アセトフェノンの還元のためのケトレダクターゼポリペプチド
ケトレダクターゼまたはカルボニルレダクターゼクラス（ＥＣ１．１．１．１８４）に属する酵素は、対応するプロ立体異性ケトン基質からの、および対応するラセミアルデヒド基質の立体特異性還元による光学活性アルコールの合成に有用である。本開示は、天然に存在する野生型ケトレダクターゼ酵素と比較して改良された特性を有する、改変ケトレダクターゼ酵素を提供する。改変ケトレダクターゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、改変ケトレダクターゼ酵素を発現できる宿主細胞、および改変ケトレダクターゼ酵素を使用して各種のキラル化合物を合成する方法も提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質を（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールに少なくとも約８５％の立体異性体過剰率で立体選択的に還元することができるケトレダクターゼポリペプチド。
【請求項２】
Ｘ１９０に対応する残基にプロリンを有する配列番号２、４または９８に基づく参照配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼアミノ酸配列がＸ１９０に対応する残基に非芳香族残基を有することを条件とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、Ｘ１９０に対応する残基に脂肪族、非極性、拘束された、またはシステイン残基を有する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、Ｘ１９０に対応する残基にプロリンを有する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ケトレダクターゼが、次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である；
Ｘ１６に対応する残基が、極性残基である；
Ｘ４３に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ６０に対応する残基が、芳香族または非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９５に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ９７に対応する残基が、極性、非極性、脂肪族、または塩基性残基である；
Ｘ１２０に対応する残基が、芳香族、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ１２５に対応する残基が、極性または非極性残基である；
Ｘ１４２に対応する残基が、極性残基、特にセリンまたはアスパラギンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１４９に対応する残基が、非極性または芳香族残基である；
Ｘ１５０に対応する残基が、拘束されたまたは酸性残基である；
Ｘ１５２に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性、または芳香族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である；
Ｘ２０５に対応する残基が、塩基性、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、非極性または芳香族残基である、の１つ以上をさらに有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、トレオニン、プロリン、トリプトファン、アルギニン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；
Ｘ１６に対応する残基が、セリンである；
Ｘ４３に対応する残基が、イソロイシンである；
Ｘ６０に対応する残基が、アラニンである；
Ｘ９４に対応する残基が、アラニン、バリンまたはシステインである；
Ｘ９５に対応する残基が、イソロイシンまたはロイシンである；
Ｘ９６に対応する残基が、セリン、アスパラギン、トレオニンまたはグルタミン酸である；
Ｘ９７に対応する残基が、リジン、トレオニン、バリン、アルギニン、メチオニン、またはイソロイシンである；
Ｘ１２０に対応する残基が、フェニルアラニンまたはバリンである；
Ｘ１２５に対応する残基が、グリシンまたはセリンである；
Ｘ１４２に対応する残基が、アスパラギンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、またはグルタミンである；
Ｘ１４９に対応する残基が、グリシンまたはフェニルアラニンである；
Ｘ１５０に対応する残基が、アスパラギン酸またはヒスチジンである；
Ｘ１５２に対応する残基が、セリン、トレオニン、またはメチオニンである；
Ｘ１９６に対応する残基が、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、またはイソロイシンである；
Ｘ２０２に対応する残基が、アラニン、トリプトファン、チロシン、またはメチオニンである；
Ｘ２０５に対応する残基が、アルギニンである；および
Ｘ２０６に対応する残基が、メチオニンまたはチロシンである、の１つ以上をさらに有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項７】
次の特徴：
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；および
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項８】
次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；および
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項９】
次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である；
Ｘ９７に対応する残基が、極性、非極性、脂肪族、または塩基性残基である；および
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
次の特徴：
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基；
特にグルタミン、イソロイシン、またはロイシンである、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性、または芳香族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
次の特徴：
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性、または芳香族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記立体異性体過剰率が少なくとも約９０％である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記立体異性体過剰率が少なくとも約９９％である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが、配列番号６の配列を有する前記ケトレダクターゼポリペプチドによって可能な率よりも高い率で基質を生成物に還元することがさらに可能である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、配列番号６の配列を有する前記ケトレダクターゼポリペプチドによって可能な率よりも少なくとも約４５０％大きい率で基質を生成物に還元することがさらに可能である、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号８、１０、１４、１６、１８、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが、配列番号６の配列を有する前記ケトレダクターゼポリペプチドによって可能な率よりも少なくとも約１５００％大きい率で基質を生成物に還元することがさらに可能である、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号１８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質の量に対して約１重量％未満の量のポリペプチドを用いて実施するとき、約２４時間未満で２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質の少なくとも約９５％を（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールに変換することができる、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号１８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
ケトレダクターゼポリペプチドであって、Ｘ１９０に対応する残基にプロリンを有する配列番号２、４または９８に基づく参照配列の残基９０〜２１１と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を有するドメインを含むが、但し、ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列がＸ１９０に対応する残基に非芳香族残基を有することを条件とする、ケトレダクターゼポリペプチド。
【請求項２５】
前記ケトレダクターゼドメインは、Ｘ１９０に対応する残基が脂肪族、非極性、拘束された、またはシステイン残基であるアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載にポリペプチド。
【請求項２６】
前記ケトレダクターゼドメインは、Ｘ１９０に対応する残基がプロリンであるアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載にポリペプチド。
【請求項２７】
前記ケトレダクターゼポリペプチドドメインが、次の特徴：
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９５に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ９７に対応する残基が、極性、非極性、脂肪族、または塩基性残基である；
Ｘ１２０に対応する残基が、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１２５に対応する残基が、極性または非極性残基である；
Ｘ１４２に対応する残基が、極性残基、特にセリンまたはアスパラギンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１４９に対応する残基が、非極性または芳香族残基である；
Ｘ１５０に対応する残基が、拘束されたまたは酸性残基である；
Ｘ１５２に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性、または芳香族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である；
Ｘ２０５に対応する残基が、塩基性、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、非極性または芳香族残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
残基９０〜２１１に対応する前記ケトレダクターゼポリペプチドドメインが、次の特徴：
Ｘ９４に対応する残基が、アラニン、バリンまたはシステインである；
Ｘ９５に対応する残基が、イソロイシンまたはロイシンである；
Ｘ９６に対応する残基が、セリン、アスパラギン、トレオニンまたはグルタミン酸である；
Ｘ９７に対応する残基が、リジン、トレオニン、バリン、アルギニン、メチオニン、またはイソロイシンである；
Ｘ１２０に対応する残基が、フェニルアラニンまたはバリンである；
Ｘ１２５に対応する残基が、グリシンまたはセリンである；
Ｘ１４２に対応する残基が、アスパラギンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、またはグルタミンである；
Ｘ１４９に対応する残基が、グリシンまたはフェニルアラニンである；
Ｘ１５０に対応する残基が、アスパラギン酸またはヒスチジンである；
Ｘ１５２に対応する残基が、セリン、トレオニン、またはメチオニンである；
Ｘ１９０に対応する残基が、アラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである；
Ｘ１９６に対応する残基が、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、またはイソロイシンである；
Ｘ２０２に対応する残基が、アラニン、トリプトファン、チロシン、またはメチオニンである；
Ｘ２０６に対応する残基が、メチオニンまたはチロシンである、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
残基９０〜２１１に対応する前記ケトレダクターゼポリペプチドドメインが、次の特徴：
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
残基９０〜２１１に対応する前記ケトレダクターゼポリペプチド領域が、次の特徴：
Ｘ９７に対応する残基が、極性、非極性、、脂肪族、または塩基性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
残基９０〜２１１に対応する前記ケトレダクターゼポリペプチド領域が、次の特徴：
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに；
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
残基９０〜２１１に対応する前記ケトレダクターゼポリペプチド領域が、次の特徴：
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性、または芳香族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
残基９０〜２１１に対応する前記ケトレダクターゼポリペプチド領域が、次の特徴：
Ｘ１４７に対応する残基が、ロイシンである；
Ｘ１９６に対応する残基が、ロイシンである；
Ｘ２０２に対応する残基が、トリプトファンである、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
配列番号２、４または９８に基づく前記参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列を有する領域をさらに含み、残基１〜８９に対応する前記領域が次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である、を有し；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基１〜８９に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
配列番号２、４または９８に基づく前記参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列を有する領域をさらに含み、残基１〜８９に対応する前記領域が次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である；
Ｘ１６に対応する残基が、極性残基である；
Ｘ４３に対応する残基が、非極性または極性残基である、を有し；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基１〜８９に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
配列番号２、４または９８に基づく前記参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列を有する領域をさらに含み、残基１〜８９に対応する前記領域が次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、トレオニン、プロリン、トリプトファン、アルギニン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；
Ｘ１６に対応する残基が、セリンである；
Ｘ４３に対応する残基が、イソロイシンである、を有し；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基１〜８９に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
配列番号２、４または９８に基づく前記参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列を有する領域をさらに含み、残基１〜８９に対応する前記ケトレダクターゼポリペプチド領域が次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である；
Ｘ１６に対応する残基が、極性残基である；
Ｘ４３に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ６０に対応する残基が、芳香族または非極性、または脂肪族残基である、を有し；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基１〜８９に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
配列番号２、４または９８に基づく前記参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列を有する領域をさらに含み、残基１〜８９に対応する前記ケトレダクターゼポリペプチド領域が次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、グリシン、ヒスチジン、トレオニン、プロリン、トリプトファン、アルギニン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；
Ｘ１６に対応する残基が、セリンである；
Ｘ４３に対応する残基が、イソロイシンである；
Ｘ６０に対応する残基が、アラニンである、を有し；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基１〜８９に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
改変ケトレダクターゼポリペプチドであって、前記改変ケトレダクターゼポリペプチドが由来する野生型ケトレダクターゼと比較して、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質を（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールに還元するための逆の立体選択性が可能である、改変ケトレダクターゼポリペプチド。
【請求項４０】
アセトフェノンを（Ｓ）−１−フェネタノールに立体選択的に還元することができる、野生型Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓケトレダクターゼに由来する、改変ケトレダクターゼポリペプチド。
【請求項４１】
前記ポリペプチドがアセトフェノンを（Ｓ）−１−フェネタノールに少なくとも約９０％の立体異性体過剰率で立体選択的に還元することができる、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記ポリペプチドがアセトフェノンを（Ｓ）−１−フェネタノールに少なくとも約９９％の立体異性体過剰率で立体選択的に還元することができる、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
前記改変ポリペプチドが配列番号２または４または９８のＸ１９０に対応する残基に非芳香族残基を含む、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
請求項１〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４５】
配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、および９３から成る群より選択される、請求項４４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４６】
宿主細胞での発現を導くのに好適な少なくとも１つの制御配列に操作可能に連結された請求項４４に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項４７】
前記制御配列がプロモータを含む、請求項４６の記載の発現ベクター。
【請求項４８】
前記プロモータがＥ．ｃｏｌｉプロモータを含む、請求項４７に記載のベクター。
【請求項４９】
前記制御配列が分泌シグナルを含む、請求項４７の記載の発現ベクター。
【請求項５０】
請求項４６に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項５１】
Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項５０に記載の宿主細胞。
【請求項５２】
発現ベクターを含むコドンが宿主細胞での発現に最適化されている、請求項５０に記載の宿主細胞。
【請求項５３】
３’、４’、および５’位の１つ以上で場合により置換された２’，６’置換アセトフェノン基質を対応する置換（Ｓ）−１−フェネタノールに立体選択的に還元する方法であって、前記基質を対応する置換（Ｓ）−アルコール生成物に立体選択的に還元または変換するのに好適な反応条件下で、前記基質を請求項１〜４３のいずれか一項に記載のケトレダクターゼポリペプチドと接触させるステップを含む、方法。
【請求項５４】
前記基質が２’，６’−ジクロロ−３’フルオロアセトフェノンであり、前記対応する（Ｓ）−アルコール生成物が（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールが９９％を超える立体異性体過剰率で形成される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記ケトレダクターゼポリペプチドが、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記方法が少なくとも２００ｇ／Ｌの基質および２ｇ／Ｌ未満のポリペプチドを用いて実施されるとき、前記基質の少なくとも約９５％が２４時間未満で前記生成物に還元される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記ケトレダクターゼ酵素を発現する全細胞、またはそのような細胞の抽出物もしくは溶解物を用いて実施される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
前記ケトレダクターゼが、単離および／または精製され、そして前記還元反応が該ケトレダクターゼの補因子および場合によっては該補因子の再生系の存在下で行われる、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
前記補因子再生系がグルコースデヒドロゲナーゼおよびグルコース；ギ酸デヒドロゲナーゼおよびギ酸エステル；またはイソプロパノールおよび第二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記第二級アルコールデヒドロゲナーゼが、ケトレダクターゼである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
３’，４’および５’位の１つ以上にて場合により置換された２’，６’−置換アセトフェノン、および／または対応する置換（Ｓ）−１−フェネタノール、ならびに請求項１に記載のケトレダクターゼを含む、組成物。
【請求項６３】
前記基質が式（Ｉ）の２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンであり、および前記対応する置換（Ｓ）−１−フェネタノールが式（ＩＩ）の（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールである、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
補因子再生系をさらに含む、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６５】
前記補因子再生系がグルコースデヒドロゲナーゼおよびグルコース；ギ酸デヒドロゲナーゼおよびギ酸エステル；またはイソプロパノールおよび第二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む、請求項６４に記載の組成物。
【請求項１】
２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質を（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールに少なくとも約８５％の立体異性体過剰率で立体選択的に還元することができるケトレダクターゼポリペプチド。
【請求項２】
Ｘ１９０に対応する残基にプロリンを有する配列番号２、４または９８に基づく参照配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、ケトレダクターゼアミノ酸配列がＸ１９０に対応する残基に非芳香族残基を有することを条件とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、Ｘ１９０に対応する残基に脂肪族、非極性、拘束された、またはシステイン残基を有する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、Ｘ１９０に対応する残基にプロリンを有する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ケトレダクターゼが、次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である；
Ｘ１６に対応する残基が、極性残基である；
Ｘ４３に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ６０に対応する残基が、芳香族または非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９５に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ９７に対応する残基が、極性、非極性、脂肪族、または塩基性残基である；
Ｘ１２０に対応する残基が、芳香族、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ１２５に対応する残基が、極性または非極性残基である；
Ｘ１４２に対応する残基が、極性残基、特にセリンまたはアスパラギンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１４９に対応する残基が、非極性または芳香族残基である；
Ｘ１５０に対応する残基が、拘束されたまたは酸性残基である；
Ｘ１５２に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性、または芳香族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である；
Ｘ２０５に対応する残基が、塩基性、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、非極性または芳香族残基である、の１つ以上をさらに有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、トレオニン、プロリン、トリプトファン、アルギニン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；
Ｘ１６に対応する残基が、セリンである；
Ｘ４３に対応する残基が、イソロイシンである；
Ｘ６０に対応する残基が、アラニンである；
Ｘ９４に対応する残基が、アラニン、バリンまたはシステインである；
Ｘ９５に対応する残基が、イソロイシンまたはロイシンである；
Ｘ９６に対応する残基が、セリン、アスパラギン、トレオニンまたはグルタミン酸である；
Ｘ９７に対応する残基が、リジン、トレオニン、バリン、アルギニン、メチオニン、またはイソロイシンである；
Ｘ１２０に対応する残基が、フェニルアラニンまたはバリンである；
Ｘ１２５に対応する残基が、グリシンまたはセリンである；
Ｘ１４２に対応する残基が、アスパラギンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、またはグルタミンである；
Ｘ１４９に対応する残基が、グリシンまたはフェニルアラニンである；
Ｘ１５０に対応する残基が、アスパラギン酸またはヒスチジンである；
Ｘ１５２に対応する残基が、セリン、トレオニン、またはメチオニンである；
Ｘ１９６に対応する残基が、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、またはイソロイシンである；
Ｘ２０２に対応する残基が、アラニン、トリプトファン、チロシン、またはメチオニンである；
Ｘ２０５に対応する残基が、アルギニンである；および
Ｘ２０６に対応する残基が、メチオニンまたはチロシンである、の１つ以上をさらに有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項７】
次の特徴：
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；および
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項８】
次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；および
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項９】
次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である；
Ｘ９７に対応する残基が、極性、非極性、脂肪族、または塩基性残基である；および
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
次の特徴：
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基；
特にグルタミン、イソロイシン、またはロイシンである、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性、または芳香族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
次の特徴：
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性、または芳香族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基に１つ以上の残基相違を場合により有する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記立体異性体過剰率が少なくとも約９０％である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記立体異性体過剰率が少なくとも約９９％である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが、配列番号６の配列を有する前記ケトレダクターゼポリペプチドによって可能な率よりも高い率で基質を生成物に還元することがさらに可能である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、配列番号６の配列を有する前記ケトレダクターゼポリペプチドによって可能な率よりも少なくとも約４５０％大きい率で基質を生成物に還元することがさらに可能である、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号８、１０、１４、１６、１８、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが、配列番号６の配列を有する前記ケトレダクターゼポリペプチドによって可能な率よりも少なくとも約１５００％大きい率で基質を生成物に還元することがさらに可能である、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号１８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質の量に対して約１重量％未満の量のポリペプチドを用いて実施するとき、約２４時間未満で２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質の少なくとも約９５％を（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールに変換することができる、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号１８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
ケトレダクターゼポリペプチドであって、Ｘ１９０に対応する残基にプロリンを有する配列番号２、４または９８に基づく参照配列の残基９０〜２１１と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を有するドメインを含むが、但し、ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列がＸ１９０に対応する残基に非芳香族残基を有することを条件とする、ケトレダクターゼポリペプチド。
【請求項２５】
前記ケトレダクターゼドメインは、Ｘ１９０に対応する残基が脂肪族、非極性、拘束された、またはシステイン残基であるアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載にポリペプチド。
【請求項２６】
前記ケトレダクターゼドメインは、Ｘ１９０に対応する残基がプロリンであるアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載にポリペプチド。
【請求項２７】
前記ケトレダクターゼポリペプチドドメインが、次の特徴：
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９５に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ９７に対応する残基が、極性、非極性、脂肪族、または塩基性残基である；
Ｘ１２０に対応する残基が、芳香族、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１２５に対応する残基が、極性または非極性残基である；
Ｘ１４２に対応する残基が、極性残基、特にセリンまたはアスパラギンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１４９に対応する残基が、非極性または芳香族残基である；
Ｘ１５０に対応する残基が、拘束されたまたは酸性残基である；
Ｘ１５２に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性、または芳香族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である；
Ｘ２０５に対応する残基が、塩基性、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、非極性または芳香族残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
残基９０〜２１１に対応する前記ケトレダクターゼポリペプチドドメインが、次の特徴：
Ｘ９４に対応する残基が、アラニン、バリンまたはシステインである；
Ｘ９５に対応する残基が、イソロイシンまたはロイシンである；
Ｘ９６に対応する残基が、セリン、アスパラギン、トレオニンまたはグルタミン酸である；
Ｘ９７に対応する残基が、リジン、トレオニン、バリン、アルギニン、メチオニン、またはイソロイシンである；
Ｘ１２０に対応する残基が、フェニルアラニンまたはバリンである；
Ｘ１２５に対応する残基が、グリシンまたはセリンである；
Ｘ１４２に対応する残基が、アスパラギンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、またはグルタミンである；
Ｘ１４９に対応する残基が、グリシンまたはフェニルアラニンである；
Ｘ１５０に対応する残基が、アスパラギン酸またはヒスチジンである；
Ｘ１５２に対応する残基が、セリン、トレオニン、またはメチオニンである；
Ｘ１９０に対応する残基が、アラニン、イソロイシン、システイン、またはプロリンである；
Ｘ１９６に対応する残基が、バリン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、またはイソロイシンである；
Ｘ２０２に対応する残基が、アラニン、トリプトファン、チロシン、またはメチオニンである；
Ｘ２０６に対応する残基が、メチオニンまたはチロシンである、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
残基９０〜２１１に対応する前記ケトレダクターゼポリペプチドドメインが、次の特徴：
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
残基９０〜２１１に対応する前記ケトレダクターゼポリペプチド領域が、次の特徴：
Ｘ９７に対応する残基が、極性、非極性、、脂肪族、または塩基性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
残基９０〜２１１に対応する前記ケトレダクターゼポリペプチド領域が、次の特徴：
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに；
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
残基９０〜２１１に対応する前記ケトレダクターゼポリペプチド領域が、次の特徴：
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、極性、非極性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、脂肪族、非極性、または芳香族残基である；
Ｘ２０２に対応する残基が、脂肪族、芳香族、または非極性残基である、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
残基９０〜２１１に対応する前記ケトレダクターゼポリペプチド領域が、次の特徴：
Ｘ１４７に対応する残基が、ロイシンである；
Ｘ１９６に対応する残基が、ロイシンである；
Ｘ２０２に対応する残基が、トリプトファンである、の１つ以上を有するアミノ酸配列を含み；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
配列番号２、４または９８に基づく前記参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列を有する領域をさらに含み、残基１〜８９に対応する前記領域が次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である、を有し；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基１〜８９に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
配列番号２、４または９８に基づく前記参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列を有する領域をさらに含み、残基１〜８９に対応する前記領域が次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である；
Ｘ１６に対応する残基が、極性残基である；
Ｘ４３に対応する残基が、非極性または極性残基である、を有し；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基１〜８９に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
配列番号２、４または９８に基づく前記参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列を有する領域をさらに含み、残基１〜８９に対応する前記領域が次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、トレオニン、プロリン、トリプトファン、アルギニン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；
Ｘ１６に対応する残基が、セリンである；
Ｘ４３に対応する残基が、イソロイシンである、を有し；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基１〜８９に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
配列番号２、４または９８に基づく前記参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列を有する領域をさらに含み、残基１〜８９に対応する前記ケトレダクターゼポリペプチド領域が次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、芳香族、非極性、極性、拘束された、または塩基性残基である；
Ｘ１６に対応する残基が、極性残基である；
Ｘ４３に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ６０に対応する残基が、芳香族または非極性、または脂肪族残基である、を有し；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基１〜８９に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
配列番号２、４または９８に基づく前記参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列を有する領域をさらに含み、残基１〜８９に対応する前記ケトレダクターゼポリペプチド領域が次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、グリシン、ヒスチジン、トレオニン、プロリン、トリプトファン、アルギニン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；
Ｘ１６に対応する残基が、セリンである；
Ｘ４３に対応する残基が、イソロイシンである；
Ｘ６０に対応する残基が、アラニンである、を有し；ならびに
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基１〜８９に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基に１つ以上の相違を場合により有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
改変ケトレダクターゼポリペプチドであって、前記改変ケトレダクターゼポリペプチドが由来する野生型ケトレダクターゼと比較して、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノン基質を（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールに還元するための逆の立体選択性が可能である、改変ケトレダクターゼポリペプチド。
【請求項４０】
アセトフェノンを（Ｓ）−１−フェネタノールに立体選択的に還元することができる、野生型Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓケトレダクターゼに由来する、改変ケトレダクターゼポリペプチド。
【請求項４１】
前記ポリペプチドがアセトフェノンを（Ｓ）−１−フェネタノールに少なくとも約９０％の立体異性体過剰率で立体選択的に還元することができる、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記ポリペプチドがアセトフェノンを（Ｓ）−１−フェネタノールに少なくとも約９９％の立体異性体過剰率で立体選択的に還元することができる、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
前記改変ポリペプチドが配列番号２または４または９８のＸ１９０に対応する残基に非芳香族残基を含む、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
請求項１〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４５】
配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、および９３から成る群より選択される、請求項４４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４６】
宿主細胞での発現を導くのに好適な少なくとも１つの制御配列に操作可能に連結された請求項４４に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項４７】
前記制御配列がプロモータを含む、請求項４６の記載の発現ベクター。
【請求項４８】
前記プロモータがＥ．ｃｏｌｉプロモータを含む、請求項４７に記載のベクター。
【請求項４９】
前記制御配列が分泌シグナルを含む、請求項４７の記載の発現ベクター。
【請求項５０】
請求項４６に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項５１】
Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項５０に記載の宿主細胞。
【請求項５２】
発現ベクターを含むコドンが宿主細胞での発現に最適化されている、請求項５０に記載の宿主細胞。
【請求項５３】
３’、４’、および５’位の１つ以上で場合により置換された２’，６’置換アセトフェノン基質を対応する置換（Ｓ）−１−フェネタノールに立体選択的に還元する方法であって、前記基質を対応する置換（Ｓ）−アルコール生成物に立体選択的に還元または変換するのに好適な反応条件下で、前記基質を請求項１〜４３のいずれか一項に記載のケトレダクターゼポリペプチドと接触させるステップを含む、方法。
【請求項５４】
前記基質が２’，６’−ジクロロ−３’フルオロアセトフェノンであり、前記対応する（Ｓ）−アルコール生成物が（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールが９９％を超える立体異性体過剰率で形成される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記ケトレダクターゼポリペプチドが、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、および９４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記方法が少なくとも２００ｇ／Ｌの基質および２ｇ／Ｌ未満のポリペプチドを用いて実施されるとき、前記基質の少なくとも約９５％が２４時間未満で前記生成物に還元される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記ケトレダクターゼ酵素を発現する全細胞、またはそのような細胞の抽出物もしくは溶解物を用いて実施される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
前記ケトレダクターゼが、単離および／または精製され、そして前記還元反応が該ケトレダクターゼの補因子および場合によっては該補因子の再生系の存在下で行われる、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
前記補因子再生系がグルコースデヒドロゲナーゼおよびグルコース；ギ酸デヒドロゲナーゼおよびギ酸エステル；またはイソプロパノールおよび第二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記第二級アルコールデヒドロゲナーゼが、ケトレダクターゼである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
３’，４’および５’位の１つ以上にて場合により置換された２’，６’−置換アセトフェノン、および／または対応する置換（Ｓ）−１−フェネタノール、ならびに請求項１に記載のケトレダクターゼを含む、組成物。
【請求項６３】
前記基質が式（Ｉ）の２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロアセトフェノンであり、および前記対応する置換（Ｓ）−１−フェネタノールが式（ＩＩ）の（Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールである、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
補因子再生系をさらに含む、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６５】
前記補因子再生系がグルコースデヒドロゲナーゼおよびグルコース；ギ酸デヒドロゲナーゼおよびギ酸エステル；またはイソプロパノールおよび第二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む、請求項６４に記載の組成物。
【図１】
【公表番号】特表２０１０−５３８６５７（Ｐ２０１０−５３８６５７Ａ）
【公表日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２５０５７（Ｐ２０１０−５２５０５７）
【出願日】平成２０年９月１３日（２００８．９．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７６３３３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０３６４０４
【国際公開日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【出願人】（５０６０３８２５７）コデクシス， インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月１３日（２００８．９．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７６３３３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０３６４０４
【国際公開日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【出願人】（５０６０３８２５７）コデクシス， インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
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