がん幹細胞マーカーおよびその使用
本発明は特に、がん幹細胞および関係のある疾患の処置のための腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する剤の使用に基づく治療方法に関係する。腫瘍関連炭水化物抗原をがん幹細胞のマーカーとして使用する診断および予後判定の方法も提供される。例えば、本発明により、腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞の処置で使用するための、該腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤が提供される。がん幹細胞に影響を与える処置であって、腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤による処置、に感受性である該がん幹細胞を含むがんを同定する方法もまた提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は特に、がん幹細胞および関係のある疾患の処置のための腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する剤（ａｇｅｎｔ）の使用に基づく治療方法に関係する。腫瘍関連炭水化物抗原をがん幹細胞のマーカーとして使用する診断および予後判定の方法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
腫瘍は、蓄積された変異を通じて無限増殖能を獲得した腫瘍原性がん細胞によって開始される、異常臓器と見なすことができる。このように腫瘍を異常臓器と見なすと、正常幹細胞の生物学の原理を適用して腫瘍が発生および播種する方法をより良好に理解することができる。多くの観察が、正常幹細胞と腫瘍原性細胞との間の類似性が適切であることを示唆している。正常幹細胞および腫瘍原性細胞のどちらも、広範な増殖ポテンシャルおよび新しい（正常または異常な）組織を生じさせる能力を有する。腫瘍原性細胞は、正常幹細胞が経験する臓器形成プロセスに類似した、異常なおよび制御が不十分な臓器形成プロセスを経験する、がん幹細胞（ＣＳＣ）またはがん開始細胞（ＣＩＣ−用語ＣＳＣおよびＣＩＣは本明細書で同義語として使用される）と考えることができる。腫瘍および正常組織はどちらも、異なる表現型の特徴および異なる増殖ポテンシャルを持つ細胞の不均質の組合せで構成されている。
【０００３】
がん幹細胞は、腫瘍性クローンを開始および維持する、幹細胞様特性を持つ腫瘍細胞のある部分であると考えられている。これらの細胞は、自己再生する能力を有するが、表現型が多様ながん細胞を生じるが、より低い腫瘍原性ポテンシャルを持つ前駆体も生じさせる。幹細胞様細胞のこの亜集団は、がん幹細胞ではない腫瘍細胞と比較して、腫瘍形成および転移性腫瘍拡散に効果がある細胞である。
【０００４】
がん幹細胞（ＣＳＣ）は、白血病、神経膠芽腫、髄芽腫、およびほぼすべての種類の上皮腫瘍（癌腫）を含む多種多様のがんで今や同定されている。
【０００５】
がん幹細胞（ＣＳＣ）が通常、がん個体発生の必要条件であるという理論は、今は広く受け入れられている。がん幹細胞は低い増殖速度、高い自己再生能、活発に増殖する腫瘍細胞に分化する性向を呈し、化学療法または放射線に耐性を示す（たとえばＶａｎ ｄｅｒ Ｇｒｉｅｎｄら、２００８を参照）。
【０００６】
がん幹細胞は、原発性腫瘍内の別個の表面マーカーパターンの調査に基づいて特徴付けることができる。これまでにますます多く提案されているＣＳＣマーカーのうち、２つ：ＣＤ４４およびＣＤ１３３が最も突出して受け入れられていて、また異なる腫瘍タイプのＣＳＣのうちで広く分布している。ＣＤ４４は、がん幹細胞の頑強なマーカーとして報告された（Ｃｈｕら、２００９；Ｔａｋａｉｓｈｉら、２００９）。結腸直腸腫瘍からの単一のＣＤ４４＋細胞は、インビトロで球を形成することが可能であり、原発性腫瘍の特性に似た異種移植腫瘍を生成することができた（Ｄｕら、２００８）。ＣＤ１３３もがん幹細胞のマーカーである。ＣＤ１３３は、ヒト造血幹細胞に特異的な表面抗原として、ならびにマウス神経上皮および複数の他の胚上皮のマーカーとして最初に記載された（Ｓｉｎｇｈら、２００４）。いくつかの最近の研究において、単独のまたは他のマーカーと組合せたＣＤ１３３が結腸、肺および肝臓の悪性腫瘍からのがん幹細胞の単離に使用された（Ｈａｒａｇｕｃｈｉら、２００８）。ＣＤ１３３＋腫瘍細胞は、放射線誘起ＤＮＡ損傷をＣＤ１３３−腫瘍細胞よりも効果的に修復する（Ｂａｏら、２００６）。
【０００７】
がん幹細胞の存在はがん療法に深い意味を有する。既存の療法が主として腫瘍細胞のバルク集団に対して開発されてきたのは、その療法が腫瘍塊を収縮させるその能力によって同定されるためである。しかしがん幹細胞は化学療法に耐性であることが多く、化学療法の失敗をもたらし得る（Ｓｅｌｌら、２００８）。がん開始細胞（本明細書ではがん幹細胞とも呼ばれる）を（も）標的とする新規治療剤を設計するためには、好ましくは良性腫瘍および／または正常な非腫瘍細胞に存在しない、ならびに同時にがん幹細胞に対して特異的に向けられたがん幹細胞の分子標的（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔ）を探求することが所望される。このような剤は、腫瘍の、ならびにとりわけ転移性腫瘍のより永続的な応答および治癒を生じることが予想される。ゆえに、療法を改善するための新規治療標的を提供する新たながん幹細胞マーカーが求められている。公知の幹細胞マーカーの大半はタンパク質である。この多くは、正常幹細胞マーカーであることも見出され、そのため非腫瘍幹細胞で発現される。これによりこれらは治療標的としては好適ではないか、または少なくともあまり好適ではない。現在、正常幹細胞マーカーとがん幹細胞マーカーとの明確な区別はない。
【０００８】
そのためさらなる好適ながん幹細胞マーカーを同定できること、ならびにこれらのマーカーを診断および予後判定の方法に、ならびに／またはがん幹細胞を標的とする療法の開発に使用できることが大いに所望される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、腫瘍関連炭水化物抗原が好適ながん幹細胞マーカーであるという発見に基づく。これまで記載されたほとんどすべてのがん幹細胞マーカーがタンパク質であるので、腫瘍関連炭水化物抗原、たとえばＣＤ１７６、ＣＤ１７４およびＣＤ１７３などががん幹細胞で発現されることが見出されたのは非常に驚きであった。そのためこれらの腫瘍関連炭水化物抗原は、がん幹細胞に好適なマーカーであり、そのほかにがん幹細胞を攻撃する療法に好適な治療標的を提供する。
【００１０】
本発明の第１の態様により、腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞の処置で使用するための上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤が提供される。上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞の処置で使用するためのそれぞれの結合剤を含む、薬学的組成物も提供される。
【００１１】
第２の態様により、腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤による処置（ここで、上記処置はがん幹細胞に影響を与える）に感受性であるがん幹細胞を含む、がんを同定するための方法であって、上記方法は、患者から取得したがん検体が、結合剤が特異的である上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞を含むかどうかを決定する工程を含み、ここで、がん幹細胞における上記腫瘍関連炭水化物抗原の存在は、上記がんが、上記腫瘍関連炭水化物抗原に特異的に結合する上記結合剤による処置にがんが感受性であることを示し、かつ、ここで、上記処置はがん幹細胞に影響を与える、方法が提供される。
【００１２】
第３の態様により、患者から単離された検体中の細胞における腫瘍関連炭水化物抗原の発現を分析する工程を含む、がんを診断、病期分類および／もしくは予後を判定するならびに／または処置に対する感受性を監視するための方法であって、ここで、上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現する細胞の存在は、上記検体中のがん幹細胞の存在を示す、方法が提供される。
【００１３】
第４の態様により、哺乳動物がん幹細胞の組成物が提供され、ここで、上記組成物中の上記細胞の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％が、腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞である。関係のある態様により、腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞の選択的富化を含む、がん幹細胞を単離するための方法が提供される。
【００１４】
第５の態様により、本発明による方法で使用するための、腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤および説明書を含む、本発明による方法で使用するためのキットが提供される。
【００１５】
第６の態様により、腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞に対する有効性について、候補治療剤、たとえば化学療法剤または別の抗がん薬をスクリーニングするための方法が提供され、上記方法は：
ａ．上記剤を本発明による細胞組成物と接触させる工程、および
ｂ．上記腫瘍関連炭水化物抗原陽性がん細胞に対する上記剤の有効性を決定する工程、を含む。
【００１６】
本発明の他の目的、特徴、利点および態様は、以下の記載および添付の特許請求の範囲から当業者に明らかになる。しかし本出願の好ましい実施形態を示す以下の記載、添付の特許請求の範囲、および特定の実施例は、例証のためのみに与えられていることを理解すべきである。開示した発明の精神および範囲の中での各種の変更および修正は、以下を読めば当業者に容易に明らかになる。
【００１７】
定義
本明細書で使用する場合、以下の表現は概して、これらが使用される文脈が別途示す範囲を除いて、好ましくは以下で述べる意味を有することを意図する。
【００１８】
「結合剤」は、標的物質、例として腫瘍関連炭水化物抗原を結合することが可能な任意の化合物または化合物の複合体であり得る。好ましくは、上記結合剤は上記標的物質を特異的に結合することが可能である。好適な結合剤は、上記標的物質に結合する結合剤を同定／取得するために結合剤ライブラリをスクリーニングすることによって取得され得る。それぞれの結合剤ライブラリの例は、たとえば上記結合剤をディスプレイするファージまたはファージミドライブラリである。たとえば抗体をインビボで取得するための方法は、ＨｕｄｓｏｎおよびＳｏｕｒｉａｕによっても記載されている（Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ Ｓｏｕｒｉａｕ，Ｃ．（２００３）“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９，１２９−１３４）。
【００１９】
上記結合剤は、これらが標的物質、ここでは腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に認識および結合できる限り、任意の構造を有し得る。結合剤は、抗体、その抗原結合フラグメントもしくは誘導体または結合機能を提供するタンパク質骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を有する結合剤、たとえばアンチカリンもしくはレクチンなどから成る群より選択され得る。結合剤は、結合機能を提供するペプチドまたは融合タンパク質でもあり得る。抗体と同様の結合機能を有する結合剤の概要は、Ｈｅｙらにおいて与えられている（Ｈｅｙら（２００５）“Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ，ｎｏｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（１０），５１４−５２２）。抗体誘導体は、たとえば改変アミノ酸配列を除いて同じ結合機能を有する、抗体または抗体フラグメントも含む。
【００２０】
「抗体」という用語は詳細には、ジスルフィド結合によって結合した少なくとも２個の重鎖および２個の軽鎖を含むタンパク質を指す。「抗体」という用語は、天然に存在する抗体ならびに抗体のすべての組換え形態、たとえば原核生物中で発現された抗体、非グリコシル化抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）で構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成されている。上記重鎖定常領域は、３個またはＩｇＭもしくはＩｇＥ型の抗体の場合には４個の重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）を含み、ここで、第１の定常ドメインＣＨ１は可変領域に隣接して、ヒンジ領域によって第２の定常ドメインＣＨ２に結合され得る。上記軽鎖定常領域は、１個の定常ドメインのみより成る。上記可変領域は、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が散在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超変異性の領域にさらに細分することができ、ここで、各可変領域は３個のＣＤＲおよび４個のＦＲを含む。上記重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の各種の細胞（たとえばエフェクタ細胞）および古典的な補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。ＩｇＡおよびＩｇＭ分子は通常、Ｊ鎖と共に存在するが、これに由来する、たとえばＪ鎖を持たない分子も明確に含まれる。そのほかに、本発明による「抗体」という用語は、単鎖抗体ならびに重鎖抗体、すなわち１個以上の、特に２個の重鎖のみから構成される抗体、ならびにナノボディ、すなわち単一のモノマー可変ドメインのみから構成される抗体も含む。
【００２１】
抗体の「抗原結合フラグメントまたは誘導体」は特に、抗原を結合することが可能な、たとえば、参照抗体として同じエピトープに結合することが可能な、タンパク質または糖タンパク質である。そのため抗体の抗原結合フラグメントまたは誘導体は本明細書で概して、機能性抗原結合フラグメントを指す。好ましくは、抗原結合フラグメントは、抗体全体から少なくとも２０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１００アミノ酸を含み、好ましくは抗体の結合領域を含む。特に好ましい実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントは重鎖可変領域を含む。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントによって実施し得ることが示されてきた。抗体のフラグメントの例は（ｉ）Ｆａｂフラグメント、すなわち各重鎖および軽鎖の可変領域および第１の定常ドメインから成る１価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ）２フラグメント、すなわちヒンジ領域にてたとえばジスルフィドブリッジによって共に連結された２個のＦａｂフラグメントを含む２価フラグメント；（ｉｉｉ）重鎖の可変領域および第１の定常ドメインＣＨ１から成るＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体のシングルアームの重鎖および軽鎖可変領域から成るＦｖフラグメント；（ｖ）ｓｃＦｖフラグメント、すなわち単一ポリペプチド鎖から成るＦｖフラグメント；（ｖｉ）共有結合的に共に連結された２個のＦｖフラグメントから成る、（Ｆｖ）２フラグメント；（ｖｉｉ）重鎖可変ドメイン；ならびに（ｖｉｉｉ）重鎖および軽鎖可変領域の会合が分子内ではなく分子間のみで生じ得るような様式で共有結合的に連結された重鎖可変領域および軽鎖可変領域から成る、マルチボディを含む。「抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体」という用語は、単一ドメイン抗体も包含する。異なるグリカン側鎖を持つ抗体または抗体フラグメントも、本定義によって理解される。これらの抗体フラグメントまたは誘導体は、当業者に公知の従来の技法を使用して取得することができる。
【００２２】
「特異的結合」は好ましくは、結合剤、例として抗体または抗原結合フラグメントもしくは誘導体が別の標的への結合と比較して特異的である標的、例としてエピトープにより強く結合することを意味する。剤は、第２の標的に対する解離定数（Ｋｄ）より低い解離定数を持つ第１の標的に結合する場合、第２の標的と比較して第１の標的により強く結合する。好ましくは、上記剤が特異的に結合する標的に対する解離定数は、その剤が特異的に結合しない標的に対する解離定数よりも２倍を超えて、好ましくは５倍を超えて、さらに好ましくは１０倍を超えて、なおさらに好ましくは２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍または１０００倍を超えて低い。好ましくは、特異的結合は１０μＭ以下の、さらに好ましくは３μＭ以下の、１μＭ以下の、７００ｎＭ以下の、５００ｎＭ以下の、３００ｎＭ以下の、２００ｎＭ以下の、好ましくは１００ｎＭ以下の、７０ｎＭ以下の、５０ｎＭ以下の、３０ｎＭ以下の、２０ｎＭ以下の、および最も好ましくは１０ｎＭ以下の、５ｎＭ以下の、２ｎＭ以下のまたは１ｎＭ以下の解離定数を持つ結合を指す。上記解離定数は、好ましくは標準条件下で、特に生理学的条件下で測定される。標的化合物（例としてＣＤ１７６）に特異的に結合する結合剤が上記標的化合物に結合するための特定の方法で使用される場合、結合条件は好ましくは、上記結合剤の他の化合物、特に同様の化合物（例として他の炭水化物抗原）への結合が上記方法で検出できないように、または上記標的への結合の検出および／または決定を妨害しないように選ばれる。標的構造、例として本発明による腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤は、上記標的構造が特異的に認識される限り、上記結合剤が上記標的構造以外の他の構造にも結合する実施形態も含む。たとえば「腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤」という用語は、腫瘍関連炭水化物抗原を結合し、そしてまた、上記腫瘍関連炭水化物抗原が付着する他の構造、特にキャリア分子にも結合する結合剤を含む。好ましくは他の構造、特に上記腫瘍関連炭水化物抗原のキャリア分子は、上記腫瘍関連炭水化物抗原の非存在下では上記結合剤によって結合されず、または特異的標的と比較して非特異的な結合に関して上で定義した通りである、はるかに高い解離定数によってのみ結合される。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「タンパク質」という用語は、特にアミノ酸の分子鎖または１を超えるアミノ酸鎖の複合体を指す。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸ならびに人工アミノ酸のいずれも含むことができ、生物起源または合成起源であることができる。タンパク質は、たとえばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化および／またはリン酸化によって、自然に（翻訳後修飾）または合成により改変され得る。タンパク質は少なくとも２個のアミノ酸を含むが、いずれかの特定の長さである必要はない；本用語は、任意のサイズ制限を含まない。本出願において、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は互換的に使用される。好ましくは、タンパク質は少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも５０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸を含み、最も好ましくは少なくとも１００アミノ酸である。
【００２４】
「患者」という用語は特に、本発明により、ヒト、非ヒト霊長類または別の動物、特に哺乳動物、例としてウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯動物、例としてマウスもしくはラットを意味する。特に好ましい実施形態において、患者はヒトである。
【００２５】
本発明による「がん」という用語は特に、これに限定されるわけではないが、白血病、精上皮腫、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、副腎がん、甲状腺がん、皮膚がん、脳のがん、子宮頸がん、腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）がん、肝臓がん、結腸がん、胃がん、腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）がん、頭頸部がん、消化管がん、リンパ節がん、食道がん、結腸直腸がん、膵臓がん、耳鼻および咽喉（ＥＮＴ）がん、乳がん、前立腺がん、子宮のがん、卵巣がんおよび肺がんならびにこれの転移したものを指す。がんは本明細書で使用する場合、過剰増殖状態を指す。上記用語は、悪性ならびに非悪性細胞集団を表すが、好ましくは悪性細胞を指し、それぞれ細胞集団を表すものである。このような障害は、形態学的におよび遺伝子型的に周囲組織と異なるように見えることが多い、１つ以上の細胞のサブセットの過剰な細胞増殖を有する。過剰細胞増殖は、一般集団の参照により、および／または特定の患者の、たとえばこの患者の生涯のより早い時点での参照により決定することができる。過剰増殖細胞障害は、異なる種類の動物およびヒトで発生し得、影響を受けた細胞に応じて異なる身体的徴候を生じる。
【００２６】
「腫瘍」とは特に、誤制御された細胞増殖によって形成される細胞または組織の群を意味する。腫瘍は、正常組織との、構造的構成（ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）および機能調整の部分的または完全な欠如を示し得て、通例、良性または悪性のどちらかであり得る別個の組織塊を形成し得る。特に、腫瘍という用語は悪性腫瘍を指す。１実施形態により、「腫瘍細胞」という用語は、非固形がんの細胞、例として白血病細胞も包含する。別の実施形態により、非固形がんのそれぞれの細胞は、「腫瘍細胞」という用語に包含されない。
【００２７】
「転移」とは特に、がん細胞の、最初の部位から体の別の部分へのがん細胞の拡散を意味する。転移の形成は非常に複雑なプロセスであり、通常、原発性腫瘍からのがん細胞の離脱、体循環への進入、および、体内の他の場所の正常組織内で定着して増殖することを伴う。腫瘍細胞が転移するとき、その新たな腫瘍は２次腫瘍または転移性腫瘍と呼ばれ、この細胞は通常、最初の腫瘍中の細胞と似ている。このことは、たとえば乳がんが肺に転移する場合、その２次腫瘍は異常な肺細胞からではなく、異常な乳房細胞からつくられることを意味する。上記肺の腫瘍は次に、肺がんではなく、転移性乳がんと呼ばれる。
【００２８】
本発明により、がんの「病期分類」は、好ましくはがんの進行および程度の分類を指す。好ましいがん病期分類システムは、悪性腫瘍のＴＮＭ分類であり、ここで、Ｔは上記腫瘍のサイズおよび付近の組織を浸潤したかどうかを記載し、Ｎは関与している領域リンパ節について記載し、Ｍは遠隔転移について記載する。これらの各パラメータは患者の状況に応じて特定の値を与えられ、ここで、一般により大きい数はより重篤な状況を示す（Ｔ（０−４）、Ｎ（０−３）、Ｍ（０／１））。加えて、より綿密な分類のために、さらなるパラメータを決定することができ、そして／または接頭辞を使用することができる。そのほかに、上記ＴＮＭ分類は、段階０から段階ＩＶまでのがんに言及する、ＵＩＣＣによるがん病期分類システムに要約され得る。
【００２９】
本発明により、「検体」は特に、これに限定されるわけではないが、組織検体、体液および／または細胞検体を指し、従来の様式によって、例としてパンチ生検を含む組織生検によって、またはがん細胞を含有するまたは含有することが疑われる血液、気管支吸引物、痰、尿、糞または他の体液もしくは組織切片、スライドなどを採取することによって取得され得る。本発明により、「検体」という用語は、それぞれの検体の部分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）または構成要素も含む。
【００３０】
「細胞増殖」または「増殖すること」という用語は、本明細書で使用する場合、特に細胞分裂による細胞の増幅を指す。
【００３１】
「がん幹細胞」という用語は、特に、これに限定されるわけではないが、インビトロでの好適な条件下で未分化細胞の凝集体、いわゆる腫瘍球を生成することが可能な細胞に関係する。球を形成する細胞は自己再生することが可能である；この細胞が解離して同じ条件下で成長すると、これが再度球を形成する。がん幹細胞はインビボでは、転移および幹細胞マーカー、例としてたとえばＣＤ４４の発現を形成するこれらのポテンシャルを特徴とする。これらは薬物耐性も提供し得る。「がん幹細胞」および「がん開始細胞」という用語は、本明細書で同義語として使用される。
【００３２】
「腫瘍関連炭水化物抗原」という用語は、特にがん細胞および／または腫瘍細胞で、特に悪性がん細胞および／または悪性腫瘍細胞で発現される炭水化物抗原を指す。
【００３３】
「腫瘍特異的炭水化物抗原」という用語は、特に、がん細胞および／または腫瘍細胞で主としてまたはなお独占的に発現され、そしてそれゆえ、非がん細胞、非腫瘍細胞では発現されない、またはごく低い程度しか発現されない炭水化物抗原を指す。好ましくは、「腫瘍特異的炭水化物抗原」という用語は、悪性がん細胞および／または悪性腫瘍細胞で主としてまたは好ましくは独占的に発現され、そしてそれゆえ、非がん細胞、非腫瘍細胞、良性がん細胞および／もしくは良性腫瘍細胞ならびに／または同じ患者の健常組織では発現されないまたはごく低い程度しか発現されない炭水化物抗原を指す。優先的に、上記腫瘍特異的炭水化物抗原は大半の正常細胞では発現されず、なおさらに好ましくは（ｍｏｒｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）数少ない正常細胞または細胞種でのみ発現され、なおさらに好ましくは（ｍｏｒｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）これらの正常細胞での発現は、たとえば厳密に頂端側のまたは密着結合の間における（ｅ．ｇ． ｓｔｒｉｃｔｌｙ ａｐｉｃａｌ ｏｒ ｉｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ）特有の局在を有するので、全身投与およびとりわけ静脈内投与された結合分子は、これらの正常細胞の抗原に到達できないか、またはほとんど到達せず、なおさらに好ましくは（ｍｏｒｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）、それは正常上皮細胞で発現されず、最も好ましくは（ｍｏｓｔ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）、それは正常細胞で発現されない。ある実施形態において、上記腫瘍特異的炭水化物抗原は、発現されたときに、キャリア分子に付着し得る。このようなキャリア分子は、特にタンパク質、ペプチドまたは炭水化物であり得る。
【００３４】
「ＣＤ１７６」は、腫瘍関連トムゼン−フリーデンライヒ抗原（ＴＦ）を指す。ＴＦは、タンパク質または糖脂質に結合することができる２つの形、ＴＦαおよびＴＦβで存在する。Ｃｏｒｅ−１は、特に腫瘍細胞中のヒドロキシアミノ酸であるセリンもしくはトレオニンまたはタンパク質にアルファ−アノマー配置でＯ−グリコシド結合している２糖のＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃである。Ｃｏｒｅ−１はＴＦα構造に相当する。この２糖は正常細胞の多くの膜糖タンパク質にて潜在性様式で見出される遍在性コア構造であるが、これの露出およびそれゆえ腫瘍細胞でのこの抗原のデノボ発生は、２、３の特異的キャリアタンパク質に限定されている。ＣＤ１７６は各種のがん細胞、例として乳房癌腫（Ｉｍａｉら、２００１；Ｇｏｌｅｔｚら、２００３）、結腸直腸癌腫（Ｃａｏら、１９９５）、肝細胞癌腫（Ｃａｏら、１９９９）、複数の白血病（Ｃａｏら、２００８）および他の種類のがんの表面で発現されることが実証されてきた。がん細胞表面のＣＤ１７６は、機能性分子実体として、上記細胞の浸潤特性および転移特性に関与する（Ｃａｏら、１９９５）。以下では、ＣＤ１７６という用語は、好ましくは腫瘍特異的Ｃｏｒｅ−１構造Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−を指す。
【００３５】
「ＣＤ１７５」は、構造ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−を持つ腫瘍関連炭水化物抗原であるＴｎ抗原を指す。これは大半の上皮がんで高いパーセンテージの症例において、および複数の白血病で発現される。これは良性腫瘍でもある程度まで発現される。ＣＤ１７５は腫瘍特異的抗原である。
【００３６】
「ＣＤ１７５ｓ」は、構造ＮｅｕＡｃα２−６ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−を持つ腫瘍関連炭水化物抗原である、ｓ−Ｔｎ抗原を指す（シアリル−ＴｎまたはＴＡＧ−７２とも呼ばれる）。これは大半の上皮がんで高いパーセンテージの症例において、および複数の白血病で発現される。
【００３７】
「ＣＤ１７３」は、構造Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−を持つ腫瘍関連炭水化物抗原である、血液型Ｏ抗原を指す（Ｈ２型とも呼ばれる）。これは血液型Ｏの個人の赤血球および内皮で発現される。これはＯ型以外の血液型を持つ患者におけるがん関連抗原である。
【００３８】
「ＣＤ１７４」は、構造Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４［Ｆｕｃα１−３］ＧｌｃＮＡｃβ１−を持つ腫瘍関連炭水化物抗原である、ルイスＹ抗原を指す（ＬｅＹとも呼ばれる）。ＣＤ１７４は、多くの上皮がん、複数の白血病、および造血前駆細胞で腫瘍特異的である。
【００３９】
「ＣＡ１９−９」は、構造ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３［Ｆｕｃα１−４］ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−の腫瘍関連炭水化物抗原である、シアリル−Ｌｅ ａ抗原を指す。これは消化管癌腫および膵臓癌腫で高度に発現されるが、乳房腫瘍、腎臓腫瘍または前立腺腫瘍では発現されない。
【００４０】
「ＣＤ３４」、膜糖タンパク質（１０５〜１２０ｋＤａ）は、造血前駆細胞の周知のマーカーである。これは大半の白血病細胞でも発現される。
【００４１】
「ＣＤ４４」は、さまざまな分子量の接着分子（Ｈ−ＣＡＭ、Ｐｇｐ−１）である。これは細胞表面ヒアルロナン受容体であり、マトリクスメタロプロテイナーゼと相互作用して、細胞移動で重要な役割を果たす。ＣＤ４４は、乳がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、結腸がん、胃がん、および他のがん種でのがん幹細胞マーカーとして記載されている（Ｌｉら、２００７、およびＴａｋａｉｓｈｉら、２００９を参照）。これは正常多能性幹細胞のマーカーでもある。いくつかのがん種では、ＣＤ４４のスプライシングバリアント、例として結腸直腸がんでのＣＤ４４ｖ６が存在する。
【００４２】
「ＣＤ１３３」（プロミニン、１２０ｋＤａ）は、５−膜貫通ドメイン糖タンパク質である。上記遺伝子は８６５アミノ酸糖タンパク質をコードして、動物界にわたって保存されている。これは多くのがん種（たとえば結腸直腸癌腫、膵臓癌腫、前立腺癌腫、非小細胞肺癌腫、および肝細胞癌腫、ならびに黒色腫および神経膠芽腫）でがん幹細胞マーカーとして記載されてきた。
【００４３】
「ＣＤ１６４」（ＭＧＣ−２４、２４ｋＤａ）は、造血前駆細胞のマーカー、および胃癌腫のがん幹細胞のマーカーでもある（Ｍａｓｕｚａｗａら、１９９２を参照）。
【００４４】
互換的に使用される「細胞（ｃｅｌｌ）」および「細胞（ｃｅｌｌｓ）」ならびに「細胞集団」という用語は、特に１個以上の細胞、特に哺乳動物細胞を指す。上記用語は、細胞または細胞集団の子孫を含む。当業者は、「細胞」が単細胞の子孫を含み、上記子孫は天然の、偶発的な、または故意の変異および／または変化により、元の親細胞とは（形態においてまたはＤＮＡ相補体全体が）必ずしも完全に同一でない可能性があることを認識する。
【００４５】
「有効量」は特に、有益なまたは所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回以上の投与で与えることができる。活性成分としての有効量の上記結合剤は、特に疾患状態の進行を診断する、軽減する、改善する、安定化する、逆行させる、遅くする（ｓｌｏｗ）または遅らせるのに十分である量である。活性成分の毒性および治療有効性は、たとえばＬＤ５０（集団の５０パーセントに致死性である用量）およびＥＤ５０（集団の５０パーセントで治療的に有効な用量）を決定することを含む、たとえば細胞培養物および／または実験動物における標準の薬学的手順に従って決定することができる。毒性作用と治療効果との間の用量比は治療指数であり、これは比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きい治療指数を示す結合剤が好ましい。細胞培養および／または動物研究から取得したデータは、ヒトに対する投薬量の範囲を処方するのに使用することができる。活性成分の投薬量は典型的に、低い毒性のＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内に並ぶ。上記投薬量は、採用された剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変えることができる。
【００４６】
図面は下に記載する実施例によって取得された結果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１．１】ａ−ｃは、肺がん細胞系ＮＣＩＨ４４６を用いて行われた共焦点顕微鏡分析（倍率×４００）を示す図である。細胞をＣＤ４４（赤色）およびＣＤ１７６（緑色）に特異的なモノクローナル抗体によって染色した。核はＤＡＰＩ（青色）によって対比染色した。ＣＤ４４は大半のＮＣＩＨ４４６細胞で強く発現している（ａ）。ＣＤ１７６発現は、細胞クラスタの膜において認めることができた（ｂ）。混合図（ｃ）は、これらの細胞クラスタにおけるＣＤ４４およびＣＤ１７６の同時局在を実証している（黄色）。
【００４８】
ｄ−ｉでは、ＨＣＣ組織におけるＣＤ４４およびＣＤ１７６の、ならびにＣＤ１３３およびＣＤ１７６の同時発現が、二重免疫蛍光染色によって示されている（倍率×２００）。オーバーレイによるＣＤ１７６（緑色、ｄ）／ＣＤ４４（赤色、ｅ）およびＣＤ１３３（赤色、ｇ）／ＣＤ１７６（緑色、ｈ）の同時発現がそれぞれ見出された（黄色、ｆおよびｉ）。
【００４９】
ｊ、ｋは、免疫組織化学により分析された肺がん組織でのＣＤ１７６の発現（倍率×２００）を示す図である。ＣＤ１７６は細胞表面ならびに肺腺癌細胞（ｊ）および肺扁平上皮がん種細胞（ｋ）の細胞質で見出された。
【図１．２Ａ】図１．２Ａは、細胞系ＳＰＣ−Ａ−１、ＧＬＣ（肺腺癌）およびＨｅｐＧ２（ＨＣＣ）の細胞におけるＣＤ４４およびＣＤ１７６の同時発現のＦＡＣＳ分析を示す図である。細胞を抗ＣＤ４４（ＩｇＧ）および抗ＣＤ１７６（ＩｇＭ）とともにインキュベートし、続いて抗ＩｇＧ−Ｃｙ３（γ鎖特異的）および抗ＩｇＭ−ＦＩＴＣ（μ鎖特異的）とともにインキュベートした。検体当り最小１０，０００のイベントが収集された。マーカーのそれぞれの組合せを持つ細胞のパーセンテージがグラフのおのおのの区画（ｓｅｃｔｉｏｎ）に示され、両方のマーカーの染色の強い相関が実証されている。示されたデータは、複数の独立した実験の代表である。
【図１．２Ｂ】図１．２Ｂは、ＭＤＡ−４３５（乳癌腫）細胞の４−ＯＨＴ処理前後のＣＤ４４およびＣＤ１７６の同時発現のＦＡＣＳ分析を示す図である。マーカーのそれぞれの組合せを持つ細胞のパーセンテージがグラフのおのおのの区画に示されている。ＣＤ４４＋／ＣＤ１７６＋細胞の数は、４−ＯＨＴによる２４時間の処理後に増加する。示されたデータは、複数の独立した実験の代表である。
【図２．１】図２．１は、乳がん細胞の二重免疫蛍光染色を示す図である。
【００５０】
ａ−ｃは、細胞系ＭＣＦ−７；ｄ−ｌ：乳がん組織切片である。細胞をモノクローナル抗体Ｇ４４−２６（ＣＤ４４、ＩｇＧ２ｂ）またはＡＮＣ９Ｃ５（ＣＤ１３３）によって、およびＡ７０−Ｃ／Ｃ８（ＣＤ１７４、ＩｇＭ）またはＡ４６−Ｂ／Ｂ１０（ＣＤ１７３、ＩｇＭ）によって染色し、続いて抗ＩｇＧ−Ｃｙ３（γ鎖特異的、赤）および抗ＩｇＭ−ＦＩＴＣ（μ鎖特異的、緑色）とともにインキュベートした。
【００５１】
ｃ、ｆ、ｉ、ｌは合成図である；核はＤＡＰＩ（青色）によって対比染色した。
【００５２】
ＣＤ１７３（ａ、ｄ）は多くの場合、ＣＤ４４（ｂ、ｅ）と同時発現される。ＣＤ１７４（ｇ、ｊ）は、ＣＤ４４（ｈ）ならびにＣＤ１３３（ｋ）による同時発現を示す。倍率：２００×。
【図２．２Ａ】Ａは、乳腺癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＣＦ−７におけるＣＤ４４＋／ＣＤ１７３＋発現のフローサイトメトリー分析を示す図である。がん細胞を抗ＣＤ４４（ＩｇＧ）および抗ＣＤ１７４（ＩｇＭ）抗体とともにそれぞれインキュベートして、続いて抗ＩｇＧ−Ｃｙ３（γ鎖特異的）および抗ＩｇＭ−ＦＩＴＣ（μ鎖特異的）とともにインキュベートした。値は３回の同様の実験のうちの１回から得る。両方の細胞系の大部分が両方のマーカー（ＣＤ４４およびＨ２）に陽性である。
【００５３】
Ｂは、４−ＯＨＴ処理前後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞でのＣＤ４４＋／ＣＤ１７４＋発現のフローサイトメトリー分析を示す図である。４−ＯＨＴ処理は、ＣＤ４４およびＣＤ１７４（ＬｅＹ）の両方を発現する細胞の割合の増加を生じる。値は３回の同様の実験のうちの１回から得る。
【図２．２Ｂ】Ａは、乳腺癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＣＦ−７におけるＣＤ４４＋／ＣＤ１７３＋発現のフローサイトメトリー分析を示す図である。がん細胞を抗ＣＤ４４（ＩｇＧ）および抗ＣＤ１７４（ＩｇＭ）抗体とともにそれぞれインキュベートして、続いて抗ＩｇＧ−Ｃｙ３（γ鎖特異的）および抗ＩｇＭ−ＦＩＴＣ（μ鎖特異的）とともにインキュベートした。値は３回の同様の実験のうちの１回から得る。両方の細胞系の大部分が両方のマーカー（ＣＤ４４およびＨ２）に陽性である。
【００５４】
Ｂは、４−ＯＨＴ処理前後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞でのＣＤ４４＋／ＣＤ１７４＋発現のフローサイトメトリー分析を示す図である。４−ＯＨＴ処理は、ＣＤ４４およびＣＤ１７４（ＬｅＹ）の両方を発現する細胞の割合の増加を生じる。値は３回の同様の実験のうちの１回から得る。
【図２．３】図２．３は、ＣＤ１７３ｍＡｂ Ａ４６−Ｂ／Ｂ１０によって染色した腺管内癌腫切片の免疫組織化学を示す図である。残存する管壁の基底細胞（幹細胞様細胞）が強く染色されている。
【図２．４】図２．４は、乳腺癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、およびＭＣＦの溶解物の免疫沈降を示す図である。ＣＤ４４免疫沈降物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分けて、ｍＡｂ ＣＤ１７３を使用する免疫ブロットによって分析した。データは、乳癌腫においてＣＤ４４がＣＤ１７３を担持していることを示す。
【図３−１】図３は、抗ＣＤ１７６抗体のアミノ酸配列を示す図である。
【図３−２】図３は、抗ＣＤ１７６抗体のアミノ酸配列を示す図である。
【図３−３】図３は、抗ＣＤ１７６抗体のアミノ酸配列を示す図である。
【図３−４】図３は、抗ＣＤ１７６抗体のアミノ酸配列を示す図である。
【図３−５】図３は、抗ＣＤ１７６抗体のアミノ酸配列を示す図である。
【図３−６】図３は、抗ＣＤ１７６抗体のアミノ酸配列を示す図である。
【図３−７】図３は、抗ＣＤ１７６抗体のアミノ酸配列を示す図である。
【図４】図４は、ＢｒｄＵ細胞増殖ＥＬＩＳＡによって測定された腫瘍細胞増殖の抑制を示す図である。ＣＤ１７６陽性ＮＭ−Ｄ４細胞を抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体（Ｊ鎖を含むまたはＪ鎖が欠如した）または無関係なアイソタイプ対照（ｈＩｇＭ）とともに培養した。架橋をヤギ抗ヒトＩｇＭ Ｆａｂ２抗体（Ｆｃ５μ）を用いて行った。無処理対照細胞に対する増殖パーセントが示されている。そのデータは、Ｊ鎖を持つまたは持たない２つのＩｇＭ型による増殖の濃度依存性抑制を実証している。
【図５】図５は、アネキシンＶ検出によって測定された抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体によるアポトーシス誘起を示す図である。ＡＭＬ細胞系ＫＧ−１の２つの亜系統ＣＤ１７６陽性（Ａ）およびＣＤ１７６陰性（Ｂ）を、Ｊ鎖を持つまたは持たない抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体とともにインキュベートした。ｈＩｇＭ：無関係なアイソタイプ対照。死んでいる細胞をＳｙｔｏｘグリーン蛍光によって測定した。抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体によるアポトーシスのＣＤ１７６特異的誘起が実証された。
【図６】図６は、ユウロピウム放出アッセイによって測定された、抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体による補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の誘起を示す図である。上記ＡＭＬ細胞系ＫＧ−１（ＣＤ１７６陽性）を、Ｊ鎖を持つ（Ｊ＋）または持たない（Ｊ−）どちらかの抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体の存在下で培養し、ウサギ補体を添加した。無関係なＩｇＭアイソタイプを対照として使用した（ｈＩｇＭ）。実証されるように、濃度依存性ＣＤＣは、抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体によって誘起される。
【図７】図７は、ユウロピウム放出アッセイによって測定された、抗ＣＤ１７６ ＩｇＧ１抗体による抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の誘起を示す図である。癌腫細胞系ＰＡＮＣ−１（ＣＤ１７６陽性）を抗ＣＤ１７６ ＩｇＧ１抗体の存在下で培養し、健常ドナーからのＰＢＭＣをＥ：Ｔ比１００：１で添加した。ｈＩｇＧ１：無関係なアイソタイプ対照。示されるように、濃度依存性ＡＤＣＣは抗ＣＤ１７６ ＩｇＧ１抗体によって誘起される。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
発明の詳細な説明
本発明は、腫瘍関連炭水化物抗原ががん幹細胞で発現され、そのためがん幹細胞マーカーとして有用であるという発見に基づく。これまで記載されたがん幹細胞マーカーがほぼすべてタンパク質であるため、本発見は驚くべきである。そのため本発明は、好ましくはＣＤ１７６、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７４、ＣＤ１７３およびＣＡ１９−９から、さらに好ましくは（ｍｏｒｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）ＣＤ１７６、ＣＤ１７５およびＣＤ１７５ｓから選択される腫瘍関連、好ましくは腫瘍特異的炭水化物抗原のがん幹細胞マーカーとしての使用に関係する。
【００５６】
第１の態様により、本発明は、上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞の処置で使用するための腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤を提供する。
【００５７】
本発明者らは、複数の腫瘍関連炭水化物抗原、例としてＣＤ１７６、ＣＤ１７４およびＣＤ１７３ががん幹細胞で発現され、そのため新規がん幹細胞マーカーであることを示してきた。腫瘍関連炭水化物抗原のがん幹細胞マーカーとしての同定は、腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する剤のための新規治療適用を提供する。それぞれの腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する剤は今や、上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞をターゲティングするために治療的に使用することができる。このことはがん幹細胞をターゲティングする、および好ましくは死滅させる治療処置の機会を提供する。それぞれの治療剤はたとえば、普通の化学療法に耐性であるがん幹細胞をターゲティングして、そのため破壊するために使用することができる。これにより、本発明によって改善されたがん療法が提供される。
【００５８】
１実施形態により、上記腫瘍関連炭水化物抗原は、がん幹細胞で主としてまたはなお独占的に発現される。別の実施形態により、上記腫瘍関連炭水化物抗原は上記がん幹細胞で、ならびにがん幹細胞ではないがん細胞で発現される。上記腫瘍関連炭水化物抗原が両方の細胞集団上で発現される場合、これは上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する上記結合剤による処置が、両方の細胞集団をターゲティングするという利点を有する。これはたとえば、腫瘍成長の間に、がん幹細胞特性を持つ新たな細胞がたとえば上皮間葉移行（ＥＭＴ）によって発生する、まれではあるが記録された症例において重要である。
【００５９】
１実施形態により、上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する上記結合剤は治療的活性である。それぞれの実施形態の１例は、治療的活性抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の結合剤としての使用である。治療的活性抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、標的細胞、特に上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現する上記がん幹細胞の溶解を好ましくは生じる、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘起することが好ましくは可能である。さらなる実施形態により、上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する上記結合剤は、ターゲティング分子として機能して、少なくとも１つの治療剤にカップリングされる。カップリングは、共有結合または非共有結合手段によって達成することができる。上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する上記結合剤がターゲティング分子として機能するときに、上記結合剤自体は治療的活性であることができるか、または治療的活性であり得ない。上記結合剤が治療的活性でない場合、これは実際の治療剤（たとえば放射性医薬品、化学療法剤または毒素）を所望の作用標的側、すなわち上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現する上記がん幹細胞まで運ぶ分子キャリアとして基本的に機能する。上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤にカップリングされた治療剤は、たとえば化学療法剤または他の抗がん薬であることができる。カップリングされた上記治療剤は、好ましくはターゲティングされたがん幹細胞を破壊もしくは死滅させる、またはこれの増殖を抑制する。これはカップリングされた上記治療剤によって直接、またはターゲティングされた上記がん幹細胞および／または処置される被験体の好適な生体メカニズムの誘起によって間接的に、のどちらかで達成することができる。
【００６０】
１実施形態により、上記腫瘍関連炭水化物抗原はＣＤ１７６、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７４、ＣＤ１７３およびＣＡ１９−９から成る群より選択される。好ましくは、上記腫瘍関連炭水化物抗原はＣＤ１７６、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４およびＣＤ１７５またはＣＤ１７５ｓより選択される。これらの腫瘍関連炭水化物抗原に関する詳細事項は上に記載されている。これらの腫瘍関連炭水化物抗原が新規であり、好適ながん幹細胞マーカーであることは、本発明者によって示された。
【００６１】
好ましくは、上記腫瘍関連炭水化物抗原は腫瘍特異的である。このことは非腫瘍細胞、非がん細胞それぞれが、上記処置により影響を受けるリスクが低下するという利点を有する。好ましい腫瘍特異性に関する詳細事項も上に記載されている；それはそれぞれの開示に言及されている。
【００６２】
１実施形態により、がん幹細胞は、好ましくは糖タンパク質である少なくとも１つの幹細胞マーカーを同時発現する上記結合剤によって処置される。本発明者らは、腫瘍関連炭水化物抗原、例として特にＣＤ１７６、ＣＤ１７３およびＣＤ１７４が、がん幹細胞マーカーであることがすでに公知である他の幹細胞マーカー、例としてＣＤ４４およびＣＤ１３３と同時発現されることを見出している。好ましい実施形態により、上記結合剤によって特異的に結合される上記腫瘍関連炭水化物抗原を担持する（糖）タンパク質である、少なくとも１つの幹細胞マーカーを発現するがん幹細胞が処置される。ある実施形態において、上記結合剤は上記腫瘍関連炭水化物抗原を担持する（糖）タンパク質にも結合し得る。しかし特異的結合は、上記腫瘍関連炭水化物抗原が存在する場合にのみ発生する。本発明者らは、がん幹細胞マーカーとして有用な腫瘍関連炭水化物抗原、例としてＣＤ１７６が正常細胞ならびにがん幹細胞のマーカーとして公知であるタンパク質、例としてＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、ＣＤ１６４にほぼ独占的に担持されることが多いことを、および／または腫瘍関連（糖）タンパク質に担持されることを実証してきた。このことは、がん幹細胞マーカーとして本明細書で同定された上記腫瘍関連炭水化物抗原（複数可）の出現（発現）を生じるがん幹細胞への悪性形質転換のプロセスの間に、正常（糖）タンパク質幹細胞マーカーおよび／または腫瘍関連（糖）タンパク質がそのグリコシル化に特徴的な変化を被ることを示唆する。そのため腫瘍関連炭水化物抗原の新規がん幹細胞マーカーとしての同定は、がん幹細胞の処置にとって貴重な治療標的を提供する。
【００６３】
１実施形態により、上記がん幹細胞はＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１３３およびＣＤ１６４から成る群より選択される１個以上の幹細胞マーカーを発現する。好ましくは、上記腫瘍関連炭水化物抗原は、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１３３およびＣＤ１６４から成る群より選択される糖タンパク質に担持される。たとえばＣＤ１７６、ＣＤ１７５およびＣＤ１７５ｓは、特にＣＤ４４およびＣＤ１３３で発現されることが見出された。
【００６４】
１実施形態により、上記がん幹細胞は、以下の特徴の１つ以上を有するがんのがん幹細胞である：
ａ）がんが固形腫瘍である；
ｂ）がんが白血病である；
ｃ）がんが多発性骨髄腫もしくはリンパ腫である；
ｄ）がんが上皮起源の腫瘍である；ならびに／または
ｅ）がんが肺がん、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、消化器がん、膵臓がん、前立腺がん、子宮頸がんおよび頭頸部がんから成る群より選択される腫瘍である。
【００６５】
上記がん幹細胞がＣＤ１７６、ＣＤ１７５またはＣＤ１７５ｓを腫瘍関連炭水化物抗原として発現する実施形態では、上記がん幹細胞は好ましくは、白血病の、または固形腫瘍を形成する、すなわち白血病およびリンパ腫以外のがんであるがんの、がん幹細胞である。好ましくは、上記がんは上皮悪性腫瘍であり、およびさらに好ましくは（ｍｏｒｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）、肺癌腫、乳癌腫および肝臓癌腫から成る群より選択される。本明細書で提供される実施例で実証されるように、ＣＤ１７６はこれらのがん種のがん幹細胞で発現される。そのほかにＣＤ１７６は、白血病でたとえばＣＤ３４と同時発現されることが見出された。
【００６６】
上記がん幹細胞がＣＡ１９−９を腫瘍関連炭水化物抗原として発現する実施形態では、上記がん幹細胞は、１実施形態により、固形腫瘍を形成するがんのがん幹細胞である。好ましくは、上記がんは消化器癌腫である。
【００６７】
１実施形態により、上記結合剤は、腫瘍特異的炭水化物抗原である上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する。好ましくは生理学的状態およびそのため上記結合剤の治療適用の間に発生する状態の下で、上記結合剤は非がん細胞、非腫瘍細胞、良性がん細胞および／または良性腫瘍細胞で発現される抗原、特に炭水化物抗原を結合しない。それぞれ腫瘍特異的結合剤を使用することは複数の利点を有する。療法で使用されるときに、上記結合剤が、標的細胞および例えば上記腫瘍特異的炭水化物抗原を発現する細胞のみを認識して、そのため結合するが、同様の抗原、特に同様の炭水化物抗原を発現するだけの非標的、特に良性または正常細胞を結合しないことが確保される。これが腫瘍特異的療法、がん特異的療法を確保して、これにより望ましくない副作用が低減される。好適な腫瘍特異的結合剤は続いて、特に上記腫瘍特異的炭水化物抗原がＣＤ１７６またはＣＤ１７５である実施形態について記載されている。
【００６８】
好ましい実施形態により、腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤は抗体または抗体の抗原結合フラグメントもしくは誘導体である。好適な例は上および実施例に記載されている。
【００６９】
本発明により結合剤として使用される抗体または抗体の抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、好ましくは以下の特徴の１つ以上を有する：
ａ）それはがん細胞および／もしくは腫瘍細胞、特にがん幹細胞のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを媒介する；
ｂ）それはがん細胞および／もしくは腫瘍がん細胞、特にがん幹細胞のアポトーシスを誘起および／または促進する；
ｃ）それは標的のがん細胞および／もしくは腫瘍細胞、特にがん幹細胞の増殖を抑制する；
ｄ）それはがん細胞および／もしくは腫瘍細胞、特にがん幹細胞の食作用を誘起および／もしくは促進する；ならびに／または
ｅ）それは細胞傷害剤の放出を誘起および／または促進する。
【００７０】
１実施形態により、ＣＤ１７６特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、ＣＤ１７６を発現するがん幹細胞を処置するために使用される。好ましくは、上記ＣＤ１７６特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２または３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号４または５または６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３から成る群より選択される少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに好ましくは、それは少なくとも２個のＣＤＲ、例としてＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ３、またはＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含み、おのおの上で定義したようなアミノ酸配列を有する。最も好ましくは、それは３個すべてのＣＤＲ、すなわちＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含み、おのおの上で定義したようなアミノ酸配列を有する。代わりにＣＤＲＨ１は、配列番号１４から１７のうちの任意の１つのアミノ酸配列を有し得、そして／またはＣＤＲＨ２は配列番号１８から２７のうちの任意の１つのアミノ酸配列を有し得る。特にこれらのＣＤＲは、上記ＣＤ１７６特異的抗体または機能的に活性なそのフラグメントもしくは誘導体の重鎖可変領域に存在する。上記ＣＤ１７６特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の重鎖可変領域は、好ましくは配列番号４６から７９のうちの任意の１つのアミノ酸配列を含有するまたはこのアミノ酸配列から成る。
【００７１】
そのほかに上記ＣＤ１７６特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は好ましくは、配列番号７または８または９のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１０または１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号１２または１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３から成る群より選択される少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに好ましくは、それは少なくとも２個のＣＤＲ、例としてＣＤＲＬ１およびＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ１およびＣＤＲＬ３、またはＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含み、おのおの上で定義したようなアミノ酸配列を有する。最も好ましくは、それは３個すべてのＣＤＲ、すなわちＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含み、おのおの上で定義したようなアミノ酸配列を有する。代わりにＣＤＲＬ１は、配列番号２８から４５のうちの任意の１つのアミノ酸配列を有し得る。特にこれらのＣＤＲは、上記ＣＤ１７６特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の軽鎖可変領域に存在する。ＣＤ１７６特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の軽鎖可変領域は、好ましくは配列番号８０から９４のうちの任意の１つのアミノ酸配列を含有する、またはこのアミノ酸配列から成る。
【００７２】
好ましい実施形態において、上記ＣＤ１７６特異的抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の以下の１つのセットを含む：
【００７３】
【表１】
上記配列を図３に示す。それぞれの配列はＥＰ １ ５７２ ７４７にも開示されているため、上記配列について同じナンバリングを本明細書で使用する。
【００７４】
本発明による上記結合剤である、上記ＣＤ１７６特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、ヒト抗体、マウス抗体、ヒト化抗体もしくはキメラ抗体または機能的に活性なそのフラグメントもしくは誘導体であり得る。そのほかにそれは単鎖抗体フラグメント（たとえばｓｃＦｖ）、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、マルチボディ（たとえばダイア−、トリア−、またはテトラボディ）、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤアイソタイプの免疫グロブリンもしくはその任意のサブクラス、例としてＩｇＧ１、または少なくとも１つの定常ドメインを含む免疫グロブリン由来認識分子、またはＪ鎖（全体または一部）を欠いたものであり得る。好ましくは、上記ＣＤ１７６特異的抗体はＩｇＧ１抗体またはＩｇＭ抗体、特に、好ましくはヘキサマーの形態である、Ｊ鎖を含むＩｇＭ抗体または上記Ｊ鎖を欠いたＩｇＭ抗体であり、すなわちそれは２個の重鎖および２個の軽鎖を含む６個の抗体ユニットを含む。
【００７５】
特に好ましい実施形態において、上記ＣＤ１７６特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、たとえばＥＰ １ ５７２ ７４７の実施例７に記載されているような生理学的条件下では、Ｇａｌα１−３ＧａｌＮＡｃα、Ｇａｌα１−３ＧａｌＮＡｃβ、ＧａｌＮＡｃα、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα、Ｇａｌβ１−３（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６）ＧａｌＮＡｃα、ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα、ＧｌｃＮＡｃα１−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα、ＧａｌＮＡｃα１−３Ｇａｌβおよび／または３’−Ｏ−Ｓｕ−Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃαと特異的に相互作用しない。
【００７６】
１実施形態により、上記ＣＤ１７６特異的抗体はコア１構造を結合して、ＧｌｃＮＡｃβ１−６［Ｇａｌβ１−３］ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−である構造ｃｏｒｅ−２との交差反応性を示す。
【００７７】
ＣＤ１７６を結合する好適な抗体の例は、これに限定されるわけではないが、ＨＨ８（Ｃｌａｕｓｅｎ Ｈら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２５：１９９−２０４（１９８８））、Ａ７８−Ｇ／Ａ７（Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）、Ｎｅｍｏｄ−ＴＦ１およびＮｅｍｏｄ−ＴＦ２（Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）ならびにＨＢ−ＴＦ１（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、ハンブルク、ドイツ）を含む。
【００７８】
そのほかに本発明による上記結合剤は、上に記載したＣＤ１７６特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体との交差反応性を示す抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体を含み得る。特に、本発明による上記結合剤は、上に記載したＣＤ１７６特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体によって、または、溶液中のＣＤ１７６構造物、またはキャリア分子（例としてポリアクリルアミドに、もしくはペプチド、タンパク質もしくは脂質）に、当業者が決定できる十分な濃度または量でカップリングさせたＣＤ１７６構造物によって、結合が効果的に抑制され得る抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体であり得る。
【００７９】
さらなる実施形態により、ＣＤ１７５特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、ＣＤ１７５を発現するがん幹細胞を処置するために使用される。好適な特異的抗体は、従来技術で公知であるおよび／または上に記載した方法によって取得することができる。ＣＤ１７５に対する公知の抗体は、たとえばＨＢ−Ｔｎ１（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、ハンブルク、ドイツより入手可能）、ＴＫＨ６（Ｋｊｅｌｄｓｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４８：２２１４，１９８８）、および１Ｅ３（Ｔｈｕｒｎｈｅｒら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ４：４２９，１９９４）である。
【００８０】
１実施形態により、ＣＤ１７５ｓ特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、ＣＤ１７５ｓを発現するがん幹細胞を処置するために使用される。好適な特異的抗体は、従来技術で公知であるおよび／または上に記載した方法によって取得することができる。ＣＤ１７５ｓに対する公知の抗体は、たとえばＨＢ−ＳＴｎ１（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、ハンブルク、ドイツより入手可能）、ＴＫＨ２（Ｋｊｅｌｄｓｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４８：２２１４，１９８８）、Ｂ７２．３（Ｚｈａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：３３６４，１９９５）、およびＭＬＳ１０２（Ｎａｋａｄａら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６：１２４０２，１９９１）である。
【００８１】
１実施形態により、ＣＤ１７４特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、ＣＤ１７４を発現するがん幹細胞を処置するために使用される。好適な特異的抗体は、従来技術で公知であるおよび／または上に記載した方法によって取得することができる。ＣＤ１７４に対する公知の抗体は、たとえばＡ７０−Ｃ／Ｃ８（Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）、ＢＲ５５−２（Ｂｌａｓｚｃｚｙｋ−Ｔｈｕｒｉｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６２：３７２，１９８７）、およびＮＣＣ−ＳＴ−４３３（Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｇａｎｎ ７６：４３，１９８５）である。ＣＤ１７４に対する公知の治療抗体は、たとえばＡＢＬ３６４（Ｓａｎｄｏｚ）およびＢＲ９６（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）である。
【００８２】
１実施形態により、ＣＤ１７３特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、ＣＤ１７３を発現するがん幹細胞を処置するために使用される。好適な特異的抗体は、従来技術で公知であるおよび／または上に記載した方法によって取得することができる。ＣＤ１７３に対する公知の抗体は、たとえばＡ４６−Ｂ／Ｂ１０（Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）、ＢＥ２（Ｙｏｕｎｇら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５６：１０９６７，１９８１）、および９２ＦＲＡ２（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、ハンブルク、ドイツ）である。
【００８３】
１実施形態により、ＣＡ１９−９特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、ＣＡ１９−９を発現するがん幹細胞を処置するために使用される。好適な特異的抗体は、従来技術で公知であるおよび／または上に記載した方法によって取得することができる。ＣＡ１９−９に対する公知の抗体は、たとえば１１１６ＮＳ−１９−９（Ｍａｇｎａｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４３：５４８９，１９８３）、および１２１ＳＬＥ（Ｈｅｒｒｅｒｏ−Ｚａｂａｌｅｔａら、Ｂｕｌｌ Ｃａｎｃｅｒ ７４：３８７，１９８７）である。
【００８４】
腫瘍関連炭水化物抗原（複数可）を発現するがん幹細胞の処置で使用するための、上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤を含む薬学的組成物も提供され、ここで、上記結合剤、上記がん幹細胞および上記腫瘍関連炭水化物抗原は、上および特許請求の範囲に記載するような特徴の１つ以上を有する。それはそれぞれの開示に言及されている。
【００８５】
別の実施形態において、被験体におけるがん幹細胞の処置のための方法であって、（ａ）処置される上記がん幹細胞で発現された腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤および（ｂ）薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物を上記処置に有効な量で上記被験体に投与する工程を含む方法が開示される。上記結合剤、上記腫瘍関連炭水化物抗原ならびに上記がん幹細胞の特徴に関する詳細事項は、目的の結合化合物の請求項（ｐｕｒｐｏｓｅ ｂｏｕｎｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｃｌａｉｍ）と併せて上に記載されている。それは上の開示に言及されている。主題の方法は、予防目的および治療目的の両方に有用である。本明細書で使用する場合、「処置すること」または「処置」という用語は、疾患の防止、および先在状態の処置の両方を指すために使用される。患者の臨床症状を安定化または改善する進行中の疾患の処置は、本発明によって提供される詳細に重要な利点である。このような処置は望ましくは、影響を受けた組織における機能喪失の前に行われる；結果的に、本発明によって提供される予防治療の利益も重要である。たとえばがん患者の処置は、腫瘍サイズの低減、悪性細胞の排除、転移の防止、寛解になった患者の再発防止、播種性がん、特に腫瘍細胞または転移がん、特に循環中の細胞または逃避もしくは浸潤中の細胞を含む細胞の低減、部分的または完全な死滅、生存の延長および／または腫瘍進行、がん進行までの時間の延長であり得る。がん幹細胞で発現される腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する本発明による結合剤およびそれを含む薬学的組成物は有用であり、上記目的のために記載されている。
【００８６】
薬学的組成物は、所望の処方物に応じて、動物またはヒトへの投与のための薬学的組成物を処方するために普通に使用されるビヒクルとして定義される、希釈剤の薬学的に許容され得る非毒性キャリアを含むことができる。上記希釈剤は、その組合せの生物活性に影響しないように選択される。このような希釈剤の例は、蒸留水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液である。その上、薬学的組成物または処方物は、他のキャリア、アジュバント、または非毒性、非治療的、非免疫原性の安定剤、賦形剤などを含むことができる。上記組成物は、生理学的条件に近づけるための追加の物質、例としてｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤および洗浄剤も含むことができる。
【００８７】
上記組成物は、任意の多種多様の安定化剤、例として抗酸化剤なども含むことができる。上記薬学的組成物がポリペプチドを含むとき、上記ポリペプチドを、上記ポリペプチドのインビボ安定性を向上させる、またはそうでなければその薬理学的特性を向上させる（たとえば上記ポリペプチドの半減期を増大する、その毒性を低減させる、溶解性または取込みを向上させる）、各種の周知の化合物と複合体化することができる。このような修飾物（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）または複合化剤（ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ ａｇｅｎｔ）の例は、硫酸塩、グルコン酸塩、クエン酸塩およびリン酸塩を含む。組成物の上記ポリペプチドは、そのインビボ属性を向上させる分子と複合体化することもできる。このような分子は、例として炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン（たとえばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン）、および脂質を含む。
【００８８】
様々な種類の投与に好適である処方物に関するさらなるガイダンスは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ ｅｄ．（１９８５）に見出すことができる。薬物送達にための方法の簡単な総説については、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）を参照。
【００８９】
本明細書に記載する薬学的組成物は、多種多様の異なるやり方で投与することができる。例は、薬学的に許容され得るキャリアを含有する組成物を経口、鼻内、直腸、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）、腹腔内、静脈内，筋肉内、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）、経皮、髄腔内、および頭蓋内方法を経て投与することを含む。
【００９０】
本発明のさらなる態様により、患者から取得したがん検体が、結合剤が特異的である腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞を含むかどうかを決定する工程を含む、上記がん幹細胞に影響を与える処置であって、上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する上記結合剤による処置に感受性である、上記がん幹細胞を含むがんを同定する方法であって、ここで、がん幹細胞での上記腫瘍関連炭水化物抗原の存在が、腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する上記結合剤による処置に上記がんが感受性であることを示し、上記処置はまた上記がん幹細胞に影響を与える方法が提供される。
【００９１】
本発明による本方法は、がんの上記がん幹細胞が腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤による処置に感受性であるであるかどうかを試験することを可能にする。上記方法の結果は、医師に貴重な診断情報を提供する。たとえば上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現しないがん幹細胞を含む場合、上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤による処置は、上記がん幹細胞に影響を与えず、したがって上記がん幹細胞に対して無益であろう。しかし、上記方法により、上記がん幹細胞が、上記結合剤が特異的である、上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現することが示される場合、上記結合剤による処置も上記がん幹細胞をターゲティングして、したがってそのがん幹細胞に影響を与える可能性が高い。そのため本発明による方法は、医師が患者のための最良の療法を選び、がんの上記がん幹細胞に影響するかどうかを推定するための貴重な支援を提供する。
【００９２】
関係のある診断態様により、患者から単離された検体中の細胞での腫瘍関連炭水化物抗原の発現を分析する工程を含む、がんを診断、病期分類および／もしくは予後を判定するためのならびに／または処置に対する感受性を監視するための方法が提供され、ここで、上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現する細胞の存在は、上記検体中のがん幹細胞の存在を示す。
【００９３】
患者検体中のがん幹細胞の存在は、がんの病期を指示することができる。その上、がん幹細胞の検出を使用して、療法に対する応答を監視することおよび予後判定を支援することができる。本発明による方法によって取得される情報は、予後判定および診断に有用であり、それには、上記疾患の加速に対する感受性を分析すること、上記がんが進行しているかどうかおよびたとえば処置を必要とするかどうかが分析される、上記疾患の能動的監視による分析、疾患状態の状態（ｓｔａｔｕｓ）、環境における変化に対する応答、例として時間の経過、選ばれた治療剤、特に上に記載した結合剤による処置、または他の様相が含まれる。上記検体に含有された細胞が腫瘍関連炭水化物抗原を発現するかどうかを、したがって上記検体ががん幹細胞を含むかどうかを分析することによって、上記細胞を治療剤および処置に応答するその能力について分類することもできる。そのほかに、得られた上記情報は、がんの転移挙動を決定および／または予測するのに有用である。がん幹細胞マーカー、特にＣＤ１７６、ＣＤ１７５およびＣＤ１７５ｓとして同定される腫瘍関連炭水化物抗原は、転移で大量に存在することが多い。本明細書で記載したがん幹細胞の腫瘍関連炭水化物抗原の存在および本発明の結合剤によるその結合は、とりわけ上記腫瘍関連炭水化物抗原が腫瘍特異的であり、さらに明確にはそれがＣＤ１７６であるときに、不良な予後と関連していることが多い。がん幹細胞が上記腫瘍関連炭水化物抗原マーカーの発現によって同定される場合、その患者は転移を発生するリスクが増大している。
【００９４】
がんは、がん幹細胞の存在の分析により、本発明によって病期分類することができ、上記がん幹細胞は、特に上記腫瘍関連炭水化物抗原をマーカー標的として使用することによって同定される。病期分類は、予後判定および処置に有用である。
【００９５】
本発明による診断方法の１態様により、がん幹細胞で発現される腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する、本発明による結合剤は、インビボ診断、特にインビボイメージングに使用される。それぞれの方法は、診断目的にも有用である。たとえばがん幹細胞で発現される上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん細胞を、患者にて同定および／または特定できるかどうかを決定することができる。これが当てはまる場合、がん幹細胞が存在するというリスクがある。上および下に記載するように、第２の幹細胞マーカーが加えて検出されて、上記がん幹細胞の性質が確認および／または決定されることが好ましい。そのほかに、療法に対する応答を、たとえば上記腫瘍サイズが縮小するかどうかを、または転移（ｍｅｔａｓｅ）が発生するかどうかを決定することができるように、監視することができる。そのほかにそれぞれの方法は、患者への好適な投薬量を同定するために好都合である。１実施形態により、上記結合剤は標識され、たとえば、それは放射性核種を含む放射性医薬品である。しかし上記結合剤は、他の剤／化合物、例としてたとえばインビボイメージングできるようにするＰＥＴトレーサにもカップリングされ得る。好適な化合物は、従来技術で公知であり、そのためここではさらなる記載は必要ない。上記結合剤、上記腫瘍関連炭水化物抗原、さらなるがん幹細胞マーカーおよびがん種に関する詳細事項は、上および下に記載され、インビボイメージング実施形態にも適用される。それはそれぞれの開示に言及されている。
【００９６】
そのため腫瘍関連炭水化物抗原、例としてＣＤ１７６、ＣＤ１７４およびＣＤ１７３のがん幹細胞マーカーとしての同定ならびにその発見の活用にそれぞれ基づく本発明の記載された方法は、重要かつ好都合な診断および予後判定ツールを提供する。
【００９７】
好ましい実施形態により、本発明による方法は、上記細胞が少なくとも１つの第２のがん幹細胞マーカーを同時発現するかどうかを分析する工程を加えて含む。これにより、がん幹細胞の表現型をさらに確認することができる。分析された上記検体中で上記腫瘍関連炭水化物抗原および少なくとも１つの第２のがん幹細胞マーカーを同時発現する細胞の存在を同定することは、それぞれの細胞ががん幹細胞であることおよびたとえば分析された上記検体ががん幹細胞を含有することまたはがん幹細胞がインビボ診断方法によって検出されたことを示す／確認する。決定することができる好適ながん幹細胞マーカーは、上記腫瘍関連炭水化物抗原のほかに、がん種に依存する。好ましい実施形態により、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１３３およびＣＤ１６４から成る群より選択される、少なくとも１つの追加の糖タンパク質がん幹細胞マーカーの同時発現が試験される。
【００９８】
１実施形態により、上記腫瘍関連炭水化物抗原はＣＤ１７６、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７４、ＣＤ１７３およびＣＡ１９−９から成る群より選択される。上記腫瘍関連炭水化物抗原に関する詳細事項は上で詳細に記載されている。それは上の開示に言及されている。
【００９９】
好ましくは、上記腫瘍関連炭水化物抗原は腫瘍特異的であり、好ましくは悪性細胞のみで発現される。１実施形態により、上記腫瘍関連炭水化物抗原は、がん幹細胞で主としてまたは独占的に発現される。別の実施形態により、上記腫瘍関連炭水化物抗原は上記がん幹細胞で発現され、ならびに、それ自体はがん幹細胞ではないが、たとえばこれらの細胞の誘導体であるがん細胞か、またはがん幹細胞ではない、がんそれぞれの腫瘍細胞（ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ）である、がん細胞で発現される。
【０１００】
１実施形態により、検体中のがん幹細胞の存在は、本明細書に記載するがん幹細胞の表現型を有する細胞を定量することによって決定され、したがって上記腫瘍関連炭水化物抗原および好ましくはさらなるがん幹細胞マーカーを発現する。上記検体中のより多数のがん幹細胞の同定は、より高悪性度のがん表現型を指示する。１実施形態により、上記検体中に存在する細胞は、上記腫瘍関連炭水化物抗原および必要に応じて、少なくとも１つのさらなるがん幹細胞マーカーの発現について定量（定量化／定量的に分析）される。上記腫瘍関連炭水化物抗原に対して陽性である細胞の「幹細胞」特質は、たとえば球を形成する際に、培養中の細胞の自己再生および増殖する能力をたとえば決定することによって実験的にさらに確認され得る。代わりにまたは加えて、上記細胞を動物モデルにおける腫瘍原性（ｔｕｍｏｒｇｅｎｉｃｉｔｙ）について試験することができる。
【０１０１】
本発明の１実施形態において、がん患者、たとえば上に記載したようながんに罹患しているまたはがんの疑いがある患者からの検体は、上記腫瘍関連炭水化物抗原に特異的な少なくとも１つの剤によって染色される。少なくとも１つのさらなるがん幹細胞マーカーの同時発現が分析される場合、検体はさらなる上記がん幹細胞マーカーに特異的な少なくとも１つの剤によっても染色されることが好ましい。
【０１０２】
染色パターンの分析は、上記検体中に存在するがん幹細胞の量についての情報を提供し得る。そのほかに上記染色パターンは上記がん幹細胞の相対分布についての情報も供給し得て、上記分布は上記がんの腫瘍原性を予測できるようにし得て、上記がんの進行を予知できるようにもし得る。
【０１０３】
１実施形態により、がん細胞を含有するまたは含有することが疑われる検体を、上記腫瘍関連、好ましくは腫瘍特異的炭水化物抗原およびそのため炭水化物がん幹細胞マーカーを特異的に結合する少なくとも１つの剤ならびに必要に応じて第２のがん幹細胞マーカー、好ましくはＣＤ４４を特異的に結合する少なくとも１つのさらなる剤と接触させる、および好ましくは上記剤によって染色する。これによって上記検体中のがん幹細胞の存在が検出できるようになる。１実施形態により、上記腫瘍関連炭水化物抗原に対する上記結合剤の結合および好ましくは上記第２のがん幹細胞マーカーに対する上記結合剤の結合は、当分野で公知のおよび本明細書に記載するような適切な検出方法によって検出される。好適な検出方法はたとえばＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、蛍光顕微鏡法などである。
【０１０４】
本発明の方法によって分析される検体は、多種多様の源から、詳細には生検検体から取得され得る。このような検体の細胞は、遠心分離、水簸（ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）、密度勾配分離、アフェレーシス、親和性選択、パニング、ＦＡＣＳ、Ｈｙｐａｑｕｅによる遠心分離などにより分析前に分離することができる。いったん検体が取得されると、検体を直接使用するか、凍結するか、または短期間にわたって適切な培養培地中で維持するか、または適した固定溶液で固定されるか、または組織学的（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｇａｌ）もしくは免疫組織学的検査に適した媒体で固定および包埋することができる。各種の媒体を採用して細胞を維持することができる。上記検体は任意の便利な手順、例として生検によって、または外科標本から取得され得る。通例、検体は少なくとも約１０２細胞、さらに通例少なくとも約１０３細胞、ならびに好ましくは１０４、１０５以上の細胞を含む。典型的に、上記検体はヒト患者からであるが、動物モデル、たとえばウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯動物、たとえばマウス、ラット、ハムスター、霊長類なども用途を見出し得る。
【０１０５】
上記検体は凍結され得る、包埋され得る、固定され得る、組織マイクロアレイ中に存在し得るなどである。上記腫瘍関連炭水化物抗原および、必要に応じてさらなるがん幹細胞マーカーを結合、検出、および特に染色するために使用される剤は、たとえば上記がん幹細胞マーカーを特異的に結合する結合剤、たとえば抗体などであることができる。好適な例は上に記載されている。これらの剤は、検出可能に標識され得るか、または染色手順で間接的に標識され得る。１実施形態により、標識を使用して、上記腫瘍関連炭水化物抗原陽性細胞を分離することもできる。好適な標識ならびに染色手順は従来技術で公知であり、したがって一部の実施例が本明細書に記載されているけれども、ここではさらなる記載は必要ない。分析の標準手順は、たとえば実施例に記載されているように、上記検体の組織学的固定（たとえばホルマリンによる）およびその後の染色を含み得る。取得されたデータによって、上記検体中のがん幹細胞の数および分布を決定できるようになる。
【０１０６】
上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現する細胞を検出および／または定量化するのに好適な方法は、たとえば免疫学的アッセイ、例としてＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウェスタンブロットおよび免疫組織化学、フローサイトメトリー、免疫組織化学などを含む。これらの方法により、新規がん幹細胞マーカーおよび、必要に応じて少なくとも１つのさらなるがん幹細胞マーカーとしての、上記腫瘍関連炭水化物抗原、例として特にＣＤ１７６、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７４およびＣＤ１７３を発現する細胞の存在および所望ならば量も同定できるようになる。
【０１０７】
特に興味深いのは、上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤としての複数の抗体、１個の抗体をそれぞれ使用することである。好都合なことには、これらの抗体は検出のためにおよび／または分離での使用のために標識と結合体化される。標識は、直接分離できるようにする磁性ビーズ、支持体に結合されたアビジンまたはストレプトアビジンによって分離することができるビオチン、特定の細胞種の分離を容易にできるようにするための、蛍光活性化セルソーターなどで使用できる蛍光色素を所望ならば含む。用途がある蛍光色素は、フィコビリタンパク質、たとえばフィコエリトリンおよびアロフィコシアニン、フルオレセイン誘導体、Ｃｙ３、Ｃｙ５、またはテキサスレッドを含む。さらなるがん幹細胞マーカーが上記腫瘍関連炭水化物抗原のほかに検出される場合、おのおのがん幹細胞マーカーについての独立したソーティングを許容するために、上記さらなるがん幹細胞マーカーを特異的に結合する剤を異なる蛍光色素によって標識することが好ましい。
【０１０８】
１実施形態により、上記がん幹細胞マーカー（複数可）を特異的に結合する上記結合剤は、細胞の懸濁物に添加され、利用可能な細胞表面抗原を結合するのに十分な期間にわたってインキュベートされる。分離の効率が上記がん幹細胞マーカーを特異的に結合する剤の欠如によって制限されないように、反応混合物中に十分な濃度の剤を有することが所望される。適切な濃度は滴定によって決定される。上記細胞が分離される媒体は、上記細胞の生存能力を維持する任意の媒体である。標識された細胞は次に好ましくは、先に記載したように、上記細胞表面マーカーの発現について定量される；いくつかのこのような方法も当分野で公知である。
【０１０９】
特異前駆体分析（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ）；または患者検体から取得されたがん幹細胞分析、および参照分析の比較は、好適な演繹プロトコル、人工知能（ＡＩ）システム、統計的比較などの使用によって達成され得る。正常細胞、同様の罹患組織からの細胞などからの参照の特異前駆体分析による比較は、上記疾患病期分類の指標を提供することができる。参照の特異前駆体分析のデータベースを蓄積することができる。特に興味のある分析は、疾患の加速が早期段階で観察されるように、患者を追跡する。本発明の方法は、臨床症状の発症前に加速の検出を提供し、ゆえに早期の治療的介入、たとえば化学療法の開始、化学療法用量の増加、化学療法薬または他の抗がん薬の選択の変更などができるようになる。
【０１１０】
上記選択したマーカーの存在を定量化するために、各種の方法を利用できる。存在する分子の量を測定するために、便利な方法は、蛍光性、発光性、放射性、酵素活性などであり得る検出可能な部分（ｍｏｉｅｔｙ）を持つ分子を、詳細には高い親和性を持つパラメータへの結合に対して特異的な分子を標識することである。蛍光部分は、ほぼ任意の生体分子、構造または細胞種を標識するために容易に利用でき、免疫蛍光部分は、特異的タンパク質だけでなく、特異的高次構造、切断生成物、またはリン酸化などの部位改変も結合するように向けることができる。個々のペプチドおよびタンパク質は、たとえば細胞内部でそれらを緑色蛍光タンパク質キメラとして発現させることにより、工学技術で作製して自己蛍光性にすることができる（総説は、Ｊｏｎｅｓら（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１２）：４７７−８１を参照）。そのため抗体は遺伝的に改変されて、その構造の一部として蛍光染料を提供することができる。選ばれた標識に応じて、パラメータは蛍光標識以外を使用して、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ホモジニアス酵素免疫測定法、および関係のある非酵素的技法などの免疫測定法技法を使用して測定され得る。
【０１１１】
上記腫瘍関連炭水化物抗原および必要に応じて、しかし好ましくは少なくとも１つのさらなるがん幹細胞マーカーを発現する、分析された検体中の細胞の同定は、上記分析された検体中のがん幹細胞の存在を示し、原発性腫瘍における、ならびに転移におけるがん幹細胞ドメインの定義もできるようにし得る。そのほかに、上に記載したように、特異的腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞の同定は、上記がん幹細胞を含む上記がんを処置するための適切な療法を選択できるようにする。
【０１１２】
１実施形態により、本発明による方法で使用される結合剤は、腫瘍特異的炭水化物抗原を特異的に結合する。好ましくは、上に記載したならびに請求項９および１０に定義した本発明の診断に関係のある方法を行うために使用される条件下で、上記結合剤は非がん細胞、非腫瘍細胞、良性がん細胞および／または良性腫瘍細胞で発現される抗原、特に炭水化物抗原を結合しない。本発明の方法でそれぞれ腫瘍特異的結合剤を使用することは複数の利点を有する。上記結合剤が標的細胞およびそのため上記腫瘍特異的炭水化物抗原を発現する細胞のみを認識して、そのため結合するが、同様の抗原、特に同様の炭水化物抗原を発現するだけの非標的細胞を結合しないことが確保される。このことは本発明による方法における偽陽性のリスクを低減する。好適な腫瘍特異的結合剤は、特に上記腫瘍特異的炭水化物抗原がＣＤ１７６である実施形態について上に記載されている。
【０１１３】
好ましい実施形態により、上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する上記結合剤は抗体または抗体の抗原結合フラグメントもしくは誘導体である。
【０１１４】
１実施形態により、検出される上記腫瘍関連炭水化物抗原に特異的な抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞を染色するために使用される。ＣＤ１７６、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７４、ＣＤ１７３およびＣＡ１９−９を結合する抗体の好適な例は上で詳細に記載されている。それは上の開示に言及されている。
【０１１５】
腫瘍関連炭水化物抗原を発現するならびに特にＣＤ１７６、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７４、ＣＤ１７３および／またはＣＡ１９−９を発現するがん種は、上に記載されている。それは上の開示に言及されている。
【０１１６】
１実施形態において、上記患者検体は参照または標準試験値と比較される。別の実施形態において、上記患者検体は、前がん検体と、または上記疾患の経過を通じて１つ以上の時点で取得された患者検体（複数可）と比較される。
【０１１７】
本発明のいくつかの実施形態において、存在するがん幹細胞によってがんの分類および／または臨床病期分類のための方法が提供され、より多数のがん幹細胞は、より高悪性度のがん表現型を示す。
【０１１８】
本発明の別の実施形態において、腫瘍関連炭水化物抗原を発現する単離がん幹細胞の組成物が提供される。そのため、哺乳動物がん幹細胞の組成物も提供され、ここで、上記組成物中の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは（ｍｏｓｔ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）少なくとも９０％の細胞は、腫瘍関連抗原に、好ましくは腫瘍特異的炭水化物抗原に陽性であるがん幹細胞である。
【０１１９】
これらの細胞、組成物はそれぞれ、たとえば、実験的評価のために、ならびに系列および細胞特異的生成物の源として、ならびにそれらに影響することができる因子または剤の発見のための標的として有用である。これらのがん幹細胞、組成物はそれぞれ、上記がん幹細胞に対する効果について剤をスクリーニングする方法で使用され得る。これは候補剤を本発明の細胞集団と組合せること、および次に上記剤から生じる任意の調節効果を決定することを伴う。これは毒性、代謝変化、または細胞機能に対する効果についての上記細胞の検査を含み得る。本明細書に記載するがん幹細胞の表現型は、疾患進行、再発、および薬物耐性の発生を予測する手段を提供する。
【０１２０】
そのほかに、腫瘍関連炭水化物抗原を発現する単離されたがん幹細胞または上記腫瘍関連炭水化物抗原を含むその溶解物、フラグメントもしくは画分の上記組成物は、がん幹細胞をターゲティングする免疫療法目的に有用である。たとえばそれらは、自家または同種異系ワクチンとして使用され得る。これらのがん幹細胞組成物は、全体として生または不活性で（好ましくは、上記細胞は分裂できない）、これら単独のまたは他の剤、例としてアジュバントと組合せた溶解物、フラグメント、画分または精製物として、上記がん幹細胞、上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん、上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現する転移および／または上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現する播種性腫瘍細胞に対する免疫応答を達成するために、動物またはヒトのどちらかを免疫するのに使用することができる。好ましくは、それらは上記腫瘍関連炭水化物自体に対する免疫応答を誘起する。好ましくは、腫瘍関連、好ましくは腫瘍特異的炭水化物抗原を発現する上記がん幹細胞に対する少なくとも１つの結合剤は、これにより取得される。好ましくは、上記取得された結合剤は腫瘍特異的であり、そのため上記腫瘍特異的炭水化物抗原のみを認識および結合するが、がん細胞、好ましくはがん幹細胞で発現されない同様の炭水化物構造は認識および結合しない。
【０１２１】
１実施形態により、上記腫瘍関連炭水化物抗原を含む上記がん幹細胞またはそれの溶解物、フラグメントもしくは画分は、抗原提示細胞ベースワクチンを取得するために使用される。好ましくは、抗原提示細胞、例としてたとえば樹状細胞前駆体はエクスビボで刺激されて、成熟し、がん幹細胞で発現される腫瘍関連炭水化物抗原を取り込んで提示する。この目的のために、上記抗原提示細胞は、腫瘍関連炭水化物抗原を発現する本発明による組成物および／またはその溶解物、フラグメントまたは画分と同時インキュベートすることができる。それらはワクチン接種を受ける患者から入手され得るか、またはそれらは同じ種類のがんを持つ他の患者から入手され得る。成熟樹状細胞は次に上記患者に注射されて、上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞に対する免疫応答を引き出すことができる。好適なおよび好ましい腫瘍関連炭水化物抗原は上に記載され、それはそれぞれの開示に言及されている。
【０１２２】
がん幹細胞で発現される上記腫瘍関連炭水化物抗原を含む、本発明による組成物またはその溶解物、フラグメントもしくは画分を使用することにより取得される上に記載されたワクチンは、がん、転移または播種性（ｄｉｓｓｉｍｉｎａｔｉｎｇ）腫瘍細胞成長を防止、低減または治癒する、好ましくは上記がん幹細胞に対する、好ましくは固形腫瘍の上記がん幹細胞に対する免疫応答を誘起する。
【０１２３】
そのほかに、上記腫瘍関連炭水化物抗原を含む本発明による上記組成物またはその溶解物もしくは画分は、上に記載した治療目的に有用な好適な結合剤を同定および／または単離するのに有用である。たとえばそれらは、がん幹細胞を標的とする好適な結合分子を同定するためのスクリーニング標的として使用することができる。好適なスクリーニング方法は、従来技術で公知である。１実施形態により、結合剤を発現および／またはディスプレイする細胞、ファージ、細菌または酵母は、本発明によるこれらの上述の組成物、上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞または上記腫瘍関連炭水化物抗原を含むその溶解物、画分もしくは精製物へのその結合により、当業者に公知のスクリーニング技術によって選択される。そのほかに、上記腫瘍関連炭水化物抗原を含む本発明による上記組成物またはその溶解物もしくは画分は、免疫原として使用されるときに、好適な結合剤を取得するのに有用である。たとえば好適な抗体を取得するためのそれぞれの免疫方法は従来技術で公知であり、上にも記載されている。
【０１２４】
上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現する興味のある上記がん幹細胞は、上に記載した特徴を有する細胞について富化する技法により細胞の複合混合物から分離され得る。例は上に記載され、これに限定されるわけではないが、上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤を担持する磁性粒子の使用を伴うＦＡＣＳソーティング手順または方法を含む。上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する好適な結合剤は、上に記載されている；それはそれぞれの開示に言及されている。
【０１２５】
１実施形態により、上記腫瘍関連炭水化物抗原はＣＤ１７６、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７４、ＣＤ１７３、およびＣＡ１９−９から成る群より選択され、好ましくはＣＤ１７６、ＣＤ１７４およびＣＤ１７３より選択される。上記腫瘍関連炭水化物抗原に関する詳細事項は上で詳細に記載されている。それは上の開示に言及されている。
【０１２６】
好ましくは、上記組成物は少なくとも１つのさらなる幹細胞マーカーに陽性であるがん幹細胞を含む。好ましくは、上記がん幹細胞は、さらに好ましくは（ｍｏｒｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１３３およびＣＤ１６４から成る群より選択される糖タンパク質を発現する。
【０１２７】
好ましくはＣＤ１７６、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７４、ＣＤ１７３、およびＣＡ１９−９から成る群より選択され、さらに好ましくは（ｍｏｒｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）ＣＤ１７６、ＣＤ１７４およびＣＤ１７３より選択される上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞を単離する工程を含む、がん幹細胞の単離のための方法も提供される。上記方法は以下の工程を含む：
ａ）腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞を含むまたは含むことが疑われる組成物を、腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞を結合するための、上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤と接触させる工程；
ｂ）腫瘍関連炭水化物抗原を発現する少なくとも１つのがん幹細胞を残存する組成物から分離する工程。
【０１２８】
好適な結合剤、それぞれの腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん種および他の詳細事項は、上および下に記載されている。それは上の開示に言及されている。
【０１２９】
組織からのそれぞれの細胞の単離には、適切な溶液が分散または懸濁のために使用され得る。概してこのような溶液は、概して５〜２５ｍＭの低濃度の許容され得る緩衝液と併せてウシ胎仔血清または他の天然に存在する因子が都合よく補われた平衡塩類溶液、たとえばノーマルセーライン（ｎｏｒｍａｌ ｓａｌｉｎｅ）、ＰＢＳ、ハンクス平衡塩類溶液などである。便利な緩衝液は、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液などを含む。
【０１３０】
分離された細胞は、上記細胞の生存能力を維持する、通例、収集チューブ底部に血清のクッションを有する任意の適切な培地に収集され得る。各種の培地が市販され、細胞の性質によって使用され得て、ウシ胎仔血清を補うことが多いｄＭＥＭ、ＨＢＳＳ、ｄＰＢＳ、ＲＰＭＩ、イスコフ培地などが含まれる。
【０１３１】
腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞が高度に富化された組成物が、本様式で達成される。対象集団は、上記細胞組成物の５０パーセントもしくは約５０パーセント以上、好ましくは細胞組成物の７５パーセントもしくは約７５パーセント以上、９０パーセント以上であり得る。所望の上記細胞は、その表面表現型によって同定される。詳細事項は上に記載され、それはそれぞれの開示に言及されている。好ましくはそのがん幹細胞表現型は、幹細胞の必須の特性であるその自己再生能力によって加えて確認される。上記富化されたがん幹細胞集団はただちに使用され得るか、または液体窒素温度にて凍結され、長期間にわたって貯蔵され得、解凍されて、再使用することが可能である。上記細胞はたとえば、１０パーセントのＤＭＳＯ、５０パーセントのＦＣＳ、４０パーセントのＲＰＭＩ１６４０培地で貯蔵され得る。上記腫瘍関連炭水化物抗原および必要に応じてさらなるがん幹細胞マーカーを発現するがん幹細胞が富化された細胞集団は、下記のような多種多様のスクリーニングアッセイおよび培養で使用され得る。
【０１３２】
上記富化されたがん幹細胞集団は、各種の培養条件下にてインビトロで成長され得る。培養培地は液体または半固体であり得て、たとえば寒天、メチルセルロースなどを含有する。上記細胞集団は通常、ウシ胎仔血清（約５〜１０パーセント）、Ｌ−グルタミン、チオール、詳細に２−メルカプトエタノール、および抗生物質、たとえばペニシリンおよびストレプトマイシンを補った適切な栄養培地、例としてイスコフ改変ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０に都合よく懸濁され得る。
【０１３３】
培養物は、上記細胞が反応性である成長因子を含有し得る。成長因子は本明細書で定義されるように、培養物中または無傷の組織中のどちらかで，膜貫通受容体に対する特異的作用を通じて、細胞の生存、成長およびまたは分化を促進することが可能である分子である。成長因子は、ポリペプチド因子および非ポリペプチド因子を含む。多種多様の成長因子、たとえばＬＩＦ、スチール因子（ｓｔｅｅｌ ｆａｃｔｏｒ）（ｃキットリガンド）、ＥＧＦ、インスリン、ＩＧＦ、ＮＧＦなどが細胞を培養するのに使用され得る。成長因子のほかにまたは代わりに、対象細胞は、線維芽細胞、間質細胞または他のフィーダー層細胞との同時培養で成長し得る。
【０１３４】
腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤および使用のための指示を含む、がんの診断、病期分類および／もしくは予後判定、がんの転移挙動の診断、病期分類および／もしくは予後判定、インビボイメージングならびに／またはがんの治療的処置の有効性の監視のためのキットも提供される。好ましくは、上記結合剤はＣＤ１７６、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７４、ＣＤ１７３、およびＣＡ１９−９から成る群より選択される、さらに好ましくは（ｍｏｒｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）ＣＤ１７６、ＣＤ１７４およびＣＤ１７３より選択される、がん幹細胞で発現される腫瘍関連炭水化物抗原を結合する。
【０１３５】
好ましくは、上記結合剤は標識されている。好適な結合剤および標識は上に記載され、それはそれぞれの開示に言及されている。キットは、チューブ、バッファーなどおよび使用のための指示も含み得る。
【０１３６】
好ましい実施形態により、上記キットはさらなる幹細胞マーカーを特異的に結合する少なくとも１つのさらなる剤を含む。好ましくは、上記幹細胞マーカーは糖タンパク質である。好ましい実施形態により、上記キットはＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１３３およびＣＤ１６４から成る群より選択される糖タンパク質を特異的に結合する少なくとも１つのさらなる剤を含む。
【０１３７】
腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞に対する有効性について候補治療剤をスクリーニングする方法も提供され、上記方法は：
ａ）上記剤を本発明による細胞組成物と接触させる工程、および
ｂ）上記腫瘍関連炭水化物抗原に対する上記剤の有効性を決定する工程、
を含む。
【０１３８】
それぞれのスクリーニング方法は、因子および治療剤、例としてがん幹細胞で活性である化学療法剤、結合剤または他の抗がん薬を検出、同定および／または単離するインビトロアッセイおよびスクリーニング方法にとって特に有用である。特に興味があるのは、ヒト細胞で活性である剤のスクリーニングアッセイである。タンパク質結合、細胞成長、分化および機能活性の決定、因子の産生のための免疫測定法；などを含む、多種多様のアッセイが本目的のために使用され得る。
【０１３９】
候補治療剤についてのスクリーニングアッセイでは、通例、興味のある上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞を含む培養物が、興味のある結合剤と接触され、上記剤の効果は出力パラメータ、例としてマーカーの発現、細胞の生存能力などを監視することによって評価される。上記スクリーニングは、上記候補治療剤の非存在下での上記細胞の成長、増殖、生存能力、および／または分化状況と比較して、上記候補治療剤の存在下で上記細胞の成長、増殖、生存能力、および／または分化の調節を決定することも含み得る。
【０１４０】
好ましくは，上記腫瘍関連炭水化物抗原はＣＤ１７６、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７４、ＣＤ１７３、およびＣＡ１９−９から成る群より選択され、さらに好ましくは（ｍｏｒｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）ＣＤ１７６、ＣＤ１７４およびＣＤ１７３より選択された。詳細事項は上に記載され、それはそれぞれの開示に言及されている。
【０１４１】
上記細胞は、上に記載したように新たに単離、培養、遺伝子的に改変されて、シグナル伝達経路などの活性化のためのマーカーを提供し得る。上記細胞は、たとえば独立した培養物中に分けられて、別個の条件下で、たとえば薬物を用いてまたは用いずに；サイトカインまたはその組合せの存在下または非存在下で成長した、クローン培養物の環境誘起バリアントであり得る。応答のタイミングを含む、細胞が剤、詳細には薬理学的剤に応答する様式は、上記細胞の生理的状態の重要な反映である。
【０１４２】
パラメータは、細胞の定量化可能な成分、詳細には望ましくは高スループットシステムで正確に測定することができる成分である。
【０１４３】
候補剤は、上記剤を哺乳動物がん幹細胞の少なくとも１つの組成物に添加することによって、生物活性についてスクリーニングされ、ここで、上記組成物中の上記細胞の少なくとも５０％は興味のある上記腫瘍関連炭水化物抗原に陽性である。上記組成物のさらなる特徴は上に記載され、本発明者らはそれぞれの開示で言及している。上記剤に応答したパラメータの変化が測定され、その結果は、たとえば上記剤の存在および非存在下で、他の剤などを用いて取得された参照培養物に対する比較によって評価される。
【０１４４】
上記剤は、溶解されてまたはただちに可溶性の形態で、培養中の細胞の培地に都合よく添加することができる。上記剤は、フロー・スルー・システムに流れとして間欠的もしくは連続的に添加され得るか、または代わりに、上記化合物のボーラスを単独にまたは増加的に、別の方法で静止している溶液に添加される。フロー・スルー・システムでは、２つの流体が使用され、一方は生理学的に中性の溶液であり、他方は試験化合物が添加された同じ溶液である。その第１の流体は上記細胞を通過して、続いて第２の流体が通過する。単一溶液の方法では、上記試験化合物のボーラスが上記細胞の周りの培地の体積（ｖｏｌｕｍｅ）に添加される。培養培地の成分の全体の濃度は、ボーラスの添加によって、またはフロースルー方法における２つの溶液の間で、有意に変化すべきではない。
【０１４５】
本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル、細胞系、動物種または属、および試薬に制限されず、これらは変化し得ることが理解されるはずである。本明細書で使用される専門用語は特定の実施形態のみを記載する目的のためであり、添付の特許請求の範囲によってのみ制限され、本発明の範囲を制限するものではないことも理解されるはずである。
【実施例】
【０１４６】
Ｉ．肺がん、乳がんおよび肝臓がん幹細胞でのＣＤ１７６（トムゼン−フリーデンライヒ抗原）の発現
１．材料および方法
抗体
適用された抗体は：ＣＤ４４ ｍＡｂ（Ｇ４４−２６，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、フランクリンレイクス、ＮＪ、米国）、ＣＤ１３３ ｍＡｂ（ＡＮＣ９Ｃ５，Ａｎｃｅｌｌ、ベイポート、ＭＮ、米国、ＣＤ１７６ ｍＡｂ（ＮＭ−ＴＦ２，Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）、ＭＵＣ１ ｍＡｂ（ＰａｎｋｏＭａｂ，Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ ＧｍｂＨ）であった。
細胞系および細胞培養
乳腺癌（ＭＤＡ２３１、ＭＤＡ４３５、およびＭＣＦ−７）、肺がん（ＳＰＣ−Ａ−１およびＧＬＣ−８２、肺腺癌；ＮＣＩＨ４４６、小細胞肺癌腫；８０１−Ｄ、巨細胞肺癌腫）、および肝細胞癌腫（ＨｅｐＧ２およびＨｕＨ−７）からのがん細胞系を含む、幅広い多様なヒトがん細胞系を本研究で使用した。すべての細胞系を、１０％ウシ胎仔血清を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で通常どおりに培養した。
免疫細胞化学
培養した細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、ポリリシン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ、米国）コートスライド上に一晩蒔いた。その後、上記培地を慎重に吸引して、上記スライドを空気乾燥させた。包んだスライドを−８０℃にて使用するまで貯蔵することができた。免疫蛍光二重染色のために、細胞を冷（−２０°）アセトンで１５分間固定し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によって３０分間ブロッキングして、ＣＤ１７６に対するｍＡｂと一緒に、ＣＤ４４またはＣＤ１３３に対する抗体とともに６０分間インキュベートした。続いてスライドをフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合体化抗マウスＩｇＭ（μ鎖特異的）（Ｆ９２５９，Ｓｉｇｍａ）およびＣｙ３結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異的）（＃６９７３２，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ウェストグローブ、ＰＡ、米国）の混合物とともにインキュベートした。対比染色を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ）（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉａｎｇｓｕ，中国）を用いて行った。陰性対照は特異的ｍＡｂの代わりに培地で行った。上記スライドをグリセロールでマウントし、共焦点顕微鏡法（オリンパス、東京、日本）および蛍光顕微鏡法によって分析した。陽性細胞または二重陽性細胞のパーセンテージをデジタル画像上でカウントした。
フローサイトメトリー分析
細胞系の細胞懸濁物を１×１０６細胞／１００μｌにて調製した。細胞を、２％ＢＳＡを含有するＰＢＳを用いて２回洗浄し、適切な希釈度の１次抗体によって４℃にて２０分間、続いて適切な濃度の抗ＩｇＧ−Ｃｙ３（γ鎖特異的）および抗ＩｇＭ−ＦＩＴＣ（μ鎖特異的）によって４℃にて２０分間インキュベートした。フローサイトメトリーをＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、フランクリンレイクス、ＮＪ、米国）を用いて行った。１０，０００細胞から収集したデータおよびＷｉｎＭＤＩソフトウェアをＦＣＳデータファイルの分析に使用した。
【０１４７】
４−ヒドロキシタモキシフェン処置のために、ＭＤＡ２３１、ＭＤＡ４３５およびＭＣＦ−７乳腺癌細胞系を２０ｎＭの最終濃度の４−ＯＨＴ（＃Ｈ６２７８，Ｓｉｇｍａ）に２４時間曝露した。次にフローサイトメトリー分析を上に記載したように行った。
組織および免疫組織化学
２１症例の肺癌腫（１３症例の腺癌および８症例の扁平上皮癌腫）、１５症例の乳癌腫、および２１症例の肝細胞癌腫（ＨＣＣ）の被検物を、最初の手術を受けた患者から取得した。上記検体は、患者の機密保護のため完全にコード化され、すべての参加施設の地域研究倫理委員会によって承認された。
【０１４８】
新たな組織をプラスチック型内のＯＣＴ化合物で−２０℃にて（最適切断温度）慎重に包埋して、クリオスタットチャンバ内での平衡化後に４〜８μｍ切片に切断し、冷（−２０°）アセトンによって１５分間固定した。免疫蛍光二重染色のために、上記組織切片を適切な希釈度の１次抗体で６０分間ブロッキングおよびインキュベートして、続いて抗ＩｇＧ−Ｃｙ３（γ鎖特異的）および抗ＩｇＭ−ＦＩＴＣ（μ鎖特異的）２次抗体とともにインキュベートし、ＤＡＰＩで対比染色して、顕微鏡分析のためにスライドガラスをグリセロールでマウントした。免疫ペルオキシダーゼ染色のために、上記組織切片を３％Ｈ２Ｏ２で３０分間処理して、内因性ペルオキシダーゼを遮断し、ＰＢＳで３回洗浄して、２％ＢＳＡによってブロッキングした。上記組織切片を上記１次抗体とともにインキュベートして、次にペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗血清（ＤＡＫＯ、コペンハーゲン、デンマーク）で処理した。陰性対照は上記ｍＡｂの代わりにＰＢＳ中２％ＢＳＡを用いて行った。抗ＭＵＣ ｍＡｂ（ＰａｎｋｏＭａｂ）をすべてのバッチの肺癌腫被検物において陽性対照として使用した。ペルオキシダーゼ基質ジアミノベンジジンによって発色させた。ヘマトキシリンによって対比染色を行った。細胞数を１００×倍率にてニコン顕微鏡を用いてカウントした。二重陽性細胞のパーセンテージをデジタル画像上で見積もった。
サンドイッチＥＬＩＳＡ
１００万個の細胞をプロテアーゼインヒビタ（＃５３９１３４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ダルムシュタット、ドイツ）の混合物を含有する１ｍｌの１％トリトン−１００（１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中）で処理して、振動によって４℃にて３０分間ホモジナイズした。遠心分離機で１５，０００ｇにて１０分間の遠心分離の後、上清を取った。９６ウェルのポリスチレンマイクロプレートを、１μｇ／ｍｌの作業濃度の、ＣＤ４４に対する捕捉抗体によって４℃にて１４時間コートした。残存するタンパク質結合部位を５％ＢＳＡによってブロッキングした後、１００μｌの抗体上清をウェルに添加して、室温にて２時間インキュベートした。次に上記プレートをＣＤ１７６ｍＡｂとともに、続いてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（μ鎖特異的）（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、バーミングハム、ＡＬ、米国）によってインキュベートした。呈色反応を、ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）溶液によって室温にて生じさせた。上記反応を２．５Ｍ硫酸によって停止した。陰性対照は上記ｍＡｂｓの代わりにＰＢＳ中２％ＢＳＡで行った。各ウェルの光学密度は、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ハーキュリーズ、ＣＡ、米国）を使用して４９２ｎｍにて３０分以内に決定した。
統計解析
データをカイ２乗検定またはフィッシャーの正確確率検定のどちらかによって分析した。計数データのピアソンの相関分析も行った。Ｐ＜０．０５の値は統計的に有意と見なされた。
２．結果
肺がん、乳がん、および肝臓がん細胞系におけるＣＤ４４およびＣＤ１３３の発現
ＣＤ４４は、大半の上記がん細胞系において、６０％を超える細胞で検出された。１つの細胞系ＨｕＨ−７（ＨＣＣ）は、低いパーセンテージのＣＤ４４陽性細胞を示した。ＣＤ１３３＋細胞は、８０１−Ｄ（巨細胞肺癌腫）およびＨｕＨ−７（ＨＣＣ）を除く本研究で使用した細胞系（上記細胞の１％未満）にて、ごく小さい亜集団を表した。これらの細胞系は常に、ＣＤ１３３を上記細胞のうちの１５％および６％の表面でそれぞれ発現した。
肺がん、乳がん、および肝臓がん細胞系におけるＣＤ１７６の発現
ｍＡｂ ＮＭ−ＴＦ２を用いたフローサイトメトリーおよび免疫細胞化学分析を通じて、本発明者らはＣＤ１７６が上記細胞の表面および細胞質に局在することを見出した。上記細胞系は、ＣＤ１７６をさまざまな強度で発現した：ＭＤＡ２３１、ＭＤＡ４３５（乳腺癌）、およびＨｕＨ−７（ＨＣＣ）は５％から３０％の陽性細胞を含有した；ＳＰＣ−Ａ−１（肺腺癌）、８０１−Ｄ（巨細胞肺癌腫）、およびＨｅｐＧ２（ＨＣＣ）は３０％から６０％の陽性細胞を明らかにした；ＧＬＣ−８２（肺腺癌）、ＮＣＩＨ４４６（小細胞肺癌腫）、およびＭＣＦ−７（乳腺癌）は、６０％超の陽性細胞を有した。
肺がん、乳がん、および肝臓がん細胞系におけるＣＤ１７６、ＣＤ４４、ＣＤ１３３の同時発現
ＣＤ４４およびＣＤ１３３は、がん開始細胞の認められたマーカーであるため（Ｃｈｕら、２００９；Ｂａｏら、２００６；Ｐｏｎｎｕｓａｍｙ ａｎｄ Ｂａｔｒａ ２００８）、本発明者らは一方または両方がＣＤ１７６と同時発現されるかどうかを調べた。細胞系における二重免疫蛍光染色実験は、ＣＤ４４およびＣＤ１７６が細胞表面に局在して、単一細胞または細胞クラスタの同時発現を呈することを実証した（図１．１、ａ−ｉ）。フローサイトメトリー実験は、以下の同時発現データを明らかにした。ＭＣＦ−７（乳腺癌）は約７％のＣＤ４４＋／ＣＤ１７６＋細胞を含有して、ＳＰＣ−Ａ−１、８０１−ＤおよびＨｅｐＧ２は、３０％から６０％のＣＤ４４＋／ＣＤ１７６＋細胞を含有し、ＧＬＣ−８２およびＮＣＩＨ４４６は６０％を超えるＣＤ４４＋／ＣＤ１７６＋細胞を有した（表１．１、図１．１、１．２を参照）。
【０１４９】
【表１．１】
対照的に、大半の細胞系は、ごく少数の、ＣＤ１３３＋／ＣＤ１７６＋表現型を持つ細胞（１％未満）を含有していた。例外として、８０１−ＤおよびＨｕＨ−７は、５％超の、ＣＤ１３３＋／ＣＤ１７６＋表現型を持つ細胞を有していた（表１．２）。
【０１５０】
【表１．２】
ＣＤ４４およびＣＤ１７６発現が外因性（ｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓ）処理によって同時に影響されたかどうかを評価するために、エストロゲン受容体リガンドのタモキシフェン（４−ＯＨＴ）を乳がん細胞に添加した（２４時間、２０ｎＭ）。本発明者らの結果は、フローサイトメトリーによって示されるように、ＭＤＡ２３１およびＭＣＦ−７ではＣＤ４４＋／ＣＤ１７６＋同時発現細胞の数の有意な増加がなかったのに対して、ＭＤＡ４３５では、ＣＤ４４＋／ＣＤ１７６＋細胞のパーセンテージが処理後に増加したことを示した（図１．２Ｂ）。
肺癌腫組織におけるＣＤ１７６の発現
本研究において、ｍＡｂ ＮＭ−ＴＦ２を採用して肺癌腫組織におけるＣＤ１７６の発現を調査した。２１名の患者から調べた組織は、１３名の腺癌および８名の扁平上皮細胞癌腫を含んでいた。ＣＤ１７６は細胞表面および細胞質中に分布していた。例を図１．１のｊとｋに示す。肺癌腫におけるＣＤ１７６−陽性細胞のパーセンテージを表３に示す。肺癌腫の４症例が５０％超の陽性細胞を明らかにした。これらのデータは、同時発現実験の前提である以前の論文（Ｔｏｍａら、１９９９）とは対照的に、肺がん組織におけるＣＤ１７６の発現を確認している。ＣＤ１７６発現は、統計解析を使って臨床病理学的特徴と比較された。＞５％の陽性細胞を示す症例は、陽性と定義された。その結果は、ＣＤ１７６の状態（ｓｔａｔｕｓ）と腫瘍悪性度ならびに肺癌腫を持つ患者における転移との間の相関を示す（Ｐ＜０．０５）。しかし、ＣＤ１７６の発現と患者の年齢、性別、または組織学的サブタイプ（腺癌または扁平上皮細胞癌腫）を含む他の臨床病理学的特徴との間に統計的に有意な相関はなかった。
肺癌腫組織、乳癌腫組織、および肝細胞癌腫組織におけるＣＤ１７６とＣＤ４４またはＣＤ１３３との同時発現
問題の組織におけるＣＤ４４、ＣＤ１３３およびＣＤ１７６発現についての免疫組織化学データを表１．３に示す。上記がん細胞系と同様に、ＣＤ４４はすべての癌腫において、高い（６０％を超える）パーセンテージで強くおよび散在して発現された。ＣＤ１３３＋細胞は、所与の癌腫組織のうちで細胞の亜集団（全がん細胞の１０％未満）のみを除いて、大半の症例で見出された。肺癌腫の２症例、乳癌腫の３症例およびＨＣＣの１症例はＣＤ１３３を全く発現しなかった。ＣＤ１３３＋細胞は、散乱パターンまたはクラスタ化された形態で存在した。ＣＤ１３３発現は肺癌腫において、性別、年齢または組織学的サブタイプとのいずれの統計的に有意な相関も示さなかった。
【０１５１】
【表１．３】
上記新たな臨床検体におけるＣＤ１７６とＣＤ４４またはＣＤ１３３の同時発現を調べた。上記がん性組織における二重染色結果は、５〜３０％のＣＤ４４＋細胞がＣＤ１７６を同時に発現して（表１．４を参照）、ＣＤ１３３＋細胞の大半もＣＤ１７６を発現することを示した。しかし本発明者らは、上記マーカーのうちの１つについて陽性の各細胞において、ＣＤ１７６とＣＤ４４またはＣＤ１３３の同時発現が見られないことにも注目した。いくつかのＣＤ４４＋細胞およびＣＤ１３３＋細胞はＣＤ１７６を発現せず、逆の場合も同様であった。上記ＨＣＣは、肺癌腫または乳癌腫のどちらよりも、ＣＤ１３３＋ＣＤ１７６＋表現型を持つ細胞を著しく多く有していた。肺癌腫におけるＣＤ１７６の状態（ｓｔａｔｕｓ）とＣＤ１３３の状態（ｓｔａｔｕｓ）との間に統計的に有意な相関があった（Ｐ＜０．０５）。臨床病理学的特徴と上記ＣＤ４４＋ＣＤ１７６＋表現型との間の相関は本研究では見られなかった。
【０１５２】
【表１．４】
ＣＤ１７６を担持するＣＤ４４の検出
複数の癌腫細胞系において、ＣＤ１７６の潜在的糖タンパク質キャリア分子をサンドイッチＥＬＩＳＡによって分析した。本発明者らは捕捉抗体としてのＣＤ４４でコートしたポリスチレンマイクロプレートを使用して、ＣＤ４４糖タンパク質を細胞全体の溶解物から収集した。上記プレートを次に検出抗体としてのＮＭ−ＴＦ２（ＣＤ１７６）とともにインキュベートした。表１．５に示すように、捕捉されたＣＤ４４は、すべての（４）肺および（２）肝臓がん細胞系ならびに３つの乳がん細胞系のうちの２つにおいてＣＤ１７６ｍＡｂと反応することが見出され、これらの症例において、ＣＤ４４が明白にＣＤ１７６のキャリアであることが示された。
【０１５３】
【表１．５】
【０１５４】
【表１．６】
３．考察
多数の刊行物によって、すべてではないにしても大半の腫瘍種の開始、維持、および分散が、がん開始細胞またはがん幹細胞と呼ばれる細胞の小集団に本質的に起因するという見解が一般に受け入れられるようになった（Ｃｈｕら、２００９；Ｂａｏら、２００６）。
【０１５５】
がん幹細胞は、活発に増殖する腫瘍細胞に分化する性向を呈する。それらは腫瘍塊の細胞の大部分とは明確に異なるが、それらはがん療法において（同時）ターゲティングされるべきである。非常に多くの、多かれ少なかれ特異的ながん開始細胞のマーカーが、近年記載されている。これらのマーカーの重要点は、それらが多すぎること、およびそれらが十分に一貫したものでないことである。上記マーカーの中で最も広く受け入れられているのは、ＣＤ４４である（Ｐｏｎｎｕｓａｍｙ ａｎｄ Ｂａｔｒａ ２００８；Ｓｈｉｐｉｔｓｉｎら、２００７）。別の膜糖タンパク質のＣＤ１３３も、脳、結腸、肺、および他の固形腫瘍におけるがん開始集団を同定可能であることが提案されている（Ｔｉｒｉｎｏら、２００８）。ＣＤ１３３は、患者における全体的な低い生存を悪性腫瘍と相関させる独立した予後判定マーカーである（Ｈｏｒｓｔら、２００８）。しかし近年の報告は、ＣＤ１３３陰性細胞もＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて長期腫瘍形成が可能であることを示した（Ｓｈｍｅｌｋｏｖら、２００８）。
【０１５６】
本発明の基礎をなす本研究において、ＣＤ４４およびＣＤ１３３の発現が細胞系ならびに肺がん、乳がん、および肝臓がんからの臨床検体において評価された。腫瘍細胞の大多数が、ＣＤ４４に対して陽性に染色されることが見出された。対照的に、研究したがん細胞系の大半では、低いＣＤ１３３発現が明らかになった。ＣＤ１３３は肺がん、乳がんおよび肝臓がん組織において、染色後にさまざまな強度にて常に発現された。他の著者らは、ＣＤ１３３が結腸がん（Ｒｉｃｃｉ−Ｖｉｔｉａｎｉら、２００７）、ならびに非小細胞肺がん（Ｔｉｒｉｎｏら、２００９）および脳腫瘍（Ｓｉｎｇｈら、２００４）においてそれぞれ、腫瘍細胞の総数の約２．５％および６〜２９％で発現されたことを報告している。
【０１５７】
次に、がん開始細胞のこれら２つのマーカーであるＣＤ４４およびＣＤ１３３と、ＣＤ１７６との同時発現が分析された。とりわけ肺癌腫細胞系およびＨｅｐＧ−２において、高いパーセンテージの細胞が、ならびに他のすべての調べた細胞系においてかなりの数が、ＣＤ１７６およびＣＤ４４を同時発現するとして見出された。調べた肺がん組織、乳がん組織および肝臓がん組織において、ＣＤ１７６およびＣＤ４４を同時発現する細胞の数は５〜３０％に達した。ＣＤ１７６およびＣＤ１３３を同時発現する細胞の数は、すべての症例ではるかに少なかったが（ＣＤ１３３発現細胞の総数と同様に）、同時発現細胞は完全に存在しないわけではなかった。
【０１５８】
ここに紹介するデータは、ＣＤ１７６が成熟がん細胞だけではなく、固形腫瘍のがん開始細胞でも発現されることを実証する。このことは魅力的な治療標的としてのＣＤ１７６に追加の重みを添加する。ＣＤ１７６＋乳がん細胞の数がタモキシフェン（４−ＯＨＴ）による処理後に向上するかどうかも分析された。タモキシフェンは、Ｇ０／Ｇ１成長停止を誘起して、乳がん細胞の増殖を抑制することが報告された。近年の研究は、タモキシフェン処置が乳房がん幹細胞様細胞の数を増加したことを示した（Ｍａｎｉら、２００８）。本発明者らの研究において、乳がん細胞のタモキシフェン処理は、３つの細胞系のうち１つ（ＭＤＡ−４３５）においてＣＤ４４＋／ＣＤ１７６＋表現型を向上させた。がん幹細胞の理論によると、がんの再発および転移はがん開始細胞に依存する。上記腫瘍塊とは異なる特性を持つこのような細胞の集団の現存は、従来の療法、たとえばタモキシフェンによる処置ががんを抑止するが、がんを完全に根絶できないことが多い理由を説明し得る。反対に、この処置はがん開始細胞の数を向上さえし得る（Ｍａｎｉら、２００８）。理論的に、がん開始細胞の排除は、腫瘍の再燃を防止することが可能である。標的がん開始細胞に対する新たな治療手法の開発はゆえに、がん療法に対して深い影響力を有し得る。そのため、固形腫瘍のがん開始細胞でのＣＤ１７６の同定は、ＣＤ１７６ベース免疫療法の今後の利用にとって重要である。
【０１５９】
ＣＤ１７６のデマスキングは、細胞膜に存在するすべての可能性のある候補糖タンパク質のうち少数のみを伴う選択的プロセスであるようである。上皮細胞においてこれまでに同定されたＣＤ１７６の最も突出したキャリア分子は、たとえば結腸直腸癌腫における多型上皮ムチンＭＵＣ−１である（Ｂａｒｒら、１９８９；Ｃａｏら、１９９７；Ｂａｌｄｕｓら、１９９８）。ここでＣＤ４４が、分析された細胞におけるｃｏｒｅ−１のキャリア分子であるかどうかが決定された。この目的のために、本発明者らは特殊なサンドイッチＥＬＩＳＡを適用して、それを用いて肺がん、乳がんおよび肝臓がんを調べた。本発明者らのデータは、結腸直腸癌腫以外の腫瘍において、ＣＤ１７６がＣＤ４４によって顕著に担持されていたことを示唆している。ＣＤ１７６抗原は、肺患者における予後判定の有用なマーカーであることが見出されたが（Ｔａｋａｎａｍｉ １９９６）、この組織におけるそれの発現について矛盾する報告が残っている（Ｔｏｍａら、１９９９）。本発明者らの研究において、本発明者らは、十分に特徴付けられていて、免疫組織化学および他の技法に適しているモノクローナル抗体ＮＭ−ＴＦ２を採用することによって、本課題を再度調べた。高度のＣＤ１７６発現が大半の肺がん細胞系で観察された。臨床肺がん検体において、本発明者らは、５０％を超える症例がカットオフ値（５％陽性細胞）を超えるＣＤ１７６＋であることも見出した。
【０１６０】
要するに、ＣＤ１７６（トムゼン−フリーデンライヒ抗原、ｃｏｒｅ−１）発現は、ヒト肺癌腫、乳癌腫および肝臓癌腫ならびにこれらの悪性腫瘍に由来する細胞系で見出された。ヒト肺癌腫、乳癌腫および肝臓癌腫におけるＣＤ４４およびＣＤ１７６の、ならびにＣＤ１３３およびＣＤ１７６の同時発現は、ＣＤ１７６が成熟がん細胞で発現されるだけでなく、がん開始細胞でも発現されることを実証した。このことにより、正常および良性成人ヒト組織ではほぼ存在しない（Ｃａｏら、１９９６）ＣＤ１７６が、腫瘍療法のためのなおさらに有望な標的となる。
【０１６１】
ＩＩ．乳がん開始細胞でのＣＤ１７３（Ｈ２）およびＣＤ１７４（ルイスＹ）とＣＤ４４との同時発現
１．材料および方法
細胞系および細胞培養
本研究では、乳腺癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、およびＭＣＦ−７を使用した。これらの細胞系を、１０％ウシ胎仔血清を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で通常どおりに培養した。上記細胞を３７℃にて、５％ＣＯ２／９５％空気の、１００％相対湿度に近い雰囲気中で成長させた。
免疫細胞化学
上記細胞を培養培地中のポリリシン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ、米国）コートスライド上に一晩蒔いた。その後、上記培地を慎重に吸引して、上記スライドを空気乾燥させた。包んだスライドを−８０℃にて使用するまで貯蔵することができた。免疫細胞化学では、細胞を冷（−２０℃）アセトンで１５分間固定して、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３０分間ブロッキングし、ＣＤ４４ ｍＡｂ（Ｇ４４−２６、マウスＩｇＧ２ｂ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、フランクリンレイクス、ＮＪ、米国）とともに、どちらもＧｌｙｃｏｔｏｐｅ ＧｍｂＨ（ベルリン、ドイツ）からのｍＡｂ ＣＤ１７３（Ａ４６−Ｂ／Ｂ１０、マウスＩｇＭ、Ｋａｒｓｔｅｎ １９８８）またはＣＤ１７４（Ａ７０−Ｃ／Ｃ８、マウスＩｇＭ）と一緒に６０分間インキュベートした。加えて上記ＣＤ１３３抗体（ＡＮＣ９Ｃ５，Ａｎｃｅｌｌ、ベイポート、ＭＮ、米国）を使用した。上記スライドを続いて、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合体化抗マウスＩｇＭ（μ鎖特異的）（Ｆ９２５９，Ｓｉｇｍａ）およびＣｙ３結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異的）（＃６９７３２，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ウェストグローブ、ＰＡ、米国）の混合物とともにインキュベートした。対比染色を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ）（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉａｎｇｓｕ、中国）を用いて行った。陰性対照は、特異的ｍＡｂの代わりにマウス血清とともにインキュベートした。上記スライドをグリセロールでマウントし、蛍光顕微鏡法によって分析した。
フローサイトメトリー分析
確立された細胞系からの細胞懸濁物を１×１０６細胞／１００μｌの密度で調製した。これらを２％ＢＳＡを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１次抗体とともに４℃にて２０分間、続いて適切な濃度の抗ＩｇＧ−Ｃｙ３（γ鎖特異的）および抗ＩｇＭ−ＦＩＴＣ（μ鎖特異的）によって４℃にて２０分間インキュベートした。フローサイトメトリーをＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、フランクリンレイクス、ＮＪ、米国）で行った。１０，０００細胞から収集したデータおよびＷｉｎＭＤＩソフトウェアをＦＡＣＳデータファイルの分析に使用した。
【０１６２】
４−ヒドロキシタモキシフェン処理のために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＣＦ−７乳腺癌細胞系を２０ｎＭの最終濃度の４−ＯＨＴ（＃Ｈ６２７８，Ｓｉｇｍａ）に２４時間曝露した。次にフローサイトメトリー分析を上に記載したように行った。
免疫沈降
１００万個の細胞をプロテアーゼインヒビタ（＃５３９１３４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ダルムシュタット、ドイツ）の混合物を含有する、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中の１％トリトン１００ １ｍｌで処理して、振動によって４℃にて３０分間ホモジナイズした。１５，０００ｇにて１０分間の遠心分離の後、上清を取った。プロテインＧアガロースビーズ（＃Ｐ−４６９１，Ｓｉｇｍａ）を事前に浄化して非特異的結合物質を除去し、次に振とう機上で抗ＣＤ４４抗体と共に４℃にて４時間インキュベートした。上記プロテインＧアガロースビーズを上清に添加して、転倒型ミキサーで４℃にて一晩インキュベートした。上記ビーズを遠心分離によって収集して、洗浄した。そのペレットをＳＤＳ−ポリアクリルアミド（ｐｏｌｙｃａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）検体緩衝液に再懸濁させて、５分間煮沸させた。免疫沈降物を続いてポリアクリルアミドゲル（８％）上で分離して、ウェスタンブロッティングで抗ＣＤ１７３および抗ＣＤ１７４抗体を使用してプローブした。
サンドイッチＥＬＩＳＡ
９６ウェルのポリスチレンマイクロプレートを、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの、ＣＤ４４に対する捕捉抗体を用いて４℃にて１４時間コートした。５％ＢＳＡによってブロッキングした後、上に記載したように調製した上清１００μｌをウェルに添加して、室温にて２時間インキュベートした。次にプレートをＣＤ１７３またはＣＤ１７４ｍＡｂとともに、続いてペルオキシダーゼ−標識ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（μ鎖特異的）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、バーミングハム、ＡＬ、米国）によってインキュベートした。呈色反応を、ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）溶液を用いて室温にて生じさせた。上記反応を２．５Ｍ硫酸によって停止した。陰性対照は上記ｍＡｂの代わりに２％ＢＳＡを用いて行った。各ウェルの光学密度は、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ハーキュリーズ、ＣＡ、米国）を使用して４９２ｎｍにて３０分以内に決定した。
組織および免疫組織化学
１５症例の乳癌腫被検物を最初の手術を受けた患者から取得した。上記検体は、患者の機密保護のため完全にコード化され、本研究および研究プロトコルはすべての参加施設の地域研究倫理委員会によって承認された。
【０１６３】
その新たな組織をプラスチック型内のＯＣＴ化合物で−２０℃にて（最適切断温度）慎重に包埋して、クリオスタットチャンバ内での平衡後に４〜８μｍ切片に切断し、冷（−２０°）アセトンによって１５分間固定した。次に免疫蛍光二重染色を上に記載したように行った。細胞数を１００×倍率にてニコン顕微鏡を用いてカウントした。二重陽性細胞のパーセンテージをデジタル画像上で見積もった。
【０１６４】
追加の３症例の乳房腺管内癌腫（ｂｒｅａｓｔ ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）において、本発明者らは免疫ペルオキシダーゼ染色も行った。組織切片を３％Ｈ２Ｏ２によって３０分間処理して、内因性ペルオキシダーゼを抑止し、ＰＢＳで３回洗浄し、２％ＢＳＡによってブロッキングした。その組織切片をＣＤ１７３抗体でインキュベートして、次にペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗血清（ＤＡＫＯ、コペンハーゲン、デンマーク）で処理した。陰性対照は上記ＣＤ１７３抗体の代わりに２％ＢＳＡを用いて行った。ジアミノベンジジンによって発色させた。ヘマトキシリンによって対比染色を行った。
統計解析
統計解析は、対応のないｔ検定、フィッシャーの正確確率検定、またはスペアマン相関検定を使用して行った。データは平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表された。Ｐ＜０．０５は統計的に有意と見なされた。
２．結果
乳がん細胞系でのＣＤ１７３およびＣＤ１７４の発現
フローサイトメトリー分析および免疫組織学的染色は、ＣＤ１７３およびＣＤ１７４が細胞表面に局在することを明らかにした（図２．１ａ）。上記乳がん細胞系（ｂｒｅａｓｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）は、頻繁なＣＤ１７３およびＣＤ１７４発現を示した：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＣＦ−７は、約２７％、９２％および８０％のＣＤ１７３陽性細胞、ならびに約４４％、５７％および７２％のＣＤ１７４陽性細胞をそれぞれ含有していた。
乳がん細胞系でのＣＤ４４とＣＤ１７３またはＣＤ１７４との同時発現
免疫細胞学的染色実験は、乳がん細胞でのＣＤ１７３またはＣＤ１７４とＣＤ４４との同時発現を調査するために行った。本発明者らは多くの細胞において、ＣＤ４４染色とＣＤ１７３およびＣＤ１７４とのオーバーレイを観察した；例を図１ａ−ｃに与える。フローサイトメトリー実験からの半定量的データを図２．２Ａに示し、表２．１にまとめる。
【０１６５】
【表２．１】
ＣＤ４４、ＣＤ１７３およびＣＤ１７４発現が外因性（ｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓ）処理後に同時に影響されたかどうかを評価するために、本発明者らは乳がん培養細胞を４−ＯＨＴによって処理した。半定量的フローサイトメトリー分析において、４−ＯＨＴ処理はＭＤＡ２３１におけるＣＤ４４＋ＣＤ１７３＋およびＣＤ４４＋ＣＤ１７４＋細胞のパーセンテージを増加させたが（Ｐ＜０．０５）（図２．２Ｂ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＣＦ−７細胞では増加させなかった（Ｐ＞０．０５、データは示さず）。
乳癌腫組織におけるＣＤ４４またはＣＤ１３３とＣＤ１７３またはＣＤ１７４との同時発現
調べた１５の乳癌腫組織のうち、ＣＤ４４、ＣＤ１７３およびＣＤ１７４染色も主として細胞膜にて観察された。ＣＤ４４、ＣＤ１７３およびＣＤ１７４陽性細胞は、散乱パターンまたはクラスタ化パターンで存在し、そのパターンは個人間で変わった。ＣＤ１７３およびＣＤ１７４陽性細胞は、大半の症例で見出された。ＣＤ１７３およびＣＤ１７４陽性細胞の平均パーセンテージは、全がん細胞のそれぞれ５１％および５２％であった。ＣＤ４４はすべての症例で、強い免疫反応性を示した（陽性染色癌腫細胞は５３％に達した）。興味深いことに、増加したＣＤ１７３およびＣＤ１７４発現を持つ症例は、上昇したＣＤ４４発現と相関していた（Ｐ＜０．０５）。最も重要なことに、９５％を超えるＣＤ１７３およびＣＤ１７４陽性細胞はそれぞれＣＤ４４抗原を同時発現した（図２．１、ｄ〜ｉ）。
【０１６６】
ＣＤ１３３もがん開始細胞のマーカーである。ゆえに本発明者らはＣＤ１７３またはＣＤ１７４がこのマーカーと共に乳癌腫組織において同時発現されるかどうかを問うた。本発明者らはＣＤ１３３が、実際、より低いパーセンテージであるが、ＣＤ１７３およびＣＤ１７４と同時発現されたことを見出した（図２．１ｊ−ｌ）。加えて、発明者らは、増加したＣＤ１７３およびＣＤ１７４発現を持つ症例が、上昇したＣＤ１３３発現と相関することを見出した（Ｐ＜０．０５）（データを示さず）。
乳房腺管内癌腫（ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）の基底細胞でのＣＤ１７３の発現
３症例の乳房腺管内癌腫において、ＣＤ１７３ｍＡｂは残存する管壁の基底細胞を染色した（図２．３）。同じ切片の移行組織の正常な管において、周囲管（主に基底）細胞層は、ＣＤ１７３に対して時折陽性であるのみであった。これらの細胞におけるＣＤ１７３の発現は、個人のＡＢＨ血液型タイプおよび分泌型の状態（ｓｔａｔｕｓ）から独立していた（データを示さず）。
ＣＤ１７３またはＣＤ１７４を担持するＣＤ４４についての証拠
ＣＤ１７３またはＣＤ１７４を担持する潜在的糖タンパク質は、３つの乳癌腫細胞系において免疫沈降によりおよびサンドイッチＥＬＩＳＡで分析された。３つの細胞系の溶解物からのＣＤ４４免疫沈降物は、ｍＡｂ ＣＤ１７３およびＣＤ１７４を使用する免疫ブロット分析を施された。どちらの抗体もＣＤ４４バンドを染色した（図２．４）。
【０１６７】
捕捉抗体としての抗ＣＤ４４を用い、続いてどちらの抗体も調べた３つの細胞系すべてで陽性を記録した、ｍＡｂ ＣＤ１７３およびＣＤ１７４によるサンドイッチＥＬＩＳＡは、ＣＤ１７３およびＣＤ１７４エピトープがＣＤ４４分子で発現されていることを示した（表２．２）。
【０１６８】
【表２．２】
３．考察
がん開始細胞の現存は、脳がん、肺がんおよび乳がんにおいて十分に文書記録されている（Ｔｉｒｉｎｏ，２００８）。それらは多系統分化できる、自己再生する、静止したおよび多分化能の細胞として機能的に定義されている。がん幹細胞の理論によると、がんの再発および転移はがん開始細胞に依存する（Ｇｉｌｂｅｒｔ，２００９）。がん開始細胞またはがん幹細胞は、上記腫瘍塊の細胞の大部分とは明確に異なるので、がん開始細胞での表面分子の発現および機能を研究することは、腫瘍生物学の重要な側面である。
【０１６９】
本研究で本発明者らは、乳癌腫においてＣＤ１７３および／またはＣＤ１７４ががん開始細胞マーカーＣＤ４４と共に同時発現されるかどうかを調べた。
【０１７０】
本研究は、ＣＤ４４が、ＣＤ１７３またはＣＤ１７４と共に細胞表面に位置して、培養された乳がん細胞のかなりの部分および乳がんから取った組織被検物において同時発現を呈することを示すものである。タモキシフェンが乳房がん幹細胞の数を増加させることが報告された（Ｍａｎｉ，２００８）。本研究において、ＣＤ４４＋／ＣＤ１７３＋またはＣＤ４４＋／ＣＤ１７４＋乳がん細胞の数は、タモキシフェン（４−ＯＨＴ）処理後に培養された細胞において向上させること可能であった。ゆえに本発明者らは、乳がんにおいてＣＤ４４がＣＤ１７３およびＣＤ１７４と同時発現されると結論付ける。
【０１７１】
興味深い観察は、乳房腺管内癌腫の症例において残存する管壁細胞のＣＤ１７３に対する強い染色であった。これは、拡張する腫瘍塊の機械的ストレス下での幹細胞様基底細胞の増殖活性を示す。Ｈ抗原およびＬｅＹ抗原は発生制御抗原であるため、この現象はこれらの細胞の進行中の上皮間葉移行（ＥＭＴ）も示す場合もある。
【０１７２】
２型ベースのＡＢＨオリゴ糖は、複数の異なる糖タンパク質および糖脂質に担持されている（Ｈａｋｏｍｏｒｉ，１９８１）。上皮性卵巣がんにおいて、ＣＤ１７４の主なキャリアタンパク質はＣＡ１２５およびＭＵＣ１である（Ｙｉｎ，１９９６）。ＣＤ３４＋造血幹細胞において、ＣＤ１７３およびＣＤ１７４の主なキャリアは１７０ｋＤａ糖タンパク質である（Ｃａｏ，２００１）。ＣＤ４４はＨ抗原のキャリアでもある（Ｒａｐｏｐｏｒｔ，１９９９）。ここで本発明者らはサンドイッチＥＬＩＳＡおよび免疫沈降を使用して、ＣＤ４４が乳がん細胞においてＣＤ１７３およびＣＤ１７４の主なキャリアであることを実証している。
【０１７３】
癌腫によって発現された糖タンパク質でのＣＤ１７３およびＣＤ１７４構造は、接着、細胞凝集、浸潤、および転移に寄与すると考えられる。ＣＤ１７４は、腫瘍関連新脈管形成の間の早期細胞間接触に関与する（Ｍｏｅｈｌｅｒ，２００８）。組織化学単独では、がん開始細胞でのＣＤ１７３およびＣＤ１７４の発現の機能および重要性が何であるかを決めることはできない。しかし、癌腫におけるＣＤ１７３およびＣＤ１７４発現の病態生理学的重要性が実証されている。ＣＤ１７３およびＣＤ１７４は、がん患者における悪性度の明らかなマーカーである（Ｆｕｊｉｔａｎｉ，２００１；Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋａ−Ｍａｚｕｒ，２０００）。ＣＤ１７３およびＣＤ１７４のより高い発現は、より良好な予後を持つ患者と比較して、高グレードおよび不良な予後を持つ患者でより多く見出された（Ｂａｌｄｕｓ，２００６）。リンパ節陰性乳癌腫において、ＣＤ１７４の過剰発現は、低下した患者生存と有意に関連していた（Ｍａｄｊｄ，２００５）。α１−２フコシル化を媒介する、増加した腫瘍原性は、増加したアポトーシスに対する耐性および免疫調節からの回避と関連している（Ｇｏｕｐｉｌｌｅ，２０００）。
【０１７４】
現在のがん療法の失敗は、潜在的に静止性のがん幹細胞に対する薬物の無効力に帰するとされ得る。処置戦略はゆえに、がん幹細胞の存在を考慮する必要がある。乳癌腫におけるがん幹細胞の表面でのＣＤ１７３の、およびとりわけＣＤ１７４の高い発現は、これらの抗原が、抗体が媒介する診断および療法の有望な標的であることを示唆する。より最近の研究は、低用量の抗ＣＤ１７４ ｍＡｂの投与が、ＴＮＦ−α放出の誘起なしでも有効な抗腫瘍応答をもたらし得ることを実証し（Ｄｅｔｔｋｅ，２０００）、およびドキソルビシンと結合体化された抗ＣＤ１７４抗体が現在、上皮腫瘍の療法において評価されている（Ｔｏｌｃｈｅｒ，１９９９）。
【０１７５】
要するに、がん幹細胞でのＣＤ１７３およびＣＤ１７４の同定は、特に再発の防止において、標的がん開始細胞をターゲティングする療法における新たな機会をもたらす。
【０１７６】
ＩＩＩ．抗ＣＤ１７６抗体の治療活性
以下の例は、以下の相補性決定領域のセットを有するＩｇＭ型またはＩｇＧ１型のモノクローナル抗ＣＤ１７６抗体を使用して行った：
【０１７７】
【表３】
１．細胞増殖の抑制
腫瘍関連炭水化物抗原ＣＤ１７６を発現するがん細胞の細胞増殖を抑制する抗ＣＤ１７６抗体の性能を実証するために、抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体がＣＤ１７６陽性がん細胞系の増殖細胞に添加された。がん細胞増殖の抑制は、ブロモデオキシウリジン細胞増殖ＥＬＩＳＡを使用して測定された。簡潔には、ＣＤ１７６陽性骨髄性白血病細胞系ＮＭ−Ｄ４の細胞（ＷＯ ０５／０１７１３０に記載）を、５％ＦＣＳおよび１％グルタミンを補ったＲＰＭＩを含む９６ウェルプレートに播種した（２，０００細胞／ウェル）。細胞を抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体（Ｊ鎖を持つまたは持たない）または無関係なアイソタイプ対照（ＣｈｒｏｍＰｕｒｅ ｈＩｇＭ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって処理した。架橋２次抗体Ｆａｂ２ヤギ抗ヒトＩｇＭ（Ｆｃ５μ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を最終濃度１０μｇ／ｍｌまで添加した。無処理対照細胞と比較したパーセント増殖は、培養の５日後にＢｒｄＵ細胞増殖ＥＬＩＳＡ（Ｒｏｃｈｅ）によって測定した。
【０１７８】
結果として、上記アッセイは、抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体によるＣＤ１７６陽性がん細胞の増殖の濃度依存性抑制を示した（図４）。抗ＣＤ１７６ ＩｇＧ抗体を使用して同様の結果が取得された。
２．細胞アポトーシスの誘起
アネキシンＶアッセイを使用して、ＣＤ１７６を発現するがん細胞においてアポトーシスを誘起する抗ＣＤ１７６抗体の能力を試験した。急性骨髄性白血病細胞系ＫＧ−１のＣＤ１７６陽性およびＣＤ１７６陰性（対照）亜系統を、１％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩを含む９６ウェルプレート（１．５×１０５細胞／ウェル）に播種した。抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体（Ｊ鎖を持つまたは持たない）または無関係なアイソタイプ対照（ＣｈｒｏｍＰｕｒｅ ｈＩｇＭ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を最終濃度１０μｇ／ｍｌまで添加した。２４時間後、アポトーシスの早期マーカーとしてホスファチジルセリン露出を分析した。細胞をアネキシンＶ−ＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＳｙｔｏｘグリーン（標識死細胞）によって１５分間染色して、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１７９】
結果として、上記実験は抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体によるアポトーシスのＣＤ１７６特異的誘起を実証した（図５）。抗ＣＤ１７６ ＩｇＧ抗体を使用して同様の結果を取得した。
３．がん細胞に対するＣＤＣの誘起
ＣＤ１７６を発現するがん細胞の溶解を生じる補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘起する抗ＣＤ１７６抗体の性能を、以下のＣＤＣアッセイによって実証した。急性骨髄性白血病細胞系ＫＧ−１（ＣＤ１７６陽性）の細胞に電気穿孔によりユウロピウムを負荷し、その細胞を、異なる濃度の抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体（Ｊ鎖を持つまたは持たない）または無関係なアイソタイプ対照（ＣｈｒｏｍＰｕｒｅ ｈＩｇＭ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）とともに９６ウェルプレート中でインキュベートした。幼齢ウサギ補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を最終濃度０．８％で添加した。４時間後、２５μｌの上清を２００μｌの増強溶液（Ｄｅｌｆｉａ）中に移して、蛍光プレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００（Ｔｅｃａｎ）を使用してユウロピウム放出を定量化した。最大放出（トリトンＸ−１００による標的細胞）、自発放出（標的細胞）および基底放出（標的細胞の上清）は、特異的細胞傷害を計算するための対照として機能した。
【０１８０】
結果として、上記ＣＤＣアッセイは、濃度依存性ＣＤＣが抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体によって誘起されることを実証した（図６）。
４．がん細胞に対するＡＤＣＣの誘起
ＣＤ１７６を発現するがん細胞の溶解を生じる抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘起する抗ＣＤ１７６抗体の性能を、以下のＡＤＣＣアッセイによって実証した。膵臓癌腫細胞系ＰＡＮＣ−１の細胞に電気穿孔によりユウロピウムを負荷し、その細胞を、異なる濃度の抗ＣＤ１７６ ＩｇＧ１抗体または無関係なアイソタイプ対照（ｈＩｇＧ１，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに９６ウェルプレート中でインキュベートした。初代ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を１００：１のエフェクタ対標的細胞比で添加した。６時間後、２５μｌの上清を２００μｌの増強溶液（Ｄｅｌｆｉａ）中に移して、蛍光プレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００（Ｔｅｃａｎ）を使用してユウロピウム放出を定量化した。最大放出（トリトンＸ−１００による標的細胞）、自発放出（標的細胞）および基底放出（標的細胞の上清）は、特異的細胞傷害を計算するための対照として機能した。
【０１８１】
結果として、ＡＤＤＣアッセイは、濃度依存性ＡＤＣＣが抗ＣＤ１７６ ＩｇＧ１抗体によって誘起されることを実証した（図７）。
５．概要
上の実験は、ＣＤ１７６に対する抗体が上記腫瘍関連炭水化物抗原ＣＤ１７６を発現する細胞において、細胞増殖を抑制すること、アポトーシスを誘起すること、ならびにＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣを誘起することが可能であることを実証した。そのため抗ＣＤ１７６抗体は、ＣＤ１７６を発現するがん幹細胞に対して強力な治療剤であることが示された。
【図１−１】
【図１−２Ａ】
【図１−２Ｂ】
【図２−１】
【図２−２Ａ】
【図２−２Ｂ】
【図２−３】
【図２−４】
【技術分野】
【０００１】
本発明は特に、がん幹細胞および関係のある疾患の処置のための腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する剤（ａｇｅｎｔ）の使用に基づく治療方法に関係する。腫瘍関連炭水化物抗原をがん幹細胞のマーカーとして使用する診断および予後判定の方法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
腫瘍は、蓄積された変異を通じて無限増殖能を獲得した腫瘍原性がん細胞によって開始される、異常臓器と見なすことができる。このように腫瘍を異常臓器と見なすと、正常幹細胞の生物学の原理を適用して腫瘍が発生および播種する方法をより良好に理解することができる。多くの観察が、正常幹細胞と腫瘍原性細胞との間の類似性が適切であることを示唆している。正常幹細胞および腫瘍原性細胞のどちらも、広範な増殖ポテンシャルおよび新しい（正常または異常な）組織を生じさせる能力を有する。腫瘍原性細胞は、正常幹細胞が経験する臓器形成プロセスに類似した、異常なおよび制御が不十分な臓器形成プロセスを経験する、がん幹細胞（ＣＳＣ）またはがん開始細胞（ＣＩＣ−用語ＣＳＣおよびＣＩＣは本明細書で同義語として使用される）と考えることができる。腫瘍および正常組織はどちらも、異なる表現型の特徴および異なる増殖ポテンシャルを持つ細胞の不均質の組合せで構成されている。
【０００３】
がん幹細胞は、腫瘍性クローンを開始および維持する、幹細胞様特性を持つ腫瘍細胞のある部分であると考えられている。これらの細胞は、自己再生する能力を有するが、表現型が多様ながん細胞を生じるが、より低い腫瘍原性ポテンシャルを持つ前駆体も生じさせる。幹細胞様細胞のこの亜集団は、がん幹細胞ではない腫瘍細胞と比較して、腫瘍形成および転移性腫瘍拡散に効果がある細胞である。
【０００４】
がん幹細胞（ＣＳＣ）は、白血病、神経膠芽腫、髄芽腫、およびほぼすべての種類の上皮腫瘍（癌腫）を含む多種多様のがんで今や同定されている。
【０００５】
がん幹細胞（ＣＳＣ）が通常、がん個体発生の必要条件であるという理論は、今は広く受け入れられている。がん幹細胞は低い増殖速度、高い自己再生能、活発に増殖する腫瘍細胞に分化する性向を呈し、化学療法または放射線に耐性を示す（たとえばＶａｎ ｄｅｒ Ｇｒｉｅｎｄら、２００８を参照）。
【０００６】
がん幹細胞は、原発性腫瘍内の別個の表面マーカーパターンの調査に基づいて特徴付けることができる。これまでにますます多く提案されているＣＳＣマーカーのうち、２つ：ＣＤ４４およびＣＤ１３３が最も突出して受け入れられていて、また異なる腫瘍タイプのＣＳＣのうちで広く分布している。ＣＤ４４は、がん幹細胞の頑強なマーカーとして報告された（Ｃｈｕら、２００９；Ｔａｋａｉｓｈｉら、２００９）。結腸直腸腫瘍からの単一のＣＤ４４＋細胞は、インビトロで球を形成することが可能であり、原発性腫瘍の特性に似た異種移植腫瘍を生成することができた（Ｄｕら、２００８）。ＣＤ１３３もがん幹細胞のマーカーである。ＣＤ１３３は、ヒト造血幹細胞に特異的な表面抗原として、ならびにマウス神経上皮および複数の他の胚上皮のマーカーとして最初に記載された（Ｓｉｎｇｈら、２００４）。いくつかの最近の研究において、単独のまたは他のマーカーと組合せたＣＤ１３３が結腸、肺および肝臓の悪性腫瘍からのがん幹細胞の単離に使用された（Ｈａｒａｇｕｃｈｉら、２００８）。ＣＤ１３３＋腫瘍細胞は、放射線誘起ＤＮＡ損傷をＣＤ１３３−腫瘍細胞よりも効果的に修復する（Ｂａｏら、２００６）。
【０００７】
がん幹細胞の存在はがん療法に深い意味を有する。既存の療法が主として腫瘍細胞のバルク集団に対して開発されてきたのは、その療法が腫瘍塊を収縮させるその能力によって同定されるためである。しかしがん幹細胞は化学療法に耐性であることが多く、化学療法の失敗をもたらし得る（Ｓｅｌｌら、２００８）。がん開始細胞（本明細書ではがん幹細胞とも呼ばれる）を（も）標的とする新規治療剤を設計するためには、好ましくは良性腫瘍および／または正常な非腫瘍細胞に存在しない、ならびに同時にがん幹細胞に対して特異的に向けられたがん幹細胞の分子標的（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔ）を探求することが所望される。このような剤は、腫瘍の、ならびにとりわけ転移性腫瘍のより永続的な応答および治癒を生じることが予想される。ゆえに、療法を改善するための新規治療標的を提供する新たながん幹細胞マーカーが求められている。公知の幹細胞マーカーの大半はタンパク質である。この多くは、正常幹細胞マーカーであることも見出され、そのため非腫瘍幹細胞で発現される。これによりこれらは治療標的としては好適ではないか、または少なくともあまり好適ではない。現在、正常幹細胞マーカーとがん幹細胞マーカーとの明確な区別はない。
【０００８】
そのためさらなる好適ながん幹細胞マーカーを同定できること、ならびにこれらのマーカーを診断および予後判定の方法に、ならびに／またはがん幹細胞を標的とする療法の開発に使用できることが大いに所望される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、腫瘍関連炭水化物抗原が好適ながん幹細胞マーカーであるという発見に基づく。これまで記載されたほとんどすべてのがん幹細胞マーカーがタンパク質であるので、腫瘍関連炭水化物抗原、たとえばＣＤ１７６、ＣＤ１７４およびＣＤ１７３などががん幹細胞で発現されることが見出されたのは非常に驚きであった。そのためこれらの腫瘍関連炭水化物抗原は、がん幹細胞に好適なマーカーであり、そのほかにがん幹細胞を攻撃する療法に好適な治療標的を提供する。
【００１０】
本発明の第１の態様により、腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞の処置で使用するための上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤が提供される。上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞の処置で使用するためのそれぞれの結合剤を含む、薬学的組成物も提供される。
【００１１】
第２の態様により、腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤による処置（ここで、上記処置はがん幹細胞に影響を与える）に感受性であるがん幹細胞を含む、がんを同定するための方法であって、上記方法は、患者から取得したがん検体が、結合剤が特異的である上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞を含むかどうかを決定する工程を含み、ここで、がん幹細胞における上記腫瘍関連炭水化物抗原の存在は、上記がんが、上記腫瘍関連炭水化物抗原に特異的に結合する上記結合剤による処置にがんが感受性であることを示し、かつ、ここで、上記処置はがん幹細胞に影響を与える、方法が提供される。
【００１２】
第３の態様により、患者から単離された検体中の細胞における腫瘍関連炭水化物抗原の発現を分析する工程を含む、がんを診断、病期分類および／もしくは予後を判定するならびに／または処置に対する感受性を監視するための方法であって、ここで、上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現する細胞の存在は、上記検体中のがん幹細胞の存在を示す、方法が提供される。
【００１３】
第４の態様により、哺乳動物がん幹細胞の組成物が提供され、ここで、上記組成物中の上記細胞の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％が、腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞である。関係のある態様により、腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞の選択的富化を含む、がん幹細胞を単離するための方法が提供される。
【００１４】
第５の態様により、本発明による方法で使用するための、腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤および説明書を含む、本発明による方法で使用するためのキットが提供される。
【００１５】
第６の態様により、腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞に対する有効性について、候補治療剤、たとえば化学療法剤または別の抗がん薬をスクリーニングするための方法が提供され、上記方法は：
ａ．上記剤を本発明による細胞組成物と接触させる工程、および
ｂ．上記腫瘍関連炭水化物抗原陽性がん細胞に対する上記剤の有効性を決定する工程、を含む。
【００１６】
本発明の他の目的、特徴、利点および態様は、以下の記載および添付の特許請求の範囲から当業者に明らかになる。しかし本出願の好ましい実施形態を示す以下の記載、添付の特許請求の範囲、および特定の実施例は、例証のためのみに与えられていることを理解すべきである。開示した発明の精神および範囲の中での各種の変更および修正は、以下を読めば当業者に容易に明らかになる。
【００１７】
定義
本明細書で使用する場合、以下の表現は概して、これらが使用される文脈が別途示す範囲を除いて、好ましくは以下で述べる意味を有することを意図する。
【００１８】
「結合剤」は、標的物質、例として腫瘍関連炭水化物抗原を結合することが可能な任意の化合物または化合物の複合体であり得る。好ましくは、上記結合剤は上記標的物質を特異的に結合することが可能である。好適な結合剤は、上記標的物質に結合する結合剤を同定／取得するために結合剤ライブラリをスクリーニングすることによって取得され得る。それぞれの結合剤ライブラリの例は、たとえば上記結合剤をディスプレイするファージまたはファージミドライブラリである。たとえば抗体をインビボで取得するための方法は、ＨｕｄｓｏｎおよびＳｏｕｒｉａｕによっても記載されている（Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ Ｓｏｕｒｉａｕ，Ｃ．（２００３）“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９，１２９−１３４）。
【００１９】
上記結合剤は、これらが標的物質、ここでは腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に認識および結合できる限り、任意の構造を有し得る。結合剤は、抗体、その抗原結合フラグメントもしくは誘導体または結合機能を提供するタンパク質骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を有する結合剤、たとえばアンチカリンもしくはレクチンなどから成る群より選択され得る。結合剤は、結合機能を提供するペプチドまたは融合タンパク質でもあり得る。抗体と同様の結合機能を有する結合剤の概要は、Ｈｅｙらにおいて与えられている（Ｈｅｙら（２００５）“Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ，ｎｏｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（１０），５１４−５２２）。抗体誘導体は、たとえば改変アミノ酸配列を除いて同じ結合機能を有する、抗体または抗体フラグメントも含む。
【００２０】
「抗体」という用語は詳細には、ジスルフィド結合によって結合した少なくとも２個の重鎖および２個の軽鎖を含むタンパク質を指す。「抗体」という用語は、天然に存在する抗体ならびに抗体のすべての組換え形態、たとえば原核生物中で発現された抗体、非グリコシル化抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）で構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成されている。上記重鎖定常領域は、３個またはＩｇＭもしくはＩｇＥ型の抗体の場合には４個の重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）を含み、ここで、第１の定常ドメインＣＨ１は可変領域に隣接して、ヒンジ領域によって第２の定常ドメインＣＨ２に結合され得る。上記軽鎖定常領域は、１個の定常ドメインのみより成る。上記可変領域は、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が散在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超変異性の領域にさらに細分することができ、ここで、各可変領域は３個のＣＤＲおよび４個のＦＲを含む。上記重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の各種の細胞（たとえばエフェクタ細胞）および古典的な補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。ＩｇＡおよびＩｇＭ分子は通常、Ｊ鎖と共に存在するが、これに由来する、たとえばＪ鎖を持たない分子も明確に含まれる。そのほかに、本発明による「抗体」という用語は、単鎖抗体ならびに重鎖抗体、すなわち１個以上の、特に２個の重鎖のみから構成される抗体、ならびにナノボディ、すなわち単一のモノマー可変ドメインのみから構成される抗体も含む。
【００２１】
抗体の「抗原結合フラグメントまたは誘導体」は特に、抗原を結合することが可能な、たとえば、参照抗体として同じエピトープに結合することが可能な、タンパク質または糖タンパク質である。そのため抗体の抗原結合フラグメントまたは誘導体は本明細書で概して、機能性抗原結合フラグメントを指す。好ましくは、抗原結合フラグメントは、抗体全体から少なくとも２０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１００アミノ酸を含み、好ましくは抗体の結合領域を含む。特に好ましい実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントは重鎖可変領域を含む。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントによって実施し得ることが示されてきた。抗体のフラグメントの例は（ｉ）Ｆａｂフラグメント、すなわち各重鎖および軽鎖の可変領域および第１の定常ドメインから成る１価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ）２フラグメント、すなわちヒンジ領域にてたとえばジスルフィドブリッジによって共に連結された２個のＦａｂフラグメントを含む２価フラグメント；（ｉｉｉ）重鎖の可変領域および第１の定常ドメインＣＨ１から成るＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体のシングルアームの重鎖および軽鎖可変領域から成るＦｖフラグメント；（ｖ）ｓｃＦｖフラグメント、すなわち単一ポリペプチド鎖から成るＦｖフラグメント；（ｖｉ）共有結合的に共に連結された２個のＦｖフラグメントから成る、（Ｆｖ）２フラグメント；（ｖｉｉ）重鎖可変ドメイン；ならびに（ｖｉｉｉ）重鎖および軽鎖可変領域の会合が分子内ではなく分子間のみで生じ得るような様式で共有結合的に連結された重鎖可変領域および軽鎖可変領域から成る、マルチボディを含む。「抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体」という用語は、単一ドメイン抗体も包含する。異なるグリカン側鎖を持つ抗体または抗体フラグメントも、本定義によって理解される。これらの抗体フラグメントまたは誘導体は、当業者に公知の従来の技法を使用して取得することができる。
【００２２】
「特異的結合」は好ましくは、結合剤、例として抗体または抗原結合フラグメントもしくは誘導体が別の標的への結合と比較して特異的である標的、例としてエピトープにより強く結合することを意味する。剤は、第２の標的に対する解離定数（Ｋｄ）より低い解離定数を持つ第１の標的に結合する場合、第２の標的と比較して第１の標的により強く結合する。好ましくは、上記剤が特異的に結合する標的に対する解離定数は、その剤が特異的に結合しない標的に対する解離定数よりも２倍を超えて、好ましくは５倍を超えて、さらに好ましくは１０倍を超えて、なおさらに好ましくは２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍または１０００倍を超えて低い。好ましくは、特異的結合は１０μＭ以下の、さらに好ましくは３μＭ以下の、１μＭ以下の、７００ｎＭ以下の、５００ｎＭ以下の、３００ｎＭ以下の、２００ｎＭ以下の、好ましくは１００ｎＭ以下の、７０ｎＭ以下の、５０ｎＭ以下の、３０ｎＭ以下の、２０ｎＭ以下の、および最も好ましくは１０ｎＭ以下の、５ｎＭ以下の、２ｎＭ以下のまたは１ｎＭ以下の解離定数を持つ結合を指す。上記解離定数は、好ましくは標準条件下で、特に生理学的条件下で測定される。標的化合物（例としてＣＤ１７６）に特異的に結合する結合剤が上記標的化合物に結合するための特定の方法で使用される場合、結合条件は好ましくは、上記結合剤の他の化合物、特に同様の化合物（例として他の炭水化物抗原）への結合が上記方法で検出できないように、または上記標的への結合の検出および／または決定を妨害しないように選ばれる。標的構造、例として本発明による腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤は、上記標的構造が特異的に認識される限り、上記結合剤が上記標的構造以外の他の構造にも結合する実施形態も含む。たとえば「腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤」という用語は、腫瘍関連炭水化物抗原を結合し、そしてまた、上記腫瘍関連炭水化物抗原が付着する他の構造、特にキャリア分子にも結合する結合剤を含む。好ましくは他の構造、特に上記腫瘍関連炭水化物抗原のキャリア分子は、上記腫瘍関連炭水化物抗原の非存在下では上記結合剤によって結合されず、または特異的標的と比較して非特異的な結合に関して上で定義した通りである、はるかに高い解離定数によってのみ結合される。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「タンパク質」という用語は、特にアミノ酸の分子鎖または１を超えるアミノ酸鎖の複合体を指す。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸ならびに人工アミノ酸のいずれも含むことができ、生物起源または合成起源であることができる。タンパク質は、たとえばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化および／またはリン酸化によって、自然に（翻訳後修飾）または合成により改変され得る。タンパク質は少なくとも２個のアミノ酸を含むが、いずれかの特定の長さである必要はない；本用語は、任意のサイズ制限を含まない。本出願において、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は互換的に使用される。好ましくは、タンパク質は少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも５０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸を含み、最も好ましくは少なくとも１００アミノ酸である。
【００２４】
「患者」という用語は特に、本発明により、ヒト、非ヒト霊長類または別の動物、特に哺乳動物、例としてウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯動物、例としてマウスもしくはラットを意味する。特に好ましい実施形態において、患者はヒトである。
【００２５】
本発明による「がん」という用語は特に、これに限定されるわけではないが、白血病、精上皮腫、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、副腎がん、甲状腺がん、皮膚がん、脳のがん、子宮頸がん、腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）がん、肝臓がん、結腸がん、胃がん、腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）がん、頭頸部がん、消化管がん、リンパ節がん、食道がん、結腸直腸がん、膵臓がん、耳鼻および咽喉（ＥＮＴ）がん、乳がん、前立腺がん、子宮のがん、卵巣がんおよび肺がんならびにこれの転移したものを指す。がんは本明細書で使用する場合、過剰増殖状態を指す。上記用語は、悪性ならびに非悪性細胞集団を表すが、好ましくは悪性細胞を指し、それぞれ細胞集団を表すものである。このような障害は、形態学的におよび遺伝子型的に周囲組織と異なるように見えることが多い、１つ以上の細胞のサブセットの過剰な細胞増殖を有する。過剰細胞増殖は、一般集団の参照により、および／または特定の患者の、たとえばこの患者の生涯のより早い時点での参照により決定することができる。過剰増殖細胞障害は、異なる種類の動物およびヒトで発生し得、影響を受けた細胞に応じて異なる身体的徴候を生じる。
【００２６】
「腫瘍」とは特に、誤制御された細胞増殖によって形成される細胞または組織の群を意味する。腫瘍は、正常組織との、構造的構成（ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）および機能調整の部分的または完全な欠如を示し得て、通例、良性または悪性のどちらかであり得る別個の組織塊を形成し得る。特に、腫瘍という用語は悪性腫瘍を指す。１実施形態により、「腫瘍細胞」という用語は、非固形がんの細胞、例として白血病細胞も包含する。別の実施形態により、非固形がんのそれぞれの細胞は、「腫瘍細胞」という用語に包含されない。
【００２７】
「転移」とは特に、がん細胞の、最初の部位から体の別の部分へのがん細胞の拡散を意味する。転移の形成は非常に複雑なプロセスであり、通常、原発性腫瘍からのがん細胞の離脱、体循環への進入、および、体内の他の場所の正常組織内で定着して増殖することを伴う。腫瘍細胞が転移するとき、その新たな腫瘍は２次腫瘍または転移性腫瘍と呼ばれ、この細胞は通常、最初の腫瘍中の細胞と似ている。このことは、たとえば乳がんが肺に転移する場合、その２次腫瘍は異常な肺細胞からではなく、異常な乳房細胞からつくられることを意味する。上記肺の腫瘍は次に、肺がんではなく、転移性乳がんと呼ばれる。
【００２８】
本発明により、がんの「病期分類」は、好ましくはがんの進行および程度の分類を指す。好ましいがん病期分類システムは、悪性腫瘍のＴＮＭ分類であり、ここで、Ｔは上記腫瘍のサイズおよび付近の組織を浸潤したかどうかを記載し、Ｎは関与している領域リンパ節について記載し、Ｍは遠隔転移について記載する。これらの各パラメータは患者の状況に応じて特定の値を与えられ、ここで、一般により大きい数はより重篤な状況を示す（Ｔ（０−４）、Ｎ（０−３）、Ｍ（０／１））。加えて、より綿密な分類のために、さらなるパラメータを決定することができ、そして／または接頭辞を使用することができる。そのほかに、上記ＴＮＭ分類は、段階０から段階ＩＶまでのがんに言及する、ＵＩＣＣによるがん病期分類システムに要約され得る。
【００２９】
本発明により、「検体」は特に、これに限定されるわけではないが、組織検体、体液および／または細胞検体を指し、従来の様式によって、例としてパンチ生検を含む組織生検によって、またはがん細胞を含有するまたは含有することが疑われる血液、気管支吸引物、痰、尿、糞または他の体液もしくは組織切片、スライドなどを採取することによって取得され得る。本発明により、「検体」という用語は、それぞれの検体の部分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）または構成要素も含む。
【００３０】
「細胞増殖」または「増殖すること」という用語は、本明細書で使用する場合、特に細胞分裂による細胞の増幅を指す。
【００３１】
「がん幹細胞」という用語は、特に、これに限定されるわけではないが、インビトロでの好適な条件下で未分化細胞の凝集体、いわゆる腫瘍球を生成することが可能な細胞に関係する。球を形成する細胞は自己再生することが可能である；この細胞が解離して同じ条件下で成長すると、これが再度球を形成する。がん幹細胞はインビボでは、転移および幹細胞マーカー、例としてたとえばＣＤ４４の発現を形成するこれらのポテンシャルを特徴とする。これらは薬物耐性も提供し得る。「がん幹細胞」および「がん開始細胞」という用語は、本明細書で同義語として使用される。
【００３２】
「腫瘍関連炭水化物抗原」という用語は、特にがん細胞および／または腫瘍細胞で、特に悪性がん細胞および／または悪性腫瘍細胞で発現される炭水化物抗原を指す。
【００３３】
「腫瘍特異的炭水化物抗原」という用語は、特に、がん細胞および／または腫瘍細胞で主としてまたはなお独占的に発現され、そしてそれゆえ、非がん細胞、非腫瘍細胞では発現されない、またはごく低い程度しか発現されない炭水化物抗原を指す。好ましくは、「腫瘍特異的炭水化物抗原」という用語は、悪性がん細胞および／または悪性腫瘍細胞で主としてまたは好ましくは独占的に発現され、そしてそれゆえ、非がん細胞、非腫瘍細胞、良性がん細胞および／もしくは良性腫瘍細胞ならびに／または同じ患者の健常組織では発現されないまたはごく低い程度しか発現されない炭水化物抗原を指す。優先的に、上記腫瘍特異的炭水化物抗原は大半の正常細胞では発現されず、なおさらに好ましくは（ｍｏｒｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）数少ない正常細胞または細胞種でのみ発現され、なおさらに好ましくは（ｍｏｒｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）これらの正常細胞での発現は、たとえば厳密に頂端側のまたは密着結合の間における（ｅ．ｇ． ｓｔｒｉｃｔｌｙ ａｐｉｃａｌ ｏｒ ｉｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ）特有の局在を有するので、全身投与およびとりわけ静脈内投与された結合分子は、これらの正常細胞の抗原に到達できないか、またはほとんど到達せず、なおさらに好ましくは（ｍｏｒｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）、それは正常上皮細胞で発現されず、最も好ましくは（ｍｏｓｔ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）、それは正常細胞で発現されない。ある実施形態において、上記腫瘍特異的炭水化物抗原は、発現されたときに、キャリア分子に付着し得る。このようなキャリア分子は、特にタンパク質、ペプチドまたは炭水化物であり得る。
【００３４】
「ＣＤ１７６」は、腫瘍関連トムゼン−フリーデンライヒ抗原（ＴＦ）を指す。ＴＦは、タンパク質または糖脂質に結合することができる２つの形、ＴＦαおよびＴＦβで存在する。Ｃｏｒｅ−１は、特に腫瘍細胞中のヒドロキシアミノ酸であるセリンもしくはトレオニンまたはタンパク質にアルファ−アノマー配置でＯ−グリコシド結合している２糖のＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃである。Ｃｏｒｅ−１はＴＦα構造に相当する。この２糖は正常細胞の多くの膜糖タンパク質にて潜在性様式で見出される遍在性コア構造であるが、これの露出およびそれゆえ腫瘍細胞でのこの抗原のデノボ発生は、２、３の特異的キャリアタンパク質に限定されている。ＣＤ１７６は各種のがん細胞、例として乳房癌腫（Ｉｍａｉら、２００１；Ｇｏｌｅｔｚら、２００３）、結腸直腸癌腫（Ｃａｏら、１９９５）、肝細胞癌腫（Ｃａｏら、１９９９）、複数の白血病（Ｃａｏら、２００８）および他の種類のがんの表面で発現されることが実証されてきた。がん細胞表面のＣＤ１７６は、機能性分子実体として、上記細胞の浸潤特性および転移特性に関与する（Ｃａｏら、１９９５）。以下では、ＣＤ１７６という用語は、好ましくは腫瘍特異的Ｃｏｒｅ−１構造Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−を指す。
【００３５】
「ＣＤ１７５」は、構造ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−を持つ腫瘍関連炭水化物抗原であるＴｎ抗原を指す。これは大半の上皮がんで高いパーセンテージの症例において、および複数の白血病で発現される。これは良性腫瘍でもある程度まで発現される。ＣＤ１７５は腫瘍特異的抗原である。
【００３６】
「ＣＤ１７５ｓ」は、構造ＮｅｕＡｃα２−６ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−を持つ腫瘍関連炭水化物抗原である、ｓ−Ｔｎ抗原を指す（シアリル−ＴｎまたはＴＡＧ−７２とも呼ばれる）。これは大半の上皮がんで高いパーセンテージの症例において、および複数の白血病で発現される。
【００３７】
「ＣＤ１７３」は、構造Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−を持つ腫瘍関連炭水化物抗原である、血液型Ｏ抗原を指す（Ｈ２型とも呼ばれる）。これは血液型Ｏの個人の赤血球および内皮で発現される。これはＯ型以外の血液型を持つ患者におけるがん関連抗原である。
【００３８】
「ＣＤ１７４」は、構造Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４［Ｆｕｃα１−３］ＧｌｃＮＡｃβ１−を持つ腫瘍関連炭水化物抗原である、ルイスＹ抗原を指す（ＬｅＹとも呼ばれる）。ＣＤ１７４は、多くの上皮がん、複数の白血病、および造血前駆細胞で腫瘍特異的である。
【００３９】
「ＣＡ１９−９」は、構造ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３［Ｆｕｃα１−４］ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−の腫瘍関連炭水化物抗原である、シアリル−Ｌｅ ａ抗原を指す。これは消化管癌腫および膵臓癌腫で高度に発現されるが、乳房腫瘍、腎臓腫瘍または前立腺腫瘍では発現されない。
【００４０】
「ＣＤ３４」、膜糖タンパク質（１０５〜１２０ｋＤａ）は、造血前駆細胞の周知のマーカーである。これは大半の白血病細胞でも発現される。
【００４１】
「ＣＤ４４」は、さまざまな分子量の接着分子（Ｈ−ＣＡＭ、Ｐｇｐ−１）である。これは細胞表面ヒアルロナン受容体であり、マトリクスメタロプロテイナーゼと相互作用して、細胞移動で重要な役割を果たす。ＣＤ４４は、乳がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、結腸がん、胃がん、および他のがん種でのがん幹細胞マーカーとして記載されている（Ｌｉら、２００７、およびＴａｋａｉｓｈｉら、２００９を参照）。これは正常多能性幹細胞のマーカーでもある。いくつかのがん種では、ＣＤ４４のスプライシングバリアント、例として結腸直腸がんでのＣＤ４４ｖ６が存在する。
【００４２】
「ＣＤ１３３」（プロミニン、１２０ｋＤａ）は、５−膜貫通ドメイン糖タンパク質である。上記遺伝子は８６５アミノ酸糖タンパク質をコードして、動物界にわたって保存されている。これは多くのがん種（たとえば結腸直腸癌腫、膵臓癌腫、前立腺癌腫、非小細胞肺癌腫、および肝細胞癌腫、ならびに黒色腫および神経膠芽腫）でがん幹細胞マーカーとして記載されてきた。
【００４３】
「ＣＤ１６４」（ＭＧＣ−２４、２４ｋＤａ）は、造血前駆細胞のマーカー、および胃癌腫のがん幹細胞のマーカーでもある（Ｍａｓｕｚａｗａら、１９９２を参照）。
【００４４】
互換的に使用される「細胞（ｃｅｌｌ）」および「細胞（ｃｅｌｌｓ）」ならびに「細胞集団」という用語は、特に１個以上の細胞、特に哺乳動物細胞を指す。上記用語は、細胞または細胞集団の子孫を含む。当業者は、「細胞」が単細胞の子孫を含み、上記子孫は天然の、偶発的な、または故意の変異および／または変化により、元の親細胞とは（形態においてまたはＤＮＡ相補体全体が）必ずしも完全に同一でない可能性があることを認識する。
【００４５】
「有効量」は特に、有益なまたは所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回以上の投与で与えることができる。活性成分としての有効量の上記結合剤は、特に疾患状態の進行を診断する、軽減する、改善する、安定化する、逆行させる、遅くする（ｓｌｏｗ）または遅らせるのに十分である量である。活性成分の毒性および治療有効性は、たとえばＬＤ５０（集団の５０パーセントに致死性である用量）およびＥＤ５０（集団の５０パーセントで治療的に有効な用量）を決定することを含む、たとえば細胞培養物および／または実験動物における標準の薬学的手順に従って決定することができる。毒性作用と治療効果との間の用量比は治療指数であり、これは比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きい治療指数を示す結合剤が好ましい。細胞培養および／または動物研究から取得したデータは、ヒトに対する投薬量の範囲を処方するのに使用することができる。活性成分の投薬量は典型的に、低い毒性のＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内に並ぶ。上記投薬量は、採用された剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変えることができる。
【００４６】
図面は下に記載する実施例によって取得された結果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１．１】ａ−ｃは、肺がん細胞系ＮＣＩＨ４４６を用いて行われた共焦点顕微鏡分析（倍率×４００）を示す図である。細胞をＣＤ４４（赤色）およびＣＤ１７６（緑色）に特異的なモノクローナル抗体によって染色した。核はＤＡＰＩ（青色）によって対比染色した。ＣＤ４４は大半のＮＣＩＨ４４６細胞で強く発現している（ａ）。ＣＤ１７６発現は、細胞クラスタの膜において認めることができた（ｂ）。混合図（ｃ）は、これらの細胞クラスタにおけるＣＤ４４およびＣＤ１７６の同時局在を実証している（黄色）。
【００４８】
ｄ−ｉでは、ＨＣＣ組織におけるＣＤ４４およびＣＤ１７６の、ならびにＣＤ１３３およびＣＤ１７６の同時発現が、二重免疫蛍光染色によって示されている（倍率×２００）。オーバーレイによるＣＤ１７６（緑色、ｄ）／ＣＤ４４（赤色、ｅ）およびＣＤ１３３（赤色、ｇ）／ＣＤ１７６（緑色、ｈ）の同時発現がそれぞれ見出された（黄色、ｆおよびｉ）。
【００４９】
ｊ、ｋは、免疫組織化学により分析された肺がん組織でのＣＤ１７６の発現（倍率×２００）を示す図である。ＣＤ１７６は細胞表面ならびに肺腺癌細胞（ｊ）および肺扁平上皮がん種細胞（ｋ）の細胞質で見出された。
【図１．２Ａ】図１．２Ａは、細胞系ＳＰＣ−Ａ−１、ＧＬＣ（肺腺癌）およびＨｅｐＧ２（ＨＣＣ）の細胞におけるＣＤ４４およびＣＤ１７６の同時発現のＦＡＣＳ分析を示す図である。細胞を抗ＣＤ４４（ＩｇＧ）および抗ＣＤ１７６（ＩｇＭ）とともにインキュベートし、続いて抗ＩｇＧ−Ｃｙ３（γ鎖特異的）および抗ＩｇＭ−ＦＩＴＣ（μ鎖特異的）とともにインキュベートした。検体当り最小１０，０００のイベントが収集された。マーカーのそれぞれの組合せを持つ細胞のパーセンテージがグラフのおのおのの区画（ｓｅｃｔｉｏｎ）に示され、両方のマーカーの染色の強い相関が実証されている。示されたデータは、複数の独立した実験の代表である。
【図１．２Ｂ】図１．２Ｂは、ＭＤＡ−４３５（乳癌腫）細胞の４−ＯＨＴ処理前後のＣＤ４４およびＣＤ１７６の同時発現のＦＡＣＳ分析を示す図である。マーカーのそれぞれの組合せを持つ細胞のパーセンテージがグラフのおのおのの区画に示されている。ＣＤ４４＋／ＣＤ１７６＋細胞の数は、４−ＯＨＴによる２４時間の処理後に増加する。示されたデータは、複数の独立した実験の代表である。
【図２．１】図２．１は、乳がん細胞の二重免疫蛍光染色を示す図である。
【００５０】
ａ−ｃは、細胞系ＭＣＦ−７；ｄ−ｌ：乳がん組織切片である。細胞をモノクローナル抗体Ｇ４４−２６（ＣＤ４４、ＩｇＧ２ｂ）またはＡＮＣ９Ｃ５（ＣＤ１３３）によって、およびＡ７０−Ｃ／Ｃ８（ＣＤ１７４、ＩｇＭ）またはＡ４６−Ｂ／Ｂ１０（ＣＤ１７３、ＩｇＭ）によって染色し、続いて抗ＩｇＧ−Ｃｙ３（γ鎖特異的、赤）および抗ＩｇＭ−ＦＩＴＣ（μ鎖特異的、緑色）とともにインキュベートした。
【００５１】
ｃ、ｆ、ｉ、ｌは合成図である；核はＤＡＰＩ（青色）によって対比染色した。
【００５２】
ＣＤ１７３（ａ、ｄ）は多くの場合、ＣＤ４４（ｂ、ｅ）と同時発現される。ＣＤ１７４（ｇ、ｊ）は、ＣＤ４４（ｈ）ならびにＣＤ１３３（ｋ）による同時発現を示す。倍率：２００×。
【図２．２Ａ】Ａは、乳腺癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＣＦ−７におけるＣＤ４４＋／ＣＤ１７３＋発現のフローサイトメトリー分析を示す図である。がん細胞を抗ＣＤ４４（ＩｇＧ）および抗ＣＤ１７４（ＩｇＭ）抗体とともにそれぞれインキュベートして、続いて抗ＩｇＧ−Ｃｙ３（γ鎖特異的）および抗ＩｇＭ−ＦＩＴＣ（μ鎖特異的）とともにインキュベートした。値は３回の同様の実験のうちの１回から得る。両方の細胞系の大部分が両方のマーカー（ＣＤ４４およびＨ２）に陽性である。
【００５３】
Ｂは、４−ＯＨＴ処理前後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞でのＣＤ４４＋／ＣＤ１７４＋発現のフローサイトメトリー分析を示す図である。４−ＯＨＴ処理は、ＣＤ４４およびＣＤ１７４（ＬｅＹ）の両方を発現する細胞の割合の増加を生じる。値は３回の同様の実験のうちの１回から得る。
【図２．２Ｂ】Ａは、乳腺癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＣＦ−７におけるＣＤ４４＋／ＣＤ１７３＋発現のフローサイトメトリー分析を示す図である。がん細胞を抗ＣＤ４４（ＩｇＧ）および抗ＣＤ１７４（ＩｇＭ）抗体とともにそれぞれインキュベートして、続いて抗ＩｇＧ−Ｃｙ３（γ鎖特異的）および抗ＩｇＭ−ＦＩＴＣ（μ鎖特異的）とともにインキュベートした。値は３回の同様の実験のうちの１回から得る。両方の細胞系の大部分が両方のマーカー（ＣＤ４４およびＨ２）に陽性である。
【００５４】
Ｂは、４−ＯＨＴ処理前後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞でのＣＤ４４＋／ＣＤ１７４＋発現のフローサイトメトリー分析を示す図である。４−ＯＨＴ処理は、ＣＤ４４およびＣＤ１７４（ＬｅＹ）の両方を発現する細胞の割合の増加を生じる。値は３回の同様の実験のうちの１回から得る。
【図２．３】図２．３は、ＣＤ１７３ｍＡｂ Ａ４６−Ｂ／Ｂ１０によって染色した腺管内癌腫切片の免疫組織化学を示す図である。残存する管壁の基底細胞（幹細胞様細胞）が強く染色されている。
【図２．４】図２．４は、乳腺癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、およびＭＣＦの溶解物の免疫沈降を示す図である。ＣＤ４４免疫沈降物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分けて、ｍＡｂ ＣＤ１７３を使用する免疫ブロットによって分析した。データは、乳癌腫においてＣＤ４４がＣＤ１７３を担持していることを示す。
【図３−１】図３は、抗ＣＤ１７６抗体のアミノ酸配列を示す図である。
【図３−２】図３は、抗ＣＤ１７６抗体のアミノ酸配列を示す図である。
【図３−３】図３は、抗ＣＤ１７６抗体のアミノ酸配列を示す図である。
【図３−４】図３は、抗ＣＤ１７６抗体のアミノ酸配列を示す図である。
【図３−５】図３は、抗ＣＤ１７６抗体のアミノ酸配列を示す図である。
【図３−６】図３は、抗ＣＤ１７６抗体のアミノ酸配列を示す図である。
【図３−７】図３は、抗ＣＤ１７６抗体のアミノ酸配列を示す図である。
【図４】図４は、ＢｒｄＵ細胞増殖ＥＬＩＳＡによって測定された腫瘍細胞増殖の抑制を示す図である。ＣＤ１７６陽性ＮＭ−Ｄ４細胞を抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体（Ｊ鎖を含むまたはＪ鎖が欠如した）または無関係なアイソタイプ対照（ｈＩｇＭ）とともに培養した。架橋をヤギ抗ヒトＩｇＭ Ｆａｂ２抗体（Ｆｃ５μ）を用いて行った。無処理対照細胞に対する増殖パーセントが示されている。そのデータは、Ｊ鎖を持つまたは持たない２つのＩｇＭ型による増殖の濃度依存性抑制を実証している。
【図５】図５は、アネキシンＶ検出によって測定された抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体によるアポトーシス誘起を示す図である。ＡＭＬ細胞系ＫＧ−１の２つの亜系統ＣＤ１７６陽性（Ａ）およびＣＤ１７６陰性（Ｂ）を、Ｊ鎖を持つまたは持たない抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体とともにインキュベートした。ｈＩｇＭ：無関係なアイソタイプ対照。死んでいる細胞をＳｙｔｏｘグリーン蛍光によって測定した。抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体によるアポトーシスのＣＤ１７６特異的誘起が実証された。
【図６】図６は、ユウロピウム放出アッセイによって測定された、抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体による補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の誘起を示す図である。上記ＡＭＬ細胞系ＫＧ−１（ＣＤ１７６陽性）を、Ｊ鎖を持つ（Ｊ＋）または持たない（Ｊ−）どちらかの抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体の存在下で培養し、ウサギ補体を添加した。無関係なＩｇＭアイソタイプを対照として使用した（ｈＩｇＭ）。実証されるように、濃度依存性ＣＤＣは、抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体によって誘起される。
【図７】図７は、ユウロピウム放出アッセイによって測定された、抗ＣＤ１７６ ＩｇＧ１抗体による抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の誘起を示す図である。癌腫細胞系ＰＡＮＣ−１（ＣＤ１７６陽性）を抗ＣＤ１７６ ＩｇＧ１抗体の存在下で培養し、健常ドナーからのＰＢＭＣをＥ：Ｔ比１００：１で添加した。ｈＩｇＧ１：無関係なアイソタイプ対照。示されるように、濃度依存性ＡＤＣＣは抗ＣＤ１７６ ＩｇＧ１抗体によって誘起される。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
発明の詳細な説明
本発明は、腫瘍関連炭水化物抗原ががん幹細胞で発現され、そのためがん幹細胞マーカーとして有用であるという発見に基づく。これまで記載されたがん幹細胞マーカーがほぼすべてタンパク質であるため、本発見は驚くべきである。そのため本発明は、好ましくはＣＤ１７６、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７４、ＣＤ１７３およびＣＡ１９−９から、さらに好ましくは（ｍｏｒｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）ＣＤ１７６、ＣＤ１７５およびＣＤ１７５ｓから選択される腫瘍関連、好ましくは腫瘍特異的炭水化物抗原のがん幹細胞マーカーとしての使用に関係する。
【００５６】
第１の態様により、本発明は、上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞の処置で使用するための腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤を提供する。
【００５７】
本発明者らは、複数の腫瘍関連炭水化物抗原、例としてＣＤ１７６、ＣＤ１７４およびＣＤ１７３ががん幹細胞で発現され、そのため新規がん幹細胞マーカーであることを示してきた。腫瘍関連炭水化物抗原のがん幹細胞マーカーとしての同定は、腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する剤のための新規治療適用を提供する。それぞれの腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する剤は今や、上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞をターゲティングするために治療的に使用することができる。このことはがん幹細胞をターゲティングする、および好ましくは死滅させる治療処置の機会を提供する。それぞれの治療剤はたとえば、普通の化学療法に耐性であるがん幹細胞をターゲティングして、そのため破壊するために使用することができる。これにより、本発明によって改善されたがん療法が提供される。
【００５８】
１実施形態により、上記腫瘍関連炭水化物抗原は、がん幹細胞で主としてまたはなお独占的に発現される。別の実施形態により、上記腫瘍関連炭水化物抗原は上記がん幹細胞で、ならびにがん幹細胞ではないがん細胞で発現される。上記腫瘍関連炭水化物抗原が両方の細胞集団上で発現される場合、これは上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する上記結合剤による処置が、両方の細胞集団をターゲティングするという利点を有する。これはたとえば、腫瘍成長の間に、がん幹細胞特性を持つ新たな細胞がたとえば上皮間葉移行（ＥＭＴ）によって発生する、まれではあるが記録された症例において重要である。
【００５９】
１実施形態により、上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する上記結合剤は治療的活性である。それぞれの実施形態の１例は、治療的活性抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の結合剤としての使用である。治療的活性抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、標的細胞、特に上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現する上記がん幹細胞の溶解を好ましくは生じる、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘起することが好ましくは可能である。さらなる実施形態により、上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する上記結合剤は、ターゲティング分子として機能して、少なくとも１つの治療剤にカップリングされる。カップリングは、共有結合または非共有結合手段によって達成することができる。上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する上記結合剤がターゲティング分子として機能するときに、上記結合剤自体は治療的活性であることができるか、または治療的活性であり得ない。上記結合剤が治療的活性でない場合、これは実際の治療剤（たとえば放射性医薬品、化学療法剤または毒素）を所望の作用標的側、すなわち上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現する上記がん幹細胞まで運ぶ分子キャリアとして基本的に機能する。上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤にカップリングされた治療剤は、たとえば化学療法剤または他の抗がん薬であることができる。カップリングされた上記治療剤は、好ましくはターゲティングされたがん幹細胞を破壊もしくは死滅させる、またはこれの増殖を抑制する。これはカップリングされた上記治療剤によって直接、またはターゲティングされた上記がん幹細胞および／または処置される被験体の好適な生体メカニズムの誘起によって間接的に、のどちらかで達成することができる。
【００６０】
１実施形態により、上記腫瘍関連炭水化物抗原はＣＤ１７６、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７４、ＣＤ１７３およびＣＡ１９−９から成る群より選択される。好ましくは、上記腫瘍関連炭水化物抗原はＣＤ１７６、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４およびＣＤ１７５またはＣＤ１７５ｓより選択される。これらの腫瘍関連炭水化物抗原に関する詳細事項は上に記載されている。これらの腫瘍関連炭水化物抗原が新規であり、好適ながん幹細胞マーカーであることは、本発明者によって示された。
【００６１】
好ましくは、上記腫瘍関連炭水化物抗原は腫瘍特異的である。このことは非腫瘍細胞、非がん細胞それぞれが、上記処置により影響を受けるリスクが低下するという利点を有する。好ましい腫瘍特異性に関する詳細事項も上に記載されている；それはそれぞれの開示に言及されている。
【００６２】
１実施形態により、がん幹細胞は、好ましくは糖タンパク質である少なくとも１つの幹細胞マーカーを同時発現する上記結合剤によって処置される。本発明者らは、腫瘍関連炭水化物抗原、例として特にＣＤ１７６、ＣＤ１７３およびＣＤ１７４が、がん幹細胞マーカーであることがすでに公知である他の幹細胞マーカー、例としてＣＤ４４およびＣＤ１３３と同時発現されることを見出している。好ましい実施形態により、上記結合剤によって特異的に結合される上記腫瘍関連炭水化物抗原を担持する（糖）タンパク質である、少なくとも１つの幹細胞マーカーを発現するがん幹細胞が処置される。ある実施形態において、上記結合剤は上記腫瘍関連炭水化物抗原を担持する（糖）タンパク質にも結合し得る。しかし特異的結合は、上記腫瘍関連炭水化物抗原が存在する場合にのみ発生する。本発明者らは、がん幹細胞マーカーとして有用な腫瘍関連炭水化物抗原、例としてＣＤ１７６が正常細胞ならびにがん幹細胞のマーカーとして公知であるタンパク質、例としてＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、ＣＤ１６４にほぼ独占的に担持されることが多いことを、および／または腫瘍関連（糖）タンパク質に担持されることを実証してきた。このことは、がん幹細胞マーカーとして本明細書で同定された上記腫瘍関連炭水化物抗原（複数可）の出現（発現）を生じるがん幹細胞への悪性形質転換のプロセスの間に、正常（糖）タンパク質幹細胞マーカーおよび／または腫瘍関連（糖）タンパク質がそのグリコシル化に特徴的な変化を被ることを示唆する。そのため腫瘍関連炭水化物抗原の新規がん幹細胞マーカーとしての同定は、がん幹細胞の処置にとって貴重な治療標的を提供する。
【００６３】
１実施形態により、上記がん幹細胞はＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１３３およびＣＤ１６４から成る群より選択される１個以上の幹細胞マーカーを発現する。好ましくは、上記腫瘍関連炭水化物抗原は、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１３３およびＣＤ１６４から成る群より選択される糖タンパク質に担持される。たとえばＣＤ１７６、ＣＤ１７５およびＣＤ１７５ｓは、特にＣＤ４４およびＣＤ１３３で発現されることが見出された。
【００６４】
１実施形態により、上記がん幹細胞は、以下の特徴の１つ以上を有するがんのがん幹細胞である：
ａ）がんが固形腫瘍である；
ｂ）がんが白血病である；
ｃ）がんが多発性骨髄腫もしくはリンパ腫である；
ｄ）がんが上皮起源の腫瘍である；ならびに／または
ｅ）がんが肺がん、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、消化器がん、膵臓がん、前立腺がん、子宮頸がんおよび頭頸部がんから成る群より選択される腫瘍である。
【００６５】
上記がん幹細胞がＣＤ１７６、ＣＤ１７５またはＣＤ１７５ｓを腫瘍関連炭水化物抗原として発現する実施形態では、上記がん幹細胞は好ましくは、白血病の、または固形腫瘍を形成する、すなわち白血病およびリンパ腫以外のがんであるがんの、がん幹細胞である。好ましくは、上記がんは上皮悪性腫瘍であり、およびさらに好ましくは（ｍｏｒｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）、肺癌腫、乳癌腫および肝臓癌腫から成る群より選択される。本明細書で提供される実施例で実証されるように、ＣＤ１７６はこれらのがん種のがん幹細胞で発現される。そのほかにＣＤ１７６は、白血病でたとえばＣＤ３４と同時発現されることが見出された。
【００６６】
上記がん幹細胞がＣＡ１９−９を腫瘍関連炭水化物抗原として発現する実施形態では、上記がん幹細胞は、１実施形態により、固形腫瘍を形成するがんのがん幹細胞である。好ましくは、上記がんは消化器癌腫である。
【００６７】
１実施形態により、上記結合剤は、腫瘍特異的炭水化物抗原である上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する。好ましくは生理学的状態およびそのため上記結合剤の治療適用の間に発生する状態の下で、上記結合剤は非がん細胞、非腫瘍細胞、良性がん細胞および／または良性腫瘍細胞で発現される抗原、特に炭水化物抗原を結合しない。それぞれ腫瘍特異的結合剤を使用することは複数の利点を有する。療法で使用されるときに、上記結合剤が、標的細胞および例えば上記腫瘍特異的炭水化物抗原を発現する細胞のみを認識して、そのため結合するが、同様の抗原、特に同様の炭水化物抗原を発現するだけの非標的、特に良性または正常細胞を結合しないことが確保される。これが腫瘍特異的療法、がん特異的療法を確保して、これにより望ましくない副作用が低減される。好適な腫瘍特異的結合剤は続いて、特に上記腫瘍特異的炭水化物抗原がＣＤ１７６またはＣＤ１７５である実施形態について記載されている。
【００６８】
好ましい実施形態により、腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤は抗体または抗体の抗原結合フラグメントもしくは誘導体である。好適な例は上および実施例に記載されている。
【００６９】
本発明により結合剤として使用される抗体または抗体の抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、好ましくは以下の特徴の１つ以上を有する：
ａ）それはがん細胞および／もしくは腫瘍細胞、特にがん幹細胞のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを媒介する；
ｂ）それはがん細胞および／もしくは腫瘍がん細胞、特にがん幹細胞のアポトーシスを誘起および／または促進する；
ｃ）それは標的のがん細胞および／もしくは腫瘍細胞、特にがん幹細胞の増殖を抑制する；
ｄ）それはがん細胞および／もしくは腫瘍細胞、特にがん幹細胞の食作用を誘起および／もしくは促進する；ならびに／または
ｅ）それは細胞傷害剤の放出を誘起および／または促進する。
【００７０】
１実施形態により、ＣＤ１７６特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、ＣＤ１７６を発現するがん幹細胞を処置するために使用される。好ましくは、上記ＣＤ１７６特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２または３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号４または５または６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３から成る群より選択される少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに好ましくは、それは少なくとも２個のＣＤＲ、例としてＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ３、またはＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含み、おのおの上で定義したようなアミノ酸配列を有する。最も好ましくは、それは３個すべてのＣＤＲ、すなわちＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含み、おのおの上で定義したようなアミノ酸配列を有する。代わりにＣＤＲＨ１は、配列番号１４から１７のうちの任意の１つのアミノ酸配列を有し得、そして／またはＣＤＲＨ２は配列番号１８から２７のうちの任意の１つのアミノ酸配列を有し得る。特にこれらのＣＤＲは、上記ＣＤ１７６特異的抗体または機能的に活性なそのフラグメントもしくは誘導体の重鎖可変領域に存在する。上記ＣＤ１７６特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の重鎖可変領域は、好ましくは配列番号４６から７９のうちの任意の１つのアミノ酸配列を含有するまたはこのアミノ酸配列から成る。
【００７１】
そのほかに上記ＣＤ１７６特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は好ましくは、配列番号７または８または９のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１０または１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号１２または１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３から成る群より選択される少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに好ましくは、それは少なくとも２個のＣＤＲ、例としてＣＤＲＬ１およびＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ１およびＣＤＲＬ３、またはＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含み、おのおの上で定義したようなアミノ酸配列を有する。最も好ましくは、それは３個すべてのＣＤＲ、すなわちＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含み、おのおの上で定義したようなアミノ酸配列を有する。代わりにＣＤＲＬ１は、配列番号２８から４５のうちの任意の１つのアミノ酸配列を有し得る。特にこれらのＣＤＲは、上記ＣＤ１７６特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の軽鎖可変領域に存在する。ＣＤ１７６特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の軽鎖可変領域は、好ましくは配列番号８０から９４のうちの任意の１つのアミノ酸配列を含有する、またはこのアミノ酸配列から成る。
【００７２】
好ましい実施形態において、上記ＣＤ１７６特異的抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の以下の１つのセットを含む：
【００７３】
【表１】
上記配列を図３に示す。それぞれの配列はＥＰ １ ５７２ ７４７にも開示されているため、上記配列について同じナンバリングを本明細書で使用する。
【００７４】
本発明による上記結合剤である、上記ＣＤ１７６特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、ヒト抗体、マウス抗体、ヒト化抗体もしくはキメラ抗体または機能的に活性なそのフラグメントもしくは誘導体であり得る。そのほかにそれは単鎖抗体フラグメント（たとえばｓｃＦｖ）、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、マルチボディ（たとえばダイア−、トリア−、またはテトラボディ）、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤアイソタイプの免疫グロブリンもしくはその任意のサブクラス、例としてＩｇＧ１、または少なくとも１つの定常ドメインを含む免疫グロブリン由来認識分子、またはＪ鎖（全体または一部）を欠いたものであり得る。好ましくは、上記ＣＤ１７６特異的抗体はＩｇＧ１抗体またはＩｇＭ抗体、特に、好ましくはヘキサマーの形態である、Ｊ鎖を含むＩｇＭ抗体または上記Ｊ鎖を欠いたＩｇＭ抗体であり、すなわちそれは２個の重鎖および２個の軽鎖を含む６個の抗体ユニットを含む。
【００７５】
特に好ましい実施形態において、上記ＣＤ１７６特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、たとえばＥＰ １ ５７２ ７４７の実施例７に記載されているような生理学的条件下では、Ｇａｌα１−３ＧａｌＮＡｃα、Ｇａｌα１−３ＧａｌＮＡｃβ、ＧａｌＮＡｃα、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα、Ｇａｌβ１−３（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６）ＧａｌＮＡｃα、ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα、ＧｌｃＮＡｃα１−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα、ＧａｌＮＡｃα１−３Ｇａｌβおよび／または３’−Ｏ−Ｓｕ−Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃαと特異的に相互作用しない。
【００７６】
１実施形態により、上記ＣＤ１７６特異的抗体はコア１構造を結合して、ＧｌｃＮＡｃβ１−６［Ｇａｌβ１−３］ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−である構造ｃｏｒｅ−２との交差反応性を示す。
【００７７】
ＣＤ１７６を結合する好適な抗体の例は、これに限定されるわけではないが、ＨＨ８（Ｃｌａｕｓｅｎ Ｈら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２５：１９９−２０４（１９８８））、Ａ７８−Ｇ／Ａ７（Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）、Ｎｅｍｏｄ−ＴＦ１およびＮｅｍｏｄ−ＴＦ２（Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）ならびにＨＢ−ＴＦ１（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、ハンブルク、ドイツ）を含む。
【００７８】
そのほかに本発明による上記結合剤は、上に記載したＣＤ１７６特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体との交差反応性を示す抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体を含み得る。特に、本発明による上記結合剤は、上に記載したＣＤ１７６特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体によって、または、溶液中のＣＤ１７６構造物、またはキャリア分子（例としてポリアクリルアミドに、もしくはペプチド、タンパク質もしくは脂質）に、当業者が決定できる十分な濃度または量でカップリングさせたＣＤ１７６構造物によって、結合が効果的に抑制され得る抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体であり得る。
【００７９】
さらなる実施形態により、ＣＤ１７５特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、ＣＤ１７５を発現するがん幹細胞を処置するために使用される。好適な特異的抗体は、従来技術で公知であるおよび／または上に記載した方法によって取得することができる。ＣＤ１７５に対する公知の抗体は、たとえばＨＢ−Ｔｎ１（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、ハンブルク、ドイツより入手可能）、ＴＫＨ６（Ｋｊｅｌｄｓｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４８：２２１４，１９８８）、および１Ｅ３（Ｔｈｕｒｎｈｅｒら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ４：４２９，１９９４）である。
【００８０】
１実施形態により、ＣＤ１７５ｓ特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、ＣＤ１７５ｓを発現するがん幹細胞を処置するために使用される。好適な特異的抗体は、従来技術で公知であるおよび／または上に記載した方法によって取得することができる。ＣＤ１７５ｓに対する公知の抗体は、たとえばＨＢ−ＳＴｎ１（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、ハンブルク、ドイツより入手可能）、ＴＫＨ２（Ｋｊｅｌｄｓｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４８：２２１４，１９８８）、Ｂ７２．３（Ｚｈａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：３３６４，１９９５）、およびＭＬＳ１０２（Ｎａｋａｄａら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６：１２４０２，１９９１）である。
【００８１】
１実施形態により、ＣＤ１７４特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、ＣＤ１７４を発現するがん幹細胞を処置するために使用される。好適な特異的抗体は、従来技術で公知であるおよび／または上に記載した方法によって取得することができる。ＣＤ１７４に対する公知の抗体は、たとえばＡ７０−Ｃ／Ｃ８（Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）、ＢＲ５５−２（Ｂｌａｓｚｃｚｙｋ−Ｔｈｕｒｉｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６２：３７２，１９８７）、およびＮＣＣ−ＳＴ−４３３（Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｇａｎｎ ７６：４３，１９８５）である。ＣＤ１７４に対する公知の治療抗体は、たとえばＡＢＬ３６４（Ｓａｎｄｏｚ）およびＢＲ９６（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）である。
【００８２】
１実施形態により、ＣＤ１７３特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、ＣＤ１７３を発現するがん幹細胞を処置するために使用される。好適な特異的抗体は、従来技術で公知であるおよび／または上に記載した方法によって取得することができる。ＣＤ１７３に対する公知の抗体は、たとえばＡ４６−Ｂ／Ｂ１０（Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）、ＢＥ２（Ｙｏｕｎｇら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５６：１０９６７，１９８１）、および９２ＦＲＡ２（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、ハンブルク、ドイツ）である。
【００８３】
１実施形態により、ＣＡ１９−９特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、ＣＡ１９−９を発現するがん幹細胞を処置するために使用される。好適な特異的抗体は、従来技術で公知であるおよび／または上に記載した方法によって取得することができる。ＣＡ１９−９に対する公知の抗体は、たとえば１１１６ＮＳ−１９−９（Ｍａｇｎａｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４３：５４８９，１９８３）、および１２１ＳＬＥ（Ｈｅｒｒｅｒｏ−Ｚａｂａｌｅｔａら、Ｂｕｌｌ Ｃａｎｃｅｒ ７４：３８７，１９８７）である。
【００８４】
腫瘍関連炭水化物抗原（複数可）を発現するがん幹細胞の処置で使用するための、上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤を含む薬学的組成物も提供され、ここで、上記結合剤、上記がん幹細胞および上記腫瘍関連炭水化物抗原は、上および特許請求の範囲に記載するような特徴の１つ以上を有する。それはそれぞれの開示に言及されている。
【００８５】
別の実施形態において、被験体におけるがん幹細胞の処置のための方法であって、（ａ）処置される上記がん幹細胞で発現された腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤および（ｂ）薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物を上記処置に有効な量で上記被験体に投与する工程を含む方法が開示される。上記結合剤、上記腫瘍関連炭水化物抗原ならびに上記がん幹細胞の特徴に関する詳細事項は、目的の結合化合物の請求項（ｐｕｒｐｏｓｅ ｂｏｕｎｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｃｌａｉｍ）と併せて上に記載されている。それは上の開示に言及されている。主題の方法は、予防目的および治療目的の両方に有用である。本明細書で使用する場合、「処置すること」または「処置」という用語は、疾患の防止、および先在状態の処置の両方を指すために使用される。患者の臨床症状を安定化または改善する進行中の疾患の処置は、本発明によって提供される詳細に重要な利点である。このような処置は望ましくは、影響を受けた組織における機能喪失の前に行われる；結果的に、本発明によって提供される予防治療の利益も重要である。たとえばがん患者の処置は、腫瘍サイズの低減、悪性細胞の排除、転移の防止、寛解になった患者の再発防止、播種性がん、特に腫瘍細胞または転移がん、特に循環中の細胞または逃避もしくは浸潤中の細胞を含む細胞の低減、部分的または完全な死滅、生存の延長および／または腫瘍進行、がん進行までの時間の延長であり得る。がん幹細胞で発現される腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する本発明による結合剤およびそれを含む薬学的組成物は有用であり、上記目的のために記載されている。
【００８６】
薬学的組成物は、所望の処方物に応じて、動物またはヒトへの投与のための薬学的組成物を処方するために普通に使用されるビヒクルとして定義される、希釈剤の薬学的に許容され得る非毒性キャリアを含むことができる。上記希釈剤は、その組合せの生物活性に影響しないように選択される。このような希釈剤の例は、蒸留水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液である。その上、薬学的組成物または処方物は、他のキャリア、アジュバント、または非毒性、非治療的、非免疫原性の安定剤、賦形剤などを含むことができる。上記組成物は、生理学的条件に近づけるための追加の物質、例としてｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤および洗浄剤も含むことができる。
【００８７】
上記組成物は、任意の多種多様の安定化剤、例として抗酸化剤なども含むことができる。上記薬学的組成物がポリペプチドを含むとき、上記ポリペプチドを、上記ポリペプチドのインビボ安定性を向上させる、またはそうでなければその薬理学的特性を向上させる（たとえば上記ポリペプチドの半減期を増大する、その毒性を低減させる、溶解性または取込みを向上させる）、各種の周知の化合物と複合体化することができる。このような修飾物（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）または複合化剤（ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ ａｇｅｎｔ）の例は、硫酸塩、グルコン酸塩、クエン酸塩およびリン酸塩を含む。組成物の上記ポリペプチドは、そのインビボ属性を向上させる分子と複合体化することもできる。このような分子は、例として炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン（たとえばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン）、および脂質を含む。
【００８８】
様々な種類の投与に好適である処方物に関するさらなるガイダンスは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ ｅｄ．（１９８５）に見出すことができる。薬物送達にための方法の簡単な総説については、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）を参照。
【００８９】
本明細書に記載する薬学的組成物は、多種多様の異なるやり方で投与することができる。例は、薬学的に許容され得るキャリアを含有する組成物を経口、鼻内、直腸、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）、腹腔内、静脈内，筋肉内、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）、経皮、髄腔内、および頭蓋内方法を経て投与することを含む。
【００９０】
本発明のさらなる態様により、患者から取得したがん検体が、結合剤が特異的である腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞を含むかどうかを決定する工程を含む、上記がん幹細胞に影響を与える処置であって、上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する上記結合剤による処置に感受性である、上記がん幹細胞を含むがんを同定する方法であって、ここで、がん幹細胞での上記腫瘍関連炭水化物抗原の存在が、腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する上記結合剤による処置に上記がんが感受性であることを示し、上記処置はまた上記がん幹細胞に影響を与える方法が提供される。
【００９１】
本発明による本方法は、がんの上記がん幹細胞が腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤による処置に感受性であるであるかどうかを試験することを可能にする。上記方法の結果は、医師に貴重な診断情報を提供する。たとえば上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現しないがん幹細胞を含む場合、上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤による処置は、上記がん幹細胞に影響を与えず、したがって上記がん幹細胞に対して無益であろう。しかし、上記方法により、上記がん幹細胞が、上記結合剤が特異的である、上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現することが示される場合、上記結合剤による処置も上記がん幹細胞をターゲティングして、したがってそのがん幹細胞に影響を与える可能性が高い。そのため本発明による方法は、医師が患者のための最良の療法を選び、がんの上記がん幹細胞に影響するかどうかを推定するための貴重な支援を提供する。
【００９２】
関係のある診断態様により、患者から単離された検体中の細胞での腫瘍関連炭水化物抗原の発現を分析する工程を含む、がんを診断、病期分類および／もしくは予後を判定するためのならびに／または処置に対する感受性を監視するための方法が提供され、ここで、上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現する細胞の存在は、上記検体中のがん幹細胞の存在を示す。
【００９３】
患者検体中のがん幹細胞の存在は、がんの病期を指示することができる。その上、がん幹細胞の検出を使用して、療法に対する応答を監視することおよび予後判定を支援することができる。本発明による方法によって取得される情報は、予後判定および診断に有用であり、それには、上記疾患の加速に対する感受性を分析すること、上記がんが進行しているかどうかおよびたとえば処置を必要とするかどうかが分析される、上記疾患の能動的監視による分析、疾患状態の状態（ｓｔａｔｕｓ）、環境における変化に対する応答、例として時間の経過、選ばれた治療剤、特に上に記載した結合剤による処置、または他の様相が含まれる。上記検体に含有された細胞が腫瘍関連炭水化物抗原を発現するかどうかを、したがって上記検体ががん幹細胞を含むかどうかを分析することによって、上記細胞を治療剤および処置に応答するその能力について分類することもできる。そのほかに、得られた上記情報は、がんの転移挙動を決定および／または予測するのに有用である。がん幹細胞マーカー、特にＣＤ１７６、ＣＤ１７５およびＣＤ１７５ｓとして同定される腫瘍関連炭水化物抗原は、転移で大量に存在することが多い。本明細書で記載したがん幹細胞の腫瘍関連炭水化物抗原の存在および本発明の結合剤によるその結合は、とりわけ上記腫瘍関連炭水化物抗原が腫瘍特異的であり、さらに明確にはそれがＣＤ１７６であるときに、不良な予後と関連していることが多い。がん幹細胞が上記腫瘍関連炭水化物抗原マーカーの発現によって同定される場合、その患者は転移を発生するリスクが増大している。
【００９４】
がんは、がん幹細胞の存在の分析により、本発明によって病期分類することができ、上記がん幹細胞は、特に上記腫瘍関連炭水化物抗原をマーカー標的として使用することによって同定される。病期分類は、予後判定および処置に有用である。
【００９５】
本発明による診断方法の１態様により、がん幹細胞で発現される腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する、本発明による結合剤は、インビボ診断、特にインビボイメージングに使用される。それぞれの方法は、診断目的にも有用である。たとえばがん幹細胞で発現される上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん細胞を、患者にて同定および／または特定できるかどうかを決定することができる。これが当てはまる場合、がん幹細胞が存在するというリスクがある。上および下に記載するように、第２の幹細胞マーカーが加えて検出されて、上記がん幹細胞の性質が確認および／または決定されることが好ましい。そのほかに、療法に対する応答を、たとえば上記腫瘍サイズが縮小するかどうかを、または転移（ｍｅｔａｓｅ）が発生するかどうかを決定することができるように、監視することができる。そのほかにそれぞれの方法は、患者への好適な投薬量を同定するために好都合である。１実施形態により、上記結合剤は標識され、たとえば、それは放射性核種を含む放射性医薬品である。しかし上記結合剤は、他の剤／化合物、例としてたとえばインビボイメージングできるようにするＰＥＴトレーサにもカップリングされ得る。好適な化合物は、従来技術で公知であり、そのためここではさらなる記載は必要ない。上記結合剤、上記腫瘍関連炭水化物抗原、さらなるがん幹細胞マーカーおよびがん種に関する詳細事項は、上および下に記載され、インビボイメージング実施形態にも適用される。それはそれぞれの開示に言及されている。
【００９６】
そのため腫瘍関連炭水化物抗原、例としてＣＤ１７６、ＣＤ１７４およびＣＤ１７３のがん幹細胞マーカーとしての同定ならびにその発見の活用にそれぞれ基づく本発明の記載された方法は、重要かつ好都合な診断および予後判定ツールを提供する。
【００９７】
好ましい実施形態により、本発明による方法は、上記細胞が少なくとも１つの第２のがん幹細胞マーカーを同時発現するかどうかを分析する工程を加えて含む。これにより、がん幹細胞の表現型をさらに確認することができる。分析された上記検体中で上記腫瘍関連炭水化物抗原および少なくとも１つの第２のがん幹細胞マーカーを同時発現する細胞の存在を同定することは、それぞれの細胞ががん幹細胞であることおよびたとえば分析された上記検体ががん幹細胞を含有することまたはがん幹細胞がインビボ診断方法によって検出されたことを示す／確認する。決定することができる好適ながん幹細胞マーカーは、上記腫瘍関連炭水化物抗原のほかに、がん種に依存する。好ましい実施形態により、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１３３およびＣＤ１６４から成る群より選択される、少なくとも１つの追加の糖タンパク質がん幹細胞マーカーの同時発現が試験される。
【００９８】
１実施形態により、上記腫瘍関連炭水化物抗原はＣＤ１７６、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７４、ＣＤ１７３およびＣＡ１９−９から成る群より選択される。上記腫瘍関連炭水化物抗原に関する詳細事項は上で詳細に記載されている。それは上の開示に言及されている。
【００９９】
好ましくは、上記腫瘍関連炭水化物抗原は腫瘍特異的であり、好ましくは悪性細胞のみで発現される。１実施形態により、上記腫瘍関連炭水化物抗原は、がん幹細胞で主としてまたは独占的に発現される。別の実施形態により、上記腫瘍関連炭水化物抗原は上記がん幹細胞で発現され、ならびに、それ自体はがん幹細胞ではないが、たとえばこれらの細胞の誘導体であるがん細胞か、またはがん幹細胞ではない、がんそれぞれの腫瘍細胞（ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ）である、がん細胞で発現される。
【０１００】
１実施形態により、検体中のがん幹細胞の存在は、本明細書に記載するがん幹細胞の表現型を有する細胞を定量することによって決定され、したがって上記腫瘍関連炭水化物抗原および好ましくはさらなるがん幹細胞マーカーを発現する。上記検体中のより多数のがん幹細胞の同定は、より高悪性度のがん表現型を指示する。１実施形態により、上記検体中に存在する細胞は、上記腫瘍関連炭水化物抗原および必要に応じて、少なくとも１つのさらなるがん幹細胞マーカーの発現について定量（定量化／定量的に分析）される。上記腫瘍関連炭水化物抗原に対して陽性である細胞の「幹細胞」特質は、たとえば球を形成する際に、培養中の細胞の自己再生および増殖する能力をたとえば決定することによって実験的にさらに確認され得る。代わりにまたは加えて、上記細胞を動物モデルにおける腫瘍原性（ｔｕｍｏｒｇｅｎｉｃｉｔｙ）について試験することができる。
【０１０１】
本発明の１実施形態において、がん患者、たとえば上に記載したようながんに罹患しているまたはがんの疑いがある患者からの検体は、上記腫瘍関連炭水化物抗原に特異的な少なくとも１つの剤によって染色される。少なくとも１つのさらなるがん幹細胞マーカーの同時発現が分析される場合、検体はさらなる上記がん幹細胞マーカーに特異的な少なくとも１つの剤によっても染色されることが好ましい。
【０１０２】
染色パターンの分析は、上記検体中に存在するがん幹細胞の量についての情報を提供し得る。そのほかに上記染色パターンは上記がん幹細胞の相対分布についての情報も供給し得て、上記分布は上記がんの腫瘍原性を予測できるようにし得て、上記がんの進行を予知できるようにもし得る。
【０１０３】
１実施形態により、がん細胞を含有するまたは含有することが疑われる検体を、上記腫瘍関連、好ましくは腫瘍特異的炭水化物抗原およびそのため炭水化物がん幹細胞マーカーを特異的に結合する少なくとも１つの剤ならびに必要に応じて第２のがん幹細胞マーカー、好ましくはＣＤ４４を特異的に結合する少なくとも１つのさらなる剤と接触させる、および好ましくは上記剤によって染色する。これによって上記検体中のがん幹細胞の存在が検出できるようになる。１実施形態により、上記腫瘍関連炭水化物抗原に対する上記結合剤の結合および好ましくは上記第２のがん幹細胞マーカーに対する上記結合剤の結合は、当分野で公知のおよび本明細書に記載するような適切な検出方法によって検出される。好適な検出方法はたとえばＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、蛍光顕微鏡法などである。
【０１０４】
本発明の方法によって分析される検体は、多種多様の源から、詳細には生検検体から取得され得る。このような検体の細胞は、遠心分離、水簸（ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）、密度勾配分離、アフェレーシス、親和性選択、パニング、ＦＡＣＳ、Ｈｙｐａｑｕｅによる遠心分離などにより分析前に分離することができる。いったん検体が取得されると、検体を直接使用するか、凍結するか、または短期間にわたって適切な培養培地中で維持するか、または適した固定溶液で固定されるか、または組織学的（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｇａｌ）もしくは免疫組織学的検査に適した媒体で固定および包埋することができる。各種の媒体を採用して細胞を維持することができる。上記検体は任意の便利な手順、例として生検によって、または外科標本から取得され得る。通例、検体は少なくとも約１０２細胞、さらに通例少なくとも約１０３細胞、ならびに好ましくは１０４、１０５以上の細胞を含む。典型的に、上記検体はヒト患者からであるが、動物モデル、たとえばウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯動物、たとえばマウス、ラット、ハムスター、霊長類なども用途を見出し得る。
【０１０５】
上記検体は凍結され得る、包埋され得る、固定され得る、組織マイクロアレイ中に存在し得るなどである。上記腫瘍関連炭水化物抗原および、必要に応じてさらなるがん幹細胞マーカーを結合、検出、および特に染色するために使用される剤は、たとえば上記がん幹細胞マーカーを特異的に結合する結合剤、たとえば抗体などであることができる。好適な例は上に記載されている。これらの剤は、検出可能に標識され得るか、または染色手順で間接的に標識され得る。１実施形態により、標識を使用して、上記腫瘍関連炭水化物抗原陽性細胞を分離することもできる。好適な標識ならびに染色手順は従来技術で公知であり、したがって一部の実施例が本明細書に記載されているけれども、ここではさらなる記載は必要ない。分析の標準手順は、たとえば実施例に記載されているように、上記検体の組織学的固定（たとえばホルマリンによる）およびその後の染色を含み得る。取得されたデータによって、上記検体中のがん幹細胞の数および分布を決定できるようになる。
【０１０６】
上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現する細胞を検出および／または定量化するのに好適な方法は、たとえば免疫学的アッセイ、例としてＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウェスタンブロットおよび免疫組織化学、フローサイトメトリー、免疫組織化学などを含む。これらの方法により、新規がん幹細胞マーカーおよび、必要に応じて少なくとも１つのさらなるがん幹細胞マーカーとしての、上記腫瘍関連炭水化物抗原、例として特にＣＤ１７６、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７４およびＣＤ１７３を発現する細胞の存在および所望ならば量も同定できるようになる。
【０１０７】
特に興味深いのは、上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤としての複数の抗体、１個の抗体をそれぞれ使用することである。好都合なことには、これらの抗体は検出のためにおよび／または分離での使用のために標識と結合体化される。標識は、直接分離できるようにする磁性ビーズ、支持体に結合されたアビジンまたはストレプトアビジンによって分離することができるビオチン、特定の細胞種の分離を容易にできるようにするための、蛍光活性化セルソーターなどで使用できる蛍光色素を所望ならば含む。用途がある蛍光色素は、フィコビリタンパク質、たとえばフィコエリトリンおよびアロフィコシアニン、フルオレセイン誘導体、Ｃｙ３、Ｃｙ５、またはテキサスレッドを含む。さらなるがん幹細胞マーカーが上記腫瘍関連炭水化物抗原のほかに検出される場合、おのおのがん幹細胞マーカーについての独立したソーティングを許容するために、上記さらなるがん幹細胞マーカーを特異的に結合する剤を異なる蛍光色素によって標識することが好ましい。
【０１０８】
１実施形態により、上記がん幹細胞マーカー（複数可）を特異的に結合する上記結合剤は、細胞の懸濁物に添加され、利用可能な細胞表面抗原を結合するのに十分な期間にわたってインキュベートされる。分離の効率が上記がん幹細胞マーカーを特異的に結合する剤の欠如によって制限されないように、反応混合物中に十分な濃度の剤を有することが所望される。適切な濃度は滴定によって決定される。上記細胞が分離される媒体は、上記細胞の生存能力を維持する任意の媒体である。標識された細胞は次に好ましくは、先に記載したように、上記細胞表面マーカーの発現について定量される；いくつかのこのような方法も当分野で公知である。
【０１０９】
特異前駆体分析（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ）；または患者検体から取得されたがん幹細胞分析、および参照分析の比較は、好適な演繹プロトコル、人工知能（ＡＩ）システム、統計的比較などの使用によって達成され得る。正常細胞、同様の罹患組織からの細胞などからの参照の特異前駆体分析による比較は、上記疾患病期分類の指標を提供することができる。参照の特異前駆体分析のデータベースを蓄積することができる。特に興味のある分析は、疾患の加速が早期段階で観察されるように、患者を追跡する。本発明の方法は、臨床症状の発症前に加速の検出を提供し、ゆえに早期の治療的介入、たとえば化学療法の開始、化学療法用量の増加、化学療法薬または他の抗がん薬の選択の変更などができるようになる。
【０１１０】
上記選択したマーカーの存在を定量化するために、各種の方法を利用できる。存在する分子の量を測定するために、便利な方法は、蛍光性、発光性、放射性、酵素活性などであり得る検出可能な部分（ｍｏｉｅｔｙ）を持つ分子を、詳細には高い親和性を持つパラメータへの結合に対して特異的な分子を標識することである。蛍光部分は、ほぼ任意の生体分子、構造または細胞種を標識するために容易に利用でき、免疫蛍光部分は、特異的タンパク質だけでなく、特異的高次構造、切断生成物、またはリン酸化などの部位改変も結合するように向けることができる。個々のペプチドおよびタンパク質は、たとえば細胞内部でそれらを緑色蛍光タンパク質キメラとして発現させることにより、工学技術で作製して自己蛍光性にすることができる（総説は、Ｊｏｎｅｓら（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１２）：４７７−８１を参照）。そのため抗体は遺伝的に改変されて、その構造の一部として蛍光染料を提供することができる。選ばれた標識に応じて、パラメータは蛍光標識以外を使用して、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ホモジニアス酵素免疫測定法、および関係のある非酵素的技法などの免疫測定法技法を使用して測定され得る。
【０１１１】
上記腫瘍関連炭水化物抗原および必要に応じて、しかし好ましくは少なくとも１つのさらなるがん幹細胞マーカーを発現する、分析された検体中の細胞の同定は、上記分析された検体中のがん幹細胞の存在を示し、原発性腫瘍における、ならびに転移におけるがん幹細胞ドメインの定義もできるようにし得る。そのほかに、上に記載したように、特異的腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞の同定は、上記がん幹細胞を含む上記がんを処置するための適切な療法を選択できるようにする。
【０１１２】
１実施形態により、本発明による方法で使用される結合剤は、腫瘍特異的炭水化物抗原を特異的に結合する。好ましくは、上に記載したならびに請求項９および１０に定義した本発明の診断に関係のある方法を行うために使用される条件下で、上記結合剤は非がん細胞、非腫瘍細胞、良性がん細胞および／または良性腫瘍細胞で発現される抗原、特に炭水化物抗原を結合しない。本発明の方法でそれぞれ腫瘍特異的結合剤を使用することは複数の利点を有する。上記結合剤が標的細胞およびそのため上記腫瘍特異的炭水化物抗原を発現する細胞のみを認識して、そのため結合するが、同様の抗原、特に同様の炭水化物抗原を発現するだけの非標的細胞を結合しないことが確保される。このことは本発明による方法における偽陽性のリスクを低減する。好適な腫瘍特異的結合剤は、特に上記腫瘍特異的炭水化物抗原がＣＤ１７６である実施形態について上に記載されている。
【０１１３】
好ましい実施形態により、上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する上記結合剤は抗体または抗体の抗原結合フラグメントもしくは誘導体である。
【０１１４】
１実施形態により、検出される上記腫瘍関連炭水化物抗原に特異的な抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞を染色するために使用される。ＣＤ１７６、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７４、ＣＤ１７３およびＣＡ１９−９を結合する抗体の好適な例は上で詳細に記載されている。それは上の開示に言及されている。
【０１１５】
腫瘍関連炭水化物抗原を発現するならびに特にＣＤ１７６、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７４、ＣＤ１７３および／またはＣＡ１９−９を発現するがん種は、上に記載されている。それは上の開示に言及されている。
【０１１６】
１実施形態において、上記患者検体は参照または標準試験値と比較される。別の実施形態において、上記患者検体は、前がん検体と、または上記疾患の経過を通じて１つ以上の時点で取得された患者検体（複数可）と比較される。
【０１１７】
本発明のいくつかの実施形態において、存在するがん幹細胞によってがんの分類および／または臨床病期分類のための方法が提供され、より多数のがん幹細胞は、より高悪性度のがん表現型を示す。
【０１１８】
本発明の別の実施形態において、腫瘍関連炭水化物抗原を発現する単離がん幹細胞の組成物が提供される。そのため、哺乳動物がん幹細胞の組成物も提供され、ここで、上記組成物中の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは（ｍｏｓｔ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）少なくとも９０％の細胞は、腫瘍関連抗原に、好ましくは腫瘍特異的炭水化物抗原に陽性であるがん幹細胞である。
【０１１９】
これらの細胞、組成物はそれぞれ、たとえば、実験的評価のために、ならびに系列および細胞特異的生成物の源として、ならびにそれらに影響することができる因子または剤の発見のための標的として有用である。これらのがん幹細胞、組成物はそれぞれ、上記がん幹細胞に対する効果について剤をスクリーニングする方法で使用され得る。これは候補剤を本発明の細胞集団と組合せること、および次に上記剤から生じる任意の調節効果を決定することを伴う。これは毒性、代謝変化、または細胞機能に対する効果についての上記細胞の検査を含み得る。本明細書に記載するがん幹細胞の表現型は、疾患進行、再発、および薬物耐性の発生を予測する手段を提供する。
【０１２０】
そのほかに、腫瘍関連炭水化物抗原を発現する単離されたがん幹細胞または上記腫瘍関連炭水化物抗原を含むその溶解物、フラグメントもしくは画分の上記組成物は、がん幹細胞をターゲティングする免疫療法目的に有用である。たとえばそれらは、自家または同種異系ワクチンとして使用され得る。これらのがん幹細胞組成物は、全体として生または不活性で（好ましくは、上記細胞は分裂できない）、これら単独のまたは他の剤、例としてアジュバントと組合せた溶解物、フラグメント、画分または精製物として、上記がん幹細胞、上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん、上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現する転移および／または上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現する播種性腫瘍細胞に対する免疫応答を達成するために、動物またはヒトのどちらかを免疫するのに使用することができる。好ましくは、それらは上記腫瘍関連炭水化物自体に対する免疫応答を誘起する。好ましくは、腫瘍関連、好ましくは腫瘍特異的炭水化物抗原を発現する上記がん幹細胞に対する少なくとも１つの結合剤は、これにより取得される。好ましくは、上記取得された結合剤は腫瘍特異的であり、そのため上記腫瘍特異的炭水化物抗原のみを認識および結合するが、がん細胞、好ましくはがん幹細胞で発現されない同様の炭水化物構造は認識および結合しない。
【０１２１】
１実施形態により、上記腫瘍関連炭水化物抗原を含む上記がん幹細胞またはそれの溶解物、フラグメントもしくは画分は、抗原提示細胞ベースワクチンを取得するために使用される。好ましくは、抗原提示細胞、例としてたとえば樹状細胞前駆体はエクスビボで刺激されて、成熟し、がん幹細胞で発現される腫瘍関連炭水化物抗原を取り込んで提示する。この目的のために、上記抗原提示細胞は、腫瘍関連炭水化物抗原を発現する本発明による組成物および／またはその溶解物、フラグメントまたは画分と同時インキュベートすることができる。それらはワクチン接種を受ける患者から入手され得るか、またはそれらは同じ種類のがんを持つ他の患者から入手され得る。成熟樹状細胞は次に上記患者に注射されて、上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞に対する免疫応答を引き出すことができる。好適なおよび好ましい腫瘍関連炭水化物抗原は上に記載され、それはそれぞれの開示に言及されている。
【０１２２】
がん幹細胞で発現される上記腫瘍関連炭水化物抗原を含む、本発明による組成物またはその溶解物、フラグメントもしくは画分を使用することにより取得される上に記載されたワクチンは、がん、転移または播種性（ｄｉｓｓｉｍｉｎａｔｉｎｇ）腫瘍細胞成長を防止、低減または治癒する、好ましくは上記がん幹細胞に対する、好ましくは固形腫瘍の上記がん幹細胞に対する免疫応答を誘起する。
【０１２３】
そのほかに、上記腫瘍関連炭水化物抗原を含む本発明による上記組成物またはその溶解物もしくは画分は、上に記載した治療目的に有用な好適な結合剤を同定および／または単離するのに有用である。たとえばそれらは、がん幹細胞を標的とする好適な結合分子を同定するためのスクリーニング標的として使用することができる。好適なスクリーニング方法は、従来技術で公知である。１実施形態により、結合剤を発現および／またはディスプレイする細胞、ファージ、細菌または酵母は、本発明によるこれらの上述の組成物、上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞または上記腫瘍関連炭水化物抗原を含むその溶解物、画分もしくは精製物へのその結合により、当業者に公知のスクリーニング技術によって選択される。そのほかに、上記腫瘍関連炭水化物抗原を含む本発明による上記組成物またはその溶解物もしくは画分は、免疫原として使用されるときに、好適な結合剤を取得するのに有用である。たとえば好適な抗体を取得するためのそれぞれの免疫方法は従来技術で公知であり、上にも記載されている。
【０１２４】
上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現する興味のある上記がん幹細胞は、上に記載した特徴を有する細胞について富化する技法により細胞の複合混合物から分離され得る。例は上に記載され、これに限定されるわけではないが、上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤を担持する磁性粒子の使用を伴うＦＡＣＳソーティング手順または方法を含む。上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する好適な結合剤は、上に記載されている；それはそれぞれの開示に言及されている。
【０１２５】
１実施形態により、上記腫瘍関連炭水化物抗原はＣＤ１７６、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７４、ＣＤ１７３、およびＣＡ１９−９から成る群より選択され、好ましくはＣＤ１７６、ＣＤ１７４およびＣＤ１７３より選択される。上記腫瘍関連炭水化物抗原に関する詳細事項は上で詳細に記載されている。それは上の開示に言及されている。
【０１２６】
好ましくは、上記組成物は少なくとも１つのさらなる幹細胞マーカーに陽性であるがん幹細胞を含む。好ましくは、上記がん幹細胞は、さらに好ましくは（ｍｏｒｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１３３およびＣＤ１６４から成る群より選択される糖タンパク質を発現する。
【０１２７】
好ましくはＣＤ１７６、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７４、ＣＤ１７３、およびＣＡ１９−９から成る群より選択され、さらに好ましくは（ｍｏｒｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）ＣＤ１７６、ＣＤ１７４およびＣＤ１７３より選択される上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞を単離する工程を含む、がん幹細胞の単離のための方法も提供される。上記方法は以下の工程を含む：
ａ）腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞を含むまたは含むことが疑われる組成物を、腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞を結合するための、上記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤と接触させる工程；
ｂ）腫瘍関連炭水化物抗原を発現する少なくとも１つのがん幹細胞を残存する組成物から分離する工程。
【０１２８】
好適な結合剤、それぞれの腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん種および他の詳細事項は、上および下に記載されている。それは上の開示に言及されている。
【０１２９】
組織からのそれぞれの細胞の単離には、適切な溶液が分散または懸濁のために使用され得る。概してこのような溶液は、概して５〜２５ｍＭの低濃度の許容され得る緩衝液と併せてウシ胎仔血清または他の天然に存在する因子が都合よく補われた平衡塩類溶液、たとえばノーマルセーライン（ｎｏｒｍａｌ ｓａｌｉｎｅ）、ＰＢＳ、ハンクス平衡塩類溶液などである。便利な緩衝液は、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液などを含む。
【０１３０】
分離された細胞は、上記細胞の生存能力を維持する、通例、収集チューブ底部に血清のクッションを有する任意の適切な培地に収集され得る。各種の培地が市販され、細胞の性質によって使用され得て、ウシ胎仔血清を補うことが多いｄＭＥＭ、ＨＢＳＳ、ｄＰＢＳ、ＲＰＭＩ、イスコフ培地などが含まれる。
【０１３１】
腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞が高度に富化された組成物が、本様式で達成される。対象集団は、上記細胞組成物の５０パーセントもしくは約５０パーセント以上、好ましくは細胞組成物の７５パーセントもしくは約７５パーセント以上、９０パーセント以上であり得る。所望の上記細胞は、その表面表現型によって同定される。詳細事項は上に記載され、それはそれぞれの開示に言及されている。好ましくはそのがん幹細胞表現型は、幹細胞の必須の特性であるその自己再生能力によって加えて確認される。上記富化されたがん幹細胞集団はただちに使用され得るか、または液体窒素温度にて凍結され、長期間にわたって貯蔵され得、解凍されて、再使用することが可能である。上記細胞はたとえば、１０パーセントのＤＭＳＯ、５０パーセントのＦＣＳ、４０パーセントのＲＰＭＩ１６４０培地で貯蔵され得る。上記腫瘍関連炭水化物抗原および必要に応じてさらなるがん幹細胞マーカーを発現するがん幹細胞が富化された細胞集団は、下記のような多種多様のスクリーニングアッセイおよび培養で使用され得る。
【０１３２】
上記富化されたがん幹細胞集団は、各種の培養条件下にてインビトロで成長され得る。培養培地は液体または半固体であり得て、たとえば寒天、メチルセルロースなどを含有する。上記細胞集団は通常、ウシ胎仔血清（約５〜１０パーセント）、Ｌ−グルタミン、チオール、詳細に２−メルカプトエタノール、および抗生物質、たとえばペニシリンおよびストレプトマイシンを補った適切な栄養培地、例としてイスコフ改変ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０に都合よく懸濁され得る。
【０１３３】
培養物は、上記細胞が反応性である成長因子を含有し得る。成長因子は本明細書で定義されるように、培養物中または無傷の組織中のどちらかで，膜貫通受容体に対する特異的作用を通じて、細胞の生存、成長およびまたは分化を促進することが可能である分子である。成長因子は、ポリペプチド因子および非ポリペプチド因子を含む。多種多様の成長因子、たとえばＬＩＦ、スチール因子（ｓｔｅｅｌ ｆａｃｔｏｒ）（ｃキットリガンド）、ＥＧＦ、インスリン、ＩＧＦ、ＮＧＦなどが細胞を培養するのに使用され得る。成長因子のほかにまたは代わりに、対象細胞は、線維芽細胞、間質細胞または他のフィーダー層細胞との同時培養で成長し得る。
【０１３４】
腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤および使用のための指示を含む、がんの診断、病期分類および／もしくは予後判定、がんの転移挙動の診断、病期分類および／もしくは予後判定、インビボイメージングならびに／またはがんの治療的処置の有効性の監視のためのキットも提供される。好ましくは、上記結合剤はＣＤ１７６、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７４、ＣＤ１７３、およびＣＡ１９−９から成る群より選択される、さらに好ましくは（ｍｏｒｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）ＣＤ１７６、ＣＤ１７４およびＣＤ１７３より選択される、がん幹細胞で発現される腫瘍関連炭水化物抗原を結合する。
【０１３５】
好ましくは、上記結合剤は標識されている。好適な結合剤および標識は上に記載され、それはそれぞれの開示に言及されている。キットは、チューブ、バッファーなどおよび使用のための指示も含み得る。
【０１３６】
好ましい実施形態により、上記キットはさらなる幹細胞マーカーを特異的に結合する少なくとも１つのさらなる剤を含む。好ましくは、上記幹細胞マーカーは糖タンパク質である。好ましい実施形態により、上記キットはＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１３３およびＣＤ１６４から成る群より選択される糖タンパク質を特異的に結合する少なくとも１つのさらなる剤を含む。
【０１３７】
腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞に対する有効性について候補治療剤をスクリーニングする方法も提供され、上記方法は：
ａ）上記剤を本発明による細胞組成物と接触させる工程、および
ｂ）上記腫瘍関連炭水化物抗原に対する上記剤の有効性を決定する工程、
を含む。
【０１３８】
それぞれのスクリーニング方法は、因子および治療剤、例としてがん幹細胞で活性である化学療法剤、結合剤または他の抗がん薬を検出、同定および／または単離するインビトロアッセイおよびスクリーニング方法にとって特に有用である。特に興味があるのは、ヒト細胞で活性である剤のスクリーニングアッセイである。タンパク質結合、細胞成長、分化および機能活性の決定、因子の産生のための免疫測定法；などを含む、多種多様のアッセイが本目的のために使用され得る。
【０１３９】
候補治療剤についてのスクリーニングアッセイでは、通例、興味のある上記腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞を含む培養物が、興味のある結合剤と接触され、上記剤の効果は出力パラメータ、例としてマーカーの発現、細胞の生存能力などを監視することによって評価される。上記スクリーニングは、上記候補治療剤の非存在下での上記細胞の成長、増殖、生存能力、および／または分化状況と比較して、上記候補治療剤の存在下で上記細胞の成長、増殖、生存能力、および／または分化の調節を決定することも含み得る。
【０１４０】
好ましくは，上記腫瘍関連炭水化物抗原はＣＤ１７６、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７４、ＣＤ１７３、およびＣＡ１９−９から成る群より選択され、さらに好ましくは（ｍｏｒｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）ＣＤ１７６、ＣＤ１７４およびＣＤ１７３より選択された。詳細事項は上に記載され、それはそれぞれの開示に言及されている。
【０１４１】
上記細胞は、上に記載したように新たに単離、培養、遺伝子的に改変されて、シグナル伝達経路などの活性化のためのマーカーを提供し得る。上記細胞は、たとえば独立した培養物中に分けられて、別個の条件下で、たとえば薬物を用いてまたは用いずに；サイトカインまたはその組合せの存在下または非存在下で成長した、クローン培養物の環境誘起バリアントであり得る。応答のタイミングを含む、細胞が剤、詳細には薬理学的剤に応答する様式は、上記細胞の生理的状態の重要な反映である。
【０１４２】
パラメータは、細胞の定量化可能な成分、詳細には望ましくは高スループットシステムで正確に測定することができる成分である。
【０１４３】
候補剤は、上記剤を哺乳動物がん幹細胞の少なくとも１つの組成物に添加することによって、生物活性についてスクリーニングされ、ここで、上記組成物中の上記細胞の少なくとも５０％は興味のある上記腫瘍関連炭水化物抗原に陽性である。上記組成物のさらなる特徴は上に記載され、本発明者らはそれぞれの開示で言及している。上記剤に応答したパラメータの変化が測定され、その結果は、たとえば上記剤の存在および非存在下で、他の剤などを用いて取得された参照培養物に対する比較によって評価される。
【０１４４】
上記剤は、溶解されてまたはただちに可溶性の形態で、培養中の細胞の培地に都合よく添加することができる。上記剤は、フロー・スルー・システムに流れとして間欠的もしくは連続的に添加され得るか、または代わりに、上記化合物のボーラスを単独にまたは増加的に、別の方法で静止している溶液に添加される。フロー・スルー・システムでは、２つの流体が使用され、一方は生理学的に中性の溶液であり、他方は試験化合物が添加された同じ溶液である。その第１の流体は上記細胞を通過して、続いて第２の流体が通過する。単一溶液の方法では、上記試験化合物のボーラスが上記細胞の周りの培地の体積（ｖｏｌｕｍｅ）に添加される。培養培地の成分の全体の濃度は、ボーラスの添加によって、またはフロースルー方法における２つの溶液の間で、有意に変化すべきではない。
【０１４５】
本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル、細胞系、動物種または属、および試薬に制限されず、これらは変化し得ることが理解されるはずである。本明細書で使用される専門用語は特定の実施形態のみを記載する目的のためであり、添付の特許請求の範囲によってのみ制限され、本発明の範囲を制限するものではないことも理解されるはずである。
【実施例】
【０１４６】
Ｉ．肺がん、乳がんおよび肝臓がん幹細胞でのＣＤ１７６（トムゼン−フリーデンライヒ抗原）の発現
１．材料および方法
抗体
適用された抗体は：ＣＤ４４ ｍＡｂ（Ｇ４４−２６，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、フランクリンレイクス、ＮＪ、米国）、ＣＤ１３３ ｍＡｂ（ＡＮＣ９Ｃ５，Ａｎｃｅｌｌ、ベイポート、ＭＮ、米国、ＣＤ１７６ ｍＡｂ（ＮＭ−ＴＦ２，Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）、ＭＵＣ１ ｍＡｂ（ＰａｎｋｏＭａｂ，Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ ＧｍｂＨ）であった。
細胞系および細胞培養
乳腺癌（ＭＤＡ２３１、ＭＤＡ４３５、およびＭＣＦ−７）、肺がん（ＳＰＣ−Ａ−１およびＧＬＣ−８２、肺腺癌；ＮＣＩＨ４４６、小細胞肺癌腫；８０１−Ｄ、巨細胞肺癌腫）、および肝細胞癌腫（ＨｅｐＧ２およびＨｕＨ−７）からのがん細胞系を含む、幅広い多様なヒトがん細胞系を本研究で使用した。すべての細胞系を、１０％ウシ胎仔血清を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で通常どおりに培養した。
免疫細胞化学
培養した細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、ポリリシン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ、米国）コートスライド上に一晩蒔いた。その後、上記培地を慎重に吸引して、上記スライドを空気乾燥させた。包んだスライドを−８０℃にて使用するまで貯蔵することができた。免疫蛍光二重染色のために、細胞を冷（−２０°）アセトンで１５分間固定し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によって３０分間ブロッキングして、ＣＤ１７６に対するｍＡｂと一緒に、ＣＤ４４またはＣＤ１３３に対する抗体とともに６０分間インキュベートした。続いてスライドをフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合体化抗マウスＩｇＭ（μ鎖特異的）（Ｆ９２５９，Ｓｉｇｍａ）およびＣｙ３結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異的）（＃６９７３２，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ウェストグローブ、ＰＡ、米国）の混合物とともにインキュベートした。対比染色を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ）（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉａｎｇｓｕ，中国）を用いて行った。陰性対照は特異的ｍＡｂの代わりに培地で行った。上記スライドをグリセロールでマウントし、共焦点顕微鏡法（オリンパス、東京、日本）および蛍光顕微鏡法によって分析した。陽性細胞または二重陽性細胞のパーセンテージをデジタル画像上でカウントした。
フローサイトメトリー分析
細胞系の細胞懸濁物を１×１０６細胞／１００μｌにて調製した。細胞を、２％ＢＳＡを含有するＰＢＳを用いて２回洗浄し、適切な希釈度の１次抗体によって４℃にて２０分間、続いて適切な濃度の抗ＩｇＧ−Ｃｙ３（γ鎖特異的）および抗ＩｇＭ−ＦＩＴＣ（μ鎖特異的）によって４℃にて２０分間インキュベートした。フローサイトメトリーをＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、フランクリンレイクス、ＮＪ、米国）を用いて行った。１０，０００細胞から収集したデータおよびＷｉｎＭＤＩソフトウェアをＦＣＳデータファイルの分析に使用した。
【０１４７】
４−ヒドロキシタモキシフェン処置のために、ＭＤＡ２３１、ＭＤＡ４３５およびＭＣＦ−７乳腺癌細胞系を２０ｎＭの最終濃度の４−ＯＨＴ（＃Ｈ６２７８，Ｓｉｇｍａ）に２４時間曝露した。次にフローサイトメトリー分析を上に記載したように行った。
組織および免疫組織化学
２１症例の肺癌腫（１３症例の腺癌および８症例の扁平上皮癌腫）、１５症例の乳癌腫、および２１症例の肝細胞癌腫（ＨＣＣ）の被検物を、最初の手術を受けた患者から取得した。上記検体は、患者の機密保護のため完全にコード化され、すべての参加施設の地域研究倫理委員会によって承認された。
【０１４８】
新たな組織をプラスチック型内のＯＣＴ化合物で−２０℃にて（最適切断温度）慎重に包埋して、クリオスタットチャンバ内での平衡化後に４〜８μｍ切片に切断し、冷（−２０°）アセトンによって１５分間固定した。免疫蛍光二重染色のために、上記組織切片を適切な希釈度の１次抗体で６０分間ブロッキングおよびインキュベートして、続いて抗ＩｇＧ−Ｃｙ３（γ鎖特異的）および抗ＩｇＭ−ＦＩＴＣ（μ鎖特異的）２次抗体とともにインキュベートし、ＤＡＰＩで対比染色して、顕微鏡分析のためにスライドガラスをグリセロールでマウントした。免疫ペルオキシダーゼ染色のために、上記組織切片を３％Ｈ２Ｏ２で３０分間処理して、内因性ペルオキシダーゼを遮断し、ＰＢＳで３回洗浄して、２％ＢＳＡによってブロッキングした。上記組織切片を上記１次抗体とともにインキュベートして、次にペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗血清（ＤＡＫＯ、コペンハーゲン、デンマーク）で処理した。陰性対照は上記ｍＡｂの代わりにＰＢＳ中２％ＢＳＡを用いて行った。抗ＭＵＣ ｍＡｂ（ＰａｎｋｏＭａｂ）をすべてのバッチの肺癌腫被検物において陽性対照として使用した。ペルオキシダーゼ基質ジアミノベンジジンによって発色させた。ヘマトキシリンによって対比染色を行った。細胞数を１００×倍率にてニコン顕微鏡を用いてカウントした。二重陽性細胞のパーセンテージをデジタル画像上で見積もった。
サンドイッチＥＬＩＳＡ
１００万個の細胞をプロテアーゼインヒビタ（＃５３９１３４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ダルムシュタット、ドイツ）の混合物を含有する１ｍｌの１％トリトン−１００（１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中）で処理して、振動によって４℃にて３０分間ホモジナイズした。遠心分離機で１５，０００ｇにて１０分間の遠心分離の後、上清を取った。９６ウェルのポリスチレンマイクロプレートを、１μｇ／ｍｌの作業濃度の、ＣＤ４４に対する捕捉抗体によって４℃にて１４時間コートした。残存するタンパク質結合部位を５％ＢＳＡによってブロッキングした後、１００μｌの抗体上清をウェルに添加して、室温にて２時間インキュベートした。次に上記プレートをＣＤ１７６ｍＡｂとともに、続いてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（μ鎖特異的）（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、バーミングハム、ＡＬ、米国）によってインキュベートした。呈色反応を、ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）溶液によって室温にて生じさせた。上記反応を２．５Ｍ硫酸によって停止した。陰性対照は上記ｍＡｂｓの代わりにＰＢＳ中２％ＢＳＡで行った。各ウェルの光学密度は、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ハーキュリーズ、ＣＡ、米国）を使用して４９２ｎｍにて３０分以内に決定した。
統計解析
データをカイ２乗検定またはフィッシャーの正確確率検定のどちらかによって分析した。計数データのピアソンの相関分析も行った。Ｐ＜０．０５の値は統計的に有意と見なされた。
２．結果
肺がん、乳がん、および肝臓がん細胞系におけるＣＤ４４およびＣＤ１３３の発現
ＣＤ４４は、大半の上記がん細胞系において、６０％を超える細胞で検出された。１つの細胞系ＨｕＨ−７（ＨＣＣ）は、低いパーセンテージのＣＤ４４陽性細胞を示した。ＣＤ１３３＋細胞は、８０１−Ｄ（巨細胞肺癌腫）およびＨｕＨ−７（ＨＣＣ）を除く本研究で使用した細胞系（上記細胞の１％未満）にて、ごく小さい亜集団を表した。これらの細胞系は常に、ＣＤ１３３を上記細胞のうちの１５％および６％の表面でそれぞれ発現した。
肺がん、乳がん、および肝臓がん細胞系におけるＣＤ１７６の発現
ｍＡｂ ＮＭ−ＴＦ２を用いたフローサイトメトリーおよび免疫細胞化学分析を通じて、本発明者らはＣＤ１７６が上記細胞の表面および細胞質に局在することを見出した。上記細胞系は、ＣＤ１７６をさまざまな強度で発現した：ＭＤＡ２３１、ＭＤＡ４３５（乳腺癌）、およびＨｕＨ−７（ＨＣＣ）は５％から３０％の陽性細胞を含有した；ＳＰＣ−Ａ−１（肺腺癌）、８０１−Ｄ（巨細胞肺癌腫）、およびＨｅｐＧ２（ＨＣＣ）は３０％から６０％の陽性細胞を明らかにした；ＧＬＣ−８２（肺腺癌）、ＮＣＩＨ４４６（小細胞肺癌腫）、およびＭＣＦ−７（乳腺癌）は、６０％超の陽性細胞を有した。
肺がん、乳がん、および肝臓がん細胞系におけるＣＤ１７６、ＣＤ４４、ＣＤ１３３の同時発現
ＣＤ４４およびＣＤ１３３は、がん開始細胞の認められたマーカーであるため（Ｃｈｕら、２００９；Ｂａｏら、２００６；Ｐｏｎｎｕｓａｍｙ ａｎｄ Ｂａｔｒａ ２００８）、本発明者らは一方または両方がＣＤ１７６と同時発現されるかどうかを調べた。細胞系における二重免疫蛍光染色実験は、ＣＤ４４およびＣＤ１７６が細胞表面に局在して、単一細胞または細胞クラスタの同時発現を呈することを実証した（図１．１、ａ−ｉ）。フローサイトメトリー実験は、以下の同時発現データを明らかにした。ＭＣＦ−７（乳腺癌）は約７％のＣＤ４４＋／ＣＤ１７６＋細胞を含有して、ＳＰＣ−Ａ−１、８０１−ＤおよびＨｅｐＧ２は、３０％から６０％のＣＤ４４＋／ＣＤ１７６＋細胞を含有し、ＧＬＣ−８２およびＮＣＩＨ４４６は６０％を超えるＣＤ４４＋／ＣＤ１７６＋細胞を有した（表１．１、図１．１、１．２を参照）。
【０１４９】
【表１．１】
対照的に、大半の細胞系は、ごく少数の、ＣＤ１３３＋／ＣＤ１７６＋表現型を持つ細胞（１％未満）を含有していた。例外として、８０１−ＤおよびＨｕＨ−７は、５％超の、ＣＤ１３３＋／ＣＤ１７６＋表現型を持つ細胞を有していた（表１．２）。
【０１５０】
【表１．２】
ＣＤ４４およびＣＤ１７６発現が外因性（ｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓ）処理によって同時に影響されたかどうかを評価するために、エストロゲン受容体リガンドのタモキシフェン（４−ＯＨＴ）を乳がん細胞に添加した（２４時間、２０ｎＭ）。本発明者らの結果は、フローサイトメトリーによって示されるように、ＭＤＡ２３１およびＭＣＦ−７ではＣＤ４４＋／ＣＤ１７６＋同時発現細胞の数の有意な増加がなかったのに対して、ＭＤＡ４３５では、ＣＤ４４＋／ＣＤ１７６＋細胞のパーセンテージが処理後に増加したことを示した（図１．２Ｂ）。
肺癌腫組織におけるＣＤ１７６の発現
本研究において、ｍＡｂ ＮＭ−ＴＦ２を採用して肺癌腫組織におけるＣＤ１７６の発現を調査した。２１名の患者から調べた組織は、１３名の腺癌および８名の扁平上皮細胞癌腫を含んでいた。ＣＤ１７６は細胞表面および細胞質中に分布していた。例を図１．１のｊとｋに示す。肺癌腫におけるＣＤ１７６−陽性細胞のパーセンテージを表３に示す。肺癌腫の４症例が５０％超の陽性細胞を明らかにした。これらのデータは、同時発現実験の前提である以前の論文（Ｔｏｍａら、１９９９）とは対照的に、肺がん組織におけるＣＤ１７６の発現を確認している。ＣＤ１７６発現は、統計解析を使って臨床病理学的特徴と比較された。＞５％の陽性細胞を示す症例は、陽性と定義された。その結果は、ＣＤ１７６の状態（ｓｔａｔｕｓ）と腫瘍悪性度ならびに肺癌腫を持つ患者における転移との間の相関を示す（Ｐ＜０．０５）。しかし、ＣＤ１７６の発現と患者の年齢、性別、または組織学的サブタイプ（腺癌または扁平上皮細胞癌腫）を含む他の臨床病理学的特徴との間に統計的に有意な相関はなかった。
肺癌腫組織、乳癌腫組織、および肝細胞癌腫組織におけるＣＤ１７６とＣＤ４４またはＣＤ１３３との同時発現
問題の組織におけるＣＤ４４、ＣＤ１３３およびＣＤ１７６発現についての免疫組織化学データを表１．３に示す。上記がん細胞系と同様に、ＣＤ４４はすべての癌腫において、高い（６０％を超える）パーセンテージで強くおよび散在して発現された。ＣＤ１３３＋細胞は、所与の癌腫組織のうちで細胞の亜集団（全がん細胞の１０％未満）のみを除いて、大半の症例で見出された。肺癌腫の２症例、乳癌腫の３症例およびＨＣＣの１症例はＣＤ１３３を全く発現しなかった。ＣＤ１３３＋細胞は、散乱パターンまたはクラスタ化された形態で存在した。ＣＤ１３３発現は肺癌腫において、性別、年齢または組織学的サブタイプとのいずれの統計的に有意な相関も示さなかった。
【０１５１】
【表１．３】
上記新たな臨床検体におけるＣＤ１７６とＣＤ４４またはＣＤ１３３の同時発現を調べた。上記がん性組織における二重染色結果は、５〜３０％のＣＤ４４＋細胞がＣＤ１７６を同時に発現して（表１．４を参照）、ＣＤ１３３＋細胞の大半もＣＤ１７６を発現することを示した。しかし本発明者らは、上記マーカーのうちの１つについて陽性の各細胞において、ＣＤ１７６とＣＤ４４またはＣＤ１３３の同時発現が見られないことにも注目した。いくつかのＣＤ４４＋細胞およびＣＤ１３３＋細胞はＣＤ１７６を発現せず、逆の場合も同様であった。上記ＨＣＣは、肺癌腫または乳癌腫のどちらよりも、ＣＤ１３３＋ＣＤ１７６＋表現型を持つ細胞を著しく多く有していた。肺癌腫におけるＣＤ１７６の状態（ｓｔａｔｕｓ）とＣＤ１３３の状態（ｓｔａｔｕｓ）との間に統計的に有意な相関があった（Ｐ＜０．０５）。臨床病理学的特徴と上記ＣＤ４４＋ＣＤ１７６＋表現型との間の相関は本研究では見られなかった。
【０１５２】
【表１．４】
ＣＤ１７６を担持するＣＤ４４の検出
複数の癌腫細胞系において、ＣＤ１７６の潜在的糖タンパク質キャリア分子をサンドイッチＥＬＩＳＡによって分析した。本発明者らは捕捉抗体としてのＣＤ４４でコートしたポリスチレンマイクロプレートを使用して、ＣＤ４４糖タンパク質を細胞全体の溶解物から収集した。上記プレートを次に検出抗体としてのＮＭ−ＴＦ２（ＣＤ１７６）とともにインキュベートした。表１．５に示すように、捕捉されたＣＤ４４は、すべての（４）肺および（２）肝臓がん細胞系ならびに３つの乳がん細胞系のうちの２つにおいてＣＤ１７６ｍＡｂと反応することが見出され、これらの症例において、ＣＤ４４が明白にＣＤ１７６のキャリアであることが示された。
【０１５３】
【表１．５】
【０１５４】
【表１．６】
３．考察
多数の刊行物によって、すべてではないにしても大半の腫瘍種の開始、維持、および分散が、がん開始細胞またはがん幹細胞と呼ばれる細胞の小集団に本質的に起因するという見解が一般に受け入れられるようになった（Ｃｈｕら、２００９；Ｂａｏら、２００６）。
【０１５５】
がん幹細胞は、活発に増殖する腫瘍細胞に分化する性向を呈する。それらは腫瘍塊の細胞の大部分とは明確に異なるが、それらはがん療法において（同時）ターゲティングされるべきである。非常に多くの、多かれ少なかれ特異的ながん開始細胞のマーカーが、近年記載されている。これらのマーカーの重要点は、それらが多すぎること、およびそれらが十分に一貫したものでないことである。上記マーカーの中で最も広く受け入れられているのは、ＣＤ４４である（Ｐｏｎｎｕｓａｍｙ ａｎｄ Ｂａｔｒａ ２００８；Ｓｈｉｐｉｔｓｉｎら、２００７）。別の膜糖タンパク質のＣＤ１３３も、脳、結腸、肺、および他の固形腫瘍におけるがん開始集団を同定可能であることが提案されている（Ｔｉｒｉｎｏら、２００８）。ＣＤ１３３は、患者における全体的な低い生存を悪性腫瘍と相関させる独立した予後判定マーカーである（Ｈｏｒｓｔら、２００８）。しかし近年の報告は、ＣＤ１３３陰性細胞もＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて長期腫瘍形成が可能であることを示した（Ｓｈｍｅｌｋｏｖら、２００８）。
【０１５６】
本発明の基礎をなす本研究において、ＣＤ４４およびＣＤ１３３の発現が細胞系ならびに肺がん、乳がん、および肝臓がんからの臨床検体において評価された。腫瘍細胞の大多数が、ＣＤ４４に対して陽性に染色されることが見出された。対照的に、研究したがん細胞系の大半では、低いＣＤ１３３発現が明らかになった。ＣＤ１３３は肺がん、乳がんおよび肝臓がん組織において、染色後にさまざまな強度にて常に発現された。他の著者らは、ＣＤ１３３が結腸がん（Ｒｉｃｃｉ−Ｖｉｔｉａｎｉら、２００７）、ならびに非小細胞肺がん（Ｔｉｒｉｎｏら、２００９）および脳腫瘍（Ｓｉｎｇｈら、２００４）においてそれぞれ、腫瘍細胞の総数の約２．５％および６〜２９％で発現されたことを報告している。
【０１５７】
次に、がん開始細胞のこれら２つのマーカーであるＣＤ４４およびＣＤ１３３と、ＣＤ１７６との同時発現が分析された。とりわけ肺癌腫細胞系およびＨｅｐＧ−２において、高いパーセンテージの細胞が、ならびに他のすべての調べた細胞系においてかなりの数が、ＣＤ１７６およびＣＤ４４を同時発現するとして見出された。調べた肺がん組織、乳がん組織および肝臓がん組織において、ＣＤ１７６およびＣＤ４４を同時発現する細胞の数は５〜３０％に達した。ＣＤ１７６およびＣＤ１３３を同時発現する細胞の数は、すべての症例ではるかに少なかったが（ＣＤ１３３発現細胞の総数と同様に）、同時発現細胞は完全に存在しないわけではなかった。
【０１５８】
ここに紹介するデータは、ＣＤ１７６が成熟がん細胞だけではなく、固形腫瘍のがん開始細胞でも発現されることを実証する。このことは魅力的な治療標的としてのＣＤ１７６に追加の重みを添加する。ＣＤ１７６＋乳がん細胞の数がタモキシフェン（４−ＯＨＴ）による処理後に向上するかどうかも分析された。タモキシフェンは、Ｇ０／Ｇ１成長停止を誘起して、乳がん細胞の増殖を抑制することが報告された。近年の研究は、タモキシフェン処置が乳房がん幹細胞様細胞の数を増加したことを示した（Ｍａｎｉら、２００８）。本発明者らの研究において、乳がん細胞のタモキシフェン処理は、３つの細胞系のうち１つ（ＭＤＡ−４３５）においてＣＤ４４＋／ＣＤ１７６＋表現型を向上させた。がん幹細胞の理論によると、がんの再発および転移はがん開始細胞に依存する。上記腫瘍塊とは異なる特性を持つこのような細胞の集団の現存は、従来の療法、たとえばタモキシフェンによる処置ががんを抑止するが、がんを完全に根絶できないことが多い理由を説明し得る。反対に、この処置はがん開始細胞の数を向上さえし得る（Ｍａｎｉら、２００８）。理論的に、がん開始細胞の排除は、腫瘍の再燃を防止することが可能である。標的がん開始細胞に対する新たな治療手法の開発はゆえに、がん療法に対して深い影響力を有し得る。そのため、固形腫瘍のがん開始細胞でのＣＤ１７６の同定は、ＣＤ１７６ベース免疫療法の今後の利用にとって重要である。
【０１５９】
ＣＤ１７６のデマスキングは、細胞膜に存在するすべての可能性のある候補糖タンパク質のうち少数のみを伴う選択的プロセスであるようである。上皮細胞においてこれまでに同定されたＣＤ１７６の最も突出したキャリア分子は、たとえば結腸直腸癌腫における多型上皮ムチンＭＵＣ−１である（Ｂａｒｒら、１９８９；Ｃａｏら、１９９７；Ｂａｌｄｕｓら、１９９８）。ここでＣＤ４４が、分析された細胞におけるｃｏｒｅ−１のキャリア分子であるかどうかが決定された。この目的のために、本発明者らは特殊なサンドイッチＥＬＩＳＡを適用して、それを用いて肺がん、乳がんおよび肝臓がんを調べた。本発明者らのデータは、結腸直腸癌腫以外の腫瘍において、ＣＤ１７６がＣＤ４４によって顕著に担持されていたことを示唆している。ＣＤ１７６抗原は、肺患者における予後判定の有用なマーカーであることが見出されたが（Ｔａｋａｎａｍｉ １９９６）、この組織におけるそれの発現について矛盾する報告が残っている（Ｔｏｍａら、１９９９）。本発明者らの研究において、本発明者らは、十分に特徴付けられていて、免疫組織化学および他の技法に適しているモノクローナル抗体ＮＭ−ＴＦ２を採用することによって、本課題を再度調べた。高度のＣＤ１７６発現が大半の肺がん細胞系で観察された。臨床肺がん検体において、本発明者らは、５０％を超える症例がカットオフ値（５％陽性細胞）を超えるＣＤ１７６＋であることも見出した。
【０１６０】
要するに、ＣＤ１７６（トムゼン−フリーデンライヒ抗原、ｃｏｒｅ−１）発現は、ヒト肺癌腫、乳癌腫および肝臓癌腫ならびにこれらの悪性腫瘍に由来する細胞系で見出された。ヒト肺癌腫、乳癌腫および肝臓癌腫におけるＣＤ４４およびＣＤ１７６の、ならびにＣＤ１３３およびＣＤ１７６の同時発現は、ＣＤ１７６が成熟がん細胞で発現されるだけでなく、がん開始細胞でも発現されることを実証した。このことにより、正常および良性成人ヒト組織ではほぼ存在しない（Ｃａｏら、１９９６）ＣＤ１７６が、腫瘍療法のためのなおさらに有望な標的となる。
【０１６１】
ＩＩ．乳がん開始細胞でのＣＤ１７３（Ｈ２）およびＣＤ１７４（ルイスＹ）とＣＤ４４との同時発現
１．材料および方法
細胞系および細胞培養
本研究では、乳腺癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、およびＭＣＦ−７を使用した。これらの細胞系を、１０％ウシ胎仔血清を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で通常どおりに培養した。上記細胞を３７℃にて、５％ＣＯ２／９５％空気の、１００％相対湿度に近い雰囲気中で成長させた。
免疫細胞化学
上記細胞を培養培地中のポリリシン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ、米国）コートスライド上に一晩蒔いた。その後、上記培地を慎重に吸引して、上記スライドを空気乾燥させた。包んだスライドを−８０℃にて使用するまで貯蔵することができた。免疫細胞化学では、細胞を冷（−２０℃）アセトンで１５分間固定して、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３０分間ブロッキングし、ＣＤ４４ ｍＡｂ（Ｇ４４−２６、マウスＩｇＧ２ｂ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、フランクリンレイクス、ＮＪ、米国）とともに、どちらもＧｌｙｃｏｔｏｐｅ ＧｍｂＨ（ベルリン、ドイツ）からのｍＡｂ ＣＤ１７３（Ａ４６−Ｂ／Ｂ１０、マウスＩｇＭ、Ｋａｒｓｔｅｎ １９８８）またはＣＤ１７４（Ａ７０−Ｃ／Ｃ８、マウスＩｇＭ）と一緒に６０分間インキュベートした。加えて上記ＣＤ１３３抗体（ＡＮＣ９Ｃ５，Ａｎｃｅｌｌ、ベイポート、ＭＮ、米国）を使用した。上記スライドを続いて、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合体化抗マウスＩｇＭ（μ鎖特異的）（Ｆ９２５９，Ｓｉｇｍａ）およびＣｙ３結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異的）（＃６９７３２，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ウェストグローブ、ＰＡ、米国）の混合物とともにインキュベートした。対比染色を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ）（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉａｎｇｓｕ、中国）を用いて行った。陰性対照は、特異的ｍＡｂの代わりにマウス血清とともにインキュベートした。上記スライドをグリセロールでマウントし、蛍光顕微鏡法によって分析した。
フローサイトメトリー分析
確立された細胞系からの細胞懸濁物を１×１０６細胞／１００μｌの密度で調製した。これらを２％ＢＳＡを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１次抗体とともに４℃にて２０分間、続いて適切な濃度の抗ＩｇＧ−Ｃｙ３（γ鎖特異的）および抗ＩｇＭ−ＦＩＴＣ（μ鎖特異的）によって４℃にて２０分間インキュベートした。フローサイトメトリーをＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、フランクリンレイクス、ＮＪ、米国）で行った。１０，０００細胞から収集したデータおよびＷｉｎＭＤＩソフトウェアをＦＡＣＳデータファイルの分析に使用した。
【０１６２】
４−ヒドロキシタモキシフェン処理のために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＣＦ−７乳腺癌細胞系を２０ｎＭの最終濃度の４−ＯＨＴ（＃Ｈ６２７８，Ｓｉｇｍａ）に２４時間曝露した。次にフローサイトメトリー分析を上に記載したように行った。
免疫沈降
１００万個の細胞をプロテアーゼインヒビタ（＃５３９１３４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ダルムシュタット、ドイツ）の混合物を含有する、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中の１％トリトン１００ １ｍｌで処理して、振動によって４℃にて３０分間ホモジナイズした。１５，０００ｇにて１０分間の遠心分離の後、上清を取った。プロテインＧアガロースビーズ（＃Ｐ−４６９１，Ｓｉｇｍａ）を事前に浄化して非特異的結合物質を除去し、次に振とう機上で抗ＣＤ４４抗体と共に４℃にて４時間インキュベートした。上記プロテインＧアガロースビーズを上清に添加して、転倒型ミキサーで４℃にて一晩インキュベートした。上記ビーズを遠心分離によって収集して、洗浄した。そのペレットをＳＤＳ−ポリアクリルアミド（ｐｏｌｙｃａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）検体緩衝液に再懸濁させて、５分間煮沸させた。免疫沈降物を続いてポリアクリルアミドゲル（８％）上で分離して、ウェスタンブロッティングで抗ＣＤ１７３および抗ＣＤ１７４抗体を使用してプローブした。
サンドイッチＥＬＩＳＡ
９６ウェルのポリスチレンマイクロプレートを、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの、ＣＤ４４に対する捕捉抗体を用いて４℃にて１４時間コートした。５％ＢＳＡによってブロッキングした後、上に記載したように調製した上清１００μｌをウェルに添加して、室温にて２時間インキュベートした。次にプレートをＣＤ１７３またはＣＤ１７４ｍＡｂとともに、続いてペルオキシダーゼ−標識ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（μ鎖特異的）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、バーミングハム、ＡＬ、米国）によってインキュベートした。呈色反応を、ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）溶液を用いて室温にて生じさせた。上記反応を２．５Ｍ硫酸によって停止した。陰性対照は上記ｍＡｂの代わりに２％ＢＳＡを用いて行った。各ウェルの光学密度は、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ハーキュリーズ、ＣＡ、米国）を使用して４９２ｎｍにて３０分以内に決定した。
組織および免疫組織化学
１５症例の乳癌腫被検物を最初の手術を受けた患者から取得した。上記検体は、患者の機密保護のため完全にコード化され、本研究および研究プロトコルはすべての参加施設の地域研究倫理委員会によって承認された。
【０１６３】
その新たな組織をプラスチック型内のＯＣＴ化合物で−２０℃にて（最適切断温度）慎重に包埋して、クリオスタットチャンバ内での平衡後に４〜８μｍ切片に切断し、冷（−２０°）アセトンによって１５分間固定した。次に免疫蛍光二重染色を上に記載したように行った。細胞数を１００×倍率にてニコン顕微鏡を用いてカウントした。二重陽性細胞のパーセンテージをデジタル画像上で見積もった。
【０１６４】
追加の３症例の乳房腺管内癌腫（ｂｒｅａｓｔ ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）において、本発明者らは免疫ペルオキシダーゼ染色も行った。組織切片を３％Ｈ２Ｏ２によって３０分間処理して、内因性ペルオキシダーゼを抑止し、ＰＢＳで３回洗浄し、２％ＢＳＡによってブロッキングした。その組織切片をＣＤ１７３抗体でインキュベートして、次にペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗血清（ＤＡＫＯ、コペンハーゲン、デンマーク）で処理した。陰性対照は上記ＣＤ１７３抗体の代わりに２％ＢＳＡを用いて行った。ジアミノベンジジンによって発色させた。ヘマトキシリンによって対比染色を行った。
統計解析
統計解析は、対応のないｔ検定、フィッシャーの正確確率検定、またはスペアマン相関検定を使用して行った。データは平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表された。Ｐ＜０．０５は統計的に有意と見なされた。
２．結果
乳がん細胞系でのＣＤ１７３およびＣＤ１７４の発現
フローサイトメトリー分析および免疫組織学的染色は、ＣＤ１７３およびＣＤ１７４が細胞表面に局在することを明らかにした（図２．１ａ）。上記乳がん細胞系（ｂｒｅａｓｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）は、頻繁なＣＤ１７３およびＣＤ１７４発現を示した：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＣＦ−７は、約２７％、９２％および８０％のＣＤ１７３陽性細胞、ならびに約４４％、５７％および７２％のＣＤ１７４陽性細胞をそれぞれ含有していた。
乳がん細胞系でのＣＤ４４とＣＤ１７３またはＣＤ１７４との同時発現
免疫細胞学的染色実験は、乳がん細胞でのＣＤ１７３またはＣＤ１７４とＣＤ４４との同時発現を調査するために行った。本発明者らは多くの細胞において、ＣＤ４４染色とＣＤ１７３およびＣＤ１７４とのオーバーレイを観察した；例を図１ａ−ｃに与える。フローサイトメトリー実験からの半定量的データを図２．２Ａに示し、表２．１にまとめる。
【０１６５】
【表２．１】
ＣＤ４４、ＣＤ１７３およびＣＤ１７４発現が外因性（ｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓ）処理後に同時に影響されたかどうかを評価するために、本発明者らは乳がん培養細胞を４−ＯＨＴによって処理した。半定量的フローサイトメトリー分析において、４−ＯＨＴ処理はＭＤＡ２３１におけるＣＤ４４＋ＣＤ１７３＋およびＣＤ４４＋ＣＤ１７４＋細胞のパーセンテージを増加させたが（Ｐ＜０．０５）（図２．２Ｂ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＣＦ−７細胞では増加させなかった（Ｐ＞０．０５、データは示さず）。
乳癌腫組織におけるＣＤ４４またはＣＤ１３３とＣＤ１７３またはＣＤ１７４との同時発現
調べた１５の乳癌腫組織のうち、ＣＤ４４、ＣＤ１７３およびＣＤ１７４染色も主として細胞膜にて観察された。ＣＤ４４、ＣＤ１７３およびＣＤ１７４陽性細胞は、散乱パターンまたはクラスタ化パターンで存在し、そのパターンは個人間で変わった。ＣＤ１７３およびＣＤ１７４陽性細胞は、大半の症例で見出された。ＣＤ１７３およびＣＤ１７４陽性細胞の平均パーセンテージは、全がん細胞のそれぞれ５１％および５２％であった。ＣＤ４４はすべての症例で、強い免疫反応性を示した（陽性染色癌腫細胞は５３％に達した）。興味深いことに、増加したＣＤ１７３およびＣＤ１７４発現を持つ症例は、上昇したＣＤ４４発現と相関していた（Ｐ＜０．０５）。最も重要なことに、９５％を超えるＣＤ１７３およびＣＤ１７４陽性細胞はそれぞれＣＤ４４抗原を同時発現した（図２．１、ｄ〜ｉ）。
【０１６６】
ＣＤ１３３もがん開始細胞のマーカーである。ゆえに本発明者らはＣＤ１７３またはＣＤ１７４がこのマーカーと共に乳癌腫組織において同時発現されるかどうかを問うた。本発明者らはＣＤ１３３が、実際、より低いパーセンテージであるが、ＣＤ１７３およびＣＤ１７４と同時発現されたことを見出した（図２．１ｊ−ｌ）。加えて、発明者らは、増加したＣＤ１７３およびＣＤ１７４発現を持つ症例が、上昇したＣＤ１３３発現と相関することを見出した（Ｐ＜０．０５）（データを示さず）。
乳房腺管内癌腫（ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）の基底細胞でのＣＤ１７３の発現
３症例の乳房腺管内癌腫において、ＣＤ１７３ｍＡｂは残存する管壁の基底細胞を染色した（図２．３）。同じ切片の移行組織の正常な管において、周囲管（主に基底）細胞層は、ＣＤ１７３に対して時折陽性であるのみであった。これらの細胞におけるＣＤ１７３の発現は、個人のＡＢＨ血液型タイプおよび分泌型の状態（ｓｔａｔｕｓ）から独立していた（データを示さず）。
ＣＤ１７３またはＣＤ１７４を担持するＣＤ４４についての証拠
ＣＤ１７３またはＣＤ１７４を担持する潜在的糖タンパク質は、３つの乳癌腫細胞系において免疫沈降によりおよびサンドイッチＥＬＩＳＡで分析された。３つの細胞系の溶解物からのＣＤ４４免疫沈降物は、ｍＡｂ ＣＤ１７３およびＣＤ１７４を使用する免疫ブロット分析を施された。どちらの抗体もＣＤ４４バンドを染色した（図２．４）。
【０１６７】
捕捉抗体としての抗ＣＤ４４を用い、続いてどちらの抗体も調べた３つの細胞系すべてで陽性を記録した、ｍＡｂ ＣＤ１７３およびＣＤ１７４によるサンドイッチＥＬＩＳＡは、ＣＤ１７３およびＣＤ１７４エピトープがＣＤ４４分子で発現されていることを示した（表２．２）。
【０１６８】
【表２．２】
３．考察
がん開始細胞の現存は、脳がん、肺がんおよび乳がんにおいて十分に文書記録されている（Ｔｉｒｉｎｏ，２００８）。それらは多系統分化できる、自己再生する、静止したおよび多分化能の細胞として機能的に定義されている。がん幹細胞の理論によると、がんの再発および転移はがん開始細胞に依存する（Ｇｉｌｂｅｒｔ，２００９）。がん開始細胞またはがん幹細胞は、上記腫瘍塊の細胞の大部分とは明確に異なるので、がん開始細胞での表面分子の発現および機能を研究することは、腫瘍生物学の重要な側面である。
【０１６９】
本研究で本発明者らは、乳癌腫においてＣＤ１７３および／またはＣＤ１７４ががん開始細胞マーカーＣＤ４４と共に同時発現されるかどうかを調べた。
【０１７０】
本研究は、ＣＤ４４が、ＣＤ１７３またはＣＤ１７４と共に細胞表面に位置して、培養された乳がん細胞のかなりの部分および乳がんから取った組織被検物において同時発現を呈することを示すものである。タモキシフェンが乳房がん幹細胞の数を増加させることが報告された（Ｍａｎｉ，２００８）。本研究において、ＣＤ４４＋／ＣＤ１７３＋またはＣＤ４４＋／ＣＤ１７４＋乳がん細胞の数は、タモキシフェン（４−ＯＨＴ）処理後に培養された細胞において向上させること可能であった。ゆえに本発明者らは、乳がんにおいてＣＤ４４がＣＤ１７３およびＣＤ１７４と同時発現されると結論付ける。
【０１７１】
興味深い観察は、乳房腺管内癌腫の症例において残存する管壁細胞のＣＤ１７３に対する強い染色であった。これは、拡張する腫瘍塊の機械的ストレス下での幹細胞様基底細胞の増殖活性を示す。Ｈ抗原およびＬｅＹ抗原は発生制御抗原であるため、この現象はこれらの細胞の進行中の上皮間葉移行（ＥＭＴ）も示す場合もある。
【０１７２】
２型ベースのＡＢＨオリゴ糖は、複数の異なる糖タンパク質および糖脂質に担持されている（Ｈａｋｏｍｏｒｉ，１９８１）。上皮性卵巣がんにおいて、ＣＤ１７４の主なキャリアタンパク質はＣＡ１２５およびＭＵＣ１である（Ｙｉｎ，１９９６）。ＣＤ３４＋造血幹細胞において、ＣＤ１７３およびＣＤ１７４の主なキャリアは１７０ｋＤａ糖タンパク質である（Ｃａｏ，２００１）。ＣＤ４４はＨ抗原のキャリアでもある（Ｒａｐｏｐｏｒｔ，１９９９）。ここで本発明者らはサンドイッチＥＬＩＳＡおよび免疫沈降を使用して、ＣＤ４４が乳がん細胞においてＣＤ１７３およびＣＤ１７４の主なキャリアであることを実証している。
【０１７３】
癌腫によって発現された糖タンパク質でのＣＤ１７３およびＣＤ１７４構造は、接着、細胞凝集、浸潤、および転移に寄与すると考えられる。ＣＤ１７４は、腫瘍関連新脈管形成の間の早期細胞間接触に関与する（Ｍｏｅｈｌｅｒ，２００８）。組織化学単独では、がん開始細胞でのＣＤ１７３およびＣＤ１７４の発現の機能および重要性が何であるかを決めることはできない。しかし、癌腫におけるＣＤ１７３およびＣＤ１７４発現の病態生理学的重要性が実証されている。ＣＤ１７３およびＣＤ１７４は、がん患者における悪性度の明らかなマーカーである（Ｆｕｊｉｔａｎｉ，２００１；Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋａ−Ｍａｚｕｒ，２０００）。ＣＤ１７３およびＣＤ１７４のより高い発現は、より良好な予後を持つ患者と比較して、高グレードおよび不良な予後を持つ患者でより多く見出された（Ｂａｌｄｕｓ，２００６）。リンパ節陰性乳癌腫において、ＣＤ１７４の過剰発現は、低下した患者生存と有意に関連していた（Ｍａｄｊｄ，２００５）。α１−２フコシル化を媒介する、増加した腫瘍原性は、増加したアポトーシスに対する耐性および免疫調節からの回避と関連している（Ｇｏｕｐｉｌｌｅ，２０００）。
【０１７４】
現在のがん療法の失敗は、潜在的に静止性のがん幹細胞に対する薬物の無効力に帰するとされ得る。処置戦略はゆえに、がん幹細胞の存在を考慮する必要がある。乳癌腫におけるがん幹細胞の表面でのＣＤ１７３の、およびとりわけＣＤ１７４の高い発現は、これらの抗原が、抗体が媒介する診断および療法の有望な標的であることを示唆する。より最近の研究は、低用量の抗ＣＤ１７４ ｍＡｂの投与が、ＴＮＦ−α放出の誘起なしでも有効な抗腫瘍応答をもたらし得ることを実証し（Ｄｅｔｔｋｅ，２０００）、およびドキソルビシンと結合体化された抗ＣＤ１７４抗体が現在、上皮腫瘍の療法において評価されている（Ｔｏｌｃｈｅｒ，１９９９）。
【０１７５】
要するに、がん幹細胞でのＣＤ１７３およびＣＤ１７４の同定は、特に再発の防止において、標的がん開始細胞をターゲティングする療法における新たな機会をもたらす。
【０１７６】
ＩＩＩ．抗ＣＤ１７６抗体の治療活性
以下の例は、以下の相補性決定領域のセットを有するＩｇＭ型またはＩｇＧ１型のモノクローナル抗ＣＤ１７６抗体を使用して行った：
【０１７７】
【表３】
１．細胞増殖の抑制
腫瘍関連炭水化物抗原ＣＤ１７６を発現するがん細胞の細胞増殖を抑制する抗ＣＤ１７６抗体の性能を実証するために、抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体がＣＤ１７６陽性がん細胞系の増殖細胞に添加された。がん細胞増殖の抑制は、ブロモデオキシウリジン細胞増殖ＥＬＩＳＡを使用して測定された。簡潔には、ＣＤ１７６陽性骨髄性白血病細胞系ＮＭ−Ｄ４の細胞（ＷＯ ０５／０１７１３０に記載）を、５％ＦＣＳおよび１％グルタミンを補ったＲＰＭＩを含む９６ウェルプレートに播種した（２，０００細胞／ウェル）。細胞を抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体（Ｊ鎖を持つまたは持たない）または無関係なアイソタイプ対照（ＣｈｒｏｍＰｕｒｅ ｈＩｇＭ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって処理した。架橋２次抗体Ｆａｂ２ヤギ抗ヒトＩｇＭ（Ｆｃ５μ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を最終濃度１０μｇ／ｍｌまで添加した。無処理対照細胞と比較したパーセント増殖は、培養の５日後にＢｒｄＵ細胞増殖ＥＬＩＳＡ（Ｒｏｃｈｅ）によって測定した。
【０１７８】
結果として、上記アッセイは、抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体によるＣＤ１７６陽性がん細胞の増殖の濃度依存性抑制を示した（図４）。抗ＣＤ１７６ ＩｇＧ抗体を使用して同様の結果が取得された。
２．細胞アポトーシスの誘起
アネキシンＶアッセイを使用して、ＣＤ１７６を発現するがん細胞においてアポトーシスを誘起する抗ＣＤ１７６抗体の能力を試験した。急性骨髄性白血病細胞系ＫＧ−１のＣＤ１７６陽性およびＣＤ１７６陰性（対照）亜系統を、１％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩを含む９６ウェルプレート（１．５×１０５細胞／ウェル）に播種した。抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体（Ｊ鎖を持つまたは持たない）または無関係なアイソタイプ対照（ＣｈｒｏｍＰｕｒｅ ｈＩｇＭ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を最終濃度１０μｇ／ｍｌまで添加した。２４時間後、アポトーシスの早期マーカーとしてホスファチジルセリン露出を分析した。細胞をアネキシンＶ−ＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＳｙｔｏｘグリーン（標識死細胞）によって１５分間染色して、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１７９】
結果として、上記実験は抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体によるアポトーシスのＣＤ１７６特異的誘起を実証した（図５）。抗ＣＤ１７６ ＩｇＧ抗体を使用して同様の結果を取得した。
３．がん細胞に対するＣＤＣの誘起
ＣＤ１７６を発現するがん細胞の溶解を生じる補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘起する抗ＣＤ１７６抗体の性能を、以下のＣＤＣアッセイによって実証した。急性骨髄性白血病細胞系ＫＧ−１（ＣＤ１７６陽性）の細胞に電気穿孔によりユウロピウムを負荷し、その細胞を、異なる濃度の抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体（Ｊ鎖を持つまたは持たない）または無関係なアイソタイプ対照（ＣｈｒｏｍＰｕｒｅ ｈＩｇＭ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）とともに９６ウェルプレート中でインキュベートした。幼齢ウサギ補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を最終濃度０．８％で添加した。４時間後、２５μｌの上清を２００μｌの増強溶液（Ｄｅｌｆｉａ）中に移して、蛍光プレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００（Ｔｅｃａｎ）を使用してユウロピウム放出を定量化した。最大放出（トリトンＸ−１００による標的細胞）、自発放出（標的細胞）および基底放出（標的細胞の上清）は、特異的細胞傷害を計算するための対照として機能した。
【０１８０】
結果として、上記ＣＤＣアッセイは、濃度依存性ＣＤＣが抗ＣＤ１７６ ＩｇＭ抗体によって誘起されることを実証した（図６）。
４．がん細胞に対するＡＤＣＣの誘起
ＣＤ１７６を発現するがん細胞の溶解を生じる抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘起する抗ＣＤ１７６抗体の性能を、以下のＡＤＣＣアッセイによって実証した。膵臓癌腫細胞系ＰＡＮＣ−１の細胞に電気穿孔によりユウロピウムを負荷し、その細胞を、異なる濃度の抗ＣＤ１７６ ＩｇＧ１抗体または無関係なアイソタイプ対照（ｈＩｇＧ１，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに９６ウェルプレート中でインキュベートした。初代ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を１００：１のエフェクタ対標的細胞比で添加した。６時間後、２５μｌの上清を２００μｌの増強溶液（Ｄｅｌｆｉａ）中に移して、蛍光プレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００（Ｔｅｃａｎ）を使用してユウロピウム放出を定量化した。最大放出（トリトンＸ−１００による標的細胞）、自発放出（標的細胞）および基底放出（標的細胞の上清）は、特異的細胞傷害を計算するための対照として機能した。
【０１８１】
結果として、ＡＤＤＣアッセイは、濃度依存性ＡＤＣＣが抗ＣＤ１７６ ＩｇＧ１抗体によって誘起されることを実証した（図７）。
５．概要
上の実験は、ＣＤ１７６に対する抗体が上記腫瘍関連炭水化物抗原ＣＤ１７６を発現する細胞において、細胞増殖を抑制すること、アポトーシスを誘起すること、ならびにＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣを誘起することが可能であることを実証した。そのため抗ＣＤ１７６抗体は、ＣＤ１７６を発現するがん幹細胞に対して強力な治療剤であることが示された。
【図１−１】
【図１−２Ａ】
【図１−２Ｂ】
【図２−１】
【図２−２Ａ】
【図２−２Ｂ】
【図２−３】
【図２−４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞の処置で使用するための、該腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤。
【請求項２】
請求項１に記載の結合剤であって、ここで、前記腫瘍関連炭水化物抗原がＣＤ１７６、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７４、ＣＤ１７３、およびＣＡ１９−９から成る群より選択される結合剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載の結合剤であって、ここで、前記がん幹細胞が１個以上の以下の特徴：
ａ）該がん幹細胞が前記腫瘍関連炭水化物抗原を担持する糖タンパク質である、少なくとも１つの幹細胞マーカーを発現すること；
ｂ）該がん幹細胞がＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１３３およびＣＤ１６４から成る群より選択される１個以上の幹細胞マーカーを発現すること；
ｃ）該腫瘍関連炭水化物抗原が該がん幹細胞によって発現された腫瘍関連糖タンパク質に担持されていること；
ｄ）該腫瘍関連炭水化物抗原が腫瘍特異的であること；および／または
ｅ）該腫瘍関連炭水化物抗原ががん幹細胞で主としてまたは独占的に発現されるが、がん幹細胞ではないがん細胞では発現されないこと；
を有する結合剤。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の結合剤であって、ここで、前記がん幹細胞が１つ以上の以下の特徴：
ａ）がんが固形腫瘍であること；
ｂ）がんが白血病であること；
ｃ）がんが多発性骨髄腫もしくはリンパ腫であること；
ｄ）がんが上皮起源の腫瘍であること；ならびに／または
ｅ）がんが肺がん、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、消化器がん、膵臓がん、前立腺がん、子宮頸がんおよび頭頸部がんから成る群より選択される腫瘍であること；
を有する該がんのがん幹細胞である結合剤。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載の結合剤であって、ここで、該結合剤が１つ以上の以下の特徴：
ａ）該結合剤が抗体または抗体の抗原結合フラグメントもしくは誘導体であること；
ｂ）該結合剤がヒト抗体、マウス抗体、ヒト化抗体、もしくはキメラ抗体またはそれぞれの抗原結合フラグメントもしくは誘導体であること；
ｃ）該結合剤が単鎖抗体フラグメント、マルチボディ、Ｆａｂフラグメント、および／またはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤアイソタイプの免疫グロブリンおよび／もしくはそのサブクラスであること；
ｄ）該結合剤が抗体または抗体の抗原結合フラグメントもしくは誘導体であって、１つ以上の以下の特徴：
ｉ．それががん細胞のＡＤＣＣおよび／もしくはＣＤＣを媒介すること；
ｉｉ．それががん細胞のアポトーシスを誘起および／もしくは促進すること；
ｉｉｉ．それががん細胞の標的細胞の増殖を抑制すること；
ｉｖ．それががん細胞の食作用を誘起および／もしくは促進すること；ならびに／または
ｖ．それが細胞傷害剤の放出を誘起および／または促進する；
を有すること；
ｅ）該結合剤が、腫瘍特異的炭水化物抗原である前記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合すること；
ｆ）該結合剤が非がん細胞、非腫瘍細胞、良性がん細胞および／もしくは良性腫瘍細胞で発現される抗原、特に炭水化物抗原を結合しないこと；ならびに／または
ｇ）該結合剤が、がん幹細胞および正常がん細胞で発現される腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合すること；
を有する結合剤。
【請求項６】
請求項５に記載の結合剤であって、ここで、前記抗体または前記抗体の機能的に活性な前記フラグメントもしくは誘導体が：
ａ）ＣＤ１７６特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体であって、好ましくは少なくとも１つの以下の特徴：
ｉ）それが、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２または３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号４または５または６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３から成る群より選択される、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、好ましくは少なくとも２つのＣＤＲ、さらに好ましくは３つすべてのＣＤＲを含むこと；
ｉｉ）それが、配列番号７または８または９のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１０または１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号１２または１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３から成る群より選択される少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、好ましくは少なくとも２つのＣＤＲ、さらに好ましくは３つすべてのＣＤＲを含むこと；
ｉｉｉ）それが、配列番号４６から７９のうちの任意の１つのアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域を含むこと；
ｉｖ）それが、配列番号８０から９４のうちの任意の１つのアミノ酸配列を含有する軽鎖可変領域を含むこと；
ｖ）それが、生理学的条件下でＧａｌα１−３ＧａｌＮＡｃα、Ｇａｌα１−３ＧａｌＮＡｃβ、ＧａｌＮＡｃα、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα、Ｇａｌβ１−３（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６）ＧａｌＮＡｃα、ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα、ＧｌｃＮＡｃα１−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα、ＧａｌＮＡｃα１−３Ｇａｌβおよび／または３’−Ｏ−Ｓｕ−Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃαと特異的に相互作用しないこと；
を有する、ＣＤ１７６特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体；
ｂ）（ａ）で定義された通りの抗体との交差特異性を示す、抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体；
ｃ）ＣＤ１７３特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体；
ｄ）ＣＤ１７４特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体；
ｅ）ＣＤ１７５特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体；
ｆ）ＣＤ１７５ｓ特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体；および／または
ｇ）ＣＡ１９−９特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体
から成る群より選択される結合剤。
【請求項７】
腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞の処置で使用するための、該腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤を含む薬学的組成物であって、ここで、該結合剤、該がん幹細胞および該腫瘍関連炭水化物抗原が請求項１から６のいずれか一項で定義された通りの特徴の１つ以上を有する薬学的組成物。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか一項に記載の結合剤または請求項７に記載の薬学的組成物であって、腫瘍サイズの低減、悪性細胞の排除、転移の防止、再発の防止、播種性がんの低減または死滅、生存の延長および／または腫瘍それぞれがん進行までの時間の延長のための療法で使用するための、結合剤または薬学的組成物。
【請求項９】
がん幹細胞に影響を与える処置であって、腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤による処置、に感受性である該がん幹細胞を含むがんを同定する方法であって、該結合剤が特異的である該腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞を、患者から取得したがん検体が含むかどうかを決定する工程であって、ここで、がん幹細胞での該腫瘍関連炭水化物抗原の存在が、該腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する該結合剤による処置に該がんが感受性であることを示し、該処置が該がん幹細胞に影響を与える工程を含む方法。
【請求項１０】
がんを診断、病期分類および／もしくは予後を判定するならびに／または処置に対する感受性を監視するための方法であって、患者から単離された検体中の細胞での腫瘍関連炭水化物抗原の発現を分析する工程であって、ここで、該腫瘍関連炭水化物抗原を発現する細胞の存在が、該検体中のがん幹細胞の存在を示す工程を含む方法。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の方法であって、ここで、前記患者からの前記検体が前記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤によって染色される方法。
【請求項１２】
請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、前記腫瘍関連炭水化物抗原がＣＤ１７６、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７４、ＣＤ１７３、およびＣＡ１９−９から成る群より選択される方法。
【請求項１３】
請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、少なくとも１つの第２のがん幹細胞マーカーを同時発現する細胞の存在が、がん幹細胞の存在を示す方法。
【請求項１４】
請求項９から１３のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１３３およびＣＤ１６４から成る群より選択される、少なくとも１つの追加の糖タンパク質がん幹細胞マーカーの同時発現が試験される方法。
【請求項１５】
請求項９から１４のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、染色パターンの分析ががん幹細胞の相対分布を提供し、該分布によりがんの腫瘍原性（ｔｕｍｏｒｇｅｎｉｃｉｔｙ）を予測する、方法。
【請求項１６】
哺乳動物がん幹細胞の組成物であって、ここで、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％の該組成物中の該細胞が、腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞である組成物。
【請求項１７】
請求項９から１５のいずれか一項に記載の方法で使用するためのキットであって、請求項９から１５の１つ以上に記載の方法で使用するための、腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤および指示を含むキット。
【請求項１８】
腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞に対する有効性について候補治療剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、
ａ）該剤を請求項１６に記載の細胞組成物と接触させる工程、および
ｂ）該腫瘍関連炭水化物抗原陽性がん細胞に対する該剤の有効性を決定する工程、
を含む方法。
【請求項１】
腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞の処置で使用するための、該腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤。
【請求項２】
請求項１に記載の結合剤であって、ここで、前記腫瘍関連炭水化物抗原がＣＤ１７６、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７４、ＣＤ１７３、およびＣＡ１９−９から成る群より選択される結合剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載の結合剤であって、ここで、前記がん幹細胞が１個以上の以下の特徴：
ａ）該がん幹細胞が前記腫瘍関連炭水化物抗原を担持する糖タンパク質である、少なくとも１つの幹細胞マーカーを発現すること；
ｂ）該がん幹細胞がＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１３３およびＣＤ１６４から成る群より選択される１個以上の幹細胞マーカーを発現すること；
ｃ）該腫瘍関連炭水化物抗原が該がん幹細胞によって発現された腫瘍関連糖タンパク質に担持されていること；
ｄ）該腫瘍関連炭水化物抗原が腫瘍特異的であること；および／または
ｅ）該腫瘍関連炭水化物抗原ががん幹細胞で主としてまたは独占的に発現されるが、がん幹細胞ではないがん細胞では発現されないこと；
を有する結合剤。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の結合剤であって、ここで、前記がん幹細胞が１つ以上の以下の特徴：
ａ）がんが固形腫瘍であること；
ｂ）がんが白血病であること；
ｃ）がんが多発性骨髄腫もしくはリンパ腫であること；
ｄ）がんが上皮起源の腫瘍であること；ならびに／または
ｅ）がんが肺がん、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、消化器がん、膵臓がん、前立腺がん、子宮頸がんおよび頭頸部がんから成る群より選択される腫瘍であること；
を有する該がんのがん幹細胞である結合剤。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載の結合剤であって、ここで、該結合剤が１つ以上の以下の特徴：
ａ）該結合剤が抗体または抗体の抗原結合フラグメントもしくは誘導体であること；
ｂ）該結合剤がヒト抗体、マウス抗体、ヒト化抗体、もしくはキメラ抗体またはそれぞれの抗原結合フラグメントもしくは誘導体であること；
ｃ）該結合剤が単鎖抗体フラグメント、マルチボディ、Ｆａｂフラグメント、および／またはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤアイソタイプの免疫グロブリンおよび／もしくはそのサブクラスであること；
ｄ）該結合剤が抗体または抗体の抗原結合フラグメントもしくは誘導体であって、１つ以上の以下の特徴：
ｉ．それががん細胞のＡＤＣＣおよび／もしくはＣＤＣを媒介すること；
ｉｉ．それががん細胞のアポトーシスを誘起および／もしくは促進すること；
ｉｉｉ．それががん細胞の標的細胞の増殖を抑制すること；
ｉｖ．それががん細胞の食作用を誘起および／もしくは促進すること；ならびに／または
ｖ．それが細胞傷害剤の放出を誘起および／または促進する；
を有すること；
ｅ）該結合剤が、腫瘍特異的炭水化物抗原である前記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合すること；
ｆ）該結合剤が非がん細胞、非腫瘍細胞、良性がん細胞および／もしくは良性腫瘍細胞で発現される抗原、特に炭水化物抗原を結合しないこと；ならびに／または
ｇ）該結合剤が、がん幹細胞および正常がん細胞で発現される腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合すること；
を有する結合剤。
【請求項６】
請求項５に記載の結合剤であって、ここで、前記抗体または前記抗体の機能的に活性な前記フラグメントもしくは誘導体が：
ａ）ＣＤ１７６特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体であって、好ましくは少なくとも１つの以下の特徴：
ｉ）それが、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２または３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、および配列番号４または５または６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３から成る群より選択される、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、好ましくは少なくとも２つのＣＤＲ、さらに好ましくは３つすべてのＣＤＲを含むこと；
ｉｉ）それが、配列番号７または８または９のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１０または１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号１２または１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３から成る群より選択される少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、好ましくは少なくとも２つのＣＤＲ、さらに好ましくは３つすべてのＣＤＲを含むこと；
ｉｉｉ）それが、配列番号４６から７９のうちの任意の１つのアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域を含むこと；
ｉｖ）それが、配列番号８０から９４のうちの任意の１つのアミノ酸配列を含有する軽鎖可変領域を含むこと；
ｖ）それが、生理学的条件下でＧａｌα１−３ＧａｌＮＡｃα、Ｇａｌα１−３ＧａｌＮＡｃβ、ＧａｌＮＡｃα、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα、Ｇａｌβ１−３（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６）ＧａｌＮＡｃα、ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα、ＧｌｃＮＡｃα１−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα、ＧａｌＮＡｃα１−３Ｇａｌβおよび／または３’−Ｏ−Ｓｕ−Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃαと特異的に相互作用しないこと；
を有する、ＣＤ１７６特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体；
ｂ）（ａ）で定義された通りの抗体との交差特異性を示す、抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体；
ｃ）ＣＤ１７３特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体；
ｄ）ＣＤ１７４特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体；
ｅ）ＣＤ１７５特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体；
ｆ）ＣＤ１７５ｓ特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体；および／または
ｇ）ＣＡ１９−９特異的抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体
から成る群より選択される結合剤。
【請求項７】
腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞の処置で使用するための、該腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤を含む薬学的組成物であって、ここで、該結合剤、該がん幹細胞および該腫瘍関連炭水化物抗原が請求項１から６のいずれか一項で定義された通りの特徴の１つ以上を有する薬学的組成物。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか一項に記載の結合剤または請求項７に記載の薬学的組成物であって、腫瘍サイズの低減、悪性細胞の排除、転移の防止、再発の防止、播種性がんの低減または死滅、生存の延長および／または腫瘍それぞれがん進行までの時間の延長のための療法で使用するための、結合剤または薬学的組成物。
【請求項９】
がん幹細胞に影響を与える処置であって、腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤による処置、に感受性である該がん幹細胞を含むがんを同定する方法であって、該結合剤が特異的である該腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞を、患者から取得したがん検体が含むかどうかを決定する工程であって、ここで、がん幹細胞での該腫瘍関連炭水化物抗原の存在が、該腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する該結合剤による処置に該がんが感受性であることを示し、該処置が該がん幹細胞に影響を与える工程を含む方法。
【請求項１０】
がんを診断、病期分類および／もしくは予後を判定するならびに／または処置に対する感受性を監視するための方法であって、患者から単離された検体中の細胞での腫瘍関連炭水化物抗原の発現を分析する工程であって、ここで、該腫瘍関連炭水化物抗原を発現する細胞の存在が、該検体中のがん幹細胞の存在を示す工程を含む方法。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の方法であって、ここで、前記患者からの前記検体が前記腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤によって染色される方法。
【請求項１２】
請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、前記腫瘍関連炭水化物抗原がＣＤ１７６、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７４、ＣＤ１７３、およびＣＡ１９−９から成る群より選択される方法。
【請求項１３】
請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、少なくとも１つの第２のがん幹細胞マーカーを同時発現する細胞の存在が、がん幹細胞の存在を示す方法。
【請求項１４】
請求項９から１３のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１３３およびＣＤ１６４から成る群より選択される、少なくとも１つの追加の糖タンパク質がん幹細胞マーカーの同時発現が試験される方法。
【請求項１５】
請求項９から１４のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、染色パターンの分析ががん幹細胞の相対分布を提供し、該分布によりがんの腫瘍原性（ｔｕｍｏｒｇｅｎｉｃｉｔｙ）を予測する、方法。
【請求項１６】
哺乳動物がん幹細胞の組成物であって、ここで、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％の該組成物中の該細胞が、腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞である組成物。
【請求項１７】
請求項９から１５のいずれか一項に記載の方法で使用するためのキットであって、請求項９から１５の１つ以上に記載の方法で使用するための、腫瘍関連炭水化物抗原を特異的に結合する結合剤および指示を含むキット。
【請求項１８】
腫瘍関連炭水化物抗原を発現するがん幹細胞に対する有効性について候補治療剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、
ａ）該剤を請求項１６に記載の細胞組成物と接触させる工程、および
ｂ）該腫瘍関連炭水化物抗原陽性がん細胞に対する該剤の有効性を決定する工程、
を含む方法。
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図３−５】
【図３−６】
【図３−７】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図３−５】
【図３−６】
【図３−７】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１３−５１７４８７（Ｐ２０１３−５１７４８７Ａ）
【公表日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４９２９１（Ｐ２０１２−５４９２９１）
【出願日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０００２１７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８９００４
【国際公開日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【出願人】（５０９０６７８８７）グリコトープ ゲーエムベーハー (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０００２１７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８９００４
【国際公開日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【出願人】（５０９０６７８８７）グリコトープ ゲーエムベーハー (7)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]