β−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースの製造方法
【課題】 酵素法によらない製造法でβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを製造する方法を提供する。
【解決手段】 糖質材料としてＤ−グルコース及びＤ−フルクトースを用い、酵素反応を利用することなく、加熱して反応させてＦｐ２−６Ｇを生成させ、反応物中からβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを取得する。一つの具体的なＦｐ２−６Ｇの製造方法は加熱反応時に水を添加しない方法であり、Ｄ−グルコース及びＤ−フルクトースの混合物に対して水を添加することなく加熱して反応させることによりβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを製造することができる。
【解決手段】 糖質材料としてＤ−グルコース及びＤ−フルクトースを用い、酵素反応を利用することなく、加熱して反応させてＦｐ２−６Ｇを生成させ、反応物中からβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを取得する。一つの具体的なＦｐ２−６Ｇの製造方法は加熱反応時に水を添加しない方法であり、Ｄ−グルコース及びＤ−フルクトースの混合物に対して水を添加することなく加熱して反応させることによりβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを製造することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースの製造方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、グルコースとフルクトースの共存下において、加熱条件下で酵素反応を利用することなく反応させてβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノース（以下「Ｆｐ２−６Ｇ」と略す場合もある）は日本国の特許第３８７１２２２号公報（発行日：平成１９年１月２４日）において新規化合物であると示された。該公報において、Ｆｐ２−６Ｇの製造は酵素反応を利用した方法（酵素法）により製造された。即ち該公報には、糖質を含む基質溶液に対してβ−フルクトフラノシダーゼを作用させることにより、Ｆｐ２−６Ｇを該溶液中に生成させ、該溶液中からＦｐ２−６Ｇを取得するか、或いは、糖質を含む培地に対してβ−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物を作用させ、Ｆｐ２−６Ｇを該培地中に生成させ、該培地中からＦｐ２−６Ｇを取得することが示されている。
【０００３】
しかしながら、Ｆｐ２−６Ｇを製造する方法において、酵素反応を利用せずに製造する方法、即ち、酵素を用いずに、或いは微生物を用いずにＦｐ２−６Ｇを製造する方法は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第３８７１２２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、酵素法によらない製造法でβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記した課題を解決するための主たる本発明のβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノース（即ち、Ｆｐ２−６Ｇ）の製造方法は、糖質材料としてＤ−グルコース及びＤ−フルクトースを用い、酵素反応を利用することなく、加熱して反応させてＦｐ２−６Ｇを生成させ、反応物中からＦｐ２−６Ｇを取得することを特徴とする。
【０００７】
さらに一つの具体的な本発明のＦｐ２−６Ｇの製造方法は加熱反応時に水を使用しない方法であり、前記主たる本発明のＦｐ２−６Ｇの製造方法において、Ｄ−グルコース及びＤ−フルクトースの混合物に対して水を添加することなく加熱して反応させ、次いで反応物に水を添加し、溶解させてβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを含有する水溶液とし、該水溶液中からβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを取得することを特徴とする。
【０００８】
さらに別の具体的な本発明のＦｐ２−６Ｇの製造方法は、加熱反応時に水を存在させる方法であり、前記主たる本発明のＦｐ２−６Ｇの製造方法において、Ｄ−グルコース及びＤ−フルクトースの混合物を水の存在下で加熱して反応させ、次いで反応物を含む水溶液中からβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを取得することを特徴とする。
【０００９】
本発明のＦｐ２−６Ｇの製造において加熱反応させる際の温度条件は、２５℃以上２００℃以下となる条件が好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノース（即ち、Ｆｐ２−６Ｇ）を製造する方法は、前記従来の酵素法で製造するよりも、収率が飛躍的に高く、また製造時間も短縮できるため、製造効率がよい。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Ｄ−グルコース及びＤ−フルクトースから合成したＦｐ２−６Ｇの温度の影響を、横軸を温度、縦軸をＦｐ２−６Ｇの相対合成量（％）をとったグラフを示す図である。
【図２】Ｄ−グルコース及びＤ−フルクトースから合成したＦｐ２−６Ｇの経時変化を、横軸を時間（分）、縦軸をＦｐ２−６Ｇの相対合成量（％）をとったグラフを示す図である。
【図３】水を添加することなく反応させてＦｐ２−６Ｇを製造した場合のＦｐ２−６Ｇを含む合成糖溶液（糖サンプル溶液）のＨＰＬＣ分析のチャートを示す図である。
【図４】水を添加することなく反応させてＦｐ２−６Ｇを製造した場合のＦｐ２−６Ｇの回収画分のＨＰＡＥＣ分析のチャートを示す図である。対照として植物エキス発酵液から調製した標準品Ｆｐ２−６Ｇも併せて示す。
【図５】水を添加することなく反応させてＦｐ２−６Ｇを製造した場合のＦｐ２−６Ｇの回収画分の４−アミノ安息香酸エチルエステル標識化（ＡＢＥＥ標識化）分析のチャートを示す図である。対照として植物エキス発酵液から調製した標準品Ｆｐ２−６Ｇも併せて示す。
【図６】対照として植物エキス発酵液から調製した標準品Ｆｐ２−６Ｇの 1Ｈ−ＮＭＲ分析のチャートを示す図である。
【図７】対照として植物エキス発酵液から調製した標準品Ｆｐ２−６Ｇの13Ｃ−ＮＭＲ分析のチャートを示す図である。
【図８】原料として用いるＤ−グルコースとＤ−フルクトースの種々の比率によるＦｐ２−６Ｇの合成量の違いのグラフを示す図である。
【図９】植物エキス発酵液から調製した標準品Ｆｐ２−６Ｇの検量線のグラフを示す図である。
【図１０】ＡＢＥＥ標識化法による植物エキス発酵液から調製した標準品Ｆｐ２−６Ｇの検量線のグラフを示す図である。
【図１１】Ｄ−グルコース・Ｄ−フルクトース混合溶液から合成したＦｐ２−６Ｇ相対合成量の経時変化のグラフを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のＦｐ２−６Ｇの製造に用いるＤ−グルコースには、β−Ｄ−グルコース、無水のＤ−グルコース、1 水和物のＤ−グルコース、アノマー混合のＤ−グルコースの何れでもよい。Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトースには市販のものが好適に利用できる。また、本発明で利用可能なＤ−グルコース、Ｄ−フルクトースの形態は、粉末状、顆粒状、シロップ状或いは水溶液の状態でもよい。
【００１３】
本発明において使用する水には、反応条件を厳密にする目的で精製水を用いることが好ましい。精製水には、ミリＱ水、蒸留水或いはイオン交換水を用いることができる。
【００１４】
Ｆｐ２−６Ｇを含有する水溶液の製造の好ましい実施の態様として、次の方法１、方法２を示す。
【００１５】
〔方法１〕
方法１は、加熱反応時に水を使用しない場合のＦｐ２−６Ｇの製造方法である。
【００１６】
粉末状または顆粒状のＤ−グルコースとＤ−フルクトースをガラス試験管にとり混合し、水を添加しない状態で、５０℃以上２００℃以下、好ましくは１１０℃以上１８０℃以下、最も好ましくは１３０℃以上１７０℃以下、さらに最も好ましくは１３０℃以上１６０℃以下である。加熱反応時の温度が５０℃未満であるとＦｐ２−６Ｇは製造されず、また２００℃を超えるとカラメル化が進み、Ｆｐ２−６Ｇの製造率が落ちるため好ましくない。
【００１７】
加熱時間は好ましくは３０分〜１２０分間、さらに好ましくは４５分〜９０分間加熱処理し、精製水を添加後溶解し、濾過してＦｐ２−６Ｇを生成した糖溶液を得ることができる（下記実施例３、４、図１、図２参照）。濾過は、ディスポーサブル０．４５μｍあるいは０．２２μｍフィルター（例えば、孔径０．４５μｍあるいは０．２２μｍのＤＩＳＭＩＣ−２５ｃｓ Cellulose Acetate ）で濾過してＦｐ２−６Ｇ含有糖溶液とすることができる。このＦｐ２−６Ｇ含有糖溶液は、−４℃以下（好ましくは−８０℃以下）のフリーザーで凍結させることにより保存できる。
【００１８】
〔方法２〕
方法２は、加熱反応時に水を存在させる場合のＦｐ２−６Ｇの製造方法である。
【００１９】
粉末状、顆粒状、シロップ状又は水溶液状のＤ−グルコースとＤ−フルクトースをマイクロチューブにとり、精製水を添加後溶解し、濾過して、好ましくは２５℃〜８０℃、更に好ましくは２５℃〜５０℃で１４日間以上加温処理し、Ｆｐ２−６Ｇを生成した糖溶液を得ることができる。製造環境が２５℃以上であるならば、反応時に加熱を要しない。２５℃未満ではＦｐ２−６Ｇを製造することが困難である。また、５０℃を超えると水分が蒸発し、定量性に欠けるので好ましくない。
【実施例】
【００２０】
下記の実施例１〜４は水を添加することなく加熱した場合の実施例であり、実施例５は水の存在下で加熱した場合の実施例である。
［実施例１］
（Ｆｐ２−６Ｇ標準サンプル溶液の調製）
Ｆｐ２−６Ｇの標準品は、前記特許文献１に記載されている植物エキス発酵液から調製する方法により製造し、ＨＰＬＣ分析、ＡＢＥＥ標識化分析、ＨＰＡＥＣ分析、ＴＯＦ／ＭＳ分析およびＮＭＲ分析により最終的に単一にしたものをＦｐ２−６Ｇ標準品として使用した。Ｆｐ２−６Ｇ標準品を１．０ｍｇ精秤し、0 ．1 ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水を加えて１．０％の「Ｆｐ２−６Ｇ標準サンプル溶液」とした。
【００２１】
このＦｐ２−６Ｇ標準サンプル溶液をさらに希釈し、０．１−１．０％（１−１０ｍｇ／ｍｌ）濃度に調製し、以下の定性試験の標準対照物質として用いた。
【００２２】
（標準品のＦｐ２−６Ｇを用いた検量線の作成）
標準品のＦｐ２−６Ｇを１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌおよび１０ｍｇ／ｍｌとなるように、それぞれ精製水で溶解させ前記実施例１のＨＰＬＣ条件−Ａ１を行い、検出されたＦｐ２−６Ｇのピークから検量線を作成した。図９に標準品Ｆｐ２−６Ｇの検量線のグラフを示す。
【００２３】
（加熱処理によるＦｐ２−６Ｇの合成）
Ｄ−グルコース（シグマ社製、純度９９％）１００ｍｇおよびＤ−フルクトース（シグマ社製、純度９９％）１００ｍｇをガラス試験管に測りとり、混合し、アルミホイルで蓋をし、予め１４０℃に温めておいたサーモバスヒーターで６０分加熱した。加熱後、デシケーター内で室温まで冷やし、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を１ｍｌ加え、溶解させることによりＦｐ２−６Ｇ含有水溶液を得た。得られたＦｐ２−６Ｇ含有水溶液を「糖サンプル溶液」とし、以下の定性試験及び定量試験に用いた。
【００２４】
（加熱処理により合成したＦｐ２−６Ｇの定性試験）
前記工程で得られた１．０％Ｆｐ２−６Ｇ標準サンプル溶液と、前記工程で得られた糖サンプル溶液を以下の条件でＨＰＬＣ分析を行った。
【００２５】
（１）ＨＰＬＣ条件−Ａ１
ＨＰＬＣ装置〔デュアルポンプ（ＤＰ８０２０：商品名、東ソー株式会社製）、検出器（ＲＩ−８０２０：商品名、東ソー株式会社製）、インテグレータ（Ｃｈｒｏｍａｔｏｃｏｒｄｅｒ２１：商品名、東ソー株式会社製）、カラム（ＯＤＳ−８０Ｔｓ ｃｏｌｕｍｎ：商品名、４．６ｍｍ×２５ｃｍ、×２本、東ソー株式会社製）〕、溶出（Ｈ2 Ｏ、0 ．4 ｍｌ／ｍｉｎ）、カラム温度（室温）、注入量（１０μｌ）。以後この分析条件を「ＨＰＬＣ条件−Ａ１」とする。
【００２６】
ＨＰＬＣ条件−Ａ１で得られたＦｐ２−６Ｇ標準サンプル溶液及び糖サンプル溶液の結果を図３に示す。Ｆｐ２−６Ｇ標準サンプル溶液と糖サンプル溶液を比較すると同一の溶出時間に溶出されたピークが一致している箇所が見られる。
【００２７】
次に、Ｆｐ２−６Ｇ標準サンプル溶液のピークと、同一時間に溶出された糖サンプル溶液のピークがＦｐ２−６Ｇについてのものであるかを確認するために以下の条件で、該ピークを分取した。
【００２８】
（２）ＨＰＬＣ条件−Ａ２
分取用ＨＰＬＣ装置〔デュアルポンプ（ＤＰ８０２０：商品名、東ソー株式会社製）、検出器（ＲＩ−８０２０：商品名、東ソー株式会社製）、オーブン（ＣＯ−８０２０：商品名、東ソー株式会社製）、インテグレータ（Ｃｈｒｏｍａｔｏｃｏｒｄｅｒ２１：商品名、東ソー株式会社製）、カラム（ＯＤＳ−８０Ｔｓ ｃｏｌｕｍｎ：商品名、２０ｍｍ×２５ｃｍ、東ソー株式会社製）〕、溶出（Ｈ2 Ｏ、３．０ｍｌ／ｍｉｎ）、カラム温度（３５℃）、注入量（２００μｌ）。以後この分析条件をＨＰＬＣ条件−Ａ２とする。
【００２９】
標準品のＦｐ２−６Ｇと同一の溶出時間に検出された糖サンプル溶液のピークを１０回分取し、この分取液を濃縮・乾固し、１１．３ｍｇの凍結乾燥物を得た。その後、Ｍｉｌｌ−Ｑ水に溶解させ、以下のようにしてその後の定性分析に用いた。
【００３０】
（３）ＨＰＬＣ条件−Ｂ（ＨＰＡＥＣ分析）
前記（２）ＨＰＬＣ条件−Ａ２で得られた分取物（ＯＤＳ−８０Ｔｓ分取画分）のピークが単一のＦｐ２−６Ｇであることを確認するために、該分取物と標準品のＦｐ２−６Ｇについて、以下の条件でＨＰＡＥＣ分析を行った。
【００３１】
カラム（Ｄｉｏｎｅｘ，ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１：商品名、４．０ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ、ダイオネックス株式会社製）、ガードカラム（Ｄｉｏｎｅｘ，ＣａｒｂｏＰａｃ Ｇｕｒｄ：商品名、ダイオネックス株式会社製）、移動層Ａ（１５０ｍＭ ＮａＯＨ）、移動層Ｂ（５００ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ｉｎ １５０ｍＭ ＮａＯＨ）、グラジエント条件（０→１分：２５ｍＭ、１→２分：２５−５０ｍＭ、２→２０分：５０−２００ｍＭ、２０→２２分：５００ｍＭ、２２→３０分：２５ｍＭ）、カラム温度（室温）、注入量（２５μｌ）、測定電位（（Ｅｌ）：０．１Ｖ（５００ｍｓ））、酸化電位（（Ｅ2 ）：０．６Ｖ（１００ｍｓ））、還元電位（（Ｅ３）：−０．６Ｖ（５０ｍｓ））。以後この分析条件を「ＨＰＬＣ条件−Ｂ」とする。
【００３２】
この分析結果を回収分画のＨＰＡＥＣ分析のチャートとして図４に示す。図４によれば、標準品のＦｐ２−６Ｇの同溶出時間にＨＰＬＣ条件−Ｂにおいてもピークが認められた。
【００３３】
（４）ＨＰＬＣ条件−Ｃ（ＡＢＥＥ標識化分析）
前記（２）ＨＰＬＣ条件−Ａ２で得られた分取物（ＯＤＳ−８０Ｔｓ分取画分）のピークがＦｐ２−６Ｇと同じ還元性の物質であることを確認するために該分取物と標準品のＦｐ２−６Ｇについて、以下の条件で周知のＡＢＥＥ標識化分析を行った。ＡＢＥＥ標識化分析は、Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry., 61(11), 1944-1946 (1997)に記載の方法に準じて行った。
【００３４】
前記（２）ＨＰＬＣ条件−Ａ２で得られたサンプル１０ｕｌにＡＢＥＥ化試薬〔株式会社Ｊ−オイルミルズ製、ＡＢＥＥ溶液（４−アミノ安息香酸エチルエステルを含むメタノール溶液）、酢酸、還元剤（ピリジンボランコンプレックス）からなる試薬〕４０μｌを加え、８０℃で1 時間加熱した。加熱後、精製水０．２ｍｌとクロロホルム０．２ｍｌを加え混合し、遠心分離（１，０００ｒｐｍ）後上澄み液を精製水にて適宜希釈したものをＨＰＬＣサンプルとした。
【００３５】
ＡＢＥＥ標識化ＨＰＬＣ装置〔デュアルポンプ（ＤＰ８０２０：商品名、東ソー株式会社製）、検出器（ＵＶ−８０２０：商品名、東ソー株式会社製）、インテグレータ（Ｃｈｒｏｍａｔｏｃｏｒｄｅｒ２１：商品名、東ソー株式会社製）、カラム（Ｈｏｎｅｎｐａｋ Ｃ−１８ ｃｏｌｕｍｎ：商品名、４．６ｍｍ×７．５ｃｍ、×2 本、Ｊ−オイルミルズ社製）〕、溶出（６．０％アセトニトリルを含む０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ4 ．0 ）、0 ．5 ｍｌ／ｍｍ）、カラム温度（室温）、注入量（１０μｌ）。以後この分析条件を「ＨＰＬＣ条件−Ｃ」とする。
【００３６】
該分析条件で標準品のＦｐ２−６ＧとＯＤＳ−８０Ｔｓ分取画分をＡＢＥＥ標識化分析した結果を表すチャートを図５に示す。図５によれば、ＨＰＬＣ条件−Ａ２で得られたＯＤＳ−８０Ｔｓ分取画分のピークは、標準品であるＦｐ２−６Ｇと同溶出時間のピークであることが認めれ、且つこの物質は還元性を持つことが認められた。
【００３７】
（５）ＴＯＦ／ＭＳ分析
前記ＨＰＬＣ条件−Ａ２で得られた分取物のピークの分子量を確認するためＴＯＦ／ＭＳ分析を行った。その結果、ＨＰＬＣ条件−Ａ２で得られたピークは３６５の〔Ｍ＋Ｎａ〕イオンピークを与え、標準品のＦｐ２−６Ｇと同じ分子量であることが認められた。
【００３８】
（６）ＮＭＲ分析
ＨＰＬＣ条件−Ａ2 で得られたピークの構造を確認するためＮＭＲ分析を行った。その結果を表１のケミカルシフト、図６と図７のチャートに示す。ＮＭＲ分析による構造の確認は、標準品のＦｐ２−６Ｇの 1Ｈ−（図６）と13Ｃ−ＮＭＲ（図７）のケミカルシフトの比較により特定できた。
【００３９】
【表１】
【００４０】
以上のＨＰＬＣ条件−Ａｌ、ＨＰＬＣ条件−Ａ２、ＨＰＬＣ条件−Ｂ、ＨＰＬＣ条件−Ｃ、ＴＯＦ／ＭＳ分析およびＮＭＲ分析の結果、得られたピークは標準品であるＦｐ２−６Ｇと同一物質で単一であることが分かる。
【００４１】
（７）グルコースとフルクトースの比率による合成量の違い
前記の加熱処理によるＦｐ２−６Ｇの合成方法において、Ｄ−グルコースとＤ−フルクトースの比率をそれぞれ、Ｄ−グルコース：Ｄ−フルクトース＝１：０、１：１、１：２、２：１、０：１と変えて、Ｆｐ２−６Ｇの製造量を確認した。その結果を図８のグラフにて示す。図８のグラフによれば、Ｄ−グルコース：Ｄ−フルクトースが１：１、１：２、２：１の時にＦｐ２−６Ｇが製造されることが分かる。Ｄ−グルコース：Ｄ−フルクトース＝１〜２：１〜２が好ましく、さらに好ましくはＤ−グルコース：Ｄ−フルクトース＝１：１〜２であることが分かる。
【００４２】
（８）酵素法との比較
前記の加熱処理によるＦｐ２−６Ｇの合成方法において、Ｄ−グルコース１００ｍｇ、Ｄ−フルクトース１００ｍｇとして、９０分の反応でＦｐ２−６Ｇを６．０ｍｇ得た。
【００４３】
これは、酵素法によるＦｐ２−６Ｇの最大合成量の約１５倍に相当することから、収率が飛躍的に高い。さらに、酵素法ではＦｐ２−６Ｇの合成量が最大になる時間が１６８時間なのに対し、本発明では１．５時間でＦｐ２−６Ｇの合成量が最大となることから、製造時間の短縮になる。
【００４４】
［実施例２］
（電気炉を用いたＦｐ２−６Ｇの合成）
Ｄ−グルコース（シグマ社製、純度９９％）１００ｍｇおよびＤ−フルクトース（シグマ社製、純度９９％）１００ｍｇをガラス試験管に測りとり、アルミホイルあるいはアルミキャップで蓋をし、予め１５０℃に温めておいた電気炉で６０分加熱した。加熱後、デシケーター内で室温まで冷やし、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を１ｍｌ加え溶解させＦｐ２−６Ｇ含有水溶液を得た。得られたＦｐ２−６Ｇ含有水溶液を「糖サンプル溶液」とした。
【００４５】
（測定）
前記実施例１のＦｐ２−６Ｇ標準サンプル溶液の調製と同じ方法により調製した標準サンプルの１％Ｆｐ２−６Ｇ溶液、及び前記工程で調製した糖サンプル溶液を、前記実施例１のＨＰＬＣ条件−Ａ１で分析した結果、標準サンプルの１％Ｆｐ２−６Ｇ溶液と糖サンプル溶液は同一溶出時間にピークが検出された。検出されたピークがＦｐ２−６Ｇであることを確認するために前記実施例１のＨＰＬＣ条件−Ａ２で糖サンプル溶液について標準品のＦｐ２−６Ｇだと思われるピークを１０回分取した。
【００４６】
得られた分取液を凍結濃縮乾燥し、６．７ｍｇの凍結乾燥物を得た。得られた凍結乾燥物をＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解させて以下の定性試験に用いた。
【００４７】
前記ＨＰＬＣ条件−Ａ２で得られた糖サンプル溶液の分取物のピークが単一のＦｐ２−６Ｇであることを確認するため、前記実施例１のＨＰＬＣ条件−ＢでＨＰＡＥＣ分析を行った。その結果、糖サンプル溶液の分取物はＦｐ２−６Ｇ標準サンプルと同一の溶出時間にピークが検出された。
【００４８】
ＨＰＬＣ条件−Ａ２で得られたピークがＦｐ２−６Ｇと同じ還元性の物質であることを確認するために前記実施例１のＨＰＬＣ条件−ＣでＡＢＥＥ標識化分析を行った。その結果、標準品であるＦｐ２−６Ｇと同一溶出時間にピークが検出され、この物質は還元性を持つことが認められた。
【００４９】
ＨＰＬＣ条件−Ａ2 で得られたピークの分子量を確認するためＴＯＦ／ＭＳ分析を行った結果、ＨＰＬＣ条件−Ａ２で得られたピークは３６５の〔Ｍ＋Ｎａ〕イオンピークを与え、標準品であるＦｐ２−６Ｇと同一分子量であることが認められた。
【００５０】
ＨＰＬＣ条件−Ａ２で得られたピークの構造を確認するためＮＭＲ分析を行った。
【００５１】
前記ＨＰＬＣ条件−Ａ１、ＨＰＬＣ条件−Ａ２、ＨＰＬＣ条件−Ｂ、ＨＰＬＣ条件−Ｃ、ＴＯＦ／ＭＳ分析およびＮＭＲ分析の結果、得られたピークは標準品であるＦｐ２−６Ｇと同一物質であることが認められた。
【００５２】
電気炉を用いたＤ−グルコース１００ｍｇとＤ−フルクトース１００ｍｇからＦｐ２−６Ｇを３．５ｍｇを得た。これは、酵素法によるＦｐ２−６Ｇの最大合成量の約８倍に相当することから、収率が飛躍的に高い。
【００５３】
［実施例３］
（各温度における加熱処理によるＦｐ２−６Ｇの合成）
前記実施例１の加熱処理によるＦｐ２−６Ｇの合成において、反応温度を１１０℃から１８０℃までの１０℃刻みに（１１０℃、１２０℃、１３０℃、１４０℃、１５０℃、１６０℃、１７０℃、１８０℃）温めておいたサーモバスヒーターでそれぞれ６０分間加熱した以外は、前記実施例１と同様に行って、Ｆｐ２−６Ｇ含有水溶液（糖サンプル溶液）を得た。
【００５４】
前記実施例１のＨＰＬＣ条件−Ａ１を行った。植物エキス発酵液から調製した標準品Ｆｐ２−６Ｇと同じ溶出時間に溶出されたピークについて前記実施例１で作成した検量線を用いて濃度を算出し、Ｆｐ２−６が最も製造される温度を相対合成量１００％とし、各温度におけるＦｐ２−６Ｇの濃度（相対合成量％）のグラフを図１に示す。
【００５５】
図１によれば、１１０℃以上１８０℃以下が好ましく、最も好ましくは１３０℃以上１７０℃以下、一番好ましくは１３０℃以上１６０℃以下、最大相対合成量（１００％）が１４０℃であることが分かる。
【００５６】
［実施例４］
（各反応時間における加熱処理によるＦｐ２−６Ｇの合成）
前記実施例１の加熱処理によるＦｐ２−６Ｇの合成において、１４０℃での加熱時の反応時間を０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１８０分間とした以外は前記実施例１と同様に行って、Ｆｐ２−６Ｇ含有水溶液（糖サンプル溶液）を得た。
【００５７】
前記実施例１のＨＰＬＣ条件−Ａ１を行った。植物エキス発酵液から調製した標準品Ｆｐ２−６Ｇと同じ溶出時間に溶出されたピークについて前記実施例１で作成した検量線を用いて濃度を算出し、Ｆｐ２−６Ｇが最も製造される反応時間を相対合成量１００％とし、各反応時間におけるＦｐ２−６Ｇの濃度（相対合成量％）のグラフを図２に示す。図２によれば、加熱時間は好ましくは３０分〜１２０分間、さらに好ましくは４５分〜９０分間であることが分かる。
【００５８】
［実施例５］
（ＡＢＥＥ標識化法での標準品Ｆｐ２−６Ｇの検量線の作製）
前記実施例１で用いた標準品のＦｐ２−６Ｇを０．０２、０．０４、０．０６、０．０８および０．０１％になるように調製し、前記実施例１のＨＰＬＣ条件−Ｃを行い、検出されたＦｐ２−６Ｇのピークから検量線を作成した。図１０に標準品Ｆｐ２−６Ｇの検量線グラフを示す。
【００５９】
（水溶液からのＦｐ２−６Ｇの合成)
４０％Ｄ−グルコース溶液と４０％Ｄ−フルクトース溶液を混合して２０％グルコース・フルクトース混合糖水溶液とし、５０℃の乾燥機内で０、１５、３０、６０、１２０および１８０日間反応させ、それぞれの糖サンプル溶液を得た。
【００６０】
溶液について標準品のＦｐ２−６Ｇだと思われるピークを３０回分取した。
得られた糖サンプル溶液を、前記ＨＰＬＣ条件−Ｃで分析した結果、標準品のＦｐ２−６Ｇと同一溶出時間にピークが検出された。検出されたピークがＦｐ２−６Ｇであることを確認するために前記実施例１のＨＰＬＣ条件−Ａｌで糖サンプル溶液について標準品のＦｐ２−６Ｇだと思われるピークを３０回分取した。
【００６１】
得られた分取液を凍結濃縮乾燥し２．７ｍｇの凍結乾燥物を得た。得られた凍結乾燥物をＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解させて以下の定性試験に用いた。
【００６２】
前記ＨＰＬＣ条件−Ａｌで得られた糖サンプル溶液の分取物のピークが単一のＦｐ２−６Ｇであることを確認するため、前記実施例１のＨＰＬＣ条件−ＢでＨＰＡＥＣ分析を行った。その結果、糖サンプル溶液の分取物はＦｐ２−６Ｇ標準サンプルと同一の溶出時間にピークが検出された。
【００６３】
前記ＨＰＬＣ条件−Ａｌで得られたピークの分子量を確認するためにＴＯＦ／ＭＳ分析を行った結果、前記ＨＰＬＣ条件−Ａｌで得られたピークは３６５の［Ｍ＋Ｎａ］イオンピークを与え、標準品であるＦｐ２−６Ｇと同一分子量であることが認められた。
【００６４】
前記ＨＰＬＣ条件−Ａｌで得られたピークの構造を確認するためＮＭＲ分析を行った。
【００６５】
前記ＨＰＬＣ条件−Ａ１、ＨＰＬＣ条件−Ｃ、ＴＯＦ／ＭＳ分析およびＮＭＲ分析の結果、得られたピークは標準品であるＦｐ２−６Ｇと同一物質であることが認められた。
【００６６】
前記実施例１のＨＰＬＣ条件−Ｃを行い、植物エキス発酵液から調製した標準品Ｆｐ２−６Ｇと同じ溶出時間に溶出されたピークについて本実施例５で作成した検量線を用いて濃度を算出し、Ｄ−グルコース・Ｄ−フルクトース混合溶液の状態でのＦｐ２−６Ｇが最も製造される日数を１００％とし、各日数におけるＦｐ２−６Ｇの濃度（相対合成量％）のグラフを図１１に示す。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明はＦｐ２−６Ｇの効率の良い製造方法を提供できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースの製造方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、グルコースとフルクトースの共存下において、加熱条件下で酵素反応を利用することなく反応させてβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノース（以下「Ｆｐ２−６Ｇ」と略す場合もある）は日本国の特許第３８７１２２２号公報（発行日：平成１９年１月２４日）において新規化合物であると示された。該公報において、Ｆｐ２−６Ｇの製造は酵素反応を利用した方法（酵素法）により製造された。即ち該公報には、糖質を含む基質溶液に対してβ−フルクトフラノシダーゼを作用させることにより、Ｆｐ２−６Ｇを該溶液中に生成させ、該溶液中からＦｐ２−６Ｇを取得するか、或いは、糖質を含む培地に対してβ−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物を作用させ、Ｆｐ２−６Ｇを該培地中に生成させ、該培地中からＦｐ２−６Ｇを取得することが示されている。
【０００３】
しかしながら、Ｆｐ２−６Ｇを製造する方法において、酵素反応を利用せずに製造する方法、即ち、酵素を用いずに、或いは微生物を用いずにＦｐ２−６Ｇを製造する方法は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第３８７１２２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、酵素法によらない製造法でβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記した課題を解決するための主たる本発明のβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノース（即ち、Ｆｐ２−６Ｇ）の製造方法は、糖質材料としてＤ−グルコース及びＤ−フルクトースを用い、酵素反応を利用することなく、加熱して反応させてＦｐ２−６Ｇを生成させ、反応物中からＦｐ２−６Ｇを取得することを特徴とする。
【０００７】
さらに一つの具体的な本発明のＦｐ２−６Ｇの製造方法は加熱反応時に水を使用しない方法であり、前記主たる本発明のＦｐ２−６Ｇの製造方法において、Ｄ−グルコース及びＤ−フルクトースの混合物に対して水を添加することなく加熱して反応させ、次いで反応物に水を添加し、溶解させてβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを含有する水溶液とし、該水溶液中からβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを取得することを特徴とする。
【０００８】
さらに別の具体的な本発明のＦｐ２−６Ｇの製造方法は、加熱反応時に水を存在させる方法であり、前記主たる本発明のＦｐ２−６Ｇの製造方法において、Ｄ−グルコース及びＤ−フルクトースの混合物を水の存在下で加熱して反応させ、次いで反応物を含む水溶液中からβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを取得することを特徴とする。
【０００９】
本発明のＦｐ２−６Ｇの製造において加熱反応させる際の温度条件は、２５℃以上２００℃以下となる条件が好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノース（即ち、Ｆｐ２−６Ｇ）を製造する方法は、前記従来の酵素法で製造するよりも、収率が飛躍的に高く、また製造時間も短縮できるため、製造効率がよい。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Ｄ−グルコース及びＤ−フルクトースから合成したＦｐ２−６Ｇの温度の影響を、横軸を温度、縦軸をＦｐ２−６Ｇの相対合成量（％）をとったグラフを示す図である。
【図２】Ｄ−グルコース及びＤ−フルクトースから合成したＦｐ２−６Ｇの経時変化を、横軸を時間（分）、縦軸をＦｐ２−６Ｇの相対合成量（％）をとったグラフを示す図である。
【図３】水を添加することなく反応させてＦｐ２−６Ｇを製造した場合のＦｐ２−６Ｇを含む合成糖溶液（糖サンプル溶液）のＨＰＬＣ分析のチャートを示す図である。
【図４】水を添加することなく反応させてＦｐ２−６Ｇを製造した場合のＦｐ２−６Ｇの回収画分のＨＰＡＥＣ分析のチャートを示す図である。対照として植物エキス発酵液から調製した標準品Ｆｐ２−６Ｇも併せて示す。
【図５】水を添加することなく反応させてＦｐ２−６Ｇを製造した場合のＦｐ２−６Ｇの回収画分の４−アミノ安息香酸エチルエステル標識化（ＡＢＥＥ標識化）分析のチャートを示す図である。対照として植物エキス発酵液から調製した標準品Ｆｐ２−６Ｇも併せて示す。
【図６】対照として植物エキス発酵液から調製した標準品Ｆｐ２−６Ｇの 1Ｈ−ＮＭＲ分析のチャートを示す図である。
【図７】対照として植物エキス発酵液から調製した標準品Ｆｐ２−６Ｇの13Ｃ−ＮＭＲ分析のチャートを示す図である。
【図８】原料として用いるＤ−グルコースとＤ−フルクトースの種々の比率によるＦｐ２−６Ｇの合成量の違いのグラフを示す図である。
【図９】植物エキス発酵液から調製した標準品Ｆｐ２−６Ｇの検量線のグラフを示す図である。
【図１０】ＡＢＥＥ標識化法による植物エキス発酵液から調製した標準品Ｆｐ２−６Ｇの検量線のグラフを示す図である。
【図１１】Ｄ−グルコース・Ｄ−フルクトース混合溶液から合成したＦｐ２−６Ｇ相対合成量の経時変化のグラフを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のＦｐ２−６Ｇの製造に用いるＤ−グルコースには、β−Ｄ−グルコース、無水のＤ−グルコース、1 水和物のＤ−グルコース、アノマー混合のＤ−グルコースの何れでもよい。Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトースには市販のものが好適に利用できる。また、本発明で利用可能なＤ−グルコース、Ｄ−フルクトースの形態は、粉末状、顆粒状、シロップ状或いは水溶液の状態でもよい。
【００１３】
本発明において使用する水には、反応条件を厳密にする目的で精製水を用いることが好ましい。精製水には、ミリＱ水、蒸留水或いはイオン交換水を用いることができる。
【００１４】
Ｆｐ２−６Ｇを含有する水溶液の製造の好ましい実施の態様として、次の方法１、方法２を示す。
【００１５】
〔方法１〕
方法１は、加熱反応時に水を使用しない場合のＦｐ２−６Ｇの製造方法である。
【００１６】
粉末状または顆粒状のＤ−グルコースとＤ−フルクトースをガラス試験管にとり混合し、水を添加しない状態で、５０℃以上２００℃以下、好ましくは１１０℃以上１８０℃以下、最も好ましくは１３０℃以上１７０℃以下、さらに最も好ましくは１３０℃以上１６０℃以下である。加熱反応時の温度が５０℃未満であるとＦｐ２−６Ｇは製造されず、また２００℃を超えるとカラメル化が進み、Ｆｐ２−６Ｇの製造率が落ちるため好ましくない。
【００１７】
加熱時間は好ましくは３０分〜１２０分間、さらに好ましくは４５分〜９０分間加熱処理し、精製水を添加後溶解し、濾過してＦｐ２−６Ｇを生成した糖溶液を得ることができる（下記実施例３、４、図１、図２参照）。濾過は、ディスポーサブル０．４５μｍあるいは０．２２μｍフィルター（例えば、孔径０．４５μｍあるいは０．２２μｍのＤＩＳＭＩＣ−２５ｃｓ Cellulose Acetate ）で濾過してＦｐ２−６Ｇ含有糖溶液とすることができる。このＦｐ２−６Ｇ含有糖溶液は、−４℃以下（好ましくは−８０℃以下）のフリーザーで凍結させることにより保存できる。
【００１８】
〔方法２〕
方法２は、加熱反応時に水を存在させる場合のＦｐ２−６Ｇの製造方法である。
【００１９】
粉末状、顆粒状、シロップ状又は水溶液状のＤ−グルコースとＤ−フルクトースをマイクロチューブにとり、精製水を添加後溶解し、濾過して、好ましくは２５℃〜８０℃、更に好ましくは２５℃〜５０℃で１４日間以上加温処理し、Ｆｐ２−６Ｇを生成した糖溶液を得ることができる。製造環境が２５℃以上であるならば、反応時に加熱を要しない。２５℃未満ではＦｐ２−６Ｇを製造することが困難である。また、５０℃を超えると水分が蒸発し、定量性に欠けるので好ましくない。
【実施例】
【００２０】
下記の実施例１〜４は水を添加することなく加熱した場合の実施例であり、実施例５は水の存在下で加熱した場合の実施例である。
［実施例１］
（Ｆｐ２−６Ｇ標準サンプル溶液の調製）
Ｆｐ２−６Ｇの標準品は、前記特許文献１に記載されている植物エキス発酵液から調製する方法により製造し、ＨＰＬＣ分析、ＡＢＥＥ標識化分析、ＨＰＡＥＣ分析、ＴＯＦ／ＭＳ分析およびＮＭＲ分析により最終的に単一にしたものをＦｐ２−６Ｇ標準品として使用した。Ｆｐ２−６Ｇ標準品を１．０ｍｇ精秤し、0 ．1 ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水を加えて１．０％の「Ｆｐ２−６Ｇ標準サンプル溶液」とした。
【００２１】
このＦｐ２−６Ｇ標準サンプル溶液をさらに希釈し、０．１−１．０％（１−１０ｍｇ／ｍｌ）濃度に調製し、以下の定性試験の標準対照物質として用いた。
【００２２】
（標準品のＦｐ２−６Ｇを用いた検量線の作成）
標準品のＦｐ２−６Ｇを１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌおよび１０ｍｇ／ｍｌとなるように、それぞれ精製水で溶解させ前記実施例１のＨＰＬＣ条件−Ａ１を行い、検出されたＦｐ２−６Ｇのピークから検量線を作成した。図９に標準品Ｆｐ２−６Ｇの検量線のグラフを示す。
【００２３】
（加熱処理によるＦｐ２−６Ｇの合成）
Ｄ−グルコース（シグマ社製、純度９９％）１００ｍｇおよびＤ−フルクトース（シグマ社製、純度９９％）１００ｍｇをガラス試験管に測りとり、混合し、アルミホイルで蓋をし、予め１４０℃に温めておいたサーモバスヒーターで６０分加熱した。加熱後、デシケーター内で室温まで冷やし、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を１ｍｌ加え、溶解させることによりＦｐ２−６Ｇ含有水溶液を得た。得られたＦｐ２−６Ｇ含有水溶液を「糖サンプル溶液」とし、以下の定性試験及び定量試験に用いた。
【００２４】
（加熱処理により合成したＦｐ２−６Ｇの定性試験）
前記工程で得られた１．０％Ｆｐ２−６Ｇ標準サンプル溶液と、前記工程で得られた糖サンプル溶液を以下の条件でＨＰＬＣ分析を行った。
【００２５】
（１）ＨＰＬＣ条件−Ａ１
ＨＰＬＣ装置〔デュアルポンプ（ＤＰ８０２０：商品名、東ソー株式会社製）、検出器（ＲＩ−８０２０：商品名、東ソー株式会社製）、インテグレータ（Ｃｈｒｏｍａｔｏｃｏｒｄｅｒ２１：商品名、東ソー株式会社製）、カラム（ＯＤＳ−８０Ｔｓ ｃｏｌｕｍｎ：商品名、４．６ｍｍ×２５ｃｍ、×２本、東ソー株式会社製）〕、溶出（Ｈ2 Ｏ、0 ．4 ｍｌ／ｍｉｎ）、カラム温度（室温）、注入量（１０μｌ）。以後この分析条件を「ＨＰＬＣ条件−Ａ１」とする。
【００２６】
ＨＰＬＣ条件−Ａ１で得られたＦｐ２−６Ｇ標準サンプル溶液及び糖サンプル溶液の結果を図３に示す。Ｆｐ２−６Ｇ標準サンプル溶液と糖サンプル溶液を比較すると同一の溶出時間に溶出されたピークが一致している箇所が見られる。
【００２７】
次に、Ｆｐ２−６Ｇ標準サンプル溶液のピークと、同一時間に溶出された糖サンプル溶液のピークがＦｐ２−６Ｇについてのものであるかを確認するために以下の条件で、該ピークを分取した。
【００２８】
（２）ＨＰＬＣ条件−Ａ２
分取用ＨＰＬＣ装置〔デュアルポンプ（ＤＰ８０２０：商品名、東ソー株式会社製）、検出器（ＲＩ−８０２０：商品名、東ソー株式会社製）、オーブン（ＣＯ−８０２０：商品名、東ソー株式会社製）、インテグレータ（Ｃｈｒｏｍａｔｏｃｏｒｄｅｒ２１：商品名、東ソー株式会社製）、カラム（ＯＤＳ−８０Ｔｓ ｃｏｌｕｍｎ：商品名、２０ｍｍ×２５ｃｍ、東ソー株式会社製）〕、溶出（Ｈ2 Ｏ、３．０ｍｌ／ｍｉｎ）、カラム温度（３５℃）、注入量（２００μｌ）。以後この分析条件をＨＰＬＣ条件−Ａ２とする。
【００２９】
標準品のＦｐ２−６Ｇと同一の溶出時間に検出された糖サンプル溶液のピークを１０回分取し、この分取液を濃縮・乾固し、１１．３ｍｇの凍結乾燥物を得た。その後、Ｍｉｌｌ−Ｑ水に溶解させ、以下のようにしてその後の定性分析に用いた。
【００３０】
（３）ＨＰＬＣ条件−Ｂ（ＨＰＡＥＣ分析）
前記（２）ＨＰＬＣ条件−Ａ２で得られた分取物（ＯＤＳ−８０Ｔｓ分取画分）のピークが単一のＦｐ２−６Ｇであることを確認するために、該分取物と標準品のＦｐ２−６Ｇについて、以下の条件でＨＰＡＥＣ分析を行った。
【００３１】
カラム（Ｄｉｏｎｅｘ，ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１：商品名、４．０ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ、ダイオネックス株式会社製）、ガードカラム（Ｄｉｏｎｅｘ，ＣａｒｂｏＰａｃ Ｇｕｒｄ：商品名、ダイオネックス株式会社製）、移動層Ａ（１５０ｍＭ ＮａＯＨ）、移動層Ｂ（５００ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ｉｎ １５０ｍＭ ＮａＯＨ）、グラジエント条件（０→１分：２５ｍＭ、１→２分：２５−５０ｍＭ、２→２０分：５０−２００ｍＭ、２０→２２分：５００ｍＭ、２２→３０分：２５ｍＭ）、カラム温度（室温）、注入量（２５μｌ）、測定電位（（Ｅｌ）：０．１Ｖ（５００ｍｓ））、酸化電位（（Ｅ2 ）：０．６Ｖ（１００ｍｓ））、還元電位（（Ｅ３）：−０．６Ｖ（５０ｍｓ））。以後この分析条件を「ＨＰＬＣ条件−Ｂ」とする。
【００３２】
この分析結果を回収分画のＨＰＡＥＣ分析のチャートとして図４に示す。図４によれば、標準品のＦｐ２−６Ｇの同溶出時間にＨＰＬＣ条件−Ｂにおいてもピークが認められた。
【００３３】
（４）ＨＰＬＣ条件−Ｃ（ＡＢＥＥ標識化分析）
前記（２）ＨＰＬＣ条件−Ａ２で得られた分取物（ＯＤＳ−８０Ｔｓ分取画分）のピークがＦｐ２−６Ｇと同じ還元性の物質であることを確認するために該分取物と標準品のＦｐ２−６Ｇについて、以下の条件で周知のＡＢＥＥ標識化分析を行った。ＡＢＥＥ標識化分析は、Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry., 61(11), 1944-1946 (1997)に記載の方法に準じて行った。
【００３４】
前記（２）ＨＰＬＣ条件−Ａ２で得られたサンプル１０ｕｌにＡＢＥＥ化試薬〔株式会社Ｊ−オイルミルズ製、ＡＢＥＥ溶液（４−アミノ安息香酸エチルエステルを含むメタノール溶液）、酢酸、還元剤（ピリジンボランコンプレックス）からなる試薬〕４０μｌを加え、８０℃で1 時間加熱した。加熱後、精製水０．２ｍｌとクロロホルム０．２ｍｌを加え混合し、遠心分離（１，０００ｒｐｍ）後上澄み液を精製水にて適宜希釈したものをＨＰＬＣサンプルとした。
【００３５】
ＡＢＥＥ標識化ＨＰＬＣ装置〔デュアルポンプ（ＤＰ８０２０：商品名、東ソー株式会社製）、検出器（ＵＶ−８０２０：商品名、東ソー株式会社製）、インテグレータ（Ｃｈｒｏｍａｔｏｃｏｒｄｅｒ２１：商品名、東ソー株式会社製）、カラム（Ｈｏｎｅｎｐａｋ Ｃ−１８ ｃｏｌｕｍｎ：商品名、４．６ｍｍ×７．５ｃｍ、×2 本、Ｊ−オイルミルズ社製）〕、溶出（６．０％アセトニトリルを含む０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ4 ．0 ）、0 ．5 ｍｌ／ｍｍ）、カラム温度（室温）、注入量（１０μｌ）。以後この分析条件を「ＨＰＬＣ条件−Ｃ」とする。
【００３６】
該分析条件で標準品のＦｐ２−６ＧとＯＤＳ−８０Ｔｓ分取画分をＡＢＥＥ標識化分析した結果を表すチャートを図５に示す。図５によれば、ＨＰＬＣ条件−Ａ２で得られたＯＤＳ−８０Ｔｓ分取画分のピークは、標準品であるＦｐ２−６Ｇと同溶出時間のピークであることが認めれ、且つこの物質は還元性を持つことが認められた。
【００３７】
（５）ＴＯＦ／ＭＳ分析
前記ＨＰＬＣ条件−Ａ２で得られた分取物のピークの分子量を確認するためＴＯＦ／ＭＳ分析を行った。その結果、ＨＰＬＣ条件−Ａ２で得られたピークは３６５の〔Ｍ＋Ｎａ〕イオンピークを与え、標準品のＦｐ２−６Ｇと同じ分子量であることが認められた。
【００３８】
（６）ＮＭＲ分析
ＨＰＬＣ条件−Ａ2 で得られたピークの構造を確認するためＮＭＲ分析を行った。その結果を表１のケミカルシフト、図６と図７のチャートに示す。ＮＭＲ分析による構造の確認は、標準品のＦｐ２−６Ｇの 1Ｈ−（図６）と13Ｃ−ＮＭＲ（図７）のケミカルシフトの比較により特定できた。
【００３９】
【表１】
【００４０】
以上のＨＰＬＣ条件−Ａｌ、ＨＰＬＣ条件−Ａ２、ＨＰＬＣ条件−Ｂ、ＨＰＬＣ条件−Ｃ、ＴＯＦ／ＭＳ分析およびＮＭＲ分析の結果、得られたピークは標準品であるＦｐ２−６Ｇと同一物質で単一であることが分かる。
【００４１】
（７）グルコースとフルクトースの比率による合成量の違い
前記の加熱処理によるＦｐ２−６Ｇの合成方法において、Ｄ−グルコースとＤ−フルクトースの比率をそれぞれ、Ｄ−グルコース：Ｄ−フルクトース＝１：０、１：１、１：２、２：１、０：１と変えて、Ｆｐ２−６Ｇの製造量を確認した。その結果を図８のグラフにて示す。図８のグラフによれば、Ｄ−グルコース：Ｄ−フルクトースが１：１、１：２、２：１の時にＦｐ２−６Ｇが製造されることが分かる。Ｄ−グルコース：Ｄ−フルクトース＝１〜２：１〜２が好ましく、さらに好ましくはＤ−グルコース：Ｄ−フルクトース＝１：１〜２であることが分かる。
【００４２】
（８）酵素法との比較
前記の加熱処理によるＦｐ２−６Ｇの合成方法において、Ｄ−グルコース１００ｍｇ、Ｄ−フルクトース１００ｍｇとして、９０分の反応でＦｐ２−６Ｇを６．０ｍｇ得た。
【００４３】
これは、酵素法によるＦｐ２−６Ｇの最大合成量の約１５倍に相当することから、収率が飛躍的に高い。さらに、酵素法ではＦｐ２−６Ｇの合成量が最大になる時間が１６８時間なのに対し、本発明では１．５時間でＦｐ２−６Ｇの合成量が最大となることから、製造時間の短縮になる。
【００４４】
［実施例２］
（電気炉を用いたＦｐ２−６Ｇの合成）
Ｄ−グルコース（シグマ社製、純度９９％）１００ｍｇおよびＤ−フルクトース（シグマ社製、純度９９％）１００ｍｇをガラス試験管に測りとり、アルミホイルあるいはアルミキャップで蓋をし、予め１５０℃に温めておいた電気炉で６０分加熱した。加熱後、デシケーター内で室温まで冷やし、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を１ｍｌ加え溶解させＦｐ２−６Ｇ含有水溶液を得た。得られたＦｐ２−６Ｇ含有水溶液を「糖サンプル溶液」とした。
【００４５】
（測定）
前記実施例１のＦｐ２−６Ｇ標準サンプル溶液の調製と同じ方法により調製した標準サンプルの１％Ｆｐ２−６Ｇ溶液、及び前記工程で調製した糖サンプル溶液を、前記実施例１のＨＰＬＣ条件−Ａ１で分析した結果、標準サンプルの１％Ｆｐ２−６Ｇ溶液と糖サンプル溶液は同一溶出時間にピークが検出された。検出されたピークがＦｐ２−６Ｇであることを確認するために前記実施例１のＨＰＬＣ条件−Ａ２で糖サンプル溶液について標準品のＦｐ２−６Ｇだと思われるピークを１０回分取した。
【００４６】
得られた分取液を凍結濃縮乾燥し、６．７ｍｇの凍結乾燥物を得た。得られた凍結乾燥物をＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解させて以下の定性試験に用いた。
【００４７】
前記ＨＰＬＣ条件−Ａ２で得られた糖サンプル溶液の分取物のピークが単一のＦｐ２−６Ｇであることを確認するため、前記実施例１のＨＰＬＣ条件−ＢでＨＰＡＥＣ分析を行った。その結果、糖サンプル溶液の分取物はＦｐ２−６Ｇ標準サンプルと同一の溶出時間にピークが検出された。
【００４８】
ＨＰＬＣ条件−Ａ２で得られたピークがＦｐ２−６Ｇと同じ還元性の物質であることを確認するために前記実施例１のＨＰＬＣ条件−ＣでＡＢＥＥ標識化分析を行った。その結果、標準品であるＦｐ２−６Ｇと同一溶出時間にピークが検出され、この物質は還元性を持つことが認められた。
【００４９】
ＨＰＬＣ条件−Ａ2 で得られたピークの分子量を確認するためＴＯＦ／ＭＳ分析を行った結果、ＨＰＬＣ条件−Ａ２で得られたピークは３６５の〔Ｍ＋Ｎａ〕イオンピークを与え、標準品であるＦｐ２−６Ｇと同一分子量であることが認められた。
【００５０】
ＨＰＬＣ条件−Ａ２で得られたピークの構造を確認するためＮＭＲ分析を行った。
【００５１】
前記ＨＰＬＣ条件−Ａ１、ＨＰＬＣ条件−Ａ２、ＨＰＬＣ条件−Ｂ、ＨＰＬＣ条件−Ｃ、ＴＯＦ／ＭＳ分析およびＮＭＲ分析の結果、得られたピークは標準品であるＦｐ２−６Ｇと同一物質であることが認められた。
【００５２】
電気炉を用いたＤ−グルコース１００ｍｇとＤ−フルクトース１００ｍｇからＦｐ２−６Ｇを３．５ｍｇを得た。これは、酵素法によるＦｐ２−６Ｇの最大合成量の約８倍に相当することから、収率が飛躍的に高い。
【００５３】
［実施例３］
（各温度における加熱処理によるＦｐ２−６Ｇの合成）
前記実施例１の加熱処理によるＦｐ２−６Ｇの合成において、反応温度を１１０℃から１８０℃までの１０℃刻みに（１１０℃、１２０℃、１３０℃、１４０℃、１５０℃、１６０℃、１７０℃、１８０℃）温めておいたサーモバスヒーターでそれぞれ６０分間加熱した以外は、前記実施例１と同様に行って、Ｆｐ２−６Ｇ含有水溶液（糖サンプル溶液）を得た。
【００５４】
前記実施例１のＨＰＬＣ条件−Ａ１を行った。植物エキス発酵液から調製した標準品Ｆｐ２−６Ｇと同じ溶出時間に溶出されたピークについて前記実施例１で作成した検量線を用いて濃度を算出し、Ｆｐ２−６が最も製造される温度を相対合成量１００％とし、各温度におけるＦｐ２−６Ｇの濃度（相対合成量％）のグラフを図１に示す。
【００５５】
図１によれば、１１０℃以上１８０℃以下が好ましく、最も好ましくは１３０℃以上１７０℃以下、一番好ましくは１３０℃以上１６０℃以下、最大相対合成量（１００％）が１４０℃であることが分かる。
【００５６】
［実施例４］
（各反応時間における加熱処理によるＦｐ２−６Ｇの合成）
前記実施例１の加熱処理によるＦｐ２−６Ｇの合成において、１４０℃での加熱時の反応時間を０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１８０分間とした以外は前記実施例１と同様に行って、Ｆｐ２−６Ｇ含有水溶液（糖サンプル溶液）を得た。
【００５７】
前記実施例１のＨＰＬＣ条件−Ａ１を行った。植物エキス発酵液から調製した標準品Ｆｐ２−６Ｇと同じ溶出時間に溶出されたピークについて前記実施例１で作成した検量線を用いて濃度を算出し、Ｆｐ２−６Ｇが最も製造される反応時間を相対合成量１００％とし、各反応時間におけるＦｐ２−６Ｇの濃度（相対合成量％）のグラフを図２に示す。図２によれば、加熱時間は好ましくは３０分〜１２０分間、さらに好ましくは４５分〜９０分間であることが分かる。
【００５８】
［実施例５］
（ＡＢＥＥ標識化法での標準品Ｆｐ２−６Ｇの検量線の作製）
前記実施例１で用いた標準品のＦｐ２−６Ｇを０．０２、０．０４、０．０６、０．０８および０．０１％になるように調製し、前記実施例１のＨＰＬＣ条件−Ｃを行い、検出されたＦｐ２−６Ｇのピークから検量線を作成した。図１０に標準品Ｆｐ２−６Ｇの検量線グラフを示す。
【００５９】
（水溶液からのＦｐ２−６Ｇの合成)
４０％Ｄ−グルコース溶液と４０％Ｄ−フルクトース溶液を混合して２０％グルコース・フルクトース混合糖水溶液とし、５０℃の乾燥機内で０、１５、３０、６０、１２０および１８０日間反応させ、それぞれの糖サンプル溶液を得た。
【００６０】
溶液について標準品のＦｐ２−６Ｇだと思われるピークを３０回分取した。
得られた糖サンプル溶液を、前記ＨＰＬＣ条件−Ｃで分析した結果、標準品のＦｐ２−６Ｇと同一溶出時間にピークが検出された。検出されたピークがＦｐ２−６Ｇであることを確認するために前記実施例１のＨＰＬＣ条件−Ａｌで糖サンプル溶液について標準品のＦｐ２−６Ｇだと思われるピークを３０回分取した。
【００６１】
得られた分取液を凍結濃縮乾燥し２．７ｍｇの凍結乾燥物を得た。得られた凍結乾燥物をＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解させて以下の定性試験に用いた。
【００６２】
前記ＨＰＬＣ条件−Ａｌで得られた糖サンプル溶液の分取物のピークが単一のＦｐ２−６Ｇであることを確認するため、前記実施例１のＨＰＬＣ条件−ＢでＨＰＡＥＣ分析を行った。その結果、糖サンプル溶液の分取物はＦｐ２−６Ｇ標準サンプルと同一の溶出時間にピークが検出された。
【００６３】
前記ＨＰＬＣ条件−Ａｌで得られたピークの分子量を確認するためにＴＯＦ／ＭＳ分析を行った結果、前記ＨＰＬＣ条件−Ａｌで得られたピークは３６５の［Ｍ＋Ｎａ］イオンピークを与え、標準品であるＦｐ２−６Ｇと同一分子量であることが認められた。
【００６４】
前記ＨＰＬＣ条件−Ａｌで得られたピークの構造を確認するためＮＭＲ分析を行った。
【００６５】
前記ＨＰＬＣ条件−Ａ１、ＨＰＬＣ条件−Ｃ、ＴＯＦ／ＭＳ分析およびＮＭＲ分析の結果、得られたピークは標準品であるＦｐ２−６Ｇと同一物質であることが認められた。
【００６６】
前記実施例１のＨＰＬＣ条件−Ｃを行い、植物エキス発酵液から調製した標準品Ｆｐ２−６Ｇと同じ溶出時間に溶出されたピークについて本実施例５で作成した検量線を用いて濃度を算出し、Ｄ−グルコース・Ｄ−フルクトース混合溶液の状態でのＦｐ２−６Ｇが最も製造される日数を１００％とし、各日数におけるＦｐ２−６Ｇの濃度（相対合成量％）のグラフを図１１に示す。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明はＦｐ２−６Ｇの効率の良い製造方法を提供できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖質材料としてＤ−グルコースとＤ−フルクトースを用い、酵素反応を利用することなく、加熱して反応させてβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを生成させ、反応物中からβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを取得することを特徴とするβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースの製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載のβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースの製造方法において、
糖質材料に対して水を添加することなく加熱して反応させ、
次いで反応物に水を添加し、溶解させてβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを含有する水溶液とし、
該水溶液中からβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを取得することを特徴とするβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースの製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースの製造方法において、
糖質材料を水の存在下で加熱して反応させ、
次いで反応物を含む水溶液中からβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを取得することを特徴とするβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースの製造方法。
【請求項４】
前記Ｄ−グルコース及びＤ−フルクトースが粉末状又は顆粒状である請求項１乃至３の何れか１項に記載のβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースの製造方法。
【請求項５】
前記加熱する際の温度条件は、５０℃以上２００℃以下となる条件である請求項１又は２に記載のβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースの製造方法。
【請求項６】
前記加熱する際の温度条件は、２５℃以上８０℃以下となる条件である請求項３に記載のβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースの製造方法。
【請求項１】
糖質材料としてＤ−グルコースとＤ−フルクトースを用い、酵素反応を利用することなく、加熱して反応させてβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを生成させ、反応物中からβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを取得することを特徴とするβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースの製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載のβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースの製造方法において、
糖質材料に対して水を添加することなく加熱して反応させ、
次いで反応物に水を添加し、溶解させてβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを含有する水溶液とし、
該水溶液中からβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを取得することを特徴とするβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースの製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースの製造方法において、
糖質材料を水の存在下で加熱して反応させ、
次いで反応物を含む水溶液中からβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを取得することを特徴とするβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースの製造方法。
【請求項４】
前記Ｄ−グルコース及びＤ−フルクトースが粉末状又は顆粒状である請求項１乃至３の何れか１項に記載のβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースの製造方法。
【請求項５】
前記加熱する際の温度条件は、５０℃以上２００℃以下となる条件である請求項１又は２に記載のβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースの製造方法。
【請求項６】
前記加熱する際の温度条件は、２５℃以上８０℃以下となる条件である請求項３に記載のβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１１−４６６８１（Ｐ２０１１−４６６８１Ａ）
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２６３０８６（Ｐ２００９−２６３０８６）
【出願日】平成２１年１１月１８日（２００９．１１．１８）
【特許番号】特許第４４８５６０２号（Ｐ４４８５６０２）
【特許公報発行日】平成２２年６月２３日（２０１０．６．２３）
【出願人】（３０３０２７３３５）大高酵素株式会社 (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月１８日（２００９．１１．１８）
【特許番号】特許第４４８５６０２号（Ｐ４４８５６０２）
【特許公報発行日】平成２２年６月２３日（２０１０．６．２３）
【出願人】（３０３０２７３３５）大高酵素株式会社 (9)
【Ｆターム（参考）】
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