カビおよびカビ培養抽出物
【課題】ヒトや動物に対して害を及ぼす可能性の低いカビを培養することにより、ガン細胞に対する細胞傷害性を有するカビ培養抽出物を提供する。
【解決手段】［１］ユーロチウム属のカビを培養した後、カビおよびカビの培養物を有機溶媒により抽出して得られるカビ培養抽出物。［２］前記ユーロチウム属のカビが、２６スベドベリのリボソームを有し、前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、特定な配列からなる塩基配列または当該塩基配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有する、上記［１］に記載されたカビ培養抽出物。
【解決手段】［１］ユーロチウム属のカビを培養した後、カビおよびカビの培養物を有機溶媒により抽出して得られるカビ培養抽出物。［２］前記ユーロチウム属のカビが、２６スベドベリのリボソームを有し、前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、特定な配列からなる塩基配列または当該塩基配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有する、上記［１］に記載されたカビ培養抽出物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カビおよびカビを培養して得られるカビ培養抽出物に関する。
【背景技術】
【０００２】
カビ等の微生物は人工的に合成が困難な医薬品原料を産生することがある。この様なカビの一種としてペニシリウム属のカビが知られている（特許文献１）。
このペニシリウム属のカビを培養して、得られた培養液を有機溶媒により抽出する。この抽出液から１，３−ジヒドロキシベンゼン環を有する１０員環マクロライドが得られることが知られている。
そして前記１０員環マクロライドをヒトの疾患や動物の疾患の治療のための医薬品として使用することが提案されている。
【０００３】
しかしながら、カビの中にはヒトや動物に対して害を及ぼす可能性のあるものも存在する。このためカビがヒトの疾患や動物の疾患の治療のための医薬品を産生する能力があることを発見した場合でも、カビそのものが毒性、発がん性等の性質を有する可能性のある場合、カビが毒性、発がん性等を示す化合物等を産生する可能性のある場合には、カビを培養して得られる医薬品を実用化することが困難となることがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００４−５３４７５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ヒトや動物に対して害を及ぼす可能性の低いカビを培養することにより、ガン細胞に対する細胞傷害性を有するカビ培養抽出物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するため本発明者らが鋭意検討した結果、ユーロチウム属のカビを培養し、そのカビおよびカビの培養物を抽出して得られるカビ培養抽出物が本発明の目的に適うことを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、
［１］ユーロチウム属のカビを培養した後、カビおよびカビの培養物を有機溶媒により抽出して得られるカビ培養抽出物を提供するものである。
【０００８】
また本発明の一つは、
［２］前記有機溶媒が、親水性有機溶媒である、上記［１］に記載されたカビ培養抽出物を提供するものである。
【０００９】
また本発明の一つは、
［３］前記培養が、２０〜４５℃の範囲並びに６時間〜６０日間の範囲で実施される、上記［１］または［２］に記載されたカビ培養抽出物を提供するものである。
【００１０】
また本発明の一つは、
［４］前記ユーロチウム属のカビが、２６スベドベリのリボソームを有し、
前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列または配列表の配列番号１に示される塩基配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有する、上記［１］〜［３］のいずれかに記載されたカビ培養抽出物を提供するものである。
【００１１】
また本発明の一つは、
［５］前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列を有する、上記［１］〜［４］のいずれかに記載されたカビ培養抽出物を提供するものである。
【００１２】
また本発明は、
［６］ユーロチウム属のカビを培養する培養工程と、
前記培養工程により得られたカビおよびカビの培養物を有機溶媒により抽出する抽出工程と、
前記抽出工程により得られた抽出液から有機溶媒に対する不溶分を除去する除去工程と、
を少なくとも有することを特徴とする、カビ培養抽出物の製造方法を提供するものである。
【００１３】
また本発明の一つは、
［７］前記抽出工程により得られた抽出液から有機溶媒に対する不溶分を除去する除去工程により得られた有機溶液から、有機溶媒を留去する留去工程を含む、上記［４］に記載されたカビ培養抽出物の製造方法を提供するものである。
【００１４】
また本発明の一つは、
［８］前記有機溶媒が、親水性有機溶媒である、上記［６］または［７］に記載されたカビ培養抽出物の製造方法を提供するものである。
【００１５】
また本発明の一つは、
［９］前記培養工程が、２０〜４５℃の温度範囲並びに６時間〜６０日間の時間範囲で実施される、上記［６］〜［８］のいずれかに記載されたカビ培養抽出物の製造方法を提供するものである。
【００１６】
また本発明の一つは、
［１０］前記ユーロチウム属のカビが、２６スベドベリのリボソームを有し、
前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列または配列表の配列番号１に示される塩基配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有する、上記［６］〜［９］のいずれかに記載されたカビ培養抽出物の製造方法を提供するものである。
【００１７】
また本発明の一つは、
［１１］前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列を有する、上記［６］〜［１０］のいずれかに記載されたカビ培養抽出物の製造方法を提供するものである。
【００１８】
また本発明は、
［１２］ユーロチウム属のカビを培養した後、カビおよびカビの培養物からカビ培養抽出物を有機溶媒により抽出することを特徴とする、カビ培養抽出物の抽出方法を提供するものである。
【００１９】
また本発明の一つは、
［１３］抽出に使用する有機溶媒が、親水性有機溶媒である、上記［１２］に記載されたカビ培養抽出物の抽出方法を提供するものである。
【００２０】
また本発明は、
［１４］前記ユーロチウム属のカビが、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに対し寄託された受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０８３、微生物の識別の表示Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ ＭＫ１４５である、上記［１］〜［５］のいずれかに記載のカビ培養抽出物を提供するものである。
【００２１】
また本発明の一つは、
［１５］上記［６］〜［１１］のいずれかに記載のカビ培養抽出物の製造方法に使用されるユーロチウム属のカビであって、
前記ユーロチウム属のカビが、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに対し寄託された受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０８３、微生物の識別の表示Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ ＭＫ１４５である、ユーロチウム属のカビを提供するものである。
【００２２】
また本発明の一つは、
［１６］上記［１２］または［１３］に記載のカビ培養抽出物の抽出方法に使用される、ユーロチウム属のカビであって、
前記ユーロチウム属のカビが、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに対し寄託された受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０８３、微生物の識別の表示Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ ＭＫ１４５である、ユーロチウム属のカビを提供するものである。
【００２３】
また本発明の一つは、
［１７］２６スベドベリのリボソームを有するユーロチウム属のカビであって、
前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列または配列番号１に示される塩基配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有する、上記［１５］または［１６］に記載のユーロチウム属のカビを提供するものである。
【００２４】
また本発明の一つは、
［１８］前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列を有する、請求項１７に記載されたユーロチウム属のカビを提供するものである。
【００２５】
また本発明の一つは、
［１９］ 独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに対し寄託されたカビであって、
受託番号が、ＮＩＴＥ Ｐ−１０８３であり、
微生物の識別の表示が、Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ ＭＫ１４５である、ユーロチウム属のカビを提供するものである。
【発明の効果】
【００２６】
本発明に使用するユーロチウム属のカビは、鰹節のカビ付けに使用することができるものである。食生活に長年使用されてきた実績に示される通り、本発明に使用するユーロチウム属のカビはヒトや動物に対する毒性が極めて小さい。
また前記ユーロチウム属のカビを培養することにより得られるカビ培養抽出物は、ガン細胞に対する細胞傷害性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、正常細胞であるマウス胎児由来繊維芽細胞に対するカビ培養抽出物の濃度と生細胞数との関係を示したグラフである。
【図２】図２は、ヒト子宮頸ガン細胞であるＨｅＬａに対するカビ培養抽出物の濃度と生細胞数との関係を示したグラフである。
【図３】図３は、ヒト肝臓ガンであるＨｅｐＧ２に対するカビ培養抽出物の濃度と生細胞数との関係を示したグラフである。
【図４】図４は、マウス大腸ガン細胞であるＣｏｌｏｎ２６に対するカビ培養抽出物の濃度と生細胞数との関係を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
最初に本発明に使用するカビについて説明する。
本発明に使用するカビは、ユーロチウム属に属するものである。前記カビはアムステロダミ種に属するものであれば好ましい。
前記ユーロチウム属のカビは一種もしくは二種以上を使用することができる。
【００２９】
前記ユーロチウム属のカビは、２６スベドベリ（以下、「２６Ｓ」という）のリボソームを有することが好ましい。
前記２６Ｓのリボソームとしては、例えば、前記２６Ｓのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列と一致するものを有するものが挙げられる。
【００３０】
前記２６Ｓのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列は、配列表の配列番号１に示される塩基配列に示される塩基配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有するものであってもよい。
【００３１】
前記２６Ｓのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列は、配列表の配列番号１に示される塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列を持つものが好ましい。前記相同性は、９８％以上であれば好ましく、９９％以上であればより好ましい。
【００３２】
前記ユーロチウム属のカビの培養に使用する培地に限定はなく、例えば、鰹節かび菌の培養に用いられている公知の培地用成分を使用することができる。
【００３３】
例えば、培養に使用する炭素源としては、グルコース、マンノース、フラクトース、マンノース、リボース、キシロース等のアルドース類、グルコン酸、マンノン酸等のアルドン酸類、グルカル酸、マンナル酸等のアルダル酸類、ソルビトール、マンニトール等のアルジトール類、グルクロン酸、マンヌロン酸等のウロン酸類等、
植物、動物由来のでんぷん、抽出液等、
エタノール、グリセリン等の水酸基含有化合物等を挙げることができる。
【００３４】
また培養に使用する窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を挙げることができる。
また培養に使用するリン源としては、リン酸アンモニウム、リン酸ナトリウム等を挙げることができる。
また培養に使用するカリウム源としては、塩化カリウム、硝酸カリウム等を挙げることができる。
【００３５】
前記炭素源、窒素源、リン源、カリウム源等は一種もしくは二種以上を使用することができる。
【００３６】
前記培地用成分として、必要に応じてｐＨを調整するための緩衝成分、ポリアクリル酸誘導体等のゲル化成分等を配合することができる。
【００３７】
前記ユーロチウム属のカビを培養するときの条件は以下の通りである。
【００３８】
前記ユーロチウム属のカビの培養を行うときの温度は、１５〜５５℃の範囲であることが好ましく、さらに好ましくは２０〜４５℃の範囲である。
前記ユーロチウム属のカビの培養を行うときの時間は、６時間〜６０日の範囲であることが好ましく、より好ましくは２〜３０日の範囲であり、さらに好ましくは３〜２０日の範囲である。
【００３９】
前記ユーロチウム属のカビの培養を行うときのｐＨは、２〜８の範囲の範囲が好ましく、より好ましくは３〜７の範囲であり、さらに好ましくは４〜６の範囲である。
【００４０】
前記ユーロチウム属のカビの培養の際に使用する水に特に限定はなく、イオン交換水、蒸留水、水道水、通常の水道水から塩素を除去した工業用水等が使用される。
【００４１】
前記ユーロチウム属のカビの培養後、前記ユーロチウム属のカビおよび前記ユーロチウム属のカビの培養物を有機溶媒により抽出する。
【００４２】
前記有機溶媒としては、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン等の鎖状脂肪族炭化水素類、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン等の環状脂肪族炭化水素類、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン類、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル、メチルブチルエーテル等の鎖状エーテル類、テトラヒドロフラン、ジオキサン等の環状エーテル類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、メチルピロリドン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の非プロトン性極性溶媒類、エチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、エチレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル等のグリコールモノエーテル類、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール類等が挙げられる。
【００４３】
本発明に使用する有機溶媒は親水性有機溶媒が好ましい。
この様な親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、テトラヒドロフラン、ジオキサン等の環状エーテル類、メチルピロリドン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の非プロトン性極性溶媒、エチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、エチレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル等のグリコールモノエーテル類等が挙げられる。
取り扱い性の面から本発明に使用する有機溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール類であればより好ましい。
【００４４】
本発明に使用する有機溶媒は、一種もしくは二種以上を使用することができる。
【００４５】
前記ユーロチウム属のカビの培養に使用した培地および前記ユーロチウム属のカビをフラスコ、試験管等の抽出用容器に移し、前記有機溶媒と接触させて前記ユーロチウム属のカビおよび前記ユーロチウム属のカビの培養物を含む培地を有機溶媒により抽出する。
この抽出操作により、前記ユーロチウム属のカビと、前記ユーロチウムのカビを培養することにより得られた培養物とから有機溶媒に溶解する成分が抽出される。
【００４６】
前記抽出操作の際に、前記ユーロチウム属のカビおよび前記ユーロチウム属のカビの培養物を含む培地（１）ならびに前記有機溶媒（２）を接触させる順番に限定はなく、例えば、前記ユーロチウム属のカビおよび前記ユーロチウム属のカビの培養物を含む培地（１）に対して有機溶媒（２）を加えてもよいし、有機溶媒（２）に対して前記ユーロチウム属のカビおよび前記ユーロチウム属のカビの培養物を含む培地（１）を加えてもよい。また前記ユーロチウム属のカビおよび前記ユーロチウム属のカビの培養物を含む培地（１）ならびに前記有機溶媒（２）をそれぞれ同時に抽出用容器に投入することにより同時に接触させてもよい。
【００４７】
次に前記ユーロチウム属のカビおよび前記ユーロチウム属のカビの培養物を含む培地（１）および有機溶媒（２）を含む混合物を攪拌する。
前記混合物を攪拌する操作は、例えば、前記混合物を含む抽出用容器を回転させる方法、前記混合物を含む抽出用容器に磁気式または機械式の攪拌手段を設置して混合物を混ぜる方法、前記混合物を含む抽出用容器を震盪する方法等が挙げられる。
なお、前記震盪する方法には、前記混合物に対して超音波により振動を加える方法が含まれる。
【００４８】
前記混合物を攪拌することにより、前記ユーロチウム属のカビおよび前記ユーロチウム属のカビの培養物を含む培地（１）から前記有機溶媒（２）に溶解する成分を抽出することができる。
【００４９】
前記抽出の際の温度は、１５〜１５０℃の範囲であることが好ましく、さらに好ましくは２０〜１００℃の範囲である。前記抽出は通常常圧下に実施されるが、加圧下に実施することも可能である。
【００５０】
前記抽出の際の時間は、１分〜１日間の範囲が好ましく、１０分〜１２時間の範囲が好ましい。
【００５１】
次に前記混合物から有機溶媒に溶けない成分を除去する。
前記有機溶媒に溶けない成分を除去する方法としては、例えば、遠心分離、濾過等の方法を挙げることができる。
前記混合物から有機溶媒に溶けない成分を除去することにより、カビ培養抽出物の有機溶液を得ることができる。
【００５２】
前記カビ培養抽出物の有機溶液から有機溶媒を留去することにより、カビ培養抽出物を得ることができる。
前記有機溶媒を留去する方法に限定はなく、例えば、前記カビ培養抽出物の有機溶液を常圧下または減圧下に前記有機溶媒の沸点以上の温度に加温する方法等を挙げることができる。
【００５３】
上記の操作により、本発明のカビ溶媒抽出物を得ることができる。
【００５４】
本発明のカビ溶媒抽出物はガン細胞に対して傷害活性を示す。
前記ガン細胞としては、例えば、肺癌患者由来のリンパ球細胞とリンパ腫細胞であるＮＡＴ−３０細胞とを融合して作製したハイブリドーマ、ヒト大腸癌由来細胞、マウス大腸癌由来細胞、ヒト末梢血リンパ球等の一種もしくは二種以上が挙げられる。
ここで、肺癌患者由来のリンパ球細胞とリンパ腫細胞であるＮＡＴ−３０細胞とを融合して作製したハイブリドーマとしては、ＨＢ４Ｃ５、ＨＦ１０Ｂ４等を挙げることができる。ＨＢ４Ｃ５は、培養及び細胞活性の測定が容易であるという理由から好ましい。
【００５５】
前記ヒト大腸癌由来細胞としては、Ｃｏｌｏ−２０１、ＬｏＶｏ、Ｃａｃｏ−２、ＬＳ１８０等を挙げることができる。Ｃｏｌｏ−２０１、及びＣａｃｏ−２からなる群より選ばれる少なくとも一つの株化細胞であることが、培養が容易であることから好ましく、Ｃｏｌｏ−２０１であることがさらに好ましい。
【００５６】
前記マウス大腸癌由来細胞としては、Ｃｏｌｏｎ−２６、ＲＫＯ−Ｅ６、ＣＴ２６、ＣＬ２５等を挙げることができる。Ｃｏｌｏｎ−２６であることが、ｉｎ ｖｉｖｏ（動物実験）において効果を検討することが容易であることから好ましい。
【００５７】
また前記カビ培養抽出物は、上記のような株化細胞以外に、ヒト末梢血リンパ球細胞に対して、細胞傷害活性を有するものであってもよい。
【００５８】
次に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００５９】
［カビの採取］
かつお節からユーロチウム属のカビをマルトモ社の研究所にて採取した。この採取したユーロチウム属のカビ（以下、「Ｎｏ．１４５株」という）をビーズストックにより冷凍保存した。
ビーズストックにはイワキ社製のマイクロバンクを用いた。Ｎｏ．１４５株を下記に示す方法により培養し、保存サンプルとした。なおマイクロバンクを用いたＮｏ．１４５株の保存温度はマイナス４０℃である。
【００６０】
前記Ｎｏ．１４５株の微生物学上の特徴は次の通りである。
（１）生育温度
２５〜３０℃の範囲で良好に生育する。
（２）生育ｐＨ
ｐＨ３．０〜ｐＨ８．０の範囲で生育が可能である。
（３）培地選択性
寒天培地上で、ツァペック・ドッグス培地、ＰＤＡ培地（ポテトデキストロース寒天培地）、ＭＹ２０培地（ぶどう糖２００ｇ、ペプトン５ｇ、麦芽エキス３ｇ、酵母エキス３ｇおよび蒸留水１リットルの組成）、サブロー培地で生育が可能であったが、コーンミール培地で生育させることはできなかった。
（４）顕微鏡を使用した形態観察結果
ホウキ状に配列した梗子をもち、その先端に分生子の数珠上の連鎖を生じる形態が観察された。
（５）ＭＹ２０寒天培地上でのコロニーの様子
観察開始初期には白色の毛足の長いコロニーを形成した。その後、次第に黄色の毛足の短いコロニーへと変化することが確認された。
【００６１】
［カビの培養］
前記Ｎｏ．１４５株をＭＹ２０（ぶどう糖２００ｇ、ペプトン５ｇ、麦芽エキス３ｇ、酵母エキス３ｇおよび蒸留水１リットルの組成）を使用した寒天培地の培養プレートに植菌し、３０℃で７日間培養を行った。
次に前記培養プレート内のシングルコロニーを回収し、新しいＭＹ２０を使用した寒天培地の培養プレートに移した。これを同様に３０℃で７日間（合計１４日間）培養を行った。
なお目視観察により、明らかに生育が遅いものについては、合計１４日間培養を行ったものと同様となるまで培養期間を延長した。
【００６２】
［カビの培養物の抽出］
前記Ｎｏ．１４５株の培養プレートをスパチュラで崩しながら試験管に詰めてメタノールを添加した。
次にシリコーンにより前記試験管に栓をして、室温で３０分間超音波を加えて抽出を行った。なお超音波の処理には市販の超音波洗浄機を使用した。
次にメタノールを含む混合物を濾過し、濾過液を回収した。
濾過により得られたメタノールに対する不溶物を試験管に戻し、再度新しいメタノールを添加し、数回試験管を振った。この混合液を再度濾過し、後に得られた濾過液を先に得られた濾過液と合わせた。
次にロータリーエバポレーターにて、合わされた濾過液からメタノールを留去し、カビ培養抽出物１（Ｎｏ．１４５株）を得た。
【００６３】
［ガン細胞に対する細胞傷害の検証］
試験細胞として下記の細胞を使用した。
・正常細胞：マウス胎児由来繊維芽細胞（日本ＳＬＣ社より購入したＢＡＬＢ／ｃマウスを交配し、母胎より摘出した胎児より調製した。）
・ガン細胞：ＨｅＬａ（ヒト子宮頸ガン、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｉｃａｌ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入した。）、Ｃｏｌｏｎ２６（マウス大腸ガン、東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センターより分譲されたもの。）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝臓ガン、財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 研究資源バンクより分譲されたもの。）
【００６４】
ＭＹ２０を使用した寒天培地の培養プレートに、マウス胎児由来繊維芽細胞、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２およびＣｏｌｏｎ２６を乗せた。次に先に得られたカビ培養抽出物１をメタノールにより希釈した同一濃度のメタノール溶液をそれぞれの培養プレートに添加した。
それぞれの培養プレートを３０℃で４８時間培養した。
【００６５】
次に細胞数測定用キットＷＳＴ−８（キシダ化学社製）を用いて、吸光光度計により各細胞の生存率を相対値として測定した。
生存率の測定は、測定用溶媒のみを使用した場合の吸光光度を１００％として行った。
結果を図１〜４に示す。
図１は、正常細胞であるマウス胎児由来繊維芽細胞に対するカビ培養抽出物の濃度と生細胞数との関係を示したグラフである。
図２は、ヒト子宮頸ガン細胞であるＨｅＬａに対するカビ培養抽出物の濃度と生細胞数との関係を示したグラフである。
図３は、ヒト肝臓ガンであるＨｅｐＧ２に対するカビ培養抽出物の濃度と生細胞数との関係を示したグラフである。
図４は、マウス大腸ガン細胞であるＣｏｌｏｎ２６に対するカビ培養抽出物の濃度と生細胞数との関係を示したグラフである。
なお各グラフの添加濃度（％）は、細胞培地に添加したカビ培養抽出物の終濃度を容積比として示したものである。
【００６６】
図１から、カビ培養抽出物１（Ｎｏ．１４５株を使用）は正常細胞に対してほとんど影響を及ぼさないことが分かる。
また図２〜４により、カビ培養抽出物１のみが特異的にガン細胞に対して細胞傷害を有することが分かる。
特にカビ培養抽出物１の添加濃度が０．１％以上でガン細胞は著しく減少し、０．５％でほぼ死滅することが分かる。
【００６７】
次にＮｏ．１４５株についてゲノム抽出し、シーケンス解析により株菌の同定を行った。
なおゲノム抽出は、塩化ベンジル法で実施した。またシーケンス解析はダイターミネータ法により、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の３１３０ Ｇｅｎｅｒｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒを使用して実施した。
株菌の同定はリボソマールＤＮＡ領域を対象として行った。
得られたデータをデータベース（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)と比較した。
その結果、最も近い菌株としてEurotium amstelodami strain UWFP1115（菌株情報データベース番号：GenBank Accession no. AY213699）が存在し、相同性は９９％であることが判明した。
【００６８】
前記シーケンス解析により判明したＮｏ．１４５株の２６Ｓ（スベドベリ）リボゾームＤＮＡ部分配列を配列表の配列番号１に示す。
【００６９】
本発明に係るカビは、２６スベドベリのリボソームを有するユーロチウム属のカビであって、前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列または配列番号１に示される塩基配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有する、ユーロチウム属のカビであれば好ましい。
【００７０】
また本発明に係るカビは、前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するユーロチウム属のカビであればなお好ましい。
【００７１】
前記Ｎｏ．１４５株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに対し、２０１１年４月８日に寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０８３、微生物の識別の表示Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ ＭＫ１４５として寄託されたものである。
【００７２】
［比較例１］
実施例１の場合で使用したＮｏ．１４５株に代えて、かつお節枯節に育成したカビをマルトモ社の研究所にて単離した。この単離されたカビ（以下、「ＭＫ８２株」という）を使用した他は全く同じ条件で実験を行った。
結果を図１〜４に示す。カビとしてＭＫ８２株を使用した場合、カビ培養抽出物にはガン細胞に対する濃度依存性が認められないことが判明した。
【００７３】
［比較例２］
実施例１の場合で使用したＮｏ．１４５株に代えて、かつお節枯節に育成したカビをマルトモ社の研究所にて単離した。この単離されたカビ（以下、「Ｎｏ．１１５株」という）を使用した他は全く同じ条件で実験を行った。
結果を図１〜４に示す。カビとしてＮｏ．１１５株株を使用した場合、カビ培養抽出物にはガン細胞に対する濃度依存性が認められないことが判明した。
【００７４】
［比較例３］
実施例１の場合で使用したＮｏ．１４５株に代えて、かつお節枯節に育成したカビをマルトモ社の研究所にて単離した。この単離されたカビ（以下、「Ｎｏ．１２５株」という）を使用した他は全く同じ条件で実験を行った。
結果を図１〜４に示す。カビとしてＮｏ．１２５株を使用した場合、カビ培養抽出物にはガン細胞に対する濃度依存性が認められないことが判明した。
【００７５】
［比較例４］
実施例１の場合で使用したＮｏ．１４５株に代えて、かつお節枯節に育成したカビをマルトモ社の研究所にて単離した。この単離されたカビ（以下、「Ｎｏ．１３５株」という）を使用した他は全く同じ条件で実験を行った。
結果を図１〜４に示す。カビとしてＮｏ．１３５株を使用した場合、カビ培養抽出物にはガン細胞に対する濃度依存性が認められないことが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明によれば、鰹節の製造に利用されるカビ菌を培養することにより、ガン細胞に対する細胞傷害を有する抽出物が得られる。この抽出物を用いることより、ガン治療の医薬品、食品添加剤等の開発に大きく寄与することが可能となる。
【符号の説明】
【００７７】
１ 実施例１
２ 比較例１
３ 比較例２
４ 比較例３
５ 比較例４
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カビおよびカビを培養して得られるカビ培養抽出物に関する。
【背景技術】
【０００２】
カビ等の微生物は人工的に合成が困難な医薬品原料を産生することがある。この様なカビの一種としてペニシリウム属のカビが知られている（特許文献１）。
このペニシリウム属のカビを培養して、得られた培養液を有機溶媒により抽出する。この抽出液から１，３−ジヒドロキシベンゼン環を有する１０員環マクロライドが得られることが知られている。
そして前記１０員環マクロライドをヒトの疾患や動物の疾患の治療のための医薬品として使用することが提案されている。
【０００３】
しかしながら、カビの中にはヒトや動物に対して害を及ぼす可能性のあるものも存在する。このためカビがヒトの疾患や動物の疾患の治療のための医薬品を産生する能力があることを発見した場合でも、カビそのものが毒性、発がん性等の性質を有する可能性のある場合、カビが毒性、発がん性等を示す化合物等を産生する可能性のある場合には、カビを培養して得られる医薬品を実用化することが困難となることがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００４−５３４７５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ヒトや動物に対して害を及ぼす可能性の低いカビを培養することにより、ガン細胞に対する細胞傷害性を有するカビ培養抽出物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するため本発明者らが鋭意検討した結果、ユーロチウム属のカビを培養し、そのカビおよびカビの培養物を抽出して得られるカビ培養抽出物が本発明の目的に適うことを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、
［１］ユーロチウム属のカビを培養した後、カビおよびカビの培養物を有機溶媒により抽出して得られるカビ培養抽出物を提供するものである。
【０００８】
また本発明の一つは、
［２］前記有機溶媒が、親水性有機溶媒である、上記［１］に記載されたカビ培養抽出物を提供するものである。
【０００９】
また本発明の一つは、
［３］前記培養が、２０〜４５℃の範囲並びに６時間〜６０日間の範囲で実施される、上記［１］または［２］に記載されたカビ培養抽出物を提供するものである。
【００１０】
また本発明の一つは、
［４］前記ユーロチウム属のカビが、２６スベドベリのリボソームを有し、
前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列または配列表の配列番号１に示される塩基配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有する、上記［１］〜［３］のいずれかに記載されたカビ培養抽出物を提供するものである。
【００１１】
また本発明の一つは、
［５］前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列を有する、上記［１］〜［４］のいずれかに記載されたカビ培養抽出物を提供するものである。
【００１２】
また本発明は、
［６］ユーロチウム属のカビを培養する培養工程と、
前記培養工程により得られたカビおよびカビの培養物を有機溶媒により抽出する抽出工程と、
前記抽出工程により得られた抽出液から有機溶媒に対する不溶分を除去する除去工程と、
を少なくとも有することを特徴とする、カビ培養抽出物の製造方法を提供するものである。
【００１３】
また本発明の一つは、
［７］前記抽出工程により得られた抽出液から有機溶媒に対する不溶分を除去する除去工程により得られた有機溶液から、有機溶媒を留去する留去工程を含む、上記［４］に記載されたカビ培養抽出物の製造方法を提供するものである。
【００１４】
また本発明の一つは、
［８］前記有機溶媒が、親水性有機溶媒である、上記［６］または［７］に記載されたカビ培養抽出物の製造方法を提供するものである。
【００１５】
また本発明の一つは、
［９］前記培養工程が、２０〜４５℃の温度範囲並びに６時間〜６０日間の時間範囲で実施される、上記［６］〜［８］のいずれかに記載されたカビ培養抽出物の製造方法を提供するものである。
【００１６】
また本発明の一つは、
［１０］前記ユーロチウム属のカビが、２６スベドベリのリボソームを有し、
前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列または配列表の配列番号１に示される塩基配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有する、上記［６］〜［９］のいずれかに記載されたカビ培養抽出物の製造方法を提供するものである。
【００１７】
また本発明の一つは、
［１１］前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列を有する、上記［６］〜［１０］のいずれかに記載されたカビ培養抽出物の製造方法を提供するものである。
【００１８】
また本発明は、
［１２］ユーロチウム属のカビを培養した後、カビおよびカビの培養物からカビ培養抽出物を有機溶媒により抽出することを特徴とする、カビ培養抽出物の抽出方法を提供するものである。
【００１９】
また本発明の一つは、
［１３］抽出に使用する有機溶媒が、親水性有機溶媒である、上記［１２］に記載されたカビ培養抽出物の抽出方法を提供するものである。
【００２０】
また本発明は、
［１４］前記ユーロチウム属のカビが、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに対し寄託された受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０８３、微生物の識別の表示Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ ＭＫ１４５である、上記［１］〜［５］のいずれかに記載のカビ培養抽出物を提供するものである。
【００２１】
また本発明の一つは、
［１５］上記［６］〜［１１］のいずれかに記載のカビ培養抽出物の製造方法に使用されるユーロチウム属のカビであって、
前記ユーロチウム属のカビが、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに対し寄託された受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０８３、微生物の識別の表示Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ ＭＫ１４５である、ユーロチウム属のカビを提供するものである。
【００２２】
また本発明の一つは、
［１６］上記［１２］または［１３］に記載のカビ培養抽出物の抽出方法に使用される、ユーロチウム属のカビであって、
前記ユーロチウム属のカビが、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに対し寄託された受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０８３、微生物の識別の表示Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ ＭＫ１４５である、ユーロチウム属のカビを提供するものである。
【００２３】
また本発明の一つは、
［１７］２６スベドベリのリボソームを有するユーロチウム属のカビであって、
前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列または配列番号１に示される塩基配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有する、上記［１５］または［１６］に記載のユーロチウム属のカビを提供するものである。
【００２４】
また本発明の一つは、
［１８］前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列を有する、請求項１７に記載されたユーロチウム属のカビを提供するものである。
【００２５】
また本発明の一つは、
［１９］ 独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに対し寄託されたカビであって、
受託番号が、ＮＩＴＥ Ｐ−１０８３であり、
微生物の識別の表示が、Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ ＭＫ１４５である、ユーロチウム属のカビを提供するものである。
【発明の効果】
【００２６】
本発明に使用するユーロチウム属のカビは、鰹節のカビ付けに使用することができるものである。食生活に長年使用されてきた実績に示される通り、本発明に使用するユーロチウム属のカビはヒトや動物に対する毒性が極めて小さい。
また前記ユーロチウム属のカビを培養することにより得られるカビ培養抽出物は、ガン細胞に対する細胞傷害性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、正常細胞であるマウス胎児由来繊維芽細胞に対するカビ培養抽出物の濃度と生細胞数との関係を示したグラフである。
【図２】図２は、ヒト子宮頸ガン細胞であるＨｅＬａに対するカビ培養抽出物の濃度と生細胞数との関係を示したグラフである。
【図３】図３は、ヒト肝臓ガンであるＨｅｐＧ２に対するカビ培養抽出物の濃度と生細胞数との関係を示したグラフである。
【図４】図４は、マウス大腸ガン細胞であるＣｏｌｏｎ２６に対するカビ培養抽出物の濃度と生細胞数との関係を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
最初に本発明に使用するカビについて説明する。
本発明に使用するカビは、ユーロチウム属に属するものである。前記カビはアムステロダミ種に属するものであれば好ましい。
前記ユーロチウム属のカビは一種もしくは二種以上を使用することができる。
【００２９】
前記ユーロチウム属のカビは、２６スベドベリ（以下、「２６Ｓ」という）のリボソームを有することが好ましい。
前記２６Ｓのリボソームとしては、例えば、前記２６Ｓのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列と一致するものを有するものが挙げられる。
【００３０】
前記２６Ｓのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列は、配列表の配列番号１に示される塩基配列に示される塩基配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有するものであってもよい。
【００３１】
前記２６Ｓのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列は、配列表の配列番号１に示される塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列を持つものが好ましい。前記相同性は、９８％以上であれば好ましく、９９％以上であればより好ましい。
【００３２】
前記ユーロチウム属のカビの培養に使用する培地に限定はなく、例えば、鰹節かび菌の培養に用いられている公知の培地用成分を使用することができる。
【００３３】
例えば、培養に使用する炭素源としては、グルコース、マンノース、フラクトース、マンノース、リボース、キシロース等のアルドース類、グルコン酸、マンノン酸等のアルドン酸類、グルカル酸、マンナル酸等のアルダル酸類、ソルビトール、マンニトール等のアルジトール類、グルクロン酸、マンヌロン酸等のウロン酸類等、
植物、動物由来のでんぷん、抽出液等、
エタノール、グリセリン等の水酸基含有化合物等を挙げることができる。
【００３４】
また培養に使用する窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を挙げることができる。
また培養に使用するリン源としては、リン酸アンモニウム、リン酸ナトリウム等を挙げることができる。
また培養に使用するカリウム源としては、塩化カリウム、硝酸カリウム等を挙げることができる。
【００３５】
前記炭素源、窒素源、リン源、カリウム源等は一種もしくは二種以上を使用することができる。
【００３６】
前記培地用成分として、必要に応じてｐＨを調整するための緩衝成分、ポリアクリル酸誘導体等のゲル化成分等を配合することができる。
【００３７】
前記ユーロチウム属のカビを培養するときの条件は以下の通りである。
【００３８】
前記ユーロチウム属のカビの培養を行うときの温度は、１５〜５５℃の範囲であることが好ましく、さらに好ましくは２０〜４５℃の範囲である。
前記ユーロチウム属のカビの培養を行うときの時間は、６時間〜６０日の範囲であることが好ましく、より好ましくは２〜３０日の範囲であり、さらに好ましくは３〜２０日の範囲である。
【００３９】
前記ユーロチウム属のカビの培養を行うときのｐＨは、２〜８の範囲の範囲が好ましく、より好ましくは３〜７の範囲であり、さらに好ましくは４〜６の範囲である。
【００４０】
前記ユーロチウム属のカビの培養の際に使用する水に特に限定はなく、イオン交換水、蒸留水、水道水、通常の水道水から塩素を除去した工業用水等が使用される。
【００４１】
前記ユーロチウム属のカビの培養後、前記ユーロチウム属のカビおよび前記ユーロチウム属のカビの培養物を有機溶媒により抽出する。
【００４２】
前記有機溶媒としては、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン等の鎖状脂肪族炭化水素類、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン等の環状脂肪族炭化水素類、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン類、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル、メチルブチルエーテル等の鎖状エーテル類、テトラヒドロフラン、ジオキサン等の環状エーテル類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、メチルピロリドン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の非プロトン性極性溶媒類、エチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、エチレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル等のグリコールモノエーテル類、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール類等が挙げられる。
【００４３】
本発明に使用する有機溶媒は親水性有機溶媒が好ましい。
この様な親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、テトラヒドロフラン、ジオキサン等の環状エーテル類、メチルピロリドン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の非プロトン性極性溶媒、エチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、エチレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル等のグリコールモノエーテル類等が挙げられる。
取り扱い性の面から本発明に使用する有機溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール類であればより好ましい。
【００４４】
本発明に使用する有機溶媒は、一種もしくは二種以上を使用することができる。
【００４５】
前記ユーロチウム属のカビの培養に使用した培地および前記ユーロチウム属のカビをフラスコ、試験管等の抽出用容器に移し、前記有機溶媒と接触させて前記ユーロチウム属のカビおよび前記ユーロチウム属のカビの培養物を含む培地を有機溶媒により抽出する。
この抽出操作により、前記ユーロチウム属のカビと、前記ユーロチウムのカビを培養することにより得られた培養物とから有機溶媒に溶解する成分が抽出される。
【００４６】
前記抽出操作の際に、前記ユーロチウム属のカビおよび前記ユーロチウム属のカビの培養物を含む培地（１）ならびに前記有機溶媒（２）を接触させる順番に限定はなく、例えば、前記ユーロチウム属のカビおよび前記ユーロチウム属のカビの培養物を含む培地（１）に対して有機溶媒（２）を加えてもよいし、有機溶媒（２）に対して前記ユーロチウム属のカビおよび前記ユーロチウム属のカビの培養物を含む培地（１）を加えてもよい。また前記ユーロチウム属のカビおよび前記ユーロチウム属のカビの培養物を含む培地（１）ならびに前記有機溶媒（２）をそれぞれ同時に抽出用容器に投入することにより同時に接触させてもよい。
【００４７】
次に前記ユーロチウム属のカビおよび前記ユーロチウム属のカビの培養物を含む培地（１）および有機溶媒（２）を含む混合物を攪拌する。
前記混合物を攪拌する操作は、例えば、前記混合物を含む抽出用容器を回転させる方法、前記混合物を含む抽出用容器に磁気式または機械式の攪拌手段を設置して混合物を混ぜる方法、前記混合物を含む抽出用容器を震盪する方法等が挙げられる。
なお、前記震盪する方法には、前記混合物に対して超音波により振動を加える方法が含まれる。
【００４８】
前記混合物を攪拌することにより、前記ユーロチウム属のカビおよび前記ユーロチウム属のカビの培養物を含む培地（１）から前記有機溶媒（２）に溶解する成分を抽出することができる。
【００４９】
前記抽出の際の温度は、１５〜１５０℃の範囲であることが好ましく、さらに好ましくは２０〜１００℃の範囲である。前記抽出は通常常圧下に実施されるが、加圧下に実施することも可能である。
【００５０】
前記抽出の際の時間は、１分〜１日間の範囲が好ましく、１０分〜１２時間の範囲が好ましい。
【００５１】
次に前記混合物から有機溶媒に溶けない成分を除去する。
前記有機溶媒に溶けない成分を除去する方法としては、例えば、遠心分離、濾過等の方法を挙げることができる。
前記混合物から有機溶媒に溶けない成分を除去することにより、カビ培養抽出物の有機溶液を得ることができる。
【００５２】
前記カビ培養抽出物の有機溶液から有機溶媒を留去することにより、カビ培養抽出物を得ることができる。
前記有機溶媒を留去する方法に限定はなく、例えば、前記カビ培養抽出物の有機溶液を常圧下または減圧下に前記有機溶媒の沸点以上の温度に加温する方法等を挙げることができる。
【００５３】
上記の操作により、本発明のカビ溶媒抽出物を得ることができる。
【００５４】
本発明のカビ溶媒抽出物はガン細胞に対して傷害活性を示す。
前記ガン細胞としては、例えば、肺癌患者由来のリンパ球細胞とリンパ腫細胞であるＮＡＴ−３０細胞とを融合して作製したハイブリドーマ、ヒト大腸癌由来細胞、マウス大腸癌由来細胞、ヒト末梢血リンパ球等の一種もしくは二種以上が挙げられる。
ここで、肺癌患者由来のリンパ球細胞とリンパ腫細胞であるＮＡＴ−３０細胞とを融合して作製したハイブリドーマとしては、ＨＢ４Ｃ５、ＨＦ１０Ｂ４等を挙げることができる。ＨＢ４Ｃ５は、培養及び細胞活性の測定が容易であるという理由から好ましい。
【００５５】
前記ヒト大腸癌由来細胞としては、Ｃｏｌｏ−２０１、ＬｏＶｏ、Ｃａｃｏ−２、ＬＳ１８０等を挙げることができる。Ｃｏｌｏ−２０１、及びＣａｃｏ−２からなる群より選ばれる少なくとも一つの株化細胞であることが、培養が容易であることから好ましく、Ｃｏｌｏ−２０１であることがさらに好ましい。
【００５６】
前記マウス大腸癌由来細胞としては、Ｃｏｌｏｎ−２６、ＲＫＯ−Ｅ６、ＣＴ２６、ＣＬ２５等を挙げることができる。Ｃｏｌｏｎ−２６であることが、ｉｎ ｖｉｖｏ（動物実験）において効果を検討することが容易であることから好ましい。
【００５７】
また前記カビ培養抽出物は、上記のような株化細胞以外に、ヒト末梢血リンパ球細胞に対して、細胞傷害活性を有するものであってもよい。
【００５８】
次に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００５９】
［カビの採取］
かつお節からユーロチウム属のカビをマルトモ社の研究所にて採取した。この採取したユーロチウム属のカビ（以下、「Ｎｏ．１４５株」という）をビーズストックにより冷凍保存した。
ビーズストックにはイワキ社製のマイクロバンクを用いた。Ｎｏ．１４５株を下記に示す方法により培養し、保存サンプルとした。なおマイクロバンクを用いたＮｏ．１４５株の保存温度はマイナス４０℃である。
【００６０】
前記Ｎｏ．１４５株の微生物学上の特徴は次の通りである。
（１）生育温度
２５〜３０℃の範囲で良好に生育する。
（２）生育ｐＨ
ｐＨ３．０〜ｐＨ８．０の範囲で生育が可能である。
（３）培地選択性
寒天培地上で、ツァペック・ドッグス培地、ＰＤＡ培地（ポテトデキストロース寒天培地）、ＭＹ２０培地（ぶどう糖２００ｇ、ペプトン５ｇ、麦芽エキス３ｇ、酵母エキス３ｇおよび蒸留水１リットルの組成）、サブロー培地で生育が可能であったが、コーンミール培地で生育させることはできなかった。
（４）顕微鏡を使用した形態観察結果
ホウキ状に配列した梗子をもち、その先端に分生子の数珠上の連鎖を生じる形態が観察された。
（５）ＭＹ２０寒天培地上でのコロニーの様子
観察開始初期には白色の毛足の長いコロニーを形成した。その後、次第に黄色の毛足の短いコロニーへと変化することが確認された。
【００６１】
［カビの培養］
前記Ｎｏ．１４５株をＭＹ２０（ぶどう糖２００ｇ、ペプトン５ｇ、麦芽エキス３ｇ、酵母エキス３ｇおよび蒸留水１リットルの組成）を使用した寒天培地の培養プレートに植菌し、３０℃で７日間培養を行った。
次に前記培養プレート内のシングルコロニーを回収し、新しいＭＹ２０を使用した寒天培地の培養プレートに移した。これを同様に３０℃で７日間（合計１４日間）培養を行った。
なお目視観察により、明らかに生育が遅いものについては、合計１４日間培養を行ったものと同様となるまで培養期間を延長した。
【００６２】
［カビの培養物の抽出］
前記Ｎｏ．１４５株の培養プレートをスパチュラで崩しながら試験管に詰めてメタノールを添加した。
次にシリコーンにより前記試験管に栓をして、室温で３０分間超音波を加えて抽出を行った。なお超音波の処理には市販の超音波洗浄機を使用した。
次にメタノールを含む混合物を濾過し、濾過液を回収した。
濾過により得られたメタノールに対する不溶物を試験管に戻し、再度新しいメタノールを添加し、数回試験管を振った。この混合液を再度濾過し、後に得られた濾過液を先に得られた濾過液と合わせた。
次にロータリーエバポレーターにて、合わされた濾過液からメタノールを留去し、カビ培養抽出物１（Ｎｏ．１４５株）を得た。
【００６３】
［ガン細胞に対する細胞傷害の検証］
試験細胞として下記の細胞を使用した。
・正常細胞：マウス胎児由来繊維芽細胞（日本ＳＬＣ社より購入したＢＡＬＢ／ｃマウスを交配し、母胎より摘出した胎児より調製した。）
・ガン細胞：ＨｅＬａ（ヒト子宮頸ガン、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｉｃａｌ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入した。）、Ｃｏｌｏｎ２６（マウス大腸ガン、東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センターより分譲されたもの。）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝臓ガン、財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 研究資源バンクより分譲されたもの。）
【００６４】
ＭＹ２０を使用した寒天培地の培養プレートに、マウス胎児由来繊維芽細胞、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２およびＣｏｌｏｎ２６を乗せた。次に先に得られたカビ培養抽出物１をメタノールにより希釈した同一濃度のメタノール溶液をそれぞれの培養プレートに添加した。
それぞれの培養プレートを３０℃で４８時間培養した。
【００６５】
次に細胞数測定用キットＷＳＴ−８（キシダ化学社製）を用いて、吸光光度計により各細胞の生存率を相対値として測定した。
生存率の測定は、測定用溶媒のみを使用した場合の吸光光度を１００％として行った。
結果を図１〜４に示す。
図１は、正常細胞であるマウス胎児由来繊維芽細胞に対するカビ培養抽出物の濃度と生細胞数との関係を示したグラフである。
図２は、ヒト子宮頸ガン細胞であるＨｅＬａに対するカビ培養抽出物の濃度と生細胞数との関係を示したグラフである。
図３は、ヒト肝臓ガンであるＨｅｐＧ２に対するカビ培養抽出物の濃度と生細胞数との関係を示したグラフである。
図４は、マウス大腸ガン細胞であるＣｏｌｏｎ２６に対するカビ培養抽出物の濃度と生細胞数との関係を示したグラフである。
なお各グラフの添加濃度（％）は、細胞培地に添加したカビ培養抽出物の終濃度を容積比として示したものである。
【００６６】
図１から、カビ培養抽出物１（Ｎｏ．１４５株を使用）は正常細胞に対してほとんど影響を及ぼさないことが分かる。
また図２〜４により、カビ培養抽出物１のみが特異的にガン細胞に対して細胞傷害を有することが分かる。
特にカビ培養抽出物１の添加濃度が０．１％以上でガン細胞は著しく減少し、０．５％でほぼ死滅することが分かる。
【００６７】
次にＮｏ．１４５株についてゲノム抽出し、シーケンス解析により株菌の同定を行った。
なおゲノム抽出は、塩化ベンジル法で実施した。またシーケンス解析はダイターミネータ法により、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の３１３０ Ｇｅｎｅｒｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒを使用して実施した。
株菌の同定はリボソマールＤＮＡ領域を対象として行った。
得られたデータをデータベース（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)と比較した。
その結果、最も近い菌株としてEurotium amstelodami strain UWFP1115（菌株情報データベース番号：GenBank Accession no. AY213699）が存在し、相同性は９９％であることが判明した。
【００６８】
前記シーケンス解析により判明したＮｏ．１４５株の２６Ｓ（スベドベリ）リボゾームＤＮＡ部分配列を配列表の配列番号１に示す。
【００６９】
本発明に係るカビは、２６スベドベリのリボソームを有するユーロチウム属のカビであって、前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列または配列番号１に示される塩基配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有する、ユーロチウム属のカビであれば好ましい。
【００７０】
また本発明に係るカビは、前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するユーロチウム属のカビであればなお好ましい。
【００７１】
前記Ｎｏ．１４５株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに対し、２０１１年４月８日に寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０８３、微生物の識別の表示Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ ＭＫ１４５として寄託されたものである。
【００７２】
［比較例１］
実施例１の場合で使用したＮｏ．１４５株に代えて、かつお節枯節に育成したカビをマルトモ社の研究所にて単離した。この単離されたカビ（以下、「ＭＫ８２株」という）を使用した他は全く同じ条件で実験を行った。
結果を図１〜４に示す。カビとしてＭＫ８２株を使用した場合、カビ培養抽出物にはガン細胞に対する濃度依存性が認められないことが判明した。
【００７３】
［比較例２］
実施例１の場合で使用したＮｏ．１４５株に代えて、かつお節枯節に育成したカビをマルトモ社の研究所にて単離した。この単離されたカビ（以下、「Ｎｏ．１１５株」という）を使用した他は全く同じ条件で実験を行った。
結果を図１〜４に示す。カビとしてＮｏ．１１５株株を使用した場合、カビ培養抽出物にはガン細胞に対する濃度依存性が認められないことが判明した。
【００７４】
［比較例３］
実施例１の場合で使用したＮｏ．１４５株に代えて、かつお節枯節に育成したカビをマルトモ社の研究所にて単離した。この単離されたカビ（以下、「Ｎｏ．１２５株」という）を使用した他は全く同じ条件で実験を行った。
結果を図１〜４に示す。カビとしてＮｏ．１２５株を使用した場合、カビ培養抽出物にはガン細胞に対する濃度依存性が認められないことが判明した。
【００７５】
［比較例４］
実施例１の場合で使用したＮｏ．１４５株に代えて、かつお節枯節に育成したカビをマルトモ社の研究所にて単離した。この単離されたカビ（以下、「Ｎｏ．１３５株」という）を使用した他は全く同じ条件で実験を行った。
結果を図１〜４に示す。カビとしてＮｏ．１３５株を使用した場合、カビ培養抽出物にはガン細胞に対する濃度依存性が認められないことが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明によれば、鰹節の製造に利用されるカビ菌を培養することにより、ガン細胞に対する細胞傷害を有する抽出物が得られる。この抽出物を用いることより、ガン治療の医薬品、食品添加剤等の開発に大きく寄与することが可能となる。
【符号の説明】
【００７７】
１ 実施例１
２ 比較例１
３ 比較例２
４ 比較例３
５ 比較例４
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユーロチウム属のカビを培養した後、カビおよびカビの培養物を有機溶媒により抽出して得られるカビ培養抽出物。
【請求項２】
前記有機溶媒が、親水性有機溶媒である、請求項１に記載されたカビ培養抽出物。
【請求項３】
前記培養が、２０〜４５℃の範囲並びに６時間〜６０日間の範囲で実施される、請求項１または２に記載されたカビ培養抽出物。
【請求項４】
前記ユーロチウム属のカビが、２６スベドベリのリボソームを有し、
前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列または配列表の配列番号１に示される塩基配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有する、請求項１〜３のいずれかに記載されたカビ培養抽出物。
【請求項５】
前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列を有する、請求項１〜４のいずれかに記載されたカビ培養抽出物。
【請求項６】
ユーロチウム属のカビを培養する培養工程と、
前記培養工程により得られたカビおよびカビの培養物を有機溶媒により抽出する抽出工程と、
前記抽出工程により得られた抽出液から有機溶媒に対する不溶分を除去する除去工程と、
を少なくとも有することを特徴とする、カビ培養抽出物の製造方法。
【請求項７】
前記抽出工程により得られた抽出液から有機溶媒に対する不溶分を除去する除去工程により得られた有機溶液から、有機溶媒を留去する留去工程を含む、請求項６に記載されたカビ培養抽出物の製造方法。
【請求項８】
前記有機溶媒が、親水性有機溶媒である、請求項６または７に記載されたカビ培養抽出物の製造方法。
【請求項９】
前記培養工程が、２０〜４５℃の温度範囲並びに６時間〜６０日間の時間範囲で実施される、請求項６〜８のいずれかに記載されたカビ培養抽出物の製造方法。
【請求項１０】
前記ユーロチウム属のカビが、２６スベドベリのリボソームを有し、
前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列または配列表の配列番号１に示される塩基配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有する、請求項６〜９のいずれかに記載されたカビ培養抽出物の製造方法。
【請求項１１】
前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列を有する、請求項６〜１０のいずれかに記載されたカビ培養抽出物の製造方法。
【請求項１２】
ユーロチウム属のカビを培養した後、カビおよびカビの培養物からカビ培養抽出物を有機溶媒により抽出することを特徴とする、カビ培養抽出物の抽出方法。
【請求項１３】
抽出に使用する有機溶媒が、親水性有機溶媒である、請求項１２に記載されたカビ培養抽出物の抽出方法。
【請求項１４】
前記ユーロチウム属のカビが、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに対し寄託された受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０８３、微生物の識別の表示Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ ＭＫ１４５である、請求項１〜５のいずれかに記載のカビ培養抽出物。
【請求項１５】
請求項６〜１１のいずれかに記載のカビ培養抽出物の製造方法に使用されるユーロチウム属のカビであって、
前記ユーロチウム属のカビが、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに対し寄託された受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０８３、微生物の識別の表示Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ ＭＫ１４５である、ユーロチウム属のカビ。
【請求項１６】
請求項１２または１３に記載のカビ培養抽出物の抽出方法に使用される、ユーロチウム属のカビであって、
前記ユーロチウム属のカビが、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに対し寄託された受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０８３、微生物の識別の表示Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ ＭＫ１４５である、ユーロチウム属のカビ。
【請求項１７】
２６スベドベリのリボソームを有するユーロチウム属のカビであって、
前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列または配列番号１に示される塩基配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有する、請求項１５または１６に記載のユーロチウム属のカビ。
【請求項１８】
前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列を有する、請求項１５〜１７のいずれかに記載されたユーロチウム属のカビ。
【請求項１９】
独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに対し寄託されたカビであって、
受託番号が、ＮＩＴＥ Ｐ−１０８３であり、
微生物の識別の表示が、Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ ＭＫ１４５である、ユーロチウム属のカビ。
【請求項１】
ユーロチウム属のカビを培養した後、カビおよびカビの培養物を有機溶媒により抽出して得られるカビ培養抽出物。
【請求項２】
前記有機溶媒が、親水性有機溶媒である、請求項１に記載されたカビ培養抽出物。
【請求項３】
前記培養が、２０〜４５℃の範囲並びに６時間〜６０日間の範囲で実施される、請求項１または２に記載されたカビ培養抽出物。
【請求項４】
前記ユーロチウム属のカビが、２６スベドベリのリボソームを有し、
前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列または配列表の配列番号１に示される塩基配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有する、請求項１〜３のいずれかに記載されたカビ培養抽出物。
【請求項５】
前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列を有する、請求項１〜４のいずれかに記載されたカビ培養抽出物。
【請求項６】
ユーロチウム属のカビを培養する培養工程と、
前記培養工程により得られたカビおよびカビの培養物を有機溶媒により抽出する抽出工程と、
前記抽出工程により得られた抽出液から有機溶媒に対する不溶分を除去する除去工程と、
を少なくとも有することを特徴とする、カビ培養抽出物の製造方法。
【請求項７】
前記抽出工程により得られた抽出液から有機溶媒に対する不溶分を除去する除去工程により得られた有機溶液から、有機溶媒を留去する留去工程を含む、請求項６に記載されたカビ培養抽出物の製造方法。
【請求項８】
前記有機溶媒が、親水性有機溶媒である、請求項６または７に記載されたカビ培養抽出物の製造方法。
【請求項９】
前記培養工程が、２０〜４５℃の温度範囲並びに６時間〜６０日間の時間範囲で実施される、請求項６〜８のいずれかに記載されたカビ培養抽出物の製造方法。
【請求項１０】
前記ユーロチウム属のカビが、２６スベドベリのリボソームを有し、
前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列または配列表の配列番号１に示される塩基配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有する、請求項６〜９のいずれかに記載されたカビ培養抽出物の製造方法。
【請求項１１】
前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列を有する、請求項６〜１０のいずれかに記載されたカビ培養抽出物の製造方法。
【請求項１２】
ユーロチウム属のカビを培養した後、カビおよびカビの培養物からカビ培養抽出物を有機溶媒により抽出することを特徴とする、カビ培養抽出物の抽出方法。
【請求項１３】
抽出に使用する有機溶媒が、親水性有機溶媒である、請求項１２に記載されたカビ培養抽出物の抽出方法。
【請求項１４】
前記ユーロチウム属のカビが、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに対し寄託された受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０８３、微生物の識別の表示Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ ＭＫ１４５である、請求項１〜５のいずれかに記載のカビ培養抽出物。
【請求項１５】
請求項６〜１１のいずれかに記載のカビ培養抽出物の製造方法に使用されるユーロチウム属のカビであって、
前記ユーロチウム属のカビが、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに対し寄託された受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０８３、微生物の識別の表示Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ ＭＫ１４５である、ユーロチウム属のカビ。
【請求項１６】
請求項１２または１３に記載のカビ培養抽出物の抽出方法に使用される、ユーロチウム属のカビであって、
前記ユーロチウム属のカビが、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに対し寄託された受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０８３、微生物の識別の表示Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ ＭＫ１４５である、ユーロチウム属のカビ。
【請求項１７】
２６スベドベリのリボソームを有するユーロチウム属のカビであって、
前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列または配列番号１に示される塩基配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有する、請求項１５または１６に記載のユーロチウム属のカビ。
【請求項１８】
前記２６スベドベリのリボソームに含まれるＤＮＡの塩基配列の部分配列が、配列表の配列番号１に示される塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列を有する、請求項１５〜１７のいずれかに記載されたユーロチウム属のカビ。
【請求項１９】
独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに対し寄託されたカビであって、
受託番号が、ＮＩＴＥ Ｐ−１０８３であり、
微生物の識別の表示が、Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ ＭＫ１４５である、ユーロチウム属のカビ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−２３１６７９（Ｐ２０１２−２３１６７９Ａ）
【公開日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１００２６１（Ｐ２０１１−１００２６１）
【出願日】平成２３年４月２７日（２０１１．４．２７）
【出願人】（５９０００６３９８）マルトモ株式会社 (23)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月２７日（２０１１．４．２７）
【出願人】（５９０００６３９８）マルトモ株式会社 (23)
【Ｆターム（参考）】
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