮＡ配列に相補的な塩基配列を有するものを言う。この突出した部分は、鋳型ｍＲＮＡにハイブリダイズし、逆転写酵素による第一鎖ｃＤＮＡ合成時のプライマーとして働く。二本鎖ＤＮＡが複製オリジンを有するものを、特に「ベクタープライマー」と言う。
またさらに、この発明において「キャップ構造を有するｍＲＮＡ」は、ゲノムＤＮＡからの転写産物ｍＲＮＡの５’端に、メチル化されたグアニン（Ｇ）を有するグアノシンが５’−５’三リン酸結合（ｍＧｐ５’−５’ｐｐ）した分子であり、例えばＧの第７位がメチル化されたキャップ構造の場合には以下の構造：
（なお、ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＵ、ｍは５０以上の正数）
を有している。
この発明における「ｍＲＮＡのキャップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有するｃＤＮＡ」とは、前記のｍＲＮＡ構造（ａ）におけるＮ１〜Ｎｍ配列に相補的なｃＤＮＡの３’端に５’−ｄＣ（ｄＡ）ｎ−３’（ｎ＝０−５）（より一般的には、５’−ｄＣ（ｄＮ）ｎ−３’（ｄＮはｄＡまたはｄＣ、ｎ＝０〜５））が付加したｃＤＮＡ（第一鎖ｃＤＮＡ）：
（なお、ｄＮはｄＡ、ｄＧ、ｄＣまたはｄＴ）
と、このｃＤＮＡ（ｂ）に対してさらに相補的なｃＤＮＡ（第二鎖ｃＤＮＡ）：
およびｃＤＮＡ（ｂ）／（ｃ）のデュプレックス（二本鎖ｃＤＮＡ）を全て意味する。ただし、単に「ｃＤＮＡ」と言う場合には二本鎖ｃＤＮＡを言い、その塩基配列について言及する場合には、前記構造（ｃ）の第二鎖ｃＤＮＡのものを言う。
また、前記のｍＲＮＡ構造（ａ）におけるＮ１は、転写開始点のヌクレオチドであることから、「ｍＲＮＡのキャップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有するｃＤＮＡ」とは、「転写開始点ヌクレオチドからの連続配列を有するｃＤＮＡ」と定義することもできる。
以下の説明においては、「ｍＲＮＡのキャップ構造に隣接するヌクレオチド（転写開始点ヌクレオチド）からの連続配列を有するｃＤＮＡ」を、「キャップ連続ｃＤＮＡ」と記載することがある。また、このキャップ連続ｃＤＮＡのうち、特にｍＲＮＡのポリ（Ａ）配列までを含むものを「完全長ｃＤＮＡ」と記載することがある。さらに、キャップ構造に隣接するヌクレオチド（前記の構造（ｂ）または（ｃ）における少なくともｄＮ１）を含まないｃＤＮＡを「キャップ非連続ｃＤＮＡ」と記載することがある。またさらに、「キャップ構造を有するｍＲＮＡ」を「キャップ（＋）ｍＲＮＡ」、「キャップ構造を持たないｍＲＮＡ」を「キャップ（−）ｍＲＮＡ」、キャップ（＋）ｍＲＮＡからキャップ構造を除去したものを「脱キャップｍＲＮＡ」と記載することがある。
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、この発明の遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，１９９５等に記載されている。
【図面の簡単な説明】
図１は、この発明の基本工程を示した模式図である。
図２は、この発明のベクタープライマーの一般的な構造を例示した模式図である。
図３は、この発明のｐＧＣＡＰ１並びにｐＧＣＡＰ１ベクタープライマーの構造を例示した模式図である。
図４は、この発明のｐＧＣＡＰ１０並びにｐＧＣＡＰ１０ベクタープライマーの構造を例示した模式図である。
【発明を実施するための最良の形態】
第１の発明は、キャップ連続ｃＤＮＡ（第一鎖ｃＤＮＡ）を合成する方法であって、以下の工程（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を必須として含むことを特徴としている（図１参照）。
工程（ｉ）： キャップ構造を有するｍＲＮＡを含むＲＮＡ混合物に、二本鎖ＤＮＡプライマーをアニールする。
工程（ｉｉ）： 二本鎖ＤＮＡプライマーから逆転写酵素により第一鎖ｃＤＮＡを合成してｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体を調製する。
工程（ｉｉｉ）： ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体のｃＤＮＡを含むＤＮＡ鎖の３’端と５’端を、リガーゼを用いて連結し環状化する。
工程（ｉ）において、「キャップ付加ｍＲＮＡを含むＲＮＡ混合物」は、実質的にキャップ付加ｍＲＮＡのみからなるものであってもよく、その他に、例えば「キャップ（−）ｍＲＮＡ」および／または「他のＲＮＡ分子（例えばｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ等）」を含んでいてもよい。このようなＲＮＡ混合物は、単細胞真核生物由来のものであってもよく、多細胞真核細胞由来のものであってもよい。またこのＲＮＡ混合物は、ＤＮＡを鋳型としてインビトロ転写により合成されたものでもよく、あるいは細胞抽出物としての全ＲＮＡであってもよい。この工程（ｉ）において、ＲＮＡ混合物は、例えば全ＲＮＡの場合は１μｇ以下でもｃＤＮＡの合成は可能であるが、好ましくは１μｇ以上を使用する。細胞から抽出される全ＲＮＡの場合、ｍＲＮＡは２−３％であり、この発明の方法ではこのような少量のｍＲＮＡを含む全ＲＮＡからキャップ連続ｃＤＮＡや完全長ｃＤＮＡを合成することが可能である。
工程（ｉ）で使用する「二本鎖ＤＮＡプライマー」は、その３’突出末端として「プライマー配列」を備えている。この場合のプライマー配列は、例えば、対象となるキャップ付加ｍＲＮＡの部分配列情報が公知の場合は、この公知配列に基づいて公知の化学合成法（例えば、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４７：４１１−４１８，１９８２；Ａｄａｍｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１，１９８３；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２５：３４４０−３４４４，１９９７；Ｆｒｅｎｋｅｌ，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９：３７３−３８０，１９９５；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：７８８６−７８９６，１９９４；Ｎａｒａｎｇ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０，１９７９；Ｂｒｏｗｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９，１９７９；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９，１９８１；米国特許第４，４５８，０６６号に記載されているような方法など）により作製することができる。例えば公知のＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ）配列はｃＤＮＡの３’側部分配列がほとんどであるが、これらの配列に基づいて作製したプライマー配列を用いることによって、そのＥＳＴ配列より５’側のキャップ連続ｃＤＮＡを取得することができる。また、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）配列に相補的なオリゴｄＴを含むプライマーを使用することもできる。オリゴｄＴを構成する連続したｄＴの数は、３０〜７０個程度が好ましく用いられる。このようなオリゴｄＴプライマーの使用によって、ポリ（Ａ）部位までを含むキャップ連続ｃＤＮＡ（完全長ｃＤＮＡ）を取得することができる。一方、このような二本鎖ＤＮＡプライマーのプライマー配列の他端部は、特に制限はなく、任意の二本鎖ＤＮＡとすることができるが、後の工程においてベクターＤＮＡへの挿入連結を容易とするように、ベクターＤＮＡのクローニングサイトへの連結末端を端部に備えるようにすることが好ましい。
工程（ｉｉ）においては、ｍＲＮＡにアニールした二本鎖ＤＮＡプライマーに逆転写酵素を作用させ、二本鎖ＤＮＡプライマーの３’端からｍＲＮＡの５’方向に相補的なｃＤＮＡ鎖を合成する。この工程により、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体が形成される。この連結体では、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスのｃＤＮＡ鎖の一端と二本鎖ＤＮＡプライマーの片側鎖の一端が連結している。またこの工程（ｉｉ）で生成されるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスのｃＤＮＡは、キャップ（＋）ｍＲＮＡに相補的で、かつ３’端にｄＣまたは５’−ｄＣ（ｄＡ）ｎ−３’を付加したキャップ連続ｃＤＮＡ、またはキャップ（−）ｍＲＮＡに由来するキャップ非連続ｃＤＮＡである。
逆転写酵素としては、Ｍ−ＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）やＡＭＶ（ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）由来の逆転写酵素が利用できるが、内在性のＲＮａｓｅＨ活性を無くしたものが好ましい。
この工程（ｉｉｉ）におけるリガーゼとしては、各種のＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼを適宜に選択して使用できるが、好ましくはＴ４ ＲＮＡリガーゼを使用する。なお、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼによって、ＲＮＡにハイブリダイズさせた２本のオリゴデオキシヌクレオチド同士を連結する方法（米国特許第６，３６８，８０１号）が報告されているが、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスに二本鎖ＤＮＡを連結した例はない。また、ライゲーションは、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体を制限酵素で切断することにより、二本鎖ＤＮＡプライマーの端部に５’突出末端あるいは平滑末端を生成させる工程（ｉｉ’）を行なった後、行なうことも好ましい。工程は一つ増えるが、ｃＤＮＡインサートの入っていないベクターだけのバックグラウンドが減少することと、ライゲーション効率が上がるといった利点がある。また、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスのキャップ構造を、例えばタバコ酸性ピロホスファターゼを用いて除去してから行っても良いが、そのキャップ構造を残存させたまま行ってもよい。さらに、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスのｍＲＮＡを分解したり、あるいはｍＲＮＡ鎖をＤＮＡ鎖に置換してからライゲーションを行なってもよい。ただし、この工程で生成するｍＲＮＡ分解産物が、ｃＤＮＡの３’端に付加する場合があるので、注意を要する。
以上の方法によって、
からなるキャップ連続ｃＤＮＡ（第一鎖ｃＤＮＡ）を一部とする環状ＤＮＡ鎖が合成される。このようにして得られたキャップ連続ｃＤＮＡは、例えばその配列解析とゲノム配列との比較によって、遺伝子の転写開始点やその上流の発現制御領域を特定するために情報を提供する。
以上の方法により得られたキャップ連続ｃＤＮＡ（第一鎖ｃＤＮＡ）は、第２発明の工程（ｉｖ）によって二本鎖ｃＤＮＡへと合成される。この工程（ｉｖ）は、例えば、ＲＮａｓｅＨ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ等を作用させてＲＮＡ鎖をＤＮＡ鎖に置換する方法によって行うことができる。この工程はかならずしも試験管内で行なう必要はなく、例えば、二本鎖ＤＮＡプライマーとして「ベクタープライマー」を用いれば、ライゲーション後、大腸菌などに導入し、細胞内でＲＮＡ鎖をＤＮＡ鎖に置換してもよい。
また第２発明の方法では、二本鎖ｃＤＮＡを、工程（ｖ）によってベクターにクローニングすることもできる。例えば、二本鎖ＤＮＡ部分に備えられた制限酵素部位で切断後、プラスミドベクターやファージベクターなどに挿入するなどして、配列解析やその発現産物の産生等に使用することができる。
なお、この第２発明の方法では、二本鎖ＤＮＡプライマーとして「ベクタープライマー」を用いれば、他のベクターへの挿入工程を省略することができるので好ましい。ベクタープライマーは、例えば、環状ベクターＤＮＡを適当なクローニングサイトで制限切断し、その３’端にｍＲＮＡの一部配列に相補的なプライマー配列を連結して３’突出末端とすることによって作製することができる。また、完全長ｃＤＮＡを合成するためには、３’端にオリゴｄＴ（好ましくは、３０〜７０個）を連結すればよい。３’突出末端としてオリゴｄＴを有する二本鎖ＤＮＡプライマーは、例えば完全長ｃＤＮＡライブラリーを効率良く作製するなどの目的には特に好ましい。また、ｃＤＮＡを切り出して他のベクターに組み換えることを容易にするために、二本鎖ＤＮＡ部分に８塩基認識の制限酵素部位を備えることも好ましい。さらにまた、二本鎖ＤＮＡ部分に複製オリジンを備えるようにすることも好ましい。複製オリジンとしては、大腸菌などの原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞などの真核細胞内で機能するものが用いられる。これによって、最終的に得られたｃＤＮＡベクターをこれらの細胞に導入して、複製することが可能となる。さらに、ｃＤＮＡをインビトロ転写・翻訳により試験管内で発現させたり、真核細胞内に導入して発現させたりできるように、二本鎖ＤＮＡ部分にプロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位などを備えることも好ましい。
このような二本鎖ＤＮＡプライマー（第５発明）は、適当なベクターＤＮＡを出発材料として適宜にデザインしてもよく、あるいは公知のもの（例えば、ｐＫＡ１ベクタープライマー（一端に約６０個の３’突出末端ｄＴテールを有し、もう一端がＥｃｏＲＶ平滑末端［Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １５０：２４３−２５０，１９９４］）等を使用することもできる。この発明の二本鎖ＤＮＡプライマーの一般的な構造を図２に示した。プライマー配列として６０±１０個のｄＴを有している。もう一方の末端部は、平滑末端、突出末端いずれでも良い。プライマー配列を含む末端部に８塩基認識制限酵素部位ＲＥ１を有し、もう一方の末端部に８塩基認識制限酵素部位ＲＥ２と５’突出末端あるいは平滑末端を生成する制限酵素部位ＲＥ３を有することが好ましい。８塩基認識制限酵素部位としては、ＮｏｔＩ、Ｓｓｅ８３８７Ｉ、ＰａｃＩ、ＳｗａＩ、ＳｆｉＩ、ＳｇｒＡＩ、ＡｓｃＩ、ＦｓｅＩ、ＰｍｅＩ、ＳｒｆＩなどが利用できる。この発明において作製したｐＧＣＡＰ１ベクタープライマーは、ＲＥ３としてＡｆｌＩＩ部位（ＣＴＴＡＡＧ）を設けてあるが、このＡｆｌＩＩ ５’突出末端（．．．ＣＴＴＡＡ）に第一鎖ｃＤＮＡの３’端が連結すると、「キャップ連続ｃＤＮＡ」の場合、５’突出末端に「ｄＧ」が付加して、．．．ＣＴＴＡＡＧ．．．となり、ＡｆｌＩＩの切断認識配列が復活する。したがって、「キャップ連続ｃＤＮＡ」クローンは、ＡｆｌＩＩによって切断可能となる。このことを利用すれば、ＡｆｌＩＩ消化によってキャップ連続ｃＤＮＡクローンかどうかを判定することもできる。他にも「ｄＧ」付加によって切断認識配列が復活するＭｕｎＩ（ＣＴＴＡＡＧ）、ＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）等も利用できる。さらに、この発明において作製したｐＧＣＡＰ１０ベクタープライマーは、ＲＥ１としてＮｏｔＩ、ＲＥ２としてＳｗａＩ、ＲＥ３としてＥｃｏＲＩを有する。
この出願の第３発明は、前記第２発明の方法によって最終的に作製されたｃＤＮＡベクターの集団からなる「ｃＤＮＡライブラリー」である。このｃＤＮＡライブラリーは、後記実施例にも示したように、キャップ連続ｃＤＮＡを含むクローンを６０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上という極めて高い確率で保有することを特徴としている。
従って、この第３発明のｃＤＮＡライブラリーは、そのほとんどのクローンがキャップ連続ｃＤＮＡであるため、キャップ連続ｃＤＮＡを特に選択しない場合であっても、高い確率でキャップ連続ｃＤＮＡを単離して解析することができる。ただし、正確を期すためには、この出願の第４発明の方法によって、キャップ連続ｃＤＮＡを正しく選択することができる。すなわち、前記第１発明および第２発明の方法によって合成されたキャップ連続ｃＤＮＡは、その５’端に「（ｄＴ）ｎｄＧ」を有することを特徴としているため、全塩基配列を調べる必要はなく、この「（ｄＴ）ｎｄＧ」の存否を指標としてキャップ連続ｃＤＮＡを特定することができる。「（ｄＴ）ｎｄＧ」の存在は、公知の塩基配列決定法等により簡便に行うことができる。なお、キャップ連続ｃＤＮＡの９０％以上は「ｄＧ」から始まるので、実際的には「ｄＧ」の存否を指標とすればよい。
この出願の第６発明は、この発明の方法でｃＤＮＡを合成するために最低限必要とする試薬類、すなわち二本鎖ＤＮＡプライマー、逆転写酵素と反応緩衝液、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼと反応緩衝液、キャップ付加モデルｍＲＮＡを含むｃＤＮＡ合成用試薬キットである。このキットを用いれば、任意のキャップ付加ｍＲＮＡを含むＲＮＡ混合物から、キャップ連続ｃＤＮＡを含むｃＤＮＡライブラリーを容易に作製することができる。
【実施例】
次に実施例により発明を具体的に説明するが、この発明はこれらの例に限定されるものではない。なおＤＮＡの組換えに関する基本的な操作および酵素反応は、文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）に従った。制限酵素および各種修飾酵素は特に記載の無い場合には宝酒造社製のものを用いた。各酵素反応の緩衝液組成、並びに反応条件は付属の説明書に従った。
【実施例１】
キャップアナログ付加ＲＮＡを用いたｃＤＮＡ合成
（１）キャップアナログ付加ＲＮＡの調製
ヒト延長因子−１α（ＥＦ−１α）の完全長ｃＤＮＡクローンｐＨＰ００１５５（非特許文献６）をＮｏｔＩ消化により直鎖状にした後、これを鋳型にしてインビトロ転写キット（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いてｍＲＮＡを調製した。反応液にキャップアナログとして、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐＧ（５）あるいはＡ（５’）ｐｐｐＧ（５）（いずれもＡｍｂｉｏｎ社製）を添加することにより、「ｍ７Ｇ」あるいは「Ａ」をキャップ構造とするモデルｍＲＮＡを得た。また、キャップアナログ無添加によって、キャップ構造を持たないモデルｍＲＮＡを得た。インビトロ転写産物の５’端の塩基配列は、ベクター由来の配列（５’−ＧＧＧＡＡＴＴＣＧＡＧＧＡ−３’）の下流にＥＦ−１αの５’端配列（５’−ＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡ．．．．．）が続いている。
（２）第一鎖ｃＤＮＡ合成
上記で調製したモデルｍＲＮＡ０．３μｇとｐＫＡ１ベクタープライマー（一端に約６０個の３’突出末端ｄＴテールを有し、もう一端がＥｃｏＲＶ平滑末端）（非特許文献６）０．３μｇを反応液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，７５ｍＭ ＫＣｌ，３ｍＭ ＭｇＣｌ２，５ｍＭ ＤＴＴ，１．２５ｍＭ ｄＮＴＰ）に混合し、モデルｍＲＮＡとベクタープライマーとをアニールさせたのち、逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ（インビトロジェン社製）２００Ｕとリボヌクレアーゼインヒビター４０Ｕ（宝酒造社製）を添加して、４２℃１時間反応させ、モデルｍＲＮＡに相補的な第一鎖ｃＤＮＡを合成した。反応液をフェノール抽出した後、エタノール沈澱により、キャップ（＋）ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスとベクタープライマーの連結体を回収し、水２０μｌに溶解した。
（３）脱キャップ反応
キャップ（＋）ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックス溶液２０μｌを反応液（５０ｍＭ 酢酸ナトリウム，ｐＨ５．５，５ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール）に混合し、１０Ｕのタバコ酸性ピロホスファターゼ（日本ジーン社製）を添加し、３７℃３０分間反応させ、ｍＲＮＡのキャップ構造を除去した。反応液をフェノール抽出した後、エタノール沈澱により、脱キャップｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスとベクタープライマーの連結体を回収し、水２０μｌに溶解した。
（４）セルフライゲーション
前記（２）で得たキャップ（＋）ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックス溶液、および前記（３）で得た脱キャップｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックス溶液のそれぞれ２０μｌを反応液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール，０．５ｍＭ ＡＴＰ，２ｍＭ ＤＴＴ）に混合し、１２０ＵのＴ４ ＲＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を添加し、２０℃１６時間反応させ、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスの末端とベクタープライマーのＥｃｏＲＶ末端とをライゲーションさせて環状とした（セルフライゲーション反応）。反応液をフェノール抽出した後、エタノール沈澱により、セルフライゲーション産物を回収し、水２０μｌに溶解した。
（５）ＲＮＡ鎖からＤＮＡ鎖への置換
セルフライゲーション産物溶液２０μｌを反応液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，４ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，１００ｍＭ ＫＣｌ，５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ，０．１ｍＭ ｄＮＴＰ）に混合し、０．３ＵのＲＮａｓｅＨ（宝酒造社製）、４ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（宝酒造社製）、６０ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を添加し、１２℃５時間反応させ、ＲＮＡ鎖をＤＮＡ鎖で置換して第二鎖ｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡ／ｃＤＮＡデュプレックスをインサートとするベクター（ｃＤＮＡベクター）を得た。反応液をフェノール抽出した後、エタノール沈澱により、ｃＤＮＡベクターを回収し、ＴＥ４０μｌに溶解した。
（６）大腸菌の形質転換
ｃＤＮＡベクター溶液１μｌをＤＨ１２Ｓコンピテント細胞（インビトロジェン社製）２０μｌと混合し、エレクトロポレーション法により形質転換を行なった。エレクトロポレーションは、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（バイオラッド社製）を用いて行なった。得られた形質転換体をＳＯＣ培地に懸濁したのち、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有寒天培地上に蒔いて、３７℃一晩培養した。その結果、形質転換大腸菌約１０５〜１０６個のライブラリーが得られた。
（７）ｃＤＮＡクローンの５’端塩基配列解析
寒天培地上に生成したコロニーを拾い、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地に懸濁し、３７℃一晩培養した。培養液から菌体を遠心分離した後、アルカリ／ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを単離・精製した。このプラスミドを鋳型にして、キット（ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．０、ＡＢＩ社製）を用いてサイクルシーケンシング反応を行ない、蛍光ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ社製）によりｃＤＮＡの５’端塩基配列を決定した。
キャップアナログとしてｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐＧ（５）を用いて作製したモデルｍＲＮＡを鋳型にした場合、ｃＤＮＡインサートを有する２０クローン中、キャップ連続ｃＤＮＡを含むものは１５個であった。その中の１２クローンは、モデルｍＲＮＡには無い「ｄＧ」が、また１クローンは「ｄＴｄＧ」が、転写開始点のｄＧの前に余分に付加していた。他に、余分な「ｄＧ」を含まないものが２個、ｍＲＮＡの途中から始まるキャップ非連続ｃＤＮＡが５個含まれていた。なお、脱キャップ反応を行なわなくとも、生成する形質転換体の数、キャップ部位から始まるｃＤＮＡの割合、余分な「ｄＧ」の付加等は変わらなかった。
一方、キャップアナログとしてＡ（５’）ｐｐｐＧ（５）を用いて作製したモデルｍＲＮＡを鋳型にした場合、ｃＤＮＡインサートを有する２４クローン中、キャップ連続ｃＤＮＡを含むものは１８個であった。その中の１５クローンは、モデルｍＲＮＡには無い「ｄＡ」が、また１クローンは「ｄＴｄＡ」が、転写開始点のＧの前に余分に付加していた。他に、余分な「ｄＡ」を含まないものが２個、ｍＲＮＡの途中から始まるキャップ非連続ｃＤＮＡが６個含まれていた。
またいずれの場合にも、キャップ非連続ｃＤＮＡを有するクローンでは、モデルｍＲＮＡには本来無い余分な「ｄＧ」や「ｄＡ」が付加した物は見出せなかった。
さらに、キャップ構造を持たないモデルｍＲＮＡを鋳型として用いた場合には、ｃＤＮＡインサートを有する１９クローン中、転写開始点からの配列を含むものは１６個であった。その中の１４クローンは、転写開始点のＧの前に余分な配列を持たなかった。しかし、２クローンはモデルｍＲＮＡには無い「ｄＴ」が余分に転写開始点のＧの前に付加していた。他に、ｍＲＮＡの途中から始まるキャップ非連続ｃＤＮＡが３個含まれていた。
以上の結果から、この発明の方法によって、第一鎖ｃＤＮＡ合成の際にその鋳型となるｍＲＮＡのキャップ構造塩基「Ｇ」に相補的なヌクレオチド「ｄＣ」が付加され、第二鎖ｃＤＮＡ合成の際に第一鎖ｃＤＮＡ３’端の「ｄＣ」に相補的な「ｄＧ」が付加されることが示された。さらに、相補的な「ｄＧ」の後に、ｄＴが付加される場合も認められた。従って、ｃＤＮＡの５’端に「ｄＧ」あるいは「ｄＴｄＧ」が付加している場合には、キャップ連続ｃＤＮＡであることが示唆された。
（８）突出末端ベクタープライマーを用いたｃＤＮＡ合成
第一鎖ｃＤＮＡを合成後、ＥｃｏＲＩでベクタープライマーを切断し、５’突出末端を生成した後、セルフライゲーション反応を行なったところ、平滑末端ＥｃｏＲＶを有するベクタープライマーを用いた場合と同様に５’端に「ｄＧ」が付加したキャップ連続ｃＤＮＡクローンが得られた。従って、ｐＫＡ１ベクタープライマーの制限酵素切断末端は、平滑末端だけでなく、５’突出末端でも良いことが示された。また、平滑末端の場合に比べライゲーションの効率が高くなりｃＤＮＡライブラリーに含まれるクローンの数が多くなった。
【実施例２】
培養細胞ＨＴ−１０８０由来のｍＲＮＡを用いたｃＤＮＡライブラリー作製
ヒトフィブロサルコーマ細胞株ＨＴ−１０８０（大日本製薬から購入）からＡＧＰＣ法（ニッポンジーン社製キット）を用いて、全ＲＮＡを調製した。これをビオチン化オリゴ（ｄＴ）プライマー（プロメガ社製）に結合させ、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓを加えた後マグネットにかけて、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ０．３μｇとｐＫＡ１ベクタープライマー０．３μｇを用いて、実施例１と同じ条件でｃＤＮＡを合成し、大腸菌の形質転換を行ない、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。その結果、約１０５から１０６の形質転換体を含むライブラリーが得られた。脱キャップ反応を行なった場合と、行なわなかった場合の両方でライブラリーを作製したが、両者のライブラリーの解析結果に大きな差異は無かったので、以下に脱キャップ反応無しの結果についてのみ記載する。
上記ライブラリーから無作為にコロニーを選択し、プラスミドを単離した後、ｃＤＮＡの５’端の塩基配列を決定した。ｃＤＮＡインサートを有するもので、その配列が決定できたもの１９１クローンについて、ＧｅｎＢａｎｋの核酸データベースを用いてＢＬＡＳＴ検索を行なったところ、１８９クローンがｍＲＮＡ由来の遺伝子として登録されていた。全体の９４％に当たる１７８クローンは、すべて翻訳領域を含んでいた。含量がもっとも多いのが、リボソーム蛋白質Ｐ１と延長因子１−αであり、それぞれ５クローンづつ含まれていた。５’端の塩基配列は、５クローンすべてが、リボソーム蛋白質Ｐ１は５’−ＧＣＣＣＴＴＴＣＣＴＣＡＧＣＴＧＣＣＧＣ．．．、延長因子１−αは５’−ＧＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧ．．．であり、いずれも５’端の「ｄＧ」以外は、従来方法（ＤＮＡ−ＲＮＡキメラオリゴキャッピング法）で作製されたライブラリーから得られたもの（非特許文献６）と同じ配列を有していた。ゲノム配列と比較してみると、５’端にあるいずれの「ｄＧ」も、ゲノム配列には存在しておらず、ｃＤＮＡ合成の過程で付加したものであることが確認された。このことを裏付けるものとして、翻訳領域を含んでいる１７８クローン中、１６８クローンが「ｄＧ」から始まるものであった。他に、（ｄＴ）ｎｄＧ（ｎ＝１−５）から始まるものが６個あった。これらは、「ｄＧ」が付加した後、さらに「ｄＴ」が複数個付加したものと考えられる。
ｍＲＮＡ由来の遺伝子として未登録のものも２クローン含まれていたが、ゲノム配列の一部と完全に一致し、かつＥＳＴデータベースの中に同じ配列を有するものが少数存在していた。いずれもゲノムの配列には存在しない「ｄＧ」が付加した配列であった。したがって、この２クローンはまだ遺伝子として未同定の新規完全長ｃＤＮＡである可能性が高い。
ｍＲＮＡの途中から始まるもの（キャップ非連続ｃＤＮＡ）が、１１クローン含まれていた。これらのｃＤＮＡクローンの５’端配列が「ｄＧ」から始まるものも３クロー含まれていたが、いずれも本来のｍＲＮＡの配列に由来するものであり、新たに付加した「ｄＧ」を有するものは無かった。
以上の結果から、全体としてみると、ｃＤＮＡインサートを有する１９１クローンの中で、完全長（キャップ連続ｃＤＮＡ）であると思われるものが１８０クローン含まれていることから、完全長率は９４％という値になる。また、５’端配列が「ｄＧ」から始まる１７１クローンの中で、キャップ非連続ｃＤＮＡは３クローンであったことから、このｃＤＮＡライブラリーの場合、５’端配列が「ｄＧ」で始まるものでかつ翻訳領域を含んでいるものは、完全長ｃＤＮＡであることが９８％の確率で保証されていると言える。特に、ゲノムの配列には存在しない「ｄＧ」から始まるものは、ほぼ間違いなく完全長ｃＤＮＡであることが保証される。
【実施例３】
培養細胞ＨＴ−１０８０由来の全−ＲＮＡを用いたｃＤＮＡライブラリー作製
ヒトフィブロサルコーマ細胞株ＨＴ−１０８０から実施例２で調製した全ＲＮＡ５μｇとｐＫＡ１ベクタープライマー０．３μｇを用いて、実施例１と同じ条件（ただし、脱キャップ反応は省略）でｃＤＮＡを合成し、大腸菌の形質転換を行ない、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。その結果、約１０５の形質転換体を含むライブラリーが得られた。
このライブラリーに含まれるｃＤＮＡクローンについて、実施例２と同様に５’端の部分塩基配列解析を行なった。ｃＤＮＡインサートを有するもので、その配列が決定できたもの２２２クローンについて、ＧｅｎＢａｎｋの核酸データベースを用いてＢＬＡＳＴ検索を行なったところ、２１７クローンがｍＲＮＡ由来の遺伝子として登録されていた。全体の９６％に当たる２０９クローンは、すべて翻訳領域を含んでいた。これらの中で、１８９クローンは「ｄＧ」から始まるクローンであった。ここで特筆すべき点は、このライブラリーは、精製したポリ（Ａ）＋ＲＮＡからではなく、全ＲＮＡから作製したという点である。しかも、その量は５μｇという微量である。したがって、この方法を用いることにより、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの精製プロセスを省くことができ、かつ数μｇオーダーの全ＲＮＡから高品質の完全長ｃＤＮＡライブラリーを作製できることが示された。
【実施例４】
培養細胞ＡＲＰＥ−１９完全長ｃＤＮＡライブラリーの大規模配列解析
ヒト網膜色素上皮細胞株ＡＲＰＥ−１９（ＡＴＣＣから分譲）から調製したポリ（Ａ）＋ＲＮＡ２．５μｇとｐＫＡ１ベクタープライマー０．７μｇを用いて、実施例１と同じ条件でｃＤＮＡを合成し、大腸菌の形質転換を行ない、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。このライブラリーに含まれるｃＤＮＡクローンについて、実施例２と同様に５’端の部分塩基配列解析を行なった。ｃＤＮＡインサートを有するもので、その配列が決定できたもの３，６８３クローンについて、ＧｅｎＢａｎｋの核酸データベースを用いてＢＬＡＳＴ検索を行なったところ、３，６６２クローンがｍＲＮＡ由来の遺伝子として登録されていた。全体の９４％に当たる３，４７４クローンは、完全長ｃＤＮＡクローンであった。これらの中で、３，０６９クローンは「ｄＧ」あるいは「（ｄＴ）ｎｄＧ」から始まるクローンであった。
【実施例５】
ｐＧＣＡＰ１ベクタープライマーの作製
多機能クローニングベクターｐＫＡ１（非特許文献６）を出発材料にして、ｐＧＣＡＰ１を作製した。図３Ａにその構造の模式図を、配列表の配列番号１にその全塩基配列を示す。ｐＫＡ１との相違点は、（１）複製オリジンをｐＵＣ１９由来に変えたこと、（２）ｐＫＡ１の制限酵素部位ＨｉｎｄＩＩＩの上流にＰａｃＩを追加したこと、（３）ｐＫＡ１のＥｃｏＲＩ−ＢｓｔＸＩ−ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩ部位をＥｃｏＲＩ−ＡｆｌＩＩ−ＳｗａＩ−ＫｐｎＩに置換したことである。配列番号１の１番目ヌクレオチド「Ａ」はＨｉｎｄＩＩＩ部位に、また５６８番目がＥｃｏＲＩ部位に対応する。
ｐＧＣＡＰ１ １００μｇを２００ＵのＫｐｎＩで完全消化後、０．８％アガロース電気泳動にかけ、切断片を単離精製した。得られた切断片７０μｇを２０μＭ ｄＴＴＰ存在下、３７５Ｕの末端転移酵素（宝酒造社製）を添加し、３７℃３０分間反応させ、ＫｐｎＩ消化によって生成した３’突出末端に約６０個のｄＴテールを付加した。次いで反応生成物をＳｗａＩで消化し、０．８％アガロース電気泳動にかけ、長い方の切断片を単離精製した。これをｐＧＣＡＰ１ベクタープライマー（図３Ｂ）として用いた。
【実施例６】
ｐＧＣＡＰ１ベクタープライマーを用いたｃＤＮＡライブラリー作製
ヒトフィブロサルコーマ細胞株ＨＴ−１０８０の全ＲＮＡ５μｇと実施例５で調製したｐＧＣＡＰ１ベクタープライマー０．３μｇを用いて、実施例３と同じ条件でｃＤＮＡを合成し、大腸菌の形質転換を行ない、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。その結果、約２×１０５の形質転換体を含むライブラリーが得られた。このライブラリーに含まれるｃＤＮＡクローンについて、５’端の部分塩基配列解析を行なったところ、５’端に「ｄＧ」が付加した完全長ｃＤＮＡが得られ、実施例３と同様に完全長率は９５％であった。
ｐＫＡ１ベクタープライマーを用いた場合、ＥｃｏＲＶ切断末端（．．．ＧＡＴ）にＧが一個付加すると．．．ＧＡＴＧ．．．となり開始コドンＡＴＧが新たに生成する。このことは、キャップ連続ｃＤＮＡの配列を知ることが目的の場合は問題にならないが、このベクターを発現ベクターとして用いようとする場合は、余分なＡＴＧの存在はｃＤＮＡの正確な転写・翻訳に悪影響を及ぼす可能性がある。ｐＧＣＡＰ１ベクタープライマーを用いると、ＳｗａＩ切断末端（．．．ＡＴＴＴ）にＧが一個付加すると．．．ＡＴＴＴＧ．．．となり開始コドンは生成しないので、この問題は生じない。
さらに、第一鎖ｃＤＮＡを合成後、ＡｆｌＩＩでベクタープライマーを切断し、５’突出末端を生成した後、セルフライゲーション反応を行なったところ、平滑末端ＳｗａＩを有するベクタープライマーを用いた場合と同様に５’端に「ｄＧ」が付加したキャップ連続ｃＤＮＡクローンが得られた。ＡｆｌＩＩ切断末端（．．．ＣＴＴＡＡ）にＧが一個付加すると．．．ＣＴＴＡＡＧ．．．となり、ＡｆｌＩＩ切断部位の再形成が起こる。したがって、キャップ連続ｃＤＮＡクローンは、ＡｆｌＩＩによって切断可能となる。このことを利用すれば、ＡｆｌＩＩ消化によってキャップ連続ｃＤＮＡクローンかどうかを判定することもできる。
【実施例７】
培養細胞ＡＲＰＥ−１９完全長ｃＤＮＡライブラリーの発現プロフィール解析
ヒト網膜色素上皮細胞株ＡＲＰＥ−１９の全ＲＮＡ５μｇから、実施例４と同様にしてｃＤＮＡライブラリーを作製し、５’端の部分塩基配列解析を行なった。ｃＤＮＡインサートを有するもので、その配列が決定できたもの３，２０４クローンについて、ＧｅｎＢａｎｋの核酸データベースを用いてＢＬＡＳＴ検索を行なったところ、全体の９５％に当たる３，０３８クローンは、完全長ｃＤＮＡクローンであった。
これらの完全長ｃＤＮＡクローンのインサートのサイズ分布を調べてみたところ、最も短いものは０．１ｋｂｐ、最も長いものは１０ｋｂｐと広範囲の長さのインサートを有しており、平均鎖長は１．９４ｋｂｐであった。３ｋｂｐ以上の長鎖クローンも１６％を占めていた。
これらのクローンを分類したところ、１，４０８種類の遺伝子からなることが示された。最も多く含まれているのはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼｃＤＮＡであり、４４クローン（全クローンの１．４％）含まれていた。３クローン以上、すなわち０．１％以上の発現量を示すものは２３５種類のｃＤＮＡに留まり、９７１種類（全遺伝子の６９％）のｃＤＮＡは１クローンづつしかとれず、０．０３％以下の低い発現量の遺伝子であることが示された。また、ゲノム配列には一致するが、データベースにまだ遺伝子として登録されていない非常に発現量の少ないと思われる新規遺伝子クローンも含まれていた。このように、得られたｃＤＮＡライブラリーは、発現量の低い遺伝子をも数多く含み、冗長度の低い高品質のライブラリーであることが確認された。
以上の解析の結果、この発明の方法で作製したｃＤＮＡライブラリーは、完全長ｃＤＮＡクローンの含有率が高いだけでなく、遺伝子の鎖長や発現量によるバイアスがかからずに、細胞内で発現しているｍＲＮＡの発現量を忠実に反映していることが示唆された。したがって、この方法は完全長ｃＤＮＡクローンを取得する目的だけでなく、細胞内で発現している遺伝子の発現プロフィールを解析するためにも有効である。
【実施例８】
ｐＧＣＡＰ１０ベクタープライマーの作製とこれを用いたｃＤＮＡライブラリー作製
ｐＧＣＡＰ１を出発材料にして、ｐＧＣＡＰ１０を作製した。図４Ａにその構造の模式図を、配列表の配列番号２にその全塩基配列を示す。ｐＧＣＡＰ１との相違点は、ＥｃｏＲＩ−ＡｆｌＩＩ−ＳｗａＩ−ＫｐｎＩ部位をＳｗａＩ−ＥｃｏＲＩ−ＦｓｅＩ−ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩに置換したことである。実施例５と同様にしてｐＧＣＡＰ１０のＫｐｎＩ ３’突出末端に約６０個のｄＴテールを付加した。次いで反応生成物をＥｃｏＲＶで消化し、長い方の切断片をｐＧＣＡＰ１０ベクタープライマー（図４Ｂ）として用いた。このベクタープライマー０．３μｇとヒトフィブロサルコーマ細胞株ＨＴ−１０８０の全ＲＮＡ５μｇを用いて、実施例３と同じ条件で第一鎖ｃＤＮＡを合成したのち、ＥｃｏＲＩ消化によってベクター側の末端を５’突出末端とした。セルフライゲーションを行なった後、ｍＲＮＡ鎖をＤＮＡ鎖に置換する工程を省いて大腸菌の形質転換を行ない、ｃＤＮＡライブラリーを作製したところ、約１０６の形質転換体を含むライブラリーが得られた。このライブラリーに含まれるｃＤＮＡクローンについて、５’端の部分塩基配列解析を行なったところ、５’端に「ｄＧ」が付加した完全長ｃＤＮＡが得られ、実施例３と同様に完全長率は９５％であった。
【産業上の利用可能性】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、１μｇオーダーの全ＲＮＡから、ＰＣＲを使用せずに、少ない工程で、転写開始点ヌクレオチドからの連続配列を有することが保証された完全長ｃＤＮＡを、９０％以上の高収率で合成することが可能となる。これによって遺伝子がコードしている蛋白質の一次構造に関する情報と、遺伝子の発現を調節している発現制御領域に関する情報を確実に得ることが可能となり、ゲノム情報を有効に活用できるばかりか、医療分野等における有用蛋白質の遺伝子工学的製造にも大きく貢献する。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【技術分野】
この出願の発明は、ｃＤＮＡの合成方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、ｍＲＮＡのキャップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有するｃＤＮＡを、簡便かつ高効率で合成する新しい方法に関するものである。
【背景技術】
ゲノムプロジェクトによって、ヒト、マウス、イネ、線虫、酵母など様々な生物の全遺伝子情報を網羅するゲノムＤＮＡ（染色体ＤＮＡ）の全長配列がほぼ決定された。これらのゲノムの全長配列から期待されることは、遺伝子がコードしている蛋白質の一次構造に関する情報と、遺伝子の発現を調節している発現制御領域（プロモーター、エンハンサー、サプレッサー等）に関する情報である。これら二つの情報をゲノム配列から抽出するためには、染色体ＤＮＡの遺伝子領域から転写されるｍＲＮＡの配列情報が必須であるが、このｍＲＮＡの配列情報を解析するためには、ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ：ｃＤＮＡ）が通常用いられている。特に、前記二つの情報を得るためには、遺伝子転写領域から正確に転写され、かつ、蛋白質コード領域の全てを含むｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ（完全長ｃＤＮＡ）を取得する必要がある。
通常、完全長ｃＤＮＡに対しては、二つの条件が設定されている。一つは、ゲノムＤＮＡの転写開始点から始まる配列を有することである。転写開始点から正しく転写されたｍＲＮＡの５’端には「キャップ構造」が付加される。このキャップ構造は、７？メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）が転写開始点ヌクレオチドに５’−５’三リン酸橋を介して結合したものであり、このキャップ構造を有するｍＲＮＡに対して相補的なｃＤＮＡは完全長ｃＤＮＡの一つの条件を満たすことになる。もう一つの指標は、ｍＲＮＡにおける「ポリ（Ａ）テール」の存在である。このポリ（Ａ）テールは、ゲノムＤＮＡから転写されたｍＲＮＡの３’端に核内で付加される数十から２００個のアデニン（Ａ）連続配列である。従って、５’側にキャップ構造を有し、３’側にポリ（Ａ）テールを有するｍＲＮＡを鋳型として正確に合成されたｃＤＮＡは、完全長ｃＤＮＡの二つの条件（転写開始点から始まり、蛋白質コード領域の全てをカバーする）を満たすことになる。
ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応により合成することができるが、染色体ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡは細胞内で、あるいは細胞外への抽出およびＤＮＡ鎖への合成過程で様々な分解反応に曝されるため、完全長ｃＤＮＡの合成は容易ではない。また、ｍＲＮＡを鋳型とする逆転写反応は、ｍＲＮＡの３’側にプライマーオリゴヌクレオチドをアニールさせ、このプライマーからｍＲＮＡの５’方向へＤＮＡ鎖（第一鎖ｃＤＮＡ）を合成する。従って、例えば、ポリ（Ａ）テールにプライマー（オリゴｄＴ）をアニールすれば、ポリ（Ａ）テールをカバーするｃＤＮＡは比較的容易に得ることができる。しかしながら、この方法は、プライマーからキャップ構造までの完全長ｃＤＮＡ合成を保証しない。ｍＲＮＡが分解していたり、ＤＮＡ鎖の合成反応が途中で中断することが頻繁に生じるためである。事実、現在までにＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ）として膨大な数の配列情報が報告されているが、これらは分解したｍＲＮＡから生成した不完全ｃＤＮＡや、ＤＮＡ合成反応が中断された不完全ｃＤＮＡに由来するものが大半である。
そこで、ｍＲＮＡの５’端に存在するキャップ構造までの配列を含む完全長ｃＤＮＡを合成する方法が数多く提案されている。これらの方法は、原理に基づき次の４つに大きく分類することができる。
（１）テーリング法
キャップ部位まで伸長した第一鎖ｃＤＮＡに、末端転移酵素によってホモオリゴマーテールを付加する方法であり、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法（非特許文献１）やＰｒｕｉｔｔ法（非特許文献２）がこれに含まれる。付加したテールの数を厳密に制御することができないため、数が多すぎると塩基配列の解析が困難になる等の問題点を有している。
逆転写酵素の末端転移酵素活性によって第一鎖ｃＤＮＡの３’端に付加したｄＣテールを利用する鋳型スイッチ法（特許文献１）もこのテーリング法に含まれる。この際、付加されるｄＣの数は、３〜５個と記載されている（非特許文献３）。
（２）リンカーライゲーション法
第一鎖ｃＤＮＡを合成後、アルカリ処理やＲＮａｓｅＨ処理によってｍＲＮＡを分解除去した後、一本鎖ｃＤＮＡの３’端に、配列既知の一本鎖オリゴヌクレオチドリンカーをＴ４ ＲＮＡリガーゼを用いて連結する方法である（非特許文献４）。一本鎖ｃＤＮＡが二次構造を形成するため高品質のｃＤＮＡライブラリーを作製するには向かない。
（３）オリゴキャッピング法
キャップ構造をオリゴマーで置換する方法である。オリゴマーとして、ＲＮＡオリゴマー（非特許文献５）やＤＮＡ−ＲＮＡキメラオリゴマーを用いる方法（例えば、この出願の発明者らによる特許文献１、非特許文献６）が報告されている。原理的には、完全長ｃＤＮＡのみが合成されるはずであるが、約５−１０μｇという多量のポリ（Ａ）＋ＲＮＡを必要とし、ｍＲＮＡを処理する工程が多く、この段階で分解されたｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡが含まれる場合もある。ｍＲＮＡの分解を抑えるために、全ＲＮＡを出発材料とすることにより、完全長率を９０％以上とした例もあるが、工程数は変わらない（特許文献２）。
過ヨウ素酸酸化反応によってキャップ構造の糖を開裂した後、合成オリゴマーを付加する方法（特許文献３）もこの方法に含まれる。
（４）キャップトラッピング法
キャップ構造を有するｍＲＮＡを選別して鋳型とする方法であり、抗キャップ抗体によって選別したｍＲＮＡを鋳型にする方法（非特許文献７）や、過ヨウ素酸酸化反応によってキャップ構造の糖を開裂した後、ビオチンを付加し、アビジン固定化担体で選別したｍＲＮＡを鋳型として用いる方法（非特許文献８）などがある。
【特許文献１】：米国特許第５，９６２，２７２号
【特許文献２】：特許３３３７７４８号
【特許文献３】：国際公開第０１／０４２８６号パンフレット
【特許文献４】：米国特許第６，０２２，７１５号
【非特許文献１】：Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１６１−１７０，１９８２．
【非特許文献２】：Ｐｒｕｉｔｔ，Ｓ．Ｃ．，Ｇｅｎｅ ６６：１２１−１３４，１９８８．
【非特許文献３】：ＣＬＯＮＴＥＣＨｎｉｑｕｅｓ，Ｊｕｌｙ １９９７，ｐ．２６．
【非特許文献４】：Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｊ．，Ｄｅｌｏｒｔ，Ｊ．，ａｎｄ Ｍａｌｌｅｔ，Ｊ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：５２２７−５２３２，１９９１．
【非特許文献５】：Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ ａｎｄ Ｓｕｇａｎｏ，Ｓ．Ｇｅｎｅ １３８：１７１−１７４，１９９４．
【非特許文献６】：Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １５０：２４３−２５０，１９９４．
【非特許文献７】：Ｅｄｅｒｙ，Ｉ，Ｃｈｕ，Ｌ．Ｌ．，Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎ．，ａｎｄ Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：３３６３−３３７１，１９９５．
【非特許文献８】：Ｃａｒｎｉｎｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３７：３２７−３３６，１９９６．
【発明の開示】
前記のいずれの従来方法によっても完全長ｃＤＮＡの合成は可能である。しかしながら、合成されたｃＤＮＡのうち、完全長ｃＤＮＡが占める割合がどれだけ多くとも、分解したｍＲＮＡに由来する不完全ｃＤＮＡや、ＤＮＡ合成が途中で中断して生成した不完全ｃＤＮＡも必ず含まれる。このため、合成されたｃＤＮＡがキャップ構造を有する完全長ｍＲＮＡに由来するものであるか否かを判定する必要がある。一般的には、同じ５’端配列を有するクローンが複数個存在すれば、それらは完全長ｍＲＮＡに由来するものである可能性は高いが、断定はできない。とりわけ、複数の転写開始点を有する遺伝子の場合には、完全長ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡクローンであるか、５’端が欠失した分解産物由来のクローンであるかを決定することは極めて困難である。
従って、完全長ｃＤＮＡを高い割合で合成し、かつ転写開始点から始まる配列を有していることを識別することのできるｃＤＮＡ合成方法が求められている。
また、前記のいずれの従来方法も、多くの工程を必要とするという問題点を有している。例えば、特許文献１のオリゴキャッピング法は、確実にキャップ部位からの塩基配列を含むｃＤＮＡを合成可能であるという点において優れた方法ではあるが、ｃＤＮＡの合成までに８工程を要する。工程の増大は、ｃＤＮＡの合成収率の低下や、時間や労力、コストの増加といった問題を引き起こす。
さらに、従来法のいくつかはＰＣＲによる増幅工程を含んでいる（非特許文献４、５）。しかしながら、ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼはポリメラーゼ反応時に鋳型と異なるヌクレオチドを取り込む頻度が高いため、ｃＤＮＡ配列中に人工的な変異を生成するという問題点を有していた。
従って、微量のＲＮＡから、ＰＣＲを使用せずに少ない工程で完全長ｃＤＮＡの合成を可能とする方法が求められていた。
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、以下の条件：
（１）１μｇオーダーの全ＲＮＡを出発材料とすること；
（２）ＰＣＲを使用しないこと；
（３）できるだけ少ない工程であること；
（４）転写開始点ヌクレオチドからの連続配列を有することが保証された完全長ｃＤＮＡを９０％以上の高収率で合成すること、
を満たす方法を提供することを課題としている。従来方法の中には、これらの要件をすべて満たすものはない。
前記の課題を解決するための第１の発明は、ｍＲＮＡのキャップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有するｃＤＮＡを合成する方法であって、
（ｉ）キャップ構造を有するｍＲＮＡを含むＲＮＡ混合物に、二本鎖ＤＮＡプライマーをアニールする工程、
（ｉｉ）二本鎖ＤＮＡプライマーから逆転写酵素により第一鎖ｃＤＮＡを合成してｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体を調製する工程、および
（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体のｃＤＮＡを含むＤＮＡ鎖の３’端と５’端を、リガーゼを用いて連結し環状化する工程、
を含むことを特徴とする方法である。
この第１発明の方法においては、キャップ構造を有するｍＲＮＡが細胞抽出物中に含まれていること、またはキャップ構造を有するｍＲＮＡがインビトロ転写によって合成されたものであることをそれぞれ好ましい態様としている。
またこの第１発明の方法においては、二本鎖ＤＮＡプライマーのプライマー配列が、キャップ構造を有するｍＲＮＡの部分配列に相補的な配列を含むこと、またはキャップ構造を有するｍＲＮＡのポリ（Ａ）配列に相補的なオリゴｄＴを含むことをそれぞれ好ましい態様としている。
さらにこの第１発明の方法においては、リガーゼがＴ４ ＲＮＡリガーゼであることを別の好ましい態様としている。
この第１発明の方法においては、工程（ｉｉ）と工程（ｉｉｉ）の間に、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体を制限酵素で切断することにより、二本鎖ＤＮＡプライマーの端部に５’突出末端あるいは平滑末端を生成する工程（ｉｉ’）を含むことを別の好ましい形態としている。
第２発明は、前記第１発明の方法に加え、さらに以下の工程：
（ｉｖ）ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体のＲＮＡ鎖をＤＮＡ鎖に置換して第二鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
を含むことを特徴とするｃＤＮＡ合成方法である。
この第２発明の方法においては、二本鎖ＤＮＡプライマーが複製オリジン、または複製オリジンとｃＤＮＡ発現用プロモーターを含んでいることを好ましい態様としている。
この第２発明の方法によって、合成された二本鎖ｃＤＮＡを含むクローンが得られる。
この第２発明の方法は、さらには以下の工程：
（ｖ）第一鎖ｃＤＮＡと第二鎖ｃＤＮＡとからなる二本鎖ｃＤＮＡをベクターＤＮＡの一部とする工程、
を含むことを別の好ましい態様としている。これによって、合成された二本鎖ｃＤＮＡがベクターにクローニングされる。
第３発明は、前記第２発明の方法によって合成された二本鎖ｃＤＮＡを含むクローンの集団であって、５’端にヌクレオチド（ｄＴ）ｎ ｄＧ（ｎ＝０〜５）を有し、これに連続してｍＲＮＡのキャップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有するｃＤＮＡのクローンを６０％以上含むことを特徴とするｃＤＮＡライブラリーである。
第４発明は、前記第３発明のｃＤＮＡライブラリーのクローンから、ｍＲＮＡのキャップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有するｃＤＮＡのクローンを選択する方法であって、５’端ヌクレオチドが（ｄＴ）ｎ ｄＧ（ｎ＝０〜５）であるｃＤＮＡを含むクローンを目的クローンとする方法である。
第５発明は、プライマー部分がオリゴ（ｄＴ）ｎ（ｎ＝１５〜１００）からなり、プライマー側の末端部分に８塩基認識制限酵素切断部位ＲＥ１を有し、もう一方の末端部に８塩基認識制限酵素切断部位ＲＥ２と５’突出末端あるいは平滑末端を生成する制限酵素部位ＲＥ３を有する二本鎖ＤＮＡプライマーである。
第５発明の二本鎖ＤＮＡプライマーは、複製オリジン、または複製オリジンとｃＤＮＡ発現用プロモーターを含んでいることを好ましい態様としている。そして、この第５発明の二本鎖ＤＮＡプライマーの具体例は、配列番号２の塩基配列を有するｐＧＣＡＰ１０由来のベクタープライマーである。
第６発明は、二本鎖ＤＮＡプライマー、逆転写酵素と反応緩衝液、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼと反応緩衝液、キャップ付加モデルｍＲＮＡを含むｃＤＮＡ合成用試薬キットである。
前記のとおりの発明は、少なくとも
（ｉ）ｍＲＮＡへの二本鎖ＤＮＡプライマーのアニール、
（ｉｉ）第一鎖ｃＤＮＡの合成によるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体の調製、および
（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体のｃＤＮＡを含むＤＮＡ鎖の３’端と５’端の連結、
という三段階の工程によって、ｍＲＮＡのキャップ構造に連続する塩基配列を有するｃＤＮＡを高効率で合成する方法である。
すなわちこの発明は、キャップ構造を有するｍＲＮＡが鋳型となる場合には、前記工程（ｉｉ）によって、キャップ構造の塩基が「Ｇ」の場合には「ｄＣ」［または５’−ｄＣ（ｄＡ）ｎ−３’（ｎ＝１−５）］が第一鎖ｃＤＮＡの３’端に付加されることを見いだして完成された。キャップ構造の塩基が「Ａ」の場合には「ｄＴ」［または５’−ｄＴ（ｄＡ）ｎ−３’（ｎ＝１−５）］が第一鎖ｃＤＮＡの３’端に付加されることから、付加されるヌクレオチドはキャップ構造の塩基に相補的な塩基を有するものであることが示された。また、キャップ構造を有さないＲＮＡを鋳型にした場合には、第一鎖ｃＤＮＡの３’端に余分なヌクレオチドの付加は認められなかった。したがって、ｃＤＮＡの５’端に余分な「ｄＧ」［または５’−（ｄＴ）ｎ ｄＧ−３’（ｎ＝１−５）］が存在する場合には、このｃＤＮＡはキャップ構造を有するｍＲＮＡに由来する完全長ｃＤＮＡであると判定できる。逆転写酵素の反応条件によっては、余分な「ｄＧ」が２個以上付加する場合もあるので（非特許文献３）、一般的にはｃＤＮＡの５’端に（ｄＮ）ｎ ｄＧ（ｄＮはｄＴまたはｄＧ、ｎ＝０〜５）が存在する場合には、このｃＤＮＡはキャップ構造を有するｍＲＮＡに由来する完全長ｃＤＮＡであると判定できる。ただし、余分な「ｄＧ」が２個以上付加する場合、どれが余分な「ｄＧ」なのか判定が困難なので、実施例のように余分な「ｄＧ」が１個付加する条件で行なうのが好ましい。
なお、鋳型スイッチ法では３〜５個のｄＣが付加されると記載されているが（非特許文献３）、この発明の実施例の条件下においては、そのような複数個のｄＣ付加は認められなかった。また、逆転写酵素の末端転移酵素様活性により、第一鎖ｃＤＮＡの３’端に優先的にｄＣが一個付加されるという報告があるが（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｗ．Ｍ．ａｎｄ Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｍ．Ｗ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：ｅ３１，１９９９）、その機構に関する報告はない。さらに、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロデュプレックス（この発明におけるキャップ構造を有さないＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスに相当する）に逆転写酵素を作用させると、ＤＮＡの３’端の９０％に一個のヌクレオチド（「ｄＡ」あるいは「ｄＧ」あるいは「ｄＣ」あるいは「ｄＴ」）が付加するという報告があるが（Ｃｈｅｎ，Ｄ．ａｎｄ Ｐａｔｔｏｎ，Ｊ．Ｔ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３０：５７４−５８２，２００１）、この発明の実施例の条件下においては、そのような付加はほとんど認められなかった。
なお、この発明において、「ヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ；またはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）を言う。以下の説明において、前記のヌクレオチドはそれぞれ単に「Ａ」、「Ｇ」、「Ｃ」、「Ｕ」、または「ｄＡ」、「ｄＧ」、「ｄＣ」、「ｄＴ」と記載することがある。また「相補的」とは、前記ヌクレオチドの「Ａ」または「ｄＡ」と「Ｕ」または「ｄＴ」、「Ｇ」または「ｄＧ」と「Ｃ」または「ｄＣ」との水素結合による対合を意味する。
また、「二本鎖ＤＮＡプライマー」とは、二本鎖ＤＮＡの片方のＤＮＡ鎖の３’端が突出しており、この突出した部分の塩基配列が鋳型ｍＲＮＡ配列に相補的な塩基配列を有するものを言う。この突出した部分は、鋳型ｍＲＮＡにハイブリダイズし、逆転写酵素による第一鎖ｃＤＮＡ合成時のプライマーとして働く。二本鎖ＤＮＡが複製オリジンを有するものを、特に「ベクタープライマー」と言う。
またさらに、この発明において「キャップ構造を有するｍＲＮＡ」は、ゲノムＤＮＡからの転写産物ｍＲＮＡの５’端に、メチル化されたグアニン（Ｇ）を有するグアノシンが５’−５’三リン酸結合（ｍＧｐ５’−５’ｐｐ）した分子であり、例えばＧの第７位がメチル化されたキャップ構造の場合には以下の構造：
（なお、ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＵ、ｍは５０以上の正数）
を有している。
この発明における「ｍＲＮＡのキャップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有するｃＤＮＡ」とは、前記のｍＲＮＡ構造（ａ）におけるＮ１〜Ｎｍ配列に相補的なｃＤＮＡの３’端に５’−ｄＣ（ｄＡ）ｎ−３’（ｎ＝０−５）（より一般的には、５’−ｄＣ（ｄＮ）ｎ−３’（ｄＮはｄＡまたはｄＣ、ｎ＝０〜５））が付加したｃＤＮＡ（第一鎖ｃＤＮＡ）：
（なお、ｄＮはｄＡ、ｄＧ、ｄＣまたはｄＴ）
と、このｃＤＮＡ（ｂ）に対してさらに相補的なｃＤＮＡ（第二鎖ｃＤＮＡ）：
およびｃＤＮＡ（ｂ）／（ｃ）のデュプレックス（二本鎖ｃＤＮＡ）を全て意味する。ただし、単に「ｃＤＮＡ」と言う場合には二本鎖ｃＤＮＡを言い、その塩基配列について言及する場合には、前記構造（ｃ）の第二鎖ｃＤＮＡのものを言う。
また、前記のｍＲＮＡ構造（ａ）におけるＮ１は、転写開始点のヌクレオチドであることから、「ｍＲＮＡのキャップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有するｃＤＮＡ」とは、「転写開始点ヌクレオチドからの連続配列を有するｃＤＮＡ」と定義することもできる。
以下の説明においては、「ｍＲＮＡのキャップ構造に隣接するヌクレオチド（転写開始点ヌクレオチド）からの連続配列を有するｃＤＮＡ」を、「キャップ連続ｃＤＮＡ」と記載することがある。また、このキャップ連続ｃＤＮＡのうち、特にｍＲＮＡのポリ（Ａ）配列までを含むものを「完全長ｃＤＮＡ」と記載することがある。さらに、キャップ構造に隣接するヌクレオチド（前記の構造（ｂ）または（ｃ）における少なくともｄＮ１）を含まないｃＤＮＡを「キャップ非連続ｃＤＮＡ」と記載することがある。またさらに、「キャップ構造を有するｍＲＮＡ」を「キャップ（＋）ｍＲＮＡ」、「キャップ構造を持たないｍＲＮＡ」を「キャップ（−）ｍＲＮＡ」、キャップ（＋）ｍＲＮＡからキャップ構造を除去したものを「脱キャップｍＲＮＡ」と記載することがある。
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、この発明の遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，１９９５等に記載されている。
【図面の簡単な説明】
図１は、この発明の基本工程を示した模式図である。
図２は、この発明のベクタープライマーの一般的な構造を例示した模式図である。
図３は、この発明のｐＧＣＡＰ１並びにｐＧＣＡＰ１ベクタープライマーの構造を例示した模式図である。
図４は、この発明のｐＧＣＡＰ１０並びにｐＧＣＡＰ１０ベクタープライマーの構造を例示した模式図である。
【発明を実施するための最良の形態】
第１の発明は、キャップ連続ｃＤＮＡ（第一鎖ｃＤＮＡ）を合成する方法であって、以下の工程（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を必須として含むことを特徴としている（図１参照）。
工程（ｉ）： キャップ構造を有するｍＲＮＡを含むＲＮＡ混合物に、二本鎖ＤＮＡプライマーをアニールする。
工程（ｉｉ）： 二本鎖ＤＮＡプライマーから逆転写酵素により第一鎖ｃＤＮＡを合成してｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体を調製する。
工程（ｉｉｉ）： ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体のｃＤＮＡを含むＤＮＡ鎖の３’端と５’端を、リガーゼを用いて連結し環状化する。
工程（ｉ）において、「キャップ付加ｍＲＮＡを含むＲＮＡ混合物」は、実質的にキャップ付加ｍＲＮＡのみからなるものであってもよく、その他に、例えば「キャップ（−）ｍＲＮＡ」および／または「他のＲＮＡ分子（例えばｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ等）」を含んでいてもよい。このようなＲＮＡ混合物は、単細胞真核生物由来のものであってもよく、多細胞真核細胞由来のものであってもよい。またこのＲＮＡ混合物は、ＤＮＡを鋳型としてインビトロ転写により合成されたものでもよく、あるいは細胞抽出物としての全ＲＮＡであってもよい。この工程（ｉ）において、ＲＮＡ混合物は、例えば全ＲＮＡの場合は１μｇ以下でもｃＤＮＡの合成は可能であるが、好ましくは１μｇ以上を使用する。細胞から抽出される全ＲＮＡの場合、ｍＲＮＡは２−３％であり、この発明の方法ではこのような少量のｍＲＮＡを含む全ＲＮＡからキャップ連続ｃＤＮＡや完全長ｃＤＮＡを合成することが可能である。
工程（ｉ）で使用する「二本鎖ＤＮＡプライマー」は、その３’突出末端として「プライマー配列」を備えている。この場合のプライマー配列は、例えば、対象となるキャップ付加ｍＲＮＡの部分配列情報が公知の場合は、この公知配列に基づいて公知の化学合成法（例えば、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４７：４１１−４１８，１９８２；Ａｄａｍｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１，１９８３；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２５：３４４０−３４４４，１９９７；Ｆｒｅｎｋｅｌ，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９：３７３−３８０，１９９５；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：７８８６−７８９６，１９９４；Ｎａｒａｎｇ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０，１９７９；Ｂｒｏｗｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９，１９７９；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９，１９８１；米国特許第４，４５８，０６６号に記載されているような方法など）により作製することができる。例えば公知のＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ）配列はｃＤＮＡの３’側部分配列がほとんどであるが、これらの配列に基づいて作製したプライマー配列を用いることによって、そのＥＳＴ配列より５’側のキャップ連続ｃＤＮＡを取得することができる。また、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）配列に相補的なオリゴｄＴを含むプライマーを使用することもできる。オリゴｄＴを構成する連続したｄＴの数は、３０〜７０個程度が好ましく用いられる。このようなオリゴｄＴプライマーの使用によって、ポリ（Ａ）部位までを含むキャップ連続ｃＤＮＡ（完全長ｃＤＮＡ）を取得することができる。一方、このような二本鎖ＤＮＡプライマーのプライマー配列の他端部は、特に制限はなく、任意の二本鎖ＤＮＡとすることができるが、後の工程においてベクターＤＮＡへの挿入連結を容易とするように、ベクターＤＮＡのクローニングサイトへの連結末端を端部に備えるようにすることが好ましい。
工程（ｉｉ）においては、ｍＲＮＡにアニールした二本鎖ＤＮＡプライマーに逆転写酵素を作用させ、二本鎖ＤＮＡプライマーの３’端からｍＲＮＡの５’方向に相補的なｃＤＮＡ鎖を合成する。この工程により、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体が形成される。この連結体では、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスのｃＤＮＡ鎖の一端と二本鎖ＤＮＡプライマーの片側鎖の一端が連結している。またこの工程（ｉｉ）で生成されるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスのｃＤＮＡは、キャップ（＋）ｍＲＮＡに相補的で、かつ３’端にｄＣまたは５’−ｄＣ（ｄＡ）ｎ−３’を付加したキャップ連続ｃＤＮＡ、またはキャップ（−）ｍＲＮＡに由来するキャップ非連続ｃＤＮＡである。
逆転写酵素としては、Ｍ−ＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）やＡＭＶ（ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）由来の逆転写酵素が利用できるが、内在性のＲＮａｓｅＨ活性を無くしたものが好ましい。
この工程（ｉｉｉ）におけるリガーゼとしては、各種のＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼを適宜に選択して使用できるが、好ましくはＴ４ ＲＮＡリガーゼを使用する。なお、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼによって、ＲＮＡにハイブリダイズさせた２本のオリゴデオキシヌクレオチド同士を連結する方法（米国特許第６，３６８，８０１号）が報告されているが、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスに二本鎖ＤＮＡを連結した例はない。また、ライゲーションは、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体を制限酵素で切断することにより、二本鎖ＤＮＡプライマーの端部に５’突出末端あるいは平滑末端を生成させる工程（ｉｉ’）を行なった後、行なうことも好ましい。工程は一つ増えるが、ｃＤＮＡインサートの入っていないベクターだけのバックグラウンドが減少することと、ライゲーション効率が上がるといった利点がある。また、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスのキャップ構造を、例えばタバコ酸性ピロホスファターゼを用いて除去してから行っても良いが、そのキャップ構造を残存させたまま行ってもよい。さらに、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスのｍＲＮＡを分解したり、あるいはｍＲＮＡ鎖をＤＮＡ鎖に置換してからライゲーションを行なってもよい。ただし、この工程で生成するｍＲＮＡ分解産物が、ｃＤＮＡの３’端に付加する場合があるので、注意を要する。
以上の方法によって、
からなるキャップ連続ｃＤＮＡ（第一鎖ｃＤＮＡ）を一部とする環状ＤＮＡ鎖が合成される。このようにして得られたキャップ連続ｃＤＮＡは、例えばその配列解析とゲノム配列との比較によって、遺伝子の転写開始点やその上流の発現制御領域を特定するために情報を提供する。
以上の方法により得られたキャップ連続ｃＤＮＡ（第一鎖ｃＤＮＡ）は、第２発明の工程（ｉｖ）によって二本鎖ｃＤＮＡへと合成される。この工程（ｉｖ）は、例えば、ＲＮａｓｅＨ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ等を作用させてＲＮＡ鎖をＤＮＡ鎖に置換する方法によって行うことができる。この工程はかならずしも試験管内で行なう必要はなく、例えば、二本鎖ＤＮＡプライマーとして「ベクタープライマー」を用いれば、ライゲーション後、大腸菌などに導入し、細胞内でＲＮＡ鎖をＤＮＡ鎖に置換してもよい。
また第２発明の方法では、二本鎖ｃＤＮＡを、工程（ｖ）によってベクターにクローニングすることもできる。例えば、二本鎖ＤＮＡ部分に備えられた制限酵素部位で切断後、プラスミドベクターやファージベクターなどに挿入するなどして、配列解析やその発現産物の産生等に使用することができる。
なお、この第２発明の方法では、二本鎖ＤＮＡプライマーとして「ベクタープライマー」を用いれば、他のベクターへの挿入工程を省略することができるので好ましい。ベクタープライマーは、例えば、環状ベクターＤＮＡを適当なクローニングサイトで制限切断し、その３’端にｍＲＮＡの一部配列に相補的なプライマー配列を連結して３’突出末端とすることによって作製することができる。また、完全長ｃＤＮＡを合成するためには、３’端にオリゴｄＴ（好ましくは、３０〜７０個）を連結すればよい。３’突出末端としてオリゴｄＴを有する二本鎖ＤＮＡプライマーは、例えば完全長ｃＤＮＡライブラリーを効率良く作製するなどの目的には特に好ましい。また、ｃＤＮＡを切り出して他のベクターに組み換えることを容易にするために、二本鎖ＤＮＡ部分に８塩基認識の制限酵素部位を備えることも好ましい。さらにまた、二本鎖ＤＮＡ部分に複製オリジンを備えるようにすることも好ましい。複製オリジンとしては、大腸菌などの原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞などの真核細胞内で機能するものが用いられる。これによって、最終的に得られたｃＤＮＡベクターをこれらの細胞に導入して、複製することが可能となる。さらに、ｃＤＮＡをインビトロ転写・翻訳により試験管内で発現させたり、真核細胞内に導入して発現させたりできるように、二本鎖ＤＮＡ部分にプロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位などを備えることも好ましい。
このような二本鎖ＤＮＡプライマー（第５発明）は、適当なベクターＤＮＡを出発材料として適宜にデザインしてもよく、あるいは公知のもの（例えば、ｐＫＡ１ベクタープライマー（一端に約６０個の３’突出末端ｄＴテールを有し、もう一端がＥｃｏＲＶ平滑末端［Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １５０：２４３−２５０，１９９４］）等を使用することもできる。この発明の二本鎖ＤＮＡプライマーの一般的な構造を図２に示した。プライマー配列として６０±１０個のｄＴを有している。もう一方の末端部は、平滑末端、突出末端いずれでも良い。プライマー配列を含む末端部に８塩基認識制限酵素部位ＲＥ１を有し、もう一方の末端部に８塩基認識制限酵素部位ＲＥ２と５’突出末端あるいは平滑末端を生成する制限酵素部位ＲＥ３を有することが好ましい。８塩基認識制限酵素部位としては、ＮｏｔＩ、Ｓｓｅ８３８７Ｉ、ＰａｃＩ、ＳｗａＩ、ＳｆｉＩ、ＳｇｒＡＩ、ＡｓｃＩ、ＦｓｅＩ、ＰｍｅＩ、ＳｒｆＩなどが利用できる。この発明において作製したｐＧＣＡＰ１ベクタープライマーは、ＲＥ３としてＡｆｌＩＩ部位（ＣＴＴＡＡＧ）を設けてあるが、このＡｆｌＩＩ ５’突出末端（．．．ＣＴＴＡＡ）に第一鎖ｃＤＮＡの３’端が連結すると、「キャップ連続ｃＤＮＡ」の場合、５’突出末端に「ｄＧ」が付加して、．．．ＣＴＴＡＡＧ．．．となり、ＡｆｌＩＩの切断認識配列が復活する。したがって、「キャップ連続ｃＤＮＡ」クローンは、ＡｆｌＩＩによって切断可能となる。このことを利用すれば、ＡｆｌＩＩ消化によってキャップ連続ｃＤＮＡクローンかどうかを判定することもできる。他にも「ｄＧ」付加によって切断認識配列が復活するＭｕｎＩ（ＣＴＴＡＡＧ）、ＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）等も利用できる。さらに、この発明において作製したｐＧＣＡＰ１０ベクタープライマーは、ＲＥ１としてＮｏｔＩ、ＲＥ２としてＳｗａＩ、ＲＥ３としてＥｃｏＲＩを有する。
この出願の第３発明は、前記第２発明の方法によって最終的に作製されたｃＤＮＡベクターの集団からなる「ｃＤＮＡライブラリー」である。このｃＤＮＡライブラリーは、後記実施例にも示したように、キャップ連続ｃＤＮＡを含むクローンを６０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上という極めて高い確率で保有することを特徴としている。
従って、この第３発明のｃＤＮＡライブラリーは、そのほとんどのクローンがキャップ連続ｃＤＮＡであるため、キャップ連続ｃＤＮＡを特に選択しない場合であっても、高い確率でキャップ連続ｃＤＮＡを単離して解析することができる。ただし、正確を期すためには、この出願の第４発明の方法によって、キャップ連続ｃＤＮＡを正しく選択することができる。すなわち、前記第１発明および第２発明の方法によって合成されたキャップ連続ｃＤＮＡは、その５’端に「（ｄＴ）ｎｄＧ」を有することを特徴としているため、全塩基配列を調べる必要はなく、この「（ｄＴ）ｎｄＧ」の存否を指標としてキャップ連続ｃＤＮＡを特定することができる。「（ｄＴ）ｎｄＧ」の存在は、公知の塩基配列決定法等により簡便に行うことができる。なお、キャップ連続ｃＤＮＡの９０％以上は「ｄＧ」から始まるので、実際的には「ｄＧ」の存否を指標とすればよい。
この出願の第６発明は、この発明の方法でｃＤＮＡを合成するために最低限必要とする試薬類、すなわち二本鎖ＤＮＡプライマー、逆転写酵素と反応緩衝液、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼと反応緩衝液、キャップ付加モデルｍＲＮＡを含むｃＤＮＡ合成用試薬キットである。このキットを用いれば、任意のキャップ付加ｍＲＮＡを含むＲＮＡ混合物から、キャップ連続ｃＤＮＡを含むｃＤＮＡライブラリーを容易に作製することができる。
【実施例】
次に実施例により発明を具体的に説明するが、この発明はこれらの例に限定されるものではない。なおＤＮＡの組換えに関する基本的な操作および酵素反応は、文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）に従った。制限酵素および各種修飾酵素は特に記載の無い場合には宝酒造社製のものを用いた。各酵素反応の緩衝液組成、並びに反応条件は付属の説明書に従った。
【実施例１】
キャップアナログ付加ＲＮＡを用いたｃＤＮＡ合成
（１）キャップアナログ付加ＲＮＡの調製
ヒト延長因子−１α（ＥＦ−１α）の完全長ｃＤＮＡクローンｐＨＰ００１５５（非特許文献６）をＮｏｔＩ消化により直鎖状にした後、これを鋳型にしてインビトロ転写キット（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いてｍＲＮＡを調製した。反応液にキャップアナログとして、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐＧ（５）あるいはＡ（５’）ｐｐｐＧ（５）（いずれもＡｍｂｉｏｎ社製）を添加することにより、「ｍ７Ｇ」あるいは「Ａ」をキャップ構造とするモデルｍＲＮＡを得た。また、キャップアナログ無添加によって、キャップ構造を持たないモデルｍＲＮＡを得た。インビトロ転写産物の５’端の塩基配列は、ベクター由来の配列（５’−ＧＧＧＡＡＴＴＣＧＡＧＧＡ−３’）の下流にＥＦ−１αの５’端配列（５’−ＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡ．．．．．）が続いている。
（２）第一鎖ｃＤＮＡ合成
上記で調製したモデルｍＲＮＡ０．３μｇとｐＫＡ１ベクタープライマー（一端に約６０個の３’突出末端ｄＴテールを有し、もう一端がＥｃｏＲＶ平滑末端）（非特許文献６）０．３μｇを反応液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，７５ｍＭ ＫＣｌ，３ｍＭ ＭｇＣｌ２，５ｍＭ ＤＴＴ，１．２５ｍＭ ｄＮＴＰ）に混合し、モデルｍＲＮＡとベクタープライマーとをアニールさせたのち、逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ（インビトロジェン社製）２００Ｕとリボヌクレアーゼインヒビター４０Ｕ（宝酒造社製）を添加して、４２℃１時間反応させ、モデルｍＲＮＡに相補的な第一鎖ｃＤＮＡを合成した。反応液をフェノール抽出した後、エタノール沈澱により、キャップ（＋）ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスとベクタープライマーの連結体を回収し、水２０μｌに溶解した。
（３）脱キャップ反応
キャップ（＋）ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックス溶液２０μｌを反応液（５０ｍＭ 酢酸ナトリウム，ｐＨ５．５，５ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール）に混合し、１０Ｕのタバコ酸性ピロホスファターゼ（日本ジーン社製）を添加し、３７℃３０分間反応させ、ｍＲＮＡのキャップ構造を除去した。反応液をフェノール抽出した後、エタノール沈澱により、脱キャップｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスとベクタープライマーの連結体を回収し、水２０μｌに溶解した。
（４）セルフライゲーション
前記（２）で得たキャップ（＋）ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックス溶液、および前記（３）で得た脱キャップｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックス溶液のそれぞれ２０μｌを反応液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール，０．５ｍＭ ＡＴＰ，２ｍＭ ＤＴＴ）に混合し、１２０ＵのＴ４ ＲＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を添加し、２０℃１６時間反応させ、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスの末端とベクタープライマーのＥｃｏＲＶ末端とをライゲーションさせて環状とした（セルフライゲーション反応）。反応液をフェノール抽出した後、エタノール沈澱により、セルフライゲーション産物を回収し、水２０μｌに溶解した。
（５）ＲＮＡ鎖からＤＮＡ鎖への置換
セルフライゲーション産物溶液２０μｌを反応液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，４ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，１００ｍＭ ＫＣｌ，５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ，０．１ｍＭ ｄＮＴＰ）に混合し、０．３ＵのＲＮａｓｅＨ（宝酒造社製）、４ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（宝酒造社製）、６０ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を添加し、１２℃５時間反応させ、ＲＮＡ鎖をＤＮＡ鎖で置換して第二鎖ｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡ／ｃＤＮＡデュプレックスをインサートとするベクター（ｃＤＮＡベクター）を得た。反応液をフェノール抽出した後、エタノール沈澱により、ｃＤＮＡベクターを回収し、ＴＥ４０μｌに溶解した。
（６）大腸菌の形質転換
ｃＤＮＡベクター溶液１μｌをＤＨ１２Ｓコンピテント細胞（インビトロジェン社製）２０μｌと混合し、エレクトロポレーション法により形質転換を行なった。エレクトロポレーションは、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（バイオラッド社製）を用いて行なった。得られた形質転換体をＳＯＣ培地に懸濁したのち、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有寒天培地上に蒔いて、３７℃一晩培養した。その結果、形質転換大腸菌約１０５〜１０６個のライブラリーが得られた。
（７）ｃＤＮＡクローンの５’端塩基配列解析
寒天培地上に生成したコロニーを拾い、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地に懸濁し、３７℃一晩培養した。培養液から菌体を遠心分離した後、アルカリ／ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを単離・精製した。このプラスミドを鋳型にして、キット（ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．０、ＡＢＩ社製）を用いてサイクルシーケンシング反応を行ない、蛍光ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ社製）によりｃＤＮＡの５’端塩基配列を決定した。
キャップアナログとしてｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐＧ（５）を用いて作製したモデルｍＲＮＡを鋳型にした場合、ｃＤＮＡインサートを有する２０クローン中、キャップ連続ｃＤＮＡを含むものは１５個であった。その中の１２クローンは、モデルｍＲＮＡには無い「ｄＧ」が、また１クローンは「ｄＴｄＧ」が、転写開始点のｄＧの前に余分に付加していた。他に、余分な「ｄＧ」を含まないものが２個、ｍＲＮＡの途中から始まるキャップ非連続ｃＤＮＡが５個含まれていた。なお、脱キャップ反応を行なわなくとも、生成する形質転換体の数、キャップ部位から始まるｃＤＮＡの割合、余分な「ｄＧ」の付加等は変わらなかった。
一方、キャップアナログとしてＡ（５’）ｐｐｐＧ（５）を用いて作製したモデルｍＲＮＡを鋳型にした場合、ｃＤＮＡインサートを有する２４クローン中、キャップ連続ｃＤＮＡを含むものは１８個であった。その中の１５クローンは、モデルｍＲＮＡには無い「ｄＡ」が、また１クローンは「ｄＴｄＡ」が、転写開始点のＧの前に余分に付加していた。他に、余分な「ｄＡ」を含まないものが２個、ｍＲＮＡの途中から始まるキャップ非連続ｃＤＮＡが６個含まれていた。
またいずれの場合にも、キャップ非連続ｃＤＮＡを有するクローンでは、モデルｍＲＮＡには本来無い余分な「ｄＧ」や「ｄＡ」が付加した物は見出せなかった。
さらに、キャップ構造を持たないモデルｍＲＮＡを鋳型として用いた場合には、ｃＤＮＡインサートを有する１９クローン中、転写開始点からの配列を含むものは１６個であった。その中の１４クローンは、転写開始点のＧの前に余分な配列を持たなかった。しかし、２クローンはモデルｍＲＮＡには無い「ｄＴ」が余分に転写開始点のＧの前に付加していた。他に、ｍＲＮＡの途中から始まるキャップ非連続ｃＤＮＡが３個含まれていた。
以上の結果から、この発明の方法によって、第一鎖ｃＤＮＡ合成の際にその鋳型となるｍＲＮＡのキャップ構造塩基「Ｇ」に相補的なヌクレオチド「ｄＣ」が付加され、第二鎖ｃＤＮＡ合成の際に第一鎖ｃＤＮＡ３’端の「ｄＣ」に相補的な「ｄＧ」が付加されることが示された。さらに、相補的な「ｄＧ」の後に、ｄＴが付加される場合も認められた。従って、ｃＤＮＡの５’端に「ｄＧ」あるいは「ｄＴｄＧ」が付加している場合には、キャップ連続ｃＤＮＡであることが示唆された。
（８）突出末端ベクタープライマーを用いたｃＤＮＡ合成
第一鎖ｃＤＮＡを合成後、ＥｃｏＲＩでベクタープライマーを切断し、５’突出末端を生成した後、セルフライゲーション反応を行なったところ、平滑末端ＥｃｏＲＶを有するベクタープライマーを用いた場合と同様に５’端に「ｄＧ」が付加したキャップ連続ｃＤＮＡクローンが得られた。従って、ｐＫＡ１ベクタープライマーの制限酵素切断末端は、平滑末端だけでなく、５’突出末端でも良いことが示された。また、平滑末端の場合に比べライゲーションの効率が高くなりｃＤＮＡライブラリーに含まれるクローンの数が多くなった。
【実施例２】
培養細胞ＨＴ−１０８０由来のｍＲＮＡを用いたｃＤＮＡライブラリー作製
ヒトフィブロサルコーマ細胞株ＨＴ−１０８０（大日本製薬から購入）からＡＧＰＣ法（ニッポンジーン社製キット）を用いて、全ＲＮＡを調製した。これをビオチン化オリゴ（ｄＴ）プライマー（プロメガ社製）に結合させ、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓを加えた後マグネットにかけて、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ０．３μｇとｐＫＡ１ベクタープライマー０．３μｇを用いて、実施例１と同じ条件でｃＤＮＡを合成し、大腸菌の形質転換を行ない、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。その結果、約１０５から１０６の形質転換体を含むライブラリーが得られた。脱キャップ反応を行なった場合と、行なわなかった場合の両方でライブラリーを作製したが、両者のライブラリーの解析結果に大きな差異は無かったので、以下に脱キャップ反応無しの結果についてのみ記載する。
上記ライブラリーから無作為にコロニーを選択し、プラスミドを単離した後、ｃＤＮＡの５’端の塩基配列を決定した。ｃＤＮＡインサートを有するもので、その配列が決定できたもの１９１クローンについて、ＧｅｎＢａｎｋの核酸データベースを用いてＢＬＡＳＴ検索を行なったところ、１８９クローンがｍＲＮＡ由来の遺伝子として登録されていた。全体の９４％に当たる１７８クローンは、すべて翻訳領域を含んでいた。含量がもっとも多いのが、リボソーム蛋白質Ｐ１と延長因子１−αであり、それぞれ５クローンづつ含まれていた。５’端の塩基配列は、５クローンすべてが、リボソーム蛋白質Ｐ１は５’−ＧＣＣＣＴＴＴＣＣＴＣＡＧＣＴＧＣＣＧＣ．．．、延長因子１−αは５’−ＧＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧ．．．であり、いずれも５’端の「ｄＧ」以外は、従来方法（ＤＮＡ−ＲＮＡキメラオリゴキャッピング法）で作製されたライブラリーから得られたもの（非特許文献６）と同じ配列を有していた。ゲノム配列と比較してみると、５’端にあるいずれの「ｄＧ」も、ゲノム配列には存在しておらず、ｃＤＮＡ合成の過程で付加したものであることが確認された。このことを裏付けるものとして、翻訳領域を含んでいる１７８クローン中、１６８クローンが「ｄＧ」から始まるものであった。他に、（ｄＴ）ｎｄＧ（ｎ＝１−５）から始まるものが６個あった。これらは、「ｄＧ」が付加した後、さらに「ｄＴ」が複数個付加したものと考えられる。
ｍＲＮＡ由来の遺伝子として未登録のものも２クローン含まれていたが、ゲノム配列の一部と完全に一致し、かつＥＳＴデータベースの中に同じ配列を有するものが少数存在していた。いずれもゲノムの配列には存在しない「ｄＧ」が付加した配列であった。したがって、この２クローンはまだ遺伝子として未同定の新規完全長ｃＤＮＡである可能性が高い。
ｍＲＮＡの途中から始まるもの（キャップ非連続ｃＤＮＡ）が、１１クローン含まれていた。これらのｃＤＮＡクローンの５’端配列が「ｄＧ」から始まるものも３クロー含まれていたが、いずれも本来のｍＲＮＡの配列に由来するものであり、新たに付加した「ｄＧ」を有するものは無かった。
以上の結果から、全体としてみると、ｃＤＮＡインサートを有する１９１クローンの中で、完全長（キャップ連続ｃＤＮＡ）であると思われるものが１８０クローン含まれていることから、完全長率は９４％という値になる。また、５’端配列が「ｄＧ」から始まる１７１クローンの中で、キャップ非連続ｃＤＮＡは３クローンであったことから、このｃＤＮＡライブラリーの場合、５’端配列が「ｄＧ」で始まるものでかつ翻訳領域を含んでいるものは、完全長ｃＤＮＡであることが９８％の確率で保証されていると言える。特に、ゲノムの配列には存在しない「ｄＧ」から始まるものは、ほぼ間違いなく完全長ｃＤＮＡであることが保証される。
【実施例３】
培養細胞ＨＴ−１０８０由来の全−ＲＮＡを用いたｃＤＮＡライブラリー作製
ヒトフィブロサルコーマ細胞株ＨＴ−１０８０から実施例２で調製した全ＲＮＡ５μｇとｐＫＡ１ベクタープライマー０．３μｇを用いて、実施例１と同じ条件（ただし、脱キャップ反応は省略）でｃＤＮＡを合成し、大腸菌の形質転換を行ない、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。その結果、約１０５の形質転換体を含むライブラリーが得られた。
このライブラリーに含まれるｃＤＮＡクローンについて、実施例２と同様に５’端の部分塩基配列解析を行なった。ｃＤＮＡインサートを有するもので、その配列が決定できたもの２２２クローンについて、ＧｅｎＢａｎｋの核酸データベースを用いてＢＬＡＳＴ検索を行なったところ、２１７クローンがｍＲＮＡ由来の遺伝子として登録されていた。全体の９６％に当たる２０９クローンは、すべて翻訳領域を含んでいた。これらの中で、１８９クローンは「ｄＧ」から始まるクローンであった。ここで特筆すべき点は、このライブラリーは、精製したポリ（Ａ）＋ＲＮＡからではなく、全ＲＮＡから作製したという点である。しかも、その量は５μｇという微量である。したがって、この方法を用いることにより、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの精製プロセスを省くことができ、かつ数μｇオーダーの全ＲＮＡから高品質の完全長ｃＤＮＡライブラリーを作製できることが示された。
【実施例４】
培養細胞ＡＲＰＥ−１９完全長ｃＤＮＡライブラリーの大規模配列解析
ヒト網膜色素上皮細胞株ＡＲＰＥ−１９（ＡＴＣＣから分譲）から調製したポリ（Ａ）＋ＲＮＡ２．５μｇとｐＫＡ１ベクタープライマー０．７μｇを用いて、実施例１と同じ条件でｃＤＮＡを合成し、大腸菌の形質転換を行ない、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。このライブラリーに含まれるｃＤＮＡクローンについて、実施例２と同様に５’端の部分塩基配列解析を行なった。ｃＤＮＡインサートを有するもので、その配列が決定できたもの３，６８３クローンについて、ＧｅｎＢａｎｋの核酸データベースを用いてＢＬＡＳＴ検索を行なったところ、３，６６２クローンがｍＲＮＡ由来の遺伝子として登録されていた。全体の９４％に当たる３，４７４クローンは、完全長ｃＤＮＡクローンであった。これらの中で、３，０６９クローンは「ｄＧ」あるいは「（ｄＴ）ｎｄＧ」から始まるクローンであった。
【実施例５】
ｐＧＣＡＰ１ベクタープライマーの作製
多機能クローニングベクターｐＫＡ１（非特許文献６）を出発材料にして、ｐＧＣＡＰ１を作製した。図３Ａにその構造の模式図を、配列表の配列番号１にその全塩基配列を示す。ｐＫＡ１との相違点は、（１）複製オリジンをｐＵＣ１９由来に変えたこと、（２）ｐＫＡ１の制限酵素部位ＨｉｎｄＩＩＩの上流にＰａｃＩを追加したこと、（３）ｐＫＡ１のＥｃｏＲＩ−ＢｓｔＸＩ−ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩ部位をＥｃｏＲＩ−ＡｆｌＩＩ−ＳｗａＩ−ＫｐｎＩに置換したことである。配列番号１の１番目ヌクレオチド「Ａ」はＨｉｎｄＩＩＩ部位に、また５６８番目がＥｃｏＲＩ部位に対応する。
ｐＧＣＡＰ１ １００μｇを２００ＵのＫｐｎＩで完全消化後、０．８％アガロース電気泳動にかけ、切断片を単離精製した。得られた切断片７０μｇを２０μＭ ｄＴＴＰ存在下、３７５Ｕの末端転移酵素（宝酒造社製）を添加し、３７℃３０分間反応させ、ＫｐｎＩ消化によって生成した３’突出末端に約６０個のｄＴテールを付加した。次いで反応生成物をＳｗａＩで消化し、０．８％アガロース電気泳動にかけ、長い方の切断片を単離精製した。これをｐＧＣＡＰ１ベクタープライマー（図３Ｂ）として用いた。
【実施例６】
ｐＧＣＡＰ１ベクタープライマーを用いたｃＤＮＡライブラリー作製
ヒトフィブロサルコーマ細胞株ＨＴ−１０８０の全ＲＮＡ５μｇと実施例５で調製したｐＧＣＡＰ１ベクタープライマー０．３μｇを用いて、実施例３と同じ条件でｃＤＮＡを合成し、大腸菌の形質転換を行ない、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。その結果、約２×１０５の形質転換体を含むライブラリーが得られた。このライブラリーに含まれるｃＤＮＡクローンについて、５’端の部分塩基配列解析を行なったところ、５’端に「ｄＧ」が付加した完全長ｃＤＮＡが得られ、実施例３と同様に完全長率は９５％であった。
ｐＫＡ１ベクタープライマーを用いた場合、ＥｃｏＲＶ切断末端（．．．ＧＡＴ）にＧが一個付加すると．．．ＧＡＴＧ．．．となり開始コドンＡＴＧが新たに生成する。このことは、キャップ連続ｃＤＮＡの配列を知ることが目的の場合は問題にならないが、このベクターを発現ベクターとして用いようとする場合は、余分なＡＴＧの存在はｃＤＮＡの正確な転写・翻訳に悪影響を及ぼす可能性がある。ｐＧＣＡＰ１ベクタープライマーを用いると、ＳｗａＩ切断末端（．．．ＡＴＴＴ）にＧが一個付加すると．．．ＡＴＴＴＧ．．．となり開始コドンは生成しないので、この問題は生じない。
さらに、第一鎖ｃＤＮＡを合成後、ＡｆｌＩＩでベクタープライマーを切断し、５’突出末端を生成した後、セルフライゲーション反応を行なったところ、平滑末端ＳｗａＩを有するベクタープライマーを用いた場合と同様に５’端に「ｄＧ」が付加したキャップ連続ｃＤＮＡクローンが得られた。ＡｆｌＩＩ切断末端（．．．ＣＴＴＡＡ）にＧが一個付加すると．．．ＣＴＴＡＡＧ．．．となり、ＡｆｌＩＩ切断部位の再形成が起こる。したがって、キャップ連続ｃＤＮＡクローンは、ＡｆｌＩＩによって切断可能となる。このことを利用すれば、ＡｆｌＩＩ消化によってキャップ連続ｃＤＮＡクローンかどうかを判定することもできる。
【実施例７】
培養細胞ＡＲＰＥ−１９完全長ｃＤＮＡライブラリーの発現プロフィール解析
ヒト網膜色素上皮細胞株ＡＲＰＥ−１９の全ＲＮＡ５μｇから、実施例４と同様にしてｃＤＮＡライブラリーを作製し、５’端の部分塩基配列解析を行なった。ｃＤＮＡインサートを有するもので、その配列が決定できたもの３，２０４クローンについて、ＧｅｎＢａｎｋの核酸データベースを用いてＢＬＡＳＴ検索を行なったところ、全体の９５％に当たる３，０３８クローンは、完全長ｃＤＮＡクローンであった。
これらの完全長ｃＤＮＡクローンのインサートのサイズ分布を調べてみたところ、最も短いものは０．１ｋｂｐ、最も長いものは１０ｋｂｐと広範囲の長さのインサートを有しており、平均鎖長は１．９４ｋｂｐであった。３ｋｂｐ以上の長鎖クローンも１６％を占めていた。
これらのクローンを分類したところ、１，４０８種類の遺伝子からなることが示された。最も多く含まれているのはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼｃＤＮＡであり、４４クローン（全クローンの１．４％）含まれていた。３クローン以上、すなわち０．１％以上の発現量を示すものは２３５種類のｃＤＮＡに留まり、９７１種類（全遺伝子の６９％）のｃＤＮＡは１クローンづつしかとれず、０．０３％以下の低い発現量の遺伝子であることが示された。また、ゲノム配列には一致するが、データベースにまだ遺伝子として登録されていない非常に発現量の少ないと思われる新規遺伝子クローンも含まれていた。このように、得られたｃＤＮＡライブラリーは、発現量の低い遺伝子をも数多く含み、冗長度の低い高品質のライブラリーであることが確認された。
以上の解析の結果、この発明の方法で作製したｃＤＮＡライブラリーは、完全長ｃＤＮＡクローンの含有率が高いだけでなく、遺伝子の鎖長や発現量によるバイアスがかからずに、細胞内で発現しているｍＲＮＡの発現量を忠実に反映していることが示唆された。したがって、この方法は完全長ｃＤＮＡクローンを取得する目的だけでなく、細胞内で発現している遺伝子の発現プロフィールを解析するためにも有効である。
【実施例８】
ｐＧＣＡＰ１０ベクタープライマーの作製とこれを用いたｃＤＮＡライブラリー作製
ｐＧＣＡＰ１を出発材料にして、ｐＧＣＡＰ１０を作製した。図４Ａにその構造の模式図を、配列表の配列番号２にその全塩基配列を示す。ｐＧＣＡＰ１との相違点は、ＥｃｏＲＩ−ＡｆｌＩＩ−ＳｗａＩ−ＫｐｎＩ部位をＳｗａＩ−ＥｃｏＲＩ−ＦｓｅＩ−ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩに置換したことである。実施例５と同様にしてｐＧＣＡＰ１０のＫｐｎＩ ３’突出末端に約６０個のｄＴテールを付加した。次いで反応生成物をＥｃｏＲＶで消化し、長い方の切断片をｐＧＣＡＰ１０ベクタープライマー（図４Ｂ）として用いた。このベクタープライマー０．３μｇとヒトフィブロサルコーマ細胞株ＨＴ−１０８０の全ＲＮＡ５μｇを用いて、実施例３と同じ条件で第一鎖ｃＤＮＡを合成したのち、ＥｃｏＲＩ消化によってベクター側の末端を５’突出末端とした。セルフライゲーションを行なった後、ｍＲＮＡ鎖をＤＮＡ鎖に置換する工程を省いて大腸菌の形質転換を行ない、ｃＤＮＡライブラリーを作製したところ、約１０６の形質転換体を含むライブラリーが得られた。このライブラリーに含まれるｃＤＮＡクローンについて、５’端の部分塩基配列解析を行なったところ、５’端に「ｄＧ」が付加した完全長ｃＤＮＡが得られ、実施例３と同様に完全長率は９５％であった。
【産業上の利用可能性】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、１μｇオーダーの全ＲＮＡから、ＰＣＲを使用せずに、少ない工程で、転写開始点ヌクレオチドからの連続配列を有することが保証された完全長ｃＤＮＡを、９０％以上の高収率で合成することが可能となる。これによって遺伝子がコードしている蛋白質の一次構造に関する情報と、遺伝子の発現を調節している発現制御領域に関する情報を確実に得ることが可能となり、ゲノム情報を有効に活用できるばかりか、医療分野等における有用蛋白質の遺伝子工学的製造にも大きく貢献する。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＲＮＡのキャップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有するｃＤＮＡを合成する方法であって、
（ｉ）キャップ構造を有するｍＲＮＡを含むＲＮＡ混合物に、二本鎖ＤＮＡプライマーをアニールする工程、
（ｉｉ）二本鎖ＤＮＡプライマーから逆転写酵素により第一鎖ｃＤＮＡを合成してｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体を調製する工程、および
（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体のｃＤＮＡを含むＤＮＡ鎖の３’端と５’端を、リガーゼを用いて連結し環状化する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
キャップ構造を有するｍＲＮＡが細胞抽出物中に含まれている請求項１の方法。
【請求項３】
キャップ構造を有するｍＲＮＡがインビトロ転写によって合成されたものである請求項１の方法。
【請求項４】
二本鎖ＤＮＡプライマーのプライマー配列が、キャップ構造を有するｍＲＮＡの部分配列に相補的な配列を含む請求項１の方法。
【請求項５】
二本鎖ＤＮＡプライマーのプライマー配列が、キャップ構造を有するｍＲＮＡのポリ（Ａ）配列に相補的なオリゴｄＴを含む請求項１の方法。
【請求項６】
リガーゼがＴ４ ＲＮＡリガーゼである請求項１の方法。
【請求項７】
工程（ｉｉ）と工程（ｉｉｉ）の間に、以下の工程：
（ｉｉ’）ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体を制限酵素で切断することにより、二本鎖ＤＮＡプライマーの端部に５’突出末端あるいは平滑末端を生成する工程、
を含む請求項１から６のいずれかの方法。
【請求項８】
さらに以下の工程：
（ｉｖ）ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体のＲＮＡ鎖をＤＮＡ鎖に置換して第二鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
を含む請求項１から７のいずれかの方法。
【請求項９】
二本鎖ＤＮＡプライマーが複製オリジン、または複製オリジンとｃＤＮＡ発現用プロモーターを含んでいる請求項８の方法。
【請求項１０】
さらに以下の工程：
（ｖ）第一鎖ｃＤＮＡと第二鎖ｃＤＮＡとからなる二本鎖ｃＤＮＡをベクターＤＮＡの一部とする工程、
を含む請求項８の方法。
【請求項１１】
請求項８または請求項１０の方法によって合成された二本鎖ｃＤＮＡを含むクローンの集団であって、５’端にヌクレオチド（ｄＴ）ｎ ｄＧ（ｎ＝０〜５）を有し、これに連続してｍＲＮＡのキャップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有するｃＤＮＡのクローンを６０％以上含むことを特徴とするｃＤＮＡライブラリー。
【請求項１２】
請求項１１のｃＤＮＡライブラリーのクローンから、ｍＲＮＡのキャップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有するｃＤＮＡのクローンを選択する方法であって、５’端ヌクレオチドが（ｄＴ）ｎ ｄＧ（ｎ＝０〜５）であるｃＤＮＡを含むクローンを目的クローンとする方法。
【請求項１３】
プライマー部分がオリゴ（ｄＴ）ｎ（ｎ＝１５〜１００）からなり、プライマー側の末端部分に８塩基認識制限酵素切断部位ＲＥ１を有し、もう一方の末端部に８塩基認識制限酵素切断部位ＲＥ２と５’突出末端あるいは平滑末端を生成する制限酵素部位ＲＥ３を有する二本鎖ＤＮＡプライマー。
【請求項１４】
複製オリジン、または複製オリジンとｃＤＮＡ発現用プロモーターを含んでいる請求項１３の二本鎖ＤＮＡプライマー。
【請求項１５】
配列番号２の塩基配列を有するｐＧＣＡＰ１０由来のベクタープライマーである請求項１４の二本鎖ＤＮＡプライマー。
【請求項１６】
請求項１４あるいは請求項１５の二本鎖ＤＮＡプライマー、逆転写酵素と反応緩衝液、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼと反応緩衝液、キャップ付加モデルｍＲＮＡを含むｃＤＮＡ合成用試薬キット。
【請求項１】
ｍＲＮＡのキャップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有するｃＤＮＡを合成する方法であって、
（ｉ）キャップ構造を有するｍＲＮＡを含むＲＮＡ混合物に、二本鎖ＤＮＡプライマーをアニールする工程、
（ｉｉ）二本鎖ＤＮＡプライマーから逆転写酵素により第一鎖ｃＤＮＡを合成してｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体を調製する工程、および
（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体のｃＤＮＡを含むＤＮＡ鎖の３’端と５’端を、リガーゼを用いて連結し環状化する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
キャップ構造を有するｍＲＮＡが細胞抽出物中に含まれている請求項１の方法。
【請求項３】
キャップ構造を有するｍＲＮＡがインビトロ転写によって合成されたものである請求項１の方法。
【請求項４】
二本鎖ＤＮＡプライマーのプライマー配列が、キャップ構造を有するｍＲＮＡの部分配列に相補的な配列を含む請求項１の方法。
【請求項５】
二本鎖ＤＮＡプライマーのプライマー配列が、キャップ構造を有するｍＲＮＡのポリ（Ａ）配列に相補的なオリゴｄＴを含む請求項１の方法。
【請求項６】
リガーゼがＴ４ ＲＮＡリガーゼである請求項１の方法。
【請求項７】
工程（ｉｉ）と工程（ｉｉｉ）の間に、以下の工程：
（ｉｉ’）ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体を制限酵素で切断することにより、二本鎖ＤＮＡプライマーの端部に５’突出末端あるいは平滑末端を生成する工程、
を含む請求項１から６のいずれかの方法。
【請求項８】
さらに以下の工程：
（ｉｖ）ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスと二本鎖ＤＮＡプライマーの連結体のＲＮＡ鎖をＤＮＡ鎖に置換して第二鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
を含む請求項１から７のいずれかの方法。
【請求項９】
二本鎖ＤＮＡプライマーが複製オリジン、または複製オリジンとｃＤＮＡ発現用プロモーターを含んでいる請求項８の方法。
【請求項１０】
さらに以下の工程：
（ｖ）第一鎖ｃＤＮＡと第二鎖ｃＤＮＡとからなる二本鎖ｃＤＮＡをベクターＤＮＡの一部とする工程、
を含む請求項８の方法。
【請求項１１】
請求項８または請求項１０の方法によって合成された二本鎖ｃＤＮＡを含むクローンの集団であって、５’端にヌクレオチド（ｄＴ）ｎ ｄＧ（ｎ＝０〜５）を有し、これに連続してｍＲＮＡのキャップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有するｃＤＮＡのクローンを６０％以上含むことを特徴とするｃＤＮＡライブラリー。
【請求項１２】
請求項１１のｃＤＮＡライブラリーのクローンから、ｍＲＮＡのキャップ構造に隣接するヌクレオチドからの連続配列を有するｃＤＮＡのクローンを選択する方法であって、５’端ヌクレオチドが（ｄＴ）ｎ ｄＧ（ｎ＝０〜５）であるｃＤＮＡを含むクローンを目的クローンとする方法。
【請求項１３】
プライマー部分がオリゴ（ｄＴ）ｎ（ｎ＝１５〜１００）からなり、プライマー側の末端部分に８塩基認識制限酵素切断部位ＲＥ１を有し、もう一方の末端部に８塩基認識制限酵素切断部位ＲＥ２と５’突出末端あるいは平滑末端を生成する制限酵素部位ＲＥ３を有する二本鎖ＤＮＡプライマー。
【請求項１４】
複製オリジン、または複製オリジンとｃＤＮＡ発現用プロモーターを含んでいる請求項１３の二本鎖ＤＮＡプライマー。
【請求項１５】
配列番号２の塩基配列を有するｐＧＣＡＰ１０由来のベクタープライマーである請求項１４の二本鎖ＤＮＡプライマー。
【請求項１６】
請求項１４あるいは請求項１５の二本鎖ＤＮＡプライマー、逆転写酵素と反応緩衝液、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼと反応緩衝液、キャップ付加モデルｍＲＮＡを含むｃＤＮＡ合成用試薬キット。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８７９１６
【国際公開日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【発行日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０４２２９（Ｐ２００５−５０４２２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００４４５８
【国際出願日】平成１６年３月２９日（２００４．３．２９）
【出願人】（３９１０３４９９４）国立身体障害者リハビリテーションセンター総長 (6)
【出願人】（３０００５０３６７）日立計測器サービス株式会社 (11)
【出願人】（５９７１１５３５８）
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【発行日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００４４５８
【国際出願日】平成１６年３月２９日（２００４．３．２９）
【出願人】（３９１０３４９９４）国立身体障害者リハビリテーションセンター総長 (6)
【出願人】（３０００５０３６７）日立計測器サービス株式会社 (11)
【出願人】（５９７１１５３５８）
【Ｆターム（参考）】
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