ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法
【課題】一分子蛍光分析技術を応用することにより、ＲＮＡ干渉において用いられるｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応を、簡便かつ迅速に検出する方法の提供。
【解決手段】ＲＮＡ干渉において用いられるｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応を検出する方法であって、ＲＮＡ切断反応の基質ＲＮＡとして蛍光標識された一本鎖ＲＮＡを用いて、ｓｉＲＮＡによって前記基質ＲＮＡが切断されたか否かを、一分子蛍光分析法により検出することを特徴とする、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法、前記基質ＲＮＡが、３’末端及び５’末端が蛍光物質により標識された一本鎖ＲＮＡである前記記載の検出方法、前記一分子蛍光分析法が、蛍光強度分布解析法である前記いずれか記載の検出方法、及び、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応が、細胞内又は反応溶液内において行われる前記いずれか記載の検出方法。
【解決手段】ＲＮＡ干渉において用いられるｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応を検出する方法であって、ＲＮＡ切断反応の基質ＲＮＡとして蛍光標識された一本鎖ＲＮＡを用いて、ｓｉＲＮＡによって前記基質ＲＮＡが切断されたか否かを、一分子蛍光分析法により検出することを特徴とする、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法、前記基質ＲＮＡが、３’末端及び５’末端が蛍光物質により標識された一本鎖ＲＮＡである前記記載の検出方法、前記一分子蛍光分析法が、蛍光強度分布解析法である前記いずれか記載の検出方法、及び、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応が、細胞内又は反応溶液内において行われる前記いずれか記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ干渉において用いられるｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応を、一分子蛍光分析法により検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉法は、線虫の体内に二本鎖ＲＮＡを導入した時に遺伝子特異的な抑制が引き起こされる現象として、１９９８年にＦｉｒｅらにより報告された（例えば、非特許文献１、特許文献１参照。）。その後、線虫のみならず、ハエ、植物、動物等といった広範囲の生物種にも存在する現象ということが明らかになった。但し、ヒト等の哺乳動物においては、３０塩基対以上の二本鎖ＲＮＡを導入することにより、インターフェロン応答が引き起こされることも知られていた（例えば、非特許文献２、３参照。）。インターフェロン応答は、免疫応答に前もって働くことが知られている生体の防御機構であり、非特異的な一本鎖ＲＮＡの分解が引き起こされることが知られている。その後、２１塩基対の二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を細胞に導入することにより、インターフェロン応答を回避し、配列特異的なＲＮＡ干渉が起こることが、Ｅｌｂａｓｈｉｒらによって示された（例えば、非特許文献４参照。）。この実験により、哺乳動物においても、ＲＮＡ干渉の技術を応用する道が開けることになった。
【０００３】
哺乳動物における成功をきっかけとして、ＲＮＡ干渉の技術が核酸医薬として応用できるのではないかという期待が膨らんだ。核酸医薬は従来の低分子化合物医薬に比べて以下のような優位点が考えられる。
【０００４】
（１）標的分子との関係が明確であるという点。ある医薬が、生体内において、標的物質以外の生体物質に対してどの程度作用するのかは、副作用等を検討する上で非常に重要である。しかしながら、主にタンパク質に作用すると考えられる従来の低分子化合物医薬は、あるタンパク質が、ある低分子化合物医薬の標的タンパク質であるのか否かの確認や、標的タンパク質以外のタンパク質に作用する副作用の検討が、非常に困難であり、基本的には、生体に直接低分子化合物医薬を投与し、副作用等を検討する以外には、確実な方法はあまりない。これは、生体内でのタンパク質の構造等を全て検討することは困難であるためと考えられる。これに対して、主に核酸に作用すると考えられる核酸医薬は、標的核酸の同定や、標的核酸以外の核酸に対する副作用の予測等が、タンパク質に作用する低分子化合物医薬に比べてはるかに簡便に精度よく行うことができる。核酸医薬においても、副作用として、遺伝子配列上の相同性等から、標的遺伝子以外の遺伝子に対する機能阻害等を引き起こすことが考えられるが、ヒトゲノムの遺伝子配列がほぼ完全に解読されているため、副作用の予見が高い精度で可能である。実際に、ＲＮＡ干渉を利用した創薬では、標的ではない遺伝子に対する副作用を回避するための予測プログラム（ＲＮＡｉ社、ｓｉＤｉｒｅｃｔ（登録商標）等）が販売されている。
【０００５】
（２）創薬プロセスの標的同定からヒット・リード分子の取得へのプロセスが早いという点。低分子化合物医薬の製造においては、一般的に、標的タンパク質を決定した後、該標的タンパク質の発現系の構築、最適なアッセイ系の構築、数万以上の化合物ライブラリからのスクリーニング、というステップを踏む必要がある。タンパク質の発現系の構築工程や、最適なアッセイ系の構築工程は、タンパク質の種類ごとにその機能に沿った至適な条件を見つけ出す必要がある。このため、これらの工程は、熟練した技術者でも、数ヶ月から1年程度はかかる作業であり、非常に労力を要する。さらにその後、最低でも数万個の低分子化合物を有する化合物ライブラリから、標的タンパク質と結合し得るヒット・リード化合物をスクリーニングする必要がある。これに対して、核酸医薬では、標的遺伝子を決定した後、該遺伝子が有する塩基配列と相補的な塩基配列を元に、直接的に核酸医薬のヒット・リード分子を設計することができる。さらに、せいぜい数千種類の候補核酸医薬からスクリーニングを行うことによって、核酸医薬として十分な効果を有する分子を取得し得る。
【０００６】
このような利点を有するため、現在、核酸医薬の開発が加速しつつある。一例を挙げると、２００５年２月には、Ａｃｕｔｉｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社の加齢性黄斑変性症を標的とした修飾ｓｉＲＮＡが、臨床試験第一相に入ったという報告がある。この核酸医薬は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ)を標的として、疾患を引き起こす血管新生を阻害することが、ラットをモデルにした実験系で実証されている。
【０００７】
このように、ＲＮＡ干渉技術を応用した核酸医薬を開発しようとする取組みが、世界中で活発に行われているが、この開発工程において、現時点ではいくつか問題点がある。
その１つは、ＲＮＡ干渉技術の評価方法にある。従来の方法では、ＲＮＡ干渉が起こっているかどうかの判断は、標的遺伝子の産物であるタンパク質の発現の有無を調べることにより間接的に検出されていた。この際の、タンパク質の発現の有無の判断においては、特に、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質や、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）等の発光反応を触媒するタンパク質が、多く利用されている（例えば、非特許文献４参照。）。しかしながら、この方法では、ＲＮＡ干渉により標的遺伝子の転写産物たるｍＲＮＡが分解されたためにタンパク質の発現が抑制された場合と、ＲＮＡ干渉における分解反応以外の原因によってタンパク質の合成が阻害されている場合とを、区別することができない。
【０００８】
その他にも、試験管内で、数千もの候補核酸医薬のスクリーニングする方法の効率が不十分であるという問題もある。従来のスクリーニング方法では、細胞アッセイや、計算機による予測等の方法が使われている。しかしながら、細胞アッセイでは、スクリーニングするためには細胞培養をしなければならず、労力と費用がかかってしまう。一方、計算機による予測では、確実に活性のあるものが選択できるという予測確度は未だ低い。その他、試験管内での検出方法は、一般的に、予め放射性同位体で標識した核酸を電気泳動することにより、ＲＮＡ干渉による核酸分解が生じているか否かを調べるため、大量の候補核酸医薬に対して行われるスクリーニングには向いていない。
【０００９】
上記の２つの問題点から、ＲＮＡ干渉技術を応用した核酸医薬の開発促進のためには、ＲＮＡ干渉における分解反応を、生体内もしくは生体外の溶液中において、直接検出することができる、効率的かつ簡便な方法の開発が重要であることが示唆される。
【００１０】
一方、近年の光計測技術の発展は目覚ましく、蛍光一分子からの蛍光を測定・解析することができる一分子蛍光分析技術が多くの分野で応用されつつある。一分子蛍光分析技術を応用することにより、例えば、分解反応において基質となる分子を蛍光標識し、この蛍光標識分子から検出される蛍光シグナルを解析することによって、分解反応やそれに伴う分子量変化を検出することができる。分解反応の検出に用いられる方法として、現在までに、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、蛍光偏光（ＦＰ）、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ）、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）等が知られている。
【００１１】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、分子をそれぞれ分光特性の異なる複数の蛍光物質で標識し、蛍光分子同士の距離が非常に近づいたとき生じる蛍光分子間の蛍光エネルギーの移動を観測する手法である（例えば、非特許文献５参照。）。一般的には、ＦＲＥＴでは、蛍光エネルギーを与える蛍光物質（ドナー）とそのエネルギーを励起エネルギーとして受け取る蛍光物質（アクセプター）の、２種類の分光特性の異なる蛍光物質を用いる。蛍光共鳴エネルギー遷移は、２つの蛍光分子が互いに混合して相互作用し、１つの吸収波長が他方の放射波長と重複する場合に観測される。ここで、２つの蛍光分子間の平均間隔をｒとした場合に、エネルギー遷移の効率は、ｒ−６に比例する。このため、２つの分子間の相互作用や相互の親和性が増大すると、エネルギー遷移現象が増強され、その結果、アクセプターからの蛍光発光が増大することとなる。そこで、従来から、分解反応の基質となる分子をドナーとアクセプターで標識し、分解反応に伴うＦＲＥＴを検出することにより、核酸やペプチドの分解を検出する方法は知られている。
【００１２】
蛍光偏光法（ＦＰ）は、分子の体積及びミクロ粘度の高感度測定のために、研究及び臨床の両方の用途に用いられている。溶液中の分子はそれらの種々の軸の周りに“混転する（ｔｕｍｂｌｅ）”傾向があり、ＦＰは溶液中の分子の回転特性の変化に依存する。具体的には、大型分子ほど、例えば体積又は分子量がより大きいものほど、小型分子よりも緩慢に、より少ない軸に沿って混転する。したがって、励起と発光の間の運動がより少なく、このため発光光線は比較的高度の偏光を示す。逆に、励起と発光の間でより大きな混転を示す小型の蛍光性分子からの蛍光発光ほど、より多面性（ｍｕｌｔｉｐｌａｎａｒ）であり、偏光度が低い。小型分子が、より大きい、又はより堅牢なコンホメーションをとると、その混転は低下し、発光蛍光は相対的により大きく偏光するようになる。この発光蛍光の偏光度の変化を測定して、蛍光分子の大きさや堅牢度の増大の指標として利用することができる。
【００１３】
蛍光相関分光法（ＦＣＳ）は、蛍光ラベルした反応体と相互作用活性を持つ物質とを、透明な媒体中で自由に拡散させることにより、相互作用による分子量変化を検出する方法の１つである（例えば、特許文献３参照。）。媒体中を拡散している分子は、焦点（極微小空間）を通過する際に、共焦点光学系で検出可能な蛍光強度の変動を発生させる。そこで、この蛍光シグナルに対して自己相関解析を行うことにより、該相互作用により得られる反応体の分子量変化を解析又は定量することができる。なお、特許文献３は、ＲＮＡ干渉反応におけるＲＮＡの分解反応検出については開示していない。
【００１４】
蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ）は、それぞれ分光特性の異なる蛍光物質を用いて標識した分子同士の相互作用を解析する方法である。つまり、試料に対し、各蛍光物質に対応した励起光を同時に照射し、それぞれの分子から検出された蛍光シグナルの相互相関を解析することにより、異なる分子の動きに同時性があるかどうかを確認することができる。このように、ＦＣＣＳは、ＦＣＳとは異なり、相互作用前後での分子サイズの変化に全く依存せずに分子間の相互作用を解析することが可能である。このため、相互作用前後での分子サイズの変化が小さい場合であっても好適に分子間相互作用を解析することができる。
【００１５】
また、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）は、溶液中の粒子の混合物の蛍光明度の分析のための方法である（例えば、特許文４参照。）。すなわち、ＦＩＤＡは、ＦＣＳ分析に用いられるものと同様の光学的かつ電子的構成に基づいているが、焦点から検出された蛍光シグナルの分析のために、ＦＣＳとは異なるアルゴリズムを利用するものである。具体的には、この方法は、光子カウント数のヒストグラムを測定し、かつ所定の粒子当たりの平均カウント率として表される比明度の関数として蛍光粒子の濃度を決定する。異種の試料における様々な蛍光種の濃度の測定に適用可能であり、様々な分野において有益なツールである。例えば、薬剤開発及び診断に対する基本的な研究等においても適用可能である。一例として、ＦＩＤＡにより、フリーの蛍光ラベルされた抗原と、二価抗体分子等の多価レセプターに結合した蛍光ラベルされた抗原とを、区別することができる。なお、特許文献４は、ＲＮＡ干渉反応におけるＲＮＡの分解反応検出については開示していない。
【特許文献１】特表２００２−５１６０６２号公報
【特許文献２】特開２００５−３３７８０５号公報
【特許文献３】特表平１１−５０２６０８号公報
【特許文献４】特表２００２−５４３４１４号公報
【非特許文献１】ファイヤ（Fire）、外５名、ネイチャー（Nature）、１９９８年、第３９１巻、８０６〜８１１ページ。
【非特許文献２】ギル（Gil）、外１名、アポトーシス（Apoptsis）、２０００年、第５巻、１０７〜１１４ページ。
【非特許文献３】ウイテイ（Ui-Tei）、外３名、フェブス・レター（FEBS letters）、２０００年、第４７９巻、７９〜８２ページ。
【非特許文献４】エルバシール（Elbashir）、外５名、ネイチャー（Nature）、２００１年、第４１１巻、４９４〜４９８ページ。
【非特許文献５】テオドラス（Theodorus）、外２名、ジャーナル・オブ・ザ・セル・バイオロジー（The Journal of Cell Biology）、１９９５年、第１２９巻、１５４３〜１５５８ページ。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明者は、従来、核酸やタンパク質等の分解反応や相互作用反応の解析に供されてきた上記のような一分子蛍光分析技術を応用することにより、ＲＮＡ干渉におけるＲＮＡ分解反応を、直接的に効率よく検出することができるのではないか、と考えた。
【００１７】
しかしながら、例えば、ＦＲＥＴを用いてＲＮＡ分解反応を検出しようとした場合には、ＦＲＥＴ効率は分子距離に大きく依存するため、基質となるＲＮＡの核酸長が長い場合には、ＦＲＥＴ効率が悪く、切断反応の検出に用いることが困難な場合がある。また、ＦＲＥＴを測定するための装置が複雑である、という問題もある。
【００１８】
また、ＦＰは、基準となる偏光度の上昇が分子量３０ｋＤａ程度で飽和してしまうことが知られている。このため、ＲＮＡの分子サイズを考慮した場合、分解前のＲＮＡと分解後のＲＮＡでは区別できない場合が多い、という問題がある。
一方、ＦＣＳでは、分子量に４倍程度の差がないと分子量変化を検出することができない。このため、ＲＮＡ干渉によるＲＮＡの切断部位によっては、分解前のＲＮＡと分解後のＲＮＡとを、区別できない可能性がある。このように、ＦＣＳにおいては、切断部位の違いは検出能に大きな影響を与えるため、特にスクリーニング等の、多種多様な候補ｓｉＲＮＡを並列に比較する用途には、ＦＣＳは適当ではない。
【００１９】
その他、ＦＣＣＳでは、相互作用前後での分子サイズの変化が２倍程度しかないような場合にも解析は可能であるという利点がある。しかしながら、微小空間である一の観測領域に、波長の異なる励起光を照射して蛍光シグナルを検出するため、使用する対物レンズ等の軸上色収差により、それぞれの波長の励起光の共焦点領域は完全には一致せず、目的の分子間相互作用の検出感度や精度が低下してしまうという重大な課題がある。
【００２０】
本発明は、一分子蛍光分析技術を応用することにより、ＲＮＡ干渉において用いられるｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応を、簡便かつ迅速に検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ＲＮＡ切断反応の基質となるＲＮＡとして、蛍光標識された一本鎖ＲＮＡを用いることにより、ｓｉＲＮＡによって前記一本鎖ＲＮＡが切断されたか否かを、一分子蛍光分析法、特にＦＩＤＡを用いて検出することによって、直接的に効率よく検出することができることを見出し、本発明を完成させた。
【００２２】
すなわち、本発明は、
（１） ＲＮＡ干渉において用いられるｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応を検出する方法であって、ＲＮＡ切断反応の基質ＲＮＡとして蛍光標識された一本鎖ＲＮＡを用いて、ｓｉＲＮＡによって前記基質ＲＮＡが切断されたか否かを、一分子蛍光分析法により検出することを特徴とする、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法、
（２） 前記基質ＲＮＡが、３’末端及び５’末端が蛍光物質により標識された一本鎖ＲＮＡであることを特徴とする前記（１）記載のｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法、
（３） 前記一分子蛍光分析法が、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載のｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法、
（４） ＲＮＡ干渉において用いられるｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応を検出する方法であって、ＲＮＡ切断反応の基質ＲＮＡとして、３’末端及び５’末端が蛍光物質により標識された一本鎖ＲＮＡを用いるものであり、ＲＮＡヘリカーゼ、及びＲＩＳＣ複合体を含む反応溶液に、ｓｉＲＮＡ及び前記基質ＲＮＡを添加し、反応させる反応工程と、前記反応工程後、前記反応溶液に、前記蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該蛍光物質から発生する蛍光を、蛍光シグナルとして検出する検出工程と、前記検出工程において検出された蛍光シグナルに基づいて蛍光強度分布解析を行い、ＲＮＡ切断反応効率を測定する測定工程と、を有することを特徴とする、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法、
（５） ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応が、細胞内又は反応溶液内において行われることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか記載のｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法を用いることにより、基質となるＲＮＡの長さや分子の大きさ、ｓｉＲＮＡによる切断部位等の条件を、個々のＲＮＡに対して別個に検討することを要することなく、簡便かつ迅速にＲＮＡ切断反応を検出することができる。
特に、ＲＮＡ干渉においては、標的遺伝子の機能を抑制・阻害する上で、２０塩基対程度の短い二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の選択は非常に重要であるが、本発明のｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法を用いることにより、多数のｓｉＲＮＡ候補分子の中から、実際に抑制効率の高いｓｉＲＮＡを選択する上で、手間や時間の節約に資することが期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明のｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法（以下、本発明の検出方法、ということがある。）は、ＲＮＡ干渉において用いられるｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応を検出する方法であって、ＲＮＡ切断反応の基質ＲＮＡとして、蛍光標識された一本鎖ＲＮＡを用いて、ｓｉＲＮＡによって前記基質ＲＮＡが切断されたか否かを、一分子蛍光分析法により検出することを特徴とする。標的遺伝子の発現産物であるタンパク質の発現効率や機能効率を指標としてｓｉＲＮＡの抑制効率を測定する従来法（例えば、非特許文献４等参照。）と比較して、本発明の検出方法は、ｓｉＲＮＡによる基質ＲＮＡの切断効率を直接測定しているため、より信頼性の高いデータを得ることができる。
【００２５】
本発明における基質ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子（ＲＮＡ干渉により、当該遺伝子又は当該遺伝子の発現産物の機能を抑制・阻害する対象である遺伝子）由来の一本鎖ＲＮＡであって、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応における基質として機能するＲＮＡである。標的遺伝子由来の一本鎖ＲＮＡは、標的遺伝子から転写された一本鎖ＲＮＡであれば特に限定されるものではなく、ｍＲＮＡ等が挙げられる。
【００２６】
標的遺伝子は、構造遺伝子であってもよく、非構造遺伝子であってもよい。また、標的遺伝子の由来する生物種は特に限定されるものではなく、線虫、ハエ等の昆虫、植物、動物のいずれであってもよい。本発明においては、ヒトをはじめとする哺乳動物由来の遺伝子であることが好ましい。
【００２７】
本発明の検出方法において用いられる基質ＲＮＡは、蛍光標識された一本鎖ＲＮＡである。蛍光標識は、基質ＲＮＡが切断されたか否かを判別し得る部分、すなわち、蛍光標識から検出される蛍光シグナルを解析することにより、切断前の基質ＲＮＡと切断後の基質ＲＮＡとの識別が可能である位置であれば、特に限定されるものではなく、検出に用いられる一分子蛍光分析法の種類、基質ＲＮＡの種類、ｓｉＲＮＡの種類等を考慮して、適宜決定することができる。
【００２８】
本発明の検出方法においては、基質ＲＮＡの３’末端及び５’末端が蛍光物質により標識されていることが好ましい。基質ＲＮＡの両末端が蛍光標識されていることにより、ｓｉＲＮＡによる基質ＲＮＡの切断部位を考慮することなく、基質ＲＮＡの切断の有無をＦＩＤＡにより簡便に検出することができるためである。例えば、基質ＲＮＡの３’末端と５’末端とに、同種の蛍光物質を結合させた場合には、理論的には、切断後の基質ＲＮＡの一分子当たりの蛍光強度は、切断前の基質ＲＮＡの一分子当たりの蛍光強度の半分になる。このため、一分子当たりの蛍光強度が異なる分子を区別して検出することが可能なＦＩＤＡにより、切断後の基質ＲＮＡと切断前の基質ＲＮＡとを識別して、切断反応効率を算出することができる。
【００２９】
基質ＲＮＡの蛍光標識に用いられる蛍光物質としては、特に限定されるものではなく、一般的に核酸の蛍光標識に用いられる蛍光物質の中から適宜決定することができる。このような蛍光物質としては、例えば、ＴＡＭＲＡ、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアナート）、フルオレセイン、ローダミン、ＮＢＤ、ＴＭＲ（テトラメチルローダミン）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（インビトロジェン社製）、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ)、ＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ)等がある。ＲＮＡ切断反応に対する影響を抑えることができるため、ＴＡＭＲＡ、ＦＩＴＣ、フルオレセイン、ローダミン、ＮＢＤ、ＴＭＲ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ等の比較的分子量の小さい蛍光物質であることが好ましい。特に、ＴＭＲ等のように、連続して光照射を行った場合でも比較的安定して蛍光を発する色素であることが好ましい。このように退色し難い蛍光物質を標識として用いることにより、光照射の時間や回数の影響を抑えて、計測値ごとのばらつきを防止し、より安定した解析結果を得ることができる。
【００３０】
基質ＲＮＡを蛍光標識する方法は、特に限定されるものではなく、核酸を蛍光標識する場合に通常行われている手法を使用して行うことができる。例えば、基質ＲＮＡに直接蛍光物質を結合させてもよく、蛍光物質と基質ＲＮＡとの相互作用を利用して間接的に結合させたものであってもよい。本発明の検出方法において基質ＲＮＡとして好適な３’末端及び５’末端が蛍光物質により標識されている一本鎖ＲＮＡは、例えば、以下の手法（Ａ）〜（Ｃ）により得ることができる。なお、本発明において用いられる基質ＲＮＡは、下記（Ａ）〜（Ｃ）により合成されたものに限定されるものではない。
【００３１】
・手法（Ａ）
まず、標的遺伝子（ＤＮＡ）から、ｍＲＮＡを調製する。例えば、ＲｉｂｏＭＡＸ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等の市販のｍＲＮＡ合成キットを用いることにより、試験管内等のｉｎ ｖｉｔｒｏにおいても、簡便にｍＲＮＡを調製することができる。
次に、５’末端が蛍光物質により標識されている１０〜２０塩基長程度の任意の塩基配列を持つ一本鎖ＲＮＡ（５’末端標識ＲＮＡ）、及び、３’末端が蛍光物質により標識されている１０〜２０塩基長程度の任意の塩基配列を持つ一本鎖ＲＮＡ（３’末端標識ＲＮＡ）を、それぞれ化学合成する。５’末端標識ＲＮＡと３’末端標識ＲＮＡの塩基配列は同一であってもよく、異なっていてもよい。また、化学合成は、当該技術分野において公知のいずれの手法により行ってもよく、シグマジェノシス社等の受託サービスを利用してもよい。
【００３２】
さらに、標的遺伝子から調製したｍＲＮＡと５’末端標識ＲＮＡと３’末端標識ＲＮＡとを連結させて、３’末端及び５’末端が蛍光物質により標識されている基質ＲＮＡを得た後、分子量の差や親和性の差を利用して公知の手法により精製することができる。一例としては、図１に模式的に示すように、まず、ｍＲＮＡ（１）と５’末端標識ＲＮＡ（２）とを、Ｔ４ ＲＮＡ ｌｉｇａｓｅ等の酵素を用いて結合させて、５’末端標識済みｍＲＮＡ（３）を得る。その後、ゲル濾過クロマトグラフィー法等により、分子サイズによる分画を行い、分子量が顕著に小さい５’末端標識ＲＮＡ（２）を除去する。さらに、残ったｍＲＮＡ（１）及び５’末端標識済みｍＲＮＡ（３）の混合物を、５’末端標識ＲＮＡ（２）と相補的な塩基配列を有する一本鎖ＲＮＡが固定された担体（４）を用いたアフィニティークロマトグラフィー法等により、親和性（アフィニティー）による分画を行い、ｍＲＮＡ（１）を除去して５’末端標識済みｍＲＮＡ（３）を精製する。次に、この精製された５’末端標識済みｍＲＮＡ（３）と３’末端標識ＲＮＡ（５）とを、Ｔ４ ＲＮＡ ｌｉｇａｓｅ等の酵素を用いて結合させて、両末端標識済みｍＲＮＡ（６）を得る。その後、同様にして、分子サイズによる分画を行い、３’末端標識ＲＮＡ（５）を除去した後、親和性（アフィニティー）による分画を行うことにより、精製された両末端標識済みｍＲＮＡ（６）が得られる。
【００３３】
・手法（Ｂ）
まず、標的遺伝子の５’側領域及び３’側領域の両方に、蛍光物質と特異的に結合するＲＮＡアプタマーを有するｍＲＮＡを合成するために、標的遺伝子（ＤＮＡ）を組み換えた組み換え遺伝子を得る。この組み換え遺伝子（ＤＮＡ）から、手法（Ａ）と同様にしてｍＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ（１）の３’末端及び５’末端に、蛍光物質と特異的に結合するＲＮＡアプタマー（７）を有するアプタマー付加ｍＲＮＡ（８）を得る。その後、図２に模式的に示すように、反応液に蛍光物質（Ｆ）を添加し、アプタマー（７）と蛍光物質（Ｆ）と結合させた後、分子サイズによる分画を行い、蛍光物質（Ｆ）と結合したアプタマー付加ｍＲＮＡ（８）を精製する。
【００３４】
・手法（Ｃ）
まず、標的遺伝子の５’側領域及び３’側領域の両方に、１０〜２０塩基長程度の任意の塩基配列を有するｍＲＮＡを合成するために、標的遺伝子（ＤＮＡ）を組み換えた組み換え遺伝子を得る。この組み換え遺伝子（ＤＮＡ）から、手法（Ａ）と同様にしてｍＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ（１）の３’末端及び５’末端に、１０〜２０塩基長程度の任意の塩基配列を有する一本鎖ＲＮＡ（９）を有する配列付加ｍＲＮＡ（１０）を得る。その後、図３に模式的に示すように、反応液に、塩基配列（９）と相補的な配列を有し、３’末端が蛍光物質（Ｆ）により標識されている一本鎖ＲＮＡである３’末端標識ＲＮＡプローブ（１１）と、一本鎖ＲＮＡ（９）と相補的な配列を有し、５’末端が蛍光物質により標識されている一本鎖ＲＮＡである５’末端標識ＲＮＡプローブ（１２）とを添加し、配列付加ｍＲＮＡ（１０）及び３’末端標識ＲＮＡプローブ（１１）、並びに、配列付加ｍＲＮＡ（１０）及び５’末端標識ＲＮＡプローブ（１２）を、ハイブリダイズさせる。これにより形成された３者からなる複合体は、分子サイズによる分画を行い、精製することができる。
【００３５】
本発明において、ｓｉＲＮＡとは、基質ＲＮＡの一部又は全部と相補的な配列を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）と、それに相補的な配列を有するＲＮＡ鎖（センス鎖）とからなる二本鎖ＲＮＡである。該ｓｉＲＮＡの塩基対長は、ＲＮＡ干渉において有効な長さであれば特に限定されるものではなく、標的遺伝子の種類や塩基配列、標的遺伝子が由来する生物種、細胞等への導入方法等を考慮して、適宜決定することができる。ヒト等の哺乳動物に対するＲＮＡ干渉において用いられるｓｉＲＮＡとしては、基質ＲＮＡと相補的な配列部分が１５〜２５塩基対長であることが好ましい。
【００３６】
本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、当該技術分野において公知のいずれの手法により設計し、合成してもよい。例えば、標的遺伝子由来のｍＲＮＡの塩基配列情報に基づき、ｓｉＲＮＡの塩基配列を常法により設計した後、該設計に基づき、公知の核酸合成反応により合成することができる。ｓｉＲＮＡの合成は、例えば、市販の合成機を用いて独自に合成してもよく、受託サービスを利用して合成することもできる。
【００３７】
なお、本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、基質ＲＮＡに対するＲＮＡ切断反応を阻害しない限り、基質ＲＮＡの一部又は全部と相補的な配列以外の付加的な塩基配列を有していてもよい。また、２’−Ｏ−メチル化等の修飾がなされた二本鎖ＲＮＡであってもよい。
【００３８】
本発明の検出方法は、例えば、ＲＮＡ切断反応の基質ＲＮＡとして、３’末端及び５’末端が蛍光物質により標識された一本鎖ＲＮＡを用いて、ＲＮＡヘリカーゼ、及びＲＩＳＣ複合体を含む反応溶液に、ｓｉＲＮＡ及び前記基質ＲＮＡを添加し、反応させる反応工程と、前記反応工程後、前記反応溶液に、前記蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該蛍光物質から発生する蛍光を、蛍光シグナルとして検出する検出工程と、前記検出工程において検出された蛍光シグナルに基づいて蛍光強度分布解析を行い、ＲＮＡ切断反応効率を測定する測定工程と、を有していてもよい。
【００３９】
まず、反応工程として、ＲＮＡヘリカーゼ及びＲＩＳＣ複合体を含む反応溶液に、ｓｉＲＮＡと３’末端及び５’末端が蛍光物質により標識されている基質ＲＮＡとを添加して反応させる。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡヘリカーゼによる巻き戻しを受けて１本鎖ＲＮＡとなり、主にアンチセンス鎖と複数のタンパク質がＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）複合体を形成する。このｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、基質ＲＮＡ中の相補的な部位と結合することにより、ＲＩＳＣのリボヌクレアーゼ活性によって基質ＲＮＡが分解される。
【００４０】
この反応工程において用いられる反応溶液は、ヘリカーゼやＲＩＳＣ等のＲＮＡ切断反応に必要な分子を含有する溶液であれば、特に限定されるものではなく、ＲＮＡ干渉を行う場合に一般的に用いられている試薬等を適宜用いて調製することができる。好ましくは、培養細胞等から調製した細胞抽出液である。元々ＲＮＡ干渉は細胞内において生じる現象であり、よって、細胞抽出液には、ＲＮＡ干渉に必要な分子が含有されているためである。なお、細胞抽出液は、Ｄｉｇｎａｍらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８３年、第１１巻、第１４７５〜１４８９ページ参照。）等の常法により調製することができる。
【００４１】
また、該反応工程は、試験管内等のｉｎ ｖｉｔｒｏで行ってもよく、細胞内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で行ってもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏで行う場合には、例えば、反応溶液に、ｓｉＲＮＡを添加して反応させた後、さらに基質ＲＮＡを添加して反応させることにより、ｓｉＲＮＡにより基質ＲＮＡを切断することができる。一方、ｉｎ ｖｉｖｏで行う場合には、例えば、細胞にｓｉＲＮＡを導入して反応させた後、さらに基質ＲＮＡを導入して反応させることにより、ｓｉＲＮＡにより基質ＲＮＡを切断することができる。なお、ｓｉＲＮＡや基質ＲＮＡの細胞への導入は、当該技術分野において公知のいずれの手法により行ってもよい。例えば、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社製）等の市販の核酸導入試薬を用いることにより、細胞内へのｓｉＲＮＡや基質ＲＮＡの導入を簡便に行うことができる。
【００４２】
反応させる時間は、反応溶液の種類、反応溶液中のヘリカーゼやＲＩＳＣ等の活性、基質ＲＮＡやｓｉＲＮＡの濃度等を考慮して適宜決定することができる。また、反応温度は、反応溶液中のヘリカーゼやＲＩＳＣ等の活性において好適な温度範囲で適宜設定することができる。例えば、反応溶液が、ヒト由来培養細胞から調製された細胞培養液に、基質ＲＮＡを添加した溶液である場合には、当該反応溶液にｓｉＲＮＡを添加し、３７℃で１５分間以上反応させた後、さらに基質ＲＮＡを添加し、３７℃で２〜６時間程度反応させることができる。一方、反応工程をヒト由来培養細胞内で行う場合には、例えば、３７℃で培養している細胞培養に、核酸導入試薬を用いてｓｉＲＮＡを導入し、導入後４８〜９６時間経過後に、核酸導入試薬を用いて基質ＲＮＡを導入し、さらに４８〜９６時間培養することができる。
【００４３】
次に、反応工程後、検出工程として、反応溶液に、基質ＲＮＡの標識に用いた蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該蛍光物質から発生する蛍光を、蛍光シグナルとして検出する。具体的には、共焦点（コンフォーカル）光学系を有する蛍光光度計に、該反応溶液を設置し、常法により蛍光シグナルを検出することができる。また、反応工程を細胞内で行った場合には、該細胞を、共焦点光学系を有する蛍光顕微鏡に設置し、常法により蛍光シグナルを検出することができる。なお、ＦＩＤＡをはじめとする一分子蛍光分析法は、一般的には、共焦点光学系を利用するものであるが、一分子由来の蛍光シグナルを取得して蛍光強度分布解析を行うことができる光学系であれば、特に限定されるものではなく、共焦点光学系以外の他の光学系を用いることも可能である。
【００４４】
蛍光シグナルの計測条件は、使用する蛍光光度計や蛍光顕微鏡の仕様により、適宜決定することができるが、例えば、１サンプル当たり、１５秒間で５回程度行う。計測時間はこれ以上長くても良く、回数もこれ以上多くても良い。但し、検出に用いる装置の種類によっては、計測時間が１０秒間以下等の短時間である場合や、測定回数が１回程度のみである場合には、データの再現性、信頼性が低下するおそれがある。また、蛍光シグナルを計測するサンプルに対して焦点位置を走査させることにより、より多数の分子から情報（蛍光シグナル）を取得することができ、統計的な精度を高めることも可能である。
【００４５】
その後、測定工程として、検出された蛍光シグナルに基づいて蛍光強度分布解析を行い、ＲＮＡ切断反応効率を測定する。すなわち、検出された蛍光シグナルのデータに対して蛍光強度分布解析を行うことにより、蛍光分子の蛍光強度や、検出領域中の濃度を算出することができる。具体的には、一分子当たりの蛍光強度から、該蛍光分子が切断された基質ＲＮＡか、未切断の基質ＲＮＡかを判別し、これらの分子数の割合を算出する。
【００４６】
ＲＮＡ切断反応の効率は、蛍光強度の減少や、蛍光強度の小さい分子の濃度の増加から判断することが可能である。図４（Ｂ）は、ＲＮＡ切断反応前と反応後のフォトンの数（Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐｈｏｔｏｎｓ）とその確率（Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）の変化を示した図である。図４（Ａ）に示すように、理論的には、切断された基質ＲＮＡの蛍光強度は、未切断の基質ＲＮＡの蛍光強度のおよそ半分となる。さらに、ＲＮＡ切断により、蛍光分子数は２倍となる。つまり、切断反応により、蛍光強度の小さい分子数の割合が多いほど、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の反応効率が高いことを示す。
【００４７】
以下、反応工程を細胞内において行う場合と、細胞外において行う場合の、それぞれにおける本発明の一実施態様を示す。なお、本発明は以下の実施態様に限定されるものではない。
【００４８】
[細胞内において反応工程を行う場合]
１．ＲＮＡ干渉の効率を検出したい標的遺伝子（ＤＮＡ）を用意する。ＲｉｂｏＭＡＸ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等を用いることにより、試験管内で標的遺伝子（ＤＮＡ）からｍＲＮＡを発現させる。
２．上記の手法（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）のいずれかの手法により、ｍＲＮＡの両末端を蛍光標識する。
３．培養細胞に、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社製）等の核酸導入試薬を用いて、当該標的遺伝子を標的とする２０塩基対前後の長さのｓｉＲＮＡを導入し、ＲＮＡ干渉を引き起こす。ｓｉＲＮＡ導入後、４８〜９６時間培養した後の培養細胞に対して、核酸導入試薬を用いて、上記２で合成した蛍光標識ｍＲＮＡを導入し、さらに４８〜９６時間培養する。
４．導入後４８〜９６時間培養した培養細胞から、直接、コンフォーカル（共焦点）光学系を用いた蛍光光度計を用いて、蛍光パターンを検出し、記録部等に記録する。蛍光パターンの検出に際し、培養細胞（サンプル）に対して焦点位置を走査させることにより、より多数の分子から情報（蛍光シグナル）を取得して統計的な精度を高めると同時に、空間的な分解効率の情報を取得することも可能である。
５．記録された蛍光パターンのデータに対してＦＩＤＡを行い、蛍光分子の並進時間を求め、測定された各蛍光分子の蛍光強度及び濃度を算出する。ＲＮＡ切断反応の効率は、蛍光強度の減少や、蛍光分子の濃度の増加から判断することが可能である。
【００４９】
[細胞外において反応工程を行う場合]
直接核酸医薬候補となる配列を有するｓｉＲＮＡを用いることにより、候補核酸医薬のスクリーニング等に好適な方法である。
１．ＲＮＡ干渉の効率を検出したい標的遺伝子（ＤＮＡ）を用意する。ＲｉｂｏＭＡＸ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等を用いることにより、試験管内で標的遺伝子（ＤＮＡ）からｍＲＮＡを発現させる。
２．上記の手法（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）のいずれかの手法により、ｍＲＮＡの両末端を蛍光標識する。
３．培養細胞から常法により細胞抽出液を調製する。
４．上記３で調製した細胞抽出液に、当該標的遺伝子を標的とする２０塩基対前後の長さのｓｉＲＮＡを添加して混合し、３７℃で約１５分間以上インキュベーションする。
５．下記の試薬を所定の濃度になるように添加して混合する；１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９)、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＡＴＰ、０．２ｍＭ ＧＴＰ、１０Ｕ／ｍｌ Ｒｎａｓｉｎ(Ｐｒｏｍｅｇａ社製)、１ｎＭ〜１０ｎＭの濃度に調製した上記２で合成した蛍光標識ｍＲＮＡ、全体の５０％の容量になるように調製した上記４の細胞抽出液。
６．上記５で調製した反応溶液を、３７℃で２〜６時間程度インキュベーションする。
７．反応後、該反応溶液を、コンフォーカル（共焦点）光学系を用いた蛍光光度計に設置し、蛍光パターンを検出し、記録部等に記録する。蛍光パターンの検出に際し、サンプル（反応溶液）に対して焦点位置を走査させることにより、より多数の分子から情報（蛍光シグナル）を取得して統計的な精度を高めると同時に、空間的な分解効率の情報を取得することも可能である。
８．記録された蛍光パターンのデータに対してＦＩＤＡを行い、蛍光分子の並進時間を求め、測定された各蛍光分子の蛍光強度及び濃度を算出する。ＲＮＡ切断反応の効率は、蛍光強度の減少や、蛍光分子の濃度の増加から判断することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明のｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法を用いることにより、簡便かつ迅速にＲＮＡ切断反応を検出することができるため、多数の候補分子の中から、ＲＮＡ干渉効果の高いｓｉＲＮＡを簡便にスクリーニングすることも可能であり、学術研究分野のみならず、ｓｉＲＮＡを応用した核酸医薬の開発の分野においても利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】蛍光標識した基質ＲＮＡを製造する手法（Ａ）を模式的に示した図である。
【図２】蛍光標識した基質ＲＮＡを製造する手法（Ｂ）を模式的に示した図である。
【図３】蛍光標識した基質ＲＮＡを製造する手法（Ｃ）を模式的に示した図である。
【図４】図４（Ａ）は、３’末端及び５’末端が蛍光物質により標識された基質ＲＮＡ（両末端標識済みｍＲＮＡ（６））が、ＲＮＡ切断反応により切断される反応を模式的に示した図である。また、図４（Ｂ）は、ＲＮＡ切断反応前と反応後のフォトンの数（Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐｈｏｔｏｎｓ）とその確率（Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）の変化を示した図である。
【符号の説明】
【００５２】
１…ｍＲＮＡ、２…５’末端標識ＲＮＡ、３…５’末端標識済みｍＲＮＡ、４…担体、５…３’末端標識ＲＮＡ、６…両末端標識済みｍＲＮＡ、７…蛍光物質と特異的に結合するＲＮＡアプタマー、８…アプタマー付加ｍＲＮＡ、９…一本鎖ＲＮＡ、１０…配列付加ｍＲＮＡ、１１…３’末端標識ＲＮＡプローブ、１２…５’末端標識ＲＮＡプローブ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ干渉において用いられるｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応を、一分子蛍光分析法により検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉法は、線虫の体内に二本鎖ＲＮＡを導入した時に遺伝子特異的な抑制が引き起こされる現象として、１９９８年にＦｉｒｅらにより報告された（例えば、非特許文献１、特許文献１参照。）。その後、線虫のみならず、ハエ、植物、動物等といった広範囲の生物種にも存在する現象ということが明らかになった。但し、ヒト等の哺乳動物においては、３０塩基対以上の二本鎖ＲＮＡを導入することにより、インターフェロン応答が引き起こされることも知られていた（例えば、非特許文献２、３参照。）。インターフェロン応答は、免疫応答に前もって働くことが知られている生体の防御機構であり、非特異的な一本鎖ＲＮＡの分解が引き起こされることが知られている。その後、２１塩基対の二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を細胞に導入することにより、インターフェロン応答を回避し、配列特異的なＲＮＡ干渉が起こることが、Ｅｌｂａｓｈｉｒらによって示された（例えば、非特許文献４参照。）。この実験により、哺乳動物においても、ＲＮＡ干渉の技術を応用する道が開けることになった。
【０００３】
哺乳動物における成功をきっかけとして、ＲＮＡ干渉の技術が核酸医薬として応用できるのではないかという期待が膨らんだ。核酸医薬は従来の低分子化合物医薬に比べて以下のような優位点が考えられる。
【０００４】
（１）標的分子との関係が明確であるという点。ある医薬が、生体内において、標的物質以外の生体物質に対してどの程度作用するのかは、副作用等を検討する上で非常に重要である。しかしながら、主にタンパク質に作用すると考えられる従来の低分子化合物医薬は、あるタンパク質が、ある低分子化合物医薬の標的タンパク質であるのか否かの確認や、標的タンパク質以外のタンパク質に作用する副作用の検討が、非常に困難であり、基本的には、生体に直接低分子化合物医薬を投与し、副作用等を検討する以外には、確実な方法はあまりない。これは、生体内でのタンパク質の構造等を全て検討することは困難であるためと考えられる。これに対して、主に核酸に作用すると考えられる核酸医薬は、標的核酸の同定や、標的核酸以外の核酸に対する副作用の予測等が、タンパク質に作用する低分子化合物医薬に比べてはるかに簡便に精度よく行うことができる。核酸医薬においても、副作用として、遺伝子配列上の相同性等から、標的遺伝子以外の遺伝子に対する機能阻害等を引き起こすことが考えられるが、ヒトゲノムの遺伝子配列がほぼ完全に解読されているため、副作用の予見が高い精度で可能である。実際に、ＲＮＡ干渉を利用した創薬では、標的ではない遺伝子に対する副作用を回避するための予測プログラム（ＲＮＡｉ社、ｓｉＤｉｒｅｃｔ（登録商標）等）が販売されている。
【０００５】
（２）創薬プロセスの標的同定からヒット・リード分子の取得へのプロセスが早いという点。低分子化合物医薬の製造においては、一般的に、標的タンパク質を決定した後、該標的タンパク質の発現系の構築、最適なアッセイ系の構築、数万以上の化合物ライブラリからのスクリーニング、というステップを踏む必要がある。タンパク質の発現系の構築工程や、最適なアッセイ系の構築工程は、タンパク質の種類ごとにその機能に沿った至適な条件を見つけ出す必要がある。このため、これらの工程は、熟練した技術者でも、数ヶ月から1年程度はかかる作業であり、非常に労力を要する。さらにその後、最低でも数万個の低分子化合物を有する化合物ライブラリから、標的タンパク質と結合し得るヒット・リード化合物をスクリーニングする必要がある。これに対して、核酸医薬では、標的遺伝子を決定した後、該遺伝子が有する塩基配列と相補的な塩基配列を元に、直接的に核酸医薬のヒット・リード分子を設計することができる。さらに、せいぜい数千種類の候補核酸医薬からスクリーニングを行うことによって、核酸医薬として十分な効果を有する分子を取得し得る。
【０００６】
このような利点を有するため、現在、核酸医薬の開発が加速しつつある。一例を挙げると、２００５年２月には、Ａｃｕｔｉｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社の加齢性黄斑変性症を標的とした修飾ｓｉＲＮＡが、臨床試験第一相に入ったという報告がある。この核酸医薬は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ)を標的として、疾患を引き起こす血管新生を阻害することが、ラットをモデルにした実験系で実証されている。
【０００７】
このように、ＲＮＡ干渉技術を応用した核酸医薬を開発しようとする取組みが、世界中で活発に行われているが、この開発工程において、現時点ではいくつか問題点がある。
その１つは、ＲＮＡ干渉技術の評価方法にある。従来の方法では、ＲＮＡ干渉が起こっているかどうかの判断は、標的遺伝子の産物であるタンパク質の発現の有無を調べることにより間接的に検出されていた。この際の、タンパク質の発現の有無の判断においては、特に、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質や、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）等の発光反応を触媒するタンパク質が、多く利用されている（例えば、非特許文献４参照。）。しかしながら、この方法では、ＲＮＡ干渉により標的遺伝子の転写産物たるｍＲＮＡが分解されたためにタンパク質の発現が抑制された場合と、ＲＮＡ干渉における分解反応以外の原因によってタンパク質の合成が阻害されている場合とを、区別することができない。
【０００８】
その他にも、試験管内で、数千もの候補核酸医薬のスクリーニングする方法の効率が不十分であるという問題もある。従来のスクリーニング方法では、細胞アッセイや、計算機による予測等の方法が使われている。しかしながら、細胞アッセイでは、スクリーニングするためには細胞培養をしなければならず、労力と費用がかかってしまう。一方、計算機による予測では、確実に活性のあるものが選択できるという予測確度は未だ低い。その他、試験管内での検出方法は、一般的に、予め放射性同位体で標識した核酸を電気泳動することにより、ＲＮＡ干渉による核酸分解が生じているか否かを調べるため、大量の候補核酸医薬に対して行われるスクリーニングには向いていない。
【０００９】
上記の２つの問題点から、ＲＮＡ干渉技術を応用した核酸医薬の開発促進のためには、ＲＮＡ干渉における分解反応を、生体内もしくは生体外の溶液中において、直接検出することができる、効率的かつ簡便な方法の開発が重要であることが示唆される。
【００１０】
一方、近年の光計測技術の発展は目覚ましく、蛍光一分子からの蛍光を測定・解析することができる一分子蛍光分析技術が多くの分野で応用されつつある。一分子蛍光分析技術を応用することにより、例えば、分解反応において基質となる分子を蛍光標識し、この蛍光標識分子から検出される蛍光シグナルを解析することによって、分解反応やそれに伴う分子量変化を検出することができる。分解反応の検出に用いられる方法として、現在までに、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、蛍光偏光（ＦＰ）、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ）、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）等が知られている。
【００１１】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、分子をそれぞれ分光特性の異なる複数の蛍光物質で標識し、蛍光分子同士の距離が非常に近づいたとき生じる蛍光分子間の蛍光エネルギーの移動を観測する手法である（例えば、非特許文献５参照。）。一般的には、ＦＲＥＴでは、蛍光エネルギーを与える蛍光物質（ドナー）とそのエネルギーを励起エネルギーとして受け取る蛍光物質（アクセプター）の、２種類の分光特性の異なる蛍光物質を用いる。蛍光共鳴エネルギー遷移は、２つの蛍光分子が互いに混合して相互作用し、１つの吸収波長が他方の放射波長と重複する場合に観測される。ここで、２つの蛍光分子間の平均間隔をｒとした場合に、エネルギー遷移の効率は、ｒ−６に比例する。このため、２つの分子間の相互作用や相互の親和性が増大すると、エネルギー遷移現象が増強され、その結果、アクセプターからの蛍光発光が増大することとなる。そこで、従来から、分解反応の基質となる分子をドナーとアクセプターで標識し、分解反応に伴うＦＲＥＴを検出することにより、核酸やペプチドの分解を検出する方法は知られている。
【００１２】
蛍光偏光法（ＦＰ）は、分子の体積及びミクロ粘度の高感度測定のために、研究及び臨床の両方の用途に用いられている。溶液中の分子はそれらの種々の軸の周りに“混転する（ｔｕｍｂｌｅ）”傾向があり、ＦＰは溶液中の分子の回転特性の変化に依存する。具体的には、大型分子ほど、例えば体積又は分子量がより大きいものほど、小型分子よりも緩慢に、より少ない軸に沿って混転する。したがって、励起と発光の間の運動がより少なく、このため発光光線は比較的高度の偏光を示す。逆に、励起と発光の間でより大きな混転を示す小型の蛍光性分子からの蛍光発光ほど、より多面性（ｍｕｌｔｉｐｌａｎａｒ）であり、偏光度が低い。小型分子が、より大きい、又はより堅牢なコンホメーションをとると、その混転は低下し、発光蛍光は相対的により大きく偏光するようになる。この発光蛍光の偏光度の変化を測定して、蛍光分子の大きさや堅牢度の増大の指標として利用することができる。
【００１３】
蛍光相関分光法（ＦＣＳ）は、蛍光ラベルした反応体と相互作用活性を持つ物質とを、透明な媒体中で自由に拡散させることにより、相互作用による分子量変化を検出する方法の１つである（例えば、特許文献３参照。）。媒体中を拡散している分子は、焦点（極微小空間）を通過する際に、共焦点光学系で検出可能な蛍光強度の変動を発生させる。そこで、この蛍光シグナルに対して自己相関解析を行うことにより、該相互作用により得られる反応体の分子量変化を解析又は定量することができる。なお、特許文献３は、ＲＮＡ干渉反応におけるＲＮＡの分解反応検出については開示していない。
【００１４】
蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ）は、それぞれ分光特性の異なる蛍光物質を用いて標識した分子同士の相互作用を解析する方法である。つまり、試料に対し、各蛍光物質に対応した励起光を同時に照射し、それぞれの分子から検出された蛍光シグナルの相互相関を解析することにより、異なる分子の動きに同時性があるかどうかを確認することができる。このように、ＦＣＣＳは、ＦＣＳとは異なり、相互作用前後での分子サイズの変化に全く依存せずに分子間の相互作用を解析することが可能である。このため、相互作用前後での分子サイズの変化が小さい場合であっても好適に分子間相互作用を解析することができる。
【００１５】
また、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）は、溶液中の粒子の混合物の蛍光明度の分析のための方法である（例えば、特許文４参照。）。すなわち、ＦＩＤＡは、ＦＣＳ分析に用いられるものと同様の光学的かつ電子的構成に基づいているが、焦点から検出された蛍光シグナルの分析のために、ＦＣＳとは異なるアルゴリズムを利用するものである。具体的には、この方法は、光子カウント数のヒストグラムを測定し、かつ所定の粒子当たりの平均カウント率として表される比明度の関数として蛍光粒子の濃度を決定する。異種の試料における様々な蛍光種の濃度の測定に適用可能であり、様々な分野において有益なツールである。例えば、薬剤開発及び診断に対する基本的な研究等においても適用可能である。一例として、ＦＩＤＡにより、フリーの蛍光ラベルされた抗原と、二価抗体分子等の多価レセプターに結合した蛍光ラベルされた抗原とを、区別することができる。なお、特許文献４は、ＲＮＡ干渉反応におけるＲＮＡの分解反応検出については開示していない。
【特許文献１】特表２００２−５１６０６２号公報
【特許文献２】特開２００５−３３７８０５号公報
【特許文献３】特表平１１−５０２６０８号公報
【特許文献４】特表２００２−５４３４１４号公報
【非特許文献１】ファイヤ（Fire）、外５名、ネイチャー（Nature）、１９９８年、第３９１巻、８０６〜８１１ページ。
【非特許文献２】ギル（Gil）、外１名、アポトーシス（Apoptsis）、２０００年、第５巻、１０７〜１１４ページ。
【非特許文献３】ウイテイ（Ui-Tei）、外３名、フェブス・レター（FEBS letters）、２０００年、第４７９巻、７９〜８２ページ。
【非特許文献４】エルバシール（Elbashir）、外５名、ネイチャー（Nature）、２００１年、第４１１巻、４９４〜４９８ページ。
【非特許文献５】テオドラス（Theodorus）、外２名、ジャーナル・オブ・ザ・セル・バイオロジー（The Journal of Cell Biology）、１９９５年、第１２９巻、１５４３〜１５５８ページ。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明者は、従来、核酸やタンパク質等の分解反応や相互作用反応の解析に供されてきた上記のような一分子蛍光分析技術を応用することにより、ＲＮＡ干渉におけるＲＮＡ分解反応を、直接的に効率よく検出することができるのではないか、と考えた。
【００１７】
しかしながら、例えば、ＦＲＥＴを用いてＲＮＡ分解反応を検出しようとした場合には、ＦＲＥＴ効率は分子距離に大きく依存するため、基質となるＲＮＡの核酸長が長い場合には、ＦＲＥＴ効率が悪く、切断反応の検出に用いることが困難な場合がある。また、ＦＲＥＴを測定するための装置が複雑である、という問題もある。
【００１８】
また、ＦＰは、基準となる偏光度の上昇が分子量３０ｋＤａ程度で飽和してしまうことが知られている。このため、ＲＮＡの分子サイズを考慮した場合、分解前のＲＮＡと分解後のＲＮＡでは区別できない場合が多い、という問題がある。
一方、ＦＣＳでは、分子量に４倍程度の差がないと分子量変化を検出することができない。このため、ＲＮＡ干渉によるＲＮＡの切断部位によっては、分解前のＲＮＡと分解後のＲＮＡとを、区別できない可能性がある。このように、ＦＣＳにおいては、切断部位の違いは検出能に大きな影響を与えるため、特にスクリーニング等の、多種多様な候補ｓｉＲＮＡを並列に比較する用途には、ＦＣＳは適当ではない。
【００１９】
その他、ＦＣＣＳでは、相互作用前後での分子サイズの変化が２倍程度しかないような場合にも解析は可能であるという利点がある。しかしながら、微小空間である一の観測領域に、波長の異なる励起光を照射して蛍光シグナルを検出するため、使用する対物レンズ等の軸上色収差により、それぞれの波長の励起光の共焦点領域は完全には一致せず、目的の分子間相互作用の検出感度や精度が低下してしまうという重大な課題がある。
【００２０】
本発明は、一分子蛍光分析技術を応用することにより、ＲＮＡ干渉において用いられるｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応を、簡便かつ迅速に検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ＲＮＡ切断反応の基質となるＲＮＡとして、蛍光標識された一本鎖ＲＮＡを用いることにより、ｓｉＲＮＡによって前記一本鎖ＲＮＡが切断されたか否かを、一分子蛍光分析法、特にＦＩＤＡを用いて検出することによって、直接的に効率よく検出することができることを見出し、本発明を完成させた。
【００２２】
すなわち、本発明は、
（１） ＲＮＡ干渉において用いられるｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応を検出する方法であって、ＲＮＡ切断反応の基質ＲＮＡとして蛍光標識された一本鎖ＲＮＡを用いて、ｓｉＲＮＡによって前記基質ＲＮＡが切断されたか否かを、一分子蛍光分析法により検出することを特徴とする、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法、
（２） 前記基質ＲＮＡが、３’末端及び５’末端が蛍光物質により標識された一本鎖ＲＮＡであることを特徴とする前記（１）記載のｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法、
（３） 前記一分子蛍光分析法が、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載のｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法、
（４） ＲＮＡ干渉において用いられるｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応を検出する方法であって、ＲＮＡ切断反応の基質ＲＮＡとして、３’末端及び５’末端が蛍光物質により標識された一本鎖ＲＮＡを用いるものであり、ＲＮＡヘリカーゼ、及びＲＩＳＣ複合体を含む反応溶液に、ｓｉＲＮＡ及び前記基質ＲＮＡを添加し、反応させる反応工程と、前記反応工程後、前記反応溶液に、前記蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該蛍光物質から発生する蛍光を、蛍光シグナルとして検出する検出工程と、前記検出工程において検出された蛍光シグナルに基づいて蛍光強度分布解析を行い、ＲＮＡ切断反応効率を測定する測定工程と、を有することを特徴とする、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法、
（５） ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応が、細胞内又は反応溶液内において行われることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか記載のｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法を用いることにより、基質となるＲＮＡの長さや分子の大きさ、ｓｉＲＮＡによる切断部位等の条件を、個々のＲＮＡに対して別個に検討することを要することなく、簡便かつ迅速にＲＮＡ切断反応を検出することができる。
特に、ＲＮＡ干渉においては、標的遺伝子の機能を抑制・阻害する上で、２０塩基対程度の短い二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の選択は非常に重要であるが、本発明のｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法を用いることにより、多数のｓｉＲＮＡ候補分子の中から、実際に抑制効率の高いｓｉＲＮＡを選択する上で、手間や時間の節約に資することが期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明のｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法（以下、本発明の検出方法、ということがある。）は、ＲＮＡ干渉において用いられるｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応を検出する方法であって、ＲＮＡ切断反応の基質ＲＮＡとして、蛍光標識された一本鎖ＲＮＡを用いて、ｓｉＲＮＡによって前記基質ＲＮＡが切断されたか否かを、一分子蛍光分析法により検出することを特徴とする。標的遺伝子の発現産物であるタンパク質の発現効率や機能効率を指標としてｓｉＲＮＡの抑制効率を測定する従来法（例えば、非特許文献４等参照。）と比較して、本発明の検出方法は、ｓｉＲＮＡによる基質ＲＮＡの切断効率を直接測定しているため、より信頼性の高いデータを得ることができる。
【００２５】
本発明における基質ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子（ＲＮＡ干渉により、当該遺伝子又は当該遺伝子の発現産物の機能を抑制・阻害する対象である遺伝子）由来の一本鎖ＲＮＡであって、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応における基質として機能するＲＮＡである。標的遺伝子由来の一本鎖ＲＮＡは、標的遺伝子から転写された一本鎖ＲＮＡであれば特に限定されるものではなく、ｍＲＮＡ等が挙げられる。
【００２６】
標的遺伝子は、構造遺伝子であってもよく、非構造遺伝子であってもよい。また、標的遺伝子の由来する生物種は特に限定されるものではなく、線虫、ハエ等の昆虫、植物、動物のいずれであってもよい。本発明においては、ヒトをはじめとする哺乳動物由来の遺伝子であることが好ましい。
【００２７】
本発明の検出方法において用いられる基質ＲＮＡは、蛍光標識された一本鎖ＲＮＡである。蛍光標識は、基質ＲＮＡが切断されたか否かを判別し得る部分、すなわち、蛍光標識から検出される蛍光シグナルを解析することにより、切断前の基質ＲＮＡと切断後の基質ＲＮＡとの識別が可能である位置であれば、特に限定されるものではなく、検出に用いられる一分子蛍光分析法の種類、基質ＲＮＡの種類、ｓｉＲＮＡの種類等を考慮して、適宜決定することができる。
【００２８】
本発明の検出方法においては、基質ＲＮＡの３’末端及び５’末端が蛍光物質により標識されていることが好ましい。基質ＲＮＡの両末端が蛍光標識されていることにより、ｓｉＲＮＡによる基質ＲＮＡの切断部位を考慮することなく、基質ＲＮＡの切断の有無をＦＩＤＡにより簡便に検出することができるためである。例えば、基質ＲＮＡの３’末端と５’末端とに、同種の蛍光物質を結合させた場合には、理論的には、切断後の基質ＲＮＡの一分子当たりの蛍光強度は、切断前の基質ＲＮＡの一分子当たりの蛍光強度の半分になる。このため、一分子当たりの蛍光強度が異なる分子を区別して検出することが可能なＦＩＤＡにより、切断後の基質ＲＮＡと切断前の基質ＲＮＡとを識別して、切断反応効率を算出することができる。
【００２９】
基質ＲＮＡの蛍光標識に用いられる蛍光物質としては、特に限定されるものではなく、一般的に核酸の蛍光標識に用いられる蛍光物質の中から適宜決定することができる。このような蛍光物質としては、例えば、ＴＡＭＲＡ、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアナート）、フルオレセイン、ローダミン、ＮＢＤ、ＴＭＲ（テトラメチルローダミン）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（インビトロジェン社製）、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ)、ＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ)等がある。ＲＮＡ切断反応に対する影響を抑えることができるため、ＴＡＭＲＡ、ＦＩＴＣ、フルオレセイン、ローダミン、ＮＢＤ、ＴＭＲ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ等の比較的分子量の小さい蛍光物質であることが好ましい。特に、ＴＭＲ等のように、連続して光照射を行った場合でも比較的安定して蛍光を発する色素であることが好ましい。このように退色し難い蛍光物質を標識として用いることにより、光照射の時間や回数の影響を抑えて、計測値ごとのばらつきを防止し、より安定した解析結果を得ることができる。
【００３０】
基質ＲＮＡを蛍光標識する方法は、特に限定されるものではなく、核酸を蛍光標識する場合に通常行われている手法を使用して行うことができる。例えば、基質ＲＮＡに直接蛍光物質を結合させてもよく、蛍光物質と基質ＲＮＡとの相互作用を利用して間接的に結合させたものであってもよい。本発明の検出方法において基質ＲＮＡとして好適な３’末端及び５’末端が蛍光物質により標識されている一本鎖ＲＮＡは、例えば、以下の手法（Ａ）〜（Ｃ）により得ることができる。なお、本発明において用いられる基質ＲＮＡは、下記（Ａ）〜（Ｃ）により合成されたものに限定されるものではない。
【００３１】
・手法（Ａ）
まず、標的遺伝子（ＤＮＡ）から、ｍＲＮＡを調製する。例えば、ＲｉｂｏＭＡＸ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等の市販のｍＲＮＡ合成キットを用いることにより、試験管内等のｉｎ ｖｉｔｒｏにおいても、簡便にｍＲＮＡを調製することができる。
次に、５’末端が蛍光物質により標識されている１０〜２０塩基長程度の任意の塩基配列を持つ一本鎖ＲＮＡ（５’末端標識ＲＮＡ）、及び、３’末端が蛍光物質により標識されている１０〜２０塩基長程度の任意の塩基配列を持つ一本鎖ＲＮＡ（３’末端標識ＲＮＡ）を、それぞれ化学合成する。５’末端標識ＲＮＡと３’末端標識ＲＮＡの塩基配列は同一であってもよく、異なっていてもよい。また、化学合成は、当該技術分野において公知のいずれの手法により行ってもよく、シグマジェノシス社等の受託サービスを利用してもよい。
【００３２】
さらに、標的遺伝子から調製したｍＲＮＡと５’末端標識ＲＮＡと３’末端標識ＲＮＡとを連結させて、３’末端及び５’末端が蛍光物質により標識されている基質ＲＮＡを得た後、分子量の差や親和性の差を利用して公知の手法により精製することができる。一例としては、図１に模式的に示すように、まず、ｍＲＮＡ（１）と５’末端標識ＲＮＡ（２）とを、Ｔ４ ＲＮＡ ｌｉｇａｓｅ等の酵素を用いて結合させて、５’末端標識済みｍＲＮＡ（３）を得る。その後、ゲル濾過クロマトグラフィー法等により、分子サイズによる分画を行い、分子量が顕著に小さい５’末端標識ＲＮＡ（２）を除去する。さらに、残ったｍＲＮＡ（１）及び５’末端標識済みｍＲＮＡ（３）の混合物を、５’末端標識ＲＮＡ（２）と相補的な塩基配列を有する一本鎖ＲＮＡが固定された担体（４）を用いたアフィニティークロマトグラフィー法等により、親和性（アフィニティー）による分画を行い、ｍＲＮＡ（１）を除去して５’末端標識済みｍＲＮＡ（３）を精製する。次に、この精製された５’末端標識済みｍＲＮＡ（３）と３’末端標識ＲＮＡ（５）とを、Ｔ４ ＲＮＡ ｌｉｇａｓｅ等の酵素を用いて結合させて、両末端標識済みｍＲＮＡ（６）を得る。その後、同様にして、分子サイズによる分画を行い、３’末端標識ＲＮＡ（５）を除去した後、親和性（アフィニティー）による分画を行うことにより、精製された両末端標識済みｍＲＮＡ（６）が得られる。
【００３３】
・手法（Ｂ）
まず、標的遺伝子の５’側領域及び３’側領域の両方に、蛍光物質と特異的に結合するＲＮＡアプタマーを有するｍＲＮＡを合成するために、標的遺伝子（ＤＮＡ）を組み換えた組み換え遺伝子を得る。この組み換え遺伝子（ＤＮＡ）から、手法（Ａ）と同様にしてｍＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ（１）の３’末端及び５’末端に、蛍光物質と特異的に結合するＲＮＡアプタマー（７）を有するアプタマー付加ｍＲＮＡ（８）を得る。その後、図２に模式的に示すように、反応液に蛍光物質（Ｆ）を添加し、アプタマー（７）と蛍光物質（Ｆ）と結合させた後、分子サイズによる分画を行い、蛍光物質（Ｆ）と結合したアプタマー付加ｍＲＮＡ（８）を精製する。
【００３４】
・手法（Ｃ）
まず、標的遺伝子の５’側領域及び３’側領域の両方に、１０〜２０塩基長程度の任意の塩基配列を有するｍＲＮＡを合成するために、標的遺伝子（ＤＮＡ）を組み換えた組み換え遺伝子を得る。この組み換え遺伝子（ＤＮＡ）から、手法（Ａ）と同様にしてｍＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ（１）の３’末端及び５’末端に、１０〜２０塩基長程度の任意の塩基配列を有する一本鎖ＲＮＡ（９）を有する配列付加ｍＲＮＡ（１０）を得る。その後、図３に模式的に示すように、反応液に、塩基配列（９）と相補的な配列を有し、３’末端が蛍光物質（Ｆ）により標識されている一本鎖ＲＮＡである３’末端標識ＲＮＡプローブ（１１）と、一本鎖ＲＮＡ（９）と相補的な配列を有し、５’末端が蛍光物質により標識されている一本鎖ＲＮＡである５’末端標識ＲＮＡプローブ（１２）とを添加し、配列付加ｍＲＮＡ（１０）及び３’末端標識ＲＮＡプローブ（１１）、並びに、配列付加ｍＲＮＡ（１０）及び５’末端標識ＲＮＡプローブ（１２）を、ハイブリダイズさせる。これにより形成された３者からなる複合体は、分子サイズによる分画を行い、精製することができる。
【００３５】
本発明において、ｓｉＲＮＡとは、基質ＲＮＡの一部又は全部と相補的な配列を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）と、それに相補的な配列を有するＲＮＡ鎖（センス鎖）とからなる二本鎖ＲＮＡである。該ｓｉＲＮＡの塩基対長は、ＲＮＡ干渉において有効な長さであれば特に限定されるものではなく、標的遺伝子の種類や塩基配列、標的遺伝子が由来する生物種、細胞等への導入方法等を考慮して、適宜決定することができる。ヒト等の哺乳動物に対するＲＮＡ干渉において用いられるｓｉＲＮＡとしては、基質ＲＮＡと相補的な配列部分が１５〜２５塩基対長であることが好ましい。
【００３６】
本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、当該技術分野において公知のいずれの手法により設計し、合成してもよい。例えば、標的遺伝子由来のｍＲＮＡの塩基配列情報に基づき、ｓｉＲＮＡの塩基配列を常法により設計した後、該設計に基づき、公知の核酸合成反応により合成することができる。ｓｉＲＮＡの合成は、例えば、市販の合成機を用いて独自に合成してもよく、受託サービスを利用して合成することもできる。
【００３７】
なお、本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、基質ＲＮＡに対するＲＮＡ切断反応を阻害しない限り、基質ＲＮＡの一部又は全部と相補的な配列以外の付加的な塩基配列を有していてもよい。また、２’−Ｏ−メチル化等の修飾がなされた二本鎖ＲＮＡであってもよい。
【００３８】
本発明の検出方法は、例えば、ＲＮＡ切断反応の基質ＲＮＡとして、３’末端及び５’末端が蛍光物質により標識された一本鎖ＲＮＡを用いて、ＲＮＡヘリカーゼ、及びＲＩＳＣ複合体を含む反応溶液に、ｓｉＲＮＡ及び前記基質ＲＮＡを添加し、反応させる反応工程と、前記反応工程後、前記反応溶液に、前記蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該蛍光物質から発生する蛍光を、蛍光シグナルとして検出する検出工程と、前記検出工程において検出された蛍光シグナルに基づいて蛍光強度分布解析を行い、ＲＮＡ切断反応効率を測定する測定工程と、を有していてもよい。
【００３９】
まず、反応工程として、ＲＮＡヘリカーゼ及びＲＩＳＣ複合体を含む反応溶液に、ｓｉＲＮＡと３’末端及び５’末端が蛍光物質により標識されている基質ＲＮＡとを添加して反応させる。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡヘリカーゼによる巻き戻しを受けて１本鎖ＲＮＡとなり、主にアンチセンス鎖と複数のタンパク質がＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）複合体を形成する。このｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、基質ＲＮＡ中の相補的な部位と結合することにより、ＲＩＳＣのリボヌクレアーゼ活性によって基質ＲＮＡが分解される。
【００４０】
この反応工程において用いられる反応溶液は、ヘリカーゼやＲＩＳＣ等のＲＮＡ切断反応に必要な分子を含有する溶液であれば、特に限定されるものではなく、ＲＮＡ干渉を行う場合に一般的に用いられている試薬等を適宜用いて調製することができる。好ましくは、培養細胞等から調製した細胞抽出液である。元々ＲＮＡ干渉は細胞内において生じる現象であり、よって、細胞抽出液には、ＲＮＡ干渉に必要な分子が含有されているためである。なお、細胞抽出液は、Ｄｉｇｎａｍらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８３年、第１１巻、第１４７５〜１４８９ページ参照。）等の常法により調製することができる。
【００４１】
また、該反応工程は、試験管内等のｉｎ ｖｉｔｒｏで行ってもよく、細胞内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で行ってもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏで行う場合には、例えば、反応溶液に、ｓｉＲＮＡを添加して反応させた後、さらに基質ＲＮＡを添加して反応させることにより、ｓｉＲＮＡにより基質ＲＮＡを切断することができる。一方、ｉｎ ｖｉｖｏで行う場合には、例えば、細胞にｓｉＲＮＡを導入して反応させた後、さらに基質ＲＮＡを導入して反応させることにより、ｓｉＲＮＡにより基質ＲＮＡを切断することができる。なお、ｓｉＲＮＡや基質ＲＮＡの細胞への導入は、当該技術分野において公知のいずれの手法により行ってもよい。例えば、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社製）等の市販の核酸導入試薬を用いることにより、細胞内へのｓｉＲＮＡや基質ＲＮＡの導入を簡便に行うことができる。
【００４２】
反応させる時間は、反応溶液の種類、反応溶液中のヘリカーゼやＲＩＳＣ等の活性、基質ＲＮＡやｓｉＲＮＡの濃度等を考慮して適宜決定することができる。また、反応温度は、反応溶液中のヘリカーゼやＲＩＳＣ等の活性において好適な温度範囲で適宜設定することができる。例えば、反応溶液が、ヒト由来培養細胞から調製された細胞培養液に、基質ＲＮＡを添加した溶液である場合には、当該反応溶液にｓｉＲＮＡを添加し、３７℃で１５分間以上反応させた後、さらに基質ＲＮＡを添加し、３７℃で２〜６時間程度反応させることができる。一方、反応工程をヒト由来培養細胞内で行う場合には、例えば、３７℃で培養している細胞培養に、核酸導入試薬を用いてｓｉＲＮＡを導入し、導入後４８〜９６時間経過後に、核酸導入試薬を用いて基質ＲＮＡを導入し、さらに４８〜９６時間培養することができる。
【００４３】
次に、反応工程後、検出工程として、反応溶液に、基質ＲＮＡの標識に用いた蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該蛍光物質から発生する蛍光を、蛍光シグナルとして検出する。具体的には、共焦点（コンフォーカル）光学系を有する蛍光光度計に、該反応溶液を設置し、常法により蛍光シグナルを検出することができる。また、反応工程を細胞内で行った場合には、該細胞を、共焦点光学系を有する蛍光顕微鏡に設置し、常法により蛍光シグナルを検出することができる。なお、ＦＩＤＡをはじめとする一分子蛍光分析法は、一般的には、共焦点光学系を利用するものであるが、一分子由来の蛍光シグナルを取得して蛍光強度分布解析を行うことができる光学系であれば、特に限定されるものではなく、共焦点光学系以外の他の光学系を用いることも可能である。
【００４４】
蛍光シグナルの計測条件は、使用する蛍光光度計や蛍光顕微鏡の仕様により、適宜決定することができるが、例えば、１サンプル当たり、１５秒間で５回程度行う。計測時間はこれ以上長くても良く、回数もこれ以上多くても良い。但し、検出に用いる装置の種類によっては、計測時間が１０秒間以下等の短時間である場合や、測定回数が１回程度のみである場合には、データの再現性、信頼性が低下するおそれがある。また、蛍光シグナルを計測するサンプルに対して焦点位置を走査させることにより、より多数の分子から情報（蛍光シグナル）を取得することができ、統計的な精度を高めることも可能である。
【００４５】
その後、測定工程として、検出された蛍光シグナルに基づいて蛍光強度分布解析を行い、ＲＮＡ切断反応効率を測定する。すなわち、検出された蛍光シグナルのデータに対して蛍光強度分布解析を行うことにより、蛍光分子の蛍光強度や、検出領域中の濃度を算出することができる。具体的には、一分子当たりの蛍光強度から、該蛍光分子が切断された基質ＲＮＡか、未切断の基質ＲＮＡかを判別し、これらの分子数の割合を算出する。
【００４６】
ＲＮＡ切断反応の効率は、蛍光強度の減少や、蛍光強度の小さい分子の濃度の増加から判断することが可能である。図４（Ｂ）は、ＲＮＡ切断反応前と反応後のフォトンの数（Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐｈｏｔｏｎｓ）とその確率（Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）の変化を示した図である。図４（Ａ）に示すように、理論的には、切断された基質ＲＮＡの蛍光強度は、未切断の基質ＲＮＡの蛍光強度のおよそ半分となる。さらに、ＲＮＡ切断により、蛍光分子数は２倍となる。つまり、切断反応により、蛍光強度の小さい分子数の割合が多いほど、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の反応効率が高いことを示す。
【００４７】
以下、反応工程を細胞内において行う場合と、細胞外において行う場合の、それぞれにおける本発明の一実施態様を示す。なお、本発明は以下の実施態様に限定されるものではない。
【００４８】
[細胞内において反応工程を行う場合]
１．ＲＮＡ干渉の効率を検出したい標的遺伝子（ＤＮＡ）を用意する。ＲｉｂｏＭＡＸ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等を用いることにより、試験管内で標的遺伝子（ＤＮＡ）からｍＲＮＡを発現させる。
２．上記の手法（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）のいずれかの手法により、ｍＲＮＡの両末端を蛍光標識する。
３．培養細胞に、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社製）等の核酸導入試薬を用いて、当該標的遺伝子を標的とする２０塩基対前後の長さのｓｉＲＮＡを導入し、ＲＮＡ干渉を引き起こす。ｓｉＲＮＡ導入後、４８〜９６時間培養した後の培養細胞に対して、核酸導入試薬を用いて、上記２で合成した蛍光標識ｍＲＮＡを導入し、さらに４８〜９６時間培養する。
４．導入後４８〜９６時間培養した培養細胞から、直接、コンフォーカル（共焦点）光学系を用いた蛍光光度計を用いて、蛍光パターンを検出し、記録部等に記録する。蛍光パターンの検出に際し、培養細胞（サンプル）に対して焦点位置を走査させることにより、より多数の分子から情報（蛍光シグナル）を取得して統計的な精度を高めると同時に、空間的な分解効率の情報を取得することも可能である。
５．記録された蛍光パターンのデータに対してＦＩＤＡを行い、蛍光分子の並進時間を求め、測定された各蛍光分子の蛍光強度及び濃度を算出する。ＲＮＡ切断反応の効率は、蛍光強度の減少や、蛍光分子の濃度の増加から判断することが可能である。
【００４９】
[細胞外において反応工程を行う場合]
直接核酸医薬候補となる配列を有するｓｉＲＮＡを用いることにより、候補核酸医薬のスクリーニング等に好適な方法である。
１．ＲＮＡ干渉の効率を検出したい標的遺伝子（ＤＮＡ）を用意する。ＲｉｂｏＭＡＸ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等を用いることにより、試験管内で標的遺伝子（ＤＮＡ）からｍＲＮＡを発現させる。
２．上記の手法（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）のいずれかの手法により、ｍＲＮＡの両末端を蛍光標識する。
３．培養細胞から常法により細胞抽出液を調製する。
４．上記３で調製した細胞抽出液に、当該標的遺伝子を標的とする２０塩基対前後の長さのｓｉＲＮＡを添加して混合し、３７℃で約１５分間以上インキュベーションする。
５．下記の試薬を所定の濃度になるように添加して混合する；１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９)、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＡＴＰ、０．２ｍＭ ＧＴＰ、１０Ｕ／ｍｌ Ｒｎａｓｉｎ(Ｐｒｏｍｅｇａ社製)、１ｎＭ〜１０ｎＭの濃度に調製した上記２で合成した蛍光標識ｍＲＮＡ、全体の５０％の容量になるように調製した上記４の細胞抽出液。
６．上記５で調製した反応溶液を、３７℃で２〜６時間程度インキュベーションする。
７．反応後、該反応溶液を、コンフォーカル（共焦点）光学系を用いた蛍光光度計に設置し、蛍光パターンを検出し、記録部等に記録する。蛍光パターンの検出に際し、サンプル（反応溶液）に対して焦点位置を走査させることにより、より多数の分子から情報（蛍光シグナル）を取得して統計的な精度を高めると同時に、空間的な分解効率の情報を取得することも可能である。
８．記録された蛍光パターンのデータに対してＦＩＤＡを行い、蛍光分子の並進時間を求め、測定された各蛍光分子の蛍光強度及び濃度を算出する。ＲＮＡ切断反応の効率は、蛍光強度の減少や、蛍光分子の濃度の増加から判断することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明のｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法を用いることにより、簡便かつ迅速にＲＮＡ切断反応を検出することができるため、多数の候補分子の中から、ＲＮＡ干渉効果の高いｓｉＲＮＡを簡便にスクリーニングすることも可能であり、学術研究分野のみならず、ｓｉＲＮＡを応用した核酸医薬の開発の分野においても利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】蛍光標識した基質ＲＮＡを製造する手法（Ａ）を模式的に示した図である。
【図２】蛍光標識した基質ＲＮＡを製造する手法（Ｂ）を模式的に示した図である。
【図３】蛍光標識した基質ＲＮＡを製造する手法（Ｃ）を模式的に示した図である。
【図４】図４（Ａ）は、３’末端及び５’末端が蛍光物質により標識された基質ＲＮＡ（両末端標識済みｍＲＮＡ（６））が、ＲＮＡ切断反応により切断される反応を模式的に示した図である。また、図４（Ｂ）は、ＲＮＡ切断反応前と反応後のフォトンの数（Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐｈｏｔｏｎｓ）とその確率（Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）の変化を示した図である。
【符号の説明】
【００５２】
１…ｍＲＮＡ、２…５’末端標識ＲＮＡ、３…５’末端標識済みｍＲＮＡ、４…担体、５…３’末端標識ＲＮＡ、６…両末端標識済みｍＲＮＡ、７…蛍光物質と特異的に結合するＲＮＡアプタマー、８…アプタマー付加ｍＲＮＡ、９…一本鎖ＲＮＡ、１０…配列付加ｍＲＮＡ、１１…３’末端標識ＲＮＡプローブ、１２…５’末端標識ＲＮＡプローブ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ干渉において用いられるｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応を検出する方法であって、
ＲＮＡ切断反応の基質ＲＮＡとして蛍光標識された一本鎖ＲＮＡを用いて、ｓｉＲＮＡによって前記基質ＲＮＡが切断されたか否かを、一分子蛍光分析法により検出することを特徴とする、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法。
【請求項２】
前記基質ＲＮＡが、３’末端及び５’末端が蛍光物質により標識された一本鎖ＲＮＡであることを特徴とする請求項１記載のｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法。
【請求項３】
前記一分子蛍光分析法が、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）であることを特徴とする請求項１又は２記載のｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法。
【請求項４】
ＲＮＡ干渉において用いられるｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応を検出する方法であって、
ＲＮＡ切断反応の基質ＲＮＡとして、３’末端及び５’末端が蛍光物質により標識された一本鎖ＲＮＡを用いるものであり、
ＲＮＡヘリカーゼ、及びＲＩＳＣ複合体を含む反応溶液に、ｓｉＲＮＡ及び前記基質ＲＮＡを添加し、反応させる反応工程と、
前記反応工程後、前記反応溶液に、前記蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該蛍光物質から発生する蛍光を、蛍光シグナルとして検出する検出工程と、
前記検出工程において検出された蛍光シグナルに基づいて蛍光強度分布解析を行い、ＲＮＡ切断反応効率を測定する測定工程と、
を有することを特徴とする、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法。
【請求項５】
ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応が、細胞内又は反応溶液内において行われることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法。
【請求項１】
ＲＮＡ干渉において用いられるｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応を検出する方法であって、
ＲＮＡ切断反応の基質ＲＮＡとして蛍光標識された一本鎖ＲＮＡを用いて、ｓｉＲＮＡによって前記基質ＲＮＡが切断されたか否かを、一分子蛍光分析法により検出することを特徴とする、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法。
【請求項２】
前記基質ＲＮＡが、３’末端及び５’末端が蛍光物質により標識された一本鎖ＲＮＡであることを特徴とする請求項１記載のｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法。
【請求項３】
前記一分子蛍光分析法が、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）であることを特徴とする請求項１又は２記載のｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法。
【請求項４】
ＲＮＡ干渉において用いられるｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応を検出する方法であって、
ＲＮＡ切断反応の基質ＲＮＡとして、３’末端及び５’末端が蛍光物質により標識された一本鎖ＲＮＡを用いるものであり、
ＲＮＡヘリカーゼ、及びＲＩＳＣ複合体を含む反応溶液に、ｓｉＲＮＡ及び前記基質ＲＮＡを添加し、反応させる反応工程と、
前記反応工程後、前記反応溶液に、前記蛍光物質を励起し得る波長の光を照射し、当該蛍光物質から発生する蛍光を、蛍光シグナルとして検出する検出工程と、
前記検出工程において検出された蛍光シグナルに基づいて蛍光強度分布解析を行い、ＲＮＡ切断反応効率を測定する測定工程と、
を有することを特徴とする、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法。
【請求項５】
ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応が、細胞内又は反応溶液内において行われることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のｓｉＲＮＡによるＲＮＡ切断反応の検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−１０４２９７（Ｐ２０１０−１０４２９７Ａ）
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２８０１１８（Ｐ２００８−２８０１１８）
【出願日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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