オートタキシンの精製方法
【課題】 診断薬、治療薬、機能解析等に必要な自然体（ｎａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）のオートタキシンをそのリゾホスホリパーゼＤ活性を失うことなく、高純度、高回収率で取得できる方法を提供すること。
【解決の手段】 試料に含まれるオートタキシンを抗オートタキシン抗体に結合させ、前記抗体に結合しなかった不純物を洗浄分離後、前記抗体に結合したオートタキシンを溶出させる方法で、オートタキシンを精製する際、オートタキシンの溶出にｐＨ＝４．５以上の緩衝液を用いることで前記課題を解決することができた。
【解決の手段】 試料に含まれるオートタキシンを抗オートタキシン抗体に結合させ、前記抗体に結合しなかった不純物を洗浄分離後、前記抗体に結合したオートタキシンを溶出させる方法で、オートタキシンを精製する際、オートタキシンの溶出にｐＨ＝４．５以上の緩衝液を用いることで前記課題を解決することができた。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はオートタキシン濃度を定量する体外診断薬もしくはリゾホスホリパーゼＤ活性測定を実施する体外診断薬に用いる既知濃度標準物質となるオートタキシンまたはオートタキシンに対する抗体作製や動物への感作により抗体を誘導するための抗原となるオートタキシンを、その酵素活性であるリゾホスホリパーゼＤ活性を損なうことなく、簡便かつ高純度に精製する方法ならびに材料に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトオートタキシンは、１９９２年Ｍ．Ｌ．ＳｔｒａｃｋｅらによってＡ２０５８ヒト黒色腫細胞培養培地から細胞運動性を惹起する物質として単離された分子量約１２５ＫＤａの糖蛋白質である（非特許文献１）。オートタキシンはそのリゾホスホリパーゼＤ活性によりリゾホスファチジルコリンを基質としリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）を産生する。生体内ではＬＰＡが癌の増殖、転移に関与していることが多くの研究者により示され（非特許文献２から４）、その産生酵素であるオートタキシンと様々な疾病との因果関係が研究されている。最近になり、ヒトオートタキシンを定量する手法が確立され（特許文献１、非特許文献５）、濾胞性リンパ腫でオートタキシン濃度の上昇が明らかとなり診断マーカーとして期待されている（特許文献１、非特許文献６）。
【０００３】
体外診断マーカーにおいては、患者検体を定量する際に既知濃度オートタキシン標準物質が必須である。また、オートタキシンと癌との因果関係より、オートタキシンを標的とした分子標的薬等の研究が試みられており、これら医薬品開発においても、抗体作製のためや機能解析のための高純度なオートタキシンは必須である。純度の高いオートタキシンを取得するためには、ＤＥＡＥ基を有するイオン交換カラムやＰｈｅｎｙｌ基を有する疎水カラム、あるいはブルー色素を有する群特異的汎用カラムクロマトグラフィーにより精製が行なわれている（非特許文献７および８）。しかし、これら汎用クロマトグラフィーでの精製純度は必ずしも十分でなく、また回収率も著しく低い。
【０００４】
簡便かつ、高純度なオートタキシンを高回収率で得る方法として、オートタキシン抗原特異的なプローブを用いた精製が知られている。例えば、組換えヒトオートタキシンであれば蛋白質発現時に適当な精製用タグ（例えば、ポリヒスチジンタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグといった汎用のタグ）を付加した状態で発現を行なえば、前記精製用タグを用いた精製が可能である。しかしながら、前記精製方法は不純物の非特異的結合を完全に排除することはできないこと、溶出用試薬が高価なことから必ずしも実用的ではない。また、取得できるオートタキシンは精製用タグが付加された蛋白質として回収されるため生体内オートタキシンと同等品を得るためには、その後の精製用タグの切断除去操作、およびタグを除去したオートタキシンの精製操作を必要とする等煩雑であり回収量低下はさけられない。
【０００５】
オートタキシンを精製する別の方法としては、オートタキシンに対する抗体（抗オートタキシン抗体）を用いたアフィニティー精製法である。本方法は特別な精製用タグを必要とせず、多くの蛋白質を高純度、高回収率で取得することができる。しかしながら、抗体をアガロースや磁性微粒子等の担体に結合させてアフィニティー精製を実施する際、最終的に担体上の抗体に結合したオートタキシンを溶出させなければならない。溶出には、ｐＨ＝３．５付近の酸性溶液での溶出、ＫＳＣＮ等のカオトロピックイオン溶液での溶出、グアニジンや尿素等の変成剤での溶出、温和な条件での溶出が可能な市販の溶出緩衝液（例えば、Ｇｅｎｔｌｅ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＩＥＲＣＥ社製））での溶出等があげられるが、これらいずれの溶出においても、オートタキシンが有するリゾホスホリパーゼＤ活性が失活する問題があった。現在、高純度なオートタキシンをそのリゾホスホリパーゼＤ活性を失うことなく取得する方法については知られてなく、簡便かつ高回収率でリゾホスホリパーゼＤ活性を有した自然体（ｎａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）のオートタキシンを取得する方法が切望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００８／０１６１８６号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５６、２５２４−２５２９、１９９２
【非特許文献２】Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ、３、５８２−５９１、２００３
【非特許文献３】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１０．１０９、８３３−８３８、２００４
【非特許文献４】Ｂｌｏｏｄ、１０６、２１３８−２１４６、２００５
【非特許文献５】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、３８８、５１−５８、２００８
【非特許文献６】Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｌ．、１４３、６０−７０、２００８
【非特許文献７】Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１５８、２２７−２３３、２００２
【非特許文献８】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７、３９４３６−３９４４２、２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
各種疾患において血液中、組織中のオートタキシン濃度が変動することが報告されることから、血液中等の濃度測定による体外診断さらには癌等の治療薬開発において高純度かつリゾホスホリパーゼＤ活性を有した自然体（ｎａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）のヒトオートタキシンを取得する方法が望まれている。しかしながら、前述したように、汎用カラムでの精製や、精製用タグを付加した精製ではリゾホスホリパーゼＤ活性を失うことなくオートタキシンを高純度、高回収率で取得することは困難であった。また、抗オートタキシン抗体を用いた精製であっても、溶出工程時にオートタキシンの有するリゾホスホリパーゼＤ活性を失うことなく溶出することはできなかったため、リゾホスホリパーゼＤ活性を失うことなくオートタキシンを高純度、高回収率で取得することは困難であった。
【０００９】
そこで本発明の課題は、診断薬、治療薬、機能解析等に必要な自然体（ｎａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）のオートタキシンをそのリゾホスホリパーゼＤ活性を失うことなく、高純度、高回収率で取得できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の発明を包含する。
【００１１】
第一の発明は、抗オートタキシン抗体を用いたオートタキシンの精製方法であって、前記抗体に結合したオートタキシンを溶出させる際、ｐＨ＝４．５以上の緩衝液で溶出させることを特徴とする、オートタキシンの精製方法である。
【００１２】
第二の発明は、前記抗オートタキシン抗体が、配列番号７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有した抗体である、第一の発明に記載の精製方法である。
【００１３】
第三の発明は、前記緩衝液が多価カルボン酸緩衝液である、第一または第二の発明に記載の精製方法である。
【００１４】
第四の発明は、前記多価カルボン酸がクエン酸または酒石酸である、第三の発明に記載の精製方法である。
【００１５】
なお、第一から第四の発明に記載の方法で得られたオートタキシンも本発明に含まれる。
【００１６】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１７】
本発明は、試料に含まれるオートタキシン（ＡＴＸ）を抗オートタキシン（抗ＡＴＸ）抗体に結合させ、前記抗体に結合しなかった不純物を洗浄分離後、前記抗体に結合したＡＴＸを溶出させることで、ＡＴＸを精製する方法において、ＡＴＸを溶出させる際に温和な条件、具体的にはｐＨ＝４．５以上の緩衝液を用いて溶出させることを特徴とする。
【００１８】
本発明の精製方法における、精製対象試料としては、ヒトＡＴＸを含んだヒト組織、またはヒト全血やヒト血清といったヒト体液を試料として用いることもできる。しかしながら、診断薬、治療薬、機能解析等に用いるためのＡＴＸの取得を目的とする場合は、大量にＡＴＸを取得する必要があるため、遺伝子組み換え技術により得られた、ＡＴＸを大量に発現可能な細胞を培養した培養液を試料とするのが好ましい。前記ＡＴＸを発現可能な細胞を調製するには、公知の遺伝子情報（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｌ４６７２０）を基に、ｃＤＮＡライブラリーからＡＴＸ遺伝子を取得後（必要に応じてポリヒスチジンタグ等の精製用タグを付加してもよい）、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等から選択した適切な細胞に対して形質転換を行なうことで調製することができる（特許文献１）。
【００１９】
本発明における抗ＡＴＸ抗体とは、ＡＴＸを特異的に認識する抗体の中から適宜選択することが可能であるが、精製したＡＴＸを診断薬や治療薬等に適用させることを考慮すると、リゾホスホリパーゼＤ活性を有した自然体（ｎａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）のＡＴＸを特異的に認識する抗体を用いるのが好ましい。なお、前記自然体のＡＴＸを特異的に認識する抗体は特許文献１の方法にて取得することが可能である。また、ｐＨ＝３．５付近でＡＴＸを精製するとＡＴＸの有する酵素活性（リゾホスホリパーゼＤ活性）が失われることから、ｐＨ＝４．５以上、好ましくはｐＨ＝５．０以上の緩衝液で、結合したＡＴＸの溶出が可能な抗体が好ましい。前記好ましい抗体の一例として、配列番号７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有した抗体があげられる。
【００２０】
本発明における溶出させる際に用いる緩衝液としては、ｐＨ＝４．５以上の領域で緩衝作用を有する緩衝液の中から適宜選択すればよく、グリシン緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液等を例示できる。中でもクエン酸緩衝液や酒石酸緩衝液といった多価カルボン酸緩衝液が好ましく、特にクエン酸緩衝液が好ましい。
【００２１】
本発明の方法を用いてＡＴＸを精製する際、抗ＡＴＸ抗体を容易に回収できる点や抗ＡＴＸ抗体を効率的に利用できる点で、担体に固定した抗ＡＴＸ抗体を用いて精製するのが好ましい。前記担体としては、抗ＡＴＸ抗体にＡＴＸを結合させるときまたは抗ＡＴＸ抗体からＡＴＸを溶出させるときに使用する緩衝液に対して不溶性であり、抗ＡＴＸ抗体を固定させても抗ＡＴＸ抗体が有するＡＴＸ認識性能が失われない担体の中から適宜選択すればよく、クロマトグラフィー用担体として通常用いられるアガロース、セルロース、デキストラン、キトサン、ビニルポリマー、シリカ等が例示できる。前記担体を用いたＡＴＸ精製方法の一態様として、ＡＴＸを含む試料を、抗ＡＴＸ抗体を固定させた担体を充填したカラムにロードして、ＡＴＸを抗ＡＴＸ抗体に結合させ、リン酸緩衝液等適切な緩衝液で前記抗体に結合しない不純物をカラムから除去した後、ｐＨ＝４．５以上の緩衝液で前記抗体に結合したＡＴＸを溶出する精製方法があげられる。前記担体を用いたＡＴＸ精製方法の別の態様としては、磁性微粒子を配合した担体に抗ＡＴＸ抗体を結合させたものに対しＡＴＸを含む試料を添加後、Ｂ（Ｂｏｕｎｄ）／Ｆ（Ｆｒｅｅ）分離により前記抗体に結合しない不純物の除去を行ない、ｐＨ＝４．５以上の緩衝液で前記抗体に結合したＡＴＸを溶出する精製方法があげられる。なお、本発明のＡＴＸ精製方法は、ｐＨ＝４．５以上の温和な条件でＡＴＸを溶出させるが、ｐＨ＝４．５のグリシン緩衝液中に３０分以上放置するとＡＴＸの有する酵素活性（リゾホスホリパーゼＤ活性）が低下する（実施例１および図２参照）ことから、ＡＴＸを溶出させた後、ＡＴＸ溶出液に対し１／１０容量程度の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）の緩衝液等を速やかに加えることで溶出液を中和させるのが好ましい。前記中和させたＡＴＸ溶出液は、その後、適切な緩衝液で透析することにより酵素活性を有した高純度ＡＴＸを得ることができる。
【００２２】
本発明の精製方法で得られた本発明のＡＴＸは、高純度、かつ自然体（ｎａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）のＡＴＸが有する酵素活性（リゾホスホリパーゼＤ活性）を保持しているため、ＡＴＸ濃度測定試薬やＡＴＸ活性測定試薬で用いる既知濃度標準品、ＡＴＸを標的とした分子標的治療薬開発のための抗原、また前記分子標的治療薬の薬効解析のための体内濃度測定試薬用抗原、抗オートタキシン抗体誘導のためのワクチン抗原等へ利用することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明は、抗オートタキシン抗体（抗ＡＴＸ抗体）を用いたオートタキシン（ＡＴＸ）の精製方法において、前記抗体に結合したＡＴＸを溶出させる際、ｐＨ＝４．５以上の緩衝液で溶出させることを特徴としている。本発明の精製方法により、特別な精製用タグを付加することなく、自然体（ｎａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）のＡＴＸを、その酵素活性（リゾホスホリパーゼＤ活性）を保持したまま、簡便、高純度に精製することができる。
【００２４】
特に、抗ＡＴＸ抗体として、配列番号７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有した抗体を用いることにより、自然体のＡＴＸを、その酵素活性を保持したまま、簡便、高純度かつ大量に得ることができる。
【００２５】
なお、本発明の精製方法で得られた本発明のＡＴＸは、酵素活性を保持しており、また高純度であることから、診断薬、治療薬、機能解析等の用途に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ポリヒスチジンタグを付加した精製ヒトオートタキシン（ＡＴＸ−ｈｉｓ）をｐＨ＝２．５で３０分間（左下の白丸）、またはｐＨ＝３．５で３０分間（中央の白丸）処理したときの、リゾホスホリパーゼＤ（ｌｙｓｏＰＬＤ）活性（横軸）とオートタキシン（ＡＴＸ）濃度（縦軸）との関係図。なお、オートタキシン（ＡＴＸ）濃度は非特許文献５に記載の酵素免疫測定方法により測定した。
【図２】精製ＡＴＸ−ｈｉｓをｐＨの異なるグリシン緩衝液で処理したときの、各処理時間における残存活性を調べた図。ＴＢＳで処理した試料をコントロールとし、残存活性は前記コントロール試料未処理（０分）時のＡＴＸ濃度測定値を１００％として計算している。
【図３】担体に各種抗ＡＴＸモノクローナル抗体を結合させたカラムを用いて、ＡＴＸ−ｈｉｓ試料を精製したときの、溶出パターンを示した図。なお、点線はｐＨに相当する電気伝導度を示しており、縦軸は非特許文献５に記載の酵素免疫測定方法により測定した、活性を有するＡＴＸ濃度を示している。
【図４】担体に各種抗ＡＴＸモノクローナル抗体を結合させたカラムを用いて、ＡＴＸ−ｈｉｓ試料を精製したときの、溶出パターンを示した図。なお、縦軸はＥＬＩＳＡ法により測定した、活性を失ったＡＴＸ濃度を示している。
【図５】担体に各種抗ＡＴＸモノクローナル抗体を結合させたカラムを用いて精製したＡＴＸ−ｈｉｓを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて純度確認した結果の図。染色はＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ）で行なっている。
【図６】担体に各種抗ＡＴＸモノクローナル抗体を結合させたカラムを用いて精製したＡＴＸ−ｈｉｓの比活性を比較した図。なお比活性は、非特許文献５に記載の酵素免疫測定方法により測定した活性を有するＡＴＸ濃度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図５）の１０５ｋＤａに位置するバンド強度より測定した全ＡＴＸ濃度で除した値である。
【図７】各種抗ＡＴＸモノクローナル抗体にＡＴＸを結合させ、その後ｐＨ＝２．５から５．０のグリシン緩衝液（１００ｍＭ）で前記ＡＴＸを溶出した際の、ＡＴＸの解離率を示した図。
【図８】各種抗ＡＴＸモノクローナル抗体にＡＴＸを結合させ、その後ｐＨ＝４．０から７．０のクエン酸緩衝液（１００ｍＭ）で前記ＡＴＸを溶出した際の、ＡＴＸの解離率を示した図。
【図９】抗ＡＴＸモノクローナル抗体（Ｒ１０．７）にＡＴＸを結合させ、その後１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液またはｐＨ＝５．０のクエン酸緩衝液（１００ｍＭ）で前記ＡＴＸを溶出した際の、ＡＴＸの解離率を示した図。
【図１０】各種抗ＡＴＸモノクローナル抗体にＡＴＸを結合させ、その後ｐＨ＝５．０の各種緩衝液（１００ｍＭ）で前記ＡＴＸを溶出した際の、ＡＴＸの解離率を示した図。
【図１１】各種抗ＡＴＸモノクローナル抗体にＡＴＸを結合させ、その後ｐＨ＝３．５から６．０の酒石酸緩衝液（１００ｍＭ）で前記ＡＴＸを溶出した際の、ＡＴＸの解離率を示した図。
【図１２】抗ＡＴＸモノクローナル抗体（Ｒ１０．７）にＡＴＸを結合させ、その後２０から１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）で前記ＡＴＸを溶出した際の、ＡＴＸの解離率を示した図。
【図１３】担体に抗ＡＴＸモノクローナル抗体（Ｒ１０．７）を結合させたカラムを用いて、ＡＴＸ試料を精製したときの、溶出パターンを示した図。なお、点線はｐＨに相当する電気伝導度を示しており、縦軸は吸光度（ＯＤ２８０）を示している。また、１、２および３は回収したフラクション領域を示す。
【図１４】実施例１０にて、担体に抗ＡＴＸモノクローナル抗体（Ｒ１０．７）を結合させたカラムを用いて、ＡＴＸ−ｈｉｓ試料を精製したときの、各回収フラクション中およびカラム通過フラクション中のＡＴＸ量を示した図。
【図１５】実施例１０にて、担体に抗ＡＴＸモノクローナル抗体（Ｒ１０．７）を結合させたカラムを用いて、ＡＴＸ−ｈｉｓ試料を精製したときの、各回収フラクションおよびカラム通過フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果（Ａ）ならびに抗ＡＴＸ抗体（Ｒ１．１Ａ８）によるウェスタンブロティング結果（Ｂ）を示した図。レーンＦ１、Ｆ２およびＦ３は図１３における各回収フラクションを、レーンＰはカラム通過フラクションをそれぞれ表す。
【図１６】実施例１１にて、担体に抗ＡＴＸモノクローナル抗体（Ｒ１０．７またはＲ１０．２３）を結合させたカラムを用いて、ＡＴＸ試料を精製したときの、溶出パターンを示した図。
【図１７】実施例１１にて、担体に抗ＡＴＸモノクローナル抗体（Ｒ１０．７またはＲ１０．２３）を結合させたカラムを用いて、ＡＴＸ試料を精製したときの、回収フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示した図。なお、ロード量は、濃度が吸光度（ＯＤ２８０）で０．１Ａｂｓの試料を７μＬ／レーンである。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２８】
実施例１ オートタキシン（ＡＴＸ）のｐＨ安定性
オートタキシン（ＡＴＸ）のｐＨ安定性の検証を実施した。
（１−１）特許文献１に記載の方法に従って構築したバキュロウイルス−昆虫細胞系で発現させたヒトＡＴＸ（２５．３μｇ／ｍＬ）を含むＴＢＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）溶液を、ＴＢＳ、１００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ＝３．５）または１００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ＝２．５）でそれぞれ１０倍希釈後、室温にて３０分放置し、ＴＢＳにて透析を実施した。
（１−２）各試料中のＡＴＸ濃度を非特許文献５に記載の酵素免疫測定方法を用いてＡＴＸ抗原量から測定し、リゾホスホリパーゼＤ活性を非特許文献８に記載の方法に従い測定した。
【００２９】
結果、図１に示す通り、各試料中における酵素免疫測定方法によるＡＴＸ濃度の測定値はリゾホスホリパーゼＤ活性値と良好な相関関係を示し、非特許文献５に記載の酵素免疫測定方法がリゾホスホリパーゼＤ活性（以下、単に酵素活性とする）を有するＡＴＸのみを定量していることが明らかとなった。そこで、非特許文献５に記載の酵素免疫測定方法を用い、ＡＴＸのｐＨ安定性を検証した。
（２−１）ヒトＡＴＸ（２５．３μｇ／ｍＬ）を含むＴＢＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）溶液を、ＴＢＳまたは１００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ＝４．５、ｐＨ＝４．０、ｐＨ＝３．５、ｐＨ＝３．０またはｐＨ２．５）に１／１０容量添加し、混合した。
（２−２）一定時間ごとに混合試料を回収し、１／１０容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）の添加により速やかに中和した後、ＡＴＸ除去ウシ血清にて１０倍希釈し、非特許文献５に記載の酵素免疫測定方法にてリゾホスホリパーゼＤ活性を有するＡＴＸを測定した。ＴＢＳを添加した試料の添加０分後の測定値を１００％残存活性とし、他の試料の測定値から残存活性を算出した。
【００３０】
結果を図２に示す。１００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ＝４．５）を混合したときは、３０分後であっても残存活性は１００％を示したが、ｐＨ＝４．５より酸性条件では活性の低下が著しく、特にｐＨ＝３．５より酸性条件では混合後５分でＡＴＸの酵素活性は失われることがわかる。従って、実際の精製作業としてｐＨ＝３．５より酸性条件での処理は好ましくないことがわかる。また、ｐＨ＝４．０であっても混合後１０分で活性の低下が認められたことから、好ましくはｐＨ＝４．５以上、かつ中和操作まで３０分以内で精製作業を完了するのが必須であることが明らかとなった。
【００３１】
実施例２ 抗体結合カラムを用いたＡＴＸ精製（その１）
特許文献１に記載の方法に従って取得した抗ＡＴＸモノクローナル抗体（約５０種）から予備評価により選定した、７種類のモノクローナル抗体を用いてＡＴＸを精製した。
（１）抗ＡＴＸモノクローナル抗体Ｒ１０．４、Ｒ１０．７、Ｒ１０．９、Ｒ１０．１２、Ｒ１０．１６、Ｒ１０．２１、Ｒ１０．２３をそれぞれプロテインＧカラムにて精製後、プロトコールに従い１ｍＬ容量のＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）カラムにそれぞれ５ｍｇのモノクローナル抗体を結合させたものを作製した。
（２）ポリヒスチジンタグを付加したヒトＡＴＸ（ＡＴＸ−ｈｉｓ）試料を下記に示す方法で調製した。
（２−１）特許文献１およびプロトコールに従い、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、ＡＴＸ−ｈｉｓ発現ウイルスを調製した。
（２−２）１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＳｆ９細胞液５００ｍＬにＡＴＸ−ｈｉｓ発現ウイルスを添加後、５日間培養し、上清を回収した。
（２−３）回収した上清は、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケアサイエンス社）を用い、５ｍＬ容量のＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕｅ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケアサイエンス社）にて濃縮を行なった。具体的には、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）にて平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕｅカラムに（２−２）の培養上清をロードした後、さらに１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）にて十分洗浄後、１Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）にてＡＴＸ−ｈｉｓを溶出した。なお、ＡＴＸの検出は溶出フラクションを非特許文献５に記載の方法で測定することで行なった。
（２−４）得られた約２０ｍＬのＡＴＸ−ｈｉｓ濃縮試料を回収後、ＴＢＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４））にて透析を行ない、これをＡＴＸ−ｈｉｓ試料とした。
（３）ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケアサイエンス社）と（１）で作製した抗体結合カラムを用いて、（２）で調製したＡＴＸ−ｈｉｓ試料の精製を下記に示す方法で行なった。
（３−１）（２）で調製したＡＴＸ−ｈｉｓ試料５ｍＬを（１）で作製した抗体結合カラムにロードした後、充分ＴＢＳで洗浄した。
（３−２）１００ｍＭクエン酸緩衝液を用い、ｐＨ＝５．０からｐＨ＝３．５までのリニアグラジエントにより結合したＡＴＸ−ｈｉｓを溶出した。なお溶出フラクションは、あらかじめ１／１０容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）を添加したチューブに回収されるため、速やかに中和される環境となっている。各フラクションは非特許文献５に記載の酵素免疫測定方法にて活性を有するＡＴＸ濃度の算出を行なった。
（３−３）一方、溶出フラクション中の変性ＡＴＸ−ｈｉｓの検出をＥＬＩＳＡ法により行なった。具体的には、溶出フラクションをＴＢＳにて１０倍希釈後、９６穴マイクロタイタープレートに５０μＬ／ウェルで添加し、４℃にて一昼夜コーティングを行なった。ＴＢＳにて洗浄後、３％の牛血清アルブミンを含むＴＢＳにてブロッキングし、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した、変性ＡＴＸを強く認識するモノクローナル抗体Ｒ１．１Ａ８（１μｇ／ｍＬ）を添加し２時間反応させた。その後、ＴＢＳで洗浄し、ＴＭＢ基質（ＫＰＬ社）を添加後、１５分反応させた。１Ｍリン酸により反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００３２】
溶出パターンを図３に示す。カラムに結合したモノクローナル抗体の種類により様々な溶出パターンを示した。非特許文献５に記載の酵素免疫測定方法により算出した、酵素活性を有するＡＴＸ−ｈｉｓ濃度が最大値を示すフラクションのｐＨはそれぞれ、ｐＨ＝４．２０（Ｒ１０．４）、ｐＨ＝４．８３（Ｒ１０．７）、ｐＨ＝４．４６（Ｒ１０．９）、ｐＨ＝３．９３（Ｒ１０．１２）、ｐＨ＝２．５０（Ｒ１０．１６）、ｐＨ＝３．５１（Ｒ１０．２１）、ｐＨ＝４．０４（Ｒ１０．２３）であり、Ｒ１０．７結合カラムが最も温和な条件でＡＴＸを溶出できることがわかる。さらに、Ｒ１０．７結合カラムの溶出パターンを確認すると、溶出ピークもシャープであることから、Ｒ１０．７結合カラムは、結合したＡＴＸ−ｈｉｓ全てを溶出するｐＨも、他の抗体結合カラムと比較し温和な条件であることが予想される。
【００３３】
一方、ＥＬＩＳＡ法の結果を図４に示す。Ｒ１０．７結合カラムを用いて得られた溶出フラクションのうち、活性を有するＡＴＸ−ｈｉｓを多く含むフラクション（４から１１ｍＬのフラクション）をＥＬＩＳＡ法で測定した結果、反応性が非常に弱いことが明らかとなった。一方、Ｒ１０．１２結合カラムやＲ１０．２１結合カラムを用いて得られた溶出フラクションのうち、活性を有するＡＴＸ−ｈｉｓを多く含むフラクションをＥＬＩＳＡ法で測定した結果、強い反応性を示していた。以上の結果より、図３に示すＡＴＸの有する酵素活性と図４に示すＥＬＩＳＡ法の結果とは相関しないこと、およびＡＴＸ−ｈｉｓが酸性側で溶出させるとＡＴＸの有する酵素活性が失われることがわかる。
【００３４】
各抗体結合カラムを用いて得られた溶出フラクションのうち、ＡＴＸ濃度が５μｇ／ｍＬ以上を示したフラクションを回収し、速やかにＴＢＳにて透析後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）（分画分子量：１００００）で１ｍＬになるまで遠心濃縮を行なった。前記濃縮試料を、非特許文献５に記載の酵素免疫測定方法にて活性を有するＡＴＸ−ｈｉｓを定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにてＡＴＸ−ｈｉｓ絶対量（活性を有するＡＴＸ−ｈｉｓ量＋活性を失ったＡＴＸ−ｈｉｓ量）を分析した。酵素免疫測定試薬による活性を有するＡＴＸ−ｈｉｓの定量の結果を表１に示す。
【００３５】
【表１】
Ｒ１０．７結合カラムおよびＲ１０．９結合カラムを用いたとき、活性を有するＡＴＸ−ｈｉｓの回収率が高いことがわかる。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図５に示すが、いずれの抗体結合カラムを用いてもＡＴＸ−ｈｉｓを高純度に精製していることがわかる。なお、図５において、Ｒ１０．２１による精製ＡＴＸが少ない理由は、Ｒ１０．２１が強酸性側で溶出されるためＡＴＸの有する酵素活性を指標にしたフラクション回収時の損失が非常に大きかったとものと考えられる。
【００３６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥのうち、ＡＴＸ−ｈｉｓに相当するバンドをＣｈｅｍｉｓｔａｇｅ ＣＣ−１６（倉敷紡績社）にてスキャン後、Ｌａｂｏ−１Ｄソフトウェア（倉敷紡績社）にてバンドのシグナル強度（ＯＤ）を測定した。その結果を表２に示す。
【００３７】
【表２】
表１で示される活性を有するＡＴＸ−ｈｉｓ量と、表２で示されるＡＴＸ−ｈｉｓ絶対量とから計算した、精製ＡＴＸ−ｈｉｓ中の活性を有するＡＴＸ−ｈｉｓの割合（比活性）を図６に示す。Ｒ１０．７結合カラムを用いたＡＴＸ精製が、回収率が高く、比活性も高いことが分かる。
【００３８】
実施例３ モノクローナル抗体の解離定数測定
実施例２で使用した抗ＡＴＸモノクローナル抗体の解離定数をＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ１００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて測定し、ＡＴＸ溶出ｐＨと比較した。
【００３９】
ＣＭ５チップに対し抗ＡＴＸ抗体をアミン結合させたもの（以下、単に抗体結合チップとする）を用意し、ＡＴＸをリガンドとして相互作用解析を実施し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフト（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のＢｉｎｄｉｎｇ解析によりＫａ（結合速度定数）、Ｋｄ（解離速度定数）、ＫＤ（解離定数）をそれぞれ算出した。結果を表３に示す。
【００４０】
【表３】
各抗体結合チップを用いたときの、活性を有するＡＴＸ濃度が最大値を示すフラクションのｐＨ（実施例２）と、結合した抗体のＫＤ（解離定数）（表３）の間には相関性は認められなかった。また、最も温和な条件で溶出可能なＲ１０．７が他の抗体と比較し、Ｋａ、Ｋｄ、ＫＤに大きな違いはなかった。以上より、抗体の解離、結合能とＡＴＸを溶出するｐＨとの間には相関性がないことがわかる。
【００４１】
実施例４ ｐＨとＡＴＸ解離率との関係（グリシン緩衝液）
実施例３で調製した抗体結合チップとｐＨが異なるグリシン緩衝液とを用い、抗体−ＡＴＸ間の解離解析をＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ１００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）にて実施した。
【００４２】
抗体結合チップにＡＴＸを結合させた後、ｐＨの異なる１００ｍＭグリシン緩衝液を流速３０μＬ／分で３０秒間流すことによりＡＴＸ解離率を測定した。結果を図７に示す。
【００４３】
Ｒ１０．７では、ｐＨ＝５．０においても約２０％の解離が認められるものの、他の抗体ではｐＨ＝５．０での解離がほとんど認められず、ｐＨ＝４．５であっても１０％以下の解離率であった。よって、Ｒ１０．７以外はｐＨ＝４．５以上の温和な条件ではグリシン緩衝液でＡＴＸが溶出されないことがわかった。
【００４４】
実施例５ ｐＨとＡＴＸ解離率との関係（クエン酸緩衝液）
実施例３で調製した抗体結合チップとｐＨが異なる１００ｍＭクエン酸緩衝液とを用い、実施例４と同様の方法で抗体−ＡＴＸ間の解離解析を実施した。結果を図８に示す。
【００４５】
グリシン緩衝液での溶出（実施例４）と異なり、ｐＨ＝４．５以上の温和な条件下におけるＡＴＸの溶出が、Ｒ１０．４、Ｒ１０．７、Ｒ１０．９の３抗体で認められた。前記３抗体を使用したときのｐＨによる解離率の変化を確認したところ、Ｒ１０．４では酸性が強いほど解離率が上昇するのに対し、Ｒ１０．７およびＲ１０．９ではｐＨ＝５．０で解離率の極大を示した。なお、Ｒ１０．７ではｐＨ＝５．０のクエン酸緩衝液を使用したときの解離率は１００％であった。
【００４６】
実施例６ ＥＤＴＡを用いたときのＡＴＸ解離
実施例５の結果において、抗体−ＡＴＸ間の解離がクエン酸のキレート作用によるものかを確認するため、１ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液を用い実施例４と同様の実験を行なった（なお、抗体はＲ１０．７を使用している）。結果を図９に示す。
【００４７】
１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液による解離が認められなかったことから、実施例４と５との違いが、クエン酸のキレート作用によるものではないことが明らかとなった。
【００４８】
実施例７ 緩衝液組成とＡＴＸ解離率との関係
実施例４から６の結果より、抗体−ＡＴＸ間の解離がｐＨのみに依存するものではなく、緩衝液組成にも依存する可能性が示唆されたため、ｐＨが同一で組成が異なる緩衝液を用いて、実施例４と同様の方法で抗体−ＡＴＸ間の解離解析を実施した。なお、緩衝液は１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）、１００ｍＭコハク酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）、１００ｍＭ酒石酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）、および１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）を使用し、抗体は実施例５で１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）でＡＴＸの溶出が確認された３抗体（Ｒ１０．４、Ｒ１０．７、Ｒ１０．９）を使用した。結果を図１０に示す。
【００４９】
クエン酸緩衝液および酒石酸緩衝液を使用したとき、抗体からのＡＴＸの解離が認められ、特にクエン酸緩衝液を使用したとき最も高いＡＴＸ解離率を示した。なお、解離率はＲ１０．７、Ｒ１０．９、Ｒ１０．４の順であった。
【００５０】
実施例８ ｐＨとＡＴＸ解離率との関係（酒石酸緩衝液）
実施例７の結果より、酒石酸緩衝液を使用してもＡＴＸの解離が確認されたため、実施例３で調製した抗体結合チップとｐＨが異なる１００ｍＭ酒石酸緩衝液とを用い、実施例４と同様の方法で抗体−ＡＴＸ間の解離解析を実施した。なお、抗体は実施例７で１００ｍＭ酒石酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）でＡＴＸの溶出が確認された３抗体（Ｒ１０．４、Ｒ１０．７、Ｒ１０．９）を使用した。結果を図１１に示す。
【００５１】
Ｒ１０．７では、ｐＨ＝４．５およびｐＨ＝５．０において約６０％の解離が認められるものの、Ｒ１０．４およびＲ１０．９では解離率が１０から２０％と極めて低かった。よって、Ｒ１０．７以外はｐＨ＝４．５以上の温和な条件では酒石酸緩衝液で溶出されないことがわかった。
【００５２】
実施例９ 溶出液中のクエン酸濃度とＡＴＸ解離率との関係
実施例３で調製したＲ１０．７結合チップと濃度が異なるクエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）とを用い、実施例４と同様の方法で抗体−ＡＴＸ間の解離解析を実施した。結果を図１２に示す。
【００５３】
クエン酸濃度の低下に伴い解離率は低下し、クエン酸濃度６０ｍＭ以下では解離率５０％を下回り有効な解離が認められないことがわかった。よって、ＡＴＸ精製で使用する溶出液のクエン酸濃度は７０ｍＭ以上が必要であることが明らかとなった。
【００５４】
実施例１０ 抗体結合カラムを用いたＡＴＸ精製（その２）
Ｒ１０．７結合カラムを用いＡＴＸ−ｈｉｓの精製を実施した。
（１）プロトコールに従い、５ｍＬ容量のＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）カラムに２５ｍｇのＲ１０．７モノクローナル抗体を結合させて、Ｒ１０．７結合カラムを作製した。
（２）実施例２の（２）と同様の方法で、ＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕｅ ＨＰカラムを用い、約２０ｍＬのＡＴＸ−ｈｉｓ濃縮試料を調製した。
（３）ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓと（１）で作製したＲ１０．７結合カラムを用いて、（２）で調製したＡＴＸ−ｈｉｓ濃縮試料を以下に示す方法で精製を行なった。
（３−１）ＴＢＳ透析を施したＡＴＸ−ｈｉｓ試料をＲ１０．７結合カラムにロードした後、充分ＴＢＳで洗浄した。
（３−２）１００ｍＭクエン酸緩衝液を用い、ｐＨ＝５．０からｐＨ＝３．５までのリニアグラジエントにより、結合したＡＴＸ−ｈｉｓを溶出した。
（４）溶出フラクションのうち、８から３２ｍＬのフラクション（以下、フラクション１）、３２から４８ｍＬのフラクション（以下、フラクション２）、４８から７２ｍＬのフラクション（以下、フラクション３）をそれぞれ回収後、ＴＢＳで透析した。
（５）透析後の各フラクション中の、活性を有するＡＴＸ濃度を非特許文献５に記載の酵素免疫測定方法により決定した。また、透析後の各フラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク純度の確認を行ない、ＡＴＸのＮ末端側を認識する抗ＡＴＸ抗体（Ｒ１．１Ａ８）を用いたウェスタンブロッティングにより精製タンパクがＡＴＸであるかの確認を行なった。
【００５５】
溶出パターンを図１３に示す。Ｒ１０．７結合カラムに結合したタンパク質は溶出開始後速やかに溶出された。フラクション１中の、活性を有するＡＴＸ濃度から、ＡＴＸ−ｈｉｓ回収率を計算したところ約９０％と非常に良好であった（図１４）。
【００５６】
フラクション１から３についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった結果、フラクション１において１００ｋＤａ付近に単一のバンドを確認し、Ｒ１０．７結合カラムにより非常に高純度にタンパクを精製できることがわかった（図１５（Ａ）のＦ１参照）。さらに、ウエスタンブロッティングの結果、フラクション１における前記バンドが確かにＡＴＸであることが判明した（図１５（Ｂ）のＦ１参照）。一方、Ｒ１０．７結合カラム通過フラクションについてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングを行なったところ、通過フラクションには低分子化した分解ＡＴＸが含まれていることが明らかとなった（図１５（Ａ）および（Ｂ）のＰ参照）。よって、Ｒ１０．７結合カラムによるＡＴＸ精製は、完全長ＡＴＸを取得するのに効果的であることを示している。
【００５７】
実施例１１ 抗体結合カラムを用いたＡＴＸ精製（その３）
精製用タグを有さないヒトＡＴＸ試料ならびに、Ｒ１０．７結合カラムおよびＲ１０．２３結合カラムを用いヒトＡＴＸの精製を行なった。
（１）実施例２と同様な方法で精製用タグを有しないヒトＡＴＸ試料を調製した。
（２）（１）で調製したヒトＡＴＸ試料をＲ１０．７結合カラムまたはＲ１０．２３結合カラムにロードした後、充分ＴＢＳで洗浄した。
（３）１００ｍＭクエン酸緩衝液をｐＨ＝５．０からｐＨ＝３．５のリニアグラジエントにより結合したヒトＡＴＸを溶出した。
（４）溶出フラクションのうち、タンパクの溶出が確認されたフラクション（Ｒ１０．７結合カラム：８から３６ｍＬまでのフラクション、Ｒ１０．２３結合カラム：８から５６ｍＬまでのフラクション）を回収後、速やかに透析した。
（５）ロードしたヒトＡＴＸ試料、抗体結合カラム通過フラクション、（４）で回収したフラクションについて、それぞれ非特許文献５に記載の酵素免疫測定方法により、活性を有するＡＴＸ濃度を定量し、回収率を算出した。
【００５８】
溶出パターンを図１６に示す。Ｒ１０．７結合カラムでは溶出開始後速やかに溶出された。一方、Ｒ１０．２３結合カラムの溶出パターンはＲ１０．７に比較し酸性側であった。Ｒ１０．７結合カラムおよびＲ１０．２３結合カラムを用いて精製したとき回収フラクションの積分値（ＯＤ２８０×容量）を計算したところ、それぞれ２１０（Ｒ１０．７）および２０７（Ｒ１０．２３）であることから、回収した蛋白質の総量はほぼ同量であることがわかる。
【００５９】
ロードしたヒトＡＴＸ試料、抗体結合カラム通過フラクション、回収フラクション中の、活性を有するＡＴＸ濃度を定量し回収率を算出した結果を表４に示す。
【００６０】
【表４】
Ｒ１０．７結合カラムおよびＲ１０．２３結合カラムを用いたときの、それぞれの回収フラクション中のタンパク量は、積分値から同程度回収できているにも関わらず、活性を有するヒトＡＴＸの回収率は、Ｒ１０．７結合カラムを用いたときが８８．５％、Ｒ１０．２３結合カラムを用いたときが３３．６％と大きく異なり、Ｒ１０．７結合カラムを用いた精製方法が、酵素活性を失うことなく、高回収率にてヒトＡＴＸを精製可能な方法であることがわかる。また、回収フラクション中のタンパク純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認したところ、いずれの抗体結合カラムを用いたときも高純度なタンパク精製が可能であることがわかった（図１７参照）。以上より、本発明の精製方法により、ポリヒスチジンといった精製用タグを有しない、天然体ヒトＡＴＸの精製が可能であることがわかる。
【００６１】
実施例１２ Ｒ１０．７の配列分析
抗ＡＴＸモノクローナル抗体Ｒ１０．７の塩基配列を以下の方法で決定した。
（１−１）重鎖遺伝子の増幅は、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ社）にてｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した後、Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用しプロトコールに従い実施した。ＰＣＲプライマーは、５’−ｇｇａｇｃｃｃａｇｔｃｃｔｇｇａｃ−３’（配列番号１、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｌ２２６５２の１から１７番目の塩基に相当）および５’−ｇｔｃａｃｇｇｔｇａｃｔｇｇｃｔｃａ−３’（配列番号２、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｌ２２６５２の５８８から６０５番目の塩基の相補鎖に相当）を用いた。
（１−２）ＰＣＲ産物をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０（アプライドバイオシステムズ社）にてシークエンスし塩基配列を決定した。シークエンスプライマーは５’−ｇｇａｇｃｃｃａｇｔｃｃｔｇｇａｃ−３’（配列番号１）および５’−ｇｔｃａｃｇｇｔｇａｃｔｇｇｃｔｃａ−３’（配列番号２）を用いた。
（２−１）軽鎖遺伝子の増幅は、重鎖と同様に回収したｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型として、Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用しプロトコールに従い実施した。ＰＣＲプライマーは、５’−ｔｇａｃａｃａｇｔｃｔｃｃａ−３’（配列番号３、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＢＣ０８８２５５の８２から９５番目の塩基に相当）および５’−ｔｇｇａｔｇｇｔｇｇｇａａｇａｔ−３’（配列番号４、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＢＣ０８８２５５の４２０から４３５番目の塩基の相補鎖に相当）を用いた。
（２−２）ＰＣＲ産物を、重鎖と同様にシークエンスし塩基配列を決定した。シークエンスプライマーは５’−ｔｇａｃａｃａｇｔｃｔｃｃａ−３’（配列番号３）および５’−ｔｇｇａｔｇｇｔｇｇｇａａｇａｔ−３’（配列番号４）を用いた。
【００６２】
前述の方法で得られた、重鎖可変領域の塩基配列を配列番号５に、軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号６にそれぞれ示す。また、前記塩基配列より決定される重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号７および８にそれぞれ示す。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の技術は高純度オートタキシンを必要とする産業分野で利用可能である。例えば、オートタキシン濃度測定試薬やオートタキシン活性測定試薬で用いる既知濃度標準品、オートタキシンを標的とした分子標的治療薬開発のための抗原、また前記分子標的治療薬の薬効解析のための体内濃度測定試薬用抗原、抗オートタキシン抗体誘導のためのワクチン抗原等への利用が考えられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明はオートタキシン濃度を定量する体外診断薬もしくはリゾホスホリパーゼＤ活性測定を実施する体外診断薬に用いる既知濃度標準物質となるオートタキシンまたはオートタキシンに対する抗体作製や動物への感作により抗体を誘導するための抗原となるオートタキシンを、その酵素活性であるリゾホスホリパーゼＤ活性を損なうことなく、簡便かつ高純度に精製する方法ならびに材料に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトオートタキシンは、１９９２年Ｍ．Ｌ．ＳｔｒａｃｋｅらによってＡ２０５８ヒト黒色腫細胞培養培地から細胞運動性を惹起する物質として単離された分子量約１２５ＫＤａの糖蛋白質である（非特許文献１）。オートタキシンはそのリゾホスホリパーゼＤ活性によりリゾホスファチジルコリンを基質としリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）を産生する。生体内ではＬＰＡが癌の増殖、転移に関与していることが多くの研究者により示され（非特許文献２から４）、その産生酵素であるオートタキシンと様々な疾病との因果関係が研究されている。最近になり、ヒトオートタキシンを定量する手法が確立され（特許文献１、非特許文献５）、濾胞性リンパ腫でオートタキシン濃度の上昇が明らかとなり診断マーカーとして期待されている（特許文献１、非特許文献６）。
【０００３】
体外診断マーカーにおいては、患者検体を定量する際に既知濃度オートタキシン標準物質が必須である。また、オートタキシンと癌との因果関係より、オートタキシンを標的とした分子標的薬等の研究が試みられており、これら医薬品開発においても、抗体作製のためや機能解析のための高純度なオートタキシンは必須である。純度の高いオートタキシンを取得するためには、ＤＥＡＥ基を有するイオン交換カラムやＰｈｅｎｙｌ基を有する疎水カラム、あるいはブルー色素を有する群特異的汎用カラムクロマトグラフィーにより精製が行なわれている（非特許文献７および８）。しかし、これら汎用クロマトグラフィーでの精製純度は必ずしも十分でなく、また回収率も著しく低い。
【０００４】
簡便かつ、高純度なオートタキシンを高回収率で得る方法として、オートタキシン抗原特異的なプローブを用いた精製が知られている。例えば、組換えヒトオートタキシンであれば蛋白質発現時に適当な精製用タグ（例えば、ポリヒスチジンタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグといった汎用のタグ）を付加した状態で発現を行なえば、前記精製用タグを用いた精製が可能である。しかしながら、前記精製方法は不純物の非特異的結合を完全に排除することはできないこと、溶出用試薬が高価なことから必ずしも実用的ではない。また、取得できるオートタキシンは精製用タグが付加された蛋白質として回収されるため生体内オートタキシンと同等品を得るためには、その後の精製用タグの切断除去操作、およびタグを除去したオートタキシンの精製操作を必要とする等煩雑であり回収量低下はさけられない。
【０００５】
オートタキシンを精製する別の方法としては、オートタキシンに対する抗体（抗オートタキシン抗体）を用いたアフィニティー精製法である。本方法は特別な精製用タグを必要とせず、多くの蛋白質を高純度、高回収率で取得することができる。しかしながら、抗体をアガロースや磁性微粒子等の担体に結合させてアフィニティー精製を実施する際、最終的に担体上の抗体に結合したオートタキシンを溶出させなければならない。溶出には、ｐＨ＝３．５付近の酸性溶液での溶出、ＫＳＣＮ等のカオトロピックイオン溶液での溶出、グアニジンや尿素等の変成剤での溶出、温和な条件での溶出が可能な市販の溶出緩衝液（例えば、Ｇｅｎｔｌｅ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＩＥＲＣＥ社製））での溶出等があげられるが、これらいずれの溶出においても、オートタキシンが有するリゾホスホリパーゼＤ活性が失活する問題があった。現在、高純度なオートタキシンをそのリゾホスホリパーゼＤ活性を失うことなく取得する方法については知られてなく、簡便かつ高回収率でリゾホスホリパーゼＤ活性を有した自然体（ｎａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）のオートタキシンを取得する方法が切望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００８／０１６１８６号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５６、２５２４−２５２９、１９９２
【非特許文献２】Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ、３、５８２−５９１、２００３
【非特許文献３】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１０．１０９、８３３−８３８、２００４
【非特許文献４】Ｂｌｏｏｄ、１０６、２１３８−２１４６、２００５
【非特許文献５】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、３８８、５１−５８、２００８
【非特許文献６】Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｌ．、１４３、６０−７０、２００８
【非特許文献７】Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１５８、２２７−２３３、２００２
【非特許文献８】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７、３９４３６−３９４４２、２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
各種疾患において血液中、組織中のオートタキシン濃度が変動することが報告されることから、血液中等の濃度測定による体外診断さらには癌等の治療薬開発において高純度かつリゾホスホリパーゼＤ活性を有した自然体（ｎａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）のヒトオートタキシンを取得する方法が望まれている。しかしながら、前述したように、汎用カラムでの精製や、精製用タグを付加した精製ではリゾホスホリパーゼＤ活性を失うことなくオートタキシンを高純度、高回収率で取得することは困難であった。また、抗オートタキシン抗体を用いた精製であっても、溶出工程時にオートタキシンの有するリゾホスホリパーゼＤ活性を失うことなく溶出することはできなかったため、リゾホスホリパーゼＤ活性を失うことなくオートタキシンを高純度、高回収率で取得することは困難であった。
【０００９】
そこで本発明の課題は、診断薬、治療薬、機能解析等に必要な自然体（ｎａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）のオートタキシンをそのリゾホスホリパーゼＤ活性を失うことなく、高純度、高回収率で取得できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の発明を包含する。
【００１１】
第一の発明は、抗オートタキシン抗体を用いたオートタキシンの精製方法であって、前記抗体に結合したオートタキシンを溶出させる際、ｐＨ＝４．５以上の緩衝液で溶出させることを特徴とする、オートタキシンの精製方法である。
【００１２】
第二の発明は、前記抗オートタキシン抗体が、配列番号７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有した抗体である、第一の発明に記載の精製方法である。
【００１３】
第三の発明は、前記緩衝液が多価カルボン酸緩衝液である、第一または第二の発明に記載の精製方法である。
【００１４】
第四の発明は、前記多価カルボン酸がクエン酸または酒石酸である、第三の発明に記載の精製方法である。
【００１５】
なお、第一から第四の発明に記載の方法で得られたオートタキシンも本発明に含まれる。
【００１６】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１７】
本発明は、試料に含まれるオートタキシン（ＡＴＸ）を抗オートタキシン（抗ＡＴＸ）抗体に結合させ、前記抗体に結合しなかった不純物を洗浄分離後、前記抗体に結合したＡＴＸを溶出させることで、ＡＴＸを精製する方法において、ＡＴＸを溶出させる際に温和な条件、具体的にはｐＨ＝４．５以上の緩衝液を用いて溶出させることを特徴とする。
【００１８】
本発明の精製方法における、精製対象試料としては、ヒトＡＴＸを含んだヒト組織、またはヒト全血やヒト血清といったヒト体液を試料として用いることもできる。しかしながら、診断薬、治療薬、機能解析等に用いるためのＡＴＸの取得を目的とする場合は、大量にＡＴＸを取得する必要があるため、遺伝子組み換え技術により得られた、ＡＴＸを大量に発現可能な細胞を培養した培養液を試料とするのが好ましい。前記ＡＴＸを発現可能な細胞を調製するには、公知の遺伝子情報（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｌ４６７２０）を基に、ｃＤＮＡライブラリーからＡＴＸ遺伝子を取得後（必要に応じてポリヒスチジンタグ等の精製用タグを付加してもよい）、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等から選択した適切な細胞に対して形質転換を行なうことで調製することができる（特許文献１）。
【００１９】
本発明における抗ＡＴＸ抗体とは、ＡＴＸを特異的に認識する抗体の中から適宜選択することが可能であるが、精製したＡＴＸを診断薬や治療薬等に適用させることを考慮すると、リゾホスホリパーゼＤ活性を有した自然体（ｎａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）のＡＴＸを特異的に認識する抗体を用いるのが好ましい。なお、前記自然体のＡＴＸを特異的に認識する抗体は特許文献１の方法にて取得することが可能である。また、ｐＨ＝３．５付近でＡＴＸを精製するとＡＴＸの有する酵素活性（リゾホスホリパーゼＤ活性）が失われることから、ｐＨ＝４．５以上、好ましくはｐＨ＝５．０以上の緩衝液で、結合したＡＴＸの溶出が可能な抗体が好ましい。前記好ましい抗体の一例として、配列番号７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有した抗体があげられる。
【００２０】
本発明における溶出させる際に用いる緩衝液としては、ｐＨ＝４．５以上の領域で緩衝作用を有する緩衝液の中から適宜選択すればよく、グリシン緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液等を例示できる。中でもクエン酸緩衝液や酒石酸緩衝液といった多価カルボン酸緩衝液が好ましく、特にクエン酸緩衝液が好ましい。
【００２１】
本発明の方法を用いてＡＴＸを精製する際、抗ＡＴＸ抗体を容易に回収できる点や抗ＡＴＸ抗体を効率的に利用できる点で、担体に固定した抗ＡＴＸ抗体を用いて精製するのが好ましい。前記担体としては、抗ＡＴＸ抗体にＡＴＸを結合させるときまたは抗ＡＴＸ抗体からＡＴＸを溶出させるときに使用する緩衝液に対して不溶性であり、抗ＡＴＸ抗体を固定させても抗ＡＴＸ抗体が有するＡＴＸ認識性能が失われない担体の中から適宜選択すればよく、クロマトグラフィー用担体として通常用いられるアガロース、セルロース、デキストラン、キトサン、ビニルポリマー、シリカ等が例示できる。前記担体を用いたＡＴＸ精製方法の一態様として、ＡＴＸを含む試料を、抗ＡＴＸ抗体を固定させた担体を充填したカラムにロードして、ＡＴＸを抗ＡＴＸ抗体に結合させ、リン酸緩衝液等適切な緩衝液で前記抗体に結合しない不純物をカラムから除去した後、ｐＨ＝４．５以上の緩衝液で前記抗体に結合したＡＴＸを溶出する精製方法があげられる。前記担体を用いたＡＴＸ精製方法の別の態様としては、磁性微粒子を配合した担体に抗ＡＴＸ抗体を結合させたものに対しＡＴＸを含む試料を添加後、Ｂ（Ｂｏｕｎｄ）／Ｆ（Ｆｒｅｅ）分離により前記抗体に結合しない不純物の除去を行ない、ｐＨ＝４．５以上の緩衝液で前記抗体に結合したＡＴＸを溶出する精製方法があげられる。なお、本発明のＡＴＸ精製方法は、ｐＨ＝４．５以上の温和な条件でＡＴＸを溶出させるが、ｐＨ＝４．５のグリシン緩衝液中に３０分以上放置するとＡＴＸの有する酵素活性（リゾホスホリパーゼＤ活性）が低下する（実施例１および図２参照）ことから、ＡＴＸを溶出させた後、ＡＴＸ溶出液に対し１／１０容量程度の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）の緩衝液等を速やかに加えることで溶出液を中和させるのが好ましい。前記中和させたＡＴＸ溶出液は、その後、適切な緩衝液で透析することにより酵素活性を有した高純度ＡＴＸを得ることができる。
【００２２】
本発明の精製方法で得られた本発明のＡＴＸは、高純度、かつ自然体（ｎａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）のＡＴＸが有する酵素活性（リゾホスホリパーゼＤ活性）を保持しているため、ＡＴＸ濃度測定試薬やＡＴＸ活性測定試薬で用いる既知濃度標準品、ＡＴＸを標的とした分子標的治療薬開発のための抗原、また前記分子標的治療薬の薬効解析のための体内濃度測定試薬用抗原、抗オートタキシン抗体誘導のためのワクチン抗原等へ利用することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明は、抗オートタキシン抗体（抗ＡＴＸ抗体）を用いたオートタキシン（ＡＴＸ）の精製方法において、前記抗体に結合したＡＴＸを溶出させる際、ｐＨ＝４．５以上の緩衝液で溶出させることを特徴としている。本発明の精製方法により、特別な精製用タグを付加することなく、自然体（ｎａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）のＡＴＸを、その酵素活性（リゾホスホリパーゼＤ活性）を保持したまま、簡便、高純度に精製することができる。
【００２４】
特に、抗ＡＴＸ抗体として、配列番号７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有した抗体を用いることにより、自然体のＡＴＸを、その酵素活性を保持したまま、簡便、高純度かつ大量に得ることができる。
【００２５】
なお、本発明の精製方法で得られた本発明のＡＴＸは、酵素活性を保持しており、また高純度であることから、診断薬、治療薬、機能解析等の用途に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ポリヒスチジンタグを付加した精製ヒトオートタキシン（ＡＴＸ−ｈｉｓ）をｐＨ＝２．５で３０分間（左下の白丸）、またはｐＨ＝３．５で３０分間（中央の白丸）処理したときの、リゾホスホリパーゼＤ（ｌｙｓｏＰＬＤ）活性（横軸）とオートタキシン（ＡＴＸ）濃度（縦軸）との関係図。なお、オートタキシン（ＡＴＸ）濃度は非特許文献５に記載の酵素免疫測定方法により測定した。
【図２】精製ＡＴＸ−ｈｉｓをｐＨの異なるグリシン緩衝液で処理したときの、各処理時間における残存活性を調べた図。ＴＢＳで処理した試料をコントロールとし、残存活性は前記コントロール試料未処理（０分）時のＡＴＸ濃度測定値を１００％として計算している。
【図３】担体に各種抗ＡＴＸモノクローナル抗体を結合させたカラムを用いて、ＡＴＸ−ｈｉｓ試料を精製したときの、溶出パターンを示した図。なお、点線はｐＨに相当する電気伝導度を示しており、縦軸は非特許文献５に記載の酵素免疫測定方法により測定した、活性を有するＡＴＸ濃度を示している。
【図４】担体に各種抗ＡＴＸモノクローナル抗体を結合させたカラムを用いて、ＡＴＸ−ｈｉｓ試料を精製したときの、溶出パターンを示した図。なお、縦軸はＥＬＩＳＡ法により測定した、活性を失ったＡＴＸ濃度を示している。
【図５】担体に各種抗ＡＴＸモノクローナル抗体を結合させたカラムを用いて精製したＡＴＸ−ｈｉｓを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて純度確認した結果の図。染色はＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ）で行なっている。
【図６】担体に各種抗ＡＴＸモノクローナル抗体を結合させたカラムを用いて精製したＡＴＸ−ｈｉｓの比活性を比較した図。なお比活性は、非特許文献５に記載の酵素免疫測定方法により測定した活性を有するＡＴＸ濃度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図５）の１０５ｋＤａに位置するバンド強度より測定した全ＡＴＸ濃度で除した値である。
【図７】各種抗ＡＴＸモノクローナル抗体にＡＴＸを結合させ、その後ｐＨ＝２．５から５．０のグリシン緩衝液（１００ｍＭ）で前記ＡＴＸを溶出した際の、ＡＴＸの解離率を示した図。
【図８】各種抗ＡＴＸモノクローナル抗体にＡＴＸを結合させ、その後ｐＨ＝４．０から７．０のクエン酸緩衝液（１００ｍＭ）で前記ＡＴＸを溶出した際の、ＡＴＸの解離率を示した図。
【図９】抗ＡＴＸモノクローナル抗体（Ｒ１０．７）にＡＴＸを結合させ、その後１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液またはｐＨ＝５．０のクエン酸緩衝液（１００ｍＭ）で前記ＡＴＸを溶出した際の、ＡＴＸの解離率を示した図。
【図１０】各種抗ＡＴＸモノクローナル抗体にＡＴＸを結合させ、その後ｐＨ＝５．０の各種緩衝液（１００ｍＭ）で前記ＡＴＸを溶出した際の、ＡＴＸの解離率を示した図。
【図１１】各種抗ＡＴＸモノクローナル抗体にＡＴＸを結合させ、その後ｐＨ＝３．５から６．０の酒石酸緩衝液（１００ｍＭ）で前記ＡＴＸを溶出した際の、ＡＴＸの解離率を示した図。
【図１２】抗ＡＴＸモノクローナル抗体（Ｒ１０．７）にＡＴＸを結合させ、その後２０から１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）で前記ＡＴＸを溶出した際の、ＡＴＸの解離率を示した図。
【図１３】担体に抗ＡＴＸモノクローナル抗体（Ｒ１０．７）を結合させたカラムを用いて、ＡＴＸ試料を精製したときの、溶出パターンを示した図。なお、点線はｐＨに相当する電気伝導度を示しており、縦軸は吸光度（ＯＤ２８０）を示している。また、１、２および３は回収したフラクション領域を示す。
【図１４】実施例１０にて、担体に抗ＡＴＸモノクローナル抗体（Ｒ１０．７）を結合させたカラムを用いて、ＡＴＸ−ｈｉｓ試料を精製したときの、各回収フラクション中およびカラム通過フラクション中のＡＴＸ量を示した図。
【図１５】実施例１０にて、担体に抗ＡＴＸモノクローナル抗体（Ｒ１０．７）を結合させたカラムを用いて、ＡＴＸ−ｈｉｓ試料を精製したときの、各回収フラクションおよびカラム通過フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果（Ａ）ならびに抗ＡＴＸ抗体（Ｒ１．１Ａ８）によるウェスタンブロティング結果（Ｂ）を示した図。レーンＦ１、Ｆ２およびＦ３は図１３における各回収フラクションを、レーンＰはカラム通過フラクションをそれぞれ表す。
【図１６】実施例１１にて、担体に抗ＡＴＸモノクローナル抗体（Ｒ１０．７またはＲ１０．２３）を結合させたカラムを用いて、ＡＴＸ試料を精製したときの、溶出パターンを示した図。
【図１７】実施例１１にて、担体に抗ＡＴＸモノクローナル抗体（Ｒ１０．７またはＲ１０．２３）を結合させたカラムを用いて、ＡＴＸ試料を精製したときの、回収フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示した図。なお、ロード量は、濃度が吸光度（ＯＤ２８０）で０．１Ａｂｓの試料を７μＬ／レーンである。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２８】
実施例１ オートタキシン（ＡＴＸ）のｐＨ安定性
オートタキシン（ＡＴＸ）のｐＨ安定性の検証を実施した。
（１−１）特許文献１に記載の方法に従って構築したバキュロウイルス−昆虫細胞系で発現させたヒトＡＴＸ（２５．３μｇ／ｍＬ）を含むＴＢＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）溶液を、ＴＢＳ、１００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ＝３．５）または１００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ＝２．５）でそれぞれ１０倍希釈後、室温にて３０分放置し、ＴＢＳにて透析を実施した。
（１−２）各試料中のＡＴＸ濃度を非特許文献５に記載の酵素免疫測定方法を用いてＡＴＸ抗原量から測定し、リゾホスホリパーゼＤ活性を非特許文献８に記載の方法に従い測定した。
【００２９】
結果、図１に示す通り、各試料中における酵素免疫測定方法によるＡＴＸ濃度の測定値はリゾホスホリパーゼＤ活性値と良好な相関関係を示し、非特許文献５に記載の酵素免疫測定方法がリゾホスホリパーゼＤ活性（以下、単に酵素活性とする）を有するＡＴＸのみを定量していることが明らかとなった。そこで、非特許文献５に記載の酵素免疫測定方法を用い、ＡＴＸのｐＨ安定性を検証した。
（２−１）ヒトＡＴＸ（２５．３μｇ／ｍＬ）を含むＴＢＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）溶液を、ＴＢＳまたは１００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ＝４．５、ｐＨ＝４．０、ｐＨ＝３．５、ｐＨ＝３．０またはｐＨ２．５）に１／１０容量添加し、混合した。
（２−２）一定時間ごとに混合試料を回収し、１／１０容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）の添加により速やかに中和した後、ＡＴＸ除去ウシ血清にて１０倍希釈し、非特許文献５に記載の酵素免疫測定方法にてリゾホスホリパーゼＤ活性を有するＡＴＸを測定した。ＴＢＳを添加した試料の添加０分後の測定値を１００％残存活性とし、他の試料の測定値から残存活性を算出した。
【００３０】
結果を図２に示す。１００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ＝４．５）を混合したときは、３０分後であっても残存活性は１００％を示したが、ｐＨ＝４．５より酸性条件では活性の低下が著しく、特にｐＨ＝３．５より酸性条件では混合後５分でＡＴＸの酵素活性は失われることがわかる。従って、実際の精製作業としてｐＨ＝３．５より酸性条件での処理は好ましくないことがわかる。また、ｐＨ＝４．０であっても混合後１０分で活性の低下が認められたことから、好ましくはｐＨ＝４．５以上、かつ中和操作まで３０分以内で精製作業を完了するのが必須であることが明らかとなった。
【００３１】
実施例２ 抗体結合カラムを用いたＡＴＸ精製（その１）
特許文献１に記載の方法に従って取得した抗ＡＴＸモノクローナル抗体（約５０種）から予備評価により選定した、７種類のモノクローナル抗体を用いてＡＴＸを精製した。
（１）抗ＡＴＸモノクローナル抗体Ｒ１０．４、Ｒ１０．７、Ｒ１０．９、Ｒ１０．１２、Ｒ１０．１６、Ｒ１０．２１、Ｒ１０．２３をそれぞれプロテインＧカラムにて精製後、プロトコールに従い１ｍＬ容量のＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）カラムにそれぞれ５ｍｇのモノクローナル抗体を結合させたものを作製した。
（２）ポリヒスチジンタグを付加したヒトＡＴＸ（ＡＴＸ−ｈｉｓ）試料を下記に示す方法で調製した。
（２−１）特許文献１およびプロトコールに従い、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、ＡＴＸ−ｈｉｓ発現ウイルスを調製した。
（２−２）１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＳｆ９細胞液５００ｍＬにＡＴＸ−ｈｉｓ発現ウイルスを添加後、５日間培養し、上清を回収した。
（２−３）回収した上清は、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケアサイエンス社）を用い、５ｍＬ容量のＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕｅ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケアサイエンス社）にて濃縮を行なった。具体的には、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）にて平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕｅカラムに（２−２）の培養上清をロードした後、さらに１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）にて十分洗浄後、１Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）にてＡＴＸ−ｈｉｓを溶出した。なお、ＡＴＸの検出は溶出フラクションを非特許文献５に記載の方法で測定することで行なった。
（２−４）得られた約２０ｍＬのＡＴＸ−ｈｉｓ濃縮試料を回収後、ＴＢＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４））にて透析を行ない、これをＡＴＸ−ｈｉｓ試料とした。
（３）ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケアサイエンス社）と（１）で作製した抗体結合カラムを用いて、（２）で調製したＡＴＸ−ｈｉｓ試料の精製を下記に示す方法で行なった。
（３−１）（２）で調製したＡＴＸ−ｈｉｓ試料５ｍＬを（１）で作製した抗体結合カラムにロードした後、充分ＴＢＳで洗浄した。
（３−２）１００ｍＭクエン酸緩衝液を用い、ｐＨ＝５．０からｐＨ＝３．５までのリニアグラジエントにより結合したＡＴＸ−ｈｉｓを溶出した。なお溶出フラクションは、あらかじめ１／１０容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）を添加したチューブに回収されるため、速やかに中和される環境となっている。各フラクションは非特許文献５に記載の酵素免疫測定方法にて活性を有するＡＴＸ濃度の算出を行なった。
（３−３）一方、溶出フラクション中の変性ＡＴＸ−ｈｉｓの検出をＥＬＩＳＡ法により行なった。具体的には、溶出フラクションをＴＢＳにて１０倍希釈後、９６穴マイクロタイタープレートに５０μＬ／ウェルで添加し、４℃にて一昼夜コーティングを行なった。ＴＢＳにて洗浄後、３％の牛血清アルブミンを含むＴＢＳにてブロッキングし、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した、変性ＡＴＸを強く認識するモノクローナル抗体Ｒ１．１Ａ８（１μｇ／ｍＬ）を添加し２時間反応させた。その後、ＴＢＳで洗浄し、ＴＭＢ基質（ＫＰＬ社）を添加後、１５分反応させた。１Ｍリン酸により反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００３２】
溶出パターンを図３に示す。カラムに結合したモノクローナル抗体の種類により様々な溶出パターンを示した。非特許文献５に記載の酵素免疫測定方法により算出した、酵素活性を有するＡＴＸ−ｈｉｓ濃度が最大値を示すフラクションのｐＨはそれぞれ、ｐＨ＝４．２０（Ｒ１０．４）、ｐＨ＝４．８３（Ｒ１０．７）、ｐＨ＝４．４６（Ｒ１０．９）、ｐＨ＝３．９３（Ｒ１０．１２）、ｐＨ＝２．５０（Ｒ１０．１６）、ｐＨ＝３．５１（Ｒ１０．２１）、ｐＨ＝４．０４（Ｒ１０．２３）であり、Ｒ１０．７結合カラムが最も温和な条件でＡＴＸを溶出できることがわかる。さらに、Ｒ１０．７結合カラムの溶出パターンを確認すると、溶出ピークもシャープであることから、Ｒ１０．７結合カラムは、結合したＡＴＸ−ｈｉｓ全てを溶出するｐＨも、他の抗体結合カラムと比較し温和な条件であることが予想される。
【００３３】
一方、ＥＬＩＳＡ法の結果を図４に示す。Ｒ１０．７結合カラムを用いて得られた溶出フラクションのうち、活性を有するＡＴＸ−ｈｉｓを多く含むフラクション（４から１１ｍＬのフラクション）をＥＬＩＳＡ法で測定した結果、反応性が非常に弱いことが明らかとなった。一方、Ｒ１０．１２結合カラムやＲ１０．２１結合カラムを用いて得られた溶出フラクションのうち、活性を有するＡＴＸ−ｈｉｓを多く含むフラクションをＥＬＩＳＡ法で測定した結果、強い反応性を示していた。以上の結果より、図３に示すＡＴＸの有する酵素活性と図４に示すＥＬＩＳＡ法の結果とは相関しないこと、およびＡＴＸ−ｈｉｓが酸性側で溶出させるとＡＴＸの有する酵素活性が失われることがわかる。
【００３４】
各抗体結合カラムを用いて得られた溶出フラクションのうち、ＡＴＸ濃度が５μｇ／ｍＬ以上を示したフラクションを回収し、速やかにＴＢＳにて透析後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）（分画分子量：１００００）で１ｍＬになるまで遠心濃縮を行なった。前記濃縮試料を、非特許文献５に記載の酵素免疫測定方法にて活性を有するＡＴＸ−ｈｉｓを定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにてＡＴＸ−ｈｉｓ絶対量（活性を有するＡＴＸ−ｈｉｓ量＋活性を失ったＡＴＸ−ｈｉｓ量）を分析した。酵素免疫測定試薬による活性を有するＡＴＸ−ｈｉｓの定量の結果を表１に示す。
【００３５】
【表１】
Ｒ１０．７結合カラムおよびＲ１０．９結合カラムを用いたとき、活性を有するＡＴＸ−ｈｉｓの回収率が高いことがわかる。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図５に示すが、いずれの抗体結合カラムを用いてもＡＴＸ−ｈｉｓを高純度に精製していることがわかる。なお、図５において、Ｒ１０．２１による精製ＡＴＸが少ない理由は、Ｒ１０．２１が強酸性側で溶出されるためＡＴＸの有する酵素活性を指標にしたフラクション回収時の損失が非常に大きかったとものと考えられる。
【００３６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥのうち、ＡＴＸ−ｈｉｓに相当するバンドをＣｈｅｍｉｓｔａｇｅ ＣＣ−１６（倉敷紡績社）にてスキャン後、Ｌａｂｏ−１Ｄソフトウェア（倉敷紡績社）にてバンドのシグナル強度（ＯＤ）を測定した。その結果を表２に示す。
【００３７】
【表２】
表１で示される活性を有するＡＴＸ−ｈｉｓ量と、表２で示されるＡＴＸ−ｈｉｓ絶対量とから計算した、精製ＡＴＸ−ｈｉｓ中の活性を有するＡＴＸ−ｈｉｓの割合（比活性）を図６に示す。Ｒ１０．７結合カラムを用いたＡＴＸ精製が、回収率が高く、比活性も高いことが分かる。
【００３８】
実施例３ モノクローナル抗体の解離定数測定
実施例２で使用した抗ＡＴＸモノクローナル抗体の解離定数をＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ１００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて測定し、ＡＴＸ溶出ｐＨと比較した。
【００３９】
ＣＭ５チップに対し抗ＡＴＸ抗体をアミン結合させたもの（以下、単に抗体結合チップとする）を用意し、ＡＴＸをリガンドとして相互作用解析を実施し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフト（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のＢｉｎｄｉｎｇ解析によりＫａ（結合速度定数）、Ｋｄ（解離速度定数）、ＫＤ（解離定数）をそれぞれ算出した。結果を表３に示す。
【００４０】
【表３】
各抗体結合チップを用いたときの、活性を有するＡＴＸ濃度が最大値を示すフラクションのｐＨ（実施例２）と、結合した抗体のＫＤ（解離定数）（表３）の間には相関性は認められなかった。また、最も温和な条件で溶出可能なＲ１０．７が他の抗体と比較し、Ｋａ、Ｋｄ、ＫＤに大きな違いはなかった。以上より、抗体の解離、結合能とＡＴＸを溶出するｐＨとの間には相関性がないことがわかる。
【００４１】
実施例４ ｐＨとＡＴＸ解離率との関係（グリシン緩衝液）
実施例３で調製した抗体結合チップとｐＨが異なるグリシン緩衝液とを用い、抗体−ＡＴＸ間の解離解析をＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ１００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）にて実施した。
【００４２】
抗体結合チップにＡＴＸを結合させた後、ｐＨの異なる１００ｍＭグリシン緩衝液を流速３０μＬ／分で３０秒間流すことによりＡＴＸ解離率を測定した。結果を図７に示す。
【００４３】
Ｒ１０．７では、ｐＨ＝５．０においても約２０％の解離が認められるものの、他の抗体ではｐＨ＝５．０での解離がほとんど認められず、ｐＨ＝４．５であっても１０％以下の解離率であった。よって、Ｒ１０．７以外はｐＨ＝４．５以上の温和な条件ではグリシン緩衝液でＡＴＸが溶出されないことがわかった。
【００４４】
実施例５ ｐＨとＡＴＸ解離率との関係（クエン酸緩衝液）
実施例３で調製した抗体結合チップとｐＨが異なる１００ｍＭクエン酸緩衝液とを用い、実施例４と同様の方法で抗体−ＡＴＸ間の解離解析を実施した。結果を図８に示す。
【００４５】
グリシン緩衝液での溶出（実施例４）と異なり、ｐＨ＝４．５以上の温和な条件下におけるＡＴＸの溶出が、Ｒ１０．４、Ｒ１０．７、Ｒ１０．９の３抗体で認められた。前記３抗体を使用したときのｐＨによる解離率の変化を確認したところ、Ｒ１０．４では酸性が強いほど解離率が上昇するのに対し、Ｒ１０．７およびＲ１０．９ではｐＨ＝５．０で解離率の極大を示した。なお、Ｒ１０．７ではｐＨ＝５．０のクエン酸緩衝液を使用したときの解離率は１００％であった。
【００４６】
実施例６ ＥＤＴＡを用いたときのＡＴＸ解離
実施例５の結果において、抗体−ＡＴＸ間の解離がクエン酸のキレート作用によるものかを確認するため、１ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液を用い実施例４と同様の実験を行なった（なお、抗体はＲ１０．７を使用している）。結果を図９に示す。
【００４７】
１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液による解離が認められなかったことから、実施例４と５との違いが、クエン酸のキレート作用によるものではないことが明らかとなった。
【００４８】
実施例７ 緩衝液組成とＡＴＸ解離率との関係
実施例４から６の結果より、抗体−ＡＴＸ間の解離がｐＨのみに依存するものではなく、緩衝液組成にも依存する可能性が示唆されたため、ｐＨが同一で組成が異なる緩衝液を用いて、実施例４と同様の方法で抗体−ＡＴＸ間の解離解析を実施した。なお、緩衝液は１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）、１００ｍＭコハク酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）、１００ｍＭ酒石酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）、および１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）を使用し、抗体は実施例５で１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）でＡＴＸの溶出が確認された３抗体（Ｒ１０．４、Ｒ１０．７、Ｒ１０．９）を使用した。結果を図１０に示す。
【００４９】
クエン酸緩衝液および酒石酸緩衝液を使用したとき、抗体からのＡＴＸの解離が認められ、特にクエン酸緩衝液を使用したとき最も高いＡＴＸ解離率を示した。なお、解離率はＲ１０．７、Ｒ１０．９、Ｒ１０．４の順であった。
【００５０】
実施例８ ｐＨとＡＴＸ解離率との関係（酒石酸緩衝液）
実施例７の結果より、酒石酸緩衝液を使用してもＡＴＸの解離が確認されたため、実施例３で調製した抗体結合チップとｐＨが異なる１００ｍＭ酒石酸緩衝液とを用い、実施例４と同様の方法で抗体−ＡＴＸ間の解離解析を実施した。なお、抗体は実施例７で１００ｍＭ酒石酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）でＡＴＸの溶出が確認された３抗体（Ｒ１０．４、Ｒ１０．７、Ｒ１０．９）を使用した。結果を図１１に示す。
【００５１】
Ｒ１０．７では、ｐＨ＝４．５およびｐＨ＝５．０において約６０％の解離が認められるものの、Ｒ１０．４およびＲ１０．９では解離率が１０から２０％と極めて低かった。よって、Ｒ１０．７以外はｐＨ＝４．５以上の温和な条件では酒石酸緩衝液で溶出されないことがわかった。
【００５２】
実施例９ 溶出液中のクエン酸濃度とＡＴＸ解離率との関係
実施例３で調製したＲ１０．７結合チップと濃度が異なるクエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）とを用い、実施例４と同様の方法で抗体−ＡＴＸ間の解離解析を実施した。結果を図１２に示す。
【００５３】
クエン酸濃度の低下に伴い解離率は低下し、クエン酸濃度６０ｍＭ以下では解離率５０％を下回り有効な解離が認められないことがわかった。よって、ＡＴＸ精製で使用する溶出液のクエン酸濃度は７０ｍＭ以上が必要であることが明らかとなった。
【００５４】
実施例１０ 抗体結合カラムを用いたＡＴＸ精製（その２）
Ｒ１０．７結合カラムを用いＡＴＸ−ｈｉｓの精製を実施した。
（１）プロトコールに従い、５ｍＬ容量のＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）カラムに２５ｍｇのＲ１０．７モノクローナル抗体を結合させて、Ｒ１０．７結合カラムを作製した。
（２）実施例２の（２）と同様の方法で、ＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕｅ ＨＰカラムを用い、約２０ｍＬのＡＴＸ−ｈｉｓ濃縮試料を調製した。
（３）ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓと（１）で作製したＲ１０．７結合カラムを用いて、（２）で調製したＡＴＸ−ｈｉｓ濃縮試料を以下に示す方法で精製を行なった。
（３−１）ＴＢＳ透析を施したＡＴＸ−ｈｉｓ試料をＲ１０．７結合カラムにロードした後、充分ＴＢＳで洗浄した。
（３−２）１００ｍＭクエン酸緩衝液を用い、ｐＨ＝５．０からｐＨ＝３．５までのリニアグラジエントにより、結合したＡＴＸ−ｈｉｓを溶出した。
（４）溶出フラクションのうち、８から３２ｍＬのフラクション（以下、フラクション１）、３２から４８ｍＬのフラクション（以下、フラクション２）、４８から７２ｍＬのフラクション（以下、フラクション３）をそれぞれ回収後、ＴＢＳで透析した。
（５）透析後の各フラクション中の、活性を有するＡＴＸ濃度を非特許文献５に記載の酵素免疫測定方法により決定した。また、透析後の各フラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク純度の確認を行ない、ＡＴＸのＮ末端側を認識する抗ＡＴＸ抗体（Ｒ１．１Ａ８）を用いたウェスタンブロッティングにより精製タンパクがＡＴＸであるかの確認を行なった。
【００５５】
溶出パターンを図１３に示す。Ｒ１０．７結合カラムに結合したタンパク質は溶出開始後速やかに溶出された。フラクション１中の、活性を有するＡＴＸ濃度から、ＡＴＸ−ｈｉｓ回収率を計算したところ約９０％と非常に良好であった（図１４）。
【００５６】
フラクション１から３についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった結果、フラクション１において１００ｋＤａ付近に単一のバンドを確認し、Ｒ１０．７結合カラムにより非常に高純度にタンパクを精製できることがわかった（図１５（Ａ）のＦ１参照）。さらに、ウエスタンブロッティングの結果、フラクション１における前記バンドが確かにＡＴＸであることが判明した（図１５（Ｂ）のＦ１参照）。一方、Ｒ１０．７結合カラム通過フラクションについてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングを行なったところ、通過フラクションには低分子化した分解ＡＴＸが含まれていることが明らかとなった（図１５（Ａ）および（Ｂ）のＰ参照）。よって、Ｒ１０．７結合カラムによるＡＴＸ精製は、完全長ＡＴＸを取得するのに効果的であることを示している。
【００５７】
実施例１１ 抗体結合カラムを用いたＡＴＸ精製（その３）
精製用タグを有さないヒトＡＴＸ試料ならびに、Ｒ１０．７結合カラムおよびＲ１０．２３結合カラムを用いヒトＡＴＸの精製を行なった。
（１）実施例２と同様な方法で精製用タグを有しないヒトＡＴＸ試料を調製した。
（２）（１）で調製したヒトＡＴＸ試料をＲ１０．７結合カラムまたはＲ１０．２３結合カラムにロードした後、充分ＴＢＳで洗浄した。
（３）１００ｍＭクエン酸緩衝液をｐＨ＝５．０からｐＨ＝３．５のリニアグラジエントにより結合したヒトＡＴＸを溶出した。
（４）溶出フラクションのうち、タンパクの溶出が確認されたフラクション（Ｒ１０．７結合カラム：８から３６ｍＬまでのフラクション、Ｒ１０．２３結合カラム：８から５６ｍＬまでのフラクション）を回収後、速やかに透析した。
（５）ロードしたヒトＡＴＸ試料、抗体結合カラム通過フラクション、（４）で回収したフラクションについて、それぞれ非特許文献５に記載の酵素免疫測定方法により、活性を有するＡＴＸ濃度を定量し、回収率を算出した。
【００５８】
溶出パターンを図１６に示す。Ｒ１０．７結合カラムでは溶出開始後速やかに溶出された。一方、Ｒ１０．２３結合カラムの溶出パターンはＲ１０．７に比較し酸性側であった。Ｒ１０．７結合カラムおよびＲ１０．２３結合カラムを用いて精製したとき回収フラクションの積分値（ＯＤ２８０×容量）を計算したところ、それぞれ２１０（Ｒ１０．７）および２０７（Ｒ１０．２３）であることから、回収した蛋白質の総量はほぼ同量であることがわかる。
【００５９】
ロードしたヒトＡＴＸ試料、抗体結合カラム通過フラクション、回収フラクション中の、活性を有するＡＴＸ濃度を定量し回収率を算出した結果を表４に示す。
【００６０】
【表４】
Ｒ１０．７結合カラムおよびＲ１０．２３結合カラムを用いたときの、それぞれの回収フラクション中のタンパク量は、積分値から同程度回収できているにも関わらず、活性を有するヒトＡＴＸの回収率は、Ｒ１０．７結合カラムを用いたときが８８．５％、Ｒ１０．２３結合カラムを用いたときが３３．６％と大きく異なり、Ｒ１０．７結合カラムを用いた精製方法が、酵素活性を失うことなく、高回収率にてヒトＡＴＸを精製可能な方法であることがわかる。また、回収フラクション中のタンパク純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認したところ、いずれの抗体結合カラムを用いたときも高純度なタンパク精製が可能であることがわかった（図１７参照）。以上より、本発明の精製方法により、ポリヒスチジンといった精製用タグを有しない、天然体ヒトＡＴＸの精製が可能であることがわかる。
【００６１】
実施例１２ Ｒ１０．７の配列分析
抗ＡＴＸモノクローナル抗体Ｒ１０．７の塩基配列を以下の方法で決定した。
（１−１）重鎖遺伝子の増幅は、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ社）にてｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した後、Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用しプロトコールに従い実施した。ＰＣＲプライマーは、５’−ｇｇａｇｃｃｃａｇｔｃｃｔｇｇａｃ−３’（配列番号１、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｌ２２６５２の１から１７番目の塩基に相当）および５’−ｇｔｃａｃｇｇｔｇａｃｔｇｇｃｔｃａ−３’（配列番号２、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｌ２２６５２の５８８から６０５番目の塩基の相補鎖に相当）を用いた。
（１−２）ＰＣＲ産物をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０（アプライドバイオシステムズ社）にてシークエンスし塩基配列を決定した。シークエンスプライマーは５’−ｇｇａｇｃｃｃａｇｔｃｃｔｇｇａｃ−３’（配列番号１）および５’−ｇｔｃａｃｇｇｔｇａｃｔｇｇｃｔｃａ−３’（配列番号２）を用いた。
（２−１）軽鎖遺伝子の増幅は、重鎖と同様に回収したｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型として、Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用しプロトコールに従い実施した。ＰＣＲプライマーは、５’−ｔｇａｃａｃａｇｔｃｔｃｃａ−３’（配列番号３、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＢＣ０８８２５５の８２から９５番目の塩基に相当）および５’−ｔｇｇａｔｇｇｔｇｇｇａａｇａｔ−３’（配列番号４、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＢＣ０８８２５５の４２０から４３５番目の塩基の相補鎖に相当）を用いた。
（２−２）ＰＣＲ産物を、重鎖と同様にシークエンスし塩基配列を決定した。シークエンスプライマーは５’−ｔｇａｃａｃａｇｔｃｔｃｃａ−３’（配列番号３）および５’−ｔｇｇａｔｇｇｔｇｇｇａａｇａｔ−３’（配列番号４）を用いた。
【００６２】
前述の方法で得られた、重鎖可変領域の塩基配列を配列番号５に、軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号６にそれぞれ示す。また、前記塩基配列より決定される重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号７および８にそれぞれ示す。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の技術は高純度オートタキシンを必要とする産業分野で利用可能である。例えば、オートタキシン濃度測定試薬やオートタキシン活性測定試薬で用いる既知濃度標準品、オートタキシンを標的とした分子標的治療薬開発のための抗原、また前記分子標的治療薬の薬効解析のための体内濃度測定試薬用抗原、抗オートタキシン抗体誘導のためのワクチン抗原等への利用が考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗オートタキシン抗体を用いたオートタキシンの精製方法であって、前記抗体に結合したオートタキシンを溶出させる際、ｐＨ＝４．５以上の緩衝液で溶出させることを特徴とする、オートタキシンの精製方法。
【請求項２】
前記抗オートタキシン抗体が、配列番号７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有した抗体である、請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
前記緩衝液が多価カルボン酸緩衝液である、請求項１または２に記載の精製方法。
【請求項４】
前記多価カルボン酸がクエン酸または酒石酸である、請求項３に記載の精製方法。
【請求項１】
抗オートタキシン抗体を用いたオートタキシンの精製方法であって、前記抗体に結合したオートタキシンを溶出させる際、ｐＨ＝４．５以上の緩衝液で溶出させることを特徴とする、オートタキシンの精製方法。
【請求項２】
前記抗オートタキシン抗体が、配列番号７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有した抗体である、請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
前記緩衝液が多価カルボン酸緩衝液である、請求項１または２に記載の精製方法。
【請求項４】
前記多価カルボン酸がクエン酸または酒石酸である、請求項３に記載の精製方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
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【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２０１１−３７８０２（Ｐ２０１１−３７８０２Ａ）
【公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１８９２７５（Ｐ２００９−１８９２７５）
【出願日】平成２１年８月１８日（２００９．８．１８）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月１８日（２００９．８．１８）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
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