アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスおよび関連生物体からの好熱性および好熱好酸性グリコシル化遺伝子および酵素、方法
アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスから単離および／または精製されたポリペプチドならびに単離および／または精製されたアリサイクロバチルス・アシドカルダリウス由来ポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。さらに、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスから単離および／または精製されたポリペプチドおよび核酸配列を使用して、タンパク質をグリコシル化および／または翻訳後に修飾するための方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本願は、「ＴＨＥＲＭＯＰＨＩＬＩＣ ＡＮＤ ＴＨＥＲＭＯＡＣＩＤＯＰＨＩＬＩＣ ＧＬＹＣＯＳＹＬＡＴＩＯＮ ＧＥＮＥＳ ＡＮＤ ＥＮＺＹＭＥＳ ＦＲＯＭ ＡＬＩＣＹＣＬＯＢＡＣＩＬＬＵＳ ＡＣＩＤＯＣＡＬＤＡＲＩＵＳ ＡＮＤ ＲＥＬＡＴＥＤ ＯＲＧＡＮＩＳＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ」と題する２００８年２月２７日出願の米国仮特許出願第６１／０３１，９８４号の出願日の利益を主張する。
【０００２】
政府の権利
米国政府は、米国エネルギー省（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ）とＢａｔｔｅｌｌｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ａｌｌｉａｎｃｅ， ＬＬＣとの間の契約番号ＤＥ−ＡＣ０７−９９ＩＤ１３７２７および契約番号ＤＥ−ＡＣ０７−０５ＩＤ１４５１７に従って、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明は、概して、バイオテクノロジーに関する。より具体的には、本発明は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスから単離および／または精製されたポリペプチドならびに単離および／または精製されたアリサイクロバチルス・アシドカルダリウス由来ポリペプチドをコードする核酸配列と、それらの使用のための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
細菌は概して細菌のタンパク質をグリコシル化しないとつい最近まで信じられてきた。いくつかの事例が報告されているが、これらは、まれな例外として取り合われなかった（Ｂｏｒｍａｎ ２００６）。細菌が実際には恐らく真核生物よりも多くの様式で細菌のタンパク質をグリコシル化することが、現在ますます認められているが、この考えは、まだ広く知られていない（Ｓｃｈaｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．２００１）。近年の総説では、グリコシル化がタンパク質安定性を助け、溶解度等の物理的性質を調節し、タンパク質分解を防ぎ、活性プロファイルを修正し、外在化を標的とすることが示されたことが述べられている（Ｕｐｒｅｔｉ ｅｔ ａｌ．２００３）。１９９４年、あるグループが、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスからアミラーゼを精製し、活発な成長の間、アミラーゼが細胞に結合し、グリコシル化されず、不溶性であることを示した（Ｓｃｈｗｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．１９９４）。培養が定常期に入ると、該細胞はアミラーゼのいくつかの可溶性グリコシル化型を培地中に放出した（Ｓｃｈｗｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．１９９４）。種々の種類のアミラーゼの活性を比較する試みは行われなかった。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の実施形態は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノムの精製および／または単離されたヌクレオチド配列、またはその相同体あるいは断片に関する。 本発明の一実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０、またはそれらの相同体もしくは断片のうちの少なくとも１つから選択される。本発明の別の実施形態では、該相同体は、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０のうちの少なくとも１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成る群より選択される。
【０００６】
本発明の実施形態は、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離および／または精製された核酸配列にさらに関連し得る。
【０００７】
また、本発明の実施形態は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノムのヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる単離および／または精製されたポリペプチド、またはそれらの相同体あるいは断片に関する。 一実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０のうちの少なくとも１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【０００８】
本発明の別の実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０、またはそれらの相同体もしくは断片のうちの少なくとも１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、該ポリペプチドは、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、該ポリペプチドは、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【０００９】
本発明の実施形態では、該ポリペプチドは、好酸性および／または好熱性であってもよい。 さらなる実施形態では、該ポリペプチドは、グリコシル化、ペグ化、および／または別様に翻訳後に修飾されてもよい。
【００１０】
方法の実施形態は、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択される第２のポリペプチドを使用して、第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップを含む。
【００１１】
方法のさらなる実施形態は、第１のポリペプチドのタンパク質安定性、溶解度、分解、活性プロファイル、および／または外在化を調節する方法を含み、該方法は、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択される第２のポリペプチドを用いて、第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップを含む。
【００１２】
方法のさらなる実施形態は、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む組み換え、精製、および／または単離されたヌクレオチド配列、および／または摂氏約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、および／または９５度以上の温度、および／または８、７、６、５、４、３、２、１、および／または０以下および／または以上のｐＨを含む環境において、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択される組み換え、精製、および／または単離されたポリペプチドを産生またはコードする細胞を配置するステップを含む。
【００１３】
本発明のこれらおよび他の側面は、本明細書に含有される教示に照らして、当業者には明白となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】配列番号１（ＲＡＡＣ００１６４）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２２３７７５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿７２９２９０．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１０８４４４０．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１０７９１５０．１｜、およびｒｅｆ｜ＺＰ＿０１４７１５９４．１｜（配列番号３〜７）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図２】配列番号１８（ＲＡＡＣ００５１７）と、ｒｅｆ｜ＺＰ＿００５８９５３３．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１３８６４３５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿３７８５３３．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿００５１３１５８．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿３７４１７３．１｜（配列番号２０〜２４）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１８に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図３】配列番号３５（ＲＡＡＣ００６５０）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１２７１８３．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２０３８５０４．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６４７９８７．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３７７１１４．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿８３５０８１．１｜（配列番号３７〜４１）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号３５に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図４】配列番号５２（ＲＡＡＣ００９９１）と、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２３２７４１２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４８７２０７．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１１７２７６５．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿８３１３１４．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿８４４００８．１｜（配列番号５４〜５８）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号５２に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図５Ａ】配列番号６９（ＲＡＡＣ０１１１０）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５１９８５６．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿７１１６８８．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１３３１９３１．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１０７６９５５．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿３３６４４０．１｜（配列番号７１〜７５）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号６９に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図５Ｂ】配列番号６９（ＲＡＡＣ０１１１０）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５１９８５６．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿７１１６８８．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１３３１９３１．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１０７６９５５．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿３３６４４０．１｜（配列番号７１〜７５）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号６９に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図６Ａ】配列番号８６（ＲＡＡＣ０１１６６）と、ｇｂ｜ＡＡＲ９９６１５．１｜、ｇｂ｜ＡＢＭ６８３３４．２｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１３７２２４８．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿５１９５５５．１｜、およびｒｅｆ｜ＺＰ＿０２２３４０７７．１｜（配列番号８８〜９２）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号８６に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図６Ｂ】配列番号８６（ＲＡＡＣ０１１６６）と、ｇｂ｜ＡＡＲ９９６１５．１｜、ｇｂ｜ＡＢＭ６８３３４．２｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１３７２２４８．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿５１９５５５．１｜、およびｒｅｆ｜ＺＰ＿０２２３４０７７．１｜（配列番号８８〜９２）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号８６に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図７】配列番号１０３（ＲＡＡＣ０１１６７）と、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１５１５２１２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２７７６４３．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２２９１４００．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６３３７２７．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４３４３５７．１｜（配列番号１０５〜１０９）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１０３に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図８Ａ】配列番号１２０（ＲＡＡＣ０１１７０）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３２４５９２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿３４２７７６．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿７８０９７５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６３６８３０．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２９９０２６．１｜（配列番号１２２〜１２６）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１２０に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図８Ｂ】配列番号１２０（ＲＡＡＣ０１１７０）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３２４５９２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿３４２７７６．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿７８０９７５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６３６８３０．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２９９０２６．１｜（配列番号１２２〜１２６）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１２０に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図９】配列番号１３７（ＲＡＡＣ０１２４８）と、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２１７０１６０．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１１７１８９５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿０７６６４６．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿５９０９１０．１｜、およびｒｅｆ｜ＺＰ＿０２１７５４１０．１｜（配列番号１３９〜１４３）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１３７に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１０Ａ】配列番号１５４（ＲＡＡＣ０１３４８）と、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１６６５２８９．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１６４３３５０．１｜、ｇｂ｜ＡＡＷ７７１６７．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿４５２７２２．１｜、およびｒｅｆ｜ＺＰ＿０２２４１７８７．１｜（配列番号１５６〜１６０）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１５４に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１０Ｂ】配列番号１５４（ＲＡＡＣ０１３４８）と、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１６６５２８９．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１６４３３５０．１｜、ｇｂ｜ＡＡＷ７７１６７．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿４５２７２２．１｜、およびｒｅｆ｜ＺＰ＿０２２４１７８７．１｜（配列番号１５６〜１６０）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１５４に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１１】配列番号１７１（ＲＡＡＣ０１３７７）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿１４７９５２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿５２０６７０．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３９５８０９．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３０９７０１．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６４３６６０．１｜（配列番号１７３〜１７７）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１７１に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１２】配列番号１８８（ＲＡＡＣ０１６１１）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿１４６２１４．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１２４４６３．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿８６５２６２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿４２６０１３．１｜、およびｒｅｆ｜ＺＰ＿０１８８５５２６．１｜（配列番号１９０〜１９４）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１８８に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１３Ａ】配列番号２０５（ＲＡＡＣ０１６１２）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿１４６２１５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１２４４６４．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿０７４９４８．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１０３９５０３．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿６２１７７０．１｜（配列番号２０７〜２１１）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号２０５に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１３Ｂ】配列番号２０５（ＲＡＡＣ０１６１２）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿１４６２１５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１２４４６４．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿０７４９４８．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１０３９５０３．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿６２１７７０．１｜（配列番号２０７〜２１１）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号２０５に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１４Ａ】配列番号２２２（ＲＡＡＣ０１９２６）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１０３８２０２．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１６６７５８７．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１５７５３０１．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２１１０２０．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿５１６４６５．１｜（配列番号２２４〜２２８）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号２２２に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１４Ｂ】配列番号２２２（ＲＡＡＣ０１９２６）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１０３８２０２．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１６６７５８７．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１５７５３０１．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２１１０２０．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿５１６４６５．１｜（配列番号２２４〜２２８）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号２２２に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１５】配列番号２３９（ＲＡＡＣ０１９９８）と、ｒｅｆ｜ＮＰ＿３４８９４０．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿７２１２４４．１｜、ｄｂｊ｜ＢＡＣ７５７００．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿００６０５１２３．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿０１５３２９．１｜（配列番号２４１〜２４５）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号２３９に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１６】配列番号２５６（ＲＡＡＣ０２０１１）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿７５４８１９．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿１８４３２２．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿５７７７８７．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿１４２０６８．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿１２５７５１．１｜（配列番号２５８〜２６２）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号２５６に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１７Ａ】配列番号２７３（ＲＡＡＣ０２３８１）と、ｒｅｆ｜ＮＰ＿６２２１７７．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿８４８８５８．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３７４６８８．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿４７００３９．１｜、およびｒｅｆ｜ＺＰ＿０１９２９３２５．１｜（配列番号２７５〜２７９）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号２７３に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１７Ｂ】配列番号２７３（ＲＡＡＣ０２３８１）と、ｒｅｆ｜ＮＰ＿６２２１７７．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿８４８８５８．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３７４６８８．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿４７００３９．１｜、およびｒｅｆ｜ＺＰ＿０１９２９３２５．１｜（配列番号２７５〜２７９）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号２７３に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１８】配列番号２９０（ＲＡＡＣ０２４２１）と、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１７２１８１１．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿２４１８９７．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４８６１０１．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１１７０５３２．１｜、およびｒｅｆ｜ＺＰ＿０２３２７９９４．１｜（配列番号２９２〜２９６）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号２９０に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１９】配列番号３０９（ＲＡＡＣ０１１６８）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６６３８８０．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１８１３３２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿６７５１４３．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００２３５２８２１．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１１４４５４．１｜（配列番号３１１〜３１５）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号３０９に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の実施形態は、好熱好酸菌アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのタンパク質のグリコシル化および／または翻訳後修飾に関連する遺伝子および関連タンパク質を含む。これらのプロセスに関連する遺伝子のためのコード配列は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノムの配列決定から生成される配列情報から決定した。これらの遺伝子およびタンパク質は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスまたは他の生物体の代謝工学の標的を表し得る。タンパク質のグリコシル化および／または翻訳後修飾に関連する、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノム内で発見したヌクレオチド配列、およびそれによってコードされるアミノ酸の限定されない例を、表１に記載する。グリコシルトランスフェラーゼおよび／または翻訳後修飾タンパク質は、以下の分類であってもよいがこれらに限定されない。ＵＤＰ β−グルコースホスホトランスフェラーゼ、ドリコール−リン酸マンノシルトランスフェラーゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼ、ならびにその他。
【００１６】
本発明の実施形態は、部分的に、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの遺伝子および／またはタンパク質を含む遺伝子配列および／またはタンパク質配列に関する。含まれる遺伝子およびタンパク質は、タンパク質のグリコシル化および／または翻訳後修飾に関与する遺伝子およびタンパク質である。細胞内酵素活性は、本質的に好熱性および／または好酸性であり得、同様の遺伝子の一般的な例を本文献に記載する。遺伝子、配列、酵素、および因子の種類としては、表１に記載するものが挙げられるがそれらに限定されない。
【００１７】
【表１】
【００１８】
本発明は、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０、またはそれらの断片のうちの１つの配列から選択されるアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノムの単離および／または精製されたヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチド配列に関する。
【００１９】
同様に、本発明は、単離および／または精製されたヌクレオチド配列を記載し、該配列が、ａ）配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０、またはそれらの断片のうちの１つの配列のうちの少なくとも１つのヌクレオチド配列、ｂ）ａ）に定義されるようなヌクレオチド配列と相同のヌクレオチド配列、ｃ）ａ）またはｂ）に定義されるようなヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、およびそれらの対応するＲＮＡのヌクレオチド配列、ｄ）ストリンジェントな条件下でａ）、ｂ）、またはｃ）に定義されるような配列とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列、ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）、またはｄ）に定義されるような配列を含むクレオチド配列、およびｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、またはｅ）に定義されるようなヌクレオチド配列によって修飾されるヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする。
【００２０】
ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または核酸配列は、本発明に従って、モノマーおよびダイマー（いわゆる、タンデム）形態における二本鎖または一本鎖ＤＮＡと該ＤＮＡの転写産物の両方を意味するものと理解されたい。
【００２１】
本発明の態様は、単離、精製、または部分的に精製可能なヌクレオチド配列に関し、例えば、イオン交換クロマトグラフィーに、分子サイズに基づく排除クロマトグラフィー、または親和性クロマトグラフィー、あるいは代替として、異なる溶媒中の溶解度に基づく分画技術等の分離方法から開始する、もしくは増幅、クローニング、およびサブクローニング等の遺伝子工学の方法から開始し、本発明の配列は、ベクターによって媒介されることが可能である。
【００２２】
本発明に従った単離および／または精製されたヌクレオチド配列断片は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノムの任意のヌクレオチド断片を指すものとして理解され、非制限的な例として、その由来する配列の少なくとも８、１２、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、１０００以上の連続的ヌクレオチド長が含まれる場合がある。
【００２３】
本発明による単離および／または精製されたヌクレオチド配列の特異的断片は、整合およびアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノム配列の対応する断片との比較後、異なる性質の少なくとも１つのヌクレオチドつまり塩基を有するアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノムの任意のヌクレオチド断片を指すものと理解されたい。
【００２４】
本発明の意味において、相同の単離および／または精製されたヌクレオチド配列は、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、または９９．７％の本発明によるヌクレオチド配列の塩基と少なくとも同一率を有する単離および／または精製されたヌクレオチド配列を意味するものと理解され、本パーセンテージは、純粋に、統計的であって、２つのヌクレオチド配列間の差異を無作為におよびそれらの長さ全体にわたって、分布させることができる。
【００２５】
本発明の意味において、特異的相同ヌクレオチド配列は、上述のような特異的断片の少なくとも１つのヌクレオチド配列を有する相同ヌクレオチド配列を意味するものと理解される。該「特異的」相同配列は、例えば、該ゲノム配列、またはアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノムの変異体を表すその断片の配列に対応する配列を含むことが可能である。したがって、これらの特異的相同配列は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの株内の突然変異体に関連する変型に対応し、特に、少なくとも１つのヌクレオチドの切断、置換、欠失および／または付加に対応し得る。同様に、該相同配列は、遺伝子コードの縮退に関連する変型に対応し得る。
【００２６】
用語「配列相同性の程度つまりパーセンテージ」は、本願に定義されるように、「最適整合後の２つの配列間の配列同一性の程度つまりパーセンテージ」を指す。
２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列は、後述のように、最大一致のために整合されると、アミノ酸またはヌクレオチド残基の配列が、２つの配列内において、同じである場合、「同一である」と言える。２つ（以上）のペプチドまたはポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、セグメントまたは「比較域」にわたる２つの最適に整合された配列の配列を比較し、配列類似性の局所的領域を同定および比較することによって行なわれる。比較のための配列の最適整合は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄ． Ａｐｐ． Ｍａｔｈ ２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３（１９７０）の相同性整合アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８５：２４４４（１９８８）の類似方法の検索によって、コンピュータによるこれらのアルゴリズムの実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査によって、行なわれ得る。
【００２７】
「配列同一性のパーセンテージ」（または、同一性の程度）は、配列比較用ウインドウにわたる２つの最適に整合された配列を比較することによって決定され、配列比較用ウインドウ内のペプチドまたはポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適整合のための参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含む場合がある。該パーセンテージは、同一のアミノ酸残基または核酸塩基が両配列内で生じる位置の数を決定し、整合位置の数を求め、整合位置の数を配列比較用ウインドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛け、配列同一性のパーセンテージを求めることによって計算される。
【００２８】
上述の配列同一性の定義は、当業者によって使用される可能性のある定義である。定義自体は、任意のアルゴリズムの支援を必要とせず、該アルゴリズムは、配列同一性の計算ではなく、配列の最適整合を達成するためにのみ有用である。
【００２９】
上述の定義から、２つの比較される配列間の配列同一性に対し、明確かつ１つのみの値が存在し、その値は、最善つまり最適整合のために求められた値に対応するということになる。
【００３０】
ウェブサイト（ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ）から利用可能であって、２つの配列間の同一性を比較および判断するのに、発明者と概して当業者によって、習慣的に使用されるソフトウェアであるＢＬＡＳＴ ＮまたはＢＬＡＳＴ Ｐ「ＢＬＡＳＴ ２配列」では、比較される配列長に応じるギャップコストは、ソフトウェアによって直接選択される（すなわち、長さ＞８５の場合、置換マトリクスＢＬＯＳＵＭ−６２に対して１１．２）。
【００３１】
本発明の配列の相補的ヌクレオチド配列は、任意のＤＮＡを意味するものと理解され、そのヌクレオチドは、本発明の配列のものに相補的であって、その配向は、逆転される（アンチセンス配列）。
【００３２】
本発明によるヌクレオチド配列とのストリンジェンシーの条件下のハイブリダイゼーションは、相補的ＤＮＡの２つの断片間のハイブリダイゼーションを維持可能なように選択される、温度およびイオン強度条件下のハイブリダイゼーションを意味するものとして理解される。
【００３３】
例示目的で、上述のヌクレオチド断片を定義する目的としてのハイブリダイゼーションステップの高ストリンジェンシー条件は、有利には、以下である。
該ハイブリダイゼーションは、ＳＳＣ緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０５Ｍクエン酸ナトリウムに対応する１ｘＳＳＣ）の存在下、６５℃の選択的温度で実行される。洗浄ステップは、例えば、以下であり得る。周囲温度の２ｘＳＳＣに続いて、それぞれ１０分間、６５℃の２ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳと、６５℃の２ｘ０．５ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳによる２回の洗浄を行なう。
【００３４】
例えば、２ｘＳＳＣ緩衝液の存在下における４２℃の温度の中度のストリンジェンシー、または例えば、２ｘＳＳＣ緩衝液の存在下における３７℃の温度の低度のストリンジェンシーの条件は、それぞれ、２つの配列間のハイブリダイゼーションのために、全体的相補性をほとんど必要としない。
【００３５】
サイズが約３５０の塩基のポリヌクレオチドのための上述のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９の教示に従って、当業者によって、より大きいまたは小さいサイズのオリゴヌクレオチドに適合される。
【００３６】
本発明による単離および／または精製されたヌクレオチド配列の中には、本発明による相同配列を得ることを可能にする方法において、プライマーまたはプローブとして使用可能なものが含まれ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸クローニング、および シークエンシング等のこれらの方法は、当業者に周知である。
【００３７】
本発明による該単離および／または精製された該ヌクレオチド配列のうち、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０、それらの断片のうちの１つ、または後述のようなそれらの変異体のうちの１つの存在を診断可能にする方法において、プライマーまたはプローブとして使用可能なものが同様に好まれる。
【００３８】
本発明によるヌクレオチド配列断片は、例えば、ＰＣＲ等の特異的増幅によって、または本発明によるヌクレオチド配列の適切な制限酵素による消化後、得ることが可能であって、これらの方法は、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９の研究に記載されている。同様に、そのような代表的断片は、当業者に周知の方法に従って、化学合成によって得ることが可能である。
【００３９】
修飾ヌクレオチド配列は、当業者に周知の技術に従って、突然変異生成によって得られ、本発明による正常配列に対する修飾、例えば、特に、該ポリペプチドの発現率の修飾または複製サイクルの変調につながるポリペプチド発現の調節配列および／またはプロモーター配列における突然変異を含有する任意のヌクレオチド配列を意味するものとして理解されたい。
【００４０】
同様に、修飾ヌクレオチド配列は、後述のような修飾ポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列を意味するものとして理解されたい。
本発明は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの単離および／または精製されたヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列に関し、該配列が、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０、またはそれらの断片のうちの１つの配列から選択されることを特徴とする。
【００４１】
同様に、本発明の実施形態は、単離および／または精製されたヌクレオチド配列に関し、該配列が、ａ）配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０、またはそれらの断片のうちの１つのヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つ、ｂ）ａ）に定義されるような配列の特異的断片のヌクレオチド配列、ｃ）ａ）またはｂ）に定義されるような配列と少なくとも８０％の同一性を有する、相同ヌクレオチド配列、ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）に定義されるような配列に対応する相補的ヌクレオチド配列、またはＲＮＡの配列、およびｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）、またはｄ）に定義されるような配列によって修飾されるヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする。
【００４２】
本発明による単離および／または精製ヌクレオチド配列の中には、配列番号１３〜１７、３０〜３４、４７〜５１、６４〜６８、８１〜８５、９８〜１０２、１１５〜１１９、１３２〜１３６、１４９〜１５３、１６６〜１７０、１８３〜１８７、２００〜２０４、２１７〜２２１、２３４〜２３８、２５１〜２５５、２６８〜２７２、２８５〜２８９、３０２〜３０６、３１９〜３２３、３３６〜３４０、３５３〜３５７、３７０〜３７４、３８７〜３９１、４０４〜４０８、４２１〜４２５、４３８〜４４２、４５５〜４５９、４７２〜４７６、４８９〜４９３、５０６〜５１０、５２３〜５２７、５４０〜５４４、５５７〜５６１、５７４〜５７８、５９１〜５９５、６０８〜６１２、６２５〜６２９、６４２〜６４６、６５９〜６６３、６７６〜６８０、６９３〜６９７、７１０〜７１４、７２７〜７３１、７４４〜７４８、７６１〜７６５、７７８〜７８２、および３２１〜３２５、またはそれらの断片のヌクレオチド配列、ならびに配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０、またはそれらの断片の配列のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、または９９．７％の同一性を有する任意の単離および／または精製されたヌクレオチド配列が含まれる。該相同配列は、例えば、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノム配列に対応する配列を含むことが可能である。同様に、これらの特異的相同配列は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの株内の突然変異と関連した変型に対応し、特に、少なくとも１つのヌクレオチドの切断、置換、欠失および／または付加に対応し得る。 当業者には明らかであるように、そのような相同体は、標準的な技術およびＢＬＡＳＴ等の公的に入手可能なコンピュータプログラムを使用して、容易に作製及び同定される。したがって、上記で言及された各相同体は、本明細書に記載され、十分に説明されたものとみなされるべきである。
【００４３】
本発明の実施形態は、本発明によるヌクレオチド配列によってコードされる単離および／または精製されたポリペプチドあるいはその断片を含み、その断片の配列は、断片（のヌクレオチド配列）によって表される。アミノ酸配列は、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０のうちの少なくとも１つの３つの可能な読み枠のうちの１つに従ってコード可能な単離および／または精製されたポリペプチドに対応する。
【００４４】
同様に、本発明の実施形態は、単離および／または精製されたポリペプチドに関し、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９、またはそれらの断片のうちの１つのアミノ酸配列から選択されるポリペプチドを含むことを特徴とする。
【００４５】
本発明の実施形態による単離および／または精製されたポリペプチドの中には、アミノ酸配列番号８〜１２、２５〜２９、４２〜４６、５９〜６３、７６〜８０、９３〜９７、１１０〜１１４、１２７〜１３１、１４４〜１４８、１６１〜１６５、１７８〜１８２、１９５〜１９９、２１２〜２１６、２２９〜２３３、２４６〜２５０、２６３〜２６７、２８０〜２８４、２９７〜３０１、３１４〜３１８、３３１〜３３５、３４８〜３５２、３６５〜３６９、３８２〜３８６、３９９〜４０３、４１６〜４２０、４３３〜４３７、４５０〜４５４、４６７〜４７１、４８４〜４８８、５０１〜５０５、５１８〜５２２、５３５〜５３９、５５２〜５５６、５６９〜５７３、５８６〜５９０、６０３〜６０７、６２０〜６２４、６３７〜６４１、６５４〜６５８、６７１〜６７５、６８８〜６９２、７０５〜７０９、７２２〜７２６、７３９〜７４３、７５６〜７６０、７７３〜７７７、および３１６〜３２０、もしくはそれらの断片の単離および／もしくは精製されたポリペプチド、または配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９、もしくはその断片の配列のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、もしくは９９．７％同一の相同性を有する任意の他の単離および／もしくは精製されたポリペプチドが含まれる。当業者には明らかであるように、そのような相同体は、標準的な技術およびＢＬＡＳＴ等の公的に入手可能なコンピュータプログラムを使用して、容易に作製及び同定される。したがって、上記で言及された各相同体は、本明細書に記載され、十分に説明されたものとみなされるべきである。
【００４６】
本発明の実施形態はまた、該ポリペプチドに関し、ａ）本発明によるアミノ酸配列のポリペプチドの少なくとも５つのアミノ酸の特異的断片、ｂ）ａ）に定義されるようなポリペプチドと相同のポリペプチド、ｃ）ａ）またはｂ）に定義されるようなポリペプチドの特異的生物活性断片、およびｄ）ａ）、ｂ）、またはｃ）に定義されるようなポリペプチドによって修飾されるポリペプチドから選択されるポリペプチドを含むことを特徴とする。
【００４７】
本説明では、ポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質という用語は、同義的に使用される。
本発明の実施形態では、本発明による単離および／または精製されたポリペプチドは、グリコシル化、ペグ化、および／または別様に翻訳後に修飾されてもよい。 さらなる実施形態では、グリコシル化、ペグ化、および／または他の翻訳後修飾は、生体内または生体外で生じてもよく、化学的技術を使用して行なわれてもよい。付加的実施形態では、任意のグリコシル化、ぺグ化、および／または他の翻訳後修飾は、Ｎ結合型またはＯ結合型であってもよい。
【００４８】
本発明の実施形態では、本発明による単離および／または精製されたポリペプチドのいずれか１つは、摂氏約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、および／もしくは９５度以上の温度で酵素的もしくは機能的に活性であってもよく、ならびに／あるいは８、７、６、５、４、３、２、１、および／もしくは０以下および／または以上のｐＨで酵素的もしくは機能的に活性であってもよい。本発明のさらなる実施形態では、グリコシル化、ぺグ化、および／または他の翻訳後修飾は、８、７、６、５、４、３、２、１、および／または０以下のｐＨ、もしくは摂氏約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、および／または９５度以上の温度で、酵素的もしくは機能的に活性である本発明による単離および／または精製ポリペプチドのために必要とされてもよい。
【００４９】
本発明の態様は、天然源から精製によって単離される、または得られるか、あるいは遺伝子組み換えによって、または代替として化学合成によって得られ、したがって、後述のように、非天然アミノ酸を含有し得る、ポリペプチドに関する。
【００５０】
本発明の実施形態による「ポリペプチド断片」は、少なくとも５つの連続的アミノ酸、好ましくは、１０の連続的アミノ酸または１５の連続的アミノ酸を含有するポリペプチドを指すものとして理解される。
【００５１】
本発明では、特異的ポリペプチド断片は、本発明による特異的断片ヌクレオチド配列によってコードされる連続的ポリペプチド断片を指すものとして理解される。
「相同ポリペプチド」は、天然ポリペプチドに対して、特に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加、あるいは置換、切断、延長、キメラ融合、および／または突然変異等のある修飾を有するポリペプチドを指すものとして理解されたい。相同ポリペプチドのうち、そのアミノ酸配列が、本発明によるポリペプチドのアミノ酸の配列と少なくとも８０％または９０％の相同性を有するものが好ましい。
【００５２】
「特異的相同ポリペプチド」は、上述のような、本発明によるポリペプチドの特異的断片を有する相同ポリペプチドを指すものと理解されたい。
置換の場合、１つもしくは複数の連続的または非連続的アミノ酸が、「等価」アミノ酸に置き換えられる。「等価」アミノ酸という表現は、塩基構造のアミノ酸の１つによって置換可能であるが、本質的に、対応するペプチドの生物活性を修飾せず、以下によって定義されるような任意のアミノ酸を指すことを目的とする。当業者には明らかであるように、そのような置換は、標準的な分子生物学技術およびＢＬＡＳＴ等の公的に入手可能なコンピュータプログラムを使用して、容易に作製及び同定される。したがって、上記で言及された各置換は、本明細書に記載され、十分に説明されたものとみなされるべきである。アミノ酸配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９におけるそのような置換の例として、アミノ酸配列番号８〜１２、２５〜２９、４２〜４６、５９〜６３、７６〜８０、９３〜９７、１１０〜１１４、１２７〜１３１、１４４〜１４８、１６１〜１６５、１７８〜１８２、１９５〜１９９、２１２〜２１６、２２９〜２３３、２４６〜２５０、２６３〜２６７、２８０〜２８４、２９７〜３０１、３１４〜３１８、３３１〜３３５、３４８〜３５２、３６５〜３６９、３８２〜３８６、３９９〜４０３、４１６〜４２０、４３３〜４３７、４５０〜４５４、４６７〜４７１、４８４〜４８８、５０１〜５０５、５１８〜５２２、５３５〜５３９、５５２〜５５６、５６９〜５７３、５８６〜５９０、６０３〜６０７、６２０〜６２４、６３７〜６４１、６５４〜６５８、６７１〜６７５、６８８〜６９２、７０５〜７０９、７２２〜７２６、７３９〜７４３、７５６〜７６０、７７３〜７７７、および３１６〜３２０の単離および／または精製されたポリペプチドが含まれる場合がある。これらの等価アミノ酸は、置換アミノ酸とのその構造的相同性、または実行可能な異なるポリペプチド間の生物活性の比較試験の結果に応じて、決定可能である。
【００５３】
非制限的な例として、対応する修飾ポリペプチドの生物活性の広範囲にわたる修飾をもたらすことなく実行可能な置換の可能性として、例えば、バリンまたはイソロイシンによるロイシン、グルタミン酸によるアスパラギン酸、アスパラギンによるグルタミン、リジンによるアルギニン等の置き換えが挙げられるが、当然ながら、反転置換も、同条件下で想定可能である。
【００５４】
さらなる実施形態では、置換は、類似同定酵素活性を有する他のタンパク質の中に保存されないアミノ酸の置換に制限される。 例えば、当業者は、同様の生物体において同一機能のタンパク質を整合し、どのアミノ酸が該機能のタンパク質の間で概して保存されるかを決定することができる。そのような整合を生成するために使用し得るプログラムの一例は、ＮＣＢＩによって提供されるデータベースと併せたｗｏｒｄｌｗｉｄｅｗｅｂ．ｃｈａｒｉｔｅ．ｄｅ／ｂｉｏｉｎｆ／ｓｔｒａｐ／である。そのようなポリペプチドの例として、アミノ酸配列番号８〜１２、２５〜２９、４２〜４６、５９〜６３、７６〜８０、９３〜９７、１１０〜１１４、１２７〜１３１、１４４〜１４８、１６１〜１６５、１７８〜１８２、１９５〜１９９、２１２〜２１６、２２９〜２３３、２４６〜２５０、２６３〜２６７、２８０〜２８４、２９７〜３０１、３１４〜３１８、３３１〜３３５、３４８〜３５２、３６５〜３６９、３８２〜３８６、３９９〜４０３、４１６〜４２０、４３３〜４３７、４５０〜４５４、４６７〜４７１、４８４〜４８８、５０１〜５０５、５１８〜５２２、５３５〜５３９、５５２〜５５６、５６９〜５７３、５８６〜５９０、６０３〜６０７、６２０〜６２４、６３７〜６４１、６５４〜６５８、６７１〜６７５、６８８〜６９２、７０５〜７０９、７２２〜７２６、７３９〜７４３、７５６〜７６０、７７３〜７７７、および３１６〜３２０に見られるようなものが含まれ得るが、それらに制限されない。
【００５５】
したがって、本発明の一実施形態によると、置換または突然変異は、該機能を有するタンパク質の間で概して保存される位置で成される場合がある。さらなる実施形態では、核酸配列は、それらがコードするアミノ酸が変化（縮重置換および突然変異）しないように突然変異または置換され、および／または任意の結果として生じるアミノ酸置換または突然変異が、概してその機能のタンパク質の中に保存される位置で成されるように突然変異または置換される場合がある。そのような核酸配列の例として、配列番号１３〜１７、３０〜３４、４７〜５１、６４〜６８、８１〜８５、９８〜１０２、１１５〜１１９、１３２〜１３６、１４９〜１５３、１６６〜１７０、１８３〜１８７、２００〜２０４、２１７〜２２１、２３４〜２３８、２５１〜２５５、２６８〜２７２、２８５〜２８９、３０２〜３０６、３１９〜３２３、３３６〜３４０、３５３〜３５７、３７０〜３７４、３８７〜３９１、４０４〜４０８、４２１〜４２５、４３８〜４４２、４５５〜４５９、４７２〜４７６、４８９〜４９３、５０６〜５１０、５２３〜５２７、５４０〜５４４、５５７〜５６１、５７４〜５７８、５９１〜５９５、６０８〜６１２、６２５〜６２９、６４２〜６４６、６５９〜６６３、６７６〜６８０、６９３〜６９７、７１０〜７１４、７２７〜７３１、７４４〜７４８、７６１〜７６５、７７８〜７８２、および３２１〜３２５、またはそれらの断片のヌクレオチド配列に見られるものが含まれ得るが、それらに制限されない。
【００５６】
同様に、特異的相同ポリペプチドは、上述のような特異的相同ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに対応し、したがって、本定義では、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス内に存在可能な変異体に突然変異または対応し、特に、少なくとも１つのアミノ酸残基の切断、置換、欠失、および／または付加に対応するポリペプチドを含む。
【００５７】
本発明の実施形態による「ポリペプチドの特異的生物活性断片」は、特に、本発明によるポリペプチドの特徴の少なくとも１つを有する上述のような特異的ポリペプチド断片を指すものとして理解されたい。 ある実施形態では、該ペプチドは、表１に概説されるタンパク質の種類のうちの少なくとも１つとして作用可能である。
【００５８】
本発明の実施形態によるポリペプチド断片は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス内に必然的に存在する単離または精製された断片に対応する、またはトリプシン、もしくはキモトリプシンもしくはコラゲナーゼ等のタンパク質酵素による、あるいは臭化シアン（ＣＮＢｒ）等の化学試薬による、該ポリペプチドの開裂によって得ることが可能な断片に対応し得る。同様に、そのようなポリペプチド断片は、適切な調節および／または発現要素の制御下で配置される該断片の発現を可能にする核酸を含有する、本発明による発現ベクターによって形質転換される宿主から、化学合成によってごく容易に調製可能である。
【００５９】
本発明の実施形態によるポリペプチドの「修飾ポリペプチド」は、正常配列に対して少なくとも１つの修飾を有する、後述のように、遺伝子組み換えまたは化学合成によって得られるポリペプチドを指すものとして理解される。これらの修飾は、特異性および／または活性の起点において、あるいは本発明によるポリペプチドの構造的立体配座、局所化、および膜内挿入能の起点において、アミノ酸に影響を及ぼすことが可能または不可能である場合がある。したがって、活性が等価、増加、または減少し、特異性が等価、より狭小、またはより広大なポリペプチドを生成することが可能となる。修飾ポリペプチドの中には、最大で５以上のアミノ酸が修飾、ＮまたはＣ末端において切断、またはさらに欠失もしくは付加可能であるポリペプチドに言及することが必要である。
【００６０】
示される真核または原核細胞に対する該変調を可能にする方法は、当業者には周知である。同様に、本発明による、後述のベクターを通して、該変調のための該修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を使用可能であることは周知である。
【００６１】
上述の修飾ポリペプチドは、コンビナトリアルケミストリーを使用することによって得ることが可能であって、例えば、複数のモデル、複数の細胞培養、または複数の生物体に対して試験し、最も活発なまたは求めた特性を有する化合物を選択する前に、ポリペプチドの一部を体系的に変更することが可能である。
【００６２】
同様に、化学合成は、非天然アミノ酸または非ペプチド結合を使用可能であるという利点を有する。
したがって、本発明によるポリペプチドの寿命を改良するために、非天然アミノ酸（例えば、Ｄ型）またはアミノ酸類似体（例えば、特に、含硫型）の使用に着目してもよい。
【００６３】
最終的に、本発明によるポリペプチド、その特異的、または修飾相同形態の構造をポリペプチド型または他の化学構造に統合することが可能となる。したがって、ＮおよびＣ末端において、プロテアーゼによって認識されない分子の提供に着目してもよい。
【００６４】
同様に、本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も、本発明の一部である。
同様に、本発明は、プライマーまたはプローブとして利用可能なヌクレオチド配列に関し、該配列が、本発明によるヌクレオチド配列から選択されることを特徴とする。
【００６５】
同様に、本発明は、種々の実施形態において、当業者に周知であって、特に、 後述のような手順による遺伝子組み換えまたは化学合成によって、天然ポリペプチドから精製して得ることが可能な、ヌクレオチド配列によってコードされるアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの特異的ポリペプチドに関することは十分理解されている。同様に、該ヌクレオチド配列によってコードされる該特異的ポリペプチドに対する標識または非標識モノあるいはポリクローナル抗体も、本発明によって包含される。
【００６６】
加えて、本発明の実施形態は、核酸配列の検出および／または増幅のためのプライマーまたはプローブとしての本発明によるヌクレオチド配列の使用に関する。
したがって、本発明の実施形態によるヌクレオチド配列を使用して、特に、ＰＣＲ技術（ポリメラーゼ連鎖反応）（Ｅｒｌｉｃｈ， １９８９、 Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９０、Ｒｏｌｆｓ ｅｔ ａｌ．， １９９１、およびＷｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９９７）によって、ヌクレオチド配列を増幅可能である。
【００６７】
これらのオリゴデオキシリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチドプライマーは、 有利には、少なくとも８つのヌクレオチド、好ましくは、少なくとも１２のヌクレオチド、さらにより好ましくは、少なくとも２０のヌクレオチドの長さを有する。
【００６８】
標的核酸の他の増幅技術が、有利には、ＰＣＲの代替として採用可能である。
同様に、本発明のヌクレオチド配列、特に本発明によるプライマーは、ＴＡＳ技術（転写増幅システム）（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、３ＳＲ技術（自家持続配列複製）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、ＮＡＳＢＡ技術（核酸増幅）（Ｋｉｅｖｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、ＳＤＡ技術（鎖置換増幅）（Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、ＴＭＡ技術（転写媒介性増幅）等、標的核酸の増幅の他の手順において採用可能である。
【００６９】
また、本発明のポリヌクレオチドは、熱安定性リガーゼを採用するＬＣＲ技術（リガーゼ連鎖反応）（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８（Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９９１によって改良））、ＲＣＲ技術（修復連鎖反応）（Ｓｅｇｅｖ，１９９２）、ＣＰＲ技術（サイクリングプローブ反応）（Ｄｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、Ｑ−βレプリカーゼによる増幅技術（Ｍｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８３（特に、Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９８６、Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８、その後、Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．ならびにＳｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６によって改良））等、プローブとしての役割を果たす核酸の増幅または修飾技術において採用可能である。
【００７０】
検出される標的ポリヌクレオチドが、可能性として、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡである場合、生物学的試料内に含有されるＲＮＡからｃＤＮＡを得るために、本発明による少なくとも１つのプライマーの支援による増幅反応の採用、または本発明の少なくとも１つのプローブの支援による検出手順の採用に先立って、逆転写型の酵素を使用することが可能となる。したがって、得られるｃＤＮＡは、本発明による増幅または検出手順において採用されるプライマーまたはプローブの標的としての役割を果たす。
【００７１】
検出プローブは、標的配列または標的配列から生成されるアンプリコンとハイブリダイズするように選択される。配列のために、そのようなプローブは、有利には、少なくとも１２のヌクレオチド、特に、少なくとも２０のヌクレオチド、好ましくは、少なくとも１００のヌクレオチドの配列を有する。
【００７２】
また、本発明の実施形態は、本発明によるプローブまたはプライマーとして利用可能なヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が放射性化合物または非放射性化合物によって標識されることを特徴とする。
【００７３】
非標識ヌクレオチド配列は、プローブまたはプライマーとして直接使用可能であるが、配列は、概して、放射性同位体（３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１２５Ｉ）または非放射性分子（ビオチン、アセチルアミノフルオレン、ジゴキシゲニン、５−ブロモデオキシウリジン、フルオレセイン）によって標識され、多くの用途のために利用可能なプローブを得る。
【００７４】
ヌクレオチド配列の非放射性標識の例は、例えば、フランス特許第７８．１０９７５号、またはＵｒｄｅａ ｅｔ ａｌ．、あるいはＳａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）に記載されている。
【００７５】
後者の場合、特許第ＦＲ−２ ４２２ ９５６号および第ＦＲ−２ ５１８ ７５５号に記載される標識方法の１つを使用することも可能となる。
該ハイブリダイゼーション技術は、種々の方法で実行可能である（Ｍａｔｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．， １９８８）。ほとんどの一般的方法は、支持体（ニトロセルロース、ナイロン、ポリスチレン等） 上に細胞の核酸抽出物を固定し、特定の条件下、プローブとともに固定された標的核酸をインキュベートするステップから成る。ハイブリダイゼーション後、過剰プローブは、排除され、形成されるハイブリッド分子は、適切な方法（プローブに連鎖する放射能、蛍光発光、または酵素活性の測定）によって検出される。
【００７６】
同様に、本発明は、種々の実施形態では、本発明によるヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、共有結合的にまたは非共有結合的に支持体上に固定されることを特徴とする。
【００７７】
本発明によるヌクレオチド配列を採用する別の有益な形態によると、後者は、支持体上に固定された状態で使用可能であって、したがって、特異的ハイブリダイゼーションによって、試験される生物学的試料から得られる標的核酸を捕捉する役割を果たすことが可能である。必要に応じて、固体支持体は、試料から分離され、その後、該捕捉プローブと標的核酸との間に形成されるハイブリダイゼーション複合体は、第２のプローブ（容易に検出可能な要素によって標識される、いわゆる検出プローブ）の支援によって検出される。
【００７８】
本発明の別の側面は、配列のクローニングおよび／または発現のためのベクターであって、該ベクターが本発明によるヌクレオチド配列を含有することを特徴とする。
同様に、所定の宿主細胞内の該ヌクレオチド配列の統合、発現、および／または分泌を可能にする要素を含有することを特徴とする本発明によるベクターも、本発明の一部である。
【００７９】
したがって、該ベクターは、プロモーター、翻訳の開始および終止信号、ならびに適切な転写調節領域を含有する場合がある。該ベクターは、宿主細胞内で安定的に維持可能であって、任意に、翻訳されたタンパク質の分泌を指定する特定の信号を有し得る。これらの異なる要素は、使用される宿主細胞に応じて選択されてもよい。本目的のために、本発明によるヌクレオチド配列は、選択された宿主内の自己複製ベクター内に挿入されてもよく、または選択された宿主の統合ベクターであってもよい。
【００８０】
そのようなベクターは、当業者によって現在使用されている方法に従って調製され、例えば、リポフェクション、エレクトロポレーション、および熱衝撃等の標準的方法によって、そこから生じるクローンを適切な宿主内に導入することが可能となる。
【００８１】
本発明によるベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルス起源のベクターである。本発明のポリペプチドの発現のためのベクターの一例は、バキュロウイルスである。
これらのベクターは、本発明のヌクレオチド配列をクローンまたは発現するために、宿主細胞の形質転換に有用である。
【００８２】
同様に、本発明は、本発明によるベクターによって形質転換される宿主細胞を含む。
これらの細胞は、上述のようなベクター内に挿入されたヌクレオチド配列を宿主細胞内に導入し、その後、トランスフェクトされたヌクレオチド配列の複製および／または発現を可能にする条件下、該細胞を培養することによって得ることが可能である。
【００８３】
該宿主細胞は、例えば、細菌性細胞（Ｏｌｉｎｓ ａｎｄ Ｌｅｅ， １９９３）であるが、同様に、酵母細胞（Ｂｕｃｋｈｏｌｚ， １９９３）およびアラビドプシス種等の植物細胞等の原核または真核細胞系、ならびに動物細胞、特に、哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）の培養物（Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ａｒｕｆｆｏ， １９９３）、同様に、例えば、バキュロウイルス、ｓｆ９昆虫細胞を採用する手順を使用可能な昆虫の細胞（Ｌｕｃｋｏｗ， １９９３）から選択可能である。
【００８４】
同様に、本発明の実施形態は、本発明による該形質転換細胞の１つを含む、生物体に関する。
アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの遺伝子の１つもしくは複数または該遺伝子の一部を発現する本発明による遺伝子組み換え生物体の取得は、ウイルス性または非ウイルス性トランスフェクション等の、当業者に周知の方法に従って、例えば、ラット、マウス、またはウサギにおいて実行されてもよい。遍在的性質の強力なプロモーターまたは一種類の組織のために選択可能なプロモーターの制御下、該遺伝子の複数のコピーのトランスフェクションによって、該遺伝子の１つもしくは複数を発現する遺伝子組み換え生物体を得ることが可能となる。同様に、胚細胞株内の相同的組み換え、これらの細胞株の胚への転移、生殖系レベルにおいて影響を受けたキメラの選択、および該キメラの成長によって、遺伝子組み換え生物体を得ることが可能となる。
【００８５】
形質転換細胞ならびに本発明による遺伝子組み換え生物体は、組み換えポリペプチドの調製のための手順において利用可能である。
今日、本発明による発現ベクターによる細胞形質転換を使用する、または本発明による遺伝子組み換え生物体を使用する遺伝子工学によって、比較的大量の組み換えポリペプチドを産生することが可能である。
【００８６】
ベクター、および／または本発明によるベクターによって形質転換された細胞、ならびに／あるいは本発明による該形質転換細胞の１つを含む遺伝子組み換え生物体を採用することを特徴とする組み換え形態における本発明のポリペプチドの調製のための手順はそれ自体、本発明内に含まれる。
【００８７】
本明細書で使用される、「形質転換」および「形質転換される」は、原核または真核細胞にかかわらず細胞への核酸の導入に関する。さらに、本明細書で使用される「形質転換」および「形質転換される」は、必ずしも増殖制御または増殖脱制御に関しない。
【００８８】
組み換え形態における本発明のポリペプチドの調製のための該手順には、ベクター、および／または該ベクターによって形質転換された細胞、ならびに／あるいはアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのポリペプチドをコードする本発明によるヌクレオチド配列を含有する該形質転換細胞の１つを含む、遺伝子組み換え生物体を採用する調製手順が含まれる。
【００８９】
本発明による変異体は、「担体」タンパク質（キメラタンパク質）に融合される組み換えポリペプチドの産生から成る場合がある。本システムの利点は、組み換え産物の安定化および／またはそのタンパク質分解の減少、生体外再生の過程における溶解度の増加、ならびに／あるいは融合パートナーが特異的リガンドに対して親和性を有する場合の精製の単純化を可能にし得ることである。
【００９０】
より具体的には、本発明は、本発明のポリペプチドの調製のための手順に関し、ａ）本発明によるヌクレオチド配列の組み換えポリペプチドの発現を可能にする条件下、形質転換細胞を培養し、ｂ）必要に応じて、該組み換えポリペプチドを回収するステップを含む。
【００９１】
本発明のポリペプチドの調製のための手順が、本発明による遺伝子組み換え生物体を採用する場合、該組み換えポリペプチドが、該生物体から抽出される。
また、本発明は、上述のような本発明の手順によって得ることが可能なポリペプチドに関する。
【００９２】
また、本発明は、合成ポリペプチドの調製のための手順を含み、本発明によるポリペプチドのアミノ酸の配列を使用することを特徴とする。
同様に、本発明は、本発明による手順によって得られる合成ポリペプチドに関する。
【００９３】
同様に、本発明によるポリペプチドは、ペプチドの合成の分野において慣習的技術によって調製可能である。本合成は、均一溶液または固体相中で実行可能である。
例えば、Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ（１９７４）による、均一溶液中の合成の技術を用いることが可能である。
【００９４】
本合成方法は、２つずつ、連続的アミノ酸を必要な順番で連続的に縮合する、あるいは前もって形成され、適切な順番でいくつかのアミノ酸を既に含有するアミノ酸および断片、または代替として、このように前もって調製されたいくつかの断片を縮合するステップから成り、ペプチドの合成において周知の方法に従って、特に、カルボキシル官能基の活性化後、通常、ペプチド結合の形成に伴うはずである、一方のアミン官能基および他方のカルボキシルまたはその反対を除き、これらのアミノ酸または断片によって担持される全反応性官能基をあらかじめ保護することが必要であることが理解されている。
【００９５】
また、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法を用いてもよい。
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの手順に従って、ペプチド鎖を生成するために、非常に多孔性の高分子樹脂が用いられ、その上に鎖の第１のＣ末端アミノ酸が固定される。本アミノ酸は、そのカルボキシル基を介して、樹脂上に固定され、そのアミン官能基が、保護される。したがって、ペプチド鎖を形成しようとするアミノ酸は、次々と、既に形成されたペプチド鎖の一部のアミノ基（毎回、あらかじめ脱保護される）上に固定され、樹脂に付着される。所望のペプチド鎖全体が形成されると、ペプチド鎖を形成する異なるアミノ酸の保護基は、排除され、ペプチドは、酸の支援によって、樹脂から分離される。
【００９６】
加えて、本発明は、本発明による少なくとも１つのポリペプチドを有するハイブリッドポリペプチドと、ヒトまたは動物内の免疫反応を誘発可能なポリペプチドの配列に関する。
【００９７】
有利には、抗原決定基は、液性応答および／または細胞性応答を誘発可能なものである。
そのような決定基は、複数のエピトープに対する抗体の合成を誘発可能な免疫原性組成を得ることを目的として使用される、グリコシル化、ペグ化、および／または別様に翻訳後修飾形態における本発明によるポリペプチドを含むことが可能となる。
【００９８】
これらのハイブリッド分子は、一部には、本発明によるポリペプチド担体分子またはその断片から形成可能であって、可能性としては、免疫原性部分、特に、ジフテリア毒素、破傷風毒素、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原（特許第ＦＲ ７９ ２１８１１号）、ポリオウイルスのＶＰ１抗原、もしくは任意の他のウイルス性または細菌性毒素あるいは抗原のエピトープに付随する。
【００９９】
ハイブリッド分子の合成のための手順は、追求されるポリペプチド配列をコードするハイブリッドヌクレオチド配列を構築するために、遺伝子工学で使用される方法を包含する。例えば、有利には、Ｍｉｎｔｏｎ（１９８４）による融合タンパク質をコードする遺伝子の取得のための技術を参照することが可能となる。
【０１００】
同様に、ハイブリッドポリペプチド、ならびに該ハイブリッドヌクレオチド配列の発現によって得られる組み換えポリペプチドであることを特徴とする本発明によるハイブリッドポリペプチドをコードする該ハイブリッドヌクレオチド配列も、本発明の一部である。
【０１０１】
同様に、本発明は、該ハイブリッドヌクレオチド配列の１つを含有することを特徴とするベクターを含む。同様に、該ベクターによって形質転換された宿主細胞、該形質転換細胞の１つを含む遺伝子組み換え生物体、ならびに該ベクター、該形質転換細胞および／または該遺伝子組み換え生物体を使用する組み換えポリペプチドの調製のための手順も、当然ながら、本発明の一部である。
【０１０２】
本発明によるポリペプチド、後述の本発明による抗体、および本発明によるヌクレオチド配列は、有利には、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスを含有可能な試料中において、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの検出および／または同定のための手順において採用可能である。該ポリペプチドの特異性、使用される本発明による抗体、ヌクレオチド配列に従う、これらの手順は、特に、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスを検出および／または同定することが可能となる。
【０１０３】
本発明によるポリペプチドは、有利には、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスを含有可能な試料中のアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの検出および／または同定するための手順において採用可能であって、ａ）該試料を本発明によるポリペプチドまたはその断片の１つと接触させるステップ（該ポリペプチドと、可能性として生物学的試料内に存在する抗体との間の免疫反応を可能にする条件下）と、ｂ）可能性として形成される抗原−抗体複合体を示すステップと、を含むことを特徴とする。
【０１０４】
従来のあらゆる手順が、可能性として形成される抗原−抗体複合体のそのような検出を実行するために採用可能である。
一例として、好ましい方法は、 ＥＬＩＳＡ技術、免疫蛍光法、または放射性免疫分析プロセス（ＲＩＡ）、あるいはそれらの同等物による、免疫酵素プロセスを利用する。
【０１０５】
したがって、同様に、本発明は、酵素、蛍光、または放射性型等の適切な標識の支援によって標識される、本発明によるポリペプチドに関する。
そのような方法は、例えば、本発明による所定量のポリペプチド組成をマイクロタイタープレートのウェル内に堆積させ、分析される増加希釈度の血清または上記で定義されたもの以外の生物学的試料を該ウェル内に導入し、マイクロタイタープレートをインキュベートし、ブタ免疫グロブリンに対する標識抗体をマイクロタイタープレートのウェル内に導入し、これらの抗体の標識化が、少なくとも、所定の波長、例えば、５５０ｎｍにおいて、後者の放射線の吸収を調節することによって、基質を加水分解可能なものから選択される酵素の支援によって実行され、対照試験と比較することによって、加水分解された基質の量を検出するステップを含む。
【０１０６】
本発明によるポリペプチドは、本発明によるポリペプチドを特異的に認識することを特徴とするモノクローナルまたはポリクローナル抗体を調製可能である。有利には、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）による技術に従って、ハイブリドーマからモノクローナル抗体を調製することが可能となる。例えば、本発明に従って、免疫反応のアジュバントに付随するポリペプチドまたはＤＮＡを動物、特に、マウスに免疫付与し、その後、抗原としての役割を果たすポリペプチドがあらかじめ固定されている親和性カラムで免疫動物の血清内に含有される特異的抗体を精製することによって、ポリクローナル抗体を調製することが可能となる。また、本発明によるポリクローナル抗体は、本発明に従って、本発明によるポリペプチドがあらかじめ固定された親和性カラム上で、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス、またはポリペプチド、あるいは断片によって免疫的に攻撃誘発された動物の血清内に含有される抗体を精製することによって、調製可能である。
【０１０７】
同様に、本発明は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、あるいはそれらの断片、あるいはキメラ抗体に関し、これらが、本発明によるポリペプチドを特異的に認識可能であることを特徴とする。
【０１０８】
同様に、本発明の抗体は、酵素、蛍光、または放射性型の標識等、本発明の核酸プローブに関する上述と同様に標識することが可能となる。
加えて、本発明は、試料中のアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの検出および／または同定のための手順を対象とし、該手順が、ａ）本発明によりモノクローナルまたはポリクローナル抗体と試料を接触させ（該抗体と、生物学的試料中に可能性として存在するアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのポリペプチドとの間の免疫反応を可能にする条件下）、ｂ）可能性として形成される抗原−抗体複合体を示すステップを含むことを特徴とする。
【０１０９】
同様に、本発明は、試料中のアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの検出および／または同定のための手順に関し、該手順が本発明によるヌクレオチド配列を採用することを特徴とする。
【０１１０】
より具体的には、本発明は、試料中のアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの検出および／または同定のための手順に関し、該手順が、ａ）必要に応じて、分析される試料からＤＮＡを単離し、ｂ）本発明により少なくとも１つのプライマーまたはプライマー対の支援によって、試料のＤＮＡを特異的に増幅し、ｃ）増幅産物を示すステップを含むことを特徴とする。
【０１１１】
これらは、例えば、本発明による核プローブを利用する分子ハイブリダイゼーションの技術によって、検出可能である。本プローブは、有利には、非放射性（コールドプローブ）または放射性同位体によって標識される。
【０１１２】
本発明の目的において、「生物学的試料のＤＮＡ」または「生物学的試料内に含有されるＤＮＡ」は、検討される生物学的試料中に存在するＤＮＡ、あるいは可能性として、該生物学的試料中に存在するＲＮＡに対する逆転写型の酵素の作用後に得られるｃＤＮＡを意味するものとして理解されたい。
【０１１３】
本発明のさらなる実施形態は、一方法を含み、該方法が、ａ）必要に応じて、あらかじめハイブリダイゼーションに感受性をもたせた生物学的試料（生物学的試料中に含有されるＤＮＡ）と、プローブを該試料のＤＮＡとハイブリダイゼーション可能な条件下、本発明によるヌクレオチドプローブを接触させ、ｂ）該ヌクレオチドプローブと該生物学的試料のＤＮＡとの間に形成されるハイブリッドを示すステップを含むことを特徴とする。
【０１１４】
また、本発明は、本発明による手順に関し、該手順が、ａ）本発明に従って、必要に応じて、あらかじめハイブリダイゼーションに感受性をもたせた生物学的試料（試料のＤＮＡ）と、該試料のＤＮＡとヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件下、支持体上に固定されたヌクレオチドプローブを接触させ、ｂ）必要に応じて、該プローブとハイブリダイズされていない生物学的試料のＤＮＡの排除後、支持体上に固定されたヌクレオチドプローブと、生物学的試料内に含有されるＤＮＡとの間に形成されるハイブリッドを、本発明に従って標識されたヌクレオチドプローブと接触させ、ｃ）ステップｂ）で形成された新規ハイブリッドを示すステップを含むことを特徴とする。
【０１１５】
上述で定義された検出および／または同定のための手順の有利な実施形態によると、これは、ステップａ）に先立って、まず、該生物学的試料のＤＮＡが、本発明による少なくとも１つのプライマーの支援によって増幅されることを特徴とする。
【０１１６】
方法の実施形態は、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択される第２のポリペプチドを使用して、第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップを含む。
【０１１７】
方法のさらなる実施形態は、第１のポリペプチドのタンパク質安定性、溶解度、分解、活性プロファイル、および／または外在化を調節する方法を含み、該方法は、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択される第２のポリペプチドを用いて、第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップを含む。
【０１１８】
方法のさらなる実施形態は、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０の配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む組み換え、精製、および／または単離されたヌクレオチド配列、および／または摂氏約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、および／または９５度以上の温度、および／または８、７、６、５、４、３、２、１、および／または０以下および／または以上のｐＨを含む環境において、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９の配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択される組み換え、精製、および／または単離されたポリペプチドを産生またはコードする細胞を配置するステップを含む。
【０１１９】
本発明は、発現タンパク質を産生する変化した能力を有するように遺伝子操作された細胞を提供する。特に、本発明は、対象となるタンパク質の増強された発現を有するバシラス属等のグラム陽性微生物に関し、バシラス内で１つもしくは複数の染色体性遺伝子が不活性化されている、および／または１つもしくは複数の染色体性遺伝子が、バシラス染色体から欠失している。いくつかのさらなる実施形態では、１つもしくは複数の常在染色体領域は、対応する野生型バシラス宿主染色体から欠失している。さらなる実施形態では、バシラスは、アリシクロバシラス属またはアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスである。
【０１２０】
さらなる実施形態では、摂氏約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、および／または９５度以上の温度で、および／または８、７、６、５、４、３、２、１、および／または０以下および／または以上のｐＨで、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０の配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む組み換え、精製、および／または単離されたヌクレオチド配列、および／または配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９の配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択される組み換え、精製、および／または単離されたポリペプチドを用いて、ポリペプチドをグリコシル化および／または翻訳後に修飾する方法を含む。
【０１２１】
本発明の実施形態では、本発明による単離および／または精製されたポリペプチドのいずれか１つが、摂氏約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、および／もしくは９５度以上の温度で酵素的もしくは機能的に活性であってもよく、ならびに／あるいは８、７、６、５、４、３、２、１、および／もしくは０以下および／または以上のｐＨで酵素的もしくは機能的に活性であってもよい。本発明のさらなる実施形態では、グリコシル化、ぺグ化、および／または他の翻訳後修飾が、８、７、６、５、４、３、２、１、および／または０以下のｐＨ、もしくは摂氏約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、および／または９５度以上の温度で、本発明による単離および／または精製されたポリペプチドが酵素的もしくは機能的に活性になるのに必要とされてもよい。
【０１２２】
本発明は、以下の例示的実施例において、さらに詳細に記載される。実施例は、本発明の選択された実施形態のみを表し得るが、以下の実施例は、例示するものであって、制限するものではないことを理解されたい。
【実施例１】
【０１２３】
アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスからのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を使用したグリコシル化
アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスから単離された、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９のポリペプチドをそれぞれコードする、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０のヌクレオチド配列を提供する。配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０のヌクレオチド配列は、当技術分野の標準的な技術を使用して、発現ベクター内に配置する。次いで、該ベクターを細菌細胞またはＳｆ９細胞またはＣＨＯ細胞等の真核細胞等の細胞に提供する。細胞内に存在する正常機構と連動して、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０を含むベクターは、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９のポリペプチドを産生する。次いで、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９のポリペプチドを単離および／または精製する。次いで、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９の単離および／または精製されたポリペプチドはそれぞれ、表１に示す活性のうちの１つもしくは複数を有することが証明された。
【０１２４】
配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９の単離および／または精製されたポリペプチドは、他のタンパク質または細胞成分と併せて、他のタンパク質のグリコシル化における活性を示すことが証明された。
【実施例２】
【０１２５】
アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスからのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を使用した、第１のポリペプチドのタンパク質安定性、溶解度、分解、活性プロファイル、および／または外在化の調節
グリコシル化または他の翻訳後修飾によって、１つもしくは複数の他のタンパク質を翻訳後修飾するために、実施例１のポリペプチドおよびヌクレオチド配列を使用する。修飾タンパク質は、同一または同様のアミノ酸配列の非修飾タンパク質と比較して、変化したタンパク質安定性、溶解度、分解、活性プロファイル、および／または外在化を有することが証明された。
【実施例３】
【０１２６】
アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのグリコシル化タンパク質
以下のプロトコルを用いて、ポリペプチドＲＡＡＣ０２６７６（配列番号３０７）を得た。アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスを小麦アラビノキシラン上で培養し、３日後に採取した。培養物を遠心分離し、細胞を除去し、結果として得られた上清を０．２２ミクロンのフィルタで濾過し、残った残屑はすべて除去した。濾過上清を、１０，０００Ｄａ分子量カットオフの透析膜を通して、限外濾過によって約１ｍＬまで濃縮した。結果として得られた濃縮濾過上清は、陽イオン交換カラム上にタンパク質を捕捉し、それらを塩勾配によって溶出し、第２の陽イオン交換カラム上に再装填し、第２の塩勾配によって溶出することによって、さらに精製した。試料を統合し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で処理した。個々のバンドをゲルから切り出し、ゲルトリプシン消化に供した。次いで、ペプチド断片を溶出し、Ｃ−１８カラム上で分離し、エレクトロスプレーを用いてイオントラップ質量分析計内に注入した。質量スペクトルを、観測スペクトルと既知のタンパク質配列から生成される理論スペクトルとを比較するＭＡＳＣＯＴによって処理した。ＭＡＳＣＯＴは、使用者がタンパク質上に存在し得る修飾を特定することを可能にし、これらの修飾と一致するスペクトルを検索する。ＭＡＳＣＯＴは、以下の表２に示すように、潜在的にグリコシル化されたＲＡＡＣ０２６７６から消化されるいくつかのペプチドを同定した。
【０１２７】
表２において分かるように、クエリ９４、９６、２２１、３３２、３３３、３３７、および４００から、ＲＡＡＣ０２６７６に対して予測されたグリコシル化が見出された。表２中の全ての断片は、配列番号３０７（ＲＡＡＣ０２６７６）の断片である。決定された部位に従ったＲＡＡＣ０２６７６のグリコシル化型を配列番号３０８で提供する。
【０１２８】
【表２−１】
【０１２９】
【表２−２】
【０１３０】
【表２−３】
【実施例４】
【０１３１】
アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスからのタンパク質の糖タンパク質染色
アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスを小麦アラビノキシラン上で培養し、３日後に採取した。培養物を遠心分離し、細胞を除去し、結果として得られた上清を０．２２ミクロンのフィルタで濾過し、残った残屑はすべて除去した。濾過上清を、１０，０００Ｄａ分子量カットオフの透析膜を通して、限外濾過によって約１ｍＬまで濃縮した。この濃縮物質のいくつかのレーンを、標準的なプロトコルを使用して、既知のグリコシル化および非グリコシル化タンパク質である陽性および陰性対照と共に、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で処理した。ゲルを縦に半分に切断し、片方をＳｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｓｔａｉｎで染色し、もう片方にはＳｉｇｍａの糖タンパク質検出キットを使用した。陽性および陰性対照の両方をＳｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ染色を使用して染色し、陽性対照のみを糖タンパク質で染色し、染色プロトコルが正確に機能していることを示した。アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスタンパク質レーンは、Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ染色ゲル上で約１２０ｋＤａのバンドを示し、それは、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの１つの細胞外タンパク質の予測された重量である。糖タンパク質染色ゲル上の同一位置は、ピンク色のバンドを示し、グリコシル化タンパク質に対して肯定的な結果を示した。
【０１３２】
本発明は、ある実施形態において説明されたが、本発明は、本開示の精神および範囲内でさらに修正可能である。したがって、本願は、その一般原則を使用して本発明の任意の変型、用途、または適合を網羅することを意図する。さらに、本願は、本発明が関連する当該分野における周知または慣例的実践内にあり、かつ添付の請求項およびそれらの法的同等物の制限内にあるような本開示からの逸脱も網羅することを意図する。
【０１３３】
【表３−１】
【０１３４】
【表３−２】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本願は、「ＴＨＥＲＭＯＰＨＩＬＩＣ ＡＮＤ ＴＨＥＲＭＯＡＣＩＤＯＰＨＩＬＩＣ ＧＬＹＣＯＳＹＬＡＴＩＯＮ ＧＥＮＥＳ ＡＮＤ ＥＮＺＹＭＥＳ ＦＲＯＭ ＡＬＩＣＹＣＬＯＢＡＣＩＬＬＵＳ ＡＣＩＤＯＣＡＬＤＡＲＩＵＳ ＡＮＤ ＲＥＬＡＴＥＤ ＯＲＧＡＮＩＳＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ」と題する２００８年２月２７日出願の米国仮特許出願第６１／０３１，９８４号の出願日の利益を主張する。
【０００２】
政府の権利
米国政府は、米国エネルギー省（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ）とＢａｔｔｅｌｌｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ａｌｌｉａｎｃｅ， ＬＬＣとの間の契約番号ＤＥ−ＡＣ０７−９９ＩＤ１３７２７および契約番号ＤＥ−ＡＣ０７−０５ＩＤ１４５１７に従って、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明は、概して、バイオテクノロジーに関する。より具体的には、本発明は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスから単離および／または精製されたポリペプチドならびに単離および／または精製されたアリサイクロバチルス・アシドカルダリウス由来ポリペプチドをコードする核酸配列と、それらの使用のための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
細菌は概して細菌のタンパク質をグリコシル化しないとつい最近まで信じられてきた。いくつかの事例が報告されているが、これらは、まれな例外として取り合われなかった（Ｂｏｒｍａｎ ２００６）。細菌が実際には恐らく真核生物よりも多くの様式で細菌のタンパク質をグリコシル化することが、現在ますます認められているが、この考えは、まだ広く知られていない（Ｓｃｈaｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．２００１）。近年の総説では、グリコシル化がタンパク質安定性を助け、溶解度等の物理的性質を調節し、タンパク質分解を防ぎ、活性プロファイルを修正し、外在化を標的とすることが示されたことが述べられている（Ｕｐｒｅｔｉ ｅｔ ａｌ．２００３）。１９９４年、あるグループが、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスからアミラーゼを精製し、活発な成長の間、アミラーゼが細胞に結合し、グリコシル化されず、不溶性であることを示した（Ｓｃｈｗｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．１９９４）。培養が定常期に入ると、該細胞はアミラーゼのいくつかの可溶性グリコシル化型を培地中に放出した（Ｓｃｈｗｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．１９９４）。種々の種類のアミラーゼの活性を比較する試みは行われなかった。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の実施形態は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノムの精製および／または単離されたヌクレオチド配列、またはその相同体あるいは断片に関する。 本発明の一実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０、またはそれらの相同体もしくは断片のうちの少なくとも１つから選択される。本発明の別の実施形態では、該相同体は、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０のうちの少なくとも１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成る群より選択される。
【０００６】
本発明の実施形態は、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離および／または精製された核酸配列にさらに関連し得る。
【０００７】
また、本発明の実施形態は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノムのヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる単離および／または精製されたポリペプチド、またはそれらの相同体あるいは断片に関する。 一実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０のうちの少なくとも１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【０００８】
本発明の別の実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０、またはそれらの相同体もしくは断片のうちの少なくとも１つから選択されるヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、該ポリペプチドは、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、該ポリペプチドは、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【０００９】
本発明の実施形態では、該ポリペプチドは、好酸性および／または好熱性であってもよい。 さらなる実施形態では、該ポリペプチドは、グリコシル化、ペグ化、および／または別様に翻訳後に修飾されてもよい。
【００１０】
方法の実施形態は、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択される第２のポリペプチドを使用して、第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップを含む。
【００１１】
方法のさらなる実施形態は、第１のポリペプチドのタンパク質安定性、溶解度、分解、活性プロファイル、および／または外在化を調節する方法を含み、該方法は、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択される第２のポリペプチドを用いて、第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップを含む。
【００１２】
方法のさらなる実施形態は、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む組み換え、精製、および／または単離されたヌクレオチド配列、および／または摂氏約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、および／または９５度以上の温度、および／または８、７、６、５、４、３、２、１、および／または０以下および／または以上のｐＨを含む環境において、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択される組み換え、精製、および／または単離されたポリペプチドを産生またはコードする細胞を配置するステップを含む。
【００１３】
本発明のこれらおよび他の側面は、本明細書に含有される教示に照らして、当業者には明白となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】配列番号１（ＲＡＡＣ００１６４）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２２３７７５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿７２９２９０．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１０８４４４０．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１０７９１５０．１｜、およびｒｅｆ｜ＺＰ＿０１４７１５９４．１｜（配列番号３〜７）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図２】配列番号１８（ＲＡＡＣ００５１７）と、ｒｅｆ｜ＺＰ＿００５８９５３３．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１３８６４３５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿３７８５３３．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿００５１３１５８．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿３７４１７３．１｜（配列番号２０〜２４）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１８に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図３】配列番号３５（ＲＡＡＣ００６５０）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１２７１８３．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２０３８５０４．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６４７９８７．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３７７１１４．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿８３５０８１．１｜（配列番号３７〜４１）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号３５に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図４】配列番号５２（ＲＡＡＣ００９９１）と、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２３２７４１２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４８７２０７．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１１７２７６５．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿８３１３１４．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿８４４００８．１｜（配列番号５４〜５８）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号５２に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図５Ａ】配列番号６９（ＲＡＡＣ０１１１０）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５１９８５６．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿７１１６８８．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１３３１９３１．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１０７６９５５．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿３３６４４０．１｜（配列番号７１〜７５）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号６９に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図５Ｂ】配列番号６９（ＲＡＡＣ０１１１０）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５１９８５６．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿７１１６８８．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１３３１９３１．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１０７６９５５．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿３３６４４０．１｜（配列番号７１〜７５）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号６９に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図６Ａ】配列番号８６（ＲＡＡＣ０１１６６）と、ｇｂ｜ＡＡＲ９９６１５．１｜、ｇｂ｜ＡＢＭ６８３３４．２｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１３７２２４８．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿５１９５５５．１｜、およびｒｅｆ｜ＺＰ＿０２２３４０７７．１｜（配列番号８８〜９２）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号８６に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図６Ｂ】配列番号８６（ＲＡＡＣ０１１６６）と、ｇｂ｜ＡＡＲ９９６１５．１｜、ｇｂ｜ＡＢＭ６８３３４．２｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１３７２２４８．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿５１９５５５．１｜、およびｒｅｆ｜ＺＰ＿０２２３４０７７．１｜（配列番号８８〜９２）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号８６に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図７】配列番号１０３（ＲＡＡＣ０１１６７）と、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１５１５２１２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２７７６４３．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２２９１４００．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６３３７２７．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４３４３５７．１｜（配列番号１０５〜１０９）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１０３に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図８Ａ】配列番号１２０（ＲＡＡＣ０１１７０）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３２４５９２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿３４２７７６．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿７８０９７５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６３６８３０．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２９９０２６．１｜（配列番号１２２〜１２６）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１２０に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図８Ｂ】配列番号１２０（ＲＡＡＣ０１１７０）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３２４５９２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿３４２７７６．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿７８０９７５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６３６８３０．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２９９０２６．１｜（配列番号１２２〜１２６）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１２０に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図９】配列番号１３７（ＲＡＡＣ０１２４８）と、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２１７０１６０．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１１７１８９５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿０７６６４６．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿５９０９１０．１｜、およびｒｅｆ｜ＺＰ＿０２１７５４１０．１｜（配列番号１３９〜１４３）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１３７に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１０Ａ】配列番号１５４（ＲＡＡＣ０１３４８）と、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１６６５２８９．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１６４３３５０．１｜、ｇｂ｜ＡＡＷ７７１６７．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿４５２７２２．１｜、およびｒｅｆ｜ＺＰ＿０２２４１７８７．１｜（配列番号１５６〜１６０）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１５４に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１０Ｂ】配列番号１５４（ＲＡＡＣ０１３４８）と、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１６６５２８９．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１６４３３５０．１｜、ｇｂ｜ＡＡＷ７７１６７．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿４５２７２２．１｜、およびｒｅｆ｜ＺＰ＿０２２４１７８７．１｜（配列番号１５６〜１６０）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１５４に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１１】配列番号１７１（ＲＡＡＣ０１３７７）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿１４７９５２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿５２０６７０．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３９５８０９．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３０９７０１．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６４３６６０．１｜（配列番号１７３〜１７７）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１７１に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１２】配列番号１８８（ＲＡＡＣ０１６１１）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿１４６２１４．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１２４４６３．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿８６５２６２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿４２６０１３．１｜、およびｒｅｆ｜ＺＰ＿０１８８５５２６．１｜（配列番号１９０〜１９４）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１８８に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１３Ａ】配列番号２０５（ＲＡＡＣ０１６１２）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿１４６２１５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１２４４６４．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿０７４９４８．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１０３９５０３．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿６２１７７０．１｜（配列番号２０７〜２１１）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号２０５に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１３Ｂ】配列番号２０５（ＲＡＡＣ０１６１２）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿１４６２１５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１２４４６４．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿０７４９４８．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１０３９５０３．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿６２１７７０．１｜（配列番号２０７〜２１１）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号２０５に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１４Ａ】配列番号２２２（ＲＡＡＣ０１９２６）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１０３８２０２．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１６６７５８７．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１５７５３０１．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２１１０２０．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿５１６４６５．１｜（配列番号２２４〜２２８）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号２２２に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１４Ｂ】配列番号２２２（ＲＡＡＣ０１９２６）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１０３８２０２．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１６６７５８７．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１５７５３０１．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２１１０２０．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿５１６４６５．１｜（配列番号２２４〜２２８）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号２２２に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１５】配列番号２３９（ＲＡＡＣ０１９９８）と、ｒｅｆ｜ＮＰ＿３４８９４０．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿７２１２４４．１｜、ｄｂｊ｜ＢＡＣ７５７００．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿００６０５１２３．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿０１５３２９．１｜（配列番号２４１〜２４５）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号２３９に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１６】配列番号２５６（ＲＡＡＣ０２０１１）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿７５４８１９．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿１８４３２２．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿５７７７８７．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿１４２０６８．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿１２５７５１．１｜（配列番号２５８〜２６２）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号２５６に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１７Ａ】配列番号２７３（ＲＡＡＣ０２３８１）と、ｒｅｆ｜ＮＰ＿６２２１７７．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿８４８８５８．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３７４６８８．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿４７００３９．１｜、およびｒｅｆ｜ＺＰ＿０１９２９３２５．１｜（配列番号２７５〜２７９）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号２７３に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１７Ｂ】配列番号２７３（ＲＡＡＣ０２３８１）と、ｒｅｆ｜ＮＰ＿６２２１７７．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿８４８８５８．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３７４６８８．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿４７００３９．１｜、およびｒｅｆ｜ＺＰ＿０１９２９３２５．１｜（配列番号２７５〜２７９）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号２７３に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１８】配列番号２９０（ＲＡＡＣ０２４２１）と、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１７２１８１１．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿２４１８９７．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４８６１０１．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１１７０５３２．１｜、およびｒｅｆ｜ＺＰ＿０２３２７９９４．１｜（配列番号２９２〜２９６）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号２９０に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１９】配列番号３０９（ＲＡＡＣ０１１６８）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６６３８８０．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１８１３３２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿６７５１４３．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００２３５２８２１．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１１４４５４．１｜（配列番号３１１〜３１５）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号３０９に割り当てられる作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の実施形態は、好熱好酸菌アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのタンパク質のグリコシル化および／または翻訳後修飾に関連する遺伝子および関連タンパク質を含む。これらのプロセスに関連する遺伝子のためのコード配列は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノムの配列決定から生成される配列情報から決定した。これらの遺伝子およびタンパク質は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスまたは他の生物体の代謝工学の標的を表し得る。タンパク質のグリコシル化および／または翻訳後修飾に関連する、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノム内で発見したヌクレオチド配列、およびそれによってコードされるアミノ酸の限定されない例を、表１に記載する。グリコシルトランスフェラーゼおよび／または翻訳後修飾タンパク質は、以下の分類であってもよいがこれらに限定されない。ＵＤＰ β−グルコースホスホトランスフェラーゼ、ドリコール−リン酸マンノシルトランスフェラーゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼ、ならびにその他。
【００１６】
本発明の実施形態は、部分的に、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの遺伝子および／またはタンパク質を含む遺伝子配列および／またはタンパク質配列に関する。含まれる遺伝子およびタンパク質は、タンパク質のグリコシル化および／または翻訳後修飾に関与する遺伝子およびタンパク質である。細胞内酵素活性は、本質的に好熱性および／または好酸性であり得、同様の遺伝子の一般的な例を本文献に記載する。遺伝子、配列、酵素、および因子の種類としては、表１に記載するものが挙げられるがそれらに限定されない。
【００１７】
【表１】
【００１８】
本発明は、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０、またはそれらの断片のうちの１つの配列から選択されるアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノムの単離および／または精製されたヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチド配列に関する。
【００１９】
同様に、本発明は、単離および／または精製されたヌクレオチド配列を記載し、該配列が、ａ）配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０、またはそれらの断片のうちの１つの配列のうちの少なくとも１つのヌクレオチド配列、ｂ）ａ）に定義されるようなヌクレオチド配列と相同のヌクレオチド配列、ｃ）ａ）またはｂ）に定義されるようなヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、およびそれらの対応するＲＮＡのヌクレオチド配列、ｄ）ストリンジェントな条件下でａ）、ｂ）、またはｃ）に定義されるような配列とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列、ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）、またはｄ）に定義されるような配列を含むクレオチド配列、およびｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、またはｅ）に定義されるようなヌクレオチド配列によって修飾されるヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする。
【００２０】
ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または核酸配列は、本発明に従って、モノマーおよびダイマー（いわゆる、タンデム）形態における二本鎖または一本鎖ＤＮＡと該ＤＮＡの転写産物の両方を意味するものと理解されたい。
【００２１】
本発明の態様は、単離、精製、または部分的に精製可能なヌクレオチド配列に関し、例えば、イオン交換クロマトグラフィーに、分子サイズに基づく排除クロマトグラフィー、または親和性クロマトグラフィー、あるいは代替として、異なる溶媒中の溶解度に基づく分画技術等の分離方法から開始する、もしくは増幅、クローニング、およびサブクローニング等の遺伝子工学の方法から開始し、本発明の配列は、ベクターによって媒介されることが可能である。
【００２２】
本発明に従った単離および／または精製されたヌクレオチド配列断片は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノムの任意のヌクレオチド断片を指すものとして理解され、非制限的な例として、その由来する配列の少なくとも８、１２、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、１０００以上の連続的ヌクレオチド長が含まれる場合がある。
【００２３】
本発明による単離および／または精製されたヌクレオチド配列の特異的断片は、整合およびアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノム配列の対応する断片との比較後、異なる性質の少なくとも１つのヌクレオチドつまり塩基を有するアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノムの任意のヌクレオチド断片を指すものと理解されたい。
【００２４】
本発明の意味において、相同の単離および／または精製されたヌクレオチド配列は、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、または９９．７％の本発明によるヌクレオチド配列の塩基と少なくとも同一率を有する単離および／または精製されたヌクレオチド配列を意味するものと理解され、本パーセンテージは、純粋に、統計的であって、２つのヌクレオチド配列間の差異を無作為におよびそれらの長さ全体にわたって、分布させることができる。
【００２５】
本発明の意味において、特異的相同ヌクレオチド配列は、上述のような特異的断片の少なくとも１つのヌクレオチド配列を有する相同ヌクレオチド配列を意味するものと理解される。該「特異的」相同配列は、例えば、該ゲノム配列、またはアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノムの変異体を表すその断片の配列に対応する配列を含むことが可能である。したがって、これらの特異的相同配列は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの株内の突然変異体に関連する変型に対応し、特に、少なくとも１つのヌクレオチドの切断、置換、欠失および／または付加に対応し得る。同様に、該相同配列は、遺伝子コードの縮退に関連する変型に対応し得る。
【００２６】
用語「配列相同性の程度つまりパーセンテージ」は、本願に定義されるように、「最適整合後の２つの配列間の配列同一性の程度つまりパーセンテージ」を指す。
２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列は、後述のように、最大一致のために整合されると、アミノ酸またはヌクレオチド残基の配列が、２つの配列内において、同じである場合、「同一である」と言える。２つ（以上）のペプチドまたはポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、セグメントまたは「比較域」にわたる２つの最適に整合された配列の配列を比較し、配列類似性の局所的領域を同定および比較することによって行なわれる。比較のための配列の最適整合は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄ． Ａｐｐ． Ｍａｔｈ ２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３（１９７０）の相同性整合アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８５：２４４４（１９８８）の類似方法の検索によって、コンピュータによるこれらのアルゴリズムの実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査によって、行なわれ得る。
【００２７】
「配列同一性のパーセンテージ」（または、同一性の程度）は、配列比較用ウインドウにわたる２つの最適に整合された配列を比較することによって決定され、配列比較用ウインドウ内のペプチドまたはポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適整合のための参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含む場合がある。該パーセンテージは、同一のアミノ酸残基または核酸塩基が両配列内で生じる位置の数を決定し、整合位置の数を求め、整合位置の数を配列比較用ウインドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛け、配列同一性のパーセンテージを求めることによって計算される。
【００２８】
上述の配列同一性の定義は、当業者によって使用される可能性のある定義である。定義自体は、任意のアルゴリズムの支援を必要とせず、該アルゴリズムは、配列同一性の計算ではなく、配列の最適整合を達成するためにのみ有用である。
【００２９】
上述の定義から、２つの比較される配列間の配列同一性に対し、明確かつ１つのみの値が存在し、その値は、最善つまり最適整合のために求められた値に対応するということになる。
【００３０】
ウェブサイト（ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ）から利用可能であって、２つの配列間の同一性を比較および判断するのに、発明者と概して当業者によって、習慣的に使用されるソフトウェアであるＢＬＡＳＴ ＮまたはＢＬＡＳＴ Ｐ「ＢＬＡＳＴ ２配列」では、比較される配列長に応じるギャップコストは、ソフトウェアによって直接選択される（すなわち、長さ＞８５の場合、置換マトリクスＢＬＯＳＵＭ−６２に対して１１．２）。
【００３１】
本発明の配列の相補的ヌクレオチド配列は、任意のＤＮＡを意味するものと理解され、そのヌクレオチドは、本発明の配列のものに相補的であって、その配向は、逆転される（アンチセンス配列）。
【００３２】
本発明によるヌクレオチド配列とのストリンジェンシーの条件下のハイブリダイゼーションは、相補的ＤＮＡの２つの断片間のハイブリダイゼーションを維持可能なように選択される、温度およびイオン強度条件下のハイブリダイゼーションを意味するものとして理解される。
【００３３】
例示目的で、上述のヌクレオチド断片を定義する目的としてのハイブリダイゼーションステップの高ストリンジェンシー条件は、有利には、以下である。
該ハイブリダイゼーションは、ＳＳＣ緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０５Ｍクエン酸ナトリウムに対応する１ｘＳＳＣ）の存在下、６５℃の選択的温度で実行される。洗浄ステップは、例えば、以下であり得る。周囲温度の２ｘＳＳＣに続いて、それぞれ１０分間、６５℃の２ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳと、６５℃の２ｘ０．５ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳによる２回の洗浄を行なう。
【００３４】
例えば、２ｘＳＳＣ緩衝液の存在下における４２℃の温度の中度のストリンジェンシー、または例えば、２ｘＳＳＣ緩衝液の存在下における３７℃の温度の低度のストリンジェンシーの条件は、それぞれ、２つの配列間のハイブリダイゼーションのために、全体的相補性をほとんど必要としない。
【００３５】
サイズが約３５０の塩基のポリヌクレオチドのための上述のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９の教示に従って、当業者によって、より大きいまたは小さいサイズのオリゴヌクレオチドに適合される。
【００３６】
本発明による単離および／または精製されたヌクレオチド配列の中には、本発明による相同配列を得ることを可能にする方法において、プライマーまたはプローブとして使用可能なものが含まれ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸クローニング、および シークエンシング等のこれらの方法は、当業者に周知である。
【００３７】
本発明による該単離および／または精製された該ヌクレオチド配列のうち、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０、それらの断片のうちの１つ、または後述のようなそれらの変異体のうちの１つの存在を診断可能にする方法において、プライマーまたはプローブとして使用可能なものが同様に好まれる。
【００３８】
本発明によるヌクレオチド配列断片は、例えば、ＰＣＲ等の特異的増幅によって、または本発明によるヌクレオチド配列の適切な制限酵素による消化後、得ることが可能であって、これらの方法は、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９の研究に記載されている。同様に、そのような代表的断片は、当業者に周知の方法に従って、化学合成によって得ることが可能である。
【００３９】
修飾ヌクレオチド配列は、当業者に周知の技術に従って、突然変異生成によって得られ、本発明による正常配列に対する修飾、例えば、特に、該ポリペプチドの発現率の修飾または複製サイクルの変調につながるポリペプチド発現の調節配列および／またはプロモーター配列における突然変異を含有する任意のヌクレオチド配列を意味するものとして理解されたい。
【００４０】
同様に、修飾ヌクレオチド配列は、後述のような修飾ポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列を意味するものとして理解されたい。
本発明は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの単離および／または精製されたヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列に関し、該配列が、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０、またはそれらの断片のうちの１つの配列から選択されることを特徴とする。
【００４１】
同様に、本発明の実施形態は、単離および／または精製されたヌクレオチド配列に関し、該配列が、ａ）配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０、またはそれらの断片のうちの１つのヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つ、ｂ）ａ）に定義されるような配列の特異的断片のヌクレオチド配列、ｃ）ａ）またはｂ）に定義されるような配列と少なくとも８０％の同一性を有する、相同ヌクレオチド配列、ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）に定義されるような配列に対応する相補的ヌクレオチド配列、またはＲＮＡの配列、およびｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）、またはｄ）に定義されるような配列によって修飾されるヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする。
【００４２】
本発明による単離および／または精製ヌクレオチド配列の中には、配列番号１３〜１７、３０〜３４、４７〜５１、６４〜６８、８１〜８５、９８〜１０２、１１５〜１１９、１３２〜１３６、１４９〜１５３、１６６〜１７０、１８３〜１８７、２００〜２０４、２１７〜２２１、２３４〜２３８、２５１〜２５５、２６８〜２７２、２８５〜２８９、３０２〜３０６、３１９〜３２３、３３６〜３４０、３５３〜３５７、３７０〜３７４、３８７〜３９１、４０４〜４０８、４２１〜４２５、４３８〜４４２、４５５〜４５９、４７２〜４７６、４８９〜４９３、５０６〜５１０、５２３〜５２７、５４０〜５４４、５５７〜５６１、５７４〜５７８、５９１〜５９５、６０８〜６１２、６２５〜６２９、６４２〜６４６、６５９〜６６３、６７６〜６８０、６９３〜６９７、７１０〜７１４、７２７〜７３１、７４４〜７４８、７６１〜７６５、７７８〜７８２、および３２１〜３２５、またはそれらの断片のヌクレオチド配列、ならびに配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０、またはそれらの断片の配列のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、または９９．７％の同一性を有する任意の単離および／または精製されたヌクレオチド配列が含まれる。該相同配列は、例えば、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノム配列に対応する配列を含むことが可能である。同様に、これらの特異的相同配列は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの株内の突然変異と関連した変型に対応し、特に、少なくとも１つのヌクレオチドの切断、置換、欠失および／または付加に対応し得る。 当業者には明らかであるように、そのような相同体は、標準的な技術およびＢＬＡＳＴ等の公的に入手可能なコンピュータプログラムを使用して、容易に作製及び同定される。したがって、上記で言及された各相同体は、本明細書に記載され、十分に説明されたものとみなされるべきである。
【００４３】
本発明の実施形態は、本発明によるヌクレオチド配列によってコードされる単離および／または精製されたポリペプチドあるいはその断片を含み、その断片の配列は、断片（のヌクレオチド配列）によって表される。アミノ酸配列は、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０のうちの少なくとも１つの３つの可能な読み枠のうちの１つに従ってコード可能な単離および／または精製されたポリペプチドに対応する。
【００４４】
同様に、本発明の実施形態は、単離および／または精製されたポリペプチドに関し、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９、またはそれらの断片のうちの１つのアミノ酸配列から選択されるポリペプチドを含むことを特徴とする。
【００４５】
本発明の実施形態による単離および／または精製されたポリペプチドの中には、アミノ酸配列番号８〜１２、２５〜２９、４２〜４６、５９〜６３、７６〜８０、９３〜９７、１１０〜１１４、１２７〜１３１、１４４〜１４８、１６１〜１６５、１７８〜１８２、１９５〜１９９、２１２〜２１６、２２９〜２３３、２４６〜２５０、２６３〜２６７、２８０〜２８４、２９７〜３０１、３１４〜３１８、３３１〜３３５、３４８〜３５２、３６５〜３６９、３８２〜３８６、３９９〜４０３、４１６〜４２０、４３３〜４３７、４５０〜４５４、４６７〜４７１、４８４〜４８８、５０１〜５０５、５１８〜５２２、５３５〜５３９、５５２〜５５６、５６９〜５７３、５８６〜５９０、６０３〜６０７、６２０〜６２４、６３７〜６４１、６５４〜６５８、６７１〜６７５、６８８〜６９２、７０５〜７０９、７２２〜７２６、７３９〜７４３、７５６〜７６０、７７３〜７７７、および３１６〜３２０、もしくはそれらの断片の単離および／もしくは精製されたポリペプチド、または配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９、もしくはその断片の配列のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、もしくは９９．７％同一の相同性を有する任意の他の単離および／もしくは精製されたポリペプチドが含まれる。当業者には明らかであるように、そのような相同体は、標準的な技術およびＢＬＡＳＴ等の公的に入手可能なコンピュータプログラムを使用して、容易に作製及び同定される。したがって、上記で言及された各相同体は、本明細書に記載され、十分に説明されたものとみなされるべきである。
【００４６】
本発明の実施形態はまた、該ポリペプチドに関し、ａ）本発明によるアミノ酸配列のポリペプチドの少なくとも５つのアミノ酸の特異的断片、ｂ）ａ）に定義されるようなポリペプチドと相同のポリペプチド、ｃ）ａ）またはｂ）に定義されるようなポリペプチドの特異的生物活性断片、およびｄ）ａ）、ｂ）、またはｃ）に定義されるようなポリペプチドによって修飾されるポリペプチドから選択されるポリペプチドを含むことを特徴とする。
【００４７】
本説明では、ポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質という用語は、同義的に使用される。
本発明の実施形態では、本発明による単離および／または精製されたポリペプチドは、グリコシル化、ペグ化、および／または別様に翻訳後に修飾されてもよい。 さらなる実施形態では、グリコシル化、ペグ化、および／または他の翻訳後修飾は、生体内または生体外で生じてもよく、化学的技術を使用して行なわれてもよい。付加的実施形態では、任意のグリコシル化、ぺグ化、および／または他の翻訳後修飾は、Ｎ結合型またはＯ結合型であってもよい。
【００４８】
本発明の実施形態では、本発明による単離および／または精製されたポリペプチドのいずれか１つは、摂氏約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、および／もしくは９５度以上の温度で酵素的もしくは機能的に活性であってもよく、ならびに／あるいは８、７、６、５、４、３、２、１、および／もしくは０以下および／または以上のｐＨで酵素的もしくは機能的に活性であってもよい。本発明のさらなる実施形態では、グリコシル化、ぺグ化、および／または他の翻訳後修飾は、８、７、６、５、４、３、２、１、および／または０以下のｐＨ、もしくは摂氏約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、および／または９５度以上の温度で、酵素的もしくは機能的に活性である本発明による単離および／または精製ポリペプチドのために必要とされてもよい。
【００４９】
本発明の態様は、天然源から精製によって単離される、または得られるか、あるいは遺伝子組み換えによって、または代替として化学合成によって得られ、したがって、後述のように、非天然アミノ酸を含有し得る、ポリペプチドに関する。
【００５０】
本発明の実施形態による「ポリペプチド断片」は、少なくとも５つの連続的アミノ酸、好ましくは、１０の連続的アミノ酸または１５の連続的アミノ酸を含有するポリペプチドを指すものとして理解される。
【００５１】
本発明では、特異的ポリペプチド断片は、本発明による特異的断片ヌクレオチド配列によってコードされる連続的ポリペプチド断片を指すものとして理解される。
「相同ポリペプチド」は、天然ポリペプチドに対して、特に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加、あるいは置換、切断、延長、キメラ融合、および／または突然変異等のある修飾を有するポリペプチドを指すものとして理解されたい。相同ポリペプチドのうち、そのアミノ酸配列が、本発明によるポリペプチドのアミノ酸の配列と少なくとも８０％または９０％の相同性を有するものが好ましい。
【００５２】
「特異的相同ポリペプチド」は、上述のような、本発明によるポリペプチドの特異的断片を有する相同ポリペプチドを指すものと理解されたい。
置換の場合、１つもしくは複数の連続的または非連続的アミノ酸が、「等価」アミノ酸に置き換えられる。「等価」アミノ酸という表現は、塩基構造のアミノ酸の１つによって置換可能であるが、本質的に、対応するペプチドの生物活性を修飾せず、以下によって定義されるような任意のアミノ酸を指すことを目的とする。当業者には明らかであるように、そのような置換は、標準的な分子生物学技術およびＢＬＡＳＴ等の公的に入手可能なコンピュータプログラムを使用して、容易に作製及び同定される。したがって、上記で言及された各置換は、本明細書に記載され、十分に説明されたものとみなされるべきである。アミノ酸配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９におけるそのような置換の例として、アミノ酸配列番号８〜１２、２５〜２９、４２〜４６、５９〜６３、７６〜８０、９３〜９７、１１０〜１１４、１２７〜１３１、１４４〜１４８、１６１〜１６５、１７８〜１８２、１９５〜１９９、２１２〜２１６、２２９〜２３３、２４６〜２５０、２６３〜２６７、２８０〜２８４、２９７〜３０１、３１４〜３１８、３３１〜３３５、３４８〜３５２、３６５〜３６９、３８２〜３８６、３９９〜４０３、４１６〜４２０、４３３〜４３７、４５０〜４５４、４６７〜４７１、４８４〜４８８、５０１〜５０５、５１８〜５２２、５３５〜５３９、５５２〜５５６、５６９〜５７３、５８６〜５９０、６０３〜６０７、６２０〜６２４、６３７〜６４１、６５４〜６５８、６７１〜６７５、６８８〜６９２、７０５〜７０９、７２２〜７２６、７３９〜７４３、７５６〜７６０、７７３〜７７７、および３１６〜３２０の単離および／または精製されたポリペプチドが含まれる場合がある。これらの等価アミノ酸は、置換アミノ酸とのその構造的相同性、または実行可能な異なるポリペプチド間の生物活性の比較試験の結果に応じて、決定可能である。
【００５３】
非制限的な例として、対応する修飾ポリペプチドの生物活性の広範囲にわたる修飾をもたらすことなく実行可能な置換の可能性として、例えば、バリンまたはイソロイシンによるロイシン、グルタミン酸によるアスパラギン酸、アスパラギンによるグルタミン、リジンによるアルギニン等の置き換えが挙げられるが、当然ながら、反転置換も、同条件下で想定可能である。
【００５４】
さらなる実施形態では、置換は、類似同定酵素活性を有する他のタンパク質の中に保存されないアミノ酸の置換に制限される。 例えば、当業者は、同様の生物体において同一機能のタンパク質を整合し、どのアミノ酸が該機能のタンパク質の間で概して保存されるかを決定することができる。そのような整合を生成するために使用し得るプログラムの一例は、ＮＣＢＩによって提供されるデータベースと併せたｗｏｒｄｌｗｉｄｅｗｅｂ．ｃｈａｒｉｔｅ．ｄｅ／ｂｉｏｉｎｆ／ｓｔｒａｐ／である。そのようなポリペプチドの例として、アミノ酸配列番号８〜１２、２５〜２９、４２〜４６、５９〜６３、７６〜８０、９３〜９７、１１０〜１１４、１２７〜１３１、１４４〜１４８、１６１〜１６５、１７８〜１８２、１９５〜１９９、２１２〜２１６、２２９〜２３３、２４６〜２５０、２６３〜２６７、２８０〜２８４、２９７〜３０１、３１４〜３１８、３３１〜３３５、３４８〜３５２、３６５〜３６９、３８２〜３８６、３９９〜４０３、４１６〜４２０、４３３〜４３７、４５０〜４５４、４６７〜４７１、４８４〜４８８、５０１〜５０５、５１８〜５２２、５３５〜５３９、５５２〜５５６、５６９〜５７３、５８６〜５９０、６０３〜６０７、６２０〜６２４、６３７〜６４１、６５４〜６５８、６７１〜６７５、６８８〜６９２、７０５〜７０９、７２２〜７２６、７３９〜７４３、７５６〜７６０、７７３〜７７７、および３１６〜３２０に見られるようなものが含まれ得るが、それらに制限されない。
【００５５】
したがって、本発明の一実施形態によると、置換または突然変異は、該機能を有するタンパク質の間で概して保存される位置で成される場合がある。さらなる実施形態では、核酸配列は、それらがコードするアミノ酸が変化（縮重置換および突然変異）しないように突然変異または置換され、および／または任意の結果として生じるアミノ酸置換または突然変異が、概してその機能のタンパク質の中に保存される位置で成されるように突然変異または置換される場合がある。そのような核酸配列の例として、配列番号１３〜１７、３０〜３４、４７〜５１、６４〜６８、８１〜８５、９８〜１０２、１１５〜１１９、１３２〜１３６、１４９〜１５３、１６６〜１７０、１８３〜１８７、２００〜２０４、２１７〜２２１、２３４〜２３８、２５１〜２５５、２６８〜２７２、２８５〜２８９、３０２〜３０６、３１９〜３２３、３３６〜３４０、３５３〜３５７、３７０〜３７４、３８７〜３９１、４０４〜４０８、４２１〜４２５、４３８〜４４２、４５５〜４５９、４７２〜４７６、４８９〜４９３、５０６〜５１０、５２３〜５２７、５４０〜５４４、５５７〜５６１、５７４〜５７８、５９１〜５９５、６０８〜６１２、６２５〜６２９、６４２〜６４６、６５９〜６６３、６７６〜６８０、６９３〜６９７、７１０〜７１４、７２７〜７３１、７４４〜７４８、７６１〜７６５、７７８〜７８２、および３２１〜３２５、またはそれらの断片のヌクレオチド配列に見られるものが含まれ得るが、それらに制限されない。
【００５６】
同様に、特異的相同ポリペプチドは、上述のような特異的相同ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに対応し、したがって、本定義では、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス内に存在可能な変異体に突然変異または対応し、特に、少なくとも１つのアミノ酸残基の切断、置換、欠失、および／または付加に対応するポリペプチドを含む。
【００５７】
本発明の実施形態による「ポリペプチドの特異的生物活性断片」は、特に、本発明によるポリペプチドの特徴の少なくとも１つを有する上述のような特異的ポリペプチド断片を指すものとして理解されたい。 ある実施形態では、該ペプチドは、表１に概説されるタンパク質の種類のうちの少なくとも１つとして作用可能である。
【００５８】
本発明の実施形態によるポリペプチド断片は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス内に必然的に存在する単離または精製された断片に対応する、またはトリプシン、もしくはキモトリプシンもしくはコラゲナーゼ等のタンパク質酵素による、あるいは臭化シアン（ＣＮＢｒ）等の化学試薬による、該ポリペプチドの開裂によって得ることが可能な断片に対応し得る。同様に、そのようなポリペプチド断片は、適切な調節および／または発現要素の制御下で配置される該断片の発現を可能にする核酸を含有する、本発明による発現ベクターによって形質転換される宿主から、化学合成によってごく容易に調製可能である。
【００５９】
本発明の実施形態によるポリペプチドの「修飾ポリペプチド」は、正常配列に対して少なくとも１つの修飾を有する、後述のように、遺伝子組み換えまたは化学合成によって得られるポリペプチドを指すものとして理解される。これらの修飾は、特異性および／または活性の起点において、あるいは本発明によるポリペプチドの構造的立体配座、局所化、および膜内挿入能の起点において、アミノ酸に影響を及ぼすことが可能または不可能である場合がある。したがって、活性が等価、増加、または減少し、特異性が等価、より狭小、またはより広大なポリペプチドを生成することが可能となる。修飾ポリペプチドの中には、最大で５以上のアミノ酸が修飾、ＮまたはＣ末端において切断、またはさらに欠失もしくは付加可能であるポリペプチドに言及することが必要である。
【００６０】
示される真核または原核細胞に対する該変調を可能にする方法は、当業者には周知である。同様に、本発明による、後述のベクターを通して、該変調のための該修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を使用可能であることは周知である。
【００６１】
上述の修飾ポリペプチドは、コンビナトリアルケミストリーを使用することによって得ることが可能であって、例えば、複数のモデル、複数の細胞培養、または複数の生物体に対して試験し、最も活発なまたは求めた特性を有する化合物を選択する前に、ポリペプチドの一部を体系的に変更することが可能である。
【００６２】
同様に、化学合成は、非天然アミノ酸または非ペプチド結合を使用可能であるという利点を有する。
したがって、本発明によるポリペプチドの寿命を改良するために、非天然アミノ酸（例えば、Ｄ型）またはアミノ酸類似体（例えば、特に、含硫型）の使用に着目してもよい。
【００６３】
最終的に、本発明によるポリペプチド、その特異的、または修飾相同形態の構造をポリペプチド型または他の化学構造に統合することが可能となる。したがって、ＮおよびＣ末端において、プロテアーゼによって認識されない分子の提供に着目してもよい。
【００６４】
同様に、本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も、本発明の一部である。
同様に、本発明は、プライマーまたはプローブとして利用可能なヌクレオチド配列に関し、該配列が、本発明によるヌクレオチド配列から選択されることを特徴とする。
【００６５】
同様に、本発明は、種々の実施形態において、当業者に周知であって、特に、 後述のような手順による遺伝子組み換えまたは化学合成によって、天然ポリペプチドから精製して得ることが可能な、ヌクレオチド配列によってコードされるアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの特異的ポリペプチドに関することは十分理解されている。同様に、該ヌクレオチド配列によってコードされる該特異的ポリペプチドに対する標識または非標識モノあるいはポリクローナル抗体も、本発明によって包含される。
【００６６】
加えて、本発明の実施形態は、核酸配列の検出および／または増幅のためのプライマーまたはプローブとしての本発明によるヌクレオチド配列の使用に関する。
したがって、本発明の実施形態によるヌクレオチド配列を使用して、特に、ＰＣＲ技術（ポリメラーゼ連鎖反応）（Ｅｒｌｉｃｈ， １９８９、 Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９０、Ｒｏｌｆｓ ｅｔ ａｌ．， １９９１、およびＷｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９９７）によって、ヌクレオチド配列を増幅可能である。
【００６７】
これらのオリゴデオキシリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチドプライマーは、 有利には、少なくとも８つのヌクレオチド、好ましくは、少なくとも１２のヌクレオチド、さらにより好ましくは、少なくとも２０のヌクレオチドの長さを有する。
【００６８】
標的核酸の他の増幅技術が、有利には、ＰＣＲの代替として採用可能である。
同様に、本発明のヌクレオチド配列、特に本発明によるプライマーは、ＴＡＳ技術（転写増幅システム）（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、３ＳＲ技術（自家持続配列複製）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、ＮＡＳＢＡ技術（核酸増幅）（Ｋｉｅｖｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、ＳＤＡ技術（鎖置換増幅）（Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、ＴＭＡ技術（転写媒介性増幅）等、標的核酸の増幅の他の手順において採用可能である。
【００６９】
また、本発明のポリヌクレオチドは、熱安定性リガーゼを採用するＬＣＲ技術（リガーゼ連鎖反応）（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８（Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９９１によって改良））、ＲＣＲ技術（修復連鎖反応）（Ｓｅｇｅｖ，１９９２）、ＣＰＲ技術（サイクリングプローブ反応）（Ｄｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、Ｑ−βレプリカーゼによる増幅技術（Ｍｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８３（特に、Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９８６、Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８、その後、Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．ならびにＳｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６によって改良））等、プローブとしての役割を果たす核酸の増幅または修飾技術において採用可能である。
【００７０】
検出される標的ポリヌクレオチドが、可能性として、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡである場合、生物学的試料内に含有されるＲＮＡからｃＤＮＡを得るために、本発明による少なくとも１つのプライマーの支援による増幅反応の採用、または本発明の少なくとも１つのプローブの支援による検出手順の採用に先立って、逆転写型の酵素を使用することが可能となる。したがって、得られるｃＤＮＡは、本発明による増幅または検出手順において採用されるプライマーまたはプローブの標的としての役割を果たす。
【００７１】
検出プローブは、標的配列または標的配列から生成されるアンプリコンとハイブリダイズするように選択される。配列のために、そのようなプローブは、有利には、少なくとも１２のヌクレオチド、特に、少なくとも２０のヌクレオチド、好ましくは、少なくとも１００のヌクレオチドの配列を有する。
【００７２】
また、本発明の実施形態は、本発明によるプローブまたはプライマーとして利用可能なヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が放射性化合物または非放射性化合物によって標識されることを特徴とする。
【００７３】
非標識ヌクレオチド配列は、プローブまたはプライマーとして直接使用可能であるが、配列は、概して、放射性同位体（３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１２５Ｉ）または非放射性分子（ビオチン、アセチルアミノフルオレン、ジゴキシゲニン、５−ブロモデオキシウリジン、フルオレセイン）によって標識され、多くの用途のために利用可能なプローブを得る。
【００７４】
ヌクレオチド配列の非放射性標識の例は、例えば、フランス特許第７８．１０９７５号、またはＵｒｄｅａ ｅｔ ａｌ．、あるいはＳａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）に記載されている。
【００７５】
後者の場合、特許第ＦＲ−２ ４２２ ９５６号および第ＦＲ−２ ５１８ ７５５号に記載される標識方法の１つを使用することも可能となる。
該ハイブリダイゼーション技術は、種々の方法で実行可能である（Ｍａｔｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．， １９８８）。ほとんどの一般的方法は、支持体（ニトロセルロース、ナイロン、ポリスチレン等） 上に細胞の核酸抽出物を固定し、特定の条件下、プローブとともに固定された標的核酸をインキュベートするステップから成る。ハイブリダイゼーション後、過剰プローブは、排除され、形成されるハイブリッド分子は、適切な方法（プローブに連鎖する放射能、蛍光発光、または酵素活性の測定）によって検出される。
【００７６】
同様に、本発明は、種々の実施形態では、本発明によるヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、共有結合的にまたは非共有結合的に支持体上に固定されることを特徴とする。
【００７７】
本発明によるヌクレオチド配列を採用する別の有益な形態によると、後者は、支持体上に固定された状態で使用可能であって、したがって、特異的ハイブリダイゼーションによって、試験される生物学的試料から得られる標的核酸を捕捉する役割を果たすことが可能である。必要に応じて、固体支持体は、試料から分離され、その後、該捕捉プローブと標的核酸との間に形成されるハイブリダイゼーション複合体は、第２のプローブ（容易に検出可能な要素によって標識される、いわゆる検出プローブ）の支援によって検出される。
【００７８】
本発明の別の側面は、配列のクローニングおよび／または発現のためのベクターであって、該ベクターが本発明によるヌクレオチド配列を含有することを特徴とする。
同様に、所定の宿主細胞内の該ヌクレオチド配列の統合、発現、および／または分泌を可能にする要素を含有することを特徴とする本発明によるベクターも、本発明の一部である。
【００７９】
したがって、該ベクターは、プロモーター、翻訳の開始および終止信号、ならびに適切な転写調節領域を含有する場合がある。該ベクターは、宿主細胞内で安定的に維持可能であって、任意に、翻訳されたタンパク質の分泌を指定する特定の信号を有し得る。これらの異なる要素は、使用される宿主細胞に応じて選択されてもよい。本目的のために、本発明によるヌクレオチド配列は、選択された宿主内の自己複製ベクター内に挿入されてもよく、または選択された宿主の統合ベクターであってもよい。
【００８０】
そのようなベクターは、当業者によって現在使用されている方法に従って調製され、例えば、リポフェクション、エレクトロポレーション、および熱衝撃等の標準的方法によって、そこから生じるクローンを適切な宿主内に導入することが可能となる。
【００８１】
本発明によるベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルス起源のベクターである。本発明のポリペプチドの発現のためのベクターの一例は、バキュロウイルスである。
これらのベクターは、本発明のヌクレオチド配列をクローンまたは発現するために、宿主細胞の形質転換に有用である。
【００８２】
同様に、本発明は、本発明によるベクターによって形質転換される宿主細胞を含む。
これらの細胞は、上述のようなベクター内に挿入されたヌクレオチド配列を宿主細胞内に導入し、その後、トランスフェクトされたヌクレオチド配列の複製および／または発現を可能にする条件下、該細胞を培養することによって得ることが可能である。
【００８３】
該宿主細胞は、例えば、細菌性細胞（Ｏｌｉｎｓ ａｎｄ Ｌｅｅ， １９９３）であるが、同様に、酵母細胞（Ｂｕｃｋｈｏｌｚ， １９９３）およびアラビドプシス種等の植物細胞等の原核または真核細胞系、ならびに動物細胞、特に、哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）の培養物（Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ａｒｕｆｆｏ， １９９３）、同様に、例えば、バキュロウイルス、ｓｆ９昆虫細胞を採用する手順を使用可能な昆虫の細胞（Ｌｕｃｋｏｗ， １９９３）から選択可能である。
【００８４】
同様に、本発明の実施形態は、本発明による該形質転換細胞の１つを含む、生物体に関する。
アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの遺伝子の１つもしくは複数または該遺伝子の一部を発現する本発明による遺伝子組み換え生物体の取得は、ウイルス性または非ウイルス性トランスフェクション等の、当業者に周知の方法に従って、例えば、ラット、マウス、またはウサギにおいて実行されてもよい。遍在的性質の強力なプロモーターまたは一種類の組織のために選択可能なプロモーターの制御下、該遺伝子の複数のコピーのトランスフェクションによって、該遺伝子の１つもしくは複数を発現する遺伝子組み換え生物体を得ることが可能となる。同様に、胚細胞株内の相同的組み換え、これらの細胞株の胚への転移、生殖系レベルにおいて影響を受けたキメラの選択、および該キメラの成長によって、遺伝子組み換え生物体を得ることが可能となる。
【００８５】
形質転換細胞ならびに本発明による遺伝子組み換え生物体は、組み換えポリペプチドの調製のための手順において利用可能である。
今日、本発明による発現ベクターによる細胞形質転換を使用する、または本発明による遺伝子組み換え生物体を使用する遺伝子工学によって、比較的大量の組み換えポリペプチドを産生することが可能である。
【００８６】
ベクター、および／または本発明によるベクターによって形質転換された細胞、ならびに／あるいは本発明による該形質転換細胞の１つを含む遺伝子組み換え生物体を採用することを特徴とする組み換え形態における本発明のポリペプチドの調製のための手順はそれ自体、本発明内に含まれる。
【００８７】
本明細書で使用される、「形質転換」および「形質転換される」は、原核または真核細胞にかかわらず細胞への核酸の導入に関する。さらに、本明細書で使用される「形質転換」および「形質転換される」は、必ずしも増殖制御または増殖脱制御に関しない。
【００８８】
組み換え形態における本発明のポリペプチドの調製のための該手順には、ベクター、および／または該ベクターによって形質転換された細胞、ならびに／あるいはアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのポリペプチドをコードする本発明によるヌクレオチド配列を含有する該形質転換細胞の１つを含む、遺伝子組み換え生物体を採用する調製手順が含まれる。
【００８９】
本発明による変異体は、「担体」タンパク質（キメラタンパク質）に融合される組み換えポリペプチドの産生から成る場合がある。本システムの利点は、組み換え産物の安定化および／またはそのタンパク質分解の減少、生体外再生の過程における溶解度の増加、ならびに／あるいは融合パートナーが特異的リガンドに対して親和性を有する場合の精製の単純化を可能にし得ることである。
【００９０】
より具体的には、本発明は、本発明のポリペプチドの調製のための手順に関し、ａ）本発明によるヌクレオチド配列の組み換えポリペプチドの発現を可能にする条件下、形質転換細胞を培養し、ｂ）必要に応じて、該組み換えポリペプチドを回収するステップを含む。
【００９１】
本発明のポリペプチドの調製のための手順が、本発明による遺伝子組み換え生物体を採用する場合、該組み換えポリペプチドが、該生物体から抽出される。
また、本発明は、上述のような本発明の手順によって得ることが可能なポリペプチドに関する。
【００９２】
また、本発明は、合成ポリペプチドの調製のための手順を含み、本発明によるポリペプチドのアミノ酸の配列を使用することを特徴とする。
同様に、本発明は、本発明による手順によって得られる合成ポリペプチドに関する。
【００９３】
同様に、本発明によるポリペプチドは、ペプチドの合成の分野において慣習的技術によって調製可能である。本合成は、均一溶液または固体相中で実行可能である。
例えば、Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ（１９７４）による、均一溶液中の合成の技術を用いることが可能である。
【００９４】
本合成方法は、２つずつ、連続的アミノ酸を必要な順番で連続的に縮合する、あるいは前もって形成され、適切な順番でいくつかのアミノ酸を既に含有するアミノ酸および断片、または代替として、このように前もって調製されたいくつかの断片を縮合するステップから成り、ペプチドの合成において周知の方法に従って、特に、カルボキシル官能基の活性化後、通常、ペプチド結合の形成に伴うはずである、一方のアミン官能基および他方のカルボキシルまたはその反対を除き、これらのアミノ酸または断片によって担持される全反応性官能基をあらかじめ保護することが必要であることが理解されている。
【００９５】
また、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法を用いてもよい。
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの手順に従って、ペプチド鎖を生成するために、非常に多孔性の高分子樹脂が用いられ、その上に鎖の第１のＣ末端アミノ酸が固定される。本アミノ酸は、そのカルボキシル基を介して、樹脂上に固定され、そのアミン官能基が、保護される。したがって、ペプチド鎖を形成しようとするアミノ酸は、次々と、既に形成されたペプチド鎖の一部のアミノ基（毎回、あらかじめ脱保護される）上に固定され、樹脂に付着される。所望のペプチド鎖全体が形成されると、ペプチド鎖を形成する異なるアミノ酸の保護基は、排除され、ペプチドは、酸の支援によって、樹脂から分離される。
【００９６】
加えて、本発明は、本発明による少なくとも１つのポリペプチドを有するハイブリッドポリペプチドと、ヒトまたは動物内の免疫反応を誘発可能なポリペプチドの配列に関する。
【００９７】
有利には、抗原決定基は、液性応答および／または細胞性応答を誘発可能なものである。
そのような決定基は、複数のエピトープに対する抗体の合成を誘発可能な免疫原性組成を得ることを目的として使用される、グリコシル化、ペグ化、および／または別様に翻訳後修飾形態における本発明によるポリペプチドを含むことが可能となる。
【００９８】
これらのハイブリッド分子は、一部には、本発明によるポリペプチド担体分子またはその断片から形成可能であって、可能性としては、免疫原性部分、特に、ジフテリア毒素、破傷風毒素、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原（特許第ＦＲ ７９ ２１８１１号）、ポリオウイルスのＶＰ１抗原、もしくは任意の他のウイルス性または細菌性毒素あるいは抗原のエピトープに付随する。
【００９９】
ハイブリッド分子の合成のための手順は、追求されるポリペプチド配列をコードするハイブリッドヌクレオチド配列を構築するために、遺伝子工学で使用される方法を包含する。例えば、有利には、Ｍｉｎｔｏｎ（１９８４）による融合タンパク質をコードする遺伝子の取得のための技術を参照することが可能となる。
【０１００】
同様に、ハイブリッドポリペプチド、ならびに該ハイブリッドヌクレオチド配列の発現によって得られる組み換えポリペプチドであることを特徴とする本発明によるハイブリッドポリペプチドをコードする該ハイブリッドヌクレオチド配列も、本発明の一部である。
【０１０１】
同様に、本発明は、該ハイブリッドヌクレオチド配列の１つを含有することを特徴とするベクターを含む。同様に、該ベクターによって形質転換された宿主細胞、該形質転換細胞の１つを含む遺伝子組み換え生物体、ならびに該ベクター、該形質転換細胞および／または該遺伝子組み換え生物体を使用する組み換えポリペプチドの調製のための手順も、当然ながら、本発明の一部である。
【０１０２】
本発明によるポリペプチド、後述の本発明による抗体、および本発明によるヌクレオチド配列は、有利には、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスを含有可能な試料中において、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの検出および／または同定のための手順において採用可能である。該ポリペプチドの特異性、使用される本発明による抗体、ヌクレオチド配列に従う、これらの手順は、特に、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスを検出および／または同定することが可能となる。
【０１０３】
本発明によるポリペプチドは、有利には、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスを含有可能な試料中のアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの検出および／または同定するための手順において採用可能であって、ａ）該試料を本発明によるポリペプチドまたはその断片の１つと接触させるステップ（該ポリペプチドと、可能性として生物学的試料内に存在する抗体との間の免疫反応を可能にする条件下）と、ｂ）可能性として形成される抗原−抗体複合体を示すステップと、を含むことを特徴とする。
【０１０４】
従来のあらゆる手順が、可能性として形成される抗原−抗体複合体のそのような検出を実行するために採用可能である。
一例として、好ましい方法は、 ＥＬＩＳＡ技術、免疫蛍光法、または放射性免疫分析プロセス（ＲＩＡ）、あるいはそれらの同等物による、免疫酵素プロセスを利用する。
【０１０５】
したがって、同様に、本発明は、酵素、蛍光、または放射性型等の適切な標識の支援によって標識される、本発明によるポリペプチドに関する。
そのような方法は、例えば、本発明による所定量のポリペプチド組成をマイクロタイタープレートのウェル内に堆積させ、分析される増加希釈度の血清または上記で定義されたもの以外の生物学的試料を該ウェル内に導入し、マイクロタイタープレートをインキュベートし、ブタ免疫グロブリンに対する標識抗体をマイクロタイタープレートのウェル内に導入し、これらの抗体の標識化が、少なくとも、所定の波長、例えば、５５０ｎｍにおいて、後者の放射線の吸収を調節することによって、基質を加水分解可能なものから選択される酵素の支援によって実行され、対照試験と比較することによって、加水分解された基質の量を検出するステップを含む。
【０１０６】
本発明によるポリペプチドは、本発明によるポリペプチドを特異的に認識することを特徴とするモノクローナルまたはポリクローナル抗体を調製可能である。有利には、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）による技術に従って、ハイブリドーマからモノクローナル抗体を調製することが可能となる。例えば、本発明に従って、免疫反応のアジュバントに付随するポリペプチドまたはＤＮＡを動物、特に、マウスに免疫付与し、その後、抗原としての役割を果たすポリペプチドがあらかじめ固定されている親和性カラムで免疫動物の血清内に含有される特異的抗体を精製することによって、ポリクローナル抗体を調製することが可能となる。また、本発明によるポリクローナル抗体は、本発明に従って、本発明によるポリペプチドがあらかじめ固定された親和性カラム上で、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス、またはポリペプチド、あるいは断片によって免疫的に攻撃誘発された動物の血清内に含有される抗体を精製することによって、調製可能である。
【０１０７】
同様に、本発明は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、あるいはそれらの断片、あるいはキメラ抗体に関し、これらが、本発明によるポリペプチドを特異的に認識可能であることを特徴とする。
【０１０８】
同様に、本発明の抗体は、酵素、蛍光、または放射性型の標識等、本発明の核酸プローブに関する上述と同様に標識することが可能となる。
加えて、本発明は、試料中のアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの検出および／または同定のための手順を対象とし、該手順が、ａ）本発明によりモノクローナルまたはポリクローナル抗体と試料を接触させ（該抗体と、生物学的試料中に可能性として存在するアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのポリペプチドとの間の免疫反応を可能にする条件下）、ｂ）可能性として形成される抗原−抗体複合体を示すステップを含むことを特徴とする。
【０１０９】
同様に、本発明は、試料中のアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの検出および／または同定のための手順に関し、該手順が本発明によるヌクレオチド配列を採用することを特徴とする。
【０１１０】
より具体的には、本発明は、試料中のアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの検出および／または同定のための手順に関し、該手順が、ａ）必要に応じて、分析される試料からＤＮＡを単離し、ｂ）本発明により少なくとも１つのプライマーまたはプライマー対の支援によって、試料のＤＮＡを特異的に増幅し、ｃ）増幅産物を示すステップを含むことを特徴とする。
【０１１１】
これらは、例えば、本発明による核プローブを利用する分子ハイブリダイゼーションの技術によって、検出可能である。本プローブは、有利には、非放射性（コールドプローブ）または放射性同位体によって標識される。
【０１１２】
本発明の目的において、「生物学的試料のＤＮＡ」または「生物学的試料内に含有されるＤＮＡ」は、検討される生物学的試料中に存在するＤＮＡ、あるいは可能性として、該生物学的試料中に存在するＲＮＡに対する逆転写型の酵素の作用後に得られるｃＤＮＡを意味するものとして理解されたい。
【０１１３】
本発明のさらなる実施形態は、一方法を含み、該方法が、ａ）必要に応じて、あらかじめハイブリダイゼーションに感受性をもたせた生物学的試料（生物学的試料中に含有されるＤＮＡ）と、プローブを該試料のＤＮＡとハイブリダイゼーション可能な条件下、本発明によるヌクレオチドプローブを接触させ、ｂ）該ヌクレオチドプローブと該生物学的試料のＤＮＡとの間に形成されるハイブリッドを示すステップを含むことを特徴とする。
【０１１４】
また、本発明は、本発明による手順に関し、該手順が、ａ）本発明に従って、必要に応じて、あらかじめハイブリダイゼーションに感受性をもたせた生物学的試料（試料のＤＮＡ）と、該試料のＤＮＡとヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件下、支持体上に固定されたヌクレオチドプローブを接触させ、ｂ）必要に応じて、該プローブとハイブリダイズされていない生物学的試料のＤＮＡの排除後、支持体上に固定されたヌクレオチドプローブと、生物学的試料内に含有されるＤＮＡとの間に形成されるハイブリッドを、本発明に従って標識されたヌクレオチドプローブと接触させ、ｃ）ステップｂ）で形成された新規ハイブリッドを示すステップを含むことを特徴とする。
【０１１５】
上述で定義された検出および／または同定のための手順の有利な実施形態によると、これは、ステップａ）に先立って、まず、該生物学的試料のＤＮＡが、本発明による少なくとも１つのプライマーの支援によって増幅されることを特徴とする。
【０１１６】
方法の実施形態は、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択される第２のポリペプチドを使用して、第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップを含む。
【０１１７】
方法のさらなる実施形態は、第１のポリペプチドのタンパク質安定性、溶解度、分解、活性プロファイル、および／または外在化を調節する方法を含み、該方法は、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択される第２のポリペプチドを用いて、第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップを含む。
【０１１８】
方法のさらなる実施形態は、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０の配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む組み換え、精製、および／または単離されたヌクレオチド配列、および／または摂氏約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、および／または９５度以上の温度、および／または８、７、６、５、４、３、２、１、および／または０以下および／または以上のｐＨを含む環境において、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９の配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択される組み換え、精製、および／または単離されたポリペプチドを産生またはコードする細胞を配置するステップを含む。
【０１１９】
本発明は、発現タンパク質を産生する変化した能力を有するように遺伝子操作された細胞を提供する。特に、本発明は、対象となるタンパク質の増強された発現を有するバシラス属等のグラム陽性微生物に関し、バシラス内で１つもしくは複数の染色体性遺伝子が不活性化されている、および／または１つもしくは複数の染色体性遺伝子が、バシラス染色体から欠失している。いくつかのさらなる実施形態では、１つもしくは複数の常在染色体領域は、対応する野生型バシラス宿主染色体から欠失している。さらなる実施形態では、バシラスは、アリシクロバシラス属またはアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスである。
【０１２０】
さらなる実施形態では、摂氏約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、および／または９５度以上の温度で、および／または８、７、６、５、４、３、２、１、および／または０以下および／または以上のｐＨで、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０の配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む組み換え、精製、および／または単離されたヌクレオチド配列、および／または配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９の配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択される組み換え、精製、および／または単離されたポリペプチドを用いて、ポリペプチドをグリコシル化および／または翻訳後に修飾する方法を含む。
【０１２１】
本発明の実施形態では、本発明による単離および／または精製されたポリペプチドのいずれか１つが、摂氏約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、および／もしくは９５度以上の温度で酵素的もしくは機能的に活性であってもよく、ならびに／あるいは８、７、６、５、４、３、２、１、および／もしくは０以下および／または以上のｐＨで酵素的もしくは機能的に活性であってもよい。本発明のさらなる実施形態では、グリコシル化、ぺグ化、および／または他の翻訳後修飾が、８、７、６、５、４、３、２、１、および／または０以下のｐＨ、もしくは摂氏約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、および／または９５度以上の温度で、本発明による単離および／または精製されたポリペプチドが酵素的もしくは機能的に活性になるのに必要とされてもよい。
【０１２２】
本発明は、以下の例示的実施例において、さらに詳細に記載される。実施例は、本発明の選択された実施形態のみを表し得るが、以下の実施例は、例示するものであって、制限するものではないことを理解されたい。
【実施例１】
【０１２３】
アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスからのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を使用したグリコシル化
アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスから単離された、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９のポリペプチドをそれぞれコードする、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０のヌクレオチド配列を提供する。配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０のヌクレオチド配列は、当技術分野の標準的な技術を使用して、発現ベクター内に配置する。次いで、該ベクターを細菌細胞またはＳｆ９細胞またはＣＨＯ細胞等の真核細胞等の細胞に提供する。細胞内に存在する正常機構と連動して、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０を含むベクターは、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９のポリペプチドを産生する。次いで、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９のポリペプチドを単離および／または精製する。次いで、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９の単離および／または精製されたポリペプチドはそれぞれ、表１に示す活性のうちの１つもしくは複数を有することが証明された。
【０１２４】
配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９の単離および／または精製されたポリペプチドは、他のタンパク質または細胞成分と併せて、他のタンパク質のグリコシル化における活性を示すことが証明された。
【実施例２】
【０１２５】
アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスからのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を使用した、第１のポリペプチドのタンパク質安定性、溶解度、分解、活性プロファイル、および／または外在化の調節
グリコシル化または他の翻訳後修飾によって、１つもしくは複数の他のタンパク質を翻訳後修飾するために、実施例１のポリペプチドおよびヌクレオチド配列を使用する。修飾タンパク質は、同一または同様のアミノ酸配列の非修飾タンパク質と比較して、変化したタンパク質安定性、溶解度、分解、活性プロファイル、および／または外在化を有することが証明された。
【実施例３】
【０１２６】
アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのグリコシル化タンパク質
以下のプロトコルを用いて、ポリペプチドＲＡＡＣ０２６７６（配列番号３０７）を得た。アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスを小麦アラビノキシラン上で培養し、３日後に採取した。培養物を遠心分離し、細胞を除去し、結果として得られた上清を０．２２ミクロンのフィルタで濾過し、残った残屑はすべて除去した。濾過上清を、１０，０００Ｄａ分子量カットオフの透析膜を通して、限外濾過によって約１ｍＬまで濃縮した。結果として得られた濃縮濾過上清は、陽イオン交換カラム上にタンパク質を捕捉し、それらを塩勾配によって溶出し、第２の陽イオン交換カラム上に再装填し、第２の塩勾配によって溶出することによって、さらに精製した。試料を統合し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で処理した。個々のバンドをゲルから切り出し、ゲルトリプシン消化に供した。次いで、ペプチド断片を溶出し、Ｃ−１８カラム上で分離し、エレクトロスプレーを用いてイオントラップ質量分析計内に注入した。質量スペクトルを、観測スペクトルと既知のタンパク質配列から生成される理論スペクトルとを比較するＭＡＳＣＯＴによって処理した。ＭＡＳＣＯＴは、使用者がタンパク質上に存在し得る修飾を特定することを可能にし、これらの修飾と一致するスペクトルを検索する。ＭＡＳＣＯＴは、以下の表２に示すように、潜在的にグリコシル化されたＲＡＡＣ０２６７６から消化されるいくつかのペプチドを同定した。
【０１２７】
表２において分かるように、クエリ９４、９６、２２１、３３２、３３３、３３７、および４００から、ＲＡＡＣ０２６７６に対して予測されたグリコシル化が見出された。表２中の全ての断片は、配列番号３０７（ＲＡＡＣ０２６７６）の断片である。決定された部位に従ったＲＡＡＣ０２６７６のグリコシル化型を配列番号３０８で提供する。
【０１２８】
【表２−１】
【０１２９】
【表２−２】
【０１３０】
【表２−３】
【実施例４】
【０１３１】
アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスからのタンパク質の糖タンパク質染色
アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスを小麦アラビノキシラン上で培養し、３日後に採取した。培養物を遠心分離し、細胞を除去し、結果として得られた上清を０．２２ミクロンのフィルタで濾過し、残った残屑はすべて除去した。濾過上清を、１０，０００Ｄａ分子量カットオフの透析膜を通して、限外濾過によって約１ｍＬまで濃縮した。この濃縮物質のいくつかのレーンを、標準的なプロトコルを使用して、既知のグリコシル化および非グリコシル化タンパク質である陽性および陰性対照と共に、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で処理した。ゲルを縦に半分に切断し、片方をＳｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｓｔａｉｎで染色し、もう片方にはＳｉｇｍａの糖タンパク質検出キットを使用した。陽性および陰性対照の両方をＳｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ染色を使用して染色し、陽性対照のみを糖タンパク質で染色し、染色プロトコルが正確に機能していることを示した。アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスタンパク質レーンは、Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ染色ゲル上で約１２０ｋＤａのバンドを示し、それは、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの１つの細胞外タンパク質の予測された重量である。糖タンパク質染色ゲル上の同一位置は、ピンク色のバンドを示し、グリコシル化タンパク質に対して肯定的な結果を示した。
【０１３２】
本発明は、ある実施形態において説明されたが、本発明は、本開示の精神および範囲内でさらに修正可能である。したがって、本願は、その一般原則を使用して本発明の任意の変型、用途、または適合を網羅することを意図する。さらに、本願は、本発明が関連する当該分野における周知または慣例的実践内にあり、かつ添付の請求項およびそれらの法的同等物の制限内にあるような本開示からの逸脱も網羅することを意図する。
【０１３３】
【表３−１】
【０１３４】
【表３−２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離または精製された核酸配列。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、約ｐＨ８以下で酵素活性を有する、請求項１に記載の単離または精製された核酸配列。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、摂氏約３５度以上の温度で酵素活性を有する、請求項１に記載の単離または精製された核酸配列。
【請求項４】
前記核酸配列が、ベクター中に存在する、請求項１に記載の単離または精製された核酸配列。
【請求項５】
前記配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、単離または精製されたポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、約ｐＨ８以下で酵素活性を呈する、請求項５に記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、摂氏約３５度以上の温度で酵素活性を有する、請求項５に記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、グリコシル化、ペグ化、または別様に翻訳後に修飾される、請求項５に記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項５に記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項１０】
摂氏約３５度以上の温度で、または約８以下のｐＨで、第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾する方法であって、
配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる組み換え、精製、または単離されたポリペプチドを提供するステップと、
前記組み換え、精製、または単離されたポリペプチドで、第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップと、
を含む、方法。
【請求項１１】
前記第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップが、約ｐＨ８以下で生じる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップが、摂氏約３５度以上の温度で生じる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記組み換え、精製、または単離されたポリペプチドが、グリコシル化、ペグ化、または別様に翻訳後に修飾される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記組み換え、精製、または単離されたポリペプチドが、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
第１のポリペプチドのタンパク質安定性、溶解度、分解、活性プロファイル、または外在化を調節する方法であって、
配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる組み換え、精製、または単離されたポリペプチドを提供するステップと、
前記組み換え、精製、または単離されたポリペプチドで、第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップと、
を含む、方法。
【請求項１６】
前記第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップが、約ｐＨ８以下で生じる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップが、摂氏約３５度以上の温度で生じる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記組み換え、精製、または単離されたポリペプチドが、グリコシル化、ペグ化、または別様に翻訳後に修飾される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記組み換え、精製、または単離されたポリペプチドが、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離または精製された核酸配列。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが、約ｐＨ８以下で酵素活性を有する、請求項２０に記載の単離または精製された核酸配列。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが、摂氏約３５度以上の温度で酵素活性を有する、請求項２０に記載の単離または精製された酸配列。
【請求項２３】
前記核酸配列が、ベクター中に存在する、請求項２０に記載の単離または精製された核酸配列。
【請求項２４】
配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択されるポリペプチドを含む、単離または精製されたポリペプチド。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが、約ｐＨ８以下で酵素活性を有する、請求項２４に記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが、摂氏約３５度以上の温度で酵素活性を有する、請求項２４に記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが、グリコシル化、ペグ化、または別様に翻訳後に修飾される、請求項２４に記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが、ＵＤＰ β−グルコースホスホトランスフェラーゼ、ドリコール−リン酸マンノシルトランスフェラーゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼ活性から成る群より選択される活性を有する、請求項２４に記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項２９】
摂氏約３５度以上の温度で、または約８以下のｐＨで、第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾する方法であって、
配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０の配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる、組み換え、精製、または単離されたポリペプチドを提供するステップと、
前記組み換え、精製、または単離されたポリペプチドで、第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップと、
を含む、方法。
【請求項３０】
前記第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップが、約ｐＨ８以下で生じる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップが、摂氏約３５度以上の温度で生じる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記組み換え、精製、または単離されたポリペプチドが、グリコシル化、ペグ化、または別様に翻訳後に修飾される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記組み換え、精製、または単離されたポリペプチドが、ＵＤＰ β−グルコースホスホトランスフェラーゼ、ドリコール−リン酸マンノシルトランスフェラーゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼ活性から成る群より選択される活性を有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
第１のポリペプチドのタンパク質安定性、溶解度、分解、活性プロファイル、または外在化を調節する方法であって、
配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０の配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる組み換え、精製、または単離されたポリペプチドを提供するステップと、
前記組み換え、精製、または単離されたポリペプチドで、第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップと、
を含む、方法。
【請求項３５】
前記第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップが、約ｐＨ８以下で生じる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップが、摂氏約３５度以上の温度で生じる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記組み換え、精製、または単離されたポリペプチドは、グリコシル化、ペグ化、または別様に翻訳後に修飾される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記組み換え、精製、または単離されたポリペプチドが、ＵＤＰ β−グルコースホスホトランスフェラーゼ、ドリコール−リン酸マンノシルトランスフェラーゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼ活性から成る群より選択される活性を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項１】
配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離または精製された核酸配列。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、約ｐＨ８以下で酵素活性を有する、請求項１に記載の単離または精製された核酸配列。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、摂氏約３５度以上の温度で酵素活性を有する、請求項１に記載の単離または精製された核酸配列。
【請求項４】
前記核酸配列が、ベクター中に存在する、請求項１に記載の単離または精製された核酸配列。
【請求項５】
前記配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、単離または精製されたポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、約ｐＨ８以下で酵素活性を呈する、請求項５に記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、摂氏約３５度以上の温度で酵素活性を有する、請求項５に記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、グリコシル化、ペグ化、または別様に翻訳後に修飾される、請求項５に記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項５に記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項１０】
摂氏約３５度以上の温度で、または約８以下のｐＨで、第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾する方法であって、
配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる組み換え、精製、または単離されたポリペプチドを提供するステップと、
前記組み換え、精製、または単離されたポリペプチドで、第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップと、
を含む、方法。
【請求項１１】
前記第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップが、約ｐＨ８以下で生じる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップが、摂氏約３５度以上の温度で生じる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記組み換え、精製、または単離されたポリペプチドが、グリコシル化、ペグ化、または別様に翻訳後に修飾される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記組み換え、精製、または単離されたポリペプチドが、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
第１のポリペプチドのタンパク質安定性、溶解度、分解、活性プロファイル、または外在化を調節する方法であって、
配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる組み換え、精製、または単離されたポリペプチドを提供するステップと、
前記組み換え、精製、または単離されたポリペプチドで、第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップと、
を含む、方法。
【請求項１６】
前記第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップが、約ｐＨ８以下で生じる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップが、摂氏約３５度以上の温度で生じる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記組み換え、精製、または単離されたポリペプチドが、グリコシル化、ペグ化、または別様に翻訳後に修飾される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記組み換え、精製、または単離されたポリペプチドが、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離または精製された核酸配列。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが、約ｐＨ８以下で酵素活性を有する、請求項２０に記載の単離または精製された核酸配列。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが、摂氏約３５度以上の温度で酵素活性を有する、請求項２０に記載の単離または精製された酸配列。
【請求項２３】
前記核酸配列が、ベクター中に存在する、請求項２０に記載の単離または精製された核酸配列。
【請求項２４】
配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、および３０９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択されるポリペプチドを含む、単離または精製されたポリペプチド。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが、約ｐＨ８以下で酵素活性を有する、請求項２４に記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが、摂氏約３５度以上の温度で酵素活性を有する、請求項２４に記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが、グリコシル化、ペグ化、または別様に翻訳後に修飾される、請求項２４に記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが、ＵＤＰ β−グルコースホスホトランスフェラーゼ、ドリコール−リン酸マンノシルトランスフェラーゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼ活性から成る群より選択される活性を有する、請求項２４に記載の単離または精製されたポリペプチド。
【請求項２９】
摂氏約３５度以上の温度で、または約８以下のｐＨで、第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾する方法であって、
配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０の配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる、組み換え、精製、または単離されたポリペプチドを提供するステップと、
前記組み換え、精製、または単離されたポリペプチドで、第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップと、
を含む、方法。
【請求項３０】
前記第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップが、約ｐＨ８以下で生じる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップが、摂氏約３５度以上の温度で生じる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記組み換え、精製、または単離されたポリペプチドが、グリコシル化、ペグ化、または別様に翻訳後に修飾される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記組み換え、精製、または単離されたポリペプチドが、ＵＤＰ β−グルコースホスホトランスフェラーゼ、ドリコール−リン酸マンノシルトランスフェラーゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼ活性から成る群より選択される活性を有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
第１のポリペプチドのタンパク質安定性、溶解度、分解、活性プロファイル、または外在化を調節する方法であって、
配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、および３１０の配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる組み換え、精製、または単離されたポリペプチドを提供するステップと、
前記組み換え、精製、または単離されたポリペプチドで、第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップと、
を含む、方法。
【請求項３５】
前記第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップが、約ｐＨ８以下で生じる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１のポリペプチドをグリコシル化または翻訳後修飾するステップが、摂氏約３５度以上の温度で生じる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記組み換え、精製、または単離されたポリペプチドは、グリコシル化、ペグ化、または別様に翻訳後に修飾される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記組み換え、精製、または単離されたポリペプチドが、ＵＤＰ β−グルコースホスホトランスフェラーゼ、ドリコール−リン酸マンノシルトランスフェラーゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼ活性から成る群より選択される活性を有する、請求項３４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８】
【図１９】
【公表番号】特表２０１１−５１７９３１（Ｐ２０１１−５１７９３１Ａ）
【公表日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４８８６９（Ｐ２０１０−５４８８６９）
【出願日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３５３０７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５１０４９
【国際公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【出願人】（５０１４４５９８８）バテル エナジー アライアンス，エルエルシー (14)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３５３０７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５１０４９
【国際公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【出願人】（５０１４４５９８８）バテル エナジー アライアンス，エルエルシー (14)
【Ｆターム（参考）】
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