アデノウイルス血清１４型に対するワクチン
本発明は、弱毒生血清１４型アデノウイルス、および、該弱毒生血清１４型アデノウイルスを用いて哺乳動物において血清１４型アデノウイルスに対する免疫応答を誘導する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、国立衛生研究所により授与された認可番号第Ｒ４３ ＡＩ０６２１７６−０１ Ａ２号のもとでの政府支援と共に為された。連邦政府は、本発明について特定の権利を有する。
【０００２】
電子的に提出された資料の参照による組み込み
コンピューターで読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列リストが、参照により、その全体として本明細書に組み込まれ、当該配列リストは、本明細書と同時に提出され、かつ、２００８年１２月１１日に作成された「704107_ST25.TXT」という名前の一つの１１３７バイトのＡＳＣＩＩ（Ｔｅｘｔ）ファイルとして識別されるものである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ヒトにおけるアデノウイルス血清１４型（Ａｄ１４）による感染は、ほとんど報告されていない。近年、Ａｄ１４は、健康な若年成人を含むヒトにおいて、重度の、時には致命的な呼吸器疾患を引き起こし得る新たなアデノウイルス血清型となった（Centers for Disease Control and Prevention, Morb. Mortal. Wkly. Rep., 56(45): 1181-84 (2007)、およびMetzgar et al., J. Infectious Diseases, 196: 1465-73 (2007)を参照)。２００６年５月、ニューヨークの生後１２日の乳児が、Ａｄ１４感染によって引き起こされた呼吸器疾患により死亡した。
【０００４】
２００７年２月以来、アデノウイルス感染に関連する呼吸器疾患の症例の発生が、テキサス州のラックランド空軍基地（ＬＡＦＢ）における基礎軍事訓練生（basic military trainees）の間で報告された。ＬＡＦＢから得られた４２３の呼吸器標本のうち、２６８（６３％）がアデノウイルス検査で陽性であり、２６８のうち１１８（４４％）について血清型が調べられ、血清型を調べられたうちの１０６（９０％）がＡｄ１４であった。
【０００５】
２００７年５月、ワシントン州の養護施設の３人の居住者が、Ａｄ１４検査に陽性であった。これらの患者は、重度の肺炎のため、集中治療および人工呼吸器が必要であった。２００７年４月始めに、１７人の患者が、重度の肺炎のためにオレゴンの病院に収容されたことが報告された。これらの患者のうち１５人のサンプルが、Ａｄ１４検査に陽性であった。オレゴン州公衆衛生局はその後、２００６年１１月から２００７年４月までに３１人の患者のサンプルがＡｄ１４に陽性であることを確認した。オレゴン州は、全部で７件のＡｄ１４に関連する死亡を報告した。Ａｄ１４の発生は他には、サウスカロライナ州において報告されている。
【０００６】
上述したＡｄ１４陽性患者のうち５３人（３８％）が入院し、これには、集中治療室（ＩＣＵ）に収容された２４人（１７％）；死亡した９人（５％）の患者が含まれる。４つの州全てから単離されたＡｄ１４は、完全なヘキソンおよびファイバー遺伝子の配列データで同一であった。しかしながら、これらの分離株は、基準となるＡｄ１４株（すなわち、ＤｅＷｉｔｔ株）（Van Der Veen et al, Am. J. Hyg., 65: 119-129 (1957)）とは異なっており、これは、合衆国における新たなＡｄ１４バリアントの発生および拡大を示唆していた（Centers for Disease Control and Prevention, Morb. Mortal. Wkly. Rep., 56(45): 1181-84 (2007)を参照）。
【０００７】
したがって、Ａｄ１４の発生株を効果的に標的するワクチンおよび免疫方法が必要である。本発明は、そのような方法を提供する。
【発明の概要】
【０００８】
発明の要旨
本発明は、哺乳動物において血清１４型アデノウイルスに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。該方法は、哺乳動物に弱毒生血清１４型アデノウイルスを投与することを含み、該投与で血清１４型アデノウイルスに対する免疫応答が該哺乳動物において誘導される。
【０００９】
本発明はまた、弱毒生血清１４型アデノウイルス、および、そのような弱毒生血清１４型アデノウイルスを含む組成物（例えば、ワクチン）を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、哺乳動物において血清１４型アデノウイルスに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。アデノウイルスは、３６ｋｂの二本鎖ＤＮＡを含む、中型（９０〜１００ｎｍ）で非エンベロープ型の二十面体ウイルスである。ヒトへの感染を引き起こし得る４９種の免疫学的に異なるアデノウイルス型が存在する：サブグループＡ（例えば、血清１２型、１８型および３１型）、サブグループＢ（例えば、血清３型、７型、１１型、１４型、１６型、２１型、３４型、３５型および５０型）、サブグループＣ（例えば、血清２型および５型）サブグループＤ（例えば、血清８型、９型、１０型、１３型、１５型、１７型、１９型、２０型、２２〜３０型、３２型、３３型、３６〜３９型および４２〜４８型）、サブグループＥ（例えば、血清４型）、サブグループＦ（例えば、血清４０型および４１型）、および未分類のサブグループ（例えば、血清４９型および５１型）。野生型血清１４型アデノウイルスは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ８０３２９４として寄託されている。血清１４型アデノウイルスの新規循環株である１９６８Ｔについても記述されている。
【００１１】
アデノウイルスは最も一般には呼吸器疾患を引き起こすが、様々な他の疾患（胃腸炎、結膜炎、膀胱炎、および発疹の疾患など)もまた引き起こし得る。アデノウイルス感染により引き起こされる呼吸器疾患の症状は、通常の風邪症候群から、肺炎、クループおよび気管支炎までわたる。免疫系不全の患者は、アデノウイルス感染の重度の合併症に特に罹患しやすい。急性呼吸器疾患（ＡＲＤ）は、第２次世界大戦中に軍隊入隊者の間で最初に認識され、混雑状態および緊張状態の間のアデノウイルス感染によって引き起こされ得る。
【００１２】
本発明は、哺乳動物に弱毒生血清１４型アデノウイルスを投与することを含む。弱毒生血清１４型アデノウイルスは高力価で産生でき、複製する細胞および複製しない細胞に効率的に送り込むことができる。弱毒生血清１４型アデノウイルスは染色体外にとどまるため、ランダムな挿入突然変異および標的細胞の遺伝型の永続的変化の危険性が排除される。
【００１３】
本明細書で用いる場合、用語「生（live）」は、細胞への進入能力を保持しており、かつ、例えば破壊（例えば、超音波処理）、変性（例えば、加熱または溶媒の使用）または架橋（例えば、ホルマリン架橋を介する）によって、物理的に不活性化されていないアデノウイルスを意味する。本明細書で用いる場合、用語「弱毒（弱毒化、attenuated）」は、病原性が低減されたアデノウイルスを意味する。弱毒化は、当該分野で公知の様々な方法を使用して達成できる。例えば、動物、卵、または組織培養物中のウイルスの連続継代は、様々な突然変異の獲得をもたらし得る。そのような突然変異は、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト細胞）におけるウイルスの複製を妨げることによって、または、ウイルスの複製能力を排除はしないが低減させ、哺乳動物細胞において病気を誘導することなく複製し得るようにすることによって、病原性の低減をもたらし得る。
【００１４】
本発明の弱毒生血清１４型アデノウイルスは、該アデノウイルスゲノムの１以上の領域の補完を必要とし得、該領域は、例えば少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能の欠損（すなわち、弱毒生血清１４型アデノウイルスが、典型的な宿主細胞、特には、本発明の方法の過程において弱毒生血清１４型アデノウイルスによって感染された哺乳動物の宿主細胞において複製しないような欠損）の結果として、複製のために必要とされるものである。このようなアデノウイルスはまた、当該技術分野において「複製欠損型」アデノウイルスとも呼ばれる。本明細書で用いる場合、遺伝子、遺伝子機能、遺伝子、またはゲノム領域の欠損は、アデノウイルスゲノムの遺伝物質の突然変異または欠失であって、全体的または部分的に核酸配列が突然変異または欠失された遺伝子の機能を、消失または減弱させる（例えば、遺伝子産物の機能が、少なくとも約２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍または５０倍低減されるなど）のに十分であるようなものとして定義される。遺伝子領域全体の欠失は、複製に必須な遺伝子機能の破壊のためには必要とされないことがしばしばである。しかしながら、アデノウイルスゲノム中の十分なスペースが１以上のトランスジーンのために必要である場合には、遺伝子領域の大部分の除去が所望され得る。遺伝物質の欠失が好ましいが、付加または置換による遺伝物質の突然変異もまた、遺伝子機能を破壊するために適切である。複製に必須な遺伝子機能とは、複製（例えば、増殖）のために必要とされる遺伝子機能であり、例えば、アデノウイルス初期領域（例えば、Ｅ１、Ｅ２およびＥ４領域）、後期領域（例えば、Ｌ１〜Ｌ５領域）、ウイルスのパッケージングに関与する遺伝子（例えば、ＩＶａ２遺伝子）、およびウイルス関連ＲＮＡ（例えば、ＶＡ−ＲＮＡ１および／またはＶＡ−ＲＮＡ−２）によってコードされている。
【００１５】
弱毒生血清１４型アデノウイルスは、増殖のために、高々、該アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ２ＡおよびＥ４領域の補完を必要とするものであることが望ましい。したがって、増殖のために、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、高々、（ａ）Ｅ１領域、（ｂ）Ｅ２Ａ領域、（ｃ）Ｅ４領域、（ｄ）Ｅ１およびＥ２Ａ領域、（ｅ）Ｅ１およびＥ４領域、（ｆ）Ｅ２ＡおよびＥ４領域、または（ｇ）Ｅ１、Ｅ２ＡおよびＥ４領域の補完を必要とし得る。好ましくは、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、増殖のために、高々、該アデノウイルスゲノムのＥ１および／またはＥ４領域の補完を必要とする。
【００１６】
弱毒生血清１４型アデノウイルスは、Ｅ１、Ｅ２Ａおよび／またはＥ４領域以外のアデノウイルスゲノムの部分において欠失および／または突然変異を含み得る。例えば、弱毒生血清１４型アデノウイルスはまた、国際特許出願公開ＷＯ ００／００６２８において議論されているように主要後期プロモーター（ＭＬＰ）において、複製に必須な遺伝子機能を含まないＥ３領域（例えば、Ｅ３領域のＸｂａＩ欠失）において、および／または、複製に必須な遺伝子機能を含むが、増殖のためにＥ１、Ｅ２Ａおよび／またはＥ４以外の領域の補完を必要としないような領域において、欠失および／または突然変異を有し得る。
【００１７】
Ｅ１領域に関して、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、Ｅ１Ａ領域の全体もしくは部分および／またはＥ１Ｂ領域の全体もしくは部分を欠失してもよく、例えば、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ領域の各々について、複製に必須な遺伝子機能を少なくとも１つ欠失し、複製のために、該アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ領域およびＥ１Ｂ領域の補完を必要とし得る。弱毒生血清１４型アデノウイルスがＥ１欠損である場合、アデノウイルスゲノムは、（アデノウイルス血清１４型ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ８０３２９４）に基づいて、）ヌクレオチド４６５から５００（例えば、ヌクレオチド４８８）の間の任意のヌクレオチドにて開始し、ヌクレオチド２，９００から２，９５０（例、ヌクレオチド２，９２５）の間の任意のヌクレオチドにて終了する欠失を含み得る。欠失ヌクレオチド部分を規定する終点は、正確に決定することが困難であり得、典型的には、弱毒生血清１４型アデノウイルスの性質には有意に影響を与えないであろう（すなわち、上述のヌクレオチド番号の各々は、＋／−１、２、３、４、５、または１０もしくは２０ヌクレオチドにさえもなり得る）。
【００１８】
Ｅ２Ａ領域に関して、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、Ｅ２Ａ領域の完全な欠失を含まないことが好ましく、欠失は、約２３０塩基対未満の長さであることが好ましい。一般に、アデノウイルスのＥ２Ａ領域は、ＤＢＰ（ＤＮＡ結合タンパク質）をコードしており、これはＤＮＡ複製に必要なポリペプチドである。ＤＢＰは、ウイルスの血清型に応じて、４７３から５２９アミノ酸から構成されている。ＤＢＰは、広がったＮｔドメインを有する球形のＣｔからなる長楕円として存在する、非対称タンパク質であると考えられている。Ｃｔドメインは、核酸に結合し、亜鉛に結合し、かつＤＮＡ鎖伸長のレベルでＤＮＡ合成に機能するというＤＢＰの能力に関与していることが、研究により示唆されている。しかしながら、Ｎｔドメインは、転写および転写後の両方のレベルで後期遺伝子発現において機能すると考えられており、該タンパク質の効率的な核局在に関与し、そしてまた、それ自体の発現の増強にも関係し得る。Ｎｔドメイン中のアミノ酸２から３８の間の欠失は、この領域がＤＢＰの機能に重要であることを示唆した（Brough et al, Virology, 196: 269-281 (1993)）。ＤＢＰのＣｔ領域をコードするＥ２Ａ領域の欠失は、ウイルスの複製に影響しないが、ＤＢＰのＮｔドメインのアミノ酸２から３８をコードするＥ２Ａ領域の欠失は、ウイルスの複製を阻害する。弱毒生血清１４型アデノウイルスは、アデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域のこの部分を含むことが好ましい。特に、例えば、Ｅ２Ａ領域の保持すべき所望の部分は、Ｅ２Ａ領域の５’末端によって規定されるアデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域の部分である。アデノウイルスゲノムのこの部分が弱毒生血清１４型アデノウイルスに含まれることが望ましく、それは、この部分は、所望のウイルス増殖レベルを提供するようには現存のＥ２Ａ補完細胞株において補完されないためである。
【００１９】
Ｅ４領域に関して、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、Ｅ４領域の全体または一部を欠失し得る。望ましくは、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、Ｅ４領域のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）６の欠失または突然変異を含み、これは、弱毒生血清１４型アデノウイルスの増殖のために必要な唯一のＥ４領域の部分であると考えられている。
【００２０】
本発明の一つの実施形態では、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、Ｅ１およびＥ４領域の各々について全体または部分を欠失しているアデノウイルスゲノムを含み（すなわち、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、Ｅ１／Ｅ４欠損型アデノウイルスである）、好ましくは、Ｅ４領域のコード領域全体がアデノウイルスゲノムから欠失されている。換言すれば、Ｅ４領域の全てのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が除去されている。別の実施形態では、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、Ｅ１領域全体の欠失によって、および、Ｅ４領域の一部の欠失によって、複製欠損型になっている。弱毒生血清１４型アデノウイルスのＥ４領域は、ネイティブなＥ４プロモーター、ポリアデニル化配列、および／または右側の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を保持し得る。
【００２１】
いくつかの実施形態では、例えば、Ｅ１領域の１以上の遺伝子機能およびＥ４領域の１以上の遺伝子機能について補完を必要とする弱毒生血清１４型アデノウイルスは、Ｅ１領域のみの１以上の遺伝子機能について補完が必要な弱毒生血清１４型アデノウイルスによって達成されるのと同様のウイルス増殖を補完細胞株において提供するために、スペーサー配列を含み得る。該スペーサー配列は、所望の長さの任意のヌクレオチド配列（単数または複数）を含み得、少なくとも約１５塩基対（例えば、約１５塩基対から約１２，０００塩基対）、好ましくは約１００塩基対から約１０，０００塩基対、より好ましくは約５００塩基対から約８，０００塩基対、さらにより好ましくは約１，５００塩基対から約６，０００塩基対、最も好ましくは約２，０００から約３，０００塩基対の長さの配列などである。スペーサーエレメント配列は、コーディングまたはノンコーディング、アデノウイルスに対してネイティブまたは非ネイティブ、血清グループＢのアデノウイルスに対してネイティブまたは非ネイティブ、および、該アデノウイルスゲノム（すなわち、血清１４型アデノウイルス）に関してネイティブまたは非ネイティブであり得るが、欠損領域について複製に必須の機能を回復させない。スペーサーエレメントは、弱毒生血清１４型アデノウイルスのいずれの領域に位置してもよいが、好ましくは、スペーサーは、アデノウイルスゲノムのＥ１領域またはＥ４領域に位置する。アデノウイルスベクターにおけるスペーサーの使用は、米国特許第５，８５１，８０６号に記載されている。
【００２２】
弱毒生血清１４型アデノウイルスは、複製（すなわち、増殖）のために、高々、該アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ２Ａおよび／またはＥ４領域の複製に必須な遺伝子機能の補完を必要とすることが好ましいが、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、増殖のために他の補完が必要とされるような他の欠損を有することが可能である。特に、弱毒生血清１４型アデノウイルスが複製欠損型を維持し、かつ、例えば、補完細胞、および／または、破壊された複製に必須な遺伝子機能をコードする外因性ＤＮＡ（例えば、ヘルパーアデノウイルス）を使用して増殖され得る限り、アデノウイルスゲノムは、実施者によって所望される１以上の複製に必須な遺伝子機能を破壊するために改変され得る。これに関して、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、アデノウイルスゲノムの初期領域のみについて、アデノウイルスゲノムの後期領域のみについて、アデノウイルスゲノムの初期および後期領域の両方について、または、アデノウイルスの全ての遺伝子について（すなわち、高キャパシティーアデノベクター（ＨＣ−Ａｄ）、Morsy et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 95: 7876-7871 (1998), Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 94: 1645-1650 (1997)、および Kochanek et al., Hum. Gene Ther., 10: 2451-2459 (1999)を参照）、複製に必須な遺伝子機能が欠損され得る。複製欠損型アデノウイルスの一般的な作製については、米国特許第５，８３７，５１１号、第５，８５１，８０６号、第６，１２７，１７５号、第６，４８２，６１６号および第７，１９５，８９６号；米国特許出願公開２００１／００４３９２２ Ａ１、２００２／０００４０４０ Ａ１、２００２／０１１０５４５ Ａ１および２００４／０１６１８４８ Ａ１；ならびに、国際特許出願公開ＷＯ ９４／２８１５２、ＷＯ ９５／０２６９７、ＷＯ ９５／１６７７２、ＷＯ ９５／３４６７１、ＷＯ ９６／２２３７８、ＷＯ ９７／１２９８６、ＷＯ ９７／２１８２６およびＷＯ ０３／０２２３１１において開示されている。
【００２３】
弱毒生血清１４型アデノウイルスは、典型的には、弱毒生血清１４型アデノウイルスには存在しないがウイルス増殖のために必要とされる遺伝子機能を提供する補完細胞株中で、高力価の弱毒生血清１４型アデノウイルスストックを作製するために適切なレベルにて、産生されるであろう。補完細胞株は、アデノウイルスの増殖のために必要とされる遺伝子機能をコードするアデノウイルス核酸配列を、細胞ゲノム中に組み込んで含むことが望ましい。好ましい細胞株は、弱毒生アデノウイルスに存在しない、少なくとも１つ、好ましくは全ての、複製に必須な遺伝子機能を補完する。補完細胞株は、（例えば、アデノウイルスアンプリコンの増殖を可能にするための）全てのアデノウイルス機能を含む、初期領域、後期領域、ウイルスパッケージング領域、ウイルスに関連するＲＮＡ領域、またはこれらの組み合わせによってコードされる少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能における欠損を補完できる。最も好ましくは、補完細胞株は、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能（例えば、２以上の複製に必須な遺伝子機能）における欠損を、特には、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ領域の各々について複製に必須な遺伝子機能における欠損を、補完する。加えて、補完細胞株は、アデノウイルスゲノムのＥ２（特に、アデノウイルスＤＮＡポリメラーゼおよび末端タンパク質に関して）および／またはＥ４領域の少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能における欠損を補完できる。望ましくは、Ｅ４領域における欠損を補完する細胞は、Ｅ４−ＯＲＦ６遺伝子配列を含み、Ｅ４−ＯＲＦ６タンパク質を産生する。このような細胞は、少なくともＯＲＦ６を含み、かつアデノウイルスゲノムのＥ４領域の他のＯＲＦは含まないことが望ましい。該細胞株は、弱毒生血清１４型アデノウイルスとオーバーラップしない様式で補完遺伝子を含み、それにより、アデノウイルスゲノムが細胞のＤＮＡと組換えを起こす可能性を最小化し、そして実質的には排除するというさらなる特徴を有することが好ましい。したがって、弱毒生血清１４型アデノウイルスストックにおいて、複製可能なアデノウイルス（ＲＣＡ）の存在が、回避まではされなくとも最小にされ、それゆえ、特定の治療目的、特にワクチン接種の目的のために好適となる。弱毒生血清１４型アデノウイルスストックにおいてＲＣＡがないことで、非補完細胞における血清１４型アデノウイルスの複製が回避される。このような補完細胞株の構築は、Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994)に記載されたものなど、標準的な分子生物学技術および細胞培養技術を伴う。
【００２４】
弱毒生血清１４型アデノウイルスを産生するための補完細胞株としては、２９３細胞（例えば、Graham et al., J. Gen. Virol, 36, 59-72 (1977)に記載されている）、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（例えば、国際特許出願公開ＷＯ ９７／００３２６、ならびに米国特許第５，９９４，１２８号および第６，０３３，９０８号）、ならびに２９３−ＯＲＦ６細胞（例えば、国際特許出願公開ＷＯ ９５／３４６７１、米国特許第７，１９５，８９６号およびBrough et al., J. Virol., 71: 9206-9213 (1997)）が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる補完細胞は、例えば、米国特許第６，６７７，１５６号および第６，６８２，９２９号ならびに国際特許出願公開ＷＯ ０３／２０８７９に記載されている。場合によっては、細胞ゲノムは、その遺伝子産物が弱毒生血清１４型アデノウイルスの全ての欠損を補完するような核酸配列を含む必要はない。弱毒生血清１４型アデノウイルスにおいて欠失している１以上の複製に必須な遺伝子機能は、ヘルパーウイルスによって供給され得、該ヘルパーウイルスとしては、例えば、所望の弱毒生血清１４型アデノウイルスの複製のために必要とされる１以上の必須遺伝子機能をトランスに供給する弱毒生血清１４型アデノウイルスである。ヘルパーウイルスはしばしば、感染性のヘルパーウイルスのパッケージングを妨げるように操作される。例えば、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の１以上の複製に必須な遺伝子機能は補完細胞によって提供され、一方、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の１以上の複製に必須な遺伝子機能はヘルパーウイルスによって提供される。
【００２５】
複製に必須な遺伝子機能をコードするアデノウイルス配列の改変（例えば、欠失、突然変異または置換）に加えて、アデノウイルスゲノムは、改変がさもなければ複製に必須な遺伝子機能を含むアデノウイルスゲノムの領域においてであるとしても良性または非致死性である改変（すなわち、アデノウイルスを複製欠損型にしないような改変、あるいは、望ましくは、ウイルス機能および／またはウイルスタンパク質の産生に悪影響を与えないような改変）を含み得る。そのような改変は、通常、ＤＮＡ操作により生じ、あるいは、弱毒生血清１４型アデノウイルスの構築を促進するように機能する。例えば、アデノウイルスゲノムにおける制限酵素部位の除去または導入は有利であり得る。そのような良性の突然変異は、しばしば、ウイルス機能に対する検出可能な悪影響を何ら有さない。
【００２６】
同様に、弱毒生血清１４型アデノウイルスのコートタンパク質は、潜在的な宿主細胞上の受容体に対してアデノウイルスの結合特異性または認識を変更させるように、操作され得る。アデノウイルスについて、そのような操作としては、アデノウイルスコートタンパク質（例えば、ファイバー、ペントンまたはヘキソン）領域の欠失、コートタンパク質の部分への様々なネイティブまたは非ネイティブのリガンドの挿入などを挙げることができる。コートタンパク質を操作することで、弱毒生血清１４型アデノウイルスによって感染される細胞の範囲を広げること、または、特定の細胞型への弱毒生血清１４型アデノウイルスの標的化を可能とすることができる。
【００２７】
宿主細胞への生来的な結合（細胞受容体へのファイバータンパク質の生来的な結合など）を変更させるための任意の好適な技術を用いることができる。例えば、細胞への生来的な結合を除去するために、異なるファイバー長を利用することができる。これは、任意には、ペントンベースまたはファイバーノブへの結合配列の付加を介して達成することができる。この結合配列の付加は、二重特異的または多重特異的な結合配列を介して、直接的または間接的のいずれかで為され得る。代替的な実施形態では、アデノウイルスファイバータンパク質を改変してファイバーシャフト内のアミノ酸の個数を減少させ、それによって「短シャフト型」ファイバー（例えば、米国特許第５，９６２，３１１号に記載されている）を作製してもよい。短シャフト型アデノウイルスファイバー遺伝子を含むアデノウイルスを使用することで、細胞表面受容体へのアデノウイルスファイバーの結合のレベルまたは効率が低減され、細胞表面受容体へのアデノウイルスペントンベースの結合が上昇するため、所与の細胞へのアデノウイルスの結合特異性が上昇する。あるいは、短シャフト型ファイバーを含む弱毒生血清１４型アデノウイルスを使用することで、ペントンベースまたはファイバーノブのいずれかへの非ネイティブなアミノ酸配列の導入による、所望の細胞表面受容体へのアデノウイルスの標的化が可能となる。
【００２８】
さらに別の実施形態では、生来的な基質の結合に関連するアミノ酸残基をコードする核酸残基を変更、追加または欠失して（例えば、国際特許出願公開ＷＯ ００／１５８２３、Einfeld et al., J Virol., 75(23): 11284-11291 (2001)、およびvan Beusechem et al., J. Virol., 76(6): 2753-2762 (2002)を参照）、当該突然変異された核酸残基を組み込んだ（またはそれによってコードされるファイバータンパク質を有する）弱毒生血清１４型アデノウイルスがその生来的な基質に結合する能力が少なくなるようにすることができる。これに関して、Ａｄ１４に対する生来的な細胞受容体は、まだ明確には決定されていない。最近の研究では、Ａｄ１４に対する生来的な細胞受容体はＣＤ４６細胞表面タンパク質であることが示唆されている（例えば、Sakurai et al., Current Gene Therapy, 7(4): 229-238 (2007)、およびMarttila et al., J. Virol., 79: 14429-14436 (2005）を参照）。さらには、Ａｄ１４は、ＣＤ４６に加えて、未だ同定されていない別の受容体に結合し得るという証拠がある（Tuve et al., J. Virol., 80: 12109-12120 (2006)を参照）。いずれにおいても、弱毒生血清１４型アデノウイルスの生来的な細胞結合部位（アデノウイルスファイバータンパク質のノブドメイン、およびアデノウイルスペントンベースに位置するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列など）はそれぞれ、除去または破壊され得る。
【００２９】
ノブと生来的な細胞受容体との間の相互作用を仲介または補助するファイバータンパク質の任意の好適なアミノ酸残基（単数または複数）は、ファイバータンパク質が三量体化できる限りにおいて、突然変異または除去され得る。同様に、ファイバータンパク質が三量体化する能力を保持する限りにおいて、ファイバーノブに対してアミノ酸が付加され得る。好適な残基としては、ファイバーノブドメインの露出されたループ（例えば、ＡＢループ、ＤＥループ、ＦＧループおよびＨＩループなど）内のアミノ酸が挙げられる。
【００３０】
ペントンベースとインテグリンとの間の相互作用を仲介または補助するペントンベースタンパク質の任意の好適なアミノ酸残基（単数または複数）は、突然変異または除去され得る。好適な残基としては、例えば、Ａｄ１４ペントンベースタンパク質の超可変領域内に位置するＲＧＤアミノ酸配列モチーフが挙げられる。ペントンベースタンパク質における生来的なインテグリン結合部位もまた、アデノウイルスペントンベースタンパク質をコードする核酸配列内またはそれに隣接するようにＤＮＡ配列を挿入することなどによって、ネイティブなＲＧＤモチーフをコードする核酸配列を改変することにより破壊して、当該ネイティブなＲＧＤアミノ酸配列がインテグリン受容体への結合のためにコンフォメーション的にアクセスできないようにすることができる。
【００３１】
弱毒生血清１４型アデノウイルスは、それら各々の生来的な細胞結合部位に結合しないようなファイバータンパク質およびペントンベースタンパク質を含み得る。代替的には、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、それら各々の生来的な細胞結合部位に結合するが、対応する野生型コートタンパク質よりも親和性が低いような、ファイバータンパク質およびペントンベースタンパク質を含む。改変されたアデノウイルスファイバータンパク質およびペントンベースタンパク質が、同じ血清型の未改変のアデノウイルスファイバータンパク質およびペントンベースタンパク質よりも、少なくとも約５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍または１００倍低い親和性で、それら各々の生来的な細胞結合部位に結合する場合には、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、生来的な細胞結合部位への結合の減少を示す。
【００３２】
弱毒生血清１４型アデノウイルスはまた、生来的な細胞受容体以外の細胞受容体などの基質（すなわち、リガンド）に結合する非ネイティブなアミノ酸配列を含むキメラコートタンパク質を含み得る。キメラなアデノウイルスコートタンパク質の非ネイティブなアミノ酸配列により、キメラコートタンパク質を含む弱毒生血清１４型アデノウイルスが、当該非ネイティブなアミノ酸配列を有さない対応するアデノウイルスによっては天然には感染されない宿主細胞（すなわち、対応する野生型アデノウイルスによっては感染されない宿主細胞）に結合し、かつ望ましくは感染すること、当該非ネイティブなアミノ酸配列を有さない対応するアデノウイルスよりも高い親和性で、対応する野生型アデノウイルスによって天然に感染される宿主細胞に結合すること、または、標的化されていない細胞よりも高い親和性で特定の標的細胞に結合することが可能となる。「非ネイティブな」アミノ酸配列には、アデノウイルスコートタンパク質には天然には存在しないアミノ酸配列、または、アデノウイルスコートに見出されるが、キャプシド内の非生来的な場所に位置しているアミノ酸配列が包含され得る。「優先的に結合する」とは、非ネイティブなアミノ酸配列が、例えばαｖβ３インテグリンなどの受容体に対して、非ネイティブなリガンドが例えばαｖβ１インテグリンなどの異なる受容体に対して結合するよりも、少なくとも約３倍よりも高い親和性（例えば、少なくとも約５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３５倍、４５倍または５０倍よりも高い親和性）で結合することを意味する。
【００３３】
弱毒生血清１４型アデノウイルスは、野生型アデノウイルスコートタンパク質よりも効率的に免疫細胞に結合する能力をキメラコートタンパク質に付与するような非ネイティブなアミノ酸配列を含むキメラコートタンパク質を含み得る。特に、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、免疫細胞、好ましくは抗原提示細胞（樹状細胞、単球およびマクロファージなど）による弱毒生血清１４型アデノウイルスの取り込みを促進させる非ネイティブなアミノ酸配列を含むキメラなアデノウイルスファイバータンパク質を含み得る。好ましい実施形態では、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、樹状細胞への弱毒生血清１４型アデノウイルスの導入効率を増加させるＲＧＤモチーフ（ＣＲＧＤＣ（配列番号：１）、ＣＸＣＲＧＤＣＸＣ（配列番号：２）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸を表す）、およびＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号：３）が挙げられるが、これらに限定されない）を含むアミノ酸配列（例えば、非ネイティブなアミノ酸配列）を含むキメラファイバータンパク質を含む。ＲＧＤモチーフまたは任意の非ネイティブなアミノ酸配列は、アデノウイルスのファイバーノブ領域、理想的にはアデノウイルスのノブの露出されたループ（ＨＩループなど）に挿入されることが好ましい。非ネイティブなアミノ酸配列はまた、アデノウイルスファイバータンパク質のＣ末端に、任意にはスペーサー配列を介して、付加され得る。スペーサー配列は、１００から２００のアミノ酸を含むことが好ましく、意図された機能を有し得る（しかし、それが必要なわけではない）。
【００３４】
非ネイティブなアミノ酸配列は、任意には、接着タンパク質、ケモカイン受容体、補体受容体、共刺激タンパク質、サイトカイン受容体、高レベルの抗原提示分子、ホーミングタンパク質、マーカータンパク質、抗原取り込みのための受容体、シグナル伝達タンパク質、ウイルス受容体などの、樹状細胞の表面に典型的に見出されるタンパク質を認識し得る。樹状細胞におけるそのような潜在的なリガンド結合部位の例としては、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、２Ａ１、７回膜貫通型（７ＴＭ）受容体、ＣＤ１、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２１、ＣＤ２４、ＣＤ３２、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４バリアント、ＣＤ４６、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５０、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ６４、ＡＳＧＰＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、Ｅカドヘリン、インテグリン、Ｍ３４２、ＭＨＣ−Ｉ、ＭＨＣ−ＩＩ、ＭＩＤＣ−８、ＭＭＲ、ＯＸ６２、ｐ２００−ＭＲ６、ｐ５５、Ｓ１００、ＴＮＦ−Ｒなどが挙げられる。樹状細胞が標的化される場合、非ネイティブなアミノ酸配列は、例えば、ＣＤ−４０（二重）特異的な抗体断片またはＣＤ４０Ｌポリペプチド由来のドメインなどによって、ＣＤ４０細胞表面タンパク質を認識することが好ましい。
【００３５】
非ネイティブなアミノ酸配列は、任意には、ホスファチジルセリン受容体、ビトロネクチン受容体、インテグリン、接着受容体、シグナル伝達および／または炎症に関与する受容体、マーカー、サイトカイン誘導のための受容体、病原体の攻撃によって上方制御される受容体、Ｂ型スカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）スーパーファミリーのメンバー、シアル酸結合受容体、Ｆｃ受容体ファミリーのメンバー、Ｂ７−１およびＢ７−２表面分子、リンパ球受容体、白血球受容体、抗原提示分子などのマクロファージ細胞の表面に典型的に見出されるタンパク質を認識し得る。好適なマクロファージ表面の標的タンパク質の例としては、以下に限定されないが、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１６、ＣＤ１６３、ＣＤ１ａ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２９、Ｃｄ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ７１、ＣＤ８７、ＣＤ９、ＣＤ９８、Ｉｇ受容体、Ｆｃ受容体タンパク質（例えば、Ｆｃα、Ｆｃγ、Ｆｃεのサブタイプなど）、葉酸受容体ｂ、ＨＬＡクラスＩ、シアロアドヘシン、シグレック５およびトル様受容体２（ＴＬＲ２）が挙げられる。
【００３６】
非ネイティブなアミノ酸配列は、インテグリンおよび他の接着分子、補体受容体、インターロイキン受容体、食細胞受容体、免疫グロブリン受容体、活性化マーカー、トランスフェリン受容体、スカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）スーパーファミリーのメンバー、成長因子受容体、セレクチン、ＭＨＣ分子、ＴＮＦ受容体およびＴＮＦ−Ｒ関連因子などのＢ細胞の表面に典型的に見出されるタンパク質を認識し得る。典型的なＢ細胞表面タンパク質の例としては、βグリカン、Ｂ細胞抗原受容体（ＢＡＣ）、Ｂ７−２、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、Ｃ３ｄ受容体、ＣＤ１、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３５、ＣＤ４０、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ６９、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ二量体、ＣＤ９５、エンドグリン、Ｆａｓ抗原、ヒトＩｇ受容体、Ｆｃ受容体タンパク質（例えば、Ｆｃａ、Ｆｃｇ、Ｆｃεのサブタイプなど）、ＩｇＭ、ｇｐ２００−ＭＲ６、成長ホルモン受容体（ＧＨ−Ｒ）、ＩＣＡＭ−１、ＩＬＴ２、ＣＤ８５、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子、トランスフォーミング成長因子受容体（ＴＧＦ−Ｒ）、α４β７インテグリンおよびαｖβ３インテグリンが挙げられる。
【００３７】
別の実施形態では、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、特定の真核細胞型に対して選択的でないキメラのウイルスコートタンパク質を含み得る。キメラコートタンパク質は、内部コートタンパク質配列内へのもしくはその代替としての非ネイティブなアミノ酸配列の挿入、または、コートタンパク質のＮ末端もしくはＣ末端への非ネイティブなアミノ酸配列の付加によって、野生型コートタンパク質とは異なる。例えば、約５から約９個のリジン残基（好ましくは７個のリジン残基）を含むリガンドが、アデノウイルスファイバータンパク質のＣ末端に、非機能的なスペーサー配列を介して連結される。この実施形態では、キメラのウイルスコートタンパク質は、米国特許第６，４６５，２５３号および国際特許出願公開ＷＯ ９７／２００５１に記載されているものなど、野生型ウイルスコートよりも広範な真核細胞に効率的に結合する。
【００３８】
弱毒生血清１４型アデノウイルスが潜在的な宿主細胞を認識する能力は、コートタンパク質の遺伝子操作をせずに、すなわち二重特異的な分子の使用を通じて、改変され得る。例えば、アデノウイルスを、ペントンベース結合ドメインおよび特定の細胞表面結合部位に選択的に結合するドメインを含む二重特異的な分子と複合体化させることにより、特定の細胞型への弱毒生血清１４型アデノウイルスの標的化が可能となる。同様に、非遺伝的な手段を通じて、アデノウイルス粒子の表面に抗原をコンジュゲート化することができる。
【００３９】
非ネイティブなアミノ酸配列を任意のアデノウイルスコートタンパク質のいずれかにコンジュゲート化して、キメラのアデノウイルスコートタンパク質を形成することができる。それゆえ、例えば、非ネイティブなアミノ酸配列は、ファイバータンパク質、ペントンベースタンパク質、ヘキソンタンパク質、タンパク質ＩＸ、ＶＩまたはＩＩＩａなどに、コンジュゲート化、挿入または連結され得る。このようなタンパク質を用いるための方法は、当該分野において周知である（例えば、米国特許第５，５４３，３２８号；第５，５５９，０９９号；第５，７１２，１３６号；第５，７３１，１９０号；第５，７５６，０８６号；第５，７７０，４４２号；第５，８４６，７８２号；第５，９６２，３１１号；第５，９６５，５４１号；第５，８４６，７８２号；第６，０５７，１５５号；第６，１２７，５２５号；第６，１５３，４３５号；第６，３２９，１９０号；第６，４５５，３１４号；第６，４６５，２５３号；第６，５７６，４５６号；第６，６４９，４０７号；第６，７４０，５２５号、第６，９５１，７５５号、および国際特許出願公開ＷＯ ９６／０７７３４、ＷＯ ９６／２６２８１、ＷＯ ９７／２００５１、ＷＯ ９８／０７８７７、ＷＯ ９８／０７８６５、ＷＯ ９８／４０５０９、ＷＯ ９８／５４３４６、ＷＯ ００／１５８２３、ＷＯ ０１／５８９４０およびＷＯ ０１／９２５４９を参照）。キメラのアデノウイルスコートタンパク質は、当該分野で公知の標準的なＤＮＡ組換え技術を使用して作製することができる。好ましくは、キメラのアデノウイルスコートタンパク質をコードする核酸配列は、アデノウイルスゲノム内に位置し、野生型アデノウイルスにおいてコートタンパク質の発現を調節するプロモーターに作動可能に連結される。代替的には、キメラのアデノウイルスコートタンパク質をコードする核酸配列は、アデノウイルスゲノム内に位置し、キメラコートタンパク質の効率的な発現のために必要とされる遺伝的エレメントを含む発現カセットの一部となる。
【００４０】
キメラのアデノウイルスコートタンパク質のコートタンパク質部分は、非ネイティブなアミノ酸配列が付加される全長のアデノウイルスコートタンパク質であり得るか、あるいは、例えば内部またはＣ末端および／もしくはＮ末端において切断されたものであり得る。どのように改変（非ネイティブなアミノ酸の存在を含む）されるにせよ、キメラコートタンパク質は、アデノウイルスのキャプシドに組み込めることが好ましい。非ネイティブなアミノ酸配列がファイバータンパク質に連結される場合、ウイルスタンパク質間またはファイバー単量体間の相互作用を妨げないことが好ましい。したがって、非ネイティブなアミノ酸配列は、それ自体オリゴマー化ドメインでないことが好ましく、それは、そのようなものはアデノウイルスファイバーの三量体化ドメインと好ましくない相互作用をし得るためである。好ましくは、非ネイティブなアミノ酸配列はビリオンタンパク質に付加され、かつ、基質、細胞表面受容体または免疫細胞に容易に露出され（例えば、アデノウイルスタンパク質のＮまたはＣ末端において、基質に面する残基に連結する、ペプチドスペーサー上に位置させる、など）、非ネイティブなアミノ酸配列を最大に露出させるような様式で組み込まれる。理想的には、非ネイティブなアミノ酸配列は、ファイバータンパク質のＣ末端においてアデノウイルスファイバータンパク質に組み込まれる（かつ、スペーサーを介して連結される）か、あるいは、ファイバーの露出されたループ（例えば、ＨＩループ）に組み込まれて、キメラコートタンパク質を生成する。非ネイティブなアミノ酸配列がペントンベースの一部に連結されるかまたはそれを置換する場合、基質、細胞表面受容体または免疫細胞との接触を確実にするために、超可変領域内であることが好ましい。非ネイティブなアミノ酸配列がヘキソンに連結される場合、超可変領域内であることが好ましい（Crawford-Miksza et al., J. Virol., 70(3): 1836-44 (1996)）。非ネイティブなアミノ酸がｐＩＸの一部に連結されるかまたはそれを置換する場合、ｐＩＸのＣ末端内であることが好ましい。スペーサー配列を使用して、アデノウイルス粒子の表面から遠ざかるように非ネイティブなアミノ酸配列を伸ばすことは、非ネイティブなアミノ酸配列が受容体への結合のためにより利用可能となる点、および、非ネイティブなアミノ酸配列とアデノウイルスファイバー単量体との間のいかなる立体相互作用も低減され得る点で有利であり得る。
【００４１】
非ネイティブなアミノ酸配列の細胞受容体への結合親和性は、任意の好適なアッセイによって決定でき、様々なアッセイが公知であって、アデノウイルスコートタンパク質中に組み込むための非ネイティブなアミノ酸配列の選択に有用である。望ましくは、宿主細胞の形質導入レベルが、相対的な結合効率の決定に利用される。すなわち、例えば、細胞表面上にαｖβ３インテグリンを提示している宿主細胞（例えば、ＭＤＡＭＢ４３５細胞）が、キメラコートタンパク質を有する弱毒生血清１４型アデノウイルスおよび非ネイティブなアミノ酸配列を有さない対応するアデノウイルスに曝露され得、次いで、相対的な結合親和性を決定するために、形質導入効率が比較され得る。同様に、細胞表面上にαｖβ３インテグリンを提示している宿主細胞（例えば、ＭＤＡＭＢ４３５細胞）および細胞表面上に主にαｖβ１を提示している宿主細胞（例えば、２９３細胞）の両方が、キメラコートタンパク質を有する弱毒生血清１４型アデノウイルスに曝露され得、次いで、結合親和性を決定するために、形質導入効率が比較され得る。
【００４２】
（例えば、特定の改変細胞型内での精製または増殖を促進するための）他の実施形態では、非ネイティブなアミノ酸（例えば、リガンド）は、細胞表面タンパク質以外の化合物に結合し得る。すなわち、リガンドは、血液および／またはリンパ液媒介性タンパク質（例えば、アルブミン）、ポリアミノ酸などの合成ペプチド配列（例えば、ポリリジン、ポリヒスチジンなど）、人工的なペプチド配列（例えば、ＦＬＡＧ）、およびＲＧＤペプチド断片（Pasqualini et al, J. Cell. Biol., 130: 1189 (1995)）に結合し得る。リガンドは、プラスチック（例えば、Adey et al., Gene, 156: 27 (1995)）、ビオチン（Saggio et al., Biochem. J., 293: 613 (1993)）、ＤＮＡ配列（Cheng et al., Gene, 171: 1 (1996)およびKrook et al., Biochem. Biophys., Res. Commun., 204: 849 (1994)）、ストレプトアビジン（Geibel et al., Biochemistry, 34: 15430 (1995)およびKatz, Biochemistry, 34: 15421 (1995)）、ニトロストレプトアビジン（Balass et al., Anal. Biochem., 243: 264 (1996)）、ヘパリン（Wickham et al., Nature Biotechnol., 14: 1570-73 (1996)）およびその他の基質など、非ペプチド性基質にさえも結合し得る。
【００４３】
アデノウイルスの改変については、米国特許第５，５４３，３２８号；第５，５５９，０９９号；第５，７１２，１３６号；第５，７３１，１９０号；第５，７５６，０８６号；第５，７７０，４４２号；第５，８４６，７８２号；第５，８７１，７２７号；第５，８８５，８０８号；第５，９２２，３１５号；第５，９６２，３１１号；第５，９６５，５４１号；第６，０５７，１５５号；第６，１２７，５２５号；第６，１５３，４３５号；第６，３２９，１９０号；第６，４５５，３１４号；第６，４６５，２５３号；第６，５７６，４５６号；第６，６４９，４０７号；第６，７４０，５２５号，第６，９５１，７５５号および第７，１９５，８９６号；米国特許出願公報２００３／００９９６１９ Ａ１、ならびに国際特許出願ＷＯ ９６／０７７３４、ＷＯ ９６／２６２８１、ＷＯ ９７／２００５１、ＷＯ ９８／０７８６５、ＷＯ ９８／０７８７７、ＷＯ ９８／４０５０９、ＷＯ ９８／５４３４６、ＷＯ ００／１５８２３、ＷＯ ０１／５８９４０およびＷＯ ０１／９２５４９に記載されている。
【００４４】
典型的には、アデノウイルスゲノムの全体または部分を除去することにより、生じる弱毒生血清１４型アデノウイルスは、アデノウイルスキャプシド内にパッケージングされる能力を保持しつつ、異種核酸配列の挿入を受け入れることが可能である。しかしながら、好ましい実施形態では、弱毒生血清１４型アデノウイルスは異種核酸配列を含まない。すなわち、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、好ましくは、アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ２Ａおよび／またはＥ４領域、ならびに任意にはＥ３領域の全体または部分の欠失を有するが、アデノウイルスゲノムの欠失された領域のいずれかに挿入された異種核酸配列は含まない。
【００４５】
しかしながら、他の実施形態では、アデノウイルスから欠失された１以上の領域への１以上の異種核酸配列の挿入が適切であり得る。これに関して、異種核酸配列は、アデノウイルスゲノムのＥ１領域、Ｅ２Ａ領域および／またはＥ４領域、ならびに任意にはＥ３領域に位置し得る。実際、その位置が異種核酸配列の発現を妨げないかまたは弱毒生血清１４型アデノウイルスのパッケージングを阻害しない限り、異種核酸配列は、アデノウイルスゲノムの任意の場所に挿入され得る。アデノウイルス中に挿入され得るあらゆる種類の核酸配列（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡ）が、本発明に関連して使用され得る。好ましくは、異種核酸配列はＤＮＡであり、そして好ましくはタンパク質をコードする（すなわち、１以上のタンパク質をコードする１以上の核酸配列である）。
【００４６】
異種核酸配列は、抗原をコードし得る。「抗原」は、哺乳動物において免疫応答を誘導する分子である。「免疫応答」は例えば、抗体産生および／または免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化を引き起こし得る。本発明の文脈における抗原は、任意のタンパク性分子の任意のサブユニット、断片またはエピトープを含み得、これらとしては、理想的には哺乳動物における免疫応答を誘発し、好ましくは防御免疫を導くような、ウイルス、細菌、寄生虫、真菌、原生動物、プリオン、細胞または細胞外由来のタンパク質またはペプチドが挙げられる。「エピトープ」は、抗体または抗原受容体によって認識される抗原上の配列を意味する。エピトープはまた、当該分野において、「抗原決定基」とも呼ばれている。
【００４７】
異種核酸配列は、弱毒生血清１４型アデノウイルスによって誘発される免疫応答を増強または改変させる免疫系刺激因子をコードし得る。免疫系刺激因子の例としては、サイトカイン、リポ多糖、二本鎖ＲＮＡ、トル様受容体（ＴＬＲ）および補体タンパク質（例えば、ＣＤ４６）が挙げられる。好ましくは、異種核酸配列はサイトカインをコードする。「サイトカイン」は、特定の細胞（例えば、炎症性白血球およびある種の非白血球細胞）によって分泌され、免疫、炎症および造血の制御などにより、細胞間メディエーターとして働く非抗体タンパク質として当該分野において知られている。サイトカインは、一般には、内分泌よりむしろ傍分泌または自己分泌の様式で局所的に作用する。サイトカインは、リンホカイン（リンパ球により作られるサイトカイン）、モノカイン（単球により作られるサイトカイン）、ケモカイン（走化性活性を有するサイトカイン）およびインターロイキン（ある白血球により作られて他の白血球に作用するサイトカイン）に分類され得る。サイトカインは当該分野で公知の任意の好適なサイトカインであってよく、それらとしては、以下に限定されないが、インターフェロン（例えば、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮデルタ、ＩＦＮオメガ、ＩＦＮタウおよびＩＦＮガンマ）、インターロイキン、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファが挙げられる。
【００４８】
弱毒生血清１４型アデノウイルスが１以上の異種核酸配列を含む場合、各異種核酸配列は、例えばプロモーターを変更可能な発現カセットの部分として、１以上のプロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントに作動可能に連結される（すなわち、これらの転写制御下となる）ことが望ましい。配列を作動可能に連結するための技術は、当該分野で周知である。異種核酸配列の十分な発現が達成される限り、本発明の文脈では、任意のプロモーターまたはエンハンサー配列を使用できる。好ましくは、プロモーターは、弱毒生血清１４型アデノウイルスの天然に生じるプロモーターから得られておらず、それに由来せず、またはそれに基づいていないという点で、異種のプロモーターである。これに関して、プロモーターは、例えば、ウイルスプロモーターまたは細胞プロモーターであり得る。さらに、プロモーターは、構成的、誘導性（例えば、放射線、光、化学療法または薬物で誘導可能）または組織特異的であり得る。好適なプロモーターが当該分野で公知である（例えば、国際特許出願公開ＷＯ ２００７／０２７８６０を参照）。
【００４９】
本発明の方法では、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、好ましくは、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与され、血清１４型アデノウイルス粒子が免疫応答を誘導する。弱毒生血清１４型アデノウイルスは、血清１４型アデノウイルスによって感染され得る任意の哺乳動物に投与され得る。好ましくは、弱毒生血清１４型アデノウイルスはヒトに投与される。免疫応答は、液性免疫応答、細胞性免疫応答であり得、あるいは望ましくは、液性および細胞性免疫の組み合わせであり得る。理想的には、免疫応答は、血清１４型アデノウイルスでのその後の攻撃の際の防御を提供する。しかしながら、本発明の文脈では、防御免疫は必要ではない。本発明の方法はさらに、抗体産生および回収のために使用され得る。
【００５０】
弱毒生血清１４型アデノウイルスの投与は、哺乳動物において免疫応答を誘導するための複数ステップのレジメンの一つの構成要素であり得る。特に、本発明の方法は、プライムブースト免疫レジメンの１つの分流を示し得る。したがって、本発明の方法は、哺乳動物に対して、（ａ）弱毒生血清１４型アデノウイルスの投与に先立ってプライミング組成物を投与すること、および／または、（ｂ）弱毒生血清１４型アデノウイルスの投与後にブースティング組成物を投与することを含み得る。
【００５１】
プライミングおよびブースティング組成物は、本明細書に記載されるような任意の好適な抗原を含み得る（例えば、不活性化ウイルス、タンパク質、ペプチドまたはエピトープ配列）。好ましくは、プライミングおよびブースティング組成物は、遺伝子導入ベクターを含む。任意の遺伝子導入ベクターを、プライミング組成物またはブースティング遺伝子組成物において用いることができ、それらとしては、以下に限定されないが、プラスミド、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルスまたはアデノウイルスが挙げられる。理想的には、遺伝子導入ベクターは、プラスミド、アルファウイルスまたはアデノウイルスベクターである。プライミング組成物およびブースティング組成物は、本発明の弱毒生血清１４型アデノウイルスを含んでもよく、あるいは、弱毒生血清１４型アデノウイルスとは異なる遺伝子導入ベクターを含んでもよい。好ましくは、プライミング組成物およびブースティング組成物は各々、本発明の弱毒生血清１４型アデノウイルスを含む。換言すれば、本発明の方法は、弱毒生血清１４型アデノウイルスの複数回の投与を伴うことが望ましい。プライミング組成物および／またはブースティング組成物は、免疫を維持するために好適な任意の時間枠（例えば、弱毒生血清１４型アデノウイルスの投与の、少なくとも約１週間、２週間、４週間、８週間、１２週間、１６週間またはそれよりも前または後）で与えられ得る。加えて、プライミング組成物および／またはブースティング組成物は、特定の免疫レジメンの過程で複数回投与され得る。例えば、免疫レジメンは、プライミング組成物の２回以上（例えば、２回、３回、５回またはそれより多く）の投与、その後で弱毒生血清１４型アデノウイルスの単回投与、その後でブースティング組成物の２回以上（例えば、２回、３回、５回またはそれより多く）の投与を含み得る。当然、場合によっては、本発明の弱毒生血清１４型アデノウイルスの投与は、強力な防御的免疫応答を誘導するのに十分であり得る。これに関しては、プライミングおよび／またはブースティングのレジメンは必要ないかもしれない。
【００５２】
プライミング／ブースティングのレジメンの効果を最大化するために、プライミング組成物および／またはブースティング組成物は、抗原をコードする異種核酸配列を含む遺伝子導入ベクターを含み得る。代替的には、免疫応答は、抗原自体（例えば、抗原性タンパク質、不活性化された病原体など）の投与によって、プライミングまたはブースティングされ得る。例えば、免疫応答は、不活性化された（例えば、熱殺菌または化学的に不活性化された）弱毒化血清１４型アデノウイルス、あるいは不活性化された野生型血清１４型アデノウイルスの投与によって、プライミングおよび／またはブースティングされ得る。
【００５３】
弱毒生血清１４型アデノウイルスを哺乳動物に送達するために任意の投与経路を使用できる。実際、弱毒生血清１４型アデノウイルスを投与するために１つよりも多くの経路を使用できるが、特定の経路が、他の経路よりも迅速かつより効果的な反応を提供し得る。好ましくは、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、筋肉内注射を通じて投与される。１用量の弱毒生血清１４型アデノウイルスはまた、体腔内への適用または注入、皮膚を通じた吸収（例えば、経皮パッチを介して）、吸入、摂取、組織への局所的な適用、または、例えば静脈、腹膜もしくは動脈内投与を通じて非経口的に投与され得る。弱毒生血清１４型アデノウイルスはまた、粒子衝突（例えば、遺伝子銃）によってインビボに投与され得る。
【００５４】
哺乳動物に投与される弱毒生血清１４型アデノウイルスの用量は、標的組織の大きさ、任意の副作用の程度、特定の投与経路などを含む多くの要素に依存するであろう。用量は、理想的には、「有効量」の弱毒生血清１４型アデノウイルスを含み、すなわち、哺乳動物において所望の免疫応答を誘発する弱毒生血清１４型アデノウイルスの用量である。所望の免疫応答は、抗体の産生、その後の攻撃に対する防御、免疫寛容、免疫細胞活性化などを引き起こし得る。単回用量の弱毒生血清１４型アデノウイルスは、少なくとも約１×１０５粒子（粒子単位ともいう）の弱毒生血清１４型アデノウイルスを含むことが望ましい。用量は、好ましくは少なくとも約１×１０６粒子（例えば、約１×１０６〜１×１０１２粒子）、より好ましくは少なくとも約１×１０７粒子、より好ましくは少なくとも約１×１０８粒子（例えば、約１×１０８〜１×１０１１粒子）、最も好ましくは少なくとも約１×１０９粒子（例えば、約１×１０９〜１×１０１０粒子）の弱毒生血清１４型アデノウイルスである。望ましくは、用量は、約１×１０１４粒子以下、好ましくは約１×１０１３粒子以下、さらにより好ましくは約１×１０１２粒子以下、さらにより好ましくは約１×１０１１粒子以下、最も好ましくは約１×１０１０粒子以下（例えば、約１×１０９粒子以下）を含む。換言すれば、単回用量の弱毒生血清１４型アデノウイルスは、例えば、約１×１０６粒子単位（ｐｕ）、２×１０６ｐｕ、４×１０６ｐｕ、１×１０７ｐｕ、２×１０７ｐｕ、４×１０７ｐｕ、１×１０８ｐｕ、２×１０８ｐｕ、４×１０８ｐｕ、１×１０９ｐｕ、２×１０９ｐｕ、４×１０９ｐｕ、１×１０１０ｐｕ、２×１０１０ｐｕ、４×１０１０ｐｕ、１×１０１１ｐｕ、２×１０１１ｐｕ、４×１０１１ｐｕ、１×１０１２ｐｕ、２×１０１２ｐｕまたは４×１０１２ｐｕの弱毒生血清１４型アデノウイルスを含み得る。
【００５５】
望ましくは、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、組成物中、好ましくは医薬的に許容される（例えば、生理学的に許容される）組成物中で投与され、該組成物は、担体、好ましくは医薬的に許容される（例えば、生理学的に許容される）担体および弱毒生血清１４型アデノウイルスを含む。任意の好適な担体を本発明の文脈では用いることができ、そのような担体は当該分野で周知である。担体の選択は、部分的には、組成物が投与される特定の部位および組成物を投与するために用いられる特定の方法によって決定されるであろう。理想的には、組成物は、複製能力を有するアデノウイルスを含まないことが好ましい。組成物は、任意には、無菌であるか、あるいは本発明の弱毒生血清１４型アデノウイルス以外は無菌であり得る。
【００５６】
組成物のために好適な剤形としては、水性および非水性の溶液、抗酸化剤、緩衝液および静菌剤を含有し得る等張無菌溶液、ならびに、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤および保存剤を含み得る水性および非水性の無菌懸濁液が挙げられる。該剤形は、単位用量または複数回用量で密封された容器（アンプルおよびバイアルなど）で提示され得、また、使用の直前に無菌性液体担体（例えば、水）の添加のみを必要とするフリーズドライの（凍結乾燥された）状態で保管され得る。即時性の溶液および懸濁液は、先に説明したような無菌性の粉末、顆粒および錠剤から調製できる。好ましくは、担体は、緩衝化された生理食塩水である。より好ましくは、本発明の方法で使用するための弱毒生血清１４型アデノウイルスは、投与前のダメージから弱毒生血清１４型アデノウイルスを保護するように製剤化された組成物で投与される。例えば、組成物は、ガラス製品、シリンジまたは注射針などの、アデノウイルスを調製、保管または投与するために使用される器具でのアデノウイルスの減小を低減するように製剤化され得る。組成物は、弱毒生血清１４型アデノウイルスの光感受性および／または温度感受性を減少させるように製剤化され得る。そのために、組成物は、例えば上述したようなものなどの医薬的に許容される液体担体、ならびに、ポリソルベート８０、Ｌ−アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロースおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される安定剤を含むことが好ましい。このような組成物の使用は、弱毒生血清１４型アデノウイルスの保存期間を延長させ、投与を促進させ、かつ本発明の方法の効率を向上させるであろう。アデノウイルス含有組成物の製剤化は、例えば、米国特許第６，２２５，２８９号、米国特許第６，５１４，９４３号および国際特許出願公開ＷＯ ００／３４４４４にさらに記載されている。
【００５７】
弱毒生血清１４型アデノウイルスは、経口投与のために製剤化できる。経口投与のために好適な製剤としては、（ａ）液体溶液（水、生理食塩水またはオレンジジュースなどの希釈剤に溶解した有効量の弱毒生血清１４型アデノウイルスなど）、（ｂ）カプセル剤、サシェ剤または錠剤（各々、固形物または顆粒として、所定量の弱毒生血清１４型アデノウイルスを含む）、（ｃ）適当な液体の懸濁液、および（ｄ）好適な乳液が挙げられる。錠剤形態は、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、ポテトスターチ、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、香味剤、および医薬的に適合性の賦形剤のうち、１つ以上を含み得る。ロゼンジ形態は、香味料（通常、ショ糖およびアカシアまたはトラガカント）中の弱毒生血清１４型アデノウイルス、ならびに、ゼラチンおよびグリセリンなどの不活性基剤中に弱毒生血清１４型アデノウイルスを含むか、または、弱毒生血清１４型アデノウイルスに加えて、当該分野で公知であるような賦形剤を含有する、ショ糖およびアカシア、乳化剤、ゲル剤などを含むトローチを含み得る。
【００５８】
弱毒生血清１４型アデノウイルスは、単独でまたは他の好適な構成成分と組み合わせて、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤とされ得る。これらのエアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧を許容する噴射剤中に入れることができる。これらは、ネブライザーまたはアトマイザー中など、加圧されない調合物用の医薬としても製剤化され得る。
【００５９】
弱毒生血清１４型アデノウイルスは、局所投与のために製剤化され得る。局所製剤としては、例えば、軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、ドロップ剤、坐剤、スプレー剤、液剤および粉末剤が挙げられる。従来の医薬担体、水剤、粉末剤、油性基材、増粘剤などが、必要であるかまたは望ましいこともあり得る。
【００６０】
弱毒生血清１４型アデノウイルスは、スポンジ、生体適合性の網、機械的リザーバーまたは機械的インプラントなどの、制御性または持続性の放出を可能とする器具内または器具上に投与され得る。インプラント（例えば、米国特許第５，４４３，５０５号を参照）および器具（例えば、米国特許第４，８６３，４５７号を参照）（埋め込み可能な器具（例えば、ポリマー組成物を含む機械的リザーバーまたはインプラントまたは器具）など）は、弱毒生血清１４型アデノウイルスの投与のために特に有用であり得る。弱毒生血清１４型アデノウイルスはまた、持続放出製剤の形態で投与され得（例えば、米国特許第５，３７８，４７５号を参照）、該製剤は、例えば、ゲルフォーム、ヒアルロン酸、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、ポリリン酸エステル（ビス−２−ヒドロキシエチル−テレフタレート（ＢＨＥＴ）など）および／またはポリ乳酸−グリコール酸を含む。
【００６１】
組成物はまた、形質導入効率を増強させるためにも製剤化できる。さらに、当業者は、弱毒生血清１４型アデノウイルスが、他の治療的または生物学的に活性の物質と共に組成物中に存在し得ることを理解するだろう。例えば、弱毒生血清１４型アデノウイルスのインビボ投与に関連する腫張および炎症を低減するために、イブプロフェンまたはステロイドなどの炎症を制御する因子を組成物の部分とすることができる。さらに、免疫系刺激因子またはアジュバント（例えば、インターロイキン、リポ多糖および二本鎖ＲＮＡ）を投与して、弱毒生血清１４型アデノウイルスに対する任意の免疫応答を増強または改変できる。抗生物質（すなわち、殺菌剤および殺真菌剤）が、既存の感染を治療するためおよび／または将来的な感染の危険性を低減するために存在し得る。
【００６２】
以下の実施例により本発明をさらに説明するが、当然ながら、それらが本発明の範囲を何らかの点で限定しているものとは解釈してはならない。
【実施例】
【００６３】
実施例１
本実施例は、弱毒生血清１４型アデノウイルスの構築および特徴付けを示す。
【００６４】
弱毒生血清１４型アデノウイルスのコンストラクトは、アデノウイルスベクターアセンブリ用の細菌の組換え系を使用して全ゲノムプラスミドから作製される（Campos et al., Hum. Gene Ther., 15(11): 1125-1130 (2004)）。簡潔に述べれば、該系は、Ｅ．ｃｏｌｉ内での一対のプラスミド（すなわち、シャトルプラスミドおよびベースプラスミド）間の相同組換えを利用する。シャトルプラスミドは、Ｅ１領域の近くのアデノウイルス配列によって隣接されるＥ１領域の欠失を含む。ベースプラスミドは、欠失を所望する位置において、選択マーカーと共に完全なアデノウイルスベクターゲノムを含む。組換えは、シャトルプラスミドおよびベースプラスミドの相同配列間で生じる。所望の組換えプラスミドは、Ｅ１欠失を含むアデノウイルスゲノムからなる。
【００６５】
組換え能力を有する（Ｒｅｃ＋）Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＪＤＥ３を、制限酵素消化により線状化したシャトルおよびベースプラスミドの混合物で形質転換し、選択培地にプレーティングする。次いで、所望の組換えクローンを、標準的なプラスミドＤＮＡ抽出、制限酵素解析および配列決定により同定する。得られたプラスミド（ｐＡｄ１４ｎｒと呼ぶ）をＰｍｅＩで消化してプラスミド骨格から組換えＡｄ１４ｎｒゲノム（ｒＡｄ１４ｎｒ）を切り出し、２９３−ＯＲＦ６細胞をトランスフェクションする。プラスミドのトランスフェクション後、得られたアデノウイルスを連続継代および塩化セシウム勾配での精製により増幅する。
【００６６】
精製したアデノウイルスを、いくつかのアッセイを使用して特徴付ける。具体的には、感染性粒子および全粒子の力価を決定し、ｒＡｄ１４ｎｒの遺伝的安定性／完全性をＰＣＲ解析およびＤＮＡ配列決定によって確認し、各ストックを、複製能力を有するアデノウイルス（ＲＣＡ）の存在について試験する。
【００６７】
Ａｄ１４ｎｒの収率を、１０リットル培養までの３回の連続増幅で評価する。Ａｄ１４ｎｒの収率は、1リットル当たり少なくとも１×１０１３粒子単位（ｐｕ）であると予測される。ウイルスストックが最終的には商用規模のバイオリアクターにまで増幅できることを保証するために、Ａｄ１４ｎｒの１０回の連続継代の間に、遺伝的構造の完全性（Genetic Structural Integrity）（ＧＳＩ）について試験する。欠失したＥ１領域に隣接するプライマーオリゴヌクレオチドを用い、ＰＣＲを使用してＡｄ１４ｎｒのＥ１領域で生じる任意の変化について調べる。Ａｄ１４ｎｒの安定性を、日常的な保存温度で試験する。Ａｄ５ベースのベクターの安定性が、−２０℃で５年にわたって、および４℃で６ヶ月にわたって示された。同様の安定性が、Ａｄ３５ベクターについて観察された。Ａｄ１４ｎｒストックの安定性を、−２０℃、４℃および２５℃で少なくとも３ヶ月間試験する。試験された時点は、１日目、７日目および１４日目ならびに４週目、８週目および１２週目である。安定性試験は、プラーク形成アッセイおよび粒子測定を使用して行う。
【００６８】
本実施例は、弱毒生血清１４型アデノウイルスの製造および特徴付けの方法を示している。
【００６９】
実施例２
本実施例は、哺乳動物における弱毒生血清１４型アデノウイルスに対する免疫応答を測定するための方法を示す。
【００７０】
Ａｄ１４ｎｒの免疫原性をマウスモデルおよび霊長類モデルにおいて試験する。具体的には、Ａｄ１４ｎｒを実施例１に記載されるように調製し、精製する。１０匹のＢａｌｂ／ｃマウスを３つの投与量群（すなわち、１×１０８ｐｕ、１×１０９ｐｕおよび１×１０１０ｐｕ）の各々に割り当てる。ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１４０Ｂの断片の発現カセットを含むＥ１欠失型の血清１４型アデノウイルス（Ａｄ１４ｇｐ１４０Ｂ）をポジティブコントロールとし、Ｅ１欠失型のＡｄ５ベクターをネガティブコントロールとする。０日目にマウスに適当なアデノウイルスを注入し、中和抗体価について特定の時点（すなわち、０日目、１日目、３日目、７日目、１４日目および２１日目）でアッセイする。
【００７１】
霊長類の免疫原性試験は、Ａｄ５ベースのワクチンについてヒトにおいて免疫原性であってかつ耐用性良好であることが知られている用量で、霊長類において免疫応答が強力であることを確認することにフォーカスする。これに関して、２匹のカニクイザルを、２つの投与量群（１×１０１０ｐｕおよび１×１０１１ｐｕ）の各々に割り当てる。０日目にサルにＡｄ１４ｎｒを注入し、中和抗体価について特定の時点（すなわち、０日目、１日目、３日目、７日目、１４日目および２１日目）でアッセイする。
【００７２】
感染された軍隊入隊者における抗体の存在を評価するために使用される中和抗体価アッセイ（Morb. Mortal. Wkly. Rep., 56(45): 1181-1184 (2007)）を上述の免疫原性実験に使用する。定量的血清比色マイクロ中和化（ＳＮ）試験も使用する。これは元々、経口生ワクチンの評価のために、アデノウイルス４型および７型のために開発および検証されたものである（Lyons et al., Vaccine, 26(23): 2890-2898 (2008))。試験前に、各血清標本を５６±２℃で３０±２分間不活性化させる。必要な範囲をカバーするために２倍希釈を用いて、６ウェル／希釈の群で血清標本を試験する。ネガティブおよびポジティブ参照の血清を同時に試験する。接種ウイルス用量を、各アッセイにおいて、６ウェル／用量を用いて２分の１ログ用量で滴定する。各ウェルは、１００組織培養感染量ＴＣＩＤ５０（±０．７ｌｏｇ１０）の適当な血清型のアデノウイルスを含む。１時間のインキュベーション後、２０，０００±２，０００個のＡ５４９細胞／ｍｌを含む１００μｌを添加する。７日後、細胞をニュートラルレッド液とともにインキュベーションして染色し、機械洗浄し、次いで酸アルコールを用いて固定する。プレートのブランクを差し引いて、５５０ｎｍにてプレートを読み取る。多重比較のためにボンフェローニ補正をしてＡＮＯＶＡを使用して統計をとる。
【００７３】
本実施例は、哺乳動物における弱毒生血清１４型アデノウイルスの免疫原性を試験するための方法を示している。
【００７４】
実施例３
本実施例は、哺乳動物において弱毒生血清１４型アデノウイルスに対する免疫応答を誘導する方法を示す。
【００７５】
欠失したＥ１領域に挿入されたＨＩＶエンベロープの断片（ｇｐ１４０Ｂ）の発現カセットを含む、１ｘ１０９ｐｕのＥ１欠失型の血清１４型アデノウイルスを、マウスに１回または２回注入した。血清を６週目に採取し、ＤｅＷｉｔｔ株と新規Ａｄ１４野生型ウイルスである１９６８Ｔとの両方について中和アッセイにて評価した。アデノウイルスの２回目の（すなわち、ブーストの）投与を受けた動物について、アデノウイルスを６週目に投与し、血清を４週間後にサンプリングした。アデノウイルスの単回投与後に、大きな力価の中和抗体が誘導され、これはアデノウイルスの２回目の投与でさらに増加した。
【００７６】
これらの結果は、トランスジーンを欠く弱毒生血清１４型アデノウイルスが、Ａｄ１４のＤｅＷｉｔｔ株および１９６８Ｔ株の両方に対して反応性の中和抗体を高力価で産生することを強く示唆している。
【００７７】
実施例４
本実施例は、哺乳動物における弱毒生血清１４型アデノウイルスの安全性を決定する方法を示す。
【００７８】
Ａｄ１４ｎｒの耐用性を、高用量のＡｄ１４ｎｒで行われる体重測定を用いて、マウスにおいて評価する。実験は以下の通りに行う。
動物：１群あたり、１０匹の雌および１０匹の雄のＢａｌｂ／ｃマウス
用量群：１×１０１０ｐｕ Ａｄ１４ｎｒ、１×１０１１ｐｕ Ａｄ１４ｎｒ、１×１０１０ｐｕ Ａｄ５ｎｕｌｌ、１×１０１１ｐｕ Ａｄ５ｎｕｌｌ、および処方緩衝液（formulation buffer）のみ
経路：筋肉内および静脈内
エンドポイント：注射後２１日間、毎日の体重測定
【００７９】
予備的な生体分布を２１日目にモニタリングする。生体分布は、Ａｄ１４ｎｒおよびＡｄ５ｎｕｌｌの欠失したＥ１領域に特異的な定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイを用いて行う。モニタリングされる組織としては、肝臓、脾臓、腎臓、脳、生殖腺、心臓、肺、および注射部位が挙げられる。これらの組織の解析は、耐用性と関連する組織におけるアデノウイルスの蓄積を同定し、将来的な毒性試験の際に考慮される必要があり得る。上述の生体分布試験の開始前に、Ａｄ１４ｎｒのｑＰＣＲアッセイを開発して試験する。
【００８０】
Ａ１４ゲノムの特異的な検出のために好適なプライマーセットは、実施例１に記載のＥ１領域の欠失を解析するために用いられるものと同様である。ゲノムの定量のためのｑＰＣＲ法は、当該分野で日常的に使用されている。これらの実験の文脈で使用されるｑＰＣＲアッセイの特異性、アッセイ内精度および正確性は、ＧＬＰ試験の一部として評価された後、ＩＮＤ提出でＦＤＡに提出されている（Ａｌｔｈｅａ Ｒｅｐｏｒｔ第Ｊ１０６−００１号、第Ｊ１０６−００２号）。このアッセイは、アデノウイルスベクターコンストラクトのコピー数の定量に好適であることが見出された。定量のためのｑＰＣＲの各実行について、妥当であると考えられる以下の許容基準を満たさなければならない：（１）標準曲線の相関係数（ｒ２）は＞０．９８０でなければならない、（２）ネガティブ抽出コントロールは検出限界より低くなければならない、および（３）鋳型なしのコントロールは増幅を示してはならない。このアッセイの検出の下限は１０コピー／サンプルであることが見出され、また、定量の下限は５０コピー／サンプルである。
【００８１】
本実施例は、哺乳動物における弱毒生血清１４型アデノウイルスの安全性を決定する方法を記述している。
【００８２】
本明細書で挙げた、刊行物、特許出願および特許を含む全ての参照文献は、各参照文献が参照したことにより組み込まれることが個々的かつ具体的に示され、また本明細書にその全体が示されているのと同程度まで、参照したことにより本明細書に組み込まれる。
【００８３】
本発明を説明する文脈における（特に、特許請求の範囲の文脈における）用語「一つの（a）」および「一つの（an）」および「該（the）」および同様の指示詞の使用は、本明細書中に別段の指示があるか、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含するものと解釈されるべきである。用語「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」および「含む（containing）」は、別段の言及がない限り、オープン・エンドの用語（すなわち、「含むが、これ（ら）に限定されない」という意味）として解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書に別段の指示がない限り、当該範囲内の各個別の値を個々的に言及する簡易的な方法として機能することを単に意図しており、各個別の値は、本明細書に個々的に列挙されたかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載された全ての方法は、本明細書に別段の指示があるか、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で行なうことができる。本明細書で与えた任意のおよび全ての例、または例示的な言葉（例えば、「など（such as）」）の使用は、本発明をより明らかにすることを単に意図しており、別段の主張がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる言葉使いも、主張されていない任意の構成要素が本発明の実施に必須のものであると示しているものと解釈してはならない。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態を、本発明者らが知っている本発明を実施するための最良の形態を含めて、本明細書に記載している。それらの好ましい実施形態の変形は、上記の記載を読めば、当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がこのような変形を適宜用いることを予期しており、また、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されたのとは別のやり方で本発明が実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用法によって許容される限り、本明細書に添付の特許請求の範囲に挙げられた事項のあらゆる改変および均等物を包含する。さらには、本明細書に別段の指示がないか、または文脈と明らかに矛盾しない限り、あらゆる可能な変形での上述した構成要素の任意の組み合わせが、本発明に包含される。
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、国立衛生研究所により授与された認可番号第Ｒ４３ ＡＩ０６２１７６−０１ Ａ２号のもとでの政府支援と共に為された。連邦政府は、本発明について特定の権利を有する。
【０００２】
電子的に提出された資料の参照による組み込み
コンピューターで読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列リストが、参照により、その全体として本明細書に組み込まれ、当該配列リストは、本明細書と同時に提出され、かつ、２００８年１２月１１日に作成された「704107_ST25.TXT」という名前の一つの１１３７バイトのＡＳＣＩＩ（Ｔｅｘｔ）ファイルとして識別されるものである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ヒトにおけるアデノウイルス血清１４型（Ａｄ１４）による感染は、ほとんど報告されていない。近年、Ａｄ１４は、健康な若年成人を含むヒトにおいて、重度の、時には致命的な呼吸器疾患を引き起こし得る新たなアデノウイルス血清型となった（Centers for Disease Control and Prevention, Morb. Mortal. Wkly. Rep., 56(45): 1181-84 (2007)、およびMetzgar et al., J. Infectious Diseases, 196: 1465-73 (2007)を参照)。２００６年５月、ニューヨークの生後１２日の乳児が、Ａｄ１４感染によって引き起こされた呼吸器疾患により死亡した。
【０００４】
２００７年２月以来、アデノウイルス感染に関連する呼吸器疾患の症例の発生が、テキサス州のラックランド空軍基地（ＬＡＦＢ）における基礎軍事訓練生（basic military trainees）の間で報告された。ＬＡＦＢから得られた４２３の呼吸器標本のうち、２６８（６３％）がアデノウイルス検査で陽性であり、２６８のうち１１８（４４％）について血清型が調べられ、血清型を調べられたうちの１０６（９０％）がＡｄ１４であった。
【０００５】
２００７年５月、ワシントン州の養護施設の３人の居住者が、Ａｄ１４検査に陽性であった。これらの患者は、重度の肺炎のため、集中治療および人工呼吸器が必要であった。２００７年４月始めに、１７人の患者が、重度の肺炎のためにオレゴンの病院に収容されたことが報告された。これらの患者のうち１５人のサンプルが、Ａｄ１４検査に陽性であった。オレゴン州公衆衛生局はその後、２００６年１１月から２００７年４月までに３１人の患者のサンプルがＡｄ１４に陽性であることを確認した。オレゴン州は、全部で７件のＡｄ１４に関連する死亡を報告した。Ａｄ１４の発生は他には、サウスカロライナ州において報告されている。
【０００６】
上述したＡｄ１４陽性患者のうち５３人（３８％）が入院し、これには、集中治療室（ＩＣＵ）に収容された２４人（１７％）；死亡した９人（５％）の患者が含まれる。４つの州全てから単離されたＡｄ１４は、完全なヘキソンおよびファイバー遺伝子の配列データで同一であった。しかしながら、これらの分離株は、基準となるＡｄ１４株（すなわち、ＤｅＷｉｔｔ株）（Van Der Veen et al, Am. J. Hyg., 65: 119-129 (1957)）とは異なっており、これは、合衆国における新たなＡｄ１４バリアントの発生および拡大を示唆していた（Centers for Disease Control and Prevention, Morb. Mortal. Wkly. Rep., 56(45): 1181-84 (2007)を参照）。
【０００７】
したがって、Ａｄ１４の発生株を効果的に標的するワクチンおよび免疫方法が必要である。本発明は、そのような方法を提供する。
【発明の概要】
【０００８】
発明の要旨
本発明は、哺乳動物において血清１４型アデノウイルスに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。該方法は、哺乳動物に弱毒生血清１４型アデノウイルスを投与することを含み、該投与で血清１４型アデノウイルスに対する免疫応答が該哺乳動物において誘導される。
【０００９】
本発明はまた、弱毒生血清１４型アデノウイルス、および、そのような弱毒生血清１４型アデノウイルスを含む組成物（例えば、ワクチン）を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、哺乳動物において血清１４型アデノウイルスに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。アデノウイルスは、３６ｋｂの二本鎖ＤＮＡを含む、中型（９０〜１００ｎｍ）で非エンベロープ型の二十面体ウイルスである。ヒトへの感染を引き起こし得る４９種の免疫学的に異なるアデノウイルス型が存在する：サブグループＡ（例えば、血清１２型、１８型および３１型）、サブグループＢ（例えば、血清３型、７型、１１型、１４型、１６型、２１型、３４型、３５型および５０型）、サブグループＣ（例えば、血清２型および５型）サブグループＤ（例えば、血清８型、９型、１０型、１３型、１５型、１７型、１９型、２０型、２２〜３０型、３２型、３３型、３６〜３９型および４２〜４８型）、サブグループＥ（例えば、血清４型）、サブグループＦ（例えば、血清４０型および４１型）、および未分類のサブグループ（例えば、血清４９型および５１型）。野生型血清１４型アデノウイルスは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ８０３２９４として寄託されている。血清１４型アデノウイルスの新規循環株である１９６８Ｔについても記述されている。
【００１１】
アデノウイルスは最も一般には呼吸器疾患を引き起こすが、様々な他の疾患（胃腸炎、結膜炎、膀胱炎、および発疹の疾患など)もまた引き起こし得る。アデノウイルス感染により引き起こされる呼吸器疾患の症状は、通常の風邪症候群から、肺炎、クループおよび気管支炎までわたる。免疫系不全の患者は、アデノウイルス感染の重度の合併症に特に罹患しやすい。急性呼吸器疾患（ＡＲＤ）は、第２次世界大戦中に軍隊入隊者の間で最初に認識され、混雑状態および緊張状態の間のアデノウイルス感染によって引き起こされ得る。
【００１２】
本発明は、哺乳動物に弱毒生血清１４型アデノウイルスを投与することを含む。弱毒生血清１４型アデノウイルスは高力価で産生でき、複製する細胞および複製しない細胞に効率的に送り込むことができる。弱毒生血清１４型アデノウイルスは染色体外にとどまるため、ランダムな挿入突然変異および標的細胞の遺伝型の永続的変化の危険性が排除される。
【００１３】
本明細書で用いる場合、用語「生（live）」は、細胞への進入能力を保持しており、かつ、例えば破壊（例えば、超音波処理）、変性（例えば、加熱または溶媒の使用）または架橋（例えば、ホルマリン架橋を介する）によって、物理的に不活性化されていないアデノウイルスを意味する。本明細書で用いる場合、用語「弱毒（弱毒化、attenuated）」は、病原性が低減されたアデノウイルスを意味する。弱毒化は、当該分野で公知の様々な方法を使用して達成できる。例えば、動物、卵、または組織培養物中のウイルスの連続継代は、様々な突然変異の獲得をもたらし得る。そのような突然変異は、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト細胞）におけるウイルスの複製を妨げることによって、または、ウイルスの複製能力を排除はしないが低減させ、哺乳動物細胞において病気を誘導することなく複製し得るようにすることによって、病原性の低減をもたらし得る。
【００１４】
本発明の弱毒生血清１４型アデノウイルスは、該アデノウイルスゲノムの１以上の領域の補完を必要とし得、該領域は、例えば少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能の欠損（すなわち、弱毒生血清１４型アデノウイルスが、典型的な宿主細胞、特には、本発明の方法の過程において弱毒生血清１４型アデノウイルスによって感染された哺乳動物の宿主細胞において複製しないような欠損）の結果として、複製のために必要とされるものである。このようなアデノウイルスはまた、当該技術分野において「複製欠損型」アデノウイルスとも呼ばれる。本明細書で用いる場合、遺伝子、遺伝子機能、遺伝子、またはゲノム領域の欠損は、アデノウイルスゲノムの遺伝物質の突然変異または欠失であって、全体的または部分的に核酸配列が突然変異または欠失された遺伝子の機能を、消失または減弱させる（例えば、遺伝子産物の機能が、少なくとも約２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍または５０倍低減されるなど）のに十分であるようなものとして定義される。遺伝子領域全体の欠失は、複製に必須な遺伝子機能の破壊のためには必要とされないことがしばしばである。しかしながら、アデノウイルスゲノム中の十分なスペースが１以上のトランスジーンのために必要である場合には、遺伝子領域の大部分の除去が所望され得る。遺伝物質の欠失が好ましいが、付加または置換による遺伝物質の突然変異もまた、遺伝子機能を破壊するために適切である。複製に必須な遺伝子機能とは、複製（例えば、増殖）のために必要とされる遺伝子機能であり、例えば、アデノウイルス初期領域（例えば、Ｅ１、Ｅ２およびＥ４領域）、後期領域（例えば、Ｌ１〜Ｌ５領域）、ウイルスのパッケージングに関与する遺伝子（例えば、ＩＶａ２遺伝子）、およびウイルス関連ＲＮＡ（例えば、ＶＡ−ＲＮＡ１および／またはＶＡ−ＲＮＡ−２）によってコードされている。
【００１５】
弱毒生血清１４型アデノウイルスは、増殖のために、高々、該アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ２ＡおよびＥ４領域の補完を必要とするものであることが望ましい。したがって、増殖のために、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、高々、（ａ）Ｅ１領域、（ｂ）Ｅ２Ａ領域、（ｃ）Ｅ４領域、（ｄ）Ｅ１およびＥ２Ａ領域、（ｅ）Ｅ１およびＥ４領域、（ｆ）Ｅ２ＡおよびＥ４領域、または（ｇ）Ｅ１、Ｅ２ＡおよびＥ４領域の補完を必要とし得る。好ましくは、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、増殖のために、高々、該アデノウイルスゲノムのＥ１および／またはＥ４領域の補完を必要とする。
【００１６】
弱毒生血清１４型アデノウイルスは、Ｅ１、Ｅ２Ａおよび／またはＥ４領域以外のアデノウイルスゲノムの部分において欠失および／または突然変異を含み得る。例えば、弱毒生血清１４型アデノウイルスはまた、国際特許出願公開ＷＯ ００／００６２８において議論されているように主要後期プロモーター（ＭＬＰ）において、複製に必須な遺伝子機能を含まないＥ３領域（例えば、Ｅ３領域のＸｂａＩ欠失）において、および／または、複製に必須な遺伝子機能を含むが、増殖のためにＥ１、Ｅ２Ａおよび／またはＥ４以外の領域の補完を必要としないような領域において、欠失および／または突然変異を有し得る。
【００１７】
Ｅ１領域に関して、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、Ｅ１Ａ領域の全体もしくは部分および／またはＥ１Ｂ領域の全体もしくは部分を欠失してもよく、例えば、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ領域の各々について、複製に必須な遺伝子機能を少なくとも１つ欠失し、複製のために、該アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ領域およびＥ１Ｂ領域の補完を必要とし得る。弱毒生血清１４型アデノウイルスがＥ１欠損である場合、アデノウイルスゲノムは、（アデノウイルス血清１４型ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ８０３２９４）に基づいて、）ヌクレオチド４６５から５００（例えば、ヌクレオチド４８８）の間の任意のヌクレオチドにて開始し、ヌクレオチド２，９００から２，９５０（例、ヌクレオチド２，９２５）の間の任意のヌクレオチドにて終了する欠失を含み得る。欠失ヌクレオチド部分を規定する終点は、正確に決定することが困難であり得、典型的には、弱毒生血清１４型アデノウイルスの性質には有意に影響を与えないであろう（すなわち、上述のヌクレオチド番号の各々は、＋／−１、２、３、４、５、または１０もしくは２０ヌクレオチドにさえもなり得る）。
【００１８】
Ｅ２Ａ領域に関して、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、Ｅ２Ａ領域の完全な欠失を含まないことが好ましく、欠失は、約２３０塩基対未満の長さであることが好ましい。一般に、アデノウイルスのＥ２Ａ領域は、ＤＢＰ（ＤＮＡ結合タンパク質）をコードしており、これはＤＮＡ複製に必要なポリペプチドである。ＤＢＰは、ウイルスの血清型に応じて、４７３から５２９アミノ酸から構成されている。ＤＢＰは、広がったＮｔドメインを有する球形のＣｔからなる長楕円として存在する、非対称タンパク質であると考えられている。Ｃｔドメインは、核酸に結合し、亜鉛に結合し、かつＤＮＡ鎖伸長のレベルでＤＮＡ合成に機能するというＤＢＰの能力に関与していることが、研究により示唆されている。しかしながら、Ｎｔドメインは、転写および転写後の両方のレベルで後期遺伝子発現において機能すると考えられており、該タンパク質の効率的な核局在に関与し、そしてまた、それ自体の発現の増強にも関係し得る。Ｎｔドメイン中のアミノ酸２から３８の間の欠失は、この領域がＤＢＰの機能に重要であることを示唆した（Brough et al, Virology, 196: 269-281 (1993)）。ＤＢＰのＣｔ領域をコードするＥ２Ａ領域の欠失は、ウイルスの複製に影響しないが、ＤＢＰのＮｔドメインのアミノ酸２から３８をコードするＥ２Ａ領域の欠失は、ウイルスの複製を阻害する。弱毒生血清１４型アデノウイルスは、アデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域のこの部分を含むことが好ましい。特に、例えば、Ｅ２Ａ領域の保持すべき所望の部分は、Ｅ２Ａ領域の５’末端によって規定されるアデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域の部分である。アデノウイルスゲノムのこの部分が弱毒生血清１４型アデノウイルスに含まれることが望ましく、それは、この部分は、所望のウイルス増殖レベルを提供するようには現存のＥ２Ａ補完細胞株において補完されないためである。
【００１９】
Ｅ４領域に関して、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、Ｅ４領域の全体または一部を欠失し得る。望ましくは、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、Ｅ４領域のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）６の欠失または突然変異を含み、これは、弱毒生血清１４型アデノウイルスの増殖のために必要な唯一のＥ４領域の部分であると考えられている。
【００２０】
本発明の一つの実施形態では、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、Ｅ１およびＥ４領域の各々について全体または部分を欠失しているアデノウイルスゲノムを含み（すなわち、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、Ｅ１／Ｅ４欠損型アデノウイルスである）、好ましくは、Ｅ４領域のコード領域全体がアデノウイルスゲノムから欠失されている。換言すれば、Ｅ４領域の全てのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が除去されている。別の実施形態では、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、Ｅ１領域全体の欠失によって、および、Ｅ４領域の一部の欠失によって、複製欠損型になっている。弱毒生血清１４型アデノウイルスのＥ４領域は、ネイティブなＥ４プロモーター、ポリアデニル化配列、および／または右側の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を保持し得る。
【００２１】
いくつかの実施形態では、例えば、Ｅ１領域の１以上の遺伝子機能およびＥ４領域の１以上の遺伝子機能について補完を必要とする弱毒生血清１４型アデノウイルスは、Ｅ１領域のみの１以上の遺伝子機能について補完が必要な弱毒生血清１４型アデノウイルスによって達成されるのと同様のウイルス増殖を補完細胞株において提供するために、スペーサー配列を含み得る。該スペーサー配列は、所望の長さの任意のヌクレオチド配列（単数または複数）を含み得、少なくとも約１５塩基対（例えば、約１５塩基対から約１２，０００塩基対）、好ましくは約１００塩基対から約１０，０００塩基対、より好ましくは約５００塩基対から約８，０００塩基対、さらにより好ましくは約１，５００塩基対から約６，０００塩基対、最も好ましくは約２，０００から約３，０００塩基対の長さの配列などである。スペーサーエレメント配列は、コーディングまたはノンコーディング、アデノウイルスに対してネイティブまたは非ネイティブ、血清グループＢのアデノウイルスに対してネイティブまたは非ネイティブ、および、該アデノウイルスゲノム（すなわち、血清１４型アデノウイルス）に関してネイティブまたは非ネイティブであり得るが、欠損領域について複製に必須の機能を回復させない。スペーサーエレメントは、弱毒生血清１４型アデノウイルスのいずれの領域に位置してもよいが、好ましくは、スペーサーは、アデノウイルスゲノムのＥ１領域またはＥ４領域に位置する。アデノウイルスベクターにおけるスペーサーの使用は、米国特許第５，８５１，８０６号に記載されている。
【００２２】
弱毒生血清１４型アデノウイルスは、複製（すなわち、増殖）のために、高々、該アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ２Ａおよび／またはＥ４領域の複製に必須な遺伝子機能の補完を必要とすることが好ましいが、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、増殖のために他の補完が必要とされるような他の欠損を有することが可能である。特に、弱毒生血清１４型アデノウイルスが複製欠損型を維持し、かつ、例えば、補完細胞、および／または、破壊された複製に必須な遺伝子機能をコードする外因性ＤＮＡ（例えば、ヘルパーアデノウイルス）を使用して増殖され得る限り、アデノウイルスゲノムは、実施者によって所望される１以上の複製に必須な遺伝子機能を破壊するために改変され得る。これに関して、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、アデノウイルスゲノムの初期領域のみについて、アデノウイルスゲノムの後期領域のみについて、アデノウイルスゲノムの初期および後期領域の両方について、または、アデノウイルスの全ての遺伝子について（すなわち、高キャパシティーアデノベクター（ＨＣ−Ａｄ）、Morsy et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 95: 7876-7871 (1998), Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 94: 1645-1650 (1997)、および Kochanek et al., Hum. Gene Ther., 10: 2451-2459 (1999)を参照）、複製に必須な遺伝子機能が欠損され得る。複製欠損型アデノウイルスの一般的な作製については、米国特許第５，８３７，５１１号、第５，８５１，８０６号、第６，１２７，１７５号、第６，４８２，６１６号および第７，１９５，８９６号；米国特許出願公開２００１／００４３９２２ Ａ１、２００２／０００４０４０ Ａ１、２００２／０１１０５４５ Ａ１および２００４／０１６１８４８ Ａ１；ならびに、国際特許出願公開ＷＯ ９４／２８１５２、ＷＯ ９５／０２６９７、ＷＯ ９５／１６７７２、ＷＯ ９５／３４６７１、ＷＯ ９６／２２３７８、ＷＯ ９７／１２９８６、ＷＯ ９７／２１８２６およびＷＯ ０３／０２２３１１において開示されている。
【００２３】
弱毒生血清１４型アデノウイルスは、典型的には、弱毒生血清１４型アデノウイルスには存在しないがウイルス増殖のために必要とされる遺伝子機能を提供する補完細胞株中で、高力価の弱毒生血清１４型アデノウイルスストックを作製するために適切なレベルにて、産生されるであろう。補完細胞株は、アデノウイルスの増殖のために必要とされる遺伝子機能をコードするアデノウイルス核酸配列を、細胞ゲノム中に組み込んで含むことが望ましい。好ましい細胞株は、弱毒生アデノウイルスに存在しない、少なくとも１つ、好ましくは全ての、複製に必須な遺伝子機能を補完する。補完細胞株は、（例えば、アデノウイルスアンプリコンの増殖を可能にするための）全てのアデノウイルス機能を含む、初期領域、後期領域、ウイルスパッケージング領域、ウイルスに関連するＲＮＡ領域、またはこれらの組み合わせによってコードされる少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能における欠損を補完できる。最も好ましくは、補完細胞株は、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能（例えば、２以上の複製に必須な遺伝子機能）における欠損を、特には、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ領域の各々について複製に必須な遺伝子機能における欠損を、補完する。加えて、補完細胞株は、アデノウイルスゲノムのＥ２（特に、アデノウイルスＤＮＡポリメラーゼおよび末端タンパク質に関して）および／またはＥ４領域の少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能における欠損を補完できる。望ましくは、Ｅ４領域における欠損を補完する細胞は、Ｅ４−ＯＲＦ６遺伝子配列を含み、Ｅ４−ＯＲＦ６タンパク質を産生する。このような細胞は、少なくともＯＲＦ６を含み、かつアデノウイルスゲノムのＥ４領域の他のＯＲＦは含まないことが望ましい。該細胞株は、弱毒生血清１４型アデノウイルスとオーバーラップしない様式で補完遺伝子を含み、それにより、アデノウイルスゲノムが細胞のＤＮＡと組換えを起こす可能性を最小化し、そして実質的には排除するというさらなる特徴を有することが好ましい。したがって、弱毒生血清１４型アデノウイルスストックにおいて、複製可能なアデノウイルス（ＲＣＡ）の存在が、回避まではされなくとも最小にされ、それゆえ、特定の治療目的、特にワクチン接種の目的のために好適となる。弱毒生血清１４型アデノウイルスストックにおいてＲＣＡがないことで、非補完細胞における血清１４型アデノウイルスの複製が回避される。このような補完細胞株の構築は、Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994)に記載されたものなど、標準的な分子生物学技術および細胞培養技術を伴う。
【００２４】
弱毒生血清１４型アデノウイルスを産生するための補完細胞株としては、２９３細胞（例えば、Graham et al., J. Gen. Virol, 36, 59-72 (1977)に記載されている）、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（例えば、国際特許出願公開ＷＯ ９７／００３２６、ならびに米国特許第５，９９４，１２８号および第６，０３３，９０８号）、ならびに２９３−ＯＲＦ６細胞（例えば、国際特許出願公開ＷＯ ９５／３４６７１、米国特許第７，１９５，８９６号およびBrough et al., J. Virol., 71: 9206-9213 (1997)）が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる補完細胞は、例えば、米国特許第６，６７７，１５６号および第６，６８２，９２９号ならびに国際特許出願公開ＷＯ ０３／２０８７９に記載されている。場合によっては、細胞ゲノムは、その遺伝子産物が弱毒生血清１４型アデノウイルスの全ての欠損を補完するような核酸配列を含む必要はない。弱毒生血清１４型アデノウイルスにおいて欠失している１以上の複製に必須な遺伝子機能は、ヘルパーウイルスによって供給され得、該ヘルパーウイルスとしては、例えば、所望の弱毒生血清１４型アデノウイルスの複製のために必要とされる１以上の必須遺伝子機能をトランスに供給する弱毒生血清１４型アデノウイルスである。ヘルパーウイルスはしばしば、感染性のヘルパーウイルスのパッケージングを妨げるように操作される。例えば、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の１以上の複製に必須な遺伝子機能は補完細胞によって提供され、一方、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の１以上の複製に必須な遺伝子機能はヘルパーウイルスによって提供される。
【００２５】
複製に必須な遺伝子機能をコードするアデノウイルス配列の改変（例えば、欠失、突然変異または置換）に加えて、アデノウイルスゲノムは、改変がさもなければ複製に必須な遺伝子機能を含むアデノウイルスゲノムの領域においてであるとしても良性または非致死性である改変（すなわち、アデノウイルスを複製欠損型にしないような改変、あるいは、望ましくは、ウイルス機能および／またはウイルスタンパク質の産生に悪影響を与えないような改変）を含み得る。そのような改変は、通常、ＤＮＡ操作により生じ、あるいは、弱毒生血清１４型アデノウイルスの構築を促進するように機能する。例えば、アデノウイルスゲノムにおける制限酵素部位の除去または導入は有利であり得る。そのような良性の突然変異は、しばしば、ウイルス機能に対する検出可能な悪影響を何ら有さない。
【００２６】
同様に、弱毒生血清１４型アデノウイルスのコートタンパク質は、潜在的な宿主細胞上の受容体に対してアデノウイルスの結合特異性または認識を変更させるように、操作され得る。アデノウイルスについて、そのような操作としては、アデノウイルスコートタンパク質（例えば、ファイバー、ペントンまたはヘキソン）領域の欠失、コートタンパク質の部分への様々なネイティブまたは非ネイティブのリガンドの挿入などを挙げることができる。コートタンパク質を操作することで、弱毒生血清１４型アデノウイルスによって感染される細胞の範囲を広げること、または、特定の細胞型への弱毒生血清１４型アデノウイルスの標的化を可能とすることができる。
【００２７】
宿主細胞への生来的な結合（細胞受容体へのファイバータンパク質の生来的な結合など）を変更させるための任意の好適な技術を用いることができる。例えば、細胞への生来的な結合を除去するために、異なるファイバー長を利用することができる。これは、任意には、ペントンベースまたはファイバーノブへの結合配列の付加を介して達成することができる。この結合配列の付加は、二重特異的または多重特異的な結合配列を介して、直接的または間接的のいずれかで為され得る。代替的な実施形態では、アデノウイルスファイバータンパク質を改変してファイバーシャフト内のアミノ酸の個数を減少させ、それによって「短シャフト型」ファイバー（例えば、米国特許第５，９６２，３１１号に記載されている）を作製してもよい。短シャフト型アデノウイルスファイバー遺伝子を含むアデノウイルスを使用することで、細胞表面受容体へのアデノウイルスファイバーの結合のレベルまたは効率が低減され、細胞表面受容体へのアデノウイルスペントンベースの結合が上昇するため、所与の細胞へのアデノウイルスの結合特異性が上昇する。あるいは、短シャフト型ファイバーを含む弱毒生血清１４型アデノウイルスを使用することで、ペントンベースまたはファイバーノブのいずれかへの非ネイティブなアミノ酸配列の導入による、所望の細胞表面受容体へのアデノウイルスの標的化が可能となる。
【００２８】
さらに別の実施形態では、生来的な基質の結合に関連するアミノ酸残基をコードする核酸残基を変更、追加または欠失して（例えば、国際特許出願公開ＷＯ ００／１５８２３、Einfeld et al., J Virol., 75(23): 11284-11291 (2001)、およびvan Beusechem et al., J. Virol., 76(6): 2753-2762 (2002)を参照）、当該突然変異された核酸残基を組み込んだ（またはそれによってコードされるファイバータンパク質を有する）弱毒生血清１４型アデノウイルスがその生来的な基質に結合する能力が少なくなるようにすることができる。これに関して、Ａｄ１４に対する生来的な細胞受容体は、まだ明確には決定されていない。最近の研究では、Ａｄ１４に対する生来的な細胞受容体はＣＤ４６細胞表面タンパク質であることが示唆されている（例えば、Sakurai et al., Current Gene Therapy, 7(4): 229-238 (2007)、およびMarttila et al., J. Virol., 79: 14429-14436 (2005）を参照）。さらには、Ａｄ１４は、ＣＤ４６に加えて、未だ同定されていない別の受容体に結合し得るという証拠がある（Tuve et al., J. Virol., 80: 12109-12120 (2006)を参照）。いずれにおいても、弱毒生血清１４型アデノウイルスの生来的な細胞結合部位（アデノウイルスファイバータンパク質のノブドメイン、およびアデノウイルスペントンベースに位置するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列など）はそれぞれ、除去または破壊され得る。
【００２９】
ノブと生来的な細胞受容体との間の相互作用を仲介または補助するファイバータンパク質の任意の好適なアミノ酸残基（単数または複数）は、ファイバータンパク質が三量体化できる限りにおいて、突然変異または除去され得る。同様に、ファイバータンパク質が三量体化する能力を保持する限りにおいて、ファイバーノブに対してアミノ酸が付加され得る。好適な残基としては、ファイバーノブドメインの露出されたループ（例えば、ＡＢループ、ＤＥループ、ＦＧループおよびＨＩループなど）内のアミノ酸が挙げられる。
【００３０】
ペントンベースとインテグリンとの間の相互作用を仲介または補助するペントンベースタンパク質の任意の好適なアミノ酸残基（単数または複数）は、突然変異または除去され得る。好適な残基としては、例えば、Ａｄ１４ペントンベースタンパク質の超可変領域内に位置するＲＧＤアミノ酸配列モチーフが挙げられる。ペントンベースタンパク質における生来的なインテグリン結合部位もまた、アデノウイルスペントンベースタンパク質をコードする核酸配列内またはそれに隣接するようにＤＮＡ配列を挿入することなどによって、ネイティブなＲＧＤモチーフをコードする核酸配列を改変することにより破壊して、当該ネイティブなＲＧＤアミノ酸配列がインテグリン受容体への結合のためにコンフォメーション的にアクセスできないようにすることができる。
【００３１】
弱毒生血清１４型アデノウイルスは、それら各々の生来的な細胞結合部位に結合しないようなファイバータンパク質およびペントンベースタンパク質を含み得る。代替的には、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、それら各々の生来的な細胞結合部位に結合するが、対応する野生型コートタンパク質よりも親和性が低いような、ファイバータンパク質およびペントンベースタンパク質を含む。改変されたアデノウイルスファイバータンパク質およびペントンベースタンパク質が、同じ血清型の未改変のアデノウイルスファイバータンパク質およびペントンベースタンパク質よりも、少なくとも約５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍または１００倍低い親和性で、それら各々の生来的な細胞結合部位に結合する場合には、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、生来的な細胞結合部位への結合の減少を示す。
【００３２】
弱毒生血清１４型アデノウイルスはまた、生来的な細胞受容体以外の細胞受容体などの基質（すなわち、リガンド）に結合する非ネイティブなアミノ酸配列を含むキメラコートタンパク質を含み得る。キメラなアデノウイルスコートタンパク質の非ネイティブなアミノ酸配列により、キメラコートタンパク質を含む弱毒生血清１４型アデノウイルスが、当該非ネイティブなアミノ酸配列を有さない対応するアデノウイルスによっては天然には感染されない宿主細胞（すなわち、対応する野生型アデノウイルスによっては感染されない宿主細胞）に結合し、かつ望ましくは感染すること、当該非ネイティブなアミノ酸配列を有さない対応するアデノウイルスよりも高い親和性で、対応する野生型アデノウイルスによって天然に感染される宿主細胞に結合すること、または、標的化されていない細胞よりも高い親和性で特定の標的細胞に結合することが可能となる。「非ネイティブな」アミノ酸配列には、アデノウイルスコートタンパク質には天然には存在しないアミノ酸配列、または、アデノウイルスコートに見出されるが、キャプシド内の非生来的な場所に位置しているアミノ酸配列が包含され得る。「優先的に結合する」とは、非ネイティブなアミノ酸配列が、例えばαｖβ３インテグリンなどの受容体に対して、非ネイティブなリガンドが例えばαｖβ１インテグリンなどの異なる受容体に対して結合するよりも、少なくとも約３倍よりも高い親和性（例えば、少なくとも約５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３５倍、４５倍または５０倍よりも高い親和性）で結合することを意味する。
【００３３】
弱毒生血清１４型アデノウイルスは、野生型アデノウイルスコートタンパク質よりも効率的に免疫細胞に結合する能力をキメラコートタンパク質に付与するような非ネイティブなアミノ酸配列を含むキメラコートタンパク質を含み得る。特に、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、免疫細胞、好ましくは抗原提示細胞（樹状細胞、単球およびマクロファージなど）による弱毒生血清１４型アデノウイルスの取り込みを促進させる非ネイティブなアミノ酸配列を含むキメラなアデノウイルスファイバータンパク質を含み得る。好ましい実施形態では、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、樹状細胞への弱毒生血清１４型アデノウイルスの導入効率を増加させるＲＧＤモチーフ（ＣＲＧＤＣ（配列番号：１）、ＣＸＣＲＧＤＣＸＣ（配列番号：２）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸を表す）、およびＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号：３）が挙げられるが、これらに限定されない）を含むアミノ酸配列（例えば、非ネイティブなアミノ酸配列）を含むキメラファイバータンパク質を含む。ＲＧＤモチーフまたは任意の非ネイティブなアミノ酸配列は、アデノウイルスのファイバーノブ領域、理想的にはアデノウイルスのノブの露出されたループ（ＨＩループなど）に挿入されることが好ましい。非ネイティブなアミノ酸配列はまた、アデノウイルスファイバータンパク質のＣ末端に、任意にはスペーサー配列を介して、付加され得る。スペーサー配列は、１００から２００のアミノ酸を含むことが好ましく、意図された機能を有し得る（しかし、それが必要なわけではない）。
【００３４】
非ネイティブなアミノ酸配列は、任意には、接着タンパク質、ケモカイン受容体、補体受容体、共刺激タンパク質、サイトカイン受容体、高レベルの抗原提示分子、ホーミングタンパク質、マーカータンパク質、抗原取り込みのための受容体、シグナル伝達タンパク質、ウイルス受容体などの、樹状細胞の表面に典型的に見出されるタンパク質を認識し得る。樹状細胞におけるそのような潜在的なリガンド結合部位の例としては、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、２Ａ１、７回膜貫通型（７ＴＭ）受容体、ＣＤ１、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２１、ＣＤ２４、ＣＤ３２、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４バリアント、ＣＤ４６、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５０、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ６４、ＡＳＧＰＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、Ｅカドヘリン、インテグリン、Ｍ３４２、ＭＨＣ−Ｉ、ＭＨＣ−ＩＩ、ＭＩＤＣ−８、ＭＭＲ、ＯＸ６２、ｐ２００−ＭＲ６、ｐ５５、Ｓ１００、ＴＮＦ−Ｒなどが挙げられる。樹状細胞が標的化される場合、非ネイティブなアミノ酸配列は、例えば、ＣＤ−４０（二重）特異的な抗体断片またはＣＤ４０Ｌポリペプチド由来のドメインなどによって、ＣＤ４０細胞表面タンパク質を認識することが好ましい。
【００３５】
非ネイティブなアミノ酸配列は、任意には、ホスファチジルセリン受容体、ビトロネクチン受容体、インテグリン、接着受容体、シグナル伝達および／または炎症に関与する受容体、マーカー、サイトカイン誘導のための受容体、病原体の攻撃によって上方制御される受容体、Ｂ型スカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）スーパーファミリーのメンバー、シアル酸結合受容体、Ｆｃ受容体ファミリーのメンバー、Ｂ７−１およびＢ７−２表面分子、リンパ球受容体、白血球受容体、抗原提示分子などのマクロファージ細胞の表面に典型的に見出されるタンパク質を認識し得る。好適なマクロファージ表面の標的タンパク質の例としては、以下に限定されないが、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１６、ＣＤ１６３、ＣＤ１ａ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２９、Ｃｄ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ７１、ＣＤ８７、ＣＤ９、ＣＤ９８、Ｉｇ受容体、Ｆｃ受容体タンパク質（例えば、Ｆｃα、Ｆｃγ、Ｆｃεのサブタイプなど）、葉酸受容体ｂ、ＨＬＡクラスＩ、シアロアドヘシン、シグレック５およびトル様受容体２（ＴＬＲ２）が挙げられる。
【００３６】
非ネイティブなアミノ酸配列は、インテグリンおよび他の接着分子、補体受容体、インターロイキン受容体、食細胞受容体、免疫グロブリン受容体、活性化マーカー、トランスフェリン受容体、スカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）スーパーファミリーのメンバー、成長因子受容体、セレクチン、ＭＨＣ分子、ＴＮＦ受容体およびＴＮＦ−Ｒ関連因子などのＢ細胞の表面に典型的に見出されるタンパク質を認識し得る。典型的なＢ細胞表面タンパク質の例としては、βグリカン、Ｂ細胞抗原受容体（ＢＡＣ）、Ｂ７−２、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、Ｃ３ｄ受容体、ＣＤ１、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３５、ＣＤ４０、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ６９、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ二量体、ＣＤ９５、エンドグリン、Ｆａｓ抗原、ヒトＩｇ受容体、Ｆｃ受容体タンパク質（例えば、Ｆｃａ、Ｆｃｇ、Ｆｃεのサブタイプなど）、ＩｇＭ、ｇｐ２００−ＭＲ６、成長ホルモン受容体（ＧＨ−Ｒ）、ＩＣＡＭ−１、ＩＬＴ２、ＣＤ８５、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子、トランスフォーミング成長因子受容体（ＴＧＦ−Ｒ）、α４β７インテグリンおよびαｖβ３インテグリンが挙げられる。
【００３７】
別の実施形態では、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、特定の真核細胞型に対して選択的でないキメラのウイルスコートタンパク質を含み得る。キメラコートタンパク質は、内部コートタンパク質配列内へのもしくはその代替としての非ネイティブなアミノ酸配列の挿入、または、コートタンパク質のＮ末端もしくはＣ末端への非ネイティブなアミノ酸配列の付加によって、野生型コートタンパク質とは異なる。例えば、約５から約９個のリジン残基（好ましくは７個のリジン残基）を含むリガンドが、アデノウイルスファイバータンパク質のＣ末端に、非機能的なスペーサー配列を介して連結される。この実施形態では、キメラのウイルスコートタンパク質は、米国特許第６，４６５，２５３号および国際特許出願公開ＷＯ ９７／２００５１に記載されているものなど、野生型ウイルスコートよりも広範な真核細胞に効率的に結合する。
【００３８】
弱毒生血清１４型アデノウイルスが潜在的な宿主細胞を認識する能力は、コートタンパク質の遺伝子操作をせずに、すなわち二重特異的な分子の使用を通じて、改変され得る。例えば、アデノウイルスを、ペントンベース結合ドメインおよび特定の細胞表面結合部位に選択的に結合するドメインを含む二重特異的な分子と複合体化させることにより、特定の細胞型への弱毒生血清１４型アデノウイルスの標的化が可能となる。同様に、非遺伝的な手段を通じて、アデノウイルス粒子の表面に抗原をコンジュゲート化することができる。
【００３９】
非ネイティブなアミノ酸配列を任意のアデノウイルスコートタンパク質のいずれかにコンジュゲート化して、キメラのアデノウイルスコートタンパク質を形成することができる。それゆえ、例えば、非ネイティブなアミノ酸配列は、ファイバータンパク質、ペントンベースタンパク質、ヘキソンタンパク質、タンパク質ＩＸ、ＶＩまたはＩＩＩａなどに、コンジュゲート化、挿入または連結され得る。このようなタンパク質を用いるための方法は、当該分野において周知である（例えば、米国特許第５，５４３，３２８号；第５，５５９，０９９号；第５，７１２，１３６号；第５，７３１，１９０号；第５，７５６，０８６号；第５，７７０，４４２号；第５，８４６，７８２号；第５，９６２，３１１号；第５，９６５，５４１号；第５，８４６，７８２号；第６，０５７，１５５号；第６，１２７，５２５号；第６，１５３，４３５号；第６，３２９，１９０号；第６，４５５，３１４号；第６，４６５，２５３号；第６，５７６，４５６号；第６，６４９，４０７号；第６，７４０，５２５号、第６，９５１，７５５号、および国際特許出願公開ＷＯ ９６／０７７３４、ＷＯ ９６／２６２８１、ＷＯ ９７／２００５１、ＷＯ ９８／０７８７７、ＷＯ ９８／０７８６５、ＷＯ ９８／４０５０９、ＷＯ ９８／５４３４６、ＷＯ ００／１５８２３、ＷＯ ０１／５８９４０およびＷＯ ０１／９２５４９を参照）。キメラのアデノウイルスコートタンパク質は、当該分野で公知の標準的なＤＮＡ組換え技術を使用して作製することができる。好ましくは、キメラのアデノウイルスコートタンパク質をコードする核酸配列は、アデノウイルスゲノム内に位置し、野生型アデノウイルスにおいてコートタンパク質の発現を調節するプロモーターに作動可能に連結される。代替的には、キメラのアデノウイルスコートタンパク質をコードする核酸配列は、アデノウイルスゲノム内に位置し、キメラコートタンパク質の効率的な発現のために必要とされる遺伝的エレメントを含む発現カセットの一部となる。
【００４０】
キメラのアデノウイルスコートタンパク質のコートタンパク質部分は、非ネイティブなアミノ酸配列が付加される全長のアデノウイルスコートタンパク質であり得るか、あるいは、例えば内部またはＣ末端および／もしくはＮ末端において切断されたものであり得る。どのように改変（非ネイティブなアミノ酸の存在を含む）されるにせよ、キメラコートタンパク質は、アデノウイルスのキャプシドに組み込めることが好ましい。非ネイティブなアミノ酸配列がファイバータンパク質に連結される場合、ウイルスタンパク質間またはファイバー単量体間の相互作用を妨げないことが好ましい。したがって、非ネイティブなアミノ酸配列は、それ自体オリゴマー化ドメインでないことが好ましく、それは、そのようなものはアデノウイルスファイバーの三量体化ドメインと好ましくない相互作用をし得るためである。好ましくは、非ネイティブなアミノ酸配列はビリオンタンパク質に付加され、かつ、基質、細胞表面受容体または免疫細胞に容易に露出され（例えば、アデノウイルスタンパク質のＮまたはＣ末端において、基質に面する残基に連結する、ペプチドスペーサー上に位置させる、など）、非ネイティブなアミノ酸配列を最大に露出させるような様式で組み込まれる。理想的には、非ネイティブなアミノ酸配列は、ファイバータンパク質のＣ末端においてアデノウイルスファイバータンパク質に組み込まれる（かつ、スペーサーを介して連結される）か、あるいは、ファイバーの露出されたループ（例えば、ＨＩループ）に組み込まれて、キメラコートタンパク質を生成する。非ネイティブなアミノ酸配列がペントンベースの一部に連結されるかまたはそれを置換する場合、基質、細胞表面受容体または免疫細胞との接触を確実にするために、超可変領域内であることが好ましい。非ネイティブなアミノ酸配列がヘキソンに連結される場合、超可変領域内であることが好ましい（Crawford-Miksza et al., J. Virol., 70(3): 1836-44 (1996)）。非ネイティブなアミノ酸がｐＩＸの一部に連結されるかまたはそれを置換する場合、ｐＩＸのＣ末端内であることが好ましい。スペーサー配列を使用して、アデノウイルス粒子の表面から遠ざかるように非ネイティブなアミノ酸配列を伸ばすことは、非ネイティブなアミノ酸配列が受容体への結合のためにより利用可能となる点、および、非ネイティブなアミノ酸配列とアデノウイルスファイバー単量体との間のいかなる立体相互作用も低減され得る点で有利であり得る。
【００４１】
非ネイティブなアミノ酸配列の細胞受容体への結合親和性は、任意の好適なアッセイによって決定でき、様々なアッセイが公知であって、アデノウイルスコートタンパク質中に組み込むための非ネイティブなアミノ酸配列の選択に有用である。望ましくは、宿主細胞の形質導入レベルが、相対的な結合効率の決定に利用される。すなわち、例えば、細胞表面上にαｖβ３インテグリンを提示している宿主細胞（例えば、ＭＤＡＭＢ４３５細胞）が、キメラコートタンパク質を有する弱毒生血清１４型アデノウイルスおよび非ネイティブなアミノ酸配列を有さない対応するアデノウイルスに曝露され得、次いで、相対的な結合親和性を決定するために、形質導入効率が比較され得る。同様に、細胞表面上にαｖβ３インテグリンを提示している宿主細胞（例えば、ＭＤＡＭＢ４３５細胞）および細胞表面上に主にαｖβ１を提示している宿主細胞（例えば、２９３細胞）の両方が、キメラコートタンパク質を有する弱毒生血清１４型アデノウイルスに曝露され得、次いで、結合親和性を決定するために、形質導入効率が比較され得る。
【００４２】
（例えば、特定の改変細胞型内での精製または増殖を促進するための）他の実施形態では、非ネイティブなアミノ酸（例えば、リガンド）は、細胞表面タンパク質以外の化合物に結合し得る。すなわち、リガンドは、血液および／またはリンパ液媒介性タンパク質（例えば、アルブミン）、ポリアミノ酸などの合成ペプチド配列（例えば、ポリリジン、ポリヒスチジンなど）、人工的なペプチド配列（例えば、ＦＬＡＧ）、およびＲＧＤペプチド断片（Pasqualini et al, J. Cell. Biol., 130: 1189 (1995)）に結合し得る。リガンドは、プラスチック（例えば、Adey et al., Gene, 156: 27 (1995)）、ビオチン（Saggio et al., Biochem. J., 293: 613 (1993)）、ＤＮＡ配列（Cheng et al., Gene, 171: 1 (1996)およびKrook et al., Biochem. Biophys., Res. Commun., 204: 849 (1994)）、ストレプトアビジン（Geibel et al., Biochemistry, 34: 15430 (1995)およびKatz, Biochemistry, 34: 15421 (1995)）、ニトロストレプトアビジン（Balass et al., Anal. Biochem., 243: 264 (1996)）、ヘパリン（Wickham et al., Nature Biotechnol., 14: 1570-73 (1996)）およびその他の基質など、非ペプチド性基質にさえも結合し得る。
【００４３】
アデノウイルスの改変については、米国特許第５，５４３，３２８号；第５，５５９，０９９号；第５，７１２，１３６号；第５，７３１，１９０号；第５，７５６，０８６号；第５，７７０，４４２号；第５，８４６，７８２号；第５，８７１，７２７号；第５，８８５，８０８号；第５，９２２，３１５号；第５，９６２，３１１号；第５，９６５，５４１号；第６，０５７，１５５号；第６，１２７，５２５号；第６，１５３，４３５号；第６，３２９，１９０号；第６，４５５，３１４号；第６，４６５，２５３号；第６，５７６，４５６号；第６，６４９，４０７号；第６，７４０，５２５号，第６，９５１，７５５号および第７，１９５，８９６号；米国特許出願公報２００３／００９９６１９ Ａ１、ならびに国際特許出願ＷＯ ９６／０７７３４、ＷＯ ９６／２６２８１、ＷＯ ９７／２００５１、ＷＯ ９８／０７８６５、ＷＯ ９８／０７８７７、ＷＯ ９８／４０５０９、ＷＯ ９８／５４３４６、ＷＯ ００／１５８２３、ＷＯ ０１／５８９４０およびＷＯ ０１／９２５４９に記載されている。
【００４４】
典型的には、アデノウイルスゲノムの全体または部分を除去することにより、生じる弱毒生血清１４型アデノウイルスは、アデノウイルスキャプシド内にパッケージングされる能力を保持しつつ、異種核酸配列の挿入を受け入れることが可能である。しかしながら、好ましい実施形態では、弱毒生血清１４型アデノウイルスは異種核酸配列を含まない。すなわち、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、好ましくは、アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ２Ａおよび／またはＥ４領域、ならびに任意にはＥ３領域の全体または部分の欠失を有するが、アデノウイルスゲノムの欠失された領域のいずれかに挿入された異種核酸配列は含まない。
【００４５】
しかしながら、他の実施形態では、アデノウイルスから欠失された１以上の領域への１以上の異種核酸配列の挿入が適切であり得る。これに関して、異種核酸配列は、アデノウイルスゲノムのＥ１領域、Ｅ２Ａ領域および／またはＥ４領域、ならびに任意にはＥ３領域に位置し得る。実際、その位置が異種核酸配列の発現を妨げないかまたは弱毒生血清１４型アデノウイルスのパッケージングを阻害しない限り、異種核酸配列は、アデノウイルスゲノムの任意の場所に挿入され得る。アデノウイルス中に挿入され得るあらゆる種類の核酸配列（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡ）が、本発明に関連して使用され得る。好ましくは、異種核酸配列はＤＮＡであり、そして好ましくはタンパク質をコードする（すなわち、１以上のタンパク質をコードする１以上の核酸配列である）。
【００４６】
異種核酸配列は、抗原をコードし得る。「抗原」は、哺乳動物において免疫応答を誘導する分子である。「免疫応答」は例えば、抗体産生および／または免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化を引き起こし得る。本発明の文脈における抗原は、任意のタンパク性分子の任意のサブユニット、断片またはエピトープを含み得、これらとしては、理想的には哺乳動物における免疫応答を誘発し、好ましくは防御免疫を導くような、ウイルス、細菌、寄生虫、真菌、原生動物、プリオン、細胞または細胞外由来のタンパク質またはペプチドが挙げられる。「エピトープ」は、抗体または抗原受容体によって認識される抗原上の配列を意味する。エピトープはまた、当該分野において、「抗原決定基」とも呼ばれている。
【００４７】
異種核酸配列は、弱毒生血清１４型アデノウイルスによって誘発される免疫応答を増強または改変させる免疫系刺激因子をコードし得る。免疫系刺激因子の例としては、サイトカイン、リポ多糖、二本鎖ＲＮＡ、トル様受容体（ＴＬＲ）および補体タンパク質（例えば、ＣＤ４６）が挙げられる。好ましくは、異種核酸配列はサイトカインをコードする。「サイトカイン」は、特定の細胞（例えば、炎症性白血球およびある種の非白血球細胞）によって分泌され、免疫、炎症および造血の制御などにより、細胞間メディエーターとして働く非抗体タンパク質として当該分野において知られている。サイトカインは、一般には、内分泌よりむしろ傍分泌または自己分泌の様式で局所的に作用する。サイトカインは、リンホカイン（リンパ球により作られるサイトカイン）、モノカイン（単球により作られるサイトカイン）、ケモカイン（走化性活性を有するサイトカイン）およびインターロイキン（ある白血球により作られて他の白血球に作用するサイトカイン）に分類され得る。サイトカインは当該分野で公知の任意の好適なサイトカインであってよく、それらとしては、以下に限定されないが、インターフェロン（例えば、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮデルタ、ＩＦＮオメガ、ＩＦＮタウおよびＩＦＮガンマ）、インターロイキン、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファが挙げられる。
【００４８】
弱毒生血清１４型アデノウイルスが１以上の異種核酸配列を含む場合、各異種核酸配列は、例えばプロモーターを変更可能な発現カセットの部分として、１以上のプロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントに作動可能に連結される（すなわち、これらの転写制御下となる）ことが望ましい。配列を作動可能に連結するための技術は、当該分野で周知である。異種核酸配列の十分な発現が達成される限り、本発明の文脈では、任意のプロモーターまたはエンハンサー配列を使用できる。好ましくは、プロモーターは、弱毒生血清１４型アデノウイルスの天然に生じるプロモーターから得られておらず、それに由来せず、またはそれに基づいていないという点で、異種のプロモーターである。これに関して、プロモーターは、例えば、ウイルスプロモーターまたは細胞プロモーターであり得る。さらに、プロモーターは、構成的、誘導性（例えば、放射線、光、化学療法または薬物で誘導可能）または組織特異的であり得る。好適なプロモーターが当該分野で公知である（例えば、国際特許出願公開ＷＯ ２００７／０２７８６０を参照）。
【００４９】
本発明の方法では、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、好ましくは、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与され、血清１４型アデノウイルス粒子が免疫応答を誘導する。弱毒生血清１４型アデノウイルスは、血清１４型アデノウイルスによって感染され得る任意の哺乳動物に投与され得る。好ましくは、弱毒生血清１４型アデノウイルスはヒトに投与される。免疫応答は、液性免疫応答、細胞性免疫応答であり得、あるいは望ましくは、液性および細胞性免疫の組み合わせであり得る。理想的には、免疫応答は、血清１４型アデノウイルスでのその後の攻撃の際の防御を提供する。しかしながら、本発明の文脈では、防御免疫は必要ではない。本発明の方法はさらに、抗体産生および回収のために使用され得る。
【００５０】
弱毒生血清１４型アデノウイルスの投与は、哺乳動物において免疫応答を誘導するための複数ステップのレジメンの一つの構成要素であり得る。特に、本発明の方法は、プライムブースト免疫レジメンの１つの分流を示し得る。したがって、本発明の方法は、哺乳動物に対して、（ａ）弱毒生血清１４型アデノウイルスの投与に先立ってプライミング組成物を投与すること、および／または、（ｂ）弱毒生血清１４型アデノウイルスの投与後にブースティング組成物を投与することを含み得る。
【００５１】
プライミングおよびブースティング組成物は、本明細書に記載されるような任意の好適な抗原を含み得る（例えば、不活性化ウイルス、タンパク質、ペプチドまたはエピトープ配列）。好ましくは、プライミングおよびブースティング組成物は、遺伝子導入ベクターを含む。任意の遺伝子導入ベクターを、プライミング組成物またはブースティング遺伝子組成物において用いることができ、それらとしては、以下に限定されないが、プラスミド、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルスまたはアデノウイルスが挙げられる。理想的には、遺伝子導入ベクターは、プラスミド、アルファウイルスまたはアデノウイルスベクターである。プライミング組成物およびブースティング組成物は、本発明の弱毒生血清１４型アデノウイルスを含んでもよく、あるいは、弱毒生血清１４型アデノウイルスとは異なる遺伝子導入ベクターを含んでもよい。好ましくは、プライミング組成物およびブースティング組成物は各々、本発明の弱毒生血清１４型アデノウイルスを含む。換言すれば、本発明の方法は、弱毒生血清１４型アデノウイルスの複数回の投与を伴うことが望ましい。プライミング組成物および／またはブースティング組成物は、免疫を維持するために好適な任意の時間枠（例えば、弱毒生血清１４型アデノウイルスの投与の、少なくとも約１週間、２週間、４週間、８週間、１２週間、１６週間またはそれよりも前または後）で与えられ得る。加えて、プライミング組成物および／またはブースティング組成物は、特定の免疫レジメンの過程で複数回投与され得る。例えば、免疫レジメンは、プライミング組成物の２回以上（例えば、２回、３回、５回またはそれより多く）の投与、その後で弱毒生血清１４型アデノウイルスの単回投与、その後でブースティング組成物の２回以上（例えば、２回、３回、５回またはそれより多く）の投与を含み得る。当然、場合によっては、本発明の弱毒生血清１４型アデノウイルスの投与は、強力な防御的免疫応答を誘導するのに十分であり得る。これに関しては、プライミングおよび／またはブースティングのレジメンは必要ないかもしれない。
【００５２】
プライミング／ブースティングのレジメンの効果を最大化するために、プライミング組成物および／またはブースティング組成物は、抗原をコードする異種核酸配列を含む遺伝子導入ベクターを含み得る。代替的には、免疫応答は、抗原自体（例えば、抗原性タンパク質、不活性化された病原体など）の投与によって、プライミングまたはブースティングされ得る。例えば、免疫応答は、不活性化された（例えば、熱殺菌または化学的に不活性化された）弱毒化血清１４型アデノウイルス、あるいは不活性化された野生型血清１４型アデノウイルスの投与によって、プライミングおよび／またはブースティングされ得る。
【００５３】
弱毒生血清１４型アデノウイルスを哺乳動物に送達するために任意の投与経路を使用できる。実際、弱毒生血清１４型アデノウイルスを投与するために１つよりも多くの経路を使用できるが、特定の経路が、他の経路よりも迅速かつより効果的な反応を提供し得る。好ましくは、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、筋肉内注射を通じて投与される。１用量の弱毒生血清１４型アデノウイルスはまた、体腔内への適用または注入、皮膚を通じた吸収（例えば、経皮パッチを介して）、吸入、摂取、組織への局所的な適用、または、例えば静脈、腹膜もしくは動脈内投与を通じて非経口的に投与され得る。弱毒生血清１４型アデノウイルスはまた、粒子衝突（例えば、遺伝子銃）によってインビボに投与され得る。
【００５４】
哺乳動物に投与される弱毒生血清１４型アデノウイルスの用量は、標的組織の大きさ、任意の副作用の程度、特定の投与経路などを含む多くの要素に依存するであろう。用量は、理想的には、「有効量」の弱毒生血清１４型アデノウイルスを含み、すなわち、哺乳動物において所望の免疫応答を誘発する弱毒生血清１４型アデノウイルスの用量である。所望の免疫応答は、抗体の産生、その後の攻撃に対する防御、免疫寛容、免疫細胞活性化などを引き起こし得る。単回用量の弱毒生血清１４型アデノウイルスは、少なくとも約１×１０５粒子（粒子単位ともいう）の弱毒生血清１４型アデノウイルスを含むことが望ましい。用量は、好ましくは少なくとも約１×１０６粒子（例えば、約１×１０６〜１×１０１２粒子）、より好ましくは少なくとも約１×１０７粒子、より好ましくは少なくとも約１×１０８粒子（例えば、約１×１０８〜１×１０１１粒子）、最も好ましくは少なくとも約１×１０９粒子（例えば、約１×１０９〜１×１０１０粒子）の弱毒生血清１４型アデノウイルスである。望ましくは、用量は、約１×１０１４粒子以下、好ましくは約１×１０１３粒子以下、さらにより好ましくは約１×１０１２粒子以下、さらにより好ましくは約１×１０１１粒子以下、最も好ましくは約１×１０１０粒子以下（例えば、約１×１０９粒子以下）を含む。換言すれば、単回用量の弱毒生血清１４型アデノウイルスは、例えば、約１×１０６粒子単位（ｐｕ）、２×１０６ｐｕ、４×１０６ｐｕ、１×１０７ｐｕ、２×１０７ｐｕ、４×１０７ｐｕ、１×１０８ｐｕ、２×１０８ｐｕ、４×１０８ｐｕ、１×１０９ｐｕ、２×１０９ｐｕ、４×１０９ｐｕ、１×１０１０ｐｕ、２×１０１０ｐｕ、４×１０１０ｐｕ、１×１０１１ｐｕ、２×１０１１ｐｕ、４×１０１１ｐｕ、１×１０１２ｐｕ、２×１０１２ｐｕまたは４×１０１２ｐｕの弱毒生血清１４型アデノウイルスを含み得る。
【００５５】
望ましくは、弱毒生血清１４型アデノウイルスは、組成物中、好ましくは医薬的に許容される（例えば、生理学的に許容される）組成物中で投与され、該組成物は、担体、好ましくは医薬的に許容される（例えば、生理学的に許容される）担体および弱毒生血清１４型アデノウイルスを含む。任意の好適な担体を本発明の文脈では用いることができ、そのような担体は当該分野で周知である。担体の選択は、部分的には、組成物が投与される特定の部位および組成物を投与するために用いられる特定の方法によって決定されるであろう。理想的には、組成物は、複製能力を有するアデノウイルスを含まないことが好ましい。組成物は、任意には、無菌であるか、あるいは本発明の弱毒生血清１４型アデノウイルス以外は無菌であり得る。
【００５６】
組成物のために好適な剤形としては、水性および非水性の溶液、抗酸化剤、緩衝液および静菌剤を含有し得る等張無菌溶液、ならびに、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤および保存剤を含み得る水性および非水性の無菌懸濁液が挙げられる。該剤形は、単位用量または複数回用量で密封された容器（アンプルおよびバイアルなど）で提示され得、また、使用の直前に無菌性液体担体（例えば、水）の添加のみを必要とするフリーズドライの（凍結乾燥された）状態で保管され得る。即時性の溶液および懸濁液は、先に説明したような無菌性の粉末、顆粒および錠剤から調製できる。好ましくは、担体は、緩衝化された生理食塩水である。より好ましくは、本発明の方法で使用するための弱毒生血清１４型アデノウイルスは、投与前のダメージから弱毒生血清１４型アデノウイルスを保護するように製剤化された組成物で投与される。例えば、組成物は、ガラス製品、シリンジまたは注射針などの、アデノウイルスを調製、保管または投与するために使用される器具でのアデノウイルスの減小を低減するように製剤化され得る。組成物は、弱毒生血清１４型アデノウイルスの光感受性および／または温度感受性を減少させるように製剤化され得る。そのために、組成物は、例えば上述したようなものなどの医薬的に許容される液体担体、ならびに、ポリソルベート８０、Ｌ−アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロースおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される安定剤を含むことが好ましい。このような組成物の使用は、弱毒生血清１４型アデノウイルスの保存期間を延長させ、投与を促進させ、かつ本発明の方法の効率を向上させるであろう。アデノウイルス含有組成物の製剤化は、例えば、米国特許第６，２２５，２８９号、米国特許第６，５１４，９４３号および国際特許出願公開ＷＯ ００／３４４４４にさらに記載されている。
【００５７】
弱毒生血清１４型アデノウイルスは、経口投与のために製剤化できる。経口投与のために好適な製剤としては、（ａ）液体溶液（水、生理食塩水またはオレンジジュースなどの希釈剤に溶解した有効量の弱毒生血清１４型アデノウイルスなど）、（ｂ）カプセル剤、サシェ剤または錠剤（各々、固形物または顆粒として、所定量の弱毒生血清１４型アデノウイルスを含む）、（ｃ）適当な液体の懸濁液、および（ｄ）好適な乳液が挙げられる。錠剤形態は、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、ポテトスターチ、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、香味剤、および医薬的に適合性の賦形剤のうち、１つ以上を含み得る。ロゼンジ形態は、香味料（通常、ショ糖およびアカシアまたはトラガカント）中の弱毒生血清１４型アデノウイルス、ならびに、ゼラチンおよびグリセリンなどの不活性基剤中に弱毒生血清１４型アデノウイルスを含むか、または、弱毒生血清１４型アデノウイルスに加えて、当該分野で公知であるような賦形剤を含有する、ショ糖およびアカシア、乳化剤、ゲル剤などを含むトローチを含み得る。
【００５８】
弱毒生血清１４型アデノウイルスは、単独でまたは他の好適な構成成分と組み合わせて、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤とされ得る。これらのエアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧を許容する噴射剤中に入れることができる。これらは、ネブライザーまたはアトマイザー中など、加圧されない調合物用の医薬としても製剤化され得る。
【００５９】
弱毒生血清１４型アデノウイルスは、局所投与のために製剤化され得る。局所製剤としては、例えば、軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、ドロップ剤、坐剤、スプレー剤、液剤および粉末剤が挙げられる。従来の医薬担体、水剤、粉末剤、油性基材、増粘剤などが、必要であるかまたは望ましいこともあり得る。
【００６０】
弱毒生血清１４型アデノウイルスは、スポンジ、生体適合性の網、機械的リザーバーまたは機械的インプラントなどの、制御性または持続性の放出を可能とする器具内または器具上に投与され得る。インプラント（例えば、米国特許第５，４４３，５０５号を参照）および器具（例えば、米国特許第４，８６３，４５７号を参照）（埋め込み可能な器具（例えば、ポリマー組成物を含む機械的リザーバーまたはインプラントまたは器具）など）は、弱毒生血清１４型アデノウイルスの投与のために特に有用であり得る。弱毒生血清１４型アデノウイルスはまた、持続放出製剤の形態で投与され得（例えば、米国特許第５，３７８，４７５号を参照）、該製剤は、例えば、ゲルフォーム、ヒアルロン酸、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、ポリリン酸エステル（ビス−２−ヒドロキシエチル−テレフタレート（ＢＨＥＴ）など）および／またはポリ乳酸−グリコール酸を含む。
【００６１】
組成物はまた、形質導入効率を増強させるためにも製剤化できる。さらに、当業者は、弱毒生血清１４型アデノウイルスが、他の治療的または生物学的に活性の物質と共に組成物中に存在し得ることを理解するだろう。例えば、弱毒生血清１４型アデノウイルスのインビボ投与に関連する腫張および炎症を低減するために、イブプロフェンまたはステロイドなどの炎症を制御する因子を組成物の部分とすることができる。さらに、免疫系刺激因子またはアジュバント（例えば、インターロイキン、リポ多糖および二本鎖ＲＮＡ）を投与して、弱毒生血清１４型アデノウイルスに対する任意の免疫応答を増強または改変できる。抗生物質（すなわち、殺菌剤および殺真菌剤）が、既存の感染を治療するためおよび／または将来的な感染の危険性を低減するために存在し得る。
【００６２】
以下の実施例により本発明をさらに説明するが、当然ながら、それらが本発明の範囲を何らかの点で限定しているものとは解釈してはならない。
【実施例】
【００６３】
実施例１
本実施例は、弱毒生血清１４型アデノウイルスの構築および特徴付けを示す。
【００６４】
弱毒生血清１４型アデノウイルスのコンストラクトは、アデノウイルスベクターアセンブリ用の細菌の組換え系を使用して全ゲノムプラスミドから作製される（Campos et al., Hum. Gene Ther., 15(11): 1125-1130 (2004)）。簡潔に述べれば、該系は、Ｅ．ｃｏｌｉ内での一対のプラスミド（すなわち、シャトルプラスミドおよびベースプラスミド）間の相同組換えを利用する。シャトルプラスミドは、Ｅ１領域の近くのアデノウイルス配列によって隣接されるＥ１領域の欠失を含む。ベースプラスミドは、欠失を所望する位置において、選択マーカーと共に完全なアデノウイルスベクターゲノムを含む。組換えは、シャトルプラスミドおよびベースプラスミドの相同配列間で生じる。所望の組換えプラスミドは、Ｅ１欠失を含むアデノウイルスゲノムからなる。
【００６５】
組換え能力を有する（Ｒｅｃ＋）Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＪＤＥ３を、制限酵素消化により線状化したシャトルおよびベースプラスミドの混合物で形質転換し、選択培地にプレーティングする。次いで、所望の組換えクローンを、標準的なプラスミドＤＮＡ抽出、制限酵素解析および配列決定により同定する。得られたプラスミド（ｐＡｄ１４ｎｒと呼ぶ）をＰｍｅＩで消化してプラスミド骨格から組換えＡｄ１４ｎｒゲノム（ｒＡｄ１４ｎｒ）を切り出し、２９３−ＯＲＦ６細胞をトランスフェクションする。プラスミドのトランスフェクション後、得られたアデノウイルスを連続継代および塩化セシウム勾配での精製により増幅する。
【００６６】
精製したアデノウイルスを、いくつかのアッセイを使用して特徴付ける。具体的には、感染性粒子および全粒子の力価を決定し、ｒＡｄ１４ｎｒの遺伝的安定性／完全性をＰＣＲ解析およびＤＮＡ配列決定によって確認し、各ストックを、複製能力を有するアデノウイルス（ＲＣＡ）の存在について試験する。
【００６７】
Ａｄ１４ｎｒの収率を、１０リットル培養までの３回の連続増幅で評価する。Ａｄ１４ｎｒの収率は、1リットル当たり少なくとも１×１０１３粒子単位（ｐｕ）であると予測される。ウイルスストックが最終的には商用規模のバイオリアクターにまで増幅できることを保証するために、Ａｄ１４ｎｒの１０回の連続継代の間に、遺伝的構造の完全性（Genetic Structural Integrity）（ＧＳＩ）について試験する。欠失したＥ１領域に隣接するプライマーオリゴヌクレオチドを用い、ＰＣＲを使用してＡｄ１４ｎｒのＥ１領域で生じる任意の変化について調べる。Ａｄ１４ｎｒの安定性を、日常的な保存温度で試験する。Ａｄ５ベースのベクターの安定性が、−２０℃で５年にわたって、および４℃で６ヶ月にわたって示された。同様の安定性が、Ａｄ３５ベクターについて観察された。Ａｄ１４ｎｒストックの安定性を、−２０℃、４℃および２５℃で少なくとも３ヶ月間試験する。試験された時点は、１日目、７日目および１４日目ならびに４週目、８週目および１２週目である。安定性試験は、プラーク形成アッセイおよび粒子測定を使用して行う。
【００６８】
本実施例は、弱毒生血清１４型アデノウイルスの製造および特徴付けの方法を示している。
【００６９】
実施例２
本実施例は、哺乳動物における弱毒生血清１４型アデノウイルスに対する免疫応答を測定するための方法を示す。
【００７０】
Ａｄ１４ｎｒの免疫原性をマウスモデルおよび霊長類モデルにおいて試験する。具体的には、Ａｄ１４ｎｒを実施例１に記載されるように調製し、精製する。１０匹のＢａｌｂ／ｃマウスを３つの投与量群（すなわち、１×１０８ｐｕ、１×１０９ｐｕおよび１×１０１０ｐｕ）の各々に割り当てる。ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１４０Ｂの断片の発現カセットを含むＥ１欠失型の血清１４型アデノウイルス（Ａｄ１４ｇｐ１４０Ｂ）をポジティブコントロールとし、Ｅ１欠失型のＡｄ５ベクターをネガティブコントロールとする。０日目にマウスに適当なアデノウイルスを注入し、中和抗体価について特定の時点（すなわち、０日目、１日目、３日目、７日目、１４日目および２１日目）でアッセイする。
【００７１】
霊長類の免疫原性試験は、Ａｄ５ベースのワクチンについてヒトにおいて免疫原性であってかつ耐用性良好であることが知られている用量で、霊長類において免疫応答が強力であることを確認することにフォーカスする。これに関して、２匹のカニクイザルを、２つの投与量群（１×１０１０ｐｕおよび１×１０１１ｐｕ）の各々に割り当てる。０日目にサルにＡｄ１４ｎｒを注入し、中和抗体価について特定の時点（すなわち、０日目、１日目、３日目、７日目、１４日目および２１日目）でアッセイする。
【００７２】
感染された軍隊入隊者における抗体の存在を評価するために使用される中和抗体価アッセイ（Morb. Mortal. Wkly. Rep., 56(45): 1181-1184 (2007)）を上述の免疫原性実験に使用する。定量的血清比色マイクロ中和化（ＳＮ）試験も使用する。これは元々、経口生ワクチンの評価のために、アデノウイルス４型および７型のために開発および検証されたものである（Lyons et al., Vaccine, 26(23): 2890-2898 (2008))。試験前に、各血清標本を５６±２℃で３０±２分間不活性化させる。必要な範囲をカバーするために２倍希釈を用いて、６ウェル／希釈の群で血清標本を試験する。ネガティブおよびポジティブ参照の血清を同時に試験する。接種ウイルス用量を、各アッセイにおいて、６ウェル／用量を用いて２分の１ログ用量で滴定する。各ウェルは、１００組織培養感染量ＴＣＩＤ５０（±０．７ｌｏｇ１０）の適当な血清型のアデノウイルスを含む。１時間のインキュベーション後、２０，０００±２，０００個のＡ５４９細胞／ｍｌを含む１００μｌを添加する。７日後、細胞をニュートラルレッド液とともにインキュベーションして染色し、機械洗浄し、次いで酸アルコールを用いて固定する。プレートのブランクを差し引いて、５５０ｎｍにてプレートを読み取る。多重比較のためにボンフェローニ補正をしてＡＮＯＶＡを使用して統計をとる。
【００７３】
本実施例は、哺乳動物における弱毒生血清１４型アデノウイルスの免疫原性を試験するための方法を示している。
【００７４】
実施例３
本実施例は、哺乳動物において弱毒生血清１４型アデノウイルスに対する免疫応答を誘導する方法を示す。
【００７５】
欠失したＥ１領域に挿入されたＨＩＶエンベロープの断片（ｇｐ１４０Ｂ）の発現カセットを含む、１ｘ１０９ｐｕのＥ１欠失型の血清１４型アデノウイルスを、マウスに１回または２回注入した。血清を６週目に採取し、ＤｅＷｉｔｔ株と新規Ａｄ１４野生型ウイルスである１９６８Ｔとの両方について中和アッセイにて評価した。アデノウイルスの２回目の（すなわち、ブーストの）投与を受けた動物について、アデノウイルスを６週目に投与し、血清を４週間後にサンプリングした。アデノウイルスの単回投与後に、大きな力価の中和抗体が誘導され、これはアデノウイルスの２回目の投与でさらに増加した。
【００７６】
これらの結果は、トランスジーンを欠く弱毒生血清１４型アデノウイルスが、Ａｄ１４のＤｅＷｉｔｔ株および１９６８Ｔ株の両方に対して反応性の中和抗体を高力価で産生することを強く示唆している。
【００７７】
実施例４
本実施例は、哺乳動物における弱毒生血清１４型アデノウイルスの安全性を決定する方法を示す。
【００７８】
Ａｄ１４ｎｒの耐用性を、高用量のＡｄ１４ｎｒで行われる体重測定を用いて、マウスにおいて評価する。実験は以下の通りに行う。
動物：１群あたり、１０匹の雌および１０匹の雄のＢａｌｂ／ｃマウス
用量群：１×１０１０ｐｕ Ａｄ１４ｎｒ、１×１０１１ｐｕ Ａｄ１４ｎｒ、１×１０１０ｐｕ Ａｄ５ｎｕｌｌ、１×１０１１ｐｕ Ａｄ５ｎｕｌｌ、および処方緩衝液（formulation buffer）のみ
経路：筋肉内および静脈内
エンドポイント：注射後２１日間、毎日の体重測定
【００７９】
予備的な生体分布を２１日目にモニタリングする。生体分布は、Ａｄ１４ｎｒおよびＡｄ５ｎｕｌｌの欠失したＥ１領域に特異的な定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイを用いて行う。モニタリングされる組織としては、肝臓、脾臓、腎臓、脳、生殖腺、心臓、肺、および注射部位が挙げられる。これらの組織の解析は、耐用性と関連する組織におけるアデノウイルスの蓄積を同定し、将来的な毒性試験の際に考慮される必要があり得る。上述の生体分布試験の開始前に、Ａｄ１４ｎｒのｑＰＣＲアッセイを開発して試験する。
【００８０】
Ａ１４ゲノムの特異的な検出のために好適なプライマーセットは、実施例１に記載のＥ１領域の欠失を解析するために用いられるものと同様である。ゲノムの定量のためのｑＰＣＲ法は、当該分野で日常的に使用されている。これらの実験の文脈で使用されるｑＰＣＲアッセイの特異性、アッセイ内精度および正確性は、ＧＬＰ試験の一部として評価された後、ＩＮＤ提出でＦＤＡに提出されている（Ａｌｔｈｅａ Ｒｅｐｏｒｔ第Ｊ１０６−００１号、第Ｊ１０６−００２号）。このアッセイは、アデノウイルスベクターコンストラクトのコピー数の定量に好適であることが見出された。定量のためのｑＰＣＲの各実行について、妥当であると考えられる以下の許容基準を満たさなければならない：（１）標準曲線の相関係数（ｒ２）は＞０．９８０でなければならない、（２）ネガティブ抽出コントロールは検出限界より低くなければならない、および（３）鋳型なしのコントロールは増幅を示してはならない。このアッセイの検出の下限は１０コピー／サンプルであることが見出され、また、定量の下限は５０コピー／サンプルである。
【００８１】
本実施例は、哺乳動物における弱毒生血清１４型アデノウイルスの安全性を決定する方法を記述している。
【００８２】
本明細書で挙げた、刊行物、特許出願および特許を含む全ての参照文献は、各参照文献が参照したことにより組み込まれることが個々的かつ具体的に示され、また本明細書にその全体が示されているのと同程度まで、参照したことにより本明細書に組み込まれる。
【００８３】
本発明を説明する文脈における（特に、特許請求の範囲の文脈における）用語「一つの（a）」および「一つの（an）」および「該（the）」および同様の指示詞の使用は、本明細書中に別段の指示があるか、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含するものと解釈されるべきである。用語「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」および「含む（containing）」は、別段の言及がない限り、オープン・エンドの用語（すなわち、「含むが、これ（ら）に限定されない」という意味）として解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書に別段の指示がない限り、当該範囲内の各個別の値を個々的に言及する簡易的な方法として機能することを単に意図しており、各個別の値は、本明細書に個々的に列挙されたかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載された全ての方法は、本明細書に別段の指示があるか、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で行なうことができる。本明細書で与えた任意のおよび全ての例、または例示的な言葉（例えば、「など（such as）」）の使用は、本発明をより明らかにすることを単に意図しており、別段の主張がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる言葉使いも、主張されていない任意の構成要素が本発明の実施に必須のものであると示しているものと解釈してはならない。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態を、本発明者らが知っている本発明を実施するための最良の形態を含めて、本明細書に記載している。それらの好ましい実施形態の変形は、上記の記載を読めば、当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がこのような変形を適宜用いることを予期しており、また、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されたのとは別のやり方で本発明が実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用法によって許容される限り、本明細書に添付の特許請求の範囲に挙げられた事項のあらゆる改変および均等物を包含する。さらには、本明細書に別段の指示がないか、または文脈と明らかに矛盾しない限り、あらゆる可能な変形での上述した構成要素の任意の組み合わせが、本発明に包含される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において血清１４型アデノウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、該方法は、該哺乳動物に弱毒生血清１４型アデノウイルスを投与することを含み、該投与で血清１４型アデノウイルスに対する免疫応答が該哺乳動物において誘導される、前記方法。
【請求項２】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、増殖のために、高々、該アデノウイルスゲノムのＥ１領域、Ｅ２Ａ領域および／またはＥ４領域の補完を必要とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、増殖のために、該アデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域の補完を必要としない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、増殖のために、該アデノウイルスゲノムのＥ１領域の補完を必要とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、Ｅ１領域の全体または部分を欠失したアデノウイルスゲノムを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、増殖のために、該アデノウイルスゲノムのＥ４領域の補完を必要とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、Ｅ４領域の全体または部分を欠失したアデノウイルスゲノムを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、Ｅ３領域の全体または部分を欠失したアデノウイルスゲノムを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、異種核酸配列を含まない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳動物に対する弱毒生血清１４型アデノウイルスの投与前に、該哺乳動物にプライミング組成物を投与することを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記プライミング組成物が、弱毒生血清１４型アデノウイルスを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物に対する前記弱毒生血清１４型アデノウイルスの投与後に、該哺乳動物にブースティング組成物を投与することを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ブースティング組成物が、弱毒生血清１４型アデノウイルスを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
弱毒生血清１４型アデノウイルス。
【請求項１６】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、増殖のために、高々、該アデノウイルスゲノムのＥ１領域、Ｅ２Ａ領域および／またはＥ４領域の補完を必要とする、請求項１５に記載の弱毒生血清１４型アデノウイルス。
【請求項１７】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、増殖のために、該アデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域の補完を必要としない、請求項１５または１６に記載の弱毒生血清１４型アデノウイルス。
【請求項１８】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、増殖のために、該アデノウイルスゲノムのＥ１領域の補完を必要とする、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の弱毒生血清１４型アデノウイルス。
【請求項１９】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、Ｅ１領域の全体または部分を欠失したアデノウイルスゲノムを含む、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の弱毒生血清１４型アデノウイルス。
【請求項２０】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、増殖のために、該アデノウイルスゲノムのＥ４領域の補完を必要とする、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の弱毒生血清１４型アデノウイルス。
【請求項２１】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、Ｅ４領域の全体または部分を欠失したアデノウイルスゲノムを含む、請求項２０に記載の弱毒生血清１４型アデノウイルス。
【請求項２２】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、Ｅ３領域の全体または部分を欠失したアデノウイルスゲノムを含む、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の弱毒生血清１４型アデノウイルス。
【請求項２３】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、異種核酸配列を含まない、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の弱毒生血清１４型アデノウイルス。
【請求項２４】
請求項１５〜２３のいずれか１項に記載の弱毒生血清１４型アデノウイルスおよび医薬的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項１】
哺乳動物において血清１４型アデノウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、該方法は、該哺乳動物に弱毒生血清１４型アデノウイルスを投与することを含み、該投与で血清１４型アデノウイルスに対する免疫応答が該哺乳動物において誘導される、前記方法。
【請求項２】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、増殖のために、高々、該アデノウイルスゲノムのＥ１領域、Ｅ２Ａ領域および／またはＥ４領域の補完を必要とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、増殖のために、該アデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域の補完を必要としない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、増殖のために、該アデノウイルスゲノムのＥ１領域の補完を必要とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、Ｅ１領域の全体または部分を欠失したアデノウイルスゲノムを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、増殖のために、該アデノウイルスゲノムのＥ４領域の補完を必要とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、Ｅ４領域の全体または部分を欠失したアデノウイルスゲノムを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、Ｅ３領域の全体または部分を欠失したアデノウイルスゲノムを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、異種核酸配列を含まない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳動物に対する弱毒生血清１４型アデノウイルスの投与前に、該哺乳動物にプライミング組成物を投与することを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記プライミング組成物が、弱毒生血清１４型アデノウイルスを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物に対する前記弱毒生血清１４型アデノウイルスの投与後に、該哺乳動物にブースティング組成物を投与することを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ブースティング組成物が、弱毒生血清１４型アデノウイルスを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
弱毒生血清１４型アデノウイルス。
【請求項１６】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、増殖のために、高々、該アデノウイルスゲノムのＥ１領域、Ｅ２Ａ領域および／またはＥ４領域の補完を必要とする、請求項１５に記載の弱毒生血清１４型アデノウイルス。
【請求項１７】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、増殖のために、該アデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域の補完を必要としない、請求項１５または１６に記載の弱毒生血清１４型アデノウイルス。
【請求項１８】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、増殖のために、該アデノウイルスゲノムのＥ１領域の補完を必要とする、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の弱毒生血清１４型アデノウイルス。
【請求項１９】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、Ｅ１領域の全体または部分を欠失したアデノウイルスゲノムを含む、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の弱毒生血清１４型アデノウイルス。
【請求項２０】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、増殖のために、該アデノウイルスゲノムのＥ４領域の補完を必要とする、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の弱毒生血清１４型アデノウイルス。
【請求項２１】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、Ｅ４領域の全体または部分を欠失したアデノウイルスゲノムを含む、請求項２０に記載の弱毒生血清１４型アデノウイルス。
【請求項２２】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、Ｅ３領域の全体または部分を欠失したアデノウイルスゲノムを含む、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の弱毒生血清１４型アデノウイルス。
【請求項２３】
前記弱毒生血清１４型アデノウイルスが、異種核酸配列を含まない、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の弱毒生血清１４型アデノウイルス。
【請求項２４】
請求項１５〜２３のいずれか１項に記載の弱毒生血清１４型アデノウイルスおよび医薬的に許容される担体を含む、組成物。
【公表番号】特表２０１１−５０５８３７（Ｐ２０１１−５０５８３７Ａ）
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３８１６３（Ｐ２０１０−５３８１６３）
【出願日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８６４５２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７６５４２
【国際公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【出願人】（５００１２９０８５）ジェンベク、インコーポレイティッド (13)
【出願人】（５１０１６３９１６）アメリカ合衆国 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８６４５２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７６５４２
【国際公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【出願人】（５００１２９０８５）ジェンベク、インコーポレイティッド (13)
【出願人】（５１０１６３９１６）アメリカ合衆国 (1)
【Ｆターム（参考）】
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