ウィルスの検知及び計量のためのＡＴＰ法
【解決手段】本発明は、対象宿主細胞の自由ＮＡ又はＤＮＡ若しくはＲＮＡウィルスに結合されたＮＡを利用したウィルスの検知及び計量のためのＡＴＰ法の利用に関する。また、ＡＴＰ法によるウィルスの測定方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウィルスの宿主細胞又は遺伝子形質（ＤＮＡ又はＡＲＮ）のヌクレオチドアデニリル（ＡＮ）に基づくウィルスの検知及び計量のためのＡＴＰ法の新技術に関する。また、この新技術の利用、及び、一方では、検知すべきウィルスが、溶解されるか（ウィルスの発達後に宿主細胞壁が切り離される）若しくは非溶解であるか（ウィルスの発達後に壁が無くならずに宿主細胞の壁を突き抜ける）に応じた宿主細胞をもとにした、又は、他方では、ＤＮＡ若しくはＲＮＡのウィルスに応じたウィルスのＤＮＡ又はＲＮＡをもとにした利用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
反応
（１）ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 ＋Ｍｇ2+＋ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン＋光子
に基づくＡＴＰ法が知られており、これにより培地内ＡＴＰ含有量の効率的な測定が可能となる。この反応はルシフェリン（基質）／ルシフェラーゼ（酵素）を利用する方式がいかなるものであってもＡＴＰに特有なものである。これにより、細胞にＡＴＰが含まれる時に生きた細胞と死んだ細胞（無ＡＴＰ）との識別が可能となる。
【０００３】
しかしながら、ＡＴＰ法は、有機体としてウィルスに細胞内自由ＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰが無くなると同時にウィルスには適用不可能となる。ウィルスの発達に関して、宿主細胞のＡＴＰが利用される。ウィルスは成熟状態に達すると他の細胞を感染させるため宿主細胞を離れる。
【０００４】
更に、非ウィルス細胞の同一種又は変種の内部において、細胞内の全自由ＡＮ含有量は、関係式（２）
（２）[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
を考慮して、一定であることが知られている。この点については、一方で、ピルビル酸キナーゼ、ミオキナーゼがそれぞれ利用されるＡＭＰ及びＡＤＰのそれぞれのＡＴＰへの転換、他方で、10μL の添加無しの次いでＡＴＰの追加添加後の放出光の（ＲＬＵ、すなわち光の関連した単位での）測定が提案されているシャンピアット ディー（Champiat D）等による「ルミネッセンス（Luminescence）」，2001年，第16号，Ｐ．193−198の論文を参照されたい。
【特許文献１】米国特許第３５７５８１２号明細書
【特許文献１】米国特許第６３１２９０２号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ウィルスのＤＮＡ又はＲＮＡの切除により得られる全ＡＮ含有量もまた一定であるという驚くべき方法は見出されたばかりである。
【０００６】
米国特許第３５７５８１２号明細書からウィルスの宿主細胞のＡＴＰを用いた自由ＡＴＰ法によるウィルスの検知が既に提案されている。宿主細胞の自由ＡＴＰ含有量が変動するとたちまち再現不可能となる結果が得られた。この点は、本発明の優先日後の2005年の論文により明確に確認されており、ＡＴＰ含有量が1から100までの係数で変動することが示されているディック バン デ コージ（Dick van der Kooij）等による「ウォーター リサーチ（Water Research）」，2005年，第39号，Ｐ．2789−2798を参照されたい（この論文の図２参照）。この点は、後述する通り、利用されるウィルスが溶解している時の、(a) 前述の関係式２及び(b) 細胞外ＮＡ含有量の考慮が必要である。
【０００７】
米国特許第６３１２９０２号明細書からもまたＡＴＰ法による試料中のウィルスを測定するためのＤＮＡ又はＲＮＡのウィルスからの切除が提案されている。この文献では、前記試料中に含まれ得るウィルス株数の評価のためのＡＮの測定の説明も、また添加の利用の示唆もしていない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ウィルス数の検知及び計量に関する多大なニーズが存在する。
【０００９】
従って、このニーズを満たすために、ＡＴＰの形で表される、宿主細胞の自由ＡＮの集合に重点がおかれたＡＴＰ法を利用した新たな技術的解決策の提供が提案され、前記ＡＮは、試験すべきウィルスが溶解している時には細胞外で、試験すべきウィルスが非溶解状態にある時には細胞内で自由であり、つまり、ウィルスのＤＮＡ若しくはＲＮＡの切除又は加水分解によるＡＮ生成物上にある。
【００１０】
本発明の第１発明によると、ウィルスの検知及び計量のための反応式（１）
（１）ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 ＋Ｍｇ2+＋ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン＋光子
の生物発光の利用が提供され、この利用は、(a) 前記ウィルスのＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰの無い水性培地液内のウィルスの対象細胞との接触、次いで、対象物の自由ＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換後の、同一細胞族の細胞内自由ＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰの総量が関係式（２）
（２）[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
により一定であるという点が考慮されたＡＴＰの形での対象細胞を元とする自由ヌクレオチドアデニリル（ＡＮ）の含有量の測定、又は、(b) ＤＮＡアーゼ若しくはＲＮＡアーゼそれぞれによる、ｄＡＭＰ、ｄＡＤＰ及びｄＡＴＰの二量体からＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰの単量体への転換並びに全ＡＭＰ及びＡＤＰのＡＴＰへの転換を伴う、前記ウィルスのＤＮＡ又はＲＮＡにより構成されるウィルス遺伝子形質の切除、次いで、同一ウィルス族の遺伝子物質のＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰの総計が前記関係式（２）により一定であるという点が考慮されたＡＴＰの形で表されるウィルスのＤＮＡ又はＲＮＡの切除から生ずるヌクレオチドアデニリル（ＡＮ）の含有量の測定、がそれぞれ行われるとともに、前記測定は、(i) ＡＴＰ添加無しにそして(ii)既知量ＡＴＰの添加後に行われることを特徴とする。
【００１１】
本発明の第２発明によると、対象細胞のＡＮ又はウィルスのＤＮＡ若しくはＲＮＡの切除により得られるＡＮをもとにしたＡＴＰ法によるウィルスの検知及び計量方法が提供され、前記ＡＮはＡＴＰの形で表される。
【００１２】
本発明の別の発明によると、前記方法に用いる定量決定要素が提供される。
【００１３】
前記定量決定要素は、ルシオール及び添加用のＡＴＰ、必要に応じてミオキナーゼ、ピルビル酸キナーゼ、ＤＮＡナーゼ、ＲＮＡナーゼ及び／又はピルビル酸オルトリン酸塩ジキナーゼ及び／又はApoHで覆われた磁気超微粉、及び／又は、測定ウィルスの特殊抗体からなるルシフェリン／ルシフェラーゼ集合体を含むことを特徴とする。
【００１４】
前記要素は、更に必要に応じて対象物の生きた健全な細胞を含む。
【００１５】
略号
便宜により、本発明に利用される略語及び頭字語の一覧を以下に示す。
ＡＤＰ：アデノシン二リン酸塩
ＡＭＰ：アデノシン一リン酸塩
ＡＮ：ヌクレオチドアデニリル（別の用語すなわちアデノシンヌクレオチドが使用可能）、ここでは、ＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰが含まれるＡＮの集合
ＡＴＰ：アデノシン三リン酸塩、
ｃＡＭＰ：アデノシン一リン酸塩環式化合物
ｄＡＤＰ：アデノシン二リン酸塩二量体
ｄＡＭＰ：アデノシン一リン酸塩二量体
ＧＤＰ：グアノシン二リン酸塩、
ＧＴＰ：グアノシン三リン酸塩
ＮＤＰＫ：ヌクレオチド二リン酸塩キナーゼ
ＲＬＵ：光の関連単位
【００１６】
ウィルスは細胞ではない。これは細胞内の寄生物である。ウィルスは細胞内にある時にのみ繁殖する。従って、ビリオン（ウィルス粒子）について述べられる。細胞外にあるウィルスは代謝活動を全くしない。原核動物細胞（バクテリオファージ）に寄生するウィルスと真核生物細胞に寄生するものとは区別される。
【００１７】
ウィルスの特徴は本質的に以下の通りである。ウィルスは、生きている物と生きていない物との間の「不定の奇妙な領域」を占拠すると同時に、遺伝子物質を有しているので生きていない物と生きた物とが似ており、更に突然変異及び組換えが可能である。従って、ウィルスは進化と同時に転換状態にある培地に順応可能である。しかしながら、同時にウィルスは無細胞性である。つまり、ウィルスは、リボソームも、蛋白の合成及びエネルギーの発生を可能にする代謝の仕組みも有していない。成分が存在しない状態ではウィルスは、宿主細胞内でないと繁殖不可能である上、ウィルスの繁殖の形は独特である。
【００１８】
すべての細胞は、サイズを増やしながら、次いで、それぞれの生命に必要な完全にひと揃いの成分が取り囲まれる２個の新細胞に分割されながら繁殖することが知られている。これに対して、ウィルスは、ウィルスの成分、つまり蛋白質及び核酸に分解され、その後、宿主細胞の代謝の仕組みにより数ダースから数百のウィルスゲノム及び新たなウィルス外被を構成する蛋白質キャプシッドがつくられる。これらの成分はすべて、その次に集められるとともに、最終的には新たなウィルス粒子をつくる。
【００１９】
ウィルスは増殖しない。ウィルスは開放系に当てはまる熱動力学の法則に従わないように思われる。
【００２０】
しかも、ウィルスは結晶化が可能である。これは、鉱物又は有機的分子の大部分の特性であるが、生きている細胞の特性ではない。良好な湿度条件で、しかも生きた細胞中に置かれると、ウィルスにより細胞に新たなウィルス粒子がつくられる。
【００２１】
生物学的ウィルスのサイクル
ウィルスは核酸及び外被から構成される。ウィルスのゲノムは、ある一定数の基部（ＮＭＰ：ＲＮＡの場合のＡＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ、リボ核酸）又は（ｄＮＭＰ：ＤＮＡの場合のｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ、デオキシリボ核酸）を呈する約数個から数百個までの遺伝子に基づく全体的に直線状又は円形状の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の単一分子から構成される。核酸は蛋白質の殻、つまり、キャプシッドで囲まれている。あるウィルスの中では、このキャプシッド自身、蛋白質が含まれる脂質の二重層で形成される薄膜の外被で囲まれている。
【００２２】
ウィルスには３タイプの増殖サイクル、すなわち、溶菌サイクル、溶原サイクル及び連続放出サイクルが知られている。最初の２つのサイクルは殆どバクテリオファージだけに関係する。既知ファージの95％を越えるものについて、遺伝物質は、５から650kpbまでの（すなわち、10,000から1,300,000 までのヌクレオチド三リン酸塩）１個のＤＮＡ二重若枝の分子であり、これらのサイズは24から200 nmまで変動する。
【００２３】
溶菌サイクルは、ウィルスが細胞に侵入する時に展開して増殖し、次いで、溶解後に宿主細胞から分散する。溶解性ウィルスによって侵入された細胞は短時間のうちにほぼ間違いなく死ぬ。
【００２４】
溶菌サイクルでは、菌染色体の消滅がある。ウィルスのＤＮＡは導入ウィルスの関わり合いに必要であるタンパク質に翻訳される。ウィルスのＤＮＡはコピーされる。コピーはキャプシッドからのタンパク質合成用の母体からなる。この合成は、ウィルスが適切なエネルギー源ではないので、菌のリボソーム（菌の仕組みの流用）、つまり細胞エネルギーの大きな攪乱及び特に細胞内ＡＮにより確保される。
【００２５】
こうして核酸の合成が起こる場合に、ヌクレオチド（基部はＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、すなわち、ＸＴＰ）は宿主細胞の仕組みによりつくられる。次に、蛋白質及びウィルスＤＮＡ（又はＲＮＡ）の自己結合が起こる。菌は分裂すると同時に多数のビリオンを放出する。この点は、核酸の加水分解が引き起こされる前に非ウィルス細胞の存在の証拠となるヌクレオチドアデニリルが定量決定されるので、ウィルス又はその他すべての原核動物又は真核生物の細胞から生じる核酸の識別に極めて重要である。
【００２６】
溶原サイクルは、毒性又は溶解性ウィルスによりその遺伝物質が宿主細胞のものと組合せられる場合に展開されると同時に固定したようになる。ウィルスのＤＮＡ（又はＲＮＡ）は溶原性細胞の名前をもつ宿主細胞のものと反駁し合い、ウィルス又はファージは親ファージと呼ばれる。ある刺激剤により親ファージは毒性となり、溶原サイクルを開始させる。溶原性細胞は、従って、溶解されると同時にウィルス粒子が放出される。
【００２７】
溶原サイクルでは、ウィルス性ＤＮＡ（又はＲＮＡ）は菌染色体内で一体化される。菌は外部の状態により溶原サイクルに移行するまで生き続ける。ある溶原性菌は人体の健康にとって大きな重要性をもつ。例えば、ジフテリアの原因であるジフテリア菌は、ジフテリア毒素に関して暗号化する遺伝子をもつ親ファージによりそのＤＮＡが感染した場合にのみ、この病気の原因である毒素と同化しない。ボツリヌス中毒の原因であるボツリヌス菌又は化膿性連鎖球菌、猩紅熱体でも同じ現象が示される。
【００２８】
従って、これらの場合（溶菌サイクルによりこの後者の時に溶原性が見られるので、ウィルスは外部の状態により溶菌サイクル内に移行するまでは固定していることになる）、ウィルスが存在する証拠立てを可能にするのは、細胞外ＡＮ（宿主細胞壁の溶解により放出された）の定量決定であり、前記全宿主細胞である。細胞外ＮＡによりウィルス数の定量化が可能となり、ＡＮ外部／ＮＡ全量関係により感染レベルが与えられる。例えば、ＡＮ外部／ＡＮ全量の場合にはすべての宿主細胞が溶解されている、つまり死んでいることを意味する（壊死）。
【００２９】
連続放出サイクルは、数個のファージ及び多数の動物性ウィルスの仕業である。これらのウィルスは、繁殖すると同時に無傷のままの宿主細胞により中断することなく放出される。ウィルスはエンドサイトーシスを通って細胞内に侵入する。エンドサイトーシスの小胞は、その宿主細胞の細胞形質内に遺伝物質を放出し得るウィルスキャプシッドの放出を可能にするリボソームと融合する。遺伝物質は、ヌクレオキャプシッドを形成するウィルス遺伝物質を含むキャプシッドが新たにつくられるために反駁されると同時に利用される。これらのヌクレオキャプシッドは、小胞体及び宿主細胞のゴルジ装置を通じてウィルス粒子が芽を出すと同時に放出され、宿主細胞から生ずる薄膜外被で囲まれる血漿薄膜まで運搬される。流行性感冒、流行性耳下腺炎、はしか又は狂犬病のウィルスはこの連続放出サイクルをもつ。
【００３０】
この場合に、細胞外ＡＮの定量決定により情報が得られないのに対して、ウィルスが存在する宿主細胞の代謝及び特にエネルギーの攪乱を考慮して予め信号が出力されるので、全ＡＮの定量決定により、この無ウィルス同一細胞のＡＮの定量決定に関する異常の検知が可能となる。
【００３１】
エム．ゲンドロー（M.Gendraud）の論文「植物生理学（Physiol. Veg.）」，1977年，第15号（１），Ｐ．121 −132 に提案されているように、発光により宿主細胞の別のヌクレオチドが定量決定されて感度を上げることができる。その機構によると、ＮＤＰＫの存在下において、
XTP+ADP→XDP+ATP
である。
【００３２】
このように、本発明のある発明では、対象物の細胞壁の溶解により細胞外に放出される、ＡＴＰの形で表されるＡＮをもとにしたＡＴＰ法による溶解性ウィルスの検知及び計量の方法が提供される。
【００３３】
本発明の別の発明によると、対象細胞の自由ＡＮ、又はウィルスＤＮＡ若しくはＲＮＡの切除によるＡＮ生成物をもとにした連続放出されるウィルスのＡＴＰ法による検知及び計量の方法が提供される。
【００３４】
このようにして、ＤＮＡのあるウィルスに関するＤＮＡ、又はＲＮＡのあるウィルスに関するＲＮＡにより構成されるウィルスの遺伝形質と結合されて見つかる全結合ＡＮ数の検知及び計量が可能であり、前記結合ＡＮは、ＤＮＡアーゼ又はＲＮＡアーゼの作用、次いで、必要に応じてｄＡＭＰ、ｄＡＤＰ及びｄＡＴＰの二量体からＡＭＰ、ＡＤＰ及びＡＴＰの単量体への転換により放出され、前記ＡＭＰ及びＡＤＰはＡＴＰの形でのＡＮの測定のためＡＴＰに転換される。
【００３５】
対象細胞の利用法
反応式（１）
（１）ルシフェリン＋ATP＋Ｏ2 ＋Ｍｇ2+＋ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン＋光子
に応じた生物発光による溶解性ウィルス株の検知及び計量の方法が目的とされ、非感染対象細胞内自由ヌクレオチドアデニリル（ＡＮ）の総量は関係式（２）
（２）[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
により一定であるという事実に基づく前記方法は、以下の連続する段階を含むことを特徴とする。すなわち、
（１°）試験ウィルス（Ｖ）の株が含まれ得ると同時に自由ＡＮの無い水性溶液試料（Ｅ）の準備
（２°）試料（Ｅ）の対象細胞との接触
（３°）その発達後に生ずるウィルスにより対象壁が溶解するまでの生成反応培地の培養継続
（４°）生ずる細胞外培地の回収、並びにＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換処理
（５°）段階（４°）から生ずる培地への、最初は(i) ＡＴＰ添加無しで、次いで(ii)既知量のＡＴＰの添加後のルシフェリン及びルシフェラーゼの導入
（６°）ＡＴＰの添加無し、次いで既知量のＡＴＰの添加後の反応式（１）による放出光の増幅信号の測定
（７°）ＡＴＰの形での全細胞外自由ＡＮ含有量の測定、次いで最初の試料（Ｅ）内の前記ウィルス（Ｖ）の株数の推定
【００３６】
前記ウィルス株数の推定のため、段階（７°）では事前に作成される計算図表方式の利用が含まれ得る。変型例では細胞外全ＡＮ含有量が、前記ウィルスが存在しない状態での段階（１°）から（７°）までの繁殖により得られる目標細胞のものとの比較により決定され、次いで最初の試料（Ｅ）内の前記ウィルス（Ｖ）の株数が推定され得る。実際には、定量決定技術によりウィルス株数を直接的に、良好に決定することが可能となる。
【００３７】
また、反応式（１）
（１）ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 ＋Ｍｇ2+＋ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン＋光子
に基づく生物発光による連続放出にあるウィルス株数の検知及び計量の方法も対象とし、非感染の対象細胞内自由ヌクレオチドアデリニル（ＡＮ）の総量が関係式（２）
（２）[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
により一定であるという事実を考慮した前記方法は、以下の連続した段階を含むことを特徴とする。
（１ａ°）試験ウィルス（Ｖ）の株が含まれ得るとともに自由ＡＮの無い水性液体試料（Ｅ）の準備
（２ａ°）試料（Ｅ）の対象細胞との接触
（３ａ°）その発達後に生ずるウィルスが対象壁を越えるまでの生成反応培地の培養継続
（４ａ°）対象細胞の回収、生ずる細胞内培地が回収されるためのこれらの溶解、次いでＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換のための前記細胞内培地の処理
（５ａ°）段階（４ａ°）から生ずる培地内への、最初は(i) ＡＴＰの添加無しに、次いで(ii)既知量のＡＴＰ添加後のルシフェリン及びルシフェラーゼの導入
（６ａ°）ＡＴＰの添加無し、次いで既知量のＡＴＰの添加後の反応式（１）による放出光の増幅信号の測定
（７ａ°）最初の試料（Ｅ）中の前記ウィルス（Ｖ）の株数の推定のためのＡＴＰの形での細胞内自由ＡＮの全含有量の決定
【００３８】
段階（７ａ°）は、段階（７°）について上記で示されたように、特に、前記ウィルスが存在しない状態での段階（１ａ°）から（７ａ°）までの繁殖状態で処理された対象細胞との比較により行われ得る。変型例では、細胞内全ＡＮの含有量の決定は予め作成された計算図表方式により行われ得る。次に、前記試料（Ｅ）内の前記ウィルス（Ｖ）の株数が推定される。
【００３９】
まとめると、段階（１°）〜（２°）及び（５°）は段階（１ａ°）〜（２ａ°）及び（５ａ°）に一致し、段階（３°）及び（６°）〜（７°）はほぼ段階（３ａ°）及び（６ａ°）〜（７ａ°）に類似している一方で、段階（４°）は段階（４ａ°）とは異なる。同一又は類似の段階が実施される方式は共通に処理される。これに対して、段階（４°）及び段階（４ａ°）の方式はそれぞれ別々に処理される。
【００４０】
試料（Ｅ）は水性組成であり、必要に応じて、有機性組成であり得る。この試料（Ｅ）は、水性が都合の良く、ガス（特に洗浄を通じて）、固体（特に接触、溶解若しくは分散を通じて）又は液体（特に抽出、溶解若しくは乳化を通じて）から採取される。
【００４１】
前述の反応式（１）により、オキシルシフェリン、ＡＭＰの光子及び１又は数種のリン酸塩主にピロリン酸塩が提供される。この反応は、最適濃度にあるＡＴＰ、ルシフェリン及びルシフェラーゼに特有のものであり、これらの三物質が存在すると同時に放出される光子の数はＡＴＰ量に直接比例する。有機体及びすべての反応培地内では、細胞外ＡＴＰは、再循環により、又は主たる分解により比較的急速に消える。
【００４２】
ＡＴＰは、エネルギー源（機械エネルギー、浸透エネルギー、化学エネルギー、熱エネルギー、光エネルギー）として、リン酸塩ドナー、ピロリン酸塩ドナー、ＡＭＰドナー及びアデノシンドナーを細胞内に介在する。
【００４３】
同一種の細胞中のＡＴＰ含有量は物理的状態に応じて大きく変動し、検知閾値は一般的に103 個の菌数である。本発明によると、ＡＴＰが１アトモル（放出光信号の安定化無しで）から0.5 アトモル（前記信号の安定化有りで）まで最上の感度が達成され、これは菌１個の全細胞内自由ＡＮの平均含有量にほぼ相当する。
【００４４】
関係式（２）を考慮すると、ＡＭＰの合成に介在する前駆物質である環式アデノシン一リン酸塩（ｃＡＭＰ）の細胞内含有量は無視される。この含有量は本発明の反応培地内では実用上無視できる。
【００４５】
本発明によると、酵素（ルシフェラーゼ）、光胞子基質（ルシフェリン）、補酵素（ＡＴＰの場合に）、ルシオール（フォチナス・ピラリス）に関する良く知られた原理が採用される。結果は、光度計（又は輝度計）にＲＬＵで表示され、ＡＴＰ量に比例するにもかかわらず、これによって試料の本当のＡＴＰ濃度決定は可能ではない。
【００４６】
この問題を改善するために、最初の読み取り（ＡＴＰの提供無しで実施）後に、既知量（例えば、102 から10ピコモルまでのＡＴＰ）の提供が推奨される。しかしながら、前記細胞内のＡＴＰ含有量は、生理学的状態に応じた急速な「逆転」があって一定に留まらないので、提供される技術では定量的な数量測定が可能ではない。
【００４７】
これに対して、所与の対象細胞はすべて同一のＡＮ含有量を示す。本発明によれば、ＡＴＰの形で示されるＡＮ含有量が決定されながら、対象細胞及びウィルス株数の定量的決定の実施が可能になる。
【００４８】
有利な方法では、分離及び濃縮に関する本発明の方法の段階（１°）又は（１ａ°）は、
・薄膜の濾過、
・特に真空かつ雰囲気温度（15〜25℃）下の蒸発・遠心分離、及び／又は
・免疫捕捉
により行われる。
【００４９】
免疫捕捉技術は好ましい。この技術により、抗体によりウィルスの固定によるウィルス株の濃縮及び純化が可能となる。実際の方法では、これらの抗体はウィルスを損なうことなくウィルス表面の抗原体に向けられ得る。また同様に実際の方法では、これらの抗体は、磁場内でのウィルス−抗体−球タイプの接合生成物の濃縮及び純化並びに前記接合生成物の回収のために磁気乳液球上に不動化される。変型例では、ウィルス株が固定される抗体に結合される非磁気又は非磁化の球により、また、上澄みの移し取りにより前記株の濃縮及び純化が可能となる。
【００５０】
免疫捕捉実施の最良の形は、ApoH、すなわち、生きた物質を固定すると同時に死んだ有機体の破片類特に壁を固定しないタンパク質で覆われた磁気超微粉の利用である。ApoHは細胞死（アポプトーシス）の直前又は瞬間にだけ現れる１種の蛋白質である。
【００５１】
前記接合生成物は、引き続き必要な場合には、抗体にもはや結合されない細胞の濃縮された液体組成を処理するために特に溶離により分離される。
【００５２】
必要に応じて、感度が下がる希釈が制限されるために、生成物のロス無しに数分間での大量の試料又は反応する培地の乾燥を可能にする蒸発−遠心分離装置（2,000 〜10,000回転／15分から2,000 〜10,000回転／分までの運転）により前記液体組成を濃縮することが賢明である。屋内温度での蒸気−遠心分離により株が含まれる培地の水分の大部分が除去可能となる利点がある。
【００５３】
また、都合の良い方法では、ウィルス株の対象株との接触、次いでこれらの発達に関する段階（２°）〜（３°）又は（２ａ°）〜（３ａ°）は専門家に既知の形により行われる。
【００５４】
段階（４ａ°）において、対象細胞壁の溶解は、
(i) TrisプラスＥＤＴＡ、及び／又は、
(ii)ＤＭＳＯ、
が含まれる水性緩衝剤の追加、次いで対象細胞を開くためのマイクロ波処理（約１分間）、急速冷却（特に、冷蔵庫における）と続き、更に必要な場合には生ずる液体培地を回収するための遠心分離により、段階（３ａ°）から生ずる培地内で行われる。溶解は細胞内ＡＮへの接近が可能となるために必要である。
【００５５】
（４°）又は段階（４ａ°）におけるＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換はミオキナーゼ及びピルビル酸キナーゼを用いて行われる。反応機構を以下に示す。
【００５６】
【数１】
【００５７】
時間の節約のため、ＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換に関する本発明の方法の段階（５°）は、段階（４°）と同時に行われ得る。
【００５８】
都合の良い方法では、本発明の方法の段階（５°）又は（５ａ°）はルシオール（フォチナス・ピラリス）のルシフェリン及びルシフェラーゼを用いて行われる。基質及び酵素はルシオールと同時に抽出され得る。
【００５９】
実用的な方法では、少なくとも１０分間ほぼ一定値の光子の放出を安定化させる物質の存在状態において反応式（１）により放出される光の測定に関する段階（６°）又は（６ａ°）が行われることが推奨される。このためにふさわしい物質には、以下のものが挙げられる。すなわち、
・前述の反応式（１）の最中に生成される、ＡＭＰ及びピロリン酸をＡＴＰに転換させるピルビル酸オルトリン酸塩ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）、
・反応する培地に存在し得る残留ＡＤＰ及び／又はＡＭＰを分解させるアデノシンリン酸塩ジアミナーゼ
【００６０】
最初の酵素は、ほぼ連続してＡＴＰを発生させながら安定した信号をもたらす。第２の酵素により、光エネルギー源としてのＡＴＰの利用法が攪乱されずに、ＡＤＰ及び／又はＡＭＰの培地内の残留物の存在による少量の液体からの雑音を小さくすることが可能となる。
【００６１】
前記第２の酵素アデノシンリン酸塩ジアミナーゼは、更に都合良いことに、反応する培地内のヌクレオチド残留物の除去のためだけでなく、特に、場合に応じて前述の段階（１°）の時に存在する試料に存在する細胞外ヌクレオチド残留物を消滅させながら排除するために利用される。
【００６２】
実際には、反応式（１）による光子の放出を安定化させるために、特に段階（５°）におけるＰＰＤＫの利用が推奨される。
【００６３】
本発明の方法は、特に、ＨＩＶ、バクテリオファージのようなウィルス、Ｃ型肝炎ウィルスの検知及び計量に適用される。
【００６４】
最初に結合され、その後このようにして得られるＡＮが、段階（４°）でミオキナーゼ及びピルビル酸キナーゼによりＡＴＰに転換される。
【００６５】
光子の放出は、ＡＴＰ添加無しで、次いでＡＴＰの添加後に、段階（５°）又は（５ａ°）で上記に示したようにルシオールのルシフェリン／ルシオールルシフェラーゼを用いて行われる。ルシオールのルシフェリン／ルシフェラーゼ集合体は特に、例えばControlifeという会社から市販で入手可能である。
【００６６】
有利な方法では、ＰＰＤＫを用いて光子の前記放出を安定化させながら上記に示したように操作される。
【００６７】
増幅信号の測定及びその決定は、段階（６°）及び（７°）において上記に示したように行われる。
【００６８】
本発明によると、ＡＴＰ法によるウィルスの検知及び計量に関する方法が推奨され、この方法には以下を含むことを特徴とする。すなわち、
−ＤＮＡアーゼ又はＲＮＡアーゼを用いたウィルスＤＮＡ又はＲＮＡの切除、次いで必要に応じてｄＡＭＰ及びｄＡＤＰの二量体のＡＭＰ及びＡＤＰの単量体への転換
−こうして得られるＡＭＰ及びＡＤＰのＡＴＰへの転換
−まず(i) ＡＴＰの添加無しで、次いで(ii)既知量のＡＴＰの添加後のＡＴＰのルシフェリン及びルシフェラーゼとの接触
−ＡＴＰ添加無しで次いでＡＴＰの添加後の反応式（１）により放出される光の増幅信号の測定、及び、
−これをもとにしたウィルス数の推定のためのＡＴＰの形で表された最初の結合された全ＡＮ含有量の決定
【００６９】
ウィルスの遺伝形質の利用法
本方法は、以下に前述の段階を参照して簡潔に説明される。
【００７０】
上記段階（１°）として水性液試料（Ｅ）を用意する。分離／濃縮は、
・薄膜上の濾過、
・特に、真空下の室温（15〜25℃）下の蒸気・遠心分離、及び／又は、
・免疫捕獲
により都合良くはApoHを用いて行われる。
【００７１】
(i) TrisプラスＥＤＴＡ、及び／又は
(ii)ＤＭＳＯ
が含まれる水性緩衝剤の追加、次いで対象細胞を開くためのマイクロ波による処理（約１分間）、引き続く急速冷却（特に冷蔵庫による）、更に必要な場合には、生ずる培地液の回収のための遠心分離によりウィルス壁が溶解される。
【００７２】
ウィルスＤＮＡ又はＲＮＡが、(i) オロゴヌクレオチドの放出用のエンドヌクレアーゼ 、例えば、ＤＮＡアーゼ若しくはＲＮＡアーゼ（特に、系統5'のGの切除用のＲＮＡアーゼT1若しくは系統5'のＣ／Ｕの切除用膵臓ＲＮＡアーゼ）、又は制限酵素、(ii)エクソヌクレアーゼ、又は(iii) 牛の脾臓のフォスフォジエステラーゼ（3'-Pが放出される5'-OH からのＲＮＡ切除用）若しくは蛇毒（5'-Pが放出される3'-OH からのＲＮＡの切除用）のフォスフォジエステラーゼにより切り離されて、ｄＡＭＰ、ｄＡＤＰ及びｄＡＴＰの二量体がＡＭＰ、ＡＤＰ及びＡＴＰの単量体に転換される。
【００７３】
ヌクレオチド一リン酸塩のヌクレオシド三リン酸塩への転換は、米国特許第６３１２９０２号明細書に説明してある操作機構が利用可能である。
【００７４】
本発明による好ましい機構には以下のものが含まれる。すなわち、
Ｉ．
(a) 特定ＤＮＡに関するＤＮＡポリメラーゼリバーストランスクリプターゼの作用下、ＲＮＡに関するＲＮＡポリメラーゼの作用下の、
ANn+PPi→ANn-1+XTP XTP
に従う。
この転換では数種の酵素、特にＡＭＶリバーストランスクリプターゼ、ＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼ、ＤＮＡポリメラーゼα及びβ、タックポリメラーゼ、T4ＤＮＡポリメラーゼ、クレナウ断片、ポリA ポリメラーゼが、0.1 から100 Ｕ／mlまでの濃度で利用された。
(b) ＮＤＰＫを使った以下の機構に従う。
【００７５】
【数２】
但し、ＡＤＰは0.01から0.50μM 、好ましくは0.5μM 、ＮＤＰＫは0.1 から10Ｕ／ml。
【００７６】
ＩＩ．
(a) 以下によるＡＮの加水分解段階、すなわち、
ANn+H2O→ANn-1+XMP
ANn+エクソヌクレアーゼ→nXMP
[すなわち、ＲＮＡならＮＭＰ、又はＤＮＡならｄＮＭＰ]
(b) ＰＲＰＰシンテラーゼを使った以下の機構に従う。
【００７７】
【数３】
［ＸＴＰはＲＮＡならＮＴＰ、ＤＮＡならｄＮＴＰ］
【００７８】
５フォスフォリボシル・ピロフォスフェート・シンテラーゼ（又はリボース・フォスフェート・ピロフォスフォキナーゼ）は様々な合成方法に共通の酵素であり、そのプリンの合成及びピリミジンの合成は人体中にある。この合成によりペントース・フォスフフェート法から生ずるαDリボースへのピロフォスファートの伝搬反応が触媒反応化される。これは0.001 から10Ｕ／mlまでのＡＴＰ濃度での利用が有利である。ＡＴＰはピロフォスフェートの補酵素ドナーでありかつエネルギードナーでもある。
【００７９】
５フォスフォリボシル・ピロフォスフェート（すなわち、５−ＰＲＰＰ）は、いわば１種の代謝「交差点」であり、ヌクレオチドの合成、すなわち、
アデノシン・フォスフォリボシル・トランスフラーゼ、
ヒポキサンチン−グアニン・フォスフォリボシル・トランスフラーゼ（ＨＧＰＲＴアーゼ）、
オロテート・フォスフォリボシル・トランスフラーゼ（Ｕ錯合成物）、
５−ＰＲＰＰアミドトランスフラーゼ、
など数多くの種類の酵素の基質として介在する。
【００８０】
酵素はプリンヌクレオチド、ＡＤＰ及びＧＤＰにより抑制される。
(c) ＮＤＫＰを使った以下の機構に従う。
【００８１】
【数４】
但し、ＡＤＰは0.01から0.50μM 、好ましくは0.5μM 、ＮＤＰＫは0.1から100 Ｕ／ml。（ＮＤＰＫが使用される場合、フォスフェートドナーはｄＣＴＰ又はα、β−メチレンアデノシン５’−三リン酸塩である）
【００８２】
ＩＩＩ．ヌクレオチド・モノフォスフェート・キナーゼ（ＮＭＰＫ）及びピルビル酸キナーゼを使った以下の機構に従う。
【００８３】
【数５】
又は、ＮＭＰＫ及び／又はミオキナーゼも使われる。
【００８４】
この最後の技術は本発明により推奨される。制約される難しい段階は核酸の加水分解である。検知の閾値はウィルスゲノムの基部の数の組成に依存する。
【００８５】
ＡＴＰの原子量が551 であること並びにＡＴＰの検知閾値は光度計及び反応物に依存することが分かったが、現在アトモルオーダーであって、アボガドロ数（6,022 ×1023）の利用により検出可能なウィルスの粒子数の予想は容易であり、ＡＴＰ法による定量決定はルシオールのルシフェリン／ルシフェラーゼ（製品はControlife社により製造されている）を使用して行われる。
【００８６】
本発明のその他の利点及び特徴は実施例に沿った説明を読めば更に良く理解される。勿論、これらの要素は限定的なものではなく、例示として提供されるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８７】
（実施例１）
ウィルスＤＮＡ又はＲＮＡについてのＡＴＰ法に関する手順
−Tris HCl 50mM、ｐＨ7.6 のNaCl 150 mMで緩衝された100 mlの試料
−用意された10μl の球の添加（ApoH又は検査ウィルスの特定抗体）
−通常回転の攪拌下の37℃での30分から90分間の培養
−ＰＢＳ中の洗浄１回
−磁気方式が使われる球の回収
−球をＤＭＳＯ型からの抽出溶液に接触させながらのウィルスの溶解
−その後、核酸のヌクレオチドへの加水分解及びこれらのＡＴＰへの転換
【００８８】
予測
−緩衝溶液：ＤＮＡ（又はＲＮＡ）の変性が回避される培地のｐＨの変動限界
−ＳＤＳ（ドデシル硫酸塩ナトリウム）：脂質層を断ち切る洗浄剤
−ＥＤＴＡ（エチレン・ジアミン・テトラアセテート）：カルシウムイオンのキレート化合物、ＤＮＡを消滅させると同時にすべての細胞に存在している酵素、ＤＮアーゼの活動にはCa2+イオンが必要である。
−溶液中（あまり重くない）の物質の固体粒子（最も重い）の急速分離のために遠心分離にかける
−冷えたナトリウムアセテート及びＤＮＡ不可溶化用の冷凍エタノール
【００８９】
（実施例２）
バクテリオファージの定量決定
溶解性ウィルスであるバクテリオファージの対象細胞として乳酸菌が利用された。
【００９０】
牛乳及びチーズ工場内では、乳製品の品質は乳酸菌に依存し、前記乳酸菌の消滅を防止するためにバクテリオファージ含有量が監視されている。
【００９１】
乳酸菌の既知個体群［本請求と同日に提出された発明の名称「細胞内ヌクレオチドアデニリルに基づく細胞数の検知及び計量のためのＡＴＰ法、特に無ＡＴＰ菌の決定のための利用及び方法」の特許請求に記載された方法により決定される］について、バクテリオファージの増殖量（０ウィルス／Ｌ、１ウィルス／Ｌ、10ウィルス／Ｌ、20ウィルス／Ｌ）が添加された。前述の段階（１°）〜（７°）の実施により、開始時点（０ウィルス／Ｌ、１ウィルス／Ｌ、10ウィルス／Ｌ、20ウィルス／Ｌ）の正確な個体群が判明した。
【００９２】
（実施例３）
宿主細胞のNaの定量決定によるバクテリオファージ群の検知
(a) ヌクレオチドＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰの定量決定が、ルシフェリン／ルシフェラーゼの複合物の存在する生物発光により実施された。ルシフェラーゼはホタル族（フォチナス・ピラリス又はルシオラ・ミングレリカ)）の腹部から抽出された1種の酵素である。ルシフェリンの各分子が、ＡＴＰ１モル及びＯ2 １モルにより酸化され、光エネルギー１量子が前述の全体反応式（１）により放出された。
【００９３】
ＡＴＰの定量決定は生物発光により直接行われ得る。ここではミオキナーゼ及びピルビン酸キナーゼを利用して、前述の反応式（３）、（３ａ）及び（４）による酵素反応によりＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換が必要である。
【００９４】
材料及び方法
菌株：中温性連鎖球菌の２種の工業生産株、ＳＭ10及びＳＭ26が、平均的ファージを検出するために、毒性ファージ（それぞれ、Φ10、Φ26）の検知に使用され、取上げられたのはＳＭ16溶原株である。
【００９５】
培養培地：合成培地Ｍ17がすべての試験に採用された。
【００９６】
毒性ファージの作用：Ｍ17培地が100 ml含まれる250 mlのエルレンマイエル中で増殖が続いた。エルレンマイエルは16時間培養して１％ｐ／Ｖまで接種されて、32℃の培養状態におかれた。光学密度（580 nmと計測された）が0.1 に達した時、毒性ファージ（109 pfu ／ml）mlが含まれる溶液が添加された。
【００９７】
平均ファージの作用：ＤＮＡ内に合体される親ファージの誘導は、増殖が0.1 の光学密度に達するとすぐ0.3 μg ／mlのミトマイシン（ＭＣ）の作用により開始される。
【００９８】
増殖方式：増殖は光学密度の測定及びヌクレオチドアデニリルの定量決定により平行して続けられた。
【００９９】
第１：全ヌクレオチドの定量決定、−200 μl の試料＋1.8 mlの純粋ＤＭＳＯ＋10mlの緩衝剤Tris（20mMのTris、10 mMのMgアセテート、ｐＨ 7.75）、第２：細胞外ヌクレオチドの定量決定、−Millipore薄膜（0.22 μm ）上で濾過された200 μL の試料＋4.8 mlの緩衝剤Tris１、第３：抽出も濾過もしないヌクレオチドの定量決定、−200 μl の試料＋4.8 mlの緩衝剤Tris１、の3個の試料が用意された。
【０１００】
用意された試料200 μl にルシフェラーゼ100 μl が添加されるとともに、
−ＡＴＰの定量決定に関して、50μl の緩衝剤Tris２（20mMのTris、10mMのMgアセテート、５mMのKアセテート、40μM のＰＥＰ）、
−内部証拠を得るために、ＡＴＰ10ピコモルを含む50μlの緩衝剤Tris２、
−ＡＴＰ及びＡＤＰの定量決定のために、ピルビル酸キナーゼ２Ｕを含む50μl の緩衝剤Tris２、及び
−ＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰの定量決定のために、ピルビル酸キナーゼ２Ｕ及びミオキナーゼ２Ｕを含む50μl の緩衝剤Tris２
【０１０１】
結果
図１及び図２によると、ＡＴＰの定量決定により得られる増殖曲線は光学密度の測定により得られるものと等しい。２つの場合（バクテリオファージの作用及びミトマイシンの添加後の菌の溶解）、細胞の溶解による減少は、光学密度の測定よりＡＴＰの測定が大きく強調される（図１及び図２の曲線a1及び曲線b1）。光学密度の測定では溶解現象時に大量培地内により多くの細胞破片が含まれるにもかかわらず、ＡＴＰ濃度では「生きている」菌の数量がより良く反映されている。
【０１０２】
図１及び図２に示された結果は、全ＡＴＰの測定値と一致する（ＤＭＳＯのある細胞内ＡＴＰの抽出による）。矢印によりファージの導入の瞬間が表示される。
【０１０３】
前述の米国特許第３５７５８１２号明細書に示されるように、添加剤が利用されない全ＡＴＰ（細胞内外の）はＲＬＵでのみ定量決定されている。確かに、ファージにより攻撃された細胞ではＲＬＵの変動が明らかであるが、この米国特許の例では、数回値が増加しているだけでなく、別の回では減少している。これは、内部証拠を利用していないだけでなく、細胞内ＡＴＰと細胞外ＡＴＰとが区別されていないためである。
【０１０４】
図３の結果により細胞内ＡＴＰの全ＡＴＰに対する定量決定の比較が可能となる。
【０１０５】
細胞外ＮＡの定量決定の利点は手順の単純化にあり、細胞の溶解（この溶解はファージにより行われる）の必要はもはやない。濾過後及び濾過無しの細胞外ＡＮの曲線は一致している（これらは重なっている）。
【０１０６】
(b) 図４にはPhageＳＭ10により培養の最初にファージが与えられた連鎖球菌 Ｍ10の株の培養が示される。
【０１０７】
細胞外ＡＮの直接定量決定により連続した検査が可能となるこれらの３変型例が、実施例３により示される。実際、この検査は試料の自動採取により行われ、ＡＮのＡＴＰへの転換が続き、次いで、このような瞬間的読み取りが利用される生物発光により形成されるＡＴＰの定量決定が行われる。
【０１０８】
実施例３の３変型例による結果は、合成培地Ｍ17で行われた試験から得られた。更に、自然培地では、光学密度を用いるのが困難であり、その上、他の検査技術は手間がかかり、不精確であり、「毒性」又は「鎮静」しているウィルス作用の迅速な検知が不可能である。それに対して、ＮＡの定量決定は迅速であるだけでなく、既知のＡＴＰ溶液からなる内部証拠を利用した方法により定量化が可能となる。
【０１０９】
ＡＮ外部／ＡＮ全部関係によりウィルスの攻撃とその大きさが明らかとなる。こうしてml当たり10ファージまでの検知が可能である。
【０１１０】
細胞外ＡＮの定量決定は溶解性ウィルスに関するものであり、これにより、より迅速かつより単純な検知が可能となる。これは、この試料を様々な宿主細胞の培養液と接触させながら、様々なウィルス種が含まれる複雑な培地内のウィルス攻撃が標定され得る唯一の方法である。本発明によると、ＡＴＰのＲＬＵではなくＡＮが定量決定されるため感度が増す。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】ＡＴＰ濃度測定による増殖検査を示す図である。
【図２】ＡＴＰ濃度測定による増殖検査を示す図である。
【図３】細胞内ＡＴＰ及び細胞外ＡＴＰのＡＴＰ濃度測定による増殖検査を示す図である。
【図４】連鎖球菌 Ｍ10の株の培養状態を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウィルスの宿主細胞又は遺伝子形質（ＤＮＡ又はＡＲＮ）のヌクレオチドアデニリル（ＡＮ）に基づくウィルスの検知及び計量のためのＡＴＰ法の新技術に関する。また、この新技術の利用、及び、一方では、検知すべきウィルスが、溶解されるか（ウィルスの発達後に宿主細胞壁が切り離される）若しくは非溶解であるか（ウィルスの発達後に壁が無くならずに宿主細胞の壁を突き抜ける）に応じた宿主細胞をもとにした、又は、他方では、ＤＮＡ若しくはＲＮＡのウィルスに応じたウィルスのＤＮＡ又はＲＮＡをもとにした利用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
反応
（１）ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 ＋Ｍｇ2+＋ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン＋光子
に基づくＡＴＰ法が知られており、これにより培地内ＡＴＰ含有量の効率的な測定が可能となる。この反応はルシフェリン（基質）／ルシフェラーゼ（酵素）を利用する方式がいかなるものであってもＡＴＰに特有なものである。これにより、細胞にＡＴＰが含まれる時に生きた細胞と死んだ細胞（無ＡＴＰ）との識別が可能となる。
【０００３】
しかしながら、ＡＴＰ法は、有機体としてウィルスに細胞内自由ＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰが無くなると同時にウィルスには適用不可能となる。ウィルスの発達に関して、宿主細胞のＡＴＰが利用される。ウィルスは成熟状態に達すると他の細胞を感染させるため宿主細胞を離れる。
【０００４】
更に、非ウィルス細胞の同一種又は変種の内部において、細胞内の全自由ＡＮ含有量は、関係式（２）
（２）[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
を考慮して、一定であることが知られている。この点については、一方で、ピルビル酸キナーゼ、ミオキナーゼがそれぞれ利用されるＡＭＰ及びＡＤＰのそれぞれのＡＴＰへの転換、他方で、10μL の添加無しの次いでＡＴＰの追加添加後の放出光の（ＲＬＵ、すなわち光の関連した単位での）測定が提案されているシャンピアット ディー（Champiat D）等による「ルミネッセンス（Luminescence）」，2001年，第16号，Ｐ．193−198の論文を参照されたい。
【特許文献１】米国特許第３５７５８１２号明細書
【特許文献１】米国特許第６３１２９０２号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ウィルスのＤＮＡ又はＲＮＡの切除により得られる全ＡＮ含有量もまた一定であるという驚くべき方法は見出されたばかりである。
【０００６】
米国特許第３５７５８１２号明細書からウィルスの宿主細胞のＡＴＰを用いた自由ＡＴＰ法によるウィルスの検知が既に提案されている。宿主細胞の自由ＡＴＰ含有量が変動するとたちまち再現不可能となる結果が得られた。この点は、本発明の優先日後の2005年の論文により明確に確認されており、ＡＴＰ含有量が1から100までの係数で変動することが示されているディック バン デ コージ（Dick van der Kooij）等による「ウォーター リサーチ（Water Research）」，2005年，第39号，Ｐ．2789−2798を参照されたい（この論文の図２参照）。この点は、後述する通り、利用されるウィルスが溶解している時の、(a) 前述の関係式２及び(b) 細胞外ＮＡ含有量の考慮が必要である。
【０００７】
米国特許第６３１２９０２号明細書からもまたＡＴＰ法による試料中のウィルスを測定するためのＤＮＡ又はＲＮＡのウィルスからの切除が提案されている。この文献では、前記試料中に含まれ得るウィルス株数の評価のためのＡＮの測定の説明も、また添加の利用の示唆もしていない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ウィルス数の検知及び計量に関する多大なニーズが存在する。
【０００９】
従って、このニーズを満たすために、ＡＴＰの形で表される、宿主細胞の自由ＡＮの集合に重点がおかれたＡＴＰ法を利用した新たな技術的解決策の提供が提案され、前記ＡＮは、試験すべきウィルスが溶解している時には細胞外で、試験すべきウィルスが非溶解状態にある時には細胞内で自由であり、つまり、ウィルスのＤＮＡ若しくはＲＮＡの切除又は加水分解によるＡＮ生成物上にある。
【００１０】
本発明の第１発明によると、ウィルスの検知及び計量のための反応式（１）
（１）ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 ＋Ｍｇ2+＋ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン＋光子
の生物発光の利用が提供され、この利用は、(a) 前記ウィルスのＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰの無い水性培地液内のウィルスの対象細胞との接触、次いで、対象物の自由ＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換後の、同一細胞族の細胞内自由ＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰの総量が関係式（２）
（２）[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
により一定であるという点が考慮されたＡＴＰの形での対象細胞を元とする自由ヌクレオチドアデニリル（ＡＮ）の含有量の測定、又は、(b) ＤＮＡアーゼ若しくはＲＮＡアーゼそれぞれによる、ｄＡＭＰ、ｄＡＤＰ及びｄＡＴＰの二量体からＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰの単量体への転換並びに全ＡＭＰ及びＡＤＰのＡＴＰへの転換を伴う、前記ウィルスのＤＮＡ又はＲＮＡにより構成されるウィルス遺伝子形質の切除、次いで、同一ウィルス族の遺伝子物質のＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰの総計が前記関係式（２）により一定であるという点が考慮されたＡＴＰの形で表されるウィルスのＤＮＡ又はＲＮＡの切除から生ずるヌクレオチドアデニリル（ＡＮ）の含有量の測定、がそれぞれ行われるとともに、前記測定は、(i) ＡＴＰ添加無しにそして(ii)既知量ＡＴＰの添加後に行われることを特徴とする。
【００１１】
本発明の第２発明によると、対象細胞のＡＮ又はウィルスのＤＮＡ若しくはＲＮＡの切除により得られるＡＮをもとにしたＡＴＰ法によるウィルスの検知及び計量方法が提供され、前記ＡＮはＡＴＰの形で表される。
【００１２】
本発明の別の発明によると、前記方法に用いる定量決定要素が提供される。
【００１３】
前記定量決定要素は、ルシオール及び添加用のＡＴＰ、必要に応じてミオキナーゼ、ピルビル酸キナーゼ、ＤＮＡナーゼ、ＲＮＡナーゼ及び／又はピルビル酸オルトリン酸塩ジキナーゼ及び／又はApoHで覆われた磁気超微粉、及び／又は、測定ウィルスの特殊抗体からなるルシフェリン／ルシフェラーゼ集合体を含むことを特徴とする。
【００１４】
前記要素は、更に必要に応じて対象物の生きた健全な細胞を含む。
【００１５】
略号
便宜により、本発明に利用される略語及び頭字語の一覧を以下に示す。
ＡＤＰ：アデノシン二リン酸塩
ＡＭＰ：アデノシン一リン酸塩
ＡＮ：ヌクレオチドアデニリル（別の用語すなわちアデノシンヌクレオチドが使用可能）、ここでは、ＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰが含まれるＡＮの集合
ＡＴＰ：アデノシン三リン酸塩、
ｃＡＭＰ：アデノシン一リン酸塩環式化合物
ｄＡＤＰ：アデノシン二リン酸塩二量体
ｄＡＭＰ：アデノシン一リン酸塩二量体
ＧＤＰ：グアノシン二リン酸塩、
ＧＴＰ：グアノシン三リン酸塩
ＮＤＰＫ：ヌクレオチド二リン酸塩キナーゼ
ＲＬＵ：光の関連単位
【００１６】
ウィルスは細胞ではない。これは細胞内の寄生物である。ウィルスは細胞内にある時にのみ繁殖する。従って、ビリオン（ウィルス粒子）について述べられる。細胞外にあるウィルスは代謝活動を全くしない。原核動物細胞（バクテリオファージ）に寄生するウィルスと真核生物細胞に寄生するものとは区別される。
【００１７】
ウィルスの特徴は本質的に以下の通りである。ウィルスは、生きている物と生きていない物との間の「不定の奇妙な領域」を占拠すると同時に、遺伝子物質を有しているので生きていない物と生きた物とが似ており、更に突然変異及び組換えが可能である。従って、ウィルスは進化と同時に転換状態にある培地に順応可能である。しかしながら、同時にウィルスは無細胞性である。つまり、ウィルスは、リボソームも、蛋白の合成及びエネルギーの発生を可能にする代謝の仕組みも有していない。成分が存在しない状態ではウィルスは、宿主細胞内でないと繁殖不可能である上、ウィルスの繁殖の形は独特である。
【００１８】
すべての細胞は、サイズを増やしながら、次いで、それぞれの生命に必要な完全にひと揃いの成分が取り囲まれる２個の新細胞に分割されながら繁殖することが知られている。これに対して、ウィルスは、ウィルスの成分、つまり蛋白質及び核酸に分解され、その後、宿主細胞の代謝の仕組みにより数ダースから数百のウィルスゲノム及び新たなウィルス外被を構成する蛋白質キャプシッドがつくられる。これらの成分はすべて、その次に集められるとともに、最終的には新たなウィルス粒子をつくる。
【００１９】
ウィルスは増殖しない。ウィルスは開放系に当てはまる熱動力学の法則に従わないように思われる。
【００２０】
しかも、ウィルスは結晶化が可能である。これは、鉱物又は有機的分子の大部分の特性であるが、生きている細胞の特性ではない。良好な湿度条件で、しかも生きた細胞中に置かれると、ウィルスにより細胞に新たなウィルス粒子がつくられる。
【００２１】
生物学的ウィルスのサイクル
ウィルスは核酸及び外被から構成される。ウィルスのゲノムは、ある一定数の基部（ＮＭＰ：ＲＮＡの場合のＡＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ、リボ核酸）又は（ｄＮＭＰ：ＤＮＡの場合のｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ、デオキシリボ核酸）を呈する約数個から数百個までの遺伝子に基づく全体的に直線状又は円形状の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の単一分子から構成される。核酸は蛋白質の殻、つまり、キャプシッドで囲まれている。あるウィルスの中では、このキャプシッド自身、蛋白質が含まれる脂質の二重層で形成される薄膜の外被で囲まれている。
【００２２】
ウィルスには３タイプの増殖サイクル、すなわち、溶菌サイクル、溶原サイクル及び連続放出サイクルが知られている。最初の２つのサイクルは殆どバクテリオファージだけに関係する。既知ファージの95％を越えるものについて、遺伝物質は、５から650kpbまでの（すなわち、10,000から1,300,000 までのヌクレオチド三リン酸塩）１個のＤＮＡ二重若枝の分子であり、これらのサイズは24から200 nmまで変動する。
【００２３】
溶菌サイクルは、ウィルスが細胞に侵入する時に展開して増殖し、次いで、溶解後に宿主細胞から分散する。溶解性ウィルスによって侵入された細胞は短時間のうちにほぼ間違いなく死ぬ。
【００２４】
溶菌サイクルでは、菌染色体の消滅がある。ウィルスのＤＮＡは導入ウィルスの関わり合いに必要であるタンパク質に翻訳される。ウィルスのＤＮＡはコピーされる。コピーはキャプシッドからのタンパク質合成用の母体からなる。この合成は、ウィルスが適切なエネルギー源ではないので、菌のリボソーム（菌の仕組みの流用）、つまり細胞エネルギーの大きな攪乱及び特に細胞内ＡＮにより確保される。
【００２５】
こうして核酸の合成が起こる場合に、ヌクレオチド（基部はＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、すなわち、ＸＴＰ）は宿主細胞の仕組みによりつくられる。次に、蛋白質及びウィルスＤＮＡ（又はＲＮＡ）の自己結合が起こる。菌は分裂すると同時に多数のビリオンを放出する。この点は、核酸の加水分解が引き起こされる前に非ウィルス細胞の存在の証拠となるヌクレオチドアデニリルが定量決定されるので、ウィルス又はその他すべての原核動物又は真核生物の細胞から生じる核酸の識別に極めて重要である。
【００２６】
溶原サイクルは、毒性又は溶解性ウィルスによりその遺伝物質が宿主細胞のものと組合せられる場合に展開されると同時に固定したようになる。ウィルスのＤＮＡ（又はＲＮＡ）は溶原性細胞の名前をもつ宿主細胞のものと反駁し合い、ウィルス又はファージは親ファージと呼ばれる。ある刺激剤により親ファージは毒性となり、溶原サイクルを開始させる。溶原性細胞は、従って、溶解されると同時にウィルス粒子が放出される。
【００２７】
溶原サイクルでは、ウィルス性ＤＮＡ（又はＲＮＡ）は菌染色体内で一体化される。菌は外部の状態により溶原サイクルに移行するまで生き続ける。ある溶原性菌は人体の健康にとって大きな重要性をもつ。例えば、ジフテリアの原因であるジフテリア菌は、ジフテリア毒素に関して暗号化する遺伝子をもつ親ファージによりそのＤＮＡが感染した場合にのみ、この病気の原因である毒素と同化しない。ボツリヌス中毒の原因であるボツリヌス菌又は化膿性連鎖球菌、猩紅熱体でも同じ現象が示される。
【００２８】
従って、これらの場合（溶菌サイクルによりこの後者の時に溶原性が見られるので、ウィルスは外部の状態により溶菌サイクル内に移行するまでは固定していることになる）、ウィルスが存在する証拠立てを可能にするのは、細胞外ＡＮ（宿主細胞壁の溶解により放出された）の定量決定であり、前記全宿主細胞である。細胞外ＮＡによりウィルス数の定量化が可能となり、ＡＮ外部／ＮＡ全量関係により感染レベルが与えられる。例えば、ＡＮ外部／ＡＮ全量の場合にはすべての宿主細胞が溶解されている、つまり死んでいることを意味する（壊死）。
【００２９】
連続放出サイクルは、数個のファージ及び多数の動物性ウィルスの仕業である。これらのウィルスは、繁殖すると同時に無傷のままの宿主細胞により中断することなく放出される。ウィルスはエンドサイトーシスを通って細胞内に侵入する。エンドサイトーシスの小胞は、その宿主細胞の細胞形質内に遺伝物質を放出し得るウィルスキャプシッドの放出を可能にするリボソームと融合する。遺伝物質は、ヌクレオキャプシッドを形成するウィルス遺伝物質を含むキャプシッドが新たにつくられるために反駁されると同時に利用される。これらのヌクレオキャプシッドは、小胞体及び宿主細胞のゴルジ装置を通じてウィルス粒子が芽を出すと同時に放出され、宿主細胞から生ずる薄膜外被で囲まれる血漿薄膜まで運搬される。流行性感冒、流行性耳下腺炎、はしか又は狂犬病のウィルスはこの連続放出サイクルをもつ。
【００３０】
この場合に、細胞外ＡＮの定量決定により情報が得られないのに対して、ウィルスが存在する宿主細胞の代謝及び特にエネルギーの攪乱を考慮して予め信号が出力されるので、全ＡＮの定量決定により、この無ウィルス同一細胞のＡＮの定量決定に関する異常の検知が可能となる。
【００３１】
エム．ゲンドロー（M.Gendraud）の論文「植物生理学（Physiol. Veg.）」，1977年，第15号（１），Ｐ．121 −132 に提案されているように、発光により宿主細胞の別のヌクレオチドが定量決定されて感度を上げることができる。その機構によると、ＮＤＰＫの存在下において、
XTP+ADP→XDP+ATP
である。
【００３２】
このように、本発明のある発明では、対象物の細胞壁の溶解により細胞外に放出される、ＡＴＰの形で表されるＡＮをもとにしたＡＴＰ法による溶解性ウィルスの検知及び計量の方法が提供される。
【００３３】
本発明の別の発明によると、対象細胞の自由ＡＮ、又はウィルスＤＮＡ若しくはＲＮＡの切除によるＡＮ生成物をもとにした連続放出されるウィルスのＡＴＰ法による検知及び計量の方法が提供される。
【００３４】
このようにして、ＤＮＡのあるウィルスに関するＤＮＡ、又はＲＮＡのあるウィルスに関するＲＮＡにより構成されるウィルスの遺伝形質と結合されて見つかる全結合ＡＮ数の検知及び計量が可能であり、前記結合ＡＮは、ＤＮＡアーゼ又はＲＮＡアーゼの作用、次いで、必要に応じてｄＡＭＰ、ｄＡＤＰ及びｄＡＴＰの二量体からＡＭＰ、ＡＤＰ及びＡＴＰの単量体への転換により放出され、前記ＡＭＰ及びＡＤＰはＡＴＰの形でのＡＮの測定のためＡＴＰに転換される。
【００３５】
対象細胞の利用法
反応式（１）
（１）ルシフェリン＋ATP＋Ｏ2 ＋Ｍｇ2+＋ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン＋光子
に応じた生物発光による溶解性ウィルス株の検知及び計量の方法が目的とされ、非感染対象細胞内自由ヌクレオチドアデニリル（ＡＮ）の総量は関係式（２）
（２）[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
により一定であるという事実に基づく前記方法は、以下の連続する段階を含むことを特徴とする。すなわち、
（１°）試験ウィルス（Ｖ）の株が含まれ得ると同時に自由ＡＮの無い水性溶液試料（Ｅ）の準備
（２°）試料（Ｅ）の対象細胞との接触
（３°）その発達後に生ずるウィルスにより対象壁が溶解するまでの生成反応培地の培養継続
（４°）生ずる細胞外培地の回収、並びにＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換処理
（５°）段階（４°）から生ずる培地への、最初は(i) ＡＴＰ添加無しで、次いで(ii)既知量のＡＴＰの添加後のルシフェリン及びルシフェラーゼの導入
（６°）ＡＴＰの添加無し、次いで既知量のＡＴＰの添加後の反応式（１）による放出光の増幅信号の測定
（７°）ＡＴＰの形での全細胞外自由ＡＮ含有量の測定、次いで最初の試料（Ｅ）内の前記ウィルス（Ｖ）の株数の推定
【００３６】
前記ウィルス株数の推定のため、段階（７°）では事前に作成される計算図表方式の利用が含まれ得る。変型例では細胞外全ＡＮ含有量が、前記ウィルスが存在しない状態での段階（１°）から（７°）までの繁殖により得られる目標細胞のものとの比較により決定され、次いで最初の試料（Ｅ）内の前記ウィルス（Ｖ）の株数が推定され得る。実際には、定量決定技術によりウィルス株数を直接的に、良好に決定することが可能となる。
【００３７】
また、反応式（１）
（１）ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 ＋Ｍｇ2+＋ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン＋光子
に基づく生物発光による連続放出にあるウィルス株数の検知及び計量の方法も対象とし、非感染の対象細胞内自由ヌクレオチドアデリニル（ＡＮ）の総量が関係式（２）
（２）[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
により一定であるという事実を考慮した前記方法は、以下の連続した段階を含むことを特徴とする。
（１ａ°）試験ウィルス（Ｖ）の株が含まれ得るとともに自由ＡＮの無い水性液体試料（Ｅ）の準備
（２ａ°）試料（Ｅ）の対象細胞との接触
（３ａ°）その発達後に生ずるウィルスが対象壁を越えるまでの生成反応培地の培養継続
（４ａ°）対象細胞の回収、生ずる細胞内培地が回収されるためのこれらの溶解、次いでＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換のための前記細胞内培地の処理
（５ａ°）段階（４ａ°）から生ずる培地内への、最初は(i) ＡＴＰの添加無しに、次いで(ii)既知量のＡＴＰ添加後のルシフェリン及びルシフェラーゼの導入
（６ａ°）ＡＴＰの添加無し、次いで既知量のＡＴＰの添加後の反応式（１）による放出光の増幅信号の測定
（７ａ°）最初の試料（Ｅ）中の前記ウィルス（Ｖ）の株数の推定のためのＡＴＰの形での細胞内自由ＡＮの全含有量の決定
【００３８】
段階（７ａ°）は、段階（７°）について上記で示されたように、特に、前記ウィルスが存在しない状態での段階（１ａ°）から（７ａ°）までの繁殖状態で処理された対象細胞との比較により行われ得る。変型例では、細胞内全ＡＮの含有量の決定は予め作成された計算図表方式により行われ得る。次に、前記試料（Ｅ）内の前記ウィルス（Ｖ）の株数が推定される。
【００３９】
まとめると、段階（１°）〜（２°）及び（５°）は段階（１ａ°）〜（２ａ°）及び（５ａ°）に一致し、段階（３°）及び（６°）〜（７°）はほぼ段階（３ａ°）及び（６ａ°）〜（７ａ°）に類似している一方で、段階（４°）は段階（４ａ°）とは異なる。同一又は類似の段階が実施される方式は共通に処理される。これに対して、段階（４°）及び段階（４ａ°）の方式はそれぞれ別々に処理される。
【００４０】
試料（Ｅ）は水性組成であり、必要に応じて、有機性組成であり得る。この試料（Ｅ）は、水性が都合の良く、ガス（特に洗浄を通じて）、固体（特に接触、溶解若しくは分散を通じて）又は液体（特に抽出、溶解若しくは乳化を通じて）から採取される。
【００４１】
前述の反応式（１）により、オキシルシフェリン、ＡＭＰの光子及び１又は数種のリン酸塩主にピロリン酸塩が提供される。この反応は、最適濃度にあるＡＴＰ、ルシフェリン及びルシフェラーゼに特有のものであり、これらの三物質が存在すると同時に放出される光子の数はＡＴＰ量に直接比例する。有機体及びすべての反応培地内では、細胞外ＡＴＰは、再循環により、又は主たる分解により比較的急速に消える。
【００４２】
ＡＴＰは、エネルギー源（機械エネルギー、浸透エネルギー、化学エネルギー、熱エネルギー、光エネルギー）として、リン酸塩ドナー、ピロリン酸塩ドナー、ＡＭＰドナー及びアデノシンドナーを細胞内に介在する。
【００４３】
同一種の細胞中のＡＴＰ含有量は物理的状態に応じて大きく変動し、検知閾値は一般的に103 個の菌数である。本発明によると、ＡＴＰが１アトモル（放出光信号の安定化無しで）から0.5 アトモル（前記信号の安定化有りで）まで最上の感度が達成され、これは菌１個の全細胞内自由ＡＮの平均含有量にほぼ相当する。
【００４４】
関係式（２）を考慮すると、ＡＭＰの合成に介在する前駆物質である環式アデノシン一リン酸塩（ｃＡＭＰ）の細胞内含有量は無視される。この含有量は本発明の反応培地内では実用上無視できる。
【００４５】
本発明によると、酵素（ルシフェラーゼ）、光胞子基質（ルシフェリン）、補酵素（ＡＴＰの場合に）、ルシオール（フォチナス・ピラリス）に関する良く知られた原理が採用される。結果は、光度計（又は輝度計）にＲＬＵで表示され、ＡＴＰ量に比例するにもかかわらず、これによって試料の本当のＡＴＰ濃度決定は可能ではない。
【００４６】
この問題を改善するために、最初の読み取り（ＡＴＰの提供無しで実施）後に、既知量（例えば、102 から10ピコモルまでのＡＴＰ）の提供が推奨される。しかしながら、前記細胞内のＡＴＰ含有量は、生理学的状態に応じた急速な「逆転」があって一定に留まらないので、提供される技術では定量的な数量測定が可能ではない。
【００４７】
これに対して、所与の対象細胞はすべて同一のＡＮ含有量を示す。本発明によれば、ＡＴＰの形で示されるＡＮ含有量が決定されながら、対象細胞及びウィルス株数の定量的決定の実施が可能になる。
【００４８】
有利な方法では、分離及び濃縮に関する本発明の方法の段階（１°）又は（１ａ°）は、
・薄膜の濾過、
・特に真空かつ雰囲気温度（15〜25℃）下の蒸発・遠心分離、及び／又は
・免疫捕捉
により行われる。
【００４９】
免疫捕捉技術は好ましい。この技術により、抗体によりウィルスの固定によるウィルス株の濃縮及び純化が可能となる。実際の方法では、これらの抗体はウィルスを損なうことなくウィルス表面の抗原体に向けられ得る。また同様に実際の方法では、これらの抗体は、磁場内でのウィルス−抗体−球タイプの接合生成物の濃縮及び純化並びに前記接合生成物の回収のために磁気乳液球上に不動化される。変型例では、ウィルス株が固定される抗体に結合される非磁気又は非磁化の球により、また、上澄みの移し取りにより前記株の濃縮及び純化が可能となる。
【００５０】
免疫捕捉実施の最良の形は、ApoH、すなわち、生きた物質を固定すると同時に死んだ有機体の破片類特に壁を固定しないタンパク質で覆われた磁気超微粉の利用である。ApoHは細胞死（アポプトーシス）の直前又は瞬間にだけ現れる１種の蛋白質である。
【００５１】
前記接合生成物は、引き続き必要な場合には、抗体にもはや結合されない細胞の濃縮された液体組成を処理するために特に溶離により分離される。
【００５２】
必要に応じて、感度が下がる希釈が制限されるために、生成物のロス無しに数分間での大量の試料又は反応する培地の乾燥を可能にする蒸発−遠心分離装置（2,000 〜10,000回転／15分から2,000 〜10,000回転／分までの運転）により前記液体組成を濃縮することが賢明である。屋内温度での蒸気−遠心分離により株が含まれる培地の水分の大部分が除去可能となる利点がある。
【００５３】
また、都合の良い方法では、ウィルス株の対象株との接触、次いでこれらの発達に関する段階（２°）〜（３°）又は（２ａ°）〜（３ａ°）は専門家に既知の形により行われる。
【００５４】
段階（４ａ°）において、対象細胞壁の溶解は、
(i) TrisプラスＥＤＴＡ、及び／又は、
(ii)ＤＭＳＯ、
が含まれる水性緩衝剤の追加、次いで対象細胞を開くためのマイクロ波処理（約１分間）、急速冷却（特に、冷蔵庫における）と続き、更に必要な場合には生ずる液体培地を回収するための遠心分離により、段階（３ａ°）から生ずる培地内で行われる。溶解は細胞内ＡＮへの接近が可能となるために必要である。
【００５５】
（４°）又は段階（４ａ°）におけるＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換はミオキナーゼ及びピルビル酸キナーゼを用いて行われる。反応機構を以下に示す。
【００５６】
【数１】
【００５７】
時間の節約のため、ＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換に関する本発明の方法の段階（５°）は、段階（４°）と同時に行われ得る。
【００５８】
都合の良い方法では、本発明の方法の段階（５°）又は（５ａ°）はルシオール（フォチナス・ピラリス）のルシフェリン及びルシフェラーゼを用いて行われる。基質及び酵素はルシオールと同時に抽出され得る。
【００５９】
実用的な方法では、少なくとも１０分間ほぼ一定値の光子の放出を安定化させる物質の存在状態において反応式（１）により放出される光の測定に関する段階（６°）又は（６ａ°）が行われることが推奨される。このためにふさわしい物質には、以下のものが挙げられる。すなわち、
・前述の反応式（１）の最中に生成される、ＡＭＰ及びピロリン酸をＡＴＰに転換させるピルビル酸オルトリン酸塩ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）、
・反応する培地に存在し得る残留ＡＤＰ及び／又はＡＭＰを分解させるアデノシンリン酸塩ジアミナーゼ
【００６０】
最初の酵素は、ほぼ連続してＡＴＰを発生させながら安定した信号をもたらす。第２の酵素により、光エネルギー源としてのＡＴＰの利用法が攪乱されずに、ＡＤＰ及び／又はＡＭＰの培地内の残留物の存在による少量の液体からの雑音を小さくすることが可能となる。
【００６１】
前記第２の酵素アデノシンリン酸塩ジアミナーゼは、更に都合良いことに、反応する培地内のヌクレオチド残留物の除去のためだけでなく、特に、場合に応じて前述の段階（１°）の時に存在する試料に存在する細胞外ヌクレオチド残留物を消滅させながら排除するために利用される。
【００６２】
実際には、反応式（１）による光子の放出を安定化させるために、特に段階（５°）におけるＰＰＤＫの利用が推奨される。
【００６３】
本発明の方法は、特に、ＨＩＶ、バクテリオファージのようなウィルス、Ｃ型肝炎ウィルスの検知及び計量に適用される。
【００６４】
最初に結合され、その後このようにして得られるＡＮが、段階（４°）でミオキナーゼ及びピルビル酸キナーゼによりＡＴＰに転換される。
【００６５】
光子の放出は、ＡＴＰ添加無しで、次いでＡＴＰの添加後に、段階（５°）又は（５ａ°）で上記に示したようにルシオールのルシフェリン／ルシオールルシフェラーゼを用いて行われる。ルシオールのルシフェリン／ルシフェラーゼ集合体は特に、例えばControlifeという会社から市販で入手可能である。
【００６６】
有利な方法では、ＰＰＤＫを用いて光子の前記放出を安定化させながら上記に示したように操作される。
【００６７】
増幅信号の測定及びその決定は、段階（６°）及び（７°）において上記に示したように行われる。
【００６８】
本発明によると、ＡＴＰ法によるウィルスの検知及び計量に関する方法が推奨され、この方法には以下を含むことを特徴とする。すなわち、
−ＤＮＡアーゼ又はＲＮＡアーゼを用いたウィルスＤＮＡ又はＲＮＡの切除、次いで必要に応じてｄＡＭＰ及びｄＡＤＰの二量体のＡＭＰ及びＡＤＰの単量体への転換
−こうして得られるＡＭＰ及びＡＤＰのＡＴＰへの転換
−まず(i) ＡＴＰの添加無しで、次いで(ii)既知量のＡＴＰの添加後のＡＴＰのルシフェリン及びルシフェラーゼとの接触
−ＡＴＰ添加無しで次いでＡＴＰの添加後の反応式（１）により放出される光の増幅信号の測定、及び、
−これをもとにしたウィルス数の推定のためのＡＴＰの形で表された最初の結合された全ＡＮ含有量の決定
【００６９】
ウィルスの遺伝形質の利用法
本方法は、以下に前述の段階を参照して簡潔に説明される。
【００７０】
上記段階（１°）として水性液試料（Ｅ）を用意する。分離／濃縮は、
・薄膜上の濾過、
・特に、真空下の室温（15〜25℃）下の蒸気・遠心分離、及び／又は、
・免疫捕獲
により都合良くはApoHを用いて行われる。
【００７１】
(i) TrisプラスＥＤＴＡ、及び／又は
(ii)ＤＭＳＯ
が含まれる水性緩衝剤の追加、次いで対象細胞を開くためのマイクロ波による処理（約１分間）、引き続く急速冷却（特に冷蔵庫による）、更に必要な場合には、生ずる培地液の回収のための遠心分離によりウィルス壁が溶解される。
【００７２】
ウィルスＤＮＡ又はＲＮＡが、(i) オロゴヌクレオチドの放出用のエンドヌクレアーゼ 、例えば、ＤＮＡアーゼ若しくはＲＮＡアーゼ（特に、系統5'のGの切除用のＲＮＡアーゼT1若しくは系統5'のＣ／Ｕの切除用膵臓ＲＮＡアーゼ）、又は制限酵素、(ii)エクソヌクレアーゼ、又は(iii) 牛の脾臓のフォスフォジエステラーゼ（3'-Pが放出される5'-OH からのＲＮＡ切除用）若しくは蛇毒（5'-Pが放出される3'-OH からのＲＮＡの切除用）のフォスフォジエステラーゼにより切り離されて、ｄＡＭＰ、ｄＡＤＰ及びｄＡＴＰの二量体がＡＭＰ、ＡＤＰ及びＡＴＰの単量体に転換される。
【００７３】
ヌクレオチド一リン酸塩のヌクレオシド三リン酸塩への転換は、米国特許第６３１２９０２号明細書に説明してある操作機構が利用可能である。
【００７４】
本発明による好ましい機構には以下のものが含まれる。すなわち、
Ｉ．
(a) 特定ＤＮＡに関するＤＮＡポリメラーゼリバーストランスクリプターゼの作用下、ＲＮＡに関するＲＮＡポリメラーゼの作用下の、
ANn+PPi→ANn-1+XTP XTP
に従う。
この転換では数種の酵素、特にＡＭＶリバーストランスクリプターゼ、ＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼ、ＤＮＡポリメラーゼα及びβ、タックポリメラーゼ、T4ＤＮＡポリメラーゼ、クレナウ断片、ポリA ポリメラーゼが、0.1 から100 Ｕ／mlまでの濃度で利用された。
(b) ＮＤＰＫを使った以下の機構に従う。
【００７５】
【数２】
但し、ＡＤＰは0.01から0.50μM 、好ましくは0.5μM 、ＮＤＰＫは0.1 から10Ｕ／ml。
【００７６】
ＩＩ．
(a) 以下によるＡＮの加水分解段階、すなわち、
ANn+H2O→ANn-1+XMP
ANn+エクソヌクレアーゼ→nXMP
[すなわち、ＲＮＡならＮＭＰ、又はＤＮＡならｄＮＭＰ]
(b) ＰＲＰＰシンテラーゼを使った以下の機構に従う。
【００７７】
【数３】
［ＸＴＰはＲＮＡならＮＴＰ、ＤＮＡならｄＮＴＰ］
【００７８】
５フォスフォリボシル・ピロフォスフェート・シンテラーゼ（又はリボース・フォスフェート・ピロフォスフォキナーゼ）は様々な合成方法に共通の酵素であり、そのプリンの合成及びピリミジンの合成は人体中にある。この合成によりペントース・フォスフフェート法から生ずるαDリボースへのピロフォスファートの伝搬反応が触媒反応化される。これは0.001 から10Ｕ／mlまでのＡＴＰ濃度での利用が有利である。ＡＴＰはピロフォスフェートの補酵素ドナーでありかつエネルギードナーでもある。
【００７９】
５フォスフォリボシル・ピロフォスフェート（すなわち、５−ＰＲＰＰ）は、いわば１種の代謝「交差点」であり、ヌクレオチドの合成、すなわち、
アデノシン・フォスフォリボシル・トランスフラーゼ、
ヒポキサンチン−グアニン・フォスフォリボシル・トランスフラーゼ（ＨＧＰＲＴアーゼ）、
オロテート・フォスフォリボシル・トランスフラーゼ（Ｕ錯合成物）、
５−ＰＲＰＰアミドトランスフラーゼ、
など数多くの種類の酵素の基質として介在する。
【００８０】
酵素はプリンヌクレオチド、ＡＤＰ及びＧＤＰにより抑制される。
(c) ＮＤＫＰを使った以下の機構に従う。
【００８１】
【数４】
但し、ＡＤＰは0.01から0.50μM 、好ましくは0.5μM 、ＮＤＰＫは0.1から100 Ｕ／ml。（ＮＤＰＫが使用される場合、フォスフェートドナーはｄＣＴＰ又はα、β−メチレンアデノシン５’−三リン酸塩である）
【００８２】
ＩＩＩ．ヌクレオチド・モノフォスフェート・キナーゼ（ＮＭＰＫ）及びピルビル酸キナーゼを使った以下の機構に従う。
【００８３】
【数５】
又は、ＮＭＰＫ及び／又はミオキナーゼも使われる。
【００８４】
この最後の技術は本発明により推奨される。制約される難しい段階は核酸の加水分解である。検知の閾値はウィルスゲノムの基部の数の組成に依存する。
【００８５】
ＡＴＰの原子量が551 であること並びにＡＴＰの検知閾値は光度計及び反応物に依存することが分かったが、現在アトモルオーダーであって、アボガドロ数（6,022 ×1023）の利用により検出可能なウィルスの粒子数の予想は容易であり、ＡＴＰ法による定量決定はルシオールのルシフェリン／ルシフェラーゼ（製品はControlife社により製造されている）を使用して行われる。
【００８６】
本発明のその他の利点及び特徴は実施例に沿った説明を読めば更に良く理解される。勿論、これらの要素は限定的なものではなく、例示として提供されるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８７】
（実施例１）
ウィルスＤＮＡ又はＲＮＡについてのＡＴＰ法に関する手順
−Tris HCl 50mM、ｐＨ7.6 のNaCl 150 mMで緩衝された100 mlの試料
−用意された10μl の球の添加（ApoH又は検査ウィルスの特定抗体）
−通常回転の攪拌下の37℃での30分から90分間の培養
−ＰＢＳ中の洗浄１回
−磁気方式が使われる球の回収
−球をＤＭＳＯ型からの抽出溶液に接触させながらのウィルスの溶解
−その後、核酸のヌクレオチドへの加水分解及びこれらのＡＴＰへの転換
【００８８】
予測
−緩衝溶液：ＤＮＡ（又はＲＮＡ）の変性が回避される培地のｐＨの変動限界
−ＳＤＳ（ドデシル硫酸塩ナトリウム）：脂質層を断ち切る洗浄剤
−ＥＤＴＡ（エチレン・ジアミン・テトラアセテート）：カルシウムイオンのキレート化合物、ＤＮＡを消滅させると同時にすべての細胞に存在している酵素、ＤＮアーゼの活動にはCa2+イオンが必要である。
−溶液中（あまり重くない）の物質の固体粒子（最も重い）の急速分離のために遠心分離にかける
−冷えたナトリウムアセテート及びＤＮＡ不可溶化用の冷凍エタノール
【００８９】
（実施例２）
バクテリオファージの定量決定
溶解性ウィルスであるバクテリオファージの対象細胞として乳酸菌が利用された。
【００９０】
牛乳及びチーズ工場内では、乳製品の品質は乳酸菌に依存し、前記乳酸菌の消滅を防止するためにバクテリオファージ含有量が監視されている。
【００９１】
乳酸菌の既知個体群［本請求と同日に提出された発明の名称「細胞内ヌクレオチドアデニリルに基づく細胞数の検知及び計量のためのＡＴＰ法、特に無ＡＴＰ菌の決定のための利用及び方法」の特許請求に記載された方法により決定される］について、バクテリオファージの増殖量（０ウィルス／Ｌ、１ウィルス／Ｌ、10ウィルス／Ｌ、20ウィルス／Ｌ）が添加された。前述の段階（１°）〜（７°）の実施により、開始時点（０ウィルス／Ｌ、１ウィルス／Ｌ、10ウィルス／Ｌ、20ウィルス／Ｌ）の正確な個体群が判明した。
【００９２】
（実施例３）
宿主細胞のNaの定量決定によるバクテリオファージ群の検知
(a) ヌクレオチドＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰの定量決定が、ルシフェリン／ルシフェラーゼの複合物の存在する生物発光により実施された。ルシフェラーゼはホタル族（フォチナス・ピラリス又はルシオラ・ミングレリカ)）の腹部から抽出された1種の酵素である。ルシフェリンの各分子が、ＡＴＰ１モル及びＯ2 １モルにより酸化され、光エネルギー１量子が前述の全体反応式（１）により放出された。
【００９３】
ＡＴＰの定量決定は生物発光により直接行われ得る。ここではミオキナーゼ及びピルビン酸キナーゼを利用して、前述の反応式（３）、（３ａ）及び（４）による酵素反応によりＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換が必要である。
【００９４】
材料及び方法
菌株：中温性連鎖球菌の２種の工業生産株、ＳＭ10及びＳＭ26が、平均的ファージを検出するために、毒性ファージ（それぞれ、Φ10、Φ26）の検知に使用され、取上げられたのはＳＭ16溶原株である。
【００９５】
培養培地：合成培地Ｍ17がすべての試験に採用された。
【００９６】
毒性ファージの作用：Ｍ17培地が100 ml含まれる250 mlのエルレンマイエル中で増殖が続いた。エルレンマイエルは16時間培養して１％ｐ／Ｖまで接種されて、32℃の培養状態におかれた。光学密度（580 nmと計測された）が0.1 に達した時、毒性ファージ（109 pfu ／ml）mlが含まれる溶液が添加された。
【００９７】
平均ファージの作用：ＤＮＡ内に合体される親ファージの誘導は、増殖が0.1 の光学密度に達するとすぐ0.3 μg ／mlのミトマイシン（ＭＣ）の作用により開始される。
【００９８】
増殖方式：増殖は光学密度の測定及びヌクレオチドアデニリルの定量決定により平行して続けられた。
【００９９】
第１：全ヌクレオチドの定量決定、−200 μl の試料＋1.8 mlの純粋ＤＭＳＯ＋10mlの緩衝剤Tris（20mMのTris、10 mMのMgアセテート、ｐＨ 7.75）、第２：細胞外ヌクレオチドの定量決定、−Millipore薄膜（0.22 μm ）上で濾過された200 μL の試料＋4.8 mlの緩衝剤Tris１、第３：抽出も濾過もしないヌクレオチドの定量決定、−200 μl の試料＋4.8 mlの緩衝剤Tris１、の3個の試料が用意された。
【０１００】
用意された試料200 μl にルシフェラーゼ100 μl が添加されるとともに、
−ＡＴＰの定量決定に関して、50μl の緩衝剤Tris２（20mMのTris、10mMのMgアセテート、５mMのKアセテート、40μM のＰＥＰ）、
−内部証拠を得るために、ＡＴＰ10ピコモルを含む50μlの緩衝剤Tris２、
−ＡＴＰ及びＡＤＰの定量決定のために、ピルビル酸キナーゼ２Ｕを含む50μl の緩衝剤Tris２、及び
−ＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰの定量決定のために、ピルビル酸キナーゼ２Ｕ及びミオキナーゼ２Ｕを含む50μl の緩衝剤Tris２
【０１０１】
結果
図１及び図２によると、ＡＴＰの定量決定により得られる増殖曲線は光学密度の測定により得られるものと等しい。２つの場合（バクテリオファージの作用及びミトマイシンの添加後の菌の溶解）、細胞の溶解による減少は、光学密度の測定よりＡＴＰの測定が大きく強調される（図１及び図２の曲線a1及び曲線b1）。光学密度の測定では溶解現象時に大量培地内により多くの細胞破片が含まれるにもかかわらず、ＡＴＰ濃度では「生きている」菌の数量がより良く反映されている。
【０１０２】
図１及び図２に示された結果は、全ＡＴＰの測定値と一致する（ＤＭＳＯのある細胞内ＡＴＰの抽出による）。矢印によりファージの導入の瞬間が表示される。
【０１０３】
前述の米国特許第３５７５８１２号明細書に示されるように、添加剤が利用されない全ＡＴＰ（細胞内外の）はＲＬＵでのみ定量決定されている。確かに、ファージにより攻撃された細胞ではＲＬＵの変動が明らかであるが、この米国特許の例では、数回値が増加しているだけでなく、別の回では減少している。これは、内部証拠を利用していないだけでなく、細胞内ＡＴＰと細胞外ＡＴＰとが区別されていないためである。
【０１０４】
図３の結果により細胞内ＡＴＰの全ＡＴＰに対する定量決定の比較が可能となる。
【０１０５】
細胞外ＮＡの定量決定の利点は手順の単純化にあり、細胞の溶解（この溶解はファージにより行われる）の必要はもはやない。濾過後及び濾過無しの細胞外ＡＮの曲線は一致している（これらは重なっている）。
【０１０６】
(b) 図４にはPhageＳＭ10により培養の最初にファージが与えられた連鎖球菌 Ｍ10の株の培養が示される。
【０１０７】
細胞外ＡＮの直接定量決定により連続した検査が可能となるこれらの３変型例が、実施例３により示される。実際、この検査は試料の自動採取により行われ、ＡＮのＡＴＰへの転換が続き、次いで、このような瞬間的読み取りが利用される生物発光により形成されるＡＴＰの定量決定が行われる。
【０１０８】
実施例３の３変型例による結果は、合成培地Ｍ17で行われた試験から得られた。更に、自然培地では、光学密度を用いるのが困難であり、その上、他の検査技術は手間がかかり、不精確であり、「毒性」又は「鎮静」しているウィルス作用の迅速な検知が不可能である。それに対して、ＮＡの定量決定は迅速であるだけでなく、既知のＡＴＰ溶液からなる内部証拠を利用した方法により定量化が可能となる。
【０１０９】
ＡＮ外部／ＡＮ全部関係によりウィルスの攻撃とその大きさが明らかとなる。こうしてml当たり10ファージまでの検知が可能である。
【０１１０】
細胞外ＡＮの定量決定は溶解性ウィルスに関するものであり、これにより、より迅速かつより単純な検知が可能となる。これは、この試料を様々な宿主細胞の培養液と接触させながら、様々なウィルス種が含まれる複雑な培地内のウィルス攻撃が標定され得る唯一の方法である。本発明によると、ＡＴＰのＲＬＵではなくＡＮが定量決定されるため感度が増す。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】ＡＴＰ濃度測定による増殖検査を示す図である。
【図２】ＡＴＰ濃度測定による増殖検査を示す図である。
【図３】細胞内ＡＴＰ及び細胞外ＡＴＰのＡＴＰ濃度測定による増殖検査を示す図である。
【図４】連鎖球菌 Ｍ10の株の培養状態を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウィルスの検知及び計量のための反応式（１）
（１）ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 ＋Ｍｇ2+＋ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン＋光子
による生物発光の利用において、
(a) ＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰが含まれない水性液培地中における対象細胞とウィルスとの接触が、次いでＡＴＰの形で表される対象細胞から生じる自由ヌクレオチドアデニリル（ＡＮ）の含有量の測定が、対象物のＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換後に、同一ウィルス族の自由細胞内のＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰの総量が、関係式（２）
（２）[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
により一定である点が考慮されて行われるか、又は、(b) ＤＮＡアーゼ若しくはＲＮＡアーゼそれぞれによる、ｄＡＭＰ及びｄＡＤＰの二量体からＡＭＰ及びＡＤＰの単量体への転換、並びにＡＭＰ及びＡＤＰのすべてのＡＴＰへの転換を伴う前記ウィルスのＤＮＡ又はＲＮＡにより構成されるウィルス遺伝形質の切除が、次いで、(i) ＡＴＰの添加無し及び(ii)ＡＴＰの既知量の添加後に行われる、ＡＴＰの形で表されるウィルス性ＤＮＡ若しくはＲＮＡの切除から生ずるヌクレオチドアデニリル（ＡＮ）の含有量の測定が、前記族の遺伝子物質のＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰの総量が前記関係式（２）により一定である点が考慮されて、それぞれ行われることを特徴とする利用。
【請求項２】
溶解性ウィルスのＡＴＰ法が、対象物のセルロース壁の溶解により細胞外に放出されるＡＴＰの形で表されるＡＮ数に基づくことを特徴とする請求項１記載の利用。
【請求項３】
連続放出中にあるウィルスのＡＴＰ法が、対象物の細胞壁の溶解により放出されるＡＴＰの形で表される細胞内ＡＮ数に基づくことを特徴とする請求項１記載の利用。
【請求項４】
ＡＴＰ法による溶解性ウィルスの検知及び計量の方法において、
対象細胞壁の溶解により細胞外に放出されるＡＴＰの形で表されるＡＮ数の測定を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
ＡＴＰ法による連続放出中のウィルスの検知及び計量の方法において、
ＡＴＰの形で表される、対象物の同一非感染細胞とは異なる対象感染細胞の細胞内自由ＡＮの全含有量による対象細胞の細胞内自由ＡＮの測定を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
非感染対象物の細胞内ヌクレオチドアデニリル（ＡＮ）の総量が関係式（２）
（２）[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
により一定であるという点に基づく、反応式（１）
（１）ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 ＋Ｍｇ2+＋ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン＋光子
による生物発光による溶解性ウィルス株数の検知及び計量のための方法において、
（１°）試験ウィルス（Ｖ）の株が含まれ得ると同時に自由ＡＮの全く無い水性試料液（Ｅ）の準備、
（２°）前記試料（Ｅ）の対象細胞との接触、
（３°）その発達後に生ずるウィルスにより対象壁が溶解するまでの生成反応培地の培養継続、
（４°）生ずる細胞外培地の回収、並びにＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換処理、
（５°）段階（４°）から生ずる培地への最初に(i) ＡＴＰの添加無しで、次いで(ii)既知量のＡＴＰの添加後のルシフェリン及びルシフェラーゼの導入、
（６°）最初にＡＴＰの添加無しで、次いで、既知量のＡＴＰの添加後の反応式（１）による放出光の増幅信号の測定、及び
（７°）ＡＴＰの形の細胞外自由ＡＮの全含有量の決定、次いで、最初の試料（Ｅ）中の前記ウィルス（Ｖ）の株数の推定、
からなる連続する段階を含むことを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項７】
最初の試料（Ｅ）中の前記ウィルス（Ｖ）の株数の推定のため、段階（７°）において、細胞外ＡＮの全含有量が、計算図表方式により又は段階（１°）から（７°）までの段階の前記ウィルスが存在しない状態の繁殖により得られる対象細胞のものと比較して決定されることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
非感染対象細胞内のヌクレオチドアデニリル（ＡＮ）の総量が関係式（２）
（２）[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
により一定であるという点に基づく、反応式（１）
（１）ルシフェリン＋ATP＋Ｏ2 ＋Ｍｇ2+＋ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン＋光子
による生物発光を通じた非溶解性ウィルスの株数の検知及び計量のための方法において、
（１ａ°）試験ウィルス（Ｖ）の株が含まれ得るとともにＡＮの全く無い水性試料液（Ｅ）の準備、
（２ａ°）前記試料（Ｅ）の対象細胞との接触、
（３ａ°）その発達後に生ずるウィルスが対象壁を越えるまでの生成反応培地の培養継続、
（４ａ°）対象細胞の回収、生ずる細胞内培地を回収するためのこれらの溶解、次いでＡＤＰ及びＡＭＰがＡＴＰに転換されるための前記細胞内培地の処理、
（５ａ°）最初に(i) ＡＴＰの添加無しの、次いで、(ii)既知量のＡＴＰの導入後の、段階（４ａ°）から生ずる培地へのルシフェリン及びルシフェラーゼの導入、
（６ａ°）最初にＡＴＰの添加無しの、次いで、既知量のＡＴＰの導入後の、反応式（１）による放出光増幅信号の測定、
（７ａ°）最初の試料（Ｅ）中の前記ウィルス（Ｖ）の株数の推定のためのＡＴＰの形での細胞内自由ＡＮの全含有量の決定、
からなる連続した段階を含むことを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項９】
最初の試料（Ｅ）のウィルス（Ｖ）の数の推定のため、段階（７ａ°）において、細胞内全ＡＮ含有量の決定が、予め作成された計算図表方式により、又は前記ウィルスが存在しない（１ａ°）から（７ａ°）までの段階の繁殖により得られる対象細胞のものとの比較により行われることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
段階（４ａ°）において、対象細胞壁の溶解が、
(i) TrisプラスＥＤＴＡ、及び／又は、
(ii)ＤＭＳＯ
を含む水性緩衝剤の追加により、次いで対象細胞を開けるためのマイクロ波処理（約１分間）により、その後に続く急速冷却（特に冷蔵庫で）により、更に必要ならば生ずる液体培地回収用の遠心分離により、段階（３ａ°）から生ずる培地内で行われることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１１】
ＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換の段階（４°）又は段階（４ａ°）がミオキナーゼ及びピルビル酸キナーゼにより行われることを特徴とする請求項６又は請求項８記載の方法。
【請求項１２】
ApoHで覆われた磁気超微粉によるウィルス又はその宿主細胞の捕捉段階を含むことを特徴とする請求項４乃至請求項１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ルシオール及び添加用ＡＴＰ、更に必要に応じてミオキナーゼ、ピルビル酸キナーゼ、ピルビル酸オルトリン酸塩ジキナーゼ、及び／又は、ApoHで覆われた磁気超微粉のルシフェリン／ルシフェラーゼ集合体を含むことを特徴とする請求項４乃至請求項１２のいずれかに記載の方法に用いる定量決定要素。
【請求項１４】
ＡＴＰ法によるウィルスの検知及び計量の方法において、
−ＤＮＡアーゼ又はＲＮＡアーゼによるＤＮＡ又はＲＮＡの切除、次いで、必要に応じてｄＡＭＰ及びｄＡＤＰの二量体からＡＭＰ及びＡＤＰの単量体への転換、
−こうして得られるＡＭＰ及びＡＤＰのＡＴＰへの転換、
−まず(i) ＡＴＰの添加無しで、次いで(ii)既知量のＡＴＰの添加後のＡＴＰのルシフェリン及びルシフェラーゼとの接触、
−ＡＴＰの添加無し、次いで既知量のＡＴＰの添加後の反応式（１）により放出される光の増幅信号の測定、及び、
−そのウィルス数の推定のためのＡＴＰの形で表される最初に結合された全ＡＮ含有量の決定
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１】
ウィルスの検知及び計量のための反応式（１）
（１）ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 ＋Ｍｇ2+＋ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン＋光子
による生物発光の利用において、
(a) ＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰが含まれない水性液培地中における対象細胞とウィルスとの接触が、次いでＡＴＰの形で表される対象細胞から生じる自由ヌクレオチドアデニリル（ＡＮ）の含有量の測定が、対象物のＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換後に、同一ウィルス族の自由細胞内のＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰの総量が、関係式（２）
（２）[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
により一定である点が考慮されて行われるか、又は、(b) ＤＮＡアーゼ若しくはＲＮＡアーゼそれぞれによる、ｄＡＭＰ及びｄＡＤＰの二量体からＡＭＰ及びＡＤＰの単量体への転換、並びにＡＭＰ及びＡＤＰのすべてのＡＴＰへの転換を伴う前記ウィルスのＤＮＡ又はＲＮＡにより構成されるウィルス遺伝形質の切除が、次いで、(i) ＡＴＰの添加無し及び(ii)ＡＴＰの既知量の添加後に行われる、ＡＴＰの形で表されるウィルス性ＤＮＡ若しくはＲＮＡの切除から生ずるヌクレオチドアデニリル（ＡＮ）の含有量の測定が、前記族の遺伝子物質のＡＴＰ、ＡＤＰ及びＡＭＰの総量が前記関係式（２）により一定である点が考慮されて、それぞれ行われることを特徴とする利用。
【請求項２】
溶解性ウィルスのＡＴＰ法が、対象物のセルロース壁の溶解により細胞外に放出されるＡＴＰの形で表されるＡＮ数に基づくことを特徴とする請求項１記載の利用。
【請求項３】
連続放出中にあるウィルスのＡＴＰ法が、対象物の細胞壁の溶解により放出されるＡＴＰの形で表される細胞内ＡＮ数に基づくことを特徴とする請求項１記載の利用。
【請求項４】
ＡＴＰ法による溶解性ウィルスの検知及び計量の方法において、
対象細胞壁の溶解により細胞外に放出されるＡＴＰの形で表されるＡＮ数の測定を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
ＡＴＰ法による連続放出中のウィルスの検知及び計量の方法において、
ＡＴＰの形で表される、対象物の同一非感染細胞とは異なる対象感染細胞の細胞内自由ＡＮの全含有量による対象細胞の細胞内自由ＡＮの測定を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
非感染対象物の細胞内ヌクレオチドアデニリル（ＡＮ）の総量が関係式（２）
（２）[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
により一定であるという点に基づく、反応式（１）
（１）ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 ＋Ｍｇ2+＋ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン＋光子
による生物発光による溶解性ウィルス株数の検知及び計量のための方法において、
（１°）試験ウィルス（Ｖ）の株が含まれ得ると同時に自由ＡＮの全く無い水性試料液（Ｅ）の準備、
（２°）前記試料（Ｅ）の対象細胞との接触、
（３°）その発達後に生ずるウィルスにより対象壁が溶解するまでの生成反応培地の培養継続、
（４°）生ずる細胞外培地の回収、並びにＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換処理、
（５°）段階（４°）から生ずる培地への最初に(i) ＡＴＰの添加無しで、次いで(ii)既知量のＡＴＰの添加後のルシフェリン及びルシフェラーゼの導入、
（６°）最初にＡＴＰの添加無しで、次いで、既知量のＡＴＰの添加後の反応式（１）による放出光の増幅信号の測定、及び
（７°）ＡＴＰの形の細胞外自由ＡＮの全含有量の決定、次いで、最初の試料（Ｅ）中の前記ウィルス（Ｖ）の株数の推定、
からなる連続する段階を含むことを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項７】
最初の試料（Ｅ）中の前記ウィルス（Ｖ）の株数の推定のため、段階（７°）において、細胞外ＡＮの全含有量が、計算図表方式により又は段階（１°）から（７°）までの段階の前記ウィルスが存在しない状態の繁殖により得られる対象細胞のものと比較して決定されることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
非感染対象細胞内のヌクレオチドアデニリル（ＡＮ）の総量が関係式（２）
（２）[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
により一定であるという点に基づく、反応式（１）
（１）ルシフェリン＋ATP＋Ｏ2 ＋Ｍｇ2+＋ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン＋光子
による生物発光を通じた非溶解性ウィルスの株数の検知及び計量のための方法において、
（１ａ°）試験ウィルス（Ｖ）の株が含まれ得るとともにＡＮの全く無い水性試料液（Ｅ）の準備、
（２ａ°）前記試料（Ｅ）の対象細胞との接触、
（３ａ°）その発達後に生ずるウィルスが対象壁を越えるまでの生成反応培地の培養継続、
（４ａ°）対象細胞の回収、生ずる細胞内培地を回収するためのこれらの溶解、次いでＡＤＰ及びＡＭＰがＡＴＰに転換されるための前記細胞内培地の処理、
（５ａ°）最初に(i) ＡＴＰの添加無しの、次いで、(ii)既知量のＡＴＰの導入後の、段階（４ａ°）から生ずる培地へのルシフェリン及びルシフェラーゼの導入、
（６ａ°）最初にＡＴＰの添加無しの、次いで、既知量のＡＴＰの導入後の、反応式（１）による放出光増幅信号の測定、
（７ａ°）最初の試料（Ｅ）中の前記ウィルス（Ｖ）の株数の推定のためのＡＴＰの形での細胞内自由ＡＮの全含有量の決定、
からなる連続した段階を含むことを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項９】
最初の試料（Ｅ）のウィルス（Ｖ）の数の推定のため、段階（７ａ°）において、細胞内全ＡＮ含有量の決定が、予め作成された計算図表方式により、又は前記ウィルスが存在しない（１ａ°）から（７ａ°）までの段階の繁殖により得られる対象細胞のものとの比較により行われることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
段階（４ａ°）において、対象細胞壁の溶解が、
(i) TrisプラスＥＤＴＡ、及び／又は、
(ii)ＤＭＳＯ
を含む水性緩衝剤の追加により、次いで対象細胞を開けるためのマイクロ波処理（約１分間）により、その後に続く急速冷却（特に冷蔵庫で）により、更に必要ならば生ずる液体培地回収用の遠心分離により、段階（３ａ°）から生ずる培地内で行われることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１１】
ＡＤＰ及びＡＭＰのＡＴＰへの転換の段階（４°）又は段階（４ａ°）がミオキナーゼ及びピルビル酸キナーゼにより行われることを特徴とする請求項６又は請求項８記載の方法。
【請求項１２】
ApoHで覆われた磁気超微粉によるウィルス又はその宿主細胞の捕捉段階を含むことを特徴とする請求項４乃至請求項１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ルシオール及び添加用ＡＴＰ、更に必要に応じてミオキナーゼ、ピルビル酸キナーゼ、ピルビル酸オルトリン酸塩ジキナーゼ、及び／又は、ApoHで覆われた磁気超微粉のルシフェリン／ルシフェラーゼ集合体を含むことを特徴とする請求項４乃至請求項１２のいずれかに記載の方法に用いる定量決定要素。
【請求項１４】
ＡＴＰ法によるウィルスの検知及び計量の方法において、
−ＤＮＡアーゼ又はＲＮＡアーゼによるＤＮＡ又はＲＮＡの切除、次いで、必要に応じてｄＡＭＰ及びｄＡＤＰの二量体からＡＭＰ及びＡＤＰの単量体への転換、
−こうして得られるＡＭＰ及びＡＤＰのＡＴＰへの転換、
−まず(i) ＡＴＰの添加無しで、次いで(ii)既知量のＡＴＰの添加後のＡＴＰのルシフェリン及びルシフェラーゼとの接触、
−ＡＴＰの添加無し、次いで既知量のＡＴＰの添加後の反応式（１）により放出される光の増幅信号の測定、及び、
−そのウィルス数の推定のためのＡＴＰの形で表される最初に結合された全ＡＮ含有量の決定
を含むことを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００８−５１６６２６（Ｐ２００８−５１６６２６Ａ）
【公表日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３７３３４（Ｐ２００７−５３７３３４）
【出願日】平成１７年１０月１９日（２００５．１０．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／００２５９６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４２９６９
【国際公開日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【出願人】（５０７１３０４４０）テストライフ テクノロジーズ (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月１９日（２００５．１０．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／００２５９６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４２９６９
【国際公開日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【出願人】（５０７１３０４４０）テストライフ テクノロジーズ (2)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]