アディポネクチンに対する結合性を有するペプチド、ならびに該ペプチドを用いた分析方法および分析装置
【課題】生産性、品質および構造の安定性、ならびに利便性に優れ、かつ安価な、アディポネクチンの認識材料を開発する。
【解決手段】５０個以下のアミノ酸からなり、かつアディポネクチンに対する結合性を有しているペプチドを提供する。
【解決手段】５０個以下のアミノ酸からなり、かつアディポネクチンに対する結合性を有しているペプチドを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アディポネクチンを分析する技術に関するものであり、より詳細には、アディポネクチンに対する結合性を有するペプチド、ならびにこれらのペプチドを用いた、アディポネクチンの分析方法および分析装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アディポネクチン（ＡＣＲＰ３０またはＧＢＰ２８ともいう。）は、主に脂肪組織から特異的に産生および分泌されるサイトカインであり、２４４個のアミノ酸からなるタンパク質である（非特許文献１参照）。アディポネクチンは、インスリン感受性を改善する効果、および肝臓や筋肉における脂肪燃焼を促進する効果を有していることが示されている。このような効果をアディポネクチンが有しているため、アディポネクチンの分泌を正常化することによって、高血圧、脂質代謝異常または糖尿病といったメタボリックシンドロームの諸症状を総合的に改善できると期待されている（非特許文献２参照）。
【０００３】
メタボリックシンドロームから引き起こされる疾患の一つである糖尿病に関し、厚生労働省による２００６年度の実態調査によると、糖尿病を強く疑われる人の数が約８２０万人、糖尿病の可能性を否定できない人の数が約１，０５０万人であり、合わせて推定約１，８７０万人である。糖尿病を含む生活習慣病やその予備軍は今後も増加傾向にあるとされており、日々の生活改善などによる予防が重要とされている。
【０００４】
上述したようにアディポネクチンがメタボリックシンドロームと関係していることから、アディポネクチンは、生活習慣病の指標になる可能性があるとされている。それ故、生体内のアディポネクチンの濃度を測定することは、健康維持、または代謝異常の早期発見につながると考えられている。
【０００５】
従来、アディポネクチンは、タンパク質である抗体（アディポネクチンを免疫原として得られたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）をアディポネクチンの認識材料として用いた免疫学的な測定方法によって測定されている（特許文献１〜２参照）。このような免疫学的な測定方法の一つには、抗体を使用したサンドイッチ法が用いられている。
【０００６】
サンドイッチ法を用いたアディポネクチンの測定方法は、具体的には以下のとおりに実施される。まず、マイクロプレート内にアディポネクチンに特異的な抗体を固定化する。次に、アディポネクチンを含むサンプルを添加し、サンプル中のアディポネクチンとこの抗体とを反応させる。これにより、マイクロプレートにアディポネクチンを固定化する。さらに、酵素または蛍光化合物などで標識された、マイクロプレート内に固定化した抗体とエピトープが異なるさらなる抗体を、固定化したアディポネクチンと反応させる。そして、この酵素または蛍光化合物を検出することによって、アディポネクチンを検出する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−３３３５０４（２００４年１１月２５日公開）
【特許文献２】国際公開第２００４／０８６０４０号パンフレット（２００４年１０月７日公開）
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Philipp E. Scherer, et al., J. Biol. Chem., 1995, vol. 270, pp. 26746-26749
【非特許文献２】Christian Weyer, et al., J. Clin. End. & Metab., 2001, vol. 86, 1930-1935
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のような従来技術において、アディポネクチンを検出するためには、抗体が必要不可欠である。しかしながら、抗体は、動物に免疫したり、ハイブリドーマ細胞を作製したりした後に、さらに精製を行うことによって得られるため、抗体の生産に長い時間を必要とする。このため、抗体を効率よく量産することが困難であり、生産コストも高くなるという問題点がある。さらに、抗体は、生産のロット毎に品質が変わるため、品質の安定化の問題点もある。
【００１０】
また、タンパク質は、分析条件（温度、湿度、ｐＨ、酸素、光または腐敗など）の影響を受けて、その構造が変化し、失活することがある。タンパク質は構造的に不安定であるため、タンパク質である抗体を使用する場合、分析条件によってタンパク質のアディポネクチンに対する結合性が変化する。すなわち、タンパク質を用いた分析では、分析条件によって異なる分析結果が得られる（分析結果の信頼性が低い）という問題点がある。さらに、アディポネクチンの分析を目的として、タンパク質を基材に固定化する場合、この固定化によってタンパク質が変性し、タンパク質のアディポネクチンに対する結合性が低下することがあるという問題点もある。その上、タンパク質は同一のアミノ酸が複数存在するため、同一官能基が複数存在する。このため、タンパク質の所望の部位を修飾したり、標識したりすることが難しいという問題点もある。
【００１１】
本発明は、上述した問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、生産性、品質および構造の安定性、ならびに利便性に優れ、かつ安価な、アディポネクチンの認識材料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、独自の観点に基づいて、アディポネクチンに対する結合性を有するペプチドを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明に係るペプチドは、５０個以下のアミノ酸からなり、かつアディポネクチンに対する結合性を有していることを特徴としている。
【００１４】
本発明に係るペプチドは、配列番号１〜１５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでいるペプチドであっても、配列番号１〜１５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換または付加が生じているアミノ酸配列を含んでいるペプチドであってもよい。
【００１５】
本発明に係るペプチドにおいて、前記アミノ酸の置換は保存的置換であることが好ましく、（ａ）アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびグリシンからなる群、（ｂ）アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群、（ｃ）ヒスチジン、リシンおよびアルギニンからなる群、（ｄ）アラニン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、バリンおよびメチオニンからなる群、ならびに、（ｅ）フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンからなる群、より選択される単一の群に含まれる２つのアミノ酸の間で生じている置換であることが好ましい。
【００１６】
また、本発明に係るペプチドは、２０個以下のアミノ酸からなることがより好ましく、配列番号１〜１５、１８および１９のいずれかに示されるアミノ酸配列からなってもよい。
【００１７】
本発明に係るペプチドは、高分子であるタンパク質（例えば、抗体）と比べてアミノ酸の数が極端に少ない。このため、本発明に係るペプチドは、（ｉ）化学合成法によって容易に得ることができ、（ｉｉ）上述した分析条件に起因する構造の変化が生じず、アディポネクチンに対する結合性が低下しない、（ｉｉｉ）ペプチド内に同一アミノ酸が存在しないか、またはペプチド内に存在する同一アミノ酸の数が少ないので、特定のアミノ酸を標的とした修飾または標識を簡便に行うことができる。このように、本発明に係るペプチドは、生産性、品質および構造の安定性、ならびに利便性に優れ、かつ安価なアディポネクチン認識材料として使用され得る。
【００１８】
本発明に係るペプチドは、上述したようにペプチド内に同一アミノ酸が存在しないか、またはペプチド内に存在する同一アミノ酸の数が少ないため、ペプチドの特定の部位を介してペプチドを基材へ簡便に固定化することができる。このような基材を用いれば、分析方法または分析装置の利便性、分析精度、または信頼性を格段に高めることができる。
【００１９】
本明細書において、「ペプチド」は、２〜５０個、好ましくは７〜５０個、より好ましくは７〜２０個のアミノ酸がペプチド結合したものが意図される。分子認識材料の１つである抗体の、超過変部位のアミノ酸の個数は一般的に１０個程度であり、このことは、１０個程度のアミノ酸からなるペプチドが標的タンパク質を認識可能であることを示している。このような技術常識に基づいて、アミノ酸の個数が上述した範囲内であれば、本発明に係るペプチドがアディポネクチンを十分に認識することができることを、当業者は容易に理解する。さらに、アミノ酸の個数が上述した範囲内であれば、ペプチドを化学合成法によって効率よく合成することができる。
【００２０】
本明細書において、「結合性」とは、分子間相互作用（例えば、静電相互作用、π−π相互作用、双極子相互作用、疎水相互作用、水素結合、配位結合、および水和結合）に基づいて結合する性質のことである。よって、「アディポネクチンに対する結合性を有するペプチド」は、分子間相互作用によってアディポネクチンに結合する性質を有するペプチドが意図される。結合性は、酵素免疫測定法、または表面プラズモン共鳴などの従来公知の方法を用いることにより評価することができる。
【００２１】
本発明に係るペプチドは、リンカーを含んでいてもよい。本明細書において「リンカー」は、２つ以上の物質を、互いの性質を保持したまま連結し得る構造をいい、リンカーを介して、本発明に係るペプチドを、アディポネクチンに対する結合性を保持した状態で他の物質（基材、さらなる分子など）に固定化することができる。なお、リンカーを含むペプチドは、他の物質と実際に連結していなくてもよい。
【００２２】
また、本発明に係るペプチドは標識されていてもよい。本明細書において「標識」は、他と異なった特徴を目的の物質に付与することをいい、生体内に存在し得る分子またはその類似物（いわゆる生体関連分子）の付加であっても、蛍光化合物の付加であってもよい。生体関連分子としては、酵素（アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）および西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）など）、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン等が挙げられるがこれらに限定されない。なお、本発明に係るペプチドは、上述したリンカーを介して標識されても、介さずに標識されてもよい。本明細書において、生体関連分子および蛍光化合物を総称して標識化合物ともいう。
【００２３】
本発明に係る分析方法は、アディポネクチンを分析するために、本発明に係るペプチドの少なくとも１種を用いることを特徴としている。好ましくは、本発明に係る分析方法は、本発明に係るペプチドの少なくとも１種とアディポネクチンとの複合体を分析する工程を包含し、より好ましくは、サンプル中のアディポネクチンを分析するために、本発明に係るペプチドの少なくとも１種をサンプルとインキュベートする工程をさらに包含する。
【００２４】
用語「サンプル」は、当該分野において標本、または調製物と同義で用いられ、本明細書において、「生物学的サンプル」またはその等価物が意図される。「生物学的サンプル」は、供給源としての生物材料（例えば、個体、体液、細胞株、組織培養物、組織切片、組織生検など）から得られる、任意の調製物が意図される。本発明に適用される生物学的サンプルとしては、体液（例えば、血液、唾液、血清、血漿、尿、髄液、分泌液など）またはその希釈物が挙げられる。好ましい生物学的サンプルは、被験体から得られたサンプル（すなわち被験体サンプル）である。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は当該分野で周知である。本明細書において、用語「サンプル」としては、上記生物学的サンプル以外に、上記生物学的サンプルから抽出したタンパク質サンプル、ゲノムＤＮＡサンプルおよび／または総ＲＮＡサンプルもまた挙げられる。
【００２５】
本明細書において、「インキュベートする」は複数の物質を共存させかつ互いに十分接触し得る状態におくことが意図される。上述したように、本発明に係るペプチドはいずれもアディポネクチンに対する結合性を有しているので、本発明に係るペプチドをサンプルとインキュベートすることによって、サンプル中にアディポネクチンが存在する場合は、「アディポネクチン−ペプチド複合体」が形成される。なお、「インキュベートする」工程は、本発明に係るペプチドをサンプル中に添加する工程であっても、サンプルと混合する工程であってもよい。
【００２６】
本明細書において、「分析」は、サンプル中の目的物質の量（例えば、モル数または濃度）の定量的または半定量的な「測定」と、サンプル中の目的物質の存在の「検出」とが包含される。ペプチドとアディポネクチンとの複合体を分析する工程は、複合体の存在を検出する工程であっても、複合体の量を測定する工程であってもよく、当該分野において公知の種々の解析手順（例えば、抗ペプチド抗体または抗アディポネクチン抗体を用いたサンドイッチ法、または直接法、あるいはペプチドの標識化）、あるいは公知の種々の解析手段（吸光度測定、蛍光強度測定、蛍光偏光、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、水晶マイクロバランス（ＱＣＭ）などを用いたシグナルの検出）を適用することができる。また、本発明に係るペプチドは分析条件に起因して構造が変化しにくいため、上述した分析方法を用いれば、分析条件に影響されない、安定した結果を得ることができる。
【００２７】
本発明に係るペプチドは基材上に固定化されていてもよい。すなわち、本発明に係る基材は、本発明に係るペプチドの少なくとも１種が固定化されていることを特徴としている。この構成によれば、基材上にて行われるべき種々の公知の分析手順（例えばマイクロチップ技術）と組み合わせて、アディポネクチンの分析を容易に行うことができる。
【００２８】
本発明に係る分析方法は、アディポネクチンを分析するために、本発明に係る基材を用いることを特徴としている。好ましくは、本発明に係る分析方法は、本発明に係る基材上のペプチドとアディポネクチンとの複合体を分析する工程を包含し、より好ましくは、サンプル中のアディポネクチンを分析するために、本発明に係る基材をサンプルとインキュベートする工程をさらに包含する。この構成によれば、基材上に固定化された本発明に係るペプチドに結合したアディポネクチンを、直接的または間接的に分析することができる。直接的な分析方法としては、例えば、ＳＰＲ、ＱＣＭが挙げられ、間接的な分析方法としては、例えば、二次的な生体認識材料（例えば抗体）を用いたサンドイッチ法などが挙げられる。
【００２９】
このように、本発明に係る分析方法は、基材上に固定化されているペプチドを用いても、固定化されていないペプチドを用いてもよい。ペプチドが基材上に固定化されている場合は、ペプチドを介して基材に固定化されたアディポネクチンを例えばＳＰＲやＱＣＭによって検出すればよい。ペプチドが基材上に固定化されていない場合は、例えば、蛍光標識したペプチドを用いてアディポネクチンと溶液中にて複合体を形成させて、生じた蛍光偏光を測定すればよい。
【００３０】
本発明に係る分析装置は、アディポネクチンを分析するために、本発明に係るペプチドの少なくとも１種を備えていることを特徴としている。この構成によれば、本発明に係るペプチドは分析条件に起因する構造変化が生じにくいので、この分析装置を用いれば、分析条件に左右されない安定した分析結果を得ることができる。本明細書において、「分析装置」とは、アディポネクチンを装置内に捕捉し、アディポネクチンが捕捉されている情報をシグナルに変換し、このシグナルを検出するための一連の操作を実施するに必要な構成を有しているものが意図される。
【００３１】
本発明に係る分析装置は、アディポネクチンを分析するために、本発明に係る基材を備えていることを特徴としている。この構成を用いれば、この分析装置に、アディポネクチンを直接的または間接的に分析する手段を適用することができる。
【００３２】
本発明に係る分析装置は、アディポネクチンを分析するために、サンプルを受容するサンプル受容部を備えており、アディポネクチンを捕捉する捕捉部が該サンプル受容部の内部に設けられており、捕捉部には、本発明に係るペプチドが固定化されているか、あるいは本発明に係る基材が配置されていればよい。そして、捕捉されたアディポネクチンを分析する分析手段がさらに備えられていることが好ましく、この場合、分析手段はサンプル受容部の内部の分析部に向けて配置されている。分析部は、サンプル受容部の内部の所定位置として予め規定されている態様であってもよいが、分析手段の種類およびその設定に従って任意に規定される態様であってもよい。すなわち、後者の態様であれば、分析部は、分析手段による分析が可能な領域として規定される。
【００３３】
本発明に係る分析装置において、サンプル受容部は流路を形成していてもよく、この場合、分析部が捕捉部の下流であってもよい。サンプル受容部が流路を形成している場合は、流路、および流路に流体を注入する注入部によって、サンプル受容部が構成され、この場合、サンプル受容部は、流路から流体を排出する排出部を含んでも含まなくてもよい。本明細書において、用語「上流」および「下流」は、流路内における流体の流れを基準とした概念であり、特に説明を加えない限り、流路における流体の注入部側が「上流」であり、流体の排出部側が「下流」である。また、本発明に係る分析装置は、基板上に形成したマイクロチャネル型分析装置であってもよい。
【００３４】
本発明に係る遺伝子は、本発明に係るペプチドをコードしていることを特徴としている。本発明に係る組換えベクターは、本発明に係る遺伝子を含んでいることを特徴としている。本発明に係る形質転換体は、本発明に係る組換えベクターを含んでいることを特徴としている。
【発明の効果】
【００３５】
本発明によれば、生産性、品質および構造の安定性、ならびに利便性に優れ、かつ安価なアディポネクチンの認識材料を提供することができる。このようなアディポネクチンの認識材料を用いることによって、いかなる分析条件においても安定した分析結果が得られる分析方法および分析装置を低コストで提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明に係る分析装置の一実施形態の断面の概略図である。
【図２】本発明に係る分析装置の一実施形態を上面から見た概略図である。
【図３】ペプチドのアディポネクチンに対する結合を測定した結果を示すグラフである。
【図４】ペプチドのアディポネクチンに対する結合を測定した結果を示すグラフである。
【図５】ペプチドのアディポネクチンに対する結合を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
（１）本発明に係るペプチド
本発明は、５０個以下のアミノ酸からなり、かつアディポネクチンに対する結合性を有しているペプチドを提供する。一実施形態において、本発明に係るペプチドは、配列番号１〜１５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでいるペプチドである。また、一実施形態において、本発明に係るペプチドは、配列番号１〜１５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換または付加が生じているアミノ酸配列を含んでいるペプチドである。
【００３８】
「１個または数個のアミノ酸の置換または付加」とは、当業者が公知の手法に従って容易に置換または付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下、なおさらに好ましくは３個以下）のアミノ酸が置換または付加されていることを意味する。
【００３９】
アミノ酸の置換は、保存的置換であることが好ましい。「保存的置換」とは、特定のアミノ酸から、このアミノ酸と同様な化学的性質および／または構造を有する他のアミノ酸に置換されていることをいう。化学的性質としては、例えば、疎水性度（疎水性および親水性）、電荷（中性、酸性および塩基性）が挙げられる。構造としては、例えば、側鎖、ならびに側鎖の官能基として存在する芳香環、脂肪炭化水素基およびカルボキシル基が挙げられる。
【００４０】
アミノ酸の化学的性質および構造を表１に示す。表１に示す疎水性度は、値が大きいほど疎水性が高く、小さいほど親水性が高いことを示す。アミノ酸は、例えば、疎水性であるか、親水性であるかによって分類することができる。
【００４１】
【表１】
【００４２】
アミノ酸の疎水性度、電荷または側鎖の官能基の種類に基づいて、化学的性質および／または構造が同様であるアミノ酸を例えば、以下の（ａ）〜（ｅ）の５つの群に分類することができる。
（ａ）親水性かつ中性を示すアミノ酸の群・・・アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびグリシン
（ｂ）酸性を示すアミノ酸の群・・・アスパラギン酸およびグルタミン酸
（ｃ）塩基性を示すアミノ酸の群・・・ヒスチジン、リジンおよびアルギニン
（ｄ）疎水性かつ中性を示すアミノ酸の群・・・アラニン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、バリンおよびメチオニン
（ｅ）芳香環を有するアミノ酸の群・・・フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン。
【００４３】
このような分類を用いれば、保存的置換とは、同じ群内のアミノ酸同士の置換であるといえ、例えばセリンとスレオニンとの置換、リジンとアルギニンとの置換、およびフェニルアラニンとトリプトファンアミノとの置換が挙げられる。
【００４４】
アミノ酸の付加は、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端にさらなるアミノ酸が結合された状態が意図され、アディポネクチンに対する結合性を有しているかぎり、本発明に係るペプチドが複数結合されたペプチドであってもよい。本発明に係るペプチドとさらなるアミノ酸とは、直接的に結合されてもよいし、リンカーを介して結合されてもよい。同様に、本発明に係るペプチドが複数結合される場合は、これらのペプチドは、互いに直接的に結合されてもよいし、後述するリンカーを介して結合されてもよい。
【００４５】
また、本発明に係るペプチドは、付加的なペプチドを含むものであってもよい。付加的なペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇなどのエピトープ標識ペプチドが挙げられる。
【００４６】
なお、本発明に係るペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているものであればよいが、これに限定されるものではなく、糖鎖やイソプレノイド基などのペプチド以外の構造を含む複合ペプチドであってもよい。アミノ酸は、表１に示す２０種のアミノ酸であることが好ましいがこれらに限定されない。アミノ酸の官能基は修飾されていてもよい。アミノ酸はＬ型であることが好ましい。
【００４７】
本発明に係るペプチドは、本発明者らが独自に見出した新規ペプチドであり、後述する実施例にて示すように、アディポネクチンに結合することが実証されている。このような機能は、本発明に係るペプチドのアミノ酸配列に基づいて当業者が容易に予測し得るものではない。本発明に係るペプチドは、当該分野において公知の任意の手法に従って容易に作製され得、例えば、化学合成されても、組換え発現されてもよい。化学合成法としては、固相法または液相法を挙げることができる。固相法において、例えば、市販の各種ペプチド合成装置（Model MultiPep RS（Intavis AG）など）を利用することができる。
【００４８】
本発明に係るペプチドは、リンカーを含んでいてもよい。本発明に係るペプチドがリンカーを含んでいることによって、本発明に係るペプチド同士を、または本発明に係るペプチドと他の物質（後述する基材など）とを、リンカーを介して結合することができる。本発明に係るペプチド同士が結合される場合、同一のペプチド同士が結合されてもよいし、異なるペプチド同士が結合されてもよい。
【００４９】
リンカーは、例えば、本発明に係るペプチドのアミノ酸と結合（例えば、共有結合）されていてもよい。リンカーは、より具体的には、本発明に係るペプチドのＮ末端のアミノ酸のアミノ基または側鎖と結合されていてもよいし、Ｃ末端のアミノ酸のカルボキシル基または側鎖と結合されていてもよいし、Ｎ末端およびＣ末端のアミノ酸以外のアミノ酸の側鎖と結合されていてもよい。さらに、本発明に係るペプチドのＮ末端および／またはＣ末端にさらなるアミノ酸を付加し、付加されたさらなるアミノ酸のアミノ基もしくはカルボキシル基または側鎖に、リンカーを結合させてもよい。
【００５０】
本発明に係るペプチドに付加されるさらなるアミノ酸は、例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンおよびシステインであることが好ましい。リジン、アルギニンおよびヒスチジンの側鎖に存在するアミノ基にリンカーを簡便に結合させることができ、システインの側鎖に存在するチオール基にリンカーを簡便に結合させることができる。
【００５１】
リンカーの末端は、ペプチドと結合できるように、適切な官能基を有していることが好ましい。このような官能基としては、例えば、アミノ基、チオール基、カルボキシル基および水酸基が挙げられる。どのような官能基を使用するかは、リンカーが結合されるペプチドに基づいて決定すればよいが、好ましい官能基はアミノ基またはチオール基である。
【００５２】
リンカーを本発明に係るペプチドに結合させるときには、当業者に公知の方法を用いて、リンカーを結合するアミノ酸以外のアミノ酸の官能基を保護することが好ましい。これによって、リンカーを結合させたい官能基と選択的に反応させることができるため、ペプチドの目的の部位にリンカーを結合させることができる。
【００５３】
リンカーとしては、例えば、炭素鎖、ペプチドおよび糖鎖が挙げられる。炭素鎖は、例えば、置換されたアルキル基であってもよいし、無置換のアルキル基であってもよい。また、炭素鎖中に、酸素原子、窒素原子および／または硫黄原子が存在していてもよい。
【００５４】
また、オキシアルキレンの両端に官能基が導入された構造の化合物（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）をリンカーとして使用することもできる。
【００５５】
また、ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル−４−[Ｎ−マレイミドメチル]シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Sulfosuccinimidyl-4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate））などのクロスリンカーと呼ばれる化合物を、リンカーとして使用することもできる。式（１）で表されるｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣは、チオール基と反応するマレイミド基とアミノ基に反応するスクシンイミド基を有している。ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣは、このように２つの反応部位を有しているため、例えば、式（２）で表されるように、マレイミド基をペプチドのチオール基に結合させ、スクシンイミド基を標識化合物のアミノ基（あるいは、基材上のアミノ基）に結合させることができる。
【００５６】
【化１】
【００５７】
【化２】
【００５８】
リンカーの長さが短すぎると、ペプチドと他の物質（基材など）とを十分に離間できず、その結果、互いに干渉しやすい。また、リンカーの長さが長すぎるとリンカーの折れ曲がりが生じやすく、その結果、ペプチドのアディポネクチンに対する結合性を損なう可能性がある。このため、リンカーの長さは、特に限定されないが、０．５〜１０ｎｍ（５〜１００Å）であることが好ましい。なお、リンカーの種類は、例えば、ペプチドのアミノ酸配列、またはペプチドに付加するさらなるアミノ酸に応じて適宜選択することができる。
【００５９】
また、本発明に係るペプチドは、標識されていてもよい。標識は、生体関連分子の付加であってもよいし、蛍光化合物の付加であってもよい。ペプチドは直接的に標識されてもよいし、リンカーを介して標識されてもよい。
【００６０】
本明細書において「生体関連分子」とは、生体内に存在し得る分子、またはその類似体をいう。生体関連分子は、天然に存在するものであっても、人工的に合成されたものであっても、それらの組合せであってもよい。生体関連分子としては、例えば、核酸、タンパク質（酵素であるアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）および西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）など）、ペプチド、および糖鎖、ならびに低分子化合物（ホルモン、ビオチンおよびアビジンなど）が挙げられる。
【００６１】
蛍光化合物としては、例えばフルオロセイン（ＦＩＴＣ）、ローダミンおよびローダミン誘導体、テキサスレッド、Ｃｙ３、ならびにＣｙ５などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６２】
上述した本発明に係るペプチドを、少なくとも２種以上組み合わせて使用してもよい。例えば、後述する基材などに、２種以上のペプチドをそれぞれ個別に固定化してもよいし、２種以上のペプチドが直接的にまたはリンカーを介して結合したものを固定化してもよい。このように、アディポネクチンに対して結合する部位（エピトープ）が異なる複数のペプチドを用いれば、複数種のペプチドが１つのアディポネクチンと結合するため、アディポネクチンに対する結合性を高めることができ、本発明に係る分析方法または分析装置の感度を向上させることができる。
【００６３】
（２）本発明に係る基材
本発明に係る基材は、本発明に係るペプチドの少なくとも１種が固定化されていることを特徴としている。本明細書において、「基材」はペプチドに足場を提供する（すなわちペプチドが固定化される）ものであれば特に限定されない。基材としては、例えば、ポリスチレンおよびポリカーボネートなどのプラスチック、セルロースおよびデキストランなどの生体高分子、金（Ａｕ）、銅（Ｃｕ）、銀（Ａｇ）、白金（Ｐｔ）およびチタン（Ｔｉ）などの金属、ガラス、セラミックス、樹脂などが挙げられる。これらの基材は、用途に応じて任意の形状で用いることができ、例えば、基板（スライド、プレート、チップ、チューブなど）、微粒子、ビーズ、メンブレンなどであってもよい。
【００６４】
本発明に係るペプチドの基材への固定化方法としては、例えば親水性や疎水性を利用した吸着によって固定化する方法、またはペプチドと基材とを結合（例えば、共有結合）することによって固定化する方法が挙げられる。
【００６５】
ペプチドは基材に直接的に固定化されてもよいし、リンカーまたは生体関連分子を介して固定化されてもよい。リンカーおよび／または生体関連分子を用いることによって、ペプチドの所望の部位を基材と結合させることができる。これによれば、リンカーおよび／または生体関連分子が結合することによって、アディポネクチンに対する結合性を保持したままペプチドを基材に固定化することができる。
【００６６】
例えば、生体関連分子としてビオチンおよびアビジンを用いる場合、まず、基材にアビジンを物理的吸着または化学的吸着によって固定化し、次いで、この基材に、ビオチンが標識されているペプチドを添加し、アビジンとビオチンとの結合を介してペプチドを基材に固定化することができる。
【００６７】
また、例えば、リンカーとしてアミノ基とマレイミド基とを有するリンカーを用いる場合、まず、金の基材上に末端にカルボキシル基を修飾したＰＥＧアルカンチオールＳＡＭ（self-assembled monolayer）を形成し、次いで、基材のカルボキシル基を活性化し、活性化したカルボキシル基をリンカーのアミノ基に結合させ、さらに、ペプチドのシステインのチオール基とリンカーのマレイミド基とを結合させることによって、ペプチドを基材に固定化することができる。用いられるべきペプチドにシステインが存在しない場合は、当業者に公知の方法を用いて、そのペプチドのＮ末端またはＣ末端にシステインを付加すればよい。
【００６８】
（３）本発明に係る分析方法
本発明は、アディポネクチンを分析する方法を提供する。本発明に係る分析方法は、本発明に係るペプチドの少なくとも１種、または本発明に係る基材を用いてアディポネクチンを分析することを特徴としている。より具体的には、本発明に係る分析方法は、本発明に係るペプチドとアディポネクチンとの複合体を分析する工程を包含している。この工程は、アディポネクチンがペプチドに結合していることを示すシグナル（吸光度、蛍光強度、蛍光偏光、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、または水晶マイクロバランス（ＱＣＭ）など）を従来公知の方法によって分析する工程であればよい。
【００６９】
また、本発明に係る分析方法は、本発明に係るペプチドの少なくとも１種をサンプルとインキュベートする工程をさらに包含していてもよい。例えば、アディポネクチンを含んでいるサンプル（あるいは、含んでいることが予想されるサンプル）を、溶液中に溶解したペプチド、またはペプチドが固定化された基材などとインキュベートすればよい。この工程によって、アディポネクチンを本発明に係るペプチドに結合させることができる。
【００７０】
アディポネクチンが、溶液中に溶解したペプチドと結合している場合、本発明に係る分析方法には蛍光偏光測定法を用いることができる。具体的には、例えば、蛍光化合物で標識されたペプチドがアディポネクチンと結合することによって、蛍光化合物の蛍光偏光に変化が生じるので、その変化の有無に基づいて、ペプチドに結合したアディポネクチンを検出することができる。
【００７１】
基材などに固定化されたペプチドにアディポネクチンが結合している場合、本発明に係る分析方法には、酵素免疫測定法、ウェスタンブロット法、放射免疫測定法、および免疫沈降法などの免疫学的方法、吸光度測定法、蛍光強度測定法、表面プラズモン共鳴ならびにＱＣＭ法などを用いることができる。
【００７２】
本発明に係る分析方法には、検出感度、特異性または簡便性の観点から酵素免疫測定法を用いることが好ましい。酵素免疫測定法は、特に限定されず、直接法であっても、サンドイッチ法であってもよい。
【００７３】
本発明に係る分析方法にサンドイッチ法を用いた場合、まず、第１のペプチドをプレートのウェル内に固定化し、次いで、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびカゼインなどのタンパク質、またはポリマーを用いてウェルをブロッキングし、そして、サンプルをウェル内にてインキュベートすることによって、サンプル中のアディポネクチンが第１のペプチドに結合する。
【００７４】
続いて、ウェルを洗浄した後に、酵素で標識された第２のペプチドをウェル内にてインキュベートすることによって、第２のペプチドがアディポネクチンに結合する。ウェルを洗浄した後に、この酵素に対する基質溶液をウェルにてインキュベートすることによって、基質溶液が酵素と反応し、反応生成物が生じる。このような反応生成物の有無に基づいて、ペプチドに結合したアディポネクチンを検出することができる。当業者は、このような方法を、使用する基質の種類に応じて、適宜選択することができる。
【００７５】
例えば、上記反応によって蛍光を生成する基質を用いた場合は、この基質からの蛍光を直接観察することによってアディポネクチンを検出することができる。また、上記反応によって色素を生成する基質を用いた場合は、この色素の吸光度を測定することによってアディポネクチンを検出することができる。上記反応によって電気化学活性が変化する基質を用いた場合は、電極を用いた電気化学的な手段によってアディポネクチンを検出することができる。
【００７６】
以上のような手順に従ってサンドイッチ法を実施すれば、サンプル中のアディポネクチンの有無を判定することができる。サンプル中のアディポネクチンの濃度の測定は、例えば、以下のように実施すればよい。まず、予め、同様の方法で既知濃度の標準アディポネクチン溶液についてシグナル（蛍光強度、吸光度、または電気化学的なシグナルなど）を測定し、アディポネクチンの濃度に対するシグナルの標準曲線を作成する。サンプルから測定したシグナルの値をこの標準曲線からアディポネクチンの濃度に換算することによって、サンプル中のアディポネクチンの濃度を測定することができる。
【００７７】
なお、上記説明では、酵素で標識された第２のペプチドを用いたが、蛍光化合物で標識されたペプチドを用いてもよい。蛍光化合物で標識された第２のペプチドを用いた場合、この第２のペプチドからの蛍光を観察することによって、アディポネクチンを検出または測定することができる。
【００７８】
また、本発明に係る分析方法に表面プラズモン共鳴ならびにＱＣＭ法を用いれば、基材に固定化されたペプチドに結合したアディポネクチンを検出するだけでなく、その量を直接的に測定することができる。
【００７９】
（４）本発明に係る分析装置
本発明は、アディポネクチンを分析するための装置を提供する。具体的には、本発明は、上述した分析方法を実行するための分析装置を提供する。本発明に係る分析装置は、サンプル中のアディポネクチンを分析するために、サンプルを受容するサンプル受容部を備えており、アディポネクチンを捕捉する捕捉部が該サンプル受容部の内部に設けられており、捕捉部には、本発明に係るペプチドが固定化されているか、あるいは本発明に係る基材が配置されていればよい。
【００８０】
本発明に係る分析装置について、図１および２を参照しながら説明する。図１は、本発明に係る分析装置１の側方からの断面図である。図２は、本発明に係る分析装置１の平面図である。なお、サンプルを流体として通過させるマイクロチャネル型の分析装置を例に用いて本発明を説明するが、サンプルが通過すべき流路は、微細溝（マイクロチャネル）に限定されず、例えばマイクロキャピラリであってもよい。また、サンプルを流体として通過させない構成（例えば、「（３）本発明に係る分析方法」に記載したウェル）もまた本発明の範囲内であることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。このようなマイクロチャネル型の分析装置は、例えばチップの形態である。
【００８１】
本発明に係る分析装置１は、基板６、および基板６と重ね合わせる蓋９を備えており、基板６の表面には、凹面の微細流路３が形成されている。なお、本明細書中において、「微細」は、μｍオーダーの径を有していることが意図され、具体的には、半導体の微細加工技術を用いて形成され得る程度のサイズが意図される。
【００８２】
基板６の表面には、注入すべき流体またはサンプルを受容する注入部２、および微細流路３から流体を排出する排出部４がさらに形成されており、それぞれ微細流路３の両端と連結している。すなわち、微細流路３は注入部２と排出部４とを基板６の表面上にて接続している。
【００８３】
注入部２は、分析されるべきサンプルや分析に用いる流体を微細流路３へ注入するための入口であり、注入されるべきサンプルや分析に用いる流体を予め貯留する機能を兼ねてもよい。また、排出部４は、分析されたサンプルや分析に用いられた流体を微細流路３内から排出するための出口であり、排出されたサンプルや流体を貯留しておく機能を兼ねてもよい。
【００８４】
このような基板６に蓋９を重ね合わせることによって微細流路３は基板外部から隔離される。ただし、蓋９を貫通する貫通孔（注入孔１２、排出孔１４）が、それぞれ注入部２および排出部４と基板外部とを連通する。これにより、注入孔１２を介して基板外部から微細流路３へ流体を供給したり、排出孔１４を介して微細流路３から基板外部へ流体を排出したりすることができる。
【００８５】
なお、本実施形態では、微細流路、注入部、および排出部は基板に形成されているが、蓋に形成されてもよい。この場合、基板を貫通する貫通孔（注入孔、排出孔）が、それぞれ注入部および排出部と基板外部とを連通する。
【００８６】
さらに、微細流路３には、微細流路３を流れる流体中のアディポネクチンを捕捉するための本発明に係るペプチドを固定化する固定化部５が設けられている。固定化部５と排出部４との間に、固定化部５にて捕捉されたアディポネクチンを分析する分析部８が設けられている。アディポネクチンを検出するための分析手段７が、分析部８へ向けて配置されている。
【００８７】
なお、図示していないが、分析装置には、微細流路３内の流体の、注入部２から排出部４への移動を促進する駆動手段が、注入部および排出部の少なくとも一方に連結されていてもよい。このような駆動手段としては、例えば、押出しポンプおよび吸引ポンプが挙げられる。押出しポンプを用いて流体を微細流路３内へ送り込む場合は、押出しポンプを注入部２に連結すればよく、吸引ポンプを用いて流体を微細流路３内から引き出す場合は、吸引ポンプを排出部４に連結すればよい。
【００８８】
基板６および蓋９としては、例えば、プラスチック材料、ガラス、石英、光硬化性樹脂、または熱硬化性樹脂などを用いることができる。注入孔１２および排出孔１４の上面から見た形状は、特に限定されず、円形、楕円形、矩形などであり得る。また基板６上に形成された注入部２および排出部４の上面から見た形状は、特に限定されず、円形、楕円形、矩形などであり得る。注入部２および排出部４の底面の、流体の流れ方向に対して垂直な形状は直線状または半円形であり得る。
【００８９】
微細流路３の流路は、流体の流れ方向に沿って角柱形状であっても円柱形状であってもよい。すなわち、微細流路３の、流体の流れ方向に対して垂直な断面の形状は、矩形、台形、円形（半円形）であり得る。また、微細流路３は直線形状である必要はなく、蛇行形状、渦巻形状、または螺旋形状でもよい。
【００９０】
微細流路３の幅は、例えば、１μｍ〜５０００μｍであり、深さは例えば、１μｍ〜５０００μｍであることが好ましいが、この範囲内に限定されるものではない。注入部２および排出部４の直径は例えば、１μｍ〜１００００μｍであり、深さは例えば、１μｍ〜５０００μｍμｍであることが好ましいが、この範囲内に限定されるものではない。注入孔１２および排出孔１４の直径は例えば、１μｍ〜１００００μｍであり、深さは例えば、１μｍ〜１００００μｍであることが好ましいが、この範囲内に限定されるものではない。
【００９１】
ペプチドは、上述した基材へ固定化する方法と同様の方法で、基板の固定化部５へ直接的に固定化することができる。また、ペプチドを基板に直接的に固定化せずに、例えば、ペプチドが固定化された基材を固定化部５に配置してもよい。このような基材は、例えばチップであってもよいし、ビーズであってもよい。例えば、基材としてビーズを用いる場合、このビーズを微細流路３内に導入して固定化部５を形成することができる。具体的には、堰き止め部を微細流路内に設け、この堰き止め部によって堰き止められたビーズを固定化部５として用いることができる。
【００９２】
アディポネクチンを分析するための分析手段７として、例えば熱レンズ顕微鏡、表面プラズモン共鳴測定装置または水晶発振子を使用することができる。
【００９３】
また、アディポネクチンの分析に光検出を用いる場合、分析手段７は光源と分析器とを備えていてもよい。光源は、レーザ、ＬＥＤおよびランプからなる群より選択されることが好ましい。分析器は、光電子増倍管またはマルチピクセル光検出器であることが好ましい。
【００９４】
また、アディポネクチンの分析に電気化学検出を用いる場合、分析手段７は電極を備えていてもよい。電極は、少なくとも参照電極および作用電極の２電極から構成されていればよいが、参照電極および作用電極に加えて対向電極を備えている３電極から構成されていることが好ましい。参照電極、作用電極および対向電極は、従来のフォトリソグラフィ技術を利用した微細加工技術によって分析部８に形成することができる。電極の構成材料としては、例えば、金（Ａｕ）、銅（Ｃｕ）、銀（Ａｇ）、白金（Ｐｔ）、チタン（Ｔｉ）などの金属、または導電性プラスチックなどを使用することができる。
【００９５】
なお、上記説明では、固定化部５と分析部８とが微小流路３の別々の箇所に設けられているが、固定化部５が分析部８を兼ねていてもよい。すなわち、固定化部５へ向けて分析手段７が配置されていてもよい。
【００９６】
本実施形態に係る分析装置を用いたアディポネクチンの分析方法の一例を、以下に示す。なお、微細流路３内にて流体を流す駆動手段は、注入部２に連結した押出ポンプを用いる方法、排出部３に連結した吸引ポンプを用いる方法、毛管力および／または吸水物質を用いる方法のいずれでもよい。
【００９７】
１．ブロッキング
サンプル中の、アディポネクチン以外の物質（非検出対象物質）が、微細流路３、固定化部５および分析部８に非特異的に吸着することを防ぐために、非特異吸着防止剤を注入部２から導入して、微細流路３内を満たす。次いで、この非特異吸着防止剤を排出部３から排出する。洗浄溶液を注入部２から導入し、微細流路３内を通過させて排出部４から排出する。これにより、微細流路３内に残留する余分な非特異吸着防止剤を取り除く。好適な非特異的吸着防止剤としては、例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）カゼイン、および高分子ポリマーが挙げられる。
【００９８】
２．サンプルの導入
サンプルを注入部２から微細流路３内に導入する。サンプルは、微細流路３内を移動して固定化部５へ送達される。サンプルが固定化部５を通過する間に、サンプル中のアディポネクチンが固定化部５の第１のペプチドと結合して、固定化部５にて捕捉される。次いで、洗浄溶液を注入部２から導入し、微細流路３内を移動させて排出部４から排出する。これにより、微細流路３内に残留する余分なサンプルを取り除く。
【００９９】
微細流路３内での注入部２から排出部３へのサンプルの移動は連続的に行われてもよいし、断続的に行われてもよい。サンプルを断続的に移動させる場合、例えば、サンプルを固定化部５の領域内にて所定の時間にわたってインキュベートしてもよい。インキュベートすることによって、サンプル中のアディポネクチンペプチドとの反応時間を最適化することができる。
【０１００】
３．固定化部にて捕捉されたアディポネクチンの標識化
標識された第２のペプチドを、注入部２から微細流路３内に導入して、固定化部５へ送達する。この第２のペプチドが固定化部５を通過する間に、第２のペプチドは固定化部５に捕捉されているアディポネクチンと結合する。この操作によって、固定化部５内に捕捉されたアディポネクチンが標識される。
【０１０１】
４．アディポネクチンの分析
分析手段７を用いて標識を検出することによって、分析部８にてアディポネクチンを分析することが可能となる。標識化合物としては、例えば、蛍光化合物または酵素を用いることができる。
【０１０２】
４−１．蛍光化合物を用いたアディポネクチンの分析
上記「３」において標識化合物が蛍光化合物であった場合、分析部８の蛍光を直接観察することによって、アディポネクチンを分析することができる。
【０１０３】
４−２．酵素を用いたアディポネクチンの分析
上記「３」において標識化合物が酵素であった場合、酵素を含む本発明に係るペプチド体をアディポネクチンに結合させた後に、この酵素に対する基質溶液を注入部２から微細流路３内に導入する。基質溶液が固定化部５を通過する間に、アディポネクチンに結合した本発明に係るペプチドの酵素と基質溶液とが反応する。この反応の結果によって得られるシグナルを公知の方法を用いて検出することによってアディポネクチンを分析することができる。当業者は、このような方法を、使用する基質の種類に応じて、適宜選択することができる。
【０１０４】
例えば、上記反応によって蛍光を発する基質を用いた場合は、分析部８にて蛍光を直接観察することによってアディポネクチンを検出することができる。また、上記反応によって吸光度が変化する基質を用いた場合は、分析部８における吸光度を測定することによってアディポネクチンを分析することができる。上記反応によって電気化学活性が変化する基質を用いた場合は、電極を用いた電気化学的な手段によってアディポネクチンを検出することができる。
【０１０５】
なお、標識化合物を用いずに、アディポネクチンを分析することもできる。このような分析を行う場合には、分析手段７として熱レンズ顕微鏡、表面プラズモン共鳴測定装置または水晶発振子などを用いればよい。
【０１０６】
（５）本発明に係る遺伝子
本発明に係る遺伝子は、本発明に係るペプチドをコードする遺伝子であることを特徴としている。本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド配列」は、「核酸配列」または「塩基配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
【０１０７】
本発明に係る遺伝子は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは、一本鎖または二本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であってもよいし、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であってもよい。
【０１０８】
当業者であれば、本発明に係るペプチドのアミノ酸配列に基づいて、所望の遺伝子を容易に取得し得る。また、本発明に係る遺伝子は、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードする遺伝子と融合され得る。
【０１０９】
本発明に係る遺伝子は、本発明に係る遺伝子と相補的な遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアディポネクチンに対する結合性を有するペプチドをコードする遺伝子であってもよい。
【０１１０】
なお、ハイブリダイゼーションは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第３版，Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｌｌ編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ（２００１）」（本明細書中に参考として援用される）に記載されている方法のような周知の方法に従って行われ得る。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同な遺伝子を取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、ヌクレオチド配列やそのヌクレオチド配列の長さによって異なり、当業者であれば適宜設定可能である。
【０１１１】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルタを洗浄することが意図されるが、ハイブリダイゼーションさせるポリヌクレオチドによって、高ストリンジェンシーでの洗浄条件は適宜変更され、例えば、哺乳類由来ＤＮＡを用いる場合は、０．１％ ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ中にて６５℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＤＮＡを用いる場合は、０．１％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、ＲＮＡを用いる場合は、０．１％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、オリゴヌクレオチドを用いる場合は、０．１％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にてハイブリダイゼーション温度での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましい。
【０１１２】
（６）本発明に係る組換えベクター
本発明に係る組換えベクターは、本発明に係る遺伝子を含んでいることを特徴としている。例えば、本発明に係るペプチドをコードする遺伝子が挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。後述するように、このような組換え発現ベクターを宿主に導入することによって、本発明に係るペプチドを宿主中において生成することができる。
【０１１３】
組換え発現ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、宿主の種類に応じて、本発明に係る遺伝子を発現させるプロモーター配列を適宜選択し、これと本発明に係る遺伝子とが組み込まれたプラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８およびｐＵＣ１１８など）、ファージ、コスミド、またはウイルス（レトロウイルス、ワクシニアウイルスおよびバキュロウイルスなど）などを組換え発現ベクターとして用いればよい。
【０１１４】
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればよい。宿主が大腸菌（Escherichia coli）である場合は、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、およびｌｐｐプロモーターなどが挙げられる。また、動物細胞を宿主として用いる場合は、例えば、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、およびＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
【０１１５】
また、本発明に係る組換えベクターには、必要に応じて当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、またはＳＶ４０複製起点などを付加することができる。さらに、本発明に係る組換えベクターには、本発明に係るペプチドとの他のタンパク質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡ、および緑色蛍光ポリペプチド（ＧＦＰ：Green Fluorescent Protein））との融合タンパク質を宿主中において発現させることができるように、この他のタンパク質をコードする遺伝子が含まれていてもよい。
【０１１６】
本発明に係る組換えベクターには、少なくとも１つの選択マーカーが含まれていることが好ましい。このような選択マーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子またはネオマイシン耐性が挙げられ、大腸菌や他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。選択マーカーを用いれば、本発明に係る組換えベクターが宿主に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で本発明に係る遺伝子が発現しているか否かを確認することができる。
【０１１７】
宿主は、特に限定されるものではなく、例えば、細胞、微生物、植物または動物（ヒトを除く）を挙げることができる。細胞としては、例えば、昆虫細胞（ｓｆ９細胞）、動物細胞（サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３およびヒトＦＬ細胞など）を挙げることができる。また、微生物としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、および酵母（出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）および分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）など）を挙げることができる。
【０１１８】
本発明に係る組換えベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、遺伝子銃、ＰＥＧ法、またはエレクトロポレーション法などの従来公知の方法を好適に用いることができる。
【０１１９】
（７）形質転換体
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る組換えベクターを含んでいることを特徴としている。形質転換の対象となる生物としては特に限定されるものではなく、上述の宿主を挙げることができる。すなわち、本明細書において、「形質転換体」は、細胞だけでなく、生物個体を含むことが意図される。
【０１２０】
形質転換体の作製方法（生産方法）としては特に限定されるものではないが、例えば、上述したように当業者に公知の形質転換方法を用いて、本発明に係る組換えベクターを宿主に導入して形質転換する方法を挙げることができる。
【０１２１】
形質転換体の選択採取方法は、例えば、本発明に係る組換えベクターに含まれる上述の選択マーカーを利用して、従来公知の方法に従って実施することができる。
【０１２２】
本発明に係る組換えベクターが宿主に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、本発明に係る組換えベクターを導入した宿主からＤＮＡを調製し、本発明に係る遺伝子またはベクターに特異的なプライマーを設計してＰＣＲを行えばよい。ＰＣＲによって増幅された産物に対して、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液などを用いて、この産物を検出することによって、宿主に本発明に係る組換えベクターが導入されたこと（宿主が形質転換されたこと）を確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅された産物を検出することもできる。
【０１２３】
このようにして得られた、本発明に係る形質転換体は、当業者に公知の方法を用いて、本発明に係るペプチドを容易に大量に取得するために使用することができる。例えば、宿主が細胞の場合、本発明に係る組換えベクターを含む細胞を培養することによって、本発明に係る遺伝子が発現し、本発明に係るペプチドが生産される。細胞内において生産された本発明に係るペプチドは、当業者に公知の方法を用いて精製することができる。
【０１２４】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１２５】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１２６】
［実施例１］
＜セルロースメンブレン上でのペプチドの合成（スポット合成）＞
アディポネクチンに対する結合性を有するアミノ酸配列を同定するために、Ｆｍｏｃ法によるペプチドスポット合成法を利用したペプチド合成装置（Model MultiPep RS（Intavis AG））を用いて、セルロースメンブレン上においてペプチドを合成した。
【０１２７】
セルロースメンブレン上には、末端がアミノ基に改変されたポリエチレングリコールが固定化されており、このアミノ基にＦｍｏｃアミノ酸を、ＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）／ＨＯＢｔ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）を使用して結合させた。次いで、Ｆｍｏｃを除去した。そして、Ｆｍｏｃの除去によって現れたアミノ酸のアミノ基に、さらなるＦｍｏｃアミノ酸を、ＤＩＣ／ＨＯＢｔを使用して結合させた。
【０１２８】
Ｆｍｏｃの除去、およびこの除去によって現れるアミノ酸のアミノ基へのＦｍｏｃアミノ酸の結合を１サイクルとして、このサイクルを繰り返してペプチドを合成した。合成の最終的なサイクルの後、全てのペプチドのＮ末端と側鎖とを脱保護した。これにより、配列番号１〜１５に示すアミノ酸配列からなるペプチドを得た。
【０１２９】
＜酵素免疫法によるペプチドとアディポネクチンとの結合の測定＞
酵素免疫法の１つであるサンドイッチ法を用いて、上述のようにして合成した各ペプチドとアディポネクチンとの結合を測定した。
【０１３０】
まず、セルロースメンブレンをエタノールに浸漬した。次いで、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）でセルロースメンブレンを連続的に洗浄することによって、セルロースメンブレン中のエタノールをＰＢＳに置換した。非特異的結合を阻害するために、ブロッキング溶液（１％の粉末状乳入りＰＢＳ）中でセルロースメンブレンを一晩インキュベートした。
【０１３１】
その後、セルロースメンブレンを、０．２５μｇ／ｍＬのヒトアディポネクチン（R&D Systems）入りブロッキング溶液（１％の粉末状乳入りＰＢＳ）と１時間インキュベートした。インキュベート後のセルロースメンブレンをＰＢＳＴ（０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０入りＰＢＳ）で洗浄した。洗浄後のセルロースメンブレンを、０．２５μｇ／ｍＬのＨＲＰが標識された抗ヒトアディポネクチン抗体（R&D Systems）を含むブロッキング溶液と１時間インキュベートし、再度ＰＢＳＴで５回洗浄した。
【０１３２】
そして、１ｍＭの過酸化水素を含む１００μＭの蛍光基質（Amplex Red（Invitrogen））を、セルロースメンブレンに添加し、１０分間反応させた。蛍光イメージャー（GE Healthcare）を用いて、５４０ｎｍの光で合成スポットにおける蛍光基質を励起して、この蛍光基質からの５９５ｎｍの吸収波長を測定することによって、合成スポットの蛍光強度を決定した。ペプチドの結合強度は合成スポットの蛍光強度として算出した。
【０１３３】
［比較例１］
実施例１と同様の方法に従って、配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるペプチドを合成した。そして、合成したペプチドとアディポネクチンとの結合を実施例１と同様にして測定した。
【０１３４】
実施例１および比較例１に用いたペプチドのアミノ酸配列を一文字表記で表２に示す。
【０１３５】
【表２】
【０１３６】
［結果１］
実施例１および比較例１における測定の結果を図３に示す。配列番号１〜１５に示すアミノ酸配列からなるペプチド（実施例１）は、配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるペプチド（比較例１）に比べて有意に高い蛍光強度を示した。よって、配列番号１〜１５に示すアミノ酸配列からなるペプチドは、アディポネクチンに結合することが示された。
【０１３７】
［実施例２］
＜マイクロプレートを用いた酵素免疫法によるペプチドとアディポネクチンとの結合の測定＞
酵素免疫法を用いて、マイクロプレートに固定化されたアディポネクチンと、ビオチンを標識したペプチド（ビオチン標識ペプチド）との結合を以下のようにして測定した。
【０１３８】
まず、配列番号１４、１５に示すペプチドのＣ末端にリジンを付加したペプチドを作製した。次いで、作製したペプチドのリジン側鎖のアミノ基にビオチンを標識することによって、ビオチン標識ペプチドを作製した。
【０１３９】
９６ウェルのマイクロプレートに、ＰＢＳで調製した５μｇ／ｍＬのアディポネクチン（R&D Systems）を１ウェルにつき１００μＬ加え、３７℃で１時間インキュベートした。これにより、マイクロプレートのウェル内にアディポネクチンを固定化した。次に、非特異的結合を阻害するために、ブロッキング溶液（Protein-Free Blocking Buffer、PIERCE）を１ウェルにつき３００μＬ加えて室温で２時間インキュベートした。インキュベート後に、ウェルをＰＢＳＴ（０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０入りＰＢＳ）で３回洗浄した。１ｍＭのビオチン標識ペプチドを１ウェルにつき１００μＬ／加えて室温で１時間インキュベートした。インキュベート後にウェルを、再度ＰＢＳＴで洗浄した。
【０１４０】
次に、ブロッキング溶液（Protein-Free Blocking Buffer、PIERCE）で２００倍に希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｒ＆Ｄ Systems）を１ウェルにつき１００μＬ加えて室温で１時間インキュベートした。インキュベート後に、ウェルをＰＢＳＴで洗浄した。そして、ＴＭＢ（tetramethylbenzidine）を１ウェルにつき１００μＬ加えて、２０分間反応させた。次いで、１ＭのＨＣｌを１ウェルにつき１００μＬ加えて反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（Bio-Rad）を用い、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１４１】
［比較例２］
実施例２と同様の方法によって、配列番号１７に示すアミノ酸配列からなるペプチドとアディポネクチンとの結合を測定した。
【０１４２】
実施例２および比較例２に用いたペプチドのアミノ酸配列を一文字表記で表３に示す。
【０１４３】
【表３】
【０１４４】
［結果２］
実施例２および比較例２における測定の結果を図４に示す。配列番号１４および１５に示すアミノ酸配列からなるペプチド（実施例２）は、配列番号１７に示すアミノ酸配列からなるペプチド（比較例２）に比べて有意に高い吸光度を示した。よって、配列番号１４および１５に示すアミノ酸配列からなるペプチドは、アディポネクチンに結合することが示された。
【０１４５】
［実施例３］
＜アミノ酸が置換されたペプチドとアディポネクチンとの結合の測定＞
上述の「（１）本発明に係るペプチド」に示した、アミノ酸を分類した群に基づいて、アミノ酸の保存的置換を行ったペプチドと、アディポネクチンとの結合を以下のようにして測定した。
【０１４６】
まず、配列番号８および９に示すアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号８のＣ末端のトリプトファンを同じ芳香環を持つチロシンに置換したペプチド（配列番号１８に示すアミノ酸配列からなるペプチド）、ならびに配列番号９のＮ末端のアルギニンを同じ塩基性アミノ酸であるリジンに置換したペプチド（配列番号１９に示すアミノ酸配列からなるペプチド）を実施例１と同様に合成した。
【０１４７】
次に、実施例１と同様の方法によって、合成した配列番号８、９、１８および１９に示すアミノ酸配列からなるペプチドと、アディポネクチンとの結合を測定した。
【０１４８】
実施例３に用いたペプチドのアミノ酸配列を一文字表記で表４に示す。
【０１４９】
【表４】
【０１５０】
［結果３］
実施例３における測定の結果を図５に示す。配列番号１８、１９に示すアミノ酸配列からなるペプチドは、配列番号８、９に示すアミノ酸配列からなるペプチドに比べて同程度の蛍光強度を示した。すなわち、配列番号１８、１９に示すアミノ酸配列からなるペプチドは、アディポネクチンに対する結合性を保持していた。
【産業上の利用可能性】
【０１５１】
本発明に係るペプチドは、アディポネクチンの認識材料または分析試薬として用いることができる。よって、本発明は、生体サンプルを分析する分野に利用することができる。
【符号の説明】
【０１５２】
１ 分析装置
２ 注入部
３ 微細流路
４ 排出部
５ 固定化部
６ 基板
７ 分析手段
８ 分析部
９ 蓋
１２ 注入孔
１４ 排出孔
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アディポネクチンを分析する技術に関するものであり、より詳細には、アディポネクチンに対する結合性を有するペプチド、ならびにこれらのペプチドを用いた、アディポネクチンの分析方法および分析装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アディポネクチン（ＡＣＲＰ３０またはＧＢＰ２８ともいう。）は、主に脂肪組織から特異的に産生および分泌されるサイトカインであり、２４４個のアミノ酸からなるタンパク質である（非特許文献１参照）。アディポネクチンは、インスリン感受性を改善する効果、および肝臓や筋肉における脂肪燃焼を促進する効果を有していることが示されている。このような効果をアディポネクチンが有しているため、アディポネクチンの分泌を正常化することによって、高血圧、脂質代謝異常または糖尿病といったメタボリックシンドロームの諸症状を総合的に改善できると期待されている（非特許文献２参照）。
【０００３】
メタボリックシンドロームから引き起こされる疾患の一つである糖尿病に関し、厚生労働省による２００６年度の実態調査によると、糖尿病を強く疑われる人の数が約８２０万人、糖尿病の可能性を否定できない人の数が約１，０５０万人であり、合わせて推定約１，８７０万人である。糖尿病を含む生活習慣病やその予備軍は今後も増加傾向にあるとされており、日々の生活改善などによる予防が重要とされている。
【０００４】
上述したようにアディポネクチンがメタボリックシンドロームと関係していることから、アディポネクチンは、生活習慣病の指標になる可能性があるとされている。それ故、生体内のアディポネクチンの濃度を測定することは、健康維持、または代謝異常の早期発見につながると考えられている。
【０００５】
従来、アディポネクチンは、タンパク質である抗体（アディポネクチンを免疫原として得られたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）をアディポネクチンの認識材料として用いた免疫学的な測定方法によって測定されている（特許文献１〜２参照）。このような免疫学的な測定方法の一つには、抗体を使用したサンドイッチ法が用いられている。
【０００６】
サンドイッチ法を用いたアディポネクチンの測定方法は、具体的には以下のとおりに実施される。まず、マイクロプレート内にアディポネクチンに特異的な抗体を固定化する。次に、アディポネクチンを含むサンプルを添加し、サンプル中のアディポネクチンとこの抗体とを反応させる。これにより、マイクロプレートにアディポネクチンを固定化する。さらに、酵素または蛍光化合物などで標識された、マイクロプレート内に固定化した抗体とエピトープが異なるさらなる抗体を、固定化したアディポネクチンと反応させる。そして、この酵素または蛍光化合物を検出することによって、アディポネクチンを検出する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−３３３５０４（２００４年１１月２５日公開）
【特許文献２】国際公開第２００４／０８６０４０号パンフレット（２００４年１０月７日公開）
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Philipp E. Scherer, et al., J. Biol. Chem., 1995, vol. 270, pp. 26746-26749
【非特許文献２】Christian Weyer, et al., J. Clin. End. & Metab., 2001, vol. 86, 1930-1935
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のような従来技術において、アディポネクチンを検出するためには、抗体が必要不可欠である。しかしながら、抗体は、動物に免疫したり、ハイブリドーマ細胞を作製したりした後に、さらに精製を行うことによって得られるため、抗体の生産に長い時間を必要とする。このため、抗体を効率よく量産することが困難であり、生産コストも高くなるという問題点がある。さらに、抗体は、生産のロット毎に品質が変わるため、品質の安定化の問題点もある。
【００１０】
また、タンパク質は、分析条件（温度、湿度、ｐＨ、酸素、光または腐敗など）の影響を受けて、その構造が変化し、失活することがある。タンパク質は構造的に不安定であるため、タンパク質である抗体を使用する場合、分析条件によってタンパク質のアディポネクチンに対する結合性が変化する。すなわち、タンパク質を用いた分析では、分析条件によって異なる分析結果が得られる（分析結果の信頼性が低い）という問題点がある。さらに、アディポネクチンの分析を目的として、タンパク質を基材に固定化する場合、この固定化によってタンパク質が変性し、タンパク質のアディポネクチンに対する結合性が低下することがあるという問題点もある。その上、タンパク質は同一のアミノ酸が複数存在するため、同一官能基が複数存在する。このため、タンパク質の所望の部位を修飾したり、標識したりすることが難しいという問題点もある。
【００１１】
本発明は、上述した問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、生産性、品質および構造の安定性、ならびに利便性に優れ、かつ安価な、アディポネクチンの認識材料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、独自の観点に基づいて、アディポネクチンに対する結合性を有するペプチドを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明に係るペプチドは、５０個以下のアミノ酸からなり、かつアディポネクチンに対する結合性を有していることを特徴としている。
【００１４】
本発明に係るペプチドは、配列番号１〜１５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでいるペプチドであっても、配列番号１〜１５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換または付加が生じているアミノ酸配列を含んでいるペプチドであってもよい。
【００１５】
本発明に係るペプチドにおいて、前記アミノ酸の置換は保存的置換であることが好ましく、（ａ）アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびグリシンからなる群、（ｂ）アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群、（ｃ）ヒスチジン、リシンおよびアルギニンからなる群、（ｄ）アラニン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、バリンおよびメチオニンからなる群、ならびに、（ｅ）フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンからなる群、より選択される単一の群に含まれる２つのアミノ酸の間で生じている置換であることが好ましい。
【００１６】
また、本発明に係るペプチドは、２０個以下のアミノ酸からなることがより好ましく、配列番号１〜１５、１８および１９のいずれかに示されるアミノ酸配列からなってもよい。
【００１７】
本発明に係るペプチドは、高分子であるタンパク質（例えば、抗体）と比べてアミノ酸の数が極端に少ない。このため、本発明に係るペプチドは、（ｉ）化学合成法によって容易に得ることができ、（ｉｉ）上述した分析条件に起因する構造の変化が生じず、アディポネクチンに対する結合性が低下しない、（ｉｉｉ）ペプチド内に同一アミノ酸が存在しないか、またはペプチド内に存在する同一アミノ酸の数が少ないので、特定のアミノ酸を標的とした修飾または標識を簡便に行うことができる。このように、本発明に係るペプチドは、生産性、品質および構造の安定性、ならびに利便性に優れ、かつ安価なアディポネクチン認識材料として使用され得る。
【００１８】
本発明に係るペプチドは、上述したようにペプチド内に同一アミノ酸が存在しないか、またはペプチド内に存在する同一アミノ酸の数が少ないため、ペプチドの特定の部位を介してペプチドを基材へ簡便に固定化することができる。このような基材を用いれば、分析方法または分析装置の利便性、分析精度、または信頼性を格段に高めることができる。
【００１９】
本明細書において、「ペプチド」は、２〜５０個、好ましくは７〜５０個、より好ましくは７〜２０個のアミノ酸がペプチド結合したものが意図される。分子認識材料の１つである抗体の、超過変部位のアミノ酸の個数は一般的に１０個程度であり、このことは、１０個程度のアミノ酸からなるペプチドが標的タンパク質を認識可能であることを示している。このような技術常識に基づいて、アミノ酸の個数が上述した範囲内であれば、本発明に係るペプチドがアディポネクチンを十分に認識することができることを、当業者は容易に理解する。さらに、アミノ酸の個数が上述した範囲内であれば、ペプチドを化学合成法によって効率よく合成することができる。
【００２０】
本明細書において、「結合性」とは、分子間相互作用（例えば、静電相互作用、π−π相互作用、双極子相互作用、疎水相互作用、水素結合、配位結合、および水和結合）に基づいて結合する性質のことである。よって、「アディポネクチンに対する結合性を有するペプチド」は、分子間相互作用によってアディポネクチンに結合する性質を有するペプチドが意図される。結合性は、酵素免疫測定法、または表面プラズモン共鳴などの従来公知の方法を用いることにより評価することができる。
【００２１】
本発明に係るペプチドは、リンカーを含んでいてもよい。本明細書において「リンカー」は、２つ以上の物質を、互いの性質を保持したまま連結し得る構造をいい、リンカーを介して、本発明に係るペプチドを、アディポネクチンに対する結合性を保持した状態で他の物質（基材、さらなる分子など）に固定化することができる。なお、リンカーを含むペプチドは、他の物質と実際に連結していなくてもよい。
【００２２】
また、本発明に係るペプチドは標識されていてもよい。本明細書において「標識」は、他と異なった特徴を目的の物質に付与することをいい、生体内に存在し得る分子またはその類似物（いわゆる生体関連分子）の付加であっても、蛍光化合物の付加であってもよい。生体関連分子としては、酵素（アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）および西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）など）、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン等が挙げられるがこれらに限定されない。なお、本発明に係るペプチドは、上述したリンカーを介して標識されても、介さずに標識されてもよい。本明細書において、生体関連分子および蛍光化合物を総称して標識化合物ともいう。
【００２３】
本発明に係る分析方法は、アディポネクチンを分析するために、本発明に係るペプチドの少なくとも１種を用いることを特徴としている。好ましくは、本発明に係る分析方法は、本発明に係るペプチドの少なくとも１種とアディポネクチンとの複合体を分析する工程を包含し、より好ましくは、サンプル中のアディポネクチンを分析するために、本発明に係るペプチドの少なくとも１種をサンプルとインキュベートする工程をさらに包含する。
【００２４】
用語「サンプル」は、当該分野において標本、または調製物と同義で用いられ、本明細書において、「生物学的サンプル」またはその等価物が意図される。「生物学的サンプル」は、供給源としての生物材料（例えば、個体、体液、細胞株、組織培養物、組織切片、組織生検など）から得られる、任意の調製物が意図される。本発明に適用される生物学的サンプルとしては、体液（例えば、血液、唾液、血清、血漿、尿、髄液、分泌液など）またはその希釈物が挙げられる。好ましい生物学的サンプルは、被験体から得られたサンプル（すなわち被験体サンプル）である。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は当該分野で周知である。本明細書において、用語「サンプル」としては、上記生物学的サンプル以外に、上記生物学的サンプルから抽出したタンパク質サンプル、ゲノムＤＮＡサンプルおよび／または総ＲＮＡサンプルもまた挙げられる。
【００２５】
本明細書において、「インキュベートする」は複数の物質を共存させかつ互いに十分接触し得る状態におくことが意図される。上述したように、本発明に係るペプチドはいずれもアディポネクチンに対する結合性を有しているので、本発明に係るペプチドをサンプルとインキュベートすることによって、サンプル中にアディポネクチンが存在する場合は、「アディポネクチン−ペプチド複合体」が形成される。なお、「インキュベートする」工程は、本発明に係るペプチドをサンプル中に添加する工程であっても、サンプルと混合する工程であってもよい。
【００２６】
本明細書において、「分析」は、サンプル中の目的物質の量（例えば、モル数または濃度）の定量的または半定量的な「測定」と、サンプル中の目的物質の存在の「検出」とが包含される。ペプチドとアディポネクチンとの複合体を分析する工程は、複合体の存在を検出する工程であっても、複合体の量を測定する工程であってもよく、当該分野において公知の種々の解析手順（例えば、抗ペプチド抗体または抗アディポネクチン抗体を用いたサンドイッチ法、または直接法、あるいはペプチドの標識化）、あるいは公知の種々の解析手段（吸光度測定、蛍光強度測定、蛍光偏光、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、水晶マイクロバランス（ＱＣＭ）などを用いたシグナルの検出）を適用することができる。また、本発明に係るペプチドは分析条件に起因して構造が変化しにくいため、上述した分析方法を用いれば、分析条件に影響されない、安定した結果を得ることができる。
【００２７】
本発明に係るペプチドは基材上に固定化されていてもよい。すなわち、本発明に係る基材は、本発明に係るペプチドの少なくとも１種が固定化されていることを特徴としている。この構成によれば、基材上にて行われるべき種々の公知の分析手順（例えばマイクロチップ技術）と組み合わせて、アディポネクチンの分析を容易に行うことができる。
【００２８】
本発明に係る分析方法は、アディポネクチンを分析するために、本発明に係る基材を用いることを特徴としている。好ましくは、本発明に係る分析方法は、本発明に係る基材上のペプチドとアディポネクチンとの複合体を分析する工程を包含し、より好ましくは、サンプル中のアディポネクチンを分析するために、本発明に係る基材をサンプルとインキュベートする工程をさらに包含する。この構成によれば、基材上に固定化された本発明に係るペプチドに結合したアディポネクチンを、直接的または間接的に分析することができる。直接的な分析方法としては、例えば、ＳＰＲ、ＱＣＭが挙げられ、間接的な分析方法としては、例えば、二次的な生体認識材料（例えば抗体）を用いたサンドイッチ法などが挙げられる。
【００２９】
このように、本発明に係る分析方法は、基材上に固定化されているペプチドを用いても、固定化されていないペプチドを用いてもよい。ペプチドが基材上に固定化されている場合は、ペプチドを介して基材に固定化されたアディポネクチンを例えばＳＰＲやＱＣＭによって検出すればよい。ペプチドが基材上に固定化されていない場合は、例えば、蛍光標識したペプチドを用いてアディポネクチンと溶液中にて複合体を形成させて、生じた蛍光偏光を測定すればよい。
【００３０】
本発明に係る分析装置は、アディポネクチンを分析するために、本発明に係るペプチドの少なくとも１種を備えていることを特徴としている。この構成によれば、本発明に係るペプチドは分析条件に起因する構造変化が生じにくいので、この分析装置を用いれば、分析条件に左右されない安定した分析結果を得ることができる。本明細書において、「分析装置」とは、アディポネクチンを装置内に捕捉し、アディポネクチンが捕捉されている情報をシグナルに変換し、このシグナルを検出するための一連の操作を実施するに必要な構成を有しているものが意図される。
【００３１】
本発明に係る分析装置は、アディポネクチンを分析するために、本発明に係る基材を備えていることを特徴としている。この構成を用いれば、この分析装置に、アディポネクチンを直接的または間接的に分析する手段を適用することができる。
【００３２】
本発明に係る分析装置は、アディポネクチンを分析するために、サンプルを受容するサンプル受容部を備えており、アディポネクチンを捕捉する捕捉部が該サンプル受容部の内部に設けられており、捕捉部には、本発明に係るペプチドが固定化されているか、あるいは本発明に係る基材が配置されていればよい。そして、捕捉されたアディポネクチンを分析する分析手段がさらに備えられていることが好ましく、この場合、分析手段はサンプル受容部の内部の分析部に向けて配置されている。分析部は、サンプル受容部の内部の所定位置として予め規定されている態様であってもよいが、分析手段の種類およびその設定に従って任意に規定される態様であってもよい。すなわち、後者の態様であれば、分析部は、分析手段による分析が可能な領域として規定される。
【００３３】
本発明に係る分析装置において、サンプル受容部は流路を形成していてもよく、この場合、分析部が捕捉部の下流であってもよい。サンプル受容部が流路を形成している場合は、流路、および流路に流体を注入する注入部によって、サンプル受容部が構成され、この場合、サンプル受容部は、流路から流体を排出する排出部を含んでも含まなくてもよい。本明細書において、用語「上流」および「下流」は、流路内における流体の流れを基準とした概念であり、特に説明を加えない限り、流路における流体の注入部側が「上流」であり、流体の排出部側が「下流」である。また、本発明に係る分析装置は、基板上に形成したマイクロチャネル型分析装置であってもよい。
【００３４】
本発明に係る遺伝子は、本発明に係るペプチドをコードしていることを特徴としている。本発明に係る組換えベクターは、本発明に係る遺伝子を含んでいることを特徴としている。本発明に係る形質転換体は、本発明に係る組換えベクターを含んでいることを特徴としている。
【発明の効果】
【００３５】
本発明によれば、生産性、品質および構造の安定性、ならびに利便性に優れ、かつ安価なアディポネクチンの認識材料を提供することができる。このようなアディポネクチンの認識材料を用いることによって、いかなる分析条件においても安定した分析結果が得られる分析方法および分析装置を低コストで提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明に係る分析装置の一実施形態の断面の概略図である。
【図２】本発明に係る分析装置の一実施形態を上面から見た概略図である。
【図３】ペプチドのアディポネクチンに対する結合を測定した結果を示すグラフである。
【図４】ペプチドのアディポネクチンに対する結合を測定した結果を示すグラフである。
【図５】ペプチドのアディポネクチンに対する結合を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
（１）本発明に係るペプチド
本発明は、５０個以下のアミノ酸からなり、かつアディポネクチンに対する結合性を有しているペプチドを提供する。一実施形態において、本発明に係るペプチドは、配列番号１〜１５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでいるペプチドである。また、一実施形態において、本発明に係るペプチドは、配列番号１〜１５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換または付加が生じているアミノ酸配列を含んでいるペプチドである。
【００３８】
「１個または数個のアミノ酸の置換または付加」とは、当業者が公知の手法に従って容易に置換または付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下、なおさらに好ましくは３個以下）のアミノ酸が置換または付加されていることを意味する。
【００３９】
アミノ酸の置換は、保存的置換であることが好ましい。「保存的置換」とは、特定のアミノ酸から、このアミノ酸と同様な化学的性質および／または構造を有する他のアミノ酸に置換されていることをいう。化学的性質としては、例えば、疎水性度（疎水性および親水性）、電荷（中性、酸性および塩基性）が挙げられる。構造としては、例えば、側鎖、ならびに側鎖の官能基として存在する芳香環、脂肪炭化水素基およびカルボキシル基が挙げられる。
【００４０】
アミノ酸の化学的性質および構造を表１に示す。表１に示す疎水性度は、値が大きいほど疎水性が高く、小さいほど親水性が高いことを示す。アミノ酸は、例えば、疎水性であるか、親水性であるかによって分類することができる。
【００４１】
【表１】
【００４２】
アミノ酸の疎水性度、電荷または側鎖の官能基の種類に基づいて、化学的性質および／または構造が同様であるアミノ酸を例えば、以下の（ａ）〜（ｅ）の５つの群に分類することができる。
（ａ）親水性かつ中性を示すアミノ酸の群・・・アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびグリシン
（ｂ）酸性を示すアミノ酸の群・・・アスパラギン酸およびグルタミン酸
（ｃ）塩基性を示すアミノ酸の群・・・ヒスチジン、リジンおよびアルギニン
（ｄ）疎水性かつ中性を示すアミノ酸の群・・・アラニン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、バリンおよびメチオニン
（ｅ）芳香環を有するアミノ酸の群・・・フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン。
【００４３】
このような分類を用いれば、保存的置換とは、同じ群内のアミノ酸同士の置換であるといえ、例えばセリンとスレオニンとの置換、リジンとアルギニンとの置換、およびフェニルアラニンとトリプトファンアミノとの置換が挙げられる。
【００４４】
アミノ酸の付加は、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端にさらなるアミノ酸が結合された状態が意図され、アディポネクチンに対する結合性を有しているかぎり、本発明に係るペプチドが複数結合されたペプチドであってもよい。本発明に係るペプチドとさらなるアミノ酸とは、直接的に結合されてもよいし、リンカーを介して結合されてもよい。同様に、本発明に係るペプチドが複数結合される場合は、これらのペプチドは、互いに直接的に結合されてもよいし、後述するリンカーを介して結合されてもよい。
【００４５】
また、本発明に係るペプチドは、付加的なペプチドを含むものであってもよい。付加的なペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇなどのエピトープ標識ペプチドが挙げられる。
【００４６】
なお、本発明に係るペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているものであればよいが、これに限定されるものではなく、糖鎖やイソプレノイド基などのペプチド以外の構造を含む複合ペプチドであってもよい。アミノ酸は、表１に示す２０種のアミノ酸であることが好ましいがこれらに限定されない。アミノ酸の官能基は修飾されていてもよい。アミノ酸はＬ型であることが好ましい。
【００４７】
本発明に係るペプチドは、本発明者らが独自に見出した新規ペプチドであり、後述する実施例にて示すように、アディポネクチンに結合することが実証されている。このような機能は、本発明に係るペプチドのアミノ酸配列に基づいて当業者が容易に予測し得るものではない。本発明に係るペプチドは、当該分野において公知の任意の手法に従って容易に作製され得、例えば、化学合成されても、組換え発現されてもよい。化学合成法としては、固相法または液相法を挙げることができる。固相法において、例えば、市販の各種ペプチド合成装置（Model MultiPep RS（Intavis AG）など）を利用することができる。
【００４８】
本発明に係るペプチドは、リンカーを含んでいてもよい。本発明に係るペプチドがリンカーを含んでいることによって、本発明に係るペプチド同士を、または本発明に係るペプチドと他の物質（後述する基材など）とを、リンカーを介して結合することができる。本発明に係るペプチド同士が結合される場合、同一のペプチド同士が結合されてもよいし、異なるペプチド同士が結合されてもよい。
【００４９】
リンカーは、例えば、本発明に係るペプチドのアミノ酸と結合（例えば、共有結合）されていてもよい。リンカーは、より具体的には、本発明に係るペプチドのＮ末端のアミノ酸のアミノ基または側鎖と結合されていてもよいし、Ｃ末端のアミノ酸のカルボキシル基または側鎖と結合されていてもよいし、Ｎ末端およびＣ末端のアミノ酸以外のアミノ酸の側鎖と結合されていてもよい。さらに、本発明に係るペプチドのＮ末端および／またはＣ末端にさらなるアミノ酸を付加し、付加されたさらなるアミノ酸のアミノ基もしくはカルボキシル基または側鎖に、リンカーを結合させてもよい。
【００５０】
本発明に係るペプチドに付加されるさらなるアミノ酸は、例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンおよびシステインであることが好ましい。リジン、アルギニンおよびヒスチジンの側鎖に存在するアミノ基にリンカーを簡便に結合させることができ、システインの側鎖に存在するチオール基にリンカーを簡便に結合させることができる。
【００５１】
リンカーの末端は、ペプチドと結合できるように、適切な官能基を有していることが好ましい。このような官能基としては、例えば、アミノ基、チオール基、カルボキシル基および水酸基が挙げられる。どのような官能基を使用するかは、リンカーが結合されるペプチドに基づいて決定すればよいが、好ましい官能基はアミノ基またはチオール基である。
【００５２】
リンカーを本発明に係るペプチドに結合させるときには、当業者に公知の方法を用いて、リンカーを結合するアミノ酸以外のアミノ酸の官能基を保護することが好ましい。これによって、リンカーを結合させたい官能基と選択的に反応させることができるため、ペプチドの目的の部位にリンカーを結合させることができる。
【００５３】
リンカーとしては、例えば、炭素鎖、ペプチドおよび糖鎖が挙げられる。炭素鎖は、例えば、置換されたアルキル基であってもよいし、無置換のアルキル基であってもよい。また、炭素鎖中に、酸素原子、窒素原子および／または硫黄原子が存在していてもよい。
【００５４】
また、オキシアルキレンの両端に官能基が導入された構造の化合物（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）をリンカーとして使用することもできる。
【００５５】
また、ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル−４−[Ｎ−マレイミドメチル]シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Sulfosuccinimidyl-4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate））などのクロスリンカーと呼ばれる化合物を、リンカーとして使用することもできる。式（１）で表されるｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣは、チオール基と反応するマレイミド基とアミノ基に反応するスクシンイミド基を有している。ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣは、このように２つの反応部位を有しているため、例えば、式（２）で表されるように、マレイミド基をペプチドのチオール基に結合させ、スクシンイミド基を標識化合物のアミノ基（あるいは、基材上のアミノ基）に結合させることができる。
【００５６】
【化１】
【００５７】
【化２】
【００５８】
リンカーの長さが短すぎると、ペプチドと他の物質（基材など）とを十分に離間できず、その結果、互いに干渉しやすい。また、リンカーの長さが長すぎるとリンカーの折れ曲がりが生じやすく、その結果、ペプチドのアディポネクチンに対する結合性を損なう可能性がある。このため、リンカーの長さは、特に限定されないが、０．５〜１０ｎｍ（５〜１００Å）であることが好ましい。なお、リンカーの種類は、例えば、ペプチドのアミノ酸配列、またはペプチドに付加するさらなるアミノ酸に応じて適宜選択することができる。
【００５９】
また、本発明に係るペプチドは、標識されていてもよい。標識は、生体関連分子の付加であってもよいし、蛍光化合物の付加であってもよい。ペプチドは直接的に標識されてもよいし、リンカーを介して標識されてもよい。
【００６０】
本明細書において「生体関連分子」とは、生体内に存在し得る分子、またはその類似体をいう。生体関連分子は、天然に存在するものであっても、人工的に合成されたものであっても、それらの組合せであってもよい。生体関連分子としては、例えば、核酸、タンパク質（酵素であるアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）および西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）など）、ペプチド、および糖鎖、ならびに低分子化合物（ホルモン、ビオチンおよびアビジンなど）が挙げられる。
【００６１】
蛍光化合物としては、例えばフルオロセイン（ＦＩＴＣ）、ローダミンおよびローダミン誘導体、テキサスレッド、Ｃｙ３、ならびにＣｙ５などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６２】
上述した本発明に係るペプチドを、少なくとも２種以上組み合わせて使用してもよい。例えば、後述する基材などに、２種以上のペプチドをそれぞれ個別に固定化してもよいし、２種以上のペプチドが直接的にまたはリンカーを介して結合したものを固定化してもよい。このように、アディポネクチンに対して結合する部位（エピトープ）が異なる複数のペプチドを用いれば、複数種のペプチドが１つのアディポネクチンと結合するため、アディポネクチンに対する結合性を高めることができ、本発明に係る分析方法または分析装置の感度を向上させることができる。
【００６３】
（２）本発明に係る基材
本発明に係る基材は、本発明に係るペプチドの少なくとも１種が固定化されていることを特徴としている。本明細書において、「基材」はペプチドに足場を提供する（すなわちペプチドが固定化される）ものであれば特に限定されない。基材としては、例えば、ポリスチレンおよびポリカーボネートなどのプラスチック、セルロースおよびデキストランなどの生体高分子、金（Ａｕ）、銅（Ｃｕ）、銀（Ａｇ）、白金（Ｐｔ）およびチタン（Ｔｉ）などの金属、ガラス、セラミックス、樹脂などが挙げられる。これらの基材は、用途に応じて任意の形状で用いることができ、例えば、基板（スライド、プレート、チップ、チューブなど）、微粒子、ビーズ、メンブレンなどであってもよい。
【００６４】
本発明に係るペプチドの基材への固定化方法としては、例えば親水性や疎水性を利用した吸着によって固定化する方法、またはペプチドと基材とを結合（例えば、共有結合）することによって固定化する方法が挙げられる。
【００６５】
ペプチドは基材に直接的に固定化されてもよいし、リンカーまたは生体関連分子を介して固定化されてもよい。リンカーおよび／または生体関連分子を用いることによって、ペプチドの所望の部位を基材と結合させることができる。これによれば、リンカーおよび／または生体関連分子が結合することによって、アディポネクチンに対する結合性を保持したままペプチドを基材に固定化することができる。
【００６６】
例えば、生体関連分子としてビオチンおよびアビジンを用いる場合、まず、基材にアビジンを物理的吸着または化学的吸着によって固定化し、次いで、この基材に、ビオチンが標識されているペプチドを添加し、アビジンとビオチンとの結合を介してペプチドを基材に固定化することができる。
【００６７】
また、例えば、リンカーとしてアミノ基とマレイミド基とを有するリンカーを用いる場合、まず、金の基材上に末端にカルボキシル基を修飾したＰＥＧアルカンチオールＳＡＭ（self-assembled monolayer）を形成し、次いで、基材のカルボキシル基を活性化し、活性化したカルボキシル基をリンカーのアミノ基に結合させ、さらに、ペプチドのシステインのチオール基とリンカーのマレイミド基とを結合させることによって、ペプチドを基材に固定化することができる。用いられるべきペプチドにシステインが存在しない場合は、当業者に公知の方法を用いて、そのペプチドのＮ末端またはＣ末端にシステインを付加すればよい。
【００６８】
（３）本発明に係る分析方法
本発明は、アディポネクチンを分析する方法を提供する。本発明に係る分析方法は、本発明に係るペプチドの少なくとも１種、または本発明に係る基材を用いてアディポネクチンを分析することを特徴としている。より具体的には、本発明に係る分析方法は、本発明に係るペプチドとアディポネクチンとの複合体を分析する工程を包含している。この工程は、アディポネクチンがペプチドに結合していることを示すシグナル（吸光度、蛍光強度、蛍光偏光、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、または水晶マイクロバランス（ＱＣＭ）など）を従来公知の方法によって分析する工程であればよい。
【００６９】
また、本発明に係る分析方法は、本発明に係るペプチドの少なくとも１種をサンプルとインキュベートする工程をさらに包含していてもよい。例えば、アディポネクチンを含んでいるサンプル（あるいは、含んでいることが予想されるサンプル）を、溶液中に溶解したペプチド、またはペプチドが固定化された基材などとインキュベートすればよい。この工程によって、アディポネクチンを本発明に係るペプチドに結合させることができる。
【００７０】
アディポネクチンが、溶液中に溶解したペプチドと結合している場合、本発明に係る分析方法には蛍光偏光測定法を用いることができる。具体的には、例えば、蛍光化合物で標識されたペプチドがアディポネクチンと結合することによって、蛍光化合物の蛍光偏光に変化が生じるので、その変化の有無に基づいて、ペプチドに結合したアディポネクチンを検出することができる。
【００７１】
基材などに固定化されたペプチドにアディポネクチンが結合している場合、本発明に係る分析方法には、酵素免疫測定法、ウェスタンブロット法、放射免疫測定法、および免疫沈降法などの免疫学的方法、吸光度測定法、蛍光強度測定法、表面プラズモン共鳴ならびにＱＣＭ法などを用いることができる。
【００７２】
本発明に係る分析方法には、検出感度、特異性または簡便性の観点から酵素免疫測定法を用いることが好ましい。酵素免疫測定法は、特に限定されず、直接法であっても、サンドイッチ法であってもよい。
【００７３】
本発明に係る分析方法にサンドイッチ法を用いた場合、まず、第１のペプチドをプレートのウェル内に固定化し、次いで、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびカゼインなどのタンパク質、またはポリマーを用いてウェルをブロッキングし、そして、サンプルをウェル内にてインキュベートすることによって、サンプル中のアディポネクチンが第１のペプチドに結合する。
【００７４】
続いて、ウェルを洗浄した後に、酵素で標識された第２のペプチドをウェル内にてインキュベートすることによって、第２のペプチドがアディポネクチンに結合する。ウェルを洗浄した後に、この酵素に対する基質溶液をウェルにてインキュベートすることによって、基質溶液が酵素と反応し、反応生成物が生じる。このような反応生成物の有無に基づいて、ペプチドに結合したアディポネクチンを検出することができる。当業者は、このような方法を、使用する基質の種類に応じて、適宜選択することができる。
【００７５】
例えば、上記反応によって蛍光を生成する基質を用いた場合は、この基質からの蛍光を直接観察することによってアディポネクチンを検出することができる。また、上記反応によって色素を生成する基質を用いた場合は、この色素の吸光度を測定することによってアディポネクチンを検出することができる。上記反応によって電気化学活性が変化する基質を用いた場合は、電極を用いた電気化学的な手段によってアディポネクチンを検出することができる。
【００７６】
以上のような手順に従ってサンドイッチ法を実施すれば、サンプル中のアディポネクチンの有無を判定することができる。サンプル中のアディポネクチンの濃度の測定は、例えば、以下のように実施すればよい。まず、予め、同様の方法で既知濃度の標準アディポネクチン溶液についてシグナル（蛍光強度、吸光度、または電気化学的なシグナルなど）を測定し、アディポネクチンの濃度に対するシグナルの標準曲線を作成する。サンプルから測定したシグナルの値をこの標準曲線からアディポネクチンの濃度に換算することによって、サンプル中のアディポネクチンの濃度を測定することができる。
【００７７】
なお、上記説明では、酵素で標識された第２のペプチドを用いたが、蛍光化合物で標識されたペプチドを用いてもよい。蛍光化合物で標識された第２のペプチドを用いた場合、この第２のペプチドからの蛍光を観察することによって、アディポネクチンを検出または測定することができる。
【００７８】
また、本発明に係る分析方法に表面プラズモン共鳴ならびにＱＣＭ法を用いれば、基材に固定化されたペプチドに結合したアディポネクチンを検出するだけでなく、その量を直接的に測定することができる。
【００７９】
（４）本発明に係る分析装置
本発明は、アディポネクチンを分析するための装置を提供する。具体的には、本発明は、上述した分析方法を実行するための分析装置を提供する。本発明に係る分析装置は、サンプル中のアディポネクチンを分析するために、サンプルを受容するサンプル受容部を備えており、アディポネクチンを捕捉する捕捉部が該サンプル受容部の内部に設けられており、捕捉部には、本発明に係るペプチドが固定化されているか、あるいは本発明に係る基材が配置されていればよい。
【００８０】
本発明に係る分析装置について、図１および２を参照しながら説明する。図１は、本発明に係る分析装置１の側方からの断面図である。図２は、本発明に係る分析装置１の平面図である。なお、サンプルを流体として通過させるマイクロチャネル型の分析装置を例に用いて本発明を説明するが、サンプルが通過すべき流路は、微細溝（マイクロチャネル）に限定されず、例えばマイクロキャピラリであってもよい。また、サンプルを流体として通過させない構成（例えば、「（３）本発明に係る分析方法」に記載したウェル）もまた本発明の範囲内であることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。このようなマイクロチャネル型の分析装置は、例えばチップの形態である。
【００８１】
本発明に係る分析装置１は、基板６、および基板６と重ね合わせる蓋９を備えており、基板６の表面には、凹面の微細流路３が形成されている。なお、本明細書中において、「微細」は、μｍオーダーの径を有していることが意図され、具体的には、半導体の微細加工技術を用いて形成され得る程度のサイズが意図される。
【００８２】
基板６の表面には、注入すべき流体またはサンプルを受容する注入部２、および微細流路３から流体を排出する排出部４がさらに形成されており、それぞれ微細流路３の両端と連結している。すなわち、微細流路３は注入部２と排出部４とを基板６の表面上にて接続している。
【００８３】
注入部２は、分析されるべきサンプルや分析に用いる流体を微細流路３へ注入するための入口であり、注入されるべきサンプルや分析に用いる流体を予め貯留する機能を兼ねてもよい。また、排出部４は、分析されたサンプルや分析に用いられた流体を微細流路３内から排出するための出口であり、排出されたサンプルや流体を貯留しておく機能を兼ねてもよい。
【００８４】
このような基板６に蓋９を重ね合わせることによって微細流路３は基板外部から隔離される。ただし、蓋９を貫通する貫通孔（注入孔１２、排出孔１４）が、それぞれ注入部２および排出部４と基板外部とを連通する。これにより、注入孔１２を介して基板外部から微細流路３へ流体を供給したり、排出孔１４を介して微細流路３から基板外部へ流体を排出したりすることができる。
【００８５】
なお、本実施形態では、微細流路、注入部、および排出部は基板に形成されているが、蓋に形成されてもよい。この場合、基板を貫通する貫通孔（注入孔、排出孔）が、それぞれ注入部および排出部と基板外部とを連通する。
【００８６】
さらに、微細流路３には、微細流路３を流れる流体中のアディポネクチンを捕捉するための本発明に係るペプチドを固定化する固定化部５が設けられている。固定化部５と排出部４との間に、固定化部５にて捕捉されたアディポネクチンを分析する分析部８が設けられている。アディポネクチンを検出するための分析手段７が、分析部８へ向けて配置されている。
【００８７】
なお、図示していないが、分析装置には、微細流路３内の流体の、注入部２から排出部４への移動を促進する駆動手段が、注入部および排出部の少なくとも一方に連結されていてもよい。このような駆動手段としては、例えば、押出しポンプおよび吸引ポンプが挙げられる。押出しポンプを用いて流体を微細流路３内へ送り込む場合は、押出しポンプを注入部２に連結すればよく、吸引ポンプを用いて流体を微細流路３内から引き出す場合は、吸引ポンプを排出部４に連結すればよい。
【００８８】
基板６および蓋９としては、例えば、プラスチック材料、ガラス、石英、光硬化性樹脂、または熱硬化性樹脂などを用いることができる。注入孔１２および排出孔１４の上面から見た形状は、特に限定されず、円形、楕円形、矩形などであり得る。また基板６上に形成された注入部２および排出部４の上面から見た形状は、特に限定されず、円形、楕円形、矩形などであり得る。注入部２および排出部４の底面の、流体の流れ方向に対して垂直な形状は直線状または半円形であり得る。
【００８９】
微細流路３の流路は、流体の流れ方向に沿って角柱形状であっても円柱形状であってもよい。すなわち、微細流路３の、流体の流れ方向に対して垂直な断面の形状は、矩形、台形、円形（半円形）であり得る。また、微細流路３は直線形状である必要はなく、蛇行形状、渦巻形状、または螺旋形状でもよい。
【００９０】
微細流路３の幅は、例えば、１μｍ〜５０００μｍであり、深さは例えば、１μｍ〜５０００μｍであることが好ましいが、この範囲内に限定されるものではない。注入部２および排出部４の直径は例えば、１μｍ〜１００００μｍであり、深さは例えば、１μｍ〜５０００μｍμｍであることが好ましいが、この範囲内に限定されるものではない。注入孔１２および排出孔１４の直径は例えば、１μｍ〜１００００μｍであり、深さは例えば、１μｍ〜１００００μｍであることが好ましいが、この範囲内に限定されるものではない。
【００９１】
ペプチドは、上述した基材へ固定化する方法と同様の方法で、基板の固定化部５へ直接的に固定化することができる。また、ペプチドを基板に直接的に固定化せずに、例えば、ペプチドが固定化された基材を固定化部５に配置してもよい。このような基材は、例えばチップであってもよいし、ビーズであってもよい。例えば、基材としてビーズを用いる場合、このビーズを微細流路３内に導入して固定化部５を形成することができる。具体的には、堰き止め部を微細流路内に設け、この堰き止め部によって堰き止められたビーズを固定化部５として用いることができる。
【００９２】
アディポネクチンを分析するための分析手段７として、例えば熱レンズ顕微鏡、表面プラズモン共鳴測定装置または水晶発振子を使用することができる。
【００９３】
また、アディポネクチンの分析に光検出を用いる場合、分析手段７は光源と分析器とを備えていてもよい。光源は、レーザ、ＬＥＤおよびランプからなる群より選択されることが好ましい。分析器は、光電子増倍管またはマルチピクセル光検出器であることが好ましい。
【００９４】
また、アディポネクチンの分析に電気化学検出を用いる場合、分析手段７は電極を備えていてもよい。電極は、少なくとも参照電極および作用電極の２電極から構成されていればよいが、参照電極および作用電極に加えて対向電極を備えている３電極から構成されていることが好ましい。参照電極、作用電極および対向電極は、従来のフォトリソグラフィ技術を利用した微細加工技術によって分析部８に形成することができる。電極の構成材料としては、例えば、金（Ａｕ）、銅（Ｃｕ）、銀（Ａｇ）、白金（Ｐｔ）、チタン（Ｔｉ）などの金属、または導電性プラスチックなどを使用することができる。
【００９５】
なお、上記説明では、固定化部５と分析部８とが微小流路３の別々の箇所に設けられているが、固定化部５が分析部８を兼ねていてもよい。すなわち、固定化部５へ向けて分析手段７が配置されていてもよい。
【００９６】
本実施形態に係る分析装置を用いたアディポネクチンの分析方法の一例を、以下に示す。なお、微細流路３内にて流体を流す駆動手段は、注入部２に連結した押出ポンプを用いる方法、排出部３に連結した吸引ポンプを用いる方法、毛管力および／または吸水物質を用いる方法のいずれでもよい。
【００９７】
１．ブロッキング
サンプル中の、アディポネクチン以外の物質（非検出対象物質）が、微細流路３、固定化部５および分析部８に非特異的に吸着することを防ぐために、非特異吸着防止剤を注入部２から導入して、微細流路３内を満たす。次いで、この非特異吸着防止剤を排出部３から排出する。洗浄溶液を注入部２から導入し、微細流路３内を通過させて排出部４から排出する。これにより、微細流路３内に残留する余分な非特異吸着防止剤を取り除く。好適な非特異的吸着防止剤としては、例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）カゼイン、および高分子ポリマーが挙げられる。
【００９８】
２．サンプルの導入
サンプルを注入部２から微細流路３内に導入する。サンプルは、微細流路３内を移動して固定化部５へ送達される。サンプルが固定化部５を通過する間に、サンプル中のアディポネクチンが固定化部５の第１のペプチドと結合して、固定化部５にて捕捉される。次いで、洗浄溶液を注入部２から導入し、微細流路３内を移動させて排出部４から排出する。これにより、微細流路３内に残留する余分なサンプルを取り除く。
【００９９】
微細流路３内での注入部２から排出部３へのサンプルの移動は連続的に行われてもよいし、断続的に行われてもよい。サンプルを断続的に移動させる場合、例えば、サンプルを固定化部５の領域内にて所定の時間にわたってインキュベートしてもよい。インキュベートすることによって、サンプル中のアディポネクチンペプチドとの反応時間を最適化することができる。
【０１００】
３．固定化部にて捕捉されたアディポネクチンの標識化
標識された第２のペプチドを、注入部２から微細流路３内に導入して、固定化部５へ送達する。この第２のペプチドが固定化部５を通過する間に、第２のペプチドは固定化部５に捕捉されているアディポネクチンと結合する。この操作によって、固定化部５内に捕捉されたアディポネクチンが標識される。
【０１０１】
４．アディポネクチンの分析
分析手段７を用いて標識を検出することによって、分析部８にてアディポネクチンを分析することが可能となる。標識化合物としては、例えば、蛍光化合物または酵素を用いることができる。
【０１０２】
４−１．蛍光化合物を用いたアディポネクチンの分析
上記「３」において標識化合物が蛍光化合物であった場合、分析部８の蛍光を直接観察することによって、アディポネクチンを分析することができる。
【０１０３】
４−２．酵素を用いたアディポネクチンの分析
上記「３」において標識化合物が酵素であった場合、酵素を含む本発明に係るペプチド体をアディポネクチンに結合させた後に、この酵素に対する基質溶液を注入部２から微細流路３内に導入する。基質溶液が固定化部５を通過する間に、アディポネクチンに結合した本発明に係るペプチドの酵素と基質溶液とが反応する。この反応の結果によって得られるシグナルを公知の方法を用いて検出することによってアディポネクチンを分析することができる。当業者は、このような方法を、使用する基質の種類に応じて、適宜選択することができる。
【０１０４】
例えば、上記反応によって蛍光を発する基質を用いた場合は、分析部８にて蛍光を直接観察することによってアディポネクチンを検出することができる。また、上記反応によって吸光度が変化する基質を用いた場合は、分析部８における吸光度を測定することによってアディポネクチンを分析することができる。上記反応によって電気化学活性が変化する基質を用いた場合は、電極を用いた電気化学的な手段によってアディポネクチンを検出することができる。
【０１０５】
なお、標識化合物を用いずに、アディポネクチンを分析することもできる。このような分析を行う場合には、分析手段７として熱レンズ顕微鏡、表面プラズモン共鳴測定装置または水晶発振子などを用いればよい。
【０１０６】
（５）本発明に係る遺伝子
本発明に係る遺伝子は、本発明に係るペプチドをコードする遺伝子であることを特徴としている。本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド配列」は、「核酸配列」または「塩基配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
【０１０７】
本発明に係る遺伝子は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは、一本鎖または二本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であってもよいし、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であってもよい。
【０１０８】
当業者であれば、本発明に係るペプチドのアミノ酸配列に基づいて、所望の遺伝子を容易に取得し得る。また、本発明に係る遺伝子は、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードする遺伝子と融合され得る。
【０１０９】
本発明に係る遺伝子は、本発明に係る遺伝子と相補的な遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアディポネクチンに対する結合性を有するペプチドをコードする遺伝子であってもよい。
【０１１０】
なお、ハイブリダイゼーションは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第３版，Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｌｌ編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ（２００１）」（本明細書中に参考として援用される）に記載されている方法のような周知の方法に従って行われ得る。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同な遺伝子を取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、ヌクレオチド配列やそのヌクレオチド配列の長さによって異なり、当業者であれば適宜設定可能である。
【０１１１】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルタを洗浄することが意図されるが、ハイブリダイゼーションさせるポリヌクレオチドによって、高ストリンジェンシーでの洗浄条件は適宜変更され、例えば、哺乳類由来ＤＮＡを用いる場合は、０．１％ ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ中にて６５℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＤＮＡを用いる場合は、０．１％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、ＲＮＡを用いる場合は、０．１％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、オリゴヌクレオチドを用いる場合は、０．１％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にてハイブリダイゼーション温度での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましい。
【０１１２】
（６）本発明に係る組換えベクター
本発明に係る組換えベクターは、本発明に係る遺伝子を含んでいることを特徴としている。例えば、本発明に係るペプチドをコードする遺伝子が挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。後述するように、このような組換え発現ベクターを宿主に導入することによって、本発明に係るペプチドを宿主中において生成することができる。
【０１１３】
組換え発現ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、宿主の種類に応じて、本発明に係る遺伝子を発現させるプロモーター配列を適宜選択し、これと本発明に係る遺伝子とが組み込まれたプラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８およびｐＵＣ１１８など）、ファージ、コスミド、またはウイルス（レトロウイルス、ワクシニアウイルスおよびバキュロウイルスなど）などを組換え発現ベクターとして用いればよい。
【０１１４】
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればよい。宿主が大腸菌（Escherichia coli）である場合は、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、およびｌｐｐプロモーターなどが挙げられる。また、動物細胞を宿主として用いる場合は、例えば、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、およびＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
【０１１５】
また、本発明に係る組換えベクターには、必要に応じて当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、またはＳＶ４０複製起点などを付加することができる。さらに、本発明に係る組換えベクターには、本発明に係るペプチドとの他のタンパク質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡ、および緑色蛍光ポリペプチド（ＧＦＰ：Green Fluorescent Protein））との融合タンパク質を宿主中において発現させることができるように、この他のタンパク質をコードする遺伝子が含まれていてもよい。
【０１１６】
本発明に係る組換えベクターには、少なくとも１つの選択マーカーが含まれていることが好ましい。このような選択マーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子またはネオマイシン耐性が挙げられ、大腸菌や他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。選択マーカーを用いれば、本発明に係る組換えベクターが宿主に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で本発明に係る遺伝子が発現しているか否かを確認することができる。
【０１１７】
宿主は、特に限定されるものではなく、例えば、細胞、微生物、植物または動物（ヒトを除く）を挙げることができる。細胞としては、例えば、昆虫細胞（ｓｆ９細胞）、動物細胞（サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３およびヒトＦＬ細胞など）を挙げることができる。また、微生物としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、および酵母（出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）および分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）など）を挙げることができる。
【０１１８】
本発明に係る組換えベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、遺伝子銃、ＰＥＧ法、またはエレクトロポレーション法などの従来公知の方法を好適に用いることができる。
【０１１９】
（７）形質転換体
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る組換えベクターを含んでいることを特徴としている。形質転換の対象となる生物としては特に限定されるものではなく、上述の宿主を挙げることができる。すなわち、本明細書において、「形質転換体」は、細胞だけでなく、生物個体を含むことが意図される。
【０１２０】
形質転換体の作製方法（生産方法）としては特に限定されるものではないが、例えば、上述したように当業者に公知の形質転換方法を用いて、本発明に係る組換えベクターを宿主に導入して形質転換する方法を挙げることができる。
【０１２１】
形質転換体の選択採取方法は、例えば、本発明に係る組換えベクターに含まれる上述の選択マーカーを利用して、従来公知の方法に従って実施することができる。
【０１２２】
本発明に係る組換えベクターが宿主に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、本発明に係る組換えベクターを導入した宿主からＤＮＡを調製し、本発明に係る遺伝子またはベクターに特異的なプライマーを設計してＰＣＲを行えばよい。ＰＣＲによって増幅された産物に対して、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液などを用いて、この産物を検出することによって、宿主に本発明に係る組換えベクターが導入されたこと（宿主が形質転換されたこと）を確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅された産物を検出することもできる。
【０１２３】
このようにして得られた、本発明に係る形質転換体は、当業者に公知の方法を用いて、本発明に係るペプチドを容易に大量に取得するために使用することができる。例えば、宿主が細胞の場合、本発明に係る組換えベクターを含む細胞を培養することによって、本発明に係る遺伝子が発現し、本発明に係るペプチドが生産される。細胞内において生産された本発明に係るペプチドは、当業者に公知の方法を用いて精製することができる。
【０１２４】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１２５】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１２６】
［実施例１］
＜セルロースメンブレン上でのペプチドの合成（スポット合成）＞
アディポネクチンに対する結合性を有するアミノ酸配列を同定するために、Ｆｍｏｃ法によるペプチドスポット合成法を利用したペプチド合成装置（Model MultiPep RS（Intavis AG））を用いて、セルロースメンブレン上においてペプチドを合成した。
【０１２７】
セルロースメンブレン上には、末端がアミノ基に改変されたポリエチレングリコールが固定化されており、このアミノ基にＦｍｏｃアミノ酸を、ＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）／ＨＯＢｔ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）を使用して結合させた。次いで、Ｆｍｏｃを除去した。そして、Ｆｍｏｃの除去によって現れたアミノ酸のアミノ基に、さらなるＦｍｏｃアミノ酸を、ＤＩＣ／ＨＯＢｔを使用して結合させた。
【０１２８】
Ｆｍｏｃの除去、およびこの除去によって現れるアミノ酸のアミノ基へのＦｍｏｃアミノ酸の結合を１サイクルとして、このサイクルを繰り返してペプチドを合成した。合成の最終的なサイクルの後、全てのペプチドのＮ末端と側鎖とを脱保護した。これにより、配列番号１〜１５に示すアミノ酸配列からなるペプチドを得た。
【０１２９】
＜酵素免疫法によるペプチドとアディポネクチンとの結合の測定＞
酵素免疫法の１つであるサンドイッチ法を用いて、上述のようにして合成した各ペプチドとアディポネクチンとの結合を測定した。
【０１３０】
まず、セルロースメンブレンをエタノールに浸漬した。次いで、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）でセルロースメンブレンを連続的に洗浄することによって、セルロースメンブレン中のエタノールをＰＢＳに置換した。非特異的結合を阻害するために、ブロッキング溶液（１％の粉末状乳入りＰＢＳ）中でセルロースメンブレンを一晩インキュベートした。
【０１３１】
その後、セルロースメンブレンを、０．２５μｇ／ｍＬのヒトアディポネクチン（R&D Systems）入りブロッキング溶液（１％の粉末状乳入りＰＢＳ）と１時間インキュベートした。インキュベート後のセルロースメンブレンをＰＢＳＴ（０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０入りＰＢＳ）で洗浄した。洗浄後のセルロースメンブレンを、０．２５μｇ／ｍＬのＨＲＰが標識された抗ヒトアディポネクチン抗体（R&D Systems）を含むブロッキング溶液と１時間インキュベートし、再度ＰＢＳＴで５回洗浄した。
【０１３２】
そして、１ｍＭの過酸化水素を含む１００μＭの蛍光基質（Amplex Red（Invitrogen））を、セルロースメンブレンに添加し、１０分間反応させた。蛍光イメージャー（GE Healthcare）を用いて、５４０ｎｍの光で合成スポットにおける蛍光基質を励起して、この蛍光基質からの５９５ｎｍの吸収波長を測定することによって、合成スポットの蛍光強度を決定した。ペプチドの結合強度は合成スポットの蛍光強度として算出した。
【０１３３】
［比較例１］
実施例１と同様の方法に従って、配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるペプチドを合成した。そして、合成したペプチドとアディポネクチンとの結合を実施例１と同様にして測定した。
【０１３４】
実施例１および比較例１に用いたペプチドのアミノ酸配列を一文字表記で表２に示す。
【０１３５】
【表２】
【０１３６】
［結果１］
実施例１および比較例１における測定の結果を図３に示す。配列番号１〜１５に示すアミノ酸配列からなるペプチド（実施例１）は、配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるペプチド（比較例１）に比べて有意に高い蛍光強度を示した。よって、配列番号１〜１５に示すアミノ酸配列からなるペプチドは、アディポネクチンに結合することが示された。
【０１３７】
［実施例２］
＜マイクロプレートを用いた酵素免疫法によるペプチドとアディポネクチンとの結合の測定＞
酵素免疫法を用いて、マイクロプレートに固定化されたアディポネクチンと、ビオチンを標識したペプチド（ビオチン標識ペプチド）との結合を以下のようにして測定した。
【０１３８】
まず、配列番号１４、１５に示すペプチドのＣ末端にリジンを付加したペプチドを作製した。次いで、作製したペプチドのリジン側鎖のアミノ基にビオチンを標識することによって、ビオチン標識ペプチドを作製した。
【０１３９】
９６ウェルのマイクロプレートに、ＰＢＳで調製した５μｇ／ｍＬのアディポネクチン（R&D Systems）を１ウェルにつき１００μＬ加え、３７℃で１時間インキュベートした。これにより、マイクロプレートのウェル内にアディポネクチンを固定化した。次に、非特異的結合を阻害するために、ブロッキング溶液（Protein-Free Blocking Buffer、PIERCE）を１ウェルにつき３００μＬ加えて室温で２時間インキュベートした。インキュベート後に、ウェルをＰＢＳＴ（０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０入りＰＢＳ）で３回洗浄した。１ｍＭのビオチン標識ペプチドを１ウェルにつき１００μＬ／加えて室温で１時間インキュベートした。インキュベート後にウェルを、再度ＰＢＳＴで洗浄した。
【０１４０】
次に、ブロッキング溶液（Protein-Free Blocking Buffer、PIERCE）で２００倍に希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｒ＆Ｄ Systems）を１ウェルにつき１００μＬ加えて室温で１時間インキュベートした。インキュベート後に、ウェルをＰＢＳＴで洗浄した。そして、ＴＭＢ（tetramethylbenzidine）を１ウェルにつき１００μＬ加えて、２０分間反応させた。次いで、１ＭのＨＣｌを１ウェルにつき１００μＬ加えて反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（Bio-Rad）を用い、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１４１】
［比較例２］
実施例２と同様の方法によって、配列番号１７に示すアミノ酸配列からなるペプチドとアディポネクチンとの結合を測定した。
【０１４２】
実施例２および比較例２に用いたペプチドのアミノ酸配列を一文字表記で表３に示す。
【０１４３】
【表３】
【０１４４】
［結果２］
実施例２および比較例２における測定の結果を図４に示す。配列番号１４および１５に示すアミノ酸配列からなるペプチド（実施例２）は、配列番号１７に示すアミノ酸配列からなるペプチド（比較例２）に比べて有意に高い吸光度を示した。よって、配列番号１４および１５に示すアミノ酸配列からなるペプチドは、アディポネクチンに結合することが示された。
【０１４５】
［実施例３］
＜アミノ酸が置換されたペプチドとアディポネクチンとの結合の測定＞
上述の「（１）本発明に係るペプチド」に示した、アミノ酸を分類した群に基づいて、アミノ酸の保存的置換を行ったペプチドと、アディポネクチンとの結合を以下のようにして測定した。
【０１４６】
まず、配列番号８および９に示すアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号８のＣ末端のトリプトファンを同じ芳香環を持つチロシンに置換したペプチド（配列番号１８に示すアミノ酸配列からなるペプチド）、ならびに配列番号９のＮ末端のアルギニンを同じ塩基性アミノ酸であるリジンに置換したペプチド（配列番号１９に示すアミノ酸配列からなるペプチド）を実施例１と同様に合成した。
【０１４７】
次に、実施例１と同様の方法によって、合成した配列番号８、９、１８および１９に示すアミノ酸配列からなるペプチドと、アディポネクチンとの結合を測定した。
【０１４８】
実施例３に用いたペプチドのアミノ酸配列を一文字表記で表４に示す。
【０１４９】
【表４】
【０１５０】
［結果３］
実施例３における測定の結果を図５に示す。配列番号１８、１９に示すアミノ酸配列からなるペプチドは、配列番号８、９に示すアミノ酸配列からなるペプチドに比べて同程度の蛍光強度を示した。すなわち、配列番号１８、１９に示すアミノ酸配列からなるペプチドは、アディポネクチンに対する結合性を保持していた。
【産業上の利用可能性】
【０１５１】
本発明に係るペプチドは、アディポネクチンの認識材料または分析試薬として用いることができる。よって、本発明は、生体サンプルを分析する分野に利用することができる。
【符号の説明】
【０１５２】
１ 分析装置
２ 注入部
３ 微細流路
４ 排出部
５ 固定化部
６ 基板
７ 分析手段
８ 分析部
９ 蓋
１２ 注入孔
１４ 排出孔
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５０個以下のアミノ酸からなり、かつアディポネクチンに対する結合性を有している、ペプチド。
【請求項２】
(i) 配列番号１〜１５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでいる、ペプチド、あるいは
(ii) 配列番号１〜１５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換または付加が生じているアミノ酸配列を含んでおり、かつアディポネクチンに対する結合性を有している、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記アミノ酸の置換が、
（ａ）アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびグリシンからなる群、
（ｂ）アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群、
（ｃ）ヒスチジン、リシンおよびアルギニンからなる群、
（ｄ）アラニン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、バリンおよびメチオニンからなる群、ならびに
（ｅ）フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンからなる群
より選択される単一の群に含まれる２つのアミノ酸の間で生じている保存的置換である、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号１〜１５、１８および１９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる、請求項２に記載のペプチド。
【請求項５】
リンカーを含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６】
標識されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７】
前記標識は、生体関連分子の付加であることを特徴とする請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
前記生体関連分子は、酵素、ビオチンおよびアビジンからなる群より少なくとも１つ選択されることを特徴とする請求項７に記載のペプチド。
【請求項９】
前記標識は、蛍光化合物の付加であることを特徴とする請求項６に記載のペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のペプチドの少なくとも１種を用いることを特徴とするアディポネクチンを分析する方法。
【請求項１１】
前記ペプチドの少なくとも１種とアディポネクチンとの複合体を分析する工程を包含していることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドの少なくとも１種をサンプルとインキュベートする工程をさらに包含している請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のペプチドの少なくとも１種が固定化されていることを特徴とする基材。
【請求項１４】
請求項１３に記載の基材を用いることを特徴とするアディポネクチンを分析する方法。
【請求項１５】
前記基材上のペプチドとアディポネクチンとの複合体を分析する工程を包含していることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記基材をサンプルとインキュベートする工程をさらに包含していることを特徴とする請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
サンプルを受容するサンプル受容部を備えており、アディポネクチンを捕捉する捕捉部が該サンプル受容部の内部に設けられており、該捕捉部には、請求項１〜９のいずれか一項に記載のペプチドの少なくとも１種が固定化されていることを特徴とするアディポネクチン分析用装置。
【請求項１８】
サンプルを受容するサンプル受容部を備えており、アディポネクチンを捕捉する捕捉部が該サンプル受容部の内部に設けられており、該捕捉部には、請求項１３に記載の基材が配置されていることを特徴とするアディポネクチン分析用装置。
【請求項１９】
前記サンプル受容部が流路を形成していることを特徴とする請求項１７または１８に記載の装置。
【請求項２０】
捕捉されたアディポネクチンを分析する分析手段が、前記サンプル受容部の内部の分析部に向けてさらに備えられていることを特徴とする請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２１】
前記分析部が前記捕捉部の下流であることを特徴とする請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
基板上に形成されたマイクロチャネル型であることを特徴とする請求項１７〜２１に記載の装置。
【請求項２３】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドをコードしていることを特徴とする遺伝子。
【請求項２４】
請求項２３に記載の遺伝子を含んでいることを特徴とする組換えベクター。
【請求項２５】
請求項２４に記載の組換えベクターを含んでいることを特徴とする形質転換体。
【請求項１】
５０個以下のアミノ酸からなり、かつアディポネクチンに対する結合性を有している、ペプチド。
【請求項２】
(i) 配列番号１〜１５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでいる、ペプチド、あるいは
(ii) 配列番号１〜１５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換または付加が生じているアミノ酸配列を含んでおり、かつアディポネクチンに対する結合性を有している、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記アミノ酸の置換が、
（ａ）アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびグリシンからなる群、
（ｂ）アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群、
（ｃ）ヒスチジン、リシンおよびアルギニンからなる群、
（ｄ）アラニン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、バリンおよびメチオニンからなる群、ならびに
（ｅ）フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンからなる群
より選択される単一の群に含まれる２つのアミノ酸の間で生じている保存的置換である、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号１〜１５、１８および１９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる、請求項２に記載のペプチド。
【請求項５】
リンカーを含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６】
標識されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７】
前記標識は、生体関連分子の付加であることを特徴とする請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
前記生体関連分子は、酵素、ビオチンおよびアビジンからなる群より少なくとも１つ選択されることを特徴とする請求項７に記載のペプチド。
【請求項９】
前記標識は、蛍光化合物の付加であることを特徴とする請求項６に記載のペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のペプチドの少なくとも１種を用いることを特徴とするアディポネクチンを分析する方法。
【請求項１１】
前記ペプチドの少なくとも１種とアディポネクチンとの複合体を分析する工程を包含していることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドの少なくとも１種をサンプルとインキュベートする工程をさらに包含している請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のペプチドの少なくとも１種が固定化されていることを特徴とする基材。
【請求項１４】
請求項１３に記載の基材を用いることを特徴とするアディポネクチンを分析する方法。
【請求項１５】
前記基材上のペプチドとアディポネクチンとの複合体を分析する工程を包含していることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記基材をサンプルとインキュベートする工程をさらに包含していることを特徴とする請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
サンプルを受容するサンプル受容部を備えており、アディポネクチンを捕捉する捕捉部が該サンプル受容部の内部に設けられており、該捕捉部には、請求項１〜９のいずれか一項に記載のペプチドの少なくとも１種が固定化されていることを特徴とするアディポネクチン分析用装置。
【請求項１８】
サンプルを受容するサンプル受容部を備えており、アディポネクチンを捕捉する捕捉部が該サンプル受容部の内部に設けられており、該捕捉部には、請求項１３に記載の基材が配置されていることを特徴とするアディポネクチン分析用装置。
【請求項１９】
前記サンプル受容部が流路を形成していることを特徴とする請求項１７または１８に記載の装置。
【請求項２０】
捕捉されたアディポネクチンを分析する分析手段が、前記サンプル受容部の内部の分析部に向けてさらに備えられていることを特徴とする請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２１】
前記分析部が前記捕捉部の下流であることを特徴とする請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
基板上に形成されたマイクロチャネル型であることを特徴とする請求項１７〜２１に記載の装置。
【請求項２３】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドをコードしていることを特徴とする遺伝子。
【請求項２４】
請求項２３に記載の遺伝子を含んでいることを特徴とする組換えベクター。
【請求項２５】
請求項２４に記載の組換えベクターを含んでいることを特徴とする形質転換体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−２３１０６９（Ｐ２０１１−２３１０６９Ａ）
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１０４２７２（Ｐ２０１０−１０４２７２）
【出願日】平成２２年４月２８日（２０１０．４．２８）
【出願人】（０００００５０４９）シャープ株式会社 (33,933)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２８日（２０１０．４．２８）
【出願人】（０００００５０４９）シャープ株式会社 (33,933)
【Ｆターム（参考）】
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