インターフェロン誘導分子ＩＰＳ−１
【課題】β−インターフェロン（ＩＦＮβ）等のＩ型ＩＦＮの産生を誘導する新規なシグナル伝達分子を及びその遺伝子を提供すること。
【解決手段】Ｉ型ＩＦＮ誘導物質のハイスループットスクリーニングにより、新規分子ＩＰＳ−１を同定した。ＩＰＳ−１の過剰発現は、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７及びＮＦ−ｋＢの活性化を介して、Ｉ型ＩＦＮ及びＩＦＮ誘導性遺伝子を産生して、抗ウイルス応答を誘導した。ＴＢＫ１及びＩＫＫｉは、ＩＰＳ−１が媒介するＩ型ＩＦＮプロモーター活性化に必須であった。ＩＰＳ−１の発現は、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子の内因性プロモーターを刺激した。ＩＰＳ−１は、ＲＩＧ−Ｉと会合するＮ末端ＣＡＲＤ様ドメインと、ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１をリクルートするＣ末端エフェクタードメインとの２つのドメインからなる。ＩＰＳ−１は、ＲＩＧ−Ｉ依存性抗ウイルス応答を媒介する新規アダプタータンパク質であると考えられる。
【解決手段】Ｉ型ＩＦＮ誘導物質のハイスループットスクリーニングにより、新規分子ＩＰＳ−１を同定した。ＩＰＳ−１の過剰発現は、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７及びＮＦ−ｋＢの活性化を介して、Ｉ型ＩＦＮ及びＩＦＮ誘導性遺伝子を産生して、抗ウイルス応答を誘導した。ＴＢＫ１及びＩＫＫｉは、ＩＰＳ−１が媒介するＩ型ＩＦＮプロモーター活性化に必須であった。ＩＰＳ−１の発現は、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子の内因性プロモーターを刺激した。ＩＰＳ−１は、ＲＩＧ−Ｉと会合するＮ末端ＣＡＲＤ様ドメインと、ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１をリクルートするＣ末端エフェクタードメインとの２つのドメインからなる。ＩＰＳ−１は、ＲＩＧ−Ｉ依存性抗ウイルス応答を媒介する新規アダプタータンパク質であると考えられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｉ型インターフェロン誘導分子ＩＰＳ−１及びそれをコードするＩＰＳ−１遺伝子、ＩＰＳ−１遺伝子を発現することができる形質転換体等に関する。
【０００２】
また本発明は、Ｉ型インターフェロン誘導分子ＩＰＳ−１及びそれをコードするＤＮＡで形質転換した宿主細胞で発現させた組換えタンパク質を用いたＩ型ＩＦＮプロモーターを活性化する方法や、ＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物の抗ウイルス応答機能が喪失したモデル動物としての使用方法等に関する。
【背景技術】
【０００３】
ウイルスやバクテリア等の微生物病原体に対する自然免疫応答は、細胞発現型認識レセプター（ＰＲＲ）が、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれる侵入病原体の特異構造を認識することによって惹起される（例えば、非特許文献１及び２参照）。ＰＡＭＰを認識すると、ＰＲＲは、細胞内シグナル伝達経路を活性化し、炎症誘発性サイトカイン及びＩ型ＩＦＮの誘導と共に、適応免疫の発達に関与する樹状細胞（ＤＣ）の成熟を導く（例えば、非特許文献３参照）。その中で、ウイルス感染後のＩ型ＩＦＮ及びＩＦＮ誘導性遺伝子の産生は、抗ウイルス自然免疫応答の中核をなしている。ウイルスの複製中に産生された二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは、トール様レセプター（ＴＬＲ）によってＰＡＭＰとして認識される（例えば、非特許文献４参照）。ｄｓＲＮＡのＴＬＲ３への会合は、アダプター分子Ｔｒｉｆ（ＴＩＣＡＭ１としても知られている）のリクルートを導く（例えば、非特許文献５及び６参照）。Ｔｒｉｆは、その後ＴＢＫ１（ＮＡＫ又はＴ２Ｋとしても知られている）、及び関連ＩＫＫｉ（ＩＫＫε）プロテインキナーゼをリクルートし、転写因子ＩＲＦ３及びＩＲＦ７を触媒し、核に移動させる（例えば、非特許文献７及び８参照）。Ｔｒｉｆは、ＴＮＦレセプター結合因子（ＴＲＡＦ６）及びレセプターと相互作用するタンパク質１（ＲＩＰ１）も、直接相互作用によって集め、その後、ＩＫＫβ依存性リン酸化を介して転写因子のＮＦ−κＢファミリーを活性化し、ＮＦ−κＢ阻害分子（ＩκＢｓ）をプロテアソームによって破壊する（例えば、非特許文献９及び１０参照）。これらの転写因子は協調して、Ｉ型ＩＦＮをコードする遺伝子のプロモーターを刺激し、その結果抗ウイルス生体防御を導く。ウイルス性一重鎖ＲＮＡ及びＤＮＡが、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９によってそれぞれ認識され、形質細胞様ＤＣによってＩＦＮαを誘導することが立証された（例えば、非特許文献１１〜１３参照）。ＴＬＲ３と異なり、これらのＴＬＲは、ＭｙＤ８８を主要なアダプターとして共有している（例えば、非特許文献１４参照）。リガンド刺激に続き、ＭｙＤ８８は、ＩＲＡＫ１、ＴＲＡＦ６及びＩＲＦ７とシグナル複合体を形成する（例えば、非特許文献１５〜１７参照）。ＩＲＡＫ１は、ＩＲＦ７の核転移及び、ＩＦＮαの発現を刺激するＩＲＦキナーゼとして作用する（例えば、非特許文献１７参照）。
【０００４】
ウイルス性ｄｓＲＮＡは、ＴＬＲ非依存性細胞内センサーを介して細胞を活性化すると考えられている（例えば、非特許文献１８及び１９参照）。ＴＬＲ３が欠損しているＤＣ及び繊維芽細胞は、細胞内へのｄｓＲＮＡ導入後も、Ｉ型ＩＦＮを分泌する（例えば、非特許文献２０参照）。この分泌には、Ｔｒｉｆは必須でないが、ＴＢＫ１及びＩＲＦ３は必須であり（例えば、非特許文献２０〜２２参照）、ＴＬＲ３依存性経路も、ＴＬＲ３非依存性経路も、ＴＢＫ１に収束することを示している。最近、ＲＩＧ−Ｉは、細胞内ｄｓＲＮＡを感知するＰＲＲの新しいクラスとして作用する分子として同定された（例えば、非特許文献２３参照）。ＲＩＧ−Ｉは、カスパーゼをリクルートするドメイン（ＣＡＲＤ）様モジュールを２個有するＤＥｘＤ／Ｈｂｏｘ型ＲＮＡヘリカーゼである。へリカーゼドメインは、ｄｓＲＮＡの認識に関与していると考えられ、ＣＡＲＤは、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７及びＮＦ−κＢの活性化を導くダウンストリームシグナル伝達の開始に必須である（例えば、非特許文献２３参照）。ＲＩＧ−Ｉ欠損マウスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）及びセンダイウイルス（ＳｅＶ）の感染に対して、一貫してＩ型ＩＦＮを産生しなかった（例えば、非特許文献２４参照）。さらに、ウイルス感染に応答したＩＲＦ３及びＮＦ−κＢの活性化は、ＲＩＧ−Ｉ欠損細胞で障害されていた。したがって、ＲＩＧ−Ｉは、インビボの抗ウイルス応答に必須である。Ｍｄａ−５／ヘリカード（Helicard）は、ＲＩＧ−Ｉに類似した構造を有し、抗ウイルス応答の媒介に関与している（例えば、非特許文献２５及び２６参照）。これらのヘリカーゼは共同で、ウイルス感染を感知する細胞内センサーの新たなファミリーを構成している。さらに最近、Ｆａｓ関連デスドメイン（ＦＡＤＤ）欠損細胞で、細胞内ｄｓＲＮＡ刺激に応答したＩ型ＩＦＮの産生が障害されることが立証され、ＦＡＤＤ欠損細胞は、ウイルス感染に対し感受性があると考えられている（例えば、非特許文献２７参照）。さらに、細胞内でｄｓＲＮＡが媒介するＩＦＮ誘導には、ＲＩＰ１が必須である（例えば、非特許文献２７参照）。ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１がシグナル伝達複合体を形成することが立証されたので、これらの観察結果は、ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１が、ｄｓＲＮＡ依存性のシグナル伝達の主要な構成要素であることを示唆している。しかし、ＲＩＧ−ＩによるｄｓＲＮＡの認識が、どのようにＦＡＤＤ／ＲＩＰ１依存性及びＴＢＫ１依存性のＩ型ＩＦＮ誘導を導くのか明らかでなかった。
【０００５】
【非特許文献１】Annu Rev Immunol.20, 197-216, 2002
【非特許文献２】Annu Rev Immunol. 21,335-376, 2003
【非特許文献３】Nat Rev Immunol. 4, 499-511, 2004
【非特許文献４】Nature 413, 732-738. (2001).
【非特許文献５】J Immunol. 169, 6668-6672, 2002
【非特許文献６】Nat Immunol. 4, 161-167, 2003
【非特許文献７】Science 300, 1148-1151,2003; 8.
【非特許文献８】Nat Immunol. 4, 491-496, 2003
【非特許文献９】J Immunol. 171, 4304-4310, 2003;
【非特許文献１０】Nat Immunol 5, 503-507, 2004
【非特許文献１１】Science 303, 1526-1529, 2004
【非特許文献１２】Science 303, 1529-1531,2004
【非特許文献１３】J Immunol. 170, 3059-3064, 2003
【非特許文献１４】Int Immunol. 14, 1225-1231, 2002
【非特許文献１５】Nat Immunol. 5, 1061-1068, 2004
【非特許文献１６】Proc Natl Acad Sci USA. 101, 15416-15421, 2004
【非特許文献１７】J Exp Med. 201, 915-923, 2005
【非特許文献１８】Science 301, 640-643, 2003
【非特許文献１９】Nat Immunol. 4, 1223-1229, 2003
【非特許文献２０】J Exp Med. 199, 1641-1650, 2004
【非特許文献２１】J Exp Med. 199, 1651-1658, 2004
【非特許文献２２】Proc Natl Acad Sci USA 101, 233-238, 2004
【非特許文献２３】Nat Immunol. 5, 730-737, 2004
【非特許文献２４】Immunity (2005) in press
【非特許文献２５】Curr Biol. 12, 838-843, 2002
【非特許文献２６】Proc Natl Acad Sci USA. 101, 17264-17269, 2004
【非特許文献２７】Nature 432, 401-405, 2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、β−インターフェロン（ＩＦＮβ）等のＩ型ＩＦＮの産生を誘導する新規なシグナル伝達分子及びその遺伝子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、Ｉ型ＩＦＮ誘導物質のハイスループットスクリーニングにより、ＩＰＳ−１と命名した新規分子を同定した。ＩＰＳ−１の過剰発現は、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７及びＮＦ−ｋＢの活性化を介して、Ｉ型ＩＦＮ及びＩＦＮ誘導性遺伝子を産生して、抗ウイルス応答を誘導した。ＴＢＫ１及びＩＫＫｉは、ＩＰＳ−１が媒介するＩ型ＩＦＮプロモーター活性化に必須であった。さらに、ＩＰＳ−１の発現は、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子の内因性プロモーターを刺激した。ＩＰＳ−１は、ＲＩＧ−Ｉと会合するＮ末端ＣＡＲＤ様ドメインと、ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１をリクルートするＣ末端エフェクタードメインとの２つのドメインからなる。ｓｉＲＮＡによるＩＰＳ−１のノックダウンにより、ｄｓＲＮＡ刺激に対する抗ウイルス応答とウイルス感染が減少した。したがって、ＩＰＳ−１は、ＲＩＧ−Ｉ依存性抗ウイルス応答を媒介する新規アダプタータンパク質であると考えられる。
【０００８】
また、ＲＩＧ−Ｉは、ウイルス性ｄｓＲＮＡを感知するＴＬＲ３非依存性の細胞内センサーであるとされてきた（Nat Immunol. 5, 730-737, 2004参照）。ＲＩＧ−Ｉ欠損マウスは、ＶＳＶ、ＮＤＶ、及びＳｅＶ感染後にＩ型ＩＦＮの誘導が障害され（Immunity, 2005参照）、ＲＩＧ−Ｉがこれらのウイルスを感知する唯一のインビボのセンサーであることを示した。ＲＩＧ−Ｉの類縁体である、Ｍｄａ５／ヘリカードは、ウイルス認識にも関与している（Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17264-17269, 2004）。ＲＩＧ−ＩもＭｄａ５／ヘリカードも、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７及びＮＦ−κＢの活性化を導くダウンストリームシグナル伝達の開始に必須である、ＣＡＲＤ様モジュールを２個有している。ＲＩＧ−Ｉ及びＭｄａ５／ヘリカードは、類似したＣＡＲＤ様モジュールを含むシグナル伝達アダプターを用いることが示唆された。ＩＰＳ−１が、これらのタンパク質との相互作用を媒介する、Ｍｄａ／ヘリカード及びＲＩＧ−Ｉと相同性のあるＣＡＲＤ様ドメインを有することを見い出したことは、非常に興味深い。ＴＢＫ１及びＩＫＫｉの両方が欠損している細胞は、細胞内ｄｓＲＮＡ刺激やウイルス感染に応答して、ＩＲＦ３活性化も、ＩＦＮβ産生もしなかった（J Exp Med. 199, 1641-1650, 2004; J Exp Med. 199, 1651-1658, 2004; Proc Natl Acad Sci US A 101, 233-238, 2004）。さらに、ＩＰＳ−１は、ＴＢＫ−１及びＩＫＫｉが欠損している細胞で、ＩＦＮα及びＩＦＮβプロモーターを活性化しなかった。したがって、ＩＰＳ−１は、ＲＩＧ−ＩとＭｄａ５／ヘリカードとを、ＴＢＫ１及びＩＫＫｉを活性化するダウンストリーム分子に結合するアダプターとして作用しうる。ＲＩＧ−Ｉ△Ｃの過剰発現は、ＩＦＮβプロモーターの恒常的な活性化を導くが、全長ＲＩＧ−Ｉがプロモーターを活性化しないことは、以前に報告されている（Nat Immunol. 5, 730-737, 2004）。この観察結果は、ＲＩＧ−ＩのＣ末端領域が、ダウンストリームエフェクター分子との相互作用を防止する制御機能を有することを示唆している。ＩＰＳ−１は、常にＲＩＧ−Ｉ△Ｃと結合するが、全長ＲＩＧ−Ｉとは結合しない。したがって、ＩＰＳ−１は、刺激されていない状態では、ＲＩＧ−Ｉと結合しないが、刺激後は、ＲＩＧ−Ｉと複合体を形成し、シグナル伝達を開始すると考えられる。
【０００９】
最近、本来デスレセプターのＴＮＦレセプターファミリーのシグナル伝達分子として同定されているＦＡＤＤ及びＲＩＰ１が、細胞内ｄｓＲＮＡが媒介する機能に参画することが示された（Nature 432, 401-405, 2004）。免疫共沈澱分析で、ＩＰＳ−１はＴＢＫ１と直接会合しなかったが、そのＣ末端領域は、ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１と相互作用するようである。これらの観察結果は、ＩＰＳ−１はウイルス感染時にＣ末端エフェクタードメインを介してＦＡＤＤ及びＲＩＰ１をリクルートし、ＴＢＫ１及びＩＫＫｉ依存性ＩＲＦ３リン酸化を惹起することを示唆した。一方、ＩＰＳ−１の過剰発現又はウイルス感染に応答したＮＦ−κＢの活性化は、ＴＢＫ１及びＩＫＫｉ欠損細胞で、正常であった。同時に、発現がＮＦ−κＢ依存性であるＩＬ−６のウイルス誘導が、これらの細胞で観察された。反対に、ＦＡＤＤ欠損細胞は、ウイルス感染時に、ＩＬ−６を産生せず（Nature 432, 401-405, 2004）、ＦＡＤＤの過剰発現は、ＴＢＫ１／ＩＫＫｉ二重欠損細胞においても、ＮＦ−κＢプロモーターを活性化した（非公開データ）。したがって、ＲＩＧ−Ｉ依存性のＮＦ−κＢ活性化は、ＴＢＫ１とは独立して、ＩＰＳ−１とＦＡＤＤのダウンストリームで起こりうるが、ＩＫＫβ活性化を導く分子メカニズムは明らかになっていない。
【００１０】
多くのウイルスが、ＩＦＮ誘導を拮抗する特異的タンパク質をコードするようである。例えば、ヒトＲＩＧ−Ｉは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡが誘導するＩＲＦ３活性化に関与している（J Virol. 79, 2689-2699, 2005; J Virol. 79, 3969-3978, 2005）。しかし、ＨＣＶのＮＳ３／４プロテアーゼはＩＲＦ３リン酸化の抑制に関与し、ＲＮＡが誘導するＩＦＮ産生をブロックする。パラミキソウイルスのＶタンパク質は、Ｍｄａ−５と会合し、ダウンストリームのシグナル伝達をブロックし、ＩＦＮ誘導を阻害することが示されている（Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17264-17269, 2004）。したがって、多くのウイルスタンパク質が、分解又はＦＡＤＤ又はＲＩＰ１等のダウンストリームシグナル伝達分子のリクルートを防止するために、ＩＰＳ−１が媒介するシグナル伝達経路を標的にすることによって拮抗しうる。さらに、細胞内へのグラム陽性菌、リステリア菌（ＬＭ）の感染が、ＴＢＫ−１依存的に、そしてＴＬＲ非依存的にＩ型ＩＦＮを誘導するようである（J Immunol. 173, 7416-7425, 2004; JImmunol. 174, 1602-1607, 2005）。ＬＭに応答したＩＦＮ誘導を惹起する細胞質レセプターはまだ同定されていないが、ＩＰＳ−１は、この細胞内バクテリアによってＩＦＮ誘導に関与している可能性がある。ＩＰＳ−１が、新たに同定された細胞質ＰＲＲのＲＩＧ−Ｉ及びＭｄａ５／ヘリカードファミリーのダウンストリームで、抗ウイルス自然免疫応答を誘導するアダプター分子として作用することを明らかにした。
【００１１】
すなわち本発明は、（１）(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又は(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質；をコードするＤＮＡや、（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、（３）配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡや、（４）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、（５）前記（２）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（これらＤＮＡを総称して「本件ＤＮＡ」ということがある）に関する。
【００１２】
また本発明は、（６）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、（７）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質や、（８）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質や、（９）組換えタンパク質であることを特徴とする前記（６）〜（８）のいずれか記載のタンパク質に関する（これらタンパク質を総称して「本件タンパク質」ということがある）。
【００１３】
また本発明は、（１０）前記（６）〜（９）のいずれか記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質又は融合ペプチドや、（１１）前記（１）〜（５）のいずれか記載のＤＮＡを含み、かつＩＰＳ−１を発現することができる組換えベクターや、（１２）組換えプラスミドベクターである前記（１１）記載の組換えベクターや、（１３）さらに、レポーター遺伝子を発現することができることを特徴とする前記（１１）又は（１２）記載の組換えベクターや、（１４）レポーター遺伝子が、ホタルルシフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする前記（１１）又は（１２）記載の組換えベクターや、（１５）前記（１１）〜（１４）のいずれか記載の組換えベクターが導入され、かつＩＰＳ−１を発現する形質転換体に関する。
【００１４】
本発明はまた、（１６）ＩＰＳ−１遺伝子を有する組換えベクターによって形質転換された形質転換体や、（１７）形質転換体が、哺乳類細胞由来であることを特徴とする前記（１５）又は（１６）記載の形質転換体や、（１８）哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞又はＭＥＦ細胞である前記（１７）に記載の形質転換体や、（１９）前記（６）〜（９）のいずれか記載のタンパク質又はその部分ポリペプチドを認識する抗体や、（２０）モノクローナル抗体であることを特徴とする前記（１９）記載の抗体や、（２１）ＩＰＳ−１遺伝子の機能が染色体上で欠損し、野生型において発現されるＩＰＳ−１を発現する機能が失われていることを特徴とするＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物や、（２２）げっ歯類動物であることを特徴とする前記（２１）記載のＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物や、（２３）げっ歯類動物が、マウスであることを特徴とする前記（２２）記載のＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物に関する。
【００１５】
さらに本発明は、（２４）（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、（ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｆ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；のいずれか記載ＤＮＡを、ＩＰＳ−１活性を有するタンパク質の製造に使用する方法や、（２５）（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質、（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質；のいずれか記載のタンパク質を用いて、Ｉ型ＩＦＮプロモーターを活性化する方法や、（２６）タンパク質が、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、（ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｆ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；のいずれか記載ＤＮＡで形質転換した宿主細胞で発現させた組換えタンパク質であることを特徴とする上記（２５）記載のＩＦＮβプロモーターを活性化する方法や、（２７）（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質、（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質；のいずれか記載のタンパク質を、Ｉ型ＩＦＮの製造に使用する方法や、（２８）タンパク質が、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、（ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｆ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；のいずれか記載ＤＮＡで形質転換した宿主細胞で発現させた組換えタンパク質であることを特徴とする上記（２７）記載の使用する方法や、（２９）ＩＰＳ−１遺伝子の機能を染色体上で欠損させたＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物の、Ｉ型ＩＦＮプロモーターの活性化による抗ウイルス応答機能が喪失したモデル動物としての使用方法や、（３０）非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする上記（２９）記載の抗ウイルス応答機能が喪失したモデル動物としての使用方法に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によると、ＩＦＮβ等のＩ型ＩＦＮの産生を誘導する新規なシグナル伝達分子ＩＰＳ−１及びＩＰＳ−１遺伝子を提供することができ、ＩＰＳ−１機能を標的とした薬剤は、ウイルス感染を制御するために、治療的に有用である。
【００１７】
また、本発明の本件ＤＮＡをＩＰＳ−１活性を有するタンパク質の製造に使用する方法や、本発明のＩＰＳ−１又はＩＰＳ−１をコードするＤＮＡで形質転換した宿主細胞で発現させた組換えタンパク質を用いたＩ型ＩＦＮプロモーターを活性化する方法や、本発明の本件タンパク質をＩ型ＩＦＮの製造に使用する方法は、ＩＰＳ−１が、ＩＦＮ−αをはじめとする各種サイトカイン産生の特異的な調節に対する治療上のターゲットとなる可能性を与え、ウイルス感染や自然免疫疾患への治療へ応用することができる。また、前記方法により、Ｉ型ＩＦＮプロモーターを活性化させてＩ型インターフェロン等を製造することも可能である。さらに、Ｉ型ＩＦＮプロモーターの活性化機能を阻害（又は増強）する化合物のスクリーニングに利用することが可能である。
【００１８】
また、本発明のＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物の抗ウイルス応答機能が喪失したモデル動物としての使用方法によれば、人工的に抗ウイルス応答機能が働かない状態を作り出すことができ、生体内におけるウイルス応答機能を明らかにするためや、ＲＮＡｉの作用機作の解明や、ウイルス感染症の治療方法の解明や、抗ウイルス薬をスクリーニングすることも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明のＤＮＡとしては、（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質ＩＰＳ−１をコードするＤＮＡ；（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；（Ｄ）配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＩＰＳ−１遺伝子ＤＮＡ；（Ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；又は（Ｆ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；の何れかのＤＮＡであれば特に制限されず、また、本発明のタンパク質としては、（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質ＩＰＳ−１；（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質；又は（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質；の何れかのタンパク質であれば特に制限されず、ここで「ＩＰＳ−１活性を有する」とは、Ｉ型ＩＦＮプロモーターを活性化する機能を有することを意味する。
【００２０】
上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。また、上記「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。
【００２１】
例えば、これら１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.以後 "モレキュラークローニング第２版" と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
【００２２】
上記「配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、配列番号２に示されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であれば特に制限されるものではないが、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上であることを意味する。
【００２３】
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、５０〜７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。
【００２４】
本発明のＩＰＳ−１遺伝子ＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１又は配列番号２に示される塩基配列又はアミノ酸配列情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該遺伝子が存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的の遺伝子を単離したり、あるいは、常法に従って化学合成により調製することができる。
【００２５】
具体的には、本発明のＩＰＳ−１ｍＲＮＡが多く発現する心臓及び骨格筋より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明の遺伝子に特有の適当なプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明の遺伝子を取得することができる。また、これらの細胞又は組織からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明の遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、実施例記載のハイスループットスクリーニング方法や、モレキュラークローニング第２版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。
【００２６】
また、上記（Ｂ）〜（Ｆ）のいずれかに示される塩基配列からなる本発明の変異遺伝子又は相同遺伝子としては、配列番号１に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡ断片を利用し、他の生物体等より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。その他、前述の変異ＤＮＡの作製方法により調製することもできる。
【００２７】
本発明のタンパク質の取得・調製方法は特に限定されず、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現している細胞又は組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。化学合成によりタンパク質を調製する場合には、例えば、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードするＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。
【００２８】
例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明のタンパク質を調製する場合、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。
【００２９】
さらに、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例を示す配列番号１に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。例えば、配列番号１に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡをプローブとしてヒト以外の生物より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニング後、発現ベクターに組み込み適当な宿主で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるタンパク質を製造することができる。
【００３０】
本発明の融合ペプチドとしては、上記本発明のタンパク質とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよい。マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本発明のペプチドの精製や、本発明のペプチドの検出や、本発明のペプチドに対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００３１】
本発明の組換えベクターとしては、前記本発明の遺伝子を含み、かつＩＰＳ−１を発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、本発明の組換えベクターは、本発明の遺伝子を発現ベクター、好ましくは発現プラスミドベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明の遺伝子を発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。
【００３２】
上記発現ベクターとして、例えば、ｐＣＭＶ６−ＸＬ３（OriGene Technologies Inc.社製）、ＥＧＦＰ-Ｃ１（Clontech社製）、ｐＧＢＴ−９(Clontech社製)、ｐｃＤＮＡＩ（フナコシ社製）、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７（Cytotechnology, 3,133, 1990）、ｐＣＤＭ８（Nature, 329, 840, 1987）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Invitrogen社製）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０３（J.Blochem., 101, 1307,1987）、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。また、プロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。さらに、プロモーターの下流に蛍光蛋白質をコードする遺伝子等のレポーター遺伝子を融合することができる。蛍光蛋白質としては、緑色蛍光蛋白質（Green Fluorescence Protein（ＧＦＰ））、赤色蛍光蛋白質（Cyan Fluorescence Protein（ＣＦＰ））、青色蛍光蛋白質（Blue Fluorescence Protein（ＢＦＰ））、黄色蛍光蛋白質（Yellow Fluorescence Protein（ＹＦＰ））、ルシフェラーゼ（luciferase）を例示することができる。
【００３３】
また、本発明の形質転換体としては、上記本発明の組換えベクターが宿主細胞に導入され、かつＩＰＳ−１を発現する形質転換体であれば特に制限されず、形質転換酵母、形質転換植物（細胞、組織、個体）、形質転換細菌、形質転換動物（細胞、組織、個体）を挙げることができるが、形質転換動物細胞が好ましい。
【００３４】
遺伝子工学により形質転換される株化された宿主細胞としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＭＥＦ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ１２７細胞、ＨＫＧ細胞、ヒト腎細胞株等が挙げられる。具体的には、ＣＨＯ−Ｋ1（チャイニーズハムスター卵巣細胞：ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、ＢＨＫ（ハムスター腎細胞：ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）、ＣＯＳ−７（ＣＶ−１Ｏｒｉｇｉｎ， ＳＶ−４０細胞：ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎細胞：ＡＴＣＣ ＣＣＬ８１）等があり、更にはマウスミエローマ細胞（Ｘ６３−Ａｇ８−６５３；Ｐ３Ｕ１）、ヒトリンパ芽球細胞（ＩＭ−９，ＡＴＣＣＣＣＬ１５９）、ヒトヒトハイブリドーマ作製用親細胞、ならびにこれらのｄｈｆｒ欠損株、ＨＧＰＲＴ欠損株、ウアバイン耐性株等を例示することができる。動物細胞への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（モレキュラークローニング第２版）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができる。
【００３５】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる（例えば、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manua1；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Bio/Technology, 6, 47(1988)等に記載）。バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ(インビトロジェン社製)等を用いることができる。組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
【００３６】
形質転換細菌の作製に用いられる細菌の宿主細胞の具体例としては、エッシェリヒア（Escherichia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、バチラス（Bacillus）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、セラチア（Serratia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、エルウニア（Erwinia）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属、ザイモモナス（Zymomonas）属等に属する微生物を挙げることができる。細菌宿主へ組換えベクターを導入する方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法やプロトプラスト法等を挙げることができる。
【００３７】
ＩＰＳ−１等の前記本発明のタンパク質又はその部分ポリペプチドを認識する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記ＩＰＳ−１等の前記本発明のタンパク質又はその部分ポリペプチドを抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等のＩＰＳ−１等の前記本発明のタンパク質又はその部分ポリペプチドに特異的に結合する抗体は、例えば、ＩＰＳ−１等の前記本発明のタンパク質の変異又は欠失に起因する疾病の診断やＩＰＳ−１等の分子機構を明らかにする上で有用である。
【００３８】
ＩＰＳ−１等の前記本発明のタンパク質又はその部分ポリペプチドに対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に該ＩＰＳ−１等の前記本発明のタンパク質又はその部分ポリペプチド若しくはエピトープを含む断片を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc.,1985）など任意の方法を用いることができる。以下にＩＰＳ−１等の前記本発明のタンパク質又はその部分ポリペプチドとして、ヒトＩＰＳ−１を例に挙げてＩＰＳ−１に対して特異的に結合するマウスのモノクローナル抗体、すなわち抗ヒトＩＰＳ−１モノクローナル抗体の作製方法を説明する。
【００３９】
上記抗ヒトＩＰＳ−１モノクローナル抗体は、抗ヒトＩＰＳ−１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをインビボ又はインビトロで常法により培養することにより生産することができる。例えば、インビボ系においては、齧歯動物、好ましくはマウス又はラットの腹腔内で培養することにより、またインビトロ系においては、動物細胞培養用培地で培養することにより得ることができる。インビトロ系でハイブリドーマを培養するための培地としては、ストレプトマイシンやペニシリン等の抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０又はＭＥＭ等の細胞培養培地を例示することができる。抗ヒトＩＰＳ−１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、ヒトＩＰＳ−１を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、免疫されたマウスの脾臓細胞とマウスＮＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１８）とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングすることにより、抗ヒトＩＰＳ−１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作出することができる。また、かかるモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、アフィニティークロマトグラフィー等の液体クロマトグラフィーを具体的に例示することができる。
【００４０】
また、本発明の上記ヒトＩＰＳ−１に対する一本鎖抗体をつくるためには、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、そのヒトＩＰＳ−１を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。ヒトＩＰＳ−１に対する抗体は、ヒトＩＰＳ−１の分子機構を明らかにする上で有用である。
【００４１】
また上記抗ヒトＩＰＳ−１モノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ又は３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、上記ヒトＩＰＳ−１の機能解析を行うことができる。また免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
【００４２】
本発明のＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物としては、ＩＰＳ−１遺伝子の機能が染色体上で欠損し、野生型において発現されるＩＰＳ−１を発現する機能が失われている非ヒト動物であれば特に制限されるものではない。本発明のＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物としては、マウスやラット等のげっ歯類、特に、ＩＰＳ−１遺伝子の機能が染色体上で欠損したＩＰＳ−１ノックアウトマウスを好適に挙げることができ、ＩＰＳ−１ノックアウトマウスは、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用い、ＩＰＳ−１遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたＩＰＳ−１遺伝子を、ウイルスベクターやプラスミドベクター等を用いてサブクローンし、制限酵素マッピング及びＤＮＡシーケンシングにより特定することができる。次に、このＩＰＳ−１をコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３’末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲットベクターを作製する。この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型マウスと交雑させると、ヘテロ接合体マウス（Ｆ１マウス：＋／−）を得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスを交雑させることによって、ＩＰＳ−１ノックアウトマウスを作製することができる。また、ＩＰＳ−１ノックアウトマウスにおいて、ＩＰＳ−１がノックアウトされているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスにおけるＩＰＳ−１の発現の有無をウエスタンブロット法等により調べる方法がある。ＩＰＳ−１ノックアウトマウスは、分子レベルでのＩＰＳ−１の作用を調べる上で有用である。
【００４３】
本発明のＩ型ＩＦＮプロモーターを活性化する方法としては、本件タンパク質又は本件ＤＮＡで形質転換した宿主細胞で発現させた組換えタンパク質を用いて、Ｉ型ＩＦＮプロモーターを活性化する方法であれば特に制限されず、例えば、上記本件タンパク質又は組換えタンパク質を用いてＩ型ＩＦＮプロモーターを活性化させ、Ｉ型インターフェロン等を製造することも可能である。また、被験物質が存在する細胞内でＩ型ＩＦＮプロモーターを活性化させ、該プロモーターの活性化の程度を、被験物質を投与していない場合と比較・評価することにより、Ｉ型ＩＦＮプロモーター活性化機能を阻害（又は増強）する化合物をスクリーニングすることも可能である。さらに、ＩＰＳ−１は、インターフェロンαをはじめとする各種サイトカインの産生に関与する分子であることから、インターフェロンαが必要とされる疾病、例えば、ウイルス感染症の遺伝子治療に使用することができ、ＩＰＳ−１等の遺伝子のアンチセンス鎖は、形質細胞様樹状細胞からのインターフェロンαの過剰産生が病態と考えられているＳＬＥ(全身性エリテマトーデス)の遺伝子治療に使用することができる。また、ウイルス感染や自然免疫疾患の治療への遺伝子レベルでの研究において使用することも可能である。
【００４４】
また、本発明は、本件ＤＮＡをＩＰＳ−１活性を有するタンパク質の製造に使用する方法に関する。ＩＰＳ−１活性を有するタンパク質の製造における使用形態は特に制限されないが、本件ＤＮＡで形質転換した宿主細胞を培養することにより、組換えタンパク質として発現させる、ＩＰＳ−１活性を有するタンパク質の製造に使用する方法などを好適に例示することができる。また、本発明は、本件タンパク質をＩ型ＩＦＮの製造に使用する方法にも関する。Ｉ型ＩＦＮの製造における使用形態は特に制限されないが、本件タンパク質を用いてＩ型ＩＦＮプロモーターを活性化させる、Ｉ型インターフェロン等の製造に使用する方法などを好適に例示することができる。
【００４５】
本発明のＩ型ＩＦＮプロモーターの活性化による抗ウイルス応答機能が喪失したモデル動物としての使用方法としては、ＩＰＳ−１遺伝子の機能を染色体上で欠損させたＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物をＩ型ＩＦＮプロモーターの活性化による抗ウイルス応答機能が喪失したモデル動物として使用する方法であれば特に制限されず、Ｉ型ＩＦＮプロモーターの活性化による抗ウイルス応答機能が喪失したとは、各種ウイルス（例えば、ニューカッスル病ウイルス：ＮＤＶ、水疱性口内炎ウイルス：ＶＳＶ、センダイウイルス：ＳｅＶ、及び脳心筋炎ウイルス：ＥＭＣＶ等のＲＮＡウイルス）の感染に対する各種サイトカイン（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ及びＩＬ−６など）による抗ウイルス応答機能が喪失していることをいい、上記ＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物は、I型ＩＦＮプロモーターの活性化による抗ウイルス応答機能が喪失していることから、マウス内においてウイルスがより活発に増殖するという性質を有している。従って、ＩＰＳ−１ノックアウトマウスは、ウイルス感染のモデルマウスとして利用することができ、このマウスを用いて抗ウイルス薬の開発などへの応用が期待される。また、インターフェロン等のウイルス応答機能により、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは培養が難しいとされているウイルスであっても、このマウス由来の細胞を適用すれば、インターフェロン等の抗ウイルス応答機能が抑制されているため、培養することが可能であり、培養可能になれば、ウイルスのライフサイクルや感染メカニズムの理解、長鎖ｄｓＲＮＡによるＲＮＡｉの作用メカニズムの解明、さらにはそのウイルスに対する薬剤開発への応用が期待される。
【００４６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４７】
（ＩＰＳ−１の同定）
本発明者らは、発現クローニングストラテジーにより、ＩＦＮβプロモーターを活性化する分子を同定した。発現プラスミドにクローニングしたｃＤＮＡライブラリーの一部を、１００個のｃＤＮＡのプールに細分し、各ＤＮＡプールを、ＩＦＮβプロモーターＬｕｃレポタープラスミドと共にＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。平均的活性と比較して、５倍以上の活性を示すプールを陽性とした（図１ａ）。ヒトの胎盤、脾臓、抹消血白血球（ＰＢＬ）の各ｃＤＮＡライブラリーの一次スクリーニングにより、２８の陽性プールを得た。各陽性プールから、ＩＦＮβプロモーター活性化に関与する単一のクローンを単離した（図１ｂ）。
【００４８】
２４００個のプールをスクリーニングした結果、合計１５のクローンを同定した。ＩＲＦ７のクローン６個、ＩＲＦ３のクローン３個、ＩＲＦ１のクローン２個及びＩＲＦ８のクローン１個を含む、１２個のクローンはプロモーターを活性化することがすでに報告されている（表１）。この他に、本発明者らは、新規ＩＦＮ誘導物質としてジンクフィンガータンパク質ＣＸＸＣ５及びプロテインキナーゼＣｄｃ４２ｂｐｂを同定した。さらに、本発明者らは、約８００倍の活性化を誘導する新規分子を単離した。このクローンは、５４０個のアミノ酸のオープンリーディングフレームからなり（図２ａ、２ｂ）、相同性検索により、Ｎ末端にＭｄａ−５／ヘリカードのＣＡＲＤに類似した領域が明らかとなった（同一性２７％）（図２ｃ）。比較分析により、かかるタンパク質が、ＲＩＧ−ＩのＣＡＲＤとも相同性を有することが示された（図２ｄ）。しかし、かかるタンパク質と他のＣＡＲＤ含有タンパク質との類似性は見い出せなかった。そこで、ＧＷＸＸＸＦφＸＡＬ（φは、疎水性）の保存配列を有するかかるドメインをＣＡＲＤ様ドメイン（ＣＬＤ）と命名した。Ｃ末端の非ＣＬＤ領域は、他の既知のタンパク質又はドメインと類似性はなかった。ＩＦＮβプロモーターの活性化能に基づき、このタンパク質をＩＦＮβプロモーター刺激剤−１としてＩＰＳ−１と命名した。
ヒトＩＰＳ−１の発現を、多組織ノーザンブロットによって調べた（図２ｅ）。ＩＰＳ−１ｍＲＮＡは、心臓及び骨格筋で多く発現したが、脳、胎盤、肺、肝臓、腎臓及び膵臓ではわずかしか発現しなかった。
【表１】
【実施例２】
【００４９】
（ＩＰＳ−１は、Ｉ型ＩＦＮプロモーターを活性化する。）
ＨＥＫ２９３細胞内でのＦｌａｇ標識ＩＰＳ−１発現プラスミドの過剰発現は、ＩＦＮβプロモーターを用量依存的に活性化した（図３ａ）。同様に、ＩＰＳ−１の過剰発現は、ＩＲＦファミリーによって制御されているＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ及びＩＳＲＥプロモーターを用量依存的に活性化した（図３ａ）。次に、ＩＦＮα４及びＩＦＮα６プロモーターＬｕｃコンストラクトを用いて、ＩＦＮαプロモーター活性化を分析した。ＩＰＳ−１のみの過剰発現は、ＩＦＮα４及びＩＦＮα６プロモーター活性化をわずかに誘導した（図３ｂ）。しかし、ＩＲＦ７が同時発現すると、ＩＦＮα４プロモーター、ＩＦＮα６プロモーターの両方が相乗的に活性化し（図３ｂ）、ＩＰＳ−１が、ＩＲＦ７媒介性転写活性を増強したことを示した。さらに、Ｆｌａｇ−ＩＰＳ−１と同時発現すると、Ｍｙｃ−ＩＲＦ３及びＭｙｃ−ＩＲＦ７がゆっくりと移動することを見い出した（図３ｃ）。この移動は、リン酸化によるものである。なぜなら、ホスファターゼ処理により、ゆっくりとした移動は消失し（データは示されていない）、ＩＰＳ−１が、ＩＲＦ３及びＩＲＦ７のリン酸化を誘導することを明らかにしたからである。
【００５０】
次に、ＴＢＫ１／ＩＫＫｉ二重欠損マウス由来のマウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）を用いて、ＩＰＳ−１が媒介するＩＦＮ誘導がこれらのキナーゼに依存するか否かを調べた。ＩＦＮβプロモーター活性は、ＩＰＳ−１発現プラスミドをトランスフェクトした野生型ＭＥＦで増加したが、ＴＢＫ１／ＩＫＫｉ二重欠損ＭＥＦでは活性化は観察されなかった（図３ｄ）。他方、ＴＢＫ１の過剰発現は、野生型とＴＢＫ１／ＩＫＫｉ二重欠損ＭＥＦとの両方でプロモーターを活性化した。同様に、ＴＢＫ１の発現は、ＴＢＫ１／ＩＫＫｉ二重欠損細胞でＩＦＮα４プロモーターを活性化したが、ＩＰＳ−１の発現は活性化せず、ＩＰＳ−１依存性のＩＦＮプロモーター活性化にＴＢＫ１及びＩＫＫｉが必須であるあることを示した（図３ｄ）。
【００５１】
本発明者らは、２つのＩＰＳ−１の欠損変異体、Ｎ末端ＣＬＤのみをコードするＩＰＳ−１Ｎと、Ｃ末端非ＣＬＤ領域のみを含むＩＰＳ−１Ｃとを作製した。ＩＰＳ−１Ｎの過剰発現は、ＩＦＮβプロモーターを活性化したが、全長の過剰発現と比べると活性化は弱かった。ＩＰＳ−１Ｃの発現は、プロモーターを活性化せず（図３ｅ）、ＩＰＳ−１が媒介するＩＦＮβプロモーター活性化には、構造全体が必要であることを示した。
【実施例３】
【００５２】
（ＩＰＳ−１の発現は、抗ウイルス応答を与える。）
ＩＰＳ−１発現後の、内因性Ｉ型ＩＦＮ及びＩＦＮ誘導性遺伝子の誘導を分析した。ＨＥＫ２９３細胞におけるＦｌａｇ−ＩＰＳ−１の過剰発現は、内因性ＩＦＮβ（Ifnb）及び、ＩＰ−１０（Cxcl10）及びＧＡＲＧ１６（Ifit1）等のＩＦＮ誘導性遺伝子の誘導を刺激した（図４ａ）。さらに、培養上清内のＩＦＮα産生は、ＩＰＳ−１をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞でも観察され、この誘導は、ＩＲＦ７の同時発現によって増強した（図４ｂ）。このように、ＩＰＳ−１の発現は、これらの遺伝子の内因性プロモーター活性化を導く。次に、コントロール又はＩＰＳ−１をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞にＶＳＶを感染し、感染の２４時間後にウイルス力価を測定した。ウイルス力価は、コントロール細胞と比較してＩＰＳ−１発現細胞で著しく減少した（図４ｃ）。これらの結果は、ＩＰＳ−１のみの発現が、恐らくＩ型ＩＦＮ等の抗ウイルス性サイトカインを産生することによって、抗ウイルス応答を与えるのに十分であることを示唆した。
【実施例４】
【００５３】
（ＩＰＳ−１はＮＦ-κＢを活性化する。）
ＩＰＳ−１の発現がＮＦ−κＢを活性化するか否かを調べるために、ＨＥＫ２９３細胞に、ＩＰＳ−１を、ＥＬＡＭ１プロモーターＬｕｃコンストラクトとトランジェントにトランスフェクトした。ＩＰＳ−１の発現は、用量依存的にＮＦ-κＢ活性化を導いた（図５ａ）。さらに、この活性化は、触媒陰性（catalytic negative）ＩＫＫβ（Ｋ４４Ａ）の同時発現によって阻害された（図５ｂ）。ＩＰＳ−１ＮもＩＰＳ−１ＣもＮＦ−κＢを活性化しなかった（図５ｃ）。さらに、ＩＰＳ−１発現プラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の培養上清において、ＩＬ−８の産生が観察されたが、コントロールプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞では観察されなかった。これは、ＩＰＳ−１が内因性ＮＦ−κＢプロモーターも活性化することを示唆している（図５ｄ）。ＩＦＮα及びＩＦＮβプロモーター活性化と異なり、ＩＰＳ−１の過剰発現は、ＴＢＫ１／ＩＫＫｉ二重欠損ＭＥＦでＥＬＡＭ１活性化を誘導した（図５ｅ）。さらに、ＴＲＡＦ６欠損ＭＥＦでは、ＩＰＳ−１によるＮＦ−κＢ及びＩＦＮβプロモーター活性化が引き続き観察された。これらの結果は、ＩＰＳ−１によるＮＦ−κＢ活性化は、ＩＫＫβ依存的であるが、ＴＲＡＦ６及びＴＢＫ１／ＩＫＫｉに非依存的であることを示している。
【実施例５】
【００５４】
（ＩＰＳ−１は、ＲＩＧ−Ｉ、Ｍｄａ５、ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１と複合体を形成する。）
ＩＰＳ−１、Ｍｄａ５及びＲＩＧ−Ｉの配列類似性により、これらの分子が物理的に互いに会合するかどうかを調べてみた。ＨＥＫ２９３細胞に、Ｍｙｃ−ＩＰＳ−１を、Ｆｌａｇ−Ｍｄａ５、Ｆｌａｇ−Ｍｄａ５△Ｃ、Ｆｌａｇ−ＲＩＧ−Ｉ又はＦｌａｇ−ＲＩＧ−Ｉ△Ｃとトランスフェクトし、細胞可溶化液を抗Ｍｙｃ抗体で免疫沈降した。Ｍｙｃ−ＩＰＳ−１及びＦｌａｇ−ＲＩＧ−Ｉ△Ｃの両方を発現する細胞で、免疫共沈降が観察された（図６ａ）。さらに、弱いものの、Ｍｙｃ−ＩＰＳ−１及びＦｌａｇ−Ｍｄａ５△Ｃ間で会合が観察された（図６ａ）。ＩＰＳ−１のＣＬＤが発現したときにも、類似した会合が観察された（データは示されていない）。これらの結果は、ＩＰＳ−１のＣＬＤがＲＩＧ−Ｉ及びＭｄａ−５のＮ末端ＣＡＲＤ含有領域と会合することを示した。
【００５５】
ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１が、ｄｓＲＮＡが誘導する抗ウイルス応答に関連していたので、これらの分子の相互作用を調べた。Ｆｌａｇ−ＦＡＤＤ及びＦｌａｇ−ＲＩＰ１ は、Ｍｙｃ−ＩＰＳ−１と共沈殿したが、Ｆｌａｇ−ＴＢＫ１はしなかった（図６ｂ）。ＦＡＤＤとの相互作用に、ＩＰＳ−１Ｃは必須であったが、ＩＰＳ−１Ｎは必須でなかった（図６ｃ）。さらに、ＩＰＳ−１が媒介するＩＦＮβプロモーター活性化は、Ｎ末端デスエフェクタードメインをコードするＦＡＤＤ ＤＥＤの発現によって減少し、ＦＡＤＤ ＤＥＤがＩＰＳ−１依存性シグナル伝達に関連するドミナントネガティブな変異体として作用することを示唆した（図６ｄ）。
【実施例６】
【００５６】
（ＩＰＳ−１ノックダウンはＩＦＮ応答をブロックする。）
ｓｉＲＮＡオリゴを用いてＩＰＳ−１の内因性発現を減少し、ＩＰＳ−１の生理機能を調べた。ヒトＩＰＳ−１ｍＲＮＡの異なる部分を標的とする二本鎖２１−ｍｅｒ ＲＮＡを３個用意した。パイロット実験では、トランスフェクションの４８時間後に、２個のｓｉＲＮＡ（Ｉｐｓ−１−１、Ｉｐｓ−１−２）が、ＲＴ−ＰＣＲで定量したように、Ｈｅｌａ細胞内のＩＰＳ−１のノックダウンを誘導した（図７ａ）。かかるｓｉＲＮＡによるＩＰＳ−１の発現の減少は、７日間続いた（データは示されていない）。そこで、かかる２つのｓｉＲＮＡを新たな分析に使用した。コントロールｓｉＲＮＡ（コントロール）、Ｉｐｓ−１−１又はＩｐｓ−１−２を、ＨＤＫ２９３細胞にトランスフェクトし、全ＲＮＡを、４８時間後にＲＴ−ＰＣＲ分析用に調製し、標的遺伝子の発現の減少を確認したが、Ｇａｐｄｈの発現には何の影響もなかった（図７ａ）。
【００５７】
ｄｓＲＮＡトランスフェクションが誘導するＩＦＮβプロモーター活性化に対する、ｓｉＲＮＡの影響を調べてみた。コントロール、Ｉｐｓ−１−１又はＩｐｓ−１−２で処理したＨＥＫ２９３細胞に、ＩＦＮβプロモーターＬｕｃコンストラクトをトランスフェクトし、その後、合成ｄｓＲＮＡポリ（Ｉ：Ｃ）を異なる濃度でトランスフェクトした。Ｉｐｓ−１発現のノックダウンは、ポリ（Ｉ：Ｃ）刺激後にプロモーター活性の減少を導いた（図７ｂ）。さらに、コントロール又はＩｐｓ−１−１ｓｉＲＮＡをトランジェントにトランスフェクション処理したＨＥＫ２９３細胞に、ＲＩＧ−Ｉ△Ｃ又はＴｒｉｆを発現させた。ＲＩＧ−Ｉ△Ｃは恒常的にＩＦＮβプロモーターを活性化することを示した（Nat Immunol. 5, 730-737, 2004）。ＲＩＧ−Ｉ△Ｃが誘導するプロモーター活性化は、Ｉｐｓ−１−１処理細胞で減少したが、Ｔｒｉｆが誘導する活性化は、これらの細胞で減少しなかった（図７ｃ）。したがって、ＩＰＳ−１は、ＲＩＧ−Ｉ依存性シグナル伝達に必須であるが、Ｔｒｉｆ依存性シグナル伝達には必須でない。
【００５８】
ポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＩＦＮβ及びＩＦＮ誘導性遺伝子の発現を調べた。ポリ（Ｉ：Ｃ）トランスフェクションの３時間後のＩＦＮβ及びＩＰ−１０メッセージの誘導は、コントロールで処理した細胞と比較して、Ｉｐｓ−１−１及びＩｐｓ−１−２で処理したＨＥＫ２９３細胞で著しく減少し（図７ｄ）、ＩＰＳ−１が、ｄｓＲＮＡが媒介する遺伝子誘導に必須であることを示唆した。次に、ｓｉＲＮＡで処理したＨＥＫ２９３細胞を、細胞変異性でないＶＳＶ変異体（ＶＳＶｍｔ）（J Virol. 76, 8011-8018, 2002）又はＮＤＶで感染し、ＩＦＮαを測定した。Ｉｐｓ−１−１又はＩｐｓ−１−２で処理した細胞における、ウイルス感染２４時間後のＩＦＮα産生は、コントロールｓｉＲＮＡで処理した細胞と比較して、顕著に減少した（図７ｅ）。したがって、ＩＰＳ−１は、ウイルス感染に対する抗ウイルス応答にも、ｄｓＲＮＡ刺激にも必須である。
【実施例７】
【００５９】
（ホモ型ノックアウトマウスは健康に生育する。）
ＩＰＳ-/-マウスは、予想されたメンデル比で生まれ、繁殖性であり、健康に育ち、１０週の年齢まで異常を示さなかった。また、ホモ接合体（−／−）において、ＩＰＳ−１遺伝子の機能が欠損していることを確認するためサザンブロット分析を行った。マウスの尾部より抽出したゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化した遺伝子断片と、以下に示した放射能標識をしたマウスゲノム由来のプローブ（配列番号２７）を用いてサザンブロット法により確認した。その結果、野生型（＋／＋）には単一の１１．３ｋｂバンドが、ホモ接合体（−／−）には７．０ｋｂバンドが、ヘテロ接合体（＋／−）にはその両方のバンドが得られた（図８ｂ参照）。次に、ホモ接合体（−／−）において、ＩＰＳ−１遺伝子が発現していないことを確認するためノーザンブロット分析を行った（図８ｃ参照）。さらに、ＩＰＳ−１の発現がタンパク質レベルでも消失していることを確認するために、ウェスタンブロット分析を行った（図８ｄ参照）。図８のｄの矢印に示した箇所が内在性ＩＰＳ−１タンパクであり、野生型（＋／＋）では現れているバンドが、ホモ接合体（−／−）には現れていないのが確認できる。
マウスゲノム由来のプローブ：AACCATGCAGGCCAGGAAGCTGGATTGTTACAATGACCTTCGTGGTTCAGCA
AGGACAAGGCTATCTATAACTGCATTTAGACGCTGGTCCTCACAGGCCTGGTGCTCTTTTTGCAAGAATTAAATAAGAGGCCCTTGTTGCTTTCAACAAGACTAAGTCACTAAACCTCACTTCAGAGTTGTTTTTTACATTTTCAAATTTGTTTTGTAGGGACAGGCAGTTGTGGACATCAGA（配列番号２７）
【実施例８】
【００６０】
（ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスは、各ＲＮＡウイルスに対する反応性を喪失し、ウイルス感染のモデルマウスとして利用できる。）
ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスにおける各ＲＮＡウイルス、具体的にはニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、及びセンダイウイルス（ＳｅＶ）に対する反応性を調べた。まず、野生型（＋／＋）、及びＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦに１本鎖ＲＮＡウイルスであるニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、及びセンダイウイルス（ＳｅＶ）を感染させ、２４時間後の培養上清中のサイトカイン（ＩＦＮα，ＩＦＮβ，ＩＬ−６）濃度をエライザ法により測定した。結果は図９のａに示すとおりである。次に、野生型（＋／＋）、及びＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦにＮＤＶ、ＶＳＶ、ＳｅＶを感染させ、０、９、１８時間後に細胞からＲＮＡを回収し、ＩＦＮβ、ＩＦＮα、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６の各ｍＲＮＡに相補的なプローブを用いて、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮα、ＩＰ−１０、ＲＮＡＴＥＳ、及びＩＬ−６の遺伝子発現をノーザンブロット法にて検討した。なお、プローブは以下の（１）〜（５）に示した。また、ポジティブコントロールとして、β−ａｃｔｉｎを用い、プローブは、Hemmi H et al., J. Exp. Med., 199: 1641-1650, 2004に記載のプローブを用いた。結果は図９のｂに示すとおりである。図９のａ及びｂより、ＩＰＳ−１欠損マウスは、上記ウイルス（ＮＤＶ、ＶＳＶ及びＳｅＶ）による各種サイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６）の産生が抑制されることが確認された。
（１）ＩＦＮ−β；CCTGCTGTGCTTCTCCACCACAGCCCTCTCCATCAACTATAAGCAGCTCCAGCTCCAAGAAA
GGACGAACATTCGGAAATGTCAGGAGCTCCTGGAGCAGCTGAATGGAAAGATCAACCTCACCTACAGGGCGGACTTCAAGATCCCTATGGAGATGACGGAGAAGATGCAGAAGAGTTACACTGCCTTTGCCATCCAAGAGATGCTCCAGAATGTCTTTCTTGTCTTCAGAAACAATTTCTCCAGCACTGGGTGGAATGAGACTATTGTTGTACGTCTCCTGGATGAACTCCACCAGCAGACAGTGTTTCTGAAGACAGTACTAGAGGAAAAGCAAGAGGAAAGATTGACGTGGGAGATGTCCTCAACTGCTCTCCACTTGAAGAGCTATTACTGGAGGGTGCAAAGGTACCTTAAACTCATGAAGTACAACAGCTACGCCTG（配列番号２８）
（２）ＩＦＮα；Hemmi H et al., J. Exp. Med., 199: 1641-1650, 2004に記載のプローブ
（３）ＩＰ−１０；CATCAGCACCATGAACCCAAGTGCTGCCGTCATTTTCTGCCTCATCCTGCTGGGTCTGAGTG
GGACTCAAGGGATCCCTCTCGCAAGGACGGTCCGCTGCAACTGCATCCATATCGATGACGGGCCAGTGAGAATGAGGGCCATAGGGAAGCTTGAAATCATCCCTGCGAGCCTATCCTGCCCACGTGTTGAGATCATTGCCACGATGAAAAAGAATGATGAGCAGAGATGTCTGAATCCGGAATCTAAGACCATCAAGAATTTAATGAAAGCGTTTAGCCAAAAAAGGTCTAAAAGGGCTCCTTAACTGGAGAGAAGCCACGCACACACCCCGGTGCTGTGATGGACAGCAGAGAGCCTGTCTCTCCATCACTCCCCTTTACCCAGTGGATGGCTAGTCCTAATTGCCCTTGGTCTTCTGAAAGGTGACCAGCCGTGGTCACATCAGCTGCTACTCCTCCTGCAGGATGATGGTTAAGCCATGGTCCTGAGACAAAAGTAACTGCCGAAGCAAGAATTCTTTAAGGGCTGGTCTGAGTCCTCACTCAAGTGGCTGGGATGGCTGTCCTAGCTC（配列番号２９）
（４）ＲＡＮＴＥＳ；CAGCCGCCCTCTGCACCCCCGCACCTGCCTCACCATATGGCTCGGACACCACTCCCTGCT
GCTTTGCCTACCTCTCCCTCGCGCTGCCTCGTGCCCACGTCAAGGAGTATTTCTACACCAGCAGCAAGTGCTCCAATCTTGCAGTCGTGTTTGTCACTCGAAGGAACCGCCAAGTGTGTGCCAACCCAGAGAAGAAGTGGGTTCAAGAATACATCAACTATTTGGAGATGAGCTAGGATAGAGGGTTTCTTGATTCTGACCCTGTATAGCTTCCCTGTCATTGCTTGCTCTAGTCC（配列番号３０）
（５）ＩＬ−６；GTTCCTCTCTGCAAGAGACTTCCATCCAGTTGCCTTCTTGGGACTGATGCTGGTGACAACCACG
GCCTTCCCTACTTCACAAGTCCGGAGAGGAGACTTCACAGAGGATACCACTCCCAACAGACCTGTCTATACCACTTCACAAGTCGGAGGCTTAATTACACATGTTCTCTGGGAAATCGTGGAAATGAGAAAAGAGTTGTGCAATGGCAATTCTGATTGTATGAACAACGATGATGCACTTGCAGAAAACAATCTGAAACTTCCAGAGATACAAAGAAATGATGGATGCTACCAAACTGGATATAATCAGGAAATTTGCCTATTGAAAATTTCCTCTGGTCTTCTGGAGTACCATAGCTACCTGGAGTACATGAAGAACAACTTAAAAGATAACAAGAAAGACAAAGCCAGAGTCCTTCAGAGAGATAC（配列番号３１）
【００６１】
さらに、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスの腹腔マクロファージに脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）を感染させ、２４時間後の培養上清中のサイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−６）濃度をエライザ法により測定した。結果は図９のｃに示すとおりである。次に、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスの腹腔マクロファージにＥＭＣＶを感染させ、０、６、９時間経過後、細胞よりＲＮＡを回収し、ＩＦＮβ、ＩＦＮα、ＩＰ−１０、ＲＮＡＴＥＳ、及びＩＬ−６の遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲ法により検討した。なお、ポジティブコントロールとして、β−ａｃｔｉｎを用いた。結果は図９のｄに示すとおりである。図９のｃ及びｄより、ＩＰＳ−１欠損マウスは、ＥＭＣＶによる各種サイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６）の産生が抑制されることが確認された。
【００６２】
これらの結果より、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスは、I型ＩＦＮプロモーターの活性化による抗ウイルス応答機能が喪失しており、マウス内においてウイルスがより活発に増殖するという性質を有している。したがって、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスは、ウイルス感染のモデルマウスとして利用できることが明らかとなった。
【実施例９】
【００６３】
（ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスにおけるポリＩ：Ｃに対する反応性を喪失し、ウイルス感染のモデルマウスとして利用できる。）
次に、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスにポリＩ：Ｃを投与し、ポリＩ：Ｃの投与量及び投与時間における各種サイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＰ−１０、及びＩＬ−６）の産生を調べた。まず、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスにおけるＮＤＶ感染応答性シグナル伝達経路を解析した。野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦを図で示した濃度のポリＩ：Ｃで刺激し、２４時間後の培養上清中のサイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−６）濃度をエライザ法により測定した。結果は図１０ａに示すとおりである。次に、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦをポリＩ：Ｃで刺激した。０、２、４、６時間後に細胞からＲＮＡを回収し、上記に示したＩＦＮβ、ＩＦＮα、ＩＰ−１０、ＩＬ−６の各ｍＲＮＡに相補的なプローブを用いて、ＩＦＮβ、ＩＦＮα、ＩＰ−１０、及びＩＬ−６の遺伝子発現をノーザンブロット法にて検討した。なお、ポジティブコントロールとして、β−アクチン（β−actin）を用いた。結果は図１０のｂに示すとおりである。さらに、ヘテロ型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスにポリＩ：Ｃを静脈内注射し、計時的に採取した血清中におけるサイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−６）濃度をエライザ法により測定した。結果は図１０のｃに示すとおりである。
【００６４】
図１０のａ〜ｃに示される結果より、ＩＰＳ−１欠損マウスはポリＩ：Ｃにより誘導される各種サイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＰ−１０、ＩＬ−６）の産生が抑制されることが確認された。これらの結果は、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスが、ウイルス感染のモデルマウスとして利用できることを支持するものである。
【実施例１０】
【００６５】
（ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスにおけるＮＤＶ感染応答性シグナル伝達経路を活性化し、抗ウイルス応答を誘導する。）
さらに本発明者らは、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスにおけるウイルス感染応答のシグナル伝達経路を解析した。まず、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦにＮＤＶを感染させ、０、１０、２０時間後に核タンパク質を抽出し、ＮＦ−ｋＢの活性化をＥＭＳＡ法により検討した。ＩＰＳ−１野生型（＋／＋）において観察されるＮＦ−κＢの発現が、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）においては、観察されなかった（図１１のａ）。次に、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦにＮＤＶを感染させ、０、６、８時間後にライセートを調整した。調整したライセートをＮａｔｉｖｅＰＡＧＥで展開後、フィルターに転写し、フィルターを抗ＩＲＦ３抗体でブロットし、ダイマー（二量体）形成を検討した。ＩＲＦ３の活性化をダイマー形成により確認したところ、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）においては、これらダイマー形成が観察されなかった（図１１のｂ）。
【００６６】
以上の結果より、ＩＰＳ−１のＮＤＶ感染応答のシグナル伝達は、ＮＦ−κＢや、ＩＲＦ３の活性化を介して、Ｉ型ＩＦＮを産生したり、ＩＦＮ誘導性遺伝子を発現したりすることにより、抗ウイルス応答を誘導するものであることが示唆された。
【００６７】
［材料と方法］
（ハイスループットスクリーニング）
スクリーニングは、若干修正を加えた文献（EMBO J. 21, 5184-5194, 2002）に従って行った。ヒト胎盤、脾臓又はＰＢＬのｃＤＮＡライブラリーを、ｐＣＭＶ６−ＸＬ３（OriGene Technologies Inc.社製）にクローニングしたプラスミドＤＮＡでE. coli ＤＨ５αを形質転換し、１プレートあたり１００コロニーまでの密度でＬＢ寒天アンピシリンプレートに播種した。一晩インキュベートした後、ニトロセルロースフィルター膜を用いてレプリカプレートを作製した。一次形質転換プレートのコロニーを掻爬し、ＱＩＡprep 8 Miniprep Kit (QIAGEN社製) を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、ｃＤＮＡプールとして用いた。２４ウェル皿に播種したＨＥＫ２９３細胞（１×１０５／ウエル）に、Lipofectamine 2000 （Invitrogen社製）を用いて、１．０μｇのｃＤＮＡプールと、１００ｎｇのＩＦＮβ―Ｌｕｃコンストラクトとをトランジェントにトランスフェクトした。３６時間後、細胞を１００μｌのレポーター溶解バッファー（Promega社製）で溶解した。デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（Promega社製）で、可溶化液５μｌのルシフェラーゼ活性を測定した。５０ｎｇのウミシイタケ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を、内部コントロールとして同時にトランスフェクトとした。
【００６８】
陽性プールに対応するレプリカプレートの個別コロニーを選択し、１．０ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地で培養した。培養物より調製したプラスミドＤＮＡを、ＩＦＮβ−ＬｕｃとＨＥＫ２９３にコトランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性を分析し、プールの活性化に関与する単一のクローンを単離した。５’及び３’プライマーを用いて、陽性ＤＮＡをシークエンシングし、ＢＬＡＳＴサーチにより特徴づけた。ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから入手した単一ヒトＩＰＳ−１クローンは、最初のＡＴＧのアップストリームで、インフレームストップコドンを有するオープンリーディングフレーム全体をコードしていた。ポリＡテールも得られたクローンに含まれていた。
【００６９】
（プラスミド）
テンプレートとして、スクリーニングによって得たＩＰＳ−１−ｐＣＭＶ６−ＸＬ３を用いて、ＰＣＲによりＩＰＳ−１、ＩＰＳ−１Ｎ（a．a．１−１１７）及びＩＰＳ−１Ｃ（ａ．ａ．１１８−５４０）を増幅し、pFLAG-CMV2（Sigma社製）、又はpEF-BOSに結紮し、それぞれＦｌａｇ標識、Ｍｙｃ標識発現コンストラクトを作製した。ヒトＩＲＦ３及びＩＲＦ７をＲＴ−ＰＣＲにより入手し、pEF-BOSに結紮した。ＩＫＫβ Ｋ４４Ａ、ＴＢＫ１及びＴｒｉｆコンストラクトは、文献に記載されている（J Immunol. 171, 4304-4310, 2003）。ＲＴ−ＰＣＲで増幅した、ヒトＦＡＤＤ ＤＥＤ（ａ．ａ．１−８５）をＲＴ−ＰＣＴにより増幅し、pFLAG-CMV2に結紮した。ＲＴ−ＰＣＴにより増幅したヒトＲＩＧ−Ｉ、ＲＩＧ−Ｉ△Ｃ（ａ．ａ．１−６０４）、Ｍｄａ５、Ｍｄａ５△Ｃ（ａ．ａ １−５７５）及びＲＩＰ１を、pFLAG-CMV6（Sigma社製）に結紮した。ＩＦＮβ、ＩＦＮα４、ＩＦＮα６及びＥＬＡＭ１のルシフェラーゼレポーターコンストラクトは文献に記載されている（Nat Immunol. 5, 1061-1068, 2004）。ＩＳＲＥ−ＬｕｃはStratageneより入手した。ＩＰ−１０−Ｌｕｃ及びＲＡＮＴＥＳ−ＬｕｃはD.T. Golenbock (マッサチューセット大学医学部、ＭＡ)より提供された。
【００７０】
（細胞、ウイルス及び試薬）
ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞及びＭＥＦ細胞を、５％ＣＯ２のインキュベーター内の１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭで培養した。ＴＢＫ１／ＩＫＫｉ二重欠損マウス由来のＭＥＦ細胞は、文献記載の通り調製した（J Exp Med. 199, 1641-1650, 2004）。ポリ（Ｉ：Ｃ）（Amersham Bioscience社製）をFugene（Roche社製）と混合し、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。抗Ｆｌａｇ抗体（Ｍ２）ビーズ及びＨＲＰ複合抗Ｆｌａｇ抗体（Ｍ２）は、Sigma社より購入した。抗Ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）アガロース及びＨＲＰ複合抗Ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）は、Santa Cruz 社から購入した。ＶＳＶ及びＶＳＶ変異体は、Dr. T. Abe 、Dr. Y. Matsuura（大阪大学）より提供された。ＮＤＶは、Dr. T.Fujita（東京都臨床医学総合研究所）より提供された。
【００７１】
（レポーター分析）
２４ウェルプレート（１×１０５細胞／ウェル）に播種したＨＥK２９３細胞、又は６
ウェルプレート（１×１０５細胞／ウェル）に播種したＭＥＦ細胞に、１００ｎｇのルシフェラーゼレポータープラスミドと、所定の発現プラスミド又は空コントロールプラスミド合計１．０μｇとを、トランジェントにトランスフェクトした。３６〜４８時間後、全細胞可溶化液のルシフェラーゼ活性をデュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Promega社製）で測定した。５０ｎｇのウミシイタケ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を、内部コントロールとして同時にトランスフェクトした。
【００７２】
（ＥＬＩＳＡ）
ＦＬＡＧ−ＩＰＳ−１又はＦＬＡＧ−ＩＲＦ７をトランジェントにトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞、又はウイルスを感染した細胞を２４時間培養した。上清のサイトカインＩＦＮαを、製造者の指示に従ってＥＬＩＳＡ（ＰＢＬ Bio Lab.社製）により測定した。ＩＬ−８のＥＬＩＳＡは、文献記載どおりに行った（J Immunol. 174, 2273-2279,2005）。
【００７３】
（プラークアッセイ）
ＶＳＶを感染させたＨＥＫ２９３細胞から回収した培養上清のウイルス収量を測定した。回収したウイルスの段階希釈液で感染されたＢＨＫ細胞を、１．０％の低融解アガロースを含むＤＭＥＭで覆った。２４時間のインキュベーション後にプラークを算定した。
【００７４】
（ノーザンブロット分析及びＲＴ−ＰＣＲ）
ヒト多組織ノーザンブロット（CLONTECH社製）で32Ｐ標識全長ヒトＩＰＳ−１プローブをハイブリダイズし、洗浄し、オートラジオグラフィーにより視覚化した。ＲＴ−ＰＣＲ分析用に、全ＲＮＡをTrizol試薬（Invitrogen 社製）を用いて単離し、SuperScript III逆転写酵素（Invitrogen 社製）を製造者の指示に従って用いて逆転写した。ＰＣＲは、以下のプライマーを用いて連続して行った。
Ｉｆｎｂ；５’−ＣＡＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧＴＧＴＣＡＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号３）及び５’−ＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣＣＴＴＧＡＧＧＣＡＧＴＡＴ−３’ （配列番号４）、Ｃｘｃｌ１０；５’−ＴＧＡＣＴＣＴＡＡＧＴＧＧＣＡＴＴＣＡＡＧＧ−３’（配列番号５）及び５’−ＧＡＴＴＣＡＧＡＣＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＡＣＣＣ−３’（配列番号６）、Ｉｆｉｔ１；５’−ＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＡＡＡＴ−３’（配列番号７）及び５’−ＴＧＣＧＧＣＣＣＴＴＧＴＴＡＴＴＣＣ−３’（配列番号８），Ｇａｐｄｈ；５’−ＣＴＧＧＧＣＴＡＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＣＡＧ−３’（配列番号９）及び５’−ＣＣＡＧＣＧＴＣＡＡＡＧＧＴＧＧＡＧ−３’（配列番号１０）。
【００７５】
（免疫共沈降及びイムノブロット分析）
ＨＥＫ２９３細胞１００万個を、１００ｍｍ皿に播種した。１２時間後、細胞に空プラスミド又は所定のプラスミド全量６．０μｇを、Lipofectamine 2000（Invitrogen社製）を用いてトランジェントにトランスフェクトした。免疫沈降及びイムノブロットは、文献記載のとおり行った（Nat Immunol. 5, 1061-1068, 2004)。
【００７６】
（ＲＮＡ干渉）
ｓｉＲＮＡ実験用に、２１ヌクレオチドを有するセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる二本鎖ＲＮＡデュプレックスを、ダーマコンリサーチ（Dharmacon research）により合成した。ヒトＩＰＳ−１を標的とするのに用いたＲＮＡオリゴヌクレオチドは、次の通りである。Ｉｐｓ−１−１センス；５’−ＵＡＧＵＵＧＡＵＣＵＣＧＣＧＧＡＣＧＡｄＴｄＴ−３’（配列番号１１）、Ｉｐｓ−１−１アンチセンス；５’−ＵＣＧＵＣＣＧＣＧＡＧＡＵＣＡＡＣＵＡｄＴｄＴ−３’（配列番号１２）、Ｉｐｓ−１−２センス；ＣＣＧＵＵＵＧＣＵＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡｄＴｄＴ−３’（配列番号１３）、Ｉｐｓ−１−２アンチセンス；ＵＣＵＵＧＵＣＵＵＣＡＧＣＡＡＡＣＧＧｄＴｄＴ−３’（配列番号１４）。ＨＥＫ２９３細胞又はＨｅｌａ細胞を、６０ｍｍ皿（５×１０５）に、トランスフェクションの１２時間前に播種した。１００ｎＭのｓｉＲＮＡを、Lipofectamine 2000又はOligofectamine（Invitrogen社製）を製造者の指示に従って用いて、それぞれＨＥＫ２９３細胞又はＨｅｌａ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を新たな実験に使用した。ＲＴ−ＰＣＲにより、ＩＰＳ−１ｍＲＮＡのノックダウンを５’−ＡＴＧＣＣＧＴＴＴＧＣＴＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号１５）及び５’−ＣＴＡＧＴＧＣＡＧＡＣＧＣＣＧＣＣＧ−３’（配列番号１６）のプライマーで確認した。
【００７７】
（ＩＰＳ−１ノックアウトマウスの作製）
（１）キメラマウスの作製
ＩＰＳ−１の生理学的役割を検討するため、ジーンターゲティングによりＩＰＳ-/-マウスを作製した。ＩＰＳ−１-/-マウスを作製するためのターゲティングベクターは、ｐＭＣ１−ｎｅｏ（Stratagene社製）からのネオマイシン耐性遺伝子で、エクソン１及びエクソン２を置換し、負の選択マーカーとして単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を挿入することにより構築した（図８ａ参照）。次に、当業者に公知の方法に従い、エレクトロポーション法で、構築されたターゲッティングベクターをＥＳ細胞に導入した。Ｇ４１８とガンシクロビアに二重に耐性を持つコロニーを選択し、ＰＣＲにより相同組換えが起きた細胞を選択した後、相同組み換えの認められた陽性クローン（ＥＳ細胞）を胚盤胞に導入して仮親に移植することによりキメラマウスを作製した。
（２）ヘテロ欠損（ＩＰＳ−１＋／−）マウスの作製
こうして得られたキメラマウスの交配によってＦ１マウスを作製した。Ｆ１マウスの遺伝型をＰＣＲ及びサザンブロット法で解析したところ生殖系列への変異の導入（ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ化）が確認され、ヘテロ欠損マウス（ＩＰＳ−１＋／−マウス）が作製された。
（３）更に、ＩＰＳ−１＋／−マウスどうしを交配させて、ＩＰＳ−１遺伝子ホモ欠損マウス（ＩＰＳ−１−／−マウス）を作製した。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】ＩＦＮβプロモーターのアクチベーターの同定結果を示す図である。（ａ）ヒト胎盤、脾臓、又はＰＢＬのｃＤＮＡ発現ライブラリーの一部を、１００個までのｃＤＮＡ複合体（complexity）のプールに細分した。各プールからのプラスミドＤＮＡを、ＨＥＫ２９３細胞に、ＩＦＮβプロモーターのレポーターコンストラクトとトランスフェクトし、レポーター遺伝子アッセイで分析した。平均的な活性より、活性化が５倍以上のときに、プールを陽性とした。陽性プールの同定例を示す。（ｂ）ＩＦＮβ活性化に関与する単一のクローンを単離するために、（ａ）で示すプール３４のレプリカプレート由来のコロニーを選択し、プラスミドを回収した。かかるプラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞にＩＦＮβプロモーターのレポーターコンストラクトとトランスフェクトし、レポーターアッセイでプロモーター活性化能を分析した。陽性クローン（クローン３）をシークエンシングし、ＢＬＡＳＴサーチにより特徴づけた。
【図２】ＩＰＳ−１の構造と発現に関する図である。（ａ）スクリーニングによって単離したクローンの概略図である。（ｂ）ヒトＩＰＳ−１の予測されるアミノ酸配列を示す図である。（ｃ）ヒトＩＰＳ−１の概略図である。ＩＰＳ−１のＮ末端ＣＡＲＤ様ドメインを、黒い四角で示した。（ｄ）ヒトＩＰＳ−１、ヒトＭｄａ５、マウスＭｄａ５、ヒトＲＩＧ−Ｉ及びマウスＲＩＧ−ＩのＣＡＲＤ様ドメインのアライメントを示す図である。少なくとも３つの分子で保存されたアミノ酸残基を赤で示した。（ｅ）各種ヒト組織におけるヒトＩＰＳ−１ＲＮＡの発現を示す図である。ラジオ標識したヒトＩＰＳ−１プローブを、多組織ノーザン（ＭＴＮ）ブロットでハイブリダイズした。
【図３】ＩＲＦ３の活性化、及びＩＰＳ−１によるＩＦＮ誘導性遺伝子の誘導を示す図である。（ａ）ＨＥＫ２９３細胞に、１ｎｇ（レーン２）、１０ｎｇ（レーン３）、１００ｎｇ（レーン４）のＦｌａｇ−ＩＰＳ−１をコードする発現プラスミドを、ＩＦＮβ、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＳＲＥの各プロモーターをコードするレポーターコンストラクトとトランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイで分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。（ｂ）ＨＥＫ２９３細胞に、１ｎｇ（レーン２、７）、１０ｎｇ（レーン３、８）、１００ｎｇ（レーン４、９）、又は１μｇ（レーン５、１０）のＦｌａｇ−ＩＰＳ−１及びコントロール（レーン１〜５）、又は５ｎｇのＦｌａｇ−ＩＰＳ−７（レーン６〜１０）を、ＩＦＮα４（左）又はＩＦＮα６（右）プロモーターレポータープラスミドとトランジェントにコトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。（ｃ）ＨＥＫ２９３細胞に、ＦＬＡＧ標識ＩＰＳ−１及びＭｙｃ標識ＩＲＦ３（上）又はＭｙｃ標識ＩＲＦ７（下）を所定の組合せでトランジェントにトランスフェクトした。３６時間後、細胞可溶化液を、抗Ｍｙｃ抗体又は抗ＦＬＡＧ抗体（ＩＰ）で免疫沈降し、その後、抗ＦＬＡＧ抗体又は抗Ｍｙｃ抗体（ＷＢ）で免疫ブロットした。（ｄ）野生型（ＷＴ）又はＴＢＫ１及びＩＫＫｉ二重欠損マウス（ＴＢＫ１／ＩＫＫｉ ＫＯ）由来のＭＥＦ細胞に、ＦＬＡＧ−ＩＰＳ−１又はＦｌａｇ−ＴＢＫ１を、ＩＦＮβ又はＩＦＮαプロモータープラスミドと指示どおりにトランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。（ｅ）ＩＰＳ−１欠失変異体の概略図（上）。ＨＥＫ２９３細胞に、１０ｎｇ（レーン２）又は１００ｎｇ（レーン３、５、７）のＦｌａｇ−ＩＰＳ−１ＦＬ（レーン２、３）、ＩＰＳ−１Ｎ（レーン４、５）又はＩＰＳ−１Ｃ（レーン６、７）をコードする発現プラスミドを、ＩＦＮβプロモータープラスミドとトランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。
【図４】ＩＰＳ−１が、抗ウイルス応答を誘導することを示す図である。（ａ）ＨＥＫ２９３細胞に、コントロール又はＦｌａｇ−ＩＰＳ−１をトランジェントにトランスフェクトした。全ＲＮＡを、トランスフェクションの２４時間後に調製し、ＩＦＮβ（Ifnb）、ＩＰ−１０（Cxcl10）、ＧＡＲＧ１６（Ifit1）又はＧＡＰＤＨ（Gapdh）の発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。（ｂ）ＨＥＫ２９３細胞に、１００ｎｇのＦＬＡＧ−ＩＰＳ−１と１００ｎｇのＭｙｃ−ＩＲＦ７を所定の組合せでトランジェントにトランスフェクトした。２４時間後、細胞上清のＩＦＮα濃度をＥＬＩＳＡで測定した。Ｎ．Ｄ．は、検出されず、を表す。データは、独立した３度の実験のうち、代表的な実験の３個のサンプル平均値±標準偏差として表す。（ｃ）コントロール又はＦｌａｇ−ＩＰＳ−１をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に、ＶＳＶ（ｍｏｉ＝１．０、０．１）を感染した。２４時間後、ウイルス力価を測定した。
【図５】ＩＰＳ−１によるＮＦ−κＢ活性化及びＩＬ−８誘導を示す図である。（ａ）ＨＥＫ２９３細胞に、１ｎｇ（レーン２）、１０ｎｇ（レーン３）、１００ｎｇ（レーン４）又は１μｇ（レーン５）のＦｌａｇ−ＩＰＳ−１をコードするプラスミドを、ＥＬＡＭ１プロモータープラスミドとトランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。（ｂ）ＨＥＫ２９３細胞に、１００ｎｇのＦｌａｇ−ＩＰＳ−１をコードするプラスミドと、１００ｎｇのＩＫＫβＫＮをコードするプラスミドとを所定の組合せでトランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。（ｃ）ＨＥＫ２９３細胞を、１００ｎｇのＦｌａｇ−ＩＰＳ−１ＦＬ、ＩＰＳ−１Ｎ又はＩＰＳ−１Ｃをコードするプラスミドを、ＥＬＡＭ１プロモータープラスミドとトランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。（ｄ）ＨＥＫ２９３細胞に、５００ｎｇのＩＰＳ−１の発現プラスミドをトランジェントにトランスフェクトした。２４時間後、培養上清のＩＬ−８濃度を、ＥＬＩＳＡで測定した。データは、独立した３度の実験のうち、代表的な実験の３個のサンプル平均値±標準偏差として表す。（ｅ）野生型（ＷＴ）又はＴＢＫ１及びＩＫＫｉ二重欠損マウス（ＴＢＫ１／ＩＫＫｉＫＯ）由来のＭＥＦ細胞に、Ｆｌａｇ−ＩＰＳ−１を、ＥＬＡＭ１プロモータープラスミドとトランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。
【図６】ＩＰＳ−１がＲＩＧ−Ｉ、ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１と会合することを示す図である。（ａ）ＨＥＫ２９３細胞１００万個に、Ｍｙｃ−ＩＰＳ−１、Ｆｌａｇ−Ｍｄａ５全長（ＦＬ）、Ｆｌａｇ−Ｍｄａ５△Ｃ、Ｆｌａｇ−ＲＩＧ−ＩＧＦＬ又はＦｌａｇ−ＲＩＧ−Ｉ△Ｃをコードするプラスミドを所定の組合せでトランジェントにトランスフェクトした。３６時間後、細胞可溶化液を抗Ｍｙｃ抗体又は抗Ｆｌａｇ抗体で免疫共沈降（ＩＰ）し、その後、抗Ｆｌａｇ抗体又は抗Ｍｙｃ抗体で免疫ブロット（ＩＢ）した。（ｂ）ＨＥＫ２９３細胞に、Ｍｙｃ−ＩＰＳ−１、Ｆｌａｇ−ＦＡＤＤ、Ｆｌａｇ−ＲＩＰ１又はＦｌａｇ−ＴＢＫ１を所定の組合せでトランジェントにトランスフェクトした。３６時間後、細胞可溶化液を抗Ｍｙｃ抗体又は抗Ｆｌａｇ抗体で免疫共沈降（ＩＰ）し、その後、抗Ｆｌａｇ抗体又は抗Ｍｙｃ抗体で免疫ブロット（ＩＢ）した。米印は、Ｆｌａｇ−ＲＩＰ１タンパク質を示す。（ｃ）ＨＥＫ２９３細胞に、Ｆｌａｇ−ＦＡＤＤ、Ｍｙｃ−ＩＰＳ−１ＦＬ、Ｍｙｃ−ＩＰＳ−１Ｎ又はＭｙｃ−ＩＰＳ−１Ｃを所定の組合せでトランジェントにトランスフェクトした。３６時間後、細胞可溶化液を抗Ｍｙｃ抗体又は抗Ｆｌａｇ抗体で共免疫沈降（ＩＰ）し、その後、抗Ｆｌａｇ抗体又は抗Ｍｙｃ抗体で免疫ブロット（ＩＢ）した。（ｄ）ＨＥＫ２９３細胞は、５０ｎｇ（レーン２、３、４）のＦｌａｇ−ＩＰＳ−１をコードする発現プラスミド及び、５０ｎｇ（レーン３）又は１００ｎｇ（レーン４）のＦｌａｇ−ＦＡＤＤ ＤＥＤを、ＩＦＮβプロモータープラスミドとトランジェントにトランスフェクトした。ＤＮＡの全量を、空ベクターの補充により一定に維持した。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。
【図７】ｓｉＲＮＡによるＩＰＳ−１発現のノックダウンを示す図である。（ａ）ＨｅLａ細胞又はＨＥＫ２９３細胞に、ｓｉＲＮＡをターゲットするＩＰＳ−１（Ｉｐｓ−１−１、Ｉｐｓ−１−２）をトランスフェクトし、２日後に細胞を、Ｉｐｓ−１又はＧａｐｄｈの特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲで分析し、ｓｉＲＮＡが媒介する内因性Ｉｐｓ−１ｍＲＮＡの減少を確認した。（ｂ）ｓｉＲＮＡで処理したＨＥＫ２９３細胞に、ＩＦＮβプロモータープラスミドをトランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を５μｇ／ｍｌ（レーン２、６、１０）、１０μｇ／ｍｌ（レーン３、７、１１）、又は２０μｇ／ｍｌ（レーン４、８、１２）のポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激した。１８時間後、細胞可溶化液のルシフェラーゼ活性を測定した。データは、独立した３度の実験のうち、代表的な実験の３個のサンプル平均値±標準偏差として表す。（ｃ）ｓｉＲＮＡで処理したＨＥＫ２９３細胞に、ＲＩＧ−Ｉ△Ｃ又はＴｒｉｆ及びＩＦＮβプロモータープラスミドをトランジェントにコトランスフェクトした。３６時間後、細胞可溶化液のルシフェラーゼ活性を分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。（ｄ）ｓｉＲＮＡで処理したＨＥＫ２９３細胞を、１０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）で３時間刺激し、細胞におけるIfnb、Cxcl10又はGapdhの発現をＲＴ−ＰＣＲにより分析した。（ｅ）ｓｉＲＮＡで処理したＨＥＫ２９３細胞に、ＶＳＶｍｔ又はＮＤＶを感染した。２４時間後、培養上清のＩＦＮα産生をＥＬＩＳＡで分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。
【図８】図８のａはマウスＩＰＳ−１ゲノムの構造（黒：コーディング領域、白：ノンコーディング領域）を示す図であり、図８のｂは、目的遺伝子が欠損していることを確認するためにサザンブロット法に供試した結果を示す図である。サザンブロットは、ＥｃｏＲＩで消化したマウステール由来のゲノムＤＮＡを電気泳動後、フィルターに転写し、図８のａで示したプローブを用いてハイブリダイズすることにより行った。図８のｃは、ＩＰＳ−１遺伝子の不活性化が生起していることを確認するためのノーザンブロット分析の結果を示す図である。ノーザンブロットは、野生型（＋／＋）及びＩＰＳ欠損型（−／−）のマウス胎児由来線維芽細胞（ＭＥＦ）から、ＲＮＡを抽出後、電気泳動にて展開し、フィルターに転写し、フィルターを全長ＩＰＳ−１プローブ及びβ−ａｃｔｉｎプローブを用いてハイブリダイズすることにより行った。図８のｄは、ＩＰＳ−１の発現がタンパクレベルでも消失していることを確認するためのウェスタンブロットの結果を示す図である。ウェスタンブロットは、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦからライセートを調整し、抗ＩＰＳ−１抗体で免疫沈降を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて展開させ、フィルターに転写後、抗ＩＰＳ−１抗体でブロットすることにより行った（図８のｄ上図）。また、図下はどのサンプルでも同じ量のタンパク質を用いていることを示すコントロール実験であり、この実験では全可溶化物（Ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅｓ： ＷＣＬ）を抗ＥＲＫ１／２抗体でブロットすることにより行った（ＩＢ）。
【図９】ＩＰＳ−１欠損マウスにおける各ＲＮＡウイルスに対する反応性に関する実験結果を示す図であり、図９のａは、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦに１本鎖ＲＮＡウイルスであるニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、及びセンダイウイルス（ＳｅＶ）を感染させ、２４時間後の培養上清中のサイトカイン（ＩＦＮα，ＩＦＮβ，ＩＬ−６）濃度をエライザ法により測定した結果を示す図である。なお、アスタリスクは検出感度以下を示す。図９のｂは、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦにＮＤＶ、ＶＳＶ、ＳｅＶを感染させ、図に示した時間後に細胞からＲＮＡを回収し、ＩＦＮβ、ＩＦＮα、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６の各ｍＲＮＡに相補的なプローブ（配列番号２８〜３２）を用いて遺伝子発現をノーザンブロット法にて検討した結果を示す図である。図９のｃは、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスの腹腔マクロファージに脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）を感染させ、２４時間後の培養上清中のサイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−６）濃度をエライザ法により測定した結果を示す図である。図９のｄは、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスの腹腔マクロファージにＥＭＣＶを感染させ、図で示した時間後、細胞よりＲＮＡを回収し、図で示した遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法により検討した結果を示す図である。
【図１０】ＩＰＳ−１欠損マウスにおけるポリＩ：Ｃに対する反応性に関する実験結果を示す図であり、図１０のａは、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦを図で示した濃度のポリＩ：Ｃで刺激し、２４時間後の培養上清中のサイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−６）濃度をエライザ法により測定した結果を示す図である。なお、アスタリスクは検出感度以下を示す。図１０のｂは、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦをポリＩＣで刺激した、図に示した時間後に細胞からＲＮＡを回収し、ＩＦＮβ、ＩＦＮα、ＩＰ−１０、ＩＬ−６の各ｍＲＮＡに相補的なプローブ（配列番号３３〜３６）を用いて遺伝子発現をノーザンブロット法にて検討した結果を示す図である。図１０のｃは、ヘテロ型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスにポリＩＣを静脈内注射し、計時的に採取した血清中におけるサイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−６）濃度をエライザ法により測定した結果を示す図である。
【図１１】ＩＰＳ−１欠損マウスにおけるＮＤＶ感染応答性シグナル伝達経路の解析に関する実験結果を示す図であり、図１１のａは、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦにＮＤＶを感染させ、図で示した時間後に核タンパク質を抽出し、ＮＦ−ｋＢの活性化をＥＭＳＡ法により検討した結果を示す図である。図１１のｂは、ＩＲＦ３の活性化の指標であるダイマー（二量体）形成を検討した結果を示す図である。野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦにＮＤＶを感染させ、図で示した時間後にライセートを調整した。調整したライセートをＮａｔｉｖｅＰＡＧＥで展開後、フィルターに転写し、フィルターを抗ＩＲＦ３抗体でブロットし、ダイマー（二量体）形成を検討した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｉ型インターフェロン誘導分子ＩＰＳ−１及びそれをコードするＩＰＳ−１遺伝子、ＩＰＳ−１遺伝子を発現することができる形質転換体等に関する。
【０００２】
また本発明は、Ｉ型インターフェロン誘導分子ＩＰＳ−１及びそれをコードするＤＮＡで形質転換した宿主細胞で発現させた組換えタンパク質を用いたＩ型ＩＦＮプロモーターを活性化する方法や、ＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物の抗ウイルス応答機能が喪失したモデル動物としての使用方法等に関する。
【背景技術】
【０００３】
ウイルスやバクテリア等の微生物病原体に対する自然免疫応答は、細胞発現型認識レセプター（ＰＲＲ）が、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれる侵入病原体の特異構造を認識することによって惹起される（例えば、非特許文献１及び２参照）。ＰＡＭＰを認識すると、ＰＲＲは、細胞内シグナル伝達経路を活性化し、炎症誘発性サイトカイン及びＩ型ＩＦＮの誘導と共に、適応免疫の発達に関与する樹状細胞（ＤＣ）の成熟を導く（例えば、非特許文献３参照）。その中で、ウイルス感染後のＩ型ＩＦＮ及びＩＦＮ誘導性遺伝子の産生は、抗ウイルス自然免疫応答の中核をなしている。ウイルスの複製中に産生された二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは、トール様レセプター（ＴＬＲ）によってＰＡＭＰとして認識される（例えば、非特許文献４参照）。ｄｓＲＮＡのＴＬＲ３への会合は、アダプター分子Ｔｒｉｆ（ＴＩＣＡＭ１としても知られている）のリクルートを導く（例えば、非特許文献５及び６参照）。Ｔｒｉｆは、その後ＴＢＫ１（ＮＡＫ又はＴ２Ｋとしても知られている）、及び関連ＩＫＫｉ（ＩＫＫε）プロテインキナーゼをリクルートし、転写因子ＩＲＦ３及びＩＲＦ７を触媒し、核に移動させる（例えば、非特許文献７及び８参照）。Ｔｒｉｆは、ＴＮＦレセプター結合因子（ＴＲＡＦ６）及びレセプターと相互作用するタンパク質１（ＲＩＰ１）も、直接相互作用によって集め、その後、ＩＫＫβ依存性リン酸化を介して転写因子のＮＦ−κＢファミリーを活性化し、ＮＦ−κＢ阻害分子（ＩκＢｓ）をプロテアソームによって破壊する（例えば、非特許文献９及び１０参照）。これらの転写因子は協調して、Ｉ型ＩＦＮをコードする遺伝子のプロモーターを刺激し、その結果抗ウイルス生体防御を導く。ウイルス性一重鎖ＲＮＡ及びＤＮＡが、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９によってそれぞれ認識され、形質細胞様ＤＣによってＩＦＮαを誘導することが立証された（例えば、非特許文献１１〜１３参照）。ＴＬＲ３と異なり、これらのＴＬＲは、ＭｙＤ８８を主要なアダプターとして共有している（例えば、非特許文献１４参照）。リガンド刺激に続き、ＭｙＤ８８は、ＩＲＡＫ１、ＴＲＡＦ６及びＩＲＦ７とシグナル複合体を形成する（例えば、非特許文献１５〜１７参照）。ＩＲＡＫ１は、ＩＲＦ７の核転移及び、ＩＦＮαの発現を刺激するＩＲＦキナーゼとして作用する（例えば、非特許文献１７参照）。
【０００４】
ウイルス性ｄｓＲＮＡは、ＴＬＲ非依存性細胞内センサーを介して細胞を活性化すると考えられている（例えば、非特許文献１８及び１９参照）。ＴＬＲ３が欠損しているＤＣ及び繊維芽細胞は、細胞内へのｄｓＲＮＡ導入後も、Ｉ型ＩＦＮを分泌する（例えば、非特許文献２０参照）。この分泌には、Ｔｒｉｆは必須でないが、ＴＢＫ１及びＩＲＦ３は必須であり（例えば、非特許文献２０〜２２参照）、ＴＬＲ３依存性経路も、ＴＬＲ３非依存性経路も、ＴＢＫ１に収束することを示している。最近、ＲＩＧ−Ｉは、細胞内ｄｓＲＮＡを感知するＰＲＲの新しいクラスとして作用する分子として同定された（例えば、非特許文献２３参照）。ＲＩＧ−Ｉは、カスパーゼをリクルートするドメイン（ＣＡＲＤ）様モジュールを２個有するＤＥｘＤ／Ｈｂｏｘ型ＲＮＡヘリカーゼである。へリカーゼドメインは、ｄｓＲＮＡの認識に関与していると考えられ、ＣＡＲＤは、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７及びＮＦ−κＢの活性化を導くダウンストリームシグナル伝達の開始に必須である（例えば、非特許文献２３参照）。ＲＩＧ−Ｉ欠損マウスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）及びセンダイウイルス（ＳｅＶ）の感染に対して、一貫してＩ型ＩＦＮを産生しなかった（例えば、非特許文献２４参照）。さらに、ウイルス感染に応答したＩＲＦ３及びＮＦ−κＢの活性化は、ＲＩＧ−Ｉ欠損細胞で障害されていた。したがって、ＲＩＧ−Ｉは、インビボの抗ウイルス応答に必須である。Ｍｄａ−５／ヘリカード（Helicard）は、ＲＩＧ−Ｉに類似した構造を有し、抗ウイルス応答の媒介に関与している（例えば、非特許文献２５及び２６参照）。これらのヘリカーゼは共同で、ウイルス感染を感知する細胞内センサーの新たなファミリーを構成している。さらに最近、Ｆａｓ関連デスドメイン（ＦＡＤＤ）欠損細胞で、細胞内ｄｓＲＮＡ刺激に応答したＩ型ＩＦＮの産生が障害されることが立証され、ＦＡＤＤ欠損細胞は、ウイルス感染に対し感受性があると考えられている（例えば、非特許文献２７参照）。さらに、細胞内でｄｓＲＮＡが媒介するＩＦＮ誘導には、ＲＩＰ１が必須である（例えば、非特許文献２７参照）。ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１がシグナル伝達複合体を形成することが立証されたので、これらの観察結果は、ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１が、ｄｓＲＮＡ依存性のシグナル伝達の主要な構成要素であることを示唆している。しかし、ＲＩＧ−ＩによるｄｓＲＮＡの認識が、どのようにＦＡＤＤ／ＲＩＰ１依存性及びＴＢＫ１依存性のＩ型ＩＦＮ誘導を導くのか明らかでなかった。
【０００５】
【非特許文献１】Annu Rev Immunol.20, 197-216, 2002
【非特許文献２】Annu Rev Immunol. 21,335-376, 2003
【非特許文献３】Nat Rev Immunol. 4, 499-511, 2004
【非特許文献４】Nature 413, 732-738. (2001).
【非特許文献５】J Immunol. 169, 6668-6672, 2002
【非特許文献６】Nat Immunol. 4, 161-167, 2003
【非特許文献７】Science 300, 1148-1151,2003; 8.
【非特許文献８】Nat Immunol. 4, 491-496, 2003
【非特許文献９】J Immunol. 171, 4304-4310, 2003;
【非特許文献１０】Nat Immunol 5, 503-507, 2004
【非特許文献１１】Science 303, 1526-1529, 2004
【非特許文献１２】Science 303, 1529-1531,2004
【非特許文献１３】J Immunol. 170, 3059-3064, 2003
【非特許文献１４】Int Immunol. 14, 1225-1231, 2002
【非特許文献１５】Nat Immunol. 5, 1061-1068, 2004
【非特許文献１６】Proc Natl Acad Sci USA. 101, 15416-15421, 2004
【非特許文献１７】J Exp Med. 201, 915-923, 2005
【非特許文献１８】Science 301, 640-643, 2003
【非特許文献１９】Nat Immunol. 4, 1223-1229, 2003
【非特許文献２０】J Exp Med. 199, 1641-1650, 2004
【非特許文献２１】J Exp Med. 199, 1651-1658, 2004
【非特許文献２２】Proc Natl Acad Sci USA 101, 233-238, 2004
【非特許文献２３】Nat Immunol. 5, 730-737, 2004
【非特許文献２４】Immunity (2005) in press
【非特許文献２５】Curr Biol. 12, 838-843, 2002
【非特許文献２６】Proc Natl Acad Sci USA. 101, 17264-17269, 2004
【非特許文献２７】Nature 432, 401-405, 2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、β−インターフェロン（ＩＦＮβ）等のＩ型ＩＦＮの産生を誘導する新規なシグナル伝達分子及びその遺伝子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、Ｉ型ＩＦＮ誘導物質のハイスループットスクリーニングにより、ＩＰＳ−１と命名した新規分子を同定した。ＩＰＳ−１の過剰発現は、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７及びＮＦ−ｋＢの活性化を介して、Ｉ型ＩＦＮ及びＩＦＮ誘導性遺伝子を産生して、抗ウイルス応答を誘導した。ＴＢＫ１及びＩＫＫｉは、ＩＰＳ−１が媒介するＩ型ＩＦＮプロモーター活性化に必須であった。さらに、ＩＰＳ−１の発現は、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子の内因性プロモーターを刺激した。ＩＰＳ−１は、ＲＩＧ−Ｉと会合するＮ末端ＣＡＲＤ様ドメインと、ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１をリクルートするＣ末端エフェクタードメインとの２つのドメインからなる。ｓｉＲＮＡによるＩＰＳ−１のノックダウンにより、ｄｓＲＮＡ刺激に対する抗ウイルス応答とウイルス感染が減少した。したがって、ＩＰＳ−１は、ＲＩＧ−Ｉ依存性抗ウイルス応答を媒介する新規アダプタータンパク質であると考えられる。
【０００８】
また、ＲＩＧ−Ｉは、ウイルス性ｄｓＲＮＡを感知するＴＬＲ３非依存性の細胞内センサーであるとされてきた（Nat Immunol. 5, 730-737, 2004参照）。ＲＩＧ−Ｉ欠損マウスは、ＶＳＶ、ＮＤＶ、及びＳｅＶ感染後にＩ型ＩＦＮの誘導が障害され（Immunity, 2005参照）、ＲＩＧ−Ｉがこれらのウイルスを感知する唯一のインビボのセンサーであることを示した。ＲＩＧ−Ｉの類縁体である、Ｍｄａ５／ヘリカードは、ウイルス認識にも関与している（Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17264-17269, 2004）。ＲＩＧ−ＩもＭｄａ５／ヘリカードも、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７及びＮＦ−κＢの活性化を導くダウンストリームシグナル伝達の開始に必須である、ＣＡＲＤ様モジュールを２個有している。ＲＩＧ−Ｉ及びＭｄａ５／ヘリカードは、類似したＣＡＲＤ様モジュールを含むシグナル伝達アダプターを用いることが示唆された。ＩＰＳ−１が、これらのタンパク質との相互作用を媒介する、Ｍｄａ／ヘリカード及びＲＩＧ−Ｉと相同性のあるＣＡＲＤ様ドメインを有することを見い出したことは、非常に興味深い。ＴＢＫ１及びＩＫＫｉの両方が欠損している細胞は、細胞内ｄｓＲＮＡ刺激やウイルス感染に応答して、ＩＲＦ３活性化も、ＩＦＮβ産生もしなかった（J Exp Med. 199, 1641-1650, 2004; J Exp Med. 199, 1651-1658, 2004; Proc Natl Acad Sci US A 101, 233-238, 2004）。さらに、ＩＰＳ−１は、ＴＢＫ−１及びＩＫＫｉが欠損している細胞で、ＩＦＮα及びＩＦＮβプロモーターを活性化しなかった。したがって、ＩＰＳ−１は、ＲＩＧ−ＩとＭｄａ５／ヘリカードとを、ＴＢＫ１及びＩＫＫｉを活性化するダウンストリーム分子に結合するアダプターとして作用しうる。ＲＩＧ−Ｉ△Ｃの過剰発現は、ＩＦＮβプロモーターの恒常的な活性化を導くが、全長ＲＩＧ−Ｉがプロモーターを活性化しないことは、以前に報告されている（Nat Immunol. 5, 730-737, 2004）。この観察結果は、ＲＩＧ−ＩのＣ末端領域が、ダウンストリームエフェクター分子との相互作用を防止する制御機能を有することを示唆している。ＩＰＳ−１は、常にＲＩＧ−Ｉ△Ｃと結合するが、全長ＲＩＧ−Ｉとは結合しない。したがって、ＩＰＳ−１は、刺激されていない状態では、ＲＩＧ−Ｉと結合しないが、刺激後は、ＲＩＧ−Ｉと複合体を形成し、シグナル伝達を開始すると考えられる。
【０００９】
最近、本来デスレセプターのＴＮＦレセプターファミリーのシグナル伝達分子として同定されているＦＡＤＤ及びＲＩＰ１が、細胞内ｄｓＲＮＡが媒介する機能に参画することが示された（Nature 432, 401-405, 2004）。免疫共沈澱分析で、ＩＰＳ−１はＴＢＫ１と直接会合しなかったが、そのＣ末端領域は、ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１と相互作用するようである。これらの観察結果は、ＩＰＳ−１はウイルス感染時にＣ末端エフェクタードメインを介してＦＡＤＤ及びＲＩＰ１をリクルートし、ＴＢＫ１及びＩＫＫｉ依存性ＩＲＦ３リン酸化を惹起することを示唆した。一方、ＩＰＳ−１の過剰発現又はウイルス感染に応答したＮＦ−κＢの活性化は、ＴＢＫ１及びＩＫＫｉ欠損細胞で、正常であった。同時に、発現がＮＦ−κＢ依存性であるＩＬ−６のウイルス誘導が、これらの細胞で観察された。反対に、ＦＡＤＤ欠損細胞は、ウイルス感染時に、ＩＬ−６を産生せず（Nature 432, 401-405, 2004）、ＦＡＤＤの過剰発現は、ＴＢＫ１／ＩＫＫｉ二重欠損細胞においても、ＮＦ−κＢプロモーターを活性化した（非公開データ）。したがって、ＲＩＧ−Ｉ依存性のＮＦ−κＢ活性化は、ＴＢＫ１とは独立して、ＩＰＳ−１とＦＡＤＤのダウンストリームで起こりうるが、ＩＫＫβ活性化を導く分子メカニズムは明らかになっていない。
【００１０】
多くのウイルスが、ＩＦＮ誘導を拮抗する特異的タンパク質をコードするようである。例えば、ヒトＲＩＧ−Ｉは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡが誘導するＩＲＦ３活性化に関与している（J Virol. 79, 2689-2699, 2005; J Virol. 79, 3969-3978, 2005）。しかし、ＨＣＶのＮＳ３／４プロテアーゼはＩＲＦ３リン酸化の抑制に関与し、ＲＮＡが誘導するＩＦＮ産生をブロックする。パラミキソウイルスのＶタンパク質は、Ｍｄａ−５と会合し、ダウンストリームのシグナル伝達をブロックし、ＩＦＮ誘導を阻害することが示されている（Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17264-17269, 2004）。したがって、多くのウイルスタンパク質が、分解又はＦＡＤＤ又はＲＩＰ１等のダウンストリームシグナル伝達分子のリクルートを防止するために、ＩＰＳ−１が媒介するシグナル伝達経路を標的にすることによって拮抗しうる。さらに、細胞内へのグラム陽性菌、リステリア菌（ＬＭ）の感染が、ＴＢＫ−１依存的に、そしてＴＬＲ非依存的にＩ型ＩＦＮを誘導するようである（J Immunol. 173, 7416-7425, 2004; JImmunol. 174, 1602-1607, 2005）。ＬＭに応答したＩＦＮ誘導を惹起する細胞質レセプターはまだ同定されていないが、ＩＰＳ−１は、この細胞内バクテリアによってＩＦＮ誘導に関与している可能性がある。ＩＰＳ−１が、新たに同定された細胞質ＰＲＲのＲＩＧ−Ｉ及びＭｄａ５／ヘリカードファミリーのダウンストリームで、抗ウイルス自然免疫応答を誘導するアダプター分子として作用することを明らかにした。
【００１１】
すなわち本発明は、（１）(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又は(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質；をコードするＤＮＡや、（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、（３）配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡや、（４）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、（５）前記（２）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（これらＤＮＡを総称して「本件ＤＮＡ」ということがある）に関する。
【００１２】
また本発明は、（６）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、（７）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質や、（８）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質や、（９）組換えタンパク質であることを特徴とする前記（６）〜（８）のいずれか記載のタンパク質に関する（これらタンパク質を総称して「本件タンパク質」ということがある）。
【００１３】
また本発明は、（１０）前記（６）〜（９）のいずれか記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質又は融合ペプチドや、（１１）前記（１）〜（５）のいずれか記載のＤＮＡを含み、かつＩＰＳ−１を発現することができる組換えベクターや、（１２）組換えプラスミドベクターである前記（１１）記載の組換えベクターや、（１３）さらに、レポーター遺伝子を発現することができることを特徴とする前記（１１）又は（１２）記載の組換えベクターや、（１４）レポーター遺伝子が、ホタルルシフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする前記（１１）又は（１２）記載の組換えベクターや、（１５）前記（１１）〜（１４）のいずれか記載の組換えベクターが導入され、かつＩＰＳ−１を発現する形質転換体に関する。
【００１４】
本発明はまた、（１６）ＩＰＳ−１遺伝子を有する組換えベクターによって形質転換された形質転換体や、（１７）形質転換体が、哺乳類細胞由来であることを特徴とする前記（１５）又は（１６）記載の形質転換体や、（１８）哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞又はＭＥＦ細胞である前記（１７）に記載の形質転換体や、（１９）前記（６）〜（９）のいずれか記載のタンパク質又はその部分ポリペプチドを認識する抗体や、（２０）モノクローナル抗体であることを特徴とする前記（１９）記載の抗体や、（２１）ＩＰＳ−１遺伝子の機能が染色体上で欠損し、野生型において発現されるＩＰＳ−１を発現する機能が失われていることを特徴とするＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物や、（２２）げっ歯類動物であることを特徴とする前記（２１）記載のＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物や、（２３）げっ歯類動物が、マウスであることを特徴とする前記（２２）記載のＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物に関する。
【００１５】
さらに本発明は、（２４）（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、（ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｆ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；のいずれか記載ＤＮＡを、ＩＰＳ−１活性を有するタンパク質の製造に使用する方法や、（２５）（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質、（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質；のいずれか記載のタンパク質を用いて、Ｉ型ＩＦＮプロモーターを活性化する方法や、（２６）タンパク質が、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、（ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｆ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；のいずれか記載ＤＮＡで形質転換した宿主細胞で発現させた組換えタンパク質であることを特徴とする上記（２５）記載のＩＦＮβプロモーターを活性化する方法や、（２７）（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質、（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質；のいずれか記載のタンパク質を、Ｉ型ＩＦＮの製造に使用する方法や、（２８）タンパク質が、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、（ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｆ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；のいずれか記載ＤＮＡで形質転換した宿主細胞で発現させた組換えタンパク質であることを特徴とする上記（２７）記載の使用する方法や、（２９）ＩＰＳ−１遺伝子の機能を染色体上で欠損させたＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物の、Ｉ型ＩＦＮプロモーターの活性化による抗ウイルス応答機能が喪失したモデル動物としての使用方法や、（３０）非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする上記（２９）記載の抗ウイルス応答機能が喪失したモデル動物としての使用方法に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によると、ＩＦＮβ等のＩ型ＩＦＮの産生を誘導する新規なシグナル伝達分子ＩＰＳ−１及びＩＰＳ−１遺伝子を提供することができ、ＩＰＳ−１機能を標的とした薬剤は、ウイルス感染を制御するために、治療的に有用である。
【００１７】
また、本発明の本件ＤＮＡをＩＰＳ−１活性を有するタンパク質の製造に使用する方法や、本発明のＩＰＳ−１又はＩＰＳ−１をコードするＤＮＡで形質転換した宿主細胞で発現させた組換えタンパク質を用いたＩ型ＩＦＮプロモーターを活性化する方法や、本発明の本件タンパク質をＩ型ＩＦＮの製造に使用する方法は、ＩＰＳ−１が、ＩＦＮ−αをはじめとする各種サイトカイン産生の特異的な調節に対する治療上のターゲットとなる可能性を与え、ウイルス感染や自然免疫疾患への治療へ応用することができる。また、前記方法により、Ｉ型ＩＦＮプロモーターを活性化させてＩ型インターフェロン等を製造することも可能である。さらに、Ｉ型ＩＦＮプロモーターの活性化機能を阻害（又は増強）する化合物のスクリーニングに利用することが可能である。
【００１８】
また、本発明のＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物の抗ウイルス応答機能が喪失したモデル動物としての使用方法によれば、人工的に抗ウイルス応答機能が働かない状態を作り出すことができ、生体内におけるウイルス応答機能を明らかにするためや、ＲＮＡｉの作用機作の解明や、ウイルス感染症の治療方法の解明や、抗ウイルス薬をスクリーニングすることも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明のＤＮＡとしては、（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質ＩＰＳ−１をコードするＤＮＡ；（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；（Ｄ）配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＩＰＳ−１遺伝子ＤＮＡ；（Ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；又は（Ｆ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；の何れかのＤＮＡであれば特に制限されず、また、本発明のタンパク質としては、（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質ＩＰＳ−１；（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質；又は（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質；の何れかのタンパク質であれば特に制限されず、ここで「ＩＰＳ−１活性を有する」とは、Ｉ型ＩＦＮプロモーターを活性化する機能を有することを意味する。
【００２０】
上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。また、上記「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。
【００２１】
例えば、これら１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.以後 "モレキュラークローニング第２版" と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
【００２２】
上記「配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、配列番号２に示されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であれば特に制限されるものではないが、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上であることを意味する。
【００２３】
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、５０〜７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。
【００２４】
本発明のＩＰＳ−１遺伝子ＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１又は配列番号２に示される塩基配列又はアミノ酸配列情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該遺伝子が存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的の遺伝子を単離したり、あるいは、常法に従って化学合成により調製することができる。
【００２５】
具体的には、本発明のＩＰＳ−１ｍＲＮＡが多く発現する心臓及び骨格筋より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明の遺伝子に特有の適当なプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明の遺伝子を取得することができる。また、これらの細胞又は組織からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明の遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、実施例記載のハイスループットスクリーニング方法や、モレキュラークローニング第２版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。
【００２６】
また、上記（Ｂ）〜（Ｆ）のいずれかに示される塩基配列からなる本発明の変異遺伝子又は相同遺伝子としては、配列番号１に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡ断片を利用し、他の生物体等より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。その他、前述の変異ＤＮＡの作製方法により調製することもできる。
【００２７】
本発明のタンパク質の取得・調製方法は特に限定されず、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現している細胞又は組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。化学合成によりタンパク質を調製する場合には、例えば、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードするＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。
【００２８】
例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明のタンパク質を調製する場合、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。
【００２９】
さらに、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例を示す配列番号１に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。例えば、配列番号１に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡをプローブとしてヒト以外の生物より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニング後、発現ベクターに組み込み適当な宿主で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるタンパク質を製造することができる。
【００３０】
本発明の融合ペプチドとしては、上記本発明のタンパク質とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよい。マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本発明のペプチドの精製や、本発明のペプチドの検出や、本発明のペプチドに対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００３１】
本発明の組換えベクターとしては、前記本発明の遺伝子を含み、かつＩＰＳ−１を発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、本発明の組換えベクターは、本発明の遺伝子を発現ベクター、好ましくは発現プラスミドベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明の遺伝子を発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。
【００３２】
上記発現ベクターとして、例えば、ｐＣＭＶ６−ＸＬ３（OriGene Technologies Inc.社製）、ＥＧＦＰ-Ｃ１（Clontech社製）、ｐＧＢＴ−９(Clontech社製)、ｐｃＤＮＡＩ（フナコシ社製）、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７（Cytotechnology, 3,133, 1990）、ｐＣＤＭ８（Nature, 329, 840, 1987）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Invitrogen社製）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０３（J.Blochem., 101, 1307,1987）、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。また、プロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。さらに、プロモーターの下流に蛍光蛋白質をコードする遺伝子等のレポーター遺伝子を融合することができる。蛍光蛋白質としては、緑色蛍光蛋白質（Green Fluorescence Protein（ＧＦＰ））、赤色蛍光蛋白質（Cyan Fluorescence Protein（ＣＦＰ））、青色蛍光蛋白質（Blue Fluorescence Protein（ＢＦＰ））、黄色蛍光蛋白質（Yellow Fluorescence Protein（ＹＦＰ））、ルシフェラーゼ（luciferase）を例示することができる。
【００３３】
また、本発明の形質転換体としては、上記本発明の組換えベクターが宿主細胞に導入され、かつＩＰＳ−１を発現する形質転換体であれば特に制限されず、形質転換酵母、形質転換植物（細胞、組織、個体）、形質転換細菌、形質転換動物（細胞、組織、個体）を挙げることができるが、形質転換動物細胞が好ましい。
【００３４】
遺伝子工学により形質転換される株化された宿主細胞としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＭＥＦ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ１２７細胞、ＨＫＧ細胞、ヒト腎細胞株等が挙げられる。具体的には、ＣＨＯ−Ｋ1（チャイニーズハムスター卵巣細胞：ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、ＢＨＫ（ハムスター腎細胞：ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）、ＣＯＳ−７（ＣＶ−１Ｏｒｉｇｉｎ， ＳＶ−４０細胞：ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎細胞：ＡＴＣＣ ＣＣＬ８１）等があり、更にはマウスミエローマ細胞（Ｘ６３−Ａｇ８−６５３；Ｐ３Ｕ１）、ヒトリンパ芽球細胞（ＩＭ−９，ＡＴＣＣＣＣＬ１５９）、ヒトヒトハイブリドーマ作製用親細胞、ならびにこれらのｄｈｆｒ欠損株、ＨＧＰＲＴ欠損株、ウアバイン耐性株等を例示することができる。動物細胞への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（モレキュラークローニング第２版）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができる。
【００３５】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる（例えば、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manua1；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Bio/Technology, 6, 47(1988)等に記載）。バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ(インビトロジェン社製)等を用いることができる。組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
【００３６】
形質転換細菌の作製に用いられる細菌の宿主細胞の具体例としては、エッシェリヒア（Escherichia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、バチラス（Bacillus）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、セラチア（Serratia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、エルウニア（Erwinia）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属、ザイモモナス（Zymomonas）属等に属する微生物を挙げることができる。細菌宿主へ組換えベクターを導入する方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法やプロトプラスト法等を挙げることができる。
【００３７】
ＩＰＳ−１等の前記本発明のタンパク質又はその部分ポリペプチドを認識する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記ＩＰＳ−１等の前記本発明のタンパク質又はその部分ポリペプチドを抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等のＩＰＳ−１等の前記本発明のタンパク質又はその部分ポリペプチドに特異的に結合する抗体は、例えば、ＩＰＳ−１等の前記本発明のタンパク質の変異又は欠失に起因する疾病の診断やＩＰＳ−１等の分子機構を明らかにする上で有用である。
【００３８】
ＩＰＳ−１等の前記本発明のタンパク質又はその部分ポリペプチドに対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に該ＩＰＳ−１等の前記本発明のタンパク質又はその部分ポリペプチド若しくはエピトープを含む断片を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc.,1985）など任意の方法を用いることができる。以下にＩＰＳ−１等の前記本発明のタンパク質又はその部分ポリペプチドとして、ヒトＩＰＳ−１を例に挙げてＩＰＳ−１に対して特異的に結合するマウスのモノクローナル抗体、すなわち抗ヒトＩＰＳ−１モノクローナル抗体の作製方法を説明する。
【００３９】
上記抗ヒトＩＰＳ−１モノクローナル抗体は、抗ヒトＩＰＳ−１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをインビボ又はインビトロで常法により培養することにより生産することができる。例えば、インビボ系においては、齧歯動物、好ましくはマウス又はラットの腹腔内で培養することにより、またインビトロ系においては、動物細胞培養用培地で培養することにより得ることができる。インビトロ系でハイブリドーマを培養するための培地としては、ストレプトマイシンやペニシリン等の抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０又はＭＥＭ等の細胞培養培地を例示することができる。抗ヒトＩＰＳ−１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、ヒトＩＰＳ−１を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、免疫されたマウスの脾臓細胞とマウスＮＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１８）とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングすることにより、抗ヒトＩＰＳ−１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作出することができる。また、かかるモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、アフィニティークロマトグラフィー等の液体クロマトグラフィーを具体的に例示することができる。
【００４０】
また、本発明の上記ヒトＩＰＳ−１に対する一本鎖抗体をつくるためには、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、そのヒトＩＰＳ−１を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。ヒトＩＰＳ−１に対する抗体は、ヒトＩＰＳ−１の分子機構を明らかにする上で有用である。
【００４１】
また上記抗ヒトＩＰＳ−１モノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ又は３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、上記ヒトＩＰＳ−１の機能解析を行うことができる。また免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
【００４２】
本発明のＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物としては、ＩＰＳ−１遺伝子の機能が染色体上で欠損し、野生型において発現されるＩＰＳ−１を発現する機能が失われている非ヒト動物であれば特に制限されるものではない。本発明のＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物としては、マウスやラット等のげっ歯類、特に、ＩＰＳ−１遺伝子の機能が染色体上で欠損したＩＰＳ−１ノックアウトマウスを好適に挙げることができ、ＩＰＳ−１ノックアウトマウスは、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用い、ＩＰＳ−１遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたＩＰＳ−１遺伝子を、ウイルスベクターやプラスミドベクター等を用いてサブクローンし、制限酵素マッピング及びＤＮＡシーケンシングにより特定することができる。次に、このＩＰＳ−１をコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３’末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲットベクターを作製する。この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型マウスと交雑させると、ヘテロ接合体マウス（Ｆ１マウス：＋／−）を得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスを交雑させることによって、ＩＰＳ−１ノックアウトマウスを作製することができる。また、ＩＰＳ−１ノックアウトマウスにおいて、ＩＰＳ−１がノックアウトされているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスにおけるＩＰＳ−１の発現の有無をウエスタンブロット法等により調べる方法がある。ＩＰＳ−１ノックアウトマウスは、分子レベルでのＩＰＳ−１の作用を調べる上で有用である。
【００４３】
本発明のＩ型ＩＦＮプロモーターを活性化する方法としては、本件タンパク質又は本件ＤＮＡで形質転換した宿主細胞で発現させた組換えタンパク質を用いて、Ｉ型ＩＦＮプロモーターを活性化する方法であれば特に制限されず、例えば、上記本件タンパク質又は組換えタンパク質を用いてＩ型ＩＦＮプロモーターを活性化させ、Ｉ型インターフェロン等を製造することも可能である。また、被験物質が存在する細胞内でＩ型ＩＦＮプロモーターを活性化させ、該プロモーターの活性化の程度を、被験物質を投与していない場合と比較・評価することにより、Ｉ型ＩＦＮプロモーター活性化機能を阻害（又は増強）する化合物をスクリーニングすることも可能である。さらに、ＩＰＳ−１は、インターフェロンαをはじめとする各種サイトカインの産生に関与する分子であることから、インターフェロンαが必要とされる疾病、例えば、ウイルス感染症の遺伝子治療に使用することができ、ＩＰＳ−１等の遺伝子のアンチセンス鎖は、形質細胞様樹状細胞からのインターフェロンαの過剰産生が病態と考えられているＳＬＥ(全身性エリテマトーデス)の遺伝子治療に使用することができる。また、ウイルス感染や自然免疫疾患の治療への遺伝子レベルでの研究において使用することも可能である。
【００４４】
また、本発明は、本件ＤＮＡをＩＰＳ−１活性を有するタンパク質の製造に使用する方法に関する。ＩＰＳ−１活性を有するタンパク質の製造における使用形態は特に制限されないが、本件ＤＮＡで形質転換した宿主細胞を培養することにより、組換えタンパク質として発現させる、ＩＰＳ−１活性を有するタンパク質の製造に使用する方法などを好適に例示することができる。また、本発明は、本件タンパク質をＩ型ＩＦＮの製造に使用する方法にも関する。Ｉ型ＩＦＮの製造における使用形態は特に制限されないが、本件タンパク質を用いてＩ型ＩＦＮプロモーターを活性化させる、Ｉ型インターフェロン等の製造に使用する方法などを好適に例示することができる。
【００４５】
本発明のＩ型ＩＦＮプロモーターの活性化による抗ウイルス応答機能が喪失したモデル動物としての使用方法としては、ＩＰＳ−１遺伝子の機能を染色体上で欠損させたＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物をＩ型ＩＦＮプロモーターの活性化による抗ウイルス応答機能が喪失したモデル動物として使用する方法であれば特に制限されず、Ｉ型ＩＦＮプロモーターの活性化による抗ウイルス応答機能が喪失したとは、各種ウイルス（例えば、ニューカッスル病ウイルス：ＮＤＶ、水疱性口内炎ウイルス：ＶＳＶ、センダイウイルス：ＳｅＶ、及び脳心筋炎ウイルス：ＥＭＣＶ等のＲＮＡウイルス）の感染に対する各種サイトカイン（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ及びＩＬ−６など）による抗ウイルス応答機能が喪失していることをいい、上記ＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物は、I型ＩＦＮプロモーターの活性化による抗ウイルス応答機能が喪失していることから、マウス内においてウイルスがより活発に増殖するという性質を有している。従って、ＩＰＳ−１ノックアウトマウスは、ウイルス感染のモデルマウスとして利用することができ、このマウスを用いて抗ウイルス薬の開発などへの応用が期待される。また、インターフェロン等のウイルス応答機能により、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは培養が難しいとされているウイルスであっても、このマウス由来の細胞を適用すれば、インターフェロン等の抗ウイルス応答機能が抑制されているため、培養することが可能であり、培養可能になれば、ウイルスのライフサイクルや感染メカニズムの理解、長鎖ｄｓＲＮＡによるＲＮＡｉの作用メカニズムの解明、さらにはそのウイルスに対する薬剤開発への応用が期待される。
【００４６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４７】
（ＩＰＳ−１の同定）
本発明者らは、発現クローニングストラテジーにより、ＩＦＮβプロモーターを活性化する分子を同定した。発現プラスミドにクローニングしたｃＤＮＡライブラリーの一部を、１００個のｃＤＮＡのプールに細分し、各ＤＮＡプールを、ＩＦＮβプロモーターＬｕｃレポタープラスミドと共にＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。平均的活性と比較して、５倍以上の活性を示すプールを陽性とした（図１ａ）。ヒトの胎盤、脾臓、抹消血白血球（ＰＢＬ）の各ｃＤＮＡライブラリーの一次スクリーニングにより、２８の陽性プールを得た。各陽性プールから、ＩＦＮβプロモーター活性化に関与する単一のクローンを単離した（図１ｂ）。
【００４８】
２４００個のプールをスクリーニングした結果、合計１５のクローンを同定した。ＩＲＦ７のクローン６個、ＩＲＦ３のクローン３個、ＩＲＦ１のクローン２個及びＩＲＦ８のクローン１個を含む、１２個のクローンはプロモーターを活性化することがすでに報告されている（表１）。この他に、本発明者らは、新規ＩＦＮ誘導物質としてジンクフィンガータンパク質ＣＸＸＣ５及びプロテインキナーゼＣｄｃ４２ｂｐｂを同定した。さらに、本発明者らは、約８００倍の活性化を誘導する新規分子を単離した。このクローンは、５４０個のアミノ酸のオープンリーディングフレームからなり（図２ａ、２ｂ）、相同性検索により、Ｎ末端にＭｄａ−５／ヘリカードのＣＡＲＤに類似した領域が明らかとなった（同一性２７％）（図２ｃ）。比較分析により、かかるタンパク質が、ＲＩＧ−ＩのＣＡＲＤとも相同性を有することが示された（図２ｄ）。しかし、かかるタンパク質と他のＣＡＲＤ含有タンパク質との類似性は見い出せなかった。そこで、ＧＷＸＸＸＦφＸＡＬ（φは、疎水性）の保存配列を有するかかるドメインをＣＡＲＤ様ドメイン（ＣＬＤ）と命名した。Ｃ末端の非ＣＬＤ領域は、他の既知のタンパク質又はドメインと類似性はなかった。ＩＦＮβプロモーターの活性化能に基づき、このタンパク質をＩＦＮβプロモーター刺激剤−１としてＩＰＳ−１と命名した。
ヒトＩＰＳ−１の発現を、多組織ノーザンブロットによって調べた（図２ｅ）。ＩＰＳ−１ｍＲＮＡは、心臓及び骨格筋で多く発現したが、脳、胎盤、肺、肝臓、腎臓及び膵臓ではわずかしか発現しなかった。
【表１】
【実施例２】
【００４９】
（ＩＰＳ−１は、Ｉ型ＩＦＮプロモーターを活性化する。）
ＨＥＫ２９３細胞内でのＦｌａｇ標識ＩＰＳ−１発現プラスミドの過剰発現は、ＩＦＮβプロモーターを用量依存的に活性化した（図３ａ）。同様に、ＩＰＳ−１の過剰発現は、ＩＲＦファミリーによって制御されているＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ及びＩＳＲＥプロモーターを用量依存的に活性化した（図３ａ）。次に、ＩＦＮα４及びＩＦＮα６プロモーターＬｕｃコンストラクトを用いて、ＩＦＮαプロモーター活性化を分析した。ＩＰＳ−１のみの過剰発現は、ＩＦＮα４及びＩＦＮα６プロモーター活性化をわずかに誘導した（図３ｂ）。しかし、ＩＲＦ７が同時発現すると、ＩＦＮα４プロモーター、ＩＦＮα６プロモーターの両方が相乗的に活性化し（図３ｂ）、ＩＰＳ−１が、ＩＲＦ７媒介性転写活性を増強したことを示した。さらに、Ｆｌａｇ−ＩＰＳ−１と同時発現すると、Ｍｙｃ−ＩＲＦ３及びＭｙｃ−ＩＲＦ７がゆっくりと移動することを見い出した（図３ｃ）。この移動は、リン酸化によるものである。なぜなら、ホスファターゼ処理により、ゆっくりとした移動は消失し（データは示されていない）、ＩＰＳ−１が、ＩＲＦ３及びＩＲＦ７のリン酸化を誘導することを明らかにしたからである。
【００５０】
次に、ＴＢＫ１／ＩＫＫｉ二重欠損マウス由来のマウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）を用いて、ＩＰＳ−１が媒介するＩＦＮ誘導がこれらのキナーゼに依存するか否かを調べた。ＩＦＮβプロモーター活性は、ＩＰＳ−１発現プラスミドをトランスフェクトした野生型ＭＥＦで増加したが、ＴＢＫ１／ＩＫＫｉ二重欠損ＭＥＦでは活性化は観察されなかった（図３ｄ）。他方、ＴＢＫ１の過剰発現は、野生型とＴＢＫ１／ＩＫＫｉ二重欠損ＭＥＦとの両方でプロモーターを活性化した。同様に、ＴＢＫ１の発現は、ＴＢＫ１／ＩＫＫｉ二重欠損細胞でＩＦＮα４プロモーターを活性化したが、ＩＰＳ−１の発現は活性化せず、ＩＰＳ−１依存性のＩＦＮプロモーター活性化にＴＢＫ１及びＩＫＫｉが必須であるあることを示した（図３ｄ）。
【００５１】
本発明者らは、２つのＩＰＳ−１の欠損変異体、Ｎ末端ＣＬＤのみをコードするＩＰＳ−１Ｎと、Ｃ末端非ＣＬＤ領域のみを含むＩＰＳ−１Ｃとを作製した。ＩＰＳ−１Ｎの過剰発現は、ＩＦＮβプロモーターを活性化したが、全長の過剰発現と比べると活性化は弱かった。ＩＰＳ−１Ｃの発現は、プロモーターを活性化せず（図３ｅ）、ＩＰＳ−１が媒介するＩＦＮβプロモーター活性化には、構造全体が必要であることを示した。
【実施例３】
【００５２】
（ＩＰＳ−１の発現は、抗ウイルス応答を与える。）
ＩＰＳ−１発現後の、内因性Ｉ型ＩＦＮ及びＩＦＮ誘導性遺伝子の誘導を分析した。ＨＥＫ２９３細胞におけるＦｌａｇ−ＩＰＳ−１の過剰発現は、内因性ＩＦＮβ（Ifnb）及び、ＩＰ−１０（Cxcl10）及びＧＡＲＧ１６（Ifit1）等のＩＦＮ誘導性遺伝子の誘導を刺激した（図４ａ）。さらに、培養上清内のＩＦＮα産生は、ＩＰＳ−１をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞でも観察され、この誘導は、ＩＲＦ７の同時発現によって増強した（図４ｂ）。このように、ＩＰＳ−１の発現は、これらの遺伝子の内因性プロモーター活性化を導く。次に、コントロール又はＩＰＳ−１をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞にＶＳＶを感染し、感染の２４時間後にウイルス力価を測定した。ウイルス力価は、コントロール細胞と比較してＩＰＳ−１発現細胞で著しく減少した（図４ｃ）。これらの結果は、ＩＰＳ−１のみの発現が、恐らくＩ型ＩＦＮ等の抗ウイルス性サイトカインを産生することによって、抗ウイルス応答を与えるのに十分であることを示唆した。
【実施例４】
【００５３】
（ＩＰＳ−１はＮＦ-κＢを活性化する。）
ＩＰＳ−１の発現がＮＦ−κＢを活性化するか否かを調べるために、ＨＥＫ２９３細胞に、ＩＰＳ−１を、ＥＬＡＭ１プロモーターＬｕｃコンストラクトとトランジェントにトランスフェクトした。ＩＰＳ−１の発現は、用量依存的にＮＦ-κＢ活性化を導いた（図５ａ）。さらに、この活性化は、触媒陰性（catalytic negative）ＩＫＫβ（Ｋ４４Ａ）の同時発現によって阻害された（図５ｂ）。ＩＰＳ−１ＮもＩＰＳ−１ＣもＮＦ−κＢを活性化しなかった（図５ｃ）。さらに、ＩＰＳ−１発現プラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の培養上清において、ＩＬ−８の産生が観察されたが、コントロールプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞では観察されなかった。これは、ＩＰＳ−１が内因性ＮＦ−κＢプロモーターも活性化することを示唆している（図５ｄ）。ＩＦＮα及びＩＦＮβプロモーター活性化と異なり、ＩＰＳ−１の過剰発現は、ＴＢＫ１／ＩＫＫｉ二重欠損ＭＥＦでＥＬＡＭ１活性化を誘導した（図５ｅ）。さらに、ＴＲＡＦ６欠損ＭＥＦでは、ＩＰＳ−１によるＮＦ−κＢ及びＩＦＮβプロモーター活性化が引き続き観察された。これらの結果は、ＩＰＳ−１によるＮＦ−κＢ活性化は、ＩＫＫβ依存的であるが、ＴＲＡＦ６及びＴＢＫ１／ＩＫＫｉに非依存的であることを示している。
【実施例５】
【００５４】
（ＩＰＳ−１は、ＲＩＧ−Ｉ、Ｍｄａ５、ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１と複合体を形成する。）
ＩＰＳ−１、Ｍｄａ５及びＲＩＧ−Ｉの配列類似性により、これらの分子が物理的に互いに会合するかどうかを調べてみた。ＨＥＫ２９３細胞に、Ｍｙｃ−ＩＰＳ−１を、Ｆｌａｇ−Ｍｄａ５、Ｆｌａｇ−Ｍｄａ５△Ｃ、Ｆｌａｇ−ＲＩＧ−Ｉ又はＦｌａｇ−ＲＩＧ−Ｉ△Ｃとトランスフェクトし、細胞可溶化液を抗Ｍｙｃ抗体で免疫沈降した。Ｍｙｃ−ＩＰＳ−１及びＦｌａｇ−ＲＩＧ−Ｉ△Ｃの両方を発現する細胞で、免疫共沈降が観察された（図６ａ）。さらに、弱いものの、Ｍｙｃ−ＩＰＳ−１及びＦｌａｇ−Ｍｄａ５△Ｃ間で会合が観察された（図６ａ）。ＩＰＳ−１のＣＬＤが発現したときにも、類似した会合が観察された（データは示されていない）。これらの結果は、ＩＰＳ−１のＣＬＤがＲＩＧ−Ｉ及びＭｄａ−５のＮ末端ＣＡＲＤ含有領域と会合することを示した。
【００５５】
ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１が、ｄｓＲＮＡが誘導する抗ウイルス応答に関連していたので、これらの分子の相互作用を調べた。Ｆｌａｇ−ＦＡＤＤ及びＦｌａｇ−ＲＩＰ１ は、Ｍｙｃ−ＩＰＳ−１と共沈殿したが、Ｆｌａｇ−ＴＢＫ１はしなかった（図６ｂ）。ＦＡＤＤとの相互作用に、ＩＰＳ−１Ｃは必須であったが、ＩＰＳ−１Ｎは必須でなかった（図６ｃ）。さらに、ＩＰＳ−１が媒介するＩＦＮβプロモーター活性化は、Ｎ末端デスエフェクタードメインをコードするＦＡＤＤ ＤＥＤの発現によって減少し、ＦＡＤＤ ＤＥＤがＩＰＳ−１依存性シグナル伝達に関連するドミナントネガティブな変異体として作用することを示唆した（図６ｄ）。
【実施例６】
【００５６】
（ＩＰＳ−１ノックダウンはＩＦＮ応答をブロックする。）
ｓｉＲＮＡオリゴを用いてＩＰＳ−１の内因性発現を減少し、ＩＰＳ−１の生理機能を調べた。ヒトＩＰＳ−１ｍＲＮＡの異なる部分を標的とする二本鎖２１−ｍｅｒ ＲＮＡを３個用意した。パイロット実験では、トランスフェクションの４８時間後に、２個のｓｉＲＮＡ（Ｉｐｓ−１−１、Ｉｐｓ−１−２）が、ＲＴ−ＰＣＲで定量したように、Ｈｅｌａ細胞内のＩＰＳ−１のノックダウンを誘導した（図７ａ）。かかるｓｉＲＮＡによるＩＰＳ−１の発現の減少は、７日間続いた（データは示されていない）。そこで、かかる２つのｓｉＲＮＡを新たな分析に使用した。コントロールｓｉＲＮＡ（コントロール）、Ｉｐｓ−１−１又はＩｐｓ−１−２を、ＨＤＫ２９３細胞にトランスフェクトし、全ＲＮＡを、４８時間後にＲＴ−ＰＣＲ分析用に調製し、標的遺伝子の発現の減少を確認したが、Ｇａｐｄｈの発現には何の影響もなかった（図７ａ）。
【００５７】
ｄｓＲＮＡトランスフェクションが誘導するＩＦＮβプロモーター活性化に対する、ｓｉＲＮＡの影響を調べてみた。コントロール、Ｉｐｓ−１−１又はＩｐｓ−１−２で処理したＨＥＫ２９３細胞に、ＩＦＮβプロモーターＬｕｃコンストラクトをトランスフェクトし、その後、合成ｄｓＲＮＡポリ（Ｉ：Ｃ）を異なる濃度でトランスフェクトした。Ｉｐｓ−１発現のノックダウンは、ポリ（Ｉ：Ｃ）刺激後にプロモーター活性の減少を導いた（図７ｂ）。さらに、コントロール又はＩｐｓ−１−１ｓｉＲＮＡをトランジェントにトランスフェクション処理したＨＥＫ２９３細胞に、ＲＩＧ−Ｉ△Ｃ又はＴｒｉｆを発現させた。ＲＩＧ−Ｉ△Ｃは恒常的にＩＦＮβプロモーターを活性化することを示した（Nat Immunol. 5, 730-737, 2004）。ＲＩＧ−Ｉ△Ｃが誘導するプロモーター活性化は、Ｉｐｓ−１−１処理細胞で減少したが、Ｔｒｉｆが誘導する活性化は、これらの細胞で減少しなかった（図７ｃ）。したがって、ＩＰＳ−１は、ＲＩＧ−Ｉ依存性シグナル伝達に必須であるが、Ｔｒｉｆ依存性シグナル伝達には必須でない。
【００５８】
ポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＩＦＮβ及びＩＦＮ誘導性遺伝子の発現を調べた。ポリ（Ｉ：Ｃ）トランスフェクションの３時間後のＩＦＮβ及びＩＰ−１０メッセージの誘導は、コントロールで処理した細胞と比較して、Ｉｐｓ−１−１及びＩｐｓ−１−２で処理したＨＥＫ２９３細胞で著しく減少し（図７ｄ）、ＩＰＳ−１が、ｄｓＲＮＡが媒介する遺伝子誘導に必須であることを示唆した。次に、ｓｉＲＮＡで処理したＨＥＫ２９３細胞を、細胞変異性でないＶＳＶ変異体（ＶＳＶｍｔ）（J Virol. 76, 8011-8018, 2002）又はＮＤＶで感染し、ＩＦＮαを測定した。Ｉｐｓ−１−１又はＩｐｓ−１−２で処理した細胞における、ウイルス感染２４時間後のＩＦＮα産生は、コントロールｓｉＲＮＡで処理した細胞と比較して、顕著に減少した（図７ｅ）。したがって、ＩＰＳ−１は、ウイルス感染に対する抗ウイルス応答にも、ｄｓＲＮＡ刺激にも必須である。
【実施例７】
【００５９】
（ホモ型ノックアウトマウスは健康に生育する。）
ＩＰＳ-/-マウスは、予想されたメンデル比で生まれ、繁殖性であり、健康に育ち、１０週の年齢まで異常を示さなかった。また、ホモ接合体（−／−）において、ＩＰＳ−１遺伝子の機能が欠損していることを確認するためサザンブロット分析を行った。マウスの尾部より抽出したゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化した遺伝子断片と、以下に示した放射能標識をしたマウスゲノム由来のプローブ（配列番号２７）を用いてサザンブロット法により確認した。その結果、野生型（＋／＋）には単一の１１．３ｋｂバンドが、ホモ接合体（−／−）には７．０ｋｂバンドが、ヘテロ接合体（＋／−）にはその両方のバンドが得られた（図８ｂ参照）。次に、ホモ接合体（−／−）において、ＩＰＳ−１遺伝子が発現していないことを確認するためノーザンブロット分析を行った（図８ｃ参照）。さらに、ＩＰＳ−１の発現がタンパク質レベルでも消失していることを確認するために、ウェスタンブロット分析を行った（図８ｄ参照）。図８のｄの矢印に示した箇所が内在性ＩＰＳ−１タンパクであり、野生型（＋／＋）では現れているバンドが、ホモ接合体（−／−）には現れていないのが確認できる。
マウスゲノム由来のプローブ：AACCATGCAGGCCAGGAAGCTGGATTGTTACAATGACCTTCGTGGTTCAGCA
AGGACAAGGCTATCTATAACTGCATTTAGACGCTGGTCCTCACAGGCCTGGTGCTCTTTTTGCAAGAATTAAATAAGAGGCCCTTGTTGCTTTCAACAAGACTAAGTCACTAAACCTCACTTCAGAGTTGTTTTTTACATTTTCAAATTTGTTTTGTAGGGACAGGCAGTTGTGGACATCAGA（配列番号２７）
【実施例８】
【００６０】
（ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスは、各ＲＮＡウイルスに対する反応性を喪失し、ウイルス感染のモデルマウスとして利用できる。）
ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスにおける各ＲＮＡウイルス、具体的にはニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、及びセンダイウイルス（ＳｅＶ）に対する反応性を調べた。まず、野生型（＋／＋）、及びＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦに１本鎖ＲＮＡウイルスであるニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、及びセンダイウイルス（ＳｅＶ）を感染させ、２４時間後の培養上清中のサイトカイン（ＩＦＮα，ＩＦＮβ，ＩＬ−６）濃度をエライザ法により測定した。結果は図９のａに示すとおりである。次に、野生型（＋／＋）、及びＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦにＮＤＶ、ＶＳＶ、ＳｅＶを感染させ、０、９、１８時間後に細胞からＲＮＡを回収し、ＩＦＮβ、ＩＦＮα、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６の各ｍＲＮＡに相補的なプローブを用いて、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮα、ＩＰ−１０、ＲＮＡＴＥＳ、及びＩＬ−６の遺伝子発現をノーザンブロット法にて検討した。なお、プローブは以下の（１）〜（５）に示した。また、ポジティブコントロールとして、β−ａｃｔｉｎを用い、プローブは、Hemmi H et al., J. Exp. Med., 199: 1641-1650, 2004に記載のプローブを用いた。結果は図９のｂに示すとおりである。図９のａ及びｂより、ＩＰＳ−１欠損マウスは、上記ウイルス（ＮＤＶ、ＶＳＶ及びＳｅＶ）による各種サイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６）の産生が抑制されることが確認された。
（１）ＩＦＮ−β；CCTGCTGTGCTTCTCCACCACAGCCCTCTCCATCAACTATAAGCAGCTCCAGCTCCAAGAAA
GGACGAACATTCGGAAATGTCAGGAGCTCCTGGAGCAGCTGAATGGAAAGATCAACCTCACCTACAGGGCGGACTTCAAGATCCCTATGGAGATGACGGAGAAGATGCAGAAGAGTTACACTGCCTTTGCCATCCAAGAGATGCTCCAGAATGTCTTTCTTGTCTTCAGAAACAATTTCTCCAGCACTGGGTGGAATGAGACTATTGTTGTACGTCTCCTGGATGAACTCCACCAGCAGACAGTGTTTCTGAAGACAGTACTAGAGGAAAAGCAAGAGGAAAGATTGACGTGGGAGATGTCCTCAACTGCTCTCCACTTGAAGAGCTATTACTGGAGGGTGCAAAGGTACCTTAAACTCATGAAGTACAACAGCTACGCCTG（配列番号２８）
（２）ＩＦＮα；Hemmi H et al., J. Exp. Med., 199: 1641-1650, 2004に記載のプローブ
（３）ＩＰ−１０；CATCAGCACCATGAACCCAAGTGCTGCCGTCATTTTCTGCCTCATCCTGCTGGGTCTGAGTG
GGACTCAAGGGATCCCTCTCGCAAGGACGGTCCGCTGCAACTGCATCCATATCGATGACGGGCCAGTGAGAATGAGGGCCATAGGGAAGCTTGAAATCATCCCTGCGAGCCTATCCTGCCCACGTGTTGAGATCATTGCCACGATGAAAAAGAATGATGAGCAGAGATGTCTGAATCCGGAATCTAAGACCATCAAGAATTTAATGAAAGCGTTTAGCCAAAAAAGGTCTAAAAGGGCTCCTTAACTGGAGAGAAGCCACGCACACACCCCGGTGCTGTGATGGACAGCAGAGAGCCTGTCTCTCCATCACTCCCCTTTACCCAGTGGATGGCTAGTCCTAATTGCCCTTGGTCTTCTGAAAGGTGACCAGCCGTGGTCACATCAGCTGCTACTCCTCCTGCAGGATGATGGTTAAGCCATGGTCCTGAGACAAAAGTAACTGCCGAAGCAAGAATTCTTTAAGGGCTGGTCTGAGTCCTCACTCAAGTGGCTGGGATGGCTGTCCTAGCTC（配列番号２９）
（４）ＲＡＮＴＥＳ；CAGCCGCCCTCTGCACCCCCGCACCTGCCTCACCATATGGCTCGGACACCACTCCCTGCT
GCTTTGCCTACCTCTCCCTCGCGCTGCCTCGTGCCCACGTCAAGGAGTATTTCTACACCAGCAGCAAGTGCTCCAATCTTGCAGTCGTGTTTGTCACTCGAAGGAACCGCCAAGTGTGTGCCAACCCAGAGAAGAAGTGGGTTCAAGAATACATCAACTATTTGGAGATGAGCTAGGATAGAGGGTTTCTTGATTCTGACCCTGTATAGCTTCCCTGTCATTGCTTGCTCTAGTCC（配列番号３０）
（５）ＩＬ−６；GTTCCTCTCTGCAAGAGACTTCCATCCAGTTGCCTTCTTGGGACTGATGCTGGTGACAACCACG
GCCTTCCCTACTTCACAAGTCCGGAGAGGAGACTTCACAGAGGATACCACTCCCAACAGACCTGTCTATACCACTTCACAAGTCGGAGGCTTAATTACACATGTTCTCTGGGAAATCGTGGAAATGAGAAAAGAGTTGTGCAATGGCAATTCTGATTGTATGAACAACGATGATGCACTTGCAGAAAACAATCTGAAACTTCCAGAGATACAAAGAAATGATGGATGCTACCAAACTGGATATAATCAGGAAATTTGCCTATTGAAAATTTCCTCTGGTCTTCTGGAGTACCATAGCTACCTGGAGTACATGAAGAACAACTTAAAAGATAACAAGAAAGACAAAGCCAGAGTCCTTCAGAGAGATAC（配列番号３１）
【００６１】
さらに、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスの腹腔マクロファージに脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）を感染させ、２４時間後の培養上清中のサイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−６）濃度をエライザ法により測定した。結果は図９のｃに示すとおりである。次に、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスの腹腔マクロファージにＥＭＣＶを感染させ、０、６、９時間経過後、細胞よりＲＮＡを回収し、ＩＦＮβ、ＩＦＮα、ＩＰ−１０、ＲＮＡＴＥＳ、及びＩＬ−６の遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲ法により検討した。なお、ポジティブコントロールとして、β−ａｃｔｉｎを用いた。結果は図９のｄに示すとおりである。図９のｃ及びｄより、ＩＰＳ−１欠損マウスは、ＥＭＣＶによる各種サイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６）の産生が抑制されることが確認された。
【００６２】
これらの結果より、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスは、I型ＩＦＮプロモーターの活性化による抗ウイルス応答機能が喪失しており、マウス内においてウイルスがより活発に増殖するという性質を有している。したがって、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスは、ウイルス感染のモデルマウスとして利用できることが明らかとなった。
【実施例９】
【００６３】
（ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスにおけるポリＩ：Ｃに対する反応性を喪失し、ウイルス感染のモデルマウスとして利用できる。）
次に、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスにポリＩ：Ｃを投与し、ポリＩ：Ｃの投与量及び投与時間における各種サイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＰ−１０、及びＩＬ−６）の産生を調べた。まず、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスにおけるＮＤＶ感染応答性シグナル伝達経路を解析した。野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦを図で示した濃度のポリＩ：Ｃで刺激し、２４時間後の培養上清中のサイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−６）濃度をエライザ法により測定した。結果は図１０ａに示すとおりである。次に、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦをポリＩ：Ｃで刺激した。０、２、４、６時間後に細胞からＲＮＡを回収し、上記に示したＩＦＮβ、ＩＦＮα、ＩＰ−１０、ＩＬ−６の各ｍＲＮＡに相補的なプローブを用いて、ＩＦＮβ、ＩＦＮα、ＩＰ−１０、及びＩＬ−６の遺伝子発現をノーザンブロット法にて検討した。なお、ポジティブコントロールとして、β−アクチン（β−actin）を用いた。結果は図１０のｂに示すとおりである。さらに、ヘテロ型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスにポリＩ：Ｃを静脈内注射し、計時的に採取した血清中におけるサイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−６）濃度をエライザ法により測定した。結果は図１０のｃに示すとおりである。
【００６４】
図１０のａ〜ｃに示される結果より、ＩＰＳ−１欠損マウスはポリＩ：Ｃにより誘導される各種サイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＰ−１０、ＩＬ−６）の産生が抑制されることが確認された。これらの結果は、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスが、ウイルス感染のモデルマウスとして利用できることを支持するものである。
【実施例１０】
【００６５】
（ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスにおけるＮＤＶ感染応答性シグナル伝達経路を活性化し、抗ウイルス応答を誘導する。）
さらに本発明者らは、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスにおけるウイルス感染応答のシグナル伝達経路を解析した。まず、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦにＮＤＶを感染させ、０、１０、２０時間後に核タンパク質を抽出し、ＮＦ−ｋＢの活性化をＥＭＳＡ法により検討した。ＩＰＳ−１野生型（＋／＋）において観察されるＮＦ−κＢの発現が、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）においては、観察されなかった（図１１のａ）。次に、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦにＮＤＶを感染させ、０、６、８時間後にライセートを調整した。調整したライセートをＮａｔｉｖｅＰＡＧＥで展開後、フィルターに転写し、フィルターを抗ＩＲＦ３抗体でブロットし、ダイマー（二量体）形成を検討した。ＩＲＦ３の活性化をダイマー形成により確認したところ、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）においては、これらダイマー形成が観察されなかった（図１１のｂ）。
【００６６】
以上の結果より、ＩＰＳ−１のＮＤＶ感染応答のシグナル伝達は、ＮＦ−κＢや、ＩＲＦ３の活性化を介して、Ｉ型ＩＦＮを産生したり、ＩＦＮ誘導性遺伝子を発現したりすることにより、抗ウイルス応答を誘導するものであることが示唆された。
【００６７】
［材料と方法］
（ハイスループットスクリーニング）
スクリーニングは、若干修正を加えた文献（EMBO J. 21, 5184-5194, 2002）に従って行った。ヒト胎盤、脾臓又はＰＢＬのｃＤＮＡライブラリーを、ｐＣＭＶ６−ＸＬ３（OriGene Technologies Inc.社製）にクローニングしたプラスミドＤＮＡでE. coli ＤＨ５αを形質転換し、１プレートあたり１００コロニーまでの密度でＬＢ寒天アンピシリンプレートに播種した。一晩インキュベートした後、ニトロセルロースフィルター膜を用いてレプリカプレートを作製した。一次形質転換プレートのコロニーを掻爬し、ＱＩＡprep 8 Miniprep Kit (QIAGEN社製) を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、ｃＤＮＡプールとして用いた。２４ウェル皿に播種したＨＥＫ２９３細胞（１×１０５／ウエル）に、Lipofectamine 2000 （Invitrogen社製）を用いて、１．０μｇのｃＤＮＡプールと、１００ｎｇのＩＦＮβ―Ｌｕｃコンストラクトとをトランジェントにトランスフェクトした。３６時間後、細胞を１００μｌのレポーター溶解バッファー（Promega社製）で溶解した。デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（Promega社製）で、可溶化液５μｌのルシフェラーゼ活性を測定した。５０ｎｇのウミシイタケ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を、内部コントロールとして同時にトランスフェクトとした。
【００６８】
陽性プールに対応するレプリカプレートの個別コロニーを選択し、１．０ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地で培養した。培養物より調製したプラスミドＤＮＡを、ＩＦＮβ−ＬｕｃとＨＥＫ２９３にコトランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性を分析し、プールの活性化に関与する単一のクローンを単離した。５’及び３’プライマーを用いて、陽性ＤＮＡをシークエンシングし、ＢＬＡＳＴサーチにより特徴づけた。ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから入手した単一ヒトＩＰＳ−１クローンは、最初のＡＴＧのアップストリームで、インフレームストップコドンを有するオープンリーディングフレーム全体をコードしていた。ポリＡテールも得られたクローンに含まれていた。
【００６９】
（プラスミド）
テンプレートとして、スクリーニングによって得たＩＰＳ−１−ｐＣＭＶ６−ＸＬ３を用いて、ＰＣＲによりＩＰＳ−１、ＩＰＳ−１Ｎ（a．a．１−１１７）及びＩＰＳ−１Ｃ（ａ．ａ．１１８−５４０）を増幅し、pFLAG-CMV2（Sigma社製）、又はpEF-BOSに結紮し、それぞれＦｌａｇ標識、Ｍｙｃ標識発現コンストラクトを作製した。ヒトＩＲＦ３及びＩＲＦ７をＲＴ−ＰＣＲにより入手し、pEF-BOSに結紮した。ＩＫＫβ Ｋ４４Ａ、ＴＢＫ１及びＴｒｉｆコンストラクトは、文献に記載されている（J Immunol. 171, 4304-4310, 2003）。ＲＴ−ＰＣＲで増幅した、ヒトＦＡＤＤ ＤＥＤ（ａ．ａ．１−８５）をＲＴ−ＰＣＴにより増幅し、pFLAG-CMV2に結紮した。ＲＴ−ＰＣＴにより増幅したヒトＲＩＧ−Ｉ、ＲＩＧ−Ｉ△Ｃ（ａ．ａ．１−６０４）、Ｍｄａ５、Ｍｄａ５△Ｃ（ａ．ａ １−５７５）及びＲＩＰ１を、pFLAG-CMV6（Sigma社製）に結紮した。ＩＦＮβ、ＩＦＮα４、ＩＦＮα６及びＥＬＡＭ１のルシフェラーゼレポーターコンストラクトは文献に記載されている（Nat Immunol. 5, 1061-1068, 2004）。ＩＳＲＥ−ＬｕｃはStratageneより入手した。ＩＰ−１０−Ｌｕｃ及びＲＡＮＴＥＳ−ＬｕｃはD.T. Golenbock (マッサチューセット大学医学部、ＭＡ)より提供された。
【００７０】
（細胞、ウイルス及び試薬）
ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞及びＭＥＦ細胞を、５％ＣＯ２のインキュベーター内の１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭで培養した。ＴＢＫ１／ＩＫＫｉ二重欠損マウス由来のＭＥＦ細胞は、文献記載の通り調製した（J Exp Med. 199, 1641-1650, 2004）。ポリ（Ｉ：Ｃ）（Amersham Bioscience社製）をFugene（Roche社製）と混合し、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。抗Ｆｌａｇ抗体（Ｍ２）ビーズ及びＨＲＰ複合抗Ｆｌａｇ抗体（Ｍ２）は、Sigma社より購入した。抗Ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）アガロース及びＨＲＰ複合抗Ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）は、Santa Cruz 社から購入した。ＶＳＶ及びＶＳＶ変異体は、Dr. T. Abe 、Dr. Y. Matsuura（大阪大学）より提供された。ＮＤＶは、Dr. T.Fujita（東京都臨床医学総合研究所）より提供された。
【００７１】
（レポーター分析）
２４ウェルプレート（１×１０５細胞／ウェル）に播種したＨＥK２９３細胞、又は６
ウェルプレート（１×１０５細胞／ウェル）に播種したＭＥＦ細胞に、１００ｎｇのルシフェラーゼレポータープラスミドと、所定の発現プラスミド又は空コントロールプラスミド合計１．０μｇとを、トランジェントにトランスフェクトした。３６〜４８時間後、全細胞可溶化液のルシフェラーゼ活性をデュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Promega社製）で測定した。５０ｎｇのウミシイタケ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を、内部コントロールとして同時にトランスフェクトした。
【００７２】
（ＥＬＩＳＡ）
ＦＬＡＧ−ＩＰＳ−１又はＦＬＡＧ−ＩＲＦ７をトランジェントにトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞、又はウイルスを感染した細胞を２４時間培養した。上清のサイトカインＩＦＮαを、製造者の指示に従ってＥＬＩＳＡ（ＰＢＬ Bio Lab.社製）により測定した。ＩＬ−８のＥＬＩＳＡは、文献記載どおりに行った（J Immunol. 174, 2273-2279,2005）。
【００７３】
（プラークアッセイ）
ＶＳＶを感染させたＨＥＫ２９３細胞から回収した培養上清のウイルス収量を測定した。回収したウイルスの段階希釈液で感染されたＢＨＫ細胞を、１．０％の低融解アガロースを含むＤＭＥＭで覆った。２４時間のインキュベーション後にプラークを算定した。
【００７４】
（ノーザンブロット分析及びＲＴ−ＰＣＲ）
ヒト多組織ノーザンブロット（CLONTECH社製）で32Ｐ標識全長ヒトＩＰＳ−１プローブをハイブリダイズし、洗浄し、オートラジオグラフィーにより視覚化した。ＲＴ−ＰＣＲ分析用に、全ＲＮＡをTrizol試薬（Invitrogen 社製）を用いて単離し、SuperScript III逆転写酵素（Invitrogen 社製）を製造者の指示に従って用いて逆転写した。ＰＣＲは、以下のプライマーを用いて連続して行った。
Ｉｆｎｂ；５’−ＣＡＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧＴＧＴＣＡＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号３）及び５’−ＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣＣＴＴＧＡＧＧＣＡＧＴＡＴ−３’ （配列番号４）、Ｃｘｃｌ１０；５’−ＴＧＡＣＴＣＴＡＡＧＴＧＧＣＡＴＴＣＡＡＧＧ−３’（配列番号５）及び５’−ＧＡＴＴＣＡＧＡＣＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＡＣＣＣ−３’（配列番号６）、Ｉｆｉｔ１；５’−ＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＡＡＡＴ−３’（配列番号７）及び５’−ＴＧＣＧＧＣＣＣＴＴＧＴＴＡＴＴＣＣ−３’（配列番号８），Ｇａｐｄｈ；５’−ＣＴＧＧＧＣＴＡＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＣＡＧ−３’（配列番号９）及び５’−ＣＣＡＧＣＧＴＣＡＡＡＧＧＴＧＧＡＧ−３’（配列番号１０）。
【００７５】
（免疫共沈降及びイムノブロット分析）
ＨＥＫ２９３細胞１００万個を、１００ｍｍ皿に播種した。１２時間後、細胞に空プラスミド又は所定のプラスミド全量６．０μｇを、Lipofectamine 2000（Invitrogen社製）を用いてトランジェントにトランスフェクトした。免疫沈降及びイムノブロットは、文献記載のとおり行った（Nat Immunol. 5, 1061-1068, 2004)。
【００７６】
（ＲＮＡ干渉）
ｓｉＲＮＡ実験用に、２１ヌクレオチドを有するセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる二本鎖ＲＮＡデュプレックスを、ダーマコンリサーチ（Dharmacon research）により合成した。ヒトＩＰＳ−１を標的とするのに用いたＲＮＡオリゴヌクレオチドは、次の通りである。Ｉｐｓ−１−１センス；５’−ＵＡＧＵＵＧＡＵＣＵＣＧＣＧＧＡＣＧＡｄＴｄＴ−３’（配列番号１１）、Ｉｐｓ−１−１アンチセンス；５’−ＵＣＧＵＣＣＧＣＧＡＧＡＵＣＡＡＣＵＡｄＴｄＴ−３’（配列番号１２）、Ｉｐｓ−１−２センス；ＣＣＧＵＵＵＧＣＵＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡｄＴｄＴ−３’（配列番号１３）、Ｉｐｓ−１−２アンチセンス；ＵＣＵＵＧＵＣＵＵＣＡＧＣＡＡＡＣＧＧｄＴｄＴ−３’（配列番号１４）。ＨＥＫ２９３細胞又はＨｅｌａ細胞を、６０ｍｍ皿（５×１０５）に、トランスフェクションの１２時間前に播種した。１００ｎＭのｓｉＲＮＡを、Lipofectamine 2000又はOligofectamine（Invitrogen社製）を製造者の指示に従って用いて、それぞれＨＥＫ２９３細胞又はＨｅｌａ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を新たな実験に使用した。ＲＴ−ＰＣＲにより、ＩＰＳ−１ｍＲＮＡのノックダウンを５’−ＡＴＧＣＣＧＴＴＴＧＣＴＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号１５）及び５’−ＣＴＡＧＴＧＣＡＧＡＣＧＣＣＧＣＣＧ−３’（配列番号１６）のプライマーで確認した。
【００７７】
（ＩＰＳ−１ノックアウトマウスの作製）
（１）キメラマウスの作製
ＩＰＳ−１の生理学的役割を検討するため、ジーンターゲティングによりＩＰＳ-/-マウスを作製した。ＩＰＳ−１-/-マウスを作製するためのターゲティングベクターは、ｐＭＣ１−ｎｅｏ（Stratagene社製）からのネオマイシン耐性遺伝子で、エクソン１及びエクソン２を置換し、負の選択マーカーとして単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を挿入することにより構築した（図８ａ参照）。次に、当業者に公知の方法に従い、エレクトロポーション法で、構築されたターゲッティングベクターをＥＳ細胞に導入した。Ｇ４１８とガンシクロビアに二重に耐性を持つコロニーを選択し、ＰＣＲにより相同組換えが起きた細胞を選択した後、相同組み換えの認められた陽性クローン（ＥＳ細胞）を胚盤胞に導入して仮親に移植することによりキメラマウスを作製した。
（２）ヘテロ欠損（ＩＰＳ−１＋／−）マウスの作製
こうして得られたキメラマウスの交配によってＦ１マウスを作製した。Ｆ１マウスの遺伝型をＰＣＲ及びサザンブロット法で解析したところ生殖系列への変異の導入（ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ化）が確認され、ヘテロ欠損マウス（ＩＰＳ−１＋／−マウス）が作製された。
（３）更に、ＩＰＳ−１＋／−マウスどうしを交配させて、ＩＰＳ−１遺伝子ホモ欠損マウス（ＩＰＳ−１−／−マウス）を作製した。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】ＩＦＮβプロモーターのアクチベーターの同定結果を示す図である。（ａ）ヒト胎盤、脾臓、又はＰＢＬのｃＤＮＡ発現ライブラリーの一部を、１００個までのｃＤＮＡ複合体（complexity）のプールに細分した。各プールからのプラスミドＤＮＡを、ＨＥＫ２９３細胞に、ＩＦＮβプロモーターのレポーターコンストラクトとトランスフェクトし、レポーター遺伝子アッセイで分析した。平均的な活性より、活性化が５倍以上のときに、プールを陽性とした。陽性プールの同定例を示す。（ｂ）ＩＦＮβ活性化に関与する単一のクローンを単離するために、（ａ）で示すプール３４のレプリカプレート由来のコロニーを選択し、プラスミドを回収した。かかるプラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞にＩＦＮβプロモーターのレポーターコンストラクトとトランスフェクトし、レポーターアッセイでプロモーター活性化能を分析した。陽性クローン（クローン３）をシークエンシングし、ＢＬＡＳＴサーチにより特徴づけた。
【図２】ＩＰＳ−１の構造と発現に関する図である。（ａ）スクリーニングによって単離したクローンの概略図である。（ｂ）ヒトＩＰＳ−１の予測されるアミノ酸配列を示す図である。（ｃ）ヒトＩＰＳ−１の概略図である。ＩＰＳ−１のＮ末端ＣＡＲＤ様ドメインを、黒い四角で示した。（ｄ）ヒトＩＰＳ−１、ヒトＭｄａ５、マウスＭｄａ５、ヒトＲＩＧ−Ｉ及びマウスＲＩＧ−ＩのＣＡＲＤ様ドメインのアライメントを示す図である。少なくとも３つの分子で保存されたアミノ酸残基を赤で示した。（ｅ）各種ヒト組織におけるヒトＩＰＳ−１ＲＮＡの発現を示す図である。ラジオ標識したヒトＩＰＳ−１プローブを、多組織ノーザン（ＭＴＮ）ブロットでハイブリダイズした。
【図３】ＩＲＦ３の活性化、及びＩＰＳ−１によるＩＦＮ誘導性遺伝子の誘導を示す図である。（ａ）ＨＥＫ２９３細胞に、１ｎｇ（レーン２）、１０ｎｇ（レーン３）、１００ｎｇ（レーン４）のＦｌａｇ−ＩＰＳ−１をコードする発現プラスミドを、ＩＦＮβ、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＳＲＥの各プロモーターをコードするレポーターコンストラクトとトランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイで分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。（ｂ）ＨＥＫ２９３細胞に、１ｎｇ（レーン２、７）、１０ｎｇ（レーン３、８）、１００ｎｇ（レーン４、９）、又は１μｇ（レーン５、１０）のＦｌａｇ−ＩＰＳ−１及びコントロール（レーン１〜５）、又は５ｎｇのＦｌａｇ−ＩＰＳ−７（レーン６〜１０）を、ＩＦＮα４（左）又はＩＦＮα６（右）プロモーターレポータープラスミドとトランジェントにコトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。（ｃ）ＨＥＫ２９３細胞に、ＦＬＡＧ標識ＩＰＳ−１及びＭｙｃ標識ＩＲＦ３（上）又はＭｙｃ標識ＩＲＦ７（下）を所定の組合せでトランジェントにトランスフェクトした。３６時間後、細胞可溶化液を、抗Ｍｙｃ抗体又は抗ＦＬＡＧ抗体（ＩＰ）で免疫沈降し、その後、抗ＦＬＡＧ抗体又は抗Ｍｙｃ抗体（ＷＢ）で免疫ブロットした。（ｄ）野生型（ＷＴ）又はＴＢＫ１及びＩＫＫｉ二重欠損マウス（ＴＢＫ１／ＩＫＫｉ ＫＯ）由来のＭＥＦ細胞に、ＦＬＡＧ−ＩＰＳ−１又はＦｌａｇ−ＴＢＫ１を、ＩＦＮβ又はＩＦＮαプロモータープラスミドと指示どおりにトランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。（ｅ）ＩＰＳ−１欠失変異体の概略図（上）。ＨＥＫ２９３細胞に、１０ｎｇ（レーン２）又は１００ｎｇ（レーン３、５、７）のＦｌａｇ−ＩＰＳ−１ＦＬ（レーン２、３）、ＩＰＳ−１Ｎ（レーン４、５）又はＩＰＳ−１Ｃ（レーン６、７）をコードする発現プラスミドを、ＩＦＮβプロモータープラスミドとトランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。
【図４】ＩＰＳ−１が、抗ウイルス応答を誘導することを示す図である。（ａ）ＨＥＫ２９３細胞に、コントロール又はＦｌａｇ−ＩＰＳ−１をトランジェントにトランスフェクトした。全ＲＮＡを、トランスフェクションの２４時間後に調製し、ＩＦＮβ（Ifnb）、ＩＰ−１０（Cxcl10）、ＧＡＲＧ１６（Ifit1）又はＧＡＰＤＨ（Gapdh）の発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。（ｂ）ＨＥＫ２９３細胞に、１００ｎｇのＦＬＡＧ−ＩＰＳ−１と１００ｎｇのＭｙｃ−ＩＲＦ７を所定の組合せでトランジェントにトランスフェクトした。２４時間後、細胞上清のＩＦＮα濃度をＥＬＩＳＡで測定した。Ｎ．Ｄ．は、検出されず、を表す。データは、独立した３度の実験のうち、代表的な実験の３個のサンプル平均値±標準偏差として表す。（ｃ）コントロール又はＦｌａｇ−ＩＰＳ−１をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に、ＶＳＶ（ｍｏｉ＝１．０、０．１）を感染した。２４時間後、ウイルス力価を測定した。
【図５】ＩＰＳ−１によるＮＦ−κＢ活性化及びＩＬ−８誘導を示す図である。（ａ）ＨＥＫ２９３細胞に、１ｎｇ（レーン２）、１０ｎｇ（レーン３）、１００ｎｇ（レーン４）又は１μｇ（レーン５）のＦｌａｇ−ＩＰＳ−１をコードするプラスミドを、ＥＬＡＭ１プロモータープラスミドとトランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。（ｂ）ＨＥＫ２９３細胞に、１００ｎｇのＦｌａｇ−ＩＰＳ−１をコードするプラスミドと、１００ｎｇのＩＫＫβＫＮをコードするプラスミドとを所定の組合せでトランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。（ｃ）ＨＥＫ２９３細胞を、１００ｎｇのＦｌａｇ−ＩＰＳ−１ＦＬ、ＩＰＳ−１Ｎ又はＩＰＳ−１Ｃをコードするプラスミドを、ＥＬＡＭ１プロモータープラスミドとトランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。（ｄ）ＨＥＫ２９３細胞に、５００ｎｇのＩＰＳ−１の発現プラスミドをトランジェントにトランスフェクトした。２４時間後、培養上清のＩＬ−８濃度を、ＥＬＩＳＡで測定した。データは、独立した３度の実験のうち、代表的な実験の３個のサンプル平均値±標準偏差として表す。（ｅ）野生型（ＷＴ）又はＴＢＫ１及びＩＫＫｉ二重欠損マウス（ＴＢＫ１／ＩＫＫｉＫＯ）由来のＭＥＦ細胞に、Ｆｌａｇ−ＩＰＳ−１を、ＥＬＡＭ１プロモータープラスミドとトランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。
【図６】ＩＰＳ−１がＲＩＧ−Ｉ、ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１と会合することを示す図である。（ａ）ＨＥＫ２９３細胞１００万個に、Ｍｙｃ−ＩＰＳ−１、Ｆｌａｇ−Ｍｄａ５全長（ＦＬ）、Ｆｌａｇ−Ｍｄａ５△Ｃ、Ｆｌａｇ−ＲＩＧ−ＩＧＦＬ又はＦｌａｇ−ＲＩＧ−Ｉ△Ｃをコードするプラスミドを所定の組合せでトランジェントにトランスフェクトした。３６時間後、細胞可溶化液を抗Ｍｙｃ抗体又は抗Ｆｌａｇ抗体で免疫共沈降（ＩＰ）し、その後、抗Ｆｌａｇ抗体又は抗Ｍｙｃ抗体で免疫ブロット（ＩＢ）した。（ｂ）ＨＥＫ２９３細胞に、Ｍｙｃ−ＩＰＳ−１、Ｆｌａｇ−ＦＡＤＤ、Ｆｌａｇ−ＲＩＰ１又はＦｌａｇ−ＴＢＫ１を所定の組合せでトランジェントにトランスフェクトした。３６時間後、細胞可溶化液を抗Ｍｙｃ抗体又は抗Ｆｌａｇ抗体で免疫共沈降（ＩＰ）し、その後、抗Ｆｌａｇ抗体又は抗Ｍｙｃ抗体で免疫ブロット（ＩＢ）した。米印は、Ｆｌａｇ−ＲＩＰ１タンパク質を示す。（ｃ）ＨＥＫ２９３細胞に、Ｆｌａｇ−ＦＡＤＤ、Ｍｙｃ−ＩＰＳ−１ＦＬ、Ｍｙｃ−ＩＰＳ−１Ｎ又はＭｙｃ−ＩＰＳ−１Ｃを所定の組合せでトランジェントにトランスフェクトした。３６時間後、細胞可溶化液を抗Ｍｙｃ抗体又は抗Ｆｌａｇ抗体で共免疫沈降（ＩＰ）し、その後、抗Ｆｌａｇ抗体又は抗Ｍｙｃ抗体で免疫ブロット（ＩＢ）した。（ｄ）ＨＥＫ２９３細胞は、５０ｎｇ（レーン２、３、４）のＦｌａｇ−ＩＰＳ−１をコードする発現プラスミド及び、５０ｎｇ（レーン３）又は１００ｎｇ（レーン４）のＦｌａｇ−ＦＡＤＤ ＤＥＤを、ＩＦＮβプロモータープラスミドとトランジェントにトランスフェクトした。ＤＮＡの全量を、空ベクターの補充により一定に維持した。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。
【図７】ｓｉＲＮＡによるＩＰＳ−１発現のノックダウンを示す図である。（ａ）ＨｅLａ細胞又はＨＥＫ２９３細胞に、ｓｉＲＮＡをターゲットするＩＰＳ−１（Ｉｐｓ−１−１、Ｉｐｓ−１−２）をトランスフェクトし、２日後に細胞を、Ｉｐｓ−１又はＧａｐｄｈの特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲで分析し、ｓｉＲＮＡが媒介する内因性Ｉｐｓ−１ｍＲＮＡの減少を確認した。（ｂ）ｓｉＲＮＡで処理したＨＥＫ２９３細胞に、ＩＦＮβプロモータープラスミドをトランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を５μｇ／ｍｌ（レーン２、６、１０）、１０μｇ／ｍｌ（レーン３、７、１１）、又は２０μｇ／ｍｌ（レーン４、８、１２）のポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激した。１８時間後、細胞可溶化液のルシフェラーゼ活性を測定した。データは、独立した３度の実験のうち、代表的な実験の３個のサンプル平均値±標準偏差として表す。（ｃ）ｓｉＲＮＡで処理したＨＥＫ２９３細胞に、ＲＩＧ−Ｉ△Ｃ又はＴｒｉｆ及びＩＦＮβプロモータープラスミドをトランジェントにコトランスフェクトした。３６時間後、細胞可溶化液のルシフェラーゼ活性を分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。（ｄ）ｓｉＲＮＡで処理したＨＥＫ２９３細胞を、１０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）で３時間刺激し、細胞におけるIfnb、Cxcl10又はGapdhの発現をＲＴ−ＰＣＲにより分析した。（ｅ）ｓｉＲＮＡで処理したＨＥＫ２９３細胞に、ＶＳＶｍｔ又はＮＤＶを感染した。２４時間後、培養上清のＩＦＮα産生をＥＬＩＳＡで分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。
【図８】図８のａはマウスＩＰＳ−１ゲノムの構造（黒：コーディング領域、白：ノンコーディング領域）を示す図であり、図８のｂは、目的遺伝子が欠損していることを確認するためにサザンブロット法に供試した結果を示す図である。サザンブロットは、ＥｃｏＲＩで消化したマウステール由来のゲノムＤＮＡを電気泳動後、フィルターに転写し、図８のａで示したプローブを用いてハイブリダイズすることにより行った。図８のｃは、ＩＰＳ−１遺伝子の不活性化が生起していることを確認するためのノーザンブロット分析の結果を示す図である。ノーザンブロットは、野生型（＋／＋）及びＩＰＳ欠損型（−／−）のマウス胎児由来線維芽細胞（ＭＥＦ）から、ＲＮＡを抽出後、電気泳動にて展開し、フィルターに転写し、フィルターを全長ＩＰＳ−１プローブ及びβ−ａｃｔｉｎプローブを用いてハイブリダイズすることにより行った。図８のｄは、ＩＰＳ−１の発現がタンパクレベルでも消失していることを確認するためのウェスタンブロットの結果を示す図である。ウェスタンブロットは、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦからライセートを調整し、抗ＩＰＳ−１抗体で免疫沈降を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて展開させ、フィルターに転写後、抗ＩＰＳ−１抗体でブロットすることにより行った（図８のｄ上図）。また、図下はどのサンプルでも同じ量のタンパク質を用いていることを示すコントロール実験であり、この実験では全可溶化物（Ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅｓ： ＷＣＬ）を抗ＥＲＫ１／２抗体でブロットすることにより行った（ＩＢ）。
【図９】ＩＰＳ−１欠損マウスにおける各ＲＮＡウイルスに対する反応性に関する実験結果を示す図であり、図９のａは、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦに１本鎖ＲＮＡウイルスであるニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、及びセンダイウイルス（ＳｅＶ）を感染させ、２４時間後の培養上清中のサイトカイン（ＩＦＮα，ＩＦＮβ，ＩＬ−６）濃度をエライザ法により測定した結果を示す図である。なお、アスタリスクは検出感度以下を示す。図９のｂは、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦにＮＤＶ、ＶＳＶ、ＳｅＶを感染させ、図に示した時間後に細胞からＲＮＡを回収し、ＩＦＮβ、ＩＦＮα、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６の各ｍＲＮＡに相補的なプローブ（配列番号２８〜３２）を用いて遺伝子発現をノーザンブロット法にて検討した結果を示す図である。図９のｃは、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスの腹腔マクロファージに脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）を感染させ、２４時間後の培養上清中のサイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−６）濃度をエライザ法により測定した結果を示す図である。図９のｄは、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスの腹腔マクロファージにＥＭＣＶを感染させ、図で示した時間後、細胞よりＲＮＡを回収し、図で示した遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法により検討した結果を示す図である。
【図１０】ＩＰＳ−１欠損マウスにおけるポリＩ：Ｃに対する反応性に関する実験結果を示す図であり、図１０のａは、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦを図で示した濃度のポリＩ：Ｃで刺激し、２４時間後の培養上清中のサイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−６）濃度をエライザ法により測定した結果を示す図である。なお、アスタリスクは検出感度以下を示す。図１０のｂは、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦをポリＩＣで刺激した、図に示した時間後に細胞からＲＮＡを回収し、ＩＦＮβ、ＩＦＮα、ＩＰ−１０、ＩＬ−６の各ｍＲＮＡに相補的なプローブ（配列番号３３〜３６）を用いて遺伝子発現をノーザンブロット法にて検討した結果を示す図である。図１０のｃは、ヘテロ型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスにポリＩＣを静脈内注射し、計時的に採取した血清中におけるサイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−６）濃度をエライザ法により測定した結果を示す図である。
【図１１】ＩＰＳ−１欠損マウスにおけるＮＤＶ感染応答性シグナル伝達経路の解析に関する実験結果を示す図であり、図１１のａは、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦにＮＤＶを感染させ、図で示した時間後に核タンパク質を抽出し、ＮＦ−ｋＢの活性化をＥＭＳＡ法により検討した結果を示す図である。図１１のｂは、ＩＲＦ３の活性化の指標であるダイマー（二量体）形成を検討した結果を示す図である。野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦにＮＤＶを感染させ、図で示した時間後にライセートを調整した。調整したライセートをＮａｔｉｖｅＰＡＧＥで展開後、フィルターに転写し、フィルターを抗ＩＲＦ３抗体でブロットし、ダイマー（二量体）形成を検討した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードするＤＮＡ。
(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質
【請求項２】
配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項２記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項７】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質。
【請求項８】
配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質。
【請求項９】
組換えタンパク質であることを特徴とする請求項６〜８のいずれか記載のタンパク質。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質又は融合ペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか記載のＤＮＡを含み、かつＩＰＳ−１を発現することができる組換えベクター。
【請求項１２】
組換えプラスミドベクターである請求項１１記載の組換えベクター。
【請求項１３】
さらに、レポーター遺伝子を発現することができることを特徴とする請求項１１又は１２記載の組換えベクター。
【請求項１４】
レポーター遺伝子が、ホタルルシフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項１１又は１２記載の組換えベクター。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか記載の組換えベクターが導入され、かつＩＰＳ−１を発現する形質転換体。
【請求項１６】
ＩＰＳ−１遺伝子を有する組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
【請求項１７】
形質転換体が、哺乳類細胞由来であることを特徴とする請求項１５又は１６記
載の形質転換体。
【請求項１８】
哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞又はＭＥＦ細胞である請求項１７に記載の形質転換体。
【請求項１９】
請求項６〜９のいずれか記載のタンパク質又はその部分ポリペプチドを認識する抗体。
【請求項２０】
モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１９記載の抗体。
【請求項２１】
ＩＰＳ−１遺伝子の機能が染色体上で欠損し、野生型において発現されるＩＰＳ−１を発現する機能が失われていることを特徴とするＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物。
【請求項２２】
げっ歯類動物であることを特徴とする請求項２１記載のＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物。
【請求項２３】
げっ歯類動物が、マウスであることを特徴とする請求項２２記載のＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物。
【請求項２４】
以下の(ａ)〜(ｆ)のいずれか記載ＤＮＡを、ＩＰＳ−１活性を有するタンパク質の製造に使用する方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項２５】
以下の(ａ)〜(ｃ)のいずれか記載のタンパク質を用いて、Ｉ型ＩＦＮプロモーターを活性化する方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質
【請求項２６】
タンパク質が、以下の(ａ)〜(ｆ)のいずれか記載ＤＮＡで形質転換した宿主細胞で発現させた組換えタンパク質であることを特徴とする請求項２５記載のＩＦＮβプロモーターを活性化する方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項２７】
以下の(ａ)〜(ｃ)のいずれか記載のタンパク質を、Ｉ型ＩＦＮの製造に使用する方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質
【請求項２８】
タンパク質が、以下の(ａ)〜(ｆ)のいずれか記載ＤＮＡで形質転換した宿主細胞で発現させた組換えタンパク質であることを特徴とする請求項２７記載の使用する方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項２９】
ＩＰＳ−１遺伝子の機能を染色体上で欠損させたＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物を、Ｉ型ＩＦＮプロモーターの活性化による抗ウイルス応答機能が喪失したモデル動物として使用する方法。
【請求項３０】
非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする請求項２９記載の抗ウイルス応答機能が喪失したモデル動物としての使用方法。
【請求項１】
以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードするＤＮＡ。
(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質
【請求項２】
配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項２記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項７】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質。
【請求項８】
配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質。
【請求項９】
組換えタンパク質であることを特徴とする請求項６〜８のいずれか記載のタンパク質。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質又は融合ペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか記載のＤＮＡを含み、かつＩＰＳ−１を発現することができる組換えベクター。
【請求項１２】
組換えプラスミドベクターである請求項１１記載の組換えベクター。
【請求項１３】
さらに、レポーター遺伝子を発現することができることを特徴とする請求項１１又は１２記載の組換えベクター。
【請求項１４】
レポーター遺伝子が、ホタルルシフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項１１又は１２記載の組換えベクター。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか記載の組換えベクターが導入され、かつＩＰＳ−１を発現する形質転換体。
【請求項１６】
ＩＰＳ−１遺伝子を有する組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
【請求項１７】
形質転換体が、哺乳類細胞由来であることを特徴とする請求項１５又は１６記
載の形質転換体。
【請求項１８】
哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞又はＭＥＦ細胞である請求項１７に記載の形質転換体。
【請求項１９】
請求項６〜９のいずれか記載のタンパク質又はその部分ポリペプチドを認識する抗体。
【請求項２０】
モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１９記載の抗体。
【請求項２１】
ＩＰＳ−１遺伝子の機能が染色体上で欠損し、野生型において発現されるＩＰＳ−１を発現する機能が失われていることを特徴とするＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物。
【請求項２２】
げっ歯類動物であることを特徴とする請求項２１記載のＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物。
【請求項２３】
げっ歯類動物が、マウスであることを特徴とする請求項２２記載のＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物。
【請求項２４】
以下の(ａ)〜(ｆ)のいずれか記載ＤＮＡを、ＩＰＳ−１活性を有するタンパク質の製造に使用する方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項２５】
以下の(ａ)〜(ｃ)のいずれか記載のタンパク質を用いて、Ｉ型ＩＦＮプロモーターを活性化する方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質
【請求項２６】
タンパク質が、以下の(ａ)〜(ｆ)のいずれか記載ＤＮＡで形質転換した宿主細胞で発現させた組換えタンパク質であることを特徴とする請求項２５記載のＩＦＮβプロモーターを活性化する方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項２７】
以下の(ａ)〜(ｃ)のいずれか記載のタンパク質を、Ｉ型ＩＦＮの製造に使用する方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質
【請求項２８】
タンパク質が、以下の(ａ)〜(ｆ)のいずれか記載ＤＮＡで形質転換した宿主細胞で発現させた組換えタンパク質であることを特徴とする請求項２７記載の使用する方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項２９】
ＩＰＳ−１遺伝子の機能を染色体上で欠損させたＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物を、Ｉ型ＩＦＮプロモーターの活性化による抗ウイルス応答機能が喪失したモデル動物として使用する方法。
【請求項３０】
非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする請求項２９記載の抗ウイルス応答機能が喪失したモデル動物としての使用方法。
【図１】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
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【図１０】
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【公開番号】特開２００７−５４０４２（Ｐ２００７−５４０４２Ａ）
【公開日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１１１４１０（Ｐ２００６−１１１４１０）
【出願日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
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