アセトアセテートエステルおよび誘導体の酵素合成
１態様において、本発明はアセトアセテートのエステル誘導体を合成するための方法を含む。この方法は、アセトアセテートの第１エステルを供給し、かつアルコール類を供給することを含む。この方法はさらに、アセトアセテートの第１エステルと該アルコールを、非水性溶媒中においてエステル交換してアセトアセテートのエステル誘導体を形成することができる酵素の存在下で混和することを含む。この方法により、アセトアセテートのエステル誘導体が形成され、これは１態様においてはモノアセトアセチンである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001] 本発明は、摂取した際にアセトアセテートの供給源として有用な可食アセトアセテートエステルおよび誘導体の合成に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002] １９７９年、Ｂｉｒｋｈａｈｎら((Birkhahn, McMenamy et al. 1979))は、彼らがモノアセトアセチン（ｍｏｎｏａｃｅｔｏａｃｅｔｉｎ）（ＭＡ）と呼んだアセトアセテートのモノグリセリドの合成を記載した。その目標は、敗血症または外傷を受けた対象のためにカルニチンに依存しない熱源を提供する基質を同定することであった。その著者らは、外傷および敗血症の患者の所見に基づいて、そのような化合物を要望する幾つかの理由を挙げた。
【０００３】
[0003] モノアセトアセチンは、幾つかの理由で外傷および敗血症の非経口処置のための有望な化合物として提唱された：たとえば、モノアセトアセチンは水溶性であり乳化の必要がない、代謝されて安全な天然化合物グリセロールとアセトアセテートになる、およびモノアセトアセチンの注入はナトリウム陽イオンを必要としないのでナトリウム負荷を増大させることなく投与できる。ケトン体の直接注入にはナトリウム陽イオンが必要であろう。
【０００４】
[0004] ＢｉｒｋｈａｈｎらはＭＡの合成を記載している。ＭＡは、１：１のモル比のグリセロールとジケテンを混和して８０℃で反応させることにより合成された。反応物を３０分間撹拌し、生成物をクロロホルムに溶解し、水で洗浄し、真空下で溶媒から分離した{Birkhahn, 1978 #412}。
【０００５】
[0005] Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，４２０，３３５、タイトル“水溶性グリセロールビスアセトアセテートをベースとする非経口栄養”は、グリセロールのＯＨ基にエステル化された２個のアセトアセテートを含むグリセロールからなる新規な非経口栄養組成物に関する。この特許は、ジケテンとグリセロールをジメチルアミノピリジン溶液中で混合する方法によるグリセロールビスアセトアセテートの合成方法を教示する。
【０００６】
[0006] ＵＳ ｐａｔｅｎｔ ５，６９３，８５０、タイトル“ヒドロキシ酪酸の栄養性水溶性グリセロールエステル”は、１９９７年１２月２日に交付された。この特許には、非経口栄養として有用な水溶性グリセロールエステルを製造するための方法が記載されている。
【０００７】
[0007] Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００６／０２８０７２１は、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート誘導体を含有する組成物、ならびにそれらの化合物をＡＤおよび類似の状態に使用することに関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，４２０，３３５
【特許文献２】ＵＳ ｐａｔｅｎｔ ５，６９３，８５０
【特許文献３】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００６／０２８０７２１
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Birkhahn, McMenamy et al. 1979
【非特許文献２】Birkhahn, 1978 #412
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
[0008] 先行技術に記載された合成方法は、危険な化合物、たとえば爆発の危険性があるジケテンを用いる必要がある。さらに、多くの有機溶媒は有毒であり、したがって医薬製剤または栄養製品中の有機溶媒の混入は重大な問題になる可能性がある。したがって、医薬製剤または栄養製品は溶媒の混入がないことを確実にすることが重要であり、これはさらに複雑さおよび経費を付加する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
[0009] 本発明は、アセトアセテートのエステルが本明細書に記載する酵素を用いて安全かつ効果的な方法で合成できるという新規な洞察を提示する。特に、グリセロールのモノアセトアセテートをこの方法で合成することができる。モノアセトアセチンは身体の細胞へのケトン体の利用を増大させる療法用化合物であり、このケトン体の増加はアルツハイマー病およびグルコース利用低下に関連する他の神経変性疾患に有益であろう。したがって、本発明に述べる化合物を用いてアルツハイマー病およびグルコース代謝低下に関連する他の神経変性疾患の治療法および予防法を開発できることが分かる。本発明は、それらの化合物を効果的な新規様式で合成する方法を記載する。
【００１２】
[0010] １態様において、本発明はアセトアセテートのエステル誘導体を合成するための方法を含む。この方法は、式Ｉを有するアセトアセテートの第１エステル：
【００１３】
【化１】
【００１４】
[0011] （式中、Ｒ１はアルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン化アルキル、シクロアルキル、脂肪族、アリール、またはアラルキル基のいずれかである）を供給し、かつアルコール類を供給することを含む。この方法はさらに、アセトアセテートの第１エステルと該アルコールを、非水性溶媒中においてエステル交換してアセトアセテートのエステル誘導体を形成することができる酵素の存在下で混和することを含む。この方法により、アセトアセテートのエステル誘導体が形成される。
【００１５】
[0012] １態様において、アセトアセテートのエステル誘導体はアセトアセテートのモノグリセリドである。他の態様において、アセトアセテートの第１エステルはメチルアセトアセテートである。他の態様において、酵素はリパーゼまたはエステラーゼである。
【００１６】
[0013] １態様において、酵素は、カンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼ、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）リパーゼ、テルモアネロビウム・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｂｒｏｃｋｉｉ）エステラーゼ、およびＥｓｔｅｒａｓｅ Ｅ０２０からなる群から選択される。
【００１７】
[0014] １態様において、非水性溶媒はアセトニトリル、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、アセトン、およびトルエンからなる群から選択される。１態様において、非水性溶媒はアセトニトリルである。
【００１８】
[0015] １態様において、本発明方法はさらに、アセトアセテートのエステル誘導体の精製を含む。
【００１９】
[0016] １態様において、アルコール類はポリオールである。他の態様において、ポリオールはグリセロールまたはグルコースである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】[0017] 図１は、生成物ＭＡの形成を示す、種々の酵素の２４時間インキュベーションの薄層クロマトグラフを示す。
【図２】[0018] 図２は、生成物ＭＡの形成を示す、種々の酵素の９６時間インキュベーションの薄層クロマトグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
[0019] 本発明は、アセトアセテートのエステルを本明細書に記載する酵素によって安全かつ効果的に合成できる、きわめて簡便な合成を提供する。特に、グリセロールのモノアセトアセテート（本明細書中でモノアセトアセチンとも記載する）をこの方法により合成できる。本発明は、アセトアセテート誘導体の合成方法に関する。この方法は特にアセトアセテートのモノグリセリドの合成に適するが、いかなるアセトアセテートエステル誘導体の合成にも使用できる。この方法により合成した化合物は、ケトン体の増加を目的とする多様な療法組成物中に使用できる。そのような状態の例には、敗血症、外傷、神経変性障害、たとえばパーキンソン病およびアルツハイマー病、ならびに当技術分野で知られている他の多数の疾患が含まれる。
【００２２】
[0020] 本発明は、いずれかのアセトアセテート誘導体、好ましくはモノアセトアセチンの簡単な合成方法であって、これまでに記載された合成方法に伴う欠点が避けられる方法に関する。本発明方法により製造される好ましいアセトアセテート誘導体はモノアセトアセチンである。ただし、本発明方法はいかなるアセトアセテート誘導体にも、特に療法用組成物のための栄養性化合物の製造にも適用できる。
【００２３】
[0021] １態様において、これらの化合物は、血清ケトン体を増加させることが望ましい多様な障害を治療または予防するために用いられる。好ましくは、障害はアルツハイマー病またはパーキンソン病である。
【００２４】
[0022] 本発明はアセトアセテートのエステルおよび／またはエステル誘導体を合成するための方法を含み、この方法は式Ｉを有するアセトアセテートの第１エステル：
【００２５】
【化２】
【００２６】
（式中、Ｒ１はアルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン化アルキル、シクロアルキル、脂肪族、アリール、またはアラルキル基のいずれかである）を供給し；アルコール類を供給し；そしてアセトアセテートの第１エステルと該アルコールを、非水性溶媒中においてエステル交換してアセトアセテートのエステル誘導体を形成することができる酵素の存在下で混和することを含み、その際、エステル交換が起きてアセトアセテートのエステルおよび／またはエステル誘導体が生成する。１態様において、エステル交換できる酵素は、エステル交換して目的生成物、たとえばアセトアセテートのエステル誘導体にすることができる。他の態様において、この方法はアセトアセテートの第１エステルと該アルコールを、非水性溶媒中においてエステル交換してアセトアセテートのエステル誘導体を形成することができる酵素の存在下で混和することを含む。この方法により、アセトアセテートのエステル誘導体が形成される。
【００２７】
[0023] １態様において、本発明は、アセトアセテートのエステルとアルコール類を水性環境で混和することから出発する、いずれかのケトン体誘導体の一般的な合成方法を提供し、この方法は下記の工程を含む：ａ）アセトアセテートの第１エステルおよびモノ−またはポリアルコールを無水溶液に添加する；ｂ）リパーゼまたはエステラーゼを添加する；ならびにｃ）反応生成物を精製する。モノアセトアセチンを製造するためには、メチルアセトアセテート、グリセロール、および好ましくはカンジダ・アンタルクチカリパーゼから出発することが好ましい。１態様において、反応工程ｂ）は有機溶媒、たとえばアセトニトリルの存在下で行われる。
【００２８】
[0024] “誘導体”は、親化合物から誘導されるかまたは理論的に誘導できる化合物または化合物の一部を表わす。
【００２９】
[0025] 用語“ヒドロキシル基”は、式−ＯＨにより表わされる。
【００３０】
[0026] 用語“アルコキシ基”は、式−ＯＲにより表わされ、ここでＲはアルキル基であってもよく、これには低級アルキル基が含まれ、これらは場合により、後記に定義するアルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、ハロゲン化アルキル、またはヘテロシクロアルキル基で置換されている。
【００３１】
[0027] 用語“エステル”は、式−ＯＣ（Ｏ）Ｒにより表わされ、ここでＲは後記に定義するアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、ハロゲン化アルキル、またはヘテロシクロアルキル基であってもよい。“エステル交換”は、エステルとアルコール類が反応して新たなエステル化合物を形成することを表わす。１態様において、アセトアセテートの第１エステル（たとえばメチルアセトアセテート）は、目的とする新たなエステル（たとえばモノアセトアセチン）の形成を促進するように選択される。
【００３２】
[0028] 用語アルコールは、広範なクラスのヒドロキシル含有有機化合物を表わし、下記のものを含む：１個のヒドロキシル基を含む脂肪族、脂環式、芳香族、複素環式および多環式の一価アルコール；２個のヒドロキシル基を含む脂肪族、脂環式、芳香族、複素環式および多環式の二価アルコール：グリコール類およびジオール類を含む；３個のヒドロキシル基を含む脂肪族、脂環式、芳香族、複素環式および多環式の三価アルコール：グリセロールおよび誘導体を含む；３個以上のヒドロキシル基を含む脂肪族、脂環式、芳香族、複素環式および多環式の多価アルコール：糖類、多糖類および糖アルコール類を含む。
【００３３】
[0029] １態様において、アルコール類はポリオールである。既知のポリオールは下記を含む化合物である：２〜２０個の炭素原子をもつ二価アルコール（脂肪族ジオール、たとえばアルキレングリコール、たとえばエチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−または１，４−ブタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、およびネオペンチルグリコール；ならびに脂環式ジオール、たとえばシクロアルキレングリコール、たとえばシクロヘキサンジオールおよびシクロヘキサンジメタノール）；３〜２０個の炭素原子をもつ三価アルコール（脂肪族トリオール、たとえばアルカントリオール、たとえばグリセロール、トリメチロールプロパン、トリメチロールエタン、およびヘキサントリオール、ならびにトリエタノールアミン）；４〜８個のヒドロキシル基および５〜２０個の炭素原子をもつ多価アルコール（脂肪族ポリオール、たとえばアルカンポリオール、およびそれらの分子内または分子間脱水生成物、たとえばペンタエリトリトール、ソルビトール、マンニトール、ソルビタン、ジグリセロール、およびジペンタエリトリトール；ならびに糖類およびそれらの誘導体、たとえばショ糖、グルコース、マンノース、フルクトース、およびメチルグルコシド）。
【００３４】
[0030] 本発明の目的に有用なポリアルコールには、少なくとも２個、より好ましくは少なくとも３個、よりさらに好ましくは３から１０個まで、最も好ましくは３から６個まで、特に好ましくは３から４個までのヒドロキシル（−ＯＨ）官能基をもつ化合物が含まれる。ポリアルコールは、脂肪族、脂環式、または芳香族、好ましくは脂肪族または脂環式、最も好ましくは直鎖または分枝鎖の脂肪族であってもよく、場合により官能基で置換されている。ポリアルコールは一般に２〜５０個、好ましくは３〜４０個の炭素原子をもつ。１態様において、多価アルコールはより高い密度のアセトアセテート均等物を供給できるが、多価アルコールは１個のヒドロキシル基においてのみ誘導体化されるであろう；ただし、１個より多いヒドロキシル基における誘導体化も許容できる。
【００３５】
[0031] １態様において、ポリアルコールは可食ポリオール、たとえばグリセロールまたは置換グリセロールおよび糖類である。可食ポリオールは、ある態様において１種類以上のポリオール、たとえば下記のものからなる群から選択される炭水化物アルコールである：キシリトール、イジトール、マルチトール、ソルビトール、マンニトール、ズルシトール、イノシトール、エリトリトール、ラクチトール、グリセリン、ＵＳＰグリセリン、食品グレードのグリセリン、リビトール、トレイトール、およびプロピレングリコール。選択したポリオール（単数または複数）は同等に作用し、ポリオール、ポリオール組合わせ、またはポリオール溶液に応じて、用いる濃度の変更ならびに加熱および混合の時間の変更により制限されるにすぎない。
【００３６】
[0032] 他の態様において、アルコール類は糖類または多糖類である。糖類または多糖類は当技術分野で既知のいずれであってもよく、例示リストには単糖類、たとえばフルクトースおよびグルコース；二糖類、たとえばショ糖、マルトース、セロビオース、および乳糖、またはより複雑な糖類、たとえばガラクトース、ソルボース、キシロース、アリノース、およびマンノースが含まれる。さらに他の炭水化物には、アルトロース、アラビノース、デキストロース、エリスロース、グルコース、イドース、リキソース、マンノース、リボース、タロース、トレオースなどが含まれる。
【００３７】
[0033] 用語“アルキル基”は、炭素原子１〜２４個の分枝鎖または非分枝鎖飽和炭化水素基と定義され、たとえばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなどである。“低級アルキル基”は、１〜１０個の炭素原子をもつ飽和分枝鎖または非分枝鎖炭化水素である。１態様において、アルキル基は１〜６個の炭素原子をもつ。１態様において、アルキル基はメチルである。
【００３８】
[0034] 用語“アルケニル基”は、２〜２４個の炭素原子および少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む構造式をもつ炭化水素基と定義される。１態様において、アルケニル基は１〜６個の炭素原子をもつ。
【００３９】
[0035] 用語“アルキニル基”は、２〜２４個の炭素原子および少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む構造式をもつ炭化水素基と定義される。１態様において、アルキニル基は１〜６個の炭素原子をもつ。
【００４０】
[0036] 用語“ハロゲン化アルキル基”は、前記に定義したアルキル基において、これらの基上の１個以上の水素原子がハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）で置換されたものと定義される。
【００４１】
[0037] 用語“シクロアルキル基”は、少なくとも３個の炭素原子から構成される非芳香族炭素環と定義される。シクロアルキル基の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが含まれるが、これらに限定されない。用語“ヘテロシクロアルキル基”は、上記のシクロアルキル基において、環の少なくとも１個の炭素原子がヘテロ原子、たとえば窒素、酸素、硫黄またはリン（これらに限定されない）で置換されたものである。１態様において、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル基は３〜１０個の炭素原子、他の態様においては５〜７個の炭素原子をもつ。
【００４２】
[0038] 用語“脂肪族基”は、前記に定義したアルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン化アルキルおよびシクロアルキル基を含むものと定義される。“低級脂肪族基”は、１から１０個までの炭素原子を含む脂肪族基である。１態様において、脂肪族基は１〜６個の炭素原子をもつ。
【００４３】
[0039] 用語“アリール基”は、炭素をベースとするいずれかの芳香族基と定義され、ベンゼン、ナフタレンなどが含まれるが、これらに限定されない。用語“芳香族”には“ヘテロアリール基”も含まれ、これは芳香族基の環内に取込まれた少なくとも１個のヘテロ原子をもつ芳香族基と定義される。ヘテロ原子の例には窒素、酸素、硫黄およびリンが含まれるが、これらに限定されない。アリール基は１個以上の基で置換されていてもよく、これにはアルキル、アルキニル、アルケニル、アリール、ハロゲン化物、ニトロ、アミノ、エステル、ケトン、アルデヒド、ヒドロキシ、カルボン酸、またはアルコキシが含まれるが、これらに限定されない；あるいは、アリール基は置換されていなくてもよい。１態様において、アリール基は３〜１０個の炭素原子をもつ；他の態様においては５〜７個の炭素原子をもつ。
【００４４】
[0040] 用語“アラルキル”は、アリール基に結合した前記に定義したアルキル基をもつアリール基と定義される。アラルキル基の一例はベンジル基である。
【００４５】
[0041] “エステル化”は、アルコール類とカルボン酸またはカルボン酸誘導体が反応してエステルを生成することを表わす。“エステル交換”は、エステルとアルコール類が反応して新たなエステル化合物を形成することを表わす。
【００４６】
[0042] 疾患または障害の“処置”は、疾患もしくは病的状態の徴候もしくは症状を軽減するか、または疾患が発症、進行もしくは完全に発達するのを阻止する、療法介入を表わす。
【００４７】
[0043] 用語“３−ヒドロキシブチレート”は用語“３−ヒドロキシ酪酸”と互換性をもって用いられる。用語“β−ヒドロキシブチレート”または“β−ヒドロキシ酪酸”もこの化合物を表わすために使用できる。
【００４８】
[0044] １態様において、エステル交換後に形成されたアセトアセテートエステル、すなわちアセトアセテートのエステル誘導体は、アセトアセテートのモノグリセリドである。この態様において、第１または出発アセトアセテートエステルはメチルアセトアセテートである。他の多数のエステル誘導体をこの方法で形成することができ、これにはたとえばポリオール、糖類、および糖アルコールのアセトアセテートエステル、たとえばグリセロール、グルコース、ショ糖、ガラクトース、マンニトール、および１，３−ブタンジオールのアセトアセテートエステルが含まれる。前記に述べたように、ある態様には出発アルコール類の１個のヒドロキシルにおける、ある態様には２個のヒドロキシルにおける、ある態様には３個のヒドロキシルにおける、ある態様には４個のヒドロキシルにおける、ある態様には５個のヒドロキシルにおける、ある態様には６個のヒドロキシルにおける、ある態様には７個またはそれより多くのヒドロキシルにおけるエステル化が含まれる。開示する例示化合物を下記の表１に示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
[0046] １態様において、エステル交換して目的とするアセトアセテートのエステル誘導体、たとえばグリセロールのモノアセトアセテートを形成することができる酵素の存在下で、混和を行なう。多数の種のいずれか、特に細菌および酵母の種に由来する多数の酵素、たとえばリパーゼまたはエステラーゼがエステル交換を行なうことができる。リパーゼおよびエステラーゼはエステル結合の加水分解を触媒してアルコール類とカルボン酸を生成し、異なる基質特異性、Ｒ基の長さ、または鎖長嗜好性、および独自の阻害因子をもつ。水性溶媒系中で、エステラーゼおよびリパーゼはそれらの自然な反応、たとえばエステル結合の加水分解を行なう。水を排除した有機溶媒中では、エステラーゼおよびリパーゼの反応は逆行する場合があり、エステル結合を形成するエステル化またはアシル化反応、すなわちエステル交換を触媒することが知られている。
【００５１】
[0047] そのような酵素は多数の業者のいずれかから入手でき、あるいは当技術分野で既知の技術を用いて独自に精製することができる。候補酵素、たとえばリパーゼまたはエステラーゼがエステル交換してアセトアセテートのエステル誘導体を形成できるかどうかを判定するために、候補酵素を適切な条件下で（たとえば目的とする反応条件下で反応体を用いて）試験して、目的とするエステル交換された生成物が形成されるかどうかを判定することができる。
【００５２】
[0048] このエステル交換工程により、第１エステル化合物、たとえば殊に式Ｉの出発エステルと、アルコール類のヒドロキシル基との間にエステル結合が得られる。このエステル結合反応を触媒することができる酵素はいずれも使用するのに適切である。この反応には、不活性有機担体上に固定化された酵素を用いるのが有利であり、これにより酵素を反応媒質から容易に分離して次いでリサイクルすることができる。好ましくは、酵素をマクロ多孔質樹脂に吸着させる。
【００５３】
[0049] 意外にも、リパーゼ活性をもつことが知られている多数の酵素が本発明に有用なエステル交換を達成できなかった。エステル交換を達成できなかったリパーゼには、ムコール・ミエイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｉ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）、シュードモナス・フルオレスセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｏａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、リゾプス・アリズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕｓ）、カンジダ・シリンドラシエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）、ブタ膵臓、およびリゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）に由来するリパーゼが含まれる。意外にも、エステラーゼ活性をもつことが知られている多数の酵素が本発明に有用なエステル交換を達成できなかった。エステル交換を達成できなかったエステラーゼには、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・テルモグルコシダシウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）、カンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ムコール・ミエイ、ウマ肝臓、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｅａ）、ブタ肝臓に由来するエステラーゼ、およびＴＨＥＲＭＯＣＡＴ Ｅｓｔｅｒａｓｅ類（Ｅ０ｌ、Ｅ０３、Ｅ０４、Ｅ０６、Ｅ０８、Ｅ０９、Ｅ０２９、Ｎｌ、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、Ｎｌ０およびＥ０１７ｂとしても知られる）が含まれる。ＴＨＥＲＭＯＣＡＴファミリーのエステラーゼは、たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，２１８，１６７、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，９６９，１２１、およびＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，２１８，１６３において同定され、それらのそれぞれを全体として本明細書に援用する。
【００５４】
[0050] 意外にも、試験した酵素のうち数種類のみが必要なエステル交換を達成できた；すなわち、アセトアセテートのエステル誘導体を形成することができた。１態様において、酵素は下記の酵素のいずれかであってよい：カンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢ、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）リパーゼ、テルモアネロビウム・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｂｒｏｃｋｉｉ）エステラーゼ、およびＴＨＥＲＭＯＣＡＴ Ｅｓｔｅｒａｓｅ ２０（Ｅ０２０）。上記酵素のいずれかの組合わせも含まれる。いかなる供給源からのカンジダ・アンタルクチカのリパーゼＢも使用に適切である；１態様において、供給源はＳｉｇｍａ− Ａｌｄｒｉｃｈ、カンジダ・アンタルクチカのリパーゼＢ（アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）において発現）を不活性担体上に固定化したもの、またはＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ｓ．Ａ．社が商品名Ｎｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５で市販しているものである。この酵素は熱安定性であり、４０〜６０℃で最適活性を示す。それはグラム当たり１０プロピルラウレート単位のエステル化活性をもつと説明されている。アスペルギルス属リパーゼは、たとえばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手でき、約０．５単位／ｍｇで供給され、１ＵがｐＨ７．４および４０℃で毎分１μモルの酢酸を加水分解する酵素量に相当する活性をもつ（トリアセチン、Ｆｌｕｋａ Ｎｏ．９０２４０を基質として）。いかなる供給源からのテルモアネロビウム・ブロッキイ由来のエステラーゼも使用するのに適切である；１態様において、供給源はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、約２Ｕ／ｇであり、その際、１単位は２５℃で１μモルの吉草酸エチルを加水分解する量の酵素であると記載されている。ＴＨＥＲＭＯＣＡＴ ２０は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，２１８，１６７、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，９６９，１２１、およびＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，２１８，１６３において同定されたエステラーゼのファミリーの一部であり、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，２１８，１６７においてエステラーゼＥ０２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２９および３０によっても同定される。
【００５５】
[0051] 酵素の適量は当業者が決定できる。１態様において、２ｇのメチルアセトアセテートおよび４ｇのグリセロール当たり、約１ミリグラム（ｍｇ）の各酵素を使用する。
【００５６】
[0052] 本発明は、リパーゼおよび／またはエステラーゼ触媒作用によるエステル交換を利用する。そのようなエステル交換は、当技術分野で既知のいずれかの条件下で実施できる。出発物質が酵素触媒作用により加水分解されてアセトアセテートを生成するのを避ける条件を選択する。１態様において、この反応は少なくとも１種類の非水性溶媒の存在下で実施される。他の態様において、この反応は無水条件下で実施される。
【００５７】
[0053] 式Ｉのエステルとアルコール類の混合は、多数の化学量論的比率で行なうことができる。広範な化学量論的量が機能することに注目する；たとえば式Ｉのエステル：アルコールの単位について約１：０．１ないし式Ｉのエステル：アルコールの単位について約１：５０。特定の反応についての厳密な化学量論的量は当業者がルーティンな実験活動に基づいて選択できる。１態様において、モノアセトアセチンの合成のためにアルコール３単位に対して式Ｉのエステル１当量の比率を採用できる。
【００５８】
[0054] この反応は使用する酵素に最適な温度を含む温度で実施できるが、エステル交換反応が優先しかつより多量の生成物を生成する温度が好ましい点を留意して、酵素が作動するいかなる温度でも実施できる。酵素の使用量も、反応が適切な速度で進行するのに十分な酵素を供給するという方針に従って当業者が決定できる。
【００５９】
[0055] この反応は、大気圧下で、または減圧もしくは加圧下で実施できる。
【００６０】
[0056] 生成物の最大収率に達するために、反応を少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも８４時間、少なくとも９６時間、さらにそれより長く、たとえば最高１４４時間、実施する。
【００６１】
[0057] １態様においては、反応を少なくとも１種類の有機溶媒の存在下で実施する。１態様においては、物質移動の制限を避けるために、出発物質を溶解しうる溶媒が望ましい。たとえば、モノアセトアセチンを得るためには、その溶媒にグリセロール、メチルアセトアセテート、エチルアセトアセテート、およびグルコースが溶解することが望ましい。この溶媒はまた、反応に際し競合することによりアルコール類を脱離させる可能性のある求核性物質を含むべきではない。限定ではないが、アセトニトリル、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、アセトン、およびトルエンなど一連の溶媒が本発明のある態様に適切なことが本発明者らにより見いだされた。たとえば、グリセロールはＴＨＦ（＞２０ｇ／Ｌ）およびアセトンまたはアセトニトリル（２０ｇ／Ｌより多量ではない）に可溶性であるが、ＭＴＢＥにはある程度可溶性であるにすぎず（＜１０ｇ／Ｌ）、トルエンには全く可溶性でないことが見いだされた。グルコースは、アセトニトリル、アセトン、ＭＴＢＥまたはＴＨＦには有意には可溶性でなかったが、トルエンには部分的に可溶性であった（＜５ｇ／Ｌ）。１態様において、非水性溶媒はアセトニトリルである。
【００６２】
[0058] 収率は約１％〜約１００％のいずれかの範囲であろう。好ましくは、収率は約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、および約９９％の範囲である。
【００６３】
[0059] 生成物、すなわちアセト酢酸のエステル誘導体を、いずれか既知の方法により反応体から精製することができる。１態様において、反応終了時に、場合により反応混合物をケイソウ土、たとえばＣｅｌｉｔｅ（登録商標）またはそれと同等のものなどにより濾過することができる。場合により、残留物を生成物が可溶性ではないかまたは貧溶性であるにすぎない溶媒、たとえばジクロロメタン（３００ｍＬ）で洗浄することができる。濾液を、場合により生成物と反応体の相対溶解度に応じて水相および／または有機相で抽出することができる。１態様において、濾液を濃縮し、次いで水性媒質、たとえばブラインに再溶解することができる。この水相を揮発性溶媒、たとえば酢酸エチルで抽出することができる。この有機相を場合により乾燥させ（たとえば硫酸ナトリウムで）、濾過および／または濃縮することができる。
【００６４】
[0060] 本発明による方法は、アセトアセテートエステルを製造するための新たな機会を提供する。具体的な用途は、疾患の処置のための栄養化合物の製造である。ただし、本発明方法は栄養化合物の製造に限定されず、他の目的にも使用できる。
【００６５】
[0061] 本発明を多数の本発明の実施例により以下に説明する。本発明は特許請求の範囲にさらに詳細に規定される。
【実施例】
【００６６】
[0062] 以下に本発明を実施例により説明する；それらは説明のために提示するにすぎで、したがって特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を限定すると解すべきではない。下記および他のいずれかの箇所に示すすべての参考文献を本明細書に援用する。
【００６７】
実施例１
[0063] 酵素をスクリーニングするために、グリセロールアセトアセテートと出発物質であるグリセロールおよびエチルまたはメチルアセトアセテートとを分離するのに適切なＴＬＣ条件を用いた。シリカを１００％イソプロピルアルコール中で展開し、ＫＭｎＯ４で染色し、および／またはＵＶにより分析した。移動度は下記のとおりであった：
メチルアセトアセテート（ＭＡＡ） Ｒｆ 約０．７５
エチルアセトアセテート（ＥＡＡ） Ｒｆ 約０．７５
グリセロール（Ｇ） Ｒｆ 約０．５
グリセロールアセトアセテート（ＧＡＡ） Ｒｆ 約０．６。
【００６８】
実施例２
[0064] リパーゼおよびエステラーゼ触媒作用によるエステル交換を試験するために、無水条件を採用して、エステル出発物質が酵素触媒作用により加水分解されてアセトアセテートを生成するのを避けた。反応を実施するのに用いる有機溶媒の評価に際して、グリセロール、メチルアセトアセテート、エチルアセトアセテート、およびグルコースを溶解する溶媒の使用により、物質移動制限を避けることが重要である。この溶媒はまた、反応に際し競合することによりアルコール類を脱離させる可能性のある求核性物質を含むべきではない。アセトニトリル、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、アセトン、およびトルエンが基質を溶解する能力を試験した。アセトアセテートエステルは試験したすべての溶媒にきわめて可溶性であった。グリセロールはＴＨＦ（＞２０ｇ／Ｌ）およびアセトンもしくはアセトニトリル（２０ｇ／Ｌより多量ではない）に可溶性であったが、ＭＴＢＥにはある程度可溶性であるにすぎず（＜１０ｇ／Ｌ）、トルエンには全く可溶性でなかった。グルコースは、アセトニトリル、アセトン、ＭＴＢＥまたはＴＨＦには有意には可溶性でなかっが、トルエンには部分的に可溶性であった（＜５ｇ／Ｌ）。
【００６９】
[0065] 有機溶媒中における酵素活性：
[0066] 溶解度データに基づいて、アセトニトリルおよびＴＨＦを酵素活性分析のために選択した。どの溶媒をスクリーニングに使用するかを判定するために、エステラーゼおよびリパーゼの部分ライブラリー（表１）の酵素活性を、比色測定試薬４−ニトロフェニルブチレートを用いて試験した。１％の４−ニトロフェニルブチレート溶液をＴＨＦおよびアセトニトリル（加水分解を促進するために、それぞれ１％の水を含有する）中に調製し、５０μＬアリコートを室温で１〜２ｍｇのランダムに選択した１０種類の酵素と共にインキュベートした。２時間後、５０μＬのｐＨ９．０ Ｔｒｉｓを反応に添加し、放出されたパラ−ニトロフェノールのため発色した黄色を比較した。全体的な傾向はすべての酵素がこの反応条件下で加水分解を示したことであったが、アセトニトリル中ではより強い黄色によって視覚化されるように、反応が一般にさらに大幅に進行した。
【００７０】
実施例３ グリセロール酵素スクリーニング
[0067] モノアセトアセチンの合成にどの酵素が有用であるかを判定するために、グリセロール４ｇをメチルアセトアセテート２ｇと混合し、１５０ｍＬのアセトニトリルに５０ｍＬのＭＴＢＥを添加したものに溶解し、次いで減圧下で蒸発させてアセトニトリルおよびグリセロール中の残留水を除去した。混合物の最終体積は１００ｍＬであった。水を除去した後、少量（約０．５ｇ）のグリセロールが溶液から分離したが、大部分は溶解したままであった。約１ｍｇの各酵素を０．５ｍＬポリプロピレン製試験管に入れ、１００μＬの調製基質ミックスを各試験管に添加し、ボルテックス撹拌し、次いで３７℃でロータリーシェーカーにより２００ｒｐｍにおいてインキュベートした。
【００７１】
[0068] ２４時間目に試料をＴＬＣにより分析した。図１を参照。陽性対照を黒丸でマークし、黄色の矢印は陽性ヒットを指し示す。酵素＃１２｛カンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼ）は、標準品グリセロールアセトアセテートと同じＲｆをもつ有意量の生成物を産生した。図１に示す他の被験酵素であってエステル交換を達成できなかったものには、下記が含まれる：ムコール・ミエイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｉ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）、シュードモナス・フルオレスセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｏａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、リゾプス・アリズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕｓ）、カンジダ・シリンドラシエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）、ブタ膵臓、およびリゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）に由来するリパーゼ、ならびにバチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・テルモグルコシダシウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）、カンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ムコール・ミエイ、ウマ肝臓、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｅａ）、ブタ肝臓に由来するエステラーゼ、およびＴＨＥＲＭＯＣＡＴ Ｅｓｔｅｒａｓｅ類。
【００７２】
[0069] ９６時間のインキュベーション後（図２）、数種類の他の酵素がＧＡＡと一致するＲｆをもつ検出可能な量の生成物を産生することができた。これらの酵素は、テルモアネロビウム・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｂｒｏｃｋｉｉ）エステラーゼ、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）リパーゼ、およびＴｈｅｒｍｏＣａｔ Ｅｓｔｅｒａｓｅ ＃２０であり、それぞれ列１１、１３および２７にみられる。
【００７３】
実施例４ グルコース酵素スクリーニング
[0070] 無水グルコース８ｍｇを０．５ｍＬ試験管（４０）に１〜２ｍｇの各酵素と共に入れる。３３ｍＬの無水アセトニトリルに０．８２５ｍｌ（０．２ｍｏｌ）のメチルアセトアセテートを添加し、これから１００μＬを、酵素およびグルコースを入れた各試験管に添加する。試験管を次いで３７℃および２００ｒｐｍでインキュベートする。試料をＴＬＣにより２４、７２および１４４時間目に分析する。１種類以上の酵素がグルコースアセトアセテートエステルを産生することが見いだされ、これには（カンジダ・アンタルクチカリパーゼ）、テルモアネロビウム・ブロッキイエステラーゼ、アスペルギルス属リパーゼ、およびＴｈｅｒｍｏＣａｔ Ｅｓｔｅｒａｓｅ ＃２０が含まれる。
【００７４】
実施例５ モノアセトアセチンの合成
[0071] モノアセトアセチンの合成を、下記に概説する無水環境でグリセロール、メチルアセトアセテートおよびリパーゼを混和する一般的なスキームにより行なった。
【００７５】
【表２】
【００７６】
[0072] Ｓｉｇｍａ− Ａｌｄｒｉｃｈから入手したグリセロール（１０．０５ｇ，１０９．２ｍｍｏｌ）を２５０ｍＬ丸底フラスコ中へ秤量し、アセトニトリル（２×５０ｍＬ）と共蒸発させる。メチルアセトアセテート（４．３０ｇ，３７．０３ｍｍｏｌ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。カンジダ・アンタルクチカのリパーゼＢ（２．００ｇ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手）および撹拌バーをフラスコに添加し、これを隔膜でシールし、アルゴンでフラッシする。フラスコにアセトニトリル（１００ｍＬ）を装入し、アルゴン下に４０℃で５日間、撹拌する。反応混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）により濾過し、残留物をジクロロメタン（３００ｍＬ）で洗浄する。濾液を濃縮し、ブライン（１００ｍＬ）に再溶解する。水相を酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出する。有機相を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過および濃縮して２．３０ｇ（３５．３％）の透明な無色の油を得た。ＴＬＣにより単一生成物の存在が明らかである（ＴＬＣ，ヘキサン中の４０％アセトン，ＰＭＡ視覚化）。
【技術分野】
【０００１】
[0001] 本発明は、摂取した際にアセトアセテートの供給源として有用な可食アセトアセテートエステルおよび誘導体の合成に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002] １９７９年、Ｂｉｒｋｈａｈｎら((Birkhahn, McMenamy et al. 1979))は、彼らがモノアセトアセチン（ｍｏｎｏａｃｅｔｏａｃｅｔｉｎ）（ＭＡ）と呼んだアセトアセテートのモノグリセリドの合成を記載した。その目標は、敗血症または外傷を受けた対象のためにカルニチンに依存しない熱源を提供する基質を同定することであった。その著者らは、外傷および敗血症の患者の所見に基づいて、そのような化合物を要望する幾つかの理由を挙げた。
【０００３】
[0003] モノアセトアセチンは、幾つかの理由で外傷および敗血症の非経口処置のための有望な化合物として提唱された：たとえば、モノアセトアセチンは水溶性であり乳化の必要がない、代謝されて安全な天然化合物グリセロールとアセトアセテートになる、およびモノアセトアセチンの注入はナトリウム陽イオンを必要としないのでナトリウム負荷を増大させることなく投与できる。ケトン体の直接注入にはナトリウム陽イオンが必要であろう。
【０００４】
[0004] ＢｉｒｋｈａｈｎらはＭＡの合成を記載している。ＭＡは、１：１のモル比のグリセロールとジケテンを混和して８０℃で反応させることにより合成された。反応物を３０分間撹拌し、生成物をクロロホルムに溶解し、水で洗浄し、真空下で溶媒から分離した{Birkhahn, 1978 #412}。
【０００５】
[0005] Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，４２０，３３５、タイトル“水溶性グリセロールビスアセトアセテートをベースとする非経口栄養”は、グリセロールのＯＨ基にエステル化された２個のアセトアセテートを含むグリセロールからなる新規な非経口栄養組成物に関する。この特許は、ジケテンとグリセロールをジメチルアミノピリジン溶液中で混合する方法によるグリセロールビスアセトアセテートの合成方法を教示する。
【０００６】
[0006] ＵＳ ｐａｔｅｎｔ ５，６９３，８５０、タイトル“ヒドロキシ酪酸の栄養性水溶性グリセロールエステル”は、１９９７年１２月２日に交付された。この特許には、非経口栄養として有用な水溶性グリセロールエステルを製造するための方法が記載されている。
【０００７】
[0007] Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００６／０２８０７２１は、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート誘導体を含有する組成物、ならびにそれらの化合物をＡＤおよび類似の状態に使用することに関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，４２０，３３５
【特許文献２】ＵＳ ｐａｔｅｎｔ ５，６９３，８５０
【特許文献３】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００６／０２８０７２１
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Birkhahn, McMenamy et al. 1979
【非特許文献２】Birkhahn, 1978 #412
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
[0008] 先行技術に記載された合成方法は、危険な化合物、たとえば爆発の危険性があるジケテンを用いる必要がある。さらに、多くの有機溶媒は有毒であり、したがって医薬製剤または栄養製品中の有機溶媒の混入は重大な問題になる可能性がある。したがって、医薬製剤または栄養製品は溶媒の混入がないことを確実にすることが重要であり、これはさらに複雑さおよび経費を付加する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
[0009] 本発明は、アセトアセテートのエステルが本明細書に記載する酵素を用いて安全かつ効果的な方法で合成できるという新規な洞察を提示する。特に、グリセロールのモノアセトアセテートをこの方法で合成することができる。モノアセトアセチンは身体の細胞へのケトン体の利用を増大させる療法用化合物であり、このケトン体の増加はアルツハイマー病およびグルコース利用低下に関連する他の神経変性疾患に有益であろう。したがって、本発明に述べる化合物を用いてアルツハイマー病およびグルコース代謝低下に関連する他の神経変性疾患の治療法および予防法を開発できることが分かる。本発明は、それらの化合物を効果的な新規様式で合成する方法を記載する。
【００１２】
[0010] １態様において、本発明はアセトアセテートのエステル誘導体を合成するための方法を含む。この方法は、式Ｉを有するアセトアセテートの第１エステル：
【００１３】
【化１】
【００１４】
[0011] （式中、Ｒ１はアルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン化アルキル、シクロアルキル、脂肪族、アリール、またはアラルキル基のいずれかである）を供給し、かつアルコール類を供給することを含む。この方法はさらに、アセトアセテートの第１エステルと該アルコールを、非水性溶媒中においてエステル交換してアセトアセテートのエステル誘導体を形成することができる酵素の存在下で混和することを含む。この方法により、アセトアセテートのエステル誘導体が形成される。
【００１５】
[0012] １態様において、アセトアセテートのエステル誘導体はアセトアセテートのモノグリセリドである。他の態様において、アセトアセテートの第１エステルはメチルアセトアセテートである。他の態様において、酵素はリパーゼまたはエステラーゼである。
【００１６】
[0013] １態様において、酵素は、カンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼ、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）リパーゼ、テルモアネロビウム・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｂｒｏｃｋｉｉ）エステラーゼ、およびＥｓｔｅｒａｓｅ Ｅ０２０からなる群から選択される。
【００１７】
[0014] １態様において、非水性溶媒はアセトニトリル、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、アセトン、およびトルエンからなる群から選択される。１態様において、非水性溶媒はアセトニトリルである。
【００１８】
[0015] １態様において、本発明方法はさらに、アセトアセテートのエステル誘導体の精製を含む。
【００１９】
[0016] １態様において、アルコール類はポリオールである。他の態様において、ポリオールはグリセロールまたはグルコースである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】[0017] 図１は、生成物ＭＡの形成を示す、種々の酵素の２４時間インキュベーションの薄層クロマトグラフを示す。
【図２】[0018] 図２は、生成物ＭＡの形成を示す、種々の酵素の９６時間インキュベーションの薄層クロマトグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
[0019] 本発明は、アセトアセテートのエステルを本明細書に記載する酵素によって安全かつ効果的に合成できる、きわめて簡便な合成を提供する。特に、グリセロールのモノアセトアセテート（本明細書中でモノアセトアセチンとも記載する）をこの方法により合成できる。本発明は、アセトアセテート誘導体の合成方法に関する。この方法は特にアセトアセテートのモノグリセリドの合成に適するが、いかなるアセトアセテートエステル誘導体の合成にも使用できる。この方法により合成した化合物は、ケトン体の増加を目的とする多様な療法組成物中に使用できる。そのような状態の例には、敗血症、外傷、神経変性障害、たとえばパーキンソン病およびアルツハイマー病、ならびに当技術分野で知られている他の多数の疾患が含まれる。
【００２２】
[0020] 本発明は、いずれかのアセトアセテート誘導体、好ましくはモノアセトアセチンの簡単な合成方法であって、これまでに記載された合成方法に伴う欠点が避けられる方法に関する。本発明方法により製造される好ましいアセトアセテート誘導体はモノアセトアセチンである。ただし、本発明方法はいかなるアセトアセテート誘導体にも、特に療法用組成物のための栄養性化合物の製造にも適用できる。
【００２３】
[0021] １態様において、これらの化合物は、血清ケトン体を増加させることが望ましい多様な障害を治療または予防するために用いられる。好ましくは、障害はアルツハイマー病またはパーキンソン病である。
【００２４】
[0022] 本発明はアセトアセテートのエステルおよび／またはエステル誘導体を合成するための方法を含み、この方法は式Ｉを有するアセトアセテートの第１エステル：
【００２５】
【化２】
【００２６】
（式中、Ｒ１はアルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン化アルキル、シクロアルキル、脂肪族、アリール、またはアラルキル基のいずれかである）を供給し；アルコール類を供給し；そしてアセトアセテートの第１エステルと該アルコールを、非水性溶媒中においてエステル交換してアセトアセテートのエステル誘導体を形成することができる酵素の存在下で混和することを含み、その際、エステル交換が起きてアセトアセテートのエステルおよび／またはエステル誘導体が生成する。１態様において、エステル交換できる酵素は、エステル交換して目的生成物、たとえばアセトアセテートのエステル誘導体にすることができる。他の態様において、この方法はアセトアセテートの第１エステルと該アルコールを、非水性溶媒中においてエステル交換してアセトアセテートのエステル誘導体を形成することができる酵素の存在下で混和することを含む。この方法により、アセトアセテートのエステル誘導体が形成される。
【００２７】
[0023] １態様において、本発明は、アセトアセテートのエステルとアルコール類を水性環境で混和することから出発する、いずれかのケトン体誘導体の一般的な合成方法を提供し、この方法は下記の工程を含む：ａ）アセトアセテートの第１エステルおよびモノ−またはポリアルコールを無水溶液に添加する；ｂ）リパーゼまたはエステラーゼを添加する；ならびにｃ）反応生成物を精製する。モノアセトアセチンを製造するためには、メチルアセトアセテート、グリセロール、および好ましくはカンジダ・アンタルクチカリパーゼから出発することが好ましい。１態様において、反応工程ｂ）は有機溶媒、たとえばアセトニトリルの存在下で行われる。
【００２８】
[0024] “誘導体”は、親化合物から誘導されるかまたは理論的に誘導できる化合物または化合物の一部を表わす。
【００２９】
[0025] 用語“ヒドロキシル基”は、式−ＯＨにより表わされる。
【００３０】
[0026] 用語“アルコキシ基”は、式−ＯＲにより表わされ、ここでＲはアルキル基であってもよく、これには低級アルキル基が含まれ、これらは場合により、後記に定義するアルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、ハロゲン化アルキル、またはヘテロシクロアルキル基で置換されている。
【００３１】
[0027] 用語“エステル”は、式−ＯＣ（Ｏ）Ｒにより表わされ、ここでＲは後記に定義するアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、ハロゲン化アルキル、またはヘテロシクロアルキル基であってもよい。“エステル交換”は、エステルとアルコール類が反応して新たなエステル化合物を形成することを表わす。１態様において、アセトアセテートの第１エステル（たとえばメチルアセトアセテート）は、目的とする新たなエステル（たとえばモノアセトアセチン）の形成を促進するように選択される。
【００３２】
[0028] 用語アルコールは、広範なクラスのヒドロキシル含有有機化合物を表わし、下記のものを含む：１個のヒドロキシル基を含む脂肪族、脂環式、芳香族、複素環式および多環式の一価アルコール；２個のヒドロキシル基を含む脂肪族、脂環式、芳香族、複素環式および多環式の二価アルコール：グリコール類およびジオール類を含む；３個のヒドロキシル基を含む脂肪族、脂環式、芳香族、複素環式および多環式の三価アルコール：グリセロールおよび誘導体を含む；３個以上のヒドロキシル基を含む脂肪族、脂環式、芳香族、複素環式および多環式の多価アルコール：糖類、多糖類および糖アルコール類を含む。
【００３３】
[0029] １態様において、アルコール類はポリオールである。既知のポリオールは下記を含む化合物である：２〜２０個の炭素原子をもつ二価アルコール（脂肪族ジオール、たとえばアルキレングリコール、たとえばエチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−または１，４−ブタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、およびネオペンチルグリコール；ならびに脂環式ジオール、たとえばシクロアルキレングリコール、たとえばシクロヘキサンジオールおよびシクロヘキサンジメタノール）；３〜２０個の炭素原子をもつ三価アルコール（脂肪族トリオール、たとえばアルカントリオール、たとえばグリセロール、トリメチロールプロパン、トリメチロールエタン、およびヘキサントリオール、ならびにトリエタノールアミン）；４〜８個のヒドロキシル基および５〜２０個の炭素原子をもつ多価アルコール（脂肪族ポリオール、たとえばアルカンポリオール、およびそれらの分子内または分子間脱水生成物、たとえばペンタエリトリトール、ソルビトール、マンニトール、ソルビタン、ジグリセロール、およびジペンタエリトリトール；ならびに糖類およびそれらの誘導体、たとえばショ糖、グルコース、マンノース、フルクトース、およびメチルグルコシド）。
【００３４】
[0030] 本発明の目的に有用なポリアルコールには、少なくとも２個、より好ましくは少なくとも３個、よりさらに好ましくは３から１０個まで、最も好ましくは３から６個まで、特に好ましくは３から４個までのヒドロキシル（−ＯＨ）官能基をもつ化合物が含まれる。ポリアルコールは、脂肪族、脂環式、または芳香族、好ましくは脂肪族または脂環式、最も好ましくは直鎖または分枝鎖の脂肪族であってもよく、場合により官能基で置換されている。ポリアルコールは一般に２〜５０個、好ましくは３〜４０個の炭素原子をもつ。１態様において、多価アルコールはより高い密度のアセトアセテート均等物を供給できるが、多価アルコールは１個のヒドロキシル基においてのみ誘導体化されるであろう；ただし、１個より多いヒドロキシル基における誘導体化も許容できる。
【００３５】
[0031] １態様において、ポリアルコールは可食ポリオール、たとえばグリセロールまたは置換グリセロールおよび糖類である。可食ポリオールは、ある態様において１種類以上のポリオール、たとえば下記のものからなる群から選択される炭水化物アルコールである：キシリトール、イジトール、マルチトール、ソルビトール、マンニトール、ズルシトール、イノシトール、エリトリトール、ラクチトール、グリセリン、ＵＳＰグリセリン、食品グレードのグリセリン、リビトール、トレイトール、およびプロピレングリコール。選択したポリオール（単数または複数）は同等に作用し、ポリオール、ポリオール組合わせ、またはポリオール溶液に応じて、用いる濃度の変更ならびに加熱および混合の時間の変更により制限されるにすぎない。
【００３６】
[0032] 他の態様において、アルコール類は糖類または多糖類である。糖類または多糖類は当技術分野で既知のいずれであってもよく、例示リストには単糖類、たとえばフルクトースおよびグルコース；二糖類、たとえばショ糖、マルトース、セロビオース、および乳糖、またはより複雑な糖類、たとえばガラクトース、ソルボース、キシロース、アリノース、およびマンノースが含まれる。さらに他の炭水化物には、アルトロース、アラビノース、デキストロース、エリスロース、グルコース、イドース、リキソース、マンノース、リボース、タロース、トレオースなどが含まれる。
【００３７】
[0033] 用語“アルキル基”は、炭素原子１〜２４個の分枝鎖または非分枝鎖飽和炭化水素基と定義され、たとえばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなどである。“低級アルキル基”は、１〜１０個の炭素原子をもつ飽和分枝鎖または非分枝鎖炭化水素である。１態様において、アルキル基は１〜６個の炭素原子をもつ。１態様において、アルキル基はメチルである。
【００３８】
[0034] 用語“アルケニル基”は、２〜２４個の炭素原子および少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む構造式をもつ炭化水素基と定義される。１態様において、アルケニル基は１〜６個の炭素原子をもつ。
【００３９】
[0035] 用語“アルキニル基”は、２〜２４個の炭素原子および少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む構造式をもつ炭化水素基と定義される。１態様において、アルキニル基は１〜６個の炭素原子をもつ。
【００４０】
[0036] 用語“ハロゲン化アルキル基”は、前記に定義したアルキル基において、これらの基上の１個以上の水素原子がハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）で置換されたものと定義される。
【００４１】
[0037] 用語“シクロアルキル基”は、少なくとも３個の炭素原子から構成される非芳香族炭素環と定義される。シクロアルキル基の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが含まれるが、これらに限定されない。用語“ヘテロシクロアルキル基”は、上記のシクロアルキル基において、環の少なくとも１個の炭素原子がヘテロ原子、たとえば窒素、酸素、硫黄またはリン（これらに限定されない）で置換されたものである。１態様において、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル基は３〜１０個の炭素原子、他の態様においては５〜７個の炭素原子をもつ。
【００４２】
[0038] 用語“脂肪族基”は、前記に定義したアルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン化アルキルおよびシクロアルキル基を含むものと定義される。“低級脂肪族基”は、１から１０個までの炭素原子を含む脂肪族基である。１態様において、脂肪族基は１〜６個の炭素原子をもつ。
【００４３】
[0039] 用語“アリール基”は、炭素をベースとするいずれかの芳香族基と定義され、ベンゼン、ナフタレンなどが含まれるが、これらに限定されない。用語“芳香族”には“ヘテロアリール基”も含まれ、これは芳香族基の環内に取込まれた少なくとも１個のヘテロ原子をもつ芳香族基と定義される。ヘテロ原子の例には窒素、酸素、硫黄およびリンが含まれるが、これらに限定されない。アリール基は１個以上の基で置換されていてもよく、これにはアルキル、アルキニル、アルケニル、アリール、ハロゲン化物、ニトロ、アミノ、エステル、ケトン、アルデヒド、ヒドロキシ、カルボン酸、またはアルコキシが含まれるが、これらに限定されない；あるいは、アリール基は置換されていなくてもよい。１態様において、アリール基は３〜１０個の炭素原子をもつ；他の態様においては５〜７個の炭素原子をもつ。
【００４４】
[0040] 用語“アラルキル”は、アリール基に結合した前記に定義したアルキル基をもつアリール基と定義される。アラルキル基の一例はベンジル基である。
【００４５】
[0041] “エステル化”は、アルコール類とカルボン酸またはカルボン酸誘導体が反応してエステルを生成することを表わす。“エステル交換”は、エステルとアルコール類が反応して新たなエステル化合物を形成することを表わす。
【００４６】
[0042] 疾患または障害の“処置”は、疾患もしくは病的状態の徴候もしくは症状を軽減するか、または疾患が発症、進行もしくは完全に発達するのを阻止する、療法介入を表わす。
【００４７】
[0043] 用語“３−ヒドロキシブチレート”は用語“３−ヒドロキシ酪酸”と互換性をもって用いられる。用語“β−ヒドロキシブチレート”または“β−ヒドロキシ酪酸”もこの化合物を表わすために使用できる。
【００４８】
[0044] １態様において、エステル交換後に形成されたアセトアセテートエステル、すなわちアセトアセテートのエステル誘導体は、アセトアセテートのモノグリセリドである。この態様において、第１または出発アセトアセテートエステルはメチルアセトアセテートである。他の多数のエステル誘導体をこの方法で形成することができ、これにはたとえばポリオール、糖類、および糖アルコールのアセトアセテートエステル、たとえばグリセロール、グルコース、ショ糖、ガラクトース、マンニトール、および１，３−ブタンジオールのアセトアセテートエステルが含まれる。前記に述べたように、ある態様には出発アルコール類の１個のヒドロキシルにおける、ある態様には２個のヒドロキシルにおける、ある態様には３個のヒドロキシルにおける、ある態様には４個のヒドロキシルにおける、ある態様には５個のヒドロキシルにおける、ある態様には６個のヒドロキシルにおける、ある態様には７個またはそれより多くのヒドロキシルにおけるエステル化が含まれる。開示する例示化合物を下記の表１に示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
[0046] １態様において、エステル交換して目的とするアセトアセテートのエステル誘導体、たとえばグリセロールのモノアセトアセテートを形成することができる酵素の存在下で、混和を行なう。多数の種のいずれか、特に細菌および酵母の種に由来する多数の酵素、たとえばリパーゼまたはエステラーゼがエステル交換を行なうことができる。リパーゼおよびエステラーゼはエステル結合の加水分解を触媒してアルコール類とカルボン酸を生成し、異なる基質特異性、Ｒ基の長さ、または鎖長嗜好性、および独自の阻害因子をもつ。水性溶媒系中で、エステラーゼおよびリパーゼはそれらの自然な反応、たとえばエステル結合の加水分解を行なう。水を排除した有機溶媒中では、エステラーゼおよびリパーゼの反応は逆行する場合があり、エステル結合を形成するエステル化またはアシル化反応、すなわちエステル交換を触媒することが知られている。
【００５１】
[0047] そのような酵素は多数の業者のいずれかから入手でき、あるいは当技術分野で既知の技術を用いて独自に精製することができる。候補酵素、たとえばリパーゼまたはエステラーゼがエステル交換してアセトアセテートのエステル誘導体を形成できるかどうかを判定するために、候補酵素を適切な条件下で（たとえば目的とする反応条件下で反応体を用いて）試験して、目的とするエステル交換された生成物が形成されるかどうかを判定することができる。
【００５２】
[0048] このエステル交換工程により、第１エステル化合物、たとえば殊に式Ｉの出発エステルと、アルコール類のヒドロキシル基との間にエステル結合が得られる。このエステル結合反応を触媒することができる酵素はいずれも使用するのに適切である。この反応には、不活性有機担体上に固定化された酵素を用いるのが有利であり、これにより酵素を反応媒質から容易に分離して次いでリサイクルすることができる。好ましくは、酵素をマクロ多孔質樹脂に吸着させる。
【００５３】
[0049] 意外にも、リパーゼ活性をもつことが知られている多数の酵素が本発明に有用なエステル交換を達成できなかった。エステル交換を達成できなかったリパーゼには、ムコール・ミエイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｉ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）、シュードモナス・フルオレスセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｏａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、リゾプス・アリズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕｓ）、カンジダ・シリンドラシエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）、ブタ膵臓、およびリゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）に由来するリパーゼが含まれる。意外にも、エステラーゼ活性をもつことが知られている多数の酵素が本発明に有用なエステル交換を達成できなかった。エステル交換を達成できなかったエステラーゼには、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・テルモグルコシダシウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）、カンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ムコール・ミエイ、ウマ肝臓、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｅａ）、ブタ肝臓に由来するエステラーゼ、およびＴＨＥＲＭＯＣＡＴ Ｅｓｔｅｒａｓｅ類（Ｅ０ｌ、Ｅ０３、Ｅ０４、Ｅ０６、Ｅ０８、Ｅ０９、Ｅ０２９、Ｎｌ、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、Ｎｌ０およびＥ０１７ｂとしても知られる）が含まれる。ＴＨＥＲＭＯＣＡＴファミリーのエステラーゼは、たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，２１８，１６７、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，９６９，１２１、およびＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，２１８，１６３において同定され、それらのそれぞれを全体として本明細書に援用する。
【００５４】
[0050] 意外にも、試験した酵素のうち数種類のみが必要なエステル交換を達成できた；すなわち、アセトアセテートのエステル誘導体を形成することができた。１態様において、酵素は下記の酵素のいずれかであってよい：カンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢ、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）リパーゼ、テルモアネロビウム・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｂｒｏｃｋｉｉ）エステラーゼ、およびＴＨＥＲＭＯＣＡＴ Ｅｓｔｅｒａｓｅ ２０（Ｅ０２０）。上記酵素のいずれかの組合わせも含まれる。いかなる供給源からのカンジダ・アンタルクチカのリパーゼＢも使用に適切である；１態様において、供給源はＳｉｇｍａ− Ａｌｄｒｉｃｈ、カンジダ・アンタルクチカのリパーゼＢ（アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）において発現）を不活性担体上に固定化したもの、またはＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ｓ．Ａ．社が商品名Ｎｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５で市販しているものである。この酵素は熱安定性であり、４０〜６０℃で最適活性を示す。それはグラム当たり１０プロピルラウレート単位のエステル化活性をもつと説明されている。アスペルギルス属リパーゼは、たとえばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手でき、約０．５単位／ｍｇで供給され、１ＵがｐＨ７．４および４０℃で毎分１μモルの酢酸を加水分解する酵素量に相当する活性をもつ（トリアセチン、Ｆｌｕｋａ Ｎｏ．９０２４０を基質として）。いかなる供給源からのテルモアネロビウム・ブロッキイ由来のエステラーゼも使用するのに適切である；１態様において、供給源はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、約２Ｕ／ｇであり、その際、１単位は２５℃で１μモルの吉草酸エチルを加水分解する量の酵素であると記載されている。ＴＨＥＲＭＯＣＡＴ ２０は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，２１８，１６７、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，９６９，１２１、およびＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，２１８，１６３において同定されたエステラーゼのファミリーの一部であり、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，２１８，１６７においてエステラーゼＥ０２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２９および３０によっても同定される。
【００５５】
[0051] 酵素の適量は当業者が決定できる。１態様において、２ｇのメチルアセトアセテートおよび４ｇのグリセロール当たり、約１ミリグラム（ｍｇ）の各酵素を使用する。
【００５６】
[0052] 本発明は、リパーゼおよび／またはエステラーゼ触媒作用によるエステル交換を利用する。そのようなエステル交換は、当技術分野で既知のいずれかの条件下で実施できる。出発物質が酵素触媒作用により加水分解されてアセトアセテートを生成するのを避ける条件を選択する。１態様において、この反応は少なくとも１種類の非水性溶媒の存在下で実施される。他の態様において、この反応は無水条件下で実施される。
【００５７】
[0053] 式Ｉのエステルとアルコール類の混合は、多数の化学量論的比率で行なうことができる。広範な化学量論的量が機能することに注目する；たとえば式Ｉのエステル：アルコールの単位について約１：０．１ないし式Ｉのエステル：アルコールの単位について約１：５０。特定の反応についての厳密な化学量論的量は当業者がルーティンな実験活動に基づいて選択できる。１態様において、モノアセトアセチンの合成のためにアルコール３単位に対して式Ｉのエステル１当量の比率を採用できる。
【００５８】
[0054] この反応は使用する酵素に最適な温度を含む温度で実施できるが、エステル交換反応が優先しかつより多量の生成物を生成する温度が好ましい点を留意して、酵素が作動するいかなる温度でも実施できる。酵素の使用量も、反応が適切な速度で進行するのに十分な酵素を供給するという方針に従って当業者が決定できる。
【００５９】
[0055] この反応は、大気圧下で、または減圧もしくは加圧下で実施できる。
【００６０】
[0056] 生成物の最大収率に達するために、反応を少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも８４時間、少なくとも９６時間、さらにそれより長く、たとえば最高１４４時間、実施する。
【００６１】
[0057] １態様においては、反応を少なくとも１種類の有機溶媒の存在下で実施する。１態様においては、物質移動の制限を避けるために、出発物質を溶解しうる溶媒が望ましい。たとえば、モノアセトアセチンを得るためには、その溶媒にグリセロール、メチルアセトアセテート、エチルアセトアセテート、およびグルコースが溶解することが望ましい。この溶媒はまた、反応に際し競合することによりアルコール類を脱離させる可能性のある求核性物質を含むべきではない。限定ではないが、アセトニトリル、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、アセトン、およびトルエンなど一連の溶媒が本発明のある態様に適切なことが本発明者らにより見いだされた。たとえば、グリセロールはＴＨＦ（＞２０ｇ／Ｌ）およびアセトンまたはアセトニトリル（２０ｇ／Ｌより多量ではない）に可溶性であるが、ＭＴＢＥにはある程度可溶性であるにすぎず（＜１０ｇ／Ｌ）、トルエンには全く可溶性でないことが見いだされた。グルコースは、アセトニトリル、アセトン、ＭＴＢＥまたはＴＨＦには有意には可溶性でなかったが、トルエンには部分的に可溶性であった（＜５ｇ／Ｌ）。１態様において、非水性溶媒はアセトニトリルである。
【００６２】
[0058] 収率は約１％〜約１００％のいずれかの範囲であろう。好ましくは、収率は約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、および約９９％の範囲である。
【００６３】
[0059] 生成物、すなわちアセト酢酸のエステル誘導体を、いずれか既知の方法により反応体から精製することができる。１態様において、反応終了時に、場合により反応混合物をケイソウ土、たとえばＣｅｌｉｔｅ（登録商標）またはそれと同等のものなどにより濾過することができる。場合により、残留物を生成物が可溶性ではないかまたは貧溶性であるにすぎない溶媒、たとえばジクロロメタン（３００ｍＬ）で洗浄することができる。濾液を、場合により生成物と反応体の相対溶解度に応じて水相および／または有機相で抽出することができる。１態様において、濾液を濃縮し、次いで水性媒質、たとえばブラインに再溶解することができる。この水相を揮発性溶媒、たとえば酢酸エチルで抽出することができる。この有機相を場合により乾燥させ（たとえば硫酸ナトリウムで）、濾過および／または濃縮することができる。
【００６４】
[0060] 本発明による方法は、アセトアセテートエステルを製造するための新たな機会を提供する。具体的な用途は、疾患の処置のための栄養化合物の製造である。ただし、本発明方法は栄養化合物の製造に限定されず、他の目的にも使用できる。
【００６５】
[0061] 本発明を多数の本発明の実施例により以下に説明する。本発明は特許請求の範囲にさらに詳細に規定される。
【実施例】
【００６６】
[0062] 以下に本発明を実施例により説明する；それらは説明のために提示するにすぎで、したがって特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を限定すると解すべきではない。下記および他のいずれかの箇所に示すすべての参考文献を本明細書に援用する。
【００６７】
実施例１
[0063] 酵素をスクリーニングするために、グリセロールアセトアセテートと出発物質であるグリセロールおよびエチルまたはメチルアセトアセテートとを分離するのに適切なＴＬＣ条件を用いた。シリカを１００％イソプロピルアルコール中で展開し、ＫＭｎＯ４で染色し、および／またはＵＶにより分析した。移動度は下記のとおりであった：
メチルアセトアセテート（ＭＡＡ） Ｒｆ 約０．７５
エチルアセトアセテート（ＥＡＡ） Ｒｆ 約０．７５
グリセロール（Ｇ） Ｒｆ 約０．５
グリセロールアセトアセテート（ＧＡＡ） Ｒｆ 約０．６。
【００６８】
実施例２
[0064] リパーゼおよびエステラーゼ触媒作用によるエステル交換を試験するために、無水条件を採用して、エステル出発物質が酵素触媒作用により加水分解されてアセトアセテートを生成するのを避けた。反応を実施するのに用いる有機溶媒の評価に際して、グリセロール、メチルアセトアセテート、エチルアセトアセテート、およびグルコースを溶解する溶媒の使用により、物質移動制限を避けることが重要である。この溶媒はまた、反応に際し競合することによりアルコール類を脱離させる可能性のある求核性物質を含むべきではない。アセトニトリル、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、アセトン、およびトルエンが基質を溶解する能力を試験した。アセトアセテートエステルは試験したすべての溶媒にきわめて可溶性であった。グリセロールはＴＨＦ（＞２０ｇ／Ｌ）およびアセトンもしくはアセトニトリル（２０ｇ／Ｌより多量ではない）に可溶性であったが、ＭＴＢＥにはある程度可溶性であるにすぎず（＜１０ｇ／Ｌ）、トルエンには全く可溶性でなかった。グルコースは、アセトニトリル、アセトン、ＭＴＢＥまたはＴＨＦには有意には可溶性でなかっが、トルエンには部分的に可溶性であった（＜５ｇ／Ｌ）。
【００６９】
[0065] 有機溶媒中における酵素活性：
[0066] 溶解度データに基づいて、アセトニトリルおよびＴＨＦを酵素活性分析のために選択した。どの溶媒をスクリーニングに使用するかを判定するために、エステラーゼおよびリパーゼの部分ライブラリー（表１）の酵素活性を、比色測定試薬４−ニトロフェニルブチレートを用いて試験した。１％の４−ニトロフェニルブチレート溶液をＴＨＦおよびアセトニトリル（加水分解を促進するために、それぞれ１％の水を含有する）中に調製し、５０μＬアリコートを室温で１〜２ｍｇのランダムに選択した１０種類の酵素と共にインキュベートした。２時間後、５０μＬのｐＨ９．０ Ｔｒｉｓを反応に添加し、放出されたパラ−ニトロフェノールのため発色した黄色を比較した。全体的な傾向はすべての酵素がこの反応条件下で加水分解を示したことであったが、アセトニトリル中ではより強い黄色によって視覚化されるように、反応が一般にさらに大幅に進行した。
【００７０】
実施例３ グリセロール酵素スクリーニング
[0067] モノアセトアセチンの合成にどの酵素が有用であるかを判定するために、グリセロール４ｇをメチルアセトアセテート２ｇと混合し、１５０ｍＬのアセトニトリルに５０ｍＬのＭＴＢＥを添加したものに溶解し、次いで減圧下で蒸発させてアセトニトリルおよびグリセロール中の残留水を除去した。混合物の最終体積は１００ｍＬであった。水を除去した後、少量（約０．５ｇ）のグリセロールが溶液から分離したが、大部分は溶解したままであった。約１ｍｇの各酵素を０．５ｍＬポリプロピレン製試験管に入れ、１００μＬの調製基質ミックスを各試験管に添加し、ボルテックス撹拌し、次いで３７℃でロータリーシェーカーにより２００ｒｐｍにおいてインキュベートした。
【００７１】
[0068] ２４時間目に試料をＴＬＣにより分析した。図１を参照。陽性対照を黒丸でマークし、黄色の矢印は陽性ヒットを指し示す。酵素＃１２｛カンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼ）は、標準品グリセロールアセトアセテートと同じＲｆをもつ有意量の生成物を産生した。図１に示す他の被験酵素であってエステル交換を達成できなかったものには、下記が含まれる：ムコール・ミエイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｉ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）、シュードモナス・フルオレスセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｏａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、リゾプス・アリズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕｓ）、カンジダ・シリンドラシエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）、ブタ膵臓、およびリゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）に由来するリパーゼ、ならびにバチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・テルモグルコシダシウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）、カンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ムコール・ミエイ、ウマ肝臓、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｅａ）、ブタ肝臓に由来するエステラーゼ、およびＴＨＥＲＭＯＣＡＴ Ｅｓｔｅｒａｓｅ類。
【００７２】
[0069] ９６時間のインキュベーション後（図２）、数種類の他の酵素がＧＡＡと一致するＲｆをもつ検出可能な量の生成物を産生することができた。これらの酵素は、テルモアネロビウム・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｂｒｏｃｋｉｉ）エステラーゼ、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）リパーゼ、およびＴｈｅｒｍｏＣａｔ Ｅｓｔｅｒａｓｅ ＃２０であり、それぞれ列１１、１３および２７にみられる。
【００７３】
実施例４ グルコース酵素スクリーニング
[0070] 無水グルコース８ｍｇを０．５ｍＬ試験管（４０）に１〜２ｍｇの各酵素と共に入れる。３３ｍＬの無水アセトニトリルに０．８２５ｍｌ（０．２ｍｏｌ）のメチルアセトアセテートを添加し、これから１００μＬを、酵素およびグルコースを入れた各試験管に添加する。試験管を次いで３７℃および２００ｒｐｍでインキュベートする。試料をＴＬＣにより２４、７２および１４４時間目に分析する。１種類以上の酵素がグルコースアセトアセテートエステルを産生することが見いだされ、これには（カンジダ・アンタルクチカリパーゼ）、テルモアネロビウム・ブロッキイエステラーゼ、アスペルギルス属リパーゼ、およびＴｈｅｒｍｏＣａｔ Ｅｓｔｅｒａｓｅ ＃２０が含まれる。
【００７４】
実施例５ モノアセトアセチンの合成
[0071] モノアセトアセチンの合成を、下記に概説する無水環境でグリセロール、メチルアセトアセテートおよびリパーゼを混和する一般的なスキームにより行なった。
【００７５】
【表２】
【００７６】
[0072] Ｓｉｇｍａ− Ａｌｄｒｉｃｈから入手したグリセロール（１０．０５ｇ，１０９．２ｍｍｏｌ）を２５０ｍＬ丸底フラスコ中へ秤量し、アセトニトリル（２×５０ｍＬ）と共蒸発させる。メチルアセトアセテート（４．３０ｇ，３７．０３ｍｍｏｌ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。カンジダ・アンタルクチカのリパーゼＢ（２．００ｇ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手）および撹拌バーをフラスコに添加し、これを隔膜でシールし、アルゴンでフラッシする。フラスコにアセトニトリル（１００ｍＬ）を装入し、アルゴン下に４０℃で５日間、撹拌する。反応混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）により濾過し、残留物をジクロロメタン（３００ｍＬ）で洗浄する。濾液を濃縮し、ブライン（１００ｍＬ）に再溶解する。水相を酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出する。有機相を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過および濃縮して２．３０ｇ（３５．３％）の透明な無色の油を得た。ＴＬＣにより単一生成物の存在が明らかである（ＴＬＣ，ヘキサン中の４０％アセトン，ＰＭＡ視覚化）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセトアセテートのエステル誘導体を合成するための方法であって、式Ｉを有するアセトアセテートの第１エステル：
【化１】
（式中、Ｒ１はアルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン化アルキル、シクロアルキル、脂肪族、アリール、またはアラルキル基のいずれかである）を供給し；
アルコール類を供給し；そして
アセトアセテートの第１エステルと該アルコールを、非水性溶媒中においてエステル交換してアセトアセテートのエステル誘導体を形成することができる酵素の存在下で混和し、これによりアセトアセテートのエステル誘導体を形成することを含む方法。
【請求項２】
アセトアセテートのエステル誘導体がアセトアセテートのモノグリセリドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アセトアセテートの第１エステルがメチルアセトアセテートである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
非水性溶媒中においてエステル交換してアセトアセテートのエステル誘導体を形成することができる酵素がリパーゼまたはエステラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
酵素が、カンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼ、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）リパーゼ、テルモアネロビウム・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｂｒｏｃｋｉｉ）エステラーゼ、およびエステラーゼ（Ｅｓｔｅｒａｓｅ）Ｅ０２０からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
非水性溶媒が、アセトニトリル、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、アセトン、およびトルエンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
非水性溶媒がアセトニトリルである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
さらに、アセトアセテートのエステル誘導体の精製を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
アルコールがポリオールである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ポリオールがグリセロールである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
アルコールがグルコースである、請求項９に記載の方法。
【請求項１】
アセトアセテートのエステル誘導体を合成するための方法であって、式Ｉを有するアセトアセテートの第１エステル：
【化１】
（式中、Ｒ１はアルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン化アルキル、シクロアルキル、脂肪族、アリール、またはアラルキル基のいずれかである）を供給し；
アルコール類を供給し；そして
アセトアセテートの第１エステルと該アルコールを、非水性溶媒中においてエステル交換してアセトアセテートのエステル誘導体を形成することができる酵素の存在下で混和し、これによりアセトアセテートのエステル誘導体を形成することを含む方法。
【請求項２】
アセトアセテートのエステル誘導体がアセトアセテートのモノグリセリドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アセトアセテートの第１エステルがメチルアセトアセテートである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
非水性溶媒中においてエステル交換してアセトアセテートのエステル誘導体を形成することができる酵素がリパーゼまたはエステラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
酵素が、カンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼ、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）リパーゼ、テルモアネロビウム・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｂｒｏｃｋｉｉ）エステラーゼ、およびエステラーゼ（Ｅｓｔｅｒａｓｅ）Ｅ０２０からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
非水性溶媒が、アセトニトリル、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、アセトン、およびトルエンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
非水性溶媒がアセトニトリルである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
さらに、アセトアセテートのエステル誘導体の精製を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
アルコールがポリオールである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ポリオールがグリセロールである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
アルコールがグルコースである、請求項９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１１−５２６７９３（Ｐ２０１１−５２６７９３Ａ）
【公表日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１６８８８（Ｐ２０１１−５１６８８８）
【出願日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４９６０５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００３１１０
【国際公開日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【出願人】（５０２３９８１７１）アクセラ・インコーポレーテッド (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４９６０５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００３１１０
【国際公開日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【出願人】（５０２３９８１７１）アクセラ・インコーポレーテッド (8)
【Ｆターム（参考）】
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