イムノグロブリン様（Ｉｇ−様）ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質の精製方法
本発明は１つまたはそれよりも多くのイムノグロブリン様（Ｉｇ−様）ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質の精製方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、１つまたはそれより多くのイムノグロブリン様（Ｉｇ−様）ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
たとえばヒト成長ホルモン、ヒトプロテインＣ凝固因子ＶＩＩおよびＩＬ−１８ＢＰが含まれる多数のヒトおよびその他哺乳類のタンパク質は、宿主細胞をこれらタンパク質をコードするＤＮＡで形質転換させ、そしてタンパク質の発現に好ましい条件下で組換え細胞を増殖させることでこれら宿主細胞において産生されている。組換えタンパク質はトランスジェニック動物によっても産生され、そして乳汁として分泌される。組換えタンパク質は細胞から細胞培養培地へ、乳汁へ分泌されるか、または細胞溶解物に存在し、そして細胞老廃物、細胞残骸およびタンパク質のようなほかの細胞成分、またはその他回収された物質から分離しなければならない。タンパク質の精製は通常あるタイプのクロマトグラフィー分離が必要とされる（コンスタンス（Constans）ら（２００２年）の総説を参照）。
【０００３】
次に示すクロマトグラフィー分離は広く用いられている：ゲルろ過（ＧＦ）、イオン交換（ＩＥＸ）、疎水性相互作用（ＨＩ）クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよびＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）。
【０００４】
タンパク質の精製は通常３段階で行われる：捕獲工程（a capture step）、ここでは目的のタンパク質がＤＮＡおよびＲＮＡのようなその他の細胞構成要素から分離される；中間の工程（intermediate step）、ここではサイズまたはその他物理的／化学的性質が類似するコンタミナント（contaminants）からタンパク質が単離される；そして最後の磨き工程（polishing step）。各精製段階は精製される特定のタンパク質に最も適した特定のクロマトグラフィー技術およびビーズサイズを用いる。
【０００５】
最初の捕獲工程は典型的には粗精製（crude）の細胞溶解物または細胞培養培地からのタンパク質の単離を含んでおり、そしてこの工程は高いキャパシティーおよび速い流速（high flow rate）の樹脂を必要とする。大きなビーズサイズおよび大きなビーズサイズ範囲（範囲は平均ビーズサイズにより幅広く変わりうる）を有する「ファストフロー（fast flow）」樹脂はこの目的に適している。
【０００６】
イムノグロブリン（Ｉｇ）は任意の構造細胞抗原レセプター（structural cell antigen receptors）として定義される；これは構造および生物学的活性に基づいて５つのクラス（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）に分けられる。イムノグロブリン分子の基本構造単位は、モノマーに関すれば、それぞれ４つのドメイン（１つの可変ＶHドメインおよび３つの定常ＣHドメイン）を有する２つの重（Ｈ）鎖およびそれぞれ２つのドメイン（１つの可変ＶLドメインおよび１つの定常ＣLドメイン）を有する２つの軽（Ｌ）鎖から構成されるＹ形の分子である。ＶHおよびＶLが抗原結合部位を構成する。イムノグロブリンドメインの基本的なパターンは、疎水性側鎖によってきつくまとめられている内部の大きな塊（internal volume）（すなわち、疎水性コア）を取り囲む２つのねじれたアンチパラレルβ−シートからなる。シートの湾曲程度（degree of curvature）に依存してドメインの全体形状はシリンダー（β−バレル）または２層が直線であればサンドイッチ様構造のいずれかで説明される。２つのβ−シートは、強くしかし厳格ではなく保存された鎖内ジスルフィド架橋の共有結合でつながっている（エンサイクロペディア・オブ・イムノロジー・エドス・ロイト・アンド・デルベス（Encyclopedia of Immunology Eds Roitt and Delves）（１９９２年）、９２〜９３頁および４７６〜４７７頁）。
【０００７】
Ｉｇ−様ドメインは真核生物および原核生物を含む多様な界由来のタンパク質から同定されており、ウイルス、カビおよび植物も含まれる（ハラビー（Halaby）ら（１９９８年））。Ｉｇ−様ドメインは多くのタンパク質において発見されており、例えばバクテリア酵素であるβ−ガラクトシダーゼおよびキチナーゼＡ（chitinase A）において、成長ホルモン受容体などのヒト受容体において、ＩＬ−１受容体（マクマハン（McMahan）ら（１９９１年））、ＩＬ−６受容体（ボルマー（Vollmer）ら（１９９９年））およびヒト組織因子（ＨＦＴ）受容体（ハラビーら（１９９９年））などのサイトカイン受容体において、成長因子依存的シグナルを細胞内環境に導入する（transduce）チロシンキナーゼ受容体において（ワイマン（Weimann）ら（２０００年））、ＣＤ４のようなイムノグロブリン関連タンパク質において、およびフィブロネクチンタイプＩＩＩのような細胞外マトリックスタンパク質において（ハラビーら（１９９９年））発見されている。
【０００８】
典型的には、イムノグロブリン様（Ｉｇ−様）ドメインは、７〜１０のβ−鎖から構成されており、特定のトポロジーおよび接続性を有する２つのシートの間に分布する。イムノグロブリン折り畳みファミリー（immunoglobulin fold family）（ＩｇＦＦ）を網羅する５２個のＩｇ−様ドメインの三次元構造が比較され（ハラビーら（１９９９年））、ほとんどのＩｇ−様ドメインは１０％以下の配列相同性を示すことが結果として示され、しかもＩｇ−様ドメインにおいて共通のコアを形成しているほとんどの残基が疎水性であることが示された。したがって、Ｉｇ−様ドメインは配列というより構造的類似性を有する。疎水性コアは、Ｉｇ折り畳みの独自性および安定性に重要な影響を与える。Ｉｇ−様ドメインの広範な配列多様性にもかかわらず、Ｉｇ折り畳みの維持は水素結合の保存された配置（conserved geometry）によって促進されているようである。一部のタンパク質は１より多くのＩｇ−様ドメインを有しており、たとえば成熟タイプＩＩのＩＬ−１受容体は３つのイムノグロブリン様ドメインを（マクマハンら（１９９１年））および接着分子ＶＣＡＭは７つのＩｇ−様ドメインを有する（オスボーン（Osborn）ら（１９９４年））。
【０００９】
次にＩｇ−様ドメインを有する重要なタンパク質の例を挙げる：ＮＣＡＭ（５つのＩｇ−様ドメイン）、フィブロネクチンタイプＩＩＩ、ＩＣＡＭ−１、ｍａｄＣＡＭ−１、ＰＥ ＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、タイチン（titin）およびカドヘリンなどの接着分子、ニューロカン（neurocan）、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲおよびＯＳＭＲなどのサイトカイン受容体の細胞外ドメイン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体（７つのＩｇ−様ドメイン）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体、ヒト血小板由来成長因子（ｈＰＤＧＦ）受容体などの成長因子受容体、Ｔ細胞受容体、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質、マクロファージコロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）、ミクログロブリン−β、ＣＴＬＡ４ Ｂ７分子に対するＴ細胞の受容体（２つのＩｇ−様ドメイン）、Ｂ７ Ｔ細胞の増殖を制御するＢ細胞活性因子などの免疫関連受容体、およびニューレグリン、凝集因子ＸＩＩＩ、ＮＦ−ｋＢ、スーパーオキシドディスムターゼ（superoxide dismutase）およびＩＬ−１８結合タンパク質などのその他のタンパク質。
【００１０】
サイトカイン結合タンパク質は、通常それぞれの細胞表面サイトカイン受容体の細胞外リガンド結合ドメインからなる（可溶性サイトカイン受容体）。可溶性受容体は細胞表面受容体の選択的なスプライシングまたはタンパク質分解切断のどちらかにより産生される。これら可溶性受容体は過去において述べられている：たとえば、ＩＬ−６およびＩＦＮ−γ（ノビック（Novick）ら（１９８９年））、ＴＮＦ（エンゲルマン（Engelmann）ら（１９８９年）およびエンゲルマンら（１９９０年））、ＩＬ−１およびＩＬ−４（マリゼウスキー（Maliszewski）ら（１９９０年））ならびにＩＦＮ−α／β（ノビックら（１９９４年）およびノビックら（１９９２年））の可溶性受容体。ひとつのサイトカイン結合タンパク質として、有名なオステオプロテゲリン（osteoprotegerin）（ＯＰＧ、オステオクラスト（osteoclast）阻害因子−ＯＣＩＦとしても知られている）は、ＴＮＦＲ／Ｆａｓファミリーのメンバーであり、分泌タンパク質としてのみ存在する可溶性受容体の最初の例と思われる（アンダーソン（Anderson）ら（１９９７年）、シモネット（Simonet）ら（１９９７年）、ヤスダら（１９９８年））。
【００１１】
インターロイキン−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）は、インビトロにおいてＩＦＮ−γのＩＬ−１８誘導およびＮＦ−κＢのＩＬ−１８活性化を廃止させることが知られている（ノビックら（１９９９年））。ＩＬ−１８ＢＰは可溶性受容体であり、分泌タンパク質としてのみ存在する。ＩＬ−１８ＢＰは１つのＩｇ−様ドメインを有し、Ｉｇ−様ドメインを含むサイトカイン受容体の細胞外セグメントに類似する。
【００１２】
Ｉｇ−様ドメインを含む他の非イムノグロブリンタンパク質はインターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）である。文献においてインターロイキン−６は、前炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの両方として働くことが提案されている（ハインリッヒ（Heinrich）らによる総説（１９９８年）、ジョン（Jones）ら（２００１年）およびペダーセン（Pedersen）ら（２００１年））。ＩＬ−６の生物学的活性を媒介する受容体複合体は２つの別個の膜結合糖タンパク質からなり、ひとつは８０ｋＤａの同族受容体サブユニット（ＩＬ−６Ｒ）でありもうひとつは１３０ＫＤａのシグナル−変換エレメント（ｇｐ１３０、ＣＤ１３０）である。ｇｐ１３０の発現は遍在しており、対照的に、ＩＬ−６Ｒの細胞分布は限定されており大部分は幹細胞および白血球亜集団（subpopulations）に限られている。膜結合受容体に加えて、ＩＬ−６Ｒの可溶性型（ｓＩＬ−６Ｒ）はヒト血清および尿から精製されている。この可溶性受容体はＩＬ−６に結合し、ＩＬ−６の血漿での半減期を引き延ばす。さらに重要なことには、ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６複合体はｇｐ１３０と相互作用することにより細胞を活性化しうる。この特徴は、ｇｐ１３０を発現しているが本質的にＩＬ−６自体には応答しない細胞タイプに対しｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６複合体をアゴニストとさせる。それ故にｓＩＬ−６Ｒは、ＩＬ−６に応答できる細胞のタイプのレパートリーを広げることが可能である。
【００１３】
可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）をコードするｃＤＮＡの完全なコーディング領域をＩＬ−６と融合させることにより組換えＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラはヒト細胞において作製された（チェバス（Chebath）ら（１９９７年））。このＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラは促進されたＩＬ−６タイプの生物学的活性を有しており、そしてインビトロにおいてｇｐ１３０鎖にＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒとの混合物よりも非常に高い効率で結合する（コレット（Kollet）ら（１９９９年））。
【発明の開示】
【００１４】
メルカプト−エチル−ピリジン（ＭＥＰ）ＨｙｐｅｒＣｅｌ（バイオセプラ（BioSepra）社製）は、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）樹脂である。この樹脂はイムノグロブリンを捕獲するために特別にデザインされたものである（ボスチェッティ（Boschetti）ら（２０００年）およびライフテクノロジーズ・インコーポレーテッド製（２０００年））。中性ｐＨにおいては脂肪族−疎水性スペーサーおよび中性（荷電していない）ピリジン環の両方による疎水性捕獲がＨＩＣＩ樹脂においておこる。ＨＩクロマトグラフィーとは対照的に、ＨＣＩＣ樹脂においては、いくらかのｐＨまたはイオン強度の調整も必要とせずに細胞培養上清から抗体を吸着することが成し遂げられた。一度ｐＨがｐＨ７．２からｐＨ４に下げられると、樹脂中のピリジン環および結合している抗体は正電荷を帯びるようになり、電荷反発によりイムノグロブリンは引き離れ、そしてカラムから溶出される。このクロマトグラフィーの手法はイムノグロブリンの捕獲に使われているが、Ｉｇ−様ドメインを有する非イムノグロブリンタンパク質の捕獲に働くではあろうことは予測されなかった、何故ならばイムノグロブリンは独特の配列を有するからであり、そしてさらには５２個の異なる非イムノグロブリンタンパク質中のＩｇ−様ドメインは１０％未満の配列相同性を持っていたからである（ハラビーら（１９９９年））。
【００１５】
本発明は生物学的液体（biological fluid）からＩｇ−様ドメインを有する非イムノグロブリンタンパク質の精製方法に関する。
【００１６】
本発明は、
ａ）目的のタンパク質を含有する生物学的液体に疎水性電荷クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）樹脂を接触させる工程、
ｂ）アンバウンド（unbound）のコンタミナントを除去するために樹脂を洗う工程、
ｃ）酸性ｐＨを有する溶液または有機溶媒を含む溶液により樹脂を処理することにより目的のタンパク質を溶出させる工程
を含む、生物学的液体から１と１０の間のイムノグロブリン様（Ｉｇ−様）ドメインを有する目的の非イムノグロブリンタンパク質の精製または捕獲方法に関する。
【００１７】
本発明の１つの態様によれば、ＨＣＩＣ樹脂は、ＭＥＰ−ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂である。
【００１８】
本発明の別の態様によれば、工程ｃ）で用いられる有機溶媒はプロピレングリコールであって、溶液中のプロピレングリコール濃度が、約２５％と５０％の間にあることが好ましい。
【００１９】
本発明のさらに別の態様によれば、工程ａ）は、酸性のｐＨで実施され、ｐＨが約３と６．８の間にあることが好ましい。
【００２０】
本発明のさらに２つめの態様によれば、洗浄工程ｂ）は、酸性のｐＨを有する溶液で実施され、ｐＨは約３と６．８の間にあることが好ましい。
【００２１】
本発明の１つの側面（aspect）によれば、生物学的液体は、細胞調製培養培地、細胞溶解物、細胞抽出物、組織抽出物、血漿、血清、乳汁、尿、腹水、脳脊髄液、野菜ジュース、植物抽出物または初期クロマトグラフィー分離工程由来のフラクションから選択される。
【００２２】
本発明のさらなる態様によれば、目的のタンパク質は、１〜７のＩｇ−様ドメインを有する。
【００２３】
本発明は、ＩＬ−１８ＢＰ、ＮＣＡＭ、フィブロネクチンタイプＩＩＩ、ＩＣＡＭ−１、ｍａｄＣＡＭ−１、ＰＥ ＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、タイチン、カドヘリン、ニューロカン、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＯＳＭＲ、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ｈＰＤＧＦ受容体、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣタンパク質、ミクログロブリン−β、ＣＴＬＡ４、Ｂ７活性化因子、ニューレグリン、凝集因子ＸＩＩＩ、ＮＦ−ｋＢ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、β−ガラクトシダーゼおよびスーパーオキシドディスムターゼ、好ましくはＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラおよびβ−ガラクトシダーゼまたは少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを含むそれらのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能性誘導体またはフラグメントなど目的のタンパク質の精製または捕獲方法を提供する。
【００２４】
１つの態様によれば、本発明の方法は、精製因子が１１倍と９４倍との範囲で、好ましくは約９４倍で精製タンパク質を得ることができる。
【００２５】
さらなる態様によれば、本発明は濃縮因子が１．５倍と３．１倍との範囲で、好ましくは３．１倍で精製タンパク質を得ることができる。
【００２６】
また本発明の方法は、収率が７３％と９８％との範囲で、好ましくは約８５％で精製タンパク質を得ることができる。
【００２７】
加えて、本発明は
ａ）目的のタンパク質を含有する生物学的液体に疎水性電荷クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）樹脂を接触させる工程、
ｂ）アンバウンドのコンタミナントを除去するために樹脂を洗う工程、
ｃ）酸性ｐＨを有する溶液または有機溶媒を含む溶液により樹脂を処理することにより目的のタンパク質を溶出させる工程
を含む生物学的液体から１と１０の間のイムノグロブリン様（Ｉｇ−様）ドメインを有する目的の非イムノグロブリンタンパク質を捕獲するためのＨＣＩＣの使用を提供する。
【００２８】
１つの側面によれば、本発明は１と１０の間までのイムノグロブリン様（Ｉｇ−様）ドメインを有する目的の非イムノグロブリンタンパク質を含む精製タンパク質調製品であって、本発明の方法によって生物学的液体から精製または捕獲された精製タンパク質調製品を提供する。
【００２９】
本発明のさらなる態様によれば、精製タンパク質調製品はＩＬ−１８ＢＰ、ＮＣＡＭ、フィブロネクチンタイプＩＩＩ、ＩＣＡＭ−１、ｍａｄＣＡＭ−１、ＰＥ ＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、タイチン、カドヘリン、ニューロカン、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＯＳＭＲ、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ｈＰＤＧＦ受容体、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣタンパク質、ミクログロブリン−β、ＣＴＬＡ４、Ｂ７活性化因子、ニューレグリン、凝集因子ＸＩＩＩ、ＮＦ−ｋＢ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、β−ガラクトシダーゼおよびスーパーオキシドディスムターゼ、好ましくはＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼ、または少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを含むそれらのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能性誘導体またはフラグメントから選択される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明は、１つまたはそれより多くのＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質が、イムノグロブリンの捕獲に典型的に用いられる樹脂であるＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂によって効率よく生物学的液体から捕獲されるという知見に基づいている。
【００３１】
したがって、本発明は
ａ）目的のタンパク質を含有する生物学的液体に疎水性電荷クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）樹脂を接触させる工程、
ｂ）アンバウンドのコンタミナントを除去するために樹脂を洗う工程、
ｃ）酸性ｐＨを有する溶液または有機溶媒を含む溶液により樹脂を処理することにより目的のタンパク質を溶出させる工程
を含む、生物学的液体から１と１０の間のイムノグロブリン様（Ｉｇ−様）ドメインを有する目的の非イムノグロブリンタンパク質の精製および／または捕獲に関する。
【００３２】
メルカプト−エチル−ピリジン（ＭＥＰ）ＨｙｐｅｒＣｅｌ（バイオセプラ社製）は、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）樹脂である。この樹脂はイムノグロブリンを捕獲するために特別にデザインされた（ボスチェッティら（２０００年）およびライフテクノロジーズ・インコーポレーテッド製（２０００年））。中性ｐＨにおいては脂肪族−疎水性スペーサーおよび中性（荷電していない）ピリジン環の両方による疎水性捕獲がＨＣＩＣ樹脂においておこる。ＨＩクロマトグラフィーとは対照的に、ＨＣＩＣ樹脂においては、いくらかのｐＨまたはイオン強度の調整も必要とせずに細胞培養上清から抗体を吸着することが成し遂げられる。一度ｐＨがｐＨ７．２からｐＨ４に下げられると、樹脂中のピリジン環および結合している抗体は正電荷を帯びるようになり、電荷反発によりイムノグロブリンは引き離れ、そしてカラムから溶出される。このクロマトグラフィーの手法はイムノグロブリンの捕獲に使われているが、Ｉｇ−様ドメインを有する非イムノグロブリンタンパク質の捕獲に働くではあろうことは予測されなかった、何故ならばイムノグロブリンは独特の配列を有するからであり、そしてさらには５２個の異なる非イムノグロブリンタンパク質中のＩｇ−様ドメインは１０％未満の配列相同性を持っていたからである（ハラビーら（１９９９年））。
【００３３】
本発明の１つの態様によれば、ＨＣＩＣ樹脂であるＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌを用いてＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質を捕獲する可能性は、ＩＬ−１８ＢＰを用いて実証された。ＩＬ−１８ＢＰは高度にグリコシル化されており、結果としてイムノグロブリンと比較してより酸性であり（等電点は約３）、そして疎水性が低い。一方では、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌへのイムノグロブリンの結合は疎水性に基づいており、イムノグロブリンとは対照的に、ＩＬ−１８ＢＰはそれほど疎水性ではない。他方では、もしＩＬ−１８ＢＰがそのような樹脂に結合したとしても、抗体を溶出するために推奨されている条件はＩＬ−１８ＢＰには作用しないことが期待される。なぜなら、ｐＨをｐＨ７．２からｐＨ４に変化させてもＩＬ−１８ＢＰを正に荷電させることはなく、したがって、ＩＬ−１８ＢＰはそのようなｐＨ条件下ではカラムに結合したままであることが期待されるからである。したがって、ＩＬ−１８ＢＰの捕獲にＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂を用いることは、当業者によってタンパク質の物理化学的特徴ならびに樹脂の結合および溶出原理から不適当であると考えられるであろう。
【００３４】
１つの態様によれば、ＩＬ−１８ＢＰを含有する濃縮粗精製物（ＣＭＭ）（実施例１、図１）は、プレ平衡化されたＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラム（緩衝液（ＰＢＳ）ｐＨ７．２）に適用された。カラムをアンバウンドタンパク質を除去するために同じ緩衝液で洗浄した。イムノグロブリン（等電点は６〜６．５の範囲）とＩＬ−１８ＢＰ（等電点は約３）との物理化学的性質の差異を利用して、そしてイムノグロブリン精製の製造説明書に従って、イムノグロブリンのコンタミナントを、ｐＨを４．５にまで低下させることによりカラムから洗浄除去した。このｐＨでは、ＩＬ−１８ＢＰは樹脂に結合したままである。最終的に、カラムからＩＬ−１８ＢＰを回収するために、プロピレングリコールを含有するｐＨ８．４の溶液（リン酸緩衝液中、約３５％のプロピレングリコール）が首尾よく使用された。
【００３５】
ＩＬ−１８ＢＰは効率よくＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂に結合し、そのタンパク質は別個のピークとして溶出されることが得られた結果により示されている。
【００３６】
下記の実施例で示されるように、流速、緩衝液組成、ローディング物のｐＨ、カラムキャパシティー等のようなクロマトグラフィーのパラメーターを変化させることによって、Ｉｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質のＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラム上への捕獲は最適化されうることが示された。たとえば、イムノグロブリンフラクションがＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムから酸性ｐＨにおいて溶出される（ｐＨ４、ボスチェッティら（２０００年）およびライフテクノロジーズ・インコーポレーテッド製（２０００年））という特徴は、ＩＬ−１８ＢＰのローディングカラムキャパシティーを増加させるために利用された。ローディング工程におけるカラムへのイムノグロブリンの吸着をより少なく、ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰの吸着をより多くするように、そして、可能な限りコンタミするイムノグロブリンを除去するように、ローディング物のｐＨをより酸性なｐＨ（たとえばｐＨ６．１）に調整できる。下記の実施例において、低いｐＨで粗精製物をロードすることによりＩＬ−１８ＢＰのキャパシティーは約２倍以上に上昇した。
【００３７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（実施例５）解析、ＲＰ−ＨＰＬＣ（実施例７）および固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）（実施例６）で示されるように、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラム捕獲工程は、ＩＬ−１８ＢＰに関して良いローディングキャパシティー（１ｍｌ樹脂あたり約６ｍｇのＩＬ−１８ＢＰ）、高い回収率（８５％以上）および精製効果を示した。一方で、精製されたｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰのフラクションは幅の狭いピークとして溶出された。ＩＬ−１８ＢＰ捕獲におけるＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂の高い性能は、おそらく以下の理由に起因する：樹脂に対するｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰの選択的結合、酸性ｐＨでの効率よい洗浄工程および選ばれた溶出条件（ＰＧを用いた溶出）。
【００３８】
さらに、ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰの捕獲において様々なＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂を用いることで、バッチ間の一貫性が示された。
【００３９】
無血清培地または血清添加培地において産生された物質を用いたとき、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムは似通った性能を示すことを付加的な実験で示している。
【００４０】
したがって、原料または粗精製収穫物中の血清の有無はタンパク質のＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムに対する結合に影響しない。
【００４１】
本発明の他の態様によれば、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂によるＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質捕獲の可能性は、ＣＨＯ細胞により産生されたｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラによって評価された。ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラ（または「ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６」もしくは「ＩＬ−６キメラ」とも呼ばれる）は、インターロイキン６に融合された、Ｉｇ−様ドメインを有するインターロイキン６受容体の可溶性部位からなる。
【００４２】
カラムに適用した物質は２％のＦＢＳを含む組換えＣＨＯ細胞によって産生された粗精製収穫物であり、浄化（clarification）および２０倍濃縮後に得られた（実施例８）。
【００４３】
さらに具体的には、ＣＨＯ細胞により産生されたｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラの粗精製収穫物はＰＢＳで平衡化されたＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムにロードされた。カラムを洗浄した後、捕獲された物質は３５％ＰＧで溶出された。溶出されたフラクション中のタンパク質量はＥＬＩＳＡおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムは１ｍｌ樹脂あたり２ｍｇ以上のｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒキャパシティーを有し、ｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒ捕獲の収率はおよそ７２％および精製因子は約９４倍である。
【００４４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図５）で示されるように、ｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラは粗精製収穫物において基本的に検出不可能であり（図５）、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ溶出フラクションにおける１つの主要なバンドであることが明らかとなった（９４倍に精製、ＥＬＩＳＡによる）。
【００４５】
ｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラ中のＩｇ−様ドメインのＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムへの結合に対する寄与を調べるために、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムにＩＬ−６単独での結合が評価された。この目的のため、組換えＣＨＯ細胞の粗精製収穫物をＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムに完全キメラと類似の条件で適用した。ＩＬ−６自体は、Ｉｇ−様ドメインを含有するＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラとは対照的にカラムに結合しなかった。
【００４６】
Ｉｇ−様含有非イムノグロブリンタンパク質捕獲のためのＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂の使用は、バクテリア由来の酵素であるｒ−β−ガラクトシダーゼを用いるさらなる態様において行われた。この酵素はＩｇ−様ドメインタイプＣ３を含有する（ハラビーら（１９９９年））。ｒ−β−ガラクトシダーゼは無血清培地（実施例９）に加えておき、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムに適用した。カラムの洗浄後、捕獲された物質は３５％のＰＧで溶出された。アンバウンドおよび溶出された物質のフラクションは回収され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された。得られた結果から、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂が溶液からβ−ガラクトシダーゼを効率よく捕獲することが示された。
【００４７】
上記の実験はＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂がＩｇ−様ドメインを含む種々の非イムノグロブリンタンパク質の精製に使用できることを示す。
【００４８】
本発明は、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌまたはＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌと同じかまたは類似の特徴からなるＨＣＩＣ樹脂により、１つまたはそれより多くのＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質の捕獲に関するのであって、それにより１つまたはそれより多くのＩｇ−様ドメインを含むタンパク質の捕獲を可能とする。本発明はまた、天然においてはＩｇ−様ドメインを有しないが組換え手法によりそのようなドメインが融合された非イムノグロブリンタンパク質の捕獲にも関する。
【００４９】
Ｉｇ−様ドメイン含有タンパク質はＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌのようなＨＣＩＣ樹脂を用いることで生物学的液体または細胞溶解物から捕獲されうる。一般的な意味において、捕獲は、目的のＩｇ−様ドメイン含有タンパク質を含む生物学的液体または細胞抽出物にＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌなどのＨＣＩＣ樹脂を接触させ、アンバウンドのコンタミナントを除去するために樹脂を洗浄し、そしてｐＨ環境を変化させること、または特定の態様で述べたようにイソプロピルアルコールまたはプロピレングリコールなどの有機溶媒および／または、たとえばグリセロール、ポリエチレングリコールなどのポリアルコール（約２５〜５０％の間）を適用することにより結合した物質を溶出させることを含む。
【００５０】
生物学的液体または細胞抽出物をＨＣＩＣに接触させることは粗精製収穫物のｐＨまたは中性のｐＨまたはもうひとつの方法として、接触させる前にカラムおよび粗精製収穫物のｐＨを酸性のｐＨ、たとえばＩＬ−１８ＢＰ精製のように３〜６．８の間のｐＨまたは塩基性のｐＨに調整させることで行われうる。
【００５１】
樹脂を洗浄し、アンバウンドのコンタミナントを除去するために、ロードした物と同じｐＨの溶液（例えばｐＨ７．２のＰＢＳ）および／または中性ｐＨの溶液が使用でき、および／または酸性（たとえばｐＨ３〜６．８）または塩基性ｐＨが使用できる。Ｉｇ−様ドメインを含有する組換えタンパク質はそのようなタンパク質をコードするベクターで形質転換されたバクテリアまたは真核生物（たとえばＣＨＯ）の培養宿主細胞において、またはトランスジェニック動物または植物において産生されうる。トランスジェニック動物を用いたときは特に異種（heterologous）タンパク質をそれらの乳汁に産生させる利点がある。ウシ、羊およびヤギなど日常の動物がしたがって好ましいホストである。たとえば国際公開第８８／００２３９号パンフレット、第９０／０５１８８号パンフレット、第９１／０２３１８号パンフレットおよび第９２／１１７５７号パンフレット；および米国特許明細書番号第４，８７３，１９１号明細書、第４，８７３，３１６号明細書および第５，３０４，４８９号明細書参照。これらの番号を参照することによってこれら全体はここに組み込まれる。
【００５２】
したがって、Ｉｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質は、少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを保持する条件でそれらのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能性誘導体またはフラグメントも含めて、組換え細胞の培地から、細胞溶解物、トランスジェニック動物の乳汁から、トランスジェニック植物、尿、腹水、野菜ジュース、植物抽出物などから本発明の手法を用いて捕獲されうる。
【００５３】
よって、本発明にしたがって、目的の非イムノグロブリンタンパク質の精製方法を使用することにより、ＮＣＡＭ（５つのＩｇ−様ドメイン）、フィブロネクチンタイプＩＩＩ、ＩＣＡＭ−１、ｍａｄＣＡＭ−１、ＰＥ ＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、タイチンおよびカドヘリン、ニューロカン、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲおよびＯＳＭＲなどのサイトカイン受容体の細胞外ドメイン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体（７つのＩｇ−様ドメイン）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体、ヒト血小板由来成長因子（ｈＰＤＧＦ）受容体などの成長因子受容体、Ｔ細胞受容体、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質、ミクログロブリン−β、ＣＴＬＡ４ Ｂ７分子に対するＴ細胞の受容体（２つのＩｇ−様ドメイン）、Ｂ７ Ｔ細胞の増殖を制御するＢ細胞活性因子などの免疫関連受容体、およびニューレグリン、凝集因子ＸＩＩＩ、ＮＦ−ｋＢ、スーパーオキシドディスムターゼおよびＩＬ−１８ＢＰなどのその他のタンパク質の精製されたタンパク質調製品を得ることが可能である。
【００５４】
好ましくは、本発明によれば、１つまたはそれより多くのＩｇ−様ドメインを有する非イムノグロブリンタンパク質の捕獲および／または精製においては、得られたタンパク質の精製因子は１１〜９４倍の範囲、より好ましくは約９４倍であり、得られたタンパク質の濃縮因子は１．５〜３．１倍の範囲、より好ましくは約５倍であり、得られたタンパク質の収率は７３〜８５％の範囲、より好ましくは約９８％である。
【００５５】
典型的には、イムノグロブリン様（Ｉｇ−様）ドメインは、７〜１０のβ−鎖から構成されており、特定のトポロジーおよび接続性を有する２つのシートの間に分布する。イムノグロブリン折り畳みファミリー（ＩｇＦＦ）を網羅する５２個のＩｇ−様ドメインの三次元構造が比較され（ハラビーら（１９９９年））、ほとんどのＩｇ−様ドメインは１０％以下の配列相同性を示すことが結果として示され、しかもＩｇ−様ドメインにおいては、共通のコアを構成するほとんどの残基が疎水性であることが示された。したがって、Ｉｇ−様ドメインは配列というより構造的類似性を有する。疎水性コアは、Ｉｇ折り畳みの独自性および安定性に重要な影響を与える。Ｉｇ−様ドメインの広範な配列多様性にもかかわらず、Ｉｇ折り畳みの維持は水素結合の保存された配置によって促進されているようである。一部のタンパク質は１つより多くのＩｇ−様ドメインを有しており、たとえば成熟タイプＩＩのＩＬ−１受容体は３つのイムノグロブリン様ドメインを（マクマハンら（１９９１年））および接着分子ＶＣＡＭは７つのＩｇ−様ドメインを有する（オスボーンら（１９９４年））。
【００５６】
次にＩｇ−様ドメインを有する重要なタンパク質の例を挙げる：ＮＣＡＭ（５つのＩｇ−様ドメイン）、フィブロネクチンタイプＩＩＩ、ＩＣＡＭ−１、ｍａｄＣＡＭ−１、ＰＥ ＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、タイチンおよびカドヘリンなどの接着分子、ニューロカン、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲおよびＯＳＭＲなどのサイトカイン受容体の細胞外ドメイン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体（７つのＩｇ−様ドメイン）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体、ヒト血小板由来成長因子（ｈＰＤＧＦ）受容体などの成長因子受容体、Ｔ細胞受容体などの免疫関連受容体、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質、マクロファージコロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）、ミクログロブリン−β、ＣＴＬＡ４ Ｂ７分子に対するＴ細胞の受容体（２つのＩｇ−様ドメイン）、Ｂ７ Ｔ細胞の増殖を制御するＢ細胞活性因子、およびニューレグリン、凝集因子ＸＩＩＩ、ＮＦ−ｋＢ、スーパーオキシドディスムターゼおよびＩＬ−１８結合タンパク質などのその他のタンパク質。
【００５７】
本明細書において使用される用語「ムテイン」はＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質の類似体を意味し、該類似体においては、たとえばＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼなどのタンパク質の１つまたはそれより多くのアミノ酸残基が、ＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼと比較して結果として生じる産物の活性の著しい変化がなく、および／または少なくとも１つのＩｇ−様ドメインが保持される条件で、異なるアミノ酸残基によって置換され、または欠失され、または１つもしくはそれより多くのアミノ酸残基がそれらに付加される。さらに詳しくは、３０より少ないが１つまたはそれよりも多くのタンパク質中のアミノ酸、好ましくは２０より少なく、さらに好ましくは１０より少なく、最も好ましくは１つまたは２つのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換され、または欠失（eliminated）され、または付加されうる。これらのムテインは公知の合成方法によっておよび／または部位特異的突然変異誘発技術によって、またはそれらにとって適したどんなほかの技術によってでも調製される。
【００５８】
本発明のムテインは、ＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼなど少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡと、本発明にしたがって、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸によってコードされるタンパク質を含む。用語「ストリンジェントな条件」とは、当業者が従来から「ストリンジェント」と呼ぶ、ハイブリダイゼーションおよびその後の洗浄条件を意味する。上記アウスベル（Ausubel）らによるカレント プロトコル イン モレキュラー バイオロジー、インターサイエンス、ニューヨーク、章６．３および６．４（１９８７年、１９９２年）および前記サンブロック（Sambrook）らを参照。限定なしで、ストリンジェントな条件の例は、試験下のハイブリッドの推定Ｔｍ値の１２〜２０℃低い洗浄条件を含む、たとえば、２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳを５分間、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを１５分間；３７℃で０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳを３０〜６０分間、そして６８℃で０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳを３０〜６０分間。当業者はストリンジェントな条件はＤＮＡ配列、オリゴヌクレオチドプローブ（１０〜４０塩基など）または混合オリゴヌクレオチドプローブの長さにも依存することを理解する。混合プローブを用いる場合は、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）をＳＳＣのかわりに使うことが好ましい。前記アウスベルを参照。
【００５９】
そのような任意のムテインは、好ましくは、ＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ−６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼなど、少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質のアミノ酸配列と、ＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼなどと充分に類似した活性を有するほど、および／または少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを保持している条件で、充分に重複する。
【００６０】
好ましい１つの態様としては、そのような任意のムテインは、例えばＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ−６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列と少なくとも４０％の相同性を有している。より好ましくは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または最も好ましくはそれらと少なくとも９０％の相同性を有している。
【００６１】
本発明において精製されるムテインまたはそれらをコードする核酸は、本明細書中で示される教示および指図に基づいて、過度の実験をすることなく、当業者によって日常的に得られる置換されたペプチドまたはポリヌクレオチドとして実質的に対応する配列の有限のセットを含む。
【００６２】
本発明によるムテインの好ましい変化は「保存的（conservative）」置換として知られるものである。ＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼなど、少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質の保存的アミノ酸置換は、グループのメンバー間の置換は、分子の生物学上の機能を保存するという充分に類似した物理化学的性質を有し（グランザム（Grantham）ら（１９７４年））、および／または少なくとも１つのＩｇ−様ドメインが保持される条件で有しうる。特に、挿入または欠失が、わずかなアミノ酸のみ、たとえば３０個以下、そして好ましくは１０個以下のアミノ酸を包含し、そして機能的配座、たとえばシステイン残基などに重要であるアミノ酸を除去または置換しない場合、アミノ酸の挿入および欠失も、それの機能を改変せずに、上で定義された配列で行われうることも明らかである。このような欠失および／または挿入により産生されるタンパク質およびムテインは、本発明の範囲内になる。
【００６３】
好ましくは、同義のアミノ酸基は、表Ａで定義されるものである。さらに好ましくは、同義のアミノ酸基は、表Ｂで定義されるものである；そして最も好ましくは、同義のアミノ酸基は、表Ｃで定義されるものである。
【００６４】
【表１】
【００６５】
【表２】
【００６６】
【表３】
【００６７】
本発明で使用するためのムテインを得るために使用されうる例えばＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼなど、Ｉｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質におけるアミノ酸置換の生成の例は、マーク（Mark）らによる米国特許第４，９５９，３１４号明細書、第４，５８８，５８５号明細書および第４，７３７，４６２号明細書；コス（Koths）らによる第５，１１６，９４３号明細書、ナメン（Namen）らによる第４，９６５，１９５号明細書；チョン（Chong）らによる第４，８７９，１１１号明細書およびリー（Lee）らによる第５，０１７，６９１号明細書に示されるものおよび米国特許第４，９０４，５８４号明細書（ショウ（Shaw）ら）に示されるリシン置換タンパク質のような、あらゆる既知方法工程が挙げられる。
【００６８】
用語「融合タンパク質」は、他の非イムノグロブリンタンパク質と融合された、例えば体液中での長期の滞留時間を有するもう１つの非イムノグロブリンタンパク質と融合された、例えばＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼまたはそれらのムテインまたはフラグメントなどのＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質を意味する。したがって、例えばＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼは他の非イムノグロブリンタンパク質、ポリペプチドなどと融合されうる。
【００６９】
本明細書において使用されるところの「機能性誘導体（functional derivative）」は、本技術分野において既知の方法によってアミノ酸部分の側鎖に、またはＮ−またはＣ−末端に存在する官能基から作製されうるＩｇ−様ドメイン含有タンパク質、例えばＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼおよびそれらのムテインおよび融合タンパク質の誘導体を意味し、薬学的に許容しうる場合、すなわち、それらが、例えばＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼの活性と充分に類似するおよび／または少なくとも１つのＩｇ−様ドメインが保持される条件でタンパク質活性を破壊しないか、またはそれらを含有する医薬組成物に毒性を与えない場合に、本発明に含まれる。
【００７０】
このような誘導体としては、たとえば抗原部位をマスクしそして体液中での滞留を引き伸ばすポリエチレングリコール側鎖が含まれる。他の誘導体としては、カルボキシル基の脂肪族エステルまたはアンモニアまたは一級もしくは二級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、およびアシル部分（moiety）（例えばアルカノイルまたはアロイル基など）と形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体またはアシル部分と形成される遊離水酸基（例えばセリンまたはスレオニン残基）のＯ−アシル誘導体が挙げられる。
【００７１】
Ｉｇ−様ドメインを含むタンパク質および／またはムテインおよび融合タンパク質の「フラグメント」として、該フラクションがＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼなどのタンパク質と実質的に同様の活性を有する条件および／または該フラクションが少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを保持する条件において、本発明は、単独のタンパク質分子のポリペプチド鎖の任意のフラグメントまたは前駆体、または結合した関連分子または残基（たとえば糖またはリン酸塩残基、もしくはタンパク質分子または糖残基自身の集合体）を伴うタンパク質のポリペプチド鎖の任意のフラグメントまたは前駆体を網羅する。
【００７２】
本発明は、ＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼなどＩｇ−様ドメインを含むタンパク質、または少なくとも１つのＩｇ−様ドメインが保持される条件でそれらのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能性誘導体、活性フラクションまたは環状にて入れ替えられた誘導体（circularly permutated derivative）に関する。
【００７３】
次にＩｇ−様ドメインを有する重要なタンパク質の例を挙げる：ＮＣＡＭ（５つのＩｇ−様ドメイン）、フィブロネクチンタイプＩＩＩ、ＩＣＡＭ−１、ｍａｄＣＡＭ−１、ＰＥ ＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、タイチンおよびカドヘリンなどの接着分子、ニューロカン、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲおよびＯＳＭＲなどのサイトカイン受容体の細胞外ドメイン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体（７つのＩｇ−様ドメイン）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体、ヒト血小板由来成長因子（ｈＰＤＧＦ）受容体などの成長因子受容体、Ｔ細胞受容体、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質、ミクログロブリン−β、ＣＴＬＡ４ Ｂ７分子に対するＴ細胞の受容体（２つのＩｇ−様ドメイン）、Ｂ７ Ｔ細胞の増殖を制御するＢ細胞活性因子などの免疫関連受容体、およびニューレグリン、凝集因子ＸＩＩＩ、ＮＦ−ｋＢ、スーパーオキシドディスムターゼおよびＩＬ−１８ＢＰ（１つのＩｇ−様ドメイン）などのその他のタンパク質。
【００７４】
用語「ＩＬ−１８結合タンパク質」は「ＩＬ−１８ＢＰ」と本明細書において同義に用いられる。ＩＬ−１８結合タンパク質は国際公開第９９／０９０６３号パンフレットまたはノビックら（１９９９年）によって定義されたものを含み、キムら（２０００年）によって定義されたＩＬ１８−結合タンパク質のスプライス（splice）変異体および／またはアイソフォームを含む。さらに詳しくは、ＩＬ−１８ＢＰのヒトアイソフォームａおよびｃは本発明によれば有用である。本発明による有用なタンパク質はグリコシル化されまたはグリコシル化されず、それらは尿など天然の採取原（natural source）由来であってよく、またはそれらは組換えによって産生されることが好ましいであろう。組換え体の発現は大腸菌などの原核生物発現系または真核生物発現系、および好ましくは哺乳類の発現系によって実施されうる。
【００７５】
「生物学的液体」は細胞、細胞成分または細胞産物由来のまたは含有する任意の液体を意味する。生物学的液体は限定されないが、細胞培養上清、細胞溶解物、透明になった（cleared）細胞溶解物、細胞抽出物、組織抽出物、血液、血漿、血清、乳汁、尿、腹水、野菜ジュース、植物抽出物およびそれらのフラクションおよび他のクロマトグラフィー分離工程由来のフラクションもまた含まれる。生物学的液体は少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンの捕獲工程において粗精製物として使用され、本発明によれば濃縮されても、濃縮されなくても、または希釈されてもよい。
【００７６】
少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質の捕獲工程において細胞培養上清または細胞調整培養培地は、本発明によれば胎児ウシ血清またはウマ血清など血清存在下増殖した細胞または無血清培地で増殖した細胞由来であってもよい。
【００７７】
「細胞調整培養培地」は、細胞がそこで培養され、および細胞の産物を含有する栄養培地を意味する。
【００７８】
細胞、細胞残骸などを含有する生物学的液体を用いて研究を行うときは、最初にこれら特定のコンタミナントを除去するために液体をろ過および／または遠心分離することが好ましい。
【００７９】
少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質の捕獲工程におけるＨＣＩＣ樹脂の使用はスケールアップすることができ、純粋なタンパク質を得るために、イオン交換クロマトグラフィー、液体アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、限外ろ過および異相沈殿（differential precipitation）など他の精製および濃縮技術と有利に組み合せることができる。
【００８０】
例えばヒト成長ホルモン、ヒトプロテインＣ、凝固因子ＶＩＩおよびＩＬ−１８ＢＰなどを含む多数のヒトおよび他の哺乳類タンパク質は、宿主細胞にこれらタンパク質をコードするＤＮＡを形質導入し、組換え細胞を増殖させ、そしてタンパク質を回収することで産生される。
【００８１】
国際公開第９９／０９０６３号パンフレットは出願において哺乳類細胞におけるＩＬ−１８ＢＰの産生を開示している。組換えタンパク質はトランスジェニック動物によって産生され乳汁に分泌される。
【００８２】
組換えタンパク質は、細胞から細胞培養培地（細胞調整培養培地）に、乳汁に分泌されるか、または細胞溶解物中に存在し、細胞廃棄産物、細胞残骸およびタンパク質など他の細胞成分、または他の回収された物質から分離されなければならない。
【００８３】
ＭＥＰ−ＨｙｐｅｒＣｅｌによって捕獲されたＩｇ−様含有非イムノグロブリンタンパク質は、さらにクロマトグラフィー分離によって精製されうる。次のクロマトグラフィー分離は広く使用されている：ゲルろ過（ＧＦ）、イオン交換（ＩＥＸ）、および疎水性相互作用（ＨＩ）クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよびＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）。
【００８４】
上述のように、タンパク質精製は通常３段階からなる：所望のタンパク質が粗精製の細胞溶解物からまたは細胞培養培地から単離される捕獲工程；タンパク質がサイズまたは他の物理的／化学的性質が類似するコンタミナントから単離される中間の工程；そして最後の磨き工程。それぞれの精製ステージは特定のタンパク質に最も適している決まったクロマトグラフィー技術およびビーズサイズを有する。
【００８５】
中間の工程は、成分の適切な分離のためにより高度な分解能を必要とする。一般的にビーズサイズは分解能と逆に相関する；小さなビーズサイズはしたがってこのステージにおいてより適当である。ＩＥＸおよびＨＩのような吸着技術は一般的に最初の２つの精製工程において使用される。ゲルろ過は通常磨き工程のために用意されており、そこにおいては少量の高度に濃縮されたサンプルがカラムに適用される。
【００８６】
溶出成分のピーク幅によって示されるように、樹脂を選択するための二つの考慮すべきファクターは、所望のタンパク質に対する選択性および効率性（efficiency）である。選択性は目的のタンパク質に相互作用し、そして結合する樹脂の能力を意味する。
【００８７】
樹脂の効率性は、成分をブロードなピークとしてではなく別個のピークとして溶出するためのクロマトグラフィーマトリックスの能力を意味する。高い効率性は、近接して溶出するタンパク質を精製する場合に不可欠であり、高い選択性と高い効率性との組み合わせが高い分解能を生む。
【００８８】
ゲルろ過（ＧＦ）（またはサイズ排除クロマトグラフィーと呼ぶ）は分子量にしたがって球状タンパク質を分離する（ポラス（Porath）ら（１９５９年））。ＧＦは物理的および化学的条件の多様さに基づき実施され、通常綿密なプロトコルは含まれない（スミス（Smith）ら（１９９８年）アマシャム バイオサイエンス Ａ（１９９８年））。タンパク質の水溶液は、溶出液の助けと共に標的タンパク質のサイズを基に選択されたポアサイズを含有する固相またはビーズから構成されるマトリックスを通過する。カラムによって「予測された（seen）」液体容量は、移動相（ビーズを取り囲む液体または「ボイド容量（void volume）」）および固定相（ビーズのポア内に含まれる液体）からなる。
【００８９】
大きすぎてビーズポアに入らない分子はボイド容量のみと接触し、したがってカラムから最初に溶出される。しかしながら最も小さい分子はポア中に拡散され総カラム容量と接触し、そして最後に溶出され、中間のサイズの分子はボイド容量および総カラム容量の間において溶出される。
【００９０】
ＧＦ媒体を選択するときに考慮すべき１つの要素はポアの排除限界または分子量限界である；この限界を超えたタンパク質は完全にポアから排除され、そして分離されない。いくつかの会社は架橋樹脂を提供しており、それは高圧条件において圧縮されず多孔性を失わないので高圧精製に有利である。ＧＦは他のタイプの液体クロマトグラフィーよりも幾つかの利点を有する。１つ目はこの技術を用いて精製されうるタンパク質のサイズ上限が高いこと；２つ目はタンパク質を変性させる有機溶媒の使用を必要としないことである。
【００９１】
ＧＦクロマトグラフィーはしかしながら微調整が困難であろう。さらに、タンパク質の分解能はカラムに適用するサンプル容量に依存する。例えば、希釈されたサンプルはこの技術によって精製することが困難である。最後に、ＧＦクロマトグラフィーは、分析からバルク精製レベルに直接的に拡大できない−大スケール精製にとって２つの不利点。
【００９２】
イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）は、高度な制御と特異性を提供する。ＩＥＸは、目的のタンパク質と、通常、共有結合で荷電基（charged group）を結合したアガロース、デキストラン、架橋セルロースおよび架橋アガロースなどの樹脂から構成されるイオン交換マトリックスとの間の荷電相互作用に基づく（アマシャム バイオサイエンス Ｂ（１９９８年））。
【００９３】
荷電基は種類（カチオン性およびアニオン性）および強度（強または弱）にしたがって分類され、強イオン交換媒体の電荷特性はｐＨによって変化しないが、弱イオン交換媒体ではサンプルのローディングキャパシティーが多様なｐＨにおいて失う電荷のために変化でき、タンパク質の結合を阻害する（アマシャム バイオサイエンス Ｂ（１９９８年））。最も広く使用されている荷電基は、弱アニオン性交換体のジエチルアミノエチル、弱カチオン性交換体のカルボキシメチル、強アニオン性交換体の四級アンモニウム、強カチオン性交換体の硫酸メチルが含まれる。他の荷電基も使用可能である。
【００９４】
イオン交換樹脂は選択的に逆電荷のタンパク質を結合する；つまり、負に荷電した樹脂は正のネット電荷（net positive charge）を有するタンパク質を結合し、その逆も同様である。この技術は５つのステップからなる：標的タンパク質結合にとって理想的なｐＨおよびイオン強度へのカラムの平衡化；カウンターイオン置換によるサンプルのカラムへの可逆的吸着；結合したタンパク質を置換するために緩衝液のｐＨまたはイオン強度を変更する溶出条件の導入；結合強度の順序（弱く結合したタンパク質が最初に溶出される）によるカラムからの物質の溶出；そして次の精製のためのカラムの再平衡化。研究者は、ＩＥＸプロトコルを標的タンパク質が選択的にカラムに結合するように（コンタミナントは通過するように）またはコンタミナントが吸着し標的タンパク質が選択的に溶出するようにデザインすることができる（アマシャム バイオサイエンス Ｂ（１９９８年））。
【００９５】
ＧＦクロマトグラフィーのように、ＩＥＸは水溶性条件において実施され、有機溶媒は必要としない。しかしながら、ＧＦとは異なりＩＥＸは高度な選択性を有する。定常相（樹脂）および移動相（緩衝液）の両方は精製の必要性にあわせて仕立て得る。緩衝液のｐＨおよび化学的組成は目的のタンパク質の性質に応じて調整され得る。ＩＥＸの主な利点の１つは、拡張性である：ＩＥＸは小スケールからプロセススケールレベルまで直接アップグレードさせることが可能である。さらには、ＩＥＸ樹脂は相対的に高価ではなくそしてバルク量で広く入手可能である。
【００９６】
疎水性相互作用（ＨＩ）クロマトグラフィーは、タンパク質表面の露出した疎水性部分と樹脂に結合した疎水性リガンドとの間の相互作用に基づくものである。疎水性吸着の機構はよく理解されていないが、このプロセスを説明するためのいくつかの理論があり、それら理論の全てがそれらの核心においてタンパク質−リガンド複合体を取り囲んでいる水分子の構造の増加（アマシャム バイオサイエンス（１９９３年））を有する。
【００９７】
ＨＩのプロセスは、タンパク質をほぐし疎水性部位を露出させる高塩濃度緩衝液の使用を伴う。タンパク質はカラムの疎水性リガンドに保持され、塩濃度が低下しつつある緩衝液勾配にさらされる。塩濃度が低くなるとタンパク質はその自然な（native）構造に戻り結局カラムから溶出される。
【００９８】
ＨＩ樹脂の選択性は疎水性リガンドの構造に依存する。直鎖アルキルリガンドおよびアリールリガンドが使用され、一般的にタンパク質の結合は鎖長の増加に伴って増加する（アマシャム バイオサイエンス（１９９３年））。理想的な樹脂の選択は標的タンパク質の化学に依存する。適切な疎水性リガンドを発見することは経験的なプロセスである。
【００９９】
少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質は、他のクロマトグラフィー分離工程由来のフラクションを原料として用い、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂を用いて本発明により精製され得る。
【０１００】
ポリペプチドまたはタンパク質に関して本明細書において使用される用語「精製された」は、絶対的な純度（absolute purity）（均質調製品（homogeneous preparation）など）のみを意味するのではなく；かわりに、ポリペプチドが天然の環境よりも相対的に純粋であることを意味する。好ましくは、ポリペプチドまたはタンパク質は、約２倍、約３倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍または約１００倍精製される。最も好ましくは、少なくとも一桁の精製、好ましくは２または３桁、そして、より好ましくは４または５桁が明確に期待される。
【０１０１】
当業者は日常の実験で、溶液、緩衝液組成、イオン強度、およびｐＨを、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌなどのＨＣＩＣ樹脂を用いて少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質の精製を向上させるために必要に応じて調整できることを認識するであろう。たとえば、タンパク質精製手法を発展させる場合を考慮するための重要な因子は、各個々の工程の拡張性であり、初めに多くのプロトコルが小スケール分析レベルで作成され、ついでバルク精製のためのプロセススケールに拡張される。ＨＣＩＣなどの多くの種類の樹脂がプロセススケール分離に使用できる。
【０１０２】
上述の手法および以下の実験的実施例はカラムクロマトグラフィーを利用しているが、当業者は、バッチプロセシングも使用できることを認識するであろう。
【０１０３】
ここまで本発明を説明したが、以下の実施例を参照することでより容易に理解されるであろう。この実施例は、説明の目的で提供され、本発明の限定を意図するものではない。
【実施例】
【０１０４】
実施例１
ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰの捕獲工程。
ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰは、２％血清含有培養培地において組換えＣＨＯクローンにより産生された。ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰは高度にグリコシル化されており、そして強酸性タンパク質である（等電点は約３）。
【０１０５】
ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ（バイオセプラ社製）は、疎水性／荷電誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）をベースとした樹脂である。この樹脂は抗体の精製のために特別にデザインされている（ボスチェッティら（２０００年）およびライフテクノロジーズ・インコーポレーテッド（２０００年））。中性のｐＨにおいて、抗体の疎水性捕獲（hydrophobic capture）は脂肪族−疎水性スペーサーと中性（荷電していない）ピリジン環との両方により生じる。その後ｐＨが低下したとき（すなわちｐＨ４まで）、リガンド中のピリジン環（ｐＫａは４．８）および結合したイムノグロブリン（等電点は６〜６．５の範囲）の両方は正電荷を帯びるようになり、その結果電荷反発力が生じ、そしてカラムから抗体の溶出が生じる。ＩＬ−１８ＢＰ中のイムノグロブリン様（Ｉｇ−様）ドメインの存在により、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂によるＩＬ−１８ＢＰ捕獲の可能性が調査された。
【０１０６】
ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラム（樹脂５ｍｌ）を、ｐＨ７．２のＰＢＳでプレ平衡化（流速は３ｍｌ／ｍｉｎ）した。ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰを含む濃縮された粗精製物（ＣＣＭ）（０．５ｍｇ／ｍｌのｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰおよび３２ｍｇ／ｍｌの総タンパク質）をプレ平衡化したＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムにロードした（流速は１ｍｌ／ｍｉｎ）。ローディング後、カラムを最初にｐＨ７．２のＰＢＳでカラムから出てくるフラクション中にタンパク質が検出（検出はＡ２８０）されなくなるまで洗浄し、そして次にイムノグロブリンの溶出のために製造者が推奨している低いｐＨの緩衝液（ｐＨ４．５の５０ｍＭ酢酸塩緩衝液、流速３ｍｌ／ｍｉｎ）で洗浄した。最初の洗浄（ｐＨ７．２）後にカラムから回収された物質中にＩＬ−１８ＢＰは検出されなかったことから、全てのＩＬ−１８ＢＰはカラムに全て結合したことを示唆している。タンパク質のピークは低いｐＨでの洗浄後に検出された（図１、ピーク１）。低いｐＨでの洗浄により溶出されたタンパク質のピークは、おそらく主としてイムノグロブリンが含まれておりｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰはまったく含まれていなかった（ＥＬＩＳＡにより監視）。ＩＬ−１８ＢＰがｐＨ４．５で溶出されないのは、イムノグロブリンとは対照的にＩＬ−１８ＢＰは強酸性（等電点は約３）であり、ｐＨ４．５はＩＬ−１８ＢＰが正電荷を帯びるよう誘導するのに充分な酸性ではない（タンパク質は荷電していないかまたは負電荷を帯びているかのいずれかである）。従って、カラムからＩＬ−１８ＢＰを溶出するために、タンパク質間の疎水性相互作用を弱めることができ、タンパク質の構造を安定化するために一般に使用されているプロピレングリコールをテストした。最初にカラムをインジェクション用の水（ＷＦＩ）で洗浄し、次にプロピレングリコール（ＰＧ）（メルク社製、プリス（puris.）カタログ番号１０７４７８）を３５％含有するｐＨ８．４の２０ｍＭリン酸塩緩衝液で洗浄した（流速は１ｍｌ／ｍｉｎ）。リン酸塩緩衝液を１リットル調製するためには、５．３６グラムのリン酸水素２ナトリウム７水和物（分子量２６８．０７、メルク社製、エクストラピュア、カタログ番号１０６５７４）、を０．８リットルのＷＦＩに溶解した。得られた溶液は６Ｍ ＨＣＬでｐＨ８．４±０．２まで滴定した。ＰＧ溶液をカラムに適用した後に、タンパク質のピーク、図１のピーク２（検出はＡ２８０）がカラムから溶出され、ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰが含まれることが明らかとなった（検出はＥＬＩＳＡ）。５０％のＰＧ溶液での付加的な溶出工程の適用によっては、カラムからのタンパク質のさらなる溶出は得られなかった。
【０１０７】
ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰを溶出するのに必要とされるプロピレングリコールの至適濃度は、次のスキーム中のひとつを用いて評価された：Ａ−５０％のＰＧを用いる１段階溶出、Ｂ−最初に３５％のＰＧを用い、ついで５０％のＰＧを用いる２段階溶出、Ｃ−最初に２５％のＰＧを用い、ついで５０％のＰＧを用いる２段階溶出。表３に要約される結果は、回収率（recovery）および精製因子が溶出工程において３５％のＰＧ溶液を用いることが最良であったことを示す（表３）。
【０１０８】
したがって、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂を用いたＣＣＭからのＩＬ−１８ＢＰの捕獲は、純度を向上させ（３４％）そしてよい回収率（８５％）の結果を示した。精製因子は２２であり、そして精製したｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰフラクションは比較的に幅の狭いピークとして溶出されたので（約１５ｍｌ）、容量測定濃度因子（volumetric concentration factor）は１．７倍に増加した（表３、図１）。ＩＬ−１８ＢＰ捕獲の種々の工程からのフラクション、たとえばロードした物、アンバウンドフラクション、酸性の洗浄フラクション（ｐＨ４．５の５０ｍＭ酢酸塩）、ＷＦＩ洗浄フラクションおよび３５％のＰＧで溶出されたピークはＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された（実施例５）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図２）により得られた結果は、ＥＬＩＳＡ／ブラフォード（ELISA over Braford）結果（表３）により得られた結果と一致しており、これは３５％のＰＧで溶出したタンパク質のピークフラクションではｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰが高度に濃縮されていることを示唆している。
【０１０９】
観測された高度な濃縮および精製因子（図２、ライン５ 溶出されたタンパク質、およびライン６ ＩＬ−１８ＢＰリファレンスタンパク質）は、おそらくＩｇ−様ドメインを通した、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂へのｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰの選択的な結合、酸性ｐＨでの効率のよい洗浄工程および選択的な溶出条件によるものである。
【０１１０】
捕獲のために使用した原料がＳＦＭ条件下で増殖させＩＬ−１８ＢＰを産生させたＣＨＯ細胞の収穫物である場合に、ＩＬ−１８ＢＰの高度な濃縮および精製の同様の結果が得られた（データは示さず）。
【０１１１】
【表４】
【０１１２】
実施例２
ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰ捕獲における種々のＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂バッチの試験。
ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂の性能のバッチ間（batch-to-batch）の一貫性を調べるために、３つの異なるＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂バッチをｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰ捕獲において試験した（バッチは＃Ａ１１２、＃Ａ１１３、＃Ａ１３０）。評価されたパラメーターは、ａ）樹脂キャパシティー、ｂ）純度、およびｃ）精製因子である。カラム（５ｍｌ ＨＲ１０カラム、ベッド高さは７ｃｍ）に１ｍｌ樹脂あたり２．５〜３．５ｍｇのｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰであるＩＬ−１８ＢＰ濃度でＣＭＭをロードした（実施例１のランニング条件を使用）。
【０１１３】
表４に示す結果は、３つのＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂バッチは全て同様のｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰの純度レベル、精製因子および濃度因子を生じたということを示す。カラムキャパシティーもまた３つの樹脂バッチ全てで同様であった（樹脂１ｍｌあたり約２ｍｇのｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰ、表４）。
【０１１４】
【表５】
【０１１５】
実施例３
ＩＬ−１８ＢＰの捕獲におけるＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムへの粗精製物のローディングに最適なｐＨの評価。
先に得られた実験上のキャパシティー（実施例２）は、樹脂１ｍｌあたりｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰは２．１〜２．４ｍｇの範囲であった（表４）。ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムを用いるとイムノグロブリンのフラクションはｐＨ６．１で溶出しはじめ、ｐＨ４でカラムから完全に溶質される（文献１および２）のに対して、我々の予備実験によると、ＩＬ−１８ＢＰはそのようなｐＨ範囲においてはカラムに結合したままである。我々は、この特徴はＩＬ−１８ＢＰに対するカラムのキャパシティーを増加させるためにＭＥＰ−ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムにＣＭＭをロードする間に利用できる、すなわちイムノグロブリンの樹脂に対する吸着をより少なくし、結果として樹脂に対するｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰのより多くの吸着を可能とする、と推論した。したがって、ｐＨ７．２のかわりにｐＨ６．１でＣＭＭをロードすることの効果を調査した。ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰを含有するＣＭＭのｐＨをＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムへの適用の前にｐＨ６．１に調整した。また、ローディングの前に、カラムをｐＨ６．１の緩衝液ＰＢＳで平衡化し、ローディングの後に同じ緩衝液で最初の洗浄を行った。
【０１１６】
これまでの実験において、ロードされたｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰの濃度は樹脂１ｍｌあたり約２ｍｇであったが、樹脂１ｍｌあたり約６ｍｇまでカラム中でのｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰの濃度を高めるためにカラムにロードするＣＣＭの容量を議論した。
【０１１７】
表６に要約されている結果はＩＬ−１８ＢＰに対する樹脂のキャパシティーは、ＣＣＭをｐＨ６．１でローディングした場合ｐＨ７．２でローディングした場合のキャパシティーと比較して少なくとも２倍上昇した（表６）。ＩＬ−１８ＢＰは幅の狭いピークとして溶出されるので（図３を参照、各３ｍｌの５つのフラクション）、濃度因子は２倍に増加した。
【０１１８】
これらの結果は ｐＨ６．１でのＣＣＭのロードによりキャパシティーが増加し、そして溶出されるＩＬ−ＢＰ１８の濃度も増加することを示す。
【０１１９】
【表６】
【０１２０】
実施例４
ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムを用いたｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰ捕獲におけるローディング速度の影響。
カラムへの粗精製物のローディング速度は、カラムの捕獲性能に影響し得るのであり、たとえば、高速でのローディングは操作においてはより便利であり、一方、低速でのローディングは収率を上昇させ得る。したがって、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムでのｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰ捕獲におけるローディング流速の影響を評価した。樹脂１ｍｌあたり６ｍｇのｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰを得るためにＣＭＭをカラムにロードした（先の実施例を参照）。ＣＭＭは１つ目の実験においては流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、２つ目の実験では３ｍｌ／ｍｉｎでロードされ、標準的な流速である１ｍｌ／ｍｉｎと比較された（表７）。流速３ｍｌ／ｍｉｎにおいては、流速１ｍｌ／ｍｉｎで回収したときと比較して、溶出フラクション中に回収したｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰは相当減少していた。流速０．５ｍｌ／ｍｉｎでのローディングは、流速１ｍｌ／ｍｉｎでのローディングと比較して、溶出フラクション中のｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰの量を顕著な増加はみられなかった。
【０１２１】
【表７】
【０１２２】
実施例５
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
精製した５μｇのｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰまたは２０μｌのクロマトグラフィーのフラクションをサンプル緩衝液４：１に希釈した。サンプルを９５℃で５分間インキュベートし、還元条件下または非還元条件下、１２％トリス−グリシン ＳＤＳ−ＰＡＧＥ調製済みゲルで分離した。ゲルは２０ｍＡの定電流で〜１．５時間流され、クマシーブルーまたはゲルコード（GELCODE）染色された。
【０１２３】
サンプル緩衝液×４；５０ｍｌのｐＨ６．８の０．１５Ｍトリス（３．２．１５、ＷＦＩで１：１３．３で希釈し、ｐＨ６．８に調整（3.2.15 diluted 1:13.3 with WFI adjusted to pH 6.8））中に、４グラムのＳＤＳ（３．１．１６）、２０グラムのスクロース（３．１．３２）、０．８ ＭのＤＴＴ（３．１．３１）および２０ｍｇのブロモフェノールブルー（３．１．３３）。
【０１２４】
ランニング緩衝液×１０；ｐＨ８．３の５００ｍｌの水（７．１０）中に、１５グラムのトリス塩酸（４．２．６６）、７２グラムのグリシン（４．２．２９）、５グラムのＳＤＳ（３．１．１６）。
【０１２５】
実施例６
ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰを検出するためのＥＬＩＳＡ
４℃で一晩、コーティング緩衝液中ＩＬ−１８ＢＰに対し作製した５μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体（モノクローナルは国際公開第０２／０９２００８号パンフレットで記述したとおりに作製され、プロテインＧカラムでアフィニティー精製された）でマイクロプレートをコートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、ブロッキング緩衝液でブロックした（下記を参照）。洗浄後、１００μｌのｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰサンプルの等分（aliquots）をウエルに加え、振とうしながら３７℃で１時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、そしてアッセイ緩衝液で１：５０００に希釈されたウサギ抗血清１００μｌを各ウエルに加えた。振とうしながら３７℃で１時間インキュベートした後、洗浄工程を繰り返し、そして結合した抗体をアッセイ緩衝液で１：１００００に希釈されたヤギ抗ウサギに結合された（cojugated）ＨＲＰで検出した。１００μ／ウェルのＨＲＰ−コンジュゲート（HRP-conjugate）をプレートに加え、振とうしながら３７℃で１時間インキュベートした。ついでプレートを洗浄し、発色反応（colour reaction）を１２５μｌ／ウェルのＯＰＤ基質溶液を加えることで展開した。１２５μｌ／ウェルの４Ｎ ＨＣｌを加えることで反応を停止させた。吸光度はＥＬＩＳＡリーダー中、４９２ｎｍで測定された。免疫精製された（immunopurified）ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰ−Ｈｉｓのバッチ由来のサンプルを、このアッセイの展開中、リファレンスサンプルとして使用した。免疫精製したリファレンススタンダードのタンパク質含有量を吸収係数（extinction coefficient）１．２６ＯＤ／ｍｇを用いて分光法によりＡ２８０の波長で測定した。検量線は標準ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰをそれぞれのアッセイのためのアッセイ緩衝液において２０ｎｇ／ｍｌから０．３ｎｇ／ｍｌまでの範囲でアッセイ緩衝液を用いて系列希釈することで作製した。
【０１２６】
ブロッキング緩衝液−ＢＳＡ希釈物／ブロッキング溶液濃縮物（３．１．５０）を１：１０に希釈。
【０１２７】
アッセイ緩衝液−ＢＳＡ希釈剤／ブロッキング溶液濃縮物（３．１．５０）を１：１５に希釈。
【０１２８】
実施例７
逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分析
ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰフラクションの同定および精製は、ＲＰ−ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣカラム スーペルコシル（Supelcosil）ＬＣ３０８、カタログ番号５８１０、４．６ｍｍ、ＩＤＸ５ｃｍ、ロット＃Ｃ１７５、スーペルコ（Supelco）社製、米国）カラムを用いて次のように行った：２０μｇのｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰをカラムにインジェクトし、０．１％のＴＦＡ（トリフルオロ酢酸、ベーカー（Baker）社製、カタログ番号９４７０−０１）中、１０〜１００％プロパノールのグラディエントを用い分離した。
【０１２９】
実施例８
ＭＲＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムによるｒ−ＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラの捕獲
ＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラ（または「ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６」もしくは「ＩＬ−６キメラ」とも呼ばれる）はキメラ分子であって、インターロイキン６に融合されたＩｇ−様ドメインを有するインターロイキン６受容体の可溶性部位からなる（チェバスら（１９９７年）およびコレットら（１９９９年））。ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムへのｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラの結合を調査した。ローディングに用いた原料は、浄化および１０ｋＤａの膜による２０倍濃縮後に得られた２％のＦＢＳ中ＣＨＯプロジューサー細胞の粗精製収穫物である（ＣＣＭ）。
【０１３０】
ＣＨＯ細胞により産生されたｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラの粗精製収穫物（ＣＣＭ）を、ＰＢＳで平衡化されたＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラム（ライフテクノロジーズ社製、カタログ番号１２０３５）上にロードした。ＰＢＳでカラムを洗浄した後に捕獲された物質を２〜５カラムベッド（2-5 column）容量の３５％プロピレングリコール（ＰＧ）を含有するｐＨ８．４の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で溶出した。ローディングおよび溶出条件はｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰ捕獲工程と同様であった（下記を参照）。溶出されたフラクション中のタンパク質量はＥＬＩＳＡおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１３１】
より具体的には、１ｍｌのカラムを２０ｍｌのＰＢＳで平衡化し、４ｍｌのｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラ粗精製収穫物をロードした。用いた流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎであった。カラムを２０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、結合した物質をｐＨ８．４の２０ｍＭリン酸塩中３５％のプロピレングリコールを含む溶出緩衝液で溶出した。クロマトグラフィープロファイル（chromatography profile）は図４に示す。アンバウンドおよび溶出されたフラクションを回収し、ＥＬＩＳＡおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。クマシーブルーによるゲル染色を図５に描く。
【０１３２】
表１はクロマトグラフィーの結果を要約している。
【０１３３】
【表８】
【０１３４】
キャパシティーの結果となるこれらの条件は上記のｍｌ樹脂あたり２ｍｇのｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒで、収率はおよそ７２％および精製因子は約９４倍である。
【０１３５】
結果は、粗精製収穫物中においては基本的に検出不可能であるｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラ（図５）は、溶出フラクションにおける主要なバンドの１つである（ＥＬＩＳＡで９４倍精製）ことが明らかとなった。
【０１３６】
ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌがｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒ捕獲に適している樹脂であることが発見された。
【０１３７】
ｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラ中Ｉｇ−様ドメインのＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムにおける寄与を評価するために、ＩＬ−６を産生するＣＨＯ細胞の粗精製収穫物を完全なｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラと同様の条件下でＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムにロードした。Ｉｇ−様ドメインを欠くＩＬ−６はカラムＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムに結合しなかった。この結果は、Ｉｇ−様ドメインがＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムによる捕獲に必要不可欠であることを示す。
【０１３８】
実施例９
ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムによるｒ−β−ガラクトシダーゼの捕獲。
もう１つの実験において、Ｉｇ−様ドメインを有するバクテリアのタンパク質、β−ガラクトシダーゼのＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムへの結合を調べた。大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ロッシュ・ダイアグノスティックス社製、カタログ番号５６７７７９）を、無血清培地（ＳＦＭ）ＰｒｏＣＨＯ−５に０．６２５ｍｃｇ／ｍｌで加えた。
【０１３９】
ＳＦＭ中のβ−ガラクトシダーゼ４ｍｌを２０ｍｌのＰＢＳで平衡化した１ｍｌのカラムにロードした。用いた流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎであった。カラムを２０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、結合した物質をｐＨ８．４の２０ｍＭリン酸塩中３５％プロピレングリコールを含む溶出緩衝液を用いて溶出した。クロマトグラフィープロファイルは図６に示す。アンバウンドおよび溶出されたフラクションを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。クロマトグラフィーの分離による種々のフラクション、リファレンス物質および分子量マーカーを含む図７に示されているゲルはクマシーブルーで染色される。結果は、β−ガラクトシダーゼが効率よくＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムに結合すること、およびβ−ガラクトシダーゼタンパク質が３５％のＰＧにより効率よく溶出されることを示す。
【０１４０】
したがって、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムはβ−ガラクトシダーゼの精製に適している。
【０１４１】
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【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラム上での２段階（３５％〜５０％）プロプレングリコール（ＰＧ）溶出におけるＩＬ−１８ＢＰの捕獲において得られたクロマトグラムを示す。実行データ（Run Data）：カラムベッド容量：５ｍｌ。平衡緩衝液：ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．２、１０×ＰＢＳの１：１０希釈により調製される、ＩＰＬコード番号Ｓ８８ＲＤ００５−流速３ｍｌ／ｍｉｎ。ロード：０．５０ｍｇ／ｍｌのｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰ（ＥＬＩＳＡ）および３２ｍｇ／ｍｌ総タンパク質（ブラフォード）を含有する濃縮粗精製物（ＣＭＭ）−流速１ｍｌ／ｍｉｎ。洗浄：１）ＰＢＳ ｐＨ７．２、２）５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ４．５（ピーク１）、３）インジェクション用の水（ＷＦＩ）−全ての洗浄の流速は３ｍｌ／ｍｉｎ。第１溶出：ｐＨ８．４の２０ｍＭリン酸塩緩衝液中３５％のプロピレングリコール（ピーク２）−流速１ｍｌ／ｍｉｎ。第２溶出：５０％のＰＧ中で。左の縦軸はＡ２８０での吸収（タンパク質のｍＡＵユニット）を示し、右縦軸は伝導度（ｍＳ／ｃｒｒユニット）を示し、横軸はカラムを通過して流れる容量（ｍｌ）を示す。
【図２】ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムを用いたＩＬ−１８ＢＰの捕獲において得られたフラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分離したフラクション（resolved fractions）は図１に示される実験に由来する。レーン１）ロード、２）アンバウンド、３）ｐＨ４．５の５０ｍＭ酢酸塩での洗浄、４）ＷＦＩでの洗浄、５）３５％ＰＧの溶出ピーク、６）リファレンスのｒｈＩＬ１８ＢＰ、７）分子量マーカー。長い矢印はｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰバンドを指し示す。
【図３】ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムのｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰ溶出ピークの分別（fractionation）のクロマトグラムを示す。実行データ：カラムベッド容量：５ｍｌ。平衡緩衝液：ｐＨ６．１のＰＢＳ−流速３ｍｌ／ｍｉｎ。ロード：ｐＨ６．１に滴定されたＣＭＭ ＣＨ００８−流速３ｍｌ／ｍｉｎ。洗浄：１）ＰＢＳ ｐＨ６．１、２）５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ４．１、３）ＷＦＩ−全ての洗浄の流速は３ｍｌ／ｍｉｎ。溶出：ｐＨ８．４の２０ｍＭリン酸塩緩衝液中３５％のプロピレングリコール−流速１ｍｌ／ｍｉｎ。図では溶出ピークの拡張を示しており、３ｍｌフラクションごとに回収した。左の縦軸はＡ２８０（タンパク質のｍＡＵユニット）での吸収を示し、右縦軸は伝導度（ｍＳ／ｃｒｒユニット）を示し、横軸はカラムを通過して流れる容量（ｍｌ）を示す。
【図４】ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラム上でのｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒ捕獲のクロマトグラムを示す。実行データ：カラムベッド容量：１ｍｌ。平衡緩衝液：ＰＢＳ−流速１ｍｌ／ｍｉｎ。ロード：０．８１ｍｇ／ｍｌのｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒを含有する粗精製収穫物（ＥＬＩＳＡ）−流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ。洗浄：ＰＢＳ−流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ。溶出：ｐＨ８．４の２０ｍＭリン酸塩緩衝液中３５％のプロピレングリコール−流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ。検出はＡ２８０。左の縦軸はＡ２８０（タンパク質のｍＡＵユニット）での吸収を示し、右縦軸は伝導度（ｍＳ／ｃｒｒユニット）を示し、横軸はカラムを通過して流れる容量（ｍｌ）を示す。
【図５】粗精製収穫物を含有するＦＢＳ中のｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６ＲキメラをロードしたＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムからのロードおよび溶出フラクションとのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。フラクションはゲルにロードされた−２０ｍｃｇ／レーン。レーン１）−ロード、２）および３）−アンバウンド物質、４）−３５％ＰＧの溶出ピーク、５）リファレンスの精製ｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、５ｍｃｇ／レーン、６）分子量（ＭＷ）マーカー。矢印はｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒバンドを指し示す。
【図６】ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラム上へのβ−ガラクトシダーゼ捕獲のクロマトグラムを示す。実行データ：カラムベッド容量：１ｍｌ。平衡緩衝液：ＰＢＳ−流速１ｍｌ／ｍｉｎ。ロード：０．６２５ｍｇ／ｍｌのβ−ガラクトシダーゼを含有する無血清培地（ＳＦＭ）−流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ。洗浄：ＰＢＳ−流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ。溶出：ｐＨ８．４の２０ｍＭリン酸塩緩衝液中３５％のプロピレングリコール−流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ。検出はＡ２８０。左の縦軸はＡ２８０（タンパク質のｍＡＵユニット）での吸収を示し、右縦軸は伝導度（ｍＳ／ｃｒｒユニット）を示し、横軸はカラムを通過して流れる容量（ｍｌ）を示す。
【図７】ＳＦＭ（ＰｒｏＣＨＯ５）中のβ−ガラクトシダーゼをロードしたＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムからのロードおよび溶出フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。フラクションは総タンパク質に基づきゲルにロードされた−２０ｍｃｇ／レーン。レーン１）ロード、２）〜４）アンバウンド、５）３５％ＰＧの溶出ピーク、６）リファレンスの精製β−ガラクトシダーゼ、５ｍｃｇ／レーン、７）分子量マーカー。
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、１つまたはそれより多くのイムノグロブリン様（Ｉｇ−様）ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
たとえばヒト成長ホルモン、ヒトプロテインＣ凝固因子ＶＩＩおよびＩＬ−１８ＢＰが含まれる多数のヒトおよびその他哺乳類のタンパク質は、宿主細胞をこれらタンパク質をコードするＤＮＡで形質転換させ、そしてタンパク質の発現に好ましい条件下で組換え細胞を増殖させることでこれら宿主細胞において産生されている。組換えタンパク質はトランスジェニック動物によっても産生され、そして乳汁として分泌される。組換えタンパク質は細胞から細胞培養培地へ、乳汁へ分泌されるか、または細胞溶解物に存在し、そして細胞老廃物、細胞残骸およびタンパク質のようなほかの細胞成分、またはその他回収された物質から分離しなければならない。タンパク質の精製は通常あるタイプのクロマトグラフィー分離が必要とされる（コンスタンス（Constans）ら（２００２年）の総説を参照）。
【０００３】
次に示すクロマトグラフィー分離は広く用いられている：ゲルろ過（ＧＦ）、イオン交換（ＩＥＸ）、疎水性相互作用（ＨＩ）クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよびＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）。
【０００４】
タンパク質の精製は通常３段階で行われる：捕獲工程（a capture step）、ここでは目的のタンパク質がＤＮＡおよびＲＮＡのようなその他の細胞構成要素から分離される；中間の工程（intermediate step）、ここではサイズまたはその他物理的／化学的性質が類似するコンタミナント（contaminants）からタンパク質が単離される；そして最後の磨き工程（polishing step）。各精製段階は精製される特定のタンパク質に最も適した特定のクロマトグラフィー技術およびビーズサイズを用いる。
【０００５】
最初の捕獲工程は典型的には粗精製（crude）の細胞溶解物または細胞培養培地からのタンパク質の単離を含んでおり、そしてこの工程は高いキャパシティーおよび速い流速（high flow rate）の樹脂を必要とする。大きなビーズサイズおよび大きなビーズサイズ範囲（範囲は平均ビーズサイズにより幅広く変わりうる）を有する「ファストフロー（fast flow）」樹脂はこの目的に適している。
【０００６】
イムノグロブリン（Ｉｇ）は任意の構造細胞抗原レセプター（structural cell antigen receptors）として定義される；これは構造および生物学的活性に基づいて５つのクラス（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）に分けられる。イムノグロブリン分子の基本構造単位は、モノマーに関すれば、それぞれ４つのドメイン（１つの可変ＶHドメインおよび３つの定常ＣHドメイン）を有する２つの重（Ｈ）鎖およびそれぞれ２つのドメイン（１つの可変ＶLドメインおよび１つの定常ＣLドメイン）を有する２つの軽（Ｌ）鎖から構成されるＹ形の分子である。ＶHおよびＶLが抗原結合部位を構成する。イムノグロブリンドメインの基本的なパターンは、疎水性側鎖によってきつくまとめられている内部の大きな塊（internal volume）（すなわち、疎水性コア）を取り囲む２つのねじれたアンチパラレルβ−シートからなる。シートの湾曲程度（degree of curvature）に依存してドメインの全体形状はシリンダー（β−バレル）または２層が直線であればサンドイッチ様構造のいずれかで説明される。２つのβ−シートは、強くしかし厳格ではなく保存された鎖内ジスルフィド架橋の共有結合でつながっている（エンサイクロペディア・オブ・イムノロジー・エドス・ロイト・アンド・デルベス（Encyclopedia of Immunology Eds Roitt and Delves）（１９９２年）、９２〜９３頁および４７６〜４７７頁）。
【０００７】
Ｉｇ−様ドメインは真核生物および原核生物を含む多様な界由来のタンパク質から同定されており、ウイルス、カビおよび植物も含まれる（ハラビー（Halaby）ら（１９９８年））。Ｉｇ−様ドメインは多くのタンパク質において発見されており、例えばバクテリア酵素であるβ−ガラクトシダーゼおよびキチナーゼＡ（chitinase A）において、成長ホルモン受容体などのヒト受容体において、ＩＬ−１受容体（マクマハン（McMahan）ら（１９９１年））、ＩＬ−６受容体（ボルマー（Vollmer）ら（１９９９年））およびヒト組織因子（ＨＦＴ）受容体（ハラビーら（１９９９年））などのサイトカイン受容体において、成長因子依存的シグナルを細胞内環境に導入する（transduce）チロシンキナーゼ受容体において（ワイマン（Weimann）ら（２０００年））、ＣＤ４のようなイムノグロブリン関連タンパク質において、およびフィブロネクチンタイプＩＩＩのような細胞外マトリックスタンパク質において（ハラビーら（１９９９年））発見されている。
【０００８】
典型的には、イムノグロブリン様（Ｉｇ−様）ドメインは、７〜１０のβ−鎖から構成されており、特定のトポロジーおよび接続性を有する２つのシートの間に分布する。イムノグロブリン折り畳みファミリー（immunoglobulin fold family）（ＩｇＦＦ）を網羅する５２個のＩｇ−様ドメインの三次元構造が比較され（ハラビーら（１９９９年））、ほとんどのＩｇ−様ドメインは１０％以下の配列相同性を示すことが結果として示され、しかもＩｇ−様ドメインにおいて共通のコアを形成しているほとんどの残基が疎水性であることが示された。したがって、Ｉｇ−様ドメインは配列というより構造的類似性を有する。疎水性コアは、Ｉｇ折り畳みの独自性および安定性に重要な影響を与える。Ｉｇ−様ドメインの広範な配列多様性にもかかわらず、Ｉｇ折り畳みの維持は水素結合の保存された配置（conserved geometry）によって促進されているようである。一部のタンパク質は１より多くのＩｇ−様ドメインを有しており、たとえば成熟タイプＩＩのＩＬ−１受容体は３つのイムノグロブリン様ドメインを（マクマハンら（１９９１年））および接着分子ＶＣＡＭは７つのＩｇ−様ドメインを有する（オスボーン（Osborn）ら（１９９４年））。
【０００９】
次にＩｇ−様ドメインを有する重要なタンパク質の例を挙げる：ＮＣＡＭ（５つのＩｇ−様ドメイン）、フィブロネクチンタイプＩＩＩ、ＩＣＡＭ−１、ｍａｄＣＡＭ−１、ＰＥ ＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、タイチン（titin）およびカドヘリンなどの接着分子、ニューロカン（neurocan）、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲおよびＯＳＭＲなどのサイトカイン受容体の細胞外ドメイン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体（７つのＩｇ−様ドメイン）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体、ヒト血小板由来成長因子（ｈＰＤＧＦ）受容体などの成長因子受容体、Ｔ細胞受容体、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質、マクロファージコロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）、ミクログロブリン−β、ＣＴＬＡ４ Ｂ７分子に対するＴ細胞の受容体（２つのＩｇ−様ドメイン）、Ｂ７ Ｔ細胞の増殖を制御するＢ細胞活性因子などの免疫関連受容体、およびニューレグリン、凝集因子ＸＩＩＩ、ＮＦ−ｋＢ、スーパーオキシドディスムターゼ（superoxide dismutase）およびＩＬ−１８結合タンパク質などのその他のタンパク質。
【００１０】
サイトカイン結合タンパク質は、通常それぞれの細胞表面サイトカイン受容体の細胞外リガンド結合ドメインからなる（可溶性サイトカイン受容体）。可溶性受容体は細胞表面受容体の選択的なスプライシングまたはタンパク質分解切断のどちらかにより産生される。これら可溶性受容体は過去において述べられている：たとえば、ＩＬ−６およびＩＦＮ−γ（ノビック（Novick）ら（１９８９年））、ＴＮＦ（エンゲルマン（Engelmann）ら（１９８９年）およびエンゲルマンら（１９９０年））、ＩＬ−１およびＩＬ−４（マリゼウスキー（Maliszewski）ら（１９９０年））ならびにＩＦＮ−α／β（ノビックら（１９９４年）およびノビックら（１９９２年））の可溶性受容体。ひとつのサイトカイン結合タンパク質として、有名なオステオプロテゲリン（osteoprotegerin）（ＯＰＧ、オステオクラスト（osteoclast）阻害因子−ＯＣＩＦとしても知られている）は、ＴＮＦＲ／Ｆａｓファミリーのメンバーであり、分泌タンパク質としてのみ存在する可溶性受容体の最初の例と思われる（アンダーソン（Anderson）ら（１９９７年）、シモネット（Simonet）ら（１９９７年）、ヤスダら（１９９８年））。
【００１１】
インターロイキン−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）は、インビトロにおいてＩＦＮ−γのＩＬ−１８誘導およびＮＦ−κＢのＩＬ−１８活性化を廃止させることが知られている（ノビックら（１９９９年））。ＩＬ−１８ＢＰは可溶性受容体であり、分泌タンパク質としてのみ存在する。ＩＬ−１８ＢＰは１つのＩｇ−様ドメインを有し、Ｉｇ−様ドメインを含むサイトカイン受容体の細胞外セグメントに類似する。
【００１２】
Ｉｇ−様ドメインを含む他の非イムノグロブリンタンパク質はインターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）である。文献においてインターロイキン−６は、前炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの両方として働くことが提案されている（ハインリッヒ（Heinrich）らによる総説（１９９８年）、ジョン（Jones）ら（２００１年）およびペダーセン（Pedersen）ら（２００１年））。ＩＬ−６の生物学的活性を媒介する受容体複合体は２つの別個の膜結合糖タンパク質からなり、ひとつは８０ｋＤａの同族受容体サブユニット（ＩＬ−６Ｒ）でありもうひとつは１３０ＫＤａのシグナル−変換エレメント（ｇｐ１３０、ＣＤ１３０）である。ｇｐ１３０の発現は遍在しており、対照的に、ＩＬ−６Ｒの細胞分布は限定されており大部分は幹細胞および白血球亜集団（subpopulations）に限られている。膜結合受容体に加えて、ＩＬ−６Ｒの可溶性型（ｓＩＬ−６Ｒ）はヒト血清および尿から精製されている。この可溶性受容体はＩＬ−６に結合し、ＩＬ−６の血漿での半減期を引き延ばす。さらに重要なことには、ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６複合体はｇｐ１３０と相互作用することにより細胞を活性化しうる。この特徴は、ｇｐ１３０を発現しているが本質的にＩＬ−６自体には応答しない細胞タイプに対しｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６複合体をアゴニストとさせる。それ故にｓＩＬ−６Ｒは、ＩＬ−６に応答できる細胞のタイプのレパートリーを広げることが可能である。
【００１３】
可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）をコードするｃＤＮＡの完全なコーディング領域をＩＬ−６と融合させることにより組換えＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラはヒト細胞において作製された（チェバス（Chebath）ら（１９９７年））。このＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラは促進されたＩＬ−６タイプの生物学的活性を有しており、そしてインビトロにおいてｇｐ１３０鎖にＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒとの混合物よりも非常に高い効率で結合する（コレット（Kollet）ら（１９９９年））。
【発明の開示】
【００１４】
メルカプト−エチル−ピリジン（ＭＥＰ）ＨｙｐｅｒＣｅｌ（バイオセプラ（BioSepra）社製）は、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）樹脂である。この樹脂はイムノグロブリンを捕獲するために特別にデザインされたものである（ボスチェッティ（Boschetti）ら（２０００年）およびライフテクノロジーズ・インコーポレーテッド製（２０００年））。中性ｐＨにおいては脂肪族−疎水性スペーサーおよび中性（荷電していない）ピリジン環の両方による疎水性捕獲がＨＩＣＩ樹脂においておこる。ＨＩクロマトグラフィーとは対照的に、ＨＣＩＣ樹脂においては、いくらかのｐＨまたはイオン強度の調整も必要とせずに細胞培養上清から抗体を吸着することが成し遂げられた。一度ｐＨがｐＨ７．２からｐＨ４に下げられると、樹脂中のピリジン環および結合している抗体は正電荷を帯びるようになり、電荷反発によりイムノグロブリンは引き離れ、そしてカラムから溶出される。このクロマトグラフィーの手法はイムノグロブリンの捕獲に使われているが、Ｉｇ−様ドメインを有する非イムノグロブリンタンパク質の捕獲に働くではあろうことは予測されなかった、何故ならばイムノグロブリンは独特の配列を有するからであり、そしてさらには５２個の異なる非イムノグロブリンタンパク質中のＩｇ−様ドメインは１０％未満の配列相同性を持っていたからである（ハラビーら（１９９９年））。
【００１５】
本発明は生物学的液体（biological fluid）からＩｇ−様ドメインを有する非イムノグロブリンタンパク質の精製方法に関する。
【００１６】
本発明は、
ａ）目的のタンパク質を含有する生物学的液体に疎水性電荷クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）樹脂を接触させる工程、
ｂ）アンバウンド（unbound）のコンタミナントを除去するために樹脂を洗う工程、
ｃ）酸性ｐＨを有する溶液または有機溶媒を含む溶液により樹脂を処理することにより目的のタンパク質を溶出させる工程
を含む、生物学的液体から１と１０の間のイムノグロブリン様（Ｉｇ−様）ドメインを有する目的の非イムノグロブリンタンパク質の精製または捕獲方法に関する。
【００１７】
本発明の１つの態様によれば、ＨＣＩＣ樹脂は、ＭＥＰ−ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂である。
【００１８】
本発明の別の態様によれば、工程ｃ）で用いられる有機溶媒はプロピレングリコールであって、溶液中のプロピレングリコール濃度が、約２５％と５０％の間にあることが好ましい。
【００１９】
本発明のさらに別の態様によれば、工程ａ）は、酸性のｐＨで実施され、ｐＨが約３と６．８の間にあることが好ましい。
【００２０】
本発明のさらに２つめの態様によれば、洗浄工程ｂ）は、酸性のｐＨを有する溶液で実施され、ｐＨは約３と６．８の間にあることが好ましい。
【００２１】
本発明の１つの側面（aspect）によれば、生物学的液体は、細胞調製培養培地、細胞溶解物、細胞抽出物、組織抽出物、血漿、血清、乳汁、尿、腹水、脳脊髄液、野菜ジュース、植物抽出物または初期クロマトグラフィー分離工程由来のフラクションから選択される。
【００２２】
本発明のさらなる態様によれば、目的のタンパク質は、１〜７のＩｇ−様ドメインを有する。
【００２３】
本発明は、ＩＬ−１８ＢＰ、ＮＣＡＭ、フィブロネクチンタイプＩＩＩ、ＩＣＡＭ−１、ｍａｄＣＡＭ−１、ＰＥ ＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、タイチン、カドヘリン、ニューロカン、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＯＳＭＲ、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ｈＰＤＧＦ受容体、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣタンパク質、ミクログロブリン−β、ＣＴＬＡ４、Ｂ７活性化因子、ニューレグリン、凝集因子ＸＩＩＩ、ＮＦ−ｋＢ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、β−ガラクトシダーゼおよびスーパーオキシドディスムターゼ、好ましくはＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラおよびβ−ガラクトシダーゼまたは少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを含むそれらのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能性誘導体またはフラグメントなど目的のタンパク質の精製または捕獲方法を提供する。
【００２４】
１つの態様によれば、本発明の方法は、精製因子が１１倍と９４倍との範囲で、好ましくは約９４倍で精製タンパク質を得ることができる。
【００２５】
さらなる態様によれば、本発明は濃縮因子が１．５倍と３．１倍との範囲で、好ましくは３．１倍で精製タンパク質を得ることができる。
【００２６】
また本発明の方法は、収率が７３％と９８％との範囲で、好ましくは約８５％で精製タンパク質を得ることができる。
【００２７】
加えて、本発明は
ａ）目的のタンパク質を含有する生物学的液体に疎水性電荷クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）樹脂を接触させる工程、
ｂ）アンバウンドのコンタミナントを除去するために樹脂を洗う工程、
ｃ）酸性ｐＨを有する溶液または有機溶媒を含む溶液により樹脂を処理することにより目的のタンパク質を溶出させる工程
を含む生物学的液体から１と１０の間のイムノグロブリン様（Ｉｇ−様）ドメインを有する目的の非イムノグロブリンタンパク質を捕獲するためのＨＣＩＣの使用を提供する。
【００２８】
１つの側面によれば、本発明は１と１０の間までのイムノグロブリン様（Ｉｇ−様）ドメインを有する目的の非イムノグロブリンタンパク質を含む精製タンパク質調製品であって、本発明の方法によって生物学的液体から精製または捕獲された精製タンパク質調製品を提供する。
【００２９】
本発明のさらなる態様によれば、精製タンパク質調製品はＩＬ−１８ＢＰ、ＮＣＡＭ、フィブロネクチンタイプＩＩＩ、ＩＣＡＭ−１、ｍａｄＣＡＭ−１、ＰＥ ＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、タイチン、カドヘリン、ニューロカン、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＯＳＭＲ、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ｈＰＤＧＦ受容体、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣタンパク質、ミクログロブリン−β、ＣＴＬＡ４、Ｂ７活性化因子、ニューレグリン、凝集因子ＸＩＩＩ、ＮＦ−ｋＢ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、β−ガラクトシダーゼおよびスーパーオキシドディスムターゼ、好ましくはＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼ、または少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを含むそれらのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能性誘導体またはフラグメントから選択される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明は、１つまたはそれより多くのＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質が、イムノグロブリンの捕獲に典型的に用いられる樹脂であるＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂によって効率よく生物学的液体から捕獲されるという知見に基づいている。
【００３１】
したがって、本発明は
ａ）目的のタンパク質を含有する生物学的液体に疎水性電荷クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）樹脂を接触させる工程、
ｂ）アンバウンドのコンタミナントを除去するために樹脂を洗う工程、
ｃ）酸性ｐＨを有する溶液または有機溶媒を含む溶液により樹脂を処理することにより目的のタンパク質を溶出させる工程
を含む、生物学的液体から１と１０の間のイムノグロブリン様（Ｉｇ−様）ドメインを有する目的の非イムノグロブリンタンパク質の精製および／または捕獲に関する。
【００３２】
メルカプト−エチル−ピリジン（ＭＥＰ）ＨｙｐｅｒＣｅｌ（バイオセプラ社製）は、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）樹脂である。この樹脂はイムノグロブリンを捕獲するために特別にデザインされた（ボスチェッティら（２０００年）およびライフテクノロジーズ・インコーポレーテッド製（２０００年））。中性ｐＨにおいては脂肪族−疎水性スペーサーおよび中性（荷電していない）ピリジン環の両方による疎水性捕獲がＨＣＩＣ樹脂においておこる。ＨＩクロマトグラフィーとは対照的に、ＨＣＩＣ樹脂においては、いくらかのｐＨまたはイオン強度の調整も必要とせずに細胞培養上清から抗体を吸着することが成し遂げられる。一度ｐＨがｐＨ７．２からｐＨ４に下げられると、樹脂中のピリジン環および結合している抗体は正電荷を帯びるようになり、電荷反発によりイムノグロブリンは引き離れ、そしてカラムから溶出される。このクロマトグラフィーの手法はイムノグロブリンの捕獲に使われているが、Ｉｇ−様ドメインを有する非イムノグロブリンタンパク質の捕獲に働くではあろうことは予測されなかった、何故ならばイムノグロブリンは独特の配列を有するからであり、そしてさらには５２個の異なる非イムノグロブリンタンパク質中のＩｇ−様ドメインは１０％未満の配列相同性を持っていたからである（ハラビーら（１９９９年））。
【００３３】
本発明の１つの態様によれば、ＨＣＩＣ樹脂であるＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌを用いてＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質を捕獲する可能性は、ＩＬ−１８ＢＰを用いて実証された。ＩＬ−１８ＢＰは高度にグリコシル化されており、結果としてイムノグロブリンと比較してより酸性であり（等電点は約３）、そして疎水性が低い。一方では、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌへのイムノグロブリンの結合は疎水性に基づいており、イムノグロブリンとは対照的に、ＩＬ−１８ＢＰはそれほど疎水性ではない。他方では、もしＩＬ−１８ＢＰがそのような樹脂に結合したとしても、抗体を溶出するために推奨されている条件はＩＬ−１８ＢＰには作用しないことが期待される。なぜなら、ｐＨをｐＨ７．２からｐＨ４に変化させてもＩＬ−１８ＢＰを正に荷電させることはなく、したがって、ＩＬ−１８ＢＰはそのようなｐＨ条件下ではカラムに結合したままであることが期待されるからである。したがって、ＩＬ−１８ＢＰの捕獲にＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂を用いることは、当業者によってタンパク質の物理化学的特徴ならびに樹脂の結合および溶出原理から不適当であると考えられるであろう。
【００３４】
１つの態様によれば、ＩＬ−１８ＢＰを含有する濃縮粗精製物（ＣＭＭ）（実施例１、図１）は、プレ平衡化されたＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラム（緩衝液（ＰＢＳ）ｐＨ７．２）に適用された。カラムをアンバウンドタンパク質を除去するために同じ緩衝液で洗浄した。イムノグロブリン（等電点は６〜６．５の範囲）とＩＬ−１８ＢＰ（等電点は約３）との物理化学的性質の差異を利用して、そしてイムノグロブリン精製の製造説明書に従って、イムノグロブリンのコンタミナントを、ｐＨを４．５にまで低下させることによりカラムから洗浄除去した。このｐＨでは、ＩＬ−１８ＢＰは樹脂に結合したままである。最終的に、カラムからＩＬ−１８ＢＰを回収するために、プロピレングリコールを含有するｐＨ８．４の溶液（リン酸緩衝液中、約３５％のプロピレングリコール）が首尾よく使用された。
【００３５】
ＩＬ−１８ＢＰは効率よくＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂に結合し、そのタンパク質は別個のピークとして溶出されることが得られた結果により示されている。
【００３６】
下記の実施例で示されるように、流速、緩衝液組成、ローディング物のｐＨ、カラムキャパシティー等のようなクロマトグラフィーのパラメーターを変化させることによって、Ｉｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質のＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラム上への捕獲は最適化されうることが示された。たとえば、イムノグロブリンフラクションがＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムから酸性ｐＨにおいて溶出される（ｐＨ４、ボスチェッティら（２０００年）およびライフテクノロジーズ・インコーポレーテッド製（２０００年））という特徴は、ＩＬ−１８ＢＰのローディングカラムキャパシティーを増加させるために利用された。ローディング工程におけるカラムへのイムノグロブリンの吸着をより少なく、ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰの吸着をより多くするように、そして、可能な限りコンタミするイムノグロブリンを除去するように、ローディング物のｐＨをより酸性なｐＨ（たとえばｐＨ６．１）に調整できる。下記の実施例において、低いｐＨで粗精製物をロードすることによりＩＬ−１８ＢＰのキャパシティーは約２倍以上に上昇した。
【００３７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（実施例５）解析、ＲＰ−ＨＰＬＣ（実施例７）および固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）（実施例６）で示されるように、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラム捕獲工程は、ＩＬ−１８ＢＰに関して良いローディングキャパシティー（１ｍｌ樹脂あたり約６ｍｇのＩＬ−１８ＢＰ）、高い回収率（８５％以上）および精製効果を示した。一方で、精製されたｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰのフラクションは幅の狭いピークとして溶出された。ＩＬ−１８ＢＰ捕獲におけるＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂の高い性能は、おそらく以下の理由に起因する：樹脂に対するｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰの選択的結合、酸性ｐＨでの効率よい洗浄工程および選ばれた溶出条件（ＰＧを用いた溶出）。
【００３８】
さらに、ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰの捕獲において様々なＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂を用いることで、バッチ間の一貫性が示された。
【００３９】
無血清培地または血清添加培地において産生された物質を用いたとき、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムは似通った性能を示すことを付加的な実験で示している。
【００４０】
したがって、原料または粗精製収穫物中の血清の有無はタンパク質のＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムに対する結合に影響しない。
【００４１】
本発明の他の態様によれば、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂によるＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質捕獲の可能性は、ＣＨＯ細胞により産生されたｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラによって評価された。ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラ（または「ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６」もしくは「ＩＬ−６キメラ」とも呼ばれる）は、インターロイキン６に融合された、Ｉｇ−様ドメインを有するインターロイキン６受容体の可溶性部位からなる。
【００４２】
カラムに適用した物質は２％のＦＢＳを含む組換えＣＨＯ細胞によって産生された粗精製収穫物であり、浄化（clarification）および２０倍濃縮後に得られた（実施例８）。
【００４３】
さらに具体的には、ＣＨＯ細胞により産生されたｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラの粗精製収穫物はＰＢＳで平衡化されたＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムにロードされた。カラムを洗浄した後、捕獲された物質は３５％ＰＧで溶出された。溶出されたフラクション中のタンパク質量はＥＬＩＳＡおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムは１ｍｌ樹脂あたり２ｍｇ以上のｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒキャパシティーを有し、ｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒ捕獲の収率はおよそ７２％および精製因子は約９４倍である。
【００４４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図５）で示されるように、ｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラは粗精製収穫物において基本的に検出不可能であり（図５）、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ溶出フラクションにおける１つの主要なバンドであることが明らかとなった（９４倍に精製、ＥＬＩＳＡによる）。
【００４５】
ｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラ中のＩｇ−様ドメインのＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムへの結合に対する寄与を調べるために、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムにＩＬ−６単独での結合が評価された。この目的のため、組換えＣＨＯ細胞の粗精製収穫物をＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムに完全キメラと類似の条件で適用した。ＩＬ−６自体は、Ｉｇ−様ドメインを含有するＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラとは対照的にカラムに結合しなかった。
【００４６】
Ｉｇ−様含有非イムノグロブリンタンパク質捕獲のためのＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂の使用は、バクテリア由来の酵素であるｒ−β−ガラクトシダーゼを用いるさらなる態様において行われた。この酵素はＩｇ−様ドメインタイプＣ３を含有する（ハラビーら（１９９９年））。ｒ−β−ガラクトシダーゼは無血清培地（実施例９）に加えておき、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムに適用した。カラムの洗浄後、捕獲された物質は３５％のＰＧで溶出された。アンバウンドおよび溶出された物質のフラクションは回収され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された。得られた結果から、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂が溶液からβ−ガラクトシダーゼを効率よく捕獲することが示された。
【００４７】
上記の実験はＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂がＩｇ−様ドメインを含む種々の非イムノグロブリンタンパク質の精製に使用できることを示す。
【００４８】
本発明は、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌまたはＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌと同じかまたは類似の特徴からなるＨＣＩＣ樹脂により、１つまたはそれより多くのＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質の捕獲に関するのであって、それにより１つまたはそれより多くのＩｇ−様ドメインを含むタンパク質の捕獲を可能とする。本発明はまた、天然においてはＩｇ−様ドメインを有しないが組換え手法によりそのようなドメインが融合された非イムノグロブリンタンパク質の捕獲にも関する。
【００４９】
Ｉｇ−様ドメイン含有タンパク質はＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌのようなＨＣＩＣ樹脂を用いることで生物学的液体または細胞溶解物から捕獲されうる。一般的な意味において、捕獲は、目的のＩｇ−様ドメイン含有タンパク質を含む生物学的液体または細胞抽出物にＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌなどのＨＣＩＣ樹脂を接触させ、アンバウンドのコンタミナントを除去するために樹脂を洗浄し、そしてｐＨ環境を変化させること、または特定の態様で述べたようにイソプロピルアルコールまたはプロピレングリコールなどの有機溶媒および／または、たとえばグリセロール、ポリエチレングリコールなどのポリアルコール（約２５〜５０％の間）を適用することにより結合した物質を溶出させることを含む。
【００５０】
生物学的液体または細胞抽出物をＨＣＩＣに接触させることは粗精製収穫物のｐＨまたは中性のｐＨまたはもうひとつの方法として、接触させる前にカラムおよび粗精製収穫物のｐＨを酸性のｐＨ、たとえばＩＬ−１８ＢＰ精製のように３〜６．８の間のｐＨまたは塩基性のｐＨに調整させることで行われうる。
【００５１】
樹脂を洗浄し、アンバウンドのコンタミナントを除去するために、ロードした物と同じｐＨの溶液（例えばｐＨ７．２のＰＢＳ）および／または中性ｐＨの溶液が使用でき、および／または酸性（たとえばｐＨ３〜６．８）または塩基性ｐＨが使用できる。Ｉｇ−様ドメインを含有する組換えタンパク質はそのようなタンパク質をコードするベクターで形質転換されたバクテリアまたは真核生物（たとえばＣＨＯ）の培養宿主細胞において、またはトランスジェニック動物または植物において産生されうる。トランスジェニック動物を用いたときは特に異種（heterologous）タンパク質をそれらの乳汁に産生させる利点がある。ウシ、羊およびヤギなど日常の動物がしたがって好ましいホストである。たとえば国際公開第８８／００２３９号パンフレット、第９０／０５１８８号パンフレット、第９１／０２３１８号パンフレットおよび第９２／１１７５７号パンフレット；および米国特許明細書番号第４，８７３，１９１号明細書、第４，８７３，３１６号明細書および第５，３０４，４８９号明細書参照。これらの番号を参照することによってこれら全体はここに組み込まれる。
【００５２】
したがって、Ｉｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質は、少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを保持する条件でそれらのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能性誘導体またはフラグメントも含めて、組換え細胞の培地から、細胞溶解物、トランスジェニック動物の乳汁から、トランスジェニック植物、尿、腹水、野菜ジュース、植物抽出物などから本発明の手法を用いて捕獲されうる。
【００５３】
よって、本発明にしたがって、目的の非イムノグロブリンタンパク質の精製方法を使用することにより、ＮＣＡＭ（５つのＩｇ−様ドメイン）、フィブロネクチンタイプＩＩＩ、ＩＣＡＭ−１、ｍａｄＣＡＭ−１、ＰＥ ＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、タイチンおよびカドヘリン、ニューロカン、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲおよびＯＳＭＲなどのサイトカイン受容体の細胞外ドメイン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体（７つのＩｇ−様ドメイン）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体、ヒト血小板由来成長因子（ｈＰＤＧＦ）受容体などの成長因子受容体、Ｔ細胞受容体、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質、ミクログロブリン−β、ＣＴＬＡ４ Ｂ７分子に対するＴ細胞の受容体（２つのＩｇ−様ドメイン）、Ｂ７ Ｔ細胞の増殖を制御するＢ細胞活性因子などの免疫関連受容体、およびニューレグリン、凝集因子ＸＩＩＩ、ＮＦ−ｋＢ、スーパーオキシドディスムターゼおよびＩＬ−１８ＢＰなどのその他のタンパク質の精製されたタンパク質調製品を得ることが可能である。
【００５４】
好ましくは、本発明によれば、１つまたはそれより多くのＩｇ−様ドメインを有する非イムノグロブリンタンパク質の捕獲および／または精製においては、得られたタンパク質の精製因子は１１〜９４倍の範囲、より好ましくは約９４倍であり、得られたタンパク質の濃縮因子は１．５〜３．１倍の範囲、より好ましくは約５倍であり、得られたタンパク質の収率は７３〜８５％の範囲、より好ましくは約９８％である。
【００５５】
典型的には、イムノグロブリン様（Ｉｇ−様）ドメインは、７〜１０のβ−鎖から構成されており、特定のトポロジーおよび接続性を有する２つのシートの間に分布する。イムノグロブリン折り畳みファミリー（ＩｇＦＦ）を網羅する５２個のＩｇ−様ドメインの三次元構造が比較され（ハラビーら（１９９９年））、ほとんどのＩｇ−様ドメインは１０％以下の配列相同性を示すことが結果として示され、しかもＩｇ−様ドメインにおいては、共通のコアを構成するほとんどの残基が疎水性であることが示された。したがって、Ｉｇ−様ドメインは配列というより構造的類似性を有する。疎水性コアは、Ｉｇ折り畳みの独自性および安定性に重要な影響を与える。Ｉｇ−様ドメインの広範な配列多様性にもかかわらず、Ｉｇ折り畳みの維持は水素結合の保存された配置によって促進されているようである。一部のタンパク質は１つより多くのＩｇ−様ドメインを有しており、たとえば成熟タイプＩＩのＩＬ−１受容体は３つのイムノグロブリン様ドメインを（マクマハンら（１９９１年））および接着分子ＶＣＡＭは７つのＩｇ−様ドメインを有する（オスボーンら（１９９４年））。
【００５６】
次にＩｇ−様ドメインを有する重要なタンパク質の例を挙げる：ＮＣＡＭ（５つのＩｇ−様ドメイン）、フィブロネクチンタイプＩＩＩ、ＩＣＡＭ−１、ｍａｄＣＡＭ−１、ＰＥ ＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、タイチンおよびカドヘリンなどの接着分子、ニューロカン、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲおよびＯＳＭＲなどのサイトカイン受容体の細胞外ドメイン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体（７つのＩｇ−様ドメイン）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体、ヒト血小板由来成長因子（ｈＰＤＧＦ）受容体などの成長因子受容体、Ｔ細胞受容体などの免疫関連受容体、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質、マクロファージコロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）、ミクログロブリン−β、ＣＴＬＡ４ Ｂ７分子に対するＴ細胞の受容体（２つのＩｇ−様ドメイン）、Ｂ７ Ｔ細胞の増殖を制御するＢ細胞活性因子、およびニューレグリン、凝集因子ＸＩＩＩ、ＮＦ−ｋＢ、スーパーオキシドディスムターゼおよびＩＬ−１８結合タンパク質などのその他のタンパク質。
【００５７】
本明細書において使用される用語「ムテイン」はＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質の類似体を意味し、該類似体においては、たとえばＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼなどのタンパク質の１つまたはそれより多くのアミノ酸残基が、ＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼと比較して結果として生じる産物の活性の著しい変化がなく、および／または少なくとも１つのＩｇ−様ドメインが保持される条件で、異なるアミノ酸残基によって置換され、または欠失され、または１つもしくはそれより多くのアミノ酸残基がそれらに付加される。さらに詳しくは、３０より少ないが１つまたはそれよりも多くのタンパク質中のアミノ酸、好ましくは２０より少なく、さらに好ましくは１０より少なく、最も好ましくは１つまたは２つのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換され、または欠失（eliminated）され、または付加されうる。これらのムテインは公知の合成方法によっておよび／または部位特異的突然変異誘発技術によって、またはそれらにとって適したどんなほかの技術によってでも調製される。
【００５８】
本発明のムテインは、ＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼなど少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡと、本発明にしたがって、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸によってコードされるタンパク質を含む。用語「ストリンジェントな条件」とは、当業者が従来から「ストリンジェント」と呼ぶ、ハイブリダイゼーションおよびその後の洗浄条件を意味する。上記アウスベル（Ausubel）らによるカレント プロトコル イン モレキュラー バイオロジー、インターサイエンス、ニューヨーク、章６．３および６．４（１９８７年、１９９２年）および前記サンブロック（Sambrook）らを参照。限定なしで、ストリンジェントな条件の例は、試験下のハイブリッドの推定Ｔｍ値の１２〜２０℃低い洗浄条件を含む、たとえば、２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳを５分間、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを１５分間；３７℃で０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳを３０〜６０分間、そして６８℃で０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳを３０〜６０分間。当業者はストリンジェントな条件はＤＮＡ配列、オリゴヌクレオチドプローブ（１０〜４０塩基など）または混合オリゴヌクレオチドプローブの長さにも依存することを理解する。混合プローブを用いる場合は、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）をＳＳＣのかわりに使うことが好ましい。前記アウスベルを参照。
【００５９】
そのような任意のムテインは、好ましくは、ＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ−６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼなど、少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質のアミノ酸配列と、ＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼなどと充分に類似した活性を有するほど、および／または少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを保持している条件で、充分に重複する。
【００６０】
好ましい１つの態様としては、そのような任意のムテインは、例えばＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ−６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列と少なくとも４０％の相同性を有している。より好ましくは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または最も好ましくはそれらと少なくとも９０％の相同性を有している。
【００６１】
本発明において精製されるムテインまたはそれらをコードする核酸は、本明細書中で示される教示および指図に基づいて、過度の実験をすることなく、当業者によって日常的に得られる置換されたペプチドまたはポリヌクレオチドとして実質的に対応する配列の有限のセットを含む。
【００６２】
本発明によるムテインの好ましい変化は「保存的（conservative）」置換として知られるものである。ＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼなど、少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質の保存的アミノ酸置換は、グループのメンバー間の置換は、分子の生物学上の機能を保存するという充分に類似した物理化学的性質を有し（グランザム（Grantham）ら（１９７４年））、および／または少なくとも１つのＩｇ−様ドメインが保持される条件で有しうる。特に、挿入または欠失が、わずかなアミノ酸のみ、たとえば３０個以下、そして好ましくは１０個以下のアミノ酸を包含し、そして機能的配座、たとえばシステイン残基などに重要であるアミノ酸を除去または置換しない場合、アミノ酸の挿入および欠失も、それの機能を改変せずに、上で定義された配列で行われうることも明らかである。このような欠失および／または挿入により産生されるタンパク質およびムテインは、本発明の範囲内になる。
【００６３】
好ましくは、同義のアミノ酸基は、表Ａで定義されるものである。さらに好ましくは、同義のアミノ酸基は、表Ｂで定義されるものである；そして最も好ましくは、同義のアミノ酸基は、表Ｃで定義されるものである。
【００６４】
【表１】
【００６５】
【表２】
【００６６】
【表３】
【００６７】
本発明で使用するためのムテインを得るために使用されうる例えばＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼなど、Ｉｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質におけるアミノ酸置換の生成の例は、マーク（Mark）らによる米国特許第４，９５９，３１４号明細書、第４，５８８，５８５号明細書および第４，７３７，４６２号明細書；コス（Koths）らによる第５，１１６，９４３号明細書、ナメン（Namen）らによる第４，９６５，１９５号明細書；チョン（Chong）らによる第４，８７９，１１１号明細書およびリー（Lee）らによる第５，０１７，６９１号明細書に示されるものおよび米国特許第４，９０４，５８４号明細書（ショウ（Shaw）ら）に示されるリシン置換タンパク質のような、あらゆる既知方法工程が挙げられる。
【００６８】
用語「融合タンパク質」は、他の非イムノグロブリンタンパク質と融合された、例えば体液中での長期の滞留時間を有するもう１つの非イムノグロブリンタンパク質と融合された、例えばＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼまたはそれらのムテインまたはフラグメントなどのＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質を意味する。したがって、例えばＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼは他の非イムノグロブリンタンパク質、ポリペプチドなどと融合されうる。
【００６９】
本明細書において使用されるところの「機能性誘導体（functional derivative）」は、本技術分野において既知の方法によってアミノ酸部分の側鎖に、またはＮ−またはＣ−末端に存在する官能基から作製されうるＩｇ−様ドメイン含有タンパク質、例えばＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼおよびそれらのムテインおよび融合タンパク質の誘導体を意味し、薬学的に許容しうる場合、すなわち、それらが、例えばＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼの活性と充分に類似するおよび／または少なくとも１つのＩｇ−様ドメインが保持される条件でタンパク質活性を破壊しないか、またはそれらを含有する医薬組成物に毒性を与えない場合に、本発明に含まれる。
【００７０】
このような誘導体としては、たとえば抗原部位をマスクしそして体液中での滞留を引き伸ばすポリエチレングリコール側鎖が含まれる。他の誘導体としては、カルボキシル基の脂肪族エステルまたはアンモニアまたは一級もしくは二級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、およびアシル部分（moiety）（例えばアルカノイルまたはアロイル基など）と形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体またはアシル部分と形成される遊離水酸基（例えばセリンまたはスレオニン残基）のＯ−アシル誘導体が挙げられる。
【００７１】
Ｉｇ−様ドメインを含むタンパク質および／またはムテインおよび融合タンパク質の「フラグメント」として、該フラクションがＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼなどのタンパク質と実質的に同様の活性を有する条件および／または該フラクションが少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを保持する条件において、本発明は、単独のタンパク質分子のポリペプチド鎖の任意のフラグメントまたは前駆体、または結合した関連分子または残基（たとえば糖またはリン酸塩残基、もしくはタンパク質分子または糖残基自身の集合体）を伴うタンパク質のポリペプチド鎖の任意のフラグメントまたは前駆体を網羅する。
【００７２】
本発明は、ＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６Ｒおよびβ−ガラクトシダーゼなどＩｇ−様ドメインを含むタンパク質、または少なくとも１つのＩｇ−様ドメインが保持される条件でそれらのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能性誘導体、活性フラクションまたは環状にて入れ替えられた誘導体（circularly permutated derivative）に関する。
【００７３】
次にＩｇ−様ドメインを有する重要なタンパク質の例を挙げる：ＮＣＡＭ（５つのＩｇ−様ドメイン）、フィブロネクチンタイプＩＩＩ、ＩＣＡＭ−１、ｍａｄＣＡＭ−１、ＰＥ ＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、タイチンおよびカドヘリンなどの接着分子、ニューロカン、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲおよびＯＳＭＲなどのサイトカイン受容体の細胞外ドメイン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体（７つのＩｇ−様ドメイン）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体、ヒト血小板由来成長因子（ｈＰＤＧＦ）受容体などの成長因子受容体、Ｔ細胞受容体、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質、ミクログロブリン−β、ＣＴＬＡ４ Ｂ７分子に対するＴ細胞の受容体（２つのＩｇ−様ドメイン）、Ｂ７ Ｔ細胞の増殖を制御するＢ細胞活性因子などの免疫関連受容体、およびニューレグリン、凝集因子ＸＩＩＩ、ＮＦ−ｋＢ、スーパーオキシドディスムターゼおよびＩＬ−１８ＢＰ（１つのＩｇ−様ドメイン）などのその他のタンパク質。
【００７４】
用語「ＩＬ−１８結合タンパク質」は「ＩＬ−１８ＢＰ」と本明細書において同義に用いられる。ＩＬ−１８結合タンパク質は国際公開第９９／０９０６３号パンフレットまたはノビックら（１９９９年）によって定義されたものを含み、キムら（２０００年）によって定義されたＩＬ１８−結合タンパク質のスプライス（splice）変異体および／またはアイソフォームを含む。さらに詳しくは、ＩＬ−１８ＢＰのヒトアイソフォームａおよびｃは本発明によれば有用である。本発明による有用なタンパク質はグリコシル化されまたはグリコシル化されず、それらは尿など天然の採取原（natural source）由来であってよく、またはそれらは組換えによって産生されることが好ましいであろう。組換え体の発現は大腸菌などの原核生物発現系または真核生物発現系、および好ましくは哺乳類の発現系によって実施されうる。
【００７５】
「生物学的液体」は細胞、細胞成分または細胞産物由来のまたは含有する任意の液体を意味する。生物学的液体は限定されないが、細胞培養上清、細胞溶解物、透明になった（cleared）細胞溶解物、細胞抽出物、組織抽出物、血液、血漿、血清、乳汁、尿、腹水、野菜ジュース、植物抽出物およびそれらのフラクションおよび他のクロマトグラフィー分離工程由来のフラクションもまた含まれる。生物学的液体は少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンの捕獲工程において粗精製物として使用され、本発明によれば濃縮されても、濃縮されなくても、または希釈されてもよい。
【００７６】
少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質の捕獲工程において細胞培養上清または細胞調整培養培地は、本発明によれば胎児ウシ血清またはウマ血清など血清存在下増殖した細胞または無血清培地で増殖した細胞由来であってもよい。
【００７７】
「細胞調整培養培地」は、細胞がそこで培養され、および細胞の産物を含有する栄養培地を意味する。
【００７８】
細胞、細胞残骸などを含有する生物学的液体を用いて研究を行うときは、最初にこれら特定のコンタミナントを除去するために液体をろ過および／または遠心分離することが好ましい。
【００７９】
少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質の捕獲工程におけるＨＣＩＣ樹脂の使用はスケールアップすることができ、純粋なタンパク質を得るために、イオン交換クロマトグラフィー、液体アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、限外ろ過および異相沈殿（differential precipitation）など他の精製および濃縮技術と有利に組み合せることができる。
【００８０】
例えばヒト成長ホルモン、ヒトプロテインＣ、凝固因子ＶＩＩおよびＩＬ−１８ＢＰなどを含む多数のヒトおよび他の哺乳類タンパク質は、宿主細胞にこれらタンパク質をコードするＤＮＡを形質導入し、組換え細胞を増殖させ、そしてタンパク質を回収することで産生される。
【００８１】
国際公開第９９／０９０６３号パンフレットは出願において哺乳類細胞におけるＩＬ−１８ＢＰの産生を開示している。組換えタンパク質はトランスジェニック動物によって産生され乳汁に分泌される。
【００８２】
組換えタンパク質は、細胞から細胞培養培地（細胞調整培養培地）に、乳汁に分泌されるか、または細胞溶解物中に存在し、細胞廃棄産物、細胞残骸およびタンパク質など他の細胞成分、または他の回収された物質から分離されなければならない。
【００８３】
ＭＥＰ−ＨｙｐｅｒＣｅｌによって捕獲されたＩｇ−様含有非イムノグロブリンタンパク質は、さらにクロマトグラフィー分離によって精製されうる。次のクロマトグラフィー分離は広く使用されている：ゲルろ過（ＧＦ）、イオン交換（ＩＥＸ）、および疎水性相互作用（ＨＩ）クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよびＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）。
【００８４】
上述のように、タンパク質精製は通常３段階からなる：所望のタンパク質が粗精製の細胞溶解物からまたは細胞培養培地から単離される捕獲工程；タンパク質がサイズまたは他の物理的／化学的性質が類似するコンタミナントから単離される中間の工程；そして最後の磨き工程。それぞれの精製ステージは特定のタンパク質に最も適している決まったクロマトグラフィー技術およびビーズサイズを有する。
【００８５】
中間の工程は、成分の適切な分離のためにより高度な分解能を必要とする。一般的にビーズサイズは分解能と逆に相関する；小さなビーズサイズはしたがってこのステージにおいてより適当である。ＩＥＸおよびＨＩのような吸着技術は一般的に最初の２つの精製工程において使用される。ゲルろ過は通常磨き工程のために用意されており、そこにおいては少量の高度に濃縮されたサンプルがカラムに適用される。
【００８６】
溶出成分のピーク幅によって示されるように、樹脂を選択するための二つの考慮すべきファクターは、所望のタンパク質に対する選択性および効率性（efficiency）である。選択性は目的のタンパク質に相互作用し、そして結合する樹脂の能力を意味する。
【００８７】
樹脂の効率性は、成分をブロードなピークとしてではなく別個のピークとして溶出するためのクロマトグラフィーマトリックスの能力を意味する。高い効率性は、近接して溶出するタンパク質を精製する場合に不可欠であり、高い選択性と高い効率性との組み合わせが高い分解能を生む。
【００８８】
ゲルろ過（ＧＦ）（またはサイズ排除クロマトグラフィーと呼ぶ）は分子量にしたがって球状タンパク質を分離する（ポラス（Porath）ら（１９５９年））。ＧＦは物理的および化学的条件の多様さに基づき実施され、通常綿密なプロトコルは含まれない（スミス（Smith）ら（１９９８年）アマシャム バイオサイエンス Ａ（１９９８年））。タンパク質の水溶液は、溶出液の助けと共に標的タンパク質のサイズを基に選択されたポアサイズを含有する固相またはビーズから構成されるマトリックスを通過する。カラムによって「予測された（seen）」液体容量は、移動相（ビーズを取り囲む液体または「ボイド容量（void volume）」）および固定相（ビーズのポア内に含まれる液体）からなる。
【００８９】
大きすぎてビーズポアに入らない分子はボイド容量のみと接触し、したがってカラムから最初に溶出される。しかしながら最も小さい分子はポア中に拡散され総カラム容量と接触し、そして最後に溶出され、中間のサイズの分子はボイド容量および総カラム容量の間において溶出される。
【００９０】
ＧＦ媒体を選択するときに考慮すべき１つの要素はポアの排除限界または分子量限界である；この限界を超えたタンパク質は完全にポアから排除され、そして分離されない。いくつかの会社は架橋樹脂を提供しており、それは高圧条件において圧縮されず多孔性を失わないので高圧精製に有利である。ＧＦは他のタイプの液体クロマトグラフィーよりも幾つかの利点を有する。１つ目はこの技術を用いて精製されうるタンパク質のサイズ上限が高いこと；２つ目はタンパク質を変性させる有機溶媒の使用を必要としないことである。
【００９１】
ＧＦクロマトグラフィーはしかしながら微調整が困難であろう。さらに、タンパク質の分解能はカラムに適用するサンプル容量に依存する。例えば、希釈されたサンプルはこの技術によって精製することが困難である。最後に、ＧＦクロマトグラフィーは、分析からバルク精製レベルに直接的に拡大できない−大スケール精製にとって２つの不利点。
【００９２】
イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）は、高度な制御と特異性を提供する。ＩＥＸは、目的のタンパク質と、通常、共有結合で荷電基（charged group）を結合したアガロース、デキストラン、架橋セルロースおよび架橋アガロースなどの樹脂から構成されるイオン交換マトリックスとの間の荷電相互作用に基づく（アマシャム バイオサイエンス Ｂ（１９９８年））。
【００９３】
荷電基は種類（カチオン性およびアニオン性）および強度（強または弱）にしたがって分類され、強イオン交換媒体の電荷特性はｐＨによって変化しないが、弱イオン交換媒体ではサンプルのローディングキャパシティーが多様なｐＨにおいて失う電荷のために変化でき、タンパク質の結合を阻害する（アマシャム バイオサイエンス Ｂ（１９９８年））。最も広く使用されている荷電基は、弱アニオン性交換体のジエチルアミノエチル、弱カチオン性交換体のカルボキシメチル、強アニオン性交換体の四級アンモニウム、強カチオン性交換体の硫酸メチルが含まれる。他の荷電基も使用可能である。
【００９４】
イオン交換樹脂は選択的に逆電荷のタンパク質を結合する；つまり、負に荷電した樹脂は正のネット電荷（net positive charge）を有するタンパク質を結合し、その逆も同様である。この技術は５つのステップからなる：標的タンパク質結合にとって理想的なｐＨおよびイオン強度へのカラムの平衡化；カウンターイオン置換によるサンプルのカラムへの可逆的吸着；結合したタンパク質を置換するために緩衝液のｐＨまたはイオン強度を変更する溶出条件の導入；結合強度の順序（弱く結合したタンパク質が最初に溶出される）によるカラムからの物質の溶出；そして次の精製のためのカラムの再平衡化。研究者は、ＩＥＸプロトコルを標的タンパク質が選択的にカラムに結合するように（コンタミナントは通過するように）またはコンタミナントが吸着し標的タンパク質が選択的に溶出するようにデザインすることができる（アマシャム バイオサイエンス Ｂ（１９９８年））。
【００９５】
ＧＦクロマトグラフィーのように、ＩＥＸは水溶性条件において実施され、有機溶媒は必要としない。しかしながら、ＧＦとは異なりＩＥＸは高度な選択性を有する。定常相（樹脂）および移動相（緩衝液）の両方は精製の必要性にあわせて仕立て得る。緩衝液のｐＨおよび化学的組成は目的のタンパク質の性質に応じて調整され得る。ＩＥＸの主な利点の１つは、拡張性である：ＩＥＸは小スケールからプロセススケールレベルまで直接アップグレードさせることが可能である。さらには、ＩＥＸ樹脂は相対的に高価ではなくそしてバルク量で広く入手可能である。
【００９６】
疎水性相互作用（ＨＩ）クロマトグラフィーは、タンパク質表面の露出した疎水性部分と樹脂に結合した疎水性リガンドとの間の相互作用に基づくものである。疎水性吸着の機構はよく理解されていないが、このプロセスを説明するためのいくつかの理論があり、それら理論の全てがそれらの核心においてタンパク質−リガンド複合体を取り囲んでいる水分子の構造の増加（アマシャム バイオサイエンス（１９９３年））を有する。
【００９７】
ＨＩのプロセスは、タンパク質をほぐし疎水性部位を露出させる高塩濃度緩衝液の使用を伴う。タンパク質はカラムの疎水性リガンドに保持され、塩濃度が低下しつつある緩衝液勾配にさらされる。塩濃度が低くなるとタンパク質はその自然な（native）構造に戻り結局カラムから溶出される。
【００９８】
ＨＩ樹脂の選択性は疎水性リガンドの構造に依存する。直鎖アルキルリガンドおよびアリールリガンドが使用され、一般的にタンパク質の結合は鎖長の増加に伴って増加する（アマシャム バイオサイエンス（１９９３年））。理想的な樹脂の選択は標的タンパク質の化学に依存する。適切な疎水性リガンドを発見することは経験的なプロセスである。
【００９９】
少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質は、他のクロマトグラフィー分離工程由来のフラクションを原料として用い、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂を用いて本発明により精製され得る。
【０１００】
ポリペプチドまたはタンパク質に関して本明細書において使用される用語「精製された」は、絶対的な純度（absolute purity）（均質調製品（homogeneous preparation）など）のみを意味するのではなく；かわりに、ポリペプチドが天然の環境よりも相対的に純粋であることを意味する。好ましくは、ポリペプチドまたはタンパク質は、約２倍、約３倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍または約１００倍精製される。最も好ましくは、少なくとも一桁の精製、好ましくは２または３桁、そして、より好ましくは４または５桁が明確に期待される。
【０１０１】
当業者は日常の実験で、溶液、緩衝液組成、イオン強度、およびｐＨを、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌなどのＨＣＩＣ樹脂を用いて少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質の精製を向上させるために必要に応じて調整できることを認識するであろう。たとえば、タンパク質精製手法を発展させる場合を考慮するための重要な因子は、各個々の工程の拡張性であり、初めに多くのプロトコルが小スケール分析レベルで作成され、ついでバルク精製のためのプロセススケールに拡張される。ＨＣＩＣなどの多くの種類の樹脂がプロセススケール分離に使用できる。
【０１０２】
上述の手法および以下の実験的実施例はカラムクロマトグラフィーを利用しているが、当業者は、バッチプロセシングも使用できることを認識するであろう。
【０１０３】
ここまで本発明を説明したが、以下の実施例を参照することでより容易に理解されるであろう。この実施例は、説明の目的で提供され、本発明の限定を意図するものではない。
【実施例】
【０１０４】
実施例１
ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰの捕獲工程。
ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰは、２％血清含有培養培地において組換えＣＨＯクローンにより産生された。ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰは高度にグリコシル化されており、そして強酸性タンパク質である（等電点は約３）。
【０１０５】
ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ（バイオセプラ社製）は、疎水性／荷電誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）をベースとした樹脂である。この樹脂は抗体の精製のために特別にデザインされている（ボスチェッティら（２０００年）およびライフテクノロジーズ・インコーポレーテッド（２０００年））。中性のｐＨにおいて、抗体の疎水性捕獲（hydrophobic capture）は脂肪族−疎水性スペーサーと中性（荷電していない）ピリジン環との両方により生じる。その後ｐＨが低下したとき（すなわちｐＨ４まで）、リガンド中のピリジン環（ｐＫａは４．８）および結合したイムノグロブリン（等電点は６〜６．５の範囲）の両方は正電荷を帯びるようになり、その結果電荷反発力が生じ、そしてカラムから抗体の溶出が生じる。ＩＬ−１８ＢＰ中のイムノグロブリン様（Ｉｇ−様）ドメインの存在により、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂によるＩＬ−１８ＢＰ捕獲の可能性が調査された。
【０１０６】
ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラム（樹脂５ｍｌ）を、ｐＨ７．２のＰＢＳでプレ平衡化（流速は３ｍｌ／ｍｉｎ）した。ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰを含む濃縮された粗精製物（ＣＣＭ）（０．５ｍｇ／ｍｌのｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰおよび３２ｍｇ／ｍｌの総タンパク質）をプレ平衡化したＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムにロードした（流速は１ｍｌ／ｍｉｎ）。ローディング後、カラムを最初にｐＨ７．２のＰＢＳでカラムから出てくるフラクション中にタンパク質が検出（検出はＡ２８０）されなくなるまで洗浄し、そして次にイムノグロブリンの溶出のために製造者が推奨している低いｐＨの緩衝液（ｐＨ４．５の５０ｍＭ酢酸塩緩衝液、流速３ｍｌ／ｍｉｎ）で洗浄した。最初の洗浄（ｐＨ７．２）後にカラムから回収された物質中にＩＬ−１８ＢＰは検出されなかったことから、全てのＩＬ−１８ＢＰはカラムに全て結合したことを示唆している。タンパク質のピークは低いｐＨでの洗浄後に検出された（図１、ピーク１）。低いｐＨでの洗浄により溶出されたタンパク質のピークは、おそらく主としてイムノグロブリンが含まれておりｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰはまったく含まれていなかった（ＥＬＩＳＡにより監視）。ＩＬ−１８ＢＰがｐＨ４．５で溶出されないのは、イムノグロブリンとは対照的にＩＬ−１８ＢＰは強酸性（等電点は約３）であり、ｐＨ４．５はＩＬ−１８ＢＰが正電荷を帯びるよう誘導するのに充分な酸性ではない（タンパク質は荷電していないかまたは負電荷を帯びているかのいずれかである）。従って、カラムからＩＬ−１８ＢＰを溶出するために、タンパク質間の疎水性相互作用を弱めることができ、タンパク質の構造を安定化するために一般に使用されているプロピレングリコールをテストした。最初にカラムをインジェクション用の水（ＷＦＩ）で洗浄し、次にプロピレングリコール（ＰＧ）（メルク社製、プリス（puris.）カタログ番号１０７４７８）を３５％含有するｐＨ８．４の２０ｍＭリン酸塩緩衝液で洗浄した（流速は１ｍｌ／ｍｉｎ）。リン酸塩緩衝液を１リットル調製するためには、５．３６グラムのリン酸水素２ナトリウム７水和物（分子量２６８．０７、メルク社製、エクストラピュア、カタログ番号１０６５７４）、を０．８リットルのＷＦＩに溶解した。得られた溶液は６Ｍ ＨＣＬでｐＨ８．４±０．２まで滴定した。ＰＧ溶液をカラムに適用した後に、タンパク質のピーク、図１のピーク２（検出はＡ２８０）がカラムから溶出され、ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰが含まれることが明らかとなった（検出はＥＬＩＳＡ）。５０％のＰＧ溶液での付加的な溶出工程の適用によっては、カラムからのタンパク質のさらなる溶出は得られなかった。
【０１０７】
ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰを溶出するのに必要とされるプロピレングリコールの至適濃度は、次のスキーム中のひとつを用いて評価された：Ａ−５０％のＰＧを用いる１段階溶出、Ｂ−最初に３５％のＰＧを用い、ついで５０％のＰＧを用いる２段階溶出、Ｃ−最初に２５％のＰＧを用い、ついで５０％のＰＧを用いる２段階溶出。表３に要約される結果は、回収率（recovery）および精製因子が溶出工程において３５％のＰＧ溶液を用いることが最良であったことを示す（表３）。
【０１０８】
したがって、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂を用いたＣＣＭからのＩＬ−１８ＢＰの捕獲は、純度を向上させ（３４％）そしてよい回収率（８５％）の結果を示した。精製因子は２２であり、そして精製したｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰフラクションは比較的に幅の狭いピークとして溶出されたので（約１５ｍｌ）、容量測定濃度因子（volumetric concentration factor）は１．７倍に増加した（表３、図１）。ＩＬ−１８ＢＰ捕獲の種々の工程からのフラクション、たとえばロードした物、アンバウンドフラクション、酸性の洗浄フラクション（ｐＨ４．５の５０ｍＭ酢酸塩）、ＷＦＩ洗浄フラクションおよび３５％のＰＧで溶出されたピークはＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された（実施例５）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図２）により得られた結果は、ＥＬＩＳＡ／ブラフォード（ELISA over Braford）結果（表３）により得られた結果と一致しており、これは３５％のＰＧで溶出したタンパク質のピークフラクションではｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰが高度に濃縮されていることを示唆している。
【０１０９】
観測された高度な濃縮および精製因子（図２、ライン５ 溶出されたタンパク質、およびライン６ ＩＬ−１８ＢＰリファレンスタンパク質）は、おそらくＩｇ−様ドメインを通した、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂へのｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰの選択的な結合、酸性ｐＨでの効率のよい洗浄工程および選択的な溶出条件によるものである。
【０１１０】
捕獲のために使用した原料がＳＦＭ条件下で増殖させＩＬ−１８ＢＰを産生させたＣＨＯ細胞の収穫物である場合に、ＩＬ−１８ＢＰの高度な濃縮および精製の同様の結果が得られた（データは示さず）。
【０１１１】
【表４】
【０１１２】
実施例２
ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰ捕獲における種々のＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂バッチの試験。
ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂の性能のバッチ間（batch-to-batch）の一貫性を調べるために、３つの異なるＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂バッチをｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰ捕獲において試験した（バッチは＃Ａ１１２、＃Ａ１１３、＃Ａ１３０）。評価されたパラメーターは、ａ）樹脂キャパシティー、ｂ）純度、およびｃ）精製因子である。カラム（５ｍｌ ＨＲ１０カラム、ベッド高さは７ｃｍ）に１ｍｌ樹脂あたり２．５〜３．５ｍｇのｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰであるＩＬ−１８ＢＰ濃度でＣＭＭをロードした（実施例１のランニング条件を使用）。
【０１１３】
表４に示す結果は、３つのＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂バッチは全て同様のｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰの純度レベル、精製因子および濃度因子を生じたということを示す。カラムキャパシティーもまた３つの樹脂バッチ全てで同様であった（樹脂１ｍｌあたり約２ｍｇのｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰ、表４）。
【０１１４】
【表５】
【０１１５】
実施例３
ＩＬ−１８ＢＰの捕獲におけるＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムへの粗精製物のローディングに最適なｐＨの評価。
先に得られた実験上のキャパシティー（実施例２）は、樹脂１ｍｌあたりｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰは２．１〜２．４ｍｇの範囲であった（表４）。ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムを用いるとイムノグロブリンのフラクションはｐＨ６．１で溶出しはじめ、ｐＨ４でカラムから完全に溶質される（文献１および２）のに対して、我々の予備実験によると、ＩＬ−１８ＢＰはそのようなｐＨ範囲においてはカラムに結合したままである。我々は、この特徴はＩＬ−１８ＢＰに対するカラムのキャパシティーを増加させるためにＭＥＰ−ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムにＣＭＭをロードする間に利用できる、すなわちイムノグロブリンの樹脂に対する吸着をより少なくし、結果として樹脂に対するｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰのより多くの吸着を可能とする、と推論した。したがって、ｐＨ７．２のかわりにｐＨ６．１でＣＭＭをロードすることの効果を調査した。ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰを含有するＣＭＭのｐＨをＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムへの適用の前にｐＨ６．１に調整した。また、ローディングの前に、カラムをｐＨ６．１の緩衝液ＰＢＳで平衡化し、ローディングの後に同じ緩衝液で最初の洗浄を行った。
【０１１６】
これまでの実験において、ロードされたｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰの濃度は樹脂１ｍｌあたり約２ｍｇであったが、樹脂１ｍｌあたり約６ｍｇまでカラム中でのｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰの濃度を高めるためにカラムにロードするＣＣＭの容量を議論した。
【０１１７】
表６に要約されている結果はＩＬ−１８ＢＰに対する樹脂のキャパシティーは、ＣＣＭをｐＨ６．１でローディングした場合ｐＨ７．２でローディングした場合のキャパシティーと比較して少なくとも２倍上昇した（表６）。ＩＬ−１８ＢＰは幅の狭いピークとして溶出されるので（図３を参照、各３ｍｌの５つのフラクション）、濃度因子は２倍に増加した。
【０１１８】
これらの結果は ｐＨ６．１でのＣＣＭのロードによりキャパシティーが増加し、そして溶出されるＩＬ−ＢＰ１８の濃度も増加することを示す。
【０１１９】
【表６】
【０１２０】
実施例４
ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムを用いたｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰ捕獲におけるローディング速度の影響。
カラムへの粗精製物のローディング速度は、カラムの捕獲性能に影響し得るのであり、たとえば、高速でのローディングは操作においてはより便利であり、一方、低速でのローディングは収率を上昇させ得る。したがって、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムでのｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰ捕獲におけるローディング流速の影響を評価した。樹脂１ｍｌあたり６ｍｇのｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰを得るためにＣＭＭをカラムにロードした（先の実施例を参照）。ＣＭＭは１つ目の実験においては流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、２つ目の実験では３ｍｌ／ｍｉｎでロードされ、標準的な流速である１ｍｌ／ｍｉｎと比較された（表７）。流速３ｍｌ／ｍｉｎにおいては、流速１ｍｌ／ｍｉｎで回収したときと比較して、溶出フラクション中に回収したｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰは相当減少していた。流速０．５ｍｌ／ｍｉｎでのローディングは、流速１ｍｌ／ｍｉｎでのローディングと比較して、溶出フラクション中のｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰの量を顕著な増加はみられなかった。
【０１２１】
【表７】
【０１２２】
実施例５
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
精製した５μｇのｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰまたは２０μｌのクロマトグラフィーのフラクションをサンプル緩衝液４：１に希釈した。サンプルを９５℃で５分間インキュベートし、還元条件下または非還元条件下、１２％トリス−グリシン ＳＤＳ−ＰＡＧＥ調製済みゲルで分離した。ゲルは２０ｍＡの定電流で〜１．５時間流され、クマシーブルーまたはゲルコード（GELCODE）染色された。
【０１２３】
サンプル緩衝液×４；５０ｍｌのｐＨ６．８の０．１５Ｍトリス（３．２．１５、ＷＦＩで１：１３．３で希釈し、ｐＨ６．８に調整（3.2.15 diluted 1:13.3 with WFI adjusted to pH 6.8））中に、４グラムのＳＤＳ（３．１．１６）、２０グラムのスクロース（３．１．３２）、０．８ ＭのＤＴＴ（３．１．３１）および２０ｍｇのブロモフェノールブルー（３．１．３３）。
【０１２４】
ランニング緩衝液×１０；ｐＨ８．３の５００ｍｌの水（７．１０）中に、１５グラムのトリス塩酸（４．２．６６）、７２グラムのグリシン（４．２．２９）、５グラムのＳＤＳ（３．１．１６）。
【０１２５】
実施例６
ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰを検出するためのＥＬＩＳＡ
４℃で一晩、コーティング緩衝液中ＩＬ−１８ＢＰに対し作製した５μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体（モノクローナルは国際公開第０２／０９２００８号パンフレットで記述したとおりに作製され、プロテインＧカラムでアフィニティー精製された）でマイクロプレートをコートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、ブロッキング緩衝液でブロックした（下記を参照）。洗浄後、１００μｌのｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰサンプルの等分（aliquots）をウエルに加え、振とうしながら３７℃で１時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、そしてアッセイ緩衝液で１：５０００に希釈されたウサギ抗血清１００μｌを各ウエルに加えた。振とうしながら３７℃で１時間インキュベートした後、洗浄工程を繰り返し、そして結合した抗体をアッセイ緩衝液で１：１００００に希釈されたヤギ抗ウサギに結合された（cojugated）ＨＲＰで検出した。１００μ／ウェルのＨＲＰ−コンジュゲート（HRP-conjugate）をプレートに加え、振とうしながら３７℃で１時間インキュベートした。ついでプレートを洗浄し、発色反応（colour reaction）を１２５μｌ／ウェルのＯＰＤ基質溶液を加えることで展開した。１２５μｌ／ウェルの４Ｎ ＨＣｌを加えることで反応を停止させた。吸光度はＥＬＩＳＡリーダー中、４９２ｎｍで測定された。免疫精製された（immunopurified）ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰ−Ｈｉｓのバッチ由来のサンプルを、このアッセイの展開中、リファレンスサンプルとして使用した。免疫精製したリファレンススタンダードのタンパク質含有量を吸収係数（extinction coefficient）１．２６ＯＤ／ｍｇを用いて分光法によりＡ２８０の波長で測定した。検量線は標準ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰをそれぞれのアッセイのためのアッセイ緩衝液において２０ｎｇ／ｍｌから０．３ｎｇ／ｍｌまでの範囲でアッセイ緩衝液を用いて系列希釈することで作製した。
【０１２６】
ブロッキング緩衝液−ＢＳＡ希釈物／ブロッキング溶液濃縮物（３．１．５０）を１：１０に希釈。
【０１２７】
アッセイ緩衝液−ＢＳＡ希釈剤／ブロッキング溶液濃縮物（３．１．５０）を１：１５に希釈。
【０１２８】
実施例７
逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分析
ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰフラクションの同定および精製は、ＲＰ−ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣカラム スーペルコシル（Supelcosil）ＬＣ３０８、カタログ番号５８１０、４．６ｍｍ、ＩＤＸ５ｃｍ、ロット＃Ｃ１７５、スーペルコ（Supelco）社製、米国）カラムを用いて次のように行った：２０μｇのｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰをカラムにインジェクトし、０．１％のＴＦＡ（トリフルオロ酢酸、ベーカー（Baker）社製、カタログ番号９４７０−０１）中、１０〜１００％プロパノールのグラディエントを用い分離した。
【０１２９】
実施例８
ＭＲＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムによるｒ−ＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラの捕獲
ＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラ（または「ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６」もしくは「ＩＬ−６キメラ」とも呼ばれる）はキメラ分子であって、インターロイキン６に融合されたＩｇ−様ドメインを有するインターロイキン６受容体の可溶性部位からなる（チェバスら（１９９７年）およびコレットら（１９９９年））。ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムへのｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラの結合を調査した。ローディングに用いた原料は、浄化および１０ｋＤａの膜による２０倍濃縮後に得られた２％のＦＢＳ中ＣＨＯプロジューサー細胞の粗精製収穫物である（ＣＣＭ）。
【０１３０】
ＣＨＯ細胞により産生されたｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラの粗精製収穫物（ＣＣＭ）を、ＰＢＳで平衡化されたＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラム（ライフテクノロジーズ社製、カタログ番号１２０３５）上にロードした。ＰＢＳでカラムを洗浄した後に捕獲された物質を２〜５カラムベッド（2-5 column）容量の３５％プロピレングリコール（ＰＧ）を含有するｐＨ８．４の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で溶出した。ローディングおよび溶出条件はｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰ捕獲工程と同様であった（下記を参照）。溶出されたフラクション中のタンパク質量はＥＬＩＳＡおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１３１】
より具体的には、１ｍｌのカラムを２０ｍｌのＰＢＳで平衡化し、４ｍｌのｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラ粗精製収穫物をロードした。用いた流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎであった。カラムを２０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、結合した物質をｐＨ８．４の２０ｍＭリン酸塩中３５％のプロピレングリコールを含む溶出緩衝液で溶出した。クロマトグラフィープロファイル（chromatography profile）は図４に示す。アンバウンドおよび溶出されたフラクションを回収し、ＥＬＩＳＡおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。クマシーブルーによるゲル染色を図５に描く。
【０１３２】
表１はクロマトグラフィーの結果を要約している。
【０１３３】
【表８】
【０１３４】
キャパシティーの結果となるこれらの条件は上記のｍｌ樹脂あたり２ｍｇのｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒで、収率はおよそ７２％および精製因子は約９４倍である。
【０１３５】
結果は、粗精製収穫物中においては基本的に検出不可能であるｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラ（図５）は、溶出フラクションにおける主要なバンドの１つである（ＥＬＩＳＡで９４倍精製）ことが明らかとなった。
【０１３６】
ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌがｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒ捕獲に適している樹脂であることが発見された。
【０１３７】
ｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラ中Ｉｇ−様ドメインのＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムにおける寄与を評価するために、ＩＬ−６を産生するＣＨＯ細胞の粗精製収穫物を完全なｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒキメラと同様の条件下でＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムにロードした。Ｉｇ−様ドメインを欠くＩＬ−６はカラムＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムに結合しなかった。この結果は、Ｉｇ−様ドメインがＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムによる捕獲に必要不可欠であることを示す。
【０１３８】
実施例９
ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムによるｒ−β−ガラクトシダーゼの捕獲。
もう１つの実験において、Ｉｇ−様ドメインを有するバクテリアのタンパク質、β−ガラクトシダーゼのＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムへの結合を調べた。大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ロッシュ・ダイアグノスティックス社製、カタログ番号５６７７７９）を、無血清培地（ＳＦＭ）ＰｒｏＣＨＯ−５に０．６２５ｍｃｇ／ｍｌで加えた。
【０１３９】
ＳＦＭ中のβ−ガラクトシダーゼ４ｍｌを２０ｍｌのＰＢＳで平衡化した１ｍｌのカラムにロードした。用いた流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎであった。カラムを２０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、結合した物質をｐＨ８．４の２０ｍＭリン酸塩中３５％プロピレングリコールを含む溶出緩衝液を用いて溶出した。クロマトグラフィープロファイルは図６に示す。アンバウンドおよび溶出されたフラクションを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。クロマトグラフィーの分離による種々のフラクション、リファレンス物質および分子量マーカーを含む図７に示されているゲルはクマシーブルーで染色される。結果は、β−ガラクトシダーゼが効率よくＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムに結合すること、およびβ−ガラクトシダーゼタンパク質が３５％のＰＧにより効率よく溶出されることを示す。
【０１４０】
したがって、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムはβ−ガラクトシダーゼの精製に適している。
【０１４１】
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【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラム上での２段階（３５％〜５０％）プロプレングリコール（ＰＧ）溶出におけるＩＬ−１８ＢＰの捕獲において得られたクロマトグラムを示す。実行データ（Run Data）：カラムベッド容量：５ｍｌ。平衡緩衝液：ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．２、１０×ＰＢＳの１：１０希釈により調製される、ＩＰＬコード番号Ｓ８８ＲＤ００５−流速３ｍｌ／ｍｉｎ。ロード：０．５０ｍｇ／ｍｌのｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰ（ＥＬＩＳＡ）および３２ｍｇ／ｍｌ総タンパク質（ブラフォード）を含有する濃縮粗精製物（ＣＭＭ）−流速１ｍｌ／ｍｉｎ。洗浄：１）ＰＢＳ ｐＨ７．２、２）５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ４．５（ピーク１）、３）インジェクション用の水（ＷＦＩ）−全ての洗浄の流速は３ｍｌ／ｍｉｎ。第１溶出：ｐＨ８．４の２０ｍＭリン酸塩緩衝液中３５％のプロピレングリコール（ピーク２）−流速１ｍｌ／ｍｉｎ。第２溶出：５０％のＰＧ中で。左の縦軸はＡ２８０での吸収（タンパク質のｍＡＵユニット）を示し、右縦軸は伝導度（ｍＳ／ｃｒｒユニット）を示し、横軸はカラムを通過して流れる容量（ｍｌ）を示す。
【図２】ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムを用いたＩＬ−１８ＢＰの捕獲において得られたフラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分離したフラクション（resolved fractions）は図１に示される実験に由来する。レーン１）ロード、２）アンバウンド、３）ｐＨ４．５の５０ｍＭ酢酸塩での洗浄、４）ＷＦＩでの洗浄、５）３５％ＰＧの溶出ピーク、６）リファレンスのｒｈＩＬ１８ＢＰ、７）分子量マーカー。長い矢印はｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰバンドを指し示す。
【図３】ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムのｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰ溶出ピークの分別（fractionation）のクロマトグラムを示す。実行データ：カラムベッド容量：５ｍｌ。平衡緩衝液：ｐＨ６．１のＰＢＳ−流速３ｍｌ／ｍｉｎ。ロード：ｐＨ６．１に滴定されたＣＭＭ ＣＨ００８−流速３ｍｌ／ｍｉｎ。洗浄：１）ＰＢＳ ｐＨ６．１、２）５０ｍＭ酢酸塩 ｐＨ４．１、３）ＷＦＩ−全ての洗浄の流速は３ｍｌ／ｍｉｎ。溶出：ｐＨ８．４の２０ｍＭリン酸塩緩衝液中３５％のプロピレングリコール−流速１ｍｌ／ｍｉｎ。図では溶出ピークの拡張を示しており、３ｍｌフラクションごとに回収した。左の縦軸はＡ２８０（タンパク質のｍＡＵユニット）での吸収を示し、右縦軸は伝導度（ｍＳ／ｃｒｒユニット）を示し、横軸はカラムを通過して流れる容量（ｍｌ）を示す。
【図４】ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラム上でのｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒ捕獲のクロマトグラムを示す。実行データ：カラムベッド容量：１ｍｌ。平衡緩衝液：ＰＢＳ−流速１ｍｌ／ｍｉｎ。ロード：０．８１ｍｇ／ｍｌのｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒを含有する粗精製収穫物（ＥＬＩＳＡ）−流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ。洗浄：ＰＢＳ−流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ。溶出：ｐＨ８．４の２０ｍＭリン酸塩緩衝液中３５％のプロピレングリコール−流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ。検出はＡ２８０。左の縦軸はＡ２８０（タンパク質のｍＡＵユニット）での吸収を示し、右縦軸は伝導度（ｍＳ／ｃｒｒユニット）を示し、横軸はカラムを通過して流れる容量（ｍｌ）を示す。
【図５】粗精製収穫物を含有するＦＢＳ中のｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６ＲキメラをロードしたＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムからのロードおよび溶出フラクションとのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。フラクションはゲルにロードされた−２０ｍｃｇ／レーン。レーン１）−ロード、２）および３）−アンバウンド物質、４）−３５％ＰＧの溶出ピーク、５）リファレンスの精製ｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、５ｍｃｇ／レーン、６）分子量（ＭＷ）マーカー。矢印はｒ−ｈＩＬ６−ＩＬ６Ｒバンドを指し示す。
【図６】ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラム上へのβ−ガラクトシダーゼ捕獲のクロマトグラムを示す。実行データ：カラムベッド容量：１ｍｌ。平衡緩衝液：ＰＢＳ−流速１ｍｌ／ｍｉｎ。ロード：０．６２５ｍｇ／ｍｌのβ−ガラクトシダーゼを含有する無血清培地（ＳＦＭ）−流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ。洗浄：ＰＢＳ−流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ。溶出：ｐＨ８．４の２０ｍＭリン酸塩緩衝液中３５％のプロピレングリコール−流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ。検出はＡ２８０。左の縦軸はＡ２８０（タンパク質のｍＡＵユニット）での吸収を示し、右縦軸は伝導度（ｍＳ／ｃｒｒユニット）を示し、横軸はカラムを通過して流れる容量（ｍｌ）を示す。
【図７】ＳＦＭ（ＰｒｏＣＨＯ５）中のβ−ガラクトシダーゼをロードしたＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムからのロードおよび溶出フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。フラクションは総タンパク質に基づきゲルにロードされた−２０ｍｃｇ／レーン。レーン１）ロード、２）〜４）アンバウンド、５）３５％ＰＧの溶出ピーク、６）リファレンスの精製β−ガラクトシダーゼ、５ｍｃｇ／レーン、７）分子量マーカー。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）目的のタンパク質を含有する生物学的液体に疎水性電荷クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）樹脂を接触させる工程、
ｂ）アンバウンドのコンタミナントを除去するために樹脂を洗う工程、
ｃ）酸性ｐＨを有する溶液または有機溶媒を含む溶液により樹脂を処理することにより目的のタンパク質を溶出させる工程
を含む、生物学的液体から１と１０の間のイムノグロブリン様（Ｉｇ−様）ドメインを有する目的の非イムノグロブリンタンパク質の精製または捕獲方法。
【請求項２】
工程ａ）で用いられるＨＣＩＣ樹脂が、ＭＥＰ−ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂である請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程ｃ）で用いられる有機溶媒が、プロピレングリコールである請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
溶液中のプロピレングリコール濃度が、約２５％と５０％の間にある請求項３記載の方法。
【請求項５】
工程ａ）が、酸性のｐＨで実施される請求項１、２、３または４記載の方法。
【請求項６】
用いられるｐＨが、約３と６．８の間にある請求項５記載の方法。
【請求項７】
洗浄工程ｂ）が、酸性のｐＨを有する溶液で実施される請求項１、２、３、４、５または６記載の方法。
【請求項８】
用いられるｐＨが、約３と６．８の間にある請求項７記載の方法。
【請求項９】
生物学的液体が、細胞調製培養培地、細胞溶解物、細胞抽出物、組織抽出物、血漿、血清、乳汁、尿、腹水、脳脊髄液、野菜ジュース、植物抽出物または初期クロマトグラフィー分離工程由来のフラクションから選択される請求項１、２、３、４、５、６、７または８記載の方法。
【請求項１０】
目的のタンパク質が、１〜７のＩｇ−様ドメインを有する請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９記載の方法。
【請求項１１】
目的のタンパク質が、ＩＬ−１８ＢＰ、ＮＣＡＭ、フィブロネクチンタイプＩＩＩ、ＩＣＡＭ−１、ｍａｄＣＡＭ−１、ＰＥ ＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、タイチン、カドヘリン、ニューロカン、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＯＳＭＲ、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ｈＰＤＧＦ受容体、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣタンパク質、ミクログロブリン−β、ＣＴＬＡ４、Ｂ７活性化因子、ニューレグリン、凝集因子ＸＩＩＩ、ＮＦ−ｋＢ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、β−ガラクトシダーゼおよびスーパーオキシドディスムターゼ、または少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを含むそれらのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能性誘導体またはフラグメントから選択される請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０記載の方法。
【請求項１２】
タンパク質が、ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
タンパク質が、ＩＬ−６−ＩＬ６Ｒキメラである請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質が、β−ガラクトシダーゼである請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
溶出タンパク質の精製因子が、１１倍と９４倍の範囲にある請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４記載の方法。
【請求項１６】
溶出タンパク質の精製因子が、約９４倍である請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
溶出タンパク質の濃縮因子が、１．５倍と３．１倍の範囲にある請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６記載の方法。
【請求項１８】
溶出タンパク質の濃縮因子が、約３．１倍である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
溶出タンパク質の収率が、７３％と９８％の範囲にある請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８記載の方法。
【請求項２０】
溶出タンパク質の収率が、約８５％である請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
ａ）目的のタンパク質を含有する生物学的液体に疎水性電荷クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）樹脂を接触させる工程、
ｂ）アンバウンドのコンタミナントを除去するために樹脂を洗う工程、
ｃ）酸性ｐＨを有する溶液または有機溶媒を含む溶液により樹脂を処理することにより目的のタンパク質を溶出させる工程、
からなる生物学的液体から１と１０の間のイムノグロブリン様（Ｉｇ−様）ドメインを有する目的の非イムノグロブリンタンパク質を捕獲するためのＨＣＩＣの使用。
【請求項２２】
工程ａ）で用いられるＨＣＩＣ樹脂が、ＭＥＰ−ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂である請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
工程ｃ）で用いられる有機溶媒が、プロピレングリコールである請求項２１または２２記載の使用。
【請求項２４】
溶液中のプロピレングリコール濃度が、約２５％と５０％の間にある請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
工程ａ）が、酸性のｐＨで実施される請求項２１、２２、２３または２４記載の使用。
【請求項２６】
用いられるｐＨが、約３と６．８の間にある請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
洗浄工程ｂ）が、酸性のｐＨを有する溶液で実施される請求項２１、２２、２３、２４、２５または２６記載の使用。
【請求項２８】
用いられるｐＨが、約３と６．８の間にある請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
生物学的液体が、細胞調製培養培地、細胞溶解物、細胞抽出物、組織抽出物、血漿、血清、乳汁、尿、腹水、脳脊髄液、野菜ジュース、植物抽出物または初期クロマトグラフィー分離工程由来のフラクションから選択される請求項２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８記載の使用。
【請求項３０】
目的のタンパク質が、１〜７のＩｇ−様ドメインを有する請求項２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９記載の使用。
【請求項３１】
目的のタンパク質が、ＩＬ−１８ＢＰ、ＮＣＡＭ、フィブロネクチンタイプＩＩＩ、ＩＣＡＭ−１、ｍａｄＣＡＭ−１、ＰＥ ＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、タイチン、カドヘリン、ニューロカン、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＯＳＭＲ、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ｈＰＤＧＦ受容体、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣタンパク質、ミクログロブリン−β、ＣＴＬＡ４、Ｂ７活性化因子、ニューレグリン、凝集因子ＸＩＩＩ、ＮＦ−ｋＢ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、β−ガラクトシダーゼおよびスーパーオキシドディスムターゼ、または少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを含むそれらのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能性誘導体またはフラグメントから選択される請求項２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０に記載の使用。
【請求項３２】
タンパク質が、ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）である請求項３１記載の使用。
【請求項３３】
タンパク質が、ＩＬ−６−ＩＬ６Ｒキメラである請求項３１記載の使用。
【請求項３４】
タンパク質が、β−ガラクトシダーゼである請求項３１記載の使用。
【請求項３５】
溶出タンパク質の精製因子が、１１倍と９４倍の範囲にある請求項２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４記載の使用。
【請求項３６】
溶出タンパク質の精製因子が、約９４倍である請求項３５記載の使用。
【請求項３７】
溶出タンパク質の濃縮因子が、１．５倍と３．１倍の範囲にある請求項２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６記載の使用。
【請求項３８】
溶出タンパク質の濃縮因子が、約３．１倍である請求項３７記載の使用。
【請求項３９】
溶出タンパク質の収率が、７３％と９８％の範囲にある請求項２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７または３８記載の使用。
【請求項４０】
溶出タンパク質の収率が、約８５％である請求項３９記載の使用。
【請求項４１】
１と１０の間のイムノグロブリン様（Ｉｇ−様）ドメインを有する目的の非イムノグロブリンタンパク質であって請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０記載の方法によって生物学的液体から精製または捕獲されたものを含む精製タンパク質調製品。
【請求項４２】
目的のタンパク質が、ＩＬ−１８ＢＰ、ＮＣＡＭ、フィブロネクチンタイプＩＩＩ、ＩＣＡＭ−１、ｍａｄＣＡＭ−１、ＰＥ ＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、タイチン、カドヘリン、ニューロカン、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＯＳＭＲ、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ｈＰＤＧＦ受容体、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣタンパク質、ミクログロブリン−β、ＣＴＬＡ４、Ｂ７活性化因子、ニューレグリン、凝集因子ＸＩＩＩ、ＮＦ−ｋＢ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、β−ガラクトシダーゼおよびスーパーオキシドディスムターゼまたはアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能性誘導体または少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを含むそれらのフラグメントから選択される請求項４１記載の精製タンパク質調製品。
【請求項４３】
タンパク質が、ＩＬ−１８ＢＰである請求項４２記載のタンパク質調製品。
【請求項４４】
タンパク質が、ＩＬ−６−ＩＬ６Ｒである請求項４２記載のタンパク質調製品。
【請求項４５】
タンパク質が、β−ガラクトシダーゼである請求項４２記載のタンパク質調製品。
【請求項１】
ａ）目的のタンパク質を含有する生物学的液体に疎水性電荷クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）樹脂を接触させる工程、
ｂ）アンバウンドのコンタミナントを除去するために樹脂を洗う工程、
ｃ）酸性ｐＨを有する溶液または有機溶媒を含む溶液により樹脂を処理することにより目的のタンパク質を溶出させる工程
を含む、生物学的液体から１と１０の間のイムノグロブリン様（Ｉｇ−様）ドメインを有する目的の非イムノグロブリンタンパク質の精製または捕獲方法。
【請求項２】
工程ａ）で用いられるＨＣＩＣ樹脂が、ＭＥＰ−ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂である請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程ｃ）で用いられる有機溶媒が、プロピレングリコールである請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
溶液中のプロピレングリコール濃度が、約２５％と５０％の間にある請求項３記載の方法。
【請求項５】
工程ａ）が、酸性のｐＨで実施される請求項１、２、３または４記載の方法。
【請求項６】
用いられるｐＨが、約３と６．８の間にある請求項５記載の方法。
【請求項７】
洗浄工程ｂ）が、酸性のｐＨを有する溶液で実施される請求項１、２、３、４、５または６記載の方法。
【請求項８】
用いられるｐＨが、約３と６．８の間にある請求項７記載の方法。
【請求項９】
生物学的液体が、細胞調製培養培地、細胞溶解物、細胞抽出物、組織抽出物、血漿、血清、乳汁、尿、腹水、脳脊髄液、野菜ジュース、植物抽出物または初期クロマトグラフィー分離工程由来のフラクションから選択される請求項１、２、３、４、５、６、７または８記載の方法。
【請求項１０】
目的のタンパク質が、１〜７のＩｇ−様ドメインを有する請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９記載の方法。
【請求項１１】
目的のタンパク質が、ＩＬ−１８ＢＰ、ＮＣＡＭ、フィブロネクチンタイプＩＩＩ、ＩＣＡＭ−１、ｍａｄＣＡＭ−１、ＰＥ ＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、タイチン、カドヘリン、ニューロカン、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＯＳＭＲ、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ｈＰＤＧＦ受容体、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣタンパク質、ミクログロブリン−β、ＣＴＬＡ４、Ｂ７活性化因子、ニューレグリン、凝集因子ＸＩＩＩ、ＮＦ−ｋＢ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、β−ガラクトシダーゼおよびスーパーオキシドディスムターゼ、または少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを含むそれらのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能性誘導体またはフラグメントから選択される請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０記載の方法。
【請求項１２】
タンパク質が、ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
タンパク質が、ＩＬ−６−ＩＬ６Ｒキメラである請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質が、β−ガラクトシダーゼである請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
溶出タンパク質の精製因子が、１１倍と９４倍の範囲にある請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４記載の方法。
【請求項１６】
溶出タンパク質の精製因子が、約９４倍である請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
溶出タンパク質の濃縮因子が、１．５倍と３．１倍の範囲にある請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６記載の方法。
【請求項１８】
溶出タンパク質の濃縮因子が、約３．１倍である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
溶出タンパク質の収率が、７３％と９８％の範囲にある請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８記載の方法。
【請求項２０】
溶出タンパク質の収率が、約８５％である請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
ａ）目的のタンパク質を含有する生物学的液体に疎水性電荷クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）樹脂を接触させる工程、
ｂ）アンバウンドのコンタミナントを除去するために樹脂を洗う工程、
ｃ）酸性ｐＨを有する溶液または有機溶媒を含む溶液により樹脂を処理することにより目的のタンパク質を溶出させる工程、
からなる生物学的液体から１と１０の間のイムノグロブリン様（Ｉｇ−様）ドメインを有する目的の非イムノグロブリンタンパク質を捕獲するためのＨＣＩＣの使用。
【請求項２２】
工程ａ）で用いられるＨＣＩＣ樹脂が、ＭＥＰ−ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂である請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
工程ｃ）で用いられる有機溶媒が、プロピレングリコールである請求項２１または２２記載の使用。
【請求項２４】
溶液中のプロピレングリコール濃度が、約２５％と５０％の間にある請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
工程ａ）が、酸性のｐＨで実施される請求項２１、２２、２３または２４記載の使用。
【請求項２６】
用いられるｐＨが、約３と６．８の間にある請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
洗浄工程ｂ）が、酸性のｐＨを有する溶液で実施される請求項２１、２２、２３、２４、２５または２６記載の使用。
【請求項２８】
用いられるｐＨが、約３と６．８の間にある請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
生物学的液体が、細胞調製培養培地、細胞溶解物、細胞抽出物、組織抽出物、血漿、血清、乳汁、尿、腹水、脳脊髄液、野菜ジュース、植物抽出物または初期クロマトグラフィー分離工程由来のフラクションから選択される請求項２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８記載の使用。
【請求項３０】
目的のタンパク質が、１〜７のＩｇ−様ドメインを有する請求項２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９記載の使用。
【請求項３１】
目的のタンパク質が、ＩＬ−１８ＢＰ、ＮＣＡＭ、フィブロネクチンタイプＩＩＩ、ＩＣＡＭ−１、ｍａｄＣＡＭ−１、ＰＥ ＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、タイチン、カドヘリン、ニューロカン、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＯＳＭＲ、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ｈＰＤＧＦ受容体、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣタンパク質、ミクログロブリン−β、ＣＴＬＡ４、Ｂ７活性化因子、ニューレグリン、凝集因子ＸＩＩＩ、ＮＦ−ｋＢ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、β−ガラクトシダーゼおよびスーパーオキシドディスムターゼ、または少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを含むそれらのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能性誘導体またはフラグメントから選択される請求項２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０に記載の使用。
【請求項３２】
タンパク質が、ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）である請求項３１記載の使用。
【請求項３３】
タンパク質が、ＩＬ−６−ＩＬ６Ｒキメラである請求項３１記載の使用。
【請求項３４】
タンパク質が、β−ガラクトシダーゼである請求項３１記載の使用。
【請求項３５】
溶出タンパク質の精製因子が、１１倍と９４倍の範囲にある請求項２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４記載の使用。
【請求項３６】
溶出タンパク質の精製因子が、約９４倍である請求項３５記載の使用。
【請求項３７】
溶出タンパク質の濃縮因子が、１．５倍と３．１倍の範囲にある請求項２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６記載の使用。
【請求項３８】
溶出タンパク質の濃縮因子が、約３．１倍である請求項３７記載の使用。
【請求項３９】
溶出タンパク質の収率が、７３％と９８％の範囲にある請求項２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７または３８記載の使用。
【請求項４０】
溶出タンパク質の収率が、約８５％である請求項３９記載の使用。
【請求項４１】
１と１０の間のイムノグロブリン様（Ｉｇ−様）ドメインを有する目的の非イムノグロブリンタンパク質であって請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０記載の方法によって生物学的液体から精製または捕獲されたものを含む精製タンパク質調製品。
【請求項４２】
目的のタンパク質が、ＩＬ−１８ＢＰ、ＮＣＡＭ、フィブロネクチンタイプＩＩＩ、ＩＣＡＭ−１、ｍａｄＣＡＭ−１、ＰＥ ＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、タイチン、カドヘリン、ニューロカン、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＯＳＭＲ、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ｈＰＤＧＦ受容体、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣタンパク質、ミクログロブリン−β、ＣＴＬＡ４、Ｂ７活性化因子、ニューレグリン、凝集因子ＸＩＩＩ、ＮＦ−ｋＢ、ＩＬ６−ＩＬ６Ｒ、β−ガラクトシダーゼおよびスーパーオキシドディスムターゼまたはアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能性誘導体または少なくとも１つのＩｇ−様ドメインを含むそれらのフラグメントから選択される請求項４１記載の精製タンパク質調製品。
【請求項４３】
タンパク質が、ＩＬ−１８ＢＰである請求項４２記載のタンパク質調製品。
【請求項４４】
タンパク質が、ＩＬ−６−ＩＬ６Ｒである請求項４２記載のタンパク質調製品。
【請求項４５】
タンパク質が、β−ガラクトシダーゼである請求項４２記載のタンパク質調製品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００７−５２３８８２（Ｐ２００７−５２３８８２Ａ）
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２２４９６（Ｐ２００６−５２２４９６）
【出願日】平成１６年８月５日（２００４．８．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００４／０００７３２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１４６２１
【国際公開日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【出願人】（３０３０６６９５４）アプライド・リサーチ・システムズ・エイアールエス・ホールディング・ナムローゼ・フェンノートシャップ (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月５日（２００４．８．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００４／０００７３２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１４６２１
【国際公開日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【出願人】（３０３０６６９５４）アプライド・リサーチ・システムズ・エイアールエス・ホールディング・ナムローゼ・フェンノートシャップ (4)
【Ｆターム（参考）】
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