ウイルス粒子の３つのコンポーネントを異なる蛍光タンパク質で標識した組換えウイルス
【課題】ウイルス粒子のコンポーネントを蛍光タンパク質で標識した組換えウイルスおよび該組換えウイルスを感染させた細胞を提供する。
【解決手段】単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）について、ウイルス粒子を構成するカプシド、テグメントおよびエンベロープの３つのタンパク質コンポーネントがそれぞれ異なった３つの蛍光タンパク質で標識された組換えウイルス。
【効果】該組換えウイルスを感染させた細胞は、ＨＳＶウイルス粒子についての一連の成熟過程の解析、抗ＨＳＶ剤の作用機序の解析および作用機序に特化した抗ＨＳＶ剤のスクリーニングに利用可能である。
【解決手段】単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）について、ウイルス粒子を構成するカプシド、テグメントおよびエンベロープの３つのタンパク質コンポーネントがそれぞれ異なった３つの蛍光タンパク質で標識された組換えウイルス。
【効果】該組換えウイルスを感染させた細胞は、ＨＳＶウイルス粒子についての一連の成熟過程の解析、抗ＨＳＶ剤の作用機序の解析および作用機序に特化した抗ＨＳＶ剤のスクリーニングに利用可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス粒子の３つのコンポーネントを異なる蛍光タンパク質で標識した組換えウイルスに関する。本発明はまた、当該組換えウイルスを感染させた細胞に関する。本発明はまた、当該組換えウイルスを用いた、ウイルス粒子についての一連の成熟過程の解析方法、抗ウイルス剤の作用機序の解析方法、および、作用機序に特化した抗ウイルス剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、ヒトに脳炎、性器ヘルペス、皮膚疾患、眼疾患、小児ヘルペスなどの多様な病態を引き起こす。ヘルペスウイルス感染症の医療費は、年間３０億ドル（約３５００億円）と試算されている。現在使用されている抗単純ヘルペスウイルス剤（抗ＨＳＶ剤）としては、アシクロビルなどが知られている。アシクロビルはＨＳＶのチミジンキナーゼ（ＴＫ）を標的としているが、ＴＫ遺伝子領域に変異を有する薬剤耐性ウイルスの出現が問題となっており、新たな作用機序、例えば、ウイルス粒子成熟過程を特異的に阻害するような抗ＨＳＶ剤の開発が求められている。
【０００３】
従来、抗ＨＳＶ剤スクリーニングにおいては、ウイルスによる細胞変性効果を指標にした方法や、１種類のレポーター遺伝子を発現する組換えＨＳＶ感染細胞におけるリポータータンパク質の発現量を指標とした方法が行われている。しかし、これらのスクリーニング系では、作用機序に特化した抗ＨＳＶ剤のスクリーニングは困難であった。
【０００４】
ＨＳＶウイルス粒子は、カプシド、テグメント、エンベロープといった３つのコンポーネントより構成されており、まず、核でカプシドが生成され、その後、カプシドは細胞質でテグメントを付着させ、最後にエンベロープを獲得してウイルス粒子が構築される。１９９８年および１９９９年にそれぞれカプシドまたはテグメントタンパク質を蛍光タンパク質で標識した組換えウイルスによる各ウイルスタンパク質の生細胞における動態解析が報告された（P. Desai and S. Person, J. Virol., 1998, Vol.72, No.9, p.7563-7568; G. Elliott and P. O'hare, J. Virol., 1999, Vol.73, No.5, p.4110-4119）。その後、２００５年にカプシドおよびテグメントをそれぞれ異なる蛍光タンパク質で標識した組換えウイルスが作成され、カプシドがテグメントを獲得する過程を解析することが可能となった（T. del Rio, et al., J. Virol., 2005, Vol.79, No.7, p.3903-3919）。しかしながら、ＨＳＶ粒子は３つのコンポーネントより構成されているので、一連のＨＳＶウイルス粒子成熟過程を解析するためには、カプシド、テグメント、エンベロープの３つの生成過程および生成後の動態を同時に解析するためには、上述の１つまたは２つのウイルス粒子コンポーネントを蛍光タンパク質で標識する実験系では不十分であった。
【０００５】
一方、カプシド、テグメントおよびエンベロープの３つのウイルス粒子コンポーネントの生成過程および生成後の動態を同時に解析可能な実験系は、ＨＳＶウイルス粒子についての一連の成熟過程の解析、および作用機序に特化した抗ＨＳＶ剤のスクリーニング法にも利用可能であると考えられ、そのような実験系の確立が強く求められていた。
【０００６】
そのような実験系として、３つのウイルス粒子コンポーネントを異なる３つの蛍光タンパク質で標識した組換えウイルスを作製することが考えられた。しかし、上述したように、１つのウイルス粒子コンポーネントを１つの蛍光タンパク質で標識した組換えウイルスが作成されてから、２つのウイルス粒子コンポーネントを２つの異なる蛍光タンパク質で標識した組換えウイルスが作成されるまでに、約７年の年月を費やされており、ウイルス粒子コンポーネントの蛍光タンパク質による標識により、ウイルス粒子の不安定化を招くことが推測されていた。これらの事情から、３つのウイルス粒子コンポーネントを異なる３つの蛍光タンパク質で標識した組換えウイルスを作製することやそのような組換えウイルスを含む実験系の確立は困難であると予想されていた。
【非特許文献１】P. Desai and S. Person, J. Virol., 1998, Vol.72, No.9, p.7563-7568
【非特許文献２】G. Elliott and P. O'hare, J. Virol., 1999, Vol.73, No.5, p.4110-4119
【非特許文献３】T. del Rio, et al., J. Virol., 2005, Vol.79, No.7, p.3903-3919
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本願発明は、以下の態様１−１６を提供することを目的とする。
態様１：ウイルス粒子のコンポーネントであるカプシド、テグメントおよびエンベロープのそれぞれが、異なる３つの蛍光タンパク質で標識されている、組換えウイルス。
【０００８】
態様２：ウイルスが、ヘルペスウイルス科に属するウイルスより選択される、態様１に記載の組換えウイルス。
態様３：ウイルスが、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）である、態様１に記載の組換えウイルス。
【０００９】
態様４：ウイルスが単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）であり；カプシドがＵＬ３５、ＵＬ１８、ＵＬ１９、ＵＬ２６、およびＵＬ３８からなる群より選択され；テグメントがＵＬ４９、ＵＬ４７、ＵＬ４６、ＵＬ４８、ＵＬ４１、ＵＬ１１、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ３６、ＵＬ３７、ＵＬ５１、ＵＬ５６、Ｕｓ２、Ｕｓ９、Ｕｓ１０、およびＵｓ１１からなる群より選択され；そして、エンベロープがＵＬ２７、ＵＬ１、ＵＬ１０、ＵＬ２２、Ｕｓ６、ＵＬ４４、ＵＬ５３、Ｕｓ４、Ｕｓ５、Ｕｓ７、およびＵｓ８からなる群より選択される；態様１に記載の組換えウイルス。
【００１０】
態様５：蛍光タンパク質が、Ｖｅｎｕｓ、ｍＲＦＰ１、ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＢＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ＰｈｉＹＦＰ、Ｊ−Ｒｅｄ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ１、ＡｍＣｙａｎ１、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ｍＡｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ１、ＣｏｐＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１、ｍＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＰｌｕｍ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｅｑＦＰ６１１、およびＡｓＲｅｄ２からなる群より選択される、態様１ないし４のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
【００１１】
態様６：３つの異なる蛍光タンパク質が、それぞれ異なる蛍光波長を有する、態様１ないし５のいずれか１つに記載の組換えウイルス。
態様７：３つの異なるタンパク質が、ＥＣＦＰ、ＥＢＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ１、およびＡｍＣｙａｎ１からなる群より選択される１種類；Ｖｅｎｕｓ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ｍＡｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ１、ＣｏｐＧＦＰ、およびＺｓＧｒｅｅｎ１からなる群より選択される１種類；ならびに、ｍＲＦＰ１、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１、ｍＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＰｌｕｍ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｅｑＦＰ６１１、およびＡｓＲｅｄ２からなる群より選択される１種類；の組み合わせである、態様１ないし６のいずれか１つに記載の組換えウイルス。
【００１２】
態様８：３つの異なる蛍光タンパク質が、Ｖｅｎｕｓ、ｍＲＦＰ１およびＥＣＦＰの組み合わせである、態様１ないし６のいずれか１つに記載の組換えウイルス。
態様９：ウイルス粒子コンポーネントのＮ末端、Ｃ末端、または内部に蛍光タンパク質を融合させることにより、ウイルス粒子のコンポーネントが蛍光タンパク質で標識されている、態様１ないし８のいずれか１つに記載の組換えウイルス。
【００１３】
態様１０：ウイルスが単純ヘルペスウイルスであり、カプシドがＶｅｎｕｓで標識されたＵＬ３５であり、テグメントがｍＲＦＰ１で標識されたＵＬ４７またはＵＬ４９であり、エンベロープがＥＣＦＰで標識されたＵＬ２７である、態様１に記載の組換えウイルス。
【００１４】
態様１１：ウイルスが単純ヘルペスウイルスであり、カプシドがＮ末端をＶｅｎｕｓで標識されたＵＬ３５であり、テグメントがＮ末端をｍＲＦＰ１で標識されたＵＬ４７またはＵＬ４９であり、エンベロープがＮ末端領域の内部をＥＣＦＰで標識されたＵＬ２７である、態様１に記載の組換えウイルス。
【００１５】
態様１２：態様１ないし１１のいずれか１つに記載の組換えウイルスを感染させた細胞。
態様１３：抗ウイルス剤の作用機序を解析する方法であって、以下：
（ｉ）態様１ないし１１のいずれか１つに記載の組換えウイルスで感染させた細胞に、抗ウイルス剤を接触させ；
（ｉｉ）ウイルス粒子のコンポーネントであるカプシド、テグメント、およびエンベロープを標識した各蛍光タンパク質の蛍光に基づいて、各コンポーネントの当該感染細胞における生成の挙動および／または局在を観察し；
（ｉｉｉ）観察された各コンポーネントの生成の挙動および／または局在について、抗ウイルス剤を接触させていない感染細胞における各コンポーネントの生成の挙動および／または局在との差異を評価し；そして
（ｉｖ）当該抗ウイルス剤は、生成の挙動および／または局在に差異があるコンポーネントが関与するウイルス粒子成熟過程に作用すると判断する；
工程を含む、前記方法。
【００１６】
態様１４：感染細胞におけるウイルス粒子の各コンポーネントの生成の挙動の観察を、リアルタイムイメージングにより行う、態様１３に記載の方法。
態様１５： 特定のウイルス粒子成熟過程を標的とする抗ウイルス剤をスクリーニングする方法であって、以下：
（ｉ）態様１ないし１１のいずれか１つに記載の組換えウイルスで感染させた細胞に、抗ウイルス剤の候補物質を接触させ；
（ｉｉ）ウイルス粒子のコンポーネントであるカプシド、テグメント、およびエンベロープを標識した各蛍光タンパク質の蛍光に基づいて、各コンポーネントの当該感染細胞における生成の挙動および／または局在を観察し；
（ｉｉｉ）観察された各コンポーネントの生成の挙動および／または局在について、抗ウイルス剤の候補物質を接触させていない感染細胞における各コンポーネントの生成の挙動および／または局在との差異を評価し；そして
（ｉｖ）差異を生じた場合は、当該抗ウイルス剤の候補物質を、生成の挙動および／または局在に差異があるコンポーネントが関与するウイルス粒子成熟過程を標的とする抗ウイルス剤として同定する；
工程を含む、前記方法。
【００１７】
態様１６：ウイルス粒子の成熟過程の解析方法であって、態様１ないし１１のいずれか１つに記載の組換えウイルスで感染させた細胞において、ウイルス粒子のコンポーネントであるカプシド、テグメント、およびエンベロープを標識した各蛍光タンパク質の蛍光に基づいて、各コンポーネント当該感染細胞におけるの生成の挙動および／または局在を観察することを含む、前記方法。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは上記課題の解決のために、鋭意研究に努めた結果、本発明に想到した。
具体的には、本発明者らは、単純ヘルペスウイルスについて、ウイルス粒子を構成するカプシドタンパク質ＵＬ３５、テグメントタンパク質ＵＬ４７またはＵＬ４９、およびエンベロープタンパク質ＵＬ２７を、それぞれ異なる蛍光タンパク質を融合させて標識することにより、３つのウイルス粒子コンポーネントがそれぞれ異なる３つの蛍光タンパク質で標識された組換え単純ヘルペスウイルスを取得することに成功した（後述の実施例を参照）。
【００１９】
本発明者らはまた、当該組換え単純ヘルペスウイルスで感染させた細胞は、ウイルス粒子コンポーネントを標識したそれぞれの蛍光タンパク質を効率的に発現していることを確認した。また、当該組換え単純ヘルペスウイルスで感染させた同一の生細胞において、各ウイルス粒子構成タンパク質の発現および局在を経時的に観察するリアルタイムイメージングも可能であった。さらに、当該組換え単純ヘルペスウイルスで感染させた細胞において、１つのウイルス粒子を３色の蛍光を発する粒子として観察することにより、１ウイルス粒子レベルで観察するリアルタイムイメージングも可能であった。
【００２０】
これらの実験結果から本発明者らは、ウイルス粒子を構成するカプシドタンパク質、テグメントタンパク質、およびエンベロープタンパク質が、それぞれ異なる蛍光タンパク質で標識された組換えウイルスが構築可能であることを見いだし、本発明に想到した。また、本発明の組換えウイルスで感染させた細胞においては、ウイルス粒子構成タンパク質の発現および局在を経時的に観察することができ、またウイルス粒子を１ウイルス粒子レベルで観察することもできるため、ウイルス粒子の生成過程の解析、抗ウイルス剤の作用機序の解析、および作用機序に特化した抗ウイルス剤のスクリーニングを行うための系として有用であることを見いだし、本発明に想到した。
【００２１】
以上、本発明の理解のために本発明を想到するに至る経緯を説明したが、本発明の範囲は上記説明に限定されず、請求の範囲の記載によって定められる。
以下、本発明について詳述する。
【００２２】
組換えウイルス
本発明は、ウイルス粒子のコンポーネントであるカプシド、テグメント、およびエンベロープのそれぞれが異なる３つの蛍光タンパク質で標識されている、組換えウイルスを提供する。
【００２３】
本明細書において、ウイルス粒子コンポーネントとは、広く一般にウイルス粒子を構成する成分を意味する。ウイルス粒子コンポーネントがタンパク質である場合は、特にウイルス粒子構成タンパク質と称する場合もある。
【００２４】
本発明の組換えウイルスは、ウイルス粒子コンポーネントとして、カプシド、テグメント、およびエンベロープの３つのタンパク質を含むウイルスであれば特に限定されない。そのようなウイルスとして、ヘルペスウイルス科に属するウイルスが挙げられる。
【００２５】
ヘルペスウイルス科に属するウイルスのうち好ましいのは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ブタヘルペスウイルス、ウマヘルペスウイルス、マレック病ウイルス、ウシヘルペスウイルス、トリ伝染性咽頭気管塩ウイルス、である。本発明の組換えウイルスとして特に好ましいのは、ＨＳＶである。
【００２６】
本発明の組換えウイルスにおいて蛍光タンパク質で標識されるカプシドタンパク質、テグメントタンパク質、およびエンベロープタンパク質の種類は特に限定されず、組換えウイルスの種類に応じて当業者が適宜選択することが可能である。
【００２７】
例えば、ウイルスが単純ヘルペスウイルスである場合、標識されるカプシドタンパク質は、ＵＬ３５、ＵＬ１８、ＵＬ１９、ＵＬ２６、およびＵＬ３８からなる群より選択され、好ましくはＵＬ３５である。また、標識されるテグメントタンパク質は、ＵＬ４９、ＵＬ４７、ＵＬ４６、ＵＬ４８、ＵＬ４１、ＵＬ１１、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ３６、ＵＬ３７、ＵＬ５１、ＵＬ５６、Ｕｓ２、Ｕｓ９、Ｕｓ１０、およびＵｓ１１からなる群より選択され、好ましくはＵＬ４９、ＵＬ４７、ＵＬ４６、ＵＬ４８、ＵＬ４１、ＵＬ３６、およびＵｓ１１からなる群より選択され、さらに好ましくはＵＬ４７またはＵＬ４９である。そして、標識されるエンベロープタンパク質は、ＵＬ２７、ＵＬ１、ＵＬ１０、ＵＬ２２、Ｕｓ６、ＵＬ４４、ＵＬ５３、Ｕｓ４、Ｕｓ５、Ｕｓ７、およびＵｓ８からなる群より選択され、好ましくはＵＬ２７、ＵＬ２２、ＵＬ４４、Ｕｓ６、Ｕｓ７、およびＵｓ８からなる群より選択され、さらに好ましくはＵＬ２７である。
【００２８】
本発明の組換えウイルスにおいて、各ウイルス粒子コンポーネントを標識する蛍光タンパク質は、蛍光を発するタンパク質であれば特に限定されない。本発明に利用可能な蛍光タンパク質として、具体的には例えば、Ｖｅｎｕｓ（励起波長：５１５ｎｍ、蛍光波長：５２８ｎｍ； Nat. Biotechnol., 2002, 20(1): 87-90）、ｍＲＦＰ１（励起波長：５８４ｎｍ、蛍光波長：６０７ｎｍ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99: 7877-7882）、ＥＣＦＰ（励起波長：４３３ｎｍ、蛍光波長：４７５ｎｍ；Clontech）、ＥＧＦＰ（励起波長：４８８ｎｍ、蛍光波長：５０７ｎｍ）、ＥＹＦＰ（励起波長：５１３ｎｍ、蛍光波長：５２７ｎｍ）、ＥＢＦＰ（励起波長：３８０ｎｍ、蛍光波長：４４０ｎｍ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ（励起波長：４３３ｎｍ、蛍光波長：４７５ｎｍ；Nat. Biotechnol., 2004, 22: 445-449）、Ｅｍｅｒａｌｄ（励起波長：４８７ｎｍ、蛍光波長：５０９ｎｍ）、Ｓａｐｐｈｉｒｅ（励起波長：３９９ｎｍ、蛍光波長：５１１ｎｍ）、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ（励起波長：３９９ｎｍ、蛍光波長：５１１ｎｍ）、Ｃｉｔｒｉｎｅ（励起波長：５１６ｎｍ、蛍光波長：５２９ｎｍ）、ＰｈｉＹＦＰ（励起波長：５２５ｎｍ、蛍光波長：５３７ｎｍ；Evrogen）、Ｊ−Ｒｅｄ（励起波長：５８４ｎｍ、蛍光波長：６１０ｎｍ；Evrogen）、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ１（励起波長：４７２ｎｍ、蛍光波長：４９５ｎｍ；MBLまたはAmalgaam）、ＡｍＣｙａｎ１（励起波長：４５８ｎｍ、蛍光波長：４８９ｎｍ；Clontech）、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ（励起波長：４９２ｎｍ、蛍光波長：５０５ｎｍ；MBLまたはAmalgaam）、ｍＡｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ１（励起波長：４９２ｎｍ、蛍光波長：５０５ｎｍ；MBLまたはAmalgaam）、ＣｏｐＧＦＰ（励起波長：４８２ｎｍ、蛍光波長：５０２ｎｍ；Evrogen）、ＺｓＧｒｅｅｎ１（励起波長：４９３ｎｍ、蛍光波長：５０５ｎｍ；Clontech）、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１（励起波長：５２９ｎｍ、蛍光波長：５３９ｎｍ；Clontech）、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１（励起波長：５４８ｎｍ、蛍光波長：５６１ｎｍ；MBLまたはAmalgaam）、ｍＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１（励起波長：５４８ｎｍ、蛍光波長：５５９ｎｍ；MBLまたはAmalgaam）、ｍＯｒａｎｇｅ（励起波長：５４８ｎｍ、蛍光波長：５６２ｎｍ；Nat. Biotechnol., 2004, 22:1567-1572）、ＤｓＲｅｄ２（励起波長：５６３ｎｍ、蛍光波長：５８２ｎｍ；Clontech）、ＤｓＲｅｄ ｍｏｎｏｍｅｒ（励起波長：５５６ｎｍ、蛍光波長：５８６ｎｍ；Clontech）、ＨｃＲｅｄ１（励起波長：５８８ｎｍ、蛍光波長：６１８ｎｍ；Clontech）、ｍＰｌｕｍ（励起波長：５９０ｎｍ、蛍光波長：６４９ｎｍ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101: 16745-16749）、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ（励起波長：５９８ｎｍ、蛍光波長：６２５ｎｍ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101: 16745-16749）、ｍＣｈｅｒｒｙ（励起波長：５８７ｎｍ、蛍光波長：６１０ｎｍ；Nat. Biotechnol., 2004, 22: 1567-1572）、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ（励起波長：５７４ｎｍ、蛍光波長：５９６ｎｍ；Nat. Biotechnol., 2004, 22: 1567-1572）、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ（励起波長：５６８ｎｍ、蛍光波長：５８５ｎｍ；Nat. Biotechnol., 2004, 22: 1567-1572）、ｅｑＦＰ６１１（励起波長：５５９ｎｍ、蛍光波長：６１１ｎｍ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99: 11646-11651）、およびＡｓＲｅｄ２（励起波長：５７６ｎｍ、蛍光波長：５９２ｎｍ；Clontech）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
本発明の組換えウイルスにおいて、カプシド、テグメントおよびエンベロープはそれぞれ異なる３つの蛍光タンパク質で標識されているが、３つの異なる蛍光タンパク質は、それぞれを区別できるように検出可能な組み合わせであれば、その組み合わせは特に限定されない。３つの蛍光タンパク質のそれぞれを区別できるように検出可能とは、例えば、それぞれの蛍光タンパク質が異なる蛍光波長を有することを意味する。一般的に、互いの蛍光波長に最小で約１０ｎｍの差があれば、それぞれの蛍光タンパク質を区別できるように検出することができる。また、互いの蛍光波長に２０ｎｍ以上の差があることが好ましく、３０ｎｍ以上の差があることがより好ましく、５０ｎｍ以上の差があることがさらに好ましい。
【００３０】
本発明の組換えウイルスにおける、好ましい３つの蛍光タンパク質の組み合わせとしては、ＥＣＦＰ、ＥＢＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ１、およびＡｍＣｙａｎ１からなる群より選択される１種類；Ｖｅｎｕｓ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ｍＡｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ１、ＣｏｐＧＦＰ、およびＺｓＧｒｅｅｎ１からなる群より選択される１種類；ならびに、ｍＲＦＰ１、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１、ｍＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＰｌｕｍ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｅｑＦＰ６１１、およびＡｓＲｅｄ２からなる群より選択される１種類；の組み合わせが挙げられる。最も好ましい組み合わせは、Ｖｅｎｕｓ、ｍＦＲＰ１、およびＥＣＦＰの組み合わせである。
【００３１】
本発明の組換えウイルスにおいて、ウイルス粒子コンポーネントは蛍光タンパク質で標識されているが、その標識の方法は特に限定されない。好ましくは、ウイルス粒子構成タンパク質を蛍光タンパク質との融合タンパク質とすることにより標識する。蛍光タンパク質との融合タンパク質としてウイルス粒子構成タンパク質を標識する場合、蛍光タンパク質をウイルス粒子構成タンパク質のＮ末端に融合させてもよく、Ｃ末端に融合させてもよく、あるいは内部に融合させてもよい。
【００３２】
組換えウイルスの製造方法
本発明の組換えウイルスを製造する方法は特に限定されないが、例えば、公知の組換えウイルス作成技術を利用して製造することができる。簡単には、野生体の性状を保持したウイルスのウイルスＤＮＡと、第一のウイルス粒子構成タンパク質と蛍光タンパク質の融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドを、細胞へ同時トランスフェクションすることにより、ウイルスＤＮＡにおいて対応するウイルス粒子構成タンパク質をコードするＤＮＡと、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡとの相同組み換えを生じさせる。相同組み換えによって産生された目的の組換えウイルス（すなわち第一のウイルス構成タンパク質が蛍光タンパク質により標識されている、組換えウイルス）を、前記蛍光タンパク質の蛍光を発するプラークを採取することによって選択する。場合により、採取されたプラークに含まれる組換えウイルスを再度細胞に感染させ、産生された組換えウイルスを前記蛍光を発するプラークとして採取することを繰り返して、１００％のプラークが目的の蛍光を発するまでプラーク純化を行ってもよい。
【００３３】
第二のウイルス構成タンパク質についても、上記と同様にして、第二のウイルス構成タンパク質が蛍光タンパク質により標識されている組換えウイルスを作成する。第三のウイルス構成タンパク質が蛍光タンパク質により標識されている組換えウイルスについても同様に作成する。
【００３４】
次いで、第一のウイルス構成タンパク質が標識されている組換えウイルスと、第二のウイルス構成タンパク質が標識されている組換えウイルスとで、細胞を共感染させる。組換えウイルスの共感染によって、細胞内で両ウイルスの相同組み換えが引き起こされ、第一および第二のウイルス構成タンパク質が標識されている組換えウイルスが産生するので、標識に用いた２つの蛍光タンパク質の蛍光を発するプラークを採取することによって選択する。所望によりプラーク純化を行ってもよい。
【００３５】
そして、第一および第二のウイルス構成タンパク質が標識されている組換えウイルスと、第三のウイルス構成タンパク質が標識されている組換えウイルスとで、細胞を共感染させる。組換えウイルスの共感染によって産生された、第一、第二および第三のウイルス構成タンパク質が標識されている組換えウイルスを、それぞれを標識した３つの蛍光タンパク質の蛍光を発するプラークを採取することによって選択する。所望によりプラーク純化を行ってもよい。
【００３６】
上述した一連の相同組み換えの操作により、カプシド、テグメントおよびエンベロープがそれぞれ異なる蛍光タンパク質で標識された、本発明の組換えウイルス粒子を作成することができる。
【００３７】
製造の各段階において、得られた組換えウイルスが目的の組換えウイルスであることを確認するためには、目的の組換えウイルスのＤＮＡについて、当業者に周知のサザン法により、当該組換えウイルスＤＮＡが、導入したウイルス構成タンパク質と蛍光タンパク質の融合タンパク質をコードするＤＮＡを有することにより確認することができる。または、当該組換えウイルスを感染させた細胞において、導入したウイルス構成タンパク質と蛍光タンパク質の融合タンパク質が発現していることを、当業者に周知のウエスタン法により感染細胞ライセートを用いて解析することにより、得られた組換えウイルスが目的の組換えウイルスであることを確認することもできる。あるいは、当該組換えウイルス粒子において、導入したウイルス構成タンパク質と蛍光タンパク質の融合タンパク質を発現していることを、当業者に周知のウエスタン法により精製した当該組換えウイルス粒子のライセートを用いて解析することにより、得られた組換えウイルスが目的の組換えウイルスであることを確認することもできる。
【００３８】
組換えウイルスを感染させた細胞
本発明は、本発明の組換えウイルスを感染させた細胞を提供する。
本発明の細胞の種類は、当該組換えウイルスが感染可能な細胞であれば、特に限定されない。当業者は、組換えウイルスの種類に応じて、感染させる細胞の種類を適宜選択することができる。好ましくは、本発明の細胞は、動物細胞である。より好ましくは、本発明の細胞は、培養細胞として確立された動物細胞である。好ましい細胞の例としては、ウサギ皮膚細胞（ＲＳＣ）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞）、ＨＥＬ（ヒト胎児肺線維芽細胞）、またはＨＥｐ−２細胞（ヒトカルシノーマ細胞）などが挙げられる。
【００３９】
ウイルス粒子の成熟過程の解析方法
本発明は、本発明の組換えウイルスおよび／または当該ウイルスで感染させた細胞を用いる、ウイルス粒子の成熟過程の解析方法を提供する。本発明のウイルス粒子の成熟過程の解析方法は、本発明の組換えウイルスで感染させた細胞において、ウイルス粒子のコンポーネントであるカプシド、テグメント、およびエンベロープ標識した各蛍光タンパク質の蛍光に基づいて、各コンポーネントの当該感染細胞における生成の挙動および／または局在を観察することを含む。
【００４０】
本発明のウイルス粒子の成熟過程の解析方法において、ウイルス粒子コンポーネントの生成の挙動および／または局在を観察するとは、各ウイルス粒子コンポーネントの発現および／または発現後の局在を、所望により経時的に観察することを意味する。ウイルス粒子コンポーネントの生成挙動および／または局在の観察は、例えば、共焦点レーザー顕微鏡、蛍光顕微鏡、またはハイコンテンツ顕微鏡イメージングシステムなどを用いて本発明の組換えウイルスで感染させた細胞を観察することにより行うことができる。これらを用いて観察した場合、各コンポーネントの発現および局在を経時的に追跡する、リアルタイムイメージングが可能である。本発明の方法は、カプシドの生成過程、テグメント生成過程、およびエンベロープ生成過程に加えて、カプシドがテグメントを獲得する過程やエンベロープを獲得する過程などの、一連のウイルス粒子成熟過程を同一の系で解析することが可能である。
【００４１】
本発明の方法によりウイルス粒子の成熟過程が解析されるウイルスは、本発明の組換えウイルスが作成可能なウイルスであれば特に限定されないが、好ましくはＨＳＶである。
抗ウイルス剤の作用機序の解析方法
本発明は、本発明の組換えウイルスおよび／または当該ウイルスで感染させた細胞を用いる、抗ウイルス剤の作用機序の解析方法を提供する。本発明の抗ウイルス剤の作用機序の解析方法は、以下の工程：
（ｉ）本発明の組換えウイルスで感染させた細胞に、抗ウイルス剤を接触させる工程；
（ｉｉ）ウイルス粒子コンポーネントであるカプシド、テグメント、およびエンベロープを標識した各蛍光タンパク質の蛍光に基づいて、各コンポーネントの当該感染細胞における生成の挙動および／または局在を観察する工程；
（ｉｉｉ）観察された各コンポーネントの生成の挙動および／または局在について、抗ウイルス剤を接触させていない感染細胞における各コンポーネントの生成の挙動および／または局在との差異を評価する工程；および
（ｉｖ）当該抗ウイルス剤は、生成の挙動および／または局在に差異があるコンポーネントが関与するウイルス粒子の成熟過程に作用すると判断する工程；
を含む。
【００４２】
本発明の方法による解析の対象となる抗ウイルス剤は、抗ウイルス剤として同定されたものであれば特に限定されない。すなわち、既知の抗ウイルス剤であってもよく、または将来的に同定される抗ウイルス剤であってもよい。
【００４３】
本発明の抗ウイルス剤の作用機序の解析方法において、ウイルス粒子コンポーネントの生成の挙動および／または局在を観察するとは、各ウイルス粒子コンポーネントの発現および／または発現後の局在を、所望により経時的に観察することを意味する。ウイルス粒子コンポーネントの生成挙動の観察は、例えば、共焦点レーザー顕微鏡、蛍光プレートリーダー、蛍光顕微鏡、またはハイコンテンツ顕微鏡イメージングシステムなどを用いて、作用機序を観察する抗ウイルス剤の存在下または非存在下で、本発明の組換えウイルスで感染させた細胞を観察することにより行うことができる。本発明の組換えウイルスは、カプシド、テグメント、およびエンベロープの３つのウイルス粒子コンポーネントが蛍光タンパク質で標識されているので、本発明の抗ウイルス剤の作用機序の解析方法は、カプシド、テグメント、およびエンベロープの生成過程に加えて、カプシドがテグメントを獲得する過程やさらにエンベロープを獲得する過程など、一連のウイルス粒子成熟過程のうちのどの過程に当該抗ウイルス剤が作用するのかを同定することが可能である。
【００４４】
共焦点レーザー顕微鏡、蛍光顕微鏡、ハイコンテンツ顕微鏡イメージングシステムを用いて観察した場合、各コンポーネントの発現および局在を経時的に追跡することができる、リアルタイムイメージングが可能である。これにより、ウイルス粒子成熟過程を可視化することが可能であるので、抗ウイルス剤の存在下および非存在下でのウイルス粒子成熟過程を比較することにより、抗ウイルス剤の作用機序を明らかにすることが可能である。具体的には、抗ウイルス剤の存在下および非存在下でのウイルス粒子成熟過程を比較して、各コンポーネントの発現量および／または局在に差異が見られる過程に、その抗ウイルス剤は作用していると判断する。より具体的には、各コンポーネントの発現量の差異は、各コンポーネントを標識した各蛍光タンパク質の蛍光強度の差として現れる。抗ウイルス剤の存在下において、あるコンポーネントを標識している蛍光タンパク質の蛍光強度が、抗ウイルス剤の非存在下と比較して低下している場合は、当該抗ウイルス剤はそのコンポーネントの生成過程に作用すると判断する。また、各コンポーネントの局在の差異は、各コンポーネントを標識した各蛍光タンパク質の局在の違いとして現れる。ウイルスの存在下において、あるコンポーネントを標識している蛍光タンパク質の局在が、抗ウイルス剤の非存在下と比較して異なる場合は、当該蛍光タンパク質が標識するウイルス粒子コンポーネントの、成熟ウイルス粒子への移行過程に作用すると判断する。
【００４５】
蛍光プレートリーダーを用いた場合は、各コンポーネントの発現の有無および／または発現の度合いを、各蛍光タンパク質の蛍光強度から評価することができる。本発明の方法においては、抗ウイルス剤の存在下および非存在下での各蛍光タンパク質の蛍光強度を比較することにより、抗ウイルス剤の作用機序を明らかにすることが可能である。具体的には、抗ウイルス剤の存在下において、カプシドを標識している蛍光タンパク質の蛍光強度が、抗ウイルス剤の非存在下と比較して低下した場合は、当該抗ウイルス剤はカプシド生成過程に作用すると判断する。または、抗ウイルス剤の存在下において、テグメントを標識している蛍光タンパク質の蛍光強度が、抗ウイルス剤の非存在下と比較して低下した場合は、当該抗ウイルス剤はテグメント生成過程に作用すると判断する。あるいは、抗ウイルス剤の存在下において、エンベロープを標識している蛍光タンパク質の蛍光強度が、抗ウイルス剤の非存在下と比較して低下している場合は、当該抗ウイルス剤はエンベロープ生成過程に作用すると判断する。
【００４６】
本発明の方法により作用機序が解析される抗ウイルス剤は、本発明の方法において用いられる本発明の組換えウイルスの種類に対応する抗ウイルス剤であれば、特に限定されない。本発明の方法により作用機序が解析される好ましい抗ウイルス剤は、抗ＨＳＶ剤であり、その際、本発明の方法において用いられる本発明の組換えウイルスはＨＳＶである。
【００４７】
抗ウイルス剤のスクリーニング方法
本発明は、本発明の組換えウイルスおよび／または当該ウイルスで感染させた細胞を用いる、作用機序に特化した抗ウイルス剤のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、特定のウイルス粒子成熟過程を標的とする抗ウイルス剤をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ｉ）本発明の組換えウイルスで感染させた細胞に、抗ウイルス剤の候補物質を接触させる工程；
（ｉｉ）ウイルス粒子のコンポーネントであるカプシド、テグメント、およびエンベロープを標識した各蛍光タンパク質の蛍光に基づいて、各コンポーネントの当該感染細胞における生成の挙動および／または局在を観察する工程；
（ｉｉｉ）観察された各コンポーネントの生成の挙動および／または局在について、抗ウイルス剤の候補物質を接触させていない感染細胞における各コンポーネントの生成の挙動および／または局在との差異を評価する工程；および
（ｉｖ）差異を生じた場合は、当該抗ウイルス剤の候補物質を、生成の挙動および／または局在に差異があるコンポーネントが関与するウイルス粒子成熟過程を標的とする抗ウイルス剤として同定する工程；
を含む。
【００４８】
本発明の方法によりスクリーニングされる抗ウイルス剤の候補物質には、小分子を含む化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、およびそれらの誘導体などが含まれるが、これらに限定されない。
【００４９】
本発明のスクリーニング方法において、ウイルス粒子コンポーネントの生成の挙動を観察するとは、各ウイルス粒子コンポーネントを標識している蛍光タンパク質の蛍光に基づいて、各ウイルスコンポーネントの発現および／または発現後の局在を所望により観察することを意味する。標識されたウイルス粒子コンポーネントの生成挙動および／または局在の観察は、例えば、ハイコンテンツ顕微鏡イメージングシステム、蛍光プレートリーダー、共焦点レーザー顕微鏡、蛍光顕微鏡などを用いて行うことができる。ハイコンテンツ顕微鏡イメージングシステムまたは蛍光プレートリーダーを用いることにより、迅速かつ大量サンプルの処理が可能である。
【００５０】
本発明のスクリーニング方法では、抗ウイルス剤の候補物質の存在下および非存在下での、本発明の組換えウイルスで感染させた細胞における各コンポーネントの生成の挙動および／またはその局在の差異に基づいてスクリーニングを行う。本発明のスクリーニング方法は、抗ウイルス剤の候補物質がウイルス粒子成熟過程のどの段階に作用するかを評価しながらスクリーニングすることが可能であるため、作用機序に基づいて抗ウイルス剤をスクリーニングすることができる。本発明の組換えウイルスは、カプシド、テグメント、およびエンベロープの３つのウイルス粒子コンポーネントが蛍光タンパク質で標識されているので、本発明のスクリーニング方法は、カプシド、テグメント、およびエンベロープの生成過程に加えて、カプシドがテグメントを獲得する過程やさらにエンベロープを獲得する過程など、一連のウイルス粒子成熟過程のうち、特定の過程を標的とする抗ウイルス剤の同定が可能である。
【００５１】
本発明のスクリーニング方法に、ハイコンテンツ顕微鏡イメージングシステム、共焦点レーザー顕微鏡、または蛍光顕微鏡を用いた場合、各コンポーネントの発現および局在を経時的に追跡することができる。この場合、抗ウイルス剤の候補物質の存在下および非存在下での各コンポーネントの発現および局在を観察し、差異を生じた抗ウイルス剤の候補物質を抗ウイルス剤として同定する。また、各コンポーネントの発現および局在の差異の特色から、抗ウイルス剤としての作用機序、すなわちいずれのウイルス粒子成熟過程に作用するかについても同定することができる。具体的には、各コンポーネントの発現量の差異は、各コンポーネントを標識した各蛍光タンパク質の蛍光強度の差として現れる。したがって、抗ウイルス剤の候補物質の存在下において、あるコンポーネントを標識している蛍光タンパク質の蛍光強度が、抗ウイルス剤の非存在下と比較して低下している場合は、当該抗ウイルス剤の候補物質は、そのコンポーネントの生成過程に作用する抗ウイルス剤として同定することができる。また、各コンポーネントの局在の差異は、各コンポーネントを標識した各蛍光タンパク質の感染細胞における局在の違いとして現れる。したがって、抗ウイルス剤の候補物質の存在下において、あるコンポーネントを標識している蛍光タンパク質の局在が、抗ウイルス剤の候補物質の非存在下と比較して異なる場合は、当該蛍光タンパク質が標識するウイルス粒子コンポーネントの成熟ウイルス粒子への移行過程、例えばカプシドがテグメントを獲得する過程や、それがさらにエンベロープを獲得する過程など、に作用する抗ウイルス剤として同定することができる。
【００５２】
また、本発明のスクリーニング方法に蛍光プレートリーダーを用いた場合は、各コンポーネントの発現を、各コンポーネントを標識した蛍光タンパク質の蛍光強度から評価することができる。この場合、抗ウイルス剤候補の存在下および非存在下での各蛍光タンパク質の蛍光強度を比較することにより、作用機序に基づいて抗ウイルス剤をスクリーニングする。具体的には、抗ウイルス剤候補の存在下において、カプシドを標識している蛍光タンパク質の蛍光強度が、抗ウイルス剤の非存在下と比較して低下した場合は、当該抗ウイルス剤候補はカプシドの発現を抑制する抗ウイルス剤として同定することができる。または、抗ウイルス剤候補の存在下において、テグメントを標識している蛍光タンパク質の蛍光強度が、抗ウイルス剤候補の非存在下と比較して低下した場合は、当該抗ウイルス剤候補はテグメントの発現を抑制する抗ウイルス剤として同定することができる。あるいは、抗ウイルス剤候補の存在下において、エンベロープを標識している蛍光タンパク質の蛍光強度が、抗ウイルス剤候補の非存在下と比較して低下している場合は、当該抗ウイルス剤候補はエンベロープの発現を抑制する抗ウイルス剤として同定することができる。
【００５３】
本発明のスクリーニング方法により同定される抗ウイルス剤は、本発明の方法において用いられる本発明の組換えウイルスの種類に対応する抗ウイルス剤である。本発明のスクリーニング方法により同定される好ましい抗ウイルス剤は、抗ＨＳＶ剤であり、その際、本発明のスクリーニング方法において用いられる本発明の組換えウイルスはＨＳＶである。
【発明の効果】
【００５４】
ウイルス粒子の３つのウイルス粒子コンポーネントを３つの異なる蛍光タンパク質で標識した組換えウイルスは、作用機序を特定した新しい抗ウイルス剤、特に抗ＨＳＶ剤、のスクリーニングに利用可能である。また、本発明の組換えウイルスは、抗ウイルス剤、特に抗ＨＳＶ剤の作用機序の解析にも利用可能である。抗ウイルス剤の開発においては、薬剤耐性ウイルスの出現の問題が常に存在するため、新たな作用機序を有する抗ウイルス剤の効率的なスクリーニング方法および解析方法が求められていた。本発明の組換えウイルスならびに本発明のスクリーニング方法および解析方法は、抗ウイルス剤の開発の分野に、新たな効率のよいツールおよび実験系を提供するものである。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００５６】
実施例１：カプシドを標識した組換えウイルスの作製
（１−１）トランスファープラスミド（ｐＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５）の構築
（ｉ）蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓ（Nat. Biotechnol., 2002, 20(1): 87-90）の２０７番目のアラニン残基をリジン残基に置換した変異体ＶｅｎｕｓＡ２０７ＫをQuickChange site-directed mutagenesis kit（Stratagene）で作製した。
【００５７】
（ｉｉ）終始コドンを含まないＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ増幅には以下のプライマーを用いた：ＧＣＡＣＴＡＧＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣ（配列番号１）およびＧＣＧＡＡＴＴＣＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣ（配列番号２）。ＰＣＲ産物として得られたＶｅｎｕｓＡ２０７ＫをpBluescript II KS+（Stratagene）のＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。
【００５８】
（ｉｉｉ）ＨＳＶ−１ Ｆ株（J. Gen. Virol., 2:357-364, 1968）のＵＬ３５遺伝子の２番目のコドンから約１ｋｂｐ（ＨＳＶゲノムについてのGenBank accession No. X14112を参照）をＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲには以下のプライマーを用いた：ＧＣＧＡＡＴＴＣｇｃｃｇｔｃｃｃｇｃａａｔｔｔｃａｃｃｇ（配列番号３）およびＧＣＧＡＡＧＣＴＴｔｔｃｃｇｃｇｔｃｔｔｃｃａｃａａａｔｃ（配列番号４）。そして、ＰＣＲ産物として得られたＵＬ３５遺伝子を含む断片を、上記（ｉｉ）で得られた、Ｖｅｎｕｓ変異体がクローニングされたpBluescript II KS+ のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に、ＶｅｎｕｓＡ２０７ＫとＵＬ３５遺伝子が融合するかたちでクローニングした。
【００５９】
（ｉｖ）ＨＳＶ−１ Ｆ株（同上）のＵＬ３５遺伝子の上流約１ｋｂｐ（ＨＳＶゲノムについてのGenBank accession No. X14112を参照）をＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲには以下のプライマーを用いた：ＧＣＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣｔｔａａｃｃｇｇｔｔｃｃｔｇｇａｃｃｔｇ（配列番号５）およびＧＣＡＣＴＡＧＴｃｇｇｇａｃｃｇｇａｇｇｔｃｇｇｇａａｇ（配列番号６）。そして、ＰＣＲ産物として得られたＵＬ３５遺伝子の上流側を含む断片を、上記（ｉｉｉ）で得られた、ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５遺伝子がクローニングされたpBluescript II KS+ のＮｏｔＩ−ＳｐｅＩ部位にさらにクローニングした。
【００６０】
得られたプラスミドは、pBluescript II KS+のマルチプルクローニングサイト領域に、５’側から順に、ＵＬ３５遺伝子の上流約１ｋｂｐ、ＶｅｎｕｓＡ２０７ＫのＯＲＦ、およびＵＬ３５遺伝子の２番目のコドンから約１ｋｂｐを含むプラスミドである。以下、得られたプラスミドをｐＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ｐＵＬ３５と称する。
【００６１】
（１−２）組換えウイルスＹＫ６０１の作製
野生体の性状を保持し、かつ、ＵＬ３−ＵＬ４遺伝子間領域にバクミド（bacmid）が挿入された組換えウイルスＹＫ３０４（J. Virol., 77: 1382-1391, 2003）のウイルスＤＮＡとｐＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ｐＵＬ３５をウサギ皮膚細胞（ＲＳＣ）にトランスフェクトした。その後、相同組み換えによって産生された、ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ遺伝子がＵＬ３５遺伝子のＮ末領域に挿入された組換えウイルスＹＫ６０１を、蛍光顕微鏡下において、蛍光を発するプラークを採取することによって選択した。また、１００％のプラークが蛍光を発するまで、蛍光顕微鏡下においてプラーク純化を行った。
【００６２】
ＹＫ６０１が目的の組換えウイルスであることはサザン法にて確認した。具体的には、ＹＫ３０４およびＹＫ６０１のウイルスＤＮＡをＳａｌＩで処理後、サザン法に供した。プローブは、ＵＬ３５の開始コドンから上流および下流にそれぞれ１ｋｂｐの領域（ＨＳＶゲノムについてのGenBank Accession No. X14112を参照）をＰＣＲで増幅した断片を用いた。ＰＣＲには以下のプライマーを用いた：ＧＣＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣｔｔａａｃｃｇｇｔｔｃｃｔｇｇａｃｃｔｇ（配列番号５）、およびＧＣＧＡＡＧＣＴＴｔｔｃｃｇｃｇｔｃｔｔｃｃａｃａａａｔｃ（配列番号４）。ＵＬ３５遺伝子を含むＳａｌＩ断片がＹＫ６０１ではＹＫ３０４と比してＶｅｎｕｓ遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。
【００６３】
また、感染細胞においてＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５融合タンパク質が発現していることを、感染細胞ライセートを用いたウエスタン法にて確認した。また、ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５融合タンパク質がウイルス粒子に取り込まれていることを、精製ウイルス粒子のライセートを用いたウエスタン法にて確認した。ウエスタン法においては、ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５融合タンパク質の検出は、抗ＧＦＰ抗体（ＭＢＬ）および抗ＵＬ３５抗体を用いて行った。抗ＵＬ３５抗体は、ＵＬ３５をＧＳＴと融合させるかたちで大腸菌で発現・精製し、ウサギに免役した抗血清である。
実施例２：テグメントを標識した組換えウイルスの作製
（２−１）テグメントＵＬ４９を標識した組換えウイルス
（２−１−１）トランスファープラスミド（ｐｍＲＦＰ１−ＵＬ４９）の構築
（ｉ）終始コドンを含まない蛍光タンパク質ｍＲＦＰ１（PNAS, 99: 7787-7882, 2002）のＯＲＦをＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ増幅には以下のプライマーを用いた：ＧＣＡＣＴＡＧＴＣＧＣＣＡＣＣａｔｇｇｃｃｔｃｃｔｃｃｇａｇｇａｃｇｔ（配列番号７）およびＧＣＧＡＡＴＴＣｇｇｃｇｃｃｇｇｔｇｇａｇｔｇｇｃｇｇｃ（配列番号８）。ＰＣＲ産物として得られたｍＲＦＰ１を、pBluescript II KS+ (Stratagene)のＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。
【００６４】
（ｉｉ）ＨＳＶ−１ Ｆ株（J. Gen. Virol., 2: 357-364, 1968）のＵＬ４９遺伝子の２番目のコドンから約１ｋｂｐ（ＨＳＶゲノムについてのGenBank accession No. X14112を参照）をＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲには以下のプライマーを用いた：ＧＣＧＡＡＴＴＣａｃｃｔｃｔｃｇｃｃｇｃｔｃｃｇｔｇａａ（配列番号９）およびＧＣＧＡＡＧＣＴＴｔｃｃｃｃｇｔｃｇｇａｔｔｇｇｇａａａｃ（配列番号１０）。ＰＣＲ産物として得られたＵＬ４９遺伝子を、上記（ｉ）で作製された、ｍＲＦＰ１がクローニングされたpBluescript II KS+ のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にｍＲＦＰ１とＵＬ４９遺伝子が融合するかたちでクローニングした。
【００６５】
（ｉｉｉ）ＨＳＶ−１ Ｆ株（同上）のＵＬ４９遺伝子の上流約１ｋｂｐ（ＨＳＶゲノムについてのGenBank accession No. X14112を参照）をＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲには以下のプライマーを用いた：ＧＣＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣｔｃｇｃｃａｇｇａｔｇｔｃｃａｇｇａａｃ（配列番号１１）およびＧＣＡＣＴＡＧＴｇｇｔｔｃｃａｃｇａａｃａｃｇｃｔａｇｇ（配列番号１２）。ＰＣＲ産物として得られたＵＬ４９遺伝子の上流側を含む断片を、上記（ｉｉ）で作製された、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４９遺伝子がクローニングされたpBluescript II KS+ のＮｏｔＩ−ＳｐｅＩ部位にさらにクローニングした。
【００６６】
得られたプラスミドは、pBluescript II KS+のマルチプルクローニングサイト領域に、５’側から順に、ＵＬ４９遺伝子の上流約１ｋｂｐ、ｍＲＦＰ１のＯＲＦ、およびＵＬ４９遺伝子の２番目のコドンから約１ｋｂｐを含むプラスミドである。以下、得られたプラスミドをｐｍＲＦＰ１−ＵＬ４９と称する。
【００６７】
（２−１−２）組換えウイルスＹＫ６０２の作製
組換えウイルスＹＫ３０４のウイルスＤＮＡとｐｍＲＦＰ１−ＵＬ４９をＲＳＣにトランスフェクトした。その後、相同組み換えによって産生された、ｍＲＦＰ１遺伝子がＵＬ４９遺伝子のＮ末領域に挿入された組み換えウイルスＹＫ６０２を、蛍光顕微鏡下において、蛍光を発するプラークを採取することによって選択した。また、１００％のプラークが蛍光を発するまで、蛍光顕微鏡下においてプラーク純化を行った。
【００６８】
ＹＫ６０２が目的の組み換えウイルスであることはサザン法にて確認した。具体的には、ＹＫ３０４およびＹＫ６０２のウイルスＤＮＡをＥｃｏＲＶで処理後、サザン法に供した。プローブは、ＵＬ４９の開始コドンから上流および下流にそれぞれ１ｋｂｐの領域(ＨＳＶゲノムについてのGenBank Accession No. X14112を参照)をＰＣＲで増幅した断片を用いた。ＰＣＲには以下のプライマーを用いた：ＧＣＧＡＡＴＴＣａｃｃｔｃｔｃｇｃｃｇｃｔｃｃｇｔｇａａ（配列番号９）、ＧＣＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣｔｃｇｃｃａｇｇａｔｇｔｃｃａｇｇａａｃ（配列番号１１）。ＵＬ４９遺伝子を含むＥｃｏＲＶ断片がＹＫ６０２ではＹＫ３０４と比してｍＲＦＰ１遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。
【００６９】
また、感染細胞においてｍＲＦＰ１−ＵＬ４９融合タンパク質が発現していることを、感染細胞ライセートを用いたウエスタン法にて確認した。また、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４９融合タンパク質がウイルス粒子に取り込まれていることを、精製ウイルス粒子のライセートを用いたウエスタン法にて確認した。ウエスタン法においては、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４９融合タンパク質の検出は、抗ＵＬ４９抗体（J. Virol., 79: 6947-6956, 2005）または抗ｍＲＦＰ１抗体（ＭＢＬ）を用いて行った。
【００７０】
（２−２）テグメントＵＬ４７を標識した組換えウイルス
（２−２−１）トランスファープラスミド（ｐｍＲＦＰ１−ＵＬ４７）の構築
（ｉ）終始コドンを含まない蛍光タンパク質ｍＲＦＰ１（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2002, 99(12): 7877-7882.）のＯＲＦをＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ増幅には以下のプライマーを用いた：ＧＣＡＣＴＡＧＴＣＧＣＣＡＣＣａｔｇｇｃｃｔｃｃｔｃｃｇａｇｇａｃｇｔ（配列番号７）およびＧＣＧＡＡＴＴＣｇｇｃｇｃｃｇｇｔｇｇａｇｔｇｇｃｇｇｃ（配列番号８）。ＰＣＲ産物として得られたｍＲＦＰ１を、pBluescript II KS+ (Stratagene)のＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。
【００７１】
（ｉｉ）ＨＳＶ−１ Ｆ株（J. Gen. Virol., 2: 357-364, 1968）のＵＬ４７遺伝子の２番目のコドンから約１ｋｂｐ（ＨＳＶゲノムについてのGenBank accession No. X14112を参照）をＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲには以下のプライマーを用いた：ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＧＧＣＴＣＧＣＧＡＡＣＣＣＧＣＧＧＧ（配列番号１３）およびＧＣＧＡＡＧＣＴＴＡＴＴＧＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＧＣＡＧＧＧ（配列番号１４）。ＰＣＲ産物として得られたＵＬ４７遺伝子を、上記（ｉ）で作製された、ｍＲＦＰ１がクローニングされたpBluescript II KS+ のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にｍＲＦＰ１とＵＬ４７遺伝子が融合するかたちでクローニングした。
【００７２】
（ｉｉｉ）ＨＳＶ−１ Ｆ株（同上）のＵＬ４７遺伝子の上流約１ｋｂｐ（ＨＳＶについてのGenBank accession No. X14112を参照）をＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲには以下のプライマーを用いた：ＧＣＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＡＣＣＴＴＡＡＣＣＴＣＣＣＧＣＴＧ（配列番号１５）およびＧＣＡＣＴＡＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＡＧＡＣＧＣＧＧＧＴＴ（配列番号１６）。ＰＣＲ産物として得られたＵＬ４７遺伝子の上流側を含む断片を、上記（ｉｉ）で作製された、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４７遺伝子がクローニングされたpBluescript II KS+ のＮｏｔＩ−ＳｐｅＩ部位にさらにクローニングした。
【００７３】
得られたプラスミドは、pBluescript II KS+のマルチプルクローニングサイト領域に、５’側から順に、ＵＬ４７遺伝子の上流約１ｋｂｐ、ｍＲＦＰ１のＯＲＦ、およびＵＬ４７遺伝子の２番目のコドンから約１ｋｂｐを含むプラスミドである。以下、得られたプラスミドをｐｍＲＦＰ１−ＵＬ４７と称する。
【００７４】
（２−２−２）組換えウイルスＹＫ６０３の作製
組み換えウイルスＹＫ３０４のウイルスＤＮＡとｐｍＲＦＰ１−ＵＬ４７をＲＳＣにトランスフェクトした。その後、相同組み換えによって産生された、ｍＲＦＰ１遺伝子がＵＬ４７遺伝子のＮ末領域に挿入された組み換えウイルスＹＫ６０３を、蛍光顕微鏡下において、蛍光を発するプラークを採取することによって選択した。また、１００％のプラークが蛍光を発するまで、蛍光顕微鏡下においてプラーク純化を行った。
【００７５】
ＹＫ６０３が目的の組み換えウイルスであることはサザン法にて確認した。具体的には、ＹＫ３０４およびＹＫ６０３のウイルスＤＮＡをＥｃｏＲＶで処理後、サザン法に供した。プローブは、ＵＬ４７の開始コドンから上流および下流にそれぞれ１ｋｂｐの領域（GenBank Accession No. X14112）をＰＣＲで増幅した断片を用いた。ＰＣＲには以下のプライマーを用いた：ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＡＴＴＧＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＧＣＡＧＧＧ（配列番号１４）、ＧＣＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＡＣＣＴＴＡＡＣＣＴＣＣＣＧＣＴＧ（配列番号１５）。ＵＬ４７遺伝子を含むＥｃｏＲＶ断片がＹＫ６０３ではＹＫ３０４と比してｍＲＦＰ１遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。
【００７６】
また、感染細胞においてｍＲＦＰ１−ＵＬ４７融合タンパク質が発現していることを、感染細胞ライセートを用いたウエスタン法にて確認した。また、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４７融合タンパク質がウイルス粒子に取り込まれていることを、精製ウイルス粒子のライセートを用いたウエスタン法にて確認した。ウエスタン法においては、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４７融合タンパク質の検出は、抗ｍＲＦＰ１抗体（ＭＢＬ）を用いて行った。
実施例３：エンベロープを標識した組換えウイルスの作製
（３−１）トランスファープラスミド（ｐＥＣＦＰＡ２０７Ｋ−ＵＬ２７）の構築
（ｉ）蛍光タンパク質ＥＣＦＰ（Clontech）の２０７番目のアラニン残基をリジン残基に置換した変異体ＥＣＦＰＡ２０７ＫをQuickChange site-directed mutagenesis kit （Stratagene）で作製した。
【００７７】
（ｉｉ）ＨＳＶ−１ Ｆ株（J. Gen Virol., 2: 357-364, 1968）のＵＬ２７遺伝子の開始コドンの上流約１ｋｂｐからＵＬ２７遺伝子の開始コドンの下流約１ｋｂｐまでの領域（ＨＳＶゲノムについてのGenBank accession No. X14112を参照）をＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲには以下のプライマーを用いた：ＧＣＴＣＴＡＧＡｃｃｔｇａｃｇａａｇｃｇｇｔｃｇｔｔｇｇ（配列番号１７）およびＧＣＧＡＡＧＣＴＴｇａｇａａｔｃｇｇａａｇｇａｇｃｃｇｃｃ(配列番号１８)。ＰＣＲ産物として得られたＵＬ２７遺伝子を含む断片を、pBluescript II KS+ のＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。
【００７８】
（ｉｉｉ）開始コドンおよび終始コドンを含まないＥＣＦＰＡ２０７ＫのＯＲＦをＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ増幅には以下のプライマーを用いた：ＧＣＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣａｇｔｇａｇｃａａｇｇｇｃｇａｇｇａｇｃｔ（配列番号１９）およびＧＣＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣ(配列番号２０)。上記（ｉｉ）で作製された、ＵＬ２７遺伝子の開始コドンの上流約１ｋｂｐからＵＬ２７遺伝子の開始コドンの下流約１ｋｂｐまでの領域がクローニングされたpBluescript II KS+ （Stratagene）のＮｏｔＩ部位に、ＵＬ２７遺伝子と融合するかたちでクローニングした。
【００７９】
得られたプラスミドは、pBluescript II KS+のマルチプルクローニングサイト領域に、５’側から順に、ＵＬ２７の開始コドンの上流約１ｋｂｐ、ＵＬ２７の開始コドンから約１００ｂｐ、ＥＣＦＰＡ２０７ＫのＯＲＦ、およびＵＬ２７遺伝子の開始コドンから約１００ｂｐのさらに下流約１ｋｂｐまでの領域を含むプラスミドである。以下、得られたプラスミドをｐＥＣＦＰＡ２０７Ｋ−ＵＬ２７と称する。
【００８０】
（３−２）組換えウイルスＹＫ６０４の作製
組換えウイルスＹＫ３０４のウイルスＤＮＡとｐＥＣＦＰＡ２０７Ｋ−ＵＬ２７をＲＳＣにトランスフェクトした。その後、相同組み換えによって産生された、ＥＣＦＰＡ２０７Ｋ遺伝子がＵＬ２７遺伝子のＮ末領域に挿入された組み換えウイルスＹＫ６０４を、蛍光顕微鏡下において、蛍光を発するプラークを採取することによって選択した。また、１００％のプラークが蛍光を発するまで、蛍光顕微鏡下においてプラーク純化を行った。
【００８１】
ＹＫ６０４が目的の組み換えウイルスであることはサザン法にて確認した。具体的には、ＹＫ３０４およびＹＫ６０４のウイルスＤＮＡをＢａｍＨＩで処理後、サザン法に供した。プローブは、ＵＬ２７遺伝子の開始コドンから上流および下流にそれぞれ１ｋｂｐの領域（ＨＳＶゲノムについてのGenBank Accession No. X14112を参照）をＰＣＲで増幅した断片を用いた。ＰＣＲには以下のプライマーを用いた：ＧＣＴＣＴＡＧＡｃｃｔｇａｃｇａａｇｃｇｇｔｃｇｔｔｇｇ（配列番号１７）、ＧＣＧＡＡＧＣＴＴｃｇｇｇｃｃｔｔｇｇｔｇｇｔｇａｇｇｔｃ（配列番号２１）。ＵＬ２７遺伝子を含むＥｃｏＲＶ断片がＹＫ６０４ではＹＫ３０４と比してＥＣＦＰ遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。
【００８２】
また、感染細胞においてＥＣＦＰ−ＵＬ２７融合タンパク質が発現していることを、感染細胞ライセートを用いたウエスタン法にて確認した。また、ＥＣＦＰ−ＵＬ２７融合タンパク質がウイルス粒子に取り込まれていることを、精製ウイルス粒子のライセートを用いたウエスタン法にて確認した。ウエスタン法においては、ＥＣＦＰ−ＵＬ２７融合タンパク質の検出は、抗ＵＬ２７抗体（Rumbaugh-Goodwin Institute）または抗ＧＦＰ抗体（MBL)を用いて行った。
実施例４：カプシドおよびテグメントを標識した組換えウイルスの作製
（４−１）組換えウイルスＹＫ６０５の作製
組み換えウイルスＹＫ６０１とＹＫ６０２を感染効率（ＭＯＩ：multiplicity of infection） ５でＶｅｒｏ細胞に共感染させた。その後、相同組み換えによって産生された、ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ遺伝子がＵＬ３５遺伝子のＮ末端領域に挿入され、かつ、ｍＲＦＰ１遺伝子がＵＬ４９遺伝子のＮ末端領域に挿入された組換えウイルスＹＫ６０５を、蛍光顕微鏡下において、２色の蛍光を発するプラークを採取することによって選択した。また、１００％のプラークが２色の蛍光を発するまで、蛍光顕微鏡下においてプラーク純化を行った。
【００８３】
ＹＫ６０５が目的の組換えウイルスであることはサザン法にて確認した。具体的には、ＹＫ３０４およびＹＫ６０５のウイルスＤＮＡをＳａｌＩで処理後、サザン法に供し、実施例１の（１−２）と同様にして、ＵＬ３５遺伝子を含むＳａｌＩ断片がＹＫ６０５ではＹＫ３０４と比してＶｅｎｕｓ遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。また、ＹＫ３０４およびＹＫ６０５のウイルスＤＮＡをＥｃｏＲＶで処理後、サザン法に供し、実施例２の（２−１−２）と同様にして、ＵＬ４９遺伝子を含むＥｃｏＲＶ断片がＹＫ６０５ではＹＫ３０４と比してｍＲＦＰ１遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。
【００８４】
また、感染細胞においてＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５およびｍＲＦＰ１−ＵＬ４９融合タンパク質が発現していることを、感染細胞ライセートを用いたウエスタン法にて確認した。また、ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５およびｍＲＦＰ１−ＵＬ４９融合タンパク質がウイルス粒子に取り込まれていることを、精製ウイルス粒子のライセートを用いたウエスタン法にて確認した。ウエスタン法におけるＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５融合タンパク質およびｍＲＦＰ１−ＵＬ４９融合タンパク質の検出は、実施例１および２と同様に行った。
【００８５】
（４−２）組換えウイルスＹＫ６０６の作製
組換えウイルスＹＫ６０１とＹＫ６０３をＭＯＩ ５でＶｅｒｏ細胞に共感染させた。その後、相同組み換えによって産生された、ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ遺伝子がＵＬ３５遺伝子のＮ末端領域に挿入され、かつ、ｍＲＦＰ１遺伝子がＵＬ４７遺伝子のＮ末端領域に挿入された組換えウイルスＹＫ６０６を、蛍光顕微鏡下において、２色の蛍光を発するプラークを採取することによって選択した。また、１００％のプラークが２色の蛍光を発するまで、蛍光顕微鏡下においてプラーク純化を行った。
【００８６】
ＹＫ６０６が目的の組み換えウイルスであることはサザン法にて確認した。具体的には、ＹＫ３０４およびＹＫ６０６のウイルスＤＮＡをＳａｌＩで処理後、サザン法に供し、実施例１の（１−２）と同様にして、ＵＬ３５遺伝子を含むＳａｌＩ断片がＹＫ６０６ではＹＫ３０４と比してＶｅｎｕｓ遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。また、ＹＫ３０４およびＹＫ６０６のウイルスＤＮＡをＥｃｏＲＶで処理後、サザン法に供し、実施例２の（２−２−２）と同様にして、ＵＬ４７遺伝子を含むＥｃｏＲＶ断片がＹＫ６０６ではＹＫ３０４と比してｍＲＦＰ１遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。
【００８７】
また、感染細胞においてＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５およびｍＲＦＰ１−ＵＬ４７融合タンパク質が発現していることを、感染細胞ライセートを用いたウエスタン法にて確認した。また、ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５およびｍＲＦＰ１−ＵＬ４７融合タンパク質がウイルス粒子に取り込まれていることを、精製ウイルス粒子のライセートを用いたウエスタン法にて確認した。ウエスタン法におけるＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５融合タンパク質およびｍＲＦＰ１−ＵＬ４７融合タンパク質の検出は、実施例１および２と同様に行った。
実施例５：カプシド、テグメントおよびエンベロープを標識した組換えウイルスの作製
（５−１）組換えウイルスＹＫ６０８の作製
組換えウイルスＹＫ６０５とＹＫ６０４をＭＯＩ ５でＶｅｒｏ細胞に共感染させた。その後、相同組み換えによって産生された、ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ遺伝子がＵＬ３５遺伝子のＮ末端領域に挿入され、ｍＲＦＰ１遺伝子がＵＬ４９遺伝子のＮ末端領域に挿入され、かつ、ＥＣＦＰＡ２０７Ａ遺伝子がＵＬ２７遺伝子のＮ末端領域に挿入された組み換えウイルスＹＫ６０８を、蛍光顕微鏡下において、３色の蛍光を発するプラークを採取することによって選択した。また、１００％のプラークが３色の蛍光を発するまで、蛍光顕微鏡下においてプラーク純化を行った。
【００８８】
ＹＫ６０８が目的の組み換えウイルスであることはサザン法にて確認した（図２）。具体的には、ＹＫ３０４およびＹＫ６０８のウイルスＤＮＡをＳａｌＩで処理後、サザン法に供し、実施例１の（１−２）と同様にして、ＵＬ３５遺伝子を含むＳａｌＩ断片がＹＫ６０８ではＹＫ３０４と比してＶｅｎｕｓ遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。また、ＹＫ３０４およびＹＫ６０８のウイルスＤＮＡをＥｃｏＲＶで処理後、サザン法に供し、実施例２の（２−１−２）と同様にして、ＵＬ４９遺伝子を含むＥｃｏＲＶ断片がＹＫ６０８ではＹＫ３０４と比してｍＲＦＰ１遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。そして、ＹＫ３０４およびＹＫ６０８のウイルスＤＮＡをＢａｍＨＩで処理後、サザン法に供し、実施例３の（３−２）と同様にして、ＵＬ２７遺伝子を含むＥｃｏＲＶ断片がＹＫ６０８ではＹＫ３０４と比してＥＣＦＰ遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。
【００８９】
また、感染細胞においてＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４９およびＥＣＦＰＡ２０７Ｋ−ＵＬ２７融合タンパク質が発現していることを、感染細胞ライセートを用いたウエスタン法にて確認した（図３）。また、ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４９およびＥＣＦＰＡ２０７Ｋ−ＵＬ２７融合タンパク質がウイルス粒子に取り込まれていることを、精製ウイルス粒子のライセートを用いたウエスタン法にて確認した（図４）。ウェスタン法におけるＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４９およびＥＣＦＰＡ２０７Ｋ−ＵＬ２７融合タンパク質の検出は、実施例１ないし３と同様に行った。
【００９０】
（５−２）組み換えウイルスＹＫ６０９の作製
組換えウイルスＹＫ６０６とＹＫ６０４をＭＯＩ ５でＶｅｒｏ細胞に共感染させた。その後、相同組み換えによって産生された、ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ遺伝子がＵＬ３５遺伝子のＮ末端領域に挿入され、ｍＲＦＰ１遺伝子がＵＬ４７遺伝子のＮ末端領域に挿入され、かつ、ＥＣＦＰＡ２０７Ａ遺伝子がＵＬ２７遺伝子のＮ末端領域に挿入された組み換えウイルスＹＫ６０９を、蛍光顕微鏡下において、３色の蛍光を発するプラークを採取することによって選択した。また、１００％のプラークが３色の蛍光を発するまで、蛍光顕微鏡下においてプラーク純化を行った。
【００９１】
ＹＫ６０９が目的の組み換えウイルスであることはサザン法にて確認した（図５）。具体的には、ＹＫ３０４およびＹＫ６０９のウイルスＤＮＡをＳａｌＩで処理後、サザン法に供し、実施例１の（１−２）と同様にして、ＵＬ３５遺伝子を含むＳａｌＩ断片がＹＫ６０９ではＹＫ３０４と比してＶｅｎｕｓ遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。また、ＹＫ３０４およびＹＫ６０９のウイルスＤＮＡをＥｃｏＲＶで処理後、サザン法に供し、実施例２の（２−２−２）と同様にして、ＵＬ４７遺伝子を含むＥｃｏＲＶ断片がＹＫ６０９ではＹＫ３０４と比してｍＲＦＰ１遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。そして、ＹＫ３０４およびＹＫ６０９のウイルスＤＮＡをＢａｍＨＩで処理後、サザン法に供し、実施例３の（３−２）と同様にして、ＵＬ２７遺伝子を含むＥｃｏＲＶ断片がＹＫ６０９ではＹＫ３０４と比してＥＣＦＰ遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。
【００９２】
また、感染細胞においてＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４７およびＥＣＦＰＡ２０７Ｋ−ＵＬ２７融合タンパク質が発現していることを、感染細胞ライセートを用いたウエスタン法にて確認した（図６）。また、ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４７およびＥＣＦＰＡ２０７Ｋ−ＵＬ２７融合タンパク質がウイルス粒子に取り込まれていることを、精製ウイルス粒子のライセートを用いたウエスタン法にて確認した（図７）。ウエスタン法におけるＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４７およびＥＣＦＰＡ２０７Ｋ−ＵＬ２７融合タンパク質の検出は、実施例１ないし３と同様に行った。
実施例６：ＹＫ６０８とＹＫ６０９の性状解析
（ｉ）ＹＫ３０４、ＹＫ６０８およびＹＫ６０９をＶｅｒｏ細胞にＭＯＩ ０．０１またはＭＯＩ ５で感染させ、６時間ごと、２４時間の各ウイルスの増殖を比較した（図８）。ＹＫ６０８およびＹＫ６０９は野生体ＹＫ３０４と比して、それぞれの時点におけるウイルスタイターが低い傾向があるが、野生体と同様な増殖様式を示した。
【００９３】
（ｉｉ）φ６０ｍｍのガラスボトムディッシュ（ＭａｔＴｅｋ）にＶｅｒｏ細胞を捲き、ＹＫ６０８およびＹＫ６０９をＶｅｒｏ細胞にＭＯＩ ５で感染させた。温度コントロールおよびＣＯ2濃度コントロールが可能なチャンバーを搭載した共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ５：Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で、１０分間隔で２４時間のタイムラプス観察を行った。その結果、生きた感染細胞における各ウイルス粒子コンポーネント（カプシド、テグメント、エンベロープ）の生成の様子を観察することが可能であった（図１０）。また、細胞外のウイルス粒子を観察することが可能であった（図９）。
【００９４】
（ｉｉｉ）新生タンパク質の細胞内輸送を阻害する薬剤であるブレフェルディンＡ（Brefeldin A）またはモネンシン（Monensin）を（ｉｉ）の系に添加すると、各ウイルスコンポーネントの挙動および発現量が野生体と比して明らかに異なることが確認された（図１１）。Ｍｏｃｋ処理では、カプシド、テグメント、エンベロープはウイルスファクトリーと考えられる複数のドメインで共局在する。しかし、両薬剤を添加するとウイルスファクトリーと考えられるドメインの形成が著しく阻害される。また、テグメントとエンベロープの発現量が明らかに低下する。ブレフェルディンＡを処理するとＨＳＶの増殖が阻害されることが報告されている（J. Virol., 65: 1893-1904, 1991）。
本実施例の結果は、本系が薬剤の作用機序の解析およびウイルス粒子コンポーネントの局在や発現量の変化を指標にした新しい抗ウイルス剤のスクリーニング系に有用であることを示すものである。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
ＨＳＶは、ヒトに脳炎、性器ヘルペス、皮膚疾患、眼疾患、小児ヘルペスなどの多様な病態を引き起こす。ヘルペスウイルス感染症の医療費は、年間３０億ドル（約３５００億円）と試算されている。
【００９６】
本発明の組換えウイルスおよびそれを利用した抗ＨＳＶ剤スクリーニング系、抗ＨＳＶ剤の作用機序解析系は、そのまま抗ＨＳＶ剤開発の現場で利用可能である。抗ウイルス剤の宿命として、薬剤耐性ウイルスの出現が挙げられるが、そのために、常に新たな作用機序の抗ウイルス剤を開発することが必要であり、実際に、製薬業界においては抗ＨＳＶ剤の開発が盛んに行われている。また、抗ウイルス剤を開発する際にその作用機序が明らかになっていることは、その抗ウイルス剤の安全性や信頼性を高める上で必須である。これらのことを鑑みて、本発明は抗ＨＳＶ剤の開発に貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、ＨＳＶ粒子の模式図（Ａ）と、組換えウイルスＹＫ６０８およびＹＫ６０９のゲノム模式図（Ｂ）である。
【図２】図２は、組換えウイルスＹＫ６０８のサザン法による解析結果を示す写真である。
【図３】図３は、組換えウイルスＹＫ６０８を感染させた細胞のライセートのウエスタン法による解析結果を示す写真である。ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４９、およびＥＣＦＰＡ２０７Ｋ−ＵＬ２７融合タンパク質の発現を確認した。
【図４】図４は、組換えウイルスＹＫ６０８の精製ウイルス粒子のライセートのウエスタン法による解析結果を示す写真である。ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４９、およびＥＣＦＰＡ２０７Ｋ−ＵＬ２７融合タンパク質がウイルス粒子に取り込まれていることを確認した。
【図５】図５は、組換えウイルスＹＫ６０９のサザン法による解析結果を示す写真である。
【図６】図６は、組換えウイルスＹＫ６０９を感染させた細胞のライセートのウエスタン法による解析結果を示す写真である。ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４７、およびＥＣＦＰＡ２０７Ｋ−ＵＬ２７融合タンパク質の発現を確認した。
【図７】図７は、組換えウイルスＹＫ６０９の精製ウイルス粒子のライセートのウエスタン法による解析結果を示す写真である。ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４７、およびＥＣＦＰＡ２０７Ｋ−ＵＬ２７融合タンパク質がウイルス粒子に取り込まれていることを確認した。
【図８】図８は、ＹＫ３０４、ＹＫ６０８、ＹＫ６０９組換えウイルスを感染させたＶｅｒｏ細胞におけるウイルスの増殖を示すグラフである。
【図９】図９は、ＹＫ６０８組換えウイルスを感染させたＶｅｒｏ細胞および細胞外における各ウイルス粒子コンポーネントのリアルタイムイメージング画像である。
【図１０】図１０は、ＹＫ６０８組換えウイルスを感染させたＶｅｒｏ細胞における各ウイルス粒子コンポーネント生成過程のリアルタイムイメージング画像である。
【図１１】図１１は、ブレフェルディンＡまたはモネンシン存在下および非存在下での、ＹＫ６０８組換えウイルスを感染させたＶｅｒｏ細胞における各ウイルス粒子コンポーネント生成過程を比較したリアルタイムイメージング画像である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス粒子の３つのコンポーネントを異なる蛍光タンパク質で標識した組換えウイルスに関する。本発明はまた、当該組換えウイルスを感染させた細胞に関する。本発明はまた、当該組換えウイルスを用いた、ウイルス粒子についての一連の成熟過程の解析方法、抗ウイルス剤の作用機序の解析方法、および、作用機序に特化した抗ウイルス剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、ヒトに脳炎、性器ヘルペス、皮膚疾患、眼疾患、小児ヘルペスなどの多様な病態を引き起こす。ヘルペスウイルス感染症の医療費は、年間３０億ドル（約３５００億円）と試算されている。現在使用されている抗単純ヘルペスウイルス剤（抗ＨＳＶ剤）としては、アシクロビルなどが知られている。アシクロビルはＨＳＶのチミジンキナーゼ（ＴＫ）を標的としているが、ＴＫ遺伝子領域に変異を有する薬剤耐性ウイルスの出現が問題となっており、新たな作用機序、例えば、ウイルス粒子成熟過程を特異的に阻害するような抗ＨＳＶ剤の開発が求められている。
【０００３】
従来、抗ＨＳＶ剤スクリーニングにおいては、ウイルスによる細胞変性効果を指標にした方法や、１種類のレポーター遺伝子を発現する組換えＨＳＶ感染細胞におけるリポータータンパク質の発現量を指標とした方法が行われている。しかし、これらのスクリーニング系では、作用機序に特化した抗ＨＳＶ剤のスクリーニングは困難であった。
【０００４】
ＨＳＶウイルス粒子は、カプシド、テグメント、エンベロープといった３つのコンポーネントより構成されており、まず、核でカプシドが生成され、その後、カプシドは細胞質でテグメントを付着させ、最後にエンベロープを獲得してウイルス粒子が構築される。１９９８年および１９９９年にそれぞれカプシドまたはテグメントタンパク質を蛍光タンパク質で標識した組換えウイルスによる各ウイルスタンパク質の生細胞における動態解析が報告された（P. Desai and S. Person, J. Virol., 1998, Vol.72, No.9, p.7563-7568; G. Elliott and P. O'hare, J. Virol., 1999, Vol.73, No.5, p.4110-4119）。その後、２００５年にカプシドおよびテグメントをそれぞれ異なる蛍光タンパク質で標識した組換えウイルスが作成され、カプシドがテグメントを獲得する過程を解析することが可能となった（T. del Rio, et al., J. Virol., 2005, Vol.79, No.7, p.3903-3919）。しかしながら、ＨＳＶ粒子は３つのコンポーネントより構成されているので、一連のＨＳＶウイルス粒子成熟過程を解析するためには、カプシド、テグメント、エンベロープの３つの生成過程および生成後の動態を同時に解析するためには、上述の１つまたは２つのウイルス粒子コンポーネントを蛍光タンパク質で標識する実験系では不十分であった。
【０００５】
一方、カプシド、テグメントおよびエンベロープの３つのウイルス粒子コンポーネントの生成過程および生成後の動態を同時に解析可能な実験系は、ＨＳＶウイルス粒子についての一連の成熟過程の解析、および作用機序に特化した抗ＨＳＶ剤のスクリーニング法にも利用可能であると考えられ、そのような実験系の確立が強く求められていた。
【０００６】
そのような実験系として、３つのウイルス粒子コンポーネントを異なる３つの蛍光タンパク質で標識した組換えウイルスを作製することが考えられた。しかし、上述したように、１つのウイルス粒子コンポーネントを１つの蛍光タンパク質で標識した組換えウイルスが作成されてから、２つのウイルス粒子コンポーネントを２つの異なる蛍光タンパク質で標識した組換えウイルスが作成されるまでに、約７年の年月を費やされており、ウイルス粒子コンポーネントの蛍光タンパク質による標識により、ウイルス粒子の不安定化を招くことが推測されていた。これらの事情から、３つのウイルス粒子コンポーネントを異なる３つの蛍光タンパク質で標識した組換えウイルスを作製することやそのような組換えウイルスを含む実験系の確立は困難であると予想されていた。
【非特許文献１】P. Desai and S. Person, J. Virol., 1998, Vol.72, No.9, p.7563-7568
【非特許文献２】G. Elliott and P. O'hare, J. Virol., 1999, Vol.73, No.5, p.4110-4119
【非特許文献３】T. del Rio, et al., J. Virol., 2005, Vol.79, No.7, p.3903-3919
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本願発明は、以下の態様１−１６を提供することを目的とする。
態様１：ウイルス粒子のコンポーネントであるカプシド、テグメントおよびエンベロープのそれぞれが、異なる３つの蛍光タンパク質で標識されている、組換えウイルス。
【０００８】
態様２：ウイルスが、ヘルペスウイルス科に属するウイルスより選択される、態様１に記載の組換えウイルス。
態様３：ウイルスが、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）である、態様１に記載の組換えウイルス。
【０００９】
態様４：ウイルスが単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）であり；カプシドがＵＬ３５、ＵＬ１８、ＵＬ１９、ＵＬ２６、およびＵＬ３８からなる群より選択され；テグメントがＵＬ４９、ＵＬ４７、ＵＬ４６、ＵＬ４８、ＵＬ４１、ＵＬ１１、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ３６、ＵＬ３７、ＵＬ５１、ＵＬ５６、Ｕｓ２、Ｕｓ９、Ｕｓ１０、およびＵｓ１１からなる群より選択され；そして、エンベロープがＵＬ２７、ＵＬ１、ＵＬ１０、ＵＬ２２、Ｕｓ６、ＵＬ４４、ＵＬ５３、Ｕｓ４、Ｕｓ５、Ｕｓ７、およびＵｓ８からなる群より選択される；態様１に記載の組換えウイルス。
【００１０】
態様５：蛍光タンパク質が、Ｖｅｎｕｓ、ｍＲＦＰ１、ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＢＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ＰｈｉＹＦＰ、Ｊ−Ｒｅｄ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ１、ＡｍＣｙａｎ１、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ｍＡｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ１、ＣｏｐＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１、ｍＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＰｌｕｍ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｅｑＦＰ６１１、およびＡｓＲｅｄ２からなる群より選択される、態様１ないし４のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
【００１１】
態様６：３つの異なる蛍光タンパク質が、それぞれ異なる蛍光波長を有する、態様１ないし５のいずれか１つに記載の組換えウイルス。
態様７：３つの異なるタンパク質が、ＥＣＦＰ、ＥＢＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ１、およびＡｍＣｙａｎ１からなる群より選択される１種類；Ｖｅｎｕｓ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ｍＡｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ１、ＣｏｐＧＦＰ、およびＺｓＧｒｅｅｎ１からなる群より選択される１種類；ならびに、ｍＲＦＰ１、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１、ｍＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＰｌｕｍ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｅｑＦＰ６１１、およびＡｓＲｅｄ２からなる群より選択される１種類；の組み合わせである、態様１ないし６のいずれか１つに記載の組換えウイルス。
【００１２】
態様８：３つの異なる蛍光タンパク質が、Ｖｅｎｕｓ、ｍＲＦＰ１およびＥＣＦＰの組み合わせである、態様１ないし６のいずれか１つに記載の組換えウイルス。
態様９：ウイルス粒子コンポーネントのＮ末端、Ｃ末端、または内部に蛍光タンパク質を融合させることにより、ウイルス粒子のコンポーネントが蛍光タンパク質で標識されている、態様１ないし８のいずれか１つに記載の組換えウイルス。
【００１３】
態様１０：ウイルスが単純ヘルペスウイルスであり、カプシドがＶｅｎｕｓで標識されたＵＬ３５であり、テグメントがｍＲＦＰ１で標識されたＵＬ４７またはＵＬ４９であり、エンベロープがＥＣＦＰで標識されたＵＬ２７である、態様１に記載の組換えウイルス。
【００１４】
態様１１：ウイルスが単純ヘルペスウイルスであり、カプシドがＮ末端をＶｅｎｕｓで標識されたＵＬ３５であり、テグメントがＮ末端をｍＲＦＰ１で標識されたＵＬ４７またはＵＬ４９であり、エンベロープがＮ末端領域の内部をＥＣＦＰで標識されたＵＬ２７である、態様１に記載の組換えウイルス。
【００１５】
態様１２：態様１ないし１１のいずれか１つに記載の組換えウイルスを感染させた細胞。
態様１３：抗ウイルス剤の作用機序を解析する方法であって、以下：
（ｉ）態様１ないし１１のいずれか１つに記載の組換えウイルスで感染させた細胞に、抗ウイルス剤を接触させ；
（ｉｉ）ウイルス粒子のコンポーネントであるカプシド、テグメント、およびエンベロープを標識した各蛍光タンパク質の蛍光に基づいて、各コンポーネントの当該感染細胞における生成の挙動および／または局在を観察し；
（ｉｉｉ）観察された各コンポーネントの生成の挙動および／または局在について、抗ウイルス剤を接触させていない感染細胞における各コンポーネントの生成の挙動および／または局在との差異を評価し；そして
（ｉｖ）当該抗ウイルス剤は、生成の挙動および／または局在に差異があるコンポーネントが関与するウイルス粒子成熟過程に作用すると判断する；
工程を含む、前記方法。
【００１６】
態様１４：感染細胞におけるウイルス粒子の各コンポーネントの生成の挙動の観察を、リアルタイムイメージングにより行う、態様１３に記載の方法。
態様１５： 特定のウイルス粒子成熟過程を標的とする抗ウイルス剤をスクリーニングする方法であって、以下：
（ｉ）態様１ないし１１のいずれか１つに記載の組換えウイルスで感染させた細胞に、抗ウイルス剤の候補物質を接触させ；
（ｉｉ）ウイルス粒子のコンポーネントであるカプシド、テグメント、およびエンベロープを標識した各蛍光タンパク質の蛍光に基づいて、各コンポーネントの当該感染細胞における生成の挙動および／または局在を観察し；
（ｉｉｉ）観察された各コンポーネントの生成の挙動および／または局在について、抗ウイルス剤の候補物質を接触させていない感染細胞における各コンポーネントの生成の挙動および／または局在との差異を評価し；そして
（ｉｖ）差異を生じた場合は、当該抗ウイルス剤の候補物質を、生成の挙動および／または局在に差異があるコンポーネントが関与するウイルス粒子成熟過程を標的とする抗ウイルス剤として同定する；
工程を含む、前記方法。
【００１７】
態様１６：ウイルス粒子の成熟過程の解析方法であって、態様１ないし１１のいずれか１つに記載の組換えウイルスで感染させた細胞において、ウイルス粒子のコンポーネントであるカプシド、テグメント、およびエンベロープを標識した各蛍光タンパク質の蛍光に基づいて、各コンポーネント当該感染細胞におけるの生成の挙動および／または局在を観察することを含む、前記方法。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは上記課題の解決のために、鋭意研究に努めた結果、本発明に想到した。
具体的には、本発明者らは、単純ヘルペスウイルスについて、ウイルス粒子を構成するカプシドタンパク質ＵＬ３５、テグメントタンパク質ＵＬ４７またはＵＬ４９、およびエンベロープタンパク質ＵＬ２７を、それぞれ異なる蛍光タンパク質を融合させて標識することにより、３つのウイルス粒子コンポーネントがそれぞれ異なる３つの蛍光タンパク質で標識された組換え単純ヘルペスウイルスを取得することに成功した（後述の実施例を参照）。
【００１９】
本発明者らはまた、当該組換え単純ヘルペスウイルスで感染させた細胞は、ウイルス粒子コンポーネントを標識したそれぞれの蛍光タンパク質を効率的に発現していることを確認した。また、当該組換え単純ヘルペスウイルスで感染させた同一の生細胞において、各ウイルス粒子構成タンパク質の発現および局在を経時的に観察するリアルタイムイメージングも可能であった。さらに、当該組換え単純ヘルペスウイルスで感染させた細胞において、１つのウイルス粒子を３色の蛍光を発する粒子として観察することにより、１ウイルス粒子レベルで観察するリアルタイムイメージングも可能であった。
【００２０】
これらの実験結果から本発明者らは、ウイルス粒子を構成するカプシドタンパク質、テグメントタンパク質、およびエンベロープタンパク質が、それぞれ異なる蛍光タンパク質で標識された組換えウイルスが構築可能であることを見いだし、本発明に想到した。また、本発明の組換えウイルスで感染させた細胞においては、ウイルス粒子構成タンパク質の発現および局在を経時的に観察することができ、またウイルス粒子を１ウイルス粒子レベルで観察することもできるため、ウイルス粒子の生成過程の解析、抗ウイルス剤の作用機序の解析、および作用機序に特化した抗ウイルス剤のスクリーニングを行うための系として有用であることを見いだし、本発明に想到した。
【００２１】
以上、本発明の理解のために本発明を想到するに至る経緯を説明したが、本発明の範囲は上記説明に限定されず、請求の範囲の記載によって定められる。
以下、本発明について詳述する。
【００２２】
組換えウイルス
本発明は、ウイルス粒子のコンポーネントであるカプシド、テグメント、およびエンベロープのそれぞれが異なる３つの蛍光タンパク質で標識されている、組換えウイルスを提供する。
【００２３】
本明細書において、ウイルス粒子コンポーネントとは、広く一般にウイルス粒子を構成する成分を意味する。ウイルス粒子コンポーネントがタンパク質である場合は、特にウイルス粒子構成タンパク質と称する場合もある。
【００２４】
本発明の組換えウイルスは、ウイルス粒子コンポーネントとして、カプシド、テグメント、およびエンベロープの３つのタンパク質を含むウイルスであれば特に限定されない。そのようなウイルスとして、ヘルペスウイルス科に属するウイルスが挙げられる。
【００２５】
ヘルペスウイルス科に属するウイルスのうち好ましいのは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ブタヘルペスウイルス、ウマヘルペスウイルス、マレック病ウイルス、ウシヘルペスウイルス、トリ伝染性咽頭気管塩ウイルス、である。本発明の組換えウイルスとして特に好ましいのは、ＨＳＶである。
【００２６】
本発明の組換えウイルスにおいて蛍光タンパク質で標識されるカプシドタンパク質、テグメントタンパク質、およびエンベロープタンパク質の種類は特に限定されず、組換えウイルスの種類に応じて当業者が適宜選択することが可能である。
【００２７】
例えば、ウイルスが単純ヘルペスウイルスである場合、標識されるカプシドタンパク質は、ＵＬ３５、ＵＬ１８、ＵＬ１９、ＵＬ２６、およびＵＬ３８からなる群より選択され、好ましくはＵＬ３５である。また、標識されるテグメントタンパク質は、ＵＬ４９、ＵＬ４７、ＵＬ４６、ＵＬ４８、ＵＬ４１、ＵＬ１１、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ３６、ＵＬ３７、ＵＬ５１、ＵＬ５６、Ｕｓ２、Ｕｓ９、Ｕｓ１０、およびＵｓ１１からなる群より選択され、好ましくはＵＬ４９、ＵＬ４７、ＵＬ４６、ＵＬ４８、ＵＬ４１、ＵＬ３６、およびＵｓ１１からなる群より選択され、さらに好ましくはＵＬ４７またはＵＬ４９である。そして、標識されるエンベロープタンパク質は、ＵＬ２７、ＵＬ１、ＵＬ１０、ＵＬ２２、Ｕｓ６、ＵＬ４４、ＵＬ５３、Ｕｓ４、Ｕｓ５、Ｕｓ７、およびＵｓ８からなる群より選択され、好ましくはＵＬ２７、ＵＬ２２、ＵＬ４４、Ｕｓ６、Ｕｓ７、およびＵｓ８からなる群より選択され、さらに好ましくはＵＬ２７である。
【００２８】
本発明の組換えウイルスにおいて、各ウイルス粒子コンポーネントを標識する蛍光タンパク質は、蛍光を発するタンパク質であれば特に限定されない。本発明に利用可能な蛍光タンパク質として、具体的には例えば、Ｖｅｎｕｓ（励起波長：５１５ｎｍ、蛍光波長：５２８ｎｍ； Nat. Biotechnol., 2002, 20(1): 87-90）、ｍＲＦＰ１（励起波長：５８４ｎｍ、蛍光波長：６０７ｎｍ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99: 7877-7882）、ＥＣＦＰ（励起波長：４３３ｎｍ、蛍光波長：４７５ｎｍ；Clontech）、ＥＧＦＰ（励起波長：４８８ｎｍ、蛍光波長：５０７ｎｍ）、ＥＹＦＰ（励起波長：５１３ｎｍ、蛍光波長：５２７ｎｍ）、ＥＢＦＰ（励起波長：３８０ｎｍ、蛍光波長：４４０ｎｍ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ（励起波長：４３３ｎｍ、蛍光波長：４７５ｎｍ；Nat. Biotechnol., 2004, 22: 445-449）、Ｅｍｅｒａｌｄ（励起波長：４８７ｎｍ、蛍光波長：５０９ｎｍ）、Ｓａｐｐｈｉｒｅ（励起波長：３９９ｎｍ、蛍光波長：５１１ｎｍ）、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ（励起波長：３９９ｎｍ、蛍光波長：５１１ｎｍ）、Ｃｉｔｒｉｎｅ（励起波長：５１６ｎｍ、蛍光波長：５２９ｎｍ）、ＰｈｉＹＦＰ（励起波長：５２５ｎｍ、蛍光波長：５３７ｎｍ；Evrogen）、Ｊ−Ｒｅｄ（励起波長：５８４ｎｍ、蛍光波長：６１０ｎｍ；Evrogen）、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ１（励起波長：４７２ｎｍ、蛍光波長：４９５ｎｍ；MBLまたはAmalgaam）、ＡｍＣｙａｎ１（励起波長：４５８ｎｍ、蛍光波長：４８９ｎｍ；Clontech）、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ（励起波長：４９２ｎｍ、蛍光波長：５０５ｎｍ；MBLまたはAmalgaam）、ｍＡｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ１（励起波長：４９２ｎｍ、蛍光波長：５０５ｎｍ；MBLまたはAmalgaam）、ＣｏｐＧＦＰ（励起波長：４８２ｎｍ、蛍光波長：５０２ｎｍ；Evrogen）、ＺｓＧｒｅｅｎ１（励起波長：４９３ｎｍ、蛍光波長：５０５ｎｍ；Clontech）、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１（励起波長：５２９ｎｍ、蛍光波長：５３９ｎｍ；Clontech）、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１（励起波長：５４８ｎｍ、蛍光波長：５６１ｎｍ；MBLまたはAmalgaam）、ｍＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１（励起波長：５４８ｎｍ、蛍光波長：５５９ｎｍ；MBLまたはAmalgaam）、ｍＯｒａｎｇｅ（励起波長：５４８ｎｍ、蛍光波長：５６２ｎｍ；Nat. Biotechnol., 2004, 22:1567-1572）、ＤｓＲｅｄ２（励起波長：５６３ｎｍ、蛍光波長：５８２ｎｍ；Clontech）、ＤｓＲｅｄ ｍｏｎｏｍｅｒ（励起波長：５５６ｎｍ、蛍光波長：５８６ｎｍ；Clontech）、ＨｃＲｅｄ１（励起波長：５８８ｎｍ、蛍光波長：６１８ｎｍ；Clontech）、ｍＰｌｕｍ（励起波長：５９０ｎｍ、蛍光波長：６４９ｎｍ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101: 16745-16749）、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ（励起波長：５９８ｎｍ、蛍光波長：６２５ｎｍ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101: 16745-16749）、ｍＣｈｅｒｒｙ（励起波長：５８７ｎｍ、蛍光波長：６１０ｎｍ；Nat. Biotechnol., 2004, 22: 1567-1572）、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ（励起波長：５７４ｎｍ、蛍光波長：５９６ｎｍ；Nat. Biotechnol., 2004, 22: 1567-1572）、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ（励起波長：５６８ｎｍ、蛍光波長：５８５ｎｍ；Nat. Biotechnol., 2004, 22: 1567-1572）、ｅｑＦＰ６１１（励起波長：５５９ｎｍ、蛍光波長：６１１ｎｍ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99: 11646-11651）、およびＡｓＲｅｄ２（励起波長：５７６ｎｍ、蛍光波長：５９２ｎｍ；Clontech）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
本発明の組換えウイルスにおいて、カプシド、テグメントおよびエンベロープはそれぞれ異なる３つの蛍光タンパク質で標識されているが、３つの異なる蛍光タンパク質は、それぞれを区別できるように検出可能な組み合わせであれば、その組み合わせは特に限定されない。３つの蛍光タンパク質のそれぞれを区別できるように検出可能とは、例えば、それぞれの蛍光タンパク質が異なる蛍光波長を有することを意味する。一般的に、互いの蛍光波長に最小で約１０ｎｍの差があれば、それぞれの蛍光タンパク質を区別できるように検出することができる。また、互いの蛍光波長に２０ｎｍ以上の差があることが好ましく、３０ｎｍ以上の差があることがより好ましく、５０ｎｍ以上の差があることがさらに好ましい。
【００３０】
本発明の組換えウイルスにおける、好ましい３つの蛍光タンパク質の組み合わせとしては、ＥＣＦＰ、ＥＢＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ１、およびＡｍＣｙａｎ１からなる群より選択される１種類；Ｖｅｎｕｓ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ｍＡｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ１、ＣｏｐＧＦＰ、およびＺｓＧｒｅｅｎ１からなる群より選択される１種類；ならびに、ｍＲＦＰ１、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１、ｍＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＰｌｕｍ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｅｑＦＰ６１１、およびＡｓＲｅｄ２からなる群より選択される１種類；の組み合わせが挙げられる。最も好ましい組み合わせは、Ｖｅｎｕｓ、ｍＦＲＰ１、およびＥＣＦＰの組み合わせである。
【００３１】
本発明の組換えウイルスにおいて、ウイルス粒子コンポーネントは蛍光タンパク質で標識されているが、その標識の方法は特に限定されない。好ましくは、ウイルス粒子構成タンパク質を蛍光タンパク質との融合タンパク質とすることにより標識する。蛍光タンパク質との融合タンパク質としてウイルス粒子構成タンパク質を標識する場合、蛍光タンパク質をウイルス粒子構成タンパク質のＮ末端に融合させてもよく、Ｃ末端に融合させてもよく、あるいは内部に融合させてもよい。
【００３２】
組換えウイルスの製造方法
本発明の組換えウイルスを製造する方法は特に限定されないが、例えば、公知の組換えウイルス作成技術を利用して製造することができる。簡単には、野生体の性状を保持したウイルスのウイルスＤＮＡと、第一のウイルス粒子構成タンパク質と蛍光タンパク質の融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドを、細胞へ同時トランスフェクションすることにより、ウイルスＤＮＡにおいて対応するウイルス粒子構成タンパク質をコードするＤＮＡと、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡとの相同組み換えを生じさせる。相同組み換えによって産生された目的の組換えウイルス（すなわち第一のウイルス構成タンパク質が蛍光タンパク質により標識されている、組換えウイルス）を、前記蛍光タンパク質の蛍光を発するプラークを採取することによって選択する。場合により、採取されたプラークに含まれる組換えウイルスを再度細胞に感染させ、産生された組換えウイルスを前記蛍光を発するプラークとして採取することを繰り返して、１００％のプラークが目的の蛍光を発するまでプラーク純化を行ってもよい。
【００３３】
第二のウイルス構成タンパク質についても、上記と同様にして、第二のウイルス構成タンパク質が蛍光タンパク質により標識されている組換えウイルスを作成する。第三のウイルス構成タンパク質が蛍光タンパク質により標識されている組換えウイルスについても同様に作成する。
【００３４】
次いで、第一のウイルス構成タンパク質が標識されている組換えウイルスと、第二のウイルス構成タンパク質が標識されている組換えウイルスとで、細胞を共感染させる。組換えウイルスの共感染によって、細胞内で両ウイルスの相同組み換えが引き起こされ、第一および第二のウイルス構成タンパク質が標識されている組換えウイルスが産生するので、標識に用いた２つの蛍光タンパク質の蛍光を発するプラークを採取することによって選択する。所望によりプラーク純化を行ってもよい。
【００３５】
そして、第一および第二のウイルス構成タンパク質が標識されている組換えウイルスと、第三のウイルス構成タンパク質が標識されている組換えウイルスとで、細胞を共感染させる。組換えウイルスの共感染によって産生された、第一、第二および第三のウイルス構成タンパク質が標識されている組換えウイルスを、それぞれを標識した３つの蛍光タンパク質の蛍光を発するプラークを採取することによって選択する。所望によりプラーク純化を行ってもよい。
【００３６】
上述した一連の相同組み換えの操作により、カプシド、テグメントおよびエンベロープがそれぞれ異なる蛍光タンパク質で標識された、本発明の組換えウイルス粒子を作成することができる。
【００３７】
製造の各段階において、得られた組換えウイルスが目的の組換えウイルスであることを確認するためには、目的の組換えウイルスのＤＮＡについて、当業者に周知のサザン法により、当該組換えウイルスＤＮＡが、導入したウイルス構成タンパク質と蛍光タンパク質の融合タンパク質をコードするＤＮＡを有することにより確認することができる。または、当該組換えウイルスを感染させた細胞において、導入したウイルス構成タンパク質と蛍光タンパク質の融合タンパク質が発現していることを、当業者に周知のウエスタン法により感染細胞ライセートを用いて解析することにより、得られた組換えウイルスが目的の組換えウイルスであることを確認することもできる。あるいは、当該組換えウイルス粒子において、導入したウイルス構成タンパク質と蛍光タンパク質の融合タンパク質を発現していることを、当業者に周知のウエスタン法により精製した当該組換えウイルス粒子のライセートを用いて解析することにより、得られた組換えウイルスが目的の組換えウイルスであることを確認することもできる。
【００３８】
組換えウイルスを感染させた細胞
本発明は、本発明の組換えウイルスを感染させた細胞を提供する。
本発明の細胞の種類は、当該組換えウイルスが感染可能な細胞であれば、特に限定されない。当業者は、組換えウイルスの種類に応じて、感染させる細胞の種類を適宜選択することができる。好ましくは、本発明の細胞は、動物細胞である。より好ましくは、本発明の細胞は、培養細胞として確立された動物細胞である。好ましい細胞の例としては、ウサギ皮膚細胞（ＲＳＣ）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞）、ＨＥＬ（ヒト胎児肺線維芽細胞）、またはＨＥｐ−２細胞（ヒトカルシノーマ細胞）などが挙げられる。
【００３９】
ウイルス粒子の成熟過程の解析方法
本発明は、本発明の組換えウイルスおよび／または当該ウイルスで感染させた細胞を用いる、ウイルス粒子の成熟過程の解析方法を提供する。本発明のウイルス粒子の成熟過程の解析方法は、本発明の組換えウイルスで感染させた細胞において、ウイルス粒子のコンポーネントであるカプシド、テグメント、およびエンベロープ標識した各蛍光タンパク質の蛍光に基づいて、各コンポーネントの当該感染細胞における生成の挙動および／または局在を観察することを含む。
【００４０】
本発明のウイルス粒子の成熟過程の解析方法において、ウイルス粒子コンポーネントの生成の挙動および／または局在を観察するとは、各ウイルス粒子コンポーネントの発現および／または発現後の局在を、所望により経時的に観察することを意味する。ウイルス粒子コンポーネントの生成挙動および／または局在の観察は、例えば、共焦点レーザー顕微鏡、蛍光顕微鏡、またはハイコンテンツ顕微鏡イメージングシステムなどを用いて本発明の組換えウイルスで感染させた細胞を観察することにより行うことができる。これらを用いて観察した場合、各コンポーネントの発現および局在を経時的に追跡する、リアルタイムイメージングが可能である。本発明の方法は、カプシドの生成過程、テグメント生成過程、およびエンベロープ生成過程に加えて、カプシドがテグメントを獲得する過程やエンベロープを獲得する過程などの、一連のウイルス粒子成熟過程を同一の系で解析することが可能である。
【００４１】
本発明の方法によりウイルス粒子の成熟過程が解析されるウイルスは、本発明の組換えウイルスが作成可能なウイルスであれば特に限定されないが、好ましくはＨＳＶである。
抗ウイルス剤の作用機序の解析方法
本発明は、本発明の組換えウイルスおよび／または当該ウイルスで感染させた細胞を用いる、抗ウイルス剤の作用機序の解析方法を提供する。本発明の抗ウイルス剤の作用機序の解析方法は、以下の工程：
（ｉ）本発明の組換えウイルスで感染させた細胞に、抗ウイルス剤を接触させる工程；
（ｉｉ）ウイルス粒子コンポーネントであるカプシド、テグメント、およびエンベロープを標識した各蛍光タンパク質の蛍光に基づいて、各コンポーネントの当該感染細胞における生成の挙動および／または局在を観察する工程；
（ｉｉｉ）観察された各コンポーネントの生成の挙動および／または局在について、抗ウイルス剤を接触させていない感染細胞における各コンポーネントの生成の挙動および／または局在との差異を評価する工程；および
（ｉｖ）当該抗ウイルス剤は、生成の挙動および／または局在に差異があるコンポーネントが関与するウイルス粒子の成熟過程に作用すると判断する工程；
を含む。
【００４２】
本発明の方法による解析の対象となる抗ウイルス剤は、抗ウイルス剤として同定されたものであれば特に限定されない。すなわち、既知の抗ウイルス剤であってもよく、または将来的に同定される抗ウイルス剤であってもよい。
【００４３】
本発明の抗ウイルス剤の作用機序の解析方法において、ウイルス粒子コンポーネントの生成の挙動および／または局在を観察するとは、各ウイルス粒子コンポーネントの発現および／または発現後の局在を、所望により経時的に観察することを意味する。ウイルス粒子コンポーネントの生成挙動の観察は、例えば、共焦点レーザー顕微鏡、蛍光プレートリーダー、蛍光顕微鏡、またはハイコンテンツ顕微鏡イメージングシステムなどを用いて、作用機序を観察する抗ウイルス剤の存在下または非存在下で、本発明の組換えウイルスで感染させた細胞を観察することにより行うことができる。本発明の組換えウイルスは、カプシド、テグメント、およびエンベロープの３つのウイルス粒子コンポーネントが蛍光タンパク質で標識されているので、本発明の抗ウイルス剤の作用機序の解析方法は、カプシド、テグメント、およびエンベロープの生成過程に加えて、カプシドがテグメントを獲得する過程やさらにエンベロープを獲得する過程など、一連のウイルス粒子成熟過程のうちのどの過程に当該抗ウイルス剤が作用するのかを同定することが可能である。
【００４４】
共焦点レーザー顕微鏡、蛍光顕微鏡、ハイコンテンツ顕微鏡イメージングシステムを用いて観察した場合、各コンポーネントの発現および局在を経時的に追跡することができる、リアルタイムイメージングが可能である。これにより、ウイルス粒子成熟過程を可視化することが可能であるので、抗ウイルス剤の存在下および非存在下でのウイルス粒子成熟過程を比較することにより、抗ウイルス剤の作用機序を明らかにすることが可能である。具体的には、抗ウイルス剤の存在下および非存在下でのウイルス粒子成熟過程を比較して、各コンポーネントの発現量および／または局在に差異が見られる過程に、その抗ウイルス剤は作用していると判断する。より具体的には、各コンポーネントの発現量の差異は、各コンポーネントを標識した各蛍光タンパク質の蛍光強度の差として現れる。抗ウイルス剤の存在下において、あるコンポーネントを標識している蛍光タンパク質の蛍光強度が、抗ウイルス剤の非存在下と比較して低下している場合は、当該抗ウイルス剤はそのコンポーネントの生成過程に作用すると判断する。また、各コンポーネントの局在の差異は、各コンポーネントを標識した各蛍光タンパク質の局在の違いとして現れる。ウイルスの存在下において、あるコンポーネントを標識している蛍光タンパク質の局在が、抗ウイルス剤の非存在下と比較して異なる場合は、当該蛍光タンパク質が標識するウイルス粒子コンポーネントの、成熟ウイルス粒子への移行過程に作用すると判断する。
【００４５】
蛍光プレートリーダーを用いた場合は、各コンポーネントの発現の有無および／または発現の度合いを、各蛍光タンパク質の蛍光強度から評価することができる。本発明の方法においては、抗ウイルス剤の存在下および非存在下での各蛍光タンパク質の蛍光強度を比較することにより、抗ウイルス剤の作用機序を明らかにすることが可能である。具体的には、抗ウイルス剤の存在下において、カプシドを標識している蛍光タンパク質の蛍光強度が、抗ウイルス剤の非存在下と比較して低下した場合は、当該抗ウイルス剤はカプシド生成過程に作用すると判断する。または、抗ウイルス剤の存在下において、テグメントを標識している蛍光タンパク質の蛍光強度が、抗ウイルス剤の非存在下と比較して低下した場合は、当該抗ウイルス剤はテグメント生成過程に作用すると判断する。あるいは、抗ウイルス剤の存在下において、エンベロープを標識している蛍光タンパク質の蛍光強度が、抗ウイルス剤の非存在下と比較して低下している場合は、当該抗ウイルス剤はエンベロープ生成過程に作用すると判断する。
【００４６】
本発明の方法により作用機序が解析される抗ウイルス剤は、本発明の方法において用いられる本発明の組換えウイルスの種類に対応する抗ウイルス剤であれば、特に限定されない。本発明の方法により作用機序が解析される好ましい抗ウイルス剤は、抗ＨＳＶ剤であり、その際、本発明の方法において用いられる本発明の組換えウイルスはＨＳＶである。
【００４７】
抗ウイルス剤のスクリーニング方法
本発明は、本発明の組換えウイルスおよび／または当該ウイルスで感染させた細胞を用いる、作用機序に特化した抗ウイルス剤のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、特定のウイルス粒子成熟過程を標的とする抗ウイルス剤をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ｉ）本発明の組換えウイルスで感染させた細胞に、抗ウイルス剤の候補物質を接触させる工程；
（ｉｉ）ウイルス粒子のコンポーネントであるカプシド、テグメント、およびエンベロープを標識した各蛍光タンパク質の蛍光に基づいて、各コンポーネントの当該感染細胞における生成の挙動および／または局在を観察する工程；
（ｉｉｉ）観察された各コンポーネントの生成の挙動および／または局在について、抗ウイルス剤の候補物質を接触させていない感染細胞における各コンポーネントの生成の挙動および／または局在との差異を評価する工程；および
（ｉｖ）差異を生じた場合は、当該抗ウイルス剤の候補物質を、生成の挙動および／または局在に差異があるコンポーネントが関与するウイルス粒子成熟過程を標的とする抗ウイルス剤として同定する工程；
を含む。
【００４８】
本発明の方法によりスクリーニングされる抗ウイルス剤の候補物質には、小分子を含む化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、およびそれらの誘導体などが含まれるが、これらに限定されない。
【００４９】
本発明のスクリーニング方法において、ウイルス粒子コンポーネントの生成の挙動を観察するとは、各ウイルス粒子コンポーネントを標識している蛍光タンパク質の蛍光に基づいて、各ウイルスコンポーネントの発現および／または発現後の局在を所望により観察することを意味する。標識されたウイルス粒子コンポーネントの生成挙動および／または局在の観察は、例えば、ハイコンテンツ顕微鏡イメージングシステム、蛍光プレートリーダー、共焦点レーザー顕微鏡、蛍光顕微鏡などを用いて行うことができる。ハイコンテンツ顕微鏡イメージングシステムまたは蛍光プレートリーダーを用いることにより、迅速かつ大量サンプルの処理が可能である。
【００５０】
本発明のスクリーニング方法では、抗ウイルス剤の候補物質の存在下および非存在下での、本発明の組換えウイルスで感染させた細胞における各コンポーネントの生成の挙動および／またはその局在の差異に基づいてスクリーニングを行う。本発明のスクリーニング方法は、抗ウイルス剤の候補物質がウイルス粒子成熟過程のどの段階に作用するかを評価しながらスクリーニングすることが可能であるため、作用機序に基づいて抗ウイルス剤をスクリーニングすることができる。本発明の組換えウイルスは、カプシド、テグメント、およびエンベロープの３つのウイルス粒子コンポーネントが蛍光タンパク質で標識されているので、本発明のスクリーニング方法は、カプシド、テグメント、およびエンベロープの生成過程に加えて、カプシドがテグメントを獲得する過程やさらにエンベロープを獲得する過程など、一連のウイルス粒子成熟過程のうち、特定の過程を標的とする抗ウイルス剤の同定が可能である。
【００５１】
本発明のスクリーニング方法に、ハイコンテンツ顕微鏡イメージングシステム、共焦点レーザー顕微鏡、または蛍光顕微鏡を用いた場合、各コンポーネントの発現および局在を経時的に追跡することができる。この場合、抗ウイルス剤の候補物質の存在下および非存在下での各コンポーネントの発現および局在を観察し、差異を生じた抗ウイルス剤の候補物質を抗ウイルス剤として同定する。また、各コンポーネントの発現および局在の差異の特色から、抗ウイルス剤としての作用機序、すなわちいずれのウイルス粒子成熟過程に作用するかについても同定することができる。具体的には、各コンポーネントの発現量の差異は、各コンポーネントを標識した各蛍光タンパク質の蛍光強度の差として現れる。したがって、抗ウイルス剤の候補物質の存在下において、あるコンポーネントを標識している蛍光タンパク質の蛍光強度が、抗ウイルス剤の非存在下と比較して低下している場合は、当該抗ウイルス剤の候補物質は、そのコンポーネントの生成過程に作用する抗ウイルス剤として同定することができる。また、各コンポーネントの局在の差異は、各コンポーネントを標識した各蛍光タンパク質の感染細胞における局在の違いとして現れる。したがって、抗ウイルス剤の候補物質の存在下において、あるコンポーネントを標識している蛍光タンパク質の局在が、抗ウイルス剤の候補物質の非存在下と比較して異なる場合は、当該蛍光タンパク質が標識するウイルス粒子コンポーネントの成熟ウイルス粒子への移行過程、例えばカプシドがテグメントを獲得する過程や、それがさらにエンベロープを獲得する過程など、に作用する抗ウイルス剤として同定することができる。
【００５２】
また、本発明のスクリーニング方法に蛍光プレートリーダーを用いた場合は、各コンポーネントの発現を、各コンポーネントを標識した蛍光タンパク質の蛍光強度から評価することができる。この場合、抗ウイルス剤候補の存在下および非存在下での各蛍光タンパク質の蛍光強度を比較することにより、作用機序に基づいて抗ウイルス剤をスクリーニングする。具体的には、抗ウイルス剤候補の存在下において、カプシドを標識している蛍光タンパク質の蛍光強度が、抗ウイルス剤の非存在下と比較して低下した場合は、当該抗ウイルス剤候補はカプシドの発現を抑制する抗ウイルス剤として同定することができる。または、抗ウイルス剤候補の存在下において、テグメントを標識している蛍光タンパク質の蛍光強度が、抗ウイルス剤候補の非存在下と比較して低下した場合は、当該抗ウイルス剤候補はテグメントの発現を抑制する抗ウイルス剤として同定することができる。あるいは、抗ウイルス剤候補の存在下において、エンベロープを標識している蛍光タンパク質の蛍光強度が、抗ウイルス剤候補の非存在下と比較して低下している場合は、当該抗ウイルス剤候補はエンベロープの発現を抑制する抗ウイルス剤として同定することができる。
【００５３】
本発明のスクリーニング方法により同定される抗ウイルス剤は、本発明の方法において用いられる本発明の組換えウイルスの種類に対応する抗ウイルス剤である。本発明のスクリーニング方法により同定される好ましい抗ウイルス剤は、抗ＨＳＶ剤であり、その際、本発明のスクリーニング方法において用いられる本発明の組換えウイルスはＨＳＶである。
【発明の効果】
【００５４】
ウイルス粒子の３つのウイルス粒子コンポーネントを３つの異なる蛍光タンパク質で標識した組換えウイルスは、作用機序を特定した新しい抗ウイルス剤、特に抗ＨＳＶ剤、のスクリーニングに利用可能である。また、本発明の組換えウイルスは、抗ウイルス剤、特に抗ＨＳＶ剤の作用機序の解析にも利用可能である。抗ウイルス剤の開発においては、薬剤耐性ウイルスの出現の問題が常に存在するため、新たな作用機序を有する抗ウイルス剤の効率的なスクリーニング方法および解析方法が求められていた。本発明の組換えウイルスならびに本発明のスクリーニング方法および解析方法は、抗ウイルス剤の開発の分野に、新たな効率のよいツールおよび実験系を提供するものである。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００５６】
実施例１：カプシドを標識した組換えウイルスの作製
（１−１）トランスファープラスミド（ｐＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５）の構築
（ｉ）蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓ（Nat. Biotechnol., 2002, 20(1): 87-90）の２０７番目のアラニン残基をリジン残基に置換した変異体ＶｅｎｕｓＡ２０７ＫをQuickChange site-directed mutagenesis kit（Stratagene）で作製した。
【００５７】
（ｉｉ）終始コドンを含まないＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ増幅には以下のプライマーを用いた：ＧＣＡＣＴＡＧＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣ（配列番号１）およびＧＣＧＡＡＴＴＣＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣ（配列番号２）。ＰＣＲ産物として得られたＶｅｎｕｓＡ２０７ＫをpBluescript II KS+（Stratagene）のＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。
【００５８】
（ｉｉｉ）ＨＳＶ−１ Ｆ株（J. Gen. Virol., 2:357-364, 1968）のＵＬ３５遺伝子の２番目のコドンから約１ｋｂｐ（ＨＳＶゲノムについてのGenBank accession No. X14112を参照）をＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲには以下のプライマーを用いた：ＧＣＧＡＡＴＴＣｇｃｃｇｔｃｃｃｇｃａａｔｔｔｃａｃｃｇ（配列番号３）およびＧＣＧＡＡＧＣＴＴｔｔｃｃｇｃｇｔｃｔｔｃｃａｃａａａｔｃ（配列番号４）。そして、ＰＣＲ産物として得られたＵＬ３５遺伝子を含む断片を、上記（ｉｉ）で得られた、Ｖｅｎｕｓ変異体がクローニングされたpBluescript II KS+ のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に、ＶｅｎｕｓＡ２０７ＫとＵＬ３５遺伝子が融合するかたちでクローニングした。
【００５９】
（ｉｖ）ＨＳＶ−１ Ｆ株（同上）のＵＬ３５遺伝子の上流約１ｋｂｐ（ＨＳＶゲノムについてのGenBank accession No. X14112を参照）をＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲには以下のプライマーを用いた：ＧＣＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣｔｔａａｃｃｇｇｔｔｃｃｔｇｇａｃｃｔｇ（配列番号５）およびＧＣＡＣＴＡＧＴｃｇｇｇａｃｃｇｇａｇｇｔｃｇｇｇａａｇ（配列番号６）。そして、ＰＣＲ産物として得られたＵＬ３５遺伝子の上流側を含む断片を、上記（ｉｉｉ）で得られた、ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５遺伝子がクローニングされたpBluescript II KS+ のＮｏｔＩ−ＳｐｅＩ部位にさらにクローニングした。
【００６０】
得られたプラスミドは、pBluescript II KS+のマルチプルクローニングサイト領域に、５’側から順に、ＵＬ３５遺伝子の上流約１ｋｂｐ、ＶｅｎｕｓＡ２０７ＫのＯＲＦ、およびＵＬ３５遺伝子の２番目のコドンから約１ｋｂｐを含むプラスミドである。以下、得られたプラスミドをｐＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ｐＵＬ３５と称する。
【００６１】
（１−２）組換えウイルスＹＫ６０１の作製
野生体の性状を保持し、かつ、ＵＬ３−ＵＬ４遺伝子間領域にバクミド（bacmid）が挿入された組換えウイルスＹＫ３０４（J. Virol., 77: 1382-1391, 2003）のウイルスＤＮＡとｐＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ｐＵＬ３５をウサギ皮膚細胞（ＲＳＣ）にトランスフェクトした。その後、相同組み換えによって産生された、ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ遺伝子がＵＬ３５遺伝子のＮ末領域に挿入された組換えウイルスＹＫ６０１を、蛍光顕微鏡下において、蛍光を発するプラークを採取することによって選択した。また、１００％のプラークが蛍光を発するまで、蛍光顕微鏡下においてプラーク純化を行った。
【００６２】
ＹＫ６０１が目的の組換えウイルスであることはサザン法にて確認した。具体的には、ＹＫ３０４およびＹＫ６０１のウイルスＤＮＡをＳａｌＩで処理後、サザン法に供した。プローブは、ＵＬ３５の開始コドンから上流および下流にそれぞれ１ｋｂｐの領域（ＨＳＶゲノムについてのGenBank Accession No. X14112を参照）をＰＣＲで増幅した断片を用いた。ＰＣＲには以下のプライマーを用いた：ＧＣＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣｔｔａａｃｃｇｇｔｔｃｃｔｇｇａｃｃｔｇ（配列番号５）、およびＧＣＧＡＡＧＣＴＴｔｔｃｃｇｃｇｔｃｔｔｃｃａｃａａａｔｃ（配列番号４）。ＵＬ３５遺伝子を含むＳａｌＩ断片がＹＫ６０１ではＹＫ３０４と比してＶｅｎｕｓ遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。
【００６３】
また、感染細胞においてＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５融合タンパク質が発現していることを、感染細胞ライセートを用いたウエスタン法にて確認した。また、ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５融合タンパク質がウイルス粒子に取り込まれていることを、精製ウイルス粒子のライセートを用いたウエスタン法にて確認した。ウエスタン法においては、ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５融合タンパク質の検出は、抗ＧＦＰ抗体（ＭＢＬ）および抗ＵＬ３５抗体を用いて行った。抗ＵＬ３５抗体は、ＵＬ３５をＧＳＴと融合させるかたちで大腸菌で発現・精製し、ウサギに免役した抗血清である。
実施例２：テグメントを標識した組換えウイルスの作製
（２−１）テグメントＵＬ４９を標識した組換えウイルス
（２−１−１）トランスファープラスミド（ｐｍＲＦＰ１−ＵＬ４９）の構築
（ｉ）終始コドンを含まない蛍光タンパク質ｍＲＦＰ１（PNAS, 99: 7787-7882, 2002）のＯＲＦをＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ増幅には以下のプライマーを用いた：ＧＣＡＣＴＡＧＴＣＧＣＣＡＣＣａｔｇｇｃｃｔｃｃｔｃｃｇａｇｇａｃｇｔ（配列番号７）およびＧＣＧＡＡＴＴＣｇｇｃｇｃｃｇｇｔｇｇａｇｔｇｇｃｇｇｃ（配列番号８）。ＰＣＲ産物として得られたｍＲＦＰ１を、pBluescript II KS+ (Stratagene)のＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。
【００６４】
（ｉｉ）ＨＳＶ−１ Ｆ株（J. Gen. Virol., 2: 357-364, 1968）のＵＬ４９遺伝子の２番目のコドンから約１ｋｂｐ（ＨＳＶゲノムについてのGenBank accession No. X14112を参照）をＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲには以下のプライマーを用いた：ＧＣＧＡＡＴＴＣａｃｃｔｃｔｃｇｃｃｇｃｔｃｃｇｔｇａａ（配列番号９）およびＧＣＧＡＡＧＣＴＴｔｃｃｃｃｇｔｃｇｇａｔｔｇｇｇａａａｃ（配列番号１０）。ＰＣＲ産物として得られたＵＬ４９遺伝子を、上記（ｉ）で作製された、ｍＲＦＰ１がクローニングされたpBluescript II KS+ のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にｍＲＦＰ１とＵＬ４９遺伝子が融合するかたちでクローニングした。
【００６５】
（ｉｉｉ）ＨＳＶ−１ Ｆ株（同上）のＵＬ４９遺伝子の上流約１ｋｂｐ（ＨＳＶゲノムについてのGenBank accession No. X14112を参照）をＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲには以下のプライマーを用いた：ＧＣＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣｔｃｇｃｃａｇｇａｔｇｔｃｃａｇｇａａｃ（配列番号１１）およびＧＣＡＣＴＡＧＴｇｇｔｔｃｃａｃｇａａｃａｃｇｃｔａｇｇ（配列番号１２）。ＰＣＲ産物として得られたＵＬ４９遺伝子の上流側を含む断片を、上記（ｉｉ）で作製された、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４９遺伝子がクローニングされたpBluescript II KS+ のＮｏｔＩ−ＳｐｅＩ部位にさらにクローニングした。
【００６６】
得られたプラスミドは、pBluescript II KS+のマルチプルクローニングサイト領域に、５’側から順に、ＵＬ４９遺伝子の上流約１ｋｂｐ、ｍＲＦＰ１のＯＲＦ、およびＵＬ４９遺伝子の２番目のコドンから約１ｋｂｐを含むプラスミドである。以下、得られたプラスミドをｐｍＲＦＰ１−ＵＬ４９と称する。
【００６７】
（２−１−２）組換えウイルスＹＫ６０２の作製
組換えウイルスＹＫ３０４のウイルスＤＮＡとｐｍＲＦＰ１−ＵＬ４９をＲＳＣにトランスフェクトした。その後、相同組み換えによって産生された、ｍＲＦＰ１遺伝子がＵＬ４９遺伝子のＮ末領域に挿入された組み換えウイルスＹＫ６０２を、蛍光顕微鏡下において、蛍光を発するプラークを採取することによって選択した。また、１００％のプラークが蛍光を発するまで、蛍光顕微鏡下においてプラーク純化を行った。
【００６８】
ＹＫ６０２が目的の組み換えウイルスであることはサザン法にて確認した。具体的には、ＹＫ３０４およびＹＫ６０２のウイルスＤＮＡをＥｃｏＲＶで処理後、サザン法に供した。プローブは、ＵＬ４９の開始コドンから上流および下流にそれぞれ１ｋｂｐの領域(ＨＳＶゲノムについてのGenBank Accession No. X14112を参照)をＰＣＲで増幅した断片を用いた。ＰＣＲには以下のプライマーを用いた：ＧＣＧＡＡＴＴＣａｃｃｔｃｔｃｇｃｃｇｃｔｃｃｇｔｇａａ（配列番号９）、ＧＣＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣｔｃｇｃｃａｇｇａｔｇｔｃｃａｇｇａａｃ（配列番号１１）。ＵＬ４９遺伝子を含むＥｃｏＲＶ断片がＹＫ６０２ではＹＫ３０４と比してｍＲＦＰ１遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。
【００６９】
また、感染細胞においてｍＲＦＰ１−ＵＬ４９融合タンパク質が発現していることを、感染細胞ライセートを用いたウエスタン法にて確認した。また、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４９融合タンパク質がウイルス粒子に取り込まれていることを、精製ウイルス粒子のライセートを用いたウエスタン法にて確認した。ウエスタン法においては、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４９融合タンパク質の検出は、抗ＵＬ４９抗体（J. Virol., 79: 6947-6956, 2005）または抗ｍＲＦＰ１抗体（ＭＢＬ）を用いて行った。
【００７０】
（２−２）テグメントＵＬ４７を標識した組換えウイルス
（２−２−１）トランスファープラスミド（ｐｍＲＦＰ１−ＵＬ４７）の構築
（ｉ）終始コドンを含まない蛍光タンパク質ｍＲＦＰ１（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2002, 99(12): 7877-7882.）のＯＲＦをＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ増幅には以下のプライマーを用いた：ＧＣＡＣＴＡＧＴＣＧＣＣＡＣＣａｔｇｇｃｃｔｃｃｔｃｃｇａｇｇａｃｇｔ（配列番号７）およびＧＣＧＡＡＴＴＣｇｇｃｇｃｃｇｇｔｇｇａｇｔｇｇｃｇｇｃ（配列番号８）。ＰＣＲ産物として得られたｍＲＦＰ１を、pBluescript II KS+ (Stratagene)のＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。
【００７１】
（ｉｉ）ＨＳＶ−１ Ｆ株（J. Gen. Virol., 2: 357-364, 1968）のＵＬ４７遺伝子の２番目のコドンから約１ｋｂｐ（ＨＳＶゲノムについてのGenBank accession No. X14112を参照）をＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲには以下のプライマーを用いた：ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＧＧＣＴＣＧＣＧＡＡＣＣＣＧＣＧＧＧ（配列番号１３）およびＧＣＧＡＡＧＣＴＴＡＴＴＧＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＧＣＡＧＧＧ（配列番号１４）。ＰＣＲ産物として得られたＵＬ４７遺伝子を、上記（ｉ）で作製された、ｍＲＦＰ１がクローニングされたpBluescript II KS+ のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にｍＲＦＰ１とＵＬ４７遺伝子が融合するかたちでクローニングした。
【００７２】
（ｉｉｉ）ＨＳＶ−１ Ｆ株（同上）のＵＬ４７遺伝子の上流約１ｋｂｐ（ＨＳＶについてのGenBank accession No. X14112を参照）をＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲには以下のプライマーを用いた：ＧＣＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＡＣＣＴＴＡＡＣＣＴＣＣＣＧＣＴＧ（配列番号１５）およびＧＣＡＣＴＡＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＡＧＡＣＧＣＧＧＧＴＴ（配列番号１６）。ＰＣＲ産物として得られたＵＬ４７遺伝子の上流側を含む断片を、上記（ｉｉ）で作製された、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４７遺伝子がクローニングされたpBluescript II KS+ のＮｏｔＩ−ＳｐｅＩ部位にさらにクローニングした。
【００７３】
得られたプラスミドは、pBluescript II KS+のマルチプルクローニングサイト領域に、５’側から順に、ＵＬ４７遺伝子の上流約１ｋｂｐ、ｍＲＦＰ１のＯＲＦ、およびＵＬ４７遺伝子の２番目のコドンから約１ｋｂｐを含むプラスミドである。以下、得られたプラスミドをｐｍＲＦＰ１−ＵＬ４７と称する。
【００７４】
（２−２−２）組換えウイルスＹＫ６０３の作製
組み換えウイルスＹＫ３０４のウイルスＤＮＡとｐｍＲＦＰ１−ＵＬ４７をＲＳＣにトランスフェクトした。その後、相同組み換えによって産生された、ｍＲＦＰ１遺伝子がＵＬ４７遺伝子のＮ末領域に挿入された組み換えウイルスＹＫ６０３を、蛍光顕微鏡下において、蛍光を発するプラークを採取することによって選択した。また、１００％のプラークが蛍光を発するまで、蛍光顕微鏡下においてプラーク純化を行った。
【００７５】
ＹＫ６０３が目的の組み換えウイルスであることはサザン法にて確認した。具体的には、ＹＫ３０４およびＹＫ６０３のウイルスＤＮＡをＥｃｏＲＶで処理後、サザン法に供した。プローブは、ＵＬ４７の開始コドンから上流および下流にそれぞれ１ｋｂｐの領域（GenBank Accession No. X14112）をＰＣＲで増幅した断片を用いた。ＰＣＲには以下のプライマーを用いた：ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＡＴＴＧＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＧＣＡＧＧＧ（配列番号１４）、ＧＣＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＡＣＣＴＴＡＡＣＣＴＣＣＣＧＣＴＧ（配列番号１５）。ＵＬ４７遺伝子を含むＥｃｏＲＶ断片がＹＫ６０３ではＹＫ３０４と比してｍＲＦＰ１遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。
【００７６】
また、感染細胞においてｍＲＦＰ１−ＵＬ４７融合タンパク質が発現していることを、感染細胞ライセートを用いたウエスタン法にて確認した。また、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４７融合タンパク質がウイルス粒子に取り込まれていることを、精製ウイルス粒子のライセートを用いたウエスタン法にて確認した。ウエスタン法においては、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４７融合タンパク質の検出は、抗ｍＲＦＰ１抗体（ＭＢＬ）を用いて行った。
実施例３：エンベロープを標識した組換えウイルスの作製
（３−１）トランスファープラスミド（ｐＥＣＦＰＡ２０７Ｋ−ＵＬ２７）の構築
（ｉ）蛍光タンパク質ＥＣＦＰ（Clontech）の２０７番目のアラニン残基をリジン残基に置換した変異体ＥＣＦＰＡ２０７ＫをQuickChange site-directed mutagenesis kit （Stratagene）で作製した。
【００７７】
（ｉｉ）ＨＳＶ−１ Ｆ株（J. Gen Virol., 2: 357-364, 1968）のＵＬ２７遺伝子の開始コドンの上流約１ｋｂｐからＵＬ２７遺伝子の開始コドンの下流約１ｋｂｐまでの領域（ＨＳＶゲノムについてのGenBank accession No. X14112を参照）をＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲには以下のプライマーを用いた：ＧＣＴＣＴＡＧＡｃｃｔｇａｃｇａａｇｃｇｇｔｃｇｔｔｇｇ（配列番号１７）およびＧＣＧＡＡＧＣＴＴｇａｇａａｔｃｇｇａａｇｇａｇｃｃｇｃｃ(配列番号１８)。ＰＣＲ産物として得られたＵＬ２７遺伝子を含む断片を、pBluescript II KS+ のＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。
【００７８】
（ｉｉｉ）開始コドンおよび終始コドンを含まないＥＣＦＰＡ２０７ＫのＯＲＦをＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ増幅には以下のプライマーを用いた：ＧＣＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣａｇｔｇａｇｃａａｇｇｇｃｇａｇｇａｇｃｔ（配列番号１９）およびＧＣＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣ(配列番号２０)。上記（ｉｉ）で作製された、ＵＬ２７遺伝子の開始コドンの上流約１ｋｂｐからＵＬ２７遺伝子の開始コドンの下流約１ｋｂｐまでの領域がクローニングされたpBluescript II KS+ （Stratagene）のＮｏｔＩ部位に、ＵＬ２７遺伝子と融合するかたちでクローニングした。
【００７９】
得られたプラスミドは、pBluescript II KS+のマルチプルクローニングサイト領域に、５’側から順に、ＵＬ２７の開始コドンの上流約１ｋｂｐ、ＵＬ２７の開始コドンから約１００ｂｐ、ＥＣＦＰＡ２０７ＫのＯＲＦ、およびＵＬ２７遺伝子の開始コドンから約１００ｂｐのさらに下流約１ｋｂｐまでの領域を含むプラスミドである。以下、得られたプラスミドをｐＥＣＦＰＡ２０７Ｋ−ＵＬ２７と称する。
【００８０】
（３−２）組換えウイルスＹＫ６０４の作製
組換えウイルスＹＫ３０４のウイルスＤＮＡとｐＥＣＦＰＡ２０７Ｋ−ＵＬ２７をＲＳＣにトランスフェクトした。その後、相同組み換えによって産生された、ＥＣＦＰＡ２０７Ｋ遺伝子がＵＬ２７遺伝子のＮ末領域に挿入された組み換えウイルスＹＫ６０４を、蛍光顕微鏡下において、蛍光を発するプラークを採取することによって選択した。また、１００％のプラークが蛍光を発するまで、蛍光顕微鏡下においてプラーク純化を行った。
【００８１】
ＹＫ６０４が目的の組み換えウイルスであることはサザン法にて確認した。具体的には、ＹＫ３０４およびＹＫ６０４のウイルスＤＮＡをＢａｍＨＩで処理後、サザン法に供した。プローブは、ＵＬ２７遺伝子の開始コドンから上流および下流にそれぞれ１ｋｂｐの領域（ＨＳＶゲノムについてのGenBank Accession No. X14112を参照）をＰＣＲで増幅した断片を用いた。ＰＣＲには以下のプライマーを用いた：ＧＣＴＣＴＡＧＡｃｃｔｇａｃｇａａｇｃｇｇｔｃｇｔｔｇｇ（配列番号１７）、ＧＣＧＡＡＧＣＴＴｃｇｇｇｃｃｔｔｇｇｔｇｇｔｇａｇｇｔｃ（配列番号２１）。ＵＬ２７遺伝子を含むＥｃｏＲＶ断片がＹＫ６０４ではＹＫ３０４と比してＥＣＦＰ遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。
【００８２】
また、感染細胞においてＥＣＦＰ−ＵＬ２７融合タンパク質が発現していることを、感染細胞ライセートを用いたウエスタン法にて確認した。また、ＥＣＦＰ−ＵＬ２７融合タンパク質がウイルス粒子に取り込まれていることを、精製ウイルス粒子のライセートを用いたウエスタン法にて確認した。ウエスタン法においては、ＥＣＦＰ−ＵＬ２７融合タンパク質の検出は、抗ＵＬ２７抗体（Rumbaugh-Goodwin Institute）または抗ＧＦＰ抗体（MBL)を用いて行った。
実施例４：カプシドおよびテグメントを標識した組換えウイルスの作製
（４−１）組換えウイルスＹＫ６０５の作製
組み換えウイルスＹＫ６０１とＹＫ６０２を感染効率（ＭＯＩ：multiplicity of infection） ５でＶｅｒｏ細胞に共感染させた。その後、相同組み換えによって産生された、ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ遺伝子がＵＬ３５遺伝子のＮ末端領域に挿入され、かつ、ｍＲＦＰ１遺伝子がＵＬ４９遺伝子のＮ末端領域に挿入された組換えウイルスＹＫ６０５を、蛍光顕微鏡下において、２色の蛍光を発するプラークを採取することによって選択した。また、１００％のプラークが２色の蛍光を発するまで、蛍光顕微鏡下においてプラーク純化を行った。
【００８３】
ＹＫ６０５が目的の組換えウイルスであることはサザン法にて確認した。具体的には、ＹＫ３０４およびＹＫ６０５のウイルスＤＮＡをＳａｌＩで処理後、サザン法に供し、実施例１の（１−２）と同様にして、ＵＬ３５遺伝子を含むＳａｌＩ断片がＹＫ６０５ではＹＫ３０４と比してＶｅｎｕｓ遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。また、ＹＫ３０４およびＹＫ６０５のウイルスＤＮＡをＥｃｏＲＶで処理後、サザン法に供し、実施例２の（２−１−２）と同様にして、ＵＬ４９遺伝子を含むＥｃｏＲＶ断片がＹＫ６０５ではＹＫ３０４と比してｍＲＦＰ１遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。
【００８４】
また、感染細胞においてＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５およびｍＲＦＰ１−ＵＬ４９融合タンパク質が発現していることを、感染細胞ライセートを用いたウエスタン法にて確認した。また、ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５およびｍＲＦＰ１−ＵＬ４９融合タンパク質がウイルス粒子に取り込まれていることを、精製ウイルス粒子のライセートを用いたウエスタン法にて確認した。ウエスタン法におけるＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５融合タンパク質およびｍＲＦＰ１−ＵＬ４９融合タンパク質の検出は、実施例１および２と同様に行った。
【００８５】
（４−２）組換えウイルスＹＫ６０６の作製
組換えウイルスＹＫ６０１とＹＫ６０３をＭＯＩ ５でＶｅｒｏ細胞に共感染させた。その後、相同組み換えによって産生された、ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ遺伝子がＵＬ３５遺伝子のＮ末端領域に挿入され、かつ、ｍＲＦＰ１遺伝子がＵＬ４７遺伝子のＮ末端領域に挿入された組換えウイルスＹＫ６０６を、蛍光顕微鏡下において、２色の蛍光を発するプラークを採取することによって選択した。また、１００％のプラークが２色の蛍光を発するまで、蛍光顕微鏡下においてプラーク純化を行った。
【００８６】
ＹＫ６０６が目的の組み換えウイルスであることはサザン法にて確認した。具体的には、ＹＫ３０４およびＹＫ６０６のウイルスＤＮＡをＳａｌＩで処理後、サザン法に供し、実施例１の（１−２）と同様にして、ＵＬ３５遺伝子を含むＳａｌＩ断片がＹＫ６０６ではＹＫ３０４と比してＶｅｎｕｓ遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。また、ＹＫ３０４およびＹＫ６０６のウイルスＤＮＡをＥｃｏＲＶで処理後、サザン法に供し、実施例２の（２−２−２）と同様にして、ＵＬ４７遺伝子を含むＥｃｏＲＶ断片がＹＫ６０６ではＹＫ３０４と比してｍＲＦＰ１遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。
【００８７】
また、感染細胞においてＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５およびｍＲＦＰ１−ＵＬ４７融合タンパク質が発現していることを、感染細胞ライセートを用いたウエスタン法にて確認した。また、ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５およびｍＲＦＰ１−ＵＬ４７融合タンパク質がウイルス粒子に取り込まれていることを、精製ウイルス粒子のライセートを用いたウエスタン法にて確認した。ウエスタン法におけるＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５融合タンパク質およびｍＲＦＰ１−ＵＬ４７融合タンパク質の検出は、実施例１および２と同様に行った。
実施例５：カプシド、テグメントおよびエンベロープを標識した組換えウイルスの作製
（５−１）組換えウイルスＹＫ６０８の作製
組換えウイルスＹＫ６０５とＹＫ６０４をＭＯＩ ５でＶｅｒｏ細胞に共感染させた。その後、相同組み換えによって産生された、ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ遺伝子がＵＬ３５遺伝子のＮ末端領域に挿入され、ｍＲＦＰ１遺伝子がＵＬ４９遺伝子のＮ末端領域に挿入され、かつ、ＥＣＦＰＡ２０７Ａ遺伝子がＵＬ２７遺伝子のＮ末端領域に挿入された組み換えウイルスＹＫ６０８を、蛍光顕微鏡下において、３色の蛍光を発するプラークを採取することによって選択した。また、１００％のプラークが３色の蛍光を発するまで、蛍光顕微鏡下においてプラーク純化を行った。
【００８８】
ＹＫ６０８が目的の組み換えウイルスであることはサザン法にて確認した（図２）。具体的には、ＹＫ３０４およびＹＫ６０８のウイルスＤＮＡをＳａｌＩで処理後、サザン法に供し、実施例１の（１−２）と同様にして、ＵＬ３５遺伝子を含むＳａｌＩ断片がＹＫ６０８ではＹＫ３０４と比してＶｅｎｕｓ遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。また、ＹＫ３０４およびＹＫ６０８のウイルスＤＮＡをＥｃｏＲＶで処理後、サザン法に供し、実施例２の（２−１−２）と同様にして、ＵＬ４９遺伝子を含むＥｃｏＲＶ断片がＹＫ６０８ではＹＫ３０４と比してｍＲＦＰ１遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。そして、ＹＫ３０４およびＹＫ６０８のウイルスＤＮＡをＢａｍＨＩで処理後、サザン法に供し、実施例３の（３−２）と同様にして、ＵＬ２７遺伝子を含むＥｃｏＲＶ断片がＹＫ６０８ではＹＫ３０４と比してＥＣＦＰ遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。
【００８９】
また、感染細胞においてＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４９およびＥＣＦＰＡ２０７Ｋ−ＵＬ２７融合タンパク質が発現していることを、感染細胞ライセートを用いたウエスタン法にて確認した（図３）。また、ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４９およびＥＣＦＰＡ２０７Ｋ−ＵＬ２７融合タンパク質がウイルス粒子に取り込まれていることを、精製ウイルス粒子のライセートを用いたウエスタン法にて確認した（図４）。ウェスタン法におけるＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４９およびＥＣＦＰＡ２０７Ｋ−ＵＬ２７融合タンパク質の検出は、実施例１ないし３と同様に行った。
【００９０】
（５−２）組み換えウイルスＹＫ６０９の作製
組換えウイルスＹＫ６０６とＹＫ６０４をＭＯＩ ５でＶｅｒｏ細胞に共感染させた。その後、相同組み換えによって産生された、ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ遺伝子がＵＬ３５遺伝子のＮ末端領域に挿入され、ｍＲＦＰ１遺伝子がＵＬ４７遺伝子のＮ末端領域に挿入され、かつ、ＥＣＦＰＡ２０７Ａ遺伝子がＵＬ２７遺伝子のＮ末端領域に挿入された組み換えウイルスＹＫ６０９を、蛍光顕微鏡下において、３色の蛍光を発するプラークを採取することによって選択した。また、１００％のプラークが３色の蛍光を発するまで、蛍光顕微鏡下においてプラーク純化を行った。
【００９１】
ＹＫ６０９が目的の組み換えウイルスであることはサザン法にて確認した（図５）。具体的には、ＹＫ３０４およびＹＫ６０９のウイルスＤＮＡをＳａｌＩで処理後、サザン法に供し、実施例１の（１−２）と同様にして、ＵＬ３５遺伝子を含むＳａｌＩ断片がＹＫ６０９ではＹＫ３０４と比してＶｅｎｕｓ遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。また、ＹＫ３０４およびＹＫ６０９のウイルスＤＮＡをＥｃｏＲＶで処理後、サザン法に供し、実施例２の（２−２−２）と同様にして、ＵＬ４７遺伝子を含むＥｃｏＲＶ断片がＹＫ６０９ではＹＫ３０４と比してｍＲＦＰ１遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。そして、ＹＫ３０４およびＹＫ６０９のウイルスＤＮＡをＢａｍＨＩで処理後、サザン法に供し、実施例３の（３−２）と同様にして、ＵＬ２７遺伝子を含むＥｃｏＲＶ断片がＹＫ６０９ではＹＫ３０４と比してＥＣＦＰ遺伝子分だけ大きくなっていることを確認した。
【００９２】
また、感染細胞においてＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４７およびＥＣＦＰＡ２０７Ｋ−ＵＬ２７融合タンパク質が発現していることを、感染細胞ライセートを用いたウエスタン法にて確認した（図６）。また、ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４７およびＥＣＦＰＡ２０７Ｋ−ＵＬ２７融合タンパク質がウイルス粒子に取り込まれていることを、精製ウイルス粒子のライセートを用いたウエスタン法にて確認した（図７）。ウエスタン法におけるＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４７およびＥＣＦＰＡ２０７Ｋ−ＵＬ２７融合タンパク質の検出は、実施例１ないし３と同様に行った。
実施例６：ＹＫ６０８とＹＫ６０９の性状解析
（ｉ）ＹＫ３０４、ＹＫ６０８およびＹＫ６０９をＶｅｒｏ細胞にＭＯＩ ０．０１またはＭＯＩ ５で感染させ、６時間ごと、２４時間の各ウイルスの増殖を比較した（図８）。ＹＫ６０８およびＹＫ６０９は野生体ＹＫ３０４と比して、それぞれの時点におけるウイルスタイターが低い傾向があるが、野生体と同様な増殖様式を示した。
【００９３】
（ｉｉ）φ６０ｍｍのガラスボトムディッシュ（ＭａｔＴｅｋ）にＶｅｒｏ細胞を捲き、ＹＫ６０８およびＹＫ６０９をＶｅｒｏ細胞にＭＯＩ ５で感染させた。温度コントロールおよびＣＯ2濃度コントロールが可能なチャンバーを搭載した共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ５：Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で、１０分間隔で２４時間のタイムラプス観察を行った。その結果、生きた感染細胞における各ウイルス粒子コンポーネント（カプシド、テグメント、エンベロープ）の生成の様子を観察することが可能であった（図１０）。また、細胞外のウイルス粒子を観察することが可能であった（図９）。
【００９４】
（ｉｉｉ）新生タンパク質の細胞内輸送を阻害する薬剤であるブレフェルディンＡ（Brefeldin A）またはモネンシン（Monensin）を（ｉｉ）の系に添加すると、各ウイルスコンポーネントの挙動および発現量が野生体と比して明らかに異なることが確認された（図１１）。Ｍｏｃｋ処理では、カプシド、テグメント、エンベロープはウイルスファクトリーと考えられる複数のドメインで共局在する。しかし、両薬剤を添加するとウイルスファクトリーと考えられるドメインの形成が著しく阻害される。また、テグメントとエンベロープの発現量が明らかに低下する。ブレフェルディンＡを処理するとＨＳＶの増殖が阻害されることが報告されている（J. Virol., 65: 1893-1904, 1991）。
本実施例の結果は、本系が薬剤の作用機序の解析およびウイルス粒子コンポーネントの局在や発現量の変化を指標にした新しい抗ウイルス剤のスクリーニング系に有用であることを示すものである。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
ＨＳＶは、ヒトに脳炎、性器ヘルペス、皮膚疾患、眼疾患、小児ヘルペスなどの多様な病態を引き起こす。ヘルペスウイルス感染症の医療費は、年間３０億ドル（約３５００億円）と試算されている。
【００９６】
本発明の組換えウイルスおよびそれを利用した抗ＨＳＶ剤スクリーニング系、抗ＨＳＶ剤の作用機序解析系は、そのまま抗ＨＳＶ剤開発の現場で利用可能である。抗ウイルス剤の宿命として、薬剤耐性ウイルスの出現が挙げられるが、そのために、常に新たな作用機序の抗ウイルス剤を開発することが必要であり、実際に、製薬業界においては抗ＨＳＶ剤の開発が盛んに行われている。また、抗ウイルス剤を開発する際にその作用機序が明らかになっていることは、その抗ウイルス剤の安全性や信頼性を高める上で必須である。これらのことを鑑みて、本発明は抗ＨＳＶ剤の開発に貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、ＨＳＶ粒子の模式図（Ａ）と、組換えウイルスＹＫ６０８およびＹＫ６０９のゲノム模式図（Ｂ）である。
【図２】図２は、組換えウイルスＹＫ６０８のサザン法による解析結果を示す写真である。
【図３】図３は、組換えウイルスＹＫ６０８を感染させた細胞のライセートのウエスタン法による解析結果を示す写真である。ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４９、およびＥＣＦＰＡ２０７Ｋ−ＵＬ２７融合タンパク質の発現を確認した。
【図４】図４は、組換えウイルスＹＫ６０８の精製ウイルス粒子のライセートのウエスタン法による解析結果を示す写真である。ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４９、およびＥＣＦＰＡ２０７Ｋ−ＵＬ２７融合タンパク質がウイルス粒子に取り込まれていることを確認した。
【図５】図５は、組換えウイルスＹＫ６０９のサザン法による解析結果を示す写真である。
【図６】図６は、組換えウイルスＹＫ６０９を感染させた細胞のライセートのウエスタン法による解析結果を示す写真である。ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４７、およびＥＣＦＰＡ２０７Ｋ−ＵＬ２７融合タンパク質の発現を確認した。
【図７】図７は、組換えウイルスＹＫ６０９の精製ウイルス粒子のライセートのウエスタン法による解析結果を示す写真である。ＶｅｎｕｓＡ２０７Ｋ−ＵＬ３５、ｍＲＦＰ１−ＵＬ４７、およびＥＣＦＰＡ２０７Ｋ−ＵＬ２７融合タンパク質がウイルス粒子に取り込まれていることを確認した。
【図８】図８は、ＹＫ３０４、ＹＫ６０８、ＹＫ６０９組換えウイルスを感染させたＶｅｒｏ細胞におけるウイルスの増殖を示すグラフである。
【図９】図９は、ＹＫ６０８組換えウイルスを感染させたＶｅｒｏ細胞および細胞外における各ウイルス粒子コンポーネントのリアルタイムイメージング画像である。
【図１０】図１０は、ＹＫ６０８組換えウイルスを感染させたＶｅｒｏ細胞における各ウイルス粒子コンポーネント生成過程のリアルタイムイメージング画像である。
【図１１】図１１は、ブレフェルディンＡまたはモネンシン存在下および非存在下での、ＹＫ６０８組換えウイルスを感染させたＶｅｒｏ細胞における各ウイルス粒子コンポーネント生成過程を比較したリアルタイムイメージング画像である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えウイルスであって、ウイルス粒子のコンポーネントであるカプシド、テグメントおよびエンベロープのそれぞれが、異なる３つの蛍光タンパク質で標識されている、前記組換えウイルス。
【請求項２】
ウイルスが、ヘルペスウイルス科に属するウイルスより選択される、請求項１に記載の組換えウイルス。
【請求項３】
ウイルスが、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）である、請求項１に記載の組換えウイルス。
【請求項４】
ウイルスが単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）であり；
カプシドがＵＬ３５、ＵＬ１８、ＵＬ１９、ＵＬ２６、およびＵＬ３８からなる群より選択され；
テグメントがＵＬ４９、ＵＬ４７、ＵＬ４６、ＵＬ４８、ＵＬ４１、ＵＬ１１、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ３６、ＵＬ３７、ＵＬ５１、ＵＬ５６、Ｕｓ２、Ｕｓ９、Ｕｓ１０、およびＵｓ１１からなる群より選択され；そして、
エンベロープがＵＬ２７、ＵＬ１、ＵＬ１０、ＵＬ２２、Ｕｓ６、ＵＬ４４、ＵＬ５３、Ｕｓ４、Ｕｓ５、Ｕｓ７、およびＵｓ８からなる群より選択される；
請求項１に記載の組換えウイルス。
【請求項５】
蛍光タンパク質が、Ｖｅｎｕｓ、ｍＲＦＰ１、ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＢＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ＰｈｉＹＦＰ、Ｊ−Ｒｅｄ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ１、ＡｍＣｙａｎ１、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ｍＡｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ１、ＣｏｐＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１、ｍＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＰｌｕｍ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｅｑＦＰ６１１、およびＡｓＲｅｄ２からなる群より選択される、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
【請求項６】
ウイルスが単純ヘルペスウイルスであり、カプシドがＶｅｎｕｓで標識されたＵＬ３５であり、テグメントがｍＲＦＰ１で標識されたＵＬ４７またはＵＬ４９であり、エンベロープがＥＣＦＰで標識されたＵＬ２７である、請求項１に記載の組換えウイルス。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の組換えウイルスを感染させた細胞。
【請求項８】
抗ウイルス剤の作用機序を解析する方法であって、以下：
（ｉ）請求項１ないし６のいずれか１項に記載の組換えウイルスで感染させた細胞に、抗ウイルス剤を接触させ；
（ｉｉ）ウイルス粒子のコンポーネントであるカプシド、テグメント、およびエンベロープを標識した各蛍光タンパク質の蛍光に基づいて、各コンポーネントの当該感染細胞における生成の挙動および／または局在を観察し；
（ｉｉｉ）観察された各コンポーネントの生成の挙動および／または局在について、抗ウイルス剤を接触させていない感染細胞における各コンポーネントの生成の挙動および／または局在との差異を評価し；そして
（ｉｖ）当該抗ウイルス剤は、生成の挙動および／または局在に差異があるコンポーネントが関与するウイルス粒子成熟過程に作用すると判断する；
工程を含む、前記方法。
【請求項９】
感染細胞におけるウイルス粒子の各コンポーネントの生成の挙動および／または局在の観察を、リアルタイムイメージングにより行う、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
特定のウイルス粒子成熟過程を標的とする抗ウイルス剤をスクリーニングする方法であって、以下：
（ｉ）請求項１ないし６のいずれか１項に記載の組換えウイルスで感染させた細胞に、抗ウイルス剤の候補物質を接触させ；
（ｉｉ）ウイルス粒子のコンポーネントであるカプシド、テグメント、およびエンベロープを標識した各蛍光タンパク質の蛍光に基づいて、各コンポーネントの当該感染細胞における生成の挙動および／または局在を観察し；
（ｉｉｉ）観察された各コンポーネントの生成の挙動および／または局在について、抗ウイルス剤の候補物質を接触させていない感染細胞における各コンポーネントの生成の挙動および／または局在との差異を評価し；そして
（ｉｖ）差異を生じた場合は、当該抗ウイルス剤の候補物質を、生成の挙動および／または局在に差異があるコンポーネントが関与するウイルス粒子成熟過程を標的とする抗ウイルス剤として同定する；
工程を含む、前記方法。
【請求項１】
組換えウイルスであって、ウイルス粒子のコンポーネントであるカプシド、テグメントおよびエンベロープのそれぞれが、異なる３つの蛍光タンパク質で標識されている、前記組換えウイルス。
【請求項２】
ウイルスが、ヘルペスウイルス科に属するウイルスより選択される、請求項１に記載の組換えウイルス。
【請求項３】
ウイルスが、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）である、請求項１に記載の組換えウイルス。
【請求項４】
ウイルスが単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）であり；
カプシドがＵＬ３５、ＵＬ１８、ＵＬ１９、ＵＬ２６、およびＵＬ３８からなる群より選択され；
テグメントがＵＬ４９、ＵＬ４７、ＵＬ４６、ＵＬ４８、ＵＬ４１、ＵＬ１１、ＵＬ１３、ＵＬ１４、ＵＬ３６、ＵＬ３７、ＵＬ５１、ＵＬ５６、Ｕｓ２、Ｕｓ９、Ｕｓ１０、およびＵｓ１１からなる群より選択され；そして、
エンベロープがＵＬ２７、ＵＬ１、ＵＬ１０、ＵＬ２２、Ｕｓ６、ＵＬ４４、ＵＬ５３、Ｕｓ４、Ｕｓ５、Ｕｓ７、およびＵｓ８からなる群より選択される；
請求項１に記載の組換えウイルス。
【請求項５】
蛍光タンパク質が、Ｖｅｎｕｓ、ｍＲＦＰ１、ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＢＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ＰｈｉＹＦＰ、Ｊ−Ｒｅｄ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ１、ＡｍＣｙａｎ１、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ｍＡｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ１、ＣｏｐＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１、ｍＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＰｌｕｍ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｅｑＦＰ６１１、およびＡｓＲｅｄ２からなる群より選択される、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
【請求項６】
ウイルスが単純ヘルペスウイルスであり、カプシドがＶｅｎｕｓで標識されたＵＬ３５であり、テグメントがｍＲＦＰ１で標識されたＵＬ４７またはＵＬ４９であり、エンベロープがＥＣＦＰで標識されたＵＬ２７である、請求項１に記載の組換えウイルス。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の組換えウイルスを感染させた細胞。
【請求項８】
抗ウイルス剤の作用機序を解析する方法であって、以下：
（ｉ）請求項１ないし６のいずれか１項に記載の組換えウイルスで感染させた細胞に、抗ウイルス剤を接触させ；
（ｉｉ）ウイルス粒子のコンポーネントであるカプシド、テグメント、およびエンベロープを標識した各蛍光タンパク質の蛍光に基づいて、各コンポーネントの当該感染細胞における生成の挙動および／または局在を観察し；
（ｉｉｉ）観察された各コンポーネントの生成の挙動および／または局在について、抗ウイルス剤を接触させていない感染細胞における各コンポーネントの生成の挙動および／または局在との差異を評価し；そして
（ｉｖ）当該抗ウイルス剤は、生成の挙動および／または局在に差異があるコンポーネントが関与するウイルス粒子成熟過程に作用すると判断する；
工程を含む、前記方法。
【請求項９】
感染細胞におけるウイルス粒子の各コンポーネントの生成の挙動および／または局在の観察を、リアルタイムイメージングにより行う、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
特定のウイルス粒子成熟過程を標的とする抗ウイルス剤をスクリーニングする方法であって、以下：
（ｉ）請求項１ないし６のいずれか１項に記載の組換えウイルスで感染させた細胞に、抗ウイルス剤の候補物質を接触させ；
（ｉｉ）ウイルス粒子のコンポーネントであるカプシド、テグメント、およびエンベロープを標識した各蛍光タンパク質の蛍光に基づいて、各コンポーネントの当該感染細胞における生成の挙動および／または局在を観察し；
（ｉｉｉ）観察された各コンポーネントの生成の挙動および／または局在について、抗ウイルス剤の候補物質を接触させていない感染細胞における各コンポーネントの生成の挙動および／または局在との差異を評価し；そして
（ｉｖ）差異を生じた場合は、当該抗ウイルス剤の候補物質を、生成の挙動および／または局在に差異があるコンポーネントが関与するウイルス粒子成熟過程を標的とする抗ウイルス剤として同定する；
工程を含む、前記方法。
【図８】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００８−１３１８６７（Ｐ２００８−１３１８６７Ａ）
【公開日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３１８５３４（Ｐ２００６−３１８５３４）
【出願日】平成１８年１１月２７日（２００６．１１．２７）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月２７日（２００６．１１．２７）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
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