アミロイドβ（Ａｂｅｔａ）の病理学的なアセンブリを標的とするモノクローナル抗体
アミロイドβ（Ａｂｅｔａ）の可溶性オリゴマーと高い特異性で結合する抗体及び当該抗体を利用する方法を本明細書で開示する。当該抗体は、アルツハイマー病（ＡＤ）の脳抽出物とコントロールのヒト脳抽出物とを区別することができる。当該抗体はＡＤ脳切片における内因性のＡｂｅｔａオリゴマーを同定し、そして更に培養海馬細胞上のＡｂｅｔａオリゴマーに対して結合する。当該抗体は内因性Ａｂｅｔａオリゴマー、及び溶液中で生成したＡｂｅｔａオリゴマーを中和する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００４年７月２日に出願された米国特許出願第６０／５８５，３１８号、及び２００４年１０月２５日に出願された米国特許出願第６０／６２１，７７６号の優先権を主張するものである。
【０００２】
政府支援の記述
本明細書中に記載の本発明の一部を、保健社会福祉省の国立衛生研究所からの助成金（助成金番号ＮＩＨＲ０１−ＡＧ１８８７７、ＮＩＨ Ｒ０１−ＡＧ２２５４７、およびＮＩＨ Ｒ０３−ＡＧ２２２３７）を使用して行った。したがって、政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【０００３】
本発明は、生物学および薬物の分野に関する。具体的には、本発明は、神経変性疾患、例えば、限定しないがアルツハイマー病の予防、診断、及び処置に関する。
【背景技術】
【０００４】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、進行性の変性認知症である（Ｔｅｒｒｙ，Ｒ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，ｖｏｌ．３０，ｐｐ．５７２−５８０；Ｃｏｙｌｅ，Ｊ．Ｔ．（１９８７）Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｎ：Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ａｄｅｌｍａｎ Ｇ，ｅｄ），ｐｐ ２９−３１．Ｂｏｓｔｏｎ−Ｂａｓｅｌ−Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）。しかし、その初期段階では、ＡＤは、主に、新たな記憶形成が著しく不可能になることによって発症する（Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２９８，ｐｐ．７８９−７９１）。この具体的なの影響についての根拠は知られていないが、現在、アミロイドβ（Ａβ）由来の神経毒の関与が支持されている。Ａβは、両親媒性ペプチドであり、この豊富さは遺伝子の変異およびＡＤに関連する危険因子により増大する。Ａβから形成する線維は、ＡＤ脳の特徴である、アミロイド斑のコアを構成する。in vitroで生成する類似のフィブリルは培養脳ニューロンにとって致命的である。これらの知見は、著しく創造性に富んだ理論である、最初のアミロイドカスケード仮説についての中心となる論理的根拠をもたらし、この中では、記憶喪失が原線維Ａβにより引き起こされたニューロンの死滅の結果であると提唱されている。
【０００５】
その強力な実験による裏付けおよび直感的な魅力にも関わらず、最初のアミロイドカスケード仮説は、鍵となる所見との矛盾、例えば、認知症とアミロイド斑負荷との間の相関が低いこと、が証明された(Katzman, R. (1988) "Clinical, pathological, and neurochemical changes in dementia: a subgroup with preserved mental status and numerous neocortical plaques" Ann. Neurol., vol. 23, no. 2, pp. 138-144)。特に、最近の研究で、トランスジェニックｈＡＰＰマウスを使用して実施したＡＤワクチン実験が報告されている（Dodart，J.C.et al.(2002) "Immunization reverses memory deficits without reducing brain Abeta burden in Alzheimer's disease model." Nat. Neurosci., vol. 5, pp. 452-457; Kotilinek, L.A. et al. (2002) "Reversible memory loss in a mouse transgenic model of Alzheimer's disease" J. Neurosci., vol. 22, pp. 6331-6335)。これらのマウスにより、発症年齢依存性アミロイド斑、最も重要には、発症年齢依存性記憶機能障害を発症する初期ＡＤの良好なモデルが得られる。マウスをＡβに対するモノクローナル抗体で処置した場合に、以下の２つの驚くべき所見が得られた。（１）ワクチン接種したマウスは記憶喪失の逆転が認められ、２４時間で明らかに回復したこと、（２）プラークレベルは変化しないにもかかわらず、ワクチン接種の認知に対する利点が生じた。このような所見は、アミロイド原線維に起因するニューロン死に依存的な記憶喪失機構と一致しない。
【０００６】
最初の仮説の主な欠点は、Ａβのセルフアセンブリによって形成された非原線維性の（ｎｏｎ−ｆｉｂｒｉｌｌａｒ）神経学的に活性な分子が果たす役割を組み込んだ最新のアミロイドカスケードによって排除されつつある。これらの分子は可溶性Ａβオリゴマーである。オリゴマーは準安定性であり、低濃度のＡβ１−４２により形成する(Lambert, M.P. et al. "Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abetal-42 are potent central nervous system neurotoxins" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 95, pp. 6448-6453)。本質的に、最初のカスケードのミッシングリンクであるＡβオリゴマーは、記憶およびシナプス可塑性についての古典的な実験パラダイムである長期電位（ＬＴＰ）を阻害する。最新のカスケードにおいて、（１）記憶喪失は、ニューロン死前のシナプス不全に起因し、そして（２）シナプス不全は原線維ではなくＡβオリゴマーにより引き起こされる、ということである(Hardy, J. & Selkoe, DJ. (2002) "The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics" Science, vol. 297, pp. 353-356)。最近のレポートによると、可溶性オリゴマーは脳組織内で生じ、そしてＡＤ(Kayed, R. et al. (2003) "Common structure of soluble amyloid oligomers implies common mechanism of pathogenesis" Science, vol. 300, pp. 486-489; Gong, Y. et al. (2003) "Alzheimer's disease-affected brain: presence of oligomeric A[beta] ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 100, pp. 10417-10422)およびｈＡＰＰトランスジェニックマウスＡＤモデル(Kotilinek, L.A. et al. (2002) "Reversible memory loss in a mouse transgenic model of Alzheimer's disease" J. Neurosci., vol. 22, pp. 6331- 6335; Chang, L. et al. (2003) "Femtomole immunodetection of synthetic and endogenous amyloid-[beta] oligomers and its application to Alzheimer's Disease drug candidate screening" J. MoI. Neurosci., vol. 20, pp. 305-313)で著しく上昇することが証明されている。
【０００７】
アルツハイマー病のアミロイドベータ免疫療法は、ＡＤのマウスモデル及び髄膜脳炎に罹患しにくいヒトの患者において初期成功を収めている。本明細書では、可溶性Ａβオリゴマー（ＡＤＤＬ）に対するモノクローナル抗体を開示する、当該抗体は、ＡＤのヒト脳抽出物とコントロールのヒト脳抽出物とを区別する。当該抗体は、ＡＤ脳スライス内の内因性オリゴマーを同定し、そして更に培養海馬細胞と結合する。当該抗体は、溶液の内因性ＡＤＤＬと「合成」ＡＤＤＬを中和する。いわゆる「合成」ＡＤＤＬは、精製アミロイドβ１−４２を、ＡＤＤＬを生成する条件下で混合することによりin vitroで生成される（米国特許第６，２１８，５０６号を参照のこと）。当該抗体の１つである２０Ｃ２は、３〜２４量体についての高い選択性を示すが、モノマーであるＡβペプチドは最小限しか検出しない。２０Ｃ２によるＡＤＤＬの認識は、Ａβ１−４２の線形配列を包含する短いペプチドによって、又はＡβ１−４０によっては阻止されない。しかしながら、結合はＡβ１−２８により阻止されたことから、高次構造的に独特な構造に基づいたエピトープもＡβ１−２８により到達したことが示唆される。
【０００８】
ＡＤは、現在治療法がない致死性の進行性認知症である。当該疾患の分子基盤は確立されておらず、多数の証拠が、４２アミノ酸のペプチドアミロイドベータ（Ａβ）に由来する神経毒が関与するタンパク質異常症(proteinopathy)であることを示している。疾患の進行を説明するための主要な「アミロイドカスケード仮説」の最近の改訂によると、小さな可溶性Ａβオリゴマーは、プラークのコアを構成するより大きなＡβフィブリルと同様に病原性であることが主張されている(Hardy, J. & Selkoe, DJ. (2002) "The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics" Science, vol. 297, pp. 353-356)。
【０００９】
近年の研究によると、小さな可溶性Ａβオリゴマー（Ａβ由来拡散性リガンド又はＡＤＤＬとも称される）がＡＤ脳に存在しており、コントロールの被験者よりも最大７０倍増大することが証明されている(Gong, Y. et al. (2003) "Alzheimer's disease-affected brain: Presence of oligomeric A[beta] ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 100, pp. 10417-10422)。ＡＤ脳にＡＤＤＬが非常に大量に存在することは、それらが治療薬又はワクチンにとって可能性があることを示唆している。ワクチンの初期の臨床試験により、当該ワクチンに対し力強い免疫反応を起こす人が認知に関する利益を示したことが明らかとなった(Hock, C. et al. (2003) "Antibodies against beta-amyloid slow cognitive decline in Alzheimer's disease" Neuron, vol. 38, pp. 547-554)。これらの所見は、当該試験の一部の初期の終結が引き起こしたＣＮＳ炎症が許容できない頻度であったにも関わらず、、真の治療的確約を示している(Birmingham, K. & Frantz, S. (2002) "Set back to Alzheimer vaccine studies" Nat. Med., vol. 8, pp. 199-200)。
【００１０】
生ワクチンの代わりとして、モノマー又は原線維と結合することなくＡＤＤＬを標的とする治療抗体が開発されている(Klein, W.L. (2002) "A/3 toxicity in Alzheimer's disease: globular oligomers (ADDLs) as new vaccine and drug targets" Neurochem. Int., vol. 41, pp. 345-352)。以前の研究では、ＡＤＤＬが優れた抗原であり、〜５０μｇ／ｍｌという非常に低濃度でウサギ中にオリゴマー選択的ポリクローナル抗体を産生させることが証明されている(Lambert, M.P. et al. (2001) "Vaccination with soluble Abeta oligomers generates toxicity-neutralizing antibodies" J. Neurochem., vol. 79, pp. 595-605)。ｔｇマウスモデル由来の結果も、抗体が記憶力低下を回復に向かわせるのに成功し得ることを示唆している(Dodart, J.C. et al. (2002) "Immunization reverses memory deficits without reducing brain Abeta burden in Alzheimer's disease" Nat. Neurosci., vol. 5, pp. 452-457)。
【００１１】
ＡＤのｔｇマウスを原線維アミロイドベータタンパク質（Ａβ）で免疫化すると、脳のＡβ沈着が低下し、そしてその形成前に投与した場合にはこの病態の形成が予防される(Schenk, D. (2002) Amyloid-beta immunotherapy for Alzheimer's disease: the end of the beginning. Nat. Rev. Neurosci. 3(10):824-8; Schenk, D. et al. (1999) Immunization with amyloid-beta attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse. Nature 400(6740): 173-7)。これらのマウスで生み出される学習及び記憶の欠損は、原線維Ａβを含む調製物による同様の能動的なワクチン接種によっても低下し、又は予防される(Janus, C. et al. (2000) A beta peptide immunization reduces behavioural impairment and plaques in a model of Alzheimer's disease. Nature 408(6815):979-82; Morgan, D. et al. (2000) A beta peptide vaccination prevents memory loss in an animal model of Alzheimer's disease. Nature 408(6815):982-5)。動物モデル由来の結果に基づき、臨床試験が開始され、そしてフェーズ１において多少の有害な反応が示された。しかしながら、フェーズ２の試験は、患者の６％が髄膜脳炎を発症した時点で中止された(Birmingham, K. & Frantz, S. (2002) Set back to Alzheimer vaccine studies. Nat. Med. 8(3): 199-200; Hock, C. et al. (2003) Antibodies against beta-amyloid slow cognitive decline in Alzheimer's disease. Neuron 38(4):547-54; Orgogozo, J.M. et al. (2003) Subacute meningoencephalitis in a subset of patients with AD after Abeta42 immunization. Neurology 61(l):46-54; Schenk, D. (2002) Amyloid-beta immunotherapy for Alzheimer's disease: the end of the beginning. Nat. Rev. Neurosci. 3(10):824-8; Schenk, D. et al. (2004) Current progress in beta-amyloid immunotherapy. Curr. Opin. Immunol. 16(5):599-606)。これらの臨床試験の臨床転帰のレポートによると、プラークを標的とする抗体を産生する患者は、1年後、抗体を産生しなかった患者よりも認知低下の速度が遅かったことが明らかとなった(Hock, C. et al. (2003) Antibodies against beta-amyloid slow cognitive decline in Alzheimer's disease. Neuron 38(4):547- 54)。二人の患者の検視結果上、有効な免疫反応を示唆するミクログリアとともに、新皮質内には全く又はほとんどプラークが見られなかった(Ferrer, I. et al. (2004) Neuropathology and pathogenesis of encephalitis following amyloid-beta immunization in Alzheimer's disease. Brain Pathol 14(1): 11-20; Nicoll, J.A. et al. (2003) Neuropathology of human Alzheimer disease after immunization with amyloid-beta peptide: a case report. Nat. Med. 9(4):448-52)。
【００１２】
治療抗体の使用による炎症反応を回避するための代替的なアプローチが現在開発されている(Agadjanyan, M.G. et al. (2005) Prototype Alzheimer's disease vaccine using the immunodominant B cell epitope from beta-amyloid and promiscuous T cell epitope pan HLA DR-binding peptide. J. Immunol. 174(3): 1580-6; Gelinas, D.S. et al. (2004) Immunotherapy for Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(Suppl 2):14657-62; Morgan, D. & Gitter, B.D. (2004) Evidence supporting a role for anti-Abeta antibodies in the treatment of Alzheimer's disease. Neurobiol. Aging 25(5):605-8; Schenk, D. et al. (2004) Current progress in beta- amyloid immunotherapy. Curr. Opin. Immunol. 16(5):599-606)。Ａβにより生成したモノクローナル抗体による注射は、ＡＤのｔｇマウスモデルの認知の改善をもたらすことが確証されている。エピトープがＡβペプチドの中心を標的とする抗体を用いると、記憶障害が処置後24時間以内にＰＤＡＰＰマウスで逆転しうることが証明されている(Dodart, J.C. et al. (2002) Immunization reverses memory deficits without reducing brain A beta burden in Alzheimer's disease model. Nature Neuroscience 5(5):452-7)。同様に、Ｔｇ２５７６マウスにおいても、ＡβのＮ末端を標的とする抗体を用いた結果、記憶喪失が逆転した(Kotilinek, L.A. et al. (2002) Reversible memory loss in a mouse transgenic model of Alzheimer's disease. J. Neurosci. 22(15):6331-5)。
【００１３】
前もっての受動ワクチン接種は、ＰＤＡＰＰ及び他のｔｇマウスモデルからプラークを取り除くことが証明された(Bacskai, BJ. et al. (2002) Non-Fc-mediated mechanisms are involved in clearance of amyloid-beta in vivo by immunotherapy. J. Neurosci. 22(18):7873-8; Bard, F. et al. (2003) Epitope and isotype specificities of antibodies to beta -amyloid peptide for protection against Alzheimer's disease-like neuropathology. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(4):2023-8; Bard, F. et al. (2000) Peripherally administered antibodies against amyloid beta-peptide enter the central nervous system and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease. Nat. Med. 6(8):916-9; McLaurin, J. et al. (2002) Therapeutically effective antibodies against amyloid-beta peptide target amyloid-beta residues 4-10 and inhibit cytotoxicity and fibrillogenesis. Nature Medicine 8(11): 1263-9)。しかしながら、記憶障害からの回復を示す研究においては、Ａβプラーク断面積比(plaque burden)は低下しなかった。プラーク断面積比の変化無しに認知が改善したことの考えられる説明としては、これらの治療抗体が、ＡＤシナプス不全に関与しているＡβの小さな可溶性オリゴマーを免疫中和するということである(Lacor, P.N. et al. (2004) Synaptic targeting by Alzheimer's-related amyloid beta oligomers. J. Neurosci. 24(45): 10191 -200)。Ａβオリゴマーは、低濃度のＡβ１−４２で形成し、ＬＴＰをブロックし、そして特異的にシナプス終末に結合する(Lacor, P.N. et al. (2004) Synaptic targeting by Alzheimer's-related amyloid beta oligomers. J. Neurosci. 24(45):10191-200; Lambert, M.P. et al. (1998) Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abetal-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(11):6448-53; Wang, H.W. et al. (2002) Soluble oligomers of beta amyloid (1-42) inhibit long-term potentiation, but not long- term depression, in rat dentate gyrus. Brain Res. 924(2): 133-40; Wang, Q. et al. (2004) Block of long-term potentiation by naturally secreted and synthetic amyloid beta-peptide in hippocampal slices is mediated via activation of the kinases c-Jun N-terminal kinase, cyclin-dependent kinase 5, and p38 mitogen-activated protein kinase as well as metabotropic glutamate receptor type 5. J. Neurosci. 24(13):3370-8)。これらのオリゴマー（ＡＤＤＬと称する）は、ＡＤ脳及びＣＳＦ並びにｔｇマウスモデルにおいて増大する(Chang, L. et al. (2003) Femtomole immunodetection of synthetic and endogenous amyloid-beta oligomers and its application to Alzheimer's disease drug candidate screening. J. MoI. Neurosci. 20(3):305-13; Georganopoulou, D.G. et al. (2005) Nanoparticle-based detection in cerebral spinal fluid of a soluble pathogenic biomarker for Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(7):2273-76; Gong, Y. et al. Alzheimer's disease-affected brain: presence of oligomeric A beta ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003 100(18): 10417-22)。
【００１４】
これらのことを考慮すると、オリゴマーは、治療用抗体にとって最適な標的を提供するものである。本発明は、オリゴマー（ＡＤＤＬ）選択性のモノクローナル抗体を得るための必要性について対処するものである。本明細書で開示するアプローチは、抗原として可溶性Ａβオリゴマー（ＡＤＤＬ）を使用するが、これは、それらがポリクローナル抗体の生成において、四次構造依存性のエピトープを提供するのに有用であることが既に証明されたためである。このストラテジーは、ＡＤとコントロールの脳とを識別し、且つ溶液中のオリゴマーを中和するモノクローナル抗体を生成し、治療上有用な抗体にとって必須であると考えられる特徴を有している。
【００１５】
本発明の要約
ある態様において、本発明は、アミロイドβ１−４２の可溶性オリゴマーと結合する抗体を含んで成る。当該オリゴマーはＡＤＤＬであってもよい。当該抗体はモノクローナルであってもよい。当該抗体は選択的にオリゴマー（ＡＤＤＬ）と結合することができ、アミロイドβモノマー又はアミロイド原線維とは結合することができない。上述のとおり、Ａβオリゴマー（ＡＤＤＬ）特異的なエピトープを標的とするモノクローナル抗体の開発及び特徴を本明細書で開示する。かかる抗体は、プラーク結合による干渉を受けることなくＡβオリゴマー（ＡＤＤＬ）を中和することができるヒトワクチンとしての役割を果たすことができる。かかる抗体はまた、そのようなワクチンのプロトタイプとしての役割を果たすことができる。当該ワクチンはヒト化抗体を含むことがある。
【００１６】
別の態様において、本発明は、アミロイドβモノマー又は原線維と結合しないモノクローナル抗体を用いて、アミロイドβ１−４２の可溶性オリゴマーをアッセイする方法を含んで成る。当該アッセイは、定量的又は定性的であり得る。当該発生は、in vitro, in vivo, 又はin vitro且つin vivoであってもよい。当該アッセイは、患者又は対象から単離した試料で実施してもよい。当該アッセイは、オリゴマーに干渉する化合物を検出することができる。当該化合物は、オリゴマーのアセンブリ、オリゴマーの活性、オリゴマーとそれらの受容体との結合、又はそれらの任意な組み合わせに干渉することがある。当該抗体を使用して、オリゴマーの１又は複数の細胞性の受容体を同定することができる。
【００１７】
別の態様において、本発明は、前記オリゴマーと選択的に結合するモノクローナル抗体を含んで成る組成物を含んで成る。当該組成物は、当業者に周知の方法に従い調製され、特徴付けられ、そして使用される医薬組成物であってもよい。当該組成物は、予防的、治療的、あるいは治療的且つ予防的であってもよい。当該組成物は、神経変性疾患を余郷し、又は神経変性疾患を処置するために投与することができる。当該疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認識障害（ＭＣＩ）、ダウン症等でありうる。
【００１８】
詳細な説明
抗体の生成、調製、特徴づけ、及び使用についての一般的な技術は当業者にとって周知である（例えば、Harlow, E. & Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor: N.Y.; Harlow, E. & Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold, Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor: N. Y.; Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor: N. Y.;等を参照のこと）。
【実施例】
【００１９】
抗ＡＤＤＬ抗体
（開発及び特徴づけ）
材料と方法
モノクローナル抗体の開発。免疫化及び融合は、ノースウェスト大学のCore Antibody Facility及びカナダ国ブリティッシュコロンビア州ビクトリアのImmuno-Precise Antibodies, Ltd.にて行った。増殖、スクリーニング、及びサブクローニング（必要に応じて）は、ノースウェスト大学のWilliam Klein博士の研究所にて行った。
【００２０】
ノースウェスタン大学では、既述の通りＡβ１−４２から調製したＦ１２培地中のＡＤＤＬ[22;27]を、完全フロイントアジュバント（初回及び二回目のワクチン接種）又は不完全フロイントアジュバント（その後の全てのワクチン接種）と１：１で混合し、そして３匹のマウスに合計量〜１ｍｌ／マウスで皮下注射（最初の２回の注射）又は腹腔注射した。各注射は、１９４±２５μｇの全タンパク質に相当するＡＤＤＬから構成した。ほぼ3週毎にマウスに注射した。６回注射した後、１匹のマウスが死に、そしてその脾臓を後のプロジェクトのために凍結した。最高の力価の血清を有するマウス由来の脾臓を続いてＳＰ２．０ミエローマ細胞と融合し、そしてこれを６枚の９６穴プレート内にプレーティングした。これらのプレート由来の上清を後述のようにスクリーニングした。最後のマウスは、２ヶ月後に7回目の注射を行い、そして前述の通り融合した。ハイブリドーマ細胞を２０枚の９６穴プレートにプレーティングし、そして３７℃、５％ＣＯ２で生育した。増殖培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２であり、これにＨＡＴ（１ｘ, Sigma）、グルタミン（２ｍＭ）、ハイブリドーマエンハンシングサプリメント（１０％、Sigma）、ＯＰＩ（オキサロ酢酸、プリン、インスリン、０．１％、Sigma）、ＰＭＡ（ホルボールモノアミンアセテート、０．６μｇ／Ｌ、Sigma）、ウシ胎児血清（０．１５％）、及び胎児クローンＩＩ血清（１５％、HyClone）を加えた。これらのプレートをKleinのラボに移し、ここで、上清を以下のようにスクリーニングした。選択したハイブリドーマを広げ、そして後のサブクローニングのために凍結した。２つのハイブリドーマを凍結することなくサブクローニングした。
【００２１】
スクリーニング工程は、最終的に５つのアッセイを利用した：合成ＡＤＤＬを用いた[２７]に記載のドットイムノブロット及びウェスタンイムノブロット、並びに後述のネイティブイムノブロット、並びに後述の、ヒト組織から得た内因性原線維を用いたドットイムノブロット及びウェスタンブロット。これらのアッセイにより、ＡＤＤＬに対する抗体の結合（ドットイムノブロット）及び特定のオリゴマー種に対する親和性（ウェスタンブロット）が試験された。上清は、５ピコモルのＡＤＤＬを用いたドットイムノブロットにより最初に試験した（最初の融合における５７６の上清及び第二の融合における１９２０の上清）。試験でポジティブだったこれらのクローンを更に、１レーン当たり１０〜２０ピコモルでのウェスタンブロットによりスクリーニングした。当該スクリーニングを繰り返し、低ポジティブ又は偽陽性のものを同定した。１０個のウェルを最初のマウスのために広げ、そして４５個のウェルを第二のマウスのために広げ、続いてこれらを凍結又はサブクローニングした。
【００２２】
Immuno-Precise Antibodies, Ltd. （カナダ国ブリティッシュコロンビア州ビクトリア）において、彼等が所有するRapid-Prime法を用いてクローンを生成した。〜０．２５−０．３５ｍＬのＡＤＤＬを用いて２週間にわたり平均０．５０５ｍｇ／ｍｌで動物を免疫化した。続いて、クローンの上清（２８８／プロジェクト）を、上述のようなスクリーニングのためにKleinのラボに送った。
【００２３】
合成及び内因性のＡＤＤＬ及び原線維：合成ＡＤＤＬは［２２；２７]に記載のようにＦ１２中で調製した。合成の原線維は[４０]に従い調製した。内因性のＡＤＤＬは、[１５]に記載のように濃縮段階を省略してＡＤ脳組織から抽出した。内因性の原線維は、同一の調製方法を用いて獲得し、但し、ペレットはその後１時間２％ＳＤＳ／Ｆ１２を用いて１時間インキュベートし、そして２２０，０００ｘｇで１時間遠心した。原線維を含むペレットを、続いてＦ１２中で懸濁し、そして３０〜６０秒間超音波処理して材料をタンパク質濃度の決定のために懸濁した。
【００２４】
ドットイムノブロット及びペプチド競合：ドットブロットによる最初のスクリーニングは、[２７]に従い、ＡＤＤＬ（５ピコモル／ドット）又は原線維（１μｇ／ドット）のいずれかを利用して実施した。競合ドットブロットの場合、ＡＤＤＬは、０．５μＬの容積中種々のピコモル濃度で、２つ１組で、SurfBlot装置由来の鋳型を用い、乾燥したニトロセルロースに適用した。続いてブロットを１５分間乾燥し、１時間ブロッキングし、そしてSurfBlot装置内に挿入した。抗体±ペプチドをウェル中で１．５時間インキュベートし、ドットブロット装置から取り出し、ウェルをブロッキングバッファーで洗浄し、そして膜を当該装置から取り出した。ニトロセルロースを続いて洗浄し、二次抗体で処理し、そして下文で引用する通り可視化した。
【００２５】
イムノブロッティング．ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を[２７]に従い実施し、但し、１０〜２０％トリス−トリシンゲル（ＢｉｏＲａｄ）を用い、そして分離は１２０Ｖで実施した。二次抗体はルーチンに１：４０，０００希釈で使用した。
【００２６】
最初のスクリーニングのために、調製用の１０〜２０％ゲルは、１レーン当たり〜１６−２０ピコモルに等しいサンプルウェル中２．７μｇのＡＤＤＬと一緒に使用した。電気泳動及びトランスファーは上述の通りである。ガイドとしてトラッキング色素を用い、ブロッキングしたニトロセルロースをSurfblot装置内に据え、そして２００μｌのハイブリドーマ上清とブロッキングバッファー（５％脱脂粉乳／ＴＢＳＴ−トリス緩衝溶液とＴｗｅｅｎ２０−［２７］を参照のこと）を２０〜２１個のウェルのそれぞれに添加した。室温で１．５時間インキュベートした後、上清を除去し、そしてウェルをバッファーで洗浄した。膜を続いてSurfblotから取り出し、そして３ｘ１５分間ＴＢＳＴ中で洗浄した。二次抗体を続いて膜と一緒に１時間室温でインキュベートした。洗浄後（３ｘ１５分間）、オリゴマーを半分の強度のSuperSignal(Pierce)で可視化した。ヒトの原線維を用いてのウェスタンイムノブロットを、同じ方法により、各ゲルにつき約６４μｇの調製した材料を用いて実施した。
【００２７】
ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動は、［７］に従い、１２０Ｖで実施した。
【００２８】
免疫細胞化学：免疫細胞化学は［２７］に記載の通り実施し、但し、培養は２１ ＤＩＶで行い、そしてAlexaFluor 488 (Molecular Probes)を使用してマウスＩｇＧを可視化した。ブロッキング実験において、抗体とＡＤＤＬを、１：４のモル比で用いて、海馬細胞培養物に適用する前に１時間室温で予めインキュベートした。
【００２９】
サイズ排除クロマトグラフィー：サイズ排除クロマトグラフィーを［７］の通りに実施した。ストレプトアビジン−ダイナビーズ（５０μｌ、Dynal）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で３０分間４℃でブロッキングした。ビーズをビオチン化した２０Ｃ２（２５０μｌのＰＢＳ中２５μｇ）と一緒に７０分間４℃でインキュベートし、そして３ｘ１０分間１ｍｌのＰＢＳで洗浄した。続いて、ビーズは、抗体と一緒に又は抗体無しで、ＡＤＤＬ（４０μｌ、２５μＭ）と一緒に７０分間４℃でインキュベートし、そして１５，０００ｇで１０分間遠心した。上清のアリコート（３０μｌ）をＳＥＣによりＰＢＳ（０．０６ｍｌ／分）で平衡化Superdex 75 PC 3.2/30カラム上で解析し、そして画分（０．３ｍｌ）を回収した。吸光度を２１５ｎｍでモニタリングした。
【００３０】
免疫組織化学：ＡＤ及びコントロールの海馬由来の、軽く固定して凍結した切片（４％パラホルムアルデヒド中４℃で３０時間、続いてスクロース中で凍結保護。４０μｍ）を、抗体（ＰＢＳ中１：１０００）と一緒に一晩４℃でインキュベートした。抗体の除去後、切片を３回ＰＢＳで洗浄し、そして次に１：５００の適当な二次抗体と一緒に一晩４℃でインキュベートした。切片を３回ＰＢＳですすぎ、そして２時間４度でVector ABCペルオキシダーゼスタンダードキットと一緒にインキュベートした。続いて結合をＤＡＢ（トリスバッファー中０．０５％又は１：５００で２分間）で可視化した。切片をヘマトキシリンで対比染色し、これにpermaslipを乗せ、そしてNikon Eclipse E600光学顕微鏡とSpot Insight デジタルビデオカメラ(v. 3.2)で撮像した。
【００３１】
結果：
オリゴマー特異的モノクローナルスクリーニングストラテジー
モノマー及び／又は原線維の代わりにオリゴマーを認識するクローンを同定するために、最初に、５ピコモルの合成ＡＤＤＬ又は１μｇの内因性ＡＤ原線維を用いたドットイムノブロットにより上清をスクリーニングした（図１）。このスクリーニングに由来するポジティブなもの（〜３０％）を続いてウェスタンイムノブロットにより試験して更に結合種を規定した。ウェスタンブロットにより試験したクローンのうち、〜２％が、低ＡＤＤＬ濃度でオリゴマーと結合し、モノマーには結合しないことが明らかとなった。これらのクローンの多くも、原線維と結合し、そして１つ（２０Ｃ２）が徹底的な特徴づけのために選択された。あるクローン（１Ｈ９）は、トリマー／テトラマー種と比較してより高次のオリゴマー（１２〜２４量体）とよく結合することが明らかとなった。天然の条件下でのみＡＤＤＬと結合する１つのクローン（３Ａ５）が見つかった。原線維と結合し、オリゴマー（３Ａ７、３Ａ９）とは結合しない２つのクローンが見つかった。およそ５０個のクローンが、更なる展開、精製、及び試験のために選択された。
【００３２】
ＡＤ脳とコントロールの脳とを特異的に識別するモノクローナル抗体
抗体が、ヒトＡＤ脳（内因性ＡＤＤＬを含む）の可溶性抽出物とコントロール脳の抽出物とを識別することができるかどうかを決定することが必須の試験であった。合成（ＡＤＤＬ（１ピコモル）及び３つのヒト脳抽出物（０．５μｇ、Ｂｒａａｋｗ及びＣＥＲＡＤで病期分類したもの）をドットイムノブロットでアッセイした。代表的な結果を図２Ａに示す。６Ｅ１０（Ａβ３−８内にエピトープを有する市販の抗体）、２Ｂ４、及び２Ａ１０は、ＡＤ脳抽出物に対し弱い結合を示したが、尚もＡＤ脳とコントロール脳とを識別した。しかしながら、２つのモノクローナル抗体２０Ｃ２及び１１Ｂ５は、ポリクローナル抗体Ｍ７１／２と共に、高度な特異性でＡＤ脳とコントロール脳とを識別した。
【００３３】
ＡＤ脳における２０Ｃ２の免疫反応性
次に２０Ｃ２がヒト脳の切片内の抗原を検出する能力について試験した。固定したＡＤ脳及びコントロール脳を抗体に曝露し、そして次にヘマトキシリンで対比染色した。免疫反応性はＡＤ脳の海馬、嗅内皮質、及び中前頭回で顕著であった（図２Ｂ、中央）。標識部分は変化に富み、プラーク様の領域と血管因子から成る。コントロール脳は２０Ｃ２による染色を示さなかった（図２０Ｂ、左）。更に、興味深い拡散性の標識パターンが、既にポリクローナル抗体で見られているように[２５]、個々のニューロン及び細胞集団の周囲で見られた（ニューロン周囲の標識、図２Ｂ、右側）。ニューロン周囲の標識は、培養物に見られる樹状部位に対してのオリゴマーの結合に類似している。
【００３４】
２０Ｃ２の特異性：ウェスタンイムノブロット及びドットイムノブロット
２０Ｃ−２がＡβ１−４０と結合する能力を続いて試験し、ＡＤＤＬと、ＡＤＤＬ画分をSuperdex 75カラムを用いたＳＥＣにより分離した。これまでに報告されているように、ＳＥＣは２つの主要な画分をもたらし、ピーク１は空隙容量の直後に溶出するものであり、そしてピーク２は１３ｋＤａのマーカー付近で溶出するものである[７；２５]。比較のために、６Ｅ１０とＭ７１／２も試験した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いて銀染色（図３Ａ）又はイムノブロッティング（図３Ｂ）を行った。６Ｅ１０のみが、モノマーとして独占的に移動するＡβ１−４０を認識した。６Ｅ１０はまた、３つ全ての画分においてモノマーのＡβ１−４２の顕著な染色をもたらした。低分子量のピーク２は主にモノマーであった。２０Ｃ２とＭ７１／２は、６Ｅ１０と対照的に、ピーク２においてわずかにうっすらとしたモノマーの染色を示し、そしてピーク１又は分画していないＡＤＤＬにおいては全くモノマーの染色を示さなかった。３つ全ての抗体が、ＡＤＤＬ調製物及びピーク１のトリマー、テトラマー、及び１２〜２４量体と反応を示した。このように、ウェスタンブロットは、２０Ｃ２がモノマーよりもオリゴマーに対し非常に優先的に結合することを示唆している。
【００３５】
オリゴマーについての選択性の評価
特異性の３つの追加試験を実施した。最初に、１０ｎＭのモノマーのＡβ１−４２からのオリゴマーの時間依存的な形成（図３Ｃ及びＤ）をドットイムノブロットで測定した。当初、モノマーが優勢である場合、染色は軽微であった。次の１０分間、オリゴマー化は比較的迅速であり、そして免疫反応性は４００％増大した。Ａβ１−４０モノマーはほとんど検出されなかった（図３Ｃ）。ウェスタンブロットと調和して、ニトロセルロースと結合した変性していない分子のこれらのアッセイは、２０Ｃ２がオリゴマー選択的であることを示唆している。
【００３６】
続いて、免疫沈降を使用して、２０Ｃ２が選択的に溶液中でモノマーよりもＡＤＤＬを選択的に認識するか否かを決定した。磁気Dynabeadを２０Ｃ２と一緒に、又は２０Ｃ２無しでＡＤＤＬとインキュベートし、ビーズと、結合した材料を除去し、そして上清はSuperdex 75カラムを用いて分画した（示さず）。ピーク１で見られたより高分子量の種を、ピーク２と比較して選択的に除去した（７３％対３３％）。ピーク２は低分子量のオリゴマーを含んで成るが、主にモノマーを含んで成る。結果は、モノマーと比較した場合のオリゴマーについての２０Ｃ２の溶液選択性と一致している。
【００３７】
第三に、溶液中でのＡＤＤＬ又はＡβ１−４０についての２０Ｃ２の親和性は、競合アッセイを用いて比較した。２０Ｃ２をＡＤＤＬの量を増やしつつ予めインキュベートし、続いてニトロセルロース上に固定したＡＤＤＬと結合する能力について試験した（図４Ａ）。溶液中のＡＤＤＬは、固定化したＡＤＤＬに対する結合を、３０ｎＭの半阻害濃度(half maximal)で効果的にブロックした（図４Ｂ）。モノマーのＡβ１−４０は、結合をブロッキングするのに有効ではなく、非特異的な会合を示唆する線形の低下を示した。非特異的な会合は、先に見られた低レベルの反応性と一致する（図３Ｃ）。
【００３８】
２０Ｃ２エピトープの高次構造の性質
２０Ｃ２のエピトープを研究するために、Ａβ１−４２の全長を包含する４つの短いペプチド（１−１２，１２−２８，２５−３５，３５−４２）を用いて、競合ドットイムノブロットを最初に実施した。いずれのペプチドもＡＤＤＬに対する２０Ｃ２の結合に対しなんら効果を有さなかったが（図５Ａ）、ＡＤＤＬコントロールは完全に結合をブロックした。続いて、より長いペプチドであるＡβ１−２８及びＡβ１７−４２をアッセイした。ＡＤＤＬに対する２０Ｃ２の結合は、Ａβ１−２８によって完全に阻害された（図５Ｂ）。半阻害濃度は１０ｎＭであり（図５Ｃ）、ＡＤＤＬによる場合よりも若干低かった。ＡＤＤＬはモノマーを含む混合溶液中にあるので、この差異は驚くべきものではない。Ａβ１７−４２はインパクトもなく、任意の組み合わせのペプチドもそうであった。２０Ｃ２とＡβ１−２８とのプレインキュベーションもウェスタンブロットにおいて結合をブロックする（図５Ｄ）。Ａβ１−２８の高次構造エピトープは三次又は四次構造から導くことができる。Ａβ１−２８がダイマーを形成することは既に示唆されており[２８]
そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した場合（図５Ｄ）、我々の調製物は単一のバンドで移動し、これはこのような示唆と一致している。しかしながら、このダイマーはウェスタンブロットにおいて２０Ｃ２により認識されなかった。
【００３９】
細胞に対するＡＤＤＬの結合の免疫中和
ＡＤＤＬは、in vitroで形成したか、ＡＤ脳から得られたかに関係なく、海馬の培養物中のシナプスに結合する[２５]。最後の実験において、２０Ｃ２はこのシナプスの結合を阻害する能力について試験された。ＡＤＤＬは、２０Ｃ２と一緒に、又は２０Ｃ２を用いずに、培養物と６０分間インキュベートされ、そしてＡＤＤＬの結合は免疫蛍光顕微鏡で検出した（図６）。２０Ｃ２無しで、ＡＤＤＬは、これまでに観察されているように[２５；２７]、点状のシナプスパターンと結合した。担体と非二次抗体コントロールは、染色を示さなかった。ＡＤ脳由来（５Ｃ）ＡＤＤＬ及び合成（５Ｄ）ＡＤＤＬの結合は共に２０Ｃ２とのプレインキュベーションによりブロックされた。これらの条件下での２０Ｃ２による結合の阻害は９０％超であった（５Ｅ）。
【００４０】
考察
ＡＤＤＬを使用して、病理学的なＡβのアセンブリを標的とするモノクローナル抗体を生成した。注目の３つの方の抗体が生成した；オリゴマー及び原線維と結合することができるもの；原線維とは結合することができるが、オリゴマーとは結合することができないもの；及び、オリゴマーとは結合することができるが、原線維とは結合することができないもの。第一のクラスが最も一般的であり、そしてこのクラスの１つの特定のクローンを展開し、そして徹底的に特徴付けた（２０Ｃ２）。この抗体は、抽出物及び組織切片中で、コントロール脳をＡＤ脳から識別した。ＡＤＤＬに共通する３Ｄエピトープに由来する識別及びＡβ１−２８のアセンブリはＡβ１−４０及び他の直鎖配列にはなかった。２０Ｃ２によるＡＤＤＬの結合は、それらが海馬の培養物中のシナプスに結合するのを防いだ。従って、２０Ｃ２は病理学的なＡβのアセンブリを選択的に免疫中和する治療用モノクローナル抗体のプロトタイプである。
【００４１】
種々の形態のＡβフラグメント及びアセンブリによる免疫化は、種々の有用な特性を有する抗体を生成させた。短いＮ末端ペプチドは、例えば、本研究で使用する６Ｅ１０[１０]を生成させ、これは全ての形態のＡβと実質的に結合する。Ｃ末端抗原は、Ａβ１−４０をＡβ１−４２と区別するモノクローナル抗体を生成させ、これはそれらを選択的ＥＬＩＳＡにとって有用なものとする[１９；３４]。Kayedらは[２０]最近、金コロイドとカップリングしたＡβ１−４０を使用して、in vitroでオリゴマーと結合するがモノマー又は原線維と結合せず、そして脳の切片において拡散性の初期のプラークと反応するがチオフラビンポジティブな高密度プラークと反応しない抗体を生成させた。ＡＤＤＬ調製物によるワクチン接種で生成したポリクローナル抗体[２７]は、ＡＤ脳組織をコントロールの脳組織から切片及びドットイムノブロット両方で区別し、ＡＤ脳のオリゴマーの性質を特徴づけ、培養細胞上のシナプスに対して結合したＡＤＤＬを同定し、そして抗ＡＤＤＬの創薬のためのリード化合物を同定するのに使用された[２５；２７；４３]。
【００４２】
２０Ｃ２モノクローナル抗体は、ウェスタンブロット及びドットイムノブロットパラダイムにおいてオリゴマー及び原線維を認識するが、モノマーを認識しない点について、ＡＤＤＬにより生成したポリクローナル抗体と似ている。ＡＤ脳の切片において、わずかなニューロン周囲の免疫反応性は明らかであった。この免疫反応性は、仮定では、シナプスに対するオリゴマーの結合に寄与しており、ＡＤにおいて初期に又は前臨床時にさえ生じていると考えられている。ウェスタンブロットにおいて２０Ｃ２により認識された種は、銀染色ではなんら材料は検出されなかったが、より高次オリゴマー（１２〜２４量体）を含んでいた。Ａβ１−４０モノマーは、２０Ｃ２ではイムノブロットにおいて検出されず、Ａβ１−４２もＳＤＳがトランスファーバッファー中に存在しているときには検出されなかった。しかしながら、ＳＤＳ無しに、２０Ｃ２はモノマーの位置に免疫反応性を示した。モノマーの移動は、ビオチン化したＡβ１−４２についてのストレプトアビジン−ＨＲＰアッセイにおいて、ＳＤＳに影響を受けないことが確認された（データは示さない）。いずれか１つの説明又は機構に拘束されることを意図するものではないが、ＳＤＳ無しで、モノマーは移動の間に複合し、そしてオリゴマーを生成すると仮定され、これはＡβが非常に低濃度であっても見られる迅速なオリゴマー化と一致している（図３）。競合実験では、２０Ｃ２が溶液中でモノマーについての最小の親和性を有していることが証明され、これによりＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に伴う不明確さが回避される。
【００４３】
競合的な実験（図５）によると、ＡＤＤＬに対する２０Ｃ２の結合が高次構造の決定因子に依存していることが更に示され、これはＡβ１−４２の抗原性についてのこれまでの示唆と一致している［８］。２０Ｃ２と、ＡＤＤＬ又はＡβ１−２８を含む溶液とのプレインキュベーションは、ドットイムノブロットにおけるＡＤＤＬに対するその後の結合をブロックした。他のペプチド、例えばＡβ１−４０は効果がなかった。エレクトロスプレー質量分析によるＡβ１−２８の解析は、これが、ダイマー、おそらくは他のより高次のオリゴマーを気相で形成することを示唆している［２８］。２つのダイマー構造が、Ａβ１７−２３又はＡβ１７−２８のいずれかのコアのオーバーラップにより、当該データに適合すると仮定された。したがって、２０Ｃ２エピトープは３次元であり、Ａβ１−２８が凝集してダイマーを形成することは、正確なアミノ酸を結合ポケットにアラインさせるのに必要であり、おそらく幾つかはそれぞれの単一ペプチドに由来する。変性したＡβ１−２８は、銀染色で見られるように（図５）、ダイマーと一致する位置に移動する。あるいは、単一のペプチド自体がフォールディングしてアミノ酸を適切な配列中にアラインさせることがあり、一方、より短いペプチドは、完全長のＡβ１−４０と同様にフォールディングすることができない。
【００４４】
Ｎ末端エピトープを有する抗体は、Ｃ末端又は中央のエピトープよりも、ｔｇマウスにおけるプラークのクリアランス［３］、そして原線維形成及び細胞毒性の阻害［２９］に有効であるようである。Ａβ３−６配列（ＥＦＲＨ）に依拠する置換一本鎖抗体は、Ａβの凝集物のin vitroでの形成を抑制し、そしてｔｇマウスにおける脳アミロイド負担の損失をもたらした［１２；３９］。別のＮ末端抗体であるＢＡＭ−１０は、アミロイド斑を減少させずにｔｇマウスにおける記憶障害の回復をもたらした［２４］。当該抗体は、認知障害を引き起こす脳内の可溶性Ａβのアセンブリを中和することで働くと仮定された。中央ドメインＡβ１３−２８に対して生じた第二の抗体Ｍ２６６も、記憶の欠損の回復をもたらした［１０］。当該回復は、脳のＡβ斑を変化させることなくわずか２４時間後に生じた。この抗体はＣＮＳ及び血漿のＡβのクリアランスを変化させるため［３８］。この筆者等は当該抗体がＡβのシンクとして働き、ＣＮＳのクリアランスを引き起こすことを示唆している［９］。
【００４５】
マウスＡＤモデルにおける能動及び受動ワクチン接種の成功は、ＡＤ患者における能動ワクチンの臨床試験へとつながる［３６；３７］。フェーズ２の試験は、患者の６％が髄膜脳炎を発症したことにより中止されたが［１７］［３３］、免疫治療に由来する初期臨床データは有望なものであり、代替のＡβ免疫療法の開発は継続中である［１３］。能動ワクチンは、Ａβのフラグメント、通常はＮ末端又は中央領域からのものから構成される免疫抱合体を、キャリヤータンパク質と連結させて用いて開発されている［３７］。これらの抗原は、Ｔ細胞の反応を開始させる、Ａβ１−４２由来のエピトープを含んでおらず、これにより自己免疫反応が排除されうる。受動ワクチンも開発されており、これは、Ａβに対するＴ細胞の反応を排除するだけでなく、高齢の患者の乏しい免疫反応を回避するという利点を提示する。既に、ＡＤＤＬを標的とする治療用抗体の開発がこのアプローチの有効性を最大限利用しうることが示唆されている［２３］。本発明は、比較的強力なモノクローナル抗体が、免疫原として合成ＡＤＤＬを用いて生成することができること、そして、生じた抗体がＡβの病理学的アセンブリに選択的であることを確証する。当該抗体は更に、ＡＤ脳から得られたＡＤＤＬを免疫中和して、それらが細胞培養アッセイにおいてシナプスに接着することをブロックする。したがって、当該抗体は、ｔｇマウスＡＤモデルにおけるＡＤＤＬの中和の行動学的研究に将来的に使用するのに有望であり、臨床的に価値のある抗体へのステップを提供するものである。
【００４６】
ＡＤＤＬ選択的なモノクローナル抗体はまた、ＡＤの診断に有用である。近年の研究において、ＡＤＤＬ選択的抗体は、ヒトＣＳＦにおいてＡＤＤＬを検出することができるアッセイを開発するためのナノテクノロジーの開発と組み合わされた(Georganopoulou, D. G. et al. (2005) Nanoparticle-based detection in cerebral spinal fluid of a soluble pathogenic biomarker for Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(7):2273-76; Haes, AJ. et al. (2005) Detection of a biomarker for Alzheimer's disease from synthetic and clinical samples using a nanoscale optical biosensor. J. Am. Chem. Soc. 127(7):2264-71)。新規なアッセイは、利用可能な最善のＥＬＩＳＡよりも桁違いに高感度であり、低atmolarのＡＤＤＬ濃度を検出することができる。ＡＤの対象者とコントロールの対象者との間のＣＳＦ ＡＤＤＬレベルの１０倍の違いを示す結果(Georganopoulou, D.G. et al. (2005) Nanoparticle-based detection in cerebral spinal fluid of a soluble pathogenic biomarker for Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(7):2273-76)は、ＡＤＤＬ選択的モノクローナル抗体と組み合わせたナノテクノロジーベースのアッセイが、ＡＤの化学的診断を初めて提供することができることを示唆している。
【００４７】
引用文献
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【００４８】
実施例２
抗ＡＤＤＬモノクローナル抗体
（開発及び特徴づけ）
材料と方法
Ａβ由来ジスルフィドリガンド（ＡＤＤＬ）の調製：ＡＤＤＬは、これまでに公開されているプロトコールに従い調製した(Lambert 1998, 2001; Klein 2002)。American Peptide Co. (Sunnyvale, CA)又はCalifornia Peptide Research, Inc. (Napa, CA)由来のＡβ１−４２は、ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）中に溶解した。ＡＤＤＬを調製するために、Ａβ１−４２のアリコートをニートのＤＭＳＯに溶解して５ｍＭにし、続いて冷たいＦ１２培地に添加して１００μＭにした。この溶液を４℃で２４時間インキュベートし、そして１４，０００ｘｇで１０分間遠心した。上清はＡＤＤＬを含んでいる。
【００４９】
ヒト原線維の調製：凍結したヒトの皮質(NADC grant # AG 13854及びNADC Neuropathology Core)から得た試料を、プロテアーゼ阻害剤(Roche Complete（登録商標）)を含む２０ｘの冷Ｆ１２培地中で１分間ホモジェナイズした。試料を続いて１０，０００ｇで１分間４℃で遠心した。Ｆ１２で２回洗浄した後、ペレットを２％ＳＤＳ／Ｆ１２中で再懸濁し、そして氷上で３０分間インキュベートした。試料を続いて２２０，０００ｇで１時間４℃で遠心した。ペレットを続いて冷Ｆ１２中で再懸濁し、そして１５秒の破壊を繰り返して１分間超音波処理した。タンパク質は、クーマシープラスキットを用いて決定した(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)。
【００５０】
海馬の培養：培養物は、これまでに公開されている手順(Brewer, 1997; Stevens, 1996)に従い、Ｅ１８胚から調製した。生存細胞の数を数え、そしてポリリジン（２００μｇ／ｍｌ）でコーティングしたカバーグラス上に、１．５ｘ１０４〜１０６細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングした。培地は、半分を捨て、そして追加したNeurobasal培地と置き換えることで交換した。
【００５１】
定量免疫細胞化学：培養した海馬細胞を５００ｎＭのＡＤＤＬと一緒に１時間３７℃でインキュベートした。ＡＤＤＬはその後洗浄することで除去し、そして細胞を３．７％ホルムアルデヒドで固定した。細胞を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＢＳ−ＮＧＳ（１０％の普通のヤギ血清を含むＰＢＳ）で３０分間インキュベートし、１回洗浄し、そして所望の一次抗体（ＰＢＳ−ＮＧＳで希釈したもの）で一晩４℃でインキュベートした。試料を続いて洗浄し、そして適切な二次抗体［Alexa Fluor（登録商標） 488又は594抗マウスＩｇＧ及び抗ウサギＩｇＧ(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)］と一緒に２時間３７℃でインキュベートした。カバーガラスを洗浄し、そしてProLong anti-fade mounting medium (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)に乗せ、そしてLeica TCS SP2共焦点スキャナDMRXE7顕微鏡を用いて撮像した。
【００５２】
ウェスタンブロット：試料はネイティブＰＡＧＥ（４〜２０％トリス−ＨＣｌ レディゲル、BioRad）又はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０〜２０％のトリストリシンレディゲル、BioRad）により分離した。続いてタンパク質をニトロセルロースに移した。ブロットは、５％の脱脂粉乳又は１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）で一晩ブロッキングし、そして一次抗体と一緒に１．５時間インキュベートし、洗浄し、そしてＨＲＰコンジュゲート二次抗体(Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ)と一緒に１時間インキュベートした。最後の洗浄をした後、タンパク質をWest Femto chemiluminescence キット(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)及びImage Station 440 CF (Kodak) 又はフィルム(Hyperfilm, Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ)で可視化した。
【００５３】
ＥＬＩＳＡ：ポリクローナル抗ＡＤＤＬ ＩｇＧ(M90/1; Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX)を０．２５ｍｇ／ウェルでImmulon 3 Removawell ストリップ(Dynatech Labs, VA, USA)上に２時間室温でプレーティングし、そして当該ウェルを２％ＢＳＡ／ＴＢＳでブロッキングした。１％ＢＳＡ／ＴＢＳで希釈した試料をウェルに添加し、２時間４℃で結合させ、そしてＢＳＡ／ＴＢＳを用いて室温で３回洗浄した。ＢＳＡ／ＴＢＳで希釈したモノクローナル抗体を９０分間室温でインキュベートし、そしてマウスＩｇＧに対するVectastain ABCキットで検出した。ＨＲＰ標識をBioRadのペルオキシダーゼ基質で可視化し、そしてDynex MRX-TCマイクロプレートリーダー上で４０５ｎｍで読み取った。
【００５４】
アイソタイピング：マウスモノクローナル抗体アイソタイピング試薬を有するSigma Immunotype（登録商標）キットを、取扱説明書に従い使用した(Sigma- Aldrich Co., St. Louis, MO)。
【００５５】
結果及び考察：図７〜１１及び表１（以下）を参照のこと。
【００５６】
結論：ＡＤＤＬは、マウスにおいて強力な免疫原性の反応を誘発する。４つの異なる結合プロファイルを有する抗体は、変性したＡβオリゴマーを認識するものであり、天然のＡβオリゴマーとの選択性に乏しい。これらの抗体は、更に、サイズ排除クロマトグラフィーによって分離されたＡＤＤＬを認識する能力により他のものと区別することができる。これらの抗体により培養細胞の軸索及び細胞体に沿った点と結合したＡＤＤＬが検出された。点はＡＤＤＬであり、そしてＡβモノマー又は大きなオリゴマー種には起因していない。モノクローナル抗体は、ＡＤＤＬ処理した培養細胞に対して異なる結合を示す。複数のアイソタイプのモノクローナル抗体が生成しうる。
【００５７】
【表７】
【００５８】
実施例２の引用文献：
【表８】
【００５９】
実施例３
診断試薬としての抗ＡＤＤＬモノクローナル抗体
抗ＡＤＤＬ抗体、特に、ＡＤＤＬに見られ、アミロイドモノマー又は原線維には見られない高次構造のエピトープに特異的なモノクローナル抗ＡＤＤＬ抗体が、当業者に知られている任意の診断用アッセイ、例えば、限定しないが、タンパク質アッセイ；核酸アッセイ；病理学的アッセイ；ウェスタンブロットアッセイ；ＥＬＩＳＡアッセイ；ＲＩＡアッセイ；ドットブロットアッセイ；疫学的アッセイ；ＡＤＤＬのアセンブリを阻害する化合物を検出するためのアッセイ；ＡＤＤＬが受容体に結合するのを阻害する化合物を検出するためのアッセイ；アルツハイマー病（ＡＤ）、ダウン症、及び軽度認識障害（ＭＣＩ）を予防又は処置する化合物を検出するためのアッセイ；患者又は対象がアルツハイマー病、ダウン症、及び軽度認識障害を有しているか否かを検出するためのアッセイ、等（例えば、Georganopoulou, D. G. et al. (2005) Nanoparticle-based detection in cerebral spinal fluid of a soluble pathogenic biomarker for Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(7):2273-76; 国際特許公報WO 2005/003394; 米国特許6,872,554; 6,866,850; 6,815,175; 6,808,712; 6,787,523; 6,787,144; 6,710,226; 6,710,226; 6,703,015; 6,670,195; 6,582,945; 6,375,949; 6,194,163; 5,786,180; 5,716,619; 5,693,753; 5,693,478; 5,679,531; 5,270,165; 米国特許公開番号2005/0142131; 2005/0129695; 2005/0119227; 2005/0090648; 2005/0053614; 2005/0048049; 2005/0037026; 2005/0031629; 2005/0019343; 2005/0019330; 2005/0013815; 2004/0265308; 2004/0234990; 2004/0228865; 2004/0219146; 2004/0197831; 2004/0192898; 2004/0181042; 2004/0175394; 2004/0170641; 2004/0166119; 2004/0157779; 2004/0081657; 2004/0052766; 2003/0235897; 2003/0157117; 2003/0086938; 2003/0073655; 2002/0182660; 2002/0150948; 2002/0136718; 2002/0102261; 2002/0086847; 2002/0009445等を参照のこと）において使用することができる。
【００６０】
本明細書で開示したモノクローナル抗体は、当業者に知られており、そしてＡＤＤＬの存在について脳の抽出物をアッセイするために本明細書で開示した（図１２を参照のこと）、方法、プロトコール、及び手順に従い使用することができる。このようなアッセイは、病態がない又は軽度(low)の患者が非常に低い検出可能なレベルのＡＤＤＬを有していることを示す。また、病態が重度(high)の患者は、可変レベルの検出可能なＡＤＤＬを有している。最後に、かかるアッセイは、ＡＤ患者が一貫して高レベルの検出可能なＡＤＤＬを有していることを示す。
【００６１】
本明細書で開示したモノクローナル抗体は、当業者に知られており、そしてＡＤＤＬの存在について脳の切片(slice section)（例えば、図１３Ａ−１３Ｄを参照のこと）をアッセイするために本明細書で開示した、方法、プロトコール、及び手順に従い使用することができる。かかるアッセイは、ＡＤＤＬがＡＤの病理に影響を受けている領域に存在していることを示す。ＡＤＤＬは、２つのコントロール中に存在しておらず、そのうち１つはＡＤの病態を有していないものであり、そして１つはＣＥＲＡＤ０、ＢｒａａｋＩである。ＡＤＤＬは病態が「重度」のコントロールの試料−ＣＥＲＡＤ Ａ，ＢｒａａｋＩＩＩ及びＡＤに存在していた。更に、これは病態が「重度」のコントロールの試料よりもＡＤの場合に多く存在していた。このようなアッセイの結果は、可変のＩＨＣパターンを示す：ニューロン周囲、びまん性老人斑様、老人斑様、アミロイド血管症、Ｎｂｍニューロン周囲の標識−これは典型的に老人斑を有する領域ではない。
【００６２】
２９のケースに由来する免疫組織化学的なアッセイ（例えば、図１４、１５及び１６を参照のこと）によると、ＡＤＤＬが見られる脳の領域は、限定しないが、海馬前部の切片：海馬、海馬支脚、前海馬支脚、嗅内皮質、海馬傍回、側頭後頭回(temporooccipital gyrus)、中前頭回が含まれる。ＡＤＤＬは、ニューロン周囲、びまん性老人斑様、老人斑様の沈着について半定量的に評価することができる。このようなアッセイにより、選択したケースと、Ａｂｅｔａ ４Ｇ８及び１２８０ ＩＨＣとを比較することができる（例えば、図１６を参照のこと）。更に、このようなアッセイは、ＡＤＤＬの標識が認知の状態と相関しているか否か、ＡＤＤＬの標識がシナプスの損失の測定に比肩するか否か；ミクログリア細胞の補充／活性化がＡＤ及び／又はＭＣＩへの移行に比肩するか否か、等について研究することを可能にする。
【００６３】
同様のアッセイを６つの認知力が評価されたケースにより実施した。当該アッセイの予備的な結果を図１７及び１８に示す。
【００６４】
このようなＩＨＣアッセイは、以下のように要約することができる情報を提供する：ＡＤＤＬ標識は、局所的な分布及び密度におけるＡＤ病態と相関しており（例外：ニューロン周囲のｎｂｍ標識）、ＡＤＤＬ標識は認知状態と相関しており、そしてヒトの組織の研究はin vitroでの細胞培養及びドットイムノブロットアッセイ研究と相関している。
【００６５】
本明細書で開示したモノクローナル抗体は、当業界で知られており、そして正常及びＡＤと診断された患者又は対象に由来するＣＳＦ試料をアッセイするために本明細書で開示した方法、プロトコール、及び手順に従い使用することができる。ナノテクノロジーを用いた例示的なアッセイ（例えば、Georganopoulou, D. G. et al. (2005) Nanoparticle-based detection in cerebral spinal fluid of a soluble pathogenic biomarker for Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(7):2273-76; 国際特許出願公報WO 2005/003394等を参照のこと）は、図１９に示すようなデータを作り出し、これは、ＡＤを診断する臨床医の助けとなるべく使用することができる。ＣＳＦにおける上昇したＡＤＤＬレベルはＡＤの診断と相関しており、そして当該診断のマーカーとして使用することができる（以下に示す関連の特許公報、特に米国特許出願第10/676,871号及び第10/924,372号並びに国際特許出願PCT/US03/30930も参照のこと）。
【００６６】
本明細書で開示したモノクローナル抗体は、当業界で知られており、そして本明細書のＥＬＩＳＡアッセイで開示した方法、プロトコール、及び手順に従い使用することができる。このようなアッセイは、ＥＬＩＳＡで検出した場合の２６のＤＩＶの海馬細胞培養物に対するＡＤＤＬの結合が濃度依存性であることを示す。
【００６７】
図２０で言及する海馬細胞（２６ＤＩＶ；２０，０００細胞／ウェルでプレーティングしたもの）は９６穴プレートで培養した。非細胞コントロールウェルは培地でプレーティングした。細胞は１時間３７℃で、増殖細胞から回収した培地で希釈した１００ｍｌのＡＤＤＬで処理した。ウェルを３ｘ２００ｍｌの温かいNeurobasal培地及び１ｘ２００ｍｌの１％ＢＳＡ／ＴＢＳ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．８％ＮａＣｌ）でそれぞれ１０分間洗浄した。モノクローナル抗体は、ＢＳＡ／ＴＢＳ中で１：２５００に希釈し、そして１００ｍｌ／ウェルで１時間室温でインキュベートし、続いて４ｘ２００ｍｌのＢＳＡ／ＴＢＳで上述のとおり洗浄し、そして３ｘ２００ｍｌのＴＢＳですすいだ。Bio-Radのペルオキシダーゼ基質（１００ｍｌ）を各ウェルに添加し、１時間室温で展開し、そしてDynex MRXマイクロプレートリーダー上で、４０５ｎｍで読み取った。
【００６８】
本明細書で開示したモノクローナル抗体は、当業界で知られており、そして本明細書の点状の結合（「ホットスポット」）免疫蛍光アッセイにおいて開示した方法、プロトコール、及び手順に従い使用することができる（例えば、図２１、及び下文で言及する関連出願における類似の情報を参照のこと）。
【００６９】
図２１で言及する海馬細胞は３週間ポリリジンコートしたカバーガラス上で生育させた。細胞を１００μＭのＡＤＤＬ、等量のビヒクル、０．５ｍｇ（全タンパク質）の内因性ＡＤＤＬ（脳から抽出したＡＤＤＬ）、又は０．５ｍｇ（全タンパク質）の高齢の対応するコントロール脳抽出物で１時間処理した。細胞を３・７％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで合計１５分間固定し、ＰＢＳですすぎ、そして２Ｂ４抗体（１：５００希釈）、続いてAlexa Fluor 488抗マウス二次抗体(Invitrogen)で免疫標識した。これらの細胞を、Nikon optihot倒立顕微鏡及びMetaMorphソフトウェア(Universal Imaging)を用いて可視化した。画像はMetaMorph及びPhotoshop (Adobe)を用いて処理した。海馬細胞に対して結合する典型的な点状ＡＤＤＬは、２Ｂ４モノクローナル抗体を用いて検出される。かかるアッセイは多数の異なる解析、例えば、限定しないがＡＤＤＬが受容体に結合するのを阻害する化合物の検出及び特徴づけ、等にとって有用である。
【００７０】
関連の特許及び特許出願には、限定しないが、米国特許第6,218,506号；国際特許出願PCT/US98/02426；国際特許公報WO 98/33815；米国特許出願09/369,236；国際特許出願PCT/US00/21458；米国特許出願第09/745,057号；米国特許出願第11/130,566号；米国特許出願第10/166,856号；国際特許出願PCT/US03/19640；米国特許出願第10/676,871号；米国特許出願第10/924,372号；米国特許出願第11/100,212号；米国特許出願第11/142,869号；国際特許出願 PCT/US03/30930；国際特許出願 PCT/US05/17176等が含まれる。
【００７１】
本明細書で言及した特許、特許出願、ならびに任意の他の科学文献および技術文献は、これらが矛盾しない範囲で引用により組み入れられる。
【００７２】
本発明の好ましい実施形態の上記開示は、例示および説明を目的として示している。厳密な形態または開示の形態は網羅的でなく、本発明を制限することを意図しない。意図する特定の用途に合わせる場合に当業者が種々の実施形態および種々の修正形態で本発明を最良に実施することができるようにするために本発明の原理およびこれらの原理の実際の適用を最良に説明するために説明を選択した。意図する特定の用途に適している。本発明の範囲は、明細書によって制限されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】Ａβ１−４２に対するオリゴマー選択的なモノクローナル抗体を開発するために使用したスクリーニング工程の略図。本明細書で詳述した通り、マウスにＡＤＤＬ（〜１９４μｇ／注射／マウス）を３週間毎に６回接種した。これらのマウスの脾臓とＳＰ２細胞との融合から生成したハイブリドーマを９６ウェルプレートにプレーティングし、そして示す通り２種類のドットブロットでスクリーニングした。有望なハイブリドーマをサブクローニングし、そしてポジティブなものを続いて種々のアッセイ、例えばウェスタンブロット、ＡＤ脳由来の抽出物（内因性ＡＤＤＬ含有）のドットブロット、及び免疫細胞化学を用いて検証した。選択した抗体を培養液から回収し、そしてプロテインＧセファロースを用いて更に精製した。
【図２】ＡＤ脳組織とコントロールの脳組織とを識別する選択された抗体。Ａ．合成ＡＤＤＬ（１ｐｍｏｌ）及びヒト脳抽出物／Ｆ１２（ヒトＡＤ脳及びコントロール脳由来；０．５μｇ．方法の項参照）をニトロセルロース上に二回一組でスポットした。ペルオキシダーゼ処理（３％Ｈ２Ｏ２、２０分）及びブロッキングの後、垂直のレーンをそれぞれ指定のモノクローナル抗体又はウサギポリクローナル抗体（Ｍ７１／２）で１時間室温でプローブした。洗浄後、ニトロセルロースは、適切なＨＲＰをコンジュゲートした二次抗体と一緒にインキュベートし；結合した二次抗体を続いてケミルミネセンスで可視化した。注意：２０Ｃ２、１１Ｂ５、及びＭ７１／２はＡＤ脳試料と強固に結合するが、コントロールの脳試料とは結合しない。Ｂ．ａ−ｃ：コントロール（ａ）及びアルツハイマー（ｂ．ｃ）の脳から調製した海馬の切片（４０μｍ）をモノクローナル２０Ｃ２と一緒に一晩４℃でインキュベートした。結合した抗体は、続いて抗ＨＲＰ二次抗体及びＤＡＢを用いて可視化した。続いて試料をヘマトキシリンで対比染色した。オリゴマーはＡＤ脳（ｂ）において広範に見られたが、コントロール脳（ａ）においては見られなかった（２００ｘ）。より高倍率（ｃ）のものは、染色が細胞体をニューロン周囲のパターンで取り囲んでいることを示している（６００ｘ）。
【図３】Ａβペプチドの最小のモノマーを示す２０Ｃ２。Ａβ１−４０、ＡＤＤＬ、及びＳＥＣ[７]で２つのピークに分離したＡＤＤＬは、１０〜２０％トリス−トリシンゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。一方のゲルを銀染色し（Ａ）、他方の試料をニトロセルロースにトランスファーし、続いて６Ｅ１０、２０Ｃ２、及びＭ７１／２でプローブした（Ｂ）。銀染色上では、Ａβ１−４０は、重鎖のモノマーのバンドのみを示した。ＡＤＤＬ及び分離したＡＤＤＬのピークは全て、種々の強度のモノマー、トリマー及びテトラマーのバンドを有している。ウェスタン解析において、６E１０は、４つの試料全てでモノマーのバンドを同定し、ＡＤＤＬ及びピーク１は強いトリマー、テトラマー及び１２〜２４量体のバンドを示し、一方、ピーク２は主にモノマーと、トリマー及びテトラマーとを示した。２０Ｃ２とＭ７１／２は、反対に、ＡＤＤＬ及びピーク１でほとんど又は全くモノマー染色を示さなかったが、６Ｅ１０と同様に強いトリマー、テトラマー、及び１２〜２４量体を示した。ピーク２は、２０Ｃ２及びＭ７１／２で染色すると僅かにモノマー、トリマー、及びテトラマーを示したが、１２〜２４量体は示さなかった。Ａβ１−４０は、２０Ｃ２又はＭ７１／２で認識されなかった。Ｃ及びＤにおいて、モノマー化したＡβ１−４２ペプチドの氷上での凝集は、ドットブロットにより、２０Ｃ２及びウサギポリクローナルＭ９０／１抗体で比較しながらモニタリングした。溶液の等量のアリコート（２０ｆｍｏｌ）を指定した時間でスポットし、そして抗体でプローブした。いずれの抗体も、Ａβ１−４２からＡＤＤＬが時間依存的に形成することを検出した。両抗体はまた、１００倍超高いペプチド濃度であっても、モノマーＡβ１−４０ではほとんどシグナルを示さなかった。Ｄにおいて、ドットブロットの相対的な強度を時間の関数として示す。これらのデータは、モノクローナル２０Ｃ２抗体がオリゴマー特異的であるという更なる証拠となる。
【図４】低濃度の固定化ＡＤＤＬに対する２０Ｃ２の結合をブロックする可溶性ＡＤＤＬと、ブロックしないモノマーのＡβ１−４０。Ａにおいて、ＡＤＤＬは１０ｐｍｏｌ／０．５μｌの濃度でニトロセルロースに適用した。ブロッキングした後、各レーンは、ＡＤＤＬ又はＡβ１−４０のいずれかと一緒に指定の種々の濃度でプレインキュベートした２０Ｃ２と一緒に１．５時間インキュベートした。続いて抗体の結合を抗マウスＨＲＰとのインキュベーション及びケミルミネセンスにより決定した。Kodak Image Station 440を使用してブロットの強度を定量した。次に、これらのデータを、SigmaPlotを用いてペプチド濃度の関数としてプロットした（Ｂ）。溶液のＡＤＤＬは、固定化したＡＤＤＬに対する２０Ｃ２の結合を効果的にブロックするが（半阻害濃度〜３２ｎＭ）、モノマーのＡβ１−４０は、非特異的なブロッキングのみを示す。
【図５】ＡＤＤＬに対する２０Ｃ２の結合をブロックする可溶性ペプチドＡβ１−２８。２０Ｃ２のエピトープを研究するための調査に、Ａβ１−４２の全長を覆う８〜１７アミノ酸の４つの短い直鎖ペプチドとのインキュベーションを用い、抗体が固定化したＡＤＤＬに結合するのをブロックした。試験したペプチドのいずれも、抗体より１００倍超であっても結合をブロッキングしなかった。続いて、２つのより長いペプチドを同様のアッセイにおいて試験した結果、Ａβ１−２８は、単独でも他のペプチドと組み合わせても、優れたブロッキング能を示した（Ｂ）。Ａβ１−２８のブロッキング効力はＡＤＤＬと同様であり、１１ｎＭの推定の半阻害濃度を有していた（Ｃ）。Ａβ１−２８はまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥイムノブロットにおいて、変性したＡＤＤＬに対する２０Ｃ２の結合をブロックした。
【図６】培養細胞に対する内因性ＡＤＤＬ及び合成ＡＤＤＬの結合を中和する２０Ｃ２。３週齢の培養海馬細胞は、内因性ＡＤＤＬ（Ａ）又は合成ＡＤＤＬ（Ｂ）のいずれかを含有するＡＤ脳由来の可溶性抽出物と一緒に６０分間インキュベートした。結合しなかったＡＤＤＬを、温かい培養液で洗浄した後、結合したＡＤＤＬを２０Ｃ２及び抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で同定した（方法の項を参照のこと）。免疫中和について試験するために、上述の培養海馬細胞とのインキュベーション前に、ＡＤＤＬを２０Ｃ２と一緒に１時間３７℃でプレインキュベーションした。洗浄後、抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８を用いて結合抗体を同定した。２０Ｃ２は、内因性ＡＤＤＬ（Ｃ）及び合成ＡＤＤＬ（Ｄ）を含有するＡＤ脳由来の両可溶性抽出物が海馬細胞培養物に対して結合するのをブロックした。新鮮な２０Ｃ２がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の前に細胞に加えられたコントロールのプレートも、ＡＤＤＬ結合を示さなかった。
【図７】ＡＤＤＬにより生成したモノクローナル抗体間の差異を浮き彫りにするスクリーニング方法。２つの異なるプロトコールを用いてマウスにＡＤＤＬを接種した。標準的な５ヶ月の接種期間及び融合方法が、ノースウェスタン大学のCoreAntibody Facilityで採用されたが、Immuno-Precise, Inc. (British Columbia, Canada)は、２週間の接種期間と選りすぐりの選択方法を使用した。ハイブリドーマの上清はその後スクリーニングのために我々に送付された。我々の最初のスクリーニングは、認識分子のために最初にＡＤＤＬを利用し、そして次にＡＤ脳由来の原線維を利用する超高感度ドットブロットアッセイで行った(Lambert, M.P. et al. "Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abetal-42 are potent central nervous system neurotoxins" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 95, pp. 6448-6453)。続いて、ポジティブなウェルは、ウェスタンプロトコールにおいて、変性（左上段）及びネイティブ（右上段）の両条件下でＡＤＤＬを用いてスクリーニングした。最後に、ＡＤ脳由来の原線維をウェスタンプロトコールで用いて（下段）、最終的な選択を決定した。
【図８】選択した抗体間で異なる結合プロファイル。（左上段）合成ＡＤＤＬを２０ｐｍｏｌ／レーンで用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンイムノブロットをハイブリドーマの上清と一緒にインキュベートし、そして適切なＨＲＰ二次抗体及びケミルミネセンスを用いて可視化した。４つのプロファイルを図示する：１：モノマー、低分子量オリゴマー、及び高分子量オリゴマー（２０Ｃ２）；２：小分子量オリゴマー（３Ｂ７）；高分子量の主要な認識（１１Ｂ４）；４：小分子及び高分子量のオリゴマー（２Ｂ４）。コントロールはポリクローナルＡＤＤＬ抗体Ｍ８８／３である。（右側上段）１レーン当たり２０ｐｍｏｌの合成ＡＤＤＬを用いてのネイティブウェスタンイムノブロットを調製した。当該ブロットを続いて５分間煮沸し、その後同一のハイブリドーマ上清で可視化した。上清は、主要な非変性型のＡＤＤＬ種と重要でないものとを認識する能力によって異なる。コントロールは６Ｅ１０モノクローナル抗体である。（下側）１レーン当たり２０ｐｍｏｌの合成ＡＤＤＬを用いてのネイティブウェスタンイムノブロットを煮沸しない点を除いて上述の通り調製した。上清は、主要なより低分子量の種及びより高分子量の種のスメアを認識する。３Ｂ７は非変性型の材料をほとんど認識しない。コントロールは６Ｅ１０である。
【図９】サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分子したＡＤＤＬの検出における差異を示す、ＡＤＤＬにより生成したモノクローナル抗体。サンドイッチＥＬＩＳＡは、捕捉抗体としてＡＤＤＬに対するポリクローナル抗体Ｍ９０を用いて展開した。ＳＥＣピーク１及びピーク２の画分は、セファデックス７５カラム上で分画したＡＤＤＬの２つの主要なピークを指す（潜在的に生体活性なオリゴマーと不活性なオリゴマーとを区別するために、「合成」ＡＤＤＬをゲルろ過クロマトグラフィーにかけ、これにより２つお主要なピークが生成した；非変性ゲル電気泳動により、３７℃で安定な、大きな（５９ｋＤａ超）の凝集物と小さい（３０ｋＤａ未満）の凝集物への分離が確認された）。これらのピークは、クローン上清についての検出物質として別々に使用した。結合はVectastainキットを用いて可視化した。データは、SigmaPlotソフトウェアを用いて定量した。２つのピークの認識の差異は全ての抗体で見られる。例えば、抗体２Ｂ４及び２０Ｃ２についてのピーク１とピーク２との比率を比較する。わずかに１つの抗体が、ピーク２についてのコントロール抗体（６Ｅ１０）の好みを反映している。
【図１０】培養細胞に結合したときにオリゴマーであるＡＤＤＬ。（左側）ＡＤＤＬ及び原線維を含む合成溶液に対して結合する３Ｂ７モノクローナル抗体及びＭ９４ポリクローナル抗体を示すウェスタンイムノブロット。３Ｂ７が原線維、高分子量オリゴマー、及びモノマーと結合しないことに注意すること。（右側）３Ｂ７で検出し、そしてAlexaFluor（登録商標）488抗マウスＩｇＧで可視化した、３週齢の培養海馬細胞と結合したＡＤＤＬのイメージ。３Ｂ７は、原線維又はモノマーを認識しないので、ＡＤＤＬのホットスポット結合はオリゴマーである。
【図１１】ＡＤＤＬ処理した培養細胞に対して異なる結合を示す、ＡＤＤＬにより生成したモノクローナル抗体。Ｅ１８から得た培養海馬細胞は、実施例２で述べた通り３週間生育した。続いて細胞を１時間ＡＤＤＬ（５００ｎＭ）に曝露し、洗浄し、そして固定した。ＡＤＤＬは、指定の抗体で同定し、そしてAlexaFluor（登録商標）488抗マウスＩｇＧで可視化した。抗体は、細胞に対して結合したＡＤＤＬ上の異なるエピトープを認識するようであり、これは、工程上のホットスポット（Ｍ９４、２Ａ１０）から細胞体特異的付着（４Ｅ２）、そして他の中間状態（２Ｄ６、４Ｃ２、２Ｂ４、５Ｆ１０、５Ｇ１２）に及ぶ。
【図１２】ドットブロットイムノアッセイによるヒト脳抽出物におけるＡＤＤＬの相対的定量。
【図１３Ａ】ヒト切片のＡＤＤＬ免疫組織化学（ＩＨＣ）解析。領域分布。２ケース。
【図１３Ｂ】ヒト切片のＡＤＤＬ免疫組織化学（ＩＨＣ）解析。領域分布。２ケース。
【図１３Ｃ】ヒト切片のＡＤＤＬ免疫組織化学（ＩＨＣ）解析。領域分布。２ケース。
【図１３Ｄ】ヒト切片のＡＤＤＬ免疫組織化学（ＩＨＣ）解析。領域分布。２ケース。
【図１４】抗ＡＤＤＬモノクローナル抗体を用いるＩＨＣ解析の要約。
【図１５】ヒト脳切片のＡＤＤＬ免疫組織化学（ＩＨＣ）解析。
【図１６】ヒト脳切片を用いてのＡＤＤＬ ＩＨＣ解析の要約。
【図１７】６つの認識的に評価したケースのＡＤＤＬ ＩＨＣ解析の結果。
【図１８】ヒト脳切片を用いての選択認識的に評価したケースについてのＡＤＤＬ ＩＨＣ解析。
【図１９】多数の正常な対象とＡＤと診断された対象についてのバイオバーコードアッセイから放出したバーコードＤＮＡの検出により生成したデータのスキャッタープロット解析。（例えば、Georganopoulou, D.G. et al. (2005) Nanoparticle-based detection in cerebral spinal fluid of a soluble pathogenic biomarker for Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(7):2273-76を参照のこと）。
【図２０】ＥＬＩＳＡで検出した２６ ＤＩＶ海馬細胞培養に対する、ＡＤＤＬ濃度依存性の結合。培養物をＡＤＤＬと一緒に１時間３７℃でインキュベートし、モノクローナル２Ｂ４又は２０Ｃ２抗体で標識し、そしてＨＲＰ連結抗マウスＩｇＧ二次抗体を用いて検出した。個々の読み取り（白色の記号）、平均（黒色の記号；ｎ＝６）及びＳＥＭ（棒）をプロットする。
【図２１】抗ＡＤＤＬモノクローナル抗体２Ｂ４を用いての点状の結合（「ホットスポット」）免疫蛍光アッセイ。in vitroで調製したＡＤＤＬ及びヒト脳抽出物から単離した内因性ＡＤＤＬを培養海馬細胞に加え、そして２Ｂ４モノクローナル抗体を用いて検出した。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００４年７月２日に出願された米国特許出願第６０／５８５，３１８号、及び２００４年１０月２５日に出願された米国特許出願第６０／６２１，７７６号の優先権を主張するものである。
【０００２】
政府支援の記述
本明細書中に記載の本発明の一部を、保健社会福祉省の国立衛生研究所からの助成金（助成金番号ＮＩＨＲ０１−ＡＧ１８８７７、ＮＩＨ Ｒ０１−ＡＧ２２５４７、およびＮＩＨ Ｒ０３−ＡＧ２２２３７）を使用して行った。したがって、政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【０００３】
本発明は、生物学および薬物の分野に関する。具体的には、本発明は、神経変性疾患、例えば、限定しないがアルツハイマー病の予防、診断、及び処置に関する。
【背景技術】
【０００４】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、進行性の変性認知症である（Ｔｅｒｒｙ，Ｒ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，ｖｏｌ．３０，ｐｐ．５７２−５８０；Ｃｏｙｌｅ，Ｊ．Ｔ．（１９８７）Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｎ：Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ａｄｅｌｍａｎ Ｇ，ｅｄ），ｐｐ ２９−３１．Ｂｏｓｔｏｎ−Ｂａｓｅｌ−Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）。しかし、その初期段階では、ＡＤは、主に、新たな記憶形成が著しく不可能になることによって発症する（Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２９８，ｐｐ．７８９−７９１）。この具体的なの影響についての根拠は知られていないが、現在、アミロイドβ（Ａβ）由来の神経毒の関与が支持されている。Ａβは、両親媒性ペプチドであり、この豊富さは遺伝子の変異およびＡＤに関連する危険因子により増大する。Ａβから形成する線維は、ＡＤ脳の特徴である、アミロイド斑のコアを構成する。in vitroで生成する類似のフィブリルは培養脳ニューロンにとって致命的である。これらの知見は、著しく創造性に富んだ理論である、最初のアミロイドカスケード仮説についての中心となる論理的根拠をもたらし、この中では、記憶喪失が原線維Ａβにより引き起こされたニューロンの死滅の結果であると提唱されている。
【０００５】
その強力な実験による裏付けおよび直感的な魅力にも関わらず、最初のアミロイドカスケード仮説は、鍵となる所見との矛盾、例えば、認知症とアミロイド斑負荷との間の相関が低いこと、が証明された(Katzman, R. (1988) "Clinical, pathological, and neurochemical changes in dementia: a subgroup with preserved mental status and numerous neocortical plaques" Ann. Neurol., vol. 23, no. 2, pp. 138-144)。特に、最近の研究で、トランスジェニックｈＡＰＰマウスを使用して実施したＡＤワクチン実験が報告されている（Dodart，J.C.et al.(2002) "Immunization reverses memory deficits without reducing brain Abeta burden in Alzheimer's disease model." Nat. Neurosci., vol. 5, pp. 452-457; Kotilinek, L.A. et al. (2002) "Reversible memory loss in a mouse transgenic model of Alzheimer's disease" J. Neurosci., vol. 22, pp. 6331-6335)。これらのマウスにより、発症年齢依存性アミロイド斑、最も重要には、発症年齢依存性記憶機能障害を発症する初期ＡＤの良好なモデルが得られる。マウスをＡβに対するモノクローナル抗体で処置した場合に、以下の２つの驚くべき所見が得られた。（１）ワクチン接種したマウスは記憶喪失の逆転が認められ、２４時間で明らかに回復したこと、（２）プラークレベルは変化しないにもかかわらず、ワクチン接種の認知に対する利点が生じた。このような所見は、アミロイド原線維に起因するニューロン死に依存的な記憶喪失機構と一致しない。
【０００６】
最初の仮説の主な欠点は、Ａβのセルフアセンブリによって形成された非原線維性の（ｎｏｎ−ｆｉｂｒｉｌｌａｒ）神経学的に活性な分子が果たす役割を組み込んだ最新のアミロイドカスケードによって排除されつつある。これらの分子は可溶性Ａβオリゴマーである。オリゴマーは準安定性であり、低濃度のＡβ１−４２により形成する(Lambert, M.P. et al. "Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abetal-42 are potent central nervous system neurotoxins" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 95, pp. 6448-6453)。本質的に、最初のカスケードのミッシングリンクであるＡβオリゴマーは、記憶およびシナプス可塑性についての古典的な実験パラダイムである長期電位（ＬＴＰ）を阻害する。最新のカスケードにおいて、（１）記憶喪失は、ニューロン死前のシナプス不全に起因し、そして（２）シナプス不全は原線維ではなくＡβオリゴマーにより引き起こされる、ということである(Hardy, J. & Selkoe, DJ. (2002) "The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics" Science, vol. 297, pp. 353-356)。最近のレポートによると、可溶性オリゴマーは脳組織内で生じ、そしてＡＤ(Kayed, R. et al. (2003) "Common structure of soluble amyloid oligomers implies common mechanism of pathogenesis" Science, vol. 300, pp. 486-489; Gong, Y. et al. (2003) "Alzheimer's disease-affected brain: presence of oligomeric A[beta] ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 100, pp. 10417-10422)およびｈＡＰＰトランスジェニックマウスＡＤモデル(Kotilinek, L.A. et al. (2002) "Reversible memory loss in a mouse transgenic model of Alzheimer's disease" J. Neurosci., vol. 22, pp. 6331- 6335; Chang, L. et al. (2003) "Femtomole immunodetection of synthetic and endogenous amyloid-[beta] oligomers and its application to Alzheimer's Disease drug candidate screening" J. MoI. Neurosci., vol. 20, pp. 305-313)で著しく上昇することが証明されている。
【０００７】
アルツハイマー病のアミロイドベータ免疫療法は、ＡＤのマウスモデル及び髄膜脳炎に罹患しにくいヒトの患者において初期成功を収めている。本明細書では、可溶性Ａβオリゴマー（ＡＤＤＬ）に対するモノクローナル抗体を開示する、当該抗体は、ＡＤのヒト脳抽出物とコントロールのヒト脳抽出物とを区別する。当該抗体は、ＡＤ脳スライス内の内因性オリゴマーを同定し、そして更に培養海馬細胞と結合する。当該抗体は、溶液の内因性ＡＤＤＬと「合成」ＡＤＤＬを中和する。いわゆる「合成」ＡＤＤＬは、精製アミロイドβ１−４２を、ＡＤＤＬを生成する条件下で混合することによりin vitroで生成される（米国特許第６，２１８，５０６号を参照のこと）。当該抗体の１つである２０Ｃ２は、３〜２４量体についての高い選択性を示すが、モノマーであるＡβペプチドは最小限しか検出しない。２０Ｃ２によるＡＤＤＬの認識は、Ａβ１−４２の線形配列を包含する短いペプチドによって、又はＡβ１−４０によっては阻止されない。しかしながら、結合はＡβ１−２８により阻止されたことから、高次構造的に独特な構造に基づいたエピトープもＡβ１−２８により到達したことが示唆される。
【０００８】
ＡＤは、現在治療法がない致死性の進行性認知症である。当該疾患の分子基盤は確立されておらず、多数の証拠が、４２アミノ酸のペプチドアミロイドベータ（Ａβ）に由来する神経毒が関与するタンパク質異常症(proteinopathy)であることを示している。疾患の進行を説明するための主要な「アミロイドカスケード仮説」の最近の改訂によると、小さな可溶性Ａβオリゴマーは、プラークのコアを構成するより大きなＡβフィブリルと同様に病原性であることが主張されている(Hardy, J. & Selkoe, DJ. (2002) "The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics" Science, vol. 297, pp. 353-356)。
【０００９】
近年の研究によると、小さな可溶性Ａβオリゴマー（Ａβ由来拡散性リガンド又はＡＤＤＬとも称される）がＡＤ脳に存在しており、コントロールの被験者よりも最大７０倍増大することが証明されている(Gong, Y. et al. (2003) "Alzheimer's disease-affected brain: Presence of oligomeric A[beta] ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 100, pp. 10417-10422)。ＡＤ脳にＡＤＤＬが非常に大量に存在することは、それらが治療薬又はワクチンにとって可能性があることを示唆している。ワクチンの初期の臨床試験により、当該ワクチンに対し力強い免疫反応を起こす人が認知に関する利益を示したことが明らかとなった(Hock, C. et al. (2003) "Antibodies against beta-amyloid slow cognitive decline in Alzheimer's disease" Neuron, vol. 38, pp. 547-554)。これらの所見は、当該試験の一部の初期の終結が引き起こしたＣＮＳ炎症が許容できない頻度であったにも関わらず、、真の治療的確約を示している(Birmingham, K. & Frantz, S. (2002) "Set back to Alzheimer vaccine studies" Nat. Med., vol. 8, pp. 199-200)。
【００１０】
生ワクチンの代わりとして、モノマー又は原線維と結合することなくＡＤＤＬを標的とする治療抗体が開発されている(Klein, W.L. (2002) "A/3 toxicity in Alzheimer's disease: globular oligomers (ADDLs) as new vaccine and drug targets" Neurochem. Int., vol. 41, pp. 345-352)。以前の研究では、ＡＤＤＬが優れた抗原であり、〜５０μｇ／ｍｌという非常に低濃度でウサギ中にオリゴマー選択的ポリクローナル抗体を産生させることが証明されている(Lambert, M.P. et al. (2001) "Vaccination with soluble Abeta oligomers generates toxicity-neutralizing antibodies" J. Neurochem., vol. 79, pp. 595-605)。ｔｇマウスモデル由来の結果も、抗体が記憶力低下を回復に向かわせるのに成功し得ることを示唆している(Dodart, J.C. et al. (2002) "Immunization reverses memory deficits without reducing brain Abeta burden in Alzheimer's disease" Nat. Neurosci., vol. 5, pp. 452-457)。
【００１１】
ＡＤのｔｇマウスを原線維アミロイドベータタンパク質（Ａβ）で免疫化すると、脳のＡβ沈着が低下し、そしてその形成前に投与した場合にはこの病態の形成が予防される(Schenk, D. (2002) Amyloid-beta immunotherapy for Alzheimer's disease: the end of the beginning. Nat. Rev. Neurosci. 3(10):824-8; Schenk, D. et al. (1999) Immunization with amyloid-beta attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse. Nature 400(6740): 173-7)。これらのマウスで生み出される学習及び記憶の欠損は、原線維Ａβを含む調製物による同様の能動的なワクチン接種によっても低下し、又は予防される(Janus, C. et al. (2000) A beta peptide immunization reduces behavioural impairment and plaques in a model of Alzheimer's disease. Nature 408(6815):979-82; Morgan, D. et al. (2000) A beta peptide vaccination prevents memory loss in an animal model of Alzheimer's disease. Nature 408(6815):982-5)。動物モデル由来の結果に基づき、臨床試験が開始され、そしてフェーズ１において多少の有害な反応が示された。しかしながら、フェーズ２の試験は、患者の６％が髄膜脳炎を発症した時点で中止された(Birmingham, K. & Frantz, S. (2002) Set back to Alzheimer vaccine studies. Nat. Med. 8(3): 199-200; Hock, C. et al. (2003) Antibodies against beta-amyloid slow cognitive decline in Alzheimer's disease. Neuron 38(4):547-54; Orgogozo, J.M. et al. (2003) Subacute meningoencephalitis in a subset of patients with AD after Abeta42 immunization. Neurology 61(l):46-54; Schenk, D. (2002) Amyloid-beta immunotherapy for Alzheimer's disease: the end of the beginning. Nat. Rev. Neurosci. 3(10):824-8; Schenk, D. et al. (2004) Current progress in beta-amyloid immunotherapy. Curr. Opin. Immunol. 16(5):599-606)。これらの臨床試験の臨床転帰のレポートによると、プラークを標的とする抗体を産生する患者は、1年後、抗体を産生しなかった患者よりも認知低下の速度が遅かったことが明らかとなった(Hock, C. et al. (2003) Antibodies against beta-amyloid slow cognitive decline in Alzheimer's disease. Neuron 38(4):547- 54)。二人の患者の検視結果上、有効な免疫反応を示唆するミクログリアとともに、新皮質内には全く又はほとんどプラークが見られなかった(Ferrer, I. et al. (2004) Neuropathology and pathogenesis of encephalitis following amyloid-beta immunization in Alzheimer's disease. Brain Pathol 14(1): 11-20; Nicoll, J.A. et al. (2003) Neuropathology of human Alzheimer disease after immunization with amyloid-beta peptide: a case report. Nat. Med. 9(4):448-52)。
【００１２】
治療抗体の使用による炎症反応を回避するための代替的なアプローチが現在開発されている(Agadjanyan, M.G. et al. (2005) Prototype Alzheimer's disease vaccine using the immunodominant B cell epitope from beta-amyloid and promiscuous T cell epitope pan HLA DR-binding peptide. J. Immunol. 174(3): 1580-6; Gelinas, D.S. et al. (2004) Immunotherapy for Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(Suppl 2):14657-62; Morgan, D. & Gitter, B.D. (2004) Evidence supporting a role for anti-Abeta antibodies in the treatment of Alzheimer's disease. Neurobiol. Aging 25(5):605-8; Schenk, D. et al. (2004) Current progress in beta- amyloid immunotherapy. Curr. Opin. Immunol. 16(5):599-606)。Ａβにより生成したモノクローナル抗体による注射は、ＡＤのｔｇマウスモデルの認知の改善をもたらすことが確証されている。エピトープがＡβペプチドの中心を標的とする抗体を用いると、記憶障害が処置後24時間以内にＰＤＡＰＰマウスで逆転しうることが証明されている(Dodart, J.C. et al. (2002) Immunization reverses memory deficits without reducing brain A beta burden in Alzheimer's disease model. Nature Neuroscience 5(5):452-7)。同様に、Ｔｇ２５７６マウスにおいても、ＡβのＮ末端を標的とする抗体を用いた結果、記憶喪失が逆転した(Kotilinek, L.A. et al. (2002) Reversible memory loss in a mouse transgenic model of Alzheimer's disease. J. Neurosci. 22(15):6331-5)。
【００１３】
前もっての受動ワクチン接種は、ＰＤＡＰＰ及び他のｔｇマウスモデルからプラークを取り除くことが証明された(Bacskai, BJ. et al. (2002) Non-Fc-mediated mechanisms are involved in clearance of amyloid-beta in vivo by immunotherapy. J. Neurosci. 22(18):7873-8; Bard, F. et al. (2003) Epitope and isotype specificities of antibodies to beta -amyloid peptide for protection against Alzheimer's disease-like neuropathology. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(4):2023-8; Bard, F. et al. (2000) Peripherally administered antibodies against amyloid beta-peptide enter the central nervous system and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease. Nat. Med. 6(8):916-9; McLaurin, J. et al. (2002) Therapeutically effective antibodies against amyloid-beta peptide target amyloid-beta residues 4-10 and inhibit cytotoxicity and fibrillogenesis. Nature Medicine 8(11): 1263-9)。しかしながら、記憶障害からの回復を示す研究においては、Ａβプラーク断面積比(plaque burden)は低下しなかった。プラーク断面積比の変化無しに認知が改善したことの考えられる説明としては、これらの治療抗体が、ＡＤシナプス不全に関与しているＡβの小さな可溶性オリゴマーを免疫中和するということである(Lacor, P.N. et al. (2004) Synaptic targeting by Alzheimer's-related amyloid beta oligomers. J. Neurosci. 24(45): 10191 -200)。Ａβオリゴマーは、低濃度のＡβ１−４２で形成し、ＬＴＰをブロックし、そして特異的にシナプス終末に結合する(Lacor, P.N. et al. (2004) Synaptic targeting by Alzheimer's-related amyloid beta oligomers. J. Neurosci. 24(45):10191-200; Lambert, M.P. et al. (1998) Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abetal-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(11):6448-53; Wang, H.W. et al. (2002) Soluble oligomers of beta amyloid (1-42) inhibit long-term potentiation, but not long- term depression, in rat dentate gyrus. Brain Res. 924(2): 133-40; Wang, Q. et al. (2004) Block of long-term potentiation by naturally secreted and synthetic amyloid beta-peptide in hippocampal slices is mediated via activation of the kinases c-Jun N-terminal kinase, cyclin-dependent kinase 5, and p38 mitogen-activated protein kinase as well as metabotropic glutamate receptor type 5. J. Neurosci. 24(13):3370-8)。これらのオリゴマー（ＡＤＤＬと称する）は、ＡＤ脳及びＣＳＦ並びにｔｇマウスモデルにおいて増大する(Chang, L. et al. (2003) Femtomole immunodetection of synthetic and endogenous amyloid-beta oligomers and its application to Alzheimer's disease drug candidate screening. J. MoI. Neurosci. 20(3):305-13; Georganopoulou, D.G. et al. (2005) Nanoparticle-based detection in cerebral spinal fluid of a soluble pathogenic biomarker for Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(7):2273-76; Gong, Y. et al. Alzheimer's disease-affected brain: presence of oligomeric A beta ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003 100(18): 10417-22)。
【００１４】
これらのことを考慮すると、オリゴマーは、治療用抗体にとって最適な標的を提供するものである。本発明は、オリゴマー（ＡＤＤＬ）選択性のモノクローナル抗体を得るための必要性について対処するものである。本明細書で開示するアプローチは、抗原として可溶性Ａβオリゴマー（ＡＤＤＬ）を使用するが、これは、それらがポリクローナル抗体の生成において、四次構造依存性のエピトープを提供するのに有用であることが既に証明されたためである。このストラテジーは、ＡＤとコントロールの脳とを識別し、且つ溶液中のオリゴマーを中和するモノクローナル抗体を生成し、治療上有用な抗体にとって必須であると考えられる特徴を有している。
【００１５】
本発明の要約
ある態様において、本発明は、アミロイドβ１−４２の可溶性オリゴマーと結合する抗体を含んで成る。当該オリゴマーはＡＤＤＬであってもよい。当該抗体はモノクローナルであってもよい。当該抗体は選択的にオリゴマー（ＡＤＤＬ）と結合することができ、アミロイドβモノマー又はアミロイド原線維とは結合することができない。上述のとおり、Ａβオリゴマー（ＡＤＤＬ）特異的なエピトープを標的とするモノクローナル抗体の開発及び特徴を本明細書で開示する。かかる抗体は、プラーク結合による干渉を受けることなくＡβオリゴマー（ＡＤＤＬ）を中和することができるヒトワクチンとしての役割を果たすことができる。かかる抗体はまた、そのようなワクチンのプロトタイプとしての役割を果たすことができる。当該ワクチンはヒト化抗体を含むことがある。
【００１６】
別の態様において、本発明は、アミロイドβモノマー又は原線維と結合しないモノクローナル抗体を用いて、アミロイドβ１−４２の可溶性オリゴマーをアッセイする方法を含んで成る。当該アッセイは、定量的又は定性的であり得る。当該発生は、in vitro, in vivo, 又はin vitro且つin vivoであってもよい。当該アッセイは、患者又は対象から単離した試料で実施してもよい。当該アッセイは、オリゴマーに干渉する化合物を検出することができる。当該化合物は、オリゴマーのアセンブリ、オリゴマーの活性、オリゴマーとそれらの受容体との結合、又はそれらの任意な組み合わせに干渉することがある。当該抗体を使用して、オリゴマーの１又は複数の細胞性の受容体を同定することができる。
【００１７】
別の態様において、本発明は、前記オリゴマーと選択的に結合するモノクローナル抗体を含んで成る組成物を含んで成る。当該組成物は、当業者に周知の方法に従い調製され、特徴付けられ、そして使用される医薬組成物であってもよい。当該組成物は、予防的、治療的、あるいは治療的且つ予防的であってもよい。当該組成物は、神経変性疾患を余郷し、又は神経変性疾患を処置するために投与することができる。当該疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認識障害（ＭＣＩ）、ダウン症等でありうる。
【００１８】
詳細な説明
抗体の生成、調製、特徴づけ、及び使用についての一般的な技術は当業者にとって周知である（例えば、Harlow, E. & Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor: N.Y.; Harlow, E. & Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold, Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor: N. Y.; Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor: N. Y.;等を参照のこと）。
【実施例】
【００１９】
抗ＡＤＤＬ抗体
（開発及び特徴づけ）
材料と方法
モノクローナル抗体の開発。免疫化及び融合は、ノースウェスト大学のCore Antibody Facility及びカナダ国ブリティッシュコロンビア州ビクトリアのImmuno-Precise Antibodies, Ltd.にて行った。増殖、スクリーニング、及びサブクローニング（必要に応じて）は、ノースウェスト大学のWilliam Klein博士の研究所にて行った。
【００２０】
ノースウェスタン大学では、既述の通りＡβ１−４２から調製したＦ１２培地中のＡＤＤＬ[22;27]を、完全フロイントアジュバント（初回及び二回目のワクチン接種）又は不完全フロイントアジュバント（その後の全てのワクチン接種）と１：１で混合し、そして３匹のマウスに合計量〜１ｍｌ／マウスで皮下注射（最初の２回の注射）又は腹腔注射した。各注射は、１９４±２５μｇの全タンパク質に相当するＡＤＤＬから構成した。ほぼ3週毎にマウスに注射した。６回注射した後、１匹のマウスが死に、そしてその脾臓を後のプロジェクトのために凍結した。最高の力価の血清を有するマウス由来の脾臓を続いてＳＰ２．０ミエローマ細胞と融合し、そしてこれを６枚の９６穴プレート内にプレーティングした。これらのプレート由来の上清を後述のようにスクリーニングした。最後のマウスは、２ヶ月後に7回目の注射を行い、そして前述の通り融合した。ハイブリドーマ細胞を２０枚の９６穴プレートにプレーティングし、そして３７℃、５％ＣＯ２で生育した。増殖培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２であり、これにＨＡＴ（１ｘ, Sigma）、グルタミン（２ｍＭ）、ハイブリドーマエンハンシングサプリメント（１０％、Sigma）、ＯＰＩ（オキサロ酢酸、プリン、インスリン、０．１％、Sigma）、ＰＭＡ（ホルボールモノアミンアセテート、０．６μｇ／Ｌ、Sigma）、ウシ胎児血清（０．１５％）、及び胎児クローンＩＩ血清（１５％、HyClone）を加えた。これらのプレートをKleinのラボに移し、ここで、上清を以下のようにスクリーニングした。選択したハイブリドーマを広げ、そして後のサブクローニングのために凍結した。２つのハイブリドーマを凍結することなくサブクローニングした。
【００２１】
スクリーニング工程は、最終的に５つのアッセイを利用した：合成ＡＤＤＬを用いた[２７]に記載のドットイムノブロット及びウェスタンイムノブロット、並びに後述のネイティブイムノブロット、並びに後述の、ヒト組織から得た内因性原線維を用いたドットイムノブロット及びウェスタンブロット。これらのアッセイにより、ＡＤＤＬに対する抗体の結合（ドットイムノブロット）及び特定のオリゴマー種に対する親和性（ウェスタンブロット）が試験された。上清は、５ピコモルのＡＤＤＬを用いたドットイムノブロットにより最初に試験した（最初の融合における５７６の上清及び第二の融合における１９２０の上清）。試験でポジティブだったこれらのクローンを更に、１レーン当たり１０〜２０ピコモルでのウェスタンブロットによりスクリーニングした。当該スクリーニングを繰り返し、低ポジティブ又は偽陽性のものを同定した。１０個のウェルを最初のマウスのために広げ、そして４５個のウェルを第二のマウスのために広げ、続いてこれらを凍結又はサブクローニングした。
【００２２】
Immuno-Precise Antibodies, Ltd. （カナダ国ブリティッシュコロンビア州ビクトリア）において、彼等が所有するRapid-Prime法を用いてクローンを生成した。〜０．２５−０．３５ｍＬのＡＤＤＬを用いて２週間にわたり平均０．５０５ｍｇ／ｍｌで動物を免疫化した。続いて、クローンの上清（２８８／プロジェクト）を、上述のようなスクリーニングのためにKleinのラボに送った。
【００２３】
合成及び内因性のＡＤＤＬ及び原線維：合成ＡＤＤＬは［２２；２７]に記載のようにＦ１２中で調製した。合成の原線維は[４０]に従い調製した。内因性のＡＤＤＬは、[１５]に記載のように濃縮段階を省略してＡＤ脳組織から抽出した。内因性の原線維は、同一の調製方法を用いて獲得し、但し、ペレットはその後１時間２％ＳＤＳ／Ｆ１２を用いて１時間インキュベートし、そして２２０，０００ｘｇで１時間遠心した。原線維を含むペレットを、続いてＦ１２中で懸濁し、そして３０〜６０秒間超音波処理して材料をタンパク質濃度の決定のために懸濁した。
【００２４】
ドットイムノブロット及びペプチド競合：ドットブロットによる最初のスクリーニングは、[２７]に従い、ＡＤＤＬ（５ピコモル／ドット）又は原線維（１μｇ／ドット）のいずれかを利用して実施した。競合ドットブロットの場合、ＡＤＤＬは、０．５μＬの容積中種々のピコモル濃度で、２つ１組で、SurfBlot装置由来の鋳型を用い、乾燥したニトロセルロースに適用した。続いてブロットを１５分間乾燥し、１時間ブロッキングし、そしてSurfBlot装置内に挿入した。抗体±ペプチドをウェル中で１．５時間インキュベートし、ドットブロット装置から取り出し、ウェルをブロッキングバッファーで洗浄し、そして膜を当該装置から取り出した。ニトロセルロースを続いて洗浄し、二次抗体で処理し、そして下文で引用する通り可視化した。
【００２５】
イムノブロッティング．ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を[２７]に従い実施し、但し、１０〜２０％トリス−トリシンゲル（ＢｉｏＲａｄ）を用い、そして分離は１２０Ｖで実施した。二次抗体はルーチンに１：４０，０００希釈で使用した。
【００２６】
最初のスクリーニングのために、調製用の１０〜２０％ゲルは、１レーン当たり〜１６−２０ピコモルに等しいサンプルウェル中２．７μｇのＡＤＤＬと一緒に使用した。電気泳動及びトランスファーは上述の通りである。ガイドとしてトラッキング色素を用い、ブロッキングしたニトロセルロースをSurfblot装置内に据え、そして２００μｌのハイブリドーマ上清とブロッキングバッファー（５％脱脂粉乳／ＴＢＳＴ−トリス緩衝溶液とＴｗｅｅｎ２０−［２７］を参照のこと）を２０〜２１個のウェルのそれぞれに添加した。室温で１．５時間インキュベートした後、上清を除去し、そしてウェルをバッファーで洗浄した。膜を続いてSurfblotから取り出し、そして３ｘ１５分間ＴＢＳＴ中で洗浄した。二次抗体を続いて膜と一緒に１時間室温でインキュベートした。洗浄後（３ｘ１５分間）、オリゴマーを半分の強度のSuperSignal(Pierce)で可視化した。ヒトの原線維を用いてのウェスタンイムノブロットを、同じ方法により、各ゲルにつき約６４μｇの調製した材料を用いて実施した。
【００２７】
ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動は、［７］に従い、１２０Ｖで実施した。
【００２８】
免疫細胞化学：免疫細胞化学は［２７］に記載の通り実施し、但し、培養は２１ ＤＩＶで行い、そしてAlexaFluor 488 (Molecular Probes)を使用してマウスＩｇＧを可視化した。ブロッキング実験において、抗体とＡＤＤＬを、１：４のモル比で用いて、海馬細胞培養物に適用する前に１時間室温で予めインキュベートした。
【００２９】
サイズ排除クロマトグラフィー：サイズ排除クロマトグラフィーを［７］の通りに実施した。ストレプトアビジン−ダイナビーズ（５０μｌ、Dynal）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で３０分間４℃でブロッキングした。ビーズをビオチン化した２０Ｃ２（２５０μｌのＰＢＳ中２５μｇ）と一緒に７０分間４℃でインキュベートし、そして３ｘ１０分間１ｍｌのＰＢＳで洗浄した。続いて、ビーズは、抗体と一緒に又は抗体無しで、ＡＤＤＬ（４０μｌ、２５μＭ）と一緒に７０分間４℃でインキュベートし、そして１５，０００ｇで１０分間遠心した。上清のアリコート（３０μｌ）をＳＥＣによりＰＢＳ（０．０６ｍｌ／分）で平衡化Superdex 75 PC 3.2/30カラム上で解析し、そして画分（０．３ｍｌ）を回収した。吸光度を２１５ｎｍでモニタリングした。
【００３０】
免疫組織化学：ＡＤ及びコントロールの海馬由来の、軽く固定して凍結した切片（４％パラホルムアルデヒド中４℃で３０時間、続いてスクロース中で凍結保護。４０μｍ）を、抗体（ＰＢＳ中１：１０００）と一緒に一晩４℃でインキュベートした。抗体の除去後、切片を３回ＰＢＳで洗浄し、そして次に１：５００の適当な二次抗体と一緒に一晩４℃でインキュベートした。切片を３回ＰＢＳですすぎ、そして２時間４度でVector ABCペルオキシダーゼスタンダードキットと一緒にインキュベートした。続いて結合をＤＡＢ（トリスバッファー中０．０５％又は１：５００で２分間）で可視化した。切片をヘマトキシリンで対比染色し、これにpermaslipを乗せ、そしてNikon Eclipse E600光学顕微鏡とSpot Insight デジタルビデオカメラ(v. 3.2)で撮像した。
【００３１】
結果：
オリゴマー特異的モノクローナルスクリーニングストラテジー
モノマー及び／又は原線維の代わりにオリゴマーを認識するクローンを同定するために、最初に、５ピコモルの合成ＡＤＤＬ又は１μｇの内因性ＡＤ原線維を用いたドットイムノブロットにより上清をスクリーニングした（図１）。このスクリーニングに由来するポジティブなもの（〜３０％）を続いてウェスタンイムノブロットにより試験して更に結合種を規定した。ウェスタンブロットにより試験したクローンのうち、〜２％が、低ＡＤＤＬ濃度でオリゴマーと結合し、モノマーには結合しないことが明らかとなった。これらのクローンの多くも、原線維と結合し、そして１つ（２０Ｃ２）が徹底的な特徴づけのために選択された。あるクローン（１Ｈ９）は、トリマー／テトラマー種と比較してより高次のオリゴマー（１２〜２４量体）とよく結合することが明らかとなった。天然の条件下でのみＡＤＤＬと結合する１つのクローン（３Ａ５）が見つかった。原線維と結合し、オリゴマー（３Ａ７、３Ａ９）とは結合しない２つのクローンが見つかった。およそ５０個のクローンが、更なる展開、精製、及び試験のために選択された。
【００３２】
ＡＤ脳とコントロールの脳とを特異的に識別するモノクローナル抗体
抗体が、ヒトＡＤ脳（内因性ＡＤＤＬを含む）の可溶性抽出物とコントロール脳の抽出物とを識別することができるかどうかを決定することが必須の試験であった。合成（ＡＤＤＬ（１ピコモル）及び３つのヒト脳抽出物（０．５μｇ、Ｂｒａａｋｗ及びＣＥＲＡＤで病期分類したもの）をドットイムノブロットでアッセイした。代表的な結果を図２Ａに示す。６Ｅ１０（Ａβ３−８内にエピトープを有する市販の抗体）、２Ｂ４、及び２Ａ１０は、ＡＤ脳抽出物に対し弱い結合を示したが、尚もＡＤ脳とコントロール脳とを識別した。しかしながら、２つのモノクローナル抗体２０Ｃ２及び１１Ｂ５は、ポリクローナル抗体Ｍ７１／２と共に、高度な特異性でＡＤ脳とコントロール脳とを識別した。
【００３３】
ＡＤ脳における２０Ｃ２の免疫反応性
次に２０Ｃ２がヒト脳の切片内の抗原を検出する能力について試験した。固定したＡＤ脳及びコントロール脳を抗体に曝露し、そして次にヘマトキシリンで対比染色した。免疫反応性はＡＤ脳の海馬、嗅内皮質、及び中前頭回で顕著であった（図２Ｂ、中央）。標識部分は変化に富み、プラーク様の領域と血管因子から成る。コントロール脳は２０Ｃ２による染色を示さなかった（図２０Ｂ、左）。更に、興味深い拡散性の標識パターンが、既にポリクローナル抗体で見られているように[２５]、個々のニューロン及び細胞集団の周囲で見られた（ニューロン周囲の標識、図２Ｂ、右側）。ニューロン周囲の標識は、培養物に見られる樹状部位に対してのオリゴマーの結合に類似している。
【００３４】
２０Ｃ２の特異性：ウェスタンイムノブロット及びドットイムノブロット
２０Ｃ−２がＡβ１−４０と結合する能力を続いて試験し、ＡＤＤＬと、ＡＤＤＬ画分をSuperdex 75カラムを用いたＳＥＣにより分離した。これまでに報告されているように、ＳＥＣは２つの主要な画分をもたらし、ピーク１は空隙容量の直後に溶出するものであり、そしてピーク２は１３ｋＤａのマーカー付近で溶出するものである[７；２５]。比較のために、６Ｅ１０とＭ７１／２も試験した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いて銀染色（図３Ａ）又はイムノブロッティング（図３Ｂ）を行った。６Ｅ１０のみが、モノマーとして独占的に移動するＡβ１−４０を認識した。６Ｅ１０はまた、３つ全ての画分においてモノマーのＡβ１−４２の顕著な染色をもたらした。低分子量のピーク２は主にモノマーであった。２０Ｃ２とＭ７１／２は、６Ｅ１０と対照的に、ピーク２においてわずかにうっすらとしたモノマーの染色を示し、そしてピーク１又は分画していないＡＤＤＬにおいては全くモノマーの染色を示さなかった。３つ全ての抗体が、ＡＤＤＬ調製物及びピーク１のトリマー、テトラマー、及び１２〜２４量体と反応を示した。このように、ウェスタンブロットは、２０Ｃ２がモノマーよりもオリゴマーに対し非常に優先的に結合することを示唆している。
【００３５】
オリゴマーについての選択性の評価
特異性の３つの追加試験を実施した。最初に、１０ｎＭのモノマーのＡβ１−４２からのオリゴマーの時間依存的な形成（図３Ｃ及びＤ）をドットイムノブロットで測定した。当初、モノマーが優勢である場合、染色は軽微であった。次の１０分間、オリゴマー化は比較的迅速であり、そして免疫反応性は４００％増大した。Ａβ１−４０モノマーはほとんど検出されなかった（図３Ｃ）。ウェスタンブロットと調和して、ニトロセルロースと結合した変性していない分子のこれらのアッセイは、２０Ｃ２がオリゴマー選択的であることを示唆している。
【００３６】
続いて、免疫沈降を使用して、２０Ｃ２が選択的に溶液中でモノマーよりもＡＤＤＬを選択的に認識するか否かを決定した。磁気Dynabeadを２０Ｃ２と一緒に、又は２０Ｃ２無しでＡＤＤＬとインキュベートし、ビーズと、結合した材料を除去し、そして上清はSuperdex 75カラムを用いて分画した（示さず）。ピーク１で見られたより高分子量の種を、ピーク２と比較して選択的に除去した（７３％対３３％）。ピーク２は低分子量のオリゴマーを含んで成るが、主にモノマーを含んで成る。結果は、モノマーと比較した場合のオリゴマーについての２０Ｃ２の溶液選択性と一致している。
【００３７】
第三に、溶液中でのＡＤＤＬ又はＡβ１−４０についての２０Ｃ２の親和性は、競合アッセイを用いて比較した。２０Ｃ２をＡＤＤＬの量を増やしつつ予めインキュベートし、続いてニトロセルロース上に固定したＡＤＤＬと結合する能力について試験した（図４Ａ）。溶液中のＡＤＤＬは、固定化したＡＤＤＬに対する結合を、３０ｎＭの半阻害濃度(half maximal)で効果的にブロックした（図４Ｂ）。モノマーのＡβ１−４０は、結合をブロッキングするのに有効ではなく、非特異的な会合を示唆する線形の低下を示した。非特異的な会合は、先に見られた低レベルの反応性と一致する（図３Ｃ）。
【００３８】
２０Ｃ２エピトープの高次構造の性質
２０Ｃ２のエピトープを研究するために、Ａβ１−４２の全長を包含する４つの短いペプチド（１−１２，１２−２８，２５−３５，３５−４２）を用いて、競合ドットイムノブロットを最初に実施した。いずれのペプチドもＡＤＤＬに対する２０Ｃ２の結合に対しなんら効果を有さなかったが（図５Ａ）、ＡＤＤＬコントロールは完全に結合をブロックした。続いて、より長いペプチドであるＡβ１−２８及びＡβ１７−４２をアッセイした。ＡＤＤＬに対する２０Ｃ２の結合は、Ａβ１−２８によって完全に阻害された（図５Ｂ）。半阻害濃度は１０ｎＭであり（図５Ｃ）、ＡＤＤＬによる場合よりも若干低かった。ＡＤＤＬはモノマーを含む混合溶液中にあるので、この差異は驚くべきものではない。Ａβ１７−４２はインパクトもなく、任意の組み合わせのペプチドもそうであった。２０Ｃ２とＡβ１−２８とのプレインキュベーションもウェスタンブロットにおいて結合をブロックする（図５Ｄ）。Ａβ１−２８の高次構造エピトープは三次又は四次構造から導くことができる。Ａβ１−２８がダイマーを形成することは既に示唆されており[２８]
そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した場合（図５Ｄ）、我々の調製物は単一のバンドで移動し、これはこのような示唆と一致している。しかしながら、このダイマーはウェスタンブロットにおいて２０Ｃ２により認識されなかった。
【００３９】
細胞に対するＡＤＤＬの結合の免疫中和
ＡＤＤＬは、in vitroで形成したか、ＡＤ脳から得られたかに関係なく、海馬の培養物中のシナプスに結合する[２５]。最後の実験において、２０Ｃ２はこのシナプスの結合を阻害する能力について試験された。ＡＤＤＬは、２０Ｃ２と一緒に、又は２０Ｃ２を用いずに、培養物と６０分間インキュベートされ、そしてＡＤＤＬの結合は免疫蛍光顕微鏡で検出した（図６）。２０Ｃ２無しで、ＡＤＤＬは、これまでに観察されているように[２５；２７]、点状のシナプスパターンと結合した。担体と非二次抗体コントロールは、染色を示さなかった。ＡＤ脳由来（５Ｃ）ＡＤＤＬ及び合成（５Ｄ）ＡＤＤＬの結合は共に２０Ｃ２とのプレインキュベーションによりブロックされた。これらの条件下での２０Ｃ２による結合の阻害は９０％超であった（５Ｅ）。
【００４０】
考察
ＡＤＤＬを使用して、病理学的なＡβのアセンブリを標的とするモノクローナル抗体を生成した。注目の３つの方の抗体が生成した；オリゴマー及び原線維と結合することができるもの；原線維とは結合することができるが、オリゴマーとは結合することができないもの；及び、オリゴマーとは結合することができるが、原線維とは結合することができないもの。第一のクラスが最も一般的であり、そしてこのクラスの１つの特定のクローンを展開し、そして徹底的に特徴付けた（２０Ｃ２）。この抗体は、抽出物及び組織切片中で、コントロール脳をＡＤ脳から識別した。ＡＤＤＬに共通する３Ｄエピトープに由来する識別及びＡβ１−２８のアセンブリはＡβ１−４０及び他の直鎖配列にはなかった。２０Ｃ２によるＡＤＤＬの結合は、それらが海馬の培養物中のシナプスに結合するのを防いだ。従って、２０Ｃ２は病理学的なＡβのアセンブリを選択的に免疫中和する治療用モノクローナル抗体のプロトタイプである。
【００４１】
種々の形態のＡβフラグメント及びアセンブリによる免疫化は、種々の有用な特性を有する抗体を生成させた。短いＮ末端ペプチドは、例えば、本研究で使用する６Ｅ１０[１０]を生成させ、これは全ての形態のＡβと実質的に結合する。Ｃ末端抗原は、Ａβ１−４０をＡβ１−４２と区別するモノクローナル抗体を生成させ、これはそれらを選択的ＥＬＩＳＡにとって有用なものとする[１９；３４]。Kayedらは[２０]最近、金コロイドとカップリングしたＡβ１−４０を使用して、in vitroでオリゴマーと結合するがモノマー又は原線維と結合せず、そして脳の切片において拡散性の初期のプラークと反応するがチオフラビンポジティブな高密度プラークと反応しない抗体を生成させた。ＡＤＤＬ調製物によるワクチン接種で生成したポリクローナル抗体[２７]は、ＡＤ脳組織をコントロールの脳組織から切片及びドットイムノブロット両方で区別し、ＡＤ脳のオリゴマーの性質を特徴づけ、培養細胞上のシナプスに対して結合したＡＤＤＬを同定し、そして抗ＡＤＤＬの創薬のためのリード化合物を同定するのに使用された[２５；２７；４３]。
【００４２】
２０Ｃ２モノクローナル抗体は、ウェスタンブロット及びドットイムノブロットパラダイムにおいてオリゴマー及び原線維を認識するが、モノマーを認識しない点について、ＡＤＤＬにより生成したポリクローナル抗体と似ている。ＡＤ脳の切片において、わずかなニューロン周囲の免疫反応性は明らかであった。この免疫反応性は、仮定では、シナプスに対するオリゴマーの結合に寄与しており、ＡＤにおいて初期に又は前臨床時にさえ生じていると考えられている。ウェスタンブロットにおいて２０Ｃ２により認識された種は、銀染色ではなんら材料は検出されなかったが、より高次オリゴマー（１２〜２４量体）を含んでいた。Ａβ１−４０モノマーは、２０Ｃ２ではイムノブロットにおいて検出されず、Ａβ１−４２もＳＤＳがトランスファーバッファー中に存在しているときには検出されなかった。しかしながら、ＳＤＳ無しに、２０Ｃ２はモノマーの位置に免疫反応性を示した。モノマーの移動は、ビオチン化したＡβ１−４２についてのストレプトアビジン−ＨＲＰアッセイにおいて、ＳＤＳに影響を受けないことが確認された（データは示さない）。いずれか１つの説明又は機構に拘束されることを意図するものではないが、ＳＤＳ無しで、モノマーは移動の間に複合し、そしてオリゴマーを生成すると仮定され、これはＡβが非常に低濃度であっても見られる迅速なオリゴマー化と一致している（図３）。競合実験では、２０Ｃ２が溶液中でモノマーについての最小の親和性を有していることが証明され、これによりＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に伴う不明確さが回避される。
【００４３】
競合的な実験（図５）によると、ＡＤＤＬに対する２０Ｃ２の結合が高次構造の決定因子に依存していることが更に示され、これはＡβ１−４２の抗原性についてのこれまでの示唆と一致している［８］。２０Ｃ２と、ＡＤＤＬ又はＡβ１−２８を含む溶液とのプレインキュベーションは、ドットイムノブロットにおけるＡＤＤＬに対するその後の結合をブロックした。他のペプチド、例えばＡβ１−４０は効果がなかった。エレクトロスプレー質量分析によるＡβ１−２８の解析は、これが、ダイマー、おそらくは他のより高次のオリゴマーを気相で形成することを示唆している［２８］。２つのダイマー構造が、Ａβ１７−２３又はＡβ１７−２８のいずれかのコアのオーバーラップにより、当該データに適合すると仮定された。したがって、２０Ｃ２エピトープは３次元であり、Ａβ１−２８が凝集してダイマーを形成することは、正確なアミノ酸を結合ポケットにアラインさせるのに必要であり、おそらく幾つかはそれぞれの単一ペプチドに由来する。変性したＡβ１−２８は、銀染色で見られるように（図５）、ダイマーと一致する位置に移動する。あるいは、単一のペプチド自体がフォールディングしてアミノ酸を適切な配列中にアラインさせることがあり、一方、より短いペプチドは、完全長のＡβ１−４０と同様にフォールディングすることができない。
【００４４】
Ｎ末端エピトープを有する抗体は、Ｃ末端又は中央のエピトープよりも、ｔｇマウスにおけるプラークのクリアランス［３］、そして原線維形成及び細胞毒性の阻害［２９］に有効であるようである。Ａβ３−６配列（ＥＦＲＨ）に依拠する置換一本鎖抗体は、Ａβの凝集物のin vitroでの形成を抑制し、そしてｔｇマウスにおける脳アミロイド負担の損失をもたらした［１２；３９］。別のＮ末端抗体であるＢＡＭ−１０は、アミロイド斑を減少させずにｔｇマウスにおける記憶障害の回復をもたらした［２４］。当該抗体は、認知障害を引き起こす脳内の可溶性Ａβのアセンブリを中和することで働くと仮定された。中央ドメインＡβ１３−２８に対して生じた第二の抗体Ｍ２６６も、記憶の欠損の回復をもたらした［１０］。当該回復は、脳のＡβ斑を変化させることなくわずか２４時間後に生じた。この抗体はＣＮＳ及び血漿のＡβのクリアランスを変化させるため［３８］。この筆者等は当該抗体がＡβのシンクとして働き、ＣＮＳのクリアランスを引き起こすことを示唆している［９］。
【００４５】
マウスＡＤモデルにおける能動及び受動ワクチン接種の成功は、ＡＤ患者における能動ワクチンの臨床試験へとつながる［３６；３７］。フェーズ２の試験は、患者の６％が髄膜脳炎を発症したことにより中止されたが［１７］［３３］、免疫治療に由来する初期臨床データは有望なものであり、代替のＡβ免疫療法の開発は継続中である［１３］。能動ワクチンは、Ａβのフラグメント、通常はＮ末端又は中央領域からのものから構成される免疫抱合体を、キャリヤータンパク質と連結させて用いて開発されている［３７］。これらの抗原は、Ｔ細胞の反応を開始させる、Ａβ１−４２由来のエピトープを含んでおらず、これにより自己免疫反応が排除されうる。受動ワクチンも開発されており、これは、Ａβに対するＴ細胞の反応を排除するだけでなく、高齢の患者の乏しい免疫反応を回避するという利点を提示する。既に、ＡＤＤＬを標的とする治療用抗体の開発がこのアプローチの有効性を最大限利用しうることが示唆されている［２３］。本発明は、比較的強力なモノクローナル抗体が、免疫原として合成ＡＤＤＬを用いて生成することができること、そして、生じた抗体がＡβの病理学的アセンブリに選択的であることを確証する。当該抗体は更に、ＡＤ脳から得られたＡＤＤＬを免疫中和して、それらが細胞培養アッセイにおいてシナプスに接着することをブロックする。したがって、当該抗体は、ｔｇマウスＡＤモデルにおけるＡＤＤＬの中和の行動学的研究に将来的に使用するのに有望であり、臨床的に価値のある抗体へのステップを提供するものである。
【００４６】
ＡＤＤＬ選択的なモノクローナル抗体はまた、ＡＤの診断に有用である。近年の研究において、ＡＤＤＬ選択的抗体は、ヒトＣＳＦにおいてＡＤＤＬを検出することができるアッセイを開発するためのナノテクノロジーの開発と組み合わされた(Georganopoulou, D. G. et al. (2005) Nanoparticle-based detection in cerebral spinal fluid of a soluble pathogenic biomarker for Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(7):2273-76; Haes, AJ. et al. (2005) Detection of a biomarker for Alzheimer's disease from synthetic and clinical samples using a nanoscale optical biosensor. J. Am. Chem. Soc. 127(7):2264-71)。新規なアッセイは、利用可能な最善のＥＬＩＳＡよりも桁違いに高感度であり、低atmolarのＡＤＤＬ濃度を検出することができる。ＡＤの対象者とコントロールの対象者との間のＣＳＦ ＡＤＤＬレベルの１０倍の違いを示す結果(Georganopoulou, D.G. et al. (2005) Nanoparticle-based detection in cerebral spinal fluid of a soluble pathogenic biomarker for Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(7):2273-76)は、ＡＤＤＬ選択的モノクローナル抗体と組み合わせたナノテクノロジーベースのアッセイが、ＡＤの化学的診断を初めて提供することができることを示唆している。
【００４７】
引用文献
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【００４８】
実施例２
抗ＡＤＤＬモノクローナル抗体
（開発及び特徴づけ）
材料と方法
Ａβ由来ジスルフィドリガンド（ＡＤＤＬ）の調製：ＡＤＤＬは、これまでに公開されているプロトコールに従い調製した(Lambert 1998, 2001; Klein 2002)。American Peptide Co. (Sunnyvale, CA)又はCalifornia Peptide Research, Inc. (Napa, CA)由来のＡβ１−４２は、ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）中に溶解した。ＡＤＤＬを調製するために、Ａβ１−４２のアリコートをニートのＤＭＳＯに溶解して５ｍＭにし、続いて冷たいＦ１２培地に添加して１００μＭにした。この溶液を４℃で２４時間インキュベートし、そして１４，０００ｘｇで１０分間遠心した。上清はＡＤＤＬを含んでいる。
【００４９】
ヒト原線維の調製：凍結したヒトの皮質(NADC grant # AG 13854及びNADC Neuropathology Core)から得た試料を、プロテアーゼ阻害剤(Roche Complete（登録商標）)を含む２０ｘの冷Ｆ１２培地中で１分間ホモジェナイズした。試料を続いて１０，０００ｇで１分間４℃で遠心した。Ｆ１２で２回洗浄した後、ペレットを２％ＳＤＳ／Ｆ１２中で再懸濁し、そして氷上で３０分間インキュベートした。試料を続いて２２０，０００ｇで１時間４℃で遠心した。ペレットを続いて冷Ｆ１２中で再懸濁し、そして１５秒の破壊を繰り返して１分間超音波処理した。タンパク質は、クーマシープラスキットを用いて決定した(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)。
【００５０】
海馬の培養：培養物は、これまでに公開されている手順(Brewer, 1997; Stevens, 1996)に従い、Ｅ１８胚から調製した。生存細胞の数を数え、そしてポリリジン（２００μｇ／ｍｌ）でコーティングしたカバーグラス上に、１．５ｘ１０４〜１０６細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングした。培地は、半分を捨て、そして追加したNeurobasal培地と置き換えることで交換した。
【００５１】
定量免疫細胞化学：培養した海馬細胞を５００ｎＭのＡＤＤＬと一緒に１時間３７℃でインキュベートした。ＡＤＤＬはその後洗浄することで除去し、そして細胞を３．７％ホルムアルデヒドで固定した。細胞を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＢＳ−ＮＧＳ（１０％の普通のヤギ血清を含むＰＢＳ）で３０分間インキュベートし、１回洗浄し、そして所望の一次抗体（ＰＢＳ−ＮＧＳで希釈したもの）で一晩４℃でインキュベートした。試料を続いて洗浄し、そして適切な二次抗体［Alexa Fluor（登録商標） 488又は594抗マウスＩｇＧ及び抗ウサギＩｇＧ(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)］と一緒に２時間３７℃でインキュベートした。カバーガラスを洗浄し、そしてProLong anti-fade mounting medium (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)に乗せ、そしてLeica TCS SP2共焦点スキャナDMRXE7顕微鏡を用いて撮像した。
【００５２】
ウェスタンブロット：試料はネイティブＰＡＧＥ（４〜２０％トリス−ＨＣｌ レディゲル、BioRad）又はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０〜２０％のトリストリシンレディゲル、BioRad）により分離した。続いてタンパク質をニトロセルロースに移した。ブロットは、５％の脱脂粉乳又は１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）で一晩ブロッキングし、そして一次抗体と一緒に１．５時間インキュベートし、洗浄し、そしてＨＲＰコンジュゲート二次抗体(Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ)と一緒に１時間インキュベートした。最後の洗浄をした後、タンパク質をWest Femto chemiluminescence キット(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)及びImage Station 440 CF (Kodak) 又はフィルム(Hyperfilm, Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ)で可視化した。
【００５３】
ＥＬＩＳＡ：ポリクローナル抗ＡＤＤＬ ＩｇＧ(M90/1; Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX)を０．２５ｍｇ／ウェルでImmulon 3 Removawell ストリップ(Dynatech Labs, VA, USA)上に２時間室温でプレーティングし、そして当該ウェルを２％ＢＳＡ／ＴＢＳでブロッキングした。１％ＢＳＡ／ＴＢＳで希釈した試料をウェルに添加し、２時間４℃で結合させ、そしてＢＳＡ／ＴＢＳを用いて室温で３回洗浄した。ＢＳＡ／ＴＢＳで希釈したモノクローナル抗体を９０分間室温でインキュベートし、そしてマウスＩｇＧに対するVectastain ABCキットで検出した。ＨＲＰ標識をBioRadのペルオキシダーゼ基質で可視化し、そしてDynex MRX-TCマイクロプレートリーダー上で４０５ｎｍで読み取った。
【００５４】
アイソタイピング：マウスモノクローナル抗体アイソタイピング試薬を有するSigma Immunotype（登録商標）キットを、取扱説明書に従い使用した(Sigma- Aldrich Co., St. Louis, MO)。
【００５５】
結果及び考察：図７〜１１及び表１（以下）を参照のこと。
【００５６】
結論：ＡＤＤＬは、マウスにおいて強力な免疫原性の反応を誘発する。４つの異なる結合プロファイルを有する抗体は、変性したＡβオリゴマーを認識するものであり、天然のＡβオリゴマーとの選択性に乏しい。これらの抗体は、更に、サイズ排除クロマトグラフィーによって分離されたＡＤＤＬを認識する能力により他のものと区別することができる。これらの抗体により培養細胞の軸索及び細胞体に沿った点と結合したＡＤＤＬが検出された。点はＡＤＤＬであり、そしてＡβモノマー又は大きなオリゴマー種には起因していない。モノクローナル抗体は、ＡＤＤＬ処理した培養細胞に対して異なる結合を示す。複数のアイソタイプのモノクローナル抗体が生成しうる。
【００５７】
【表７】
【００５８】
実施例２の引用文献：
【表８】
【００５９】
実施例３
診断試薬としての抗ＡＤＤＬモノクローナル抗体
抗ＡＤＤＬ抗体、特に、ＡＤＤＬに見られ、アミロイドモノマー又は原線維には見られない高次構造のエピトープに特異的なモノクローナル抗ＡＤＤＬ抗体が、当業者に知られている任意の診断用アッセイ、例えば、限定しないが、タンパク質アッセイ；核酸アッセイ；病理学的アッセイ；ウェスタンブロットアッセイ；ＥＬＩＳＡアッセイ；ＲＩＡアッセイ；ドットブロットアッセイ；疫学的アッセイ；ＡＤＤＬのアセンブリを阻害する化合物を検出するためのアッセイ；ＡＤＤＬが受容体に結合するのを阻害する化合物を検出するためのアッセイ；アルツハイマー病（ＡＤ）、ダウン症、及び軽度認識障害（ＭＣＩ）を予防又は処置する化合物を検出するためのアッセイ；患者又は対象がアルツハイマー病、ダウン症、及び軽度認識障害を有しているか否かを検出するためのアッセイ、等（例えば、Georganopoulou, D. G. et al. (2005) Nanoparticle-based detection in cerebral spinal fluid of a soluble pathogenic biomarker for Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(7):2273-76; 国際特許公報WO 2005/003394; 米国特許6,872,554; 6,866,850; 6,815,175; 6,808,712; 6,787,523; 6,787,144; 6,710,226; 6,710,226; 6,703,015; 6,670,195; 6,582,945; 6,375,949; 6,194,163; 5,786,180; 5,716,619; 5,693,753; 5,693,478; 5,679,531; 5,270,165; 米国特許公開番号2005/0142131; 2005/0129695; 2005/0119227; 2005/0090648; 2005/0053614; 2005/0048049; 2005/0037026; 2005/0031629; 2005/0019343; 2005/0019330; 2005/0013815; 2004/0265308; 2004/0234990; 2004/0228865; 2004/0219146; 2004/0197831; 2004/0192898; 2004/0181042; 2004/0175394; 2004/0170641; 2004/0166119; 2004/0157779; 2004/0081657; 2004/0052766; 2003/0235897; 2003/0157117; 2003/0086938; 2003/0073655; 2002/0182660; 2002/0150948; 2002/0136718; 2002/0102261; 2002/0086847; 2002/0009445等を参照のこと）において使用することができる。
【００６０】
本明細書で開示したモノクローナル抗体は、当業者に知られており、そしてＡＤＤＬの存在について脳の抽出物をアッセイするために本明細書で開示した（図１２を参照のこと）、方法、プロトコール、及び手順に従い使用することができる。このようなアッセイは、病態がない又は軽度(low)の患者が非常に低い検出可能なレベルのＡＤＤＬを有していることを示す。また、病態が重度(high)の患者は、可変レベルの検出可能なＡＤＤＬを有している。最後に、かかるアッセイは、ＡＤ患者が一貫して高レベルの検出可能なＡＤＤＬを有していることを示す。
【００６１】
本明細書で開示したモノクローナル抗体は、当業者に知られており、そしてＡＤＤＬの存在について脳の切片(slice section)（例えば、図１３Ａ−１３Ｄを参照のこと）をアッセイするために本明細書で開示した、方法、プロトコール、及び手順に従い使用することができる。かかるアッセイは、ＡＤＤＬがＡＤの病理に影響を受けている領域に存在していることを示す。ＡＤＤＬは、２つのコントロール中に存在しておらず、そのうち１つはＡＤの病態を有していないものであり、そして１つはＣＥＲＡＤ０、ＢｒａａｋＩである。ＡＤＤＬは病態が「重度」のコントロールの試料−ＣＥＲＡＤ Ａ，ＢｒａａｋＩＩＩ及びＡＤに存在していた。更に、これは病態が「重度」のコントロールの試料よりもＡＤの場合に多く存在していた。このようなアッセイの結果は、可変のＩＨＣパターンを示す：ニューロン周囲、びまん性老人斑様、老人斑様、アミロイド血管症、Ｎｂｍニューロン周囲の標識−これは典型的に老人斑を有する領域ではない。
【００６２】
２９のケースに由来する免疫組織化学的なアッセイ（例えば、図１４、１５及び１６を参照のこと）によると、ＡＤＤＬが見られる脳の領域は、限定しないが、海馬前部の切片：海馬、海馬支脚、前海馬支脚、嗅内皮質、海馬傍回、側頭後頭回(temporooccipital gyrus)、中前頭回が含まれる。ＡＤＤＬは、ニューロン周囲、びまん性老人斑様、老人斑様の沈着について半定量的に評価することができる。このようなアッセイにより、選択したケースと、Ａｂｅｔａ ４Ｇ８及び１２８０ ＩＨＣとを比較することができる（例えば、図１６を参照のこと）。更に、このようなアッセイは、ＡＤＤＬの標識が認知の状態と相関しているか否か、ＡＤＤＬの標識がシナプスの損失の測定に比肩するか否か；ミクログリア細胞の補充／活性化がＡＤ及び／又はＭＣＩへの移行に比肩するか否か、等について研究することを可能にする。
【００６３】
同様のアッセイを６つの認知力が評価されたケースにより実施した。当該アッセイの予備的な結果を図１７及び１８に示す。
【００６４】
このようなＩＨＣアッセイは、以下のように要約することができる情報を提供する：ＡＤＤＬ標識は、局所的な分布及び密度におけるＡＤ病態と相関しており（例外：ニューロン周囲のｎｂｍ標識）、ＡＤＤＬ標識は認知状態と相関しており、そしてヒトの組織の研究はin vitroでの細胞培養及びドットイムノブロットアッセイ研究と相関している。
【００６５】
本明細書で開示したモノクローナル抗体は、当業界で知られており、そして正常及びＡＤと診断された患者又は対象に由来するＣＳＦ試料をアッセイするために本明細書で開示した方法、プロトコール、及び手順に従い使用することができる。ナノテクノロジーを用いた例示的なアッセイ（例えば、Georganopoulou, D. G. et al. (2005) Nanoparticle-based detection in cerebral spinal fluid of a soluble pathogenic biomarker for Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(7):2273-76; 国際特許出願公報WO 2005/003394等を参照のこと）は、図１９に示すようなデータを作り出し、これは、ＡＤを診断する臨床医の助けとなるべく使用することができる。ＣＳＦにおける上昇したＡＤＤＬレベルはＡＤの診断と相関しており、そして当該診断のマーカーとして使用することができる（以下に示す関連の特許公報、特に米国特許出願第10/676,871号及び第10/924,372号並びに国際特許出願PCT/US03/30930も参照のこと）。
【００６６】
本明細書で開示したモノクローナル抗体は、当業界で知られており、そして本明細書のＥＬＩＳＡアッセイで開示した方法、プロトコール、及び手順に従い使用することができる。このようなアッセイは、ＥＬＩＳＡで検出した場合の２６のＤＩＶの海馬細胞培養物に対するＡＤＤＬの結合が濃度依存性であることを示す。
【００６７】
図２０で言及する海馬細胞（２６ＤＩＶ；２０，０００細胞／ウェルでプレーティングしたもの）は９６穴プレートで培養した。非細胞コントロールウェルは培地でプレーティングした。細胞は１時間３７℃で、増殖細胞から回収した培地で希釈した１００ｍｌのＡＤＤＬで処理した。ウェルを３ｘ２００ｍｌの温かいNeurobasal培地及び１ｘ２００ｍｌの１％ＢＳＡ／ＴＢＳ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．８％ＮａＣｌ）でそれぞれ１０分間洗浄した。モノクローナル抗体は、ＢＳＡ／ＴＢＳ中で１：２５００に希釈し、そして１００ｍｌ／ウェルで１時間室温でインキュベートし、続いて４ｘ２００ｍｌのＢＳＡ／ＴＢＳで上述のとおり洗浄し、そして３ｘ２００ｍｌのＴＢＳですすいだ。Bio-Radのペルオキシダーゼ基質（１００ｍｌ）を各ウェルに添加し、１時間室温で展開し、そしてDynex MRXマイクロプレートリーダー上で、４０５ｎｍで読み取った。
【００６８】
本明細書で開示したモノクローナル抗体は、当業界で知られており、そして本明細書の点状の結合（「ホットスポット」）免疫蛍光アッセイにおいて開示した方法、プロトコール、及び手順に従い使用することができる（例えば、図２１、及び下文で言及する関連出願における類似の情報を参照のこと）。
【００６９】
図２１で言及する海馬細胞は３週間ポリリジンコートしたカバーガラス上で生育させた。細胞を１００μＭのＡＤＤＬ、等量のビヒクル、０．５ｍｇ（全タンパク質）の内因性ＡＤＤＬ（脳から抽出したＡＤＤＬ）、又は０．５ｍｇ（全タンパク質）の高齢の対応するコントロール脳抽出物で１時間処理した。細胞を３・７％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで合計１５分間固定し、ＰＢＳですすぎ、そして２Ｂ４抗体（１：５００希釈）、続いてAlexa Fluor 488抗マウス二次抗体(Invitrogen)で免疫標識した。これらの細胞を、Nikon optihot倒立顕微鏡及びMetaMorphソフトウェア(Universal Imaging)を用いて可視化した。画像はMetaMorph及びPhotoshop (Adobe)を用いて処理した。海馬細胞に対して結合する典型的な点状ＡＤＤＬは、２Ｂ４モノクローナル抗体を用いて検出される。かかるアッセイは多数の異なる解析、例えば、限定しないがＡＤＤＬが受容体に結合するのを阻害する化合物の検出及び特徴づけ、等にとって有用である。
【００７０】
関連の特許及び特許出願には、限定しないが、米国特許第6,218,506号；国際特許出願PCT/US98/02426；国際特許公報WO 98/33815；米国特許出願09/369,236；国際特許出願PCT/US00/21458；米国特許出願第09/745,057号；米国特許出願第11/130,566号；米国特許出願第10/166,856号；国際特許出願PCT/US03/19640；米国特許出願第10/676,871号；米国特許出願第10/924,372号；米国特許出願第11/100,212号；米国特許出願第11/142,869号；国際特許出願 PCT/US03/30930；国際特許出願 PCT/US05/17176等が含まれる。
【００７１】
本明細書で言及した特許、特許出願、ならびに任意の他の科学文献および技術文献は、これらが矛盾しない範囲で引用により組み入れられる。
【００７２】
本発明の好ましい実施形態の上記開示は、例示および説明を目的として示している。厳密な形態または開示の形態は網羅的でなく、本発明を制限することを意図しない。意図する特定の用途に合わせる場合に当業者が種々の実施形態および種々の修正形態で本発明を最良に実施することができるようにするために本発明の原理およびこれらの原理の実際の適用を最良に説明するために説明を選択した。意図する特定の用途に適している。本発明の範囲は、明細書によって制限されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】Ａβ１−４２に対するオリゴマー選択的なモノクローナル抗体を開発するために使用したスクリーニング工程の略図。本明細書で詳述した通り、マウスにＡＤＤＬ（〜１９４μｇ／注射／マウス）を３週間毎に６回接種した。これらのマウスの脾臓とＳＰ２細胞との融合から生成したハイブリドーマを９６ウェルプレートにプレーティングし、そして示す通り２種類のドットブロットでスクリーニングした。有望なハイブリドーマをサブクローニングし、そしてポジティブなものを続いて種々のアッセイ、例えばウェスタンブロット、ＡＤ脳由来の抽出物（内因性ＡＤＤＬ含有）のドットブロット、及び免疫細胞化学を用いて検証した。選択した抗体を培養液から回収し、そしてプロテインＧセファロースを用いて更に精製した。
【図２】ＡＤ脳組織とコントロールの脳組織とを識別する選択された抗体。Ａ．合成ＡＤＤＬ（１ｐｍｏｌ）及びヒト脳抽出物／Ｆ１２（ヒトＡＤ脳及びコントロール脳由来；０．５μｇ．方法の項参照）をニトロセルロース上に二回一組でスポットした。ペルオキシダーゼ処理（３％Ｈ２Ｏ２、２０分）及びブロッキングの後、垂直のレーンをそれぞれ指定のモノクローナル抗体又はウサギポリクローナル抗体（Ｍ７１／２）で１時間室温でプローブした。洗浄後、ニトロセルロースは、適切なＨＲＰをコンジュゲートした二次抗体と一緒にインキュベートし；結合した二次抗体を続いてケミルミネセンスで可視化した。注意：２０Ｃ２、１１Ｂ５、及びＭ７１／２はＡＤ脳試料と強固に結合するが、コントロールの脳試料とは結合しない。Ｂ．ａ−ｃ：コントロール（ａ）及びアルツハイマー（ｂ．ｃ）の脳から調製した海馬の切片（４０μｍ）をモノクローナル２０Ｃ２と一緒に一晩４℃でインキュベートした。結合した抗体は、続いて抗ＨＲＰ二次抗体及びＤＡＢを用いて可視化した。続いて試料をヘマトキシリンで対比染色した。オリゴマーはＡＤ脳（ｂ）において広範に見られたが、コントロール脳（ａ）においては見られなかった（２００ｘ）。より高倍率（ｃ）のものは、染色が細胞体をニューロン周囲のパターンで取り囲んでいることを示している（６００ｘ）。
【図３】Ａβペプチドの最小のモノマーを示す２０Ｃ２。Ａβ１−４０、ＡＤＤＬ、及びＳＥＣ[７]で２つのピークに分離したＡＤＤＬは、１０〜２０％トリス−トリシンゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。一方のゲルを銀染色し（Ａ）、他方の試料をニトロセルロースにトランスファーし、続いて６Ｅ１０、２０Ｃ２、及びＭ７１／２でプローブした（Ｂ）。銀染色上では、Ａβ１−４０は、重鎖のモノマーのバンドのみを示した。ＡＤＤＬ及び分離したＡＤＤＬのピークは全て、種々の強度のモノマー、トリマー及びテトラマーのバンドを有している。ウェスタン解析において、６E１０は、４つの試料全てでモノマーのバンドを同定し、ＡＤＤＬ及びピーク１は強いトリマー、テトラマー及び１２〜２４量体のバンドを示し、一方、ピーク２は主にモノマーと、トリマー及びテトラマーとを示した。２０Ｃ２とＭ７１／２は、反対に、ＡＤＤＬ及びピーク１でほとんど又は全くモノマー染色を示さなかったが、６Ｅ１０と同様に強いトリマー、テトラマー、及び１２〜２４量体を示した。ピーク２は、２０Ｃ２及びＭ７１／２で染色すると僅かにモノマー、トリマー、及びテトラマーを示したが、１２〜２４量体は示さなかった。Ａβ１−４０は、２０Ｃ２又はＭ７１／２で認識されなかった。Ｃ及びＤにおいて、モノマー化したＡβ１−４２ペプチドの氷上での凝集は、ドットブロットにより、２０Ｃ２及びウサギポリクローナルＭ９０／１抗体で比較しながらモニタリングした。溶液の等量のアリコート（２０ｆｍｏｌ）を指定した時間でスポットし、そして抗体でプローブした。いずれの抗体も、Ａβ１−４２からＡＤＤＬが時間依存的に形成することを検出した。両抗体はまた、１００倍超高いペプチド濃度であっても、モノマーＡβ１−４０ではほとんどシグナルを示さなかった。Ｄにおいて、ドットブロットの相対的な強度を時間の関数として示す。これらのデータは、モノクローナル２０Ｃ２抗体がオリゴマー特異的であるという更なる証拠となる。
【図４】低濃度の固定化ＡＤＤＬに対する２０Ｃ２の結合をブロックする可溶性ＡＤＤＬと、ブロックしないモノマーのＡβ１−４０。Ａにおいて、ＡＤＤＬは１０ｐｍｏｌ／０．５μｌの濃度でニトロセルロースに適用した。ブロッキングした後、各レーンは、ＡＤＤＬ又はＡβ１−４０のいずれかと一緒に指定の種々の濃度でプレインキュベートした２０Ｃ２と一緒に１．５時間インキュベートした。続いて抗体の結合を抗マウスＨＲＰとのインキュベーション及びケミルミネセンスにより決定した。Kodak Image Station 440を使用してブロットの強度を定量した。次に、これらのデータを、SigmaPlotを用いてペプチド濃度の関数としてプロットした（Ｂ）。溶液のＡＤＤＬは、固定化したＡＤＤＬに対する２０Ｃ２の結合を効果的にブロックするが（半阻害濃度〜３２ｎＭ）、モノマーのＡβ１−４０は、非特異的なブロッキングのみを示す。
【図５】ＡＤＤＬに対する２０Ｃ２の結合をブロックする可溶性ペプチドＡβ１−２８。２０Ｃ２のエピトープを研究するための調査に、Ａβ１−４２の全長を覆う８〜１７アミノ酸の４つの短い直鎖ペプチドとのインキュベーションを用い、抗体が固定化したＡＤＤＬに結合するのをブロックした。試験したペプチドのいずれも、抗体より１００倍超であっても結合をブロッキングしなかった。続いて、２つのより長いペプチドを同様のアッセイにおいて試験した結果、Ａβ１−２８は、単独でも他のペプチドと組み合わせても、優れたブロッキング能を示した（Ｂ）。Ａβ１−２８のブロッキング効力はＡＤＤＬと同様であり、１１ｎＭの推定の半阻害濃度を有していた（Ｃ）。Ａβ１−２８はまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥイムノブロットにおいて、変性したＡＤＤＬに対する２０Ｃ２の結合をブロックした。
【図６】培養細胞に対する内因性ＡＤＤＬ及び合成ＡＤＤＬの結合を中和する２０Ｃ２。３週齢の培養海馬細胞は、内因性ＡＤＤＬ（Ａ）又は合成ＡＤＤＬ（Ｂ）のいずれかを含有するＡＤ脳由来の可溶性抽出物と一緒に６０分間インキュベートした。結合しなかったＡＤＤＬを、温かい培養液で洗浄した後、結合したＡＤＤＬを２０Ｃ２及び抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で同定した（方法の項を参照のこと）。免疫中和について試験するために、上述の培養海馬細胞とのインキュベーション前に、ＡＤＤＬを２０Ｃ２と一緒に１時間３７℃でプレインキュベーションした。洗浄後、抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８を用いて結合抗体を同定した。２０Ｃ２は、内因性ＡＤＤＬ（Ｃ）及び合成ＡＤＤＬ（Ｄ）を含有するＡＤ脳由来の両可溶性抽出物が海馬細胞培養物に対して結合するのをブロックした。新鮮な２０Ｃ２がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の前に細胞に加えられたコントロールのプレートも、ＡＤＤＬ結合を示さなかった。
【図７】ＡＤＤＬにより生成したモノクローナル抗体間の差異を浮き彫りにするスクリーニング方法。２つの異なるプロトコールを用いてマウスにＡＤＤＬを接種した。標準的な５ヶ月の接種期間及び融合方法が、ノースウェスタン大学のCoreAntibody Facilityで採用されたが、Immuno-Precise, Inc. (British Columbia, Canada)は、２週間の接種期間と選りすぐりの選択方法を使用した。ハイブリドーマの上清はその後スクリーニングのために我々に送付された。我々の最初のスクリーニングは、認識分子のために最初にＡＤＤＬを利用し、そして次にＡＤ脳由来の原線維を利用する超高感度ドットブロットアッセイで行った(Lambert, M.P. et al. "Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abetal-42 are potent central nervous system neurotoxins" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 95, pp. 6448-6453)。続いて、ポジティブなウェルは、ウェスタンプロトコールにおいて、変性（左上段）及びネイティブ（右上段）の両条件下でＡＤＤＬを用いてスクリーニングした。最後に、ＡＤ脳由来の原線維をウェスタンプロトコールで用いて（下段）、最終的な選択を決定した。
【図８】選択した抗体間で異なる結合プロファイル。（左上段）合成ＡＤＤＬを２０ｐｍｏｌ／レーンで用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンイムノブロットをハイブリドーマの上清と一緒にインキュベートし、そして適切なＨＲＰ二次抗体及びケミルミネセンスを用いて可視化した。４つのプロファイルを図示する：１：モノマー、低分子量オリゴマー、及び高分子量オリゴマー（２０Ｃ２）；２：小分子量オリゴマー（３Ｂ７）；高分子量の主要な認識（１１Ｂ４）；４：小分子及び高分子量のオリゴマー（２Ｂ４）。コントロールはポリクローナルＡＤＤＬ抗体Ｍ８８／３である。（右側上段）１レーン当たり２０ｐｍｏｌの合成ＡＤＤＬを用いてのネイティブウェスタンイムノブロットを調製した。当該ブロットを続いて５分間煮沸し、その後同一のハイブリドーマ上清で可視化した。上清は、主要な非変性型のＡＤＤＬ種と重要でないものとを認識する能力によって異なる。コントロールは６Ｅ１０モノクローナル抗体である。（下側）１レーン当たり２０ｐｍｏｌの合成ＡＤＤＬを用いてのネイティブウェスタンイムノブロットを煮沸しない点を除いて上述の通り調製した。上清は、主要なより低分子量の種及びより高分子量の種のスメアを認識する。３Ｂ７は非変性型の材料をほとんど認識しない。コントロールは６Ｅ１０である。
【図９】サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分子したＡＤＤＬの検出における差異を示す、ＡＤＤＬにより生成したモノクローナル抗体。サンドイッチＥＬＩＳＡは、捕捉抗体としてＡＤＤＬに対するポリクローナル抗体Ｍ９０を用いて展開した。ＳＥＣピーク１及びピーク２の画分は、セファデックス７５カラム上で分画したＡＤＤＬの２つの主要なピークを指す（潜在的に生体活性なオリゴマーと不活性なオリゴマーとを区別するために、「合成」ＡＤＤＬをゲルろ過クロマトグラフィーにかけ、これにより２つお主要なピークが生成した；非変性ゲル電気泳動により、３７℃で安定な、大きな（５９ｋＤａ超）の凝集物と小さい（３０ｋＤａ未満）の凝集物への分離が確認された）。これらのピークは、クローン上清についての検出物質として別々に使用した。結合はVectastainキットを用いて可視化した。データは、SigmaPlotソフトウェアを用いて定量した。２つのピークの認識の差異は全ての抗体で見られる。例えば、抗体２Ｂ４及び２０Ｃ２についてのピーク１とピーク２との比率を比較する。わずかに１つの抗体が、ピーク２についてのコントロール抗体（６Ｅ１０）の好みを反映している。
【図１０】培養細胞に結合したときにオリゴマーであるＡＤＤＬ。（左側）ＡＤＤＬ及び原線維を含む合成溶液に対して結合する３Ｂ７モノクローナル抗体及びＭ９４ポリクローナル抗体を示すウェスタンイムノブロット。３Ｂ７が原線維、高分子量オリゴマー、及びモノマーと結合しないことに注意すること。（右側）３Ｂ７で検出し、そしてAlexaFluor（登録商標）488抗マウスＩｇＧで可視化した、３週齢の培養海馬細胞と結合したＡＤＤＬのイメージ。３Ｂ７は、原線維又はモノマーを認識しないので、ＡＤＤＬのホットスポット結合はオリゴマーである。
【図１１】ＡＤＤＬ処理した培養細胞に対して異なる結合を示す、ＡＤＤＬにより生成したモノクローナル抗体。Ｅ１８から得た培養海馬細胞は、実施例２で述べた通り３週間生育した。続いて細胞を１時間ＡＤＤＬ（５００ｎＭ）に曝露し、洗浄し、そして固定した。ＡＤＤＬは、指定の抗体で同定し、そしてAlexaFluor（登録商標）488抗マウスＩｇＧで可視化した。抗体は、細胞に対して結合したＡＤＤＬ上の異なるエピトープを認識するようであり、これは、工程上のホットスポット（Ｍ９４、２Ａ１０）から細胞体特異的付着（４Ｅ２）、そして他の中間状態（２Ｄ６、４Ｃ２、２Ｂ４、５Ｆ１０、５Ｇ１２）に及ぶ。
【図１２】ドットブロットイムノアッセイによるヒト脳抽出物におけるＡＤＤＬの相対的定量。
【図１３Ａ】ヒト切片のＡＤＤＬ免疫組織化学（ＩＨＣ）解析。領域分布。２ケース。
【図１３Ｂ】ヒト切片のＡＤＤＬ免疫組織化学（ＩＨＣ）解析。領域分布。２ケース。
【図１３Ｃ】ヒト切片のＡＤＤＬ免疫組織化学（ＩＨＣ）解析。領域分布。２ケース。
【図１３Ｄ】ヒト切片のＡＤＤＬ免疫組織化学（ＩＨＣ）解析。領域分布。２ケース。
【図１４】抗ＡＤＤＬモノクローナル抗体を用いるＩＨＣ解析の要約。
【図１５】ヒト脳切片のＡＤＤＬ免疫組織化学（ＩＨＣ）解析。
【図１６】ヒト脳切片を用いてのＡＤＤＬ ＩＨＣ解析の要約。
【図１７】６つの認識的に評価したケースのＡＤＤＬ ＩＨＣ解析の結果。
【図１８】ヒト脳切片を用いての選択認識的に評価したケースについてのＡＤＤＬ ＩＨＣ解析。
【図１９】多数の正常な対象とＡＤと診断された対象についてのバイオバーコードアッセイから放出したバーコードＤＮＡの検出により生成したデータのスキャッタープロット解析。（例えば、Georganopoulou, D.G. et al. (2005) Nanoparticle-based detection in cerebral spinal fluid of a soluble pathogenic biomarker for Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(7):2273-76を参照のこと）。
【図２０】ＥＬＩＳＡで検出した２６ ＤＩＶ海馬細胞培養に対する、ＡＤＤＬ濃度依存性の結合。培養物をＡＤＤＬと一緒に１時間３７℃でインキュベートし、モノクローナル２Ｂ４又は２０Ｃ２抗体で標識し、そしてＨＲＰ連結抗マウスＩｇＧ二次抗体を用いて検出した。個々の読み取り（白色の記号）、平均（黒色の記号；ｎ＝６）及びＳＥＭ（棒）をプロットする。
【図２１】抗ＡＤＤＬモノクローナル抗体２Ｂ４を用いての点状の結合（「ホットスポット」）免疫蛍光アッセイ。in vitroで調製したＡＤＤＬ及びヒト脳抽出物から単離した内因性ＡＤＤＬを培養海馬細胞に加え、そして２Ｂ４モノクローナル抗体を用いて検出した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロイドβ（Ａｂｅｔａ）１−４２の可溶性オリゴマーと選択的に結合するモノクローナル抗体を含んで成る組成物。
【請求項２】
アミロイドβ（Ａｂｅｔａ）の可溶性オリゴマーをアッセイする方法であって、モノクローナル抗体を当該オリゴマーに添加する工程及び当該オリゴマーに対する前記抗体の効果を決定する工程を含んで成る方法。
【請求項３】
試料中のアミロイドβ（Ａｂｅｔａ）の可溶性オリゴマーを検出する方法であって、当該試料を、アミロイドβ（Ａｂｅｔａ）１−４２の可溶性オリゴマーと選択的に結合するモノクローナル抗体と接触させる工程及び当該試料中のオリゴマー量を決定する工程を含んで成る方法。
【請求項１】
アミロイドβ（Ａｂｅｔａ）１−４２の可溶性オリゴマーと選択的に結合するモノクローナル抗体を含んで成る組成物。
【請求項２】
アミロイドβ（Ａｂｅｔａ）の可溶性オリゴマーをアッセイする方法であって、モノクローナル抗体を当該オリゴマーに添加する工程及び当該オリゴマーに対する前記抗体の効果を決定する工程を含んで成る方法。
【請求項３】
試料中のアミロイドβ（Ａｂｅｔａ）の可溶性オリゴマーを検出する方法であって、当該試料を、アミロイドβ（Ａｂｅｔａ）１−４２の可溶性オリゴマーと選択的に結合するモノクローナル抗体と接触させる工程及び当該試料中のオリゴマー量を決定する工程を含んで成る方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【公表番号】特表２００８−５１３７３２（Ｐ２００８−５１３７３２Ａ）
【公表日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２０４６６（Ｐ２００７−５２０４６６）
【出願日】平成１７年７月５日（２００５．７．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２３９５８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１４４７８
【国際公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【出願人】（５９６０５７８９３）ノースウエスタン ユニバーシティ (35)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月５日（２００５．７．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２３９５８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１４４７８
【国際公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【出願人】（５９６０５７８９３）ノースウエスタン ユニバーシティ (35)
【Ｆターム（参考）】
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