ｍＲＮＡ発現を指標にしたＭＡＰキナーゼシグナリングのリアルタイム測定法の開発と抗がん剤探索法
【課題】酵母のＭＡＰキナーゼシグナル伝達系にルシフェラーゼ遺伝子を組みあわせた、キナーゼ阻害剤の新しい評価方法を提供する。
【解決手段】（１）ＣＲＥ塩基配列および/またはＲＬＭ１結合配列と、その下流にルシフェラーゼ遺伝子を有するベクターを調製し、（２）前記ベクターを酵母に導入し、（３）供試化合物存在下または非存在下で前記酵母を培養して発光強度を測定する工程を含む、キナーゼ阻害剤の評価方法。制癌剤のスクリーニングなどに応用できる。
【解決手段】（１）ＣＲＥ塩基配列および/またはＲＬＭ１結合配列と、その下流にルシフェラーゼ遺伝子を有するベクターを調製し、（２）前記ベクターを酵母に導入し、（３）供試化合物存在下または非存在下で前記酵母を培養して発光強度を測定する工程を含む、キナーゼ阻害剤の評価方法。制癌剤のスクリーニングなどに応用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はキナーゼ阻害剤の評価方法に関する。より詳しくは、新しい制癌剤として注目されるキナーゼ阻害剤を、酵母ＭＡＰキナーゼ系のシグナル伝達阻害活性を指標として評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の研究により、がんは遺伝子の異常によっておこる疾患であることが明らかになってきた。ヒトの体を構成する細胞には、細胞の増殖を促進する働きを持つ遺伝子群と、細胞の増殖を抑制する遺伝子群が存在し、通常はこれら２つの遺伝子群の働きのバランスがとれているため、正常な状態が維持されている。一方、がん細胞では、細胞増殖を促進する遺伝子群が過剰に働くことにより、あるいは細胞増殖を抑制する遺伝子群の機能が減弱することにより、両遺伝子群間の働きのバランスが崩れ、細胞の増殖が過剰に促進されていると考えられている。細胞増殖を促進する遺伝子群としては、例えばＭＡＰキナーゼ、ｓｒｃ、ｒａｓ、ｍｙｃなどがあり、細胞増殖を抑制する遺伝子群としては、例えばｐ５３、Ｒｂなどがある。
【０００３】
ヒトのＭＡＰキナーゼタンパク質にはＥＲＫ、ｐ３８、ＪＮＫの３種類が存在し、細胞の増殖、分化、発生などの生命現象に重要な働きをしている。特に、ＥＲＫはｐ９０ＲｓｋやＥｌｋなどの基質をリン酸化することによって、細胞の増殖を促進する。一方、ＥＲＫ自身はＭＡＰキナーゼキナーゼであるＭＥＫによってリン酸化されることによって活性化され、ＭＥＫはＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼであるＲａｆによってリン酸化されて活性化する。このようにＭＡＰキナーゼはリン酸化を介して次々にシグナルを伝達しており、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達系と呼ばれている。ＭＡＰキナーゼシグナル伝達系は細胞増殖に重要な役割を果たしているため、本伝達系の異常はがん疾患と深く関わっている。
【０００４】
疾患の病態に関わる特定のタンパク質の活性を抑制あるいは促進する分子標的治療薬は、奏功メカニズムが明らかなために、強い薬効が期待できる一方、副作用も予見可能な軽微なものになると考えられる。がんの薬物治療においてＭＡＰキナーゼシグナル伝達系は創薬ターゲットして有望なものと考えられ、分子標的治療薬として多くの物質が探索および検討されている。例えばＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ阻害剤であるソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６）が新たな抗がん活性を有する分子標的治療薬として、注目を集めている（後記特許文献１）。
【０００５】
しかし、ヒトの細胞ではＭＡＰキナーゼ以外にも増殖に関与するシグナル伝達系が存在するため、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達系を抑制あるいは促進する薬の効果は、他のシグナル伝達系によってマスクされることが多く、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達系をターゲットとする分子標的治療薬を開発するのには困難を伴った。一方、ヒトの約１／１０の遺伝子数を有する分裂酵母もＭＡＰキナーゼシグナル伝達系を持つが、遺伝子数が少ないためにその他のシグナル伝達系はシンプルであり、ヒトの細胞を用いた場合と比較してハイスループットであるため、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達系をターゲットとする分子標的治療薬の開発には適したモデル生物である。
このような観点から、酵母を利用した薬剤のスクリーニング方法が既に提案されている（後記特許文献２）。ここでは、ヒト転写因子の阻害活性を酵母で評価するため、その転写因子が結合するプロモーター配列とアッセイレポーター導入のためのベクターのほか、該転写因子を発現するベクターを併せて用いている。
また本発明者等は本願発明を既に文献にて公表済みである（下記非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第００／４１６９８号
【特許文献２】特開２００２−３０６１７１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】H.Takada等、Molecular Biology of the Cell, Vol.21, 674-685(2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、新規でよりシンプルなＭＡＰキナーゼ阻害剤の評価系を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
分裂酵母には、Ｐｍｋ１、Ｓｔｙ１、Ｓｐｋ１の３種のＭＡＰキナーゼが存在し、ヒトのＥＲＫの分裂酵母ホモログ（構造および機能が類似したもの）はＰｍｋ１、ヒトｐ３８の分裂酵母ホモログはＳｔｙ１であるとされている。本発明者らはこれら酵母のＭＡＰキナーゼに着目し、これらが結合する転写因子とルシフェラーゼ（マーカー酵素）を組み合わせることにより図１で示される新しいＭＡＰキナーゼ阻害剤評価系を確立した。
【００１０】
Ｐｍｋ１はＭＡＰキナーゼキナーゼであるＰｅｋ１によってリン酸化され、Ｐｅｋ１はＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼであるＭｋｈ１によってリン酸化される。また、Ｐｍｋ１は転写因子であるＡｔｆ１とＭｂｘ１をリン酸化する。一方、Ｓｔｙ１はＭＡＰキナーゼキナーゼであるＷｉｓ１によってリン酸化され、Ｗｉｓ１はＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼであるＷｉｎ１およびＷｉｓ４によってリン酸化される。また、Ｓｔｙ１は転写因子であるＡｔｆ１をリン酸化する。Ａｔｆ１はＤＮＡ上に存在するプロモーター配列であるＣＲＥ配列（cAMP-responsive element-binding sequence：ＴＴＡＣＡＧＴＡＡ）を認識して結合し、下流に存在する遺伝子を活性化する。もうひとつの転写因子であるＭｂｘ１はプロモーター配列であるＲＬＭ１配列（ＧＴＡＴＡＴＡＴＡＧ）を認識して結合し、下流の遺伝子発現を誘導することが知られている。
【００１１】
本発明の一つの態様は、転写因子Ａｔｆ１がＣＲＥ配列およびＲＬＭ１配列に結合することを利用してＰｍｋ１とＳｔｙ１の活性化を測定するシステムである。ここでマーカー酵素としてルシフェラーゼを用いているが、これは安定型でも不安定型でもよく、安定型を用いた場合には分裂酵母細胞内でのＡｔｆ１とＣＲＥ配列の結合の長時間変化を測定することができ、不安定型を用いた場合には細胞内の変化をリアルタイムで測定することができる。ここで、不安定型ルシフェラーゼとは分解されやすく、安定性の低いルシフェラーゼをいう。
【００１２】
１個あるいは複数のＣＲＥ配列があり、その下流にルシフェラーゼ配列を有するようにプラスミドを構築する。このプラスミドに転写因子Ａｔｆ１が結合すると、ＣＲＥがプロモーターとしての活性を発揮し、下流に存在するルシフェラーゼ遺伝子の転写が活性化され、ルシフェラーゼタンパク質が生成する。ルシフェラーゼタンパク質はルシフェリンなどの発光基質を酸化することによって光を放出させるため、光の有無あるいは強度を測定することによって、Ａｔｆ１とＣＲＥ配列の結合の状況を知ることができる。
【００１３】
Ａｔｆ１はＰｍｋ１によってリン酸化を受けて活性化するため、Ａｔｆ１活性を測定することによって間接的にＰｍｋ１のリン酸化活性を知ることができる。Ｐｍｋ１のシグナル伝達系はリン酸化によって順に情報伝達がなされるため、Ａｔｆ１の活性を測定することによって、Ｐｍｋ１のみならず、さらにシグナル伝達系として上流に存在するＰｅｋ１やＭｋｈ１の活性も知ることができる。また、Ａｔｆ１はＳｔｙ１によってもリン酸化を受けて活性化するため、Ａｔｆ１の活性を測定することによって、シグナル伝達系として上流に存在するＷｉｓ１やＷｉｎ１およびＷｉｓ４の活性を知ることもできる。Ｐｍｋ１のシグナル伝達系とＳｔｙ１シグナル伝達系が同時に活性化している場合には、Ａｔｆ１活性を測定することによって、Ｐｍｋ１シグナル伝達系の活性とＳｔｙ１シグナル伝達系の活性の和を知ることができる。尚、ＣＲＥ配列の個数を増加させると、生成するルシフェラーゼ量も増加し、高感度にＡｔｆ１活性を測定することができる。後記実施例１では、３個のＣＲＥ配列を配置することにより、鋭敏なＡｔｆ１活性測定系を構築している。
【００１４】
本発明の別の態様は、転写因子Ｍｂｘ１がＲＬＭ配列に結合することを利用してＰｍｋ１の活性を測定するシステムである。ここでもマーカー酵素としてはルシフェラーゼを用いているが、これは安定型でも不安定型でもよく、安定型を用いた場合には分裂酵母細胞内でのＭｂｘ１とＲＬＭ配列の結合の長時間変化を測定することができ、不安定型を用いた場合には細胞内の変化をリアルタイムで測定することができる。
一方、Ｍｂｘ１はＰｍｋ１によってリン酸化を受けて活性化するため、Ｍｂｘ１活性を測定することによってＰｍｋ１のリン酸化活性を知ることができる。
この態様においては、１個あるいは複数のＲＬＭ配列があり、その下流にルシフェラーゼ配列を有するようにプラスミドを構築する。このプラスミドに転写因子Ｍｂｘ１が結合すると、ＲＬＭ配列がプロモーターとしての活性を発揮し、下流に存在するルシフェラーゼ遺伝子の転写が活性化され、ルシフェラーゼタンパク質が生成する。ルシフェラーゼタンパク質はルシフェリンなどの発光基質を酸化することによって光を放出させるため、光の有無あるいは強度を測定することによって、Ｍｂｘ１とＲＬＭ配列の結合の状況を知ることができる。
Ｍｂｘ１はＰｍｋ１によってリン酸化を受けて活性化するため、Ｍｂｘ１活性を測定することによって間接的にＰｍｋ１のリン酸化活性を知ることができる。Ｐｍｋ１のシグナル伝達系はリン酸化によって順に情報伝達がなされるため、Ｍｂｘ１の活性を測定することによって、Ｐｍｋ１の上流に存在するＰｅｋ１やＭｋｈ１の活性も知ることができる。
本発明のＲＬＭ配列の個数を増加させると、生成するルシフェラーゼ量も増加し、高感度にＰｍｋ１活性を測定することができる。後記実施例２では６個のＲＬＭ配列を配置することにより、鋭敏なＭｂｘ１活性測定系を構築している。
Ａｔｆ１を含むプラスミドを用いることによってＰｍｋ１とＳｔｙ１による活性の和を測定することができ、ＲＬＭ１を含むプラスミドを用いることによってＰｍｋ１活性を測定することができるため、Ａｔｆ１活性測定系とＲＬＭ１活性測定系の差をとることにより、Ｓｔｙ１活性を知ることができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、ヒトのがんなどＭＡＰキナーゼ系の異常に関連する疾患の治療薬を創製に有用な、Ｐｍｋ１およびＳｔｙ１活性測定システムに関するものである。また、本発明ではマーカー酵素として不安定型のルシフェラーゼを用いることにより、リアルタイムで細胞内の変化を測定することができる。さらに本発明を用いることによりＰｍｋ１およびＳｔｙ１活性に影響を及ぼす物質を探索することが可能となり、がんなどの疾患の創薬に応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｐｍｋ１およびＳｔｙ１活性測定システムの概略を表す図である。
【図２Ａ】転写因子Ａｔｆ１の試験系においてＮａＣｌ刺激によるレポーター活性の変化を表す図である。左端（wt/3×CREECM33）は本発明のＣＲＥ配列を持つプラスミドを含む野生細胞の試験系、中央（Δatf1/3×CREECM33）はＣＲＥ配列を持つプラスミドを含むａｔｆ１遺伝子欠損細胞、右端（wt/3×CREmECM33）はＣＲＥ配列に変異を導入したプラスミドを持つ野生細胞の結果を示す。
【図２Ｂ】転写因子Ａｔｆ１の試験系においてＮａＣｌ刺激によるレポーター活性の変化を表す図である。左側（Δpmk1）はｐｍｋ１遺伝子欠損細胞、右側（Δsty1）はｓｔｙ１遺伝子欠損細胞を用いた場合の結果を示す。
【図２Ｃ】転写因子Ａｔｆ１の試験系においてＰｅｋ１ＤＤを用いてＰｍｋ１ＭＡＰＫを活性化した上で、ＮａＣｌ刺激によるレポーター活性の変化を示した図である。上段（basal）はＮａＣｌ刺激なし、下段（+500mM NaCl）はＮａＣｌ刺激を行った場合、そして左端は本発明の試験系、中央はｐｍｋ１遺伝子欠損細胞、右端はｓｔｙ１遺伝子欠損細胞を用いた場合の結果を示す。
【図３Ａ】転写因子Ｍｂｘ１の試験系においてＮａＣｌ刺激によるレポーター活性の変化を表す図である。左端（wt/6×RLMECM33）はＲＬＭ配列を持つプラスミドを含む野生細胞の本発明の試験系、中央（Δmbx1/6×RLMECM33）はＲＬＭ配列を持つプラスミドを含むｍｂｘ１遺伝子欠損細胞、右端（wt/6×RLMmECM33）はＲＬＭ１配列に変異を導入したプラスミドを含む野生細胞の結果を示す。
【図３Ｂ】転写因子Ｍｂｘ１の試験系においてＮａＣｌ刺激によるレポーター活性の変化を表す図である。左側（Δpmk1）はｐｍｋ１遺伝子欠損細胞、右側（Δsty1）はｓｔｙ１遺伝子欠損細胞を用いた場合の結果を示す。
【図３Ｃ】転写因子Ｍｂｘ１の試験系においてＰｅｋ１ＤＤを用いてＰｍｋ１ＭＡＰＫを活性化した上で、ＮａＣｌ刺激によるレポーター活性の変化を示した図である。上段（basal）はＮａＣｌ刺激なし、下段（+500mM NaCl）はＮａＣｌ刺激を行った場合、そして左端は本発明の試験系、中央はｐｍｋ１遺伝子欠損細胞、右端はｍｂｘ１遺伝子欠損細胞を用いた場合の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明で使用する酵母は特に限定されないが、例えば以下の実施例で使用した細胞（表１）を例示することができる。
【００１８】
【表１】
Schizosaccharomyces pombe 株
【００１９】
培地としては例えば以下のものを使用することができる。
完全培地ＹＰＤ（yeast extract-peptone-dextrose）
酵母抽出物 １％
ポリペプトン ２％
グルコース ２％
最少培地ＥＭＭ（Edinburgh minimal medium）
組成は表２のとおりである。
【００２０】
【表２】
【００２１】
表２中、「20×溶液」、「50×塩」、「1,000×ビタミン」および「1,000×ミネラル」の組成は以下の表３のとおりである。
【００２２】
【表３】
【００２３】
クローニングは例えば以下のようにして行う。即ち、クローン化した標的遺伝子（insert ＤＮＡ）を適当な酵素で切り出し、同じ酵素でベクターＤＮＡも切断する。フェノール抽出、エタノール沈殿により精製した標的遺伝子を菌由来アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ：Bacterial Alkaline Phosphatase）処理したベクターＤＮＡと混ぜ合わせ、ＤＮＡリガーゼによってつなぎ合わせ大腸菌に形質転換しＤＮＡをミニプレップ（Miniprep）にて抽出する。
【００２４】
形質転換には酢酸リチウム法が好適に利用される。例えば、前日から液体培地で培養した細胞を集菌し、酢酸リチウムで懸濁し、２７℃１時間インキュベートする。その後、懸濁液に目的のＤＮＡ及びポリエチレングリコール４，０００（６０％）を加え、さらに２７℃、１時間インキュベートし遠心を行い、上清をアスピレートし細胞を滅菌水で懸濁させＥＭＭ培地に撒けばよい。
【００２５】
遺伝子破壊株の作製は以下のとおりである。即ち、クローン化した標的遺伝子のコード領域内に選択マーカー（例えばura4+、 KanM×6）を挿入する。このプラスミドを用いて、適当な制限酵素により破壊遺伝子とベクター部分を切り離す。そして、フェノール抽出 エタノール沈殿により精製した切断DNAを酢酸リチウム法に従って細胞に形質転換させることによって、インテグレーションさせる（Beach et al., Mol. Gen. Genet. 1982; Rothstein et al., Methods Enzymol. 1983）。
本発明の形態を以下の実施例によって具体的に説明する。本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。尚、以下の実施例ではキナーゼ阻害剤を添加する代わりに高浸透圧ストレスであるＮａＣｌ（500 mM）の添加を試みた。ＮａＣｌ刺激によってＡｔｆ１の転写活性が上昇することが既に報告されているので（Wilkinson et al., Genes Dev. 1996）、該ＮａＣｌ刺激でこのレポーター活性が上昇するのか否かを検証した。
【実施例１】
【００２６】
ＣＲＥ配列を３つ持つＤＮＡを調製するため、センスおよびアンチセンスＤＮＡ（センス：ggcttttacagtaaatacattacagtaaatacacattacagtaaatgcac アンチセンス：tcgagtgcatttactgtaatgtgtatttactgtaatgtatttactgtaaaagcctgca）を混合した後、９５℃, ２分加温してＤＮＡを変性させ、５５℃, ３分加温してアニーリングを行うことで２本鎖ＤＮＡを調製した。同様に、６個のＲＬＭ配列を持つＤＮＡを調製するため、センスおよびアンチセンスＤＮＡ（センス：ggcttgtatatatagatacagtatatatagatacacagtatatatagatacagtatatatagatacacagtatatatagatacagtatatatagatgcac アンチセンス：ggcttttacagtaaatacattacagtaaatacacattacagtaaatgcac）を混合した後、９５℃, ２分加温してＤＮＡを変性させ、５５℃, ３分加温してアニーリングを行うことで２本鎖ＤＮＡを調製した。ＣＲＥ配列あるいはＲＬＭ１配列を持つＤＮＡとルシフェラーゼ遺伝子をｐＤＳ４７３ａＬ（Forsburg, Sherman et al., Genetics 1997）に挿入し、これらプラスミドを形質転換させた細胞をＥＭＭ培地において２７℃で対数増殖期まで培養し、新しいＥＭＭ培地で６００ｎｍの吸光度が０．１５になるように調整した。その後２７℃で３時間インキュベートし、最終６００ｎｍの吸光度が０．２０になるように調整した。最終濃度が０．５ｍＭになるよう５０ｍＭのＤ−ルシフェリンナトリウム（ナカライテスク）を加え、９６穴プレートに細胞懸濁液を９０μＬずつ分注し、最終容量が１００μＬになるように試薬を加えた。コントロールとしては細胞懸濁液９０μＬに１０μＬの水を加えた。ルミネッセンサーＪＮＲＩＩ（アトー）を用いて発光強度を１２秒毎に３時間計測した。
【００２７】
ＣＲＥ配列を３回繰り返し持つプラスミド［3×CREECM33::luc(R2.2)］を用いて正常細胞を形質転換し、ＮａＣｌ刺激によるＡｔｆ１の転写活性上昇がレポーター活性に反映されるか否か検証した。結果を図２に示す。
その結果、［3×CREECM33::luc(R2.2)］活性は、ＮａＣｌ添加後すぐに一過性の上昇が認められ、その後、［3×CREECM33::luc(R2.2)］活性が一度低下した後、再びピークが認められるという特徴的な波形が認められた（図２Ａ 左端）。一方、ａｔｆ１遺伝子を欠損したａｔｆ１ＫＯ細胞では、ＮａＣｌ刺激による［3×CREECM33::luc(R2.2)］活性の上昇は全く認められなかった（図２Ａ 中央）。さらに、このＣＲＥ配列が、Ａｔｆ１活性に機能的に関連する配列であるか否かを検証するために、ＣＲＥモチーフに変異（ＴＴＡＣＡＧＴＡＡ→ＴＴＡＴＴＴＴＡＡ）を導入した配列を３回繰り返したものをルシフェラーゼ遺伝子に融合させた構築を作製し［3×CREmECM33::luc(R2.2)］、この構築を用いてＮａＣｌ刺激による活性を測定した。その結果、ＮａＣｌ刺激による［3×CREmECM33::luc(R2.2)］活性の上昇は、ほとんど検出されなかった（図２Ａ, 右端）。
【００２８】
次に、［3×CREECM33::luc(R2.2)］レポーター活性が、Ａｔｆ１の上流に位置し、Ａｔｆ１をリン酸化することで制御する２つのＭＡＰＫであるＳｔｙ１ ＭＡＰＫとＰｍｋ ＭＡＰＫ経路に依存的であることを検証した。ｓｔｙ１ＫＯ細胞において、非ストレスおよびＮａＣｌ刺激時のいずれにおいても［3×CREECM33::luc(R2.2)］レポーター活性は、全く検出されなかった。また、ｐｍｋ１ＫＯ細胞においては、正常細胞と比較して、［3×CREECM33::luc(R2.2)］レポーター活性は、顕著に低下していたが、ＮａＣｌ刺激時においては、微弱な反応が認められた（図２Ｂ Δpmk1およびΔsty1）。そこで、Ｐｍｋ１ ＭＡＰＫの上流にあたるＰｅｋ１ ＭＡＰＫＫの恒常的活性化型であるＰｅｋ１ＤＤを用いてＰｍｋ１ ＭＡＰＫの活性化による［3×CREECM33::luc(R2.2)］レポーター活性を測定した結果、非ストレス条件下およびＮａＣｌ刺激時のいずれにおいても、顕著に活性が上昇していた（図２Ｃ wt-Pek1DD OP）。また、ｐｍｋ１ＫＯ細胞においては、Ｐｅｋ１ＤＤを過剰発現した影響はほとんど認められなかった（図２Ｃ Δpmk1）。これらの結果から、［3×CREECM33::luc(R2.2)］レポーター活性は、Ｓｔｙ１ ＭＡＰＫとＰｍｋ１ ＭＡＰＫ活性を反映したものであることが示された。
【実施例２】
【００２９】
ＲＬＭ１認識配列であるＧＴＡＴＡＴＡＴＡＧを６回繰り返した配列をルシフェラーゼ遺伝子に融合させた遺伝子を作製し［6×RLMECM33::luc(R2.2)］、前記実施例１と同様の原理でＭｂｘ１の転写活性を生細胞でリアルタイムに測定することができるシステムを確立した（図３）。
［6×RLMECM33::luc(R2.2)］により形質転換した正常細胞を用いて、ＮａＣｌ（５００ｍＭ）刺激によるレポーター活性を測定した。その結果、［6×RLMECM33::luc(R2.2)］活性は、前述の［3×CREECM33::luc(R2.2)］活性同様、ＮａＣｌ添加後すぐに一過性の上昇が認められ、その後、活性が一度低下した後、再び活性の上昇が認められた（図３Ａ 左端）。一方、ｍｂｘ１ ＫＯ細胞では、ＮａＣｌ刺激による［6×RLMECM33::luc(R2.2)］活性の上昇は全く認められなかった（図３Ａ 中央）。
さらに、このＲＬＭ認識配列に変異（ＧＴＡＴＡＴＡＴＡＧ→ＧＴＧＧＧＣＣＣＡＧ）を導入した配列を６回繰り返したものをルシフェラーゼ遺伝子に融合させた構築を作製し［6×RLMmECM33::luc(R2.2)］、この構築を用いてＮａＣｌ刺激による活性を測定した。その結果、ＮａＣｌ刺激による［6×RLMmECM33::luc(R2.2)］活性の上昇は、全く認められなかった（図３Ａ 右端）。
次に、［6×RLMECM33::luc(R2.2)］レポーター活性が、２つのＭＡＰＫであるＳｔｙ１ ＭＡＰＫとＰｍｋ１ ＭＡＰＫ経路に依存的かを検証したところ、ｐｍｋ１ＫＯ細胞において、非ストレスおよびＮａＣｌ刺激時のいずれにおいても［6×RLMECM33::luc(R2.2)］レポーター活性は、ほとんど検出されなかった（図３Ｂ Δpmk1）。一方、ｓｔｙ１ ＫＯ細胞では、ＮａＣｌ刺激後すぐに認められる１相目のピークは、正常細胞と同様に認められたのに対し、正常細胞では認められる２相目のピークが、ｓｔｙ１ＫＯ細胞において全く認められなかった（図３Ｂ Δsty1）。したがって、ＮａＣｌ刺激によって認められる［6×RLMECM33::luc(R2.2)］レポーター活性の１相目のピークは、Ｐｍｋ１ ＭＡＰＫ経路の活性化を正確に反映していると考えられる。
また、Ｐｅｋ１ＤＤを用いてＰｍｋ１ ＭＡＰＫの活性化による影響を検証したが前記実施例１と同様の結果を得た（図３Ｃ）。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明を用いることにより酵母ＭＡＰキナーゼ系のシグナル伝達系を利用して、Ｐｍｋ１およびＳｔｙ１活性に影響を及ぼす物質を探索することが可能となり、制癌剤などのスクリーニングに応用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明はキナーゼ阻害剤の評価方法に関する。より詳しくは、新しい制癌剤として注目されるキナーゼ阻害剤を、酵母ＭＡＰキナーゼ系のシグナル伝達阻害活性を指標として評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の研究により、がんは遺伝子の異常によっておこる疾患であることが明らかになってきた。ヒトの体を構成する細胞には、細胞の増殖を促進する働きを持つ遺伝子群と、細胞の増殖を抑制する遺伝子群が存在し、通常はこれら２つの遺伝子群の働きのバランスがとれているため、正常な状態が維持されている。一方、がん細胞では、細胞増殖を促進する遺伝子群が過剰に働くことにより、あるいは細胞増殖を抑制する遺伝子群の機能が減弱することにより、両遺伝子群間の働きのバランスが崩れ、細胞の増殖が過剰に促進されていると考えられている。細胞増殖を促進する遺伝子群としては、例えばＭＡＰキナーゼ、ｓｒｃ、ｒａｓ、ｍｙｃなどがあり、細胞増殖を抑制する遺伝子群としては、例えばｐ５３、Ｒｂなどがある。
【０００３】
ヒトのＭＡＰキナーゼタンパク質にはＥＲＫ、ｐ３８、ＪＮＫの３種類が存在し、細胞の増殖、分化、発生などの生命現象に重要な働きをしている。特に、ＥＲＫはｐ９０ＲｓｋやＥｌｋなどの基質をリン酸化することによって、細胞の増殖を促進する。一方、ＥＲＫ自身はＭＡＰキナーゼキナーゼであるＭＥＫによってリン酸化されることによって活性化され、ＭＥＫはＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼであるＲａｆによってリン酸化されて活性化する。このようにＭＡＰキナーゼはリン酸化を介して次々にシグナルを伝達しており、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達系と呼ばれている。ＭＡＰキナーゼシグナル伝達系は細胞増殖に重要な役割を果たしているため、本伝達系の異常はがん疾患と深く関わっている。
【０００４】
疾患の病態に関わる特定のタンパク質の活性を抑制あるいは促進する分子標的治療薬は、奏功メカニズムが明らかなために、強い薬効が期待できる一方、副作用も予見可能な軽微なものになると考えられる。がんの薬物治療においてＭＡＰキナーゼシグナル伝達系は創薬ターゲットして有望なものと考えられ、分子標的治療薬として多くの物質が探索および検討されている。例えばＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ阻害剤であるソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６）が新たな抗がん活性を有する分子標的治療薬として、注目を集めている（後記特許文献１）。
【０００５】
しかし、ヒトの細胞ではＭＡＰキナーゼ以外にも増殖に関与するシグナル伝達系が存在するため、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達系を抑制あるいは促進する薬の効果は、他のシグナル伝達系によってマスクされることが多く、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達系をターゲットとする分子標的治療薬を開発するのには困難を伴った。一方、ヒトの約１／１０の遺伝子数を有する分裂酵母もＭＡＰキナーゼシグナル伝達系を持つが、遺伝子数が少ないためにその他のシグナル伝達系はシンプルであり、ヒトの細胞を用いた場合と比較してハイスループットであるため、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達系をターゲットとする分子標的治療薬の開発には適したモデル生物である。
このような観点から、酵母を利用した薬剤のスクリーニング方法が既に提案されている（後記特許文献２）。ここでは、ヒト転写因子の阻害活性を酵母で評価するため、その転写因子が結合するプロモーター配列とアッセイレポーター導入のためのベクターのほか、該転写因子を発現するベクターを併せて用いている。
また本発明者等は本願発明を既に文献にて公表済みである（下記非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第００／４１６９８号
【特許文献２】特開２００２−３０６１７１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】H.Takada等、Molecular Biology of the Cell, Vol.21, 674-685(2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、新規でよりシンプルなＭＡＰキナーゼ阻害剤の評価系を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
分裂酵母には、Ｐｍｋ１、Ｓｔｙ１、Ｓｐｋ１の３種のＭＡＰキナーゼが存在し、ヒトのＥＲＫの分裂酵母ホモログ（構造および機能が類似したもの）はＰｍｋ１、ヒトｐ３８の分裂酵母ホモログはＳｔｙ１であるとされている。本発明者らはこれら酵母のＭＡＰキナーゼに着目し、これらが結合する転写因子とルシフェラーゼ（マーカー酵素）を組み合わせることにより図１で示される新しいＭＡＰキナーゼ阻害剤評価系を確立した。
【００１０】
Ｐｍｋ１はＭＡＰキナーゼキナーゼであるＰｅｋ１によってリン酸化され、Ｐｅｋ１はＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼであるＭｋｈ１によってリン酸化される。また、Ｐｍｋ１は転写因子であるＡｔｆ１とＭｂｘ１をリン酸化する。一方、Ｓｔｙ１はＭＡＰキナーゼキナーゼであるＷｉｓ１によってリン酸化され、Ｗｉｓ１はＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼであるＷｉｎ１およびＷｉｓ４によってリン酸化される。また、Ｓｔｙ１は転写因子であるＡｔｆ１をリン酸化する。Ａｔｆ１はＤＮＡ上に存在するプロモーター配列であるＣＲＥ配列（cAMP-responsive element-binding sequence：ＴＴＡＣＡＧＴＡＡ）を認識して結合し、下流に存在する遺伝子を活性化する。もうひとつの転写因子であるＭｂｘ１はプロモーター配列であるＲＬＭ１配列（ＧＴＡＴＡＴＡＴＡＧ）を認識して結合し、下流の遺伝子発現を誘導することが知られている。
【００１１】
本発明の一つの態様は、転写因子Ａｔｆ１がＣＲＥ配列およびＲＬＭ１配列に結合することを利用してＰｍｋ１とＳｔｙ１の活性化を測定するシステムである。ここでマーカー酵素としてルシフェラーゼを用いているが、これは安定型でも不安定型でもよく、安定型を用いた場合には分裂酵母細胞内でのＡｔｆ１とＣＲＥ配列の結合の長時間変化を測定することができ、不安定型を用いた場合には細胞内の変化をリアルタイムで測定することができる。ここで、不安定型ルシフェラーゼとは分解されやすく、安定性の低いルシフェラーゼをいう。
【００１２】
１個あるいは複数のＣＲＥ配列があり、その下流にルシフェラーゼ配列を有するようにプラスミドを構築する。このプラスミドに転写因子Ａｔｆ１が結合すると、ＣＲＥがプロモーターとしての活性を発揮し、下流に存在するルシフェラーゼ遺伝子の転写が活性化され、ルシフェラーゼタンパク質が生成する。ルシフェラーゼタンパク質はルシフェリンなどの発光基質を酸化することによって光を放出させるため、光の有無あるいは強度を測定することによって、Ａｔｆ１とＣＲＥ配列の結合の状況を知ることができる。
【００１３】
Ａｔｆ１はＰｍｋ１によってリン酸化を受けて活性化するため、Ａｔｆ１活性を測定することによって間接的にＰｍｋ１のリン酸化活性を知ることができる。Ｐｍｋ１のシグナル伝達系はリン酸化によって順に情報伝達がなされるため、Ａｔｆ１の活性を測定することによって、Ｐｍｋ１のみならず、さらにシグナル伝達系として上流に存在するＰｅｋ１やＭｋｈ１の活性も知ることができる。また、Ａｔｆ１はＳｔｙ１によってもリン酸化を受けて活性化するため、Ａｔｆ１の活性を測定することによって、シグナル伝達系として上流に存在するＷｉｓ１やＷｉｎ１およびＷｉｓ４の活性を知ることもできる。Ｐｍｋ１のシグナル伝達系とＳｔｙ１シグナル伝達系が同時に活性化している場合には、Ａｔｆ１活性を測定することによって、Ｐｍｋ１シグナル伝達系の活性とＳｔｙ１シグナル伝達系の活性の和を知ることができる。尚、ＣＲＥ配列の個数を増加させると、生成するルシフェラーゼ量も増加し、高感度にＡｔｆ１活性を測定することができる。後記実施例１では、３個のＣＲＥ配列を配置することにより、鋭敏なＡｔｆ１活性測定系を構築している。
【００１４】
本発明の別の態様は、転写因子Ｍｂｘ１がＲＬＭ配列に結合することを利用してＰｍｋ１の活性を測定するシステムである。ここでもマーカー酵素としてはルシフェラーゼを用いているが、これは安定型でも不安定型でもよく、安定型を用いた場合には分裂酵母細胞内でのＭｂｘ１とＲＬＭ配列の結合の長時間変化を測定することができ、不安定型を用いた場合には細胞内の変化をリアルタイムで測定することができる。
一方、Ｍｂｘ１はＰｍｋ１によってリン酸化を受けて活性化するため、Ｍｂｘ１活性を測定することによってＰｍｋ１のリン酸化活性を知ることができる。
この態様においては、１個あるいは複数のＲＬＭ配列があり、その下流にルシフェラーゼ配列を有するようにプラスミドを構築する。このプラスミドに転写因子Ｍｂｘ１が結合すると、ＲＬＭ配列がプロモーターとしての活性を発揮し、下流に存在するルシフェラーゼ遺伝子の転写が活性化され、ルシフェラーゼタンパク質が生成する。ルシフェラーゼタンパク質はルシフェリンなどの発光基質を酸化することによって光を放出させるため、光の有無あるいは強度を測定することによって、Ｍｂｘ１とＲＬＭ配列の結合の状況を知ることができる。
Ｍｂｘ１はＰｍｋ１によってリン酸化を受けて活性化するため、Ｍｂｘ１活性を測定することによって間接的にＰｍｋ１のリン酸化活性を知ることができる。Ｐｍｋ１のシグナル伝達系はリン酸化によって順に情報伝達がなされるため、Ｍｂｘ１の活性を測定することによって、Ｐｍｋ１の上流に存在するＰｅｋ１やＭｋｈ１の活性も知ることができる。
本発明のＲＬＭ配列の個数を増加させると、生成するルシフェラーゼ量も増加し、高感度にＰｍｋ１活性を測定することができる。後記実施例２では６個のＲＬＭ配列を配置することにより、鋭敏なＭｂｘ１活性測定系を構築している。
Ａｔｆ１を含むプラスミドを用いることによってＰｍｋ１とＳｔｙ１による活性の和を測定することができ、ＲＬＭ１を含むプラスミドを用いることによってＰｍｋ１活性を測定することができるため、Ａｔｆ１活性測定系とＲＬＭ１活性測定系の差をとることにより、Ｓｔｙ１活性を知ることができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、ヒトのがんなどＭＡＰキナーゼ系の異常に関連する疾患の治療薬を創製に有用な、Ｐｍｋ１およびＳｔｙ１活性測定システムに関するものである。また、本発明ではマーカー酵素として不安定型のルシフェラーゼを用いることにより、リアルタイムで細胞内の変化を測定することができる。さらに本発明を用いることによりＰｍｋ１およびＳｔｙ１活性に影響を及ぼす物質を探索することが可能となり、がんなどの疾患の創薬に応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｐｍｋ１およびＳｔｙ１活性測定システムの概略を表す図である。
【図２Ａ】転写因子Ａｔｆ１の試験系においてＮａＣｌ刺激によるレポーター活性の変化を表す図である。左端（wt/3×CREECM33）は本発明のＣＲＥ配列を持つプラスミドを含む野生細胞の試験系、中央（Δatf1/3×CREECM33）はＣＲＥ配列を持つプラスミドを含むａｔｆ１遺伝子欠損細胞、右端（wt/3×CREmECM33）はＣＲＥ配列に変異を導入したプラスミドを持つ野生細胞の結果を示す。
【図２Ｂ】転写因子Ａｔｆ１の試験系においてＮａＣｌ刺激によるレポーター活性の変化を表す図である。左側（Δpmk1）はｐｍｋ１遺伝子欠損細胞、右側（Δsty1）はｓｔｙ１遺伝子欠損細胞を用いた場合の結果を示す。
【図２Ｃ】転写因子Ａｔｆ１の試験系においてＰｅｋ１ＤＤを用いてＰｍｋ１ＭＡＰＫを活性化した上で、ＮａＣｌ刺激によるレポーター活性の変化を示した図である。上段（basal）はＮａＣｌ刺激なし、下段（+500mM NaCl）はＮａＣｌ刺激を行った場合、そして左端は本発明の試験系、中央はｐｍｋ１遺伝子欠損細胞、右端はｓｔｙ１遺伝子欠損細胞を用いた場合の結果を示す。
【図３Ａ】転写因子Ｍｂｘ１の試験系においてＮａＣｌ刺激によるレポーター活性の変化を表す図である。左端（wt/6×RLMECM33）はＲＬＭ配列を持つプラスミドを含む野生細胞の本発明の試験系、中央（Δmbx1/6×RLMECM33）はＲＬＭ配列を持つプラスミドを含むｍｂｘ１遺伝子欠損細胞、右端（wt/6×RLMmECM33）はＲＬＭ１配列に変異を導入したプラスミドを含む野生細胞の結果を示す。
【図３Ｂ】転写因子Ｍｂｘ１の試験系においてＮａＣｌ刺激によるレポーター活性の変化を表す図である。左側（Δpmk1）はｐｍｋ１遺伝子欠損細胞、右側（Δsty1）はｓｔｙ１遺伝子欠損細胞を用いた場合の結果を示す。
【図３Ｃ】転写因子Ｍｂｘ１の試験系においてＰｅｋ１ＤＤを用いてＰｍｋ１ＭＡＰＫを活性化した上で、ＮａＣｌ刺激によるレポーター活性の変化を示した図である。上段（basal）はＮａＣｌ刺激なし、下段（+500mM NaCl）はＮａＣｌ刺激を行った場合、そして左端は本発明の試験系、中央はｐｍｋ１遺伝子欠損細胞、右端はｍｂｘ１遺伝子欠損細胞を用いた場合の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明で使用する酵母は特に限定されないが、例えば以下の実施例で使用した細胞（表１）を例示することができる。
【００１８】
【表１】
Schizosaccharomyces pombe 株
【００１９】
培地としては例えば以下のものを使用することができる。
完全培地ＹＰＤ（yeast extract-peptone-dextrose）
酵母抽出物 １％
ポリペプトン ２％
グルコース ２％
最少培地ＥＭＭ（Edinburgh minimal medium）
組成は表２のとおりである。
【００２０】
【表２】
【００２１】
表２中、「20×溶液」、「50×塩」、「1,000×ビタミン」および「1,000×ミネラル」の組成は以下の表３のとおりである。
【００２２】
【表３】
【００２３】
クローニングは例えば以下のようにして行う。即ち、クローン化した標的遺伝子（insert ＤＮＡ）を適当な酵素で切り出し、同じ酵素でベクターＤＮＡも切断する。フェノール抽出、エタノール沈殿により精製した標的遺伝子を菌由来アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ：Bacterial Alkaline Phosphatase）処理したベクターＤＮＡと混ぜ合わせ、ＤＮＡリガーゼによってつなぎ合わせ大腸菌に形質転換しＤＮＡをミニプレップ（Miniprep）にて抽出する。
【００２４】
形質転換には酢酸リチウム法が好適に利用される。例えば、前日から液体培地で培養した細胞を集菌し、酢酸リチウムで懸濁し、２７℃１時間インキュベートする。その後、懸濁液に目的のＤＮＡ及びポリエチレングリコール４，０００（６０％）を加え、さらに２７℃、１時間インキュベートし遠心を行い、上清をアスピレートし細胞を滅菌水で懸濁させＥＭＭ培地に撒けばよい。
【００２５】
遺伝子破壊株の作製は以下のとおりである。即ち、クローン化した標的遺伝子のコード領域内に選択マーカー（例えばura4+、 KanM×6）を挿入する。このプラスミドを用いて、適当な制限酵素により破壊遺伝子とベクター部分を切り離す。そして、フェノール抽出 エタノール沈殿により精製した切断DNAを酢酸リチウム法に従って細胞に形質転換させることによって、インテグレーションさせる（Beach et al., Mol. Gen. Genet. 1982; Rothstein et al., Methods Enzymol. 1983）。
本発明の形態を以下の実施例によって具体的に説明する。本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。尚、以下の実施例ではキナーゼ阻害剤を添加する代わりに高浸透圧ストレスであるＮａＣｌ（500 mM）の添加を試みた。ＮａＣｌ刺激によってＡｔｆ１の転写活性が上昇することが既に報告されているので（Wilkinson et al., Genes Dev. 1996）、該ＮａＣｌ刺激でこのレポーター活性が上昇するのか否かを検証した。
【実施例１】
【００２６】
ＣＲＥ配列を３つ持つＤＮＡを調製するため、センスおよびアンチセンスＤＮＡ（センス：ggcttttacagtaaatacattacagtaaatacacattacagtaaatgcac アンチセンス：tcgagtgcatttactgtaatgtgtatttactgtaatgtatttactgtaaaagcctgca）を混合した後、９５℃, ２分加温してＤＮＡを変性させ、５５℃, ３分加温してアニーリングを行うことで２本鎖ＤＮＡを調製した。同様に、６個のＲＬＭ配列を持つＤＮＡを調製するため、センスおよびアンチセンスＤＮＡ（センス：ggcttgtatatatagatacagtatatatagatacacagtatatatagatacagtatatatagatacacagtatatatagatacagtatatatagatgcac アンチセンス：ggcttttacagtaaatacattacagtaaatacacattacagtaaatgcac）を混合した後、９５℃, ２分加温してＤＮＡを変性させ、５５℃, ３分加温してアニーリングを行うことで２本鎖ＤＮＡを調製した。ＣＲＥ配列あるいはＲＬＭ１配列を持つＤＮＡとルシフェラーゼ遺伝子をｐＤＳ４７３ａＬ（Forsburg, Sherman et al., Genetics 1997）に挿入し、これらプラスミドを形質転換させた細胞をＥＭＭ培地において２７℃で対数増殖期まで培養し、新しいＥＭＭ培地で６００ｎｍの吸光度が０．１５になるように調整した。その後２７℃で３時間インキュベートし、最終６００ｎｍの吸光度が０．２０になるように調整した。最終濃度が０．５ｍＭになるよう５０ｍＭのＤ−ルシフェリンナトリウム（ナカライテスク）を加え、９６穴プレートに細胞懸濁液を９０μＬずつ分注し、最終容量が１００μＬになるように試薬を加えた。コントロールとしては細胞懸濁液９０μＬに１０μＬの水を加えた。ルミネッセンサーＪＮＲＩＩ（アトー）を用いて発光強度を１２秒毎に３時間計測した。
【００２７】
ＣＲＥ配列を３回繰り返し持つプラスミド［3×CREECM33::luc(R2.2)］を用いて正常細胞を形質転換し、ＮａＣｌ刺激によるＡｔｆ１の転写活性上昇がレポーター活性に反映されるか否か検証した。結果を図２に示す。
その結果、［3×CREECM33::luc(R2.2)］活性は、ＮａＣｌ添加後すぐに一過性の上昇が認められ、その後、［3×CREECM33::luc(R2.2)］活性が一度低下した後、再びピークが認められるという特徴的な波形が認められた（図２Ａ 左端）。一方、ａｔｆ１遺伝子を欠損したａｔｆ１ＫＯ細胞では、ＮａＣｌ刺激による［3×CREECM33::luc(R2.2)］活性の上昇は全く認められなかった（図２Ａ 中央）。さらに、このＣＲＥ配列が、Ａｔｆ１活性に機能的に関連する配列であるか否かを検証するために、ＣＲＥモチーフに変異（ＴＴＡＣＡＧＴＡＡ→ＴＴＡＴＴＴＴＡＡ）を導入した配列を３回繰り返したものをルシフェラーゼ遺伝子に融合させた構築を作製し［3×CREmECM33::luc(R2.2)］、この構築を用いてＮａＣｌ刺激による活性を測定した。その結果、ＮａＣｌ刺激による［3×CREmECM33::luc(R2.2)］活性の上昇は、ほとんど検出されなかった（図２Ａ, 右端）。
【００２８】
次に、［3×CREECM33::luc(R2.2)］レポーター活性が、Ａｔｆ１の上流に位置し、Ａｔｆ１をリン酸化することで制御する２つのＭＡＰＫであるＳｔｙ１ ＭＡＰＫとＰｍｋ ＭＡＰＫ経路に依存的であることを検証した。ｓｔｙ１ＫＯ細胞において、非ストレスおよびＮａＣｌ刺激時のいずれにおいても［3×CREECM33::luc(R2.2)］レポーター活性は、全く検出されなかった。また、ｐｍｋ１ＫＯ細胞においては、正常細胞と比較して、［3×CREECM33::luc(R2.2)］レポーター活性は、顕著に低下していたが、ＮａＣｌ刺激時においては、微弱な反応が認められた（図２Ｂ Δpmk1およびΔsty1）。そこで、Ｐｍｋ１ ＭＡＰＫの上流にあたるＰｅｋ１ ＭＡＰＫＫの恒常的活性化型であるＰｅｋ１ＤＤを用いてＰｍｋ１ ＭＡＰＫの活性化による［3×CREECM33::luc(R2.2)］レポーター活性を測定した結果、非ストレス条件下およびＮａＣｌ刺激時のいずれにおいても、顕著に活性が上昇していた（図２Ｃ wt-Pek1DD OP）。また、ｐｍｋ１ＫＯ細胞においては、Ｐｅｋ１ＤＤを過剰発現した影響はほとんど認められなかった（図２Ｃ Δpmk1）。これらの結果から、［3×CREECM33::luc(R2.2)］レポーター活性は、Ｓｔｙ１ ＭＡＰＫとＰｍｋ１ ＭＡＰＫ活性を反映したものであることが示された。
【実施例２】
【００２９】
ＲＬＭ１認識配列であるＧＴＡＴＡＴＡＴＡＧを６回繰り返した配列をルシフェラーゼ遺伝子に融合させた遺伝子を作製し［6×RLMECM33::luc(R2.2)］、前記実施例１と同様の原理でＭｂｘ１の転写活性を生細胞でリアルタイムに測定することができるシステムを確立した（図３）。
［6×RLMECM33::luc(R2.2)］により形質転換した正常細胞を用いて、ＮａＣｌ（５００ｍＭ）刺激によるレポーター活性を測定した。その結果、［6×RLMECM33::luc(R2.2)］活性は、前述の［3×CREECM33::luc(R2.2)］活性同様、ＮａＣｌ添加後すぐに一過性の上昇が認められ、その後、活性が一度低下した後、再び活性の上昇が認められた（図３Ａ 左端）。一方、ｍｂｘ１ ＫＯ細胞では、ＮａＣｌ刺激による［6×RLMECM33::luc(R2.2)］活性の上昇は全く認められなかった（図３Ａ 中央）。
さらに、このＲＬＭ認識配列に変異（ＧＴＡＴＡＴＡＴＡＧ→ＧＴＧＧＧＣＣＣＡＧ）を導入した配列を６回繰り返したものをルシフェラーゼ遺伝子に融合させた構築を作製し［6×RLMmECM33::luc(R2.2)］、この構築を用いてＮａＣｌ刺激による活性を測定した。その結果、ＮａＣｌ刺激による［6×RLMmECM33::luc(R2.2)］活性の上昇は、全く認められなかった（図３Ａ 右端）。
次に、［6×RLMECM33::luc(R2.2)］レポーター活性が、２つのＭＡＰＫであるＳｔｙ１ ＭＡＰＫとＰｍｋ１ ＭＡＰＫ経路に依存的かを検証したところ、ｐｍｋ１ＫＯ細胞において、非ストレスおよびＮａＣｌ刺激時のいずれにおいても［6×RLMECM33::luc(R2.2)］レポーター活性は、ほとんど検出されなかった（図３Ｂ Δpmk1）。一方、ｓｔｙ１ ＫＯ細胞では、ＮａＣｌ刺激後すぐに認められる１相目のピークは、正常細胞と同様に認められたのに対し、正常細胞では認められる２相目のピークが、ｓｔｙ１ＫＯ細胞において全く認められなかった（図３Ｂ Δsty1）。したがって、ＮａＣｌ刺激によって認められる［6×RLMECM33::luc(R2.2)］レポーター活性の１相目のピークは、Ｐｍｋ１ ＭＡＰＫ経路の活性化を正確に反映していると考えられる。
また、Ｐｅｋ１ＤＤを用いてＰｍｋ１ ＭＡＰＫの活性化による影響を検証したが前記実施例１と同様の結果を得た（図３Ｃ）。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明を用いることにより酵母ＭＡＰキナーゼ系のシグナル伝達系を利用して、Ｐｍｋ１およびＳｔｙ１活性に影響を及ぼす物質を探索することが可能となり、制癌剤などのスクリーニングに応用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母ＭＡＰキナーゼ系のシグナル伝達阻害活性を指標とすることを特徴とする、キナーゼ阻害剤の評価方法。
【請求項２】
酵母ＭＡＰキナーゼがＰｍｋ１およびＳｔｙ１から選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
（１）ＣＲＥ塩基配列および/またはＲＬＭ１結合配列と、その下流にルシフェラーゼ遺伝子を有するベクターを調製し、（２）前記ベクターを酵母に導入し、（３）供試化合物存在下または非存在下で前記酵母を培養して発光強度を測定する工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ベクターが、複数個のＣＲＥ塩基配列とその下流にルシフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ベクターが、複数個のＲＬＭ１結合配列とその下流にルシフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
酵母ＭＡＰキナーゼ系のシグナル伝達阻害活性を指標とすることを特徴とする、キナーゼ阻害剤の評価方法。
【請求項２】
酵母ＭＡＰキナーゼがＰｍｋ１およびＳｔｙ１から選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
（１）ＣＲＥ塩基配列および/またはＲＬＭ１結合配列と、その下流にルシフェラーゼ遺伝子を有するベクターを調製し、（２）前記ベクターを酵母に導入し、（３）供試化合物存在下または非存在下で前記酵母を培養して発光強度を測定する工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ベクターが、複数個のＣＲＥ塩基配列とその下流にルシフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ベクターが、複数個のＲＬＭ１結合配列とその下流にルシフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【公開番号】特開２０１２−１９７６３（Ｐ２０１２−１９７６３Ａ）
【公開日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１６２０９３（Ｐ２０１０−１６２０９３）
【出願日】平成２２年７月１６日（２０１０．７．１６）
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月１６日（２０１０．７．１６）
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【Ｆターム（参考）】
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