エネルギー移動色素、ダイターミネーター及びその使用
本発明は蛍光標識ダイターミネーター４つの新規なセットに関する。これらのうち２つは単一ダイ標識ターミネーターであり、他の２つのダイターミネーターはフォスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づくものである。ＦＲＥＴダイターミネーターは４′，５′−ビス−アミノメチルフルオロセインから生成される。ドナー色素である４′，５′−ビス−アミノメチルフルオロセインのアミノ基２個のうち、アミノ基１個を用いてアクセプター色素に結合し、アミノ基の別の１個はジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸に結合するために使用する。その調製、エネルギー移動効率及び標識としての使用、特にＤＮＡシークエンシング反応における標識としての使用を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はエネルギー移動色素及び蛍光標識ダイターミネーター、その調製及びＤＮＡ配列決定における標識としての使用に関する。
【０００２】
ハイスループット遺伝子配列決定の現在受け入れられている慣行法は、一般則として、４種類の異なる標識を有するエネルギー移動（ＥＴ）ダイターミネーターを用いて、フォスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）メカニズムに基づいて、ドナーの励起波長で励起し、４種類の個々の核酸塩基にコンジュゲートした４種類のアクセプターの波長で発光を測定することによって配列を読み取る。
【０００３】
しかし、報告されている現在使用可能なＥＴターミネーターセットは輝度が低いという難点を有する。こうした低い輝度はドナーに吸収されたエネルギーのアクセプターへの移動が非効率的であること、及びアクセプターの発光波長における再発光に起因する。こうした非効率性はドナーとアクセプター及び塩基を結合してダイターミネーターの形成に用いられている構造的連結が最適ではないことによる。
【０００４】
多数の蛍光色素が生物学的試料中の成分の標識及び検出に最近開発されている。一般にこれらの蛍光色素は、低い検出限界を達成するには、高い吸光係数と量子収率を有さなければならない。
【０００５】
フォスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）メカニズムに基づいてストークスシフトを大きくしかつ多様にするために開発され、混合物中の異なる標識を有する試料の同時検出に使用されている色素の１つのクラスはＥＴ（エネルギー移動）色素である。これらのＥＴ色素はドナー蛍光団及びアクセプター蛍光団並びに目的の生物分子へのコンジュゲーションを可能にするための標識機能からなる複雑な分子構造を含む。ドナー蛍光団の励起によってドナーに吸収されたエネルギーはフォスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）メカニズムでアクセプター蛍光団に移動し、蛍光を発する。１ドナーの場合に、異なるアクセプターを用いて１セットのＥＴ色素をなすことにより、該セットが単一のドナー周波数で励起された場合にもアクセプターの選択に応じて様々な発光を観察することができる。こうした異なる発光を定量することにより、これらの色素が目的の生物分子にコンジュゲートしたときに混合物の各成分を容易に分解することができる。これらのＥＴ色素セットは現在のハイスループット遺伝子配列決定方法論の骨格をなす。
【背景技術】
【０００６】
以前より、二元蛍光団の様々な組合せが報告されている。援用によって図面も含めてその全体が本明細書に組み込まれるＭａｔｈｉｅｓ等の「Ｐｒｏｂｅｓ Ｌａｂｅｌｌｅｄ ｗｉｔｈ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｙｅｓ」と題する米国特許５６８８６４８号、「Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｓｐａｃｅｒ／ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｙｅｓ」と題する米国特許５７２８５２８号、及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｌａｂｅｌｓ ｗｉｔｈ ｃｙａｎｉｎｅ ｄｙｅｓ ａｓ ｄｏｎｏｒ ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅｓ」と題する米国特許６１５０１０７号には、ドナー色素分子とアクセプター色素分子の対を担持した蛍光標識のセットが開示されており、標識は配列決定用核酸骨格に連結することができる。核酸塩基又は塩基糖単位をスペーサーとして用いてドナー色素とアクセプター色素を分離する。ドナー色素からアクセプター色素への効率的エネルギー移動に最適な距離は約６〜１０塩基であることが判明している。蛍光部分がシアニン色素及びキサンテン類のような群から選択される、各種蛍光標識を用いて複数の核酸の混合物中の所定の核酸を同定・検出する方法も開示されている。蛍光標識は蛍光団の対を含んでおり、１つの蛍光団ドナーは蛍光団アクセプターの吸収と重複する発光スペクトルを有していて、対のうちの励起側から他方へのエネルギーの移動が起こる。
【０００７】
援用によって図面も含めてその全体が本明細書に組み込まれるＷａｇｇｏｎｅｒ等の「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ｌａｒｇｅ ｓｔｏｋｅｓ ｓｈｉｆｔ ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｃｙａｎｉｎｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅｓ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ」と題する米国特許６００８３７３号には、第１の吸光及び発光スペクトルを有する第１の蛍光色素及び第２の吸光及び発光スペクトルを有する第２の蛍光色素を含む複合体が開示されている。蛍光色素の間のリンカー基はアルキル鎖である。色素の蛍光の性質により、配列決定及び核酸の検出に使用可能となる。
【０００８】
援用によってその全体が本明細書に組み込まれる「Ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｙｅｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ」と題するＬｅｅ等の米国特許５８６３７２７号には、ドナー及びアクセプター色素が色素間のリンカーで離隔されたエネルギー移動色素が開示されている。色素間の好ましいリンカーは４−アミノメチル安息香酸である（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（１４），２８１６−２８２２）。このリンカーに基づくエネルギー移動ターミネーターＤＮＡ配列決定キットはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（米国カリフォルニア州フォスター・シティ）から入手可能であり、ＢｉｇＤｙｅターミネーターキットとして市販されている。
【０００９】
援用によって図及び図面も含めてその全体が本明細書に組み込まれるＫｕｍａｒ等の「Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｙｅｓ」と題する国際公開第００／１３０２６号には、エネルギー移動色素、その調製及び生物学的な系における標識としてのその使用が開示されている。色素は好ましくは各種生物学的物質へのその結合を可能とするカセットの形態である。ドナー色素、アクセプター色素及びジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸は全て芳香族アミノ酸構造に基づく三官能性リンカーに連結する（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒ，２０００，４１，８８６７−８８７１）。これらの構造に基づくエネルギー移動ターミネーターキットはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）からＤＮＡ配列決定用のＤＹＥｎａｍｉｃ ＥＴターミネーターキットとして市販されている。
【００１０】
援用によって図及び図面も含めてその全体が本明細書に組み込まれるＫｕｍａｒ等の「Ｃｈａｒｇｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ」と題する国際公開第０１／１９８４１号には、リンカーアームに正電荷又は負電荷を導入した単一のエネルギー移動ダイ標識ターミネーターが開示している。これらのターミネーターは、ダイ標識ジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸の分解で形成されるいかなる「色素ブロック」も含まないＤＮＡシークエンシングバンドの発生に有用である。荷電ターミネーターの使用により、これらの分解生成物は配列情報の後方（正電荷ターミネーター）又は前方に移動させることができる（Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，３０（１３），２８７７−２８８５、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００３，３１，４７６９−４７７８）。
【００１１】
ただし、これらの特許に記載されたＥＴターミネーターセットは輝度が低いという難点を有する。こうした低い輝度はドナーに吸収されたエネルギーのアクセプターへの移動が非効率的であること並びにアクセプターの発光波長におけるその再発光に起因する。こうした非効率性はドナーとアクセプター及び塩基を結合してダイターミネーターの形成に用いられている構造的連結が最適ではないことによる。従って、最大の輝度を得るためのエネルギー移動色素の構築及び生物学的分子へのその結合をさらに改善するニーズが依然として存在している。
【特許文献１】米国特許５６８８６４８号明細書
【特許文献２】米国特許５７２８５２８号明細書
【特許文献３】米国特許６１５０１０７号明細書
【特許文献４】米国特許６００８３７３号明細書
【特許文献５】米国特許５８６３７２７号明細書
【特許文献６】国際公開第００／１３０２６号パンフレット
【特許文献７】国際公開第０１／１９８４１号パンフレット
【非特許文献１】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（１４），２８１６−２８２２
【非特許文献２】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒ，２０００，４１，８８６７−８８７１
【非特許文献３】Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，３０（１３），２８７７−２８８５
【非特許文献４】Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００３，３１，４７６９−４７７８
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は現在入手可能なターミネーターよりも格段に輝度の高い４種類の異なる標識を有するダイターミネーターの新規なセットを提供する。このセットにおけるダイターミネーターの２種類は単一色素からなり、他の２種類は伝統的なＥＴ色素ではあるがＥＴ効率その他の特性に格段に優れている。本発明のダイターミネーターのセットでの輝度の向上及びそれに伴うＳＮ比の改善は広範な鋳型使用量でのシークエンシングを可能にする。さらに、この新規ダイターミネーターセットは大幅に改善されたピーク均一性を示し、配列特異的なアーチファクトの一部が除かれた電気泳動図を与える。本発明で開示する４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン及びその５及び６−カルボキシ置換誘導体の形態の新しい蛍光団／リンカーの組合せはトリフルオル（三元発色団系）ＥＴ色素の構築を可能にする。標識官能性に加えて２個以上のドナー及び/又はアクセプターを有するトリフルオル色素は単波長励起によってアクセプターの発光可能域を拡張するのに使用できる。これにより、シークエンシング反応のモニタリング及び高輝度発光、さらには他の可能な標識用途への途が広がる。４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン−５（６）−カルボン酸骨格は様々な電荷のフルオレセイン色素及び荷電エネルギー移動色素の合成に使用できる正荷電又は負荷電部分の結合のための特別の部位を与える。本発明の荷電エネルギー移動ダイターミネーターは直接ローディング式「ブロブフリー」ＤＮＡ配列決定に使用し得る。
【００１３】
本発明は既存のダイターミネーターよりも高輝度であり、ＤＮＡポリメラーゼの基質となるエネルギー移動色素及び標識ヌクレオチドを提供する。エネルギー移動色素は４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン構造に基づく。この系では、アクセプター色素はアクセプター色素に結合する別のリンカーを必要とせずに、アミノ基に直接結合する。この構造の第２のアミノ基はヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドその他の目的の生物学的分子を始めとする、目的の生物学的分子に結合するように検討されている。
【００１４】
本発明は、単フルオレセイン構造系の色素又は各種電荷のエネルギー移動色素を提供する。４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン又はその５（６）−カルボン酸構造を用いて正荷電又は負荷電部分に結合してよい。本発明の荷電色素及びターミネーターはまた「直接ローディング式」ＤＮＡ配列決定に用いてよい。
【００１５】
本発明は４種類のターミネーターのセットを提供する。ターミネーターセットには単一ダイ（フルオレセイン（ＦＡＭ）、ローダミン１１０（Ｒ１１０）又はローダミン６Ｇ（ＲＥＧ又はＲ６Ｇ））で標識されたジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸２種類及びエネルギー移動色素（フルオレセイン−テトラメチルローダミン（ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ）及びフルオレセイン−ローダミンＸ（ＦＡＭ−ＲＯＸ）で標識されたジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸２種類が含まれる。このターミネーターセットはＤＮＡ配列決定用に最適化されている。セット内の標識ヌクレオチドターミネーターは既存のキットよりも格段に高輝度であり、より均一なバンドを与える。その調製法及びＤＮＡ配列決定における使用も本発明において開示する。
【００１６】
本発明の組成物及びエネルギー移動色素の製造方法及びヌクレオシド、ヌクレオチド（一、二又は三リン酸）又はオリゴヌクレオチドのような目的の生物学的分子へのその結合についても開示する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
ＦＲＥＴの効率は多くの要因に依存している。フォスター理論（Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ． Ｌａｋｏｗｉｃｚ， “Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ” ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｈａｐｔｅｒ １３， Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｂｏｓｔｏｎ， Ｄｕｒｄｒｅｃｈｔ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｍｏｓｃｏｗ １９９９）によれば、それらは主に以下の要因である。
１）ドナーの発光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルの重複、
２）ドナーとアクセプターの間の間隔、及び、
３）ドナーとアクセプターの二極の間の空間的配向。
【００１８】
実際には、問題ははるかに複雑である。場合によっては、ドナー発光が全く存在しないときでも、ドナーとアクセプター間の特異的な相互作用によって消光が起こり、アクセプターからの発光がほとんどみられないことがある。さらに、ドナーが消光される程度はアクセプターに移動したエネルギーとはほとんど関係なく、観察される発光量とは殆ど関係ない。本発明者等はこれらのダイターミネーターに関する現実的なＥＴ過程を説明するために数学的な処理を開発した。かかる数学的処理には、以下に挙げる３つの実験的に測定可能なパラメーターが最も重要である。
１）ＰＱＥＱ（ドナーの消光率％）、これは以下の通り定義される。
ＰＱＷＱ＝（１−発光ドナー／アクセプター対のドナー／発光アクセプター非存在下での同量のドナー）×１００
２）ＰＡＥＥ（アクセプター発光効率％）、
ＰＥＡＡ＝（ドナーアクセプター対のアクセプターの発光効率）／（ドナー非存在下でのアクセプターの発光効率）×１００％、及び、
３）ＰＥＴ（エネルギー移動率％）、
ＰＥＴ＝ドナーの量子収率×（ドナー励起波長で励起されたアクセプターの発光効率）／（アクセプター非存在下のドナーの発光効率）。
【００１９】
上記のＰＥＴは、実際には、ドナー励起波長で励起されたドナー／アクセプター対の量子収率、及びアクセプター発光波長で測定される発光となる。
【００２０】
上述の方法論は１個のドナーと３個以上のアクセプターからなるＥＴ集合体にも拡張できる。さらに、これらの数値から、ＥＴ過程全体を通じた光子の流れを示すフローダイアグラムを構築できる。一例として、現在のＤＮＡシークエンシング反応に使用されている４種類のＥＴダイターミネーターのセット（Ｋｕｍａｒ等、国際公開第００／１３０２６、Ｎａｍｐａｌｌｉ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０００，４１，８８６７）に関する数値を表１に示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】
表に記載の化合物の分子構造を以下に示す。
【００２３】
【化１】
【００２４】
例示として、例えば化合物（IV）を用いて光子のフローダイアグラムを構築できる。
【００２５】
【化２】
【００２６】
ダイアグラムの構築は比較的単純である。化合物（IV）のＰＱＥＱが９９％に等しいので、ドナー（ＦＡＭ）に吸収された光子１００個のうちドナーで再発光されるものは僅か１個である。ＰＥＴは０．１９に等しく、これは、ドナーに吸収された光子１００個当たり、光子１９個がアクセプター（ＲＯＸ）から発光されることを意味する。ＰＡＥＥは０．３５であり、その遊離状態におけるＲＯＸの量子収率がＦＡＭとの相対値として１．０であると仮定すると、ＲＯＸアクセプターから光子１９個を発光させるには１９／０．３５、つまり５４個の光子のインプットが必要となる。従って、蛍光以外の過程におけるアクセプター（ＲＯＸ）で失われた光子の数は３５（＝５４−１９）となる。次に光子の保存則から、ドナーＦＡＭから放射過程で失われた光子の数は４５（＝１００−１−５４）となるはずである。
【００２７】
表１に記載したものについて、本発明者等がダイターミネーターの改良された輝度を精査する過程において、本発明者等は４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン（ＢＡＭ−ＦＡＭ）及びその５置換誘導体（５−カルボキシ−ＢＡＭ−ＦＡＭ）に基づく新しい種類のＥＴ色素を発見した。ＢＡＭ−ＦＡＭは、ドナー蛍光団としてだけでなく、アクセプター蛍光団及び修飾核酸塩基を結合して輝度その他所望の特性に優れたダイターミネーターを形成できる構造的結合部としての働きも有する。５−カルボキシ−ＢＡＭ−ＦＡＭはさらに、２以上の結合部位を与え、これによりトリフルオルダイターミネーター（１個ドナーと同一又は異なる２個のアクセプターと核酸塩基）の構造を可能とする。
【００２８】
即ち、本発明は次式のエネルギー移動色素を提供する。
【００２９】
【化３】
【００３０】
式中、
Ｒ１はキサンチン色素、ローダミン色素及びシアニン色素からなる群から選択されるアクセプター色素であって、Ｒ１はフルオレセインドナー発色団からエネルギーを受け取ることができ、
Ｌ１は炭素、酸素、窒素、イオウ及びリン原子から選択される連結した原子２〜５０個を含むリンカー鎖であって、
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上又は−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含む（Ｒは水素又はＣ１−Ｃ４アルキル基を表す。）か、或いは
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上及び−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含んでおり（Ｒは水素又はＣ１−Ｃ４アルキル基を表す。）、
Ｒ２はＨ、ＣＯＯＲ又はＣＨ２ＯＲ、又は炭素、酸素、窒素、イオウ及びリン原子から選択される連結した原子２〜３０個を含む鎖Ｌ２を表し、
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上又は−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含む（Ｒは上記の通り定義される。）か、或いは
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上及び−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含んでおり（Ｒは上記の通り定義される。）、
Ｘは以下のものから選択され、
【００３１】
【化４】
【００３２】
Ｔは生物学的分子である。
【００３３】
別の実施形態は次式のエネルギー移動色素を提供する。
【００３４】
【化５】
【００３５】
式中、
Ｒ１はキサンチン色素、ローダミン色素及びシアニン色素からなる群から選択されるアクセプター色素であって、Ｒ１はフルオレセインドナー発色団からエネルギーを受け取ることができ、
Ｌ１は炭素、酸素、窒素、イオウ及びリン原子から選択される連結した原子２〜５０個を含むリンカー鎖であって、
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上又は−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含む（Ｒは水素又はＣ１−Ｃ４アルキル基を表す。）か、或いは
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上及び−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含んでおり（Ｒは水素又はＣ１−Ｃ４アルキル基を表す。）、
ＹはＨ、ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＮＨＣＯＲ又はＣＨ２ＯＲ（Ｒは上記の通り定義される。）、又は炭素、酸素、窒素、イオウ及びリン原子から選択される連結した原子２〜３０個を含む鎖Ｌ２を表し、
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上又は−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含む（Ｒは上記の通り定義される。）か、或いは
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上及び−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含んでおり（Ｒは上記の通り定義される。）、
Ｘは以下のものから選択され、
【００３６】
【化６】
【００３７】
Ｔは生物学的分子である。
【００３８】
別の特徴においては、本発明は、核酸の配列を決定する方法であって、
ａ）配列決定すべき核酸の試料、配列決定すべき核酸の少なくとも一部に相補的なプライマー核酸配列、シークエンシング反応を終了するためのデオキシヌクレオチド及び請求項８記載の１種以上のジデオキシヌクレオチドの供給源、及びポリメラーゼを準備すること、
ｂ）核酸鎖伸長及び連鎖停止反応を実施すること、
ｃ）サイズに応じてオリゴヌクレオチドフラグメントを分離すること
を含んでなる方法に関する。
【００３９】
さらに本発明は上述の化合物の１種類以上を含むＤＮＡ配列決定用キットに関し、標的分子は上述の生物学的分子であり、Ｔは２′，３′−ジデオキシシチジン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキシチミジン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキシウリジン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキシアデノシン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキグアノシン−５′−三リン酸及び２′，３′−ジデオキシイノシン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキシ−７−デアザアデノシン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグアノシン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキシ−７−デアザイノシン−５′−三リン酸及びこれらの３′−フルオロ、３′−アジド、３′−アミノ又は３′−チオ誘導体からなる群から選択されるジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸である。
【００４０】
上述の通り、適当なＲ１アクセプター色素は本発明のエネルギー移動化合物の一部を形成するフルオロセインドナー発色団又はエネルギーを受け取ることのできる色素である。例えば、適当なアクセプター色素はキサンチン色素（例えばフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、ロドール及び上記のものの誘導体）、ローダミン色素（例えばローダミン１１０、ＲＥＧ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、テキサスレッド等）及びシアニン色素（例えばＣｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７等）からなる群から選択でき、Ｒ１はフルオレセインドナー発色団からエネルギーを受け取ることができる。
【００４１】
適当なアクセプター色素の具体例としては、フルオレセイン、ナフトフルオレセイン、ロドール、５−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミン、５−カルボキシローダミン−６−Ｇ、６−カルボキシローダミン−６−Ｇ、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−５−カルボキシローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−６−カルボキシローダミン、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、Ｃｙ３（３−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′ ，３′−テトラメチル−５，５′−ジスルホナト−カルボシアニン）、Ｃｙ３．５（３−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′ ，３′−テトラメチル−４，５，４′，５′−（１，３−ジスルホナト）ジベンゾ−カルボシアニン、Ｃｙ５（３−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′ ，３′−テトラメチル−５，５′−ジスルホナト）ジベンゾ−ジカルボシアニン、Ｃｙ５．５（（３−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′ ，３′−テトラメチル−４，５，４′，５′−（１，３−ジスルホナト）ジベンゾ−ジカルボシアニン及びＣｙ７（（３−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′ ，３′−テトラメチル−５，５′−（１，３−ジスルホナト）トリカルボシアニンが挙げられる。ただし、他の部類の色素もアクセプター色素として使用し得る。
【００４２】
エネルギー移動（ＥＴ）効率はドナーとアクセプター色素の距離及び配向に依存する。表１の化合物（III）において、ドナーのフルオレセイン（ＦＡＭ）とアクセプターのテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）の間の結合部はその間に１１結合長の隔たりを有している。ただし、結合部は（Ｖ）のようなＢＡＭ−ＦＡＭ結合化合物に示すように、３結合長程度の小さなものでもよい。
【００４３】
実際、Ｌｅｅ等（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９７，２５（１４），１８２６−２８２２）はＥＴ色素「ビフルオル−Ｉ」（Ｖ）を検討している。しかし、上記報文でこの研究者等は「しかし、ビフルオル−Ｉはテトラメチルローダミン単独よりも高輝度ではなかった」と結論している。本発明者等が検討したところでは、化合物（Ｖ）又は４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン（VI）及びその５又は６−カルボキシル誘導体（VII）から誘導したＥＴターミネーターで格段に向上したＥＴが観察されている。
【００４４】
【化７】
【００４５】
４′−アミノメチルフルオレセイン−５−カルボン酸又は４′−アミノメチルフルオレセイン−６−カルボン酸及び４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン又は４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン−５−カルボン酸及び６−カルボン酸の合成を図１に示す通り行った。即ち、フルオレセイン或いはフルオレセイン−５−又は６−カルボン酸を２−クロロ−ｎ−（ヒドロキシメチル）−アセトアミドと硫酸溶液中で反応させ、次に濃塩酸で加水分解して対応アミノエチル誘導体を得た。
【００４６】
色素とジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸との間のリンカーが異なる多数の単一ダイ標識ターミネーターを合成し、４８８ｎｍの励起光でその輝度（ＰＥＴ）を測定した。本発明の方法における各ターミネーターの選択は、ＤＮＡポリメラーゼとターミネーターとの反応性、バンドの均一性及び配列全体での分解能に基づいて行った（例えば図１１及び図１２参照）。単一ダイ標識ターミネーターの輝度も、本発明のエネルギー移動ダイ標識ターミネーター及び従前開示されたターミネーターと比較した（表１（前出）及び表２（後出）参照）。
【００４７】
モノアミノメチルフルオレセイン誘導ターミネーターの合成は図３に示す通り行った。即ち、４′−アミノメチルフルオレセイン−５−カルボン酸をトリフルオロアセトアミド−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンアミド（ＴＦＡ−ＮＨＳ）と反応させて一段階で酸の活性化とアミノ保護を行った。活性エステルを、適切に結合したプロパルギルアミノ−ｄｄＮＴＰと反応させ、水酸化アンモニウムで加水分解して得た遊離アミノ化合物を適当な色素−ＮＨＳエステルと反応させてエネルギー移動ダイターミネーターを得た。
【００４８】
４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン誘導ターミネーターの合成は図４に示する通り行った。この場合、ビスアミノメチルフルオレセインを無水コハク酸でモノアシル化し、その後ＴＦＡ−ＮＨＳと反応させて、４′（５′）−トリフルオロアセトアミドフルオレセイン−５′（４′）−スクシニルアミドメチル−ＮＨＳエステルとした。次の２つの段階は４′−アミノメチルフルオレセイン誘導エネルギー移動ターミネーターの合成に関して上述の方法と基本的に同じ方法で行った。
【００４９】
エネルギー移動（ＥＴ）効率を本発明で合成した全ての単一ダイ標識ジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸（ターミネーター）及びエネルギー移動ターミネーターについて測定した。全てのダイターミネーターは４８８ｎｍで励起し、その対応発光波長において発光を測定した。結果を表２に示す。
【００５０】
【表２】
【００５１】
表２に記載したダイターミネーターの分子構造を図５に示す。
【００５２】
これらのＰＥＴ測定から、色素ＦＡＭ、Ｒ１１０及びＲＥＧから誘導された単一ダイターミネーターはＦＡＭ−Ｒ１１０及びＦＡＭ−ＲＥＧの複合体から誘導されたＥＴコンストラクトよりも高輝度であることが分かる。ＦＡＭ−ＴＡＭ及びＦＡＭ−ＲＯＸから誘導されたＥＴ色素のコンストラクトはＴＡＭＲＡ及びＲＯＸ単独から誘導された単一ダイターミネーターよりも高輝度である。色素に関する報文（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９７，２５（１４），２８１６−２８２２）とは逆に、ＥＴダイターミネーター（XVI）は単一ダイターミネーター（XII）より格段に高輝度である。
【００５３】
本発明の単一ダイ標識ターミネーター及びエネルギー移動ダイ標識ターミネーター（上記）を、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡシークエンシング反応で試験した。個々のダイ標識ターミネーターの利用性はバンドの全体的な配列の特性、輝度及び均一性に基づいて確認した（図１１〜１４）。これらの基準に基づいて、新しいセットのダイターミネーターを構築した（図６）。この新しいセットのターミネーターのＰＥＴを以下に示す。
【００５４】
【表３】
【００５５】
本発明のターミネーターセットは、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）又はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（米国カリフォルニア州フォスター・シティ）から入手可能な現在市販されているダイターミネーターよりも高輝度である（図８）。この新しいセットは、幾つかの測定によれば、表１に記載したＥＴターミネーターよりも約２倍高輝度、ＢｉｇＤｙｅ（商標）バージョン１及び２のターミネーターよりも４倍高輝度、ＢｉｇＤｙｅ（商標）バージョン３のターミネーターよりも約８倍高輝度である（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（米国カリフォルニア州フォスター・シティ））。こうした輝度の向上は、少量の鋳型でも検出でき、必要なサイクル数が減り、しかも不十分な鋳型のシークエンシングでも良好な配列が得られる可能性が高まることを意味する。この新しいセットのダイターミネーターは泳動速度の速いＧ、傾斜するＴ、及びＡの後の弱いＧのような電気泳動図における３つの一般的アーチファクトが補正されるという更なる利点を有する。またピーク高さもより均一である（図９）。
【００５６】
以下に好ましい結合位置と共に示す（VIII）のような化合物は、さらに、結合した核酸塩基の他に１個のドナー蛍光団及び同一又は異なる２個のアクセプターを有するＥＴトリフルオルダイターミネーターの調製の機会を与える。
【００５７】
【化８】
【００５８】
かかる集合体は、本発明者等はドナーから生じる２回の連続したエネルギー移動に依存しているため、２つの異なるアクセプター蛍光団の導入を伴うＥＴダイターミネーターの発光範囲を拡張することができる。まず第１のアクセプター蛍光団に、次に第１のアクセプター蛍光団から第２へと、３つの蛍光団の間で妥当なスペクトル重複を維持しながら行われる。さらに、複合蛍光団の励起には１以上の方法が存在する。１つは４８８ｎｍでフルオレセイン蛍光団を励起し、エネルギー移動過程が最長の発光蛍光団から発光させることである。フルオレセインと第２の蛍光団の両方を４８８ｎｍ及び第２の蛍光団の吸収最大で同時に励起する場合は、両者に吸収されたエネルギーを第３の蛍光団へ移動させそこから生じる輝度を最大としなければならない。
【００５９】
本発明の標識複合体は好ましくは４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン−５−カルボン酸を他の蛍光団に共有結合させてエネルギードナー−アクセプター複合体を形成することによって合成される。本発明は、試薬、並びに担体物質と共に上述の蛍光水溶性標識複合体をインキュベートすることを含む試薬の調製方法も包含する。複合体と担体を結合する目的には、複合体は担体上の反応性基と反応して共有結合を形成する官能基を有していてよい。或いは、複合体は担体上の官能基と反応して共有結合を形成する反応性基を含んでいてもよい。担体物質はアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル又はヒドロキシル基のうちの１つを含むように誘導体化された重合体粒子、ガラスビーズ、細胞、抗体、抗原、タンパク質、酵素、ヌクレオチドからなる群から選択される。上述の通り、担体物質は反応性基を含んでいてよく、本発明の蛍光標識複合体は反応性基と反応して共有結合を形成する上述の官能基を含んでいてもよい。
【００６０】
別の実施形態では、本発明の蛍光複合体は、別の化合物に非共有結合で結合するために用いられる場合は、反応性基を有する必要はない。例えば、複合体をポリスチレンのような重合体粒子と共に有機溶媒に溶解して混合し、次に乳化重合により攪拌してよい。溶媒を蒸発させ、蛍光色素複合体をポリスチレン粒子に吸着させる。
【００６１】
本発明をさらに以下の実施例を参考にしながら説明する。これらの実施例は説明を目的とするのみであり、請求項及び本発明の範囲を限定するものではない。本発明は明細書の記載から明らかな如何なる変更も包含する。
【実施例】
【００６２】
１）ＦＡＭ−１８−ｄｄＧＴＰ（IX）の調製
１１−ｄｄＧＴＰ（０．１ＭＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ８．５、６０μｍｏｌ、５ｍｌ）の溶液を氷／水バス中で冷却した。溶液にＤＭＦ（５ｍｌ）中の５−カルボキシ−フルオレセイン−ＮＨＳ（３５ｍｇ、１等量）を添加した。反応フラスコを冷却バスから取り外し、反応混合物を１６時間室温で攪拌した。生成物をアニオン交換クロマトグラフィー及びＨＰＬＣで精製した。画分を含む生成物を濃縮し、凍結乾燥し、黄色固体を得た。
【００６３】
２）４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン（ＢＡＭ−ＦＡＭ）の合成（図１）
ａ）４′，５′ビス−（２−クロロアセトアミド）−アミノメチルフルオレセインの調製
フルオレセイン（３．３グラム）及び２−クロロ−ｎ−（ヒドロキシメチル）−アセトアミド（５．０グラム）を濃硫酸２０ｍｌに溶解した。暗褐色の溶液を２時間室温で攪拌した。この時点でＥＳＭＳ＋はフルオレセインが残存していないことを示した。生成物を氷水２００グラムに注ぎ込み、沈殿を濾過し、水、次いでエーテルで洗浄し、風乾した。このようにして得られた物質のＮＭＲは、これが所望の生成物であることを示していた。
ｂ）４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン（ＢＡＭ−ＦＡＭ）を得るための４′，５′ビス−（２−クロロアセトアミド）−アミノメチルフルオレセインの濃塩酸加水分解
上記反応の生成物を濃塩酸４０ｍｌに懸濁し、３０分間還流下に加熱した。その時点で透明な溶液が得られた。生成物を蒸発乾固させ、残存物をメタノール／ジクロロメタンから再結晶させ、ＮＭＲ及びＥＳＭＳ＋により同定された所望の生成物を得た。
【００６４】
３）４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン−５−カルボン酸の合成（図１）
フルオレセイン−５−カルボン酸は濃硫酸に僅かしか溶解しないため、変法を用いた。
ａ）４′，５′ビス−（２−クロロアセトアミド）アミノメチルフルオレセイン−５−カルボン酸の調製
室温で攪拌した濃硫酸２０ｍｌにジピバロイルフルオレセイン−５−カルボン酸を添加した。懸濁液に過剰（４等量）の２−クロロ−ｎ−（ヒドロキシメチル）−アセトアミドを少しずつ、透明な溶液が得られるまで添加した。溶液の色が明黄色から茶色に変化するまでさらに原料（フルオレセイン及び過剰のＨＯＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２Ｃｌ）を添加した。次に溶液を氷／水の混合物に注ぎ込んだ。このようにして得られた沈殿を濾過し、水及びエーテルで洗浄した。沈殿のＮＭＲ及びＥＳＭＳ＋から、所望の生成物であることを確認した。
ｂ）４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン−５−カルボン酸を得るための４′，５′ビス−（２−クロロアセトアミド）アミノメチルフルオレセイン−５−カルボン酸の濃塩酸加水分解
上記生成物１．０１グラムを濃塩酸２０ｍｌ及び２−メトキシエーテル５ｍｌに溶解した。得られた懸濁液を透明になり始めるまで（約２時間）還流下に加熱した。次に溶液を放冷した。一夜室温で放置した後、沈殿を濾過し、０．１Ｎ塩酸、ついでエーテルで洗浄し、ＮＭＲ及びＥＳＭＳ＋スペクトラによれば所望の生成物が得られた。
【００６５】
４）トリフルオロアセトアミドメチル−フルオレセインＮＨＳエステル（ＴＦＡ−ＡＭＦＡＭ−ＮＨＳ）の調製（図３）
４′−アミノメチル−５−カルボキシフルオレセイン（１、０．４９ｇ、１．２１μｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（１５ｍｌ）と共に共沸させることにより乾燥した。これを乾燥ピリジンに懸濁し、これにＴＦＡ−ＮＨＳ（１．５３ｇ、７．２６μｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下に添加した。反応混合物を１時間室温で攪拌し、クロロホルム（１２５ｍｌ）で稀釈し、水（３×７５ｍｌ）で洗浄した。有機層を乾燥（硫酸ナトリウム）し、蒸発させ、トルエンと共沸させて黄色固体を得た。
【００６６】
５）ＴＦＡ−ＡＭＦＡＭ−ＮＨＳの１１−ｄｄＣＴＰの調製（図３）
上記の生成物（２５ｍｇ）をＤＭＦ（１ｍｌ）中に溶解した。溶液にＤＭＳＯ中の１１−ｄＣＴＰの溶液（１ｍｌ、３３μｍｏｌ）又はｐＨ８５炭酸塩／重炭酸塩緩衝液中の１１−ｄｄＣＴＰの溶液（３４μｍｏｌ）のいずれかを添加した。反応混合物を２０時間室温で攪拌した。この時点において、濃水酸化アンモニウム１０ｍｌを添加した。室温で３時間攪拌した後、少量となるまで蒸発させた。粗生成物を水（１０ｍｌ）で稀釈し、イオン交換カラムクロマトグラフィー、次いで逆相カラムクロマトグラフィーで精製した。
【００６７】
６）ＡＭＦＡＭ−ＲＯＸ−１１−ｄｄＣＴＰ（XVII）の合成（図３）
上記の生成物（６０μｍｏｌ）を乾燥ＤＭＳＯ（５ｍｌ）に溶解し、これにＲＯＸ−ＮＨＳエステル（６０ｍｇ、６０μｍｏｌ）を添加し、反応混合物を２０時間室温で攪拌した。反応混合物を水で稀釈し、イオン交換カラムクロマトグラフィー、次いで逆相カラムクロマトグラフィーで精製した。
【００６８】
７）ＡＭＦＡＭ−ＴＡＭ−１８−ｄｄＡＴＰ（XVI）の合成（図３）
化合物（XVII）の調製について記載した方法と同様にして、ＴＦＡ−ＡＭＦＡＭ−ＮＨＳと１８−ｄｄＡＴＰのコンジュゲーション、次いで、ＴＡＭＲＡ−ＮＨＳエステルの反応を行い、標的化合物（XVI）を得た。
【００６９】
８）Ｃｙ−５−ＡＭＦＡＭ（XX）の調製
【００７０】
【化９】
【００７１】
４′−メチルアミノ−フルオレセイン５ｍｇを乾燥ＤＭＦ０．５ｍｌに溶解した。溶液に重炭酸ナトリウム−炭酸塩緩衝液１．０ｍｌ中のＣｙ−５−１官能性反応性色素２０ｍｇを添加した。室温で２０分の後、溶媒を蒸発させ、残存物をクロマトグラフィーに付し、所望の生成物（XX）を得た。
【００７２】
９）Ｃｙ−５ＡＭＦＡＭ−ＴＡＭ（XXＩ）の合成
ａ）ＡＭＦＡＭ−ＴＡＭ（XVIａ）の調製
４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン４ｍｇ及び５−カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル１０ｍｇを過剰のジエチル−ｎ−イソプロピルアミンと共に乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１ｍｌに溶解した。反応を室温で一夜進行させ、得られた生成物をＴＬＣで精製して所望の物質（XVIａ）を得た。
ｂ）Ｃｙ−５ＡＭＦＡＭ−ＴＡＭ（XXＩ）の調製
上記の通り得られた化合物（XVIａ）を過剰のジエチル−ｎ−イソプロピルアミンと共に乾燥ジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液に、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液中の僅かに過剰量のＣｙ−５の１官能性ＮＨＳエステルを添加した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）上における出発物質（ＢＡ）の消失で示される通り反応が終了した後、溶媒を蒸発乾固させ、残存物をＣ１８逆相ＴＬＣプレート上でクロマトグラフィーに付し、所望の生成物（XXＩ）を得た。
ｃ）４′（５′）−トリフルオロアセトアミドフルオレセイン−４′（５′）−スクシニルアミドメチル−ＮＨＳエステル（図４）
ビス−アミノメチルフルオレセイン（０．１４ｇ、０．３μｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）と共に共沸させることにより乾燥した。次にこれをＤＭＦ（８ｍｌ）及びピリジン（４ｍｌ）の混合物に溶解し、これに無水コハク酸（１９ｍｇ）を添加した。２時間室温で攪拌した後、さらに７ｍｇの無水コハク酸を添加した。反応をさらに２時間継続し、溶媒を蒸発乾固させた。粗生成物は出発物質であるモノスクシニル誘導体及びジスクシニル誘導体を一部含有していた。モノ及びジスクシニル誘導体を０．５％ギ酸を含有する１０〜３０％メタノール−ジクロロメタンを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離した。モノスクシニル誘導体を含有する適当な画分を収集し、蒸発乾固させた。
【００７３】
モノスクシニル化合物（５０ｍｇ）を乾燥ピリジン（２×１０ｍｌ）との共沸により乾燥し、次にピリジン（４ｍｌ）とジクロロメタン（４ｍｌ）の混合物中に溶解し、これにＴＦＡ−ＮＨＳ（１５０ｍｇ）を添加した。１時間室温で攪拌した後、反応混合物をジクロロメタン（１００ｍｌ）で稀釈し、水（２×５０ｍｌ）で洗浄した。有機層を乾燥（硫酸ナトリウム）し、蒸発し、残存物をトルエンと共沸させて明黄色固体５０ｍｇを得た。質量スペクトル計算値：６８３．２４、測定値：６８２．２３（Ｍ−Ｈ）−。
【００７４】
ｄｄＮＴＰ誘導体とのコンジュゲート形成及びＥＴ−ターミネーターへの変換（図４）
ｐＨ８．５の炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（０．５ｍｌ）中のｄｄＮＴＰ（２５μｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＦ（０．４ｍｌ）中の化合物８（２５ｍｇ）の溶液を添加した。反応混合物を一夜室温で攪拌し、濃水酸化アンモニウム２０ｍｌを添加した。３時間後、反応混合物を少量になるまで蒸発させ、水で稀釈し、イオン交換クロマトグラフィーで精製した。純粋な生成物を含有する画分を蒸発させ、残存物をメタノール（３×５０ｍｌ）と共沸させた。次にこれをＤＭＳＯ（２ｍｌ）中に溶解し、これに色素−ＮＨＳエステル（３０μｍｏｌ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ又はＲ６Ｇ）を添加し、混合物を２０時間室温で攪拌した。反応混合物を水で稀釈し、イオン交換カラムクロマトグラフィー、次いで逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。
【００７５】
１０）表２及び図６中の化合物IX、XI、XVII及びXVIIIとしての標識化合物を用いたＤＮＡの配列決定（図１０）
Ｍ１３ｍｐ１８鋳型ＤＮＡの配列を標準的な「−４０」プライマーを用いて発生させた。反応混合物（２０μｌ）は２００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ、１００μＭのｄＴＴＰ、１６０ｎＭのＦＡＭ−１８−ｄｄＧＴＰ、１２５ｎＭのＲ６Ｇ−１１−ｄｄＵＴＰ、９５ｎＭのＢＡＭＦＡＭ−ＴＡＭ−２２−ｄｄＡＴＰ，６０ｎＭのＡＭＦＡＭ−ＲＯＸ−１１ｄｄＣＴＰ、２ｐｍｏｌの−４０プライマー、２００ｎｇのＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡ、２０単位のテルモシーケンサー又は他の突然変異ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、０．０００８単位のサーモプラズマ・アシドフィラムの無機ピロホスファターゼ、５０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．５、３０ｍＭのＫＣｌ及び５ｍＭのＮｇＣｌ２を含むものとした。
【００７６】
反応混合物を９５℃２０秒、５０℃３０秒及び６０℃１２０秒の２５サイクルについて熱サイクラー中でインキュベートした。サイクル処理の後、反応生成物を標準的な操作法を用いてエタノールで沈殿させ、洗浄し、ホルムアミドローディング緩衝液中に再懸濁した。試料をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社３７７型装置又はＭｅｇａＢＡＣＥ１００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）上にローディングし、結果を標準的なソフトウエア法を用いて分析した。
【００７７】
上述の本発明の教示の利点を得る当業者は多くの変更を施すことが可能である。かかる変更は添付する請求項に示した本発明の範囲内に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン及びその５−カルボン酸の合成の模式図である。
【図２】４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン及びその５−カルボン酸構造上の種々の電荷及び生物学的分子の結合のための可能な部位を示す。
【図３】４′−アミノメチル−５−カルボン酸構造に基づくエネルギー移動色素及びターミネーターの合成の模式図である。
【図４】４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン−５−カルボン酸構造に基づくエネルギー移動色素及びターミネーターの合成の模式図である。
【図５】本発明の単一ダイ標識ターミネーター及びＥＴターミネーターの構造の模式図である。
【図６】本発明の好ましいダイターミネーターセットすなわち単一ダイターミネーター２つ及びＥＴターミネーター２つの構造の模式図である。
【図７】ＤＮＡ配列決定用に最適化されたダイターミネーターの正規化発光スペクトルを示す。
【図８】共に本発明のダイターミネーターを用いて発生させたシークエンシングバンドと他の市販のターミネーターを用いた場合の相対的輝度の比較を示す。
【図９】本発明のターミネーターを用いた場合のシークエンシングバンドの均一性及び既存の市販ターミネーターとのその比較を示す。
【図１０】本発明の２つの単一ダイ及び２つのＥＴ色素のターミネーターを用いたＤＮＡ分子のシークエンシングデータを示す。
【図１１】各種突然変異ＤＮＡポリメラーゼを用いた様々なリンカー長のＦＡＭ−ｄｄＧＴＰによるシークエンシングのバンドの均一性を示す。
【図１２】各種突然変異ＤＮＡポリメラーゼを用いた様々なリンカー長のＲＥＧ−ｄｄＵＴＰによるシークエンシングのバンドの均一性を示す。
【図１３】各種突然変異ＤＮＡポリメラーゼを用いた様々なリンカー長のＡＭＦＡＭ−ＲＯＸ−ｄｄＣＴＰによるシークエンシングのバンドの均一性を示す。
【図１４】各種突然変異ＤＮＡポリメラーゼを用いた様々なリンカー長のＢＡＭＦＡＭ−ＴＡＭ−ｄｄＡＴＰによるシークエンシングのバンドの均一性を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明はエネルギー移動色素及び蛍光標識ダイターミネーター、その調製及びＤＮＡ配列決定における標識としての使用に関する。
【０００２】
ハイスループット遺伝子配列決定の現在受け入れられている慣行法は、一般則として、４種類の異なる標識を有するエネルギー移動（ＥＴ）ダイターミネーターを用いて、フォスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）メカニズムに基づいて、ドナーの励起波長で励起し、４種類の個々の核酸塩基にコンジュゲートした４種類のアクセプターの波長で発光を測定することによって配列を読み取る。
【０００３】
しかし、報告されている現在使用可能なＥＴターミネーターセットは輝度が低いという難点を有する。こうした低い輝度はドナーに吸収されたエネルギーのアクセプターへの移動が非効率的であること、及びアクセプターの発光波長における再発光に起因する。こうした非効率性はドナーとアクセプター及び塩基を結合してダイターミネーターの形成に用いられている構造的連結が最適ではないことによる。
【０００４】
多数の蛍光色素が生物学的試料中の成分の標識及び検出に最近開発されている。一般にこれらの蛍光色素は、低い検出限界を達成するには、高い吸光係数と量子収率を有さなければならない。
【０００５】
フォスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）メカニズムに基づいてストークスシフトを大きくしかつ多様にするために開発され、混合物中の異なる標識を有する試料の同時検出に使用されている色素の１つのクラスはＥＴ（エネルギー移動）色素である。これらのＥＴ色素はドナー蛍光団及びアクセプター蛍光団並びに目的の生物分子へのコンジュゲーションを可能にするための標識機能からなる複雑な分子構造を含む。ドナー蛍光団の励起によってドナーに吸収されたエネルギーはフォスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）メカニズムでアクセプター蛍光団に移動し、蛍光を発する。１ドナーの場合に、異なるアクセプターを用いて１セットのＥＴ色素をなすことにより、該セットが単一のドナー周波数で励起された場合にもアクセプターの選択に応じて様々な発光を観察することができる。こうした異なる発光を定量することにより、これらの色素が目的の生物分子にコンジュゲートしたときに混合物の各成分を容易に分解することができる。これらのＥＴ色素セットは現在のハイスループット遺伝子配列決定方法論の骨格をなす。
【背景技術】
【０００６】
以前より、二元蛍光団の様々な組合せが報告されている。援用によって図面も含めてその全体が本明細書に組み込まれるＭａｔｈｉｅｓ等の「Ｐｒｏｂｅｓ Ｌａｂｅｌｌｅｄ ｗｉｔｈ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｙｅｓ」と題する米国特許５６８８６４８号、「Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｓｐａｃｅｒ／ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｙｅｓ」と題する米国特許５７２８５２８号、及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｌａｂｅｌｓ ｗｉｔｈ ｃｙａｎｉｎｅ ｄｙｅｓ ａｓ ｄｏｎｏｒ ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅｓ」と題する米国特許６１５０１０７号には、ドナー色素分子とアクセプター色素分子の対を担持した蛍光標識のセットが開示されており、標識は配列決定用核酸骨格に連結することができる。核酸塩基又は塩基糖単位をスペーサーとして用いてドナー色素とアクセプター色素を分離する。ドナー色素からアクセプター色素への効率的エネルギー移動に最適な距離は約６〜１０塩基であることが判明している。蛍光部分がシアニン色素及びキサンテン類のような群から選択される、各種蛍光標識を用いて複数の核酸の混合物中の所定の核酸を同定・検出する方法も開示されている。蛍光標識は蛍光団の対を含んでおり、１つの蛍光団ドナーは蛍光団アクセプターの吸収と重複する発光スペクトルを有していて、対のうちの励起側から他方へのエネルギーの移動が起こる。
【０００７】
援用によって図面も含めてその全体が本明細書に組み込まれるＷａｇｇｏｎｅｒ等の「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ｌａｒｇｅ ｓｔｏｋｅｓ ｓｈｉｆｔ ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｃｙａｎｉｎｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅｓ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ」と題する米国特許６００８３７３号には、第１の吸光及び発光スペクトルを有する第１の蛍光色素及び第２の吸光及び発光スペクトルを有する第２の蛍光色素を含む複合体が開示されている。蛍光色素の間のリンカー基はアルキル鎖である。色素の蛍光の性質により、配列決定及び核酸の検出に使用可能となる。
【０００８】
援用によってその全体が本明細書に組み込まれる「Ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｙｅｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ」と題するＬｅｅ等の米国特許５８６３７２７号には、ドナー及びアクセプター色素が色素間のリンカーで離隔されたエネルギー移動色素が開示されている。色素間の好ましいリンカーは４−アミノメチル安息香酸である（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（１４），２８１６−２８２２）。このリンカーに基づくエネルギー移動ターミネーターＤＮＡ配列決定キットはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（米国カリフォルニア州フォスター・シティ）から入手可能であり、ＢｉｇＤｙｅターミネーターキットとして市販されている。
【０００９】
援用によって図及び図面も含めてその全体が本明細書に組み込まれるＫｕｍａｒ等の「Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｙｅｓ」と題する国際公開第００／１３０２６号には、エネルギー移動色素、その調製及び生物学的な系における標識としてのその使用が開示されている。色素は好ましくは各種生物学的物質へのその結合を可能とするカセットの形態である。ドナー色素、アクセプター色素及びジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸は全て芳香族アミノ酸構造に基づく三官能性リンカーに連結する（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒ，２０００，４１，８８６７−８８７１）。これらの構造に基づくエネルギー移動ターミネーターキットはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）からＤＮＡ配列決定用のＤＹＥｎａｍｉｃ ＥＴターミネーターキットとして市販されている。
【００１０】
援用によって図及び図面も含めてその全体が本明細書に組み込まれるＫｕｍａｒ等の「Ｃｈａｒｇｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ」と題する国際公開第０１／１９８４１号には、リンカーアームに正電荷又は負電荷を導入した単一のエネルギー移動ダイ標識ターミネーターが開示している。これらのターミネーターは、ダイ標識ジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸の分解で形成されるいかなる「色素ブロック」も含まないＤＮＡシークエンシングバンドの発生に有用である。荷電ターミネーターの使用により、これらの分解生成物は配列情報の後方（正電荷ターミネーター）又は前方に移動させることができる（Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，３０（１３），２８７７−２８８５、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００３，３１，４７６９−４７７８）。
【００１１】
ただし、これらの特許に記載されたＥＴターミネーターセットは輝度が低いという難点を有する。こうした低い輝度はドナーに吸収されたエネルギーのアクセプターへの移動が非効率的であること並びにアクセプターの発光波長におけるその再発光に起因する。こうした非効率性はドナーとアクセプター及び塩基を結合してダイターミネーターの形成に用いられている構造的連結が最適ではないことによる。従って、最大の輝度を得るためのエネルギー移動色素の構築及び生物学的分子へのその結合をさらに改善するニーズが依然として存在している。
【特許文献１】米国特許５６８８６４８号明細書
【特許文献２】米国特許５７２８５２８号明細書
【特許文献３】米国特許６１５０１０７号明細書
【特許文献４】米国特許６００８３７３号明細書
【特許文献５】米国特許５８６３７２７号明細書
【特許文献６】国際公開第００／１３０２６号パンフレット
【特許文献７】国際公開第０１／１９８４１号パンフレット
【非特許文献１】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（１４），２８１６−２８２２
【非特許文献２】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒ，２０００，４１，８８６７−８８７１
【非特許文献３】Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，３０（１３），２８７７−２８８５
【非特許文献４】Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００３，３１，４７６９−４７７８
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は現在入手可能なターミネーターよりも格段に輝度の高い４種類の異なる標識を有するダイターミネーターの新規なセットを提供する。このセットにおけるダイターミネーターの２種類は単一色素からなり、他の２種類は伝統的なＥＴ色素ではあるがＥＴ効率その他の特性に格段に優れている。本発明のダイターミネーターのセットでの輝度の向上及びそれに伴うＳＮ比の改善は広範な鋳型使用量でのシークエンシングを可能にする。さらに、この新規ダイターミネーターセットは大幅に改善されたピーク均一性を示し、配列特異的なアーチファクトの一部が除かれた電気泳動図を与える。本発明で開示する４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン及びその５及び６−カルボキシ置換誘導体の形態の新しい蛍光団／リンカーの組合せはトリフルオル（三元発色団系）ＥＴ色素の構築を可能にする。標識官能性に加えて２個以上のドナー及び/又はアクセプターを有するトリフルオル色素は単波長励起によってアクセプターの発光可能域を拡張するのに使用できる。これにより、シークエンシング反応のモニタリング及び高輝度発光、さらには他の可能な標識用途への途が広がる。４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン−５（６）−カルボン酸骨格は様々な電荷のフルオレセイン色素及び荷電エネルギー移動色素の合成に使用できる正荷電又は負荷電部分の結合のための特別の部位を与える。本発明の荷電エネルギー移動ダイターミネーターは直接ローディング式「ブロブフリー」ＤＮＡ配列決定に使用し得る。
【００１３】
本発明は既存のダイターミネーターよりも高輝度であり、ＤＮＡポリメラーゼの基質となるエネルギー移動色素及び標識ヌクレオチドを提供する。エネルギー移動色素は４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン構造に基づく。この系では、アクセプター色素はアクセプター色素に結合する別のリンカーを必要とせずに、アミノ基に直接結合する。この構造の第２のアミノ基はヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドその他の目的の生物学的分子を始めとする、目的の生物学的分子に結合するように検討されている。
【００１４】
本発明は、単フルオレセイン構造系の色素又は各種電荷のエネルギー移動色素を提供する。４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン又はその５（６）−カルボン酸構造を用いて正荷電又は負荷電部分に結合してよい。本発明の荷電色素及びターミネーターはまた「直接ローディング式」ＤＮＡ配列決定に用いてよい。
【００１５】
本発明は４種類のターミネーターのセットを提供する。ターミネーターセットには単一ダイ（フルオレセイン（ＦＡＭ）、ローダミン１１０（Ｒ１１０）又はローダミン６Ｇ（ＲＥＧ又はＲ６Ｇ））で標識されたジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸２種類及びエネルギー移動色素（フルオレセイン−テトラメチルローダミン（ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ）及びフルオレセイン−ローダミンＸ（ＦＡＭ−ＲＯＸ）で標識されたジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸２種類が含まれる。このターミネーターセットはＤＮＡ配列決定用に最適化されている。セット内の標識ヌクレオチドターミネーターは既存のキットよりも格段に高輝度であり、より均一なバンドを与える。その調製法及びＤＮＡ配列決定における使用も本発明において開示する。
【００１６】
本発明の組成物及びエネルギー移動色素の製造方法及びヌクレオシド、ヌクレオチド（一、二又は三リン酸）又はオリゴヌクレオチドのような目的の生物学的分子へのその結合についても開示する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
ＦＲＥＴの効率は多くの要因に依存している。フォスター理論（Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ． Ｌａｋｏｗｉｃｚ， “Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ” ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｈａｐｔｅｒ １３， Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｂｏｓｔｏｎ， Ｄｕｒｄｒｅｃｈｔ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｍｏｓｃｏｗ １９９９）によれば、それらは主に以下の要因である。
１）ドナーの発光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルの重複、
２）ドナーとアクセプターの間の間隔、及び、
３）ドナーとアクセプターの二極の間の空間的配向。
【００１８】
実際には、問題ははるかに複雑である。場合によっては、ドナー発光が全く存在しないときでも、ドナーとアクセプター間の特異的な相互作用によって消光が起こり、アクセプターからの発光がほとんどみられないことがある。さらに、ドナーが消光される程度はアクセプターに移動したエネルギーとはほとんど関係なく、観察される発光量とは殆ど関係ない。本発明者等はこれらのダイターミネーターに関する現実的なＥＴ過程を説明するために数学的な処理を開発した。かかる数学的処理には、以下に挙げる３つの実験的に測定可能なパラメーターが最も重要である。
１）ＰＱＥＱ（ドナーの消光率％）、これは以下の通り定義される。
ＰＱＷＱ＝（１−発光ドナー／アクセプター対のドナー／発光アクセプター非存在下での同量のドナー）×１００
２）ＰＡＥＥ（アクセプター発光効率％）、
ＰＥＡＡ＝（ドナーアクセプター対のアクセプターの発光効率）／（ドナー非存在下でのアクセプターの発光効率）×１００％、及び、
３）ＰＥＴ（エネルギー移動率％）、
ＰＥＴ＝ドナーの量子収率×（ドナー励起波長で励起されたアクセプターの発光効率）／（アクセプター非存在下のドナーの発光効率）。
【００１９】
上記のＰＥＴは、実際には、ドナー励起波長で励起されたドナー／アクセプター対の量子収率、及びアクセプター発光波長で測定される発光となる。
【００２０】
上述の方法論は１個のドナーと３個以上のアクセプターからなるＥＴ集合体にも拡張できる。さらに、これらの数値から、ＥＴ過程全体を通じた光子の流れを示すフローダイアグラムを構築できる。一例として、現在のＤＮＡシークエンシング反応に使用されている４種類のＥＴダイターミネーターのセット（Ｋｕｍａｒ等、国際公開第００／１３０２６、Ｎａｍｐａｌｌｉ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０００，４１，８８６７）に関する数値を表１に示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】
表に記載の化合物の分子構造を以下に示す。
【００２３】
【化１】
【００２４】
例示として、例えば化合物（IV）を用いて光子のフローダイアグラムを構築できる。
【００２５】
【化２】
【００２６】
ダイアグラムの構築は比較的単純である。化合物（IV）のＰＱＥＱが９９％に等しいので、ドナー（ＦＡＭ）に吸収された光子１００個のうちドナーで再発光されるものは僅か１個である。ＰＥＴは０．１９に等しく、これは、ドナーに吸収された光子１００個当たり、光子１９個がアクセプター（ＲＯＸ）から発光されることを意味する。ＰＡＥＥは０．３５であり、その遊離状態におけるＲＯＸの量子収率がＦＡＭとの相対値として１．０であると仮定すると、ＲＯＸアクセプターから光子１９個を発光させるには１９／０．３５、つまり５４個の光子のインプットが必要となる。従って、蛍光以外の過程におけるアクセプター（ＲＯＸ）で失われた光子の数は３５（＝５４−１９）となる。次に光子の保存則から、ドナーＦＡＭから放射過程で失われた光子の数は４５（＝１００−１−５４）となるはずである。
【００２７】
表１に記載したものについて、本発明者等がダイターミネーターの改良された輝度を精査する過程において、本発明者等は４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン（ＢＡＭ−ＦＡＭ）及びその５置換誘導体（５−カルボキシ−ＢＡＭ−ＦＡＭ）に基づく新しい種類のＥＴ色素を発見した。ＢＡＭ−ＦＡＭは、ドナー蛍光団としてだけでなく、アクセプター蛍光団及び修飾核酸塩基を結合して輝度その他所望の特性に優れたダイターミネーターを形成できる構造的結合部としての働きも有する。５−カルボキシ−ＢＡＭ−ＦＡＭはさらに、２以上の結合部位を与え、これによりトリフルオルダイターミネーター（１個ドナーと同一又は異なる２個のアクセプターと核酸塩基）の構造を可能とする。
【００２８】
即ち、本発明は次式のエネルギー移動色素を提供する。
【００２９】
【化３】
【００３０】
式中、
Ｒ１はキサンチン色素、ローダミン色素及びシアニン色素からなる群から選択されるアクセプター色素であって、Ｒ１はフルオレセインドナー発色団からエネルギーを受け取ることができ、
Ｌ１は炭素、酸素、窒素、イオウ及びリン原子から選択される連結した原子２〜５０個を含むリンカー鎖であって、
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上又は−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含む（Ｒは水素又はＣ１−Ｃ４アルキル基を表す。）か、或いは
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上及び−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含んでおり（Ｒは水素又はＣ１−Ｃ４アルキル基を表す。）、
Ｒ２はＨ、ＣＯＯＲ又はＣＨ２ＯＲ、又は炭素、酸素、窒素、イオウ及びリン原子から選択される連結した原子２〜３０個を含む鎖Ｌ２を表し、
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上又は−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含む（Ｒは上記の通り定義される。）か、或いは
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上及び−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含んでおり（Ｒは上記の通り定義される。）、
Ｘは以下のものから選択され、
【００３１】
【化４】
【００３２】
Ｔは生物学的分子である。
【００３３】
別の実施形態は次式のエネルギー移動色素を提供する。
【００３４】
【化５】
【００３５】
式中、
Ｒ１はキサンチン色素、ローダミン色素及びシアニン色素からなる群から選択されるアクセプター色素であって、Ｒ１はフルオレセインドナー発色団からエネルギーを受け取ることができ、
Ｌ１は炭素、酸素、窒素、イオウ及びリン原子から選択される連結した原子２〜５０個を含むリンカー鎖であって、
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上又は−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含む（Ｒは水素又はＣ１−Ｃ４アルキル基を表す。）か、或いは
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上及び−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含んでおり（Ｒは水素又はＣ１−Ｃ４アルキル基を表す。）、
ＹはＨ、ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＮＨＣＯＲ又はＣＨ２ＯＲ（Ｒは上記の通り定義される。）、又は炭素、酸素、窒素、イオウ及びリン原子から選択される連結した原子２〜３０個を含む鎖Ｌ２を表し、
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上又は−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含む（Ｒは上記の通り定義される。）か、或いは
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上及び−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含んでおり（Ｒは上記の通り定義される。）、
Ｘは以下のものから選択され、
【００３６】
【化６】
【００３７】
Ｔは生物学的分子である。
【００３８】
別の特徴においては、本発明は、核酸の配列を決定する方法であって、
ａ）配列決定すべき核酸の試料、配列決定すべき核酸の少なくとも一部に相補的なプライマー核酸配列、シークエンシング反応を終了するためのデオキシヌクレオチド及び請求項８記載の１種以上のジデオキシヌクレオチドの供給源、及びポリメラーゼを準備すること、
ｂ）核酸鎖伸長及び連鎖停止反応を実施すること、
ｃ）サイズに応じてオリゴヌクレオチドフラグメントを分離すること
を含んでなる方法に関する。
【００３９】
さらに本発明は上述の化合物の１種類以上を含むＤＮＡ配列決定用キットに関し、標的分子は上述の生物学的分子であり、Ｔは２′，３′−ジデオキシシチジン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキシチミジン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキシウリジン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキシアデノシン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキグアノシン−５′−三リン酸及び２′，３′−ジデオキシイノシン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキシ−７−デアザアデノシン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグアノシン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキシ−７−デアザイノシン−５′−三リン酸及びこれらの３′−フルオロ、３′−アジド、３′−アミノ又は３′−チオ誘導体からなる群から選択されるジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸である。
【００４０】
上述の通り、適当なＲ１アクセプター色素は本発明のエネルギー移動化合物の一部を形成するフルオロセインドナー発色団又はエネルギーを受け取ることのできる色素である。例えば、適当なアクセプター色素はキサンチン色素（例えばフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、ロドール及び上記のものの誘導体）、ローダミン色素（例えばローダミン１１０、ＲＥＧ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、テキサスレッド等）及びシアニン色素（例えばＣｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７等）からなる群から選択でき、Ｒ１はフルオレセインドナー発色団からエネルギーを受け取ることができる。
【００４１】
適当なアクセプター色素の具体例としては、フルオレセイン、ナフトフルオレセイン、ロドール、５−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミン、５−カルボキシローダミン−６−Ｇ、６−カルボキシローダミン−６−Ｇ、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−５−カルボキシローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−６−カルボキシローダミン、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、Ｃｙ３（３−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′ ，３′−テトラメチル−５，５′−ジスルホナト−カルボシアニン）、Ｃｙ３．５（３−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′ ，３′−テトラメチル−４，５，４′，５′−（１，３−ジスルホナト）ジベンゾ−カルボシアニン、Ｃｙ５（３−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′ ，３′−テトラメチル−５，５′−ジスルホナト）ジベンゾ−ジカルボシアニン、Ｃｙ５．５（（３−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′ ，３′−テトラメチル−４，５，４′，５′−（１，３−ジスルホナト）ジベンゾ−ジカルボシアニン及びＣｙ７（（３−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′ ，３′−テトラメチル−５，５′−（１，３−ジスルホナト）トリカルボシアニンが挙げられる。ただし、他の部類の色素もアクセプター色素として使用し得る。
【００４２】
エネルギー移動（ＥＴ）効率はドナーとアクセプター色素の距離及び配向に依存する。表１の化合物（III）において、ドナーのフルオレセイン（ＦＡＭ）とアクセプターのテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）の間の結合部はその間に１１結合長の隔たりを有している。ただし、結合部は（Ｖ）のようなＢＡＭ−ＦＡＭ結合化合物に示すように、３結合長程度の小さなものでもよい。
【００４３】
実際、Ｌｅｅ等（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９７，２５（１４），１８２６−２８２２）はＥＴ色素「ビフルオル−Ｉ」（Ｖ）を検討している。しかし、上記報文でこの研究者等は「しかし、ビフルオル−Ｉはテトラメチルローダミン単独よりも高輝度ではなかった」と結論している。本発明者等が検討したところでは、化合物（Ｖ）又は４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン（VI）及びその５又は６−カルボキシル誘導体（VII）から誘導したＥＴターミネーターで格段に向上したＥＴが観察されている。
【００４４】
【化７】
【００４５】
４′−アミノメチルフルオレセイン−５−カルボン酸又は４′−アミノメチルフルオレセイン−６−カルボン酸及び４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン又は４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン−５−カルボン酸及び６−カルボン酸の合成を図１に示す通り行った。即ち、フルオレセイン或いはフルオレセイン−５−又は６−カルボン酸を２−クロロ−ｎ−（ヒドロキシメチル）−アセトアミドと硫酸溶液中で反応させ、次に濃塩酸で加水分解して対応アミノエチル誘導体を得た。
【００４６】
色素とジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸との間のリンカーが異なる多数の単一ダイ標識ターミネーターを合成し、４８８ｎｍの励起光でその輝度（ＰＥＴ）を測定した。本発明の方法における各ターミネーターの選択は、ＤＮＡポリメラーゼとターミネーターとの反応性、バンドの均一性及び配列全体での分解能に基づいて行った（例えば図１１及び図１２参照）。単一ダイ標識ターミネーターの輝度も、本発明のエネルギー移動ダイ標識ターミネーター及び従前開示されたターミネーターと比較した（表１（前出）及び表２（後出）参照）。
【００４７】
モノアミノメチルフルオレセイン誘導ターミネーターの合成は図３に示す通り行った。即ち、４′−アミノメチルフルオレセイン−５−カルボン酸をトリフルオロアセトアミド−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンアミド（ＴＦＡ−ＮＨＳ）と反応させて一段階で酸の活性化とアミノ保護を行った。活性エステルを、適切に結合したプロパルギルアミノ−ｄｄＮＴＰと反応させ、水酸化アンモニウムで加水分解して得た遊離アミノ化合物を適当な色素−ＮＨＳエステルと反応させてエネルギー移動ダイターミネーターを得た。
【００４８】
４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン誘導ターミネーターの合成は図４に示する通り行った。この場合、ビスアミノメチルフルオレセインを無水コハク酸でモノアシル化し、その後ＴＦＡ−ＮＨＳと反応させて、４′（５′）−トリフルオロアセトアミドフルオレセイン−５′（４′）−スクシニルアミドメチル−ＮＨＳエステルとした。次の２つの段階は４′−アミノメチルフルオレセイン誘導エネルギー移動ターミネーターの合成に関して上述の方法と基本的に同じ方法で行った。
【００４９】
エネルギー移動（ＥＴ）効率を本発明で合成した全ての単一ダイ標識ジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸（ターミネーター）及びエネルギー移動ターミネーターについて測定した。全てのダイターミネーターは４８８ｎｍで励起し、その対応発光波長において発光を測定した。結果を表２に示す。
【００５０】
【表２】
【００５１】
表２に記載したダイターミネーターの分子構造を図５に示す。
【００５２】
これらのＰＥＴ測定から、色素ＦＡＭ、Ｒ１１０及びＲＥＧから誘導された単一ダイターミネーターはＦＡＭ−Ｒ１１０及びＦＡＭ−ＲＥＧの複合体から誘導されたＥＴコンストラクトよりも高輝度であることが分かる。ＦＡＭ−ＴＡＭ及びＦＡＭ−ＲＯＸから誘導されたＥＴ色素のコンストラクトはＴＡＭＲＡ及びＲＯＸ単独から誘導された単一ダイターミネーターよりも高輝度である。色素に関する報文（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９７，２５（１４），２８１６−２８２２）とは逆に、ＥＴダイターミネーター（XVI）は単一ダイターミネーター（XII）より格段に高輝度である。
【００５３】
本発明の単一ダイ標識ターミネーター及びエネルギー移動ダイ標識ターミネーター（上記）を、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡシークエンシング反応で試験した。個々のダイ標識ターミネーターの利用性はバンドの全体的な配列の特性、輝度及び均一性に基づいて確認した（図１１〜１４）。これらの基準に基づいて、新しいセットのダイターミネーターを構築した（図６）。この新しいセットのターミネーターのＰＥＴを以下に示す。
【００５４】
【表３】
【００５５】
本発明のターミネーターセットは、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）又はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（米国カリフォルニア州フォスター・シティ）から入手可能な現在市販されているダイターミネーターよりも高輝度である（図８）。この新しいセットは、幾つかの測定によれば、表１に記載したＥＴターミネーターよりも約２倍高輝度、ＢｉｇＤｙｅ（商標）バージョン１及び２のターミネーターよりも４倍高輝度、ＢｉｇＤｙｅ（商標）バージョン３のターミネーターよりも約８倍高輝度である（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（米国カリフォルニア州フォスター・シティ））。こうした輝度の向上は、少量の鋳型でも検出でき、必要なサイクル数が減り、しかも不十分な鋳型のシークエンシングでも良好な配列が得られる可能性が高まることを意味する。この新しいセットのダイターミネーターは泳動速度の速いＧ、傾斜するＴ、及びＡの後の弱いＧのような電気泳動図における３つの一般的アーチファクトが補正されるという更なる利点を有する。またピーク高さもより均一である（図９）。
【００５６】
以下に好ましい結合位置と共に示す（VIII）のような化合物は、さらに、結合した核酸塩基の他に１個のドナー蛍光団及び同一又は異なる２個のアクセプターを有するＥＴトリフルオルダイターミネーターの調製の機会を与える。
【００５７】
【化８】
【００５８】
かかる集合体は、本発明者等はドナーから生じる２回の連続したエネルギー移動に依存しているため、２つの異なるアクセプター蛍光団の導入を伴うＥＴダイターミネーターの発光範囲を拡張することができる。まず第１のアクセプター蛍光団に、次に第１のアクセプター蛍光団から第２へと、３つの蛍光団の間で妥当なスペクトル重複を維持しながら行われる。さらに、複合蛍光団の励起には１以上の方法が存在する。１つは４８８ｎｍでフルオレセイン蛍光団を励起し、エネルギー移動過程が最長の発光蛍光団から発光させることである。フルオレセインと第２の蛍光団の両方を４８８ｎｍ及び第２の蛍光団の吸収最大で同時に励起する場合は、両者に吸収されたエネルギーを第３の蛍光団へ移動させそこから生じる輝度を最大としなければならない。
【００５９】
本発明の標識複合体は好ましくは４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン−５−カルボン酸を他の蛍光団に共有結合させてエネルギードナー−アクセプター複合体を形成することによって合成される。本発明は、試薬、並びに担体物質と共に上述の蛍光水溶性標識複合体をインキュベートすることを含む試薬の調製方法も包含する。複合体と担体を結合する目的には、複合体は担体上の反応性基と反応して共有結合を形成する官能基を有していてよい。或いは、複合体は担体上の官能基と反応して共有結合を形成する反応性基を含んでいてもよい。担体物質はアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル又はヒドロキシル基のうちの１つを含むように誘導体化された重合体粒子、ガラスビーズ、細胞、抗体、抗原、タンパク質、酵素、ヌクレオチドからなる群から選択される。上述の通り、担体物質は反応性基を含んでいてよく、本発明の蛍光標識複合体は反応性基と反応して共有結合を形成する上述の官能基を含んでいてもよい。
【００６０】
別の実施形態では、本発明の蛍光複合体は、別の化合物に非共有結合で結合するために用いられる場合は、反応性基を有する必要はない。例えば、複合体をポリスチレンのような重合体粒子と共に有機溶媒に溶解して混合し、次に乳化重合により攪拌してよい。溶媒を蒸発させ、蛍光色素複合体をポリスチレン粒子に吸着させる。
【００６１】
本発明をさらに以下の実施例を参考にしながら説明する。これらの実施例は説明を目的とするのみであり、請求項及び本発明の範囲を限定するものではない。本発明は明細書の記載から明らかな如何なる変更も包含する。
【実施例】
【００６２】
１）ＦＡＭ−１８−ｄｄＧＴＰ（IX）の調製
１１−ｄｄＧＴＰ（０．１ＭＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ８．５、６０μｍｏｌ、５ｍｌ）の溶液を氷／水バス中で冷却した。溶液にＤＭＦ（５ｍｌ）中の５−カルボキシ−フルオレセイン−ＮＨＳ（３５ｍｇ、１等量）を添加した。反応フラスコを冷却バスから取り外し、反応混合物を１６時間室温で攪拌した。生成物をアニオン交換クロマトグラフィー及びＨＰＬＣで精製した。画分を含む生成物を濃縮し、凍結乾燥し、黄色固体を得た。
【００６３】
２）４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン（ＢＡＭ−ＦＡＭ）の合成（図１）
ａ）４′，５′ビス−（２−クロロアセトアミド）−アミノメチルフルオレセインの調製
フルオレセイン（３．３グラム）及び２−クロロ−ｎ−（ヒドロキシメチル）−アセトアミド（５．０グラム）を濃硫酸２０ｍｌに溶解した。暗褐色の溶液を２時間室温で攪拌した。この時点でＥＳＭＳ＋はフルオレセインが残存していないことを示した。生成物を氷水２００グラムに注ぎ込み、沈殿を濾過し、水、次いでエーテルで洗浄し、風乾した。このようにして得られた物質のＮＭＲは、これが所望の生成物であることを示していた。
ｂ）４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン（ＢＡＭ−ＦＡＭ）を得るための４′，５′ビス−（２−クロロアセトアミド）−アミノメチルフルオレセインの濃塩酸加水分解
上記反応の生成物を濃塩酸４０ｍｌに懸濁し、３０分間還流下に加熱した。その時点で透明な溶液が得られた。生成物を蒸発乾固させ、残存物をメタノール／ジクロロメタンから再結晶させ、ＮＭＲ及びＥＳＭＳ＋により同定された所望の生成物を得た。
【００６４】
３）４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン−５−カルボン酸の合成（図１）
フルオレセイン−５−カルボン酸は濃硫酸に僅かしか溶解しないため、変法を用いた。
ａ）４′，５′ビス−（２−クロロアセトアミド）アミノメチルフルオレセイン−５−カルボン酸の調製
室温で攪拌した濃硫酸２０ｍｌにジピバロイルフルオレセイン−５−カルボン酸を添加した。懸濁液に過剰（４等量）の２−クロロ−ｎ−（ヒドロキシメチル）−アセトアミドを少しずつ、透明な溶液が得られるまで添加した。溶液の色が明黄色から茶色に変化するまでさらに原料（フルオレセイン及び過剰のＨＯＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２Ｃｌ）を添加した。次に溶液を氷／水の混合物に注ぎ込んだ。このようにして得られた沈殿を濾過し、水及びエーテルで洗浄した。沈殿のＮＭＲ及びＥＳＭＳ＋から、所望の生成物であることを確認した。
ｂ）４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン−５−カルボン酸を得るための４′，５′ビス−（２−クロロアセトアミド）アミノメチルフルオレセイン−５−カルボン酸の濃塩酸加水分解
上記生成物１．０１グラムを濃塩酸２０ｍｌ及び２−メトキシエーテル５ｍｌに溶解した。得られた懸濁液を透明になり始めるまで（約２時間）還流下に加熱した。次に溶液を放冷した。一夜室温で放置した後、沈殿を濾過し、０．１Ｎ塩酸、ついでエーテルで洗浄し、ＮＭＲ及びＥＳＭＳ＋スペクトラによれば所望の生成物が得られた。
【００６５】
４）トリフルオロアセトアミドメチル−フルオレセインＮＨＳエステル（ＴＦＡ−ＡＭＦＡＭ−ＮＨＳ）の調製（図３）
４′−アミノメチル−５−カルボキシフルオレセイン（１、０．４９ｇ、１．２１μｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（１５ｍｌ）と共に共沸させることにより乾燥した。これを乾燥ピリジンに懸濁し、これにＴＦＡ−ＮＨＳ（１．５３ｇ、７．２６μｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下に添加した。反応混合物を１時間室温で攪拌し、クロロホルム（１２５ｍｌ）で稀釈し、水（３×７５ｍｌ）で洗浄した。有機層を乾燥（硫酸ナトリウム）し、蒸発させ、トルエンと共沸させて黄色固体を得た。
【００６６】
５）ＴＦＡ−ＡＭＦＡＭ−ＮＨＳの１１−ｄｄＣＴＰの調製（図３）
上記の生成物（２５ｍｇ）をＤＭＦ（１ｍｌ）中に溶解した。溶液にＤＭＳＯ中の１１−ｄＣＴＰの溶液（１ｍｌ、３３μｍｏｌ）又はｐＨ８５炭酸塩／重炭酸塩緩衝液中の１１−ｄｄＣＴＰの溶液（３４μｍｏｌ）のいずれかを添加した。反応混合物を２０時間室温で攪拌した。この時点において、濃水酸化アンモニウム１０ｍｌを添加した。室温で３時間攪拌した後、少量となるまで蒸発させた。粗生成物を水（１０ｍｌ）で稀釈し、イオン交換カラムクロマトグラフィー、次いで逆相カラムクロマトグラフィーで精製した。
【００６７】
６）ＡＭＦＡＭ−ＲＯＸ−１１−ｄｄＣＴＰ（XVII）の合成（図３）
上記の生成物（６０μｍｏｌ）を乾燥ＤＭＳＯ（５ｍｌ）に溶解し、これにＲＯＸ−ＮＨＳエステル（６０ｍｇ、６０μｍｏｌ）を添加し、反応混合物を２０時間室温で攪拌した。反応混合物を水で稀釈し、イオン交換カラムクロマトグラフィー、次いで逆相カラムクロマトグラフィーで精製した。
【００６８】
７）ＡＭＦＡＭ−ＴＡＭ−１８−ｄｄＡＴＰ（XVI）の合成（図３）
化合物（XVII）の調製について記載した方法と同様にして、ＴＦＡ−ＡＭＦＡＭ−ＮＨＳと１８−ｄｄＡＴＰのコンジュゲーション、次いで、ＴＡＭＲＡ−ＮＨＳエステルの反応を行い、標的化合物（XVI）を得た。
【００６９】
８）Ｃｙ−５−ＡＭＦＡＭ（XX）の調製
【００７０】
【化９】
【００７１】
４′−メチルアミノ−フルオレセイン５ｍｇを乾燥ＤＭＦ０．５ｍｌに溶解した。溶液に重炭酸ナトリウム−炭酸塩緩衝液１．０ｍｌ中のＣｙ−５−１官能性反応性色素２０ｍｇを添加した。室温で２０分の後、溶媒を蒸発させ、残存物をクロマトグラフィーに付し、所望の生成物（XX）を得た。
【００７２】
９）Ｃｙ−５ＡＭＦＡＭ−ＴＡＭ（XXＩ）の合成
ａ）ＡＭＦＡＭ−ＴＡＭ（XVIａ）の調製
４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン４ｍｇ及び５−カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル１０ｍｇを過剰のジエチル−ｎ−イソプロピルアミンと共に乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１ｍｌに溶解した。反応を室温で一夜進行させ、得られた生成物をＴＬＣで精製して所望の物質（XVIａ）を得た。
ｂ）Ｃｙ−５ＡＭＦＡＭ−ＴＡＭ（XXＩ）の調製
上記の通り得られた化合物（XVIａ）を過剰のジエチル−ｎ−イソプロピルアミンと共に乾燥ジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液に、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液中の僅かに過剰量のＣｙ−５の１官能性ＮＨＳエステルを添加した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）上における出発物質（ＢＡ）の消失で示される通り反応が終了した後、溶媒を蒸発乾固させ、残存物をＣ１８逆相ＴＬＣプレート上でクロマトグラフィーに付し、所望の生成物（XXＩ）を得た。
ｃ）４′（５′）−トリフルオロアセトアミドフルオレセイン−４′（５′）−スクシニルアミドメチル−ＮＨＳエステル（図４）
ビス−アミノメチルフルオレセイン（０．１４ｇ、０．３μｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）と共に共沸させることにより乾燥した。次にこれをＤＭＦ（８ｍｌ）及びピリジン（４ｍｌ）の混合物に溶解し、これに無水コハク酸（１９ｍｇ）を添加した。２時間室温で攪拌した後、さらに７ｍｇの無水コハク酸を添加した。反応をさらに２時間継続し、溶媒を蒸発乾固させた。粗生成物は出発物質であるモノスクシニル誘導体及びジスクシニル誘導体を一部含有していた。モノ及びジスクシニル誘導体を０．５％ギ酸を含有する１０〜３０％メタノール−ジクロロメタンを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離した。モノスクシニル誘導体を含有する適当な画分を収集し、蒸発乾固させた。
【００７３】
モノスクシニル化合物（５０ｍｇ）を乾燥ピリジン（２×１０ｍｌ）との共沸により乾燥し、次にピリジン（４ｍｌ）とジクロロメタン（４ｍｌ）の混合物中に溶解し、これにＴＦＡ−ＮＨＳ（１５０ｍｇ）を添加した。１時間室温で攪拌した後、反応混合物をジクロロメタン（１００ｍｌ）で稀釈し、水（２×５０ｍｌ）で洗浄した。有機層を乾燥（硫酸ナトリウム）し、蒸発し、残存物をトルエンと共沸させて明黄色固体５０ｍｇを得た。質量スペクトル計算値：６８３．２４、測定値：６８２．２３（Ｍ−Ｈ）−。
【００７４】
ｄｄＮＴＰ誘導体とのコンジュゲート形成及びＥＴ−ターミネーターへの変換（図４）
ｐＨ８．５の炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（０．５ｍｌ）中のｄｄＮＴＰ（２５μｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＦ（０．４ｍｌ）中の化合物８（２５ｍｇ）の溶液を添加した。反応混合物を一夜室温で攪拌し、濃水酸化アンモニウム２０ｍｌを添加した。３時間後、反応混合物を少量になるまで蒸発させ、水で稀釈し、イオン交換クロマトグラフィーで精製した。純粋な生成物を含有する画分を蒸発させ、残存物をメタノール（３×５０ｍｌ）と共沸させた。次にこれをＤＭＳＯ（２ｍｌ）中に溶解し、これに色素−ＮＨＳエステル（３０μｍｏｌ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ又はＲ６Ｇ）を添加し、混合物を２０時間室温で攪拌した。反応混合物を水で稀釈し、イオン交換カラムクロマトグラフィー、次いで逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。
【００７５】
１０）表２及び図６中の化合物IX、XI、XVII及びXVIIIとしての標識化合物を用いたＤＮＡの配列決定（図１０）
Ｍ１３ｍｐ１８鋳型ＤＮＡの配列を標準的な「−４０」プライマーを用いて発生させた。反応混合物（２０μｌ）は２００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ、１００μＭのｄＴＴＰ、１６０ｎＭのＦＡＭ−１８−ｄｄＧＴＰ、１２５ｎＭのＲ６Ｇ−１１−ｄｄＵＴＰ、９５ｎＭのＢＡＭＦＡＭ−ＴＡＭ−２２−ｄｄＡＴＰ，６０ｎＭのＡＭＦＡＭ−ＲＯＸ−１１ｄｄＣＴＰ、２ｐｍｏｌの−４０プライマー、２００ｎｇのＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡ、２０単位のテルモシーケンサー又は他の突然変異ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、０．０００８単位のサーモプラズマ・アシドフィラムの無機ピロホスファターゼ、５０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．５、３０ｍＭのＫＣｌ及び５ｍＭのＮｇＣｌ２を含むものとした。
【００７６】
反応混合物を９５℃２０秒、５０℃３０秒及び６０℃１２０秒の２５サイクルについて熱サイクラー中でインキュベートした。サイクル処理の後、反応生成物を標準的な操作法を用いてエタノールで沈殿させ、洗浄し、ホルムアミドローディング緩衝液中に再懸濁した。試料をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社３７７型装置又はＭｅｇａＢＡＣＥ１００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）上にローディングし、結果を標準的なソフトウエア法を用いて分析した。
【００７７】
上述の本発明の教示の利点を得る当業者は多くの変更を施すことが可能である。かかる変更は添付する請求項に示した本発明の範囲内に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン及びその５−カルボン酸の合成の模式図である。
【図２】４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン及びその５−カルボン酸構造上の種々の電荷及び生物学的分子の結合のための可能な部位を示す。
【図３】４′−アミノメチル−５−カルボン酸構造に基づくエネルギー移動色素及びターミネーターの合成の模式図である。
【図４】４′，５′ビス−アミノメチルフルオレセイン−５−カルボン酸構造に基づくエネルギー移動色素及びターミネーターの合成の模式図である。
【図５】本発明の単一ダイ標識ターミネーター及びＥＴターミネーターの構造の模式図である。
【図６】本発明の好ましいダイターミネーターセットすなわち単一ダイターミネーター２つ及びＥＴターミネーター２つの構造の模式図である。
【図７】ＤＮＡ配列決定用に最適化されたダイターミネーターの正規化発光スペクトルを示す。
【図８】共に本発明のダイターミネーターを用いて発生させたシークエンシングバンドと他の市販のターミネーターを用いた場合の相対的輝度の比較を示す。
【図９】本発明のターミネーターを用いた場合のシークエンシングバンドの均一性及び既存の市販ターミネーターとのその比較を示す。
【図１０】本発明の２つの単一ダイ及び２つのＥＴ色素のターミネーターを用いたＤＮＡ分子のシークエンシングデータを示す。
【図１１】各種突然変異ＤＮＡポリメラーゼを用いた様々なリンカー長のＦＡＭ−ｄｄＧＴＰによるシークエンシングのバンドの均一性を示す。
【図１２】各種突然変異ＤＮＡポリメラーゼを用いた様々なリンカー長のＲＥＧ−ｄｄＵＴＰによるシークエンシングのバンドの均一性を示す。
【図１３】各種突然変異ＤＮＡポリメラーゼを用いた様々なリンカー長のＡＭＦＡＭ−ＲＯＸ−ｄｄＣＴＰによるシークエンシングのバンドの均一性を示す。
【図１４】各種突然変異ＤＮＡポリメラーゼを用いた様々なリンカー長のＢＡＭＦＡＭ−ＴＡＭ−ｄｄＡＴＰによるシークエンシングのバンドの均一性を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式の化合物。
【化１】
式中、
Ｒ１はキサンチン色素、ローダミン色素及びシアニン色素からなる群から選択されるアクセプター色素であって、Ｒ１はフルオレセインドナー発色団からエネルギーを受け取ることができ、
Ｌ１は炭素、酸素、窒素、イオウ及びリン原子から選択される連結した原子２〜５０個を含むリンカー鎖であって、
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上又は−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含む（Ｒは水素又はＣ１−Ｃ４アルキル基を表す。）か、或いは
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上及び−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含んでおり（Ｒは水素又はＣ１−Ｃ４アルキル基を表す。）、
Ｒ２はＨ、ＣＯＯＲ又はＣＨ２ＯＲ、又は炭素、酸素、窒素、イオウ及びリン原子から選択される連結した原子２〜３０個を含む鎖Ｌ２を表し、
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上又は−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含む（Ｒは上記の通り定義される。）か、或いは
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上及び−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含んでおり（Ｒは上記の通り定義される。）、
Ｘは以下のものから選択され、
【化２】
Ｔは生物学的分子である。
【請求項２】
次式の化合物。
【化３】
式中、
Ｒ１はキサンチン色素、ローダミン色素及びシアニン色素からなる群から選択されるアクセプター色素であって、Ｒ１はフルオレセインドナー発色団からエネルギーを受け取ることができ、
Ｌ１は炭素、酸素、窒素、イオウ及びリン原子から選択される連結した原子２〜５０個を含むリンカー鎖であって、
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上又は−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含む（Ｒは水素又はＣ１−Ｃ４アルキル基を表す。）か、或いは、
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上及び−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含んでおり（Ｒは水素又はＣ１−Ｃ４アルキル基を表す。）、
ＹはＨ、ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＮＨＣＯＲ（Ｒは上記の通り定義される。）、又はＣＨ２ＯＲ（Ｒは上記の通り定義される。）、又は炭素、酸素、窒素、イオウ及びリン原子から選択される連結した原子２〜３０個を含む鎖Ｌ２を表し、
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上又は−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含む（Ｒは上記の通り定義される。）か、或いは
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上及び−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含んでおり（Ｒは上記の通り定義される。）、
Ｘは以下のものから選択され、
【化４】
Ｔは生物学的分子である。
【請求項３】
Ｌ１がＣ２−５０アルキル鎖であり、該鎖は−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−ＮＲ−、−Ｎ＋Ｒ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＯ−ＮＲ−及び次式の基から選択される基１個以上を適宜含む（Ｒは請求項１又は請求項２と同様に定義される。）、請求項１又は請求項２記載の化合物。
【化５】
【請求項４】
Ｌ２がＣ２−３０アルキル鎖であり、該鎖は−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−ＮＲ−、−Ｎ＋Ｒ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＯ−ＮＲ−及び次式の基から選択される基１個以上を適宜含む（Ｒは請求項１又は請求項２と同様に定義される。）、請求項１又は請求項２記載の化合物。
【化６】
【請求項５】
Ｔがヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド誘導体、ペプチド、タンパク質及び炭水化物からなる群から選択される、請求項１又は請求項２記載の化合物。
【請求項６】
Ｔがリボヌクレオチド、２′−又は３′−デオキシリボヌクレオチド及び２，３′−ジデオキシリボヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１又は請求項２記載の化合物。
【請求項７】
Ｔがヌクレオシド−５′−一、二又は三リン酸である、請求項１又は請求項２記載の化合物。
【請求項８】
Ｔが２′，３′−ジデオキシシチジン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキシチミジン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキシウリジン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキシアデノシン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキグアノシン−５′−三リン酸及び２′，３′−ジデオキシイノシン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキシ−７−デアザアデノシン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグアノシン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキシ−７−デアザイノシン−５′−三リン酸及びこれらの３′−フルオロ、３′−アジド、３′−アミノ又は３′−チオ誘導体からなる群から選択されるジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸である、請求項１又は請求項２記載の化合物。
【請求項９】
Ｌ１が標的分子に対し、該標的分子がピリミジンを含む場合はＣ−５位に、該標的分子が７−デアザプリンを含む場合はＣ−７位に結合している、請求項１又は請求項２記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ１がフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、ロドール、５−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミン、５−カルボキシローダミン−６−Ｇ、６−カルボキシローダミン−６−Ｇ、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−５−カルボキシローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−６−カルボキシローダミン、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、Ｃｙ３（３−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′ ，３′−テトラメチル−５，５′−ジスルホナト−カルボシアニン）、Ｃｙ３．５（３−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′ ，３′−テトラメチル−４，５，４′，５′−（１，３−ジスルホナト）ジベンゾ−カルボシアニン、Ｃｙ５（３−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′ ，３′−テトラメチル−５，５′−ジスルホナト）ジベンゾ−ジカルボシアニン、Ｃｙ５．５（（３−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′ ，３′−テトラメチル−４，５，４′，５′−（１，３−ジスルホナト）ジベンゾ−ジカルボシアニン及びＣｙ７（（３−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′ ，３′−テトラメチル−５，５′−（１，３−ジスルホナト）トリカルボシアニンからなる群から選択される、請求項１又は請求項２記載の化合物。
【請求項１１】
次式の化合物。
【化７】
【請求項１２】
次式の化合物。
【化８】
【請求項１３】
次式の化合物。
【化９】
【請求項１４】
次式の化合物。
【化１０】
【請求項１５】
請求項１乃至請求項１４のいずれか１項記載の化合物１種以上のヌクレオシド部分を含むデオキシリボ核酸配列。
【請求項１６】
核酸の配列を決定する方法であって、
ａ）配列決定すべき核酸の試料、配列決定すべき核酸の少なくとも一部に相補的なプライマー核酸配列、シークエンシング反応を終了するためのデオキシヌクレオチド及び請求項８記載の１種以上のジデオキシヌクレオチドの供給源、及びポリメラーゼを準備すること、
ｂ）核酸鎖伸長及び連鎖停止反応を実施すること、
ｃ）サイズに応じてオリゴヌクレオチドフラグメントを分離すること
を含んでなる方法。
【請求項１７】
核酸の配列を決定する方法であって、
ａ）配列決定すべき核酸の試料、配列決定すべき核酸の少なくとも一部に相補的なプライマー核酸配列、シークエンシング反応を終了するためのデオキシヌクレオチド及び請求項１１乃至請求項１４のいずれか１項記載の１種以上のジデオキシヌクレオチドの供給源、及び、ポリメラーゼを準備すること、
ｂ）核酸鎖伸長及び連鎖停止反応を実施すること、
ｃ）サイズに応じてオリゴヌクレオチドフラグメントを分離すること、
を含んでなる方法。
【請求項１８】
請求項７記載の１種以上の化合物を含むＤＮＡ配列決定用キット。
【請求項１９】
ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項１８記載のキット。
【請求項１】
次式の化合物。
【化１】
式中、
Ｒ１はキサンチン色素、ローダミン色素及びシアニン色素からなる群から選択されるアクセプター色素であって、Ｒ１はフルオレセインドナー発色団からエネルギーを受け取ることができ、
Ｌ１は炭素、酸素、窒素、イオウ及びリン原子から選択される連結した原子２〜５０個を含むリンカー鎖であって、
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上又は−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含む（Ｒは水素又はＣ１−Ｃ４アルキル基を表す。）か、或いは
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上及び−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含んでおり（Ｒは水素又はＣ１−Ｃ４アルキル基を表す。）、
Ｒ２はＨ、ＣＯＯＲ又はＣＨ２ＯＲ、又は炭素、酸素、窒素、イオウ及びリン原子から選択される連結した原子２〜３０個を含む鎖Ｌ２を表し、
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上又は−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含む（Ｒは上記の通り定義される。）か、或いは
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上及び−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含んでおり（Ｒは上記の通り定義される。）、
Ｘは以下のものから選択され、
【化２】
Ｔは生物学的分子である。
【請求項２】
次式の化合物。
【化３】
式中、
Ｒ１はキサンチン色素、ローダミン色素及びシアニン色素からなる群から選択されるアクセプター色素であって、Ｒ１はフルオレセインドナー発色団からエネルギーを受け取ることができ、
Ｌ１は炭素、酸素、窒素、イオウ及びリン原子から選択される連結した原子２〜５０個を含むリンカー鎖であって、
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上又は−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含む（Ｒは水素又はＣ１−Ｃ４アルキル基を表す。）か、或いは、
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上及び−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含んでおり（Ｒは水素又はＣ１−Ｃ４アルキル基を表す。）、
ＹはＨ、ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＮＨＣＯＲ（Ｒは上記の通り定義される。）、又はＣＨ２ＯＲ（Ｒは上記の通り定義される。）、又は炭素、酸素、窒素、イオウ及びリン原子から選択される連結した原子２〜３０個を含む鎖Ｌ２を表し、
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上又は−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含む（Ｒは上記の通り定義される。）か、或いは
該鎖は正荷電又は負荷電の基１個以上及び−ＣＲ＝ＣＲ−及び−Ｃ≡Ｃ−からなる群から選択される不飽和基１個以上を適宜含んでおり（Ｒは上記の通り定義される。）、
Ｘは以下のものから選択され、
【化４】
Ｔは生物学的分子である。
【請求項３】
Ｌ１がＣ２−５０アルキル鎖であり、該鎖は−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−ＮＲ−、−Ｎ＋Ｒ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＯ−ＮＲ−及び次式の基から選択される基１個以上を適宜含む（Ｒは請求項１又は請求項２と同様に定義される。）、請求項１又は請求項２記載の化合物。
【化５】
【請求項４】
Ｌ２がＣ２−３０アルキル鎖であり、該鎖は−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−ＮＲ−、−Ｎ＋Ｒ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＯ−ＮＲ−及び次式の基から選択される基１個以上を適宜含む（Ｒは請求項１又は請求項２と同様に定義される。）、請求項１又は請求項２記載の化合物。
【化６】
【請求項５】
Ｔがヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド誘導体、ペプチド、タンパク質及び炭水化物からなる群から選択される、請求項１又は請求項２記載の化合物。
【請求項６】
Ｔがリボヌクレオチド、２′−又は３′−デオキシリボヌクレオチド及び２，３′−ジデオキシリボヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１又は請求項２記載の化合物。
【請求項７】
Ｔがヌクレオシド−５′−一、二又は三リン酸である、請求項１又は請求項２記載の化合物。
【請求項８】
Ｔが２′，３′−ジデオキシシチジン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキシチミジン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキシウリジン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキシアデノシン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキグアノシン−５′−三リン酸及び２′，３′−ジデオキシイノシン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキシ−７−デアザアデノシン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグアノシン−５′−三リン酸、２′，３′−ジデオキシ−７−デアザイノシン−５′−三リン酸及びこれらの３′−フルオロ、３′−アジド、３′−アミノ又は３′−チオ誘導体からなる群から選択されるジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸である、請求項１又は請求項２記載の化合物。
【請求項９】
Ｌ１が標的分子に対し、該標的分子がピリミジンを含む場合はＣ−５位に、該標的分子が７−デアザプリンを含む場合はＣ−７位に結合している、請求項１又は請求項２記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ１がフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、ロドール、５−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミン、５−カルボキシローダミン−６−Ｇ、６−カルボキシローダミン−６−Ｇ、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−５−カルボキシローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−６−カルボキシローダミン、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、Ｃｙ３（３−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′ ，３′−テトラメチル−５，５′−ジスルホナト−カルボシアニン）、Ｃｙ３．５（３−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′ ，３′−テトラメチル−４，５，４′，５′−（１，３−ジスルホナト）ジベンゾ−カルボシアニン、Ｃｙ５（３−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′ ，３′−テトラメチル−５，５′−ジスルホナト）ジベンゾ−ジカルボシアニン、Ｃｙ５．５（（３−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′ ，３′−テトラメチル−４，５，４′，５′−（１，３−ジスルホナト）ジベンゾ−ジカルボシアニン及びＣｙ７（（３−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′ ，３′−テトラメチル−５，５′−（１，３−ジスルホナト）トリカルボシアニンからなる群から選択される、請求項１又は請求項２記載の化合物。
【請求項１１】
次式の化合物。
【化７】
【請求項１２】
次式の化合物。
【化８】
【請求項１３】
次式の化合物。
【化９】
【請求項１４】
次式の化合物。
【化１０】
【請求項１５】
請求項１乃至請求項１４のいずれか１項記載の化合物１種以上のヌクレオシド部分を含むデオキシリボ核酸配列。
【請求項１６】
核酸の配列を決定する方法であって、
ａ）配列決定すべき核酸の試料、配列決定すべき核酸の少なくとも一部に相補的なプライマー核酸配列、シークエンシング反応を終了するためのデオキシヌクレオチド及び請求項８記載の１種以上のジデオキシヌクレオチドの供給源、及びポリメラーゼを準備すること、
ｂ）核酸鎖伸長及び連鎖停止反応を実施すること、
ｃ）サイズに応じてオリゴヌクレオチドフラグメントを分離すること
を含んでなる方法。
【請求項１７】
核酸の配列を決定する方法であって、
ａ）配列決定すべき核酸の試料、配列決定すべき核酸の少なくとも一部に相補的なプライマー核酸配列、シークエンシング反応を終了するためのデオキシヌクレオチド及び請求項１１乃至請求項１４のいずれか１項記載の１種以上のジデオキシヌクレオチドの供給源、及び、ポリメラーゼを準備すること、
ｂ）核酸鎖伸長及び連鎖停止反応を実施すること、
ｃ）サイズに応じてオリゴヌクレオチドフラグメントを分離すること、
を含んでなる方法。
【請求項１８】
請求項７記載の１種以上の化合物を含むＤＮＡ配列決定用キット。
【請求項１９】
ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項１８記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２００６−５０００６５（Ｐ２００６−５０００６５Ａ）
【公表日】平成１８年１月５日（２００６．１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５３９９４９（Ｐ２００４−５３９９４９）
【出願日】平成１５年９月２５日（２００３．９．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３０３６０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２９５７８
【国際公開日】平成１６年４月８日（２００４．４．８）
【出願人】（５９８０４１４６３）アマシャム・バイオサイエンス・コーポレイション (43)
【氏名又は名称原語表記】Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ
【住所又は居所原語表記】８００ Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ Ａｖｅｎｕｅ， Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １３２７，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ ０８８５５−１３２７，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１月５日（２００６．１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年９月２５日（２００３．９．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３０３６０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２９５７８
【国際公開日】平成１６年４月８日（２００４．４．８）
【出願人】（５９８０４１４６３）アマシャム・バイオサイエンス・コーポレイション (43)
【氏名又は名称原語表記】Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ
【住所又は居所原語表記】８００ Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ Ａｖｅｎｕｅ， Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １３２７，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ ０８８５５−１３２７，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
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