γδＴ細胞培養前の増殖能判定方法、該判定方法のためのキット
【課題】 簡便迅速かつ高精度にγδＴ細胞の培養増殖が可能かどうかを判断する方法を提供する。
【解決手段】 採血した末梢血単核球からγδＴ細胞を採取・染色した後、γδＴ細胞表面に発現しているＣＤ４５ＲＡマーカーを発現している細胞（ＣＤ４５陽性かつＣＤ２７陰性もしくはＣＣＲ７陰性細胞：ＴｅｍｒａγδＴ細胞及びＣＤ４５陽性かつＣＤ２７陽性もしくはＣＣＲ７陽性細胞：ＴｎａｉｖｅγδＴ細胞）の割合を測定し、４０％以下である場合に治療に必要な量のγδＴ細胞を培養可能であると判断する。
【解決手段】 採血した末梢血単核球からγδＴ細胞を採取・染色した後、γδＴ細胞表面に発現しているＣＤ４５ＲＡマーカーを発現している細胞（ＣＤ４５陽性かつＣＤ２７陰性もしくはＣＣＲ７陰性細胞：ＴｅｍｒａγδＴ細胞及びＣＤ４５陽性かつＣＤ２７陽性もしくはＣＣＲ７陽性細胞：ＴｎａｉｖｅγδＴ細胞）の割合を測定し、４０％以下である場合に治療に必要な量のγδＴ細胞を培養可能であると判断する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γδＴ細胞培養のための増殖能判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本人の最も多い死亡原因として悪性新生物（以下、がんという）が挙げられる。がんの治療法としては、三大療法と言われる外科療法、化学療法、放射線療法があるが、夫々治療の困難性や副作用等といった問題がある。
【０００３】
近年、上記三大療法の他にがんの新しい治療法として免疫細胞療法が行われており、この免疫細胞療法は、上記の三大療法のような治療の困難性や副作用といった問題が少ないため注目されている。
【０００４】
この免疫細胞療法の中に、ＬＡＫ（ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｌｌｅｒ；リンフォカイン活性化キラー）療法というＴ細胞もしくはＮＫ細胞を活性化させる療法がある。Ｔ細胞は、αβ型のＴＣＲ（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を発現するαβＴ細胞とγδ型のＴＣＲを発現するγδＴ細胞との２種類があり、Ｔ細胞を活性化するＬＡＫ療法の主流は主にαβＴ細胞を活性化させる療法である。ここで、αβＴ細胞は獲得免疫を中心に担っているＴ細胞のことである。
【０００５】
一方、γδＴ細胞は、自然免疫を担う細胞である。最近ではがん細胞に対して細胞傷害活性（非特異的活性）を有することがわかり（例えば、非特許文献１及び非特許論文２）、このγδＴ細胞の有する強い抗腫瘍活性を利用したγδＴＬＡＫ免疫療法の研究が行われている（例えば、非特許文献３、非特許文献４及び非特許文献５）。
【０００６】
【非特許文献１】Ｈｕｍａｎ γδＴ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ （Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｐａｔｈｏｌ， ２００６， ４６（１）： １１−２３）
【非特許文献２】Ｖγ９Ｖδ２Ｔｃｅｌｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃｅｌｌｓ （Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２００５， １７５： ５４８１−８８）
【非特許文献３】Ｐｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ γδＴ Ｃｅｌｌｓ Ｋｉｌｌ Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｒｅｎａｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ （Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２００５， １７４： １３３８−１３４７）
【非特許文献４】Ｅｆｆｅｃｔｏｒ γδＴ ｃｅｌｌｓ ａｓ ｉｍｍｕｎｅ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ｚｏｌｅｄｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅｍｙｅｌｏｍａ （Ｌｕｋｅｍｉａ， ２００５， １９（４）： ６６４−７０）
【非特許文献５】Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ γδ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ ｚｏｌｅｄｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎ ｖｉｖｏ （Ｂｌｏｏｄ， ２００３， １０２（６）： ２３１０−１）
【０００７】
しかしながら、γδＴ細胞は通常、末梢血中に１〜５％しか存在しないため、少量の血液を採取してγδＴ細胞を活性化及び／又は増殖させても治療に十分な純度及び細胞数を確保することができない場合がある。この場合、治療に十分な純度及び細胞数を確保するために患者からの採血量を多くすると、患者に多大な負担がかかるといった問題もある。さらに、患者によっては以前に受けた種々の治療のため、γδＴ細胞が全く増殖しない場合もある。
【０００８】
したがって、がん患者ではγδＴＬＡＫ免疫療法によって満足な抗腫瘍効果を得るためには患者の末梢血から十分量の活性化γδＴ細胞が回収できることが治療の成功の鍵となり、治療前に少量の患者末梢血を用いてγδＴ細胞の増殖程度を判定することにより、この治療の適応性を決めることができれば患者の負担を少なくして、治療効果が期待できる適切なγδＴＬＡＫ免疫療法細胞を受けることが可能となる。
しかしながら、現状ではγδＴ細胞を用いた治療ができるかどうかは、実際に培養してみてはじめてわかるものであり、そうすると培養（治療）可能かどうか判定できるまで通常１週間〜２週間程度かかってしまう。
また、培養は技術者の手によるものなので、各技術者の有する技術次第で培養の結果も変わってしまうという問題もあり、その培養の可否を判断するための信頼性の高い手法というものがないという問題がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、簡便かつ迅速に、そして精度良く、γδＴ細胞を実際に培養する前にその増殖能を判断することができる技術を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、γδＴ細胞の表面に発現している表面マーカーのＣＤ（ＣＤ；Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；白血球分化抗原）４５ＲＡに着目し、その発現率によって、その後のγδＴ細胞の培養の可否を判定できることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
具体的には本発明は、以下の（１）〜（５）に関するものである。
（１）血液中のγδＴ細胞集団において、γδＴ細胞増殖能判定因子を表面に発現している細胞の割合を測定する工程と、前記発現している細胞の割合が全体の４０％以上かどうかを判定する工程と、を具備することを特徴とするγδＴ細胞培養における事前増殖能判定方法；
（２）前記γδＴ細胞増殖能判定因子を発現している細胞がＣＤ４５ＲＡ陽性細胞であることを特徴とする（１）に記載のγδＴ細胞の増殖能判定方法；
（３）前記ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が、ａ）ＣＤ４５ＲＡ陽性及びＣＤ２７陰性もしくはＣＣＲ７陰性細胞である最終分化メモリーγδＴ細胞；ＴｅｍｒａγδＴ細胞と、ｂ）ＣＤ４５ＲＡ陽性及びＣＤ２７陽性もしくはＣＣＲ７陽性細胞であるナイーブγδＴ細胞；ＴｎａｉｖｅγδＴ細胞と、からなることを特徴とする（２）に記載のγδＴ細胞の増殖能判定方法；
（４）末梢血から末梢血単核球を採取する工程と、前記末梢血単核球を抗γδＴＣＲ， 抗ＣＤ４５ＲＡ，抗ＣＤ２７及び／又は抗ＣＣＲ７抗体で染色し、血中のγδＴ細胞における表面マーカーの割合を測定する工程と、前記測定において、ａ）ＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ２７又はＣＣＲ７陰性細胞である最終分化メモリーγδＴ細胞；ＴｅｍｒａγδＴ細胞と、ｂ）ＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ２７もしくはＣＣＲ７陽性細胞であるナイーブγδＴ細胞；ＴｎａｉｖｅγδＴ細胞と、の割合の合計を測定する工程と、前記ＴｅｍｒａγδＴ細胞とＴｎａｉｖｅγδＴ細胞との割合が４０％以下の場合に増殖可能であると判定する工程と、を具備することを特徴とするγδＴ細胞培養増殖能判定方法；
（５）（４）に記載の判定方法を行うためのキット。
【００１２】
従来は、γδＴ細胞の培養が可能であるかどうかを１，２週間程度かけて実際に培養して判断していたが、本発明の技術によれば、培養を行わずに少量の採血を行うだけで、採血を行ったその当日には増殖可能かどうか、すなわちγδＴ細胞による治療が可能かどうかを判断することができる。また培養を行う必要もないので、医療を提供する側としてはコストも削減できる。
また患者の立場としては、少量の採血量のため身体の負担なく、かつ、時間を無駄にすることなく、γδＴ細胞療法を採用することができるかどうかを判断することが可能となる。
【発明の効果】
【００１３】
以上のことから、本発明の診断方法を用いることにより、従来であれば１週間〜２週間程度要していた患者のγδＴ細胞増殖能の判定を、採血した当日に判定することが可能であり、その判定精度も格段に向上する。また、時間的にも費用的にもそのコストを削減することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００１５】
本発明に係るγδＴ細胞の増殖能判定方法（以下本発明の方法ともいう）は、微量の血液からγδＴ細胞のγδＴ細胞増殖判定因子である表面マーカーの割合を測定し、その測定値にしたがって、がん治療等の治療に対して必要なだけのγδＴ細胞を増殖させることが可能であるかを判定するものである。
ここで、増殖能判定因子とは、細胞表面マーカーのＣＤ４５ＲＡを指す。
【００１６】
すなわち、本発明の方法は、血中のγδＴ細胞集団において、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞の割合を測定し、その割合が４０％以下であるかどうかで、その後のγδＴ細胞の培養が可能であるかどうかを判定するものである。
【００１７】
ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞の割合が４０％以下、好ましくは概ね３０％以下であれば、治療に必要な細胞数まで培養可能であると判定でき、逆に４０％以上、好ましくは概ね５０％以上であると、実際に培養しても培養不良となり、γδＴ細胞療法ができないものと判定できる。
【００１８】
具体的な手法としては、検体から採血した微量の血液から末梢血単核球を採取し、その中のγδＴ細胞を検出する。そのγδＴ細胞集団において、ＣＤ４５ＲＡの発現率を測定する。
【００１９】
ここで、γδＴ細胞集団はＣＤ４５ＲＡ陽性のナイーブγδＴ細胞とＣＤ４５ＲＡ陰性のメモリーγδＴ細胞の２つの集団に分けられる。
更に、ＣＤ４５ＲＡ陽性γδＴ細胞としては、ＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ２７陰性もしくはＣＣＲ７陰性（ＣＤ４５ＲＡ＋ ＣＤ２７−／ＣＣＲ７−）細胞である最終分化メモリーγδＴ細胞（以下ＴｅｍｒａγδＴ細胞という）と、ＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ２７陽性もしくはＣＣＲ７陽性（ＣＤ４５ＲＡ＋・ＣＤ２７＋／ＣＣＲ７＋）細胞であるナイーブγδＴ細胞（以下ＴｎａｉｖｅγδＴ細胞という）の２つのサブセットに分けられる。
【００２０】
ＣＤ４５ＲＡ陰性γδＴ細胞細胞としては、ＣＤ４５ＲＡ陰性かつＣＤ２７陰性もしくはＣＣＲ７陰性（ＣＤ４５ＲＡ− ＣＤ２７−／ＣＣＲ７−）細胞であるエフェクターメモリーγδＴ細胞（以下ＴｅｍγδＴ細胞という）と、ＣＤ４５ＲＡ陰性かつＣＤ２７陽性もしくはＣＣＲ７陽性（ＣＤ４５ＲＡ− ＣＤ２７＋／ＣＣＲ７＋）細胞であるセントラルメモリーγδＴ細胞（以下ＴｃｍγδＴ細胞という）の２つのサブセットに分類される。
【００２１】
本発明者らは、血中のγδＴ細胞集団において、この２種類のＣＤ４５ＲＡ陽性細胞、すなわちＴｅｍｒａγδＴ細胞とＴｎａｉｖｅγδＴ細胞の割合が多いと、γδＴ細胞が増殖できないということを見出した。
具体的な基準としては、上記ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞の割合が４０％以上の場合、その患者の血液ではγδＴ細胞が、効果的な疾病治療のために必要な程度の量まで増殖することができないと判断する。
【００２２】
治療適用可能な疾病としては、がん、ウイルス感染症等の難治性疾患が挙げられる。
本発明により判定可能ながんの種類としては種々のがんに対して用いることができるが、好ましくは固形がんに好適に用いられる。具体的な例としては以下のがん等があげられる。
メラノーマ、結腸がん、大腸がん、顆粒膜細胞腫瘍、肺がん、乳がん、肝臓がん、腎臓がん、子宮頚がん、前立腺がん、胃がん、膵がん、卵巣がん等
【００２３】
測定に使用する血液の量としては１００μＬ〜３ｍＬ程度あれば良い。使用する量は測定する時の血液の状態により、例えば全血を用いて赤血球を溶血し、そこに表面マーカー抗体試薬を用いて染色する場合には１００μＬ〜５００μＬ程度あれば良い。また、末梢血単核球を用いて染色、測定する場合には２〜３ｍＬ程度あれば良い。
この程度の採血量であれば、患者への負担も軽減することができる。また、本発明の方法であれば、たとえγδＴ細胞の血中量が少ない患者であっても、このような少量の血液から、その培養の可否を速やかに判定することができる。
【００２４】
また、発現率の測定は通常の技術であれば好適に用いることができる。
すなわち、本発明の判定方法は、例えば抗体試薬などを用いてＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）などのフローサイトメーターで簡便に行うことが可能である。
以下、本発明の判定方法手順を具体的に説明する。
【００２５】
Ａ．末梢血単核球を用いて判定する場合
まず、患者から採血する。採血方法は、通常用いられる注射器や真空採血管等を用いて行うことができる。採血量としては２〜３ｍＬ程度あれば良い。
【００２６】
次に、その末梢血から末梢血単核球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ、以下ＰＢＭＣという）を採取する。採取する方法としては従来公知の方法を用いることができるが、例えば密度勾配遠心分離法などを用いることで容易に行うことができる。量としては１×１０＾５〜２×１０＾５個程度の細胞数得られれば良い。
【００２７】
次に採取したＰＢＭＣをあらかじめ表面マーカーの抗体試薬を分注しておいたエッペンチューブ等に加えて染色する。抗体としては、抗γδＴ細胞受容体（γδＴＣＲ）、抗ＣＤ２７、抗ＣＣＲ７、抗ＣＤ４５ＲＡの抗体試薬を用いる。更に抗ＣＤ３抗体を用いて染色を行っても良い。
【００２８】
上記抗体試薬を用いて染色した細胞をフローサイトメーターを用いてそのＣＤ４５ＲＡ陽性細胞の割合を測定する。その割合が４０％以上の患者については、γδＴ細胞を治療に必要な程度の細胞数まで増殖させることができないと予測できる。
【００２９】
Ｂ．全血から溶血して判定する場合。
まず、上記ＰＢＭＣを用いる場合と同様にして患者から採血する。採血量としては全血として１００μＬ〜５００μＬ程度あれば良い。その後の手順も上記Ａと同様に行えば良い。
【００３０】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明する。ただし、本発明がこれに限定されるものでないことは言うまでもない。
【実施例１】
【００３１】
まず、被験者１５名の採血を行った。
１．検査サンプルの調整（全血からＰＢＭＣを分離する方法）
採血はヘパリン採血で行い、５ｍＬ採血した。
各サンプルとしてＰＢＭＣをフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）、シグマ社製）により分離、回収した。
各サンプル中のγδＴ細胞のサブセットを測定するために以下の４種の抗体試薬を使用した。
１．抗ＴＣＲＶγ９−ＦＩＴＣ（抗γδＴＣＲ抗体）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）
２．抗ＣＤ２７−ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）
３．抗ＣＤ３−ＥＣＤ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）
４．抗ＣＤ４５ＲＡ−ＰＣ５（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）
各エッペンドルフチューブに１〜４の抗体試薬をそれぞれ５μＬ分注した。次いで、先に得たＰＢＭＣ２×１０＾５個を抗体分注済みのチューブに入れ、Ｖｏｒｔｅｘで振盪し、振盪後、４℃、暗所にて３０分静置した。
その後、ＰＦＡ（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）０．５％入りＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を５００μＬ添加し、Ｖｏｒｔｅｘにて振盪した。
【００３２】
２．検査サンプルの調整（全血から赤血球を溶血させる方法）
先に得た全血１００μＬを抗体分注済みのチューブに入れ、Ｖｏｒｔｅｘで振盪した。振盪後、室温（２０℃〜２５℃程度）の暗所にて１５分静置した。その後Ｏｐｔｉｌｙｓｅ Ｃ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を５００μＬずつ添加し、更にＶｏｒｔｅｘで振盪し、室温、暗所にて１０分静置した。
次いでＰＢＳを５００μＬ添加しＶｏｒｔｅｘにて振盪した。その後、遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）にて４５０Ｇで５分遠心分離を行った。
分離後の上清を捨て、細胞画分にＰＦＡ０．５％入りＰＢＳを５００μＬ添加し、Ｖｏｒｔｅｘにて振盪した。
【００３３】
３．フローサイトメーターによる測定
上記１．又は２．の手法により調整した、各被験者のサンプルを、フローサイトメーターを用いて表面マーカー（ＣＤ４５、ＣＤ２７、ＣＤ３、ＴＣＲ）の測定を行った。
【００３４】
４．培養による検証
その後、各サンプルの血液を従来と同様の方法で、ＰＢＭＣにビスホスホネート系骨代謝改善薬のゾレドロン酸ナトリウム・水和物（Ｚｏｍｅｔａ（登録商標）、ノバルティスファーマ）及びＩＬ−２を添加してγδＴ細胞の培養を行った。
【００３５】
５．結果
上記培養の結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】
表１には、培養結果により増殖不良の被験者群Ａと増殖良好の被験者群Ｂとに分けて表示してある。
表１中、Ａ群９例中８例で全γδＴ細胞中のＣＤ４５ＲＡ陽性γδＴ細胞の割合がすべて４０％以上であり、γδＴ細胞の培養後の増殖率も低くなっている。１例については、ＣＤ４５ＲＡ陽性γδＴ細胞の割合が４０％よりも低いものの（１６％）、増殖率は低いまま（２８％）となっているが、これは当該被験者の体質的な要因によるものと判断した。
他方、Ｂ群８例はすべて全γδＴ細胞中のＣＤ４５ＲＡ陽性γδＴ細胞の割合が４０％以下であり、γδＴ細胞の増殖率も非常に高いものとなっている。
【００３８】
以上の結果から、ほとんどの場合において、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞の割合が４０％以上の群は、γδＴ細胞を治療に必要なレベルまで増殖させることができず、また反対に４０％以下の群では、すべて効率よく増殖し、治療に用いることができるということが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
以上説明したように、本発明のγδＴ細胞増殖能判定方法は、従来よりも格段に短い期間で培養予測を行うことができ、かつその精度も従来よりも高いものである。これにより、γδＴ細胞を用いた治療ができるかどうかを速やかに判断できるので、治療開始を早めることができ、かつ治療できないと判断した場合も、γδＴ細胞療法以外の治療を速やかに検討することができる。これにより、治療の質をも向上させることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γδＴ細胞培養のための増殖能判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本人の最も多い死亡原因として悪性新生物（以下、がんという）が挙げられる。がんの治療法としては、三大療法と言われる外科療法、化学療法、放射線療法があるが、夫々治療の困難性や副作用等といった問題がある。
【０００３】
近年、上記三大療法の他にがんの新しい治療法として免疫細胞療法が行われており、この免疫細胞療法は、上記の三大療法のような治療の困難性や副作用といった問題が少ないため注目されている。
【０００４】
この免疫細胞療法の中に、ＬＡＫ（ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｌｌｅｒ；リンフォカイン活性化キラー）療法というＴ細胞もしくはＮＫ細胞を活性化させる療法がある。Ｔ細胞は、αβ型のＴＣＲ（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を発現するαβＴ細胞とγδ型のＴＣＲを発現するγδＴ細胞との２種類があり、Ｔ細胞を活性化するＬＡＫ療法の主流は主にαβＴ細胞を活性化させる療法である。ここで、αβＴ細胞は獲得免疫を中心に担っているＴ細胞のことである。
【０００５】
一方、γδＴ細胞は、自然免疫を担う細胞である。最近ではがん細胞に対して細胞傷害活性（非特異的活性）を有することがわかり（例えば、非特許文献１及び非特許論文２）、このγδＴ細胞の有する強い抗腫瘍活性を利用したγδＴＬＡＫ免疫療法の研究が行われている（例えば、非特許文献３、非特許文献４及び非特許文献５）。
【０００６】
【非特許文献１】Ｈｕｍａｎ γδＴ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ （Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｐａｔｈｏｌ， ２００６， ４６（１）： １１−２３）
【非特許文献２】Ｖγ９Ｖδ２Ｔｃｅｌｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃｅｌｌｓ （Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２００５， １７５： ５４８１−８８）
【非特許文献３】Ｐｈｏｓｐｈｏｓｔｉｍ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ γδＴ Ｃｅｌｌｓ Ｋｉｌｌ Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｒｅｎａｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ （Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２００５， １７４： １３３８−１３４７）
【非特許文献４】Ｅｆｆｅｃｔｏｒ γδＴ ｃｅｌｌｓ ａｓ ｉｍｍｕｎｅ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ｚｏｌｅｄｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅｍｙｅｌｏｍａ （Ｌｕｋｅｍｉａ， ２００５， １９（４）： ６６４−７０）
【非特許文献５】Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ γδ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ ｚｏｌｅｄｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎ ｖｉｖｏ （Ｂｌｏｏｄ， ２００３， １０２（６）： ２３１０−１）
【０００７】
しかしながら、γδＴ細胞は通常、末梢血中に１〜５％しか存在しないため、少量の血液を採取してγδＴ細胞を活性化及び／又は増殖させても治療に十分な純度及び細胞数を確保することができない場合がある。この場合、治療に十分な純度及び細胞数を確保するために患者からの採血量を多くすると、患者に多大な負担がかかるといった問題もある。さらに、患者によっては以前に受けた種々の治療のため、γδＴ細胞が全く増殖しない場合もある。
【０００８】
したがって、がん患者ではγδＴＬＡＫ免疫療法によって満足な抗腫瘍効果を得るためには患者の末梢血から十分量の活性化γδＴ細胞が回収できることが治療の成功の鍵となり、治療前に少量の患者末梢血を用いてγδＴ細胞の増殖程度を判定することにより、この治療の適応性を決めることができれば患者の負担を少なくして、治療効果が期待できる適切なγδＴＬＡＫ免疫療法細胞を受けることが可能となる。
しかしながら、現状ではγδＴ細胞を用いた治療ができるかどうかは、実際に培養してみてはじめてわかるものであり、そうすると培養（治療）可能かどうか判定できるまで通常１週間〜２週間程度かかってしまう。
また、培養は技術者の手によるものなので、各技術者の有する技術次第で培養の結果も変わってしまうという問題もあり、その培養の可否を判断するための信頼性の高い手法というものがないという問題がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、簡便かつ迅速に、そして精度良く、γδＴ細胞を実際に培養する前にその増殖能を判断することができる技術を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、γδＴ細胞の表面に発現している表面マーカーのＣＤ（ＣＤ；Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；白血球分化抗原）４５ＲＡに着目し、その発現率によって、その後のγδＴ細胞の培養の可否を判定できることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
具体的には本発明は、以下の（１）〜（５）に関するものである。
（１）血液中のγδＴ細胞集団において、γδＴ細胞増殖能判定因子を表面に発現している細胞の割合を測定する工程と、前記発現している細胞の割合が全体の４０％以上かどうかを判定する工程と、を具備することを特徴とするγδＴ細胞培養における事前増殖能判定方法；
（２）前記γδＴ細胞増殖能判定因子を発現している細胞がＣＤ４５ＲＡ陽性細胞であることを特徴とする（１）に記載のγδＴ細胞の増殖能判定方法；
（３）前記ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が、ａ）ＣＤ４５ＲＡ陽性及びＣＤ２７陰性もしくはＣＣＲ７陰性細胞である最終分化メモリーγδＴ細胞；ＴｅｍｒａγδＴ細胞と、ｂ）ＣＤ４５ＲＡ陽性及びＣＤ２７陽性もしくはＣＣＲ７陽性細胞であるナイーブγδＴ細胞；ＴｎａｉｖｅγδＴ細胞と、からなることを特徴とする（２）に記載のγδＴ細胞の増殖能判定方法；
（４）末梢血から末梢血単核球を採取する工程と、前記末梢血単核球を抗γδＴＣＲ， 抗ＣＤ４５ＲＡ，抗ＣＤ２７及び／又は抗ＣＣＲ７抗体で染色し、血中のγδＴ細胞における表面マーカーの割合を測定する工程と、前記測定において、ａ）ＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ２７又はＣＣＲ７陰性細胞である最終分化メモリーγδＴ細胞；ＴｅｍｒａγδＴ細胞と、ｂ）ＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ２７もしくはＣＣＲ７陽性細胞であるナイーブγδＴ細胞；ＴｎａｉｖｅγδＴ細胞と、の割合の合計を測定する工程と、前記ＴｅｍｒａγδＴ細胞とＴｎａｉｖｅγδＴ細胞との割合が４０％以下の場合に増殖可能であると判定する工程と、を具備することを特徴とするγδＴ細胞培養増殖能判定方法；
（５）（４）に記載の判定方法を行うためのキット。
【００１２】
従来は、γδＴ細胞の培養が可能であるかどうかを１，２週間程度かけて実際に培養して判断していたが、本発明の技術によれば、培養を行わずに少量の採血を行うだけで、採血を行ったその当日には増殖可能かどうか、すなわちγδＴ細胞による治療が可能かどうかを判断することができる。また培養を行う必要もないので、医療を提供する側としてはコストも削減できる。
また患者の立場としては、少量の採血量のため身体の負担なく、かつ、時間を無駄にすることなく、γδＴ細胞療法を採用することができるかどうかを判断することが可能となる。
【発明の効果】
【００１３】
以上のことから、本発明の診断方法を用いることにより、従来であれば１週間〜２週間程度要していた患者のγδＴ細胞増殖能の判定を、採血した当日に判定することが可能であり、その判定精度も格段に向上する。また、時間的にも費用的にもそのコストを削減することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００１５】
本発明に係るγδＴ細胞の増殖能判定方法（以下本発明の方法ともいう）は、微量の血液からγδＴ細胞のγδＴ細胞増殖判定因子である表面マーカーの割合を測定し、その測定値にしたがって、がん治療等の治療に対して必要なだけのγδＴ細胞を増殖させることが可能であるかを判定するものである。
ここで、増殖能判定因子とは、細胞表面マーカーのＣＤ４５ＲＡを指す。
【００１６】
すなわち、本発明の方法は、血中のγδＴ細胞集団において、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞の割合を測定し、その割合が４０％以下であるかどうかで、その後のγδＴ細胞の培養が可能であるかどうかを判定するものである。
【００１７】
ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞の割合が４０％以下、好ましくは概ね３０％以下であれば、治療に必要な細胞数まで培養可能であると判定でき、逆に４０％以上、好ましくは概ね５０％以上であると、実際に培養しても培養不良となり、γδＴ細胞療法ができないものと判定できる。
【００１８】
具体的な手法としては、検体から採血した微量の血液から末梢血単核球を採取し、その中のγδＴ細胞を検出する。そのγδＴ細胞集団において、ＣＤ４５ＲＡの発現率を測定する。
【００１９】
ここで、γδＴ細胞集団はＣＤ４５ＲＡ陽性のナイーブγδＴ細胞とＣＤ４５ＲＡ陰性のメモリーγδＴ細胞の２つの集団に分けられる。
更に、ＣＤ４５ＲＡ陽性γδＴ細胞としては、ＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ２７陰性もしくはＣＣＲ７陰性（ＣＤ４５ＲＡ＋ ＣＤ２７−／ＣＣＲ７−）細胞である最終分化メモリーγδＴ細胞（以下ＴｅｍｒａγδＴ細胞という）と、ＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ２７陽性もしくはＣＣＲ７陽性（ＣＤ４５ＲＡ＋・ＣＤ２７＋／ＣＣＲ７＋）細胞であるナイーブγδＴ細胞（以下ＴｎａｉｖｅγδＴ細胞という）の２つのサブセットに分けられる。
【００２０】
ＣＤ４５ＲＡ陰性γδＴ細胞細胞としては、ＣＤ４５ＲＡ陰性かつＣＤ２７陰性もしくはＣＣＲ７陰性（ＣＤ４５ＲＡ− ＣＤ２７−／ＣＣＲ７−）細胞であるエフェクターメモリーγδＴ細胞（以下ＴｅｍγδＴ細胞という）と、ＣＤ４５ＲＡ陰性かつＣＤ２７陽性もしくはＣＣＲ７陽性（ＣＤ４５ＲＡ− ＣＤ２７＋／ＣＣＲ７＋）細胞であるセントラルメモリーγδＴ細胞（以下ＴｃｍγδＴ細胞という）の２つのサブセットに分類される。
【００２１】
本発明者らは、血中のγδＴ細胞集団において、この２種類のＣＤ４５ＲＡ陽性細胞、すなわちＴｅｍｒａγδＴ細胞とＴｎａｉｖｅγδＴ細胞の割合が多いと、γδＴ細胞が増殖できないということを見出した。
具体的な基準としては、上記ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞の割合が４０％以上の場合、その患者の血液ではγδＴ細胞が、効果的な疾病治療のために必要な程度の量まで増殖することができないと判断する。
【００２２】
治療適用可能な疾病としては、がん、ウイルス感染症等の難治性疾患が挙げられる。
本発明により判定可能ながんの種類としては種々のがんに対して用いることができるが、好ましくは固形がんに好適に用いられる。具体的な例としては以下のがん等があげられる。
メラノーマ、結腸がん、大腸がん、顆粒膜細胞腫瘍、肺がん、乳がん、肝臓がん、腎臓がん、子宮頚がん、前立腺がん、胃がん、膵がん、卵巣がん等
【００２３】
測定に使用する血液の量としては１００μＬ〜３ｍＬ程度あれば良い。使用する量は測定する時の血液の状態により、例えば全血を用いて赤血球を溶血し、そこに表面マーカー抗体試薬を用いて染色する場合には１００μＬ〜５００μＬ程度あれば良い。また、末梢血単核球を用いて染色、測定する場合には２〜３ｍＬ程度あれば良い。
この程度の採血量であれば、患者への負担も軽減することができる。また、本発明の方法であれば、たとえγδＴ細胞の血中量が少ない患者であっても、このような少量の血液から、その培養の可否を速やかに判定することができる。
【００２４】
また、発現率の測定は通常の技術であれば好適に用いることができる。
すなわち、本発明の判定方法は、例えば抗体試薬などを用いてＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）などのフローサイトメーターで簡便に行うことが可能である。
以下、本発明の判定方法手順を具体的に説明する。
【００２５】
Ａ．末梢血単核球を用いて判定する場合
まず、患者から採血する。採血方法は、通常用いられる注射器や真空採血管等を用いて行うことができる。採血量としては２〜３ｍＬ程度あれば良い。
【００２６】
次に、その末梢血から末梢血単核球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ、以下ＰＢＭＣという）を採取する。採取する方法としては従来公知の方法を用いることができるが、例えば密度勾配遠心分離法などを用いることで容易に行うことができる。量としては１×１０＾５〜２×１０＾５個程度の細胞数得られれば良い。
【００２７】
次に採取したＰＢＭＣをあらかじめ表面マーカーの抗体試薬を分注しておいたエッペンチューブ等に加えて染色する。抗体としては、抗γδＴ細胞受容体（γδＴＣＲ）、抗ＣＤ２７、抗ＣＣＲ７、抗ＣＤ４５ＲＡの抗体試薬を用いる。更に抗ＣＤ３抗体を用いて染色を行っても良い。
【００２８】
上記抗体試薬を用いて染色した細胞をフローサイトメーターを用いてそのＣＤ４５ＲＡ陽性細胞の割合を測定する。その割合が４０％以上の患者については、γδＴ細胞を治療に必要な程度の細胞数まで増殖させることができないと予測できる。
【００２９】
Ｂ．全血から溶血して判定する場合。
まず、上記ＰＢＭＣを用いる場合と同様にして患者から採血する。採血量としては全血として１００μＬ〜５００μＬ程度あれば良い。その後の手順も上記Ａと同様に行えば良い。
【００３０】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明する。ただし、本発明がこれに限定されるものでないことは言うまでもない。
【実施例１】
【００３１】
まず、被験者１５名の採血を行った。
１．検査サンプルの調整（全血からＰＢＭＣを分離する方法）
採血はヘパリン採血で行い、５ｍＬ採血した。
各サンプルとしてＰＢＭＣをフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）、シグマ社製）により分離、回収した。
各サンプル中のγδＴ細胞のサブセットを測定するために以下の４種の抗体試薬を使用した。
１．抗ＴＣＲＶγ９−ＦＩＴＣ（抗γδＴＣＲ抗体）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）
２．抗ＣＤ２７−ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）
３．抗ＣＤ３−ＥＣＤ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）
４．抗ＣＤ４５ＲＡ−ＰＣ５（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）
各エッペンドルフチューブに１〜４の抗体試薬をそれぞれ５μＬ分注した。次いで、先に得たＰＢＭＣ２×１０＾５個を抗体分注済みのチューブに入れ、Ｖｏｒｔｅｘで振盪し、振盪後、４℃、暗所にて３０分静置した。
その後、ＰＦＡ（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）０．５％入りＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を５００μＬ添加し、Ｖｏｒｔｅｘにて振盪した。
【００３２】
２．検査サンプルの調整（全血から赤血球を溶血させる方法）
先に得た全血１００μＬを抗体分注済みのチューブに入れ、Ｖｏｒｔｅｘで振盪した。振盪後、室温（２０℃〜２５℃程度）の暗所にて１５分静置した。その後Ｏｐｔｉｌｙｓｅ Ｃ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を５００μＬずつ添加し、更にＶｏｒｔｅｘで振盪し、室温、暗所にて１０分静置した。
次いでＰＢＳを５００μＬ添加しＶｏｒｔｅｘにて振盪した。その後、遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）にて４５０Ｇで５分遠心分離を行った。
分離後の上清を捨て、細胞画分にＰＦＡ０．５％入りＰＢＳを５００μＬ添加し、Ｖｏｒｔｅｘにて振盪した。
【００３３】
３．フローサイトメーターによる測定
上記１．又は２．の手法により調整した、各被験者のサンプルを、フローサイトメーターを用いて表面マーカー（ＣＤ４５、ＣＤ２７、ＣＤ３、ＴＣＲ）の測定を行った。
【００３４】
４．培養による検証
その後、各サンプルの血液を従来と同様の方法で、ＰＢＭＣにビスホスホネート系骨代謝改善薬のゾレドロン酸ナトリウム・水和物（Ｚｏｍｅｔａ（登録商標）、ノバルティスファーマ）及びＩＬ−２を添加してγδＴ細胞の培養を行った。
【００３５】
５．結果
上記培養の結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】
表１には、培養結果により増殖不良の被験者群Ａと増殖良好の被験者群Ｂとに分けて表示してある。
表１中、Ａ群９例中８例で全γδＴ細胞中のＣＤ４５ＲＡ陽性γδＴ細胞の割合がすべて４０％以上であり、γδＴ細胞の培養後の増殖率も低くなっている。１例については、ＣＤ４５ＲＡ陽性γδＴ細胞の割合が４０％よりも低いものの（１６％）、増殖率は低いまま（２８％）となっているが、これは当該被験者の体質的な要因によるものと判断した。
他方、Ｂ群８例はすべて全γδＴ細胞中のＣＤ４５ＲＡ陽性γδＴ細胞の割合が４０％以下であり、γδＴ細胞の増殖率も非常に高いものとなっている。
【００３８】
以上の結果から、ほとんどの場合において、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞の割合が４０％以上の群は、γδＴ細胞を治療に必要なレベルまで増殖させることができず、また反対に４０％以下の群では、すべて効率よく増殖し、治療に用いることができるということが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
以上説明したように、本発明のγδＴ細胞増殖能判定方法は、従来よりも格段に短い期間で培養予測を行うことができ、かつその精度も従来よりも高いものである。これにより、γδＴ細胞を用いた治療ができるかどうかを速やかに判断できるので、治療開始を早めることができ、かつ治療できないと判断した場合も、γδＴ細胞療法以外の治療を速やかに検討することができる。これにより、治療の質をも向上させることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液中のγδＴ細胞集団において、γδＴ細胞増殖能判定因子を表面に発現している細胞の割合を測定する工程と、
前記発現している細胞の割合が全体の４０％以上かどうかを判定する工程と、
を具備することを特徴とするγδＴ細胞培養における事前増殖能判定方法。
【請求項２】
前記γδＴ細胞増殖能判定因子を発現している細胞がＣＤ４５ＲＡ陽性細胞であることを特徴とする請求項１に記載のγδＴ細胞の増殖能判定方法。
【請求項３】
前記ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が、
ａ）ＣＤ４５ＲＡ陽性及びＣＤ２７陰性もしくはＣＣＲ７陰性細胞である最終分化メモリーγδＴ細胞；ＴｅｍｒａγδＴ細胞と、
ｂ）ＣＤ４５ＲＡ陽性及びＣＤ２７陽性もしくはＣＣＲ７陽性細胞であるナイーブγδＴ細胞；ＴｎａｉｖｅγδＴ細胞と、
からなることを特徴とする請求項２に記載のγδＴ細胞の増殖能判定方法。
【請求項４】
末梢血から末梢血単核球を採取する工程と、
前記末梢血単核球を抗γδＴＣＲ， 抗ＣＤ４５ＲＡ，抗ＣＤ２７及び／又は抗ＣＣＲ７抗体で染色し、血中のγδＴ細胞における表面マーカーの割合を測定する工程と、
前記測定において、ａ）ＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ２７又はＣＣＲ７陰性細胞である最終分化メモリーγδＴ細胞；ＴｅｍｒａγδＴ細胞と、
ｂ）ＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ２７陽性もしくはＣＣＲ７陽性細胞であるナイーブγδＴ細胞；ＴｎａｉｖｅγδＴ細胞と、の割合の合計を測定する工程と、
前記ＴｅｍｒａγδＴ細胞とＴｎａｉｖｅγδＴ細胞との割合が４０％以下の場合に増殖可能であると判定する工程と、
を具備することを特徴とするγδＴ細胞培養増殖能判定方法。
【請求項５】
請求項４に記載の診断方法を行うためのキット。
【請求項１】
血液中のγδＴ細胞集団において、γδＴ細胞増殖能判定因子を表面に発現している細胞の割合を測定する工程と、
前記発現している細胞の割合が全体の４０％以上かどうかを判定する工程と、
を具備することを特徴とするγδＴ細胞培養における事前増殖能判定方法。
【請求項２】
前記γδＴ細胞増殖能判定因子を発現している細胞がＣＤ４５ＲＡ陽性細胞であることを特徴とする請求項１に記載のγδＴ細胞の増殖能判定方法。
【請求項３】
前記ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が、
ａ）ＣＤ４５ＲＡ陽性及びＣＤ２７陰性もしくはＣＣＲ７陰性細胞である最終分化メモリーγδＴ細胞；ＴｅｍｒａγδＴ細胞と、
ｂ）ＣＤ４５ＲＡ陽性及びＣＤ２７陽性もしくはＣＣＲ７陽性細胞であるナイーブγδＴ細胞；ＴｎａｉｖｅγδＴ細胞と、
からなることを特徴とする請求項２に記載のγδＴ細胞の増殖能判定方法。
【請求項４】
末梢血から末梢血単核球を採取する工程と、
前記末梢血単核球を抗γδＴＣＲ， 抗ＣＤ４５ＲＡ，抗ＣＤ２７及び／又は抗ＣＣＲ７抗体で染色し、血中のγδＴ細胞における表面マーカーの割合を測定する工程と、
前記測定において、ａ）ＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ２７又はＣＣＲ７陰性細胞である最終分化メモリーγδＴ細胞；ＴｅｍｒａγδＴ細胞と、
ｂ）ＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ２７陽性もしくはＣＣＲ７陽性細胞であるナイーブγδＴ細胞；ＴｎａｉｖｅγδＴ細胞と、の割合の合計を測定する工程と、
前記ＴｅｍｒａγδＴ細胞とＴｎａｉｖｅγδＴ細胞との割合が４０％以下の場合に増殖可能であると判定する工程と、
を具備することを特徴とするγδＴ細胞培養増殖能判定方法。
【請求項５】
請求項４に記載の診断方法を行うためのキット。
【公開番号】特開２００８−２７５３９７（Ｐ２００８−２７５３９７Ａ）
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１１７７４５（Ｐ２００７−１１７７４５）
【出願日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１８年１１月１６日 アメリカ血液学会発行の「ブラッド アメリカ血液学会誌 第１０８刊 第１１号」に発表
【出願人】（５９８０８６８４４）株式会社メディネット (10)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１８年１１月１６日 アメリカ血液学会発行の「ブラッド アメリカ血液学会誌 第１０８刊 第１１号」に発表
【出願人】（５９８０８６８４４）株式会社メディネット (10)
【Ｆターム（参考）】
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