β−アミロイドタンパク質会合体形成阻害剤
【課題】 β−アミロイドタンパク質（Ａβ）のフィブリル生成を起こしにくくする阻害剤を提供する。
【解決手段】 配列番号１ ＫＬＶＦＦ で示されるアミノ酸配列のカルボキシル末端を、アスパルチルーアスパルチルー（アミノエトキシ）エトキシ酢酸で修飾したβ−アミロイドタンパク質のフィブリル生成阻害剤。
【解決手段】 配列番号１ ＫＬＶＦＦ で示されるアミノ酸配列のカルボキシル末端を、アスパルチルーアスパルチルー（アミノエトキシ）エトキシ酢酸で修飾したβ−アミロイドタンパク質のフィブリル生成阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、β−アミロイドタンパク質（Ａβ）のフィブリル生成に対して有効に阻害する阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】β−アミロイドタンパク質（Ａβ）は、（DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA 配列番号２）で示されるポリペプチドであり、アルツハイマー病を引き起こすタンパク質として知られており、単独では毒性を示さないが、図１に示されるように会合（aggregation）してフィブリルを形成すると、神経細胞（neural cell）を死滅させることが解っている。
【０００３】しかし、なぜ会合（aggregation）してフィブリルを形成するのかも、またどのようにすればフィブリルを形成しなくなるのかも良く分かっていなかった。
【０００４】
【発明の解決しようとする課題】本発明者は鋭意研究した結果、β−アミロイドタンパク質（Ａβ）が会合（aggregation）する箇所が、β−アミロイドタンパク質（Ａβ）の分子中のほぼ同じ箇所であることを突き止めた。この部分は１６〜２０番目のペプチド（ＫＬＶＦＦ）であり、比較的疎水性のアミノ酸が連なった部分であることが分かった。
【０００５】そこで、β−アミロイドタンパク質（Ａβ）が会合を起こしやすい付近のペプチドの配列の中から、１６〜２０番目のペプチド（ＫＬＶＦＦ 配列番号１）に注目し、このペプチドを有効にブロックすれば会合が起こりにくくなると判断し、この１６〜２０番目のペプチド（ＫＬＶＦＦ 配列番号１）の末端に親水基を付加する実験を行った。
【０００６】さらに実験を重ねた結果、１６〜２０番目のペプチド（ＫＬＶＦＦ 配列番号１）のカルボキシル末端に親水基を付加すると、β−アミロイドタンパク質（Ａβ）が会合（aggregation）してフィブリルを形成しにくいことを見いだした。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、１６〜２０番目のペプチド（ＫＬＶＦＦ 配列番号１）のカルボキシル末端にアスパルチルーアスパルチルー（アミノエトキシ）エトキシ酢酸又はその重合体を、図２に示すように、デザインして実験を行ったところ会合（aggregation）が起こりにくいことが解った。
【０００８】
【発明の実施の態様】本発明は、１６〜２０番目のペプチド（ＫＬＶＦＦ 配列番号１）のカルボキシル末端に付加する親水基として、アスパルチルーアスパルチルー（アミノエトキシ）エトキシ酢酸が非常に有力であることを見いだした。また、アスパルチルーアスパルチルー（アミノエトキシ）エトキシ酢酸は、この繰り返し単位を有する重合体であれば、さらに良い結果が得られた。
【０００９】実施例アスパルチルーアスパルチルー（アミノエトキシ）エトキシ酢酸の３量体から成る親水性部分を持つ会合阻害剤（（ＤＤＸ）３)は、アミノ基をＦｍｏｃ基で保護したアミノ酸と（アミノエトキシ）エトキシ酢酸を用い固相合成法によって合成した。フィブリル生成阻害の実験及び細胞毒性阻害の実験では、適切な溶解性を得るため、４０アミノ酸残基から構成されるβ−アミロイドタンパク質を用いた。β−アミロイドタンパク質（１００μＭ)と会合阻害剤（２００μＭ）を含む溶液を５日間インキュベートした後、この混合溶液５μＬをｐＨ７．２に調整した２５μＭのコンゴーレッド溶液１２０μＬに加え、５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。この吸光度の値によって、β−アミロイドタンパク質のフィブリル生成率を表した。β−アミロイドタンパク質の細胞毒性に対する会合阻害剤の効果は、ＩＭＲ−３２ヒト神経芽細胞腫を用いて調べた。β−アミロイドタンパク質（最終濃度：１００μＭ)と会合阻害剤溶液（最終濃度：２００μＭ）を含む溶液を調製した。この溶液を３７℃で４日間インキュベートした後、９６ウェルのプレート上で１ｘ１０４個／ウェルになるように調整されたＩＭＲ−３２ヒト神経芽細胞腫に加えた。β−アミロイドタンパク質の最終濃度は０．５μＭとなった。２４時間後、ＭＴＴ試薬[３−（４，５−ジメチル−２−チアゾイル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド]（２．０ｍｇ／ｍＬ）を２５μＬ／ウェルずつ加え、４時間培養した後、３０００ｒｐｍ（回転／分）で１０分間遠心し、上清を除き、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を２００μＬ／ウェルずつ加えて５４０ｎｍの吸光度を測定し、生細胞数の割合を計算した。結果を表１及び表２に示す。
【００１０】
【表１】
なお、ＤＤＸとは、アスパルチルーアスパルチルー（アミノエトキシ）エトキシ酢酸を表す。表１の結果より、阻害剤の存在下では、５４０ｎｍでの吸光度が小さくなるので、フィブリルの生成が阻害されることが解る。阻害剤の親水性の部分が長いほど、この効果が大きいことが期待できる。
【００１１】
【表２】
阻害剤存在下では、生き残る細胞数が増える。すなわち、β−アミロイドタンパク質の毒性が軽減される。
【００１２】
【発明の効果】本発明の阻害剤が、β−アミロイドタンパク質のフィブリル生成に対して有効に阻害することが確認された。このフィブリル生成に対する阻害剤は、アルツハイマー病の予防、治療、診断等に役立つことが期待できる。
【００１３】
【配列表】
SEQUENCE LISTING <110> Director-General of National Institute of Advanced Industrial Science and Technology,Ministry of Economy,Trade and Industry<120> Inhibitor for aggregation of beta-Amyloid<130> 11900413<140><141><150><151><160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1<210> 1<211> 5<212> PRT<400> 1Lys Leu Val Phe Phe 1 5<210> 2<211> 42<212> PRT<400> 2Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、β−アミロイドタンパク質（Ａβ）のフィブリル生成に対して有効に阻害する阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】β−アミロイドタンパク質（Ａβ）は、（DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA 配列番号２）で示されるポリペプチドであり、アルツハイマー病を引き起こすタンパク質として知られており、単独では毒性を示さないが、図１に示されるように会合（aggregation）してフィブリルを形成すると、神経細胞（neural cell）を死滅させることが解っている。
【０００３】しかし、なぜ会合（aggregation）してフィブリルを形成するのかも、またどのようにすればフィブリルを形成しなくなるのかも良く分かっていなかった。
【０００４】
【発明の解決しようとする課題】本発明者は鋭意研究した結果、β−アミロイドタンパク質（Ａβ）が会合（aggregation）する箇所が、β−アミロイドタンパク質（Ａβ）の分子中のほぼ同じ箇所であることを突き止めた。この部分は１６〜２０番目のペプチド（ＫＬＶＦＦ）であり、比較的疎水性のアミノ酸が連なった部分であることが分かった。
【０００５】そこで、β−アミロイドタンパク質（Ａβ）が会合を起こしやすい付近のペプチドの配列の中から、１６〜２０番目のペプチド（ＫＬＶＦＦ 配列番号１）に注目し、このペプチドを有効にブロックすれば会合が起こりにくくなると判断し、この１６〜２０番目のペプチド（ＫＬＶＦＦ 配列番号１）の末端に親水基を付加する実験を行った。
【０００６】さらに実験を重ねた結果、１６〜２０番目のペプチド（ＫＬＶＦＦ 配列番号１）のカルボキシル末端に親水基を付加すると、β−アミロイドタンパク質（Ａβ）が会合（aggregation）してフィブリルを形成しにくいことを見いだした。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、１６〜２０番目のペプチド（ＫＬＶＦＦ 配列番号１）のカルボキシル末端にアスパルチルーアスパルチルー（アミノエトキシ）エトキシ酢酸又はその重合体を、図２に示すように、デザインして実験を行ったところ会合（aggregation）が起こりにくいことが解った。
【０００８】
【発明の実施の態様】本発明は、１６〜２０番目のペプチド（ＫＬＶＦＦ 配列番号１）のカルボキシル末端に付加する親水基として、アスパルチルーアスパルチルー（アミノエトキシ）エトキシ酢酸が非常に有力であることを見いだした。また、アスパルチルーアスパルチルー（アミノエトキシ）エトキシ酢酸は、この繰り返し単位を有する重合体であれば、さらに良い結果が得られた。
【０００９】実施例アスパルチルーアスパルチルー（アミノエトキシ）エトキシ酢酸の３量体から成る親水性部分を持つ会合阻害剤（（ＤＤＸ）３)は、アミノ基をＦｍｏｃ基で保護したアミノ酸と（アミノエトキシ）エトキシ酢酸を用い固相合成法によって合成した。フィブリル生成阻害の実験及び細胞毒性阻害の実験では、適切な溶解性を得るため、４０アミノ酸残基から構成されるβ−アミロイドタンパク質を用いた。β−アミロイドタンパク質（１００μＭ)と会合阻害剤（２００μＭ）を含む溶液を５日間インキュベートした後、この混合溶液５μＬをｐＨ７．２に調整した２５μＭのコンゴーレッド溶液１２０μＬに加え、５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。この吸光度の値によって、β−アミロイドタンパク質のフィブリル生成率を表した。β−アミロイドタンパク質の細胞毒性に対する会合阻害剤の効果は、ＩＭＲ−３２ヒト神経芽細胞腫を用いて調べた。β−アミロイドタンパク質（最終濃度：１００μＭ)と会合阻害剤溶液（最終濃度：２００μＭ）を含む溶液を調製した。この溶液を３７℃で４日間インキュベートした後、９６ウェルのプレート上で１ｘ１０４個／ウェルになるように調整されたＩＭＲ−３２ヒト神経芽細胞腫に加えた。β−アミロイドタンパク質の最終濃度は０．５μＭとなった。２４時間後、ＭＴＴ試薬[３−（４，５−ジメチル−２−チアゾイル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド]（２．０ｍｇ／ｍＬ）を２５μＬ／ウェルずつ加え、４時間培養した後、３０００ｒｐｍ（回転／分）で１０分間遠心し、上清を除き、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を２００μＬ／ウェルずつ加えて５４０ｎｍの吸光度を測定し、生細胞数の割合を計算した。結果を表１及び表２に示す。
【００１０】
【表１】
なお、ＤＤＸとは、アスパルチルーアスパルチルー（アミノエトキシ）エトキシ酢酸を表す。表１の結果より、阻害剤の存在下では、５４０ｎｍでの吸光度が小さくなるので、フィブリルの生成が阻害されることが解る。阻害剤の親水性の部分が長いほど、この効果が大きいことが期待できる。
【００１１】
【表２】
阻害剤存在下では、生き残る細胞数が増える。すなわち、β−アミロイドタンパク質の毒性が軽減される。
【００１２】
【発明の効果】本発明の阻害剤が、β−アミロイドタンパク質のフィブリル生成に対して有効に阻害することが確認された。このフィブリル生成に対する阻害剤は、アルツハイマー病の予防、治療、診断等に役立つことが期待できる。
【００１３】
【配列表】
SEQUENCE LISTING <110> Director-General of National Institute of Advanced Industrial Science and Technology,Ministry of Economy,Trade and Industry<120> Inhibitor for aggregation of beta-Amyloid<130> 11900413<140><141><150><151><160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1<210> 1<211> 5<212> PRT<400> 1Lys Leu Val Phe Phe 1 5<210> 2<211> 42<212> PRT<400> 2Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40
【特許請求の範囲】
【請求項１】 配列番号１で示されるアミノ酸配列のカルボキシル末端を、アスパルチルーアスパルチルー（アミノエトキシ）エトキシ酢酸で修飾したβ−アミロイドタンパク質（Ａβ）のフィブリル生成阻害剤。
【請求項２】 修飾基が、アスパルチルーアスパルチルー（アミノエトキシ）エトキシ酢酸の重合体である請求項１に記載されたβ−アミロイドタンパク質（Ａβ）のフィブリル生成阻害剤。
【請求項１】 配列番号１で示されるアミノ酸配列のカルボキシル末端を、アスパルチルーアスパルチルー（アミノエトキシ）エトキシ酢酸で修飾したβ−アミロイドタンパク質（Ａβ）のフィブリル生成阻害剤。
【請求項２】 修飾基が、アスパルチルーアスパルチルー（アミノエトキシ）エトキシ酢酸の重合体である請求項１に記載されたβ−アミロイドタンパク質（Ａβ）のフィブリル生成阻害剤。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００２−２４１３０２（Ｐ２００２−２４１３０２Ａ）
【公開日】平成１４年８月２８日（２００２．８．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００１−４１１７０（Ｐ２００１−４１１７０）
【出願日】平成１３年２月１９日（２００１．２．１９）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１４年８月２８日（２００２．８．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１３年２月１９日（２００１．２．１９）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]