アルコール性肝硬変患者における感染の予防及び治療のための医薬
【課題】アルコール性肝硬変患者における易感染性を改善するための医薬を提供する。
【解決手段】アルコール性肝硬変患者における感染の予防及び／又は治療のための医薬であって、ニンニク加工物、例えば乾燥形態のニンニク粉末を有効成分として含む医薬。
【解決手段】アルコール性肝硬変患者における感染の予防及び／又は治療のための医薬であって、ニンニク加工物、例えば乾燥形態のニンニク粉末を有効成分として含む医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコール性肝硬変患者における感染の予防及び／又は治療のための医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝硬変は線維化が長期間持続した肝病変の終末像であり、正常な肝小葉が長期間の病変により破壊されて偽小葉として改築され、結節形成など肝構造の破壊と再生が行われている状態である。肝硬変の原因としてはウイルス感染やアルコールによるもののほか多様な原因があるが、アルコール性肝硬変は特に米国においてアルコール依存症による患者数が多く中高年の死因の上位を占めている。アルコール性肝硬変患者は感染に対して非常に脆弱になっており、感染により死亡することが多いことから、感染に対して予防や治療を積極的に行う必要がある。
【０００３】
補体第三成分(C3)は主として肝臓で産生され、血中に存在する非特異的免疫を担う液性因子である(Science, 163, pp.286-8, 1969)。C3のホモ接合欠損や後天性欠損は重篤な免疫低下やグラム陽性又はグラム陰性細菌による再発性感染を引き起こすことが知られていることから(Med. Clin. North Am, 69(3), pp.487-504, 1985)、補体は細菌に対する一次防御に重要であると考えられている。アルコール性肝硬変患者において血清C3が低下することが知られており(Gut, 40, pp.544-9, 1997)、アルコール性肝硬変患者における補体機能の低下と代替経路における溶血機能の低下が感染に対する脆弱性の原因となり、易感染性と致死率の増加をもたらすものと考えられている。また、C3を介する補体活性化の代替経路の役割に関して、C3ノックアウトマウスを用いた実験から、院内感染の起炎菌として知られているPseudomonas aeruginosaの経鼻感染の防御に本経路が重要な役割を果たしていることが示されている(Infect. Immun. 72(5), 2899-2906, 2004)。従って、C3遺伝子の発現を増加させることにより、アルコール性肝硬変患者における易感染性を改善し、重篤な感染症を予防及び／又は治療することが可能であると考えられる。
【０００４】
一方、ニンニクより抽出された乾燥粉末には、強壮、健胃、整腸、及び疲労回復などの薬効が認められている。また、ニンニクに含まれるアリシン、アホエン、及び二硫化ニアリル（DADS）等の成分は、Bcl-2発現抑制及びBax発現誘導作用、caspase-3活性上昇によるアポトーシス亢進作用(Exp. Mol. Med. 32(3), pp.127-34, 2000; Leukemia, 16(1), pp.74-83, 2002)、ferritin及びTransferrin receptor発現誘導による生体内の鉄の恒常性への寄与(J. Nutr., 132(12), pp.3638-41, 2002)、及びMicrosomal triglyceride transfer protein遺伝子発現誘導による脂質低下作用(J. Nutr., 132(6), pp.1165-8, 2001)を有することが報告されている。しかしながら、従来、ニンニク抽出物などのニンニク加工物のC3遺伝子の発現に対する作用については全く報告がなく、ニンニク加工物がアルコール性肝硬変患者における感染の予防及び／又は治療に有効性を示すことに関しても報告はない。
【非特許文献１】Science, 163, pp.286-8, 1969
【非特許文献２】Med. Clin. North. Am., 69(3), pp.487-504, 1985
【非特許文献３】Gut, 40, pp.544-545, 1997
【非特許文献４】Infect. Immun., 72(5), pp.2899-2906, 2004
【非特許文献５】Exp. Mol. Med. 32(3), pp.127-34, 2000
【非特許文献６】Leukemia, 16(1), pp.74-83, 2002
【非特許文献７】J. Nutr., 132(12), pp.3638-41, 2002
【非特許文献８】J. Nutr., 132(6), pp.1165-8, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、アルコール性肝硬変患者における感染の予防及び／又は治療のための医薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ニンニク抽出物などのニンニク加工物が補体第三成分(C3)遺伝子の発現を増強する作用を有しており、アルコール性肝硬変患者における易感染性を改善して、感染の予防及び／又は治療を達成できることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成された。
【０００７】
すなわち、本発明により、アルコール性肝硬変患者における感染の予防及び／又は治療のための医薬であって、ニンニク加工物を有効成分として含む医薬が提供される。また、本発明により、アルコール性肝硬変患者の易感染性を改善するための医薬であって、ニンニク加工物を有効成分として含む医薬が提供される。
これらの発明の好ましい態様によれば、ニンニク加工物がニンニク抽出物である上記の医薬；及びニンニク加工物が乾燥形態のニンニク粉末である上記の医薬が提供される。
【０００８】
別の観点からは、上記の医薬の製造のためのニンニク加工物の使用；及び、アルコール性肝硬変患者の感染の予防及び治療方法であって、ニンニク加工物の有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法、及びアルコール性肝硬変患者の易感染性の改善方法であって、ニンニク加工物の有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法が提供される。
さらに、ニンニク加工物を有効成分として含む補体第三成分(C3)発現増強剤、ヒトを含む哺乳類動物の生体内において C3の発現を増強する方法であって、ニンニク加工物の有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法が本発明により提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の医薬は補体第三成分(C3)遺伝子の発現を増強する作用を有しており、アルコール性肝硬変患者における感染の予防及び／又は治療に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の医薬の有効成分として用いられるニンニク加工物の種類は特に限定されず、ユリ科ネギ属にんにく（Allium sativuml.）の鱗茎を加工して得られるものであればいかなるものを用いてもよい。本明細書において、「加工」の用語は生のニンニクに加熱、乾燥、粉砕、又は抽出などの何らかの加工を施すことを意味しているが、加工の種類は特に限定されず、いかなる意味においてもこの用語を限定的に解釈してはならない。
【００１１】
加工には、例えば、生ニンニクを乾燥する処理若しくは乾燥後に粉末化する処理、生ニンニクを水蒸気蒸留する処理、生ニンニクを油、水、熱水、若しくは水溶性有機溶媒等で抽出する処理、又は生ニンニクを加熱する処理などが含まれ、特に水溶性有機溶媒で抽出する処理が好ましい。抽出に用いる油としては、例えば、菜種油、オリーブ油、又は大豆油等の食用植物油が挙げられ、水溶性有機溶媒としては、例えば、エタノール若しくはイソプロパノール等の低級アルコール；又はプロピレングリコール若しくはジエチレングリコール等のグリコール等が挙げられる。
【００１２】
ニンニク加工物としては、例えば、加工大蒜、ニンニク抽出液、ニンニクエキス、又は乾燥ニンニク等が好ましく、特に加工大蒜が好ましい。加工大蒜は、加熱処理ニンニク抽出液を低級アルコール抽出等の工程を経て調製されるニンニク粉末又はエキスを意味しており、例えば、オキソアミヂン（登録商標）（理研化学工業株式会社製）、オキソアミヂン（登録商標）末（理研化学工業株式会社製）、オキソレヂン（登録商標）（理研化学工業株式会社製）、又はオキソレヂン（登録商標）末（理研化学工業株式会社製）等が市販されている。ニンニクエキスとしては、例えば、ニンニクエキス（アルプス薬品工業株式会社製）又はニンニク流エキス（日本粉末薬品株式会社製）等が市販されている。乾燥ニンニクとしては、例えば、ガーリックパウダー又はローストガーリックパウダーＥＸ（理研化学工業株式会社製）等が市販されている。これらのニンニク加工物のうち、オキソアミヂン（登録商標）（理研化学工業株式会社製）、オキソアミヂン（登録商標）末（理研化学工業株式会社製）、オキソレヂン（登録商標）（理研化学工業株式会社製）、又はオキソレヂン（登録商標）末（理研化学工業株式会社製）等が好ましい。
【００１３】
本発明の医薬の有効成分であるニンニク加工物は、以下の実施例に具体的に示すように、肝臓で産生され、血中に放出されることにより感染防御等の免疫応答に重要な役割を果たしている補体第三成分(C3)の発現を増強する作用を有している。本発明の医薬は、肝臓における本遺伝子の発現を増強することによりアルコール性肝硬変患者の易感染性を改善することができ、アルコール性肝硬変患者における感染の予防及び／又は治療効果を発揮することができる。
【００１４】
肝硬変は線維化が長期間持続して正常な肝小葉が破壊されて偽小葉として改築され、結節形成など肝構造の破壊と再生が行われている状態であり、医師により容易に診断可能な疾患である。本発明の医薬は、種々の原因により生じる肝硬変のうちアルコール性肝硬変を対象としているが、アルコール性肝硬変であるか否かは熟練した医師により容易に判定することができる。診断に際しては飲酒歴やアルコール性脂肪肝やアルコール性肝炎の罹患暦などが参考になる場合もある。
【００１５】
本発明の医薬は、アルコール性肝硬変患者における易感染性を改善し、感染の予防及び／又は治療を達成することができるが、本発明の医薬はアルコール性肝硬変患者において補体第三成分(C3)の発現を増強することにより免疫を増強することから、適用対象となる感染症の種類は特に限定されず、細菌、真菌、若しくは原虫などの微生物やウイルスなどによる任意の感染症に対して適用することができる。例えば、グラム陽性菌又はグラム陰性菌、あるいは好気性菌又は嫌気性菌などに分類される各種の細菌による感染症や、ヘルペスウイルスやHIVウイルスなどのウイルス感染症を好ましい対象とすることができる。本発明の医薬は、感染症に対して感染原因となる微生物やウイルスの排除（殺菌や静菌など）を目的として使用される抗微生物薬や抗ウイルス薬のほか、感染にともなう炎症や発熱に対して用いられる解熱鎮痛剤などと併用することができる。
【００１６】
本発明の医薬としては、有効成分である上記のニンニク加工物をそのまま投与してもよいが、ニンニク加工物とともに１種又は２種以上の製剤用添加物を含む医薬組成物を調製して投与してもよい。本発明の医薬は、通常は経口により投与することが望ましいが、ニンニク加工物としてニンニク抽出液を用いる場合などには静脈内投与などの非経口投与を行なうことも可能であり、あるいは直腸内投与形態の医薬組成物を調製して非経口的に投与することも可能である。
【００１７】
経口投与に適する医薬組成物としては、固形又は液体の医薬組成物のいずれであってもよい。経口用の固形医薬組成物は、例えば、有効成分であるニンニク加工物に賦形剤を加え、さらに必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、又は矯味剤などの製剤用添加物を加えた後、常法により錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤として調製することができる。製剤用添加物としては、当該分野で一般的に使用されているものを用いることができる。例えば、乳糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、微結晶セルロース、珪酸等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ゼラチン液、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、ポリビニルピロリドン等の結合剤；カンテン末、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド等の崩壊剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等の滑沢剤；β−カロチン、黄色三二酸化鉄、カラメル等の着色剤；及び白糖、橙皮等の矯味剤を例示できる。
【００１８】
経口用の液体医薬組成物は、有効成分であるニンニク加工物に矯味剤、安定化剤、又は保存剤など製剤用添加物の１種又は２種以上を加え、常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等として調製することができる。製剤用添加物としては、当該分野で一般的に使用されているものを用いることができる。例えば白糖等の矯味剤；トラガント等の安定化剤；パラオキシ安息香酸エステル等の保存剤が挙げられる。
【００１９】
非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤などの製剤形態を例示することができる。注射剤は、例えば水性のニンニク抽出液に安定化剤又は等張化剤等などの製剤用添加物の１種又は２種以上を添加し、常法により皮下、筋肉、又は静脈内投与用の注射剤として製造することができる。製剤用添加物としては、当該分野で一般的に使用されているものを用いることができる。例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム等の安定化剤；塩化ナトリウム等の等張化剤を例示できる。直腸内投与用の医薬組成物としては坐薬を挙げることができる。座薬は、ニンニク加工物に担体及び界面活性剤などの製剤用添加物を加えて常法により製造することができる。製剤用添加物としては、当該分野で一般的に使用されているものを用いることができる。例えば、ポリエチレングリコール、ハードファット等の担体；ポリソルベート８０等の界面活性剤を例示できる。
【００２０】
本発明の医薬の投与量は特に限定されず、患者の年齢、体重、及び症状、投与形態、投与経路、及び投与回数などによって適宜選択可能である。通常は、ニンニク加工物の質量として成人１日あたり0.1 mg〜10 g程度を投与することができる。本発明の医薬は１日１回又は数回に分けて経口投与又は非経口投与することができるが、投与回数も適宜選択可能である。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例により限定されることはない。
例１
(1)方法
(a)被験物質：
オキソアミヂン末（登録商標、理研化学工業株式会社製）
媒体:生理食塩液、濃度：5mg/mL
(b)動物実験
一晩絶食したラットにオキソアミヂン末を100mg/kgとなるよう経口単回投与した（対照動物については媒体を経口単回投与）。24時間後、それぞれの動物について無麻酔下で断頭した後肝臓を摘出し、液体窒素で凍結させた。凍結させた肝臓については次の操作まで−80℃で保存した。
【００２２】
(c)Total RNAの抽出並びに蛍光標識
Total RNAの抽出にはSV total RNA isolation system(登録商標、Promega社製)を用いた。すなわち、凍結したサンプルを約30mg秤量し、SV RNA Lysis Bufferを175μL 添加し、30分間の超音波処理並びに注射針(22G)により肝臓をホモジナイズし、SV RNA Dilution Bufferを350μL 添加して転倒混和させた。70℃で2分 インキュベートした後、10000×g、4℃で10分間の遠心分離を2回行い、上清を回収した。氷冷した95%エタノールを200μL添加し、ピペッティングにより混和した後、溶液をSpin BasketとCollection tubeからなるSpin Column Assemblyに移し、10000×g、4℃で1分間遠心分離した。Spin Column AssemblyにSV RNA Wash Solutionを600μL添加した後、10000×g、4℃で1分間遠心分離することにより洗浄した。予め調製したDNaseI反応液（Yellow Core Buffer 40μL 、MnCl2 5μL 、DNaseI 5μLを含む）を Spin Column Assemblyに添加し、室温で5分間静置した後、Spin Column AssemblyにSV DNase Stop Solutionを200μL添加して、10000×g、4℃で1分間遠心分離した。SV RNA Wash Solutionを250μL添加して洗浄した後、Nuclease-Free Waterを100μL添加して10000×g、4℃で2分間遠心分離することによりtotal RNAを溶出した。
【００２３】
得られたtotal RNAのうち400ngを用いて、Low RNA Input リニア増幅＆ラベル化キットによるラベリングを行った。すなわち、total RNAを400ng、T7 promoter プライマーを1.2μL、Nuclease-free waterを混合して合計11.5μLとした後、65℃で10分間インキュベーションし、5分間氷冷後、予め65℃で加温した5×First strand bufferを4μL、0.1M DTTを2μL、10mM dNTP mixを１μL、MMLV-RTを1μL、RNaseOUTを0.5μL添加して40℃で2時間インキュベートした。65℃で10分間インキュベートすることにより反応を停止した後、5分間氷冷した。氷冷後、Nuclease-free waterを15.3μL、4×Transcription bufferを20μL、0.1M DTTを6μL、NTP mixを8μL、予め40℃で加温した50％ PEGを6.4μL、RNaseOUTを0.5μL、Inorganic pyrophosphataseを0.6μL、T7 RNA polymeraseを0.8μL添加し、混合した。混合後、オキソアミヂン末を投与した動物の肝臓由来のRNAについては10mM Cyanine 5-CTP（以下Cy5）を2.4μL、媒体を投与した動物の肝臓由来のRNAについては10mM Cyanine 3-CTP（以下Cy3）を2.4μL 添加し、40℃で2時間、遮光下でインキュベートした。
【００２４】
反応終了後、RNeasy mini（QIAGEN社製）を用いて反応物（ラベル化cRNA）の精製を行った。すなわち、RLT bufferを350μL、エタノールを250μL添加し、混合後カラムに供し、10000×gで30秒間遠心した。カラムにRPE bufferを500μL添加し10000×gで30秒間遠心することでカラムを洗浄した。本洗浄操作は2回行った。RNase-free waterを30μL添加し、1分間静置した後10000×gで30秒間遠心することによりラベル化cRNAを溶出した。本溶出操作は2回行った。得られたラベル化cRNAを用いて、In situ hybridization kit plus（Agilent社製）によるrat microarray oligo（Agilent社製、以下ラットオリゴ）とのハイブリダイゼーションを行った。すなわち、Cy3 ラベル化cRNA 0.75μg相当とCy5ラベル化cRNA 0.75μg、10×コントロールターゲットを50μLとヌクレアーゼフリー水を混合して合計215μLとし、2×ターゲットソリューションを215μL、25×フラグメンテーションバッファを9μL添加し、60℃で30分間、遮光下でインキュベートした。2×ハイブリダイゼーションバッファを225μL添加して反応停止させた後、マイクロアレイ用チャンバー内でラットオリゴにアプライし、60℃で17時間ハイブリダイゼーションを行った。反応終了後、ラットオリゴを0.005％ TritonX-102含6×SSC並びに0.005％ TritonX-102含0.1×SSCで洗浄し、窒素ガスで乾燥させた。乾燥したラットオリゴをマイクロアレイスキャナー（Agilent社製）に供して画像を取り込んだ後、画像化ソフトFeature Extractionを用いてスポットの画像化並びにシグナル強度の数値化を行った。得られた数値について、Microsoft EXCEL にて解析を行った。
【００２５】
(2)結果及び考察
ラットオリゴに搭載されているプローブのうち、コントロールプローブ並びにノイズにより測定値の信頼性が低いプローブを除去し、残りの約20000遺伝子について解析を行った。その結果、オキソアミヂン末投与により媒体投与に対して発現量が2倍以上増加したものが1464遺伝子、逆にオキソアミヂン末投与により媒体投与に対して発現量が1/2以下に減少したものが1714遺伝子であった。これらのうち、機能既知遺伝子については発現が増加したものが1113遺伝子、減少したものが1222遺伝子であった。発現が増加した遺伝子には補体第三成分(C3)が含まれており、この遺伝子の発現量は媒体投与時を１とした場合、2.464であった（表１）。
【００２６】
C3低下は、C3の産生低下や消費亢進によって起こることから、本遺伝子の発現を増強したオキソアミヂンは、アルコール性肝硬変患者の感染症に認められるC3低下に基づく感染防御の免疫応答の低下に対して予防および治療効果を有するものと結論された。
【００２７】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコール性肝硬変患者における感染の予防及び／又は治療のための医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝硬変は線維化が長期間持続した肝病変の終末像であり、正常な肝小葉が長期間の病変により破壊されて偽小葉として改築され、結節形成など肝構造の破壊と再生が行われている状態である。肝硬変の原因としてはウイルス感染やアルコールによるもののほか多様な原因があるが、アルコール性肝硬変は特に米国においてアルコール依存症による患者数が多く中高年の死因の上位を占めている。アルコール性肝硬変患者は感染に対して非常に脆弱になっており、感染により死亡することが多いことから、感染に対して予防や治療を積極的に行う必要がある。
【０００３】
補体第三成分(C3)は主として肝臓で産生され、血中に存在する非特異的免疫を担う液性因子である(Science, 163, pp.286-8, 1969)。C3のホモ接合欠損や後天性欠損は重篤な免疫低下やグラム陽性又はグラム陰性細菌による再発性感染を引き起こすことが知られていることから(Med. Clin. North Am, 69(3), pp.487-504, 1985)、補体は細菌に対する一次防御に重要であると考えられている。アルコール性肝硬変患者において血清C3が低下することが知られており(Gut, 40, pp.544-9, 1997)、アルコール性肝硬変患者における補体機能の低下と代替経路における溶血機能の低下が感染に対する脆弱性の原因となり、易感染性と致死率の増加をもたらすものと考えられている。また、C3を介する補体活性化の代替経路の役割に関して、C3ノックアウトマウスを用いた実験から、院内感染の起炎菌として知られているPseudomonas aeruginosaの経鼻感染の防御に本経路が重要な役割を果たしていることが示されている(Infect. Immun. 72(5), 2899-2906, 2004)。従って、C3遺伝子の発現を増加させることにより、アルコール性肝硬変患者における易感染性を改善し、重篤な感染症を予防及び／又は治療することが可能であると考えられる。
【０００４】
一方、ニンニクより抽出された乾燥粉末には、強壮、健胃、整腸、及び疲労回復などの薬効が認められている。また、ニンニクに含まれるアリシン、アホエン、及び二硫化ニアリル（DADS）等の成分は、Bcl-2発現抑制及びBax発現誘導作用、caspase-3活性上昇によるアポトーシス亢進作用(Exp. Mol. Med. 32(3), pp.127-34, 2000; Leukemia, 16(1), pp.74-83, 2002)、ferritin及びTransferrin receptor発現誘導による生体内の鉄の恒常性への寄与(J. Nutr., 132(12), pp.3638-41, 2002)、及びMicrosomal triglyceride transfer protein遺伝子発現誘導による脂質低下作用(J. Nutr., 132(6), pp.1165-8, 2001)を有することが報告されている。しかしながら、従来、ニンニク抽出物などのニンニク加工物のC3遺伝子の発現に対する作用については全く報告がなく、ニンニク加工物がアルコール性肝硬変患者における感染の予防及び／又は治療に有効性を示すことに関しても報告はない。
【非特許文献１】Science, 163, pp.286-8, 1969
【非特許文献２】Med. Clin. North. Am., 69(3), pp.487-504, 1985
【非特許文献３】Gut, 40, pp.544-545, 1997
【非特許文献４】Infect. Immun., 72(5), pp.2899-2906, 2004
【非特許文献５】Exp. Mol. Med. 32(3), pp.127-34, 2000
【非特許文献６】Leukemia, 16(1), pp.74-83, 2002
【非特許文献７】J. Nutr., 132(12), pp.3638-41, 2002
【非特許文献８】J. Nutr., 132(6), pp.1165-8, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、アルコール性肝硬変患者における感染の予防及び／又は治療のための医薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ニンニク抽出物などのニンニク加工物が補体第三成分(C3)遺伝子の発現を増強する作用を有しており、アルコール性肝硬変患者における易感染性を改善して、感染の予防及び／又は治療を達成できることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成された。
【０００７】
すなわち、本発明により、アルコール性肝硬変患者における感染の予防及び／又は治療のための医薬であって、ニンニク加工物を有効成分として含む医薬が提供される。また、本発明により、アルコール性肝硬変患者の易感染性を改善するための医薬であって、ニンニク加工物を有効成分として含む医薬が提供される。
これらの発明の好ましい態様によれば、ニンニク加工物がニンニク抽出物である上記の医薬；及びニンニク加工物が乾燥形態のニンニク粉末である上記の医薬が提供される。
【０００８】
別の観点からは、上記の医薬の製造のためのニンニク加工物の使用；及び、アルコール性肝硬変患者の感染の予防及び治療方法であって、ニンニク加工物の有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法、及びアルコール性肝硬変患者の易感染性の改善方法であって、ニンニク加工物の有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法が提供される。
さらに、ニンニク加工物を有効成分として含む補体第三成分(C3)発現増強剤、ヒトを含む哺乳類動物の生体内において C3の発現を増強する方法であって、ニンニク加工物の有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法が本発明により提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の医薬は補体第三成分(C3)遺伝子の発現を増強する作用を有しており、アルコール性肝硬変患者における感染の予防及び／又は治療に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の医薬の有効成分として用いられるニンニク加工物の種類は特に限定されず、ユリ科ネギ属にんにく（Allium sativuml.）の鱗茎を加工して得られるものであればいかなるものを用いてもよい。本明細書において、「加工」の用語は生のニンニクに加熱、乾燥、粉砕、又は抽出などの何らかの加工を施すことを意味しているが、加工の種類は特に限定されず、いかなる意味においてもこの用語を限定的に解釈してはならない。
【００１１】
加工には、例えば、生ニンニクを乾燥する処理若しくは乾燥後に粉末化する処理、生ニンニクを水蒸気蒸留する処理、生ニンニクを油、水、熱水、若しくは水溶性有機溶媒等で抽出する処理、又は生ニンニクを加熱する処理などが含まれ、特に水溶性有機溶媒で抽出する処理が好ましい。抽出に用いる油としては、例えば、菜種油、オリーブ油、又は大豆油等の食用植物油が挙げられ、水溶性有機溶媒としては、例えば、エタノール若しくはイソプロパノール等の低級アルコール；又はプロピレングリコール若しくはジエチレングリコール等のグリコール等が挙げられる。
【００１２】
ニンニク加工物としては、例えば、加工大蒜、ニンニク抽出液、ニンニクエキス、又は乾燥ニンニク等が好ましく、特に加工大蒜が好ましい。加工大蒜は、加熱処理ニンニク抽出液を低級アルコール抽出等の工程を経て調製されるニンニク粉末又はエキスを意味しており、例えば、オキソアミヂン（登録商標）（理研化学工業株式会社製）、オキソアミヂン（登録商標）末（理研化学工業株式会社製）、オキソレヂン（登録商標）（理研化学工業株式会社製）、又はオキソレヂン（登録商標）末（理研化学工業株式会社製）等が市販されている。ニンニクエキスとしては、例えば、ニンニクエキス（アルプス薬品工業株式会社製）又はニンニク流エキス（日本粉末薬品株式会社製）等が市販されている。乾燥ニンニクとしては、例えば、ガーリックパウダー又はローストガーリックパウダーＥＸ（理研化学工業株式会社製）等が市販されている。これらのニンニク加工物のうち、オキソアミヂン（登録商標）（理研化学工業株式会社製）、オキソアミヂン（登録商標）末（理研化学工業株式会社製）、オキソレヂン（登録商標）（理研化学工業株式会社製）、又はオキソレヂン（登録商標）末（理研化学工業株式会社製）等が好ましい。
【００１３】
本発明の医薬の有効成分であるニンニク加工物は、以下の実施例に具体的に示すように、肝臓で産生され、血中に放出されることにより感染防御等の免疫応答に重要な役割を果たしている補体第三成分(C3)の発現を増強する作用を有している。本発明の医薬は、肝臓における本遺伝子の発現を増強することによりアルコール性肝硬変患者の易感染性を改善することができ、アルコール性肝硬変患者における感染の予防及び／又は治療効果を発揮することができる。
【００１４】
肝硬変は線維化が長期間持続して正常な肝小葉が破壊されて偽小葉として改築され、結節形成など肝構造の破壊と再生が行われている状態であり、医師により容易に診断可能な疾患である。本発明の医薬は、種々の原因により生じる肝硬変のうちアルコール性肝硬変を対象としているが、アルコール性肝硬変であるか否かは熟練した医師により容易に判定することができる。診断に際しては飲酒歴やアルコール性脂肪肝やアルコール性肝炎の罹患暦などが参考になる場合もある。
【００１５】
本発明の医薬は、アルコール性肝硬変患者における易感染性を改善し、感染の予防及び／又は治療を達成することができるが、本発明の医薬はアルコール性肝硬変患者において補体第三成分(C3)の発現を増強することにより免疫を増強することから、適用対象となる感染症の種類は特に限定されず、細菌、真菌、若しくは原虫などの微生物やウイルスなどによる任意の感染症に対して適用することができる。例えば、グラム陽性菌又はグラム陰性菌、あるいは好気性菌又は嫌気性菌などに分類される各種の細菌による感染症や、ヘルペスウイルスやHIVウイルスなどのウイルス感染症を好ましい対象とすることができる。本発明の医薬は、感染症に対して感染原因となる微生物やウイルスの排除（殺菌や静菌など）を目的として使用される抗微生物薬や抗ウイルス薬のほか、感染にともなう炎症や発熱に対して用いられる解熱鎮痛剤などと併用することができる。
【００１６】
本発明の医薬としては、有効成分である上記のニンニク加工物をそのまま投与してもよいが、ニンニク加工物とともに１種又は２種以上の製剤用添加物を含む医薬組成物を調製して投与してもよい。本発明の医薬は、通常は経口により投与することが望ましいが、ニンニク加工物としてニンニク抽出液を用いる場合などには静脈内投与などの非経口投与を行なうことも可能であり、あるいは直腸内投与形態の医薬組成物を調製して非経口的に投与することも可能である。
【００１７】
経口投与に適する医薬組成物としては、固形又は液体の医薬組成物のいずれであってもよい。経口用の固形医薬組成物は、例えば、有効成分であるニンニク加工物に賦形剤を加え、さらに必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、又は矯味剤などの製剤用添加物を加えた後、常法により錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤として調製することができる。製剤用添加物としては、当該分野で一般的に使用されているものを用いることができる。例えば、乳糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、微結晶セルロース、珪酸等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ゼラチン液、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、ポリビニルピロリドン等の結合剤；カンテン末、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド等の崩壊剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等の滑沢剤；β−カロチン、黄色三二酸化鉄、カラメル等の着色剤；及び白糖、橙皮等の矯味剤を例示できる。
【００１８】
経口用の液体医薬組成物は、有効成分であるニンニク加工物に矯味剤、安定化剤、又は保存剤など製剤用添加物の１種又は２種以上を加え、常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等として調製することができる。製剤用添加物としては、当該分野で一般的に使用されているものを用いることができる。例えば白糖等の矯味剤；トラガント等の安定化剤；パラオキシ安息香酸エステル等の保存剤が挙げられる。
【００１９】
非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤などの製剤形態を例示することができる。注射剤は、例えば水性のニンニク抽出液に安定化剤又は等張化剤等などの製剤用添加物の１種又は２種以上を添加し、常法により皮下、筋肉、又は静脈内投与用の注射剤として製造することができる。製剤用添加物としては、当該分野で一般的に使用されているものを用いることができる。例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム等の安定化剤；塩化ナトリウム等の等張化剤を例示できる。直腸内投与用の医薬組成物としては坐薬を挙げることができる。座薬は、ニンニク加工物に担体及び界面活性剤などの製剤用添加物を加えて常法により製造することができる。製剤用添加物としては、当該分野で一般的に使用されているものを用いることができる。例えば、ポリエチレングリコール、ハードファット等の担体；ポリソルベート８０等の界面活性剤を例示できる。
【００２０】
本発明の医薬の投与量は特に限定されず、患者の年齢、体重、及び症状、投与形態、投与経路、及び投与回数などによって適宜選択可能である。通常は、ニンニク加工物の質量として成人１日あたり0.1 mg〜10 g程度を投与することができる。本発明の医薬は１日１回又は数回に分けて経口投与又は非経口投与することができるが、投与回数も適宜選択可能である。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例により限定されることはない。
例１
(1)方法
(a)被験物質：
オキソアミヂン末（登録商標、理研化学工業株式会社製）
媒体:生理食塩液、濃度：5mg/mL
(b)動物実験
一晩絶食したラットにオキソアミヂン末を100mg/kgとなるよう経口単回投与した（対照動物については媒体を経口単回投与）。24時間後、それぞれの動物について無麻酔下で断頭した後肝臓を摘出し、液体窒素で凍結させた。凍結させた肝臓については次の操作まで−80℃で保存した。
【００２２】
(c)Total RNAの抽出並びに蛍光標識
Total RNAの抽出にはSV total RNA isolation system(登録商標、Promega社製)を用いた。すなわち、凍結したサンプルを約30mg秤量し、SV RNA Lysis Bufferを175μL 添加し、30分間の超音波処理並びに注射針(22G)により肝臓をホモジナイズし、SV RNA Dilution Bufferを350μL 添加して転倒混和させた。70℃で2分 インキュベートした後、10000×g、4℃で10分間の遠心分離を2回行い、上清を回収した。氷冷した95%エタノールを200μL添加し、ピペッティングにより混和した後、溶液をSpin BasketとCollection tubeからなるSpin Column Assemblyに移し、10000×g、4℃で1分間遠心分離した。Spin Column AssemblyにSV RNA Wash Solutionを600μL添加した後、10000×g、4℃で1分間遠心分離することにより洗浄した。予め調製したDNaseI反応液（Yellow Core Buffer 40μL 、MnCl2 5μL 、DNaseI 5μLを含む）を Spin Column Assemblyに添加し、室温で5分間静置した後、Spin Column AssemblyにSV DNase Stop Solutionを200μL添加して、10000×g、4℃で1分間遠心分離した。SV RNA Wash Solutionを250μL添加して洗浄した後、Nuclease-Free Waterを100μL添加して10000×g、4℃で2分間遠心分離することによりtotal RNAを溶出した。
【００２３】
得られたtotal RNAのうち400ngを用いて、Low RNA Input リニア増幅＆ラベル化キットによるラベリングを行った。すなわち、total RNAを400ng、T7 promoter プライマーを1.2μL、Nuclease-free waterを混合して合計11.5μLとした後、65℃で10分間インキュベーションし、5分間氷冷後、予め65℃で加温した5×First strand bufferを4μL、0.1M DTTを2μL、10mM dNTP mixを１μL、MMLV-RTを1μL、RNaseOUTを0.5μL添加して40℃で2時間インキュベートした。65℃で10分間インキュベートすることにより反応を停止した後、5分間氷冷した。氷冷後、Nuclease-free waterを15.3μL、4×Transcription bufferを20μL、0.1M DTTを6μL、NTP mixを8μL、予め40℃で加温した50％ PEGを6.4μL、RNaseOUTを0.5μL、Inorganic pyrophosphataseを0.6μL、T7 RNA polymeraseを0.8μL添加し、混合した。混合後、オキソアミヂン末を投与した動物の肝臓由来のRNAについては10mM Cyanine 5-CTP（以下Cy5）を2.4μL、媒体を投与した動物の肝臓由来のRNAについては10mM Cyanine 3-CTP（以下Cy3）を2.4μL 添加し、40℃で2時間、遮光下でインキュベートした。
【００２４】
反応終了後、RNeasy mini（QIAGEN社製）を用いて反応物（ラベル化cRNA）の精製を行った。すなわち、RLT bufferを350μL、エタノールを250μL添加し、混合後カラムに供し、10000×gで30秒間遠心した。カラムにRPE bufferを500μL添加し10000×gで30秒間遠心することでカラムを洗浄した。本洗浄操作は2回行った。RNase-free waterを30μL添加し、1分間静置した後10000×gで30秒間遠心することによりラベル化cRNAを溶出した。本溶出操作は2回行った。得られたラベル化cRNAを用いて、In situ hybridization kit plus（Agilent社製）によるrat microarray oligo（Agilent社製、以下ラットオリゴ）とのハイブリダイゼーションを行った。すなわち、Cy3 ラベル化cRNA 0.75μg相当とCy5ラベル化cRNA 0.75μg、10×コントロールターゲットを50μLとヌクレアーゼフリー水を混合して合計215μLとし、2×ターゲットソリューションを215μL、25×フラグメンテーションバッファを9μL添加し、60℃で30分間、遮光下でインキュベートした。2×ハイブリダイゼーションバッファを225μL添加して反応停止させた後、マイクロアレイ用チャンバー内でラットオリゴにアプライし、60℃で17時間ハイブリダイゼーションを行った。反応終了後、ラットオリゴを0.005％ TritonX-102含6×SSC並びに0.005％ TritonX-102含0.1×SSCで洗浄し、窒素ガスで乾燥させた。乾燥したラットオリゴをマイクロアレイスキャナー（Agilent社製）に供して画像を取り込んだ後、画像化ソフトFeature Extractionを用いてスポットの画像化並びにシグナル強度の数値化を行った。得られた数値について、Microsoft EXCEL にて解析を行った。
【００２５】
(2)結果及び考察
ラットオリゴに搭載されているプローブのうち、コントロールプローブ並びにノイズにより測定値の信頼性が低いプローブを除去し、残りの約20000遺伝子について解析を行った。その結果、オキソアミヂン末投与により媒体投与に対して発現量が2倍以上増加したものが1464遺伝子、逆にオキソアミヂン末投与により媒体投与に対して発現量が1/2以下に減少したものが1714遺伝子であった。これらのうち、機能既知遺伝子については発現が増加したものが1113遺伝子、減少したものが1222遺伝子であった。発現が増加した遺伝子には補体第三成分(C3)が含まれており、この遺伝子の発現量は媒体投与時を１とした場合、2.464であった（表１）。
【００２６】
C3低下は、C3の産生低下や消費亢進によって起こることから、本遺伝子の発現を増強したオキソアミヂンは、アルコール性肝硬変患者の感染症に認められるC3低下に基づく感染防御の免疫応答の低下に対して予防および治療効果を有するものと結論された。
【００２７】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコール性肝硬変患者における感染の予防及び／又は治療のための医薬であって、ニンニク加工物を有効成分として含む医薬。
【請求項２】
アルコール性肝硬変患者の易感染性を改善するための医薬であって、ニンニク加工物を有効成分として含む医薬。
【請求項３】
ニンニク加工物がニンニク抽出物である請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項４】
ニンニク加工物が乾燥形態のニンニク粉末である請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項１】
アルコール性肝硬変患者における感染の予防及び／又は治療のための医薬であって、ニンニク加工物を有効成分として含む医薬。
【請求項２】
アルコール性肝硬変患者の易感染性を改善するための医薬であって、ニンニク加工物を有効成分として含む医薬。
【請求項３】
ニンニク加工物がニンニク抽出物である請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項４】
ニンニク加工物が乾燥形態のニンニク粉末である請求項１又は２に記載の医薬。
【公開番号】特開２００８−７４７０９（Ｐ２００８−７４７０９Ａ）
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２５２１５８（Ｐ２００６−２５２１５８）
【出願日】平成１８年９月１９日（２００６．９．１９）
【出願人】（０００１６３００６）興和株式会社 (618)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月１９日（２００６．９．１９）
【出願人】（０００１６３００６）興和株式会社 (618)
【Ｆターム（参考）】
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