インターロイキン−２の中和能を有する免疫治療用製剤
本発明は癌に関係して用いることができ、インターロイキン−２（ＩＬ−２）のインターロイキン−２レセプターへの結合を遮断する医薬製剤に関する。より詳細には、本発明はアジュバントであるモンタニドＩＳＡ ５１中でＩＬ−２を髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の輸送タンパク質Ｐ６４ｋに結合させることにより、ＩＬ−２のＩＬ−２レセプターへの結合を遮断する自己抗体の誘導のための、ＩＬ−２の免疫原性を増強することができる治療用製剤に関する。発明はまた、乳癌を含む腫瘍の治療に有効な方法に関する。本発明はさらに、ＩＬ−２に基づくワクチンと、腫瘍の特異性抗原又は腫瘍成長因子に基づく他の癌ワクチン、並びに伝統的に腫瘍学の診療で用いられる放射線療法又は化学療法剤との治療的な組合せに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）に対する免疫応答を増強でき、且つレセプターとの結合を阻害し、腫瘍治療に有用な自己抗体を上昇させる医薬製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍抗原を認識する免疫系及び特にＴ細胞の能力の発見は、癌患者治療を目的とする免疫系操作に関する戦略の開発のための主要な柱の１つである。
【０００３】
したがって、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）として知られている腫瘍間質へ浸潤している特異的なＴ細胞、又は無処置の個体の末梢血液に由来するか、又は治療用癌ワクチン使用後の末梢血液に由来する特異的なＴ細胞を回収する方法を開発するために、ｉｎ ｖｉｖｏで特異的なＴ細胞を刺激してその抗腫瘍性エフェクター能を増強することに対して、主な努力が向けられてきた。
【０００４】
したがって、主な戦略は、様々な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対するＴ細胞の特異的な細胞毒性活性を増強することに向けられてきた。次いで、主な治療的アプローチは、腫瘍を有する個体由来のＴＩＬを活性化し、増加させるためにインターロイキン−２（ＩＬ−２）をｉｎ ｖｉｔｒｏで使用し、これらの個体にこれらの細胞を再注入することに焦点が当てられている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｓ．Ａ．ら、（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３，１３１８〜１３２１；Ｋａｗａｋａｍｉ、Ｙ．ら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，６４５８〜６４６２；Ｋａｗａｋａｍｉ、Ｙ．ら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，３５１５〜３５１９）。しかしながら、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞性免疫応答の刺激が証明されたにもかかわらず、そのような介入は限られた治療成績しか有していない。その結果、ｉｎ ｖｉｖｏで有効な細胞性免疫応答の誘発を促進させるために、ＩＬ−２に関連する腫瘍抗原を含むワクチンベクターを設計して、治療用癌ワクチンを用いる活性のある特異的免疫プロトコールの使用に基づく治療様式の評価することになったが、これらの方法は不十分な結果を与えた（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，ら、（１９９８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４，３２１〜３２７）。
【０００５】
現在では、主要な臨床的な戦略は、患者由来の患者自身の腫瘍抗原に反応性のＴ細胞の養子移入に基づく様式の開発に移行している。これらの細胞を、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及びＩＬ−２を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激して増加させ、血流へ再注入した後に、ＩＬ−２を非経口投与する。この方法は、癌患者治療に関して考えられる主要な治療的介入の１つを構成するが、治療結果は控えめにとどまる（Ｄｕｄｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．，ら、（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８，８５０〜８５４；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ら、（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１ Ｓｕｐｐｌ．２，１４６３９〜４５）。
【０００６】
全てのこの治療戦略の合理的な設計は、抗腫瘍性免疫応答の細胞活性化における必須な分子としてのインターロイキン−２の使用に基づいている（Ｕ．Ｓ．６，０６０，０６８及びＵ．Ｓ．５，８３０，４５２）。
【０００７】
免疫におけるＩＬ−２の機能に関する背景は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される実験に基づいている。その発見からＩＬ−２はＴ細胞増殖を促進する能力によって認識された（したがって、ＩＬ−２アクロニムは、Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（Ｔ細胞成長因子）である）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞の増殖と機能の更なる証明は、この概念を確認した抗ＩＬ−２又は抗ＩＬ−２レセプターを用いて抑制できることである（Ｓｍｉｔｈ，ＫＡ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．５１：３３７〜３５７，１９８０）。
【０００８】
最近、抗腫瘍免疫のサプレッサー能力を有するＴ細胞の生成を介して、ヒト腫瘍が免疫系の応答を減少させうることが実験的に証明された。分化マーカーの関連性は実験モデルとは異なるが、これらの細胞は異なる分化マーカーを提示する動物モデル及び患者で特徴づけられた（Ｂａｃｈ，Ｊ．Ｆ．（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３，１８９〜１９８；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，Ｎ．Ｇ．，ら、（２００４）Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５，７９４〜８０２；Ｍａｒｋｕｓ，Ｙ．Ｍ．ｙ．Ｓｙｋｅｓ，Ｍ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２，１１３６〜１１５１）。
【０００９】
分化抗原群２５（ＣＤ２５）は、ＩＬ−２レセプターのα鎖を構成する。また、このサイトカインに対するレセプターの構造は、ベータ（ＣＤ１２２）及びガンマ（ＣＤ１３２）鎖を含んでいる。それらは静止期にあるＴリンパ球で構成的に発現し、これらの細胞が活性化されると、アルファ鎖の合成、高親和性ヘテロ３量体レセプターの形成及びＩＬ−２分泌が誘導される。ＣＤ２５は、ＣＤ４＋ Ｔリンパ球の５〜１０％及び末梢のＣＤ８＋Ｔリンパ球の１％未満で構成的に発現している。これらの細胞はアネルギー性であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでサプレッサー活性を示す（Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｅ．Ｍ．（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，３８９〜４００）。
【００１０】
他の実験腫瘍はこの治療に難治性であるが、一部の実験腫瘍で抗ＣＤ２５ ｍＡｂの受動的投与により、抗腫瘍性応答が誘導されることが最近実証された（Ｏｎｉｚｕｋａ，Ｓ．ら、（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９，３１２８〜３１３３）。
【００１１】
自己分子、特に成長因子などの可溶性分子に対しする応答を誘導する免疫系の能力は限定される。それにもかかわらず、担体タンパク質に結合させアジュバントで乳化したこれらの因子を用いた能動免疫により、これらの分子に対する免疫応答の誘導が促進される（Ｕ．Ｓ．５，９８４，０１８）。自己由来又は異種の分子に対して産生された特異的自己抗体は、それらの因子のレセプターへの結合を阻害し、この結合により誘発される増殖機構を遮断する。
【００１２】
それらの結果から、抗腫瘍性応答はＩＬ−２の存在に依存することは最高水準の技術として認められる。したがって、我々は、アジュバント中の担体分子に結合したＩＬ−２を用いる能動免疫により誘導される抗ＩＬ−２自己抗体の、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍発展に及ぼす影響を特徴づけることに決定した。
【００１３】
意外にも、抗ＣＤ２５ ｍＡｂの受動的投与により誘導される抗腫瘍効果に耐性の腫瘍でさえも、ＩＬ−２のＩＬ−２レセプターへの結合を遮断する自己抗体の誘導は、腫瘍増殖の減少を促進する。さらに、そのような自己抗体の存在は、治療を受ける対象で癌ワクチンに対する免疫応答に影響を及ぼさない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、対象の免疫系の役割が重要である腫瘍治療で効果を有する治療用製剤に関する。特に、本発明は、インターロイキン−２のインターロイキン−２レセプターへの結合を遮断し、腫瘍増殖を阻害する自己抗体を産生できる免疫治療用製剤の生成を含む。
【００１５】
本発明の目的は、癌患者治療で有用な、ＩＬ−２のＩＬ−２レセプターへの結合を阻害する治療用製剤であって、この製剤は担体タンパク質に結合されたＩＬ−２又はそのペプチドを含み、さらに適切なアジュバントを含む。特に、本発明の治療用製剤は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の担体タンパク質Ｐ６４ｋを含み、アジュバントは水酸化アルミニウム及びモンタニドＩＳＡ ５１からなる群から選択される。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の一実施態様では、治療用製剤は化学的結合によりＰ６４ｋに結合したＩＬ−２を含む。本発明の他の実施態様において、製剤は融合タンパク質中のＩＬ−２又はそのペプチド及びＰ６４ｋを含む。
【００１７】
また、インターロイキン−２のインターロイキン−２レセプターへの結合を阻害する、癌を有する個体の治療に有効な、ヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）に対し特異的モノクローナル抗体を含む治療用製剤は、本発明を構成する。
【００１８】
また、腫瘍に対して適切な免疫応答の誘発するためにＩＬ−２のそのレセプターへの結合を遮断することを必要とする、ＩＬ−２又はＩＬ−２に対する抗体を含むワクチンの組成物の投与を含む癌患者の治療法が、本発明の目的である。
【００１９】
他の態様において、本発明は特異的腫瘍抗原又は腫瘍増殖因子に基づく癌の他のワクチン及び現在通常に使用する化学療法剤若しくは放射線療法とＩＬ−２に基づくワクチンとの治療的組合せについて説明する。
【００２０】
用語「治療的組合せ」とは、別々の及び分離した組成（試薬の計画形式の例（ｅｘａｍｐｌｅ ｉｎ ｆｏｒｍ ｏｆ ｇａｍｅｓ ｏｆ ｒｅａｇｅｎｔｓ））としての２つの構成成分の組合せに関し、これらの成分が患者の治療に組み合わせて用いられる場合の物理的な組合せ（すなわち混合物の形態）を意味する。したがって、薬剤の組合せとは、治療のコースの間、同じ患者への２つの化合物の投与、又は独立した用量投与によるのと同程度の物理的な組合せによる用量投与を含む治療スケジュールにおける薬剤の有用な組合せである。
【００２１】
用語「癌ワクチン」とは、そのワクチンが対象の服従治療においてワクチンに用いられた抗原を認識し、測定可能な免疫応答を生じるような能動的免疫療法における有用な薬剤を意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
１．− 免疫原性組成物の入手
本発明のワクチン組成物は、担体タンパク質、好ましくは髄膜炎菌Ｐ６４ｋの外膜複合体由来のタンパク質に結合させた、ヒト組換え型インターロイキン−２（ｈＩＬ−２ｒ）を有効成分として含む（０４７４３１３ ＥＰ Ａ２及びＵ．Ｓ．５，２８６，４８４）。さらに、このワクチン組成物は、適切なアジュバントを含む。本発明のワクチン組成物は、アジュバントとしてモンタニドＩＳＡ ５１を用いるのが好ましい。
ｈＩＬ−２ｒ及び担体タンパク質間の結合は、化学的結合又は遺伝子工学の技術により得られる融合タンパク質の作製により可能である。
【００２３】
− 化学的結合によりＰ６４ｋタンパク質に結合したｈＩＬ−２ｒを含むワクチン組成物の入手
ｈＩＬ−２ｒ及びＰ６４ｋタンパク質間にタンパク質結合を達成するために、両成分を様々な割合、２０：１から５：１（Ｐ６４ｋタンパク質のモルに対するｈＩＬ−２ｒのモル）まで、好ましくは１０：１（Ｐ６４ｋタンパク質のモルに対するｈＩＬ−２ｒのモル）で混合する。グルタルアルデヒドを、０．０２％及び０．１％間にある、好ましくは０．５％の最終濃度でこの混合物に添加し、室温（ＲＴ）で１〜５時間インキュベートする。最後に、これをリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液中で充分に透析した。
結合反応は、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した（Ｌａｅｍｍｌｉ ＵＫ （１９７０）Ｎａｔｕｒｅ ２７７，６８０〜６８５）。
【００２４】
− ｈＩＬ−２ｒ及びＰ６４ｋタンパク質間の融合タンパク質を含むワクチン組成物の入手
ヒトＩＬ−２（４４７ｐｂ）をコードする遺伝子を、特異的プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により増幅する。得られたＤＮＡフラグメントを消化し、生じたタンパク質が両分子の１コピー又はそれ以上を含むように、担体タンパク質をコードする遺伝子をクローニングする発現ベクターの特異的結合部位に結合させる。哺乳動物細胞及び細菌又は酵母菌の任意の発現ベクターを用いることができる。またベクターは、担体タンパク質のＮ末端に、６つのヒスチジンを含むことができる。得られたプラスミドは、アガロースゲル電気泳動での制限酵素分析、酵素シークエンス２，０（ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ Ｓｅｑｕｅｎａｃｅ ２，０）（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＵＳＢ）を用いるＤＮＡ塩基配列分析、及び最後に特異的抗ｈＩＬ−２モノクローナル抗体を用いる「ウエスタンブロット」法で、大腸菌の任意の発現株で融合タンパク質産物の分析により確認する。タンパク質を得るために、細菌壁を強い破断方法を用いて破壊後、タンパク質を硫酸アンモニウムによる差次的な沈殿法とクロマトグラフィー法の組合せにより精製する。最後に、タンパク質を無菌条件下で濾過し、後に使用するまで−２０℃で保存するか又は凍結乾燥して４℃で保存する。
【００２５】
− Ｐ６４ｋタンパク質に化学的に結合したか又は融合タンパク質として結合したｈＩＬ−２ｒ由来ペプチドを含むワクチン組成物の入手
ＩＬ−２のアミノ酸配列由来の化学合成により得たペプチドを、Ｐ６４ｋタンパク質に、Ｕ．Ｓ．５，９８４，０１８で記載されているように化学的結合により結合できる。或いは、ｈＩＬ−２ｒ及びＰ６４ｋタンパク質由来のペプチドの融合タンパク質は、前節に記載のものと同じ方法により本質的に得られる。実施例は下記の領域からのペプチドを含むことができる。すなわち、
１）ペプチド Ｎ３３−Ａ５０
アミノ酸番号：１８
配列： ＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡ
２）ペプチド Ｔ１１３−Ｔ１３３
アミノ酸番号：２１
配列： ＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ
【００２６】
− ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ化学的結合体の電気泳動
この電気泳動は、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により実施できる（Ｌａｅｍｍｌｉ Ｕ．Ｋ．（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ ２７７，６８０〜６８５）。電気泳動では、１ウェル当たり１５μｇの試料を適用し、クーマシーで染色する。
【００２７】
２．− ｈＩＬ−２ｒ及びタンパク質Ｐ６４ｋを含むワクチン組成物のもたらす効果の特徴づけ。前臨床試験
− ワクチン組成物の免疫原性
動物で本発明のワクチン製剤の免疫原性を試験するために、生後８〜１２週目の体重１８〜２０ｇの雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。実験の間、マウスを実験動物優良飼育及び使用基準に従い標準作業手順書（ＳＯＰ）により定められた給餌及び処置の標準条件で飼育した。
【００２８】
これは次の種々の免疫化のスケジュールに従うことができる。
− スケジュールＡ、ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチン、０．１ｍＬ中に結合したｈＩＬ−２ｒの４μｇ当量の４用量を、肢の免疫部位を交互に換えて、２週間ごとに筋肉内投与する。
− スケジュールＢ、ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチン、０．１ｍＬ中に結合したｈＩＬ−２ｒの１０μｇ当量の４用量を、筋肉内投与する。最初の２用量は、２つの肢の独立した免疫部位に同時に投与し、２週間後に２用量を別の２つの肢に投与する。
【００２９】
− ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンにより誘導されたｈＩＬ−２ｒに対する抗体応答の評価
特異的抗体又はＢ細胞を測定することにより、遮断抗体を測定するか又は末梢血液で特異的免疫応答を評価する最高水準の技術で利用可能な方法の１つにより、自己抗体力価を血清で検出できる。
ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンにより誘導される抗ｈＩＬ−２ｒ抗体は、免疫した動物の血清を用いる、以下に記載の間接ＥＬＩＳＡ（酵素結合抗体免疫吸着アッセイ）により評価できる。
９６穴平底マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ，ＵＳＡ）は、０．１Ｍ炭酸塩−重炭酸塩ｐＨ９．６溶液中で１０μｇ／ｍＬの濃度に調製したｈＩＬ−２ｒ（５０μＬ／ウェル）を含む。プレートを４℃で終夜インキュベートし、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０）を用いて２００μＬ／ウェルで２回洗浄した。１００μＬ（１％ウシ血清アルブミン（ＰＢＳ−ＢＳＡ １％）を含む）／ウェルで３７℃で１時間インキュベート後、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０（２００μＬ／ウェル）で洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡ１％中、異なる希釈の血清試料５０μＬ／ウェルを添加する。３７℃で１時間インキュベート後、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡで１／５０００に希釈したアルカリホスファターゼ結合ヒツジ抗マウス血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を５０μＬ／ウェルで添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ｐＨ９．８、ジエタノールアミン緩衝液中にｐ−ニトロフェニルリン酸（Ｓｉｇｍａ）１ｎｇ／ｍＬを含む基質溶液を５０μＬ／ウェルで添加する。室温（ＲＴ）で３０分プレートをインキュベートした後に、反応産物の吸光度を４０５ｎｍで、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ，Ａｕｓｔｒｉａ）で測定する。
【００３０】
− ＥＧＦに基づくワクチンにより誘導された抗ｈＥＧＦ抗体応答の評価
Ｂ細胞又は特異的抗体を測定することにより、遮断抗体を測定するか又は末梢血液で特異的免疫応答を評価する最高水準の技術で利用可能な方法の１つにより、自己抗体力価は血清で検出できる。
Ｇｏｎｚａｌｅｚ、Ｇ．、ら、（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５，２３３〜２４４で記載されているように、ＥＧＦに基づくワクチンにより誘導される抗ｈＥＧＦ抗体を、免疫した動物の血清を用いる間接ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）により評価できる。
【００３１】
− ｈＩＬ−２−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１をワクチン接種した動物からの血清又はｈＩＬ−２ｒに対する特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と共にインキュベーションした後のＣＴＬＬ−２細胞系の増殖に及ぼす効果
ＩＬ−２依存性Ｔ細胞系ＣＴＬＬ−２を、連続的増殖下で、ｈＩＬ−２ｈの１Ｕ／ｍＬを含むＲＰＭＩ−１６４０培地に保持する。ＣＴＬＬ−２の培養を、細胞懸濁液中０．５×１０５〜１０６細胞／ｍＬと共に８〜２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４０が２５ｍＬ入っている７５ｃｍ２細胞培養フラスコで実施する。細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖の２日後に使用する。
アッセイを実施するため、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ培養から採取し、ＲＰＭＩ−１６４０又はＰＢＳで少なくとも４回洗浄する。９６穴平底培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ，ＵＳＡ）へ、５×１０３細胞を播種する。これらの細胞を、ｈＩＬ−２−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンで免疫した動物からのＩＬ−２に対するＥＬＩＳＡ力価が１：１００００の希釈血清又は抗ＩＬ−２特異的ｍＡｂで処理し、ｈＩＬ−２ｒ（１Ｕ／ｍＬ）を添加する。培養を５％ＣＯ２インキュベーターで、３７℃の湿潤な空気中で２４時間実施する。培養の最後の１８〜２４時間に［３Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウェル）をパルスすることにより増殖を測定した。チミジン取り込みは、液体シンチレーションカウンターで測定する。全ての操作は、無菌状態で実施する。
【００３２】
３− ｈＩＬ−２−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンの抗腫瘍効果。前臨床試験
本発明のワクチンの製剤の抗腫瘍効果を動物で試験するために、生後８〜１２週間目の体重１８〜２０ｇの雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。動物はすでに詳述したスケジュールＡ及びＢに従って、ｈＩＬ−２−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンで免疫可能であり、１週後に乳癌Ｆ３ＩＩのような腫瘍細胞系を、５×１０４細胞／動物で、同所性に皮下投与経路で接種する。触知可能な腫瘍を有するマウスを陽性と記録し、腫瘍増殖はカリパーを用いて測定し、最長の表面距離（ａ）及びこれに対して垂直な幅（ｂ）を規定し、腫瘍サイズはａ×ｂとして記録した。腫瘍は定期的に調べる。
驚くべきことに、予想外にも、本発明の著者らは、悪性腫瘍を有する対象で、ＩＬ−２のＩＬ−２レセプターへの結合中和、この腫瘍に対する免疫応答が増強され、腫瘍サイズの減少を誘導することを見出した。以前の技術の状態は、そのような処置は腫瘍に対する個体の免疫系の応答の抑制を生じるであろうことを示していた。
減少が抗ＩＬ−２モノクローナル抗体で受動的治療を受けて得られる場合と同様に、対象が本発明のワクチンの組成物による能動的治療を受けている場合、循環血中のＩＬ−２濃度が実質的に低下する場合、本著者らは腫瘍増殖に及ぼすこの効果が得られることを見出した。
その理由のために、本発明は悪性腫瘍患者の治療のために結果として否定できない利益になり、且つ、これらの場合用いられる通常の治療よりも患者にとってはるかに不快でなく積極的で有効で簡単なＩＬ−２によるワクチン投与法を提供する。
下記の実施例は、本発明の対象のワクチン組成物の免疫学的有効性を例証する実験の詳しい説明を含む。
【実施例】
【００３３】
本発明のワクチン組成物で用いられるヒト組換え型ＩＬ−２（ｈＩＬ−２ｒ）は市販のものであった：（Ｕ．Ｓ．５，６１４，１８５）。
ワクチンで用いた髄膜炎菌由来のタンパク質Ｐ６４ｋは、ＥＰ ０４７４３１３Ａ２及びＵ．Ｓ．５，２８６，４８４で記載される組換えＤＮＡ技術により得た。
【００３４】
（実施例１）
ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンにより誘導された抗体応答
ヒトインターロイキン−２に対する免疫原性を増進するために、ヒトインターロイキン−２を、髄膜炎菌由来の担体タンパク質Ｐ６４ｋタンパク質に化学的に結合した。化学的結合は、グルタルアルデヒド法により行うことができる（Ｕ．Ｓ．５，９８４，０１８）。１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、各成分の試料（ｈＩＬ−２ｒ、Ｐ６４ｋ）を別々に添加し、化学的結合体ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋと分子量の標準パターンを比較して結合効率が確認される。ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋを添加したレーンで連続的に存在するため、得られた結合型を確認することは可能である（図１）。
ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンにより誘導されたｈＩＬ−２ｒに対する抗体応答を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、スケジュールＡ及びＢで免疫した。ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンに応答した動物からの高度免疫血清を陽性対照として用い、免疫前血清を陰性対照として用いた。血清の吸光度が、免疫前血清の吸光度の平均値プラス５倍の標準偏差より大きい最大希釈を、免疫した動物の抗体力価と定義した。対照動物で力価を定義するため、陰性対照として免疫前血清の代わりにＰＢＳ−ＢＳＡ１％を用いた場合を除き、同じ先の判定基準を用いた。
１：１００から１：５００００まで力価が達する抗体応答が誘導された。この免疫プロトコールは約５２日間続く、その理由は短期間に同程度であるか又はより高い抗体力価を得るためにプロトコールを改変する必要があり、したがって我々はスケジュールＢを用いて図２に示すように同程度の結果を得た。
【００３５】
（実施例２）
ｈＩＬ−２−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンで免疫した動物由来血清で処理したＣＴＬＬ−２細胞系の増殖試験
ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンで免疫した動物で産生される血清抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＬ−２結合能は、血清抗体と共にＩＬ−２依存性Ｔ細胞系ＣＴＬＬ−２を培養することにより評価した。ＣＴＬＬ−２細胞をＩＬ−２の存在下で培養プレートに播種して増殖させ、約１：１００００抗体力価を有する動物からの種々の希釈血清を添加した。血清濃度とＣＴＬＬ−２細胞系増殖の阻害の間に、直接的相関が認められた（図３）。この血清は、ワクチン接種した動物由来の血清のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＬ−２中和能力を実証する。
【００３６】
（実施例３）
ｈＩＬ−２−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンで処置した動物における抗腫瘍性の実験
スケジュールＢに従い、動物をｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンで免疫した。１週間後に、動物を５×１０４ Ｆ３ＩＩ腫瘍細胞に曝露した。腫瘍増殖カイネティクスは、ＰＢＳ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１で免疫した対照群と比較して、ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ５１で免疫した動物でより緩慢であった（図４ａ）。これら２群間の腫瘍サイズに統計有意差が認められた。
【００３７】
（実施例４）
抗ＩＬ−２特異的ｍＡｂで処理したＣＴＬＬ−２細胞系の増殖試験
Ｓ４Ｂ６（ＡＴＣＣ ＃ ＨＢ−８７９４）ハイブリドーマにより産生されたｈＩＬ−２ｒに対する特異的抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＬ−２結合能を、ＩＬ−２依存性Ｔ細胞系ＣＴＬＬ−２と共にそれらを培養することにより評価した。ＣＴＬＬ−２細胞を、ＩＬ−２存在下で培養プレートに播種して増殖させ、種々の希釈抗体を添加した。抗体濃度とＣＴＬＬ−２細胞系増殖の阻害の間に、直接的な相関が認められた（図５）。モノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＬ−２中和能力を実証する、１：１００希釈抗体によりＣＴＬＬ−２細胞系増殖を８０％以上阻害できることが見出された。
【００３８】
（実施例５）
抗ＩＬ−２ ｍＡｂ及び抗ＣＤ２５ ｍＡｂ（ＡＴＣＣ−ＰＣ６１）の抗腫瘍効果、Ｆ３ＩＩ実験モデル（乳癌）
マウスを、日用量１ｍｇの特異的モノクローナル抗体（抗ＣＤ２５ ｍＡｂ又は抗ＩＬ−２ ｍＡｂ）を、連続して５日間投与した。２日後に皮下同所性注射により、マウスを実験的乳癌Ｆ３ＩＩに５×１０４細胞／マウスで曝露した。最長の表面距離（ａ）及びこれに対して垂直な幅（ｂ）を定期的に測定した。対照群の腫瘍サイズ（ＰＢＳを投与した）は、抗ＩＬ−２ ｍＡｂを投与した群よりも大きかった（図６）。２つの実験群間の腫瘍サイズは統計的に相異した。しかしながら抗ＣＤ２５ ｍＡｂ（ＡＴＣＣ―ＰＣ６１）を投与した動物の腫瘍サイズは、対照群と同程度であった。この結果はＣＤ２５制御細胞の除去が影響を与えない腫瘍においてさえも、ＩＬ−２中和抗体は強い抗腫瘍効果を有することを示す。
【００３９】
（実施例６）
抗ＩＬ−２ ｍＡｂ及び抗ＣＤ２５ ｍＡｂ（ＡＴＣＣ−ＰＣ６１）の抗腫瘍効果。ＥＬ４実験モデル（リンパ腫）
Ｃ５７ＢＬ／６動物を、ＥＬ４リンパ腫（５×１０４細胞／マウス）に皮下で曝露した。動物に抗ＣＤ２５ ｍＡｂ（ＰＣ６１）の１ｍｇの１用量を、腫瘍への曝露の２日前に静脈内投与するか、又は抗ＩＬ−２ ｍＡｂ（Ｓ４Ｂ６）の１ｍｇの日用量を、腫瘍接種の６日前に開始して連続５日間静脈内投与した。別の群は、以前に記載した同様のスケジュールに基づき抗ＣＤ２５及び抗ＩＬ−２ ｍＡｂｓを同時投与した。
マウスの各群の腫瘍増殖を記録した。腫瘍へ曝露後毎週２回、各マウスにおける腫瘍サイズを、２つの垂直な大きさで測定した。ＥＬ４腫瘍に関する統計的差異は、＊ｐ＝０．０２３２（＊＊ｐ＝０．００３９）、＊＊＊ｐ＜０．０００１である。
図７は、２つのモノクローナル抗体の組合せが、腫瘍増殖に及ぼす最も強い効果を有することを示す。
【００４０】
（実施例７）
自己抗体抗ＩＬ−２の誘導は、ＥＧＦ癌ワクチンに対する応答に影響を及ぼさない
ｈＥＧＦ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンにより誘導されるｈＥＧＦに対する抗体応答が、自己抗体の誘導を伴うｈＩＬ−２ｒによるその前のワクチン投与により影響を受けるかどうかを評価するために、ＢＡＬＢ／ｃ動物をスケジュールＡに従いｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１で調製したワクチンで免疫し、１９日後にｈＥＧＦ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１又はｈＥＧＦ／モンタニドＩＳＡ ５１で調製したワクチンで免疫した。ｈＥＧＦのワクチンで免疫した全ての実験で、０．１ｍＬの量で調製したワクチンに結合したｈＥＧＦの４μｇ当量を筋肉内経路で投与した。ｈＥＧＦ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンに応答した動物の高度免疫血清を、陽性対照として用い、陰性対照には免疫前血清を用いた。血清の吸光度が、免疫前血清の吸光度の平均値よりさらに５倍標準偏差より大きい最大希釈を、免疫した動物の抗体力価と定義した。対照動物で力価を定義するため、陰性対照として免疫前血清の代わりにＰＢＳ−ＢＳＡ１％を用いた場合を除き、同じ先の判定基準を用いた。ＥＧＦ／モンタニドＩＳＡ ５１又はｈＥＧＦ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１によるワクチン接種により誘導されるＥＧＦに対する抗体の力価は、図８で示すように、ｈＩＬ−２ｒに対する自己抗体の誘導によっては影響を受けないことが得られた。
【００４１】
（実施例８）
ｉｎ ｖｉｖｏでインターロイキン−２の中和により、腫瘍保持宿主のリンパ節細胞で評価した細胞溶解活性を回復する
腫瘍保持宿主で、名目抗原に対する免疫応答に及ぼすＩＬ−２の中和効果を評価した。雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｈ−２ｂ）は、標準飼育条件下で維持した。全ての実験で、６及び１２週齢の間のマウスを用いた。卵白アルブミン（ＯＶＡ）及びペプチド：ＯＶＡグレードＶＩＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）は、これらの実験の全体を通じて用いたモデルタンパク質Ａｇであった。優占するペプチドＯＶＡ２７５−２６４（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）は、＞９０％の純度で用いた。増殖反応測定法：Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、左側腹の皮下経路でＭＢ１６Ｆ１０腫瘍の１０４細胞又はＰＢＳに曝露した。腫瘍直径は定期的に測定する。３週間後にこれらのマウスを、試験開始時に１００μｇ／マウスのポリイノシン酸ポリシチジル酸［ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ］（ＰＩＣ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と共に１ｍｇのＯＶＡで皮下に免疫し、その後の２日はＰＩＣのみを投与した。同時に動物に、ｈＩＬ−２ｒ（αｌＬ−２）対する特異的モノクローナル抗体又はＰＢＳを５日連続して投与した。差次的に蛍光色素ＣＦＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）で標識した未処置のマウスからの脾臓細胞を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞溶解活性を測定した。ＣＦＳＥｈｉｇｈで標識した細胞を標的として用い、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（１μＭ；３７℃で９０分、５％ＣＯ２）でパルスしたが、ＣＦＳＥｌｏｗで標識した細胞は内部対照としてパルスしなかった。ペプチドでパルスした標的細胞を、遊離のペプチドを除去するために充分に洗浄後、前もって免疫したマウスに１：１の比率で同時に静注した。１６時間後リンパ節及び脾臓を摘出し、両方の蛍光強度（ＣＦＳＥｌｏｗ及びＣＦＳＥｈｉｇｈ）に対応する全事象を、フローサイトメトリーにより測定した。非コーティング対ＳＩＩＮＦＥＫＬコーティング（ＣＦＳＥｉｎｔ／ＣＦＳＥｈｉｇｈ）のパーセンテージ間の比率を算出して、細胞毒性の数値を得る。ＯＶＡペプチドに対するリンパ節細胞の細胞溶解活性を、最大の応答を与えたＯＶＡプラスＰＩＣで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスでｉｎ ｖｉｖｏで評価した。日用量１ｍｇの抗ＩＬ−２モノクローナル抗体の連続５日間の静脈内注射は、これらの動物で細胞溶解性応答に影響を及ぼさない。ＭＢ１６Ｆ１０腫瘍に曝露されたＣ５７ＢＬ／６マウスは、ＯＶＡに対する細胞溶解活性低下を伴う免疫抑制になる。しかしＩＬ−２中和能を有するモノクローナル抗体をｉｎ ｖｉｖｏで投与すると、リンパ節細胞の免疫応答が回復する（図９）。
【００４２】
（実施例９）
ｉｎ ｖｉｖｏでのインターロイキン−２の中和により、腫瘍保持宿主の脾臓細胞で評価した細胞溶解活性が回復する
腫瘍保持宿主での名目抗原に対する免疫応答に及ぼすＩＬ−２中和効果を評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＯＶＡプラスＰＩＣで免疫してＯＶＡペプチドに対する脾臓細胞の細胞溶解活性をｉｎ ｖｉｖｏ評価し、最大の応答を得た。日用量１ｍｇの抗ＩＬ−２モノクローナル抗体の連続５日間の静注投与は、これらの動物で細胞溶解性応答に影響を及ぼさない。
ＭＢ１６Ｆ１０腫瘍に曝露されたＣ５７ＢＬ／６マウスは、ＯＶＡに対する細胞溶解活性低下を伴う免疫抑制になる。しかし、ＩＬ−２中和能を有するモノクローナル抗体をｉｎ ｖｉｖｏで投与すると、脾臓細胞の免疫応答が回復する（図１０）。
【００４３】
（実施例１０）
調製したワクチンｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１で免疫した動物での血液細胞の計数
調製したｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンでの免疫が、最初の免疫後の１００日まで、（スケジュールＡに従い）調製したワクチンで免疫した動物又はワクチン接種していない動物と同程度に、赤血球、白血球及び血小板を計数した血液細胞数の変化を引き起こすどうかを評価する目的。図１１の１つのように、１つは分析した群間に細胞数値に差異を得なかった。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】化学的結合したｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋの電気泳動。左から右に向かいバンドは、それぞれＰ６４ｋ、ｈＩＬ−２ｒ、ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ及び分子量の標準パターンに対応する。
【図２】両方とも以前に説明した免疫スケジュールを用いる、ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１のワクチン接種により誘導されたｈＩＬ−２ｒに対する抗体の力価。ｙ軸は、ＩＬ−２に対する抗体の力価の幾何平均値を示す。ｘ軸は、以下で免疫された動物に対応する群である。 対照：Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１。 スケジュールＡに従い、 Ｓｃｈ Ａ ＩＬ−２：ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ スケジュールＢに従い、 Ｓｃｈ Ｂ ＩＬ−２：ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１。
【図３】ｈＩＬ−２ｒ及びｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンで免疫し、１：１０００から１：５００００のオーダーまでの力価を有する動物の血清からの種々の希釈の存在下でＣＴＬＬ−２系の増殖。
【図４】ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１のワクチン又はＰ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１（対照群）でワクチン接種し、その後Ｆ３ＩＩ腫瘍に曝露した動物での腫瘍増殖。ｙ軸は、垂直に選択した最大×最小直径として定義した腫瘍領域を示す。
【図５】ｈＩＬ−２ｒの及びＩＬ−２に対する抗体の種々の希釈の存在下でのＣＴＬＬ−２系の増殖。
【図６】抗ＩＬ−２ ｍＡｂ、抗ＣＤ２５ ｍＡｂ又はＰＢＳ（対照群）で処置し、Ｆ３ＩＩ腫瘍細胞系に曝露した動物の腫瘍増殖。ｙ軸は、垂直に選択した最大直径×最小直径として定義した腫瘍の面積を示す。
【図７】αＣＤ２５ ｍＡｂ、抗ＣＤ２５ ｍＡｂ又はＰＢＳ（対照群）で処置し、その後リンパ腫ＥＬ４に曝露した動物の腫瘍増殖。ｙ軸は、垂直に選択した最大直径×最小直径として定義した腫瘍の面積を示す。
【図８】ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１及びｈＥＧＦ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１のワクチン接種により誘導されたＥＧＦに対する抗体力価。ｙ軸は、ＥＧＦに対する抗体の力価の幾何平均を示す。ｘ軸は以下で免疫された群を示す。ｈＩＬ−２ｒ：ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１。ｈＥＧＦ：ｈＥＧＦ／モンタニドＩＳＡ ５１ｈＩＬ−２ｒ＋ｈＥＧＦ：ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニド ＋ ｈＥＧＦ／モンタニド。ｈＥＧＦ／Ｐ６４ｋ：ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニド ＋ ｈＥＧＦ／モンタニド。ｈＩＬ−２ｒ＋ｈＥＧＦ／Ｐ６４ｋ：ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニド ＋ ｈＥＧＦ／Ｐ６４ｋ／モンタニド。
【図９】インターロイキン−２に対して誘導された抗体は、腫瘍保持宿主のリンパ節細胞で評価した細胞溶解活性を回復する。 全てのマウスは試験開始時に、１ｍｇのＯＶＡに加えてＰＩＣの１００μｇ／マウスで皮下に免疫し、その後２日はＰＩＣのみを投与した。ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞溶解活性を、蛍光色素ＣＦＳＥで差次的に標識した未処置のマウス由来の脾臓細胞を用いて測定した。ＣＦＳＥｈｉｇｈで標識した細胞を標的として用い、ＳＩＩＮＦＥＫＬでパルスしたが、ＣＦＳＥｌｏｗで標識した細胞は内部対照としてパルスしないでおき、次いで、あらかじめ免疫したマウスに１：１の比率で同時に静脈内に注射した。細胞溶解活性は、リンパ節細胞で評価した。 対照 − ＰＢＳで処置した動物、αｌＬ−２ − ＩＬ−２中和モノクローナル抗体で処置した動物、ＭＢ１６Ｆ１０ − 対照と同様であるがＭＢ１６Ｆ１０に曝露した動物、αｌＬ−２＋ＭＢ１６Ｆ１０ − ＩＬ−２中和モノクローナル抗体で処置したＭＢ１６Ｆ１０腫瘍保持マウス。
【図１０】インターロイキン−２に対して誘導された抗体は、腫瘍保持宿主の脾臓細胞で評価した細胞溶解活性を回復する。 全てのマウスは試験開始時に、１ｍｇのＯＶＡに加えてＰＩＣの１００μｇ／マウスで皮下に免疫し、その後２日はＰＩＣのみを投与した。ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞溶解活性を、蛍光色素ＣＦＳＥで差次的に標識した未処置のマウス由来の脾臓細胞を用いて測定した。ＣＦＳＥｈｉｇｈで標識した細胞を標的として用い、ＳＩＩＮＦＥＫＬでパルスしたが、ＣＦＳＥｌｏｗで標識した細胞は内部対照としてパルスしないでおき、次いで、あらかじめ免疫したマウスに１：１の比率で同時に静脈内に注射した。細胞溶解活性は、脾臓細胞で評価した。 対照 − ＰＢＳで処置した動物、αｌＬ−２ − ＩＬ−２中和モノクローナル抗体で処置した動物、ＭＢ１６Ｆ１０ − 対照と同様であるがＭＢ１６Ｆ１０に曝露した動物、αｌＬ−２＋ＭＢ１６Ｆ１０ − ＩＬ−２中和モノクローナル抗体で処置したＭＢ１６Ｆ１０腫瘍保持マウス。
【図１１】対照（Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１）と比較した、ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンで免疫した動物の血球（ロイコサイト（白血球）、エリスロサイト（赤血球）及び血小板）算定。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）に対する免疫応答を増強でき、且つレセプターとの結合を阻害し、腫瘍治療に有用な自己抗体を上昇させる医薬製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍抗原を認識する免疫系及び特にＴ細胞の能力の発見は、癌患者治療を目的とする免疫系操作に関する戦略の開発のための主要な柱の１つである。
【０００３】
したがって、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）として知られている腫瘍間質へ浸潤している特異的なＴ細胞、又は無処置の個体の末梢血液に由来するか、又は治療用癌ワクチン使用後の末梢血液に由来する特異的なＴ細胞を回収する方法を開発するために、ｉｎ ｖｉｖｏで特異的なＴ細胞を刺激してその抗腫瘍性エフェクター能を増強することに対して、主な努力が向けられてきた。
【０００４】
したがって、主な戦略は、様々な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対するＴ細胞の特異的な細胞毒性活性を増強することに向けられてきた。次いで、主な治療的アプローチは、腫瘍を有する個体由来のＴＩＬを活性化し、増加させるためにインターロイキン−２（ＩＬ−２）をｉｎ ｖｉｔｒｏで使用し、これらの個体にこれらの細胞を再注入することに焦点が当てられている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｓ．Ａ．ら、（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３，１３１８〜１３２１；Ｋａｗａｋａｍｉ、Ｙ．ら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，６４５８〜６４６２；Ｋａｗａｋａｍｉ、Ｙ．ら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，３５１５〜３５１９）。しかしながら、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞性免疫応答の刺激が証明されたにもかかわらず、そのような介入は限られた治療成績しか有していない。その結果、ｉｎ ｖｉｖｏで有効な細胞性免疫応答の誘発を促進させるために、ＩＬ−２に関連する腫瘍抗原を含むワクチンベクターを設計して、治療用癌ワクチンを用いる活性のある特異的免疫プロトコールの使用に基づく治療様式の評価することになったが、これらの方法は不十分な結果を与えた（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，ら、（１９９８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４，３２１〜３２７）。
【０００５】
現在では、主要な臨床的な戦略は、患者由来の患者自身の腫瘍抗原に反応性のＴ細胞の養子移入に基づく様式の開発に移行している。これらの細胞を、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及びＩＬ−２を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激して増加させ、血流へ再注入した後に、ＩＬ−２を非経口投与する。この方法は、癌患者治療に関して考えられる主要な治療的介入の１つを構成するが、治療結果は控えめにとどまる（Ｄｕｄｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．，ら、（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８，８５０〜８５４；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ら、（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１ Ｓｕｐｐｌ．２，１４６３９〜４５）。
【０００６】
全てのこの治療戦略の合理的な設計は、抗腫瘍性免疫応答の細胞活性化における必須な分子としてのインターロイキン−２の使用に基づいている（Ｕ．Ｓ．６，０６０，０６８及びＵ．Ｓ．５，８３０，４５２）。
【０００７】
免疫におけるＩＬ−２の機能に関する背景は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される実験に基づいている。その発見からＩＬ−２はＴ細胞増殖を促進する能力によって認識された（したがって、ＩＬ−２アクロニムは、Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（Ｔ細胞成長因子）である）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞の増殖と機能の更なる証明は、この概念を確認した抗ＩＬ−２又は抗ＩＬ−２レセプターを用いて抑制できることである（Ｓｍｉｔｈ，ＫＡ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．５１：３３７〜３５７，１９８０）。
【０００８】
最近、抗腫瘍免疫のサプレッサー能力を有するＴ細胞の生成を介して、ヒト腫瘍が免疫系の応答を減少させうることが実験的に証明された。分化マーカーの関連性は実験モデルとは異なるが、これらの細胞は異なる分化マーカーを提示する動物モデル及び患者で特徴づけられた（Ｂａｃｈ，Ｊ．Ｆ．（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３，１８９〜１９８；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，Ｎ．Ｇ．，ら、（２００４）Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５，７９４〜８０２；Ｍａｒｋｕｓ，Ｙ．Ｍ．ｙ．Ｓｙｋｅｓ，Ｍ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２，１１３６〜１１５１）。
【０００９】
分化抗原群２５（ＣＤ２５）は、ＩＬ−２レセプターのα鎖を構成する。また、このサイトカインに対するレセプターの構造は、ベータ（ＣＤ１２２）及びガンマ（ＣＤ１３２）鎖を含んでいる。それらは静止期にあるＴリンパ球で構成的に発現し、これらの細胞が活性化されると、アルファ鎖の合成、高親和性ヘテロ３量体レセプターの形成及びＩＬ−２分泌が誘導される。ＣＤ２５は、ＣＤ４＋ Ｔリンパ球の５〜１０％及び末梢のＣＤ８＋Ｔリンパ球の１％未満で構成的に発現している。これらの細胞はアネルギー性であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでサプレッサー活性を示す（Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｅ．Ｍ．（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，３８９〜４００）。
【００１０】
他の実験腫瘍はこの治療に難治性であるが、一部の実験腫瘍で抗ＣＤ２５ ｍＡｂの受動的投与により、抗腫瘍性応答が誘導されることが最近実証された（Ｏｎｉｚｕｋａ，Ｓ．ら、（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９，３１２８〜３１３３）。
【００１１】
自己分子、特に成長因子などの可溶性分子に対しする応答を誘導する免疫系の能力は限定される。それにもかかわらず、担体タンパク質に結合させアジュバントで乳化したこれらの因子を用いた能動免疫により、これらの分子に対する免疫応答の誘導が促進される（Ｕ．Ｓ．５，９８４，０１８）。自己由来又は異種の分子に対して産生された特異的自己抗体は、それらの因子のレセプターへの結合を阻害し、この結合により誘発される増殖機構を遮断する。
【００１２】
それらの結果から、抗腫瘍性応答はＩＬ−２の存在に依存することは最高水準の技術として認められる。したがって、我々は、アジュバント中の担体分子に結合したＩＬ−２を用いる能動免疫により誘導される抗ＩＬ−２自己抗体の、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍発展に及ぼす影響を特徴づけることに決定した。
【００１３】
意外にも、抗ＣＤ２５ ｍＡｂの受動的投与により誘導される抗腫瘍効果に耐性の腫瘍でさえも、ＩＬ−２のＩＬ−２レセプターへの結合を遮断する自己抗体の誘導は、腫瘍増殖の減少を促進する。さらに、そのような自己抗体の存在は、治療を受ける対象で癌ワクチンに対する免疫応答に影響を及ぼさない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、対象の免疫系の役割が重要である腫瘍治療で効果を有する治療用製剤に関する。特に、本発明は、インターロイキン−２のインターロイキン−２レセプターへの結合を遮断し、腫瘍増殖を阻害する自己抗体を産生できる免疫治療用製剤の生成を含む。
【００１５】
本発明の目的は、癌患者治療で有用な、ＩＬ−２のＩＬ−２レセプターへの結合を阻害する治療用製剤であって、この製剤は担体タンパク質に結合されたＩＬ−２又はそのペプチドを含み、さらに適切なアジュバントを含む。特に、本発明の治療用製剤は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の担体タンパク質Ｐ６４ｋを含み、アジュバントは水酸化アルミニウム及びモンタニドＩＳＡ ５１からなる群から選択される。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の一実施態様では、治療用製剤は化学的結合によりＰ６４ｋに結合したＩＬ−２を含む。本発明の他の実施態様において、製剤は融合タンパク質中のＩＬ−２又はそのペプチド及びＰ６４ｋを含む。
【００１７】
また、インターロイキン−２のインターロイキン−２レセプターへの結合を阻害する、癌を有する個体の治療に有効な、ヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）に対し特異的モノクローナル抗体を含む治療用製剤は、本発明を構成する。
【００１８】
また、腫瘍に対して適切な免疫応答の誘発するためにＩＬ−２のそのレセプターへの結合を遮断することを必要とする、ＩＬ−２又はＩＬ−２に対する抗体を含むワクチンの組成物の投与を含む癌患者の治療法が、本発明の目的である。
【００１９】
他の態様において、本発明は特異的腫瘍抗原又は腫瘍増殖因子に基づく癌の他のワクチン及び現在通常に使用する化学療法剤若しくは放射線療法とＩＬ−２に基づくワクチンとの治療的組合せについて説明する。
【００２０】
用語「治療的組合せ」とは、別々の及び分離した組成（試薬の計画形式の例（ｅｘａｍｐｌｅ ｉｎ ｆｏｒｍ ｏｆ ｇａｍｅｓ ｏｆ ｒｅａｇｅｎｔｓ））としての２つの構成成分の組合せに関し、これらの成分が患者の治療に組み合わせて用いられる場合の物理的な組合せ（すなわち混合物の形態）を意味する。したがって、薬剤の組合せとは、治療のコースの間、同じ患者への２つの化合物の投与、又は独立した用量投与によるのと同程度の物理的な組合せによる用量投与を含む治療スケジュールにおける薬剤の有用な組合せである。
【００２１】
用語「癌ワクチン」とは、そのワクチンが対象の服従治療においてワクチンに用いられた抗原を認識し、測定可能な免疫応答を生じるような能動的免疫療法における有用な薬剤を意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
１．− 免疫原性組成物の入手
本発明のワクチン組成物は、担体タンパク質、好ましくは髄膜炎菌Ｐ６４ｋの外膜複合体由来のタンパク質に結合させた、ヒト組換え型インターロイキン−２（ｈＩＬ−２ｒ）を有効成分として含む（０４７４３１３ ＥＰ Ａ２及びＵ．Ｓ．５，２８６，４８４）。さらに、このワクチン組成物は、適切なアジュバントを含む。本発明のワクチン組成物は、アジュバントとしてモンタニドＩＳＡ ５１を用いるのが好ましい。
ｈＩＬ−２ｒ及び担体タンパク質間の結合は、化学的結合又は遺伝子工学の技術により得られる融合タンパク質の作製により可能である。
【００２３】
− 化学的結合によりＰ６４ｋタンパク質に結合したｈＩＬ−２ｒを含むワクチン組成物の入手
ｈＩＬ−２ｒ及びＰ６４ｋタンパク質間にタンパク質結合を達成するために、両成分を様々な割合、２０：１から５：１（Ｐ６４ｋタンパク質のモルに対するｈＩＬ−２ｒのモル）まで、好ましくは１０：１（Ｐ６４ｋタンパク質のモルに対するｈＩＬ−２ｒのモル）で混合する。グルタルアルデヒドを、０．０２％及び０．１％間にある、好ましくは０．５％の最終濃度でこの混合物に添加し、室温（ＲＴ）で１〜５時間インキュベートする。最後に、これをリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液中で充分に透析した。
結合反応は、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した（Ｌａｅｍｍｌｉ ＵＫ （１９７０）Ｎａｔｕｒｅ ２７７，６８０〜６８５）。
【００２４】
− ｈＩＬ−２ｒ及びＰ６４ｋタンパク質間の融合タンパク質を含むワクチン組成物の入手
ヒトＩＬ−２（４４７ｐｂ）をコードする遺伝子を、特異的プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により増幅する。得られたＤＮＡフラグメントを消化し、生じたタンパク質が両分子の１コピー又はそれ以上を含むように、担体タンパク質をコードする遺伝子をクローニングする発現ベクターの特異的結合部位に結合させる。哺乳動物細胞及び細菌又は酵母菌の任意の発現ベクターを用いることができる。またベクターは、担体タンパク質のＮ末端に、６つのヒスチジンを含むことができる。得られたプラスミドは、アガロースゲル電気泳動での制限酵素分析、酵素シークエンス２，０（ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ Ｓｅｑｕｅｎａｃｅ ２，０）（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＵＳＢ）を用いるＤＮＡ塩基配列分析、及び最後に特異的抗ｈＩＬ−２モノクローナル抗体を用いる「ウエスタンブロット」法で、大腸菌の任意の発現株で融合タンパク質産物の分析により確認する。タンパク質を得るために、細菌壁を強い破断方法を用いて破壊後、タンパク質を硫酸アンモニウムによる差次的な沈殿法とクロマトグラフィー法の組合せにより精製する。最後に、タンパク質を無菌条件下で濾過し、後に使用するまで−２０℃で保存するか又は凍結乾燥して４℃で保存する。
【００２５】
− Ｐ６４ｋタンパク質に化学的に結合したか又は融合タンパク質として結合したｈＩＬ−２ｒ由来ペプチドを含むワクチン組成物の入手
ＩＬ−２のアミノ酸配列由来の化学合成により得たペプチドを、Ｐ６４ｋタンパク質に、Ｕ．Ｓ．５，９８４，０１８で記載されているように化学的結合により結合できる。或いは、ｈＩＬ−２ｒ及びＰ６４ｋタンパク質由来のペプチドの融合タンパク質は、前節に記載のものと同じ方法により本質的に得られる。実施例は下記の領域からのペプチドを含むことができる。すなわち、
１）ペプチド Ｎ３３−Ａ５０
アミノ酸番号：１８
配列： ＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡ
２）ペプチド Ｔ１１３−Ｔ１３３
アミノ酸番号：２１
配列： ＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ
【００２６】
− ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ化学的結合体の電気泳動
この電気泳動は、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により実施できる（Ｌａｅｍｍｌｉ Ｕ．Ｋ．（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ ２７７，６８０〜６８５）。電気泳動では、１ウェル当たり１５μｇの試料を適用し、クーマシーで染色する。
【００２７】
２．− ｈＩＬ−２ｒ及びタンパク質Ｐ６４ｋを含むワクチン組成物のもたらす効果の特徴づけ。前臨床試験
− ワクチン組成物の免疫原性
動物で本発明のワクチン製剤の免疫原性を試験するために、生後８〜１２週目の体重１８〜２０ｇの雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。実験の間、マウスを実験動物優良飼育及び使用基準に従い標準作業手順書（ＳＯＰ）により定められた給餌及び処置の標準条件で飼育した。
【００２８】
これは次の種々の免疫化のスケジュールに従うことができる。
− スケジュールＡ、ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチン、０．１ｍＬ中に結合したｈＩＬ−２ｒの４μｇ当量の４用量を、肢の免疫部位を交互に換えて、２週間ごとに筋肉内投与する。
− スケジュールＢ、ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチン、０．１ｍＬ中に結合したｈＩＬ−２ｒの１０μｇ当量の４用量を、筋肉内投与する。最初の２用量は、２つの肢の独立した免疫部位に同時に投与し、２週間後に２用量を別の２つの肢に投与する。
【００２９】
− ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンにより誘導されたｈＩＬ−２ｒに対する抗体応答の評価
特異的抗体又はＢ細胞を測定することにより、遮断抗体を測定するか又は末梢血液で特異的免疫応答を評価する最高水準の技術で利用可能な方法の１つにより、自己抗体力価を血清で検出できる。
ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンにより誘導される抗ｈＩＬ−２ｒ抗体は、免疫した動物の血清を用いる、以下に記載の間接ＥＬＩＳＡ（酵素結合抗体免疫吸着アッセイ）により評価できる。
９６穴平底マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ，ＵＳＡ）は、０．１Ｍ炭酸塩−重炭酸塩ｐＨ９．６溶液中で１０μｇ／ｍＬの濃度に調製したｈＩＬ−２ｒ（５０μＬ／ウェル）を含む。プレートを４℃で終夜インキュベートし、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０）を用いて２００μＬ／ウェルで２回洗浄した。１００μＬ（１％ウシ血清アルブミン（ＰＢＳ−ＢＳＡ １％）を含む）／ウェルで３７℃で１時間インキュベート後、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０（２００μＬ／ウェル）で洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡ１％中、異なる希釈の血清試料５０μＬ／ウェルを添加する。３７℃で１時間インキュベート後、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡで１／５０００に希釈したアルカリホスファターゼ結合ヒツジ抗マウス血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を５０μＬ／ウェルで添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ｐＨ９．８、ジエタノールアミン緩衝液中にｐ−ニトロフェニルリン酸（Ｓｉｇｍａ）１ｎｇ／ｍＬを含む基質溶液を５０μＬ／ウェルで添加する。室温（ＲＴ）で３０分プレートをインキュベートした後に、反応産物の吸光度を４０５ｎｍで、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ，Ａｕｓｔｒｉａ）で測定する。
【００３０】
− ＥＧＦに基づくワクチンにより誘導された抗ｈＥＧＦ抗体応答の評価
Ｂ細胞又は特異的抗体を測定することにより、遮断抗体を測定するか又は末梢血液で特異的免疫応答を評価する最高水準の技術で利用可能な方法の１つにより、自己抗体力価は血清で検出できる。
Ｇｏｎｚａｌｅｚ、Ｇ．、ら、（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５，２３３〜２４４で記載されているように、ＥＧＦに基づくワクチンにより誘導される抗ｈＥＧＦ抗体を、免疫した動物の血清を用いる間接ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）により評価できる。
【００３１】
− ｈＩＬ−２−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１をワクチン接種した動物からの血清又はｈＩＬ−２ｒに対する特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と共にインキュベーションした後のＣＴＬＬ−２細胞系の増殖に及ぼす効果
ＩＬ−２依存性Ｔ細胞系ＣＴＬＬ−２を、連続的増殖下で、ｈＩＬ−２ｈの１Ｕ／ｍＬを含むＲＰＭＩ−１６４０培地に保持する。ＣＴＬＬ−２の培養を、細胞懸濁液中０．５×１０５〜１０６細胞／ｍＬと共に８〜２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４０が２５ｍＬ入っている７５ｃｍ２細胞培養フラスコで実施する。細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖の２日後に使用する。
アッセイを実施するため、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ培養から採取し、ＲＰＭＩ−１６４０又はＰＢＳで少なくとも４回洗浄する。９６穴平底培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ，ＵＳＡ）へ、５×１０３細胞を播種する。これらの細胞を、ｈＩＬ−２−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンで免疫した動物からのＩＬ−２に対するＥＬＩＳＡ力価が１：１００００の希釈血清又は抗ＩＬ−２特異的ｍＡｂで処理し、ｈＩＬ−２ｒ（１Ｕ／ｍＬ）を添加する。培養を５％ＣＯ２インキュベーターで、３７℃の湿潤な空気中で２４時間実施する。培養の最後の１８〜２４時間に［３Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウェル）をパルスすることにより増殖を測定した。チミジン取り込みは、液体シンチレーションカウンターで測定する。全ての操作は、無菌状態で実施する。
【００３２】
３− ｈＩＬ−２−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンの抗腫瘍効果。前臨床試験
本発明のワクチンの製剤の抗腫瘍効果を動物で試験するために、生後８〜１２週間目の体重１８〜２０ｇの雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。動物はすでに詳述したスケジュールＡ及びＢに従って、ｈＩＬ−２−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンで免疫可能であり、１週後に乳癌Ｆ３ＩＩのような腫瘍細胞系を、５×１０４細胞／動物で、同所性に皮下投与経路で接種する。触知可能な腫瘍を有するマウスを陽性と記録し、腫瘍増殖はカリパーを用いて測定し、最長の表面距離（ａ）及びこれに対して垂直な幅（ｂ）を規定し、腫瘍サイズはａ×ｂとして記録した。腫瘍は定期的に調べる。
驚くべきことに、予想外にも、本発明の著者らは、悪性腫瘍を有する対象で、ＩＬ−２のＩＬ−２レセプターへの結合中和、この腫瘍に対する免疫応答が増強され、腫瘍サイズの減少を誘導することを見出した。以前の技術の状態は、そのような処置は腫瘍に対する個体の免疫系の応答の抑制を生じるであろうことを示していた。
減少が抗ＩＬ−２モノクローナル抗体で受動的治療を受けて得られる場合と同様に、対象が本発明のワクチンの組成物による能動的治療を受けている場合、循環血中のＩＬ−２濃度が実質的に低下する場合、本著者らは腫瘍増殖に及ぼすこの効果が得られることを見出した。
その理由のために、本発明は悪性腫瘍患者の治療のために結果として否定できない利益になり、且つ、これらの場合用いられる通常の治療よりも患者にとってはるかに不快でなく積極的で有効で簡単なＩＬ−２によるワクチン投与法を提供する。
下記の実施例は、本発明の対象のワクチン組成物の免疫学的有効性を例証する実験の詳しい説明を含む。
【実施例】
【００３３】
本発明のワクチン組成物で用いられるヒト組換え型ＩＬ−２（ｈＩＬ−２ｒ）は市販のものであった：（Ｕ．Ｓ．５，６１４，１８５）。
ワクチンで用いた髄膜炎菌由来のタンパク質Ｐ６４ｋは、ＥＰ ０４７４３１３Ａ２及びＵ．Ｓ．５，２８６，４８４で記載される組換えＤＮＡ技術により得た。
【００３４】
（実施例１）
ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンにより誘導された抗体応答
ヒトインターロイキン−２に対する免疫原性を増進するために、ヒトインターロイキン−２を、髄膜炎菌由来の担体タンパク質Ｐ６４ｋタンパク質に化学的に結合した。化学的結合は、グルタルアルデヒド法により行うことができる（Ｕ．Ｓ．５，９８４，０１８）。１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、各成分の試料（ｈＩＬ−２ｒ、Ｐ６４ｋ）を別々に添加し、化学的結合体ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋと分子量の標準パターンを比較して結合効率が確認される。ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋを添加したレーンで連続的に存在するため、得られた結合型を確認することは可能である（図１）。
ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンにより誘導されたｈＩＬ−２ｒに対する抗体応答を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、スケジュールＡ及びＢで免疫した。ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンに応答した動物からの高度免疫血清を陽性対照として用い、免疫前血清を陰性対照として用いた。血清の吸光度が、免疫前血清の吸光度の平均値プラス５倍の標準偏差より大きい最大希釈を、免疫した動物の抗体力価と定義した。対照動物で力価を定義するため、陰性対照として免疫前血清の代わりにＰＢＳ−ＢＳＡ１％を用いた場合を除き、同じ先の判定基準を用いた。
１：１００から１：５００００まで力価が達する抗体応答が誘導された。この免疫プロトコールは約５２日間続く、その理由は短期間に同程度であるか又はより高い抗体力価を得るためにプロトコールを改変する必要があり、したがって我々はスケジュールＢを用いて図２に示すように同程度の結果を得た。
【００３５】
（実施例２）
ｈＩＬ−２−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンで免疫した動物由来血清で処理したＣＴＬＬ−２細胞系の増殖試験
ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンで免疫した動物で産生される血清抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＬ−２結合能は、血清抗体と共にＩＬ−２依存性Ｔ細胞系ＣＴＬＬ−２を培養することにより評価した。ＣＴＬＬ−２細胞をＩＬ−２の存在下で培養プレートに播種して増殖させ、約１：１００００抗体力価を有する動物からの種々の希釈血清を添加した。血清濃度とＣＴＬＬ−２細胞系増殖の阻害の間に、直接的相関が認められた（図３）。この血清は、ワクチン接種した動物由来の血清のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＬ−２中和能力を実証する。
【００３６】
（実施例３）
ｈＩＬ−２−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンで処置した動物における抗腫瘍性の実験
スケジュールＢに従い、動物をｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンで免疫した。１週間後に、動物を５×１０４ Ｆ３ＩＩ腫瘍細胞に曝露した。腫瘍増殖カイネティクスは、ＰＢＳ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１で免疫した対照群と比較して、ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ５１で免疫した動物でより緩慢であった（図４ａ）。これら２群間の腫瘍サイズに統計有意差が認められた。
【００３７】
（実施例４）
抗ＩＬ−２特異的ｍＡｂで処理したＣＴＬＬ−２細胞系の増殖試験
Ｓ４Ｂ６（ＡＴＣＣ ＃ ＨＢ−８７９４）ハイブリドーマにより産生されたｈＩＬ−２ｒに対する特異的抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＬ−２結合能を、ＩＬ−２依存性Ｔ細胞系ＣＴＬＬ−２と共にそれらを培養することにより評価した。ＣＴＬＬ−２細胞を、ＩＬ−２存在下で培養プレートに播種して増殖させ、種々の希釈抗体を添加した。抗体濃度とＣＴＬＬ−２細胞系増殖の阻害の間に、直接的な相関が認められた（図５）。モノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＬ−２中和能力を実証する、１：１００希釈抗体によりＣＴＬＬ−２細胞系増殖を８０％以上阻害できることが見出された。
【００３８】
（実施例５）
抗ＩＬ−２ ｍＡｂ及び抗ＣＤ２５ ｍＡｂ（ＡＴＣＣ−ＰＣ６１）の抗腫瘍効果、Ｆ３ＩＩ実験モデル（乳癌）
マウスを、日用量１ｍｇの特異的モノクローナル抗体（抗ＣＤ２５ ｍＡｂ又は抗ＩＬ−２ ｍＡｂ）を、連続して５日間投与した。２日後に皮下同所性注射により、マウスを実験的乳癌Ｆ３ＩＩに５×１０４細胞／マウスで曝露した。最長の表面距離（ａ）及びこれに対して垂直な幅（ｂ）を定期的に測定した。対照群の腫瘍サイズ（ＰＢＳを投与した）は、抗ＩＬ−２ ｍＡｂを投与した群よりも大きかった（図６）。２つの実験群間の腫瘍サイズは統計的に相異した。しかしながら抗ＣＤ２５ ｍＡｂ（ＡＴＣＣ―ＰＣ６１）を投与した動物の腫瘍サイズは、対照群と同程度であった。この結果はＣＤ２５制御細胞の除去が影響を与えない腫瘍においてさえも、ＩＬ−２中和抗体は強い抗腫瘍効果を有することを示す。
【００３９】
（実施例６）
抗ＩＬ−２ ｍＡｂ及び抗ＣＤ２５ ｍＡｂ（ＡＴＣＣ−ＰＣ６１）の抗腫瘍効果。ＥＬ４実験モデル（リンパ腫）
Ｃ５７ＢＬ／６動物を、ＥＬ４リンパ腫（５×１０４細胞／マウス）に皮下で曝露した。動物に抗ＣＤ２５ ｍＡｂ（ＰＣ６１）の１ｍｇの１用量を、腫瘍への曝露の２日前に静脈内投与するか、又は抗ＩＬ−２ ｍＡｂ（Ｓ４Ｂ６）の１ｍｇの日用量を、腫瘍接種の６日前に開始して連続５日間静脈内投与した。別の群は、以前に記載した同様のスケジュールに基づき抗ＣＤ２５及び抗ＩＬ−２ ｍＡｂｓを同時投与した。
マウスの各群の腫瘍増殖を記録した。腫瘍へ曝露後毎週２回、各マウスにおける腫瘍サイズを、２つの垂直な大きさで測定した。ＥＬ４腫瘍に関する統計的差異は、＊ｐ＝０．０２３２（＊＊ｐ＝０．００３９）、＊＊＊ｐ＜０．０００１である。
図７は、２つのモノクローナル抗体の組合せが、腫瘍増殖に及ぼす最も強い効果を有することを示す。
【００４０】
（実施例７）
自己抗体抗ＩＬ−２の誘導は、ＥＧＦ癌ワクチンに対する応答に影響を及ぼさない
ｈＥＧＦ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンにより誘導されるｈＥＧＦに対する抗体応答が、自己抗体の誘導を伴うｈＩＬ−２ｒによるその前のワクチン投与により影響を受けるかどうかを評価するために、ＢＡＬＢ／ｃ動物をスケジュールＡに従いｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１で調製したワクチンで免疫し、１９日後にｈＥＧＦ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１又はｈＥＧＦ／モンタニドＩＳＡ ５１で調製したワクチンで免疫した。ｈＥＧＦのワクチンで免疫した全ての実験で、０．１ｍＬの量で調製したワクチンに結合したｈＥＧＦの４μｇ当量を筋肉内経路で投与した。ｈＥＧＦ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンに応答した動物の高度免疫血清を、陽性対照として用い、陰性対照には免疫前血清を用いた。血清の吸光度が、免疫前血清の吸光度の平均値よりさらに５倍標準偏差より大きい最大希釈を、免疫した動物の抗体力価と定義した。対照動物で力価を定義するため、陰性対照として免疫前血清の代わりにＰＢＳ−ＢＳＡ１％を用いた場合を除き、同じ先の判定基準を用いた。ＥＧＦ／モンタニドＩＳＡ ５１又はｈＥＧＦ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１によるワクチン接種により誘導されるＥＧＦに対する抗体の力価は、図８で示すように、ｈＩＬ−２ｒに対する自己抗体の誘導によっては影響を受けないことが得られた。
【００４１】
（実施例８）
ｉｎ ｖｉｖｏでインターロイキン−２の中和により、腫瘍保持宿主のリンパ節細胞で評価した細胞溶解活性を回復する
腫瘍保持宿主で、名目抗原に対する免疫応答に及ぼすＩＬ−２の中和効果を評価した。雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｈ−２ｂ）は、標準飼育条件下で維持した。全ての実験で、６及び１２週齢の間のマウスを用いた。卵白アルブミン（ＯＶＡ）及びペプチド：ＯＶＡグレードＶＩＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）は、これらの実験の全体を通じて用いたモデルタンパク質Ａｇであった。優占するペプチドＯＶＡ２７５−２６４（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）は、＞９０％の純度で用いた。増殖反応測定法：Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、左側腹の皮下経路でＭＢ１６Ｆ１０腫瘍の１０４細胞又はＰＢＳに曝露した。腫瘍直径は定期的に測定する。３週間後にこれらのマウスを、試験開始時に１００μｇ／マウスのポリイノシン酸ポリシチジル酸［ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ］（ＰＩＣ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と共に１ｍｇのＯＶＡで皮下に免疫し、その後の２日はＰＩＣのみを投与した。同時に動物に、ｈＩＬ−２ｒ（αｌＬ−２）対する特異的モノクローナル抗体又はＰＢＳを５日連続して投与した。差次的に蛍光色素ＣＦＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）で標識した未処置のマウスからの脾臓細胞を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞溶解活性を測定した。ＣＦＳＥｈｉｇｈで標識した細胞を標的として用い、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（１μＭ；３７℃で９０分、５％ＣＯ２）でパルスしたが、ＣＦＳＥｌｏｗで標識した細胞は内部対照としてパルスしなかった。ペプチドでパルスした標的細胞を、遊離のペプチドを除去するために充分に洗浄後、前もって免疫したマウスに１：１の比率で同時に静注した。１６時間後リンパ節及び脾臓を摘出し、両方の蛍光強度（ＣＦＳＥｌｏｗ及びＣＦＳＥｈｉｇｈ）に対応する全事象を、フローサイトメトリーにより測定した。非コーティング対ＳＩＩＮＦＥＫＬコーティング（ＣＦＳＥｉｎｔ／ＣＦＳＥｈｉｇｈ）のパーセンテージ間の比率を算出して、細胞毒性の数値を得る。ＯＶＡペプチドに対するリンパ節細胞の細胞溶解活性を、最大の応答を与えたＯＶＡプラスＰＩＣで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスでｉｎ ｖｉｖｏで評価した。日用量１ｍｇの抗ＩＬ−２モノクローナル抗体の連続５日間の静脈内注射は、これらの動物で細胞溶解性応答に影響を及ぼさない。ＭＢ１６Ｆ１０腫瘍に曝露されたＣ５７ＢＬ／６マウスは、ＯＶＡに対する細胞溶解活性低下を伴う免疫抑制になる。しかしＩＬ−２中和能を有するモノクローナル抗体をｉｎ ｖｉｖｏで投与すると、リンパ節細胞の免疫応答が回復する（図９）。
【００４２】
（実施例９）
ｉｎ ｖｉｖｏでのインターロイキン−２の中和により、腫瘍保持宿主の脾臓細胞で評価した細胞溶解活性が回復する
腫瘍保持宿主での名目抗原に対する免疫応答に及ぼすＩＬ−２中和効果を評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＯＶＡプラスＰＩＣで免疫してＯＶＡペプチドに対する脾臓細胞の細胞溶解活性をｉｎ ｖｉｖｏ評価し、最大の応答を得た。日用量１ｍｇの抗ＩＬ−２モノクローナル抗体の連続５日間の静注投与は、これらの動物で細胞溶解性応答に影響を及ぼさない。
ＭＢ１６Ｆ１０腫瘍に曝露されたＣ５７ＢＬ／６マウスは、ＯＶＡに対する細胞溶解活性低下を伴う免疫抑制になる。しかし、ＩＬ−２中和能を有するモノクローナル抗体をｉｎ ｖｉｖｏで投与すると、脾臓細胞の免疫応答が回復する（図１０）。
【００４３】
（実施例１０）
調製したワクチンｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１で免疫した動物での血液細胞の計数
調製したｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンでの免疫が、最初の免疫後の１００日まで、（スケジュールＡに従い）調製したワクチンで免疫した動物又はワクチン接種していない動物と同程度に、赤血球、白血球及び血小板を計数した血液細胞数の変化を引き起こすどうかを評価する目的。図１１の１つのように、１つは分析した群間に細胞数値に差異を得なかった。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】化学的結合したｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋの電気泳動。左から右に向かいバンドは、それぞれＰ６４ｋ、ｈＩＬ−２ｒ、ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ及び分子量の標準パターンに対応する。
【図２】両方とも以前に説明した免疫スケジュールを用いる、ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１のワクチン接種により誘導されたｈＩＬ−２ｒに対する抗体の力価。ｙ軸は、ＩＬ−２に対する抗体の力価の幾何平均値を示す。ｘ軸は、以下で免疫された動物に対応する群である。 対照：Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１。 スケジュールＡに従い、 Ｓｃｈ Ａ ＩＬ−２：ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ スケジュールＢに従い、 Ｓｃｈ Ｂ ＩＬ−２：ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１。
【図３】ｈＩＬ−２ｒ及びｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンで免疫し、１：１０００から１：５００００のオーダーまでの力価を有する動物の血清からの種々の希釈の存在下でＣＴＬＬ−２系の増殖。
【図４】ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１のワクチン又はＰ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１（対照群）でワクチン接種し、その後Ｆ３ＩＩ腫瘍に曝露した動物での腫瘍増殖。ｙ軸は、垂直に選択した最大×最小直径として定義した腫瘍領域を示す。
【図５】ｈＩＬ−２ｒの及びＩＬ−２に対する抗体の種々の希釈の存在下でのＣＴＬＬ−２系の増殖。
【図６】抗ＩＬ−２ ｍＡｂ、抗ＣＤ２５ ｍＡｂ又はＰＢＳ（対照群）で処置し、Ｆ３ＩＩ腫瘍細胞系に曝露した動物の腫瘍増殖。ｙ軸は、垂直に選択した最大直径×最小直径として定義した腫瘍の面積を示す。
【図７】αＣＤ２５ ｍＡｂ、抗ＣＤ２５ ｍＡｂ又はＰＢＳ（対照群）で処置し、その後リンパ腫ＥＬ４に曝露した動物の腫瘍増殖。ｙ軸は、垂直に選択した最大直径×最小直径として定義した腫瘍の面積を示す。
【図８】ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１及びｈＥＧＦ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１のワクチン接種により誘導されたＥＧＦに対する抗体力価。ｙ軸は、ＥＧＦに対する抗体の力価の幾何平均を示す。ｘ軸は以下で免疫された群を示す。ｈＩＬ−２ｒ：ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１。ｈＥＧＦ：ｈＥＧＦ／モンタニドＩＳＡ ５１ｈＩＬ−２ｒ＋ｈＥＧＦ：ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニド ＋ ｈＥＧＦ／モンタニド。ｈＥＧＦ／Ｐ６４ｋ：ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニド ＋ ｈＥＧＦ／モンタニド。ｈＩＬ−２ｒ＋ｈＥＧＦ／Ｐ６４ｋ：ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニド ＋ ｈＥＧＦ／Ｐ６４ｋ／モンタニド。
【図９】インターロイキン−２に対して誘導された抗体は、腫瘍保持宿主のリンパ節細胞で評価した細胞溶解活性を回復する。 全てのマウスは試験開始時に、１ｍｇのＯＶＡに加えてＰＩＣの１００μｇ／マウスで皮下に免疫し、その後２日はＰＩＣのみを投与した。ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞溶解活性を、蛍光色素ＣＦＳＥで差次的に標識した未処置のマウス由来の脾臓細胞を用いて測定した。ＣＦＳＥｈｉｇｈで標識した細胞を標的として用い、ＳＩＩＮＦＥＫＬでパルスしたが、ＣＦＳＥｌｏｗで標識した細胞は内部対照としてパルスしないでおき、次いで、あらかじめ免疫したマウスに１：１の比率で同時に静脈内に注射した。細胞溶解活性は、リンパ節細胞で評価した。 対照 − ＰＢＳで処置した動物、αｌＬ−２ − ＩＬ−２中和モノクローナル抗体で処置した動物、ＭＢ１６Ｆ１０ − 対照と同様であるがＭＢ１６Ｆ１０に曝露した動物、αｌＬ−２＋ＭＢ１６Ｆ１０ − ＩＬ−２中和モノクローナル抗体で処置したＭＢ１６Ｆ１０腫瘍保持マウス。
【図１０】インターロイキン−２に対して誘導された抗体は、腫瘍保持宿主の脾臓細胞で評価した細胞溶解活性を回復する。 全てのマウスは試験開始時に、１ｍｇのＯＶＡに加えてＰＩＣの１００μｇ／マウスで皮下に免疫し、その後２日はＰＩＣのみを投与した。ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞溶解活性を、蛍光色素ＣＦＳＥで差次的に標識した未処置のマウス由来の脾臓細胞を用いて測定した。ＣＦＳＥｈｉｇｈで標識した細胞を標的として用い、ＳＩＩＮＦＥＫＬでパルスしたが、ＣＦＳＥｌｏｗで標識した細胞は内部対照としてパルスしないでおき、次いで、あらかじめ免疫したマウスに１：１の比率で同時に静脈内に注射した。細胞溶解活性は、脾臓細胞で評価した。 対照 − ＰＢＳで処置した動物、αｌＬ−２ − ＩＬ−２中和モノクローナル抗体で処置した動物、ＭＢ１６Ｆ１０ − 対照と同様であるがＭＢ１６Ｆ１０に曝露した動物、αｌＬ−２＋ＭＢ１６Ｆ１０ − ＩＬ−２中和モノクローナル抗体で処置したＭＢ１６Ｆ１０腫瘍保持マウス。
【図１１】対照（Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１）と比較した、ｈＩＬ−２ｒ−Ｐ６４ｋ／モンタニドＩＳＡ ５１ワクチンで免疫した動物の血球（ロイコサイト（白血球）、エリスロサイト（赤血球）及び血小板）算定。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌患者の治療のために有用な、ＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤であって、
Ａ．適切なアジュバントを含む、遺伝的又は化学的結合により任意の担体タンパク質に結合したＩＬ−２又はＩＬ−２の任意の誘導体、
Ｂ．抗ＩＬ−２モノクローナル抗体、
Ｃ．特異的腫瘍抗原又は成長因子に基づく癌ワクチン、
Ｄ．抗ＣＤ２５モノクローナル抗体
の少なくとも１つを含む治療用製剤。
【請求項２】
同時に又は連続した方法でのＡ＋Ｃ又はＡ＋Ｄ又はＢ＋Ｃ又はＢ＋Ｄの投与を含む、請求項１に記載のＩＬ−２に対する免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項３】
担体タンパク質に結合したＩＬ−２又はＩＬ−２の任意の誘導体及び適切なアジュバントを含む、請求項１に記載のＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項４】
担体タンパク質に結合したＩＬ−２及び適切なアジュバントを含む、請求項３に記載のＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項５】
使用する担体タンパク質が、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＰ６４ｋである、請求項４に記載のＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項６】
アジュバントが、水酸化アルミニウム及びモンタニドＩＳＡ ５１を含む群から選択される、請求項５に記載のＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項７】
アジュバントがモンタニドＩＳＡ ５１である、請求項６に記載のＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項８】
ＩＬ−２及びＰ６４ｋの間を結合する化学物質を含む、請求項１に記載のＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項９】
ＩＬ−２及びＰ６４ｋの間の融合タンパク質を含む、請求項１に記載のＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項１０】
ＩＬ−２及びＰ６４ｋから由来するペプチド間の融合タンパク質を含む、請求項１に記載のＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項１１】
ヒトＩＬ−２に対する特異的モノクローナル抗体を含む、請求項１に記載のＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項１２】
特異的腫瘍抗原又は成長因子に基づく癌ワクチンと組み合わせて、担体タンパク質に結合したＩＬ−２又はＩＬ−２の任意の誘導体及びアジュバントを、対象に投与することを含む請求項２に記載のＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項１３】
癌ワクチンがＥＧＦを含む、請求項１２に記載のＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項１４】
特異的モノクローナル抗体ＣＤ２５と組み合わせて、担体タンパク質に結合したＩＬ−２又はＩＬ−２の任意の誘導体及びアジュバントを対象に投与することを含む、請求項２に記載のＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項１５】
抗ＣＤ２５特異的モノクローナル抗体を含む、請求項１３に記載のＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項１６】
癌患者で腫瘍の増殖を抑制することが可能な、ＩＬ−２に対する免疫応答を引き起こす薬剤を製造するのための請求項１から１５までに記載の治療用製剤。
【請求項１７】
腫瘍の増殖を抑制することが可能な請求項１から１５までに記載の治療用製剤の使用。
【請求項１】
癌患者の治療のために有用な、ＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤であって、
Ａ．適切なアジュバントを含む、遺伝的又は化学的結合により任意の担体タンパク質に結合したＩＬ−２又はＩＬ−２の任意の誘導体、
Ｂ．抗ＩＬ−２モノクローナル抗体、
Ｃ．特異的腫瘍抗原又は成長因子に基づく癌ワクチン、
Ｄ．抗ＣＤ２５モノクローナル抗体
の少なくとも１つを含む治療用製剤。
【請求項２】
同時に又は連続した方法でのＡ＋Ｃ又はＡ＋Ｄ又はＢ＋Ｃ又はＢ＋Ｄの投与を含む、請求項１に記載のＩＬ−２に対する免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項３】
担体タンパク質に結合したＩＬ−２又はＩＬ−２の任意の誘導体及び適切なアジュバントを含む、請求項１に記載のＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項４】
担体タンパク質に結合したＩＬ−２及び適切なアジュバントを含む、請求項３に記載のＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項５】
使用する担体タンパク質が、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＰ６４ｋである、請求項４に記載のＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項６】
アジュバントが、水酸化アルミニウム及びモンタニドＩＳＡ ５１を含む群から選択される、請求項５に記載のＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項７】
アジュバントがモンタニドＩＳＡ ５１である、請求項６に記載のＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項８】
ＩＬ−２及びＰ６４ｋの間を結合する化学物質を含む、請求項１に記載のＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項９】
ＩＬ−２及びＰ６４ｋの間の融合タンパク質を含む、請求項１に記載のＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項１０】
ＩＬ−２及びＰ６４ｋから由来するペプチド間の融合タンパク質を含む、請求項１に記載のＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項１１】
ヒトＩＬ−２に対する特異的モノクローナル抗体を含む、請求項１に記載のＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項１２】
特異的腫瘍抗原又は成長因子に基づく癌ワクチンと組み合わせて、担体タンパク質に結合したＩＬ−２又はＩＬ−２の任意の誘導体及びアジュバントを、対象に投与することを含む請求項２に記載のＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項１３】
癌ワクチンがＥＧＦを含む、請求項１２に記載のＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項１４】
特異的モノクローナル抗体ＣＤ２５と組み合わせて、担体タンパク質に結合したＩＬ−２又はＩＬ−２の任意の誘導体及びアジュバントを対象に投与することを含む、請求項２に記載のＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項１５】
抗ＣＤ２５特異的モノクローナル抗体を含む、請求項１３に記載のＩＬ−２に対して免疫応答を引き起こす治療用製剤。
【請求項１６】
癌患者で腫瘍の増殖を抑制することが可能な、ＩＬ−２に対する免疫応答を引き起こす薬剤を製造するのための請求項１から１５までに記載の治療用製剤。
【請求項１７】
腫瘍の増殖を抑制することが可能な請求項１から１５までに記載の治療用製剤の使用。
【図１】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１１】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１１】
【公表番号】特表２００８−５２６６８６（Ｐ２００８−５２６６８６Ａ）
【公表日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４１６５４（Ｐ２００７−５４１６５４）
【出願日】平成１７年１１月１６日（２００５．１１．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＵ２００５／０００００９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５３５０８
【国際公開日】平成１８年５月２６日（２００６．５．２６）
【出願人】（５００１８５６８９）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月１６日（２００５．１１．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＵ２００５／０００００９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５３５０８
【国際公開日】平成１８年５月２６日（２００６．５．２６）
【出願人】（５００１８５６８９）
【Ｆターム（参考）】
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