アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌由来の発症防御抗原である新規組換え蛋白
【課題】アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌に対して、有効でかつ安全性に優れた免疫化抗原である蛋白、および該蛋白を用いた非ヒト動物の免疫化方法、ならびに前記蛋白を調製するのに好適に使用されるモノクローナル抗体、およびハイブリドーマを提供する。
【解決手段】特定の塩基配列またはアミノ酸配列から作製され、かつ受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２１０６０であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体(ＭＡｂ)Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃと反応し、抗アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌不活化全菌体免疫血清に含まれる血清型特異的赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体を吸収することを特徴とする組換え蛋白、ならびにこの組換え蛋白を非ヒト動物の皮下又は筋肉内に投与して血清型特異的ＨＩ抗体価を誘導することを特徴とする非ヒト動物、特に鳥類の免疫化方法。
【解決手段】特定の塩基配列またはアミノ酸配列から作製され、かつ受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２１０６０であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体(ＭＡｂ)Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃと反応し、抗アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌不活化全菌体免疫血清に含まれる血清型特異的赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体を吸収することを特徴とする組換え蛋白、ならびにこの組換え蛋白を非ヒト動物の皮下又は筋肉内に投与して血清型特異的ＨＩ抗体価を誘導することを特徴とする非ヒト動物、特に鳥類の免疫化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アビバクテリウム・パラガリナラム（Avibacterium paragallinarum）Ｃ型菌の感染防御抗原である赤血球凝集素（以下「ＨＡ」という。）に存在する免疫原性の高いエピトープをコードする遺伝子領域を特定し組換え蛋白として得ることであり、この蛋白を用いて非ヒト動物、特に鳥類を免疫化する方法に関するものである。菌名はこれまでヘモフィルス・パラガリナラム（Haemophilus paragallinarum）と呼ばれていたが、Ｂｌａｃｋａｌｌらが再分類し、アビバクテリウム・パラガリナルム（Avibacterium paragallinarum）と呼ぶことを提唱し正式名称となっている。(例えば、非特許文献１を参照。)
【背景技術】
【０００２】
アビバクテリウム・パラガリナラムは、伝染性コリーザと呼ばれる家禽の呼吸器伝染病の原因菌である。症状は鼻汁の漏出、顔面の腫脹、流涙等であり致死率は低いが、他の感染症を併発した場合には重症化する。養鶏産業においては産卵開始の遅延、産卵率の低下による大きな経済的損失を引き起こす伝染病である。血清型についてはＰａｇｅが凝集反応に基づいて３つの型が存在することを報告し、それぞれＡ、Ｂ、Ｃ型と呼ばれる（例えば、非特許文献２を参照。）。これらの血清型間の交差免疫が成立しないことがＫｕｍｅらの報告によって明らかにされている（例えば、非特許文献３、４、５、６を参照。）。
【０００３】
アビバクテリウム・パラガリナラム全菌体を鶏に接種すると、赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体の産生が促され、このＨＩ抗体価と防御効果とが相関することから赤血球凝集素（ＨＡ）が重要な防御抗原であると考えられている。Ｋｕｍｅらは、Ａ型菌にはＨＡ−Ｌ（易熱性、トリプシン感受性）、ＨＡ−ＨＬ（易熱性、トリプシン耐性）、ＨＡ−ＨＳ（耐熱性、トリプシン耐性）の３種類のＨＡが存在し、このうち感染防御に関与するのは血清型特異性のあるＨＡ−Ｌのみであることを報告している。ＹａｍａｇｕｃｈｉとＩｒｉｔａｎｉはＡ型菌のＨＡをタイプ１ＨＡ（易熱性、蛋白分解酵素感受性）及びタイプ２ＨＡ（易熱性、蛋白分解酵素耐性）の２種類に分類した（例えば非特許文献７を参照。）。ＫｕｍｅらのＨＡ−Ｌ及びＨＡ−ＨＬは、それぞれＩｒｉｔａｎｉらのタイプ１ＨＡ及びタイプ２ＨＡに相当すると考えられている。Ｃ型菌においては、易熱性、トリプシン感受性のＨＡ抗原が存在し、Ａ型菌とは抗原性が異なるＨＡであることが報告されている（例えば非特許文献８を参照。）。また、ＹａｍａｇｕｃｈｉらはＨＡ性を欠如したＣ型菌変異株の感染防御能が変異前と比較して明らかに低下したことから、Ｃ型菌特異的なＨＡ抗原が病原性と免疫原性に重要な役割を果たしていることを報告している（例えば非特許文献９を参照。）。このようにアビバクテリウム・パラガリナラムの感染防御抗原はＨＡがその重要な役割を担うことが報告されている。
【０００４】
アビバクテリウム・パラガリナラムＡ型菌のＨＡ遺伝子のクローニングについては、Ｔａｋａｇｉらがヘモフィルス・パラガリナラム（Haemophilus paragallinarum）Ａ型菌（アビバクテリウム・パラガリナラムと同じ）２２１株のゲノムＤＮＡから２．５７キロベースペア（以下「ｋｂｐ」と記す。）の遺伝子断片をクローニングし、この組換え大腸菌が弱い防御活性を持つことを報告したが、塩基配列が報告されていないために詳細は不明である(例えば非特許文献１０を参照。)。Ｈｏｂｂらは、Ｔａｋａｇｉらが作製したモノクローナル抗体（以下「ＭＡｂ」と記す。）を用いてＡ型菌５株、Ｂ型菌２株、Ｃ型菌４株、計１１株から１ｋｂｐ程の遺伝子断片をクローニングし遺伝子配列を解析したが、それらの蛋白の免疫原性は確認していない（例えば非特許文献１１を参照。）。Ｔｏｋｕｎａｇａらはアビバクテリウム・パラガリナラムＡ型菌２２１株のゲノムＤＮＡから８，９３０ベースペア（以下「ｂｐ」と記す。）の遺伝子断片をクローニングし、その塩基配列を報告している（例えば特許文献１を参照。）。この遺伝子断片には６．１ｋｂｐのＯＲＦが含まれ、このＯＲＦ中に含まれる３．５ｋｂｐの遺伝子断片と４．１ｋｂｐの遺伝子断片を挿入した組換え大腸菌の菌体破砕液をそれぞれ１０羽の鶏に免疫した各１０羽の鶏のうち７羽が攻撃に対して防御したことを報告した。山元らは、ヘモフィルス・パラガリナラムＡ型菌２２１株のゲノムＤＮＡから２，０１６ｂｐのＨＰＡ２．０をクローニングし、この遺伝子断片から作製した組換え蛋白を免疫した１０羽の鶏のうち１０羽が攻撃に対して発症防御を示したことを報告している（例えば特許文献３を参照。）。
【０００５】
アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌のＨＡ遺伝子のクローニングについては、Ｔｏｋｕｎａｇａらが、ヘモフィルス・パラガリナラムＣ型菌５３−４７株のゲノムＤＮＡから１３．５ｋｂｐの遺伝子断片をクローニングし，そのうちの７，４８６ｂｐの遺伝子配列を解析した。この遺伝子領域内に２，０３９アミノ酸からなるＯＲＦが存在し、このＯＲＦがＡ型菌の２，０４２アミノ酸からなるＯＲＦと遺伝子間相同性がおよそ８０％であったことを報告した（例えば特許文献２を参照。）。また、このＯＲＦ全長を発現した組換え蛋白が精製抗原を免疫して得られたＨＩ活性を有する抗モルモット血清と反応したことを報告している。しかし、この組換え蛋白の鶏に対する免疫原性は確認されていない。
【０００６】
上記のようにアビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌のＨＡをコードする遺伝子に関係した報告があるが、リコンビナントワクチンの抗原に応用可能な免疫原性を有する組換え蛋白とそれをコードする遺伝子領域は未知である。
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６，９１９，０８０号 Ｂ２ 明細書
【特許文献２】特開２００４−５７０７８号公報
【特許文献３】特開２００５−２１８４１４号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００５，５５，ｐ３５３−３６２
【非特許文献２】Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｃｈ， １９６２， ２３， ｐ８５−９５
【非特許文献３】Ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅａｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９７８， ４０， ｐ６５−７３
【非特許文献４】Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９８０， ４１， ｐ９７−１００
【非特許文献５】Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９８０， ４１， ｐ７５７−７６０
【非特許文献６】Ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅａｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８０， ４２， ｐ６７３−６８０
【非特許文献７】Ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅａｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８０， ４２， ｐ７０９−７１１
【非特許文献８】Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９８２， ４３， ｐ１３１１−１３１４
【非特許文献９】Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， １９９３， ３７， ｐ９７０−９７６
【非特許文献１０】Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９１， ５３（５），ｐ９１７−９２０
【非特許文献１１】Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００２， １４８， ｐ２１７１−２１７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
アビバクテリウム・パラガリナラム不活化全菌体を用いたワクチンは注射局所の腫脹等の一過性の副作用が生じる場合があり、養鶏産業の生産性に悪影響を及ぼすことから、副作用の少ないワクチンが望まれている。その解決策の１つとしてリコンビナントワクチンの開発が容易に思いつくが、その主成分となる組換え抗原を作製するために必要な遺伝子配列もしくはアミノ酸配列については、Ａ型菌ではいくつかの報告があるものの、Ｃ型菌については報告されていない。本菌は血清型間に交差性が認められないことから、組換え抗原はそれぞれの血清型について開発する必要があり、Ａ型菌の知見は殆ど参考にならない。さらに、実用性の面から１回の接種で免疫を付与することができる強い免疫原性を有する組換え蛋白の開発が望まれている。
したがって、本発明の課題は、アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌に対して、有効でかつ安全性に優れた免疫化抗原である蛋白、および該蛋白を用いた非ヒト動物の免疫化方法を提供することにある。また、前記蛋白を調製するのに好適に使用されるモノクローナル抗体、及びハイブリドーマを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者はこれらの課題を解決するために種々の検討を行った結果、１回接種で十分な免疫を付与する組換え蛋白をコードする遺伝子領域を特定してリコンビナントワクチンに応用可能な組換え蛋白を作出するに至った。すなわち、配列番号１で示された塩基配列またはアミノ酸配列から作製され、かつ受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２１０６０であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体(ＭＡｂ)Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃと反応し、抗アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌不活化全菌体免疫血清に含まれる血清型特異的赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体を吸収することを特徴とする組換え蛋白である。
【００１０】
本発明の第二は、配列番号１で示された塩基配列またはアミノ酸配列から作製され、かつ受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２１０６０であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体(ＭＡｂ)Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃと反応し、抗アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌不活化全菌体免疫血清に含まれる血清型特異的赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体を吸収することを特徴とする組換え蛋白を、非ヒト動物に投与することを特徴とする非ヒト動物の免疫化方法である。非ヒト動物は鳥類であることが好ましい。
【００１１】
本発明の第三は、上記モノクローナル抗体を産生する受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２１０６０であるハイブリドーマＨｐｇ８Ｃ１Ｃとこれにより産生されるモノクローナル抗体である。本モノクローナル抗体を用いることによって、上記配列番号１に示した組換え蛋白に含まれるエピトープの特定が可能となり、組換え蛋白の免疫原性を確認することができる。本モノクローナル抗体はアビバクテリウム・パラガリナラムＡ型菌とは反応せずＣ型菌に特異的に反応し、高いＨＩ活性を有し、アビバクテリウム・パラガリナラムＡ型菌には反応せずＣ型菌と特異的に反応し、可溶化（２％ＳＤＳ存在下で１００℃５分感作）抗原とは反応せず、高いＨＩ活性を有し、塩基配列とアミノ酸配列を配列番号１に示した組換え蛋白ＨＰＣ５．５と反応し、かつ配列番号１の塩基配列の５’末端が３３３ｂｐもしくはＮ末のアミノ酸配列が１１１個欠損したＨＰＣ５．１とは反応しないという特徴を有する抗体である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の組換え蛋白をワクチン抗原として利用し、この分野における公知の技術を用いてアジュバントと混合してリコンビナントワクチンを作製し、非ヒト動物の筋肉内または皮下に投与して非ヒト動物を免疫化することによってアビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌を原因とする鶏伝染性コリーザを予防する効果が得られる。このリコンビナントワクチン接種による副作用は従来の鶏伝染性コリーザワクチンよりも弱いという利点を有し、例えば、産卵率等の養鶏産業の生産性に寄与することが期待できる。
したがって、本発明は、前記組換え蛋白を筋肉内または皮下投与して鳥類を免疫化する方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の組換え蛋白は、配列番号１で示された塩基配列から作製される、または配列番号１で示されたアミノ酸配列から作製され、かつ受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２１０６０であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃと反応し、抗アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌不活化全菌体免疫血清に含まれる血清型特異的赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体を吸収することを特徴とするものである。
【００１４】
本発明の組換え蛋白は、ＭＡｂ Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃと反応し、抗アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌不活化全菌体免疫血清に含まれるＨＩ抗体を吸収する物性を有するものであれば、前記配列番号１で示された塩基配列において１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加されていてもよく、前記配列番号１で示されたアミノ酸配列においても、１もしくは数個のアミノ酸配列が、欠失、置換もしくは付加されていてもよい。
【００１５】
前記アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌としては、例えば、アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌ＫＡ株が挙げられるが、これは日本国内で分離された株であり、株式会社微生物化学研究所が製造販売する伝染性コリーザワクチンに用いられている菌株である。本発明においては、前記アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌は、微生物学的に同一のものであればよく、株名等は特に限定されるものではない。
【００１６】
本発明で使用されるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃは、アビバクテリウム・パラガリナラムＡ型菌には反応せずＣ型菌と特異的に反応し、可溶化（２％ＳＤＳ存在下で１００℃５分感作）抗原とは反応せず、高いＨＩ活性を有し、塩基配列とアミノ酸配列を配列番号１に示した組換え蛋白ＨＰＣ５．５と反応し、かつ配列番号１の塩基配列の５’末端が３３３ｂｐもしくはＮ末のアミノ酸配列が１１１個欠損したＨＰＣ５．１とは反応しないという特徴を有する抗体である。本発明においてはこのＭＡｂ Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃとの反応性を見ることで所望の組換え蛋白を効率的に選択することができる。なお、ＭＡｂは以下のようにして作製することができる。
【００１７】
ＭＡｂは例えば、免疫材料としてアビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌不活化全菌体を常法に従って動物に接種するかまたは動物細胞と接触させてインビボまたはインビトロで免疫化することで抗体産生細胞を得、この抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させて得られるハイブリドーマの培養上清を得ることで製造することができる。または、ヌードマウスやプリスタンを投与したマウスの腹腔内にハイブリドーマを接種し、腹水を採取して精製することによっても製造することができる。ＭＡｂのスクリーニングは前記ハイブリドーマの培養上清を試料としてＨＩ抗体価測定によって行う。実施例に示すように、組換え蛋白ＨＰＣ５．５とＨＰＣ５．１を用いたＥＬＩＳＡ試験を併用することによってより効率的なスクリーニングが可能となる。ＭＡｂの特異性は、Ａ型菌ＨＡ抗原を用いたＨＩ試験においてＨＩ活性を示さず、イムノドットブロット法でＡ型菌と反応しないこと、２％ＳＤＳ存在下で１００℃５分感作して可溶化処理した抗原とは反応しないことによって確認される。ＨＩ試験とイムノドットブロット法は後述の実施例に記載の方法を用いて実施することができる。
【００１８】
前記抗体産生細胞の由来は、特に限定されず、マウス、ラット、ウマ、ウサギ等の動物の脾細胞の中から、ミエローマとの適合性等を考慮して適宜選択して用いることができるが、好ましくはマウス由来の脾細胞である。
【００１９】
前記抗体産生細胞と融合されるミエローマ細胞としては、マウス、ラット、ウマ、ヤギ、ウサギ等に由来するものが挙げられる。好ましくは前記抗体産生細胞と同種の動物に由来するものであることが望ましい。例えば、抗体産生細胞がマウスの脾細胞に由来する場合、その融合の相手としては、マウスから得られた骨髄腫株化細胞等のミエローマ細胞を用いることが好ましい。なお、前記抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、公知の方法、例えば、Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７（１９７５）に記載の方法、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７，５１２２−５１２６（１９８１）に記載の方法またはこれらに準ずる方法によって行うことができる。抗体産生細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体産生能および増殖能を獲得したハイブリドーマの選択は、通常の選択用培地を用いる培養によって行うことができる。
【００２０】
上記の方法で得られるハイブリドーマのうち、アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌に特異的な高いＨＩ活性を有し、塩基配列とアミノ酸配列を配列番号１に示した組換え蛋白ＨＰＣ５．５と反応し、かつ配列番号１の塩基配列の５’末端が３３３ｂｐもしくはＮ末のアミノ酸配列が１１１個欠損したＨＰＣ５．１とは反応しないＭＡｂ Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃを産生するハイブリドーマ「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃ」を平成１８年１０月１１日付けにて独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託し、受託番号「ＦＥＲＭ Ｐ−２１０６０」が付されている。本発明では、この受託番号が付されたハイブリドーマを用いることで、ＭＡｂ Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃを効率よく得ることができる。
【００２１】
また、本発明の組換え蛋白は、抗アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌不活化全菌体免疫血清に含まれる血清型特異的赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体を吸収する。
【００２２】
前記抗アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌不活化全菌体免疫血清は、非ヒト動物、例えばニワトリ、モルモット、ウサギ、マウス、ラット等をＣ型菌不活化全菌体で免疫して得られた抗血清であればよく、動物種や菌株を特に限定するものではない。また、本発明の組換え蛋白が前記ＨＩ抗体を吸収することは、後述の実施例に記載の方法に準じて確認することができる。
【００２３】
前記特徴を有する本発明の組換え蛋白は、例えば、前記ＭＡｂのエピトープをコードするゲノムＤＮＡのスクリーニングを行った後、免疫原性の確認等して組換え蛋白を特定することで調製することができる。各工程を以下に説明する。
【００２４】
[ＭＡｂのエピトープをコードするゲノムＤＮＡのスクリーニング]
抗体スクリーニングが可能なラムダファージベクターに、制限酵素処理によって断片化したゲノムＤＮＡ断片を挿入して、ゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、プラーク上に発現させた組換え蛋白をＭＡｂを用いてスクリーニングを行う。ゲノムＤＮＡの制限酵素処理は、５〜１０ｋｂｐのサイズの断片が多く含まれるように調整することが好ましく、５×１０6個ほどのプラークをスクリーニングして陽性クローンが得られない場合には、ゲノムＤＮＡライブラリーを再度作製してスクリーニングを行う。
【００２５】
[組換え蛋白の特定]
図１に示したように、様々な長さのゲノムＤＮＡ断片を大腸菌発現系のプラスミドにサブクローニングして組換え大腸菌を作製し、組換え蛋白を発現させ、分離精製して、ＭＡｂとの反応をイムノドットブロット法で解析する。また、アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌不活化全菌体に対するＨＩ抗体価が６４０倍ほどの抗血清（ポリクローナル抗体）を用意し、各組換え蛋白と反応させた後に遠心除去し、組換え蛋白のＨＩ抗体吸収能を測定する。表１のＨＰＣ５．５のように吸収操作によって６４０倍の抗体価を２０倍に低下させるＨＩ抗体吸収能を有し、かつ多くのＭＡｂと反応する組換え蛋白を選択する。ポリクローナル抗体は、アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌不活化全菌体を接種した動物から得られる免疫血清であればよく、不活性化方法、動物の種類や免疫血清の採取方法等について特に限定はない。
【００２６】
[組換え蛋白の免疫原性の確認]
ワクチン抗原としての有効性を確認する為に、前記の組換え蛋白に適当なアジュバントを加えた試作ワクチンを作製して鶏に免疫する。免疫前と免疫４週後にＨＩ抗体価を測定し、免疫４週後にアビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌の強毒株を鼻腔内に接種して攻撃する。ＨＩ抗体価が免疫前と比較して上昇していることと、組換え蛋白免疫群の発症防御率が１００％であることを確認する。また抗原の安全性を確認するために、不活化全菌体抗原と組換え蛋白を用いた試作ワクチンを作製し、鶏に免疫してその注射局所における副反応を観察し比較して、組換え抗原の安全性が不活化全菌体抗原よりも優れていることを確認する。
【００２７】
[組換え蛋白の製造]
本発明の組換え蛋白は、例えば、前記配列番号１で示される塩基配列またはその改変塩基配列をプラスミドベクターに挿入し、これを用いて組換え大腸菌を作製し、組換え蛋白の発現を誘導し、組換え蛋白を分離精製することによって本発明の組換え蛋白を大量に得ることができる。分離精製方法としては、公知の方法であれば特に限定はない。なお、得られた組換え蛋白は、前記と同様に免疫原性を確認する。
【００２８】
以上のようにして得られる本発明の組換え蛋白は、非ヒト動物のワクチンとして使用することができる。前記組換え蛋白をワクチン抗原として使用する場合は、常套手段に従って、その有効量を非ヒト動物に皮下または筋肉内に投与して血清型特異的ＨＩ抗体を誘導することで行うことができる。
【００２９】
本発明の組換え蛋白をワクチン抗原として使用する場合、アジュバント等と混合したワクチン組成物とするのが好ましい。
【００３０】
前記ワクチン組成物に用いられるアジュバントとしては、油性アジュバントを含むのが好ましい。油性アジュバントは、ワクチン、特に動物用ワクチンのアジュバントとして好適に用いられている。本発明に用いられる油性アジュバントを用いたオイルワクチンのタイプとしては、任意の油中水（Ｗ／Ｏ）型エマルション、水中油（Ｏ／Ｗ）型エマルション及びＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションが含まれ、これらは重篤な副作用を起こすことなく動物に投与し得る。通常、エマルションは、水、塩水又は緩衝液（例えば、リン酸緩衝食塩水）から形成し得る水相、油相、及び１種以上の乳化剤からなり、公知の方法に従ってこれらの成分を安定なエマルションが得られるように十分に混合する。Ｏ／Ｗ型エマルション又はＷ／Ｏ型エマルションの製造方法は、油相と水相の相対比率及びそれらの正確な性質に関連して、適当なタイプの乳化剤を適切に選択することを含む。乳化剤によって促進され得るエマルションのタイプは、その親水性基と親油性基のバランス、ＨＬＢ値として知られている油と水の相対親和性によって示される。
【００３１】
適当な油の例としては、鉱物、動物、魚または植物由来の任意の代謝性油、精製または化学改質形態の代謝性油を用い得る。
魚由来の油としては、タラ肝油、サメ肝油のような代謝性油を含んでいるもの、スクアレンのような魚油由来のテルペノイド誘導体が挙げられる。動物油の由来としては、牛、豚、鶏等が挙げられる。植物油の例としては、落花生油、大豆油、椰子油、オリーブ油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油、コーン油等が含まれる。
【００３２】
本発明で使用できる乳化剤としては、脂肪酸置換したソルビタン界面活性剤、例えば、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート等、並びにポリオキシエチレンソルビタンのモノエステル及びトリエステルを含む一連の界面活性剤等が挙げられる。
【００３３】
前記ワクチン組成物において、Ｗ／Ｏ型エマルションの連続相中の油成分の量や、水相の量および乳化剤の量は、該ワクチン組成物中に本発明の組換え蛋白が均一に混合できる量であればよく、特に限定はない。
【００３４】
また、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ等の市販のアジュバントに本発明の組換え蛋白を混合して、ワクチン組成物を調製してもよい。
【００３５】
また、前記ワクチン組成物には、免疫化する動物に応じて、他の免疫可能な抗原を含有させてもよい。
【００３６】
前記ワクチン組成物を注射剤とする場合には、無菌の水性または非水性の、溶液剤、懸濁剤および乳濁剤を含有してもよい。水性の溶液剤や懸濁剤には、例えば注射剤用蒸留水および生理食塩水が含まれる。非水性の溶液剤、懸濁剤には、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのような製薬学的に許容されるアルコール類、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルのような界面活性剤が含まれる。このような水性、非水性の組成物はこれらの添加剤以外に湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、分散剤、安定価剤（例えばラクトース）、溶解補助剤（例えばグルタミン酸やアスパラギン酸等）等の補助剤や防腐剤を含有してもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化される。これらはまた無菌の固体組成物として製造し、使用前に無菌水または無菌の注射用溶媒に溶解して使用する形態をとることもできる。
【００３７】
本発明の組換え蛋白の投与量は被検体である非ヒト動物の日齢、体重、投与ルート、アジュバントの種類等によって異なり、これらを考慮して適宜設定されるが、例えば、鶏等の鳥類であれば皮下または筋肉内に通常１０μg〜１００μg、好ましくは３０μg〜６０μgを通常１回投与すれば有効である。したがって公知のワクチンに比べてコスト的に優れ、また、ワクチンによる副作用を引き起こす可能性も低くなるという利点がある。投与量は予防目的やその他の種々の条件によって変動するので、上記投与量範囲より少ない量で十分な場合もある。
【００３８】
本発明の組換え蛋白は、安全で低毒性であるので、非ヒト動物中でも家禽等の鳥類に対して好適に投与することができる。
【実施例】
【００３９】
次に本発明の組換え蛋白の製造方法について詳細に説明する。なお、以下の製造方法は一例であって、本明細書に開示する発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００４０】
実施例１（組換え蛋白の製造）
[アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌に特異的なＨＩ活性を有するモノクローナル抗体および該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製]
アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌(以下Ｃ型菌という)のＨＡをコードする遺伝子を同定するために、該Ｃ型菌ＫＡ株不活化全菌体でマウスを免疫し、常法に従ってＭＡｂを作製した。
【００４１】
Ｃ型菌ＫＡ株不活化全菌体を２×１０9ＣＦＵ／ｍＬとＦｒｅｕｎｄ’ｓ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｄｉｆｃｏ社製）を５０％含むように免疫原を調整し、７週令の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの背部皮下に３週毎に２回、０．１ｍＬ注射した。２回目を注射した３週後に、１×１０8ＣＦＵの不活化Ｃ型菌ＫＡ株を含むＰＢＳをおよそ５０μＬ静脈内注射し、３日後にマウスの脾細胞と骨髄腫細胞を常法に従って融合し、ハイブリドーマを作製した。得られたハイブリドーマの培養上清を該Ｃ型菌ＨＡ抗原を用いたＨＩ試験によってスクリーニングし、限界希釈法によってクローニングした。これを３回繰り返した結果５つのハイブリドーマが得られ、これをあらかじめプリスタンで処理したマウスの腹腔内に接種して腹水を採取し、精製してそれぞれのＭＡｂ Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃ、Ｈｐｇ１１Ｅ１１Ｂ、Ｈｐｇ４Ｇ８Ｂ、Ｈｐｇ２４Ｅ４Ｄ、Ｈｐｇ１０Ｄ１Ａが得られた。モノクローナル抗体の蛋白量１ｍｇあたりのＨＩ抗体価は、ＭＡｂ Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃは４，５７１、Ｈｐｇ１１Ｅ１１Ｂは１，１４３、Ｈｐｇ４Ｇ８Ｂは３，５５６、Ｈｐｇ２４Ｅ４Ｄは３，２００、Ｈｐｇ１０Ｄ１Ａは1,６００であった。免疫グロブリンのアイソタイプは２４Ｅ４Ｄ、１１Ｅ１１Ｂ、１０Ｄ１ＡがＩｇＧ１であり、８Ｃ１Ｃ、４Ｇ８ＢがＩｇＧ２ａであった。
【００４２】
これらのモノクローナル抗体は全てイムノドットブロットとＨＩ試験によってＡ型菌２２１株とは反応せず、かつＣ型菌Ｓ１株、ｍｏｄｅｓｔｏ株と反応することが確認され、Ｃ型菌に特異的であると考えられた。
【００４３】
ＨＩ試験方法は、ＨＡ抗原に「コリーザＡ型ＨＡ抗原ＮＰ」または「コリーザＣ型ＨＡ抗原ＮＰ」（日本ファーマシー株式会社製）を用い、プロトコールに従って実施した。イムノドットブロットはおよそ１００μＬの各株の培養液をＰＶＤＦ膜に染み込ませ、１％ゼラチン加ＴｗｅｅｎＰＢＳでブロッキングし、ＨＲＰ標識したＭＡｂを反応させて発色させた。
【００４４】
また、これら５種の精製ＭＡｂをＨＲＰ標識した抗体を作製し、競合ＥＬＩＳＡ試験を行ったところ、Ｈｐｇ４Ｇ８Ｂと２４Ｅ４Ｄ、１１Ｅ１１Ｂと１０Ｄ１Ａがそれぞれ同じエピトープを認識することが確認され、Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃの場合を加えて少なくとも３つの異なるエピトープの存在が示された。
【００４５】
[ＭＡｂを用いたＨＡ遺伝子のクローニング]
次に、Ｃ型菌ＫＡ株から抽出した染色体遺伝子を制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで５ｋｂ〜１０ｋｂほどの比較的長い遺伝子断片が多く含まれるように部分消化し、「ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｖｅｃｔｏｒ」(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製：Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．)のＢａｍＨＩサイトに連結し、「Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔ」(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製)を用いてインビトロパッケージングを行い、得られた組換えファージを大腸菌に感作させ、寒天平板上にファージプラークを作らせた。このファージプラークをあらかじめＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）をしみ込ませたニトロセルロース膜に転写し、一次スクリーニングに抗Ｃ型菌ＫＡ株免疫ウサギ血清と反応させ、陽性プラークを選択し、二次スクリーニングとして前記の５つのＭＡｂ（Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃ，１１Ｅ１１Ｂ，４Ｇ８Ｂ，２４Ｅ４Ｄ，１０Ｄ１Ａ）を混合した抗体を用いた。
【００４６】
その結果一つのファージクローンが得られ、ＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージ・大腸菌ＸＬＯＬＲシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いてファージミドを作製した。挿入遺伝子配列を解析したところ、およそ４．８ｋｂｐの遺伝子断片であり、ジーンバンクに登録されている配列と比較したところ、Ｔｏｋｕｎａｇａらの報告しているアビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌５３−４７株のＨＡ遺伝子(ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＲ３０３１２６)と９９％以上の高い相同性が認められた。
【００４７】
[大腸菌を用いた組換え蛋白の発現とエピトープ解析]
この挿入遺伝子断片とＴｏｋｕｎａｇａらの配列をもとにＰＣＲプライマーを設計した。具体的には、図１に示したようにｈｐｃ４．８の５’末端領域を延長した５，１５７、５，４９０ｂｐの遺伝子断片ｈｐｃ５．１、ｈｐｃ５．５と、ｈｐｃ５．５の３’末端を欠失させたｈｐｃ３．２とｈｐｃ２．５を作製し、これら５つの遺伝子断片をｐＣｏｌｄIIベクター（タカラバイオ社）に挿入し、大腸菌ＢＬ２１株を形質転換して組換え大腸菌を作出した。各組換え大腸菌から常法により発現させた組換え蛋白は、そのほとんどが不溶性の封入体として発現された。そこで、発現を誘導した組換え大腸菌培養液を遠心、濃縮し、公知の方法によって菌体を破砕し、その遠心沈渣を４％ＴｒｉｔｏｎＸ１００加ＰＢＳで懸濁し、室温で３０分震盪感作後にさらに遠心分離した。得られた沈渣をＰＢＳで再浮遊させ、粗精製組換え蛋白を得た（なお、粗精製前後の組換え蛋白ＨＰＣ５．５の状態を図２に示す）。これらの粗精製組換え蛋白と上記５つのＭＡｂの反応パターンをイムノドットブロット法を用いて解析し、各エピトープをコードする領域を特定した。その結果を図１に示す。イムノドットブロット法は、ＰＶＤＦメンブランに上記の方法で作製した粗精製組換え蛋白およそ８０μgをアプライし、以降は前記の方法で行った。
【００４８】
図１の結果より、ＭＡｂ８Ｃ１Ｃは組換え蛋白ＨＰＣ５．５と反応し、ＨＰＣ５．１とは反応しないことが示され、これらの組換え蛋白を用いることによってより簡便にＭＡｂ８Ｃ１Ｃを選択することが可能になることが判明した。そこで以下の実験を行った。アビバクテリウムＣ型菌のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施しｈｐｃ５．１とｈｐｃ５．５を増幅し、これらを発現用プラスミドベクターｐＣｏｌｄII（タカラバイオ社）に挿入して、宿主大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株を形質転換して組換え大腸菌を作製し、組換え蛋白を誘導して前記の方法で分離精製した。得られた粗精製組換え蛋白を１ウェルあたり３μgＥＬＩＳＡプレートに固相化し、１％ゼラチン加ＴｗｅｅｎＰＢＳでブロッキングした後にハイブリドーマ「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃ」（ＦＥＲＭ Ｐ−２１０６０）の培養上清をサンプルとしてアプライ、３回洗浄し、二次抗体としてＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＧ抗体を反応させた後に３回洗浄し、ジアミノベンジジン発色液で発色させ、波長４９２ｎｍで吸光度を測定してＥＬＩＳＡ試験を実施した。結果としてはハイブリドーマ「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃ」（ＦＥＲＭ Ｐ−２１０６０）の培養上清（ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体Ｈｐｇ８Ｃ1Ｃ）は組換え蛋白ＨＰＣ５．５とは強い反応を示し、組換え蛋白ＨＰＣ５．１とは反応しないことが確認された。
【００４９】
[ＨＩ抗体関連エピトープの解析]
また、上記のようにして得られる各組換え蛋白のＣ型菌ＫＡ株全菌体免疫血清に含まれるＨＩ抗体を吸収する能力を比較した。
【００５０】
従来のワクチン抗原に用いられる不活化全菌体を免疫した場合に誘導されるＨＩ抗体と各組換え蛋白との反応を比較し、ＨＩ関連エピトープを解析するために、ＨＩ抗体吸収試験を実施した。まず、Ｃ型菌ＫＡ株の不活化全菌体をニワトリに免疫して得られたＨＩ抗体価６４０倍の血清を２０倍希釈した。次に上記のようにして得られた５種類の粗精製組換え蛋白１００μＬ（総蛋白量はおよそ０．２ｍｇ）を遠心分離して上清を除きペレットとし、２０倍希釈した血清１００μＬで再浮遊し、３７℃で１時間震盪感作した。これを遠心分離し、吸収操作を５回繰り返した後に遠心上清のＨＩ抗体価を測定した。
その結果、表１に示したようにＨＰＣ５．５が顕著にＨＩ抗体を吸収した成績が得られ、ＭＡｂ Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃが認識するエピトープがＨＩ抗体を強く誘導するエピトープであることが示唆された。
【００５１】
また、各組換え蛋白とアビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌不活化全菌体にＳＤＳを２．０Ｗ／Ｖ％加えて、沸騰水浴中で１００℃５分間熱処理したところ、全ての組換え蛋白において前記の５つのＭＡｂと反応する性質が消失したことから、可溶化抗原とは反応しないことがわかる。つまり図１右側に示したドットブロットの結果で、陽性と判定されていたところがすべて陰性となった。したがって、これら５つのＭＡｂのエピトープが構造依存性のエピトープであることが示唆された。また、前記５つのＭＡｂのエピトープについて、通常の可溶化抗原を用いたウェスタンブロッティングによる解析は不可能であることが確認された。
【００５２】
得られた結果より、ＨＩ抗体を十分に吸収する組換え蛋白ＨＰＣ５．５とこれを発現させるために必要な遺伝子配列ｈｐｃ５．５を特定した。なお、前記ｈｐｃ５．５の塩基配列とＨＰＣ５．５のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。また、ＨＰＣ５．１の塩基配列は配列番号１の塩基配列の５’末端が３３３ｂｐ欠損したものであり、そのアミノ酸配列は配列番号１のＮ末のアミノ酸配列が１１１個欠損したものである。
【００５３】
【表１】
【００５４】
次に本発明の組換え蛋白であるＨＰＣ５．５の特性を以下のようにして調べた。
【００５５】
［組換え蛋白の免疫原性］
ＨＰＣ５．５、ＨＰＣ５．１、各組換え蛋白のＨＩ抗体誘導能と発症防御能を確認するために、鶏発症防御試験を実施した。１ドーズ０．５ｍＬに各粗精製組換え蛋白を６０μｇとＦｒｅｕｎｄ’ｓ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｄｉｆｃｏ社）を５０％含む試作ワクチンを作製し、各群８羽の５週齢ＳＰＦ鶏の脚部筋肉内に注射した。また、対照群として遺伝子断片を挿入していないプラスミドによって形質転換した大腸菌の菌対破砕液を接種した群を設けた。免疫前と免疫後４週目に採血しＨＩ抗体価を測定した。４週目の採血直後にアビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌ＫＡ株を１．１×１０8ＣＦＵを含む菌液０．２ｍＬを鼻腔内投与によって攻撃し、１週間臨床観察した。結果は表２に示したように対照群以外の２群にＨＩ抗体価の上昇が認められ、群毎の幾何平均値はＨＰＣ５．５接種群が比較的高かった。また強毒株を鼻腔内へ攻撃した後に、対照群の鶏は全羽発症し鼻汁の漏出や顔面の腫脹、流涙という伝染性コリーザの典型的な症状を示した。発症防御率はＨＰＣ５．５免疫群が最も高く１００％の防御能を示し、ワクチン抗原として最も適していることが示され、リコンビナントワクチンに応用可能な組換え蛋白であることがわかる。なお、表２のＨＩ抗体価は各群８羽の幾何平均値を示す。
【００５６】
【表２】
【００５７】
［組換え蛋白の安全性］
ＨＰＣ５．５とＣ型菌ＫＡ株不活化全菌体の安全性を比較するために、オイルアジュバントとＦｒｅｕｎｄ’ｓ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｄｉｆｃｏ社）を５０％含む２つの試作ワクチンを各群１０羽の鶏の脚部筋肉内に０．５ｍＬ接種して注射局所の腫脹度を観察した。ＨＰＣ５．５を含む試作ワクチンは、上記の免疫原性試験と同一のものを用いた。また該Ｃ型菌不活化全菌体を含む試作ワクチンは、抗原以外はＨＰＣ５．５試作ワクチンと同一の組成とし、不活化全菌体抗原は０．５×１０8ＣＦＵ／ドーズとした。この抗原量は市販ワクチン中に含まれる通常の量よりやや少ない量である。接種後７日目から３５日目までの注射局所の腫脹度をスコア化して記録した。以下にスコアの基準を示す。０．５＝肉眼所見で腫脹は認めないが、触診によりわずかな腫脹を認める。１．０＝肉眼所見で腫脹が認められ、触診で明らかな腫脹を認める。２．０＝肉眼所見で明らかな腫脹を認め、触診では重度な腫脹を認める。臨床症状において跛行を認める。３．０＝肉眼所見で重度の腫脹を認め、触診ではピンポン球のような腫脹を呈し、臨床症状において重度の跛行を認める。結果は図３に示した。図３はスコア値を群毎の平均値として示したグラフであり、不活化全菌体免疫群よりＨＰＣ５．５免疫群が明らかに低く推移し、従来のワクチン抗原よりも安全性が高いことが確認された。
図３の結果から、ＨＰＣ５．５を用いた試作ワクチンの注射局所の腫脹度は、不活化全菌体を用いた試作ワクチンよりも明らかに軽度であることが示され、ＨＰＣ５．５は従来のワクチン抗原である不活化全菌体よりも安全性の高いワクチン抗原であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明を利用してアビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌を原因とする鶏伝染性コリーザのリコンビナントワクチンを開発することができる。このリコンビナントワクチンは、現在市販ワクチンに使用されている不活化全菌体抗原と比較して接種動物の注射局所の副反応が低いという利点を持つ。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、実施例１で得られた遺伝子断片の模式図、およびモノクローナル抗体を用いたイムノドットブロット法による各組換え蛋白の解析の結果を示す図である。
【図２】図２は、粗精製前後の組換え蛋白ＨＰＣ５．５のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を示す。
【図３】図３は、実施例１で得られた組換え蛋白ＨＰＣ５．５とＣ型不活化全菌体の注射局所の腫脹度の比較の結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アビバクテリウム・パラガリナラム（Avibacterium paragallinarum）Ｃ型菌の感染防御抗原である赤血球凝集素（以下「ＨＡ」という。）に存在する免疫原性の高いエピトープをコードする遺伝子領域を特定し組換え蛋白として得ることであり、この蛋白を用いて非ヒト動物、特に鳥類を免疫化する方法に関するものである。菌名はこれまでヘモフィルス・パラガリナラム（Haemophilus paragallinarum）と呼ばれていたが、Ｂｌａｃｋａｌｌらが再分類し、アビバクテリウム・パラガリナルム（Avibacterium paragallinarum）と呼ぶことを提唱し正式名称となっている。(例えば、非特許文献１を参照。)
【背景技術】
【０００２】
アビバクテリウム・パラガリナラムは、伝染性コリーザと呼ばれる家禽の呼吸器伝染病の原因菌である。症状は鼻汁の漏出、顔面の腫脹、流涙等であり致死率は低いが、他の感染症を併発した場合には重症化する。養鶏産業においては産卵開始の遅延、産卵率の低下による大きな経済的損失を引き起こす伝染病である。血清型についてはＰａｇｅが凝集反応に基づいて３つの型が存在することを報告し、それぞれＡ、Ｂ、Ｃ型と呼ばれる（例えば、非特許文献２を参照。）。これらの血清型間の交差免疫が成立しないことがＫｕｍｅらの報告によって明らかにされている（例えば、非特許文献３、４、５、６を参照。）。
【０００３】
アビバクテリウム・パラガリナラム全菌体を鶏に接種すると、赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体の産生が促され、このＨＩ抗体価と防御効果とが相関することから赤血球凝集素（ＨＡ）が重要な防御抗原であると考えられている。Ｋｕｍｅらは、Ａ型菌にはＨＡ−Ｌ（易熱性、トリプシン感受性）、ＨＡ−ＨＬ（易熱性、トリプシン耐性）、ＨＡ−ＨＳ（耐熱性、トリプシン耐性）の３種類のＨＡが存在し、このうち感染防御に関与するのは血清型特異性のあるＨＡ−Ｌのみであることを報告している。ＹａｍａｇｕｃｈｉとＩｒｉｔａｎｉはＡ型菌のＨＡをタイプ１ＨＡ（易熱性、蛋白分解酵素感受性）及びタイプ２ＨＡ（易熱性、蛋白分解酵素耐性）の２種類に分類した（例えば非特許文献７を参照。）。ＫｕｍｅらのＨＡ−Ｌ及びＨＡ−ＨＬは、それぞれＩｒｉｔａｎｉらのタイプ１ＨＡ及びタイプ２ＨＡに相当すると考えられている。Ｃ型菌においては、易熱性、トリプシン感受性のＨＡ抗原が存在し、Ａ型菌とは抗原性が異なるＨＡであることが報告されている（例えば非特許文献８を参照。）。また、ＹａｍａｇｕｃｈｉらはＨＡ性を欠如したＣ型菌変異株の感染防御能が変異前と比較して明らかに低下したことから、Ｃ型菌特異的なＨＡ抗原が病原性と免疫原性に重要な役割を果たしていることを報告している（例えば非特許文献９を参照。）。このようにアビバクテリウム・パラガリナラムの感染防御抗原はＨＡがその重要な役割を担うことが報告されている。
【０００４】
アビバクテリウム・パラガリナラムＡ型菌のＨＡ遺伝子のクローニングについては、Ｔａｋａｇｉらがヘモフィルス・パラガリナラム（Haemophilus paragallinarum）Ａ型菌（アビバクテリウム・パラガリナラムと同じ）２２１株のゲノムＤＮＡから２．５７キロベースペア（以下「ｋｂｐ」と記す。）の遺伝子断片をクローニングし、この組換え大腸菌が弱い防御活性を持つことを報告したが、塩基配列が報告されていないために詳細は不明である(例えば非特許文献１０を参照。)。Ｈｏｂｂらは、Ｔａｋａｇｉらが作製したモノクローナル抗体（以下「ＭＡｂ」と記す。）を用いてＡ型菌５株、Ｂ型菌２株、Ｃ型菌４株、計１１株から１ｋｂｐ程の遺伝子断片をクローニングし遺伝子配列を解析したが、それらの蛋白の免疫原性は確認していない（例えば非特許文献１１を参照。）。Ｔｏｋｕｎａｇａらはアビバクテリウム・パラガリナラムＡ型菌２２１株のゲノムＤＮＡから８，９３０ベースペア（以下「ｂｐ」と記す。）の遺伝子断片をクローニングし、その塩基配列を報告している（例えば特許文献１を参照。）。この遺伝子断片には６．１ｋｂｐのＯＲＦが含まれ、このＯＲＦ中に含まれる３．５ｋｂｐの遺伝子断片と４．１ｋｂｐの遺伝子断片を挿入した組換え大腸菌の菌体破砕液をそれぞれ１０羽の鶏に免疫した各１０羽の鶏のうち７羽が攻撃に対して防御したことを報告した。山元らは、ヘモフィルス・パラガリナラムＡ型菌２２１株のゲノムＤＮＡから２，０１６ｂｐのＨＰＡ２．０をクローニングし、この遺伝子断片から作製した組換え蛋白を免疫した１０羽の鶏のうち１０羽が攻撃に対して発症防御を示したことを報告している（例えば特許文献３を参照。）。
【０００５】
アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌のＨＡ遺伝子のクローニングについては、Ｔｏｋｕｎａｇａらが、ヘモフィルス・パラガリナラムＣ型菌５３−４７株のゲノムＤＮＡから１３．５ｋｂｐの遺伝子断片をクローニングし，そのうちの７，４８６ｂｐの遺伝子配列を解析した。この遺伝子領域内に２，０３９アミノ酸からなるＯＲＦが存在し、このＯＲＦがＡ型菌の２，０４２アミノ酸からなるＯＲＦと遺伝子間相同性がおよそ８０％であったことを報告した（例えば特許文献２を参照。）。また、このＯＲＦ全長を発現した組換え蛋白が精製抗原を免疫して得られたＨＩ活性を有する抗モルモット血清と反応したことを報告している。しかし、この組換え蛋白の鶏に対する免疫原性は確認されていない。
【０００６】
上記のようにアビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌のＨＡをコードする遺伝子に関係した報告があるが、リコンビナントワクチンの抗原に応用可能な免疫原性を有する組換え蛋白とそれをコードする遺伝子領域は未知である。
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６，９１９，０８０号 Ｂ２ 明細書
【特許文献２】特開２００４−５７０７８号公報
【特許文献３】特開２００５−２１８４１４号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００５，５５，ｐ３５３−３６２
【非特許文献２】Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｃｈ， １９６２， ２３， ｐ８５−９５
【非特許文献３】Ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅａｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９７８， ４０， ｐ６５−７３
【非特許文献４】Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９８０， ４１， ｐ９７−１００
【非特許文献５】Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９８０， ４１， ｐ７５７−７６０
【非特許文献６】Ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅａｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８０， ４２， ｐ６７３−６８０
【非特許文献７】Ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅａｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８０， ４２， ｐ７０９−７１１
【非特許文献８】Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９８２， ４３， ｐ１３１１−１３１４
【非特許文献９】Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， １９９３， ３７， ｐ９７０−９７６
【非特許文献１０】Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９１， ５３（５），ｐ９１７−９２０
【非特許文献１１】Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００２， １４８， ｐ２１７１−２１７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
アビバクテリウム・パラガリナラム不活化全菌体を用いたワクチンは注射局所の腫脹等の一過性の副作用が生じる場合があり、養鶏産業の生産性に悪影響を及ぼすことから、副作用の少ないワクチンが望まれている。その解決策の１つとしてリコンビナントワクチンの開発が容易に思いつくが、その主成分となる組換え抗原を作製するために必要な遺伝子配列もしくはアミノ酸配列については、Ａ型菌ではいくつかの報告があるものの、Ｃ型菌については報告されていない。本菌は血清型間に交差性が認められないことから、組換え抗原はそれぞれの血清型について開発する必要があり、Ａ型菌の知見は殆ど参考にならない。さらに、実用性の面から１回の接種で免疫を付与することができる強い免疫原性を有する組換え蛋白の開発が望まれている。
したがって、本発明の課題は、アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌に対して、有効でかつ安全性に優れた免疫化抗原である蛋白、および該蛋白を用いた非ヒト動物の免疫化方法を提供することにある。また、前記蛋白を調製するのに好適に使用されるモノクローナル抗体、及びハイブリドーマを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者はこれらの課題を解決するために種々の検討を行った結果、１回接種で十分な免疫を付与する組換え蛋白をコードする遺伝子領域を特定してリコンビナントワクチンに応用可能な組換え蛋白を作出するに至った。すなわち、配列番号１で示された塩基配列またはアミノ酸配列から作製され、かつ受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２１０６０であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体(ＭＡｂ)Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃと反応し、抗アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌不活化全菌体免疫血清に含まれる血清型特異的赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体を吸収することを特徴とする組換え蛋白である。
【００１０】
本発明の第二は、配列番号１で示された塩基配列またはアミノ酸配列から作製され、かつ受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２１０６０であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体(ＭＡｂ)Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃと反応し、抗アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌不活化全菌体免疫血清に含まれる血清型特異的赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体を吸収することを特徴とする組換え蛋白を、非ヒト動物に投与することを特徴とする非ヒト動物の免疫化方法である。非ヒト動物は鳥類であることが好ましい。
【００１１】
本発明の第三は、上記モノクローナル抗体を産生する受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２１０６０であるハイブリドーマＨｐｇ８Ｃ１Ｃとこれにより産生されるモノクローナル抗体である。本モノクローナル抗体を用いることによって、上記配列番号１に示した組換え蛋白に含まれるエピトープの特定が可能となり、組換え蛋白の免疫原性を確認することができる。本モノクローナル抗体はアビバクテリウム・パラガリナラムＡ型菌とは反応せずＣ型菌に特異的に反応し、高いＨＩ活性を有し、アビバクテリウム・パラガリナラムＡ型菌には反応せずＣ型菌と特異的に反応し、可溶化（２％ＳＤＳ存在下で１００℃５分感作）抗原とは反応せず、高いＨＩ活性を有し、塩基配列とアミノ酸配列を配列番号１に示した組換え蛋白ＨＰＣ５．５と反応し、かつ配列番号１の塩基配列の５’末端が３３３ｂｐもしくはＮ末のアミノ酸配列が１１１個欠損したＨＰＣ５．１とは反応しないという特徴を有する抗体である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の組換え蛋白をワクチン抗原として利用し、この分野における公知の技術を用いてアジュバントと混合してリコンビナントワクチンを作製し、非ヒト動物の筋肉内または皮下に投与して非ヒト動物を免疫化することによってアビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌を原因とする鶏伝染性コリーザを予防する効果が得られる。このリコンビナントワクチン接種による副作用は従来の鶏伝染性コリーザワクチンよりも弱いという利点を有し、例えば、産卵率等の養鶏産業の生産性に寄与することが期待できる。
したがって、本発明は、前記組換え蛋白を筋肉内または皮下投与して鳥類を免疫化する方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の組換え蛋白は、配列番号１で示された塩基配列から作製される、または配列番号１で示されたアミノ酸配列から作製され、かつ受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２１０６０であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃと反応し、抗アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌不活化全菌体免疫血清に含まれる血清型特異的赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体を吸収することを特徴とするものである。
【００１４】
本発明の組換え蛋白は、ＭＡｂ Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃと反応し、抗アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌不活化全菌体免疫血清に含まれるＨＩ抗体を吸収する物性を有するものであれば、前記配列番号１で示された塩基配列において１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加されていてもよく、前記配列番号１で示されたアミノ酸配列においても、１もしくは数個のアミノ酸配列が、欠失、置換もしくは付加されていてもよい。
【００１５】
前記アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌としては、例えば、アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌ＫＡ株が挙げられるが、これは日本国内で分離された株であり、株式会社微生物化学研究所が製造販売する伝染性コリーザワクチンに用いられている菌株である。本発明においては、前記アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌は、微生物学的に同一のものであればよく、株名等は特に限定されるものではない。
【００１６】
本発明で使用されるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃは、アビバクテリウム・パラガリナラムＡ型菌には反応せずＣ型菌と特異的に反応し、可溶化（２％ＳＤＳ存在下で１００℃５分感作）抗原とは反応せず、高いＨＩ活性を有し、塩基配列とアミノ酸配列を配列番号１に示した組換え蛋白ＨＰＣ５．５と反応し、かつ配列番号１の塩基配列の５’末端が３３３ｂｐもしくはＮ末のアミノ酸配列が１１１個欠損したＨＰＣ５．１とは反応しないという特徴を有する抗体である。本発明においてはこのＭＡｂ Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃとの反応性を見ることで所望の組換え蛋白を効率的に選択することができる。なお、ＭＡｂは以下のようにして作製することができる。
【００１７】
ＭＡｂは例えば、免疫材料としてアビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌不活化全菌体を常法に従って動物に接種するかまたは動物細胞と接触させてインビボまたはインビトロで免疫化することで抗体産生細胞を得、この抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させて得られるハイブリドーマの培養上清を得ることで製造することができる。または、ヌードマウスやプリスタンを投与したマウスの腹腔内にハイブリドーマを接種し、腹水を採取して精製することによっても製造することができる。ＭＡｂのスクリーニングは前記ハイブリドーマの培養上清を試料としてＨＩ抗体価測定によって行う。実施例に示すように、組換え蛋白ＨＰＣ５．５とＨＰＣ５．１を用いたＥＬＩＳＡ試験を併用することによってより効率的なスクリーニングが可能となる。ＭＡｂの特異性は、Ａ型菌ＨＡ抗原を用いたＨＩ試験においてＨＩ活性を示さず、イムノドットブロット法でＡ型菌と反応しないこと、２％ＳＤＳ存在下で１００℃５分感作して可溶化処理した抗原とは反応しないことによって確認される。ＨＩ試験とイムノドットブロット法は後述の実施例に記載の方法を用いて実施することができる。
【００１８】
前記抗体産生細胞の由来は、特に限定されず、マウス、ラット、ウマ、ウサギ等の動物の脾細胞の中から、ミエローマとの適合性等を考慮して適宜選択して用いることができるが、好ましくはマウス由来の脾細胞である。
【００１９】
前記抗体産生細胞と融合されるミエローマ細胞としては、マウス、ラット、ウマ、ヤギ、ウサギ等に由来するものが挙げられる。好ましくは前記抗体産生細胞と同種の動物に由来するものであることが望ましい。例えば、抗体産生細胞がマウスの脾細胞に由来する場合、その融合の相手としては、マウスから得られた骨髄腫株化細胞等のミエローマ細胞を用いることが好ましい。なお、前記抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、公知の方法、例えば、Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７（１９７５）に記載の方法、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７，５１２２−５１２６（１９８１）に記載の方法またはこれらに準ずる方法によって行うことができる。抗体産生細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体産生能および増殖能を獲得したハイブリドーマの選択は、通常の選択用培地を用いる培養によって行うことができる。
【００２０】
上記の方法で得られるハイブリドーマのうち、アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌に特異的な高いＨＩ活性を有し、塩基配列とアミノ酸配列を配列番号１に示した組換え蛋白ＨＰＣ５．５と反応し、かつ配列番号１の塩基配列の５’末端が３３３ｂｐもしくはＮ末のアミノ酸配列が１１１個欠損したＨＰＣ５．１とは反応しないＭＡｂ Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃを産生するハイブリドーマ「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃ」を平成１８年１０月１１日付けにて独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託し、受託番号「ＦＥＲＭ Ｐ−２１０６０」が付されている。本発明では、この受託番号が付されたハイブリドーマを用いることで、ＭＡｂ Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃを効率よく得ることができる。
【００２１】
また、本発明の組換え蛋白は、抗アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌不活化全菌体免疫血清に含まれる血清型特異的赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体を吸収する。
【００２２】
前記抗アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌不活化全菌体免疫血清は、非ヒト動物、例えばニワトリ、モルモット、ウサギ、マウス、ラット等をＣ型菌不活化全菌体で免疫して得られた抗血清であればよく、動物種や菌株を特に限定するものではない。また、本発明の組換え蛋白が前記ＨＩ抗体を吸収することは、後述の実施例に記載の方法に準じて確認することができる。
【００２３】
前記特徴を有する本発明の組換え蛋白は、例えば、前記ＭＡｂのエピトープをコードするゲノムＤＮＡのスクリーニングを行った後、免疫原性の確認等して組換え蛋白を特定することで調製することができる。各工程を以下に説明する。
【００２４】
[ＭＡｂのエピトープをコードするゲノムＤＮＡのスクリーニング]
抗体スクリーニングが可能なラムダファージベクターに、制限酵素処理によって断片化したゲノムＤＮＡ断片を挿入して、ゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、プラーク上に発現させた組換え蛋白をＭＡｂを用いてスクリーニングを行う。ゲノムＤＮＡの制限酵素処理は、５〜１０ｋｂｐのサイズの断片が多く含まれるように調整することが好ましく、５×１０6個ほどのプラークをスクリーニングして陽性クローンが得られない場合には、ゲノムＤＮＡライブラリーを再度作製してスクリーニングを行う。
【００２５】
[組換え蛋白の特定]
図１に示したように、様々な長さのゲノムＤＮＡ断片を大腸菌発現系のプラスミドにサブクローニングして組換え大腸菌を作製し、組換え蛋白を発現させ、分離精製して、ＭＡｂとの反応をイムノドットブロット法で解析する。また、アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌不活化全菌体に対するＨＩ抗体価が６４０倍ほどの抗血清（ポリクローナル抗体）を用意し、各組換え蛋白と反応させた後に遠心除去し、組換え蛋白のＨＩ抗体吸収能を測定する。表１のＨＰＣ５．５のように吸収操作によって６４０倍の抗体価を２０倍に低下させるＨＩ抗体吸収能を有し、かつ多くのＭＡｂと反応する組換え蛋白を選択する。ポリクローナル抗体は、アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌不活化全菌体を接種した動物から得られる免疫血清であればよく、不活性化方法、動物の種類や免疫血清の採取方法等について特に限定はない。
【００２６】
[組換え蛋白の免疫原性の確認]
ワクチン抗原としての有効性を確認する為に、前記の組換え蛋白に適当なアジュバントを加えた試作ワクチンを作製して鶏に免疫する。免疫前と免疫４週後にＨＩ抗体価を測定し、免疫４週後にアビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌の強毒株を鼻腔内に接種して攻撃する。ＨＩ抗体価が免疫前と比較して上昇していることと、組換え蛋白免疫群の発症防御率が１００％であることを確認する。また抗原の安全性を確認するために、不活化全菌体抗原と組換え蛋白を用いた試作ワクチンを作製し、鶏に免疫してその注射局所における副反応を観察し比較して、組換え抗原の安全性が不活化全菌体抗原よりも優れていることを確認する。
【００２７】
[組換え蛋白の製造]
本発明の組換え蛋白は、例えば、前記配列番号１で示される塩基配列またはその改変塩基配列をプラスミドベクターに挿入し、これを用いて組換え大腸菌を作製し、組換え蛋白の発現を誘導し、組換え蛋白を分離精製することによって本発明の組換え蛋白を大量に得ることができる。分離精製方法としては、公知の方法であれば特に限定はない。なお、得られた組換え蛋白は、前記と同様に免疫原性を確認する。
【００２８】
以上のようにして得られる本発明の組換え蛋白は、非ヒト動物のワクチンとして使用することができる。前記組換え蛋白をワクチン抗原として使用する場合は、常套手段に従って、その有効量を非ヒト動物に皮下または筋肉内に投与して血清型特異的ＨＩ抗体を誘導することで行うことができる。
【００２９】
本発明の組換え蛋白をワクチン抗原として使用する場合、アジュバント等と混合したワクチン組成物とするのが好ましい。
【００３０】
前記ワクチン組成物に用いられるアジュバントとしては、油性アジュバントを含むのが好ましい。油性アジュバントは、ワクチン、特に動物用ワクチンのアジュバントとして好適に用いられている。本発明に用いられる油性アジュバントを用いたオイルワクチンのタイプとしては、任意の油中水（Ｗ／Ｏ）型エマルション、水中油（Ｏ／Ｗ）型エマルション及びＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションが含まれ、これらは重篤な副作用を起こすことなく動物に投与し得る。通常、エマルションは、水、塩水又は緩衝液（例えば、リン酸緩衝食塩水）から形成し得る水相、油相、及び１種以上の乳化剤からなり、公知の方法に従ってこれらの成分を安定なエマルションが得られるように十分に混合する。Ｏ／Ｗ型エマルション又はＷ／Ｏ型エマルションの製造方法は、油相と水相の相対比率及びそれらの正確な性質に関連して、適当なタイプの乳化剤を適切に選択することを含む。乳化剤によって促進され得るエマルションのタイプは、その親水性基と親油性基のバランス、ＨＬＢ値として知られている油と水の相対親和性によって示される。
【００３１】
適当な油の例としては、鉱物、動物、魚または植物由来の任意の代謝性油、精製または化学改質形態の代謝性油を用い得る。
魚由来の油としては、タラ肝油、サメ肝油のような代謝性油を含んでいるもの、スクアレンのような魚油由来のテルペノイド誘導体が挙げられる。動物油の由来としては、牛、豚、鶏等が挙げられる。植物油の例としては、落花生油、大豆油、椰子油、オリーブ油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油、コーン油等が含まれる。
【００３２】
本発明で使用できる乳化剤としては、脂肪酸置換したソルビタン界面活性剤、例えば、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート等、並びにポリオキシエチレンソルビタンのモノエステル及びトリエステルを含む一連の界面活性剤等が挙げられる。
【００３３】
前記ワクチン組成物において、Ｗ／Ｏ型エマルションの連続相中の油成分の量や、水相の量および乳化剤の量は、該ワクチン組成物中に本発明の組換え蛋白が均一に混合できる量であればよく、特に限定はない。
【００３４】
また、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ等の市販のアジュバントに本発明の組換え蛋白を混合して、ワクチン組成物を調製してもよい。
【００３５】
また、前記ワクチン組成物には、免疫化する動物に応じて、他の免疫可能な抗原を含有させてもよい。
【００３６】
前記ワクチン組成物を注射剤とする場合には、無菌の水性または非水性の、溶液剤、懸濁剤および乳濁剤を含有してもよい。水性の溶液剤や懸濁剤には、例えば注射剤用蒸留水および生理食塩水が含まれる。非水性の溶液剤、懸濁剤には、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのような製薬学的に許容されるアルコール類、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルのような界面活性剤が含まれる。このような水性、非水性の組成物はこれらの添加剤以外に湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、分散剤、安定価剤（例えばラクトース）、溶解補助剤（例えばグルタミン酸やアスパラギン酸等）等の補助剤や防腐剤を含有してもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化される。これらはまた無菌の固体組成物として製造し、使用前に無菌水または無菌の注射用溶媒に溶解して使用する形態をとることもできる。
【００３７】
本発明の組換え蛋白の投与量は被検体である非ヒト動物の日齢、体重、投与ルート、アジュバントの種類等によって異なり、これらを考慮して適宜設定されるが、例えば、鶏等の鳥類であれば皮下または筋肉内に通常１０μg〜１００μg、好ましくは３０μg〜６０μgを通常１回投与すれば有効である。したがって公知のワクチンに比べてコスト的に優れ、また、ワクチンによる副作用を引き起こす可能性も低くなるという利点がある。投与量は予防目的やその他の種々の条件によって変動するので、上記投与量範囲より少ない量で十分な場合もある。
【００３８】
本発明の組換え蛋白は、安全で低毒性であるので、非ヒト動物中でも家禽等の鳥類に対して好適に投与することができる。
【実施例】
【００３９】
次に本発明の組換え蛋白の製造方法について詳細に説明する。なお、以下の製造方法は一例であって、本明細書に開示する発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００４０】
実施例１（組換え蛋白の製造）
[アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌に特異的なＨＩ活性を有するモノクローナル抗体および該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製]
アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌(以下Ｃ型菌という)のＨＡをコードする遺伝子を同定するために、該Ｃ型菌ＫＡ株不活化全菌体でマウスを免疫し、常法に従ってＭＡｂを作製した。
【００４１】
Ｃ型菌ＫＡ株不活化全菌体を２×１０9ＣＦＵ／ｍＬとＦｒｅｕｎｄ’ｓ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｄｉｆｃｏ社製）を５０％含むように免疫原を調整し、７週令の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの背部皮下に３週毎に２回、０．１ｍＬ注射した。２回目を注射した３週後に、１×１０8ＣＦＵの不活化Ｃ型菌ＫＡ株を含むＰＢＳをおよそ５０μＬ静脈内注射し、３日後にマウスの脾細胞と骨髄腫細胞を常法に従って融合し、ハイブリドーマを作製した。得られたハイブリドーマの培養上清を該Ｃ型菌ＨＡ抗原を用いたＨＩ試験によってスクリーニングし、限界希釈法によってクローニングした。これを３回繰り返した結果５つのハイブリドーマが得られ、これをあらかじめプリスタンで処理したマウスの腹腔内に接種して腹水を採取し、精製してそれぞれのＭＡｂ Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃ、Ｈｐｇ１１Ｅ１１Ｂ、Ｈｐｇ４Ｇ８Ｂ、Ｈｐｇ２４Ｅ４Ｄ、Ｈｐｇ１０Ｄ１Ａが得られた。モノクローナル抗体の蛋白量１ｍｇあたりのＨＩ抗体価は、ＭＡｂ Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃは４，５７１、Ｈｐｇ１１Ｅ１１Ｂは１，１４３、Ｈｐｇ４Ｇ８Ｂは３，５５６、Ｈｐｇ２４Ｅ４Ｄは３，２００、Ｈｐｇ１０Ｄ１Ａは1,６００であった。免疫グロブリンのアイソタイプは２４Ｅ４Ｄ、１１Ｅ１１Ｂ、１０Ｄ１ＡがＩｇＧ１であり、８Ｃ１Ｃ、４Ｇ８ＢがＩｇＧ２ａであった。
【００４２】
これらのモノクローナル抗体は全てイムノドットブロットとＨＩ試験によってＡ型菌２２１株とは反応せず、かつＣ型菌Ｓ１株、ｍｏｄｅｓｔｏ株と反応することが確認され、Ｃ型菌に特異的であると考えられた。
【００４３】
ＨＩ試験方法は、ＨＡ抗原に「コリーザＡ型ＨＡ抗原ＮＰ」または「コリーザＣ型ＨＡ抗原ＮＰ」（日本ファーマシー株式会社製）を用い、プロトコールに従って実施した。イムノドットブロットはおよそ１００μＬの各株の培養液をＰＶＤＦ膜に染み込ませ、１％ゼラチン加ＴｗｅｅｎＰＢＳでブロッキングし、ＨＲＰ標識したＭＡｂを反応させて発色させた。
【００４４】
また、これら５種の精製ＭＡｂをＨＲＰ標識した抗体を作製し、競合ＥＬＩＳＡ試験を行ったところ、Ｈｐｇ４Ｇ８Ｂと２４Ｅ４Ｄ、１１Ｅ１１Ｂと１０Ｄ１Ａがそれぞれ同じエピトープを認識することが確認され、Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃの場合を加えて少なくとも３つの異なるエピトープの存在が示された。
【００４５】
[ＭＡｂを用いたＨＡ遺伝子のクローニング]
次に、Ｃ型菌ＫＡ株から抽出した染色体遺伝子を制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで５ｋｂ〜１０ｋｂほどの比較的長い遺伝子断片が多く含まれるように部分消化し、「ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｖｅｃｔｏｒ」(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製：Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．)のＢａｍＨＩサイトに連結し、「Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔ」(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製)を用いてインビトロパッケージングを行い、得られた組換えファージを大腸菌に感作させ、寒天平板上にファージプラークを作らせた。このファージプラークをあらかじめＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）をしみ込ませたニトロセルロース膜に転写し、一次スクリーニングに抗Ｃ型菌ＫＡ株免疫ウサギ血清と反応させ、陽性プラークを選択し、二次スクリーニングとして前記の５つのＭＡｂ（Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃ，１１Ｅ１１Ｂ，４Ｇ８Ｂ，２４Ｅ４Ｄ，１０Ｄ１Ａ）を混合した抗体を用いた。
【００４６】
その結果一つのファージクローンが得られ、ＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージ・大腸菌ＸＬＯＬＲシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いてファージミドを作製した。挿入遺伝子配列を解析したところ、およそ４．８ｋｂｐの遺伝子断片であり、ジーンバンクに登録されている配列と比較したところ、Ｔｏｋｕｎａｇａらの報告しているアビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌５３−４７株のＨＡ遺伝子(ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＲ３０３１２６)と９９％以上の高い相同性が認められた。
【００４７】
[大腸菌を用いた組換え蛋白の発現とエピトープ解析]
この挿入遺伝子断片とＴｏｋｕｎａｇａらの配列をもとにＰＣＲプライマーを設計した。具体的には、図１に示したようにｈｐｃ４．８の５’末端領域を延長した５，１５７、５，４９０ｂｐの遺伝子断片ｈｐｃ５．１、ｈｐｃ５．５と、ｈｐｃ５．５の３’末端を欠失させたｈｐｃ３．２とｈｐｃ２．５を作製し、これら５つの遺伝子断片をｐＣｏｌｄIIベクター（タカラバイオ社）に挿入し、大腸菌ＢＬ２１株を形質転換して組換え大腸菌を作出した。各組換え大腸菌から常法により発現させた組換え蛋白は、そのほとんどが不溶性の封入体として発現された。そこで、発現を誘導した組換え大腸菌培養液を遠心、濃縮し、公知の方法によって菌体を破砕し、その遠心沈渣を４％ＴｒｉｔｏｎＸ１００加ＰＢＳで懸濁し、室温で３０分震盪感作後にさらに遠心分離した。得られた沈渣をＰＢＳで再浮遊させ、粗精製組換え蛋白を得た（なお、粗精製前後の組換え蛋白ＨＰＣ５．５の状態を図２に示す）。これらの粗精製組換え蛋白と上記５つのＭＡｂの反応パターンをイムノドットブロット法を用いて解析し、各エピトープをコードする領域を特定した。その結果を図１に示す。イムノドットブロット法は、ＰＶＤＦメンブランに上記の方法で作製した粗精製組換え蛋白およそ８０μgをアプライし、以降は前記の方法で行った。
【００４８】
図１の結果より、ＭＡｂ８Ｃ１Ｃは組換え蛋白ＨＰＣ５．５と反応し、ＨＰＣ５．１とは反応しないことが示され、これらの組換え蛋白を用いることによってより簡便にＭＡｂ８Ｃ１Ｃを選択することが可能になることが判明した。そこで以下の実験を行った。アビバクテリウムＣ型菌のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施しｈｐｃ５．１とｈｐｃ５．５を増幅し、これらを発現用プラスミドベクターｐＣｏｌｄII（タカラバイオ社）に挿入して、宿主大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株を形質転換して組換え大腸菌を作製し、組換え蛋白を誘導して前記の方法で分離精製した。得られた粗精製組換え蛋白を１ウェルあたり３μgＥＬＩＳＡプレートに固相化し、１％ゼラチン加ＴｗｅｅｎＰＢＳでブロッキングした後にハイブリドーマ「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃ」（ＦＥＲＭ Ｐ−２１０６０）の培養上清をサンプルとしてアプライ、３回洗浄し、二次抗体としてＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＧ抗体を反応させた後に３回洗浄し、ジアミノベンジジン発色液で発色させ、波長４９２ｎｍで吸光度を測定してＥＬＩＳＡ試験を実施した。結果としてはハイブリドーマ「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃ」（ＦＥＲＭ Ｐ−２１０６０）の培養上清（ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体Ｈｐｇ８Ｃ1Ｃ）は組換え蛋白ＨＰＣ５．５とは強い反応を示し、組換え蛋白ＨＰＣ５．１とは反応しないことが確認された。
【００４９】
[ＨＩ抗体関連エピトープの解析]
また、上記のようにして得られる各組換え蛋白のＣ型菌ＫＡ株全菌体免疫血清に含まれるＨＩ抗体を吸収する能力を比較した。
【００５０】
従来のワクチン抗原に用いられる不活化全菌体を免疫した場合に誘導されるＨＩ抗体と各組換え蛋白との反応を比較し、ＨＩ関連エピトープを解析するために、ＨＩ抗体吸収試験を実施した。まず、Ｃ型菌ＫＡ株の不活化全菌体をニワトリに免疫して得られたＨＩ抗体価６４０倍の血清を２０倍希釈した。次に上記のようにして得られた５種類の粗精製組換え蛋白１００μＬ（総蛋白量はおよそ０．２ｍｇ）を遠心分離して上清を除きペレットとし、２０倍希釈した血清１００μＬで再浮遊し、３７℃で１時間震盪感作した。これを遠心分離し、吸収操作を５回繰り返した後に遠心上清のＨＩ抗体価を測定した。
その結果、表１に示したようにＨＰＣ５．５が顕著にＨＩ抗体を吸収した成績が得られ、ＭＡｂ Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃが認識するエピトープがＨＩ抗体を強く誘導するエピトープであることが示唆された。
【００５１】
また、各組換え蛋白とアビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌不活化全菌体にＳＤＳを２．０Ｗ／Ｖ％加えて、沸騰水浴中で１００℃５分間熱処理したところ、全ての組換え蛋白において前記の５つのＭＡｂと反応する性質が消失したことから、可溶化抗原とは反応しないことがわかる。つまり図１右側に示したドットブロットの結果で、陽性と判定されていたところがすべて陰性となった。したがって、これら５つのＭＡｂのエピトープが構造依存性のエピトープであることが示唆された。また、前記５つのＭＡｂのエピトープについて、通常の可溶化抗原を用いたウェスタンブロッティングによる解析は不可能であることが確認された。
【００５２】
得られた結果より、ＨＩ抗体を十分に吸収する組換え蛋白ＨＰＣ５．５とこれを発現させるために必要な遺伝子配列ｈｐｃ５．５を特定した。なお、前記ｈｐｃ５．５の塩基配列とＨＰＣ５．５のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。また、ＨＰＣ５．１の塩基配列は配列番号１の塩基配列の５’末端が３３３ｂｐ欠損したものであり、そのアミノ酸配列は配列番号１のＮ末のアミノ酸配列が１１１個欠損したものである。
【００５３】
【表１】
【００５４】
次に本発明の組換え蛋白であるＨＰＣ５．５の特性を以下のようにして調べた。
【００５５】
［組換え蛋白の免疫原性］
ＨＰＣ５．５、ＨＰＣ５．１、各組換え蛋白のＨＩ抗体誘導能と発症防御能を確認するために、鶏発症防御試験を実施した。１ドーズ０．５ｍＬに各粗精製組換え蛋白を６０μｇとＦｒｅｕｎｄ’ｓ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｄｉｆｃｏ社）を５０％含む試作ワクチンを作製し、各群８羽の５週齢ＳＰＦ鶏の脚部筋肉内に注射した。また、対照群として遺伝子断片を挿入していないプラスミドによって形質転換した大腸菌の菌対破砕液を接種した群を設けた。免疫前と免疫後４週目に採血しＨＩ抗体価を測定した。４週目の採血直後にアビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌ＫＡ株を１．１×１０8ＣＦＵを含む菌液０．２ｍＬを鼻腔内投与によって攻撃し、１週間臨床観察した。結果は表２に示したように対照群以外の２群にＨＩ抗体価の上昇が認められ、群毎の幾何平均値はＨＰＣ５．５接種群が比較的高かった。また強毒株を鼻腔内へ攻撃した後に、対照群の鶏は全羽発症し鼻汁の漏出や顔面の腫脹、流涙という伝染性コリーザの典型的な症状を示した。発症防御率はＨＰＣ５．５免疫群が最も高く１００％の防御能を示し、ワクチン抗原として最も適していることが示され、リコンビナントワクチンに応用可能な組換え蛋白であることがわかる。なお、表２のＨＩ抗体価は各群８羽の幾何平均値を示す。
【００５６】
【表２】
【００５７】
［組換え蛋白の安全性］
ＨＰＣ５．５とＣ型菌ＫＡ株不活化全菌体の安全性を比較するために、オイルアジュバントとＦｒｅｕｎｄ’ｓ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｄｉｆｃｏ社）を５０％含む２つの試作ワクチンを各群１０羽の鶏の脚部筋肉内に０．５ｍＬ接種して注射局所の腫脹度を観察した。ＨＰＣ５．５を含む試作ワクチンは、上記の免疫原性試験と同一のものを用いた。また該Ｃ型菌不活化全菌体を含む試作ワクチンは、抗原以外はＨＰＣ５．５試作ワクチンと同一の組成とし、不活化全菌体抗原は０．５×１０8ＣＦＵ／ドーズとした。この抗原量は市販ワクチン中に含まれる通常の量よりやや少ない量である。接種後７日目から３５日目までの注射局所の腫脹度をスコア化して記録した。以下にスコアの基準を示す。０．５＝肉眼所見で腫脹は認めないが、触診によりわずかな腫脹を認める。１．０＝肉眼所見で腫脹が認められ、触診で明らかな腫脹を認める。２．０＝肉眼所見で明らかな腫脹を認め、触診では重度な腫脹を認める。臨床症状において跛行を認める。３．０＝肉眼所見で重度の腫脹を認め、触診ではピンポン球のような腫脹を呈し、臨床症状において重度の跛行を認める。結果は図３に示した。図３はスコア値を群毎の平均値として示したグラフであり、不活化全菌体免疫群よりＨＰＣ５．５免疫群が明らかに低く推移し、従来のワクチン抗原よりも安全性が高いことが確認された。
図３の結果から、ＨＰＣ５．５を用いた試作ワクチンの注射局所の腫脹度は、不活化全菌体を用いた試作ワクチンよりも明らかに軽度であることが示され、ＨＰＣ５．５は従来のワクチン抗原である不活化全菌体よりも安全性の高いワクチン抗原であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明を利用してアビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌を原因とする鶏伝染性コリーザのリコンビナントワクチンを開発することができる。このリコンビナントワクチンは、現在市販ワクチンに使用されている不活化全菌体抗原と比較して接種動物の注射局所の副反応が低いという利点を持つ。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、実施例１で得られた遺伝子断片の模式図、およびモノクローナル抗体を用いたイムノドットブロット法による各組換え蛋白の解析の結果を示す図である。
【図２】図２は、粗精製前後の組換え蛋白ＨＰＣ５．５のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を示す。
【図３】図３は、実施例１で得られた組換え蛋白ＨＰＣ５．５とＣ型不活化全菌体の注射局所の腫脹度の比較の結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示された塩基配列から作製され、かつ受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２１０６０であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体(ＭＡｂ)Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃと反応し、抗アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌不活化全菌体免疫血清に含まれる血清型特異的赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体を吸収することを特徴とする組換え蛋白。
【請求項２】
配列番号１で示されたアミノ酸配列で構成され、かつ受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２１０６０であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体(ＭＡｂ)Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃと反応し、抗アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌不活化全菌体免疫血清に含まれる血清型特異的赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体を吸収することを特徴とする組換え蛋白。
【請求項３】
請求項１または２に記載の組換え蛋白を非ヒト動物の皮下又は筋肉内に投与して血清型特異的ＨＩ抗体を誘導することを特徴とする非ヒト動物の免疫化方法。
【請求項４】
非ヒト動物が鳥類であることを特徴とする請求項３記載の免疫化方法。
【請求項５】
受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２１０６０であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃ。
【請求項６】
受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２１０６０であるハイブリドーマ。
【請求項１】
配列番号１で示された塩基配列から作製され、かつ受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２１０６０であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体(ＭＡｂ)Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃと反応し、抗アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌不活化全菌体免疫血清に含まれる血清型特異的赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体を吸収することを特徴とする組換え蛋白。
【請求項２】
配列番号１で示されたアミノ酸配列で構成され、かつ受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２１０６０であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体(ＭＡｂ)Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃと反応し、抗アビバクテリウム・パラガリナラムＣ型菌不活化全菌体免疫血清に含まれる血清型特異的赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体を吸収することを特徴とする組換え蛋白。
【請求項３】
請求項１または２に記載の組換え蛋白を非ヒト動物の皮下又は筋肉内に投与して血清型特異的ＨＩ抗体を誘導することを特徴とする非ヒト動物の免疫化方法。
【請求項４】
非ヒト動物が鳥類であることを特徴とする請求項３記載の免疫化方法。
【請求項５】
受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２１０６０であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体Ｈｐｇ８Ｃ１Ｃ。
【請求項６】
受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２１０６０であるハイブリドーマ。
【図１】
【図３】
【図２】
【図３】
【図２】
【公開番号】特開２００８−１５６３１７（Ｐ２００８−１５６３１７Ａ）
【公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３４９６８８（Ｐ２００６−３４９６８８）
【出願日】平成１８年１２月２６日（２００６．１２．２６）
【出願人】（５９１１９３３７０）株式会社微生物化学研究所 (14)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月２６日（２００６．１２．２６）
【出願人】（５９１１９３３７０）株式会社微生物化学研究所 (14)
【Ｆターム（参考）】
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