ウイルス感染に対して抵抗性を有するニワトリの遺伝情報による選抜方法
【課題】ニワトリにおけるウイルス、特にＲＳＶ感染に対する抵抗性を評価する方法の提供。
【解決手段】少なくとも第１６番染色体上に位置するＭＨＣ−Ｂ領域にあるマイクロサテライトマーカーＬＥＩ０２５８の多型を検出、評価することを含む、ニワトリにおけるウイルス、特にＲＳＶ感染に対する抵抗性を評価する方法の提供。
【解決手段】少なくとも第１６番染色体上に位置するＭＨＣ−Ｂ領域にあるマイクロサテライトマーカーＬＥＩ０２５８の多型を検出、評価することを含む、ニワトリにおけるウイルス、特にＲＳＶ感染に対する抵抗性を評価する方法の提供。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニワトリにおけるウイルス、特にＲＳＶ感染に対する抵抗性を評価する方法およびそれを用いた当該抵抗性を有するニワトリの選抜方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリ白血病ウイルス（Ａｖｉａｎ Ｌｅｕｋｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ：以下、「ＡＬＶ」と記載する）はトリ白血病−肉腫ウイルス（ＡＬＳＶ：Ａｖｉａｎ Ｌｅｕｋｏｓｉｓ−Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ）の一種であり、肉用鶏に感染して、骨髄球（骨髄性白血球の幼若型）白血症（ｍｙｅｌｏｃｙｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｃｏｓｉｓ）、腎腫瘍（ｎｅｐｈｒｏｍａｓ）や他の腫瘍（ｔｕｍｏｒ）を発生させることが知られている。肉用鶏生産の現場では、当該ウイルスに感染してトリ白血病が発生してしまうと、鶏舎全てのニワトリの抗体価を測定し、ＡＬＶ感染しているかどうかを調べ、感染ニワトリと非感染ニワトリを分け感染鶏を処分した後、鶏舎の汚染を除くために消毒操作を行いまた、長期間汚染鶏舎を用いない等、時間的、経済的に大きな負担を生じるため問題となる。
【０００３】
このような問題を解決すべく、わが国では家畜改良センター（旧農林水産省白河種畜牧場）を中心に、１９８０年頃から約１０年間にわたりニワトリのウイルス病抵抗性に関する育種事業が行われた。
【０００４】
当該育種事業においては、ＡＬＶ感染への抵抗性（感受性）を評価するために、ＡＬＶの代わりにラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ：以下、「ＲＳＶ」と記載する）を用いた感染試験が行われた。
【０００５】
ＲＳＶはＡＬＶのシュードタイプ（Ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅ：疑似タイプ）であることが知られている。ＡＬＶとＲＳＶの遺伝子構造は、ｇａｇ（切断されてキャプシドプロテインになるポリプロテインを作る）、ｐｏｌ（逆転写酵素とウイルス遺伝子を宿主ゲノムに組み込むのに関わる酵素を作る）、ｅｎｖ（エンベロープの糖タンパクを作る）の３つの部分において同じであり、ＲＳＶにはこれらに加えｓｒｃ（ガン遺伝子）部分が含まれる。ＲＳＶはニワトリに感染後、わずか５日程度で腫瘍を発生させることができる。これらの性質によりＡＬＶ感染に対するニワトリの抵抗性（感受性）を調べる際には、ＡＬＶに代えてＲＳＶが通常用いられている（非特許文献１）。
【０００６】
ウイルス感染に対するニワトリの抵抗性には２つの種類が存在する。
【０００７】
１つは、ウイルスを細胞内に受け入れないこと、すなわち非感受性による「抵抗性」である。これは、ホスト細胞表面のウイルスレセプターの変異によるレセプタータンパク質とウイルスタンパク質との親和性の低下や、タンパク質から成るウイルスのキャプシドを開裂させるのに適した酵素を持たない等によって生ずる。
【０００８】
もう１つは、ウイルスに感染はするが、細胞性免疫および／または液性免疫の作用によりウイルス増加が抑制されることによる「抵抗性」である。当該「抵抗性」は、ウイルス感染によって生じる腫瘍の退行によって評価することができる。
【０００９】
上記家畜改良センターが行ったＲＳＶを用いた感染試験の結果から、白色レグホンの１０種類の系統（ＷＬ０１系統、ＷＬ０２系統、ＷＬ０４系統、ＷＬ０５系統、ＷＬ０６系統、ＷＬ１１系統、ＷＬ１２系統、ＷＬ１４系統、ＷＬ１５系統およびＷＬ２１系統）のうち、ＷＬ１１系統において高い割合で腫瘍の退行が観察され、ＷＬ１１系統がウイルス感染に対して抵抗性を有することが明らかにされた（非特許文献２）。
【００１０】
しかし、ＷＬ１１系統に属するニワトリの全てにおいて腫瘍の退行が観察されたわけではなく、その約５０％の個体において腫瘍退行が観察されるにとどまり、残る個体においては腫瘍退行が観察されなかった。そのため、ウイルス感染に対して抵抗性を有する個体を選抜するための手法が、当該分野において切望されていた。
【００１１】
本発明者らは、ＲＳＶ（特に、ＲＳＶ−Ａ）感染によって生じる腫瘍の退行を伴う、ウイルス感染に対する抵抗性に関連する遺伝子がどの染色体に座乗しているかを分析した。詳細には、ＷＬ１１系統と、腫瘍の退行を示さないロードアイランドレッド種の系統（以下、「ＲＹＲＹＳ」と記載する）を交配して実験家系を造成し、これに対しＲＳＶの感染試験を実施し、マクロサテライトを用いた連鎖解析を行った。
【００１２】
その結果、当該抵抗性に関連する染色体領域が第１，２，４，１６番染色体に認められ、特に第１６番染色体の有意性が最も高いことを見出し報告した（非特許文献３）。
【００１３】
本発明者らによる上記結果より、ウイルス感染に対する抵抗性が第１６番染色体に特に高い有意性を持って依存していることが理解されたが、この情報だけでは、ウイルス感染に対して抵抗性を有する個体の選抜に十分とは言えず、当該分野においては依然として、当該抵抗性を有する個体を選抜するための新たな手法が求められていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】鶏の白血病抗病性に対する育種 山田行雄 畜産技術（１９６９）７：ｐ２１７−２２１
【非特許文献２】鶏の抗病性育種事業に関する資料（１９９０）農林水産省 白河種畜牧場
【非特許文献３】Ｙ．Ｕｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００９） Ａｓｉａｎ−Ａｕｓｔ． Ｊ． Ａｎｉｍ． Ｓｃｉ． ２２（１０）：１３５９−１３６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、ニワトリにおけるウイルス、特にＲＳＶ感染に対する抵抗性を評価する方法およびそれを用いた当該抵抗性を有するニワトリの選抜方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、少なくとも第１６番染色体上に位置するＭＨＣ−Ｂ領域にあるマイクロサテライトＬＥＩ０２５８（以下、「ＬＥＩ０２５８」と記載する）の多型を検出、評価することによって、ウイルス、特にＲＳＶ感染に対して抵抗性を有するニワトリを選抜できることを見出した。さらに、上記ＬＥＩ０２５８の多型に加えて、同じく第１６番染色体上のＭＨＣ−Ｂ領域にあるＴＡＰＢＰ遺伝子の遺伝子多型を検出することによって、ＲＳＶ感染に対して抵抗性を有するニワトリを高い精度で選抜できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は以下の特徴を有する。
［１］ ニワトリにおけるウイルス感染に対する抵抗性を評価する方法であって、第１６番染色体上に位置するＭＨＣ−Ｂ領域にあるマイクロサテライトＬＥＩ０２５８の多型を検出し評価することを含む、上記方法。
［２］ ウイルスがラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）である、［１］の方法。
［３］ ウイルスがトリＲＳＶ−Ｊである、［２］の方法。
［４］ マイクロサテライトＬＥＩ０２５８の塩基長が４４３ｂｐである場合に、ウイルス感染に対する抵抗性を有すると判断する、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［５］ さらに、第１６番染色体上に位置するＭＨＣ−Ｂ領域にあるＢｌｅｃ２遺伝子、ＴＡＰＢＰ（ＴＡＰ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子、ＢＬＢ２遺伝子、ＤＭＢ１遺伝子およびＴＡＰ２遺伝子からなる群から選択される１または複数の遺伝子の遺伝子多型を検出し評価することを含む、［１］〜［４］のいずれかの方法。
［６］ ＴＡＰＢＰ（ＴＡＰ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子の遺伝子多型を検出し評価する、［５］の方法。
［７］ ＴＡＰＢＰ（ＴＡＰ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子のアミノ酸コード配列において９４４番目のヌクレオチドがアデニンである場合に、ウイルス感染に対する抵抗性を有すると判断する、［６］の方法。
［８］ ［１］〜［７］のいずれかの方法を用いる、ウイルス感染に対して抵抗性を有するニワトリを選抜する方法。
［９］ ［１］〜［８］のいずれかの方法において、マイクロサテライトＬＥＩ０２５８をＰＣＲ反応によって増幅するためのプライマーを含む、ニワトリにおけるウイルス感染に対する抵抗性を評価するための試薬キット。
［１０］ さらに、ＴＡＰＢＰ遺伝子の遺伝子多型を検出するためのプライマーまたはオリゴヌクレオチドを含む、［９］の試薬キット。
【発明の効果】
【００１８】
本発明を用いることにより、ニワトリにおけるウイルス、特にＲＳＶ感染に対する抵抗性を評価することが可能となり、当該抵抗性を有するニワトリを選抜することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、第１６番染色体上に位置するＭＨＣ−Ｂ領域にあるＬＥＩ０２５８および本発明者らによって当該領域中に見いだされた３５カ所の単塩基変異（ＳＮＰ）の位置を示す。
【図２】図２は、ＰＣＲ反応によって増幅した、ＷＬ１１系統における各ハプロタイプ（ＷＬＡ，ＷＬＢ，ＷＬＣ，ＲＩＲａ，ＲＩＲｂ，ＲＩＲｃ）におけるＬＥＩ０２５８の電気泳動像図である。各レーンはそれぞれ以下のサンプルを示す。Ｌ：１００ｂｐ〜１，０００ｂｐラダー（マーカー），１：ＷＬＡホモ（４４３ｂｐホモ），２：ＷＬＢホモ（２６０ｂｐホモ），３：ＲＩＲａホモ（３１０ｂｐホモ），４：ＲＩＲｂホモ（３１０ｂｐホモ），５：ＲＩＲｃホモ（３５７ｂｐホモ），６：ＷＬＢ，ＲＩＲａヘテロ（２６０ｂｐ／３１０ｂｐ），７：ＷＬＡ，ＷＬＢヘテロ（２６０ｂｐ／４４３ｂｐ），８：ＷＬＡ，ＲＩＲａヘテロ（３１０ｂｐ／４４３ｂｐ），９：ＷＬＡ，ＲＩＲｃヘテロ（３５７ｂｐ／４４３ｂｐ），１０：ＷＬＢ，ＲＩＲａヘテロ（２６０ｂｐ／３１０ｂｐ），１１：ＷＬＡ，ＲＩＲｃヘテロ（３５７ｂｐ／４４３ｂｐ），１２ＷＬＡホモ（４４３ｂｐホモ）。
【図３−１】図３−１は、４つのハプロタイプＲＪＦ，Ｂ６，Ｂ２４，ＲＩＲａのＭＨＣ−Ｂ領域に存在する遺伝子の方向、ＣＤＳの長さ、アミノ酸の数とＷＬＡハプロタイプを基準としたときの同義単塩基置換および非同義単塩基置換の数を示す。
【図３−２】（図３−１の続き）
【図４−１】図４−１は、５つの異なるＭＨＣ−Ｂハプロタイプに存在するＴＡＰＢＰ遺伝子の塩基配列を示す。塩基配列中、四角で囲まれたヌクレオチドは、同義置換を示し、下線で示されたヌクレオチドは非同義置換を示す。
【図４−２】（図４−１の続き）
【図４−３】（図４−２の続き）
【図４−４】（図４−３の続き）
【図４−５】（図４−４の続き）
【図４−６】（図４−５の続き）
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、ニワトリにおけるウイルス感染に対する抵抗性を評価する方法を提供する。
【００２１】
本発明において、「ウイルス」にはトリ白血病ウイルス（Ａｖｉａｎ Ｌｅｕｋｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ：以下、「ＡＬＶ」と記載する）およびラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ：以下、「ＲＳＶ」と記載する）が含まれる。ＡＬＶもＲＳＶもガンウイルスであり、そのキャプシド構造の違いから、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩおよびＪの１０の型に分類される（Ｐａｙｎｅ Ｌ．Ｎ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ７３：２９９５−２９７７）。好ましくは、本発明における「ウイルス」は、ＲＳＶであり、さらに好ましくはＲＳＶ−Ｊである。
【００２２】
本発明において、「ウイルス感染に対する抵抗性」とは、ウイルスに感染はするが、細胞性免疫および／または液性免疫の作用によりウイルス増加が抑制されることを意味する。本発明において、当該「抵抗性」は、ウイルス感染、好ましくはＲＳＶの感染、さらに好ましくはＲＳＶ−Ｊの感染、によって生じる腫瘍の退行によって評価することができる。「腫瘍の退行」とは、ニワトリにおいてウイルス感染によって生じた腫瘍が、２０〜４５日程度の間に縮小または消失することを意味する。したがって、本明細書においては、「ウイルス感染に対する抵抗性」を、「腫瘍の退行」や「腫瘍退行能」といった用語で表現される場合があるが、これらの用語は全て相互互換的に用いられる。
【００２３】
本発明において、「ニワトリ」は特に限定されない。好ましくはＷＬ１１系統またはＷＬ１１系統に由来するニワトリである。「ＷＬ１１系統に由来するニワトリ」とは、ＷＬ１１系統との交配により得られたニワトリ（Ｆ１世代）に限定されることなく、Ｆ２、Ｆ３世代など（特にこれらに限定されない）後の世代のニワトリおよびこれらのニワトリと交配して得られたニワトリも含まれる。
【００２４】
本発明において、ウイルス感染に対する抵抗性の評価はニワトリの遺伝子情報に基づいて行うことができる。すなわち、ニワトリＤＮＡを含む試料において、少なくとも第１６番染色体上に位置するＭＨＣ−Ｂ領域にあるマイクロサテライトマーカーＬＥＩ０２５８の多型を検出、評価することによって行うことができる。
【００２５】
本発明において用いられる「ニワトリＤＮＡを含む試料」は、ニワトリから単離されたあらゆる細胞（生殖細胞を除く）、組織、臓器などを材料として調製される。好ましくは、末梢血（白血球や単核球）より調製することができる。
【００２６】
本明細書中において、「遺伝子多型」には、いわゆる単一ヌクレオチド多型（１塩基多型：ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：以下、「ＳＮＰ」と記載する）、および連続した複数ヌクレオチドにわたる多型、の両方を含むものとする。すなわち、集団において、ある一個体のゲノム配列を基準として、他の１または複数の個体ゲノム中の特定部位に、１または複数ヌクレオチドの置換、欠失、挿入、転位、逆位等の変異が存在するとき、その変異が当該１または複数の個体に生じた突然変異でないことが統計的に確実か、または当該個体内突然変異でなく、１％以上の頻度で集団内に存在することが家系的に証明される場合、その変異を「遺伝子多型」とする。
【００２７】
ＬＥＩ０２５８は、第１６番染色体上に位置するＭＨＣ−Ｂ領域にあるマイクロサテライトとして公知であり、従来的にニワトリのＭＨＣ領域におけるハプロタイプを決定するために利用されている（Ｆｕｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５８：４０７−４２１（２００６））。ＬＥＩ０２５８の塩基配列は、例えば、ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｓ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎｉｍ． Ｇｅｎｅｔ． ３０ （３），１８３−１８９（１９９９）に記載されている。
【００２８】
下記実施例にて詳細に記載するように、当該ＬＥＩ０２５８の多型を利用して、ＭＨＣ−Ｂ領域のハプロタイプ（以下、「ＭＨＣ−Ｂハプロタイプ」と記載する）を分析することによって、５０％の個体が腫瘍退行能を示すＷＬ１１系統において、３種類のＭＨＣ−Ｂハプロタイプ、すなわち、腫瘍退行能に有意に関連するハプロタイプ（以下、「ＷＬＡ」と記載する）および腫瘍退行能に有意に関係しない２つのハプロタイプ（以下、「ＷＬＢ」および「ＷＬＣ」と記載する）を決定することができる。また、ＬＥＩ０２５８の多型を利用して、腫瘍が進行するロードアイランドレッドのＲＩＲＹＳ系統において３種類のＭＨＣ−Ｂハプロタイプ、すなわち、腫瘍進行が高いハプロタイプ（以下、「ＲＩＲａ」、「ＲＩＲｂ」と記載する）および腫瘍進行に有意に関係しないハプロタイプ（「ＲＩＲｃ」と記載する）を決定することができる。
【００２９】
ＭＨＣ−Ｂハプロタイプと腫瘍退行能との間には相関関係が見られ、ＷＬＡをホモに持つニワトリは９０〜１００％の確率で腫瘍退行能を有する。またＷＬＡをヘテロで有するニワトリは、一方の対立遺伝子がＲＩＲａでなければ、８０〜９０％の確率で腫瘍退行能を有する。
【００３０】
したがって、ＬＥＩ０２５８の多型を検出し、ニワトリにおけるＭＨＣ−Ｂハプロタイプを決定することによって、詳細にはＷＬＡの存在の有無を検出することによって、当該ニワトリのウイルス感染に対する抵抗性を評価することができる。
【００３１】
ＬＥＩ０２５８の多型は、塩基長を測定することによって検出することができる。例えば、ＬＥＩ０２５８の多型として、２６１ｂｐ、２９５ｂｐ、３０７ｂｐ、３０９ｂｐ、３１０ｂｐ、３２１ｂｐ、３３３ｂｐ、３４５ｂｐ、３５７ｂｐ、３６７ｂｐ、３６９ｂｐ、３８１ｂｐ、３９３ｂｐ、４０８ｂｐ、４２０ｂｐまたは４４３ｂｐの塩基長を有するものが公知である（Ｆｕｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）上掲）。
【００３２】
ＬＥＩ０２５８の塩基長と上記ＭＨＣ−Ｂハプロタイプの関係を以下に示す。
【００３３】
【００３４】
ＷＬＡにおけるＬＥＩ０２５８の塩基長のみが４４３ｂｐであるために、当該塩基長に基づいて、他のＭＨＣ−Ｂハプロタイプと区別することが可能である。
【００３５】
ＬＥＩ０２５８の塩基長の測定は、当業者に公知である一般的な手法によって行うことが可能であり、例えば、ＰＣＲ法を用いて行うことができる。
【００３６】
本発明方法はさらに、上記ＬＥＩ０２５８の多型の検出に加えて、ＬＥＩ０２５８と同じくＭＨＣ−Ｂ領域に存在する、Ｂｌｅｃ２遺伝子、ＴＡＰＢＰ遺伝子、ＢＬＢ２遺伝子、ＤＭＢ１遺伝子およびＴＡＰ２遺伝子からなる群から選択される１または複数の遺伝子の遺伝子多型を検出、評価する工程を包含する。ＬＥＩ０２５８の多型に加えて、上記遺伝子の遺伝子多型を検出することによって、ＷＬＡを高い精度で選抜することができる。
【００３７】
従来的に、ニワトリのＭＨＣ−Ｂハプロタイプを決定するためにＢＦ２遺伝子の遺伝子多型の検出、評価が行われており、ＢＦ２遺伝子の遺伝子多型に基づいて、非常に多くのハプロタイプ（Ｂ１−２４）が検出、同定されている（Ｌｉｖａｎｔ Ｅ． Ｊ． ａｎｄ Ｓ． Ｊ． Ｅｄｗａｒｄ（２００５）Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｎｅｔ． ３６：４３２−４３４．）。
【００３８】
このうちＢ６と称されるハプロタイプは、ＷＬＡにおけるＭＨＣ−Ｂ領域と同一の塩基配列を有するものではないが、上記ＬＥＩ０２５８の塩基長は４４３ｂｐであり、ＷＬＡにおけるＬＥＩ０２５８のサイズと同一である。このため、ＬＥＩ０２５８の塩基長のみではＷＬＡをＢ６と区別することができない。
【００３９】
下記実施例にて詳述するように、Ｂｌｅｃ２遺伝子、ＴＡＰＢＰ遺伝子、ＢＬＢ２遺伝子、ＤＭＢ１遺伝子およびＴＡＰ２遺伝子の遺伝子多型は、少なくともＷＬＡとＢ６との間で異なっており、ＷＬＡとＢ６におけるＢｌｅｃ２遺伝子、ＴＡＰＢＰ遺伝子、ＢＬＢ２遺伝子、ＤＭＢ１遺伝子およびＴＡＰ２遺伝子からなる群から選択される１または複数の遺伝子の遺伝子多型を検出、評価することによって、両者を識別することができる。Ｂｌｅｃ２遺伝子、ＴＡＰＢＰ遺伝子、ＢＬＢ２遺伝子、ＤＭＢ１遺伝子およびＴＡＰ２遺伝子は公知であり、それぞれＧｅｎＢａｎｋにＢＡＧ６９３１８．１、ＢＡＧ６９３２１、ＢＡＧ６９３２０、ＢＡＧ６９３２５およびＢＡＧ６９３２９として登録されており、これらの遺伝子情報を利用することができる。また、各遺伝子の塩基配列は、例えば、Ｈｏｓｏｍｉｃｈｉ，Ｋ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８１ （５）， ３３９３−３３９９ （２００８）に開示されている。
【００４０】
好ましくは、ＴＡＰＢＰ遺伝子の遺伝子多型を検出、評価する。
【００４１】
ＴＡＰＢＰ遺伝子の遺伝子多型は配列番号２〜６によって表わされるＴＡＰＢＰ遺伝子の塩基配列において９４４番目のヌクレオチドに存在する。当該ＴＡＰＢＰ遺伝子の遺伝子多型は、ＷＬＡとＢ６の間で異なっている。すなわち、ＷＬＡのＴＡＰＢＰ遺伝子においては９４４番目のヌクレオチドがアデニン（配列番号２）であるのに対して、Ｂ６では９４４番目のヌクレオチドがグアニンである（配列番号４）。
【００４２】
したがって、ＴＡＰＢＰ遺伝子の遺伝子多型を検出、評価することによって、ＷＬＡとＢ６を区別することができる。
【００４３】
ＴＡＰＢＰ遺伝子の遺伝子多型を検出、評価する方法は、当業者に公知である一般的な手法によって行うことが可能である。例えば、最も直接的な方法である標的領域の塩基配列決定法（シークエンス法）や、特定位置の塩基置換だけを検出する目的の場合に有効な、２０塩基程度の合成オリゴヌクレオチドと標的塩基配列とのハイブリッド形成の有無を利用したアレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法（ＭＡＳＡ法）、標準ＲＮＡプローブと標準ＤＮＡ断片とのハイブリッドをリボヌクレアーゼＡで処理しミスマッチ位置でのプローブＲＮＡの切断で塩基置換の存在とおよその位置を知るリボヌクレアーゼＡミスマッチ切断法（ＲＮａｓｅプロテクション法）や、ＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅する際に、その一端にＧＣに富んだ塩基配列（ＧＣクランプ）をつけて変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ）を行い一塩基置換を検出する方法（ＰＣＲ‐ＤＧＧＥ法）を用いることができる。
【００４４】
また、２本鎖ＤＮＡ断片を１本鎖に解離し、その塩基配列に依存した独自の高次構造をポリアクリルアミドゲル電気泳動することにより、一塩基置換を移動度の差として検出する方法（ＰＣＲ‐ＳＳＣＰ法）や、塩基配列特異的プローブ（ＳＳＯＰ）を用いたハイブリダイゼーション法（ＰＣＲ‐ＳＳＯＰ法）や、その変法（ＰＣＲ‐ＲＤ法やＰＣＲ‐ＭＰＨ法）や、ある領域をＰＣＲ法などで増幅した後、点突然変異が生じた部位を切断部位と認識する制限酵素で処理して点突然変異を生じなかったＤＮＡとはサイズの違ったアリルとして検出するＰＣＲ‐ＲＦＬＰ法（特開平５−３０８９９９号公報）や、標的ＤＮＡの３’末端のヌクレオチド部位に隣接する核酸配列に対して検出プライマーをアニールすることと、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、検出するヌクレオチドに対して相補性の、シングルラベルのヌクレオチド三リン酸でかかるプライマーを伸長する方法（ミニシークエンシング法）等も用いることができる。
【００４５】
また、ＴａｑＭａｎＰＣＲ法、インベーダー法等種々の公知のＳＮＰタイピング法によっても検出することができる。
【００４６】
一塩基の変異を検出できる方法であれば、上記の方法に限定されることなく、本発明に用いることができる。
【００４７】
本発明方法を用いて、ニワトリにおけるウイルス感染に対する抵抗性を評価することによって、ウイルス感染に対して抵抗性を有するニワトリを選抜することが可能である。すなわち、本発明方法を用いて、ＷＬＡをホモまたはヘテロ（ただし、一方の対立遺伝子がＲＩＲａではない）で有するニワトリをウイルス感染に対して抵抗性を有するものとして選抜する。
【００４８】
本発明はまた、上記ＬＥＩ０２５８の多型の検出方法およびＴＡＰＢＰ遺伝子の遺伝子多型の検出方法に用いるためのプライマーを提供する。
【００４９】
ＬＥＩ０２５８の多型を検出するためのプライマー対は、ニワトリのゲノム配列上、少なくともＬＥＩ０２５８を挟み込むように設計されたプライマーであることが必要である。ここで、「挟み込む」とは、フォワード（順向）プライマーおよびリバース（逆向）プライマーからなるプライマー対によって増幅されるＤＮＡ断片の塩基配列中に標的遺伝子の塩基配列含むことをいう。当該プライマーは、通常、１０ｍｅｒ〜１００ｍｅｒであり、好ましくは１５ｍｅｒ〜４０ｍｅｒ、更に好ましくは１８ｍｅｒ〜３０ｍｅｒである。また、当該プライマーによって増幅されるＤＮＡ領域は、ＷＬＡと他のハプロタイプのＬＥＩ０２５８の塩基長が区別できる限り、特に限定されないが、好ましくは増幅されるＤＮＡ断片の長さは、１００ｂｐ〜１，５００ｂｐ、好ましくは２００ｂｐ〜７００ｂｐである。
【００５０】
好ましくは、ＬＥＩ０２５８の塩基長を検出するためのプライマーは、好ましくは遺伝子多型において共通の塩基配列に基づいて設計することができ、当業者であればＬＥＩ０２５８の塩基配列に基づいて、このようなプライマーを容易に設計することができる。ＬＥＩ０２５８の塩基長を検出するためのプライマーとして、例えば、配列番号７および８で表される塩基配列を含むプライマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
また、ＴＡＰＢＰ遺伝子の遺伝子多型を検出するためのプライマー対はＴＡＰＢＰ遺伝子をコードするＤＮＡまたはその相補鎖にハイブリダイズし、かつ、標的多型部位（ＷＬＡおよびＢ６のＴＡＰＢＰ遺伝子の塩基配列をそれぞれ表わす配列番号２または配列番号４における９４４番目のヌクレオチド）を挟み込むように設計されたプライマーであることが必要である。「挟み込む」とは、上に定義されるとおりである。当該プライマーは、通常、１０ｍｅｒ〜１００ｍｅｒであり、好ましくは１５ｍｅｒ〜４０ｍｅｒ、更に好ましくは１８ｍｅｒ〜３０ｍｅｒである。また、当該プライマーによって増幅されるＤＮＡ領域の長さは、５０ｂｐ〜５，０００ｂｐ、好ましくは１００ｂｐ〜１，５００ｂｐ、更に好ましくは２００ｂｐ〜７００ｂｐである。
【００５２】
ＴＡＰＢＰ遺伝子の遺伝子多型を検出するためのプライマーは、好ましくは遺伝子多型において共通の塩基配列に基づいて設計することができ、当業者であればＴＡＰＢＰ遺伝子の塩基配列に基づいて、このようなプライマーを容易に設計することができる。ＴＡＰＢＰ遺伝子の遺伝子多型を検出するためのプライマーとして、例えば、配列番号１１および１２で表される塩基配列を含むプライマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
これらプライマーによって挟まれる領域内に、さらに別のプライマーまたはプライマー対を設計することができる。このような第二のプライマーは、配列決定などにおいて用いることができる。このような第二のプライマーは、例えば、配列番号１３で表されるが、これらに限定されない。
【００５４】
尚、プライマーの鋳型ＤＮＡへのハイブリダイゼーションは、当分野において通常用いられる条件下で行うことができる。プライマーは、相補的な塩基対結合を形成できること、そしてその３’末端において相補鎖合成の起点となる−ＯＨ基を与えることの２つの条件を満たしている限り、プライマーを構成する主鎖はホスホジエステル結合によるもの（例えばＤＮＡ）に限定されない。例えばリン（Ｐ）ではなく硫黄（Ｓ）をバックボーンとしたホスホチオエート体や、ペプチド結合に基づくペプチド核酸からなるものであることもできる。また、塩基は、相補的な塩基対結合を可能とするものであれば良い。天然においては、アデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシルの５種類により構成されるが、例えばブロモデオキシウリジン等の類似体であることもできる。
【００５５】
本発明はまた、上記ＴＡＰＢＰ遺伝子の遺伝子多型の検出方法に用いられるオリゴヌクレオチドを提供する。このようなオリゴヌクレオチドは、好ましくは、上記ＴＡＰＢＰ遺伝子の多型部位を含む領域に特異的にハイブリダイズするものである。ここで、「特異的」とは、上記ＴＡＰＢＰ遺伝子の多型部位を含む領域にハイブリダイズし、他の領域にハイブリダイズしないことを意味する。このようなハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件として、例えば低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳである。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては、温度や塩濃度等の複数の要素があり、当業者はこれらの要素を適宜選択することで、同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００５６】
本発明におけるオリゴヌクレオチドは、上記多型部位を含むＤＮＡ領域にハイブリダイズする限り、その鎖長に特に制限はないが、好ましくは１０ｍｅｒ〜２００ｍｅｒであり、より好ましくは１５ｍｅｒ〜１００ｍｅｒであり、更に好ましくは１５ｍｅｒ〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。
【００５７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、前記多型を検出するためのプローブとして、および前記多型を含むＤＮＡを精製するための吸着リガンドとして利用することができる。
【００５８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、固相に固定されていても良い。このような固相の材料としては、例えば、セルロース、ニトロセルロースなどのセルロース誘導体、セファロース、アガロース、金属、ガラス、セラミック、樹脂など（これらに限定されない）が挙げられる。固相の形状および材質は特に限定されるものではない。
【００５９】
上記のプライマーおよび／またはオリゴヌクレオチドは、ニワトリのウイルス感染に対する抵抗性を評価するための検査試薬として使用することができる。さらに、これらの試薬をパッケージングし、キットとして供給することも可能である。
【００６０】
尚、上記プライマー及びプローブは、当該技術分野で公知の方法によって製造することができ、例えば、ＤＮＡプライマー及びＤＮＡプローブは、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法またはこれらの自動化された方法等を利用して、簡便にはＤＮＡ自動合成機等を利用して本発明で開示する塩基配列に従って合成することができる。
【００６１】
以下、本発明を実施例を挙げて更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６２】
実施例１：ＭＨＣ−Ｂハプロタイプの決定
ＭＨＣ−Ｂ領域にあるマイクロサテライトマーカーＬＥＩ０２５８の多型、ＢＦ２の遺伝子多型および、本願発明者らがＭＨＣ−Ｂ領域に見いだした３５カ所のＳＮＰのタイプ（図１）から、腫瘍退行能を持つと考えられるＷＬ１１系統と腫瘍が進行するロードアイランドレッドのＲＩＲＹＳ系統におけるＭＨＣ−Ｂハプロタイプを決定した。また、ＲＳＶーＪの感染試験を実施し、各ＭＨＣ−ＢハプロタイプとＲＳＶ−Ｊ感染由来の腫瘍に対する退行能との関係を明らかにした（Ｋ．Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８９：６５１−６５７（２０１０））。
【００６３】
ＷＬ１１系統の個体（ｎ＝３００）とＲＩＲＹＳ系統の個体（ｎ＝２００）（いずれも独立行政法人家畜改良センターにて繋養）より、ベノジェクトＩＩＥＤＴＡ真空採血管（ＴＥＲＭＯ， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）または等量の２％Ｗ／Ｖクエン酸ナトリウムで採血し、以下の３種のうちいずれかの方法でＤＮＡを抽出・精製した。
１．血液５０μｌを、１×ＰＢＳ（−）（ＧＩＢＣＯ，ＵＳＡ）で２ｍｌに希釈し、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ ＤＮＡ ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ ｋｉｔ Ｌ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ， Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）でＤＮＡを抽出・精製した。
２．血液５μｌを１×ＰＢＳ（−）で２００μｌに希釈し、ＱＩＡｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ， Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）でＤＮＡを抽出・精製した。
３．羽毛の根元０．５ｍｇ以内を細かく裁断し、ＤＮＡエクストラクターＦＭキット（Ｗａｋｏ， Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）でＤＮＡを抽出・精製した。
【００６４】
なお、いずれの手法を用いてＤＮＡを調製したとしても、以下の実験に何ら影響しない。
【００６５】
各個体より得られたＤＮＡを用いて、ＬＥＩ０２５８およびＢＦ２の遺伝子多型をそれぞれ以下のプライマーを用いたＰＣＲ法によって決定した。
【００６６】
ＬＥＩ０２５８増幅用プライマー
フォワードプライマー：５’−ＣＡＣＧＣＡＧＣＡＧＡＡＣＴＴＧＧＴＡＡＧＧ−３’（配列番号７）
リバースプライマー ：５’−ＡＧＣＴＧＴＧＣＴＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＴＧＣ−３’（配列番号８）
ＢＦ２増幅用プライマー
フォワードプライマー：５’−ＧＣＡＧＡＧＣＴＣＣＡＴＡＣＣＣＴＧＣＧＧＴＡ−３’（配列番号９）
リバースプライマー ：５’−ＧＣＣＧＧＴＣＴＧＧＴＴＧＴＡＧＣＧＣＣＧ−３’（配列番号１０）
【００６７】
ＰＣＲ反応は以下の組成で行なった。２０μｌの容量において、１０−２０ｎｇ ＤＮＡ／５ｐｍｏｌ 各プライマー／０．２ｍＭ ｄＮＴＰ／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ［ｐＨ８．３］／５０ｍＭ ＫＣｌ／１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２／０．２Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ−Ｇｏｌｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）。
【００６８】
反応条件は、９４度１０分、その後９４度３０秒、６０度３０秒、７２度３０秒を４０サイクルで行なった。
【００６９】
反応終了後、各サンプルを２％ｗ／ｖアガロースを用いて電気泳動し、ＤＮＡサイズマーカーからＰＣＲ産物のサイズを算出した。なお、ＢＦ２のタイプの決定は、公知の手法（Ｌｉｖａｎｔ Ｅ． Ｊ． ａｎｄ Ｓ． Ｊ． Ｅｄｗａｒｄ（２００５）上掲）に基づいて行った。
【００７０】
また、上記３５カ所のＳＮＰのタイプについては、公知の手法（ＯｋａｍｕｒａＮ． ｅｔ ａｌ． Ａｎｉｍ． Ｓｃｉ． Ｊ． ７９：３０３−３１３（２００８））に基づいてマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析によって決定した。
【００７１】
ＲＳＶ−Ｊの感染試験は、ＲＳＶ−Ｊ（ＨＰＲＳ−１０３；Ｐａｙｎｅ ｅｔ ａｌ， Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８０１−８０７（１９９２））を３週齢のニワトリの翼芽に皮下接種し、その後７，１０，１４，２８および４２日目に各腫瘍のサイズを計測した。
【００７２】
結果、ＷＬ１１系統においては３種類（ＷＬＡ、ＷＬＢ、ＷＬＣと称呼）、およびＲＩＲＹＳ系統においては３種類（ＲＩＲａ、ＲＩＲｂ、ＲＩＲｃと称呼）のハプロタイプの存在が明らかとなり、各ハプロタイプとＲＳＶ−Ｊ感染由来の腫瘍に対する退行能の関係も明らかとなった。
【００７３】
ＬＥＩ０２５８およびＢＦ２のタイプならびに各ハプロタイプを有する個体のＲＳＶ−Ｊ感染による腫瘍に対する退行能を以下の表１に示す。
【００７４】
【表１】
【００７５】
この結果より、ＭＨＣ−Ｂハプロタイプのうち、ＬＥＩ０２５８の塩基長が４４３ｂｐとして特徴付けられるＷＬＡが、ＲＳＶ−Ｊ感染による腫瘍に対する退行能と有意に関連することが明らかとなった。
【００７６】
実施例２：ＭＨＣ−Ｂハプロタイプの組み合わせによる腫瘍進行能への影響
ＭＨＣ−Ｂハプロタイプの組み合わせによる腫瘍進行能への影響を調べるために、ＷＬ１１系統と、ＲＹＲＹ系統を交配して実験家系を造成し、これに対しＲＳＶ−Ｊの感染試験を実施した。
【００７７】
ＷＬ１１系統雄３羽とＲＹＲＹ系統雌７羽の交配からＦ１世代雌雄計２３羽を生産し、Ｆ１雌雄の交配によりＦ２世代雌雄計９１羽を生産した。さらに、Ｆ２世代よりＷＬＡホモ接合体およびＲＩＲａホモ接合体の雌雄を選択・交配してＦ３世代雌雄計２８羽を生産した。
【００７８】
ＲＳＶ−Ｊの感染試験は、上記実施例１と同様に行った。
【００７９】
Ｆ２世代の複数の個体より、上記実施例１に記載の方法と同様にＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡを用いて、上記実施例１と同様に各個体のＬＥＩ０２５８の塩基長をＰＣＲ法によって検出し、上記表１の結果に基づいて各個体におけるＭＨＣ−Ｂハプロタイプの組み合わせを決定した。
【００８０】
結果を図２に示す。ＬＥＩ０２５８の塩基長をＰＣＲ法によって検出することによって、各個体におけるＭＨＣ−Ｂハプロタイプの組み合わせ（特にＷＬＡの存在の有無）を容易に決定することができる。
【００８１】
実験家系のＦ２世代及びＦ３世代に認められたＭＨＣ−Ｂハプロタイプの組み合わせとＲＳＶ−Ｊ感染によって生じる腫瘍の退行との関係を以下の表２に示す。
【００８２】
【表２】
【００８３】
この結果より、ＷＬＡをホモに持つニワトリのほぼ１００％が、ＲＳＶ−Ｊ感染によって生じる腫瘍に対する退行能を示すことが明らかとなった。また、ＷＬＡをヘテロに持つニワトリであっても、もう一つの対立遺伝子がＲＩＲａでないならば８５％程度の個体がＲＳＶ−Ｊ感染によって生じる腫瘍に対する退行能を示すことが明らかとなった。さらに、ＲＩＲａをホモに持つニワトリのほぼ９０％は死亡に至る程度の大きな腫瘍を形成することが明らかとなった。
【００８４】
この結果より、ＷＬＡおよびＲＩＲａを指標として、ニワトリにおけるＲＳＶ−Ｊ感染によって生じる腫瘍に対する退行能を評価できることが明らかとなった。
【００８５】
実施例３：ＷＬＡおよびＢ６ハプロタイプの識別
ＬＥＩ０２５８の塩基長に基づいて、ＭＨＣ−Ｂハプロタイプを分類した場合、ＷＬＡとＢＦ２のハプロタイプの一種であるＢ６は共に４４３ｂｐのＬＥＩ０２５８が検出されるために、両者を区別することができない。また、本願発明者らがＭＨＣ−Ｂ領域に見いだした３５カ所のＳＮＰのタイプ（図１）についても両者の間で違いが見られなかった。
【００８６】
Ｂ６についてはこれまでに、ウイルス感染によって生じる腫瘍に対する退行能に影響するか否か明らかにされていないが、Ｂ６に相当するＢ１を持つ系統はＲＳＶ−Ｂ由来の腫瘍を進行させる割合が低いことが報告されている（Ｓｃｈｉｅｒｍａｎ，Ｌ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．（１９７７） Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５， ３２５−３３２）。そこで、ＷＬＡとＢ６を識別することによって、ＷＬＡを高い精度で検出することができ、結果としてニワトリにおけるＲＳＶ−Ｊ感染によって生じる腫瘍に対する退行能を高い精度で評価できると考え、両者を識別できる遺伝子マーカーを探索した。
【００８７】
ＷＬＡをホモに持つニワトリ個体のゲノムＤＮＡから、ＢＡＣライブラリーを構築し、ＷＬＡとＲＩＲａについて、ＭＨＣ−Ｂ領域を含む１６７，４６４ｂｐの領域の塩基配列を決定した。そして、ＷＬＡの塩基配列と、ＲＩＲａ、ＲＪＦ（Ｒｅｄ Ｊｕｎｇｌｅ Ｆｏｗｌ）（世界家畜辞典：監修 正田陽一 東洋書林発行ｐ．３４４−３４５（２００６））、Ｂ６およびＢ２４の塩基配列を比較した。
【００８８】
結果を図３−１〜２に示す。
【００８９】
ＷＬＡとＢ６間の比較については、Ｂ６において既に遺伝子情報が明らかにされている１４の遺伝子（ＢＧ１、Ｂｌｅｃ２、Ｂｌｅｃ１、ＢＬＢ１、ＴＡＰＢＰ、ＢＬＢ２、ＢＲＤ２、ＤＭＡ１、ＤＭＢ１、ＤＭＡ２、ＢＦ１、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＢＦ２）のアミノ酸コード配列（ＣＤＳ）の比較を行った。
【００９０】
その結果、Ｂｌｅｃ２遺伝子に同義置換１カ所および非同義置換１カ所（１−１と略記 以下同順）、ＴＡＰＢＰ遺伝子（１−１）、ＢＬＢ２遺伝子（２２−１９）、ＤＭＢ１遺伝子（２−１）、ＴＡＰ２遺伝子（１−０）の計４９カ所のＳＮＰが、ＷＬＡとＢ６の間で異なることが認められた（図３−１〜２）。
【００９１】
このことから、ＷＬＡとＢ６のＭＨＣ−Ｂ領域は同一ではないことが明らかとなった。
【００９２】
上記１４の遺伝子のＣＤＳの中にＷＬＡとＢ６と間で異なるＳＮＰは４９カ所あったが、両者の識別を可能とする遺伝子マーカーとしては、両者を同様に増幅することが出来るなど検出の容易性からＳＮＰの数が少ない遺伝子が好ましい。この点を考慮すると、ＷＬＡとＢ６との間で遺伝子１つ当たり１カ所の非同義置換ＳＮＰを持つＢｌｅｃ２遺伝子およびＴＡＰＢＰ（ＴＡＰ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子が遺伝子マーカーとして利用可能である。
【００９３】
Ｂｌｅｃ２遺伝子は、ＷＬＡとＢ２４およびＲＩＲａとの間でそれぞれ３９カ所のＳＮＰを有するため、３者を同様に増幅することが出来るなど検出の容易性から、これらの間でより少ないＳＮＰ（それぞれ３カ所、１カ所）を持つＴＡＰＢＰ遺伝子が目的の遺伝子マーカーとして有効であると判断される。
【００９４】
ＷＬＡ、ＲＩＲａ、ＲＪＦ、Ｂ６およびＢ２４におけるＴＡＰＢＰ遺伝子のアミノ酸コード領域における塩基配列の比較結果を図４−１〜６に示す。
【００９５】
ＴＡＰＢＰ遺伝子において、ＷＬＡとＢ６の間で１カ所存在するＳＮＰの位置は、９４４番目のヌクレオチドであり、ＷＬＡではアデニン（コドンはＣＡＣ，アミノ酸はＨ：ヒスチジン）、Ｂ６ではグアニン（コドンはＣＧＣ，アミノ酸はＲ：アルギニン）となっている。
【００９６】
したがって、ＴＡＰＢＰ遺伝子中に存在する当該ＳＮＰを検出・評価することによって、ＷＬＡとＢ６を識別することができる。
【００９７】
上記ＳＮＰの検出は、各個体におけるＴＡＰＢＰ遺伝子の９４４番目のヌクレオチドを含む領域を配列決定することによって行った。
【００９８】
ニワトリ個体のゲノムＤＮＡおよび以下のＴＡＰＢＰ遺伝子増幅用プライマー：フォワードプライマー：５’−ＡＴＧＡＧＧＧＣＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣ−３’（配列番号１１）
リバースプライマー：５’−ＴＴＧＧＧＡＣＡＴＡＧＴＧＡＣＡＴＴＧＣＴＣ−３’（配列番号１２）
を用いて、実施例１と同様にＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ産物をＰｒｅ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＵＳＢ， ＵＳＡ）で処理し、２μｌをＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｋｉｔ ｖ．３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ， ＵＳＡ）および
配列決定用プライマー：５’−ＧＧＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＡＴＴＣＣＴＡＴ−３’（配列番号１３）を用いて配列を決定した。ＳＮＰの位置のヌクレオチドがアデニンであるか否かを評価して、ＷＬＡであるか否かを識別した。
【００９９】
以上の結果より、ＴＡＰＢＰ遺伝子中に存在する上記ＳＮＰの検出・評価をＬＥＩ０２５８の塩基長の検出・評価と組み合わせることによって、ＷＬＡを高い精度で検出することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明により、ニワトリにおけるウイルス感染に対する抵抗性を評価することができ、当該抵抗性を有するニワトリを選抜することが可能となるため、ウイルス病抵抗性を有する新たなニワトリ系統の育種に利用されることが大いに期待される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニワトリにおけるウイルス、特にＲＳＶ感染に対する抵抗性を評価する方法およびそれを用いた当該抵抗性を有するニワトリの選抜方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリ白血病ウイルス（Ａｖｉａｎ Ｌｅｕｋｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ：以下、「ＡＬＶ」と記載する）はトリ白血病−肉腫ウイルス（ＡＬＳＶ：Ａｖｉａｎ Ｌｅｕｋｏｓｉｓ−Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ）の一種であり、肉用鶏に感染して、骨髄球（骨髄性白血球の幼若型）白血症（ｍｙｅｌｏｃｙｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｃｏｓｉｓ）、腎腫瘍（ｎｅｐｈｒｏｍａｓ）や他の腫瘍（ｔｕｍｏｒ）を発生させることが知られている。肉用鶏生産の現場では、当該ウイルスに感染してトリ白血病が発生してしまうと、鶏舎全てのニワトリの抗体価を測定し、ＡＬＶ感染しているかどうかを調べ、感染ニワトリと非感染ニワトリを分け感染鶏を処分した後、鶏舎の汚染を除くために消毒操作を行いまた、長期間汚染鶏舎を用いない等、時間的、経済的に大きな負担を生じるため問題となる。
【０００３】
このような問題を解決すべく、わが国では家畜改良センター（旧農林水産省白河種畜牧場）を中心に、１９８０年頃から約１０年間にわたりニワトリのウイルス病抵抗性に関する育種事業が行われた。
【０００４】
当該育種事業においては、ＡＬＶ感染への抵抗性（感受性）を評価するために、ＡＬＶの代わりにラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ：以下、「ＲＳＶ」と記載する）を用いた感染試験が行われた。
【０００５】
ＲＳＶはＡＬＶのシュードタイプ（Ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅ：疑似タイプ）であることが知られている。ＡＬＶとＲＳＶの遺伝子構造は、ｇａｇ（切断されてキャプシドプロテインになるポリプロテインを作る）、ｐｏｌ（逆転写酵素とウイルス遺伝子を宿主ゲノムに組み込むのに関わる酵素を作る）、ｅｎｖ（エンベロープの糖タンパクを作る）の３つの部分において同じであり、ＲＳＶにはこれらに加えｓｒｃ（ガン遺伝子）部分が含まれる。ＲＳＶはニワトリに感染後、わずか５日程度で腫瘍を発生させることができる。これらの性質によりＡＬＶ感染に対するニワトリの抵抗性（感受性）を調べる際には、ＡＬＶに代えてＲＳＶが通常用いられている（非特許文献１）。
【０００６】
ウイルス感染に対するニワトリの抵抗性には２つの種類が存在する。
【０００７】
１つは、ウイルスを細胞内に受け入れないこと、すなわち非感受性による「抵抗性」である。これは、ホスト細胞表面のウイルスレセプターの変異によるレセプタータンパク質とウイルスタンパク質との親和性の低下や、タンパク質から成るウイルスのキャプシドを開裂させるのに適した酵素を持たない等によって生ずる。
【０００８】
もう１つは、ウイルスに感染はするが、細胞性免疫および／または液性免疫の作用によりウイルス増加が抑制されることによる「抵抗性」である。当該「抵抗性」は、ウイルス感染によって生じる腫瘍の退行によって評価することができる。
【０００９】
上記家畜改良センターが行ったＲＳＶを用いた感染試験の結果から、白色レグホンの１０種類の系統（ＷＬ０１系統、ＷＬ０２系統、ＷＬ０４系統、ＷＬ０５系統、ＷＬ０６系統、ＷＬ１１系統、ＷＬ１２系統、ＷＬ１４系統、ＷＬ１５系統およびＷＬ２１系統）のうち、ＷＬ１１系統において高い割合で腫瘍の退行が観察され、ＷＬ１１系統がウイルス感染に対して抵抗性を有することが明らかにされた（非特許文献２）。
【００１０】
しかし、ＷＬ１１系統に属するニワトリの全てにおいて腫瘍の退行が観察されたわけではなく、その約５０％の個体において腫瘍退行が観察されるにとどまり、残る個体においては腫瘍退行が観察されなかった。そのため、ウイルス感染に対して抵抗性を有する個体を選抜するための手法が、当該分野において切望されていた。
【００１１】
本発明者らは、ＲＳＶ（特に、ＲＳＶ−Ａ）感染によって生じる腫瘍の退行を伴う、ウイルス感染に対する抵抗性に関連する遺伝子がどの染色体に座乗しているかを分析した。詳細には、ＷＬ１１系統と、腫瘍の退行を示さないロードアイランドレッド種の系統（以下、「ＲＹＲＹＳ」と記載する）を交配して実験家系を造成し、これに対しＲＳＶの感染試験を実施し、マクロサテライトを用いた連鎖解析を行った。
【００１２】
その結果、当該抵抗性に関連する染色体領域が第１，２，４，１６番染色体に認められ、特に第１６番染色体の有意性が最も高いことを見出し報告した（非特許文献３）。
【００１３】
本発明者らによる上記結果より、ウイルス感染に対する抵抗性が第１６番染色体に特に高い有意性を持って依存していることが理解されたが、この情報だけでは、ウイルス感染に対して抵抗性を有する個体の選抜に十分とは言えず、当該分野においては依然として、当該抵抗性を有する個体を選抜するための新たな手法が求められていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】鶏の白血病抗病性に対する育種 山田行雄 畜産技術（１９６９）７：ｐ２１７−２２１
【非特許文献２】鶏の抗病性育種事業に関する資料（１９９０）農林水産省 白河種畜牧場
【非特許文献３】Ｙ．Ｕｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００９） Ａｓｉａｎ−Ａｕｓｔ． Ｊ． Ａｎｉｍ． Ｓｃｉ． ２２（１０）：１３５９−１３６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、ニワトリにおけるウイルス、特にＲＳＶ感染に対する抵抗性を評価する方法およびそれを用いた当該抵抗性を有するニワトリの選抜方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、少なくとも第１６番染色体上に位置するＭＨＣ−Ｂ領域にあるマイクロサテライトＬＥＩ０２５８（以下、「ＬＥＩ０２５８」と記載する）の多型を検出、評価することによって、ウイルス、特にＲＳＶ感染に対して抵抗性を有するニワトリを選抜できることを見出した。さらに、上記ＬＥＩ０２５８の多型に加えて、同じく第１６番染色体上のＭＨＣ−Ｂ領域にあるＴＡＰＢＰ遺伝子の遺伝子多型を検出することによって、ＲＳＶ感染に対して抵抗性を有するニワトリを高い精度で選抜できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は以下の特徴を有する。
［１］ ニワトリにおけるウイルス感染に対する抵抗性を評価する方法であって、第１６番染色体上に位置するＭＨＣ−Ｂ領域にあるマイクロサテライトＬＥＩ０２５８の多型を検出し評価することを含む、上記方法。
［２］ ウイルスがラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）である、［１］の方法。
［３］ ウイルスがトリＲＳＶ−Ｊである、［２］の方法。
［４］ マイクロサテライトＬＥＩ０２５８の塩基長が４４３ｂｐである場合に、ウイルス感染に対する抵抗性を有すると判断する、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［５］ さらに、第１６番染色体上に位置するＭＨＣ−Ｂ領域にあるＢｌｅｃ２遺伝子、ＴＡＰＢＰ（ＴＡＰ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子、ＢＬＢ２遺伝子、ＤＭＢ１遺伝子およびＴＡＰ２遺伝子からなる群から選択される１または複数の遺伝子の遺伝子多型を検出し評価することを含む、［１］〜［４］のいずれかの方法。
［６］ ＴＡＰＢＰ（ＴＡＰ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子の遺伝子多型を検出し評価する、［５］の方法。
［７］ ＴＡＰＢＰ（ＴＡＰ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子のアミノ酸コード配列において９４４番目のヌクレオチドがアデニンである場合に、ウイルス感染に対する抵抗性を有すると判断する、［６］の方法。
［８］ ［１］〜［７］のいずれかの方法を用いる、ウイルス感染に対して抵抗性を有するニワトリを選抜する方法。
［９］ ［１］〜［８］のいずれかの方法において、マイクロサテライトＬＥＩ０２５８をＰＣＲ反応によって増幅するためのプライマーを含む、ニワトリにおけるウイルス感染に対する抵抗性を評価するための試薬キット。
［１０］ さらに、ＴＡＰＢＰ遺伝子の遺伝子多型を検出するためのプライマーまたはオリゴヌクレオチドを含む、［９］の試薬キット。
【発明の効果】
【００１８】
本発明を用いることにより、ニワトリにおけるウイルス、特にＲＳＶ感染に対する抵抗性を評価することが可能となり、当該抵抗性を有するニワトリを選抜することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、第１６番染色体上に位置するＭＨＣ−Ｂ領域にあるＬＥＩ０２５８および本発明者らによって当該領域中に見いだされた３５カ所の単塩基変異（ＳＮＰ）の位置を示す。
【図２】図２は、ＰＣＲ反応によって増幅した、ＷＬ１１系統における各ハプロタイプ（ＷＬＡ，ＷＬＢ，ＷＬＣ，ＲＩＲａ，ＲＩＲｂ，ＲＩＲｃ）におけるＬＥＩ０２５８の電気泳動像図である。各レーンはそれぞれ以下のサンプルを示す。Ｌ：１００ｂｐ〜１，０００ｂｐラダー（マーカー），１：ＷＬＡホモ（４４３ｂｐホモ），２：ＷＬＢホモ（２６０ｂｐホモ），３：ＲＩＲａホモ（３１０ｂｐホモ），４：ＲＩＲｂホモ（３１０ｂｐホモ），５：ＲＩＲｃホモ（３５７ｂｐホモ），６：ＷＬＢ，ＲＩＲａヘテロ（２６０ｂｐ／３１０ｂｐ），７：ＷＬＡ，ＷＬＢヘテロ（２６０ｂｐ／４４３ｂｐ），８：ＷＬＡ，ＲＩＲａヘテロ（３１０ｂｐ／４４３ｂｐ），９：ＷＬＡ，ＲＩＲｃヘテロ（３５７ｂｐ／４４３ｂｐ），１０：ＷＬＢ，ＲＩＲａヘテロ（２６０ｂｐ／３１０ｂｐ），１１：ＷＬＡ，ＲＩＲｃヘテロ（３５７ｂｐ／４４３ｂｐ），１２ＷＬＡホモ（４４３ｂｐホモ）。
【図３−１】図３−１は、４つのハプロタイプＲＪＦ，Ｂ６，Ｂ２４，ＲＩＲａのＭＨＣ−Ｂ領域に存在する遺伝子の方向、ＣＤＳの長さ、アミノ酸の数とＷＬＡハプロタイプを基準としたときの同義単塩基置換および非同義単塩基置換の数を示す。
【図３−２】（図３−１の続き）
【図４−１】図４−１は、５つの異なるＭＨＣ−Ｂハプロタイプに存在するＴＡＰＢＰ遺伝子の塩基配列を示す。塩基配列中、四角で囲まれたヌクレオチドは、同義置換を示し、下線で示されたヌクレオチドは非同義置換を示す。
【図４−２】（図４−１の続き）
【図４−３】（図４−２の続き）
【図４−４】（図４−３の続き）
【図４−５】（図４−４の続き）
【図４−６】（図４−５の続き）
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、ニワトリにおけるウイルス感染に対する抵抗性を評価する方法を提供する。
【００２１】
本発明において、「ウイルス」にはトリ白血病ウイルス（Ａｖｉａｎ Ｌｅｕｋｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ：以下、「ＡＬＶ」と記載する）およびラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ：以下、「ＲＳＶ」と記載する）が含まれる。ＡＬＶもＲＳＶもガンウイルスであり、そのキャプシド構造の違いから、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩおよびＪの１０の型に分類される（Ｐａｙｎｅ Ｌ．Ｎ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ７３：２９９５−２９７７）。好ましくは、本発明における「ウイルス」は、ＲＳＶであり、さらに好ましくはＲＳＶ−Ｊである。
【００２２】
本発明において、「ウイルス感染に対する抵抗性」とは、ウイルスに感染はするが、細胞性免疫および／または液性免疫の作用によりウイルス増加が抑制されることを意味する。本発明において、当該「抵抗性」は、ウイルス感染、好ましくはＲＳＶの感染、さらに好ましくはＲＳＶ−Ｊの感染、によって生じる腫瘍の退行によって評価することができる。「腫瘍の退行」とは、ニワトリにおいてウイルス感染によって生じた腫瘍が、２０〜４５日程度の間に縮小または消失することを意味する。したがって、本明細書においては、「ウイルス感染に対する抵抗性」を、「腫瘍の退行」や「腫瘍退行能」といった用語で表現される場合があるが、これらの用語は全て相互互換的に用いられる。
【００２３】
本発明において、「ニワトリ」は特に限定されない。好ましくはＷＬ１１系統またはＷＬ１１系統に由来するニワトリである。「ＷＬ１１系統に由来するニワトリ」とは、ＷＬ１１系統との交配により得られたニワトリ（Ｆ１世代）に限定されることなく、Ｆ２、Ｆ３世代など（特にこれらに限定されない）後の世代のニワトリおよびこれらのニワトリと交配して得られたニワトリも含まれる。
【００２４】
本発明において、ウイルス感染に対する抵抗性の評価はニワトリの遺伝子情報に基づいて行うことができる。すなわち、ニワトリＤＮＡを含む試料において、少なくとも第１６番染色体上に位置するＭＨＣ−Ｂ領域にあるマイクロサテライトマーカーＬＥＩ０２５８の多型を検出、評価することによって行うことができる。
【００２５】
本発明において用いられる「ニワトリＤＮＡを含む試料」は、ニワトリから単離されたあらゆる細胞（生殖細胞を除く）、組織、臓器などを材料として調製される。好ましくは、末梢血（白血球や単核球）より調製することができる。
【００２６】
本明細書中において、「遺伝子多型」には、いわゆる単一ヌクレオチド多型（１塩基多型：ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：以下、「ＳＮＰ」と記載する）、および連続した複数ヌクレオチドにわたる多型、の両方を含むものとする。すなわち、集団において、ある一個体のゲノム配列を基準として、他の１または複数の個体ゲノム中の特定部位に、１または複数ヌクレオチドの置換、欠失、挿入、転位、逆位等の変異が存在するとき、その変異が当該１または複数の個体に生じた突然変異でないことが統計的に確実か、または当該個体内突然変異でなく、１％以上の頻度で集団内に存在することが家系的に証明される場合、その変異を「遺伝子多型」とする。
【００２７】
ＬＥＩ０２５８は、第１６番染色体上に位置するＭＨＣ−Ｂ領域にあるマイクロサテライトとして公知であり、従来的にニワトリのＭＨＣ領域におけるハプロタイプを決定するために利用されている（Ｆｕｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５８：４０７−４２１（２００６））。ＬＥＩ０２５８の塩基配列は、例えば、ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｓ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎｉｍ． Ｇｅｎｅｔ． ３０ （３），１８３−１８９（１９９９）に記載されている。
【００２８】
下記実施例にて詳細に記載するように、当該ＬＥＩ０２５８の多型を利用して、ＭＨＣ−Ｂ領域のハプロタイプ（以下、「ＭＨＣ−Ｂハプロタイプ」と記載する）を分析することによって、５０％の個体が腫瘍退行能を示すＷＬ１１系統において、３種類のＭＨＣ−Ｂハプロタイプ、すなわち、腫瘍退行能に有意に関連するハプロタイプ（以下、「ＷＬＡ」と記載する）および腫瘍退行能に有意に関係しない２つのハプロタイプ（以下、「ＷＬＢ」および「ＷＬＣ」と記載する）を決定することができる。また、ＬＥＩ０２５８の多型を利用して、腫瘍が進行するロードアイランドレッドのＲＩＲＹＳ系統において３種類のＭＨＣ−Ｂハプロタイプ、すなわち、腫瘍進行が高いハプロタイプ（以下、「ＲＩＲａ」、「ＲＩＲｂ」と記載する）および腫瘍進行に有意に関係しないハプロタイプ（「ＲＩＲｃ」と記載する）を決定することができる。
【００２９】
ＭＨＣ−Ｂハプロタイプと腫瘍退行能との間には相関関係が見られ、ＷＬＡをホモに持つニワトリは９０〜１００％の確率で腫瘍退行能を有する。またＷＬＡをヘテロで有するニワトリは、一方の対立遺伝子がＲＩＲａでなければ、８０〜９０％の確率で腫瘍退行能を有する。
【００３０】
したがって、ＬＥＩ０２５８の多型を検出し、ニワトリにおけるＭＨＣ−Ｂハプロタイプを決定することによって、詳細にはＷＬＡの存在の有無を検出することによって、当該ニワトリのウイルス感染に対する抵抗性を評価することができる。
【００３１】
ＬＥＩ０２５８の多型は、塩基長を測定することによって検出することができる。例えば、ＬＥＩ０２５８の多型として、２６１ｂｐ、２９５ｂｐ、３０７ｂｐ、３０９ｂｐ、３１０ｂｐ、３２１ｂｐ、３３３ｂｐ、３４５ｂｐ、３５７ｂｐ、３６７ｂｐ、３６９ｂｐ、３８１ｂｐ、３９３ｂｐ、４０８ｂｐ、４２０ｂｐまたは４４３ｂｐの塩基長を有するものが公知である（Ｆｕｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）上掲）。
【００３２】
ＬＥＩ０２５８の塩基長と上記ＭＨＣ−Ｂハプロタイプの関係を以下に示す。
【００３３】
【００３４】
ＷＬＡにおけるＬＥＩ０２５８の塩基長のみが４４３ｂｐであるために、当該塩基長に基づいて、他のＭＨＣ−Ｂハプロタイプと区別することが可能である。
【００３５】
ＬＥＩ０２５８の塩基長の測定は、当業者に公知である一般的な手法によって行うことが可能であり、例えば、ＰＣＲ法を用いて行うことができる。
【００３６】
本発明方法はさらに、上記ＬＥＩ０２５８の多型の検出に加えて、ＬＥＩ０２５８と同じくＭＨＣ−Ｂ領域に存在する、Ｂｌｅｃ２遺伝子、ＴＡＰＢＰ遺伝子、ＢＬＢ２遺伝子、ＤＭＢ１遺伝子およびＴＡＰ２遺伝子からなる群から選択される１または複数の遺伝子の遺伝子多型を検出、評価する工程を包含する。ＬＥＩ０２５８の多型に加えて、上記遺伝子の遺伝子多型を検出することによって、ＷＬＡを高い精度で選抜することができる。
【００３７】
従来的に、ニワトリのＭＨＣ−Ｂハプロタイプを決定するためにＢＦ２遺伝子の遺伝子多型の検出、評価が行われており、ＢＦ２遺伝子の遺伝子多型に基づいて、非常に多くのハプロタイプ（Ｂ１−２４）が検出、同定されている（Ｌｉｖａｎｔ Ｅ． Ｊ． ａｎｄ Ｓ． Ｊ． Ｅｄｗａｒｄ（２００５）Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｎｅｔ． ３６：４３２−４３４．）。
【００３８】
このうちＢ６と称されるハプロタイプは、ＷＬＡにおけるＭＨＣ−Ｂ領域と同一の塩基配列を有するものではないが、上記ＬＥＩ０２５８の塩基長は４４３ｂｐであり、ＷＬＡにおけるＬＥＩ０２５８のサイズと同一である。このため、ＬＥＩ０２５８の塩基長のみではＷＬＡをＢ６と区別することができない。
【００３９】
下記実施例にて詳述するように、Ｂｌｅｃ２遺伝子、ＴＡＰＢＰ遺伝子、ＢＬＢ２遺伝子、ＤＭＢ１遺伝子およびＴＡＰ２遺伝子の遺伝子多型は、少なくともＷＬＡとＢ６との間で異なっており、ＷＬＡとＢ６におけるＢｌｅｃ２遺伝子、ＴＡＰＢＰ遺伝子、ＢＬＢ２遺伝子、ＤＭＢ１遺伝子およびＴＡＰ２遺伝子からなる群から選択される１または複数の遺伝子の遺伝子多型を検出、評価することによって、両者を識別することができる。Ｂｌｅｃ２遺伝子、ＴＡＰＢＰ遺伝子、ＢＬＢ２遺伝子、ＤＭＢ１遺伝子およびＴＡＰ２遺伝子は公知であり、それぞれＧｅｎＢａｎｋにＢＡＧ６９３１８．１、ＢＡＧ６９３２１、ＢＡＧ６９３２０、ＢＡＧ６９３２５およびＢＡＧ６９３２９として登録されており、これらの遺伝子情報を利用することができる。また、各遺伝子の塩基配列は、例えば、Ｈｏｓｏｍｉｃｈｉ，Ｋ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８１ （５）， ３３９３−３３９９ （２００８）に開示されている。
【００４０】
好ましくは、ＴＡＰＢＰ遺伝子の遺伝子多型を検出、評価する。
【００４１】
ＴＡＰＢＰ遺伝子の遺伝子多型は配列番号２〜６によって表わされるＴＡＰＢＰ遺伝子の塩基配列において９４４番目のヌクレオチドに存在する。当該ＴＡＰＢＰ遺伝子の遺伝子多型は、ＷＬＡとＢ６の間で異なっている。すなわち、ＷＬＡのＴＡＰＢＰ遺伝子においては９４４番目のヌクレオチドがアデニン（配列番号２）であるのに対して、Ｂ６では９４４番目のヌクレオチドがグアニンである（配列番号４）。
【００４２】
したがって、ＴＡＰＢＰ遺伝子の遺伝子多型を検出、評価することによって、ＷＬＡとＢ６を区別することができる。
【００４３】
ＴＡＰＢＰ遺伝子の遺伝子多型を検出、評価する方法は、当業者に公知である一般的な手法によって行うことが可能である。例えば、最も直接的な方法である標的領域の塩基配列決定法（シークエンス法）や、特定位置の塩基置換だけを検出する目的の場合に有効な、２０塩基程度の合成オリゴヌクレオチドと標的塩基配列とのハイブリッド形成の有無を利用したアレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法（ＭＡＳＡ法）、標準ＲＮＡプローブと標準ＤＮＡ断片とのハイブリッドをリボヌクレアーゼＡで処理しミスマッチ位置でのプローブＲＮＡの切断で塩基置換の存在とおよその位置を知るリボヌクレアーゼＡミスマッチ切断法（ＲＮａｓｅプロテクション法）や、ＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅する際に、その一端にＧＣに富んだ塩基配列（ＧＣクランプ）をつけて変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ）を行い一塩基置換を検出する方法（ＰＣＲ‐ＤＧＧＥ法）を用いることができる。
【００４４】
また、２本鎖ＤＮＡ断片を１本鎖に解離し、その塩基配列に依存した独自の高次構造をポリアクリルアミドゲル電気泳動することにより、一塩基置換を移動度の差として検出する方法（ＰＣＲ‐ＳＳＣＰ法）や、塩基配列特異的プローブ（ＳＳＯＰ）を用いたハイブリダイゼーション法（ＰＣＲ‐ＳＳＯＰ法）や、その変法（ＰＣＲ‐ＲＤ法やＰＣＲ‐ＭＰＨ法）や、ある領域をＰＣＲ法などで増幅した後、点突然変異が生じた部位を切断部位と認識する制限酵素で処理して点突然変異を生じなかったＤＮＡとはサイズの違ったアリルとして検出するＰＣＲ‐ＲＦＬＰ法（特開平５−３０８９９９号公報）や、標的ＤＮＡの３’末端のヌクレオチド部位に隣接する核酸配列に対して検出プライマーをアニールすることと、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、検出するヌクレオチドに対して相補性の、シングルラベルのヌクレオチド三リン酸でかかるプライマーを伸長する方法（ミニシークエンシング法）等も用いることができる。
【００４５】
また、ＴａｑＭａｎＰＣＲ法、インベーダー法等種々の公知のＳＮＰタイピング法によっても検出することができる。
【００４６】
一塩基の変異を検出できる方法であれば、上記の方法に限定されることなく、本発明に用いることができる。
【００４７】
本発明方法を用いて、ニワトリにおけるウイルス感染に対する抵抗性を評価することによって、ウイルス感染に対して抵抗性を有するニワトリを選抜することが可能である。すなわち、本発明方法を用いて、ＷＬＡをホモまたはヘテロ（ただし、一方の対立遺伝子がＲＩＲａではない）で有するニワトリをウイルス感染に対して抵抗性を有するものとして選抜する。
【００４８】
本発明はまた、上記ＬＥＩ０２５８の多型の検出方法およびＴＡＰＢＰ遺伝子の遺伝子多型の検出方法に用いるためのプライマーを提供する。
【００４９】
ＬＥＩ０２５８の多型を検出するためのプライマー対は、ニワトリのゲノム配列上、少なくともＬＥＩ０２５８を挟み込むように設計されたプライマーであることが必要である。ここで、「挟み込む」とは、フォワード（順向）プライマーおよびリバース（逆向）プライマーからなるプライマー対によって増幅されるＤＮＡ断片の塩基配列中に標的遺伝子の塩基配列含むことをいう。当該プライマーは、通常、１０ｍｅｒ〜１００ｍｅｒであり、好ましくは１５ｍｅｒ〜４０ｍｅｒ、更に好ましくは１８ｍｅｒ〜３０ｍｅｒである。また、当該プライマーによって増幅されるＤＮＡ領域は、ＷＬＡと他のハプロタイプのＬＥＩ０２５８の塩基長が区別できる限り、特に限定されないが、好ましくは増幅されるＤＮＡ断片の長さは、１００ｂｐ〜１，５００ｂｐ、好ましくは２００ｂｐ〜７００ｂｐである。
【００５０】
好ましくは、ＬＥＩ０２５８の塩基長を検出するためのプライマーは、好ましくは遺伝子多型において共通の塩基配列に基づいて設計することができ、当業者であればＬＥＩ０２５８の塩基配列に基づいて、このようなプライマーを容易に設計することができる。ＬＥＩ０２５８の塩基長を検出するためのプライマーとして、例えば、配列番号７および８で表される塩基配列を含むプライマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
また、ＴＡＰＢＰ遺伝子の遺伝子多型を検出するためのプライマー対はＴＡＰＢＰ遺伝子をコードするＤＮＡまたはその相補鎖にハイブリダイズし、かつ、標的多型部位（ＷＬＡおよびＢ６のＴＡＰＢＰ遺伝子の塩基配列をそれぞれ表わす配列番号２または配列番号４における９４４番目のヌクレオチド）を挟み込むように設計されたプライマーであることが必要である。「挟み込む」とは、上に定義されるとおりである。当該プライマーは、通常、１０ｍｅｒ〜１００ｍｅｒであり、好ましくは１５ｍｅｒ〜４０ｍｅｒ、更に好ましくは１８ｍｅｒ〜３０ｍｅｒである。また、当該プライマーによって増幅されるＤＮＡ領域の長さは、５０ｂｐ〜５，０００ｂｐ、好ましくは１００ｂｐ〜１，５００ｂｐ、更に好ましくは２００ｂｐ〜７００ｂｐである。
【００５２】
ＴＡＰＢＰ遺伝子の遺伝子多型を検出するためのプライマーは、好ましくは遺伝子多型において共通の塩基配列に基づいて設計することができ、当業者であればＴＡＰＢＰ遺伝子の塩基配列に基づいて、このようなプライマーを容易に設計することができる。ＴＡＰＢＰ遺伝子の遺伝子多型を検出するためのプライマーとして、例えば、配列番号１１および１２で表される塩基配列を含むプライマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
これらプライマーによって挟まれる領域内に、さらに別のプライマーまたはプライマー対を設計することができる。このような第二のプライマーは、配列決定などにおいて用いることができる。このような第二のプライマーは、例えば、配列番号１３で表されるが、これらに限定されない。
【００５４】
尚、プライマーの鋳型ＤＮＡへのハイブリダイゼーションは、当分野において通常用いられる条件下で行うことができる。プライマーは、相補的な塩基対結合を形成できること、そしてその３’末端において相補鎖合成の起点となる−ＯＨ基を与えることの２つの条件を満たしている限り、プライマーを構成する主鎖はホスホジエステル結合によるもの（例えばＤＮＡ）に限定されない。例えばリン（Ｐ）ではなく硫黄（Ｓ）をバックボーンとしたホスホチオエート体や、ペプチド結合に基づくペプチド核酸からなるものであることもできる。また、塩基は、相補的な塩基対結合を可能とするものであれば良い。天然においては、アデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシルの５種類により構成されるが、例えばブロモデオキシウリジン等の類似体であることもできる。
【００５５】
本発明はまた、上記ＴＡＰＢＰ遺伝子の遺伝子多型の検出方法に用いられるオリゴヌクレオチドを提供する。このようなオリゴヌクレオチドは、好ましくは、上記ＴＡＰＢＰ遺伝子の多型部位を含む領域に特異的にハイブリダイズするものである。ここで、「特異的」とは、上記ＴＡＰＢＰ遺伝子の多型部位を含む領域にハイブリダイズし、他の領域にハイブリダイズしないことを意味する。このようなハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件として、例えば低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳである。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては、温度や塩濃度等の複数の要素があり、当業者はこれらの要素を適宜選択することで、同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００５６】
本発明におけるオリゴヌクレオチドは、上記多型部位を含むＤＮＡ領域にハイブリダイズする限り、その鎖長に特に制限はないが、好ましくは１０ｍｅｒ〜２００ｍｅｒであり、より好ましくは１５ｍｅｒ〜１００ｍｅｒであり、更に好ましくは１５ｍｅｒ〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。
【００５７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、前記多型を検出するためのプローブとして、および前記多型を含むＤＮＡを精製するための吸着リガンドとして利用することができる。
【００５８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、固相に固定されていても良い。このような固相の材料としては、例えば、セルロース、ニトロセルロースなどのセルロース誘導体、セファロース、アガロース、金属、ガラス、セラミック、樹脂など（これらに限定されない）が挙げられる。固相の形状および材質は特に限定されるものではない。
【００５９】
上記のプライマーおよび／またはオリゴヌクレオチドは、ニワトリのウイルス感染に対する抵抗性を評価するための検査試薬として使用することができる。さらに、これらの試薬をパッケージングし、キットとして供給することも可能である。
【００６０】
尚、上記プライマー及びプローブは、当該技術分野で公知の方法によって製造することができ、例えば、ＤＮＡプライマー及びＤＮＡプローブは、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法またはこれらの自動化された方法等を利用して、簡便にはＤＮＡ自動合成機等を利用して本発明で開示する塩基配列に従って合成することができる。
【００６１】
以下、本発明を実施例を挙げて更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６２】
実施例１：ＭＨＣ−Ｂハプロタイプの決定
ＭＨＣ−Ｂ領域にあるマイクロサテライトマーカーＬＥＩ０２５８の多型、ＢＦ２の遺伝子多型および、本願発明者らがＭＨＣ−Ｂ領域に見いだした３５カ所のＳＮＰのタイプ（図１）から、腫瘍退行能を持つと考えられるＷＬ１１系統と腫瘍が進行するロードアイランドレッドのＲＩＲＹＳ系統におけるＭＨＣ−Ｂハプロタイプを決定した。また、ＲＳＶーＪの感染試験を実施し、各ＭＨＣ−ＢハプロタイプとＲＳＶ−Ｊ感染由来の腫瘍に対する退行能との関係を明らかにした（Ｋ．Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８９：６５１−６５７（２０１０））。
【００６３】
ＷＬ１１系統の個体（ｎ＝３００）とＲＩＲＹＳ系統の個体（ｎ＝２００）（いずれも独立行政法人家畜改良センターにて繋養）より、ベノジェクトＩＩＥＤＴＡ真空採血管（ＴＥＲＭＯ， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）または等量の２％Ｗ／Ｖクエン酸ナトリウムで採血し、以下の３種のうちいずれかの方法でＤＮＡを抽出・精製した。
１．血液５０μｌを、１×ＰＢＳ（−）（ＧＩＢＣＯ，ＵＳＡ）で２ｍｌに希釈し、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ ＤＮＡ ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ ｋｉｔ Ｌ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ， Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）でＤＮＡを抽出・精製した。
２．血液５μｌを１×ＰＢＳ（−）で２００μｌに希釈し、ＱＩＡｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ， Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）でＤＮＡを抽出・精製した。
３．羽毛の根元０．５ｍｇ以内を細かく裁断し、ＤＮＡエクストラクターＦＭキット（Ｗａｋｏ， Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）でＤＮＡを抽出・精製した。
【００６４】
なお、いずれの手法を用いてＤＮＡを調製したとしても、以下の実験に何ら影響しない。
【００６５】
各個体より得られたＤＮＡを用いて、ＬＥＩ０２５８およびＢＦ２の遺伝子多型をそれぞれ以下のプライマーを用いたＰＣＲ法によって決定した。
【００６６】
ＬＥＩ０２５８増幅用プライマー
フォワードプライマー：５’−ＣＡＣＧＣＡＧＣＡＧＡＡＣＴＴＧＧＴＡＡＧＧ−３’（配列番号７）
リバースプライマー ：５’−ＡＧＣＴＧＴＧＣＴＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＴＧＣ−３’（配列番号８）
ＢＦ２増幅用プライマー
フォワードプライマー：５’−ＧＣＡＧＡＧＣＴＣＣＡＴＡＣＣＣＴＧＣＧＧＴＡ−３’（配列番号９）
リバースプライマー ：５’−ＧＣＣＧＧＴＣＴＧＧＴＴＧＴＡＧＣＧＣＣＧ−３’（配列番号１０）
【００６７】
ＰＣＲ反応は以下の組成で行なった。２０μｌの容量において、１０−２０ｎｇ ＤＮＡ／５ｐｍｏｌ 各プライマー／０．２ｍＭ ｄＮＴＰ／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ［ｐＨ８．３］／５０ｍＭ ＫＣｌ／１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２／０．２Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ−Ｇｏｌｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）。
【００６８】
反応条件は、９４度１０分、その後９４度３０秒、６０度３０秒、７２度３０秒を４０サイクルで行なった。
【００６９】
反応終了後、各サンプルを２％ｗ／ｖアガロースを用いて電気泳動し、ＤＮＡサイズマーカーからＰＣＲ産物のサイズを算出した。なお、ＢＦ２のタイプの決定は、公知の手法（Ｌｉｖａｎｔ Ｅ． Ｊ． ａｎｄ Ｓ． Ｊ． Ｅｄｗａｒｄ（２００５）上掲）に基づいて行った。
【００７０】
また、上記３５カ所のＳＮＰのタイプについては、公知の手法（ＯｋａｍｕｒａＮ． ｅｔ ａｌ． Ａｎｉｍ． Ｓｃｉ． Ｊ． ７９：３０３−３１３（２００８））に基づいてマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析によって決定した。
【００７１】
ＲＳＶ−Ｊの感染試験は、ＲＳＶ−Ｊ（ＨＰＲＳ−１０３；Ｐａｙｎｅ ｅｔ ａｌ， Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８０１−８０７（１９９２））を３週齢のニワトリの翼芽に皮下接種し、その後７，１０，１４，２８および４２日目に各腫瘍のサイズを計測した。
【００７２】
結果、ＷＬ１１系統においては３種類（ＷＬＡ、ＷＬＢ、ＷＬＣと称呼）、およびＲＩＲＹＳ系統においては３種類（ＲＩＲａ、ＲＩＲｂ、ＲＩＲｃと称呼）のハプロタイプの存在が明らかとなり、各ハプロタイプとＲＳＶ−Ｊ感染由来の腫瘍に対する退行能の関係も明らかとなった。
【００７３】
ＬＥＩ０２５８およびＢＦ２のタイプならびに各ハプロタイプを有する個体のＲＳＶ−Ｊ感染による腫瘍に対する退行能を以下の表１に示す。
【００７４】
【表１】
【００７５】
この結果より、ＭＨＣ−Ｂハプロタイプのうち、ＬＥＩ０２５８の塩基長が４４３ｂｐとして特徴付けられるＷＬＡが、ＲＳＶ−Ｊ感染による腫瘍に対する退行能と有意に関連することが明らかとなった。
【００７６】
実施例２：ＭＨＣ−Ｂハプロタイプの組み合わせによる腫瘍進行能への影響
ＭＨＣ−Ｂハプロタイプの組み合わせによる腫瘍進行能への影響を調べるために、ＷＬ１１系統と、ＲＹＲＹ系統を交配して実験家系を造成し、これに対しＲＳＶ−Ｊの感染試験を実施した。
【００７７】
ＷＬ１１系統雄３羽とＲＹＲＹ系統雌７羽の交配からＦ１世代雌雄計２３羽を生産し、Ｆ１雌雄の交配によりＦ２世代雌雄計９１羽を生産した。さらに、Ｆ２世代よりＷＬＡホモ接合体およびＲＩＲａホモ接合体の雌雄を選択・交配してＦ３世代雌雄計２８羽を生産した。
【００７８】
ＲＳＶ−Ｊの感染試験は、上記実施例１と同様に行った。
【００７９】
Ｆ２世代の複数の個体より、上記実施例１に記載の方法と同様にＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡを用いて、上記実施例１と同様に各個体のＬＥＩ０２５８の塩基長をＰＣＲ法によって検出し、上記表１の結果に基づいて各個体におけるＭＨＣ−Ｂハプロタイプの組み合わせを決定した。
【００８０】
結果を図２に示す。ＬＥＩ０２５８の塩基長をＰＣＲ法によって検出することによって、各個体におけるＭＨＣ−Ｂハプロタイプの組み合わせ（特にＷＬＡの存在の有無）を容易に決定することができる。
【００８１】
実験家系のＦ２世代及びＦ３世代に認められたＭＨＣ−Ｂハプロタイプの組み合わせとＲＳＶ−Ｊ感染によって生じる腫瘍の退行との関係を以下の表２に示す。
【００８２】
【表２】
【００８３】
この結果より、ＷＬＡをホモに持つニワトリのほぼ１００％が、ＲＳＶ−Ｊ感染によって生じる腫瘍に対する退行能を示すことが明らかとなった。また、ＷＬＡをヘテロに持つニワトリであっても、もう一つの対立遺伝子がＲＩＲａでないならば８５％程度の個体がＲＳＶ−Ｊ感染によって生じる腫瘍に対する退行能を示すことが明らかとなった。さらに、ＲＩＲａをホモに持つニワトリのほぼ９０％は死亡に至る程度の大きな腫瘍を形成することが明らかとなった。
【００８４】
この結果より、ＷＬＡおよびＲＩＲａを指標として、ニワトリにおけるＲＳＶ−Ｊ感染によって生じる腫瘍に対する退行能を評価できることが明らかとなった。
【００８５】
実施例３：ＷＬＡおよびＢ６ハプロタイプの識別
ＬＥＩ０２５８の塩基長に基づいて、ＭＨＣ−Ｂハプロタイプを分類した場合、ＷＬＡとＢＦ２のハプロタイプの一種であるＢ６は共に４４３ｂｐのＬＥＩ０２５８が検出されるために、両者を区別することができない。また、本願発明者らがＭＨＣ−Ｂ領域に見いだした３５カ所のＳＮＰのタイプ（図１）についても両者の間で違いが見られなかった。
【００８６】
Ｂ６についてはこれまでに、ウイルス感染によって生じる腫瘍に対する退行能に影響するか否か明らかにされていないが、Ｂ６に相当するＢ１を持つ系統はＲＳＶ−Ｂ由来の腫瘍を進行させる割合が低いことが報告されている（Ｓｃｈｉｅｒｍａｎ，Ｌ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．（１９７７） Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５， ３２５−３３２）。そこで、ＷＬＡとＢ６を識別することによって、ＷＬＡを高い精度で検出することができ、結果としてニワトリにおけるＲＳＶ−Ｊ感染によって生じる腫瘍に対する退行能を高い精度で評価できると考え、両者を識別できる遺伝子マーカーを探索した。
【００８７】
ＷＬＡをホモに持つニワトリ個体のゲノムＤＮＡから、ＢＡＣライブラリーを構築し、ＷＬＡとＲＩＲａについて、ＭＨＣ−Ｂ領域を含む１６７，４６４ｂｐの領域の塩基配列を決定した。そして、ＷＬＡの塩基配列と、ＲＩＲａ、ＲＪＦ（Ｒｅｄ Ｊｕｎｇｌｅ Ｆｏｗｌ）（世界家畜辞典：監修 正田陽一 東洋書林発行ｐ．３４４−３４５（２００６））、Ｂ６およびＢ２４の塩基配列を比較した。
【００８８】
結果を図３−１〜２に示す。
【００８９】
ＷＬＡとＢ６間の比較については、Ｂ６において既に遺伝子情報が明らかにされている１４の遺伝子（ＢＧ１、Ｂｌｅｃ２、Ｂｌｅｃ１、ＢＬＢ１、ＴＡＰＢＰ、ＢＬＢ２、ＢＲＤ２、ＤＭＡ１、ＤＭＢ１、ＤＭＡ２、ＢＦ１、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＢＦ２）のアミノ酸コード配列（ＣＤＳ）の比較を行った。
【００９０】
その結果、Ｂｌｅｃ２遺伝子に同義置換１カ所および非同義置換１カ所（１−１と略記 以下同順）、ＴＡＰＢＰ遺伝子（１−１）、ＢＬＢ２遺伝子（２２−１９）、ＤＭＢ１遺伝子（２−１）、ＴＡＰ２遺伝子（１−０）の計４９カ所のＳＮＰが、ＷＬＡとＢ６の間で異なることが認められた（図３−１〜２）。
【００９１】
このことから、ＷＬＡとＢ６のＭＨＣ−Ｂ領域は同一ではないことが明らかとなった。
【００９２】
上記１４の遺伝子のＣＤＳの中にＷＬＡとＢ６と間で異なるＳＮＰは４９カ所あったが、両者の識別を可能とする遺伝子マーカーとしては、両者を同様に増幅することが出来るなど検出の容易性からＳＮＰの数が少ない遺伝子が好ましい。この点を考慮すると、ＷＬＡとＢ６との間で遺伝子１つ当たり１カ所の非同義置換ＳＮＰを持つＢｌｅｃ２遺伝子およびＴＡＰＢＰ（ＴＡＰ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子が遺伝子マーカーとして利用可能である。
【００９３】
Ｂｌｅｃ２遺伝子は、ＷＬＡとＢ２４およびＲＩＲａとの間でそれぞれ３９カ所のＳＮＰを有するため、３者を同様に増幅することが出来るなど検出の容易性から、これらの間でより少ないＳＮＰ（それぞれ３カ所、１カ所）を持つＴＡＰＢＰ遺伝子が目的の遺伝子マーカーとして有効であると判断される。
【００９４】
ＷＬＡ、ＲＩＲａ、ＲＪＦ、Ｂ６およびＢ２４におけるＴＡＰＢＰ遺伝子のアミノ酸コード領域における塩基配列の比較結果を図４−１〜６に示す。
【００９５】
ＴＡＰＢＰ遺伝子において、ＷＬＡとＢ６の間で１カ所存在するＳＮＰの位置は、９４４番目のヌクレオチドであり、ＷＬＡではアデニン（コドンはＣＡＣ，アミノ酸はＨ：ヒスチジン）、Ｂ６ではグアニン（コドンはＣＧＣ，アミノ酸はＲ：アルギニン）となっている。
【００９６】
したがって、ＴＡＰＢＰ遺伝子中に存在する当該ＳＮＰを検出・評価することによって、ＷＬＡとＢ６を識別することができる。
【００９７】
上記ＳＮＰの検出は、各個体におけるＴＡＰＢＰ遺伝子の９４４番目のヌクレオチドを含む領域を配列決定することによって行った。
【００９８】
ニワトリ個体のゲノムＤＮＡおよび以下のＴＡＰＢＰ遺伝子増幅用プライマー：フォワードプライマー：５’−ＡＴＧＡＧＧＧＣＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣ−３’（配列番号１１）
リバースプライマー：５’−ＴＴＧＧＧＡＣＡＴＡＧＴＧＡＣＡＴＴＧＣＴＣ−３’（配列番号１２）
を用いて、実施例１と同様にＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ産物をＰｒｅ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＵＳＢ， ＵＳＡ）で処理し、２μｌをＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｋｉｔ ｖ．３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ， ＵＳＡ）および
配列決定用プライマー：５’−ＧＧＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＡＴＴＣＣＴＡＴ−３’（配列番号１３）を用いて配列を決定した。ＳＮＰの位置のヌクレオチドがアデニンであるか否かを評価して、ＷＬＡであるか否かを識別した。
【００９９】
以上の結果より、ＴＡＰＢＰ遺伝子中に存在する上記ＳＮＰの検出・評価をＬＥＩ０２５８の塩基長の検出・評価と組み合わせることによって、ＷＬＡを高い精度で検出することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明により、ニワトリにおけるウイルス感染に対する抵抗性を評価することができ、当該抵抗性を有するニワトリを選抜することが可能となるため、ウイルス病抵抗性を有する新たなニワトリ系統の育種に利用されることが大いに期待される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニワトリにおけるウイルス感染に対する抵抗性を評価する方法であって、第１６番染色体上に位置するＭＨＣ−Ｂ領域にあるマイクロサテライトＬＥＩ０２５８の多型を検出し評価することを含む、上記方法。
【請求項２】
ウイルスがラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ウイルスがトリＲＳＶ−Ｊである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
マイクロサテライトＬＥＩ０２５８の塩基長が４４３ｂｐである場合に、ウイルス感染に対する抵抗性を有すると判断する、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
さらに、第１６番染色体上に位置するＭＨＣ−Ｂ領域にあるＢｌｅｃ２遺伝子、ＴＡＰＢＰ（ＴＡＰ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子、ＢＬＢ２遺伝子、ＤＭＢ１遺伝子およびＴＡＰ２遺伝子からなる群から選択される１または複数の遺伝子の遺伝子多型を検出し評価することを含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ＴＡＰＢＰ（ＴＡＰ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子の遺伝子多型を検出し評価する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＴＡＰＢＰ（ＴＡＰ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子のアミノ酸コード配列において９４４番目のヌクレオチドがアデニンである場合に、ウイルス感染に対する抵抗性を有すると判断する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の方法を用いる、ウイルス感染に対して抵抗性を有するニワトリを選抜する方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載の方法において、マイクロサテライトＬＥＩ０２５８をＰＣＲ反応によって増幅するためのプライマーを含む、ニワトリにおけるウイルス感染に対する抵抗性を評価するための試薬キット。
【請求項１０】
さらに、ＴＡＰＢＰ遺伝子の遺伝子多型を検出するためのプライマーまたはオリゴヌクレオチドを含む、請求項９記載の試薬キット。
【請求項１】
ニワトリにおけるウイルス感染に対する抵抗性を評価する方法であって、第１６番染色体上に位置するＭＨＣ−Ｂ領域にあるマイクロサテライトＬＥＩ０２５８の多型を検出し評価することを含む、上記方法。
【請求項２】
ウイルスがラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ウイルスがトリＲＳＶ−Ｊである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
マイクロサテライトＬＥＩ０２５８の塩基長が４４３ｂｐである場合に、ウイルス感染に対する抵抗性を有すると判断する、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
さらに、第１６番染色体上に位置するＭＨＣ−Ｂ領域にあるＢｌｅｃ２遺伝子、ＴＡＰＢＰ（ＴＡＰ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子、ＢＬＢ２遺伝子、ＤＭＢ１遺伝子およびＴＡＰ２遺伝子からなる群から選択される１または複数の遺伝子の遺伝子多型を検出し評価することを含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ＴＡＰＢＰ（ＴＡＰ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子の遺伝子多型を検出し評価する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＴＡＰＢＰ（ＴＡＰ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子のアミノ酸コード配列において９４４番目のヌクレオチドがアデニンである場合に、ウイルス感染に対する抵抗性を有すると判断する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の方法を用いる、ウイルス感染に対して抵抗性を有するニワトリを選抜する方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載の方法において、マイクロサテライトＬＥＩ０２５８をＰＣＲ反応によって増幅するためのプライマーを含む、ニワトリにおけるウイルス感染に対する抵抗性を評価するための試薬キット。
【請求項１０】
さらに、ＴＡＰＢＰ遺伝子の遺伝子多型を検出するためのプライマーまたはオリゴヌクレオチドを含む、請求項９記載の試薬キット。
【図１】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図４−４】
【図４−５】
【図４−６】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図４−４】
【図４−５】
【図４−６】
【公開番号】特開２０１２−４４９６５（Ｐ２０１２−４４９６５Ａ）
【公開日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１９２４９２（Ｐ２０１０−１９２４９２）
【出願日】平成２２年８月３０日（２０１０．８．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ▲１▼刊行物 ：Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．８９ 発行日 ：平成２２年４月１日 発行所 ：Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｉｎｋ． 該当ページ ：６５１−６５７ ▲２▼掲載アドレス：ｈｔｔｐ：／／ｎｉｌｇｓ．ｎａｒｏ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ＳＥＩＫＡ／２００９／ｎｉｌｇｓ／ｃｈ０９０２５．ｈｔｍｌ 電気通信回線発表日：平成２２年７月８日
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度、農林水産省、「アグリバイオ実用化・産業化研究開発」（分子遺伝子情報を利用した抗病性鶏品種実用化・産業化のための研究開発）委託事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【出願人】（３０１０２９４０３）独立行政法人家畜改良センター (12)
【出願人】（５０５０６８５２７）株式会社小松種鶏場 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月３０日（２０１０．８．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ▲１▼刊行物 ：Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．８９ 発行日 ：平成２２年４月１日 発行所 ：Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｉｎｋ． 該当ページ ：６５１−６５７ ▲２▼掲載アドレス：ｈｔｔｐ：／／ｎｉｌｇｓ．ｎａｒｏ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ＳＥＩＫＡ／２００９／ｎｉｌｇｓ／ｃｈ０９０２５．ｈｔｍｌ 電気通信回線発表日：平成２２年７月８日
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度、農林水産省、「アグリバイオ実用化・産業化研究開発」（分子遺伝子情報を利用した抗病性鶏品種実用化・産業化のための研究開発）委託事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【出願人】（３０１０２９４０３）独立行政法人家畜改良センター (12)
【出願人】（５０５０６８５２７）株式会社小松種鶏場 (1)
【Ｆターム（参考）】
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