カイコを用いた糖鎖構造に特徴を有する糖蛋白質の製造方法
【課題】トランスジェニックカイコで生産した糖蛋白質の糖鎖構造解析をおこなうことにより、その糖鎖がどのような構造であるかについて調べる。
【解決手段】トランスジェニックカイコで生産した糖蛋白質の糖鎖では、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖構造を有する糖蛋白質が得られる。また、このトランスジェニックカイコにさらにＧａｌＴ遺伝子を組み込むことによって、ほぼ完全にヒト型化した糖鎖構造を有する糖蛋白質が得られる。
【解決手段】トランスジェニックカイコで生産した糖蛋白質の糖鎖では、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖構造を有する糖蛋白質が得られる。また、このトランスジェニックカイコにさらにＧａｌＴ遺伝子を組み込むことによって、ほぼ完全にヒト型化した糖鎖構造を有する糖蛋白質が得られる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖構造に特徴を有する糖蛋白質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、組換えタンパク質として大腸菌等で生産されるタンパク質は、少量で高い効果を発揮するサイトカインやホルモンなどに加えて、比較的多量に用いなければ効果が得られない抗体や血液タンパク質のような糖タンパク質にも生産対象が広がっている。大腸菌では、糖タンパク質の合成が本来行えないので、多くの製薬会社では、ほ乳類培養細胞を使って生産が行われている。ほ乳類培養細胞を用いた場合、大量生産が難しく、高コストをさけることはできない。そのため、糖タンパク質製剤を大量にそして安価に生産できる発現系の開発が望まれている。
【０００３】
ネオシルク社および広島県産業科学技術研究所では、組換えタンパク質を絹糸の構成成分として分泌するトランスジェニックカイコを創り出すことに成功しており（特許文献１〜７）、これを用いて組換えタンパク質受託生産およびタンパク質医薬品開発を行っている。
【０００４】
一方、ネオシルク社および広島県産業科学技術研究所以外でも、昆虫細胞を利用した糖蛋白質の生産についての研究もこれまで多少行われてきた。しかし、バキュロウイルス−昆虫細胞発現系を用いて発現させた蛋白質では、Ｎ結合型糖鎖のほとんどは、図７の経路１に示すようにトリマンノシルコア型であることが知られている。なぜなら、宿主である昆虫細胞がガラクトース転移酵素（ＧａｌＴ）およびシアル酸転移酵素（ＳＴ）活性を欠くためである。さらに、昆虫細胞宿主では、ゴルジ体に局在する酵素であるＮ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＧｌｃＮＡｃａｓｅ）が昆虫細胞で発現される糖蛋白質に付加されるＮ結合型糖鎖を昆虫細胞に特徴的な構造に構築する活性を有するからでもある。すなわち、この酵素が合成経路のＮ結合型糖鎖末端のアセチルグルコサミン残基を加水分解することにより糖鎖の伸長とα１，３フコース無しが起こらないと考えられている。一方、哺乳動物由来の糖タンパク質が持つコンプレックス型（哺乳類型）糖鎖は図７の経路２によって合成され、その末端にシアル酸が付加される。
【０００５】
そのため、昆虫細胞型の糖鎖を持つ組換え糖蛋白質を哺乳動物に投与した場合には、昆虫型糖鎖は哺乳動物体内で異物として認識され、あるいは生体内に長くとどまらないなどの問題が生じていた。このため、昆虫細胞で哺乳動物由来の糖蛋白質を発現させても、哺乳動物生体内での安定性が低く、哺乳動物への投与には適さなかった。
【０００６】
そこで、生体内での安定性に優れ、哺乳動物への投与に適した形の、哺乳動物本来の持つ蛋白質に近い、シアル酸が付加された組換え糖蛋白質を昆虫細胞で発現させる方法を提供することを目的として、昆虫細胞の持つＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を抑制、阻害または除去することを含む、シアル酸が付加された糖鎖を有する組換え糖蛋白質を昆虫または昆虫細胞で発現する方法が開発されている（特許文献８）。
【０００７】
また、昆虫培養細胞で発現している糖蛋白質のＮ結合型糖鎖におけるフコースの結合について明らかにした研究によれば、糖タンパク質のＮ結合型糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンに、α１，３結合したフコースやα１，６結合したフコースが存在する場合があることが示されている（非特許文献１、２）。α１，３結合したフコース（α１，３フコース）については、哺乳動物生体内では抗原性を示すことが知られており、そのため、昆虫培養細胞を用いて生産した糖タンパク質は、哺乳動物への投与には適さないと考えられている。また、ガラクトース転移酵素遺伝子を組み込んだカイコの作製については、特許文献および論文では無いが、学会等では発表されており、ホームページにも掲載されている（非特許文献３）。
【０００８】
他方、抗腫瘍抗体の臨床応用では、現状では抗体単独の抗腫瘍効果は不十分な場合が多く、化学療法との併用療法が行われているが、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）の増強による抗体単独のより強い抗腫瘍効果が認められれば、化学療法に対する依存度が低くなり、副作用の低減も期待できる。そこで、協和醗酵工業株式会社は、各種動物細胞で生産したヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体の糖鎖を分析してＡＤＣＣ活性を高める糖鎖を特定し、免疫機能分子の活性を調節する方法を提供することを目的として、ラットミエローマＹＢ２／０細胞で生産したヒト化抗体のＡＤＣＣ活性が他の細胞で生産したヒト化抗体に比べ著しく高いことを見出している（特許文献９）。
【０００９】
この発見に基づいて、協和発酵工業株式会社は、さらに研究開発を進め、現在では、協和発酵工業株式会社の米国子会社バイオワ（ＢｉｏＷａ，Ｉｎｃ．）を通じて、ＡＤＣＣ活性を強化するポテリジェント（Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ、登録商標）技術について、世界中の製薬会社等に対してライセンス許諾等のビジネスを行っている（特許文献１０〜１８）。
【００１０】
【特許文献１】特開２００１−１６１２１４号公報
【特許文献２】特開２００２−３０６１６７号公報
【特許文献３】特開２００２−３１５５８０号公報
【特許文献４】特開２００４−１６１４４号公報
【特許文献５】特開２００４−３４４１２３号公報
【特許文献６】特開２００６−１６３２３号公報
【特許文献７】特開２００６−１０９７７２号公報
【特許文献８】特開２００３−７０４６９号公報
【特許文献９】国際公開第００／６１７３９号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第０２／０３１１４０号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第０３／０５５９９３号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第０３／０８４５６９号パンフレット
【特許文献１３】国際公開第０３／０８４５７０号パンフレット
【特許文献１４】国際公開第０３／０８５１０２号パンフレット
【特許文献１５】国際公開第０３／０８５１１８号パンフレット
【特許文献１６】国際公開第０３／０８５１１９号パンフレット
【特許文献１７】国際公開第０５／０５３７４２号パンフレット
【特許文献１８】特開２００７−１２９９０３号公報
【非特許文献１】Kubelka, V. et al., Arch. Biochem Biophys. 308, 148-157, 1994、
【非特許文献２】Staudacher, E. et al., Eur. J. Biochem. 207, 987-993, 1992
【非特許文献３】森肇著、「カイコの形質転換による有用物質生産系の開発」http://www.jst.go.jp/shincho/db/seika/2006_s/2006_s_9/2006_s_9_koncyukinou/2006_s_9_koncyukinou_3_1_3.htm
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、上記文献記載の従来技術は、以下の点で改善の余地を有していた。
第一に、特許文献１〜７では、組換えタンパク質を絹糸の構成成分として分泌するトランスジェニックカイコを創り出すこと自体は成功しているが、従来の知見では、カイコで生産されるタンパク質には糖鎖が付加されるものの、この糖鎖の構造は哺乳動物が合成するタンパク質と同じではないと考えられている。そのため、この糖鎖の構造がカイコで糖タンパク質製剤を生産する際の問題点であった。また、仮にカイコ細胞またはカイコ個体の遺伝子改変を行ってこの問題を解決するにしても、糖鎖改変に必要な糖転移酵素を選択するためには、やはりカイコで付加された糖鎖の構造を調べることが必要であった。
【００１２】
第二に、特許文献８では、シアル酸が付加された糖鎖を有する組換糖蛋白質を昆虫または昆虫細胞で発現すること自体は成功しているが、トランスジェニックカイコで発現された糖蛋白質の糖鎖構造におけるフコースの結合状態については、何ら検討されていない。そのため、トランスジェニックカイコで哺乳動物由来の抗体を生産した場合に、その抗体の哺乳動物体内でのＡＤＣＣ活性および抗原性がどのようになるかについては不明であった。
【００１３】
第三に、特許文献９〜１８では、ＡＤＣＣ活性を高める糖鎖を特定すること自体は成功しているが、そのような特定の構造の糖鎖を有する抗体を効率よく低コストで生産することのできる生産系は未だ確立されていない。すなわち、大腸菌では、糖タンパク質の合成を行うことができないので、多くの企業では、哺乳類培養細胞を使って生産が行われているが、哺乳類培養細胞を用いた場合、大量生産が難しく、高コストをさけることはできなかった。
【００１４】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、トランスジェニックカイコで生産したＩｇＧをはじめとする糖蛋白質の糖鎖構造解析をおこなうことにより、その糖鎖がどのような構造であるかについて調べることを目的とする。また、本発明の別の目的は、上記の糖鎖構造解析の結果に基づいて、糖鎖構造に特徴を有する糖蛋白質を、昆虫個体または昆虫細胞を用いて、効率的に低コストで生産する技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明によれば、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質の生産方法であって、昆虫の絹糸腺細胞において、糖蛋白質を発現させる工程を含む、糖蛋白質の生産方法が提供される。
【００１６】
この生産方法によれば、昆虫の絹糸腺細胞において、糖蛋白質を発現させるため、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質を効率よく発現させることができる。また発現された糖蛋白質を効率よく抽出することもできるので、糖鎖構造に特徴を有する糖蛋白質を、昆虫細胞を用いて、効率的に低コストで生産することができる。
【００１７】
また、本発明によれば、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質の生産方法であって、昆虫個体に内在している絹糸腺、昆虫個体より摘出した絹糸腺組織、または昆虫個体より摘出した絹糸腺より得られる絹糸腺細胞において、前記糖蛋白質を発現させる工程を含む、糖蛋白質の生産方法が提供される。
【００１８】
この生産方法によれば、昆虫個体に内在している絹糸腺、昆虫個体より摘出した絹糸腺組織、または昆虫個体より摘出した絹糸腺組織より得られる絹糸腺細胞において、糖蛋白質を発現させるため、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質を効率よく発現させることができ、発現された糖蛋白質を効率よく抽出することができるので、糖鎖構造に特徴を有する糖蛋白質を、昆虫細胞を用いて、効率的に低コストで生産することができる。
【００１９】
また、本発明によれば、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質を生産するための糖蛋白質生産細胞であって、糖蛋白質を発現するように遺伝的に改変されてなる昆虫の絹糸腺細胞である、糖蛋白質生産細胞が提供される。
【００２０】
この糖蛋白質生産細胞によれば、糖蛋白質を発現するように遺伝的に改変されてなる昆虫の絹糸腺細胞において、糖蛋白質を発現させるため、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質を効率よく発現させることができる。また発現された糖蛋白質を効率よく抽出することもできるので、糖鎖構造に特徴を有する糖蛋白質を、昆虫細胞を用いて、効率的に低コストで生産することができる。
【００２１】
また、本発明によれば、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質を生産するための糖蛋白質生産生物個体であって、糖蛋白質を絹糸腺において発現するように遺伝的に改変されてなる昆虫個体である、糖蛋白質生産生物個体が提供される。
【００２２】
この糖蛋白質生産生物個体によれば、糖蛋白質を絹糸腺において発現するように遺伝的に改変されてなる昆虫個体の絹糸腺において、糖蛋白質を発現させるため、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質を効率よく発現させることができる。また発現された糖蛋白質を効率よく抽出することもできるので、糖鎖構造に特徴を有する糖蛋白質を、昆虫細胞を用いて、効率的に低コストで生産することができる。
【００２３】
なお、上記の生産方法は本発明の一態様であり、本発明の生産方法は、以上の構成要素の任意の組合せであってもよい。また、本発明の糖蛋白質生産組織なども、同様の構成を有し、同様の作用効果を奏する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、特定の種類の昆虫個体・昆虫組織または昆虫細胞を用いるため、糖鎖構造に特徴を有する糖蛋白質を、昆虫個体・昆虫組織または昆虫細胞を用いて、効率的に低コストで生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
＜用語の説明＞
本明細書において、「下限数値〜上限数値」とは、下限数値以上かつ上限数値以下の範囲内にあることを意味するものである。
【００２６】
本明細書では、「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ；またはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）が２個以上結合した分子を意味する。ポリヌクレオチドと他のポリヌクレオチドが「機能的に連結されている」とは、各々のポリヌクレオチドが有する機能が損なわれることなく、しかも連結によって所望の機能が発揮しうる状態が確保されている状態を意味する。具体的には、一方のポリヌクレオチドの３’端ヌクレオチドと他方のポリヌクレオチドの５’端ヌクレオチドが直接、または他のリンカー配列を介して結合している状態をいう。
【００２７】
本明細書では、「蛋白質」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味し、「組換蛋白質」とは、遺伝子工学的に製造されるタンパク質を意味する。
【００２８】
本明細書において、「糖蛋白質」とは、通常の糖蛋白質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）を意味し、蛋白質を構成するアミノ酸の一部に糖鎖が結合したものである。動物においては、細胞表面や細胞外に分泌されているタンパク質のほとんどが糖蛋白質であるといわれている。蛋白質のアミノ酸の修飾では、アスパラギンに結合したもの（Ｎ結合型）とセリンやスレオニンに結合したもの（Ｏ結合型、ムチン型）の２種類が頻繁に観察される。
【００２９】
糖タンパク質に結合している糖鎖を成す糖の種類はそれほど多くなく、よく見られるものは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、キシロースなど７〜８種程度である。構造様式もある程度限られており、その中のわずかな構造の違いが識別され、精密に認識されて様々な生命現象が制御されている。
【００３０】
本明細書において、「抗体」とは、通常の抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）を意味し、リンパ球のうちＢ細胞の産生する糖タンパク分子で、特定のタンパク質などの分子（抗原）を認識して結合する働きをもつ。なお、「抗体」という名は抗原に結合するという機能を重視した名称で、物質としては免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）と呼ばれ、「Ｉｇ（アイジー）」と略される。すべての抗体は免疫グロブリンであり、血漿中のγ（ガンマ）グロブリンにあたる。
【００３１】
抗体は定常領域の構造の違いにより、いくつかのクラス（アイソタイプ）に分けられる。哺乳類では、定常領域の構造の違いによりＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥの５種類のクラスの免疫グロブリンに分類される。ヒトの場合、ＩｇＧにはＩｇＧ１〜ＩｇＧ４の４つのサブクラスが、ＩｇＡにはＩｇＡ１とＩｇＡ２の２つのサブクラスがあり、それぞれ少しずつ構造が異なっている。ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥにはサブクラスはない。なお、本明細書では、「抗体」とは、上述のクラス・サブクラスの総称を意味し、それらのＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２などの抗体断片であってもよく、さらにマウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト型抗体などが含まれる。
【００３２】
本明細書では、「蛋白質をコードする遺伝子」とは、蛋白質をコードする領域（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ： ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドであり、例えば蛋白質遺伝子のｃＤＮＡである。「遺伝子プロモーター領域」とは、タンパク質をコードする遺伝子領域の転写開始点から上流域に存在する転写を開始させるために必須な配列を含む領域であって、一般に「プロモーター領域」および「エンハンサー領域」と言われる領域を言う。そのため、「抗体のＨ鎖をコードする遺伝子」または、「抗体のＬ鎖をコードする遺伝子」とは、抗体のＨ鎖またはＬ鎖をコードする領域（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ： ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドであり、例えばこれらをコードする遺伝子のｃＤＮＡである。
【００３３】
本明細書では、「フコース」とは、通常のフコース（ｆｕｃｏｓｅ）を意味し、デオキシ糖の一種である６−デオキシ−ガラクトースで、化学式はＣ６Ｈ１２Ｏ５、分子量１６４．１６、融点１６３℃、比旋光度−７６゜で六炭糖、単糖に分類される。天然にはＬ型がＬ−フコシドの形で、動植物に幅広く存在する。哺乳動物および植物では細胞表面のＮ結合糖鎖上で見つかる。
【００３４】
本明細書では、「Ｎ−アセチルグルコサミン」とは、通常のＮ−アセチルグルコサミン（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、ＧｌｃＮＡｃ、ＮＡＧ）を意味し、グルコースから誘導された単糖で、いくつかの生化学的機構にとって重要な物質である。化学的にはこの物質はグルコサミンと酢酸の間のアミドである。Ｎ−アセチルグルコサミンは、哺乳動物においては、糖タンパク質、ヒアルロン酸などグリコサミノグリカン（ムコ多糖）の成分となっている。Ｎ−アセチルグルコサミンは、アスパラギンにマンノースを中心とするオリゴ糖鎖が結合するＮ結合型糖タンパク質の骨格をなすほか（キトビオース構造）、更に複雑構造を持つ糖鎖の主要構成糖である。
【００３５】
本明細書では、「ガラクトース」とは、通常のガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）を意味し、分子式、分子量はグルコースと同じＣ６Ｈ１２Ｏ６、１８０である。立体配置は２位（Ｆｉｓｃｈｅｒ投影式で上から２番目）、５位の−ＯＨが同じ方向３位、４位が反対方向であり、Ｄ−ガラクトースは５位Ｄ−グリセルアルデヒドと同じ配向をもっている。グルコースの４−エピマーである。天然ではＤ−ガラクトースがほとんどである。
【００３６】
本明細書では、「βガラクトース転移酵素」とは、通常のβ−ガラクトース転移酵素（β−ＧａｌＴ）を意味し、ＵＤＰ−ＧａｌからＧａｌを糖鎖末端のＧｌｃＮＡｃ残基に転移することでＧａｌβ１→３／４ＧｌｃＮＡｃという構造を形成する酵素である。なお、最近になって、これまでに知られていないβ−１，４−ＧａｌＴやβ−１，３−ＧａｌＴをコードする遺伝子が次々にクローニングされ、これらもそれぞれファミリーを形成していることが明らかになっている。例えば、ヒトβ−１，４−ＧａｌＴ遺伝子は、糖転移酵素間に見られるアミノ酸配列のホモロジーや遺伝子バンクに登録された遺伝子断片の配列情報を利用してクローニングされており、それらはβ−１，４−ＧａｌＴ Ｉとアミノ酸配列で５５，４４，４１，３７，３３％のホモロジーを持っていたので、ホモロジーの順番に従ってβ−１，４−ＧａｌＴ ＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶ，Ｖ，ＶＩと命名されている。本明細書における「βガラクトース転移酵素」には、これらのすべてのβ−１，４−ＧａｌＴやβ−１，３−ＧａｌＴが含まれるものとする。
【００３７】
本明細書では、「Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素」とは、通常のＮ−アセチルグルコサミン転移酵素（ＧｎＴ）を意味し、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶ，Ｖ，ＶＩ（ＧｎＴ−Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶ，Ｖ，ＶＩ）が知られている。これらの中でも、Ｎ型糖鎖の高分岐化に関しては、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ，ＩＶ，Ｖ，ＶＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ，ＩＶ，Ｖ，ＶＩ）が分岐構造のコアとなる部分を決定するため、これらの酵素の活性化制御が全体の糖鎖構造の変化をきたすとされている。一方、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉ，ＩＩ（ＧｎＴ−Ｉ，ＩＩ）は、基本となるコア構造の決定に重要な意味をもつとされている。本明細書における「Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素」には、これらのすべてのＮ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶ，Ｖ，ＶＩが含まれるものとする。
【００３８】
本明細書において、「昆虫」とは、通常の意味の昆虫（Ｉｎｓｅｃｔ）を意味し、昆虫綱（Ｉｎｓｅｃｔａ）に分類される生物の総称であるものとする。
【００３９】
本明細書において、「鱗翅目」とは、通常の意味の鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）を意味し、チョウ目またはガ目とも呼ばれる昆虫類の分類群の一つであるものとする。成虫の体表が鱗粉や毛で覆われることから「鱗翅目」の名がある。なお、成長段階は、卵、幼虫、蛹、成虫という完全変態をおこなう。幼虫は円筒形で柔らかい体を持ち、胸部の歩脚は短く、腹部にはイボ足をもつ。本明細書において、鱗翅目の昆虫には、成虫のみではなく、当然に卵、幼虫、蛹の段階のものも含まれるものとする。
【００４０】
本明細書において、「カイコ」とは、通常の意味のカイコ（蚕）を意味し、チョウ目（鱗翅目）・カイコガ科に属する昆虫の一種であるものとする。正式和名はカイコガで、カイコはこの幼虫の名称だが、一般的にはこの種全般をも指す。クワ（桑）を食餌とし、絹を産生して蛹の繭を作る。カイコは家蚕（かさん）とも呼ばれ、野生に生息する昆虫ではない。カイコの祖先は東アジアに生息するクワコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍａｎｄａｒｉｎａ）であると考えられている。カイコとクワコは学問的には別種とされるが、これらの雑種は生殖能力をもつ。本明細書では、カイコには、クワコが含まれるものとする。
【００４１】
本明細書において、「絹糸腺」とは、熟蚕の体内に存在する左右１対の器官であり、クワの葉から摂取した多量のタンパク質（アミノ酸）を２種類の絹タンパク質（フィブロイン、セリシン）に変える器官を意味する。絹糸腺は左右一対となっており、マユ糸の原料となる液状絹を分泌する。絹糸腺は、後部絹糸腺、中部絹糸腺、前部絹糸腺の３つの部分に分けられる。
【００４２】
後部絹糸腺とは、最後部にある細長い部分で、伸ばすと約２０ｃｍになる。ここでは後にマユ糸の中心となるフィブロインタンパク質を合成する。
【００４３】
中部絹糸腺とは、中央部分にあるＳ字に曲がった太い部分で、伸ばすと約６ｃｍになる。後部絹糸腺から送られてきたフィブロインタンパク質を濃縮して蓄え、繊維にしやすい形に整える。またもうひとつの絹タンパク質であるセリシンも分泌する。マユ糸を吐きだすとき、フィブロインタンパク質をまとめる接着剤の役割をする。
【００４４】
前部絹糸腺とは、長さは約４ｃｍの吐糸口につながる細い管で、先に行くほど細くなる。液状のフィブロインタンパク質の分子が引き伸ばされて一定方向に揃えられ、互いに集合することでさらに水分が除かれる。管の先端でもう一対の管と一本に合流し、吐糸口から吐きだされて一本のマユ糸になる。
【００４５】
カイコは５齢の終わり頃にクワを食べるのをやめる（熟蚕）。熟蚕の体の中は、マユ糸の原料となる水飴のような液（液状絹）をため込んだ一対の器官（絹糸腺）でいっぱいになっている。絹糸腺は、細い吐糸管をつうじてカイコの口元にある吐糸口につながっている。液状絹は細い吐糸管を通ることで引き伸ばされて固まり、マユ糸となる。さらには、幼虫が吐糸管から吐きだした糸を近くのものに貼りつけ、頭と胸を８の字状に動かし、引っぱるという一連の運動で、マユ糸は次々と絹糸腺から引きだされるのである。
【００４６】
本明細書において、「フィブロイン」とは、繭糸の約７５％を占める繊維状のタンパク質であり、絹の原料である。光沢があってしなやかで、水やアルカリ液でも溶けない性質がある。１本のフィブロイン繊維は約２，０００本のフィブリルでできており、フィブリルはさらに直径１０万分の１ｍｍという微細なミクロフィブリルからできている。
【００４７】
本明細書において、「セリシン」とは、繭糸の約２５％を占めるタンパク質であり、２本のフィブロイン繊維を結びつけ、マユをつくるための接着剤の役割を果たすが、水に溶けやすい。
【００４８】
本明細書におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はSambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている。
【００４９】
＜発明の経緯＞
本発明者等の所属するネオシルク社は、トランスジェニックカイコ（ＴＧカイコ）を組換えタンパク質の生産に用いる技術を開発済みである。その主要な特徴として以下の３点が挙げられる。
（１）宿主はカイコ由来の培養細胞ではなく昆虫であるカイコの個体（またはカイコの個体内に含まれる体細胞）である。
（２）バキュロウイルス等によるものではなくトランスジェニック技術による遺伝子導入法である。
（３）セリシンプロモーターまたはフィブロインプロモーターによって目的タンパク質の発現が制御される為絹糸腺特異的に、ひいてはカイコが作成する繭のなかに発現させることができる。
【００５０】
しかしながら、既述のように、ネオシルク社としては、組換えタンパク質を絹糸の構成成分として分泌するトランスジェニックカイコを創り出すこと自体は成功しているが、従来の知見では、カイコで生産されるタンパク質には糖鎖が付加されるものの、この糖鎖の構造は哺乳動物が合成するタンパク質と同じではないと考えられている。そのため、この糖鎖の構造がカイコで糖タンパク質製剤を生産する際の問題点であった。また、仮にカイコ細胞またはカイコ個体の遺伝子改変を行ってこの問題を解決するにしても、糖鎖改変に必要な糖転移酵素を選択するためには、やはりカイコで付加された糖鎖の構造を調べることが必要であった。
【００５１】
そこで、本発明者等は、後述の実施例で説明するように、上記のネオシルク社における常法によるトランスジェニックカイコに産生させたマウスＩｇＧの糖鎖の構造解析を行ったところ、以下の結果を得た（図７）。
（１）高マンノース型および、トリマンノシルコア構造の１−３結合マンノース及び１−６結合マンノースにＧｌｃＮＡｃが１個または２個β１−２結合し、かつＧａｌが結合していない二分岐型の構造を持つ。
（２）昆虫由来の糖鎖の特徴である少マンノース型構造や、還元末端のＧｌｃＮＡｃ残基にα１−３結合するフコース（以下、１−３Ｆｕｃ）も検出されず、α１−６結合フコース（以下、１−６Ｆｕｃ）の付加も同様に見られなかった。
【００５２】
ここで、一般的にカイコを含む昆虫のＮ型糖鎖は以下の点が特徴である。
（１）パウチマンノース型（少マンノース型）が主でありガラクトース（以下Ｇａｌ）付加及びシアル酸の付加は無い。
（２）Ａｓｎと結合しているＧｌｃＮＡｃにヒトを含む哺乳動物は１−６Ｆｕｃ構造を持つが、昆虫ではフコースが１−６Ｆｕｃ構造に加えて１−３Ｆｕｃ構造もとりうる。
【００５３】
すなわち、トランスジェニックカイコに産生させたマウスＩｇＧの糖鎖の構造解析を行った結果は、上述の昆虫のＮ型糖鎖の糖鎖構造とは全く異なる構造を有しており、従来の予想を覆す、驚くべき知見であった。
【００５４】
すなわち、本発明者等は、カイコ絹糸腺で合成される糖鎖には１−３Ｆｕｃも１−６Ｆｕｃも検出されないことにくわえて、従来の知見では、昆虫で合成される糖鎖は、マンノースを３つまたは２つもつ糖鎖が大半であると言われていたが、実際には、繭から精製したＩｇＧではマンノース５つや、ＧｌｃＮＡｃが付いた糖鎖が多いことを見出した。
【００５５】
すなわち、本発明者等の行った実験によれば、バキュロウイルス発現系での主な発現組織となる組織であるカイコの脂肪体では、従来の知見どおりの結果（マンノースを３つまたは２つもつ糖鎖が大半であるという結果）が再現されたが、一方、カイコの繭では、抗体（ＩｇＧ）の場合と同様な結果（マンノース５つや、ＧｌｃＮＡｃが付いた糖鎖が多いという結果）が得られた。また、この実験結果と同様な結果が、カイコの絹糸腺の糖鎖の解析からも得られた。すなわち、本発明者等の行った実験によれば、カイコの脂肪体より、むしろＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ：チャイニーズハムスターの卵巣）細胞の糖鎖（哺乳動物型、ヒト型）に近いことが判明した。
【００５６】
言い換えれば、本発明者等は、このように、カイコの絹糸腺で合成し、繭に分泌された糖蛋白質の糖鎖は、糖鎖のヒト型化（糖鎖の伸長とα１，３フコース無し）に関して非常に有利であることを見出した。このことは、従来の知見とは全く異なる予想外の結果であり、本発明者等はさらに研究を進めた。
【００５７】
その後、本発明者等は、βガラクトース転移酵素（ＧａｌＴ）およびＮ−アセチルグルコサミン転移酵素（ＧｎＴ）を絹糸腺で発現するトランスジェニックカイコを作製し、繭タンパク質の糖鎖解析を行った。その結果は、後述するとおりであり、比率的にはまだ改善の余地があるものの、ＧｌｃＮＡｃの先にβＧａｌが付いた糖鎖を作ることに成功した。すなわち、こうして得られたカイコの絹糸腺で生産された糖蛋白質の糖鎖では、まだ改善の余地があるとは言え、ほぼ糖鎖のヒト型化が実現できていることになる。このように、本発明者等の完成したカイコの絹糸腺による糖蛋白質の生産方法によれば、たった１個または２個の遺伝子（βガラクトース転移酵素遺伝子のみ、または該遺伝子に加えてＮ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子）の導入で、糖鎖のヒト型化（糖鎖の伸長とα１，３フコース無し）が達成されるわけであり、絹糸腺を発現組織として使うメリットははかりしれないと考えられる。
【００５８】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
＜実施形態の概要＞
本実施形態によれば、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質の生産方法であって、昆虫の絹糸腺細胞において、糖蛋白質を発現させる工程を含む、糖蛋白質の生産方法が提供される。
【００５９】
この生産方法によれば、鱗翅目に分類される昆虫の絹糸腺細胞において、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質を効率よく発現させることができ、発現された糖蛋白質を効率よく抽出することができるので、糖鎖構造に特徴を有する糖蛋白質を、昆虫細胞を用いて、効率的に低コストで生産することができる。また、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質は、哺乳動物体内において低い抗原性を示すため、哺乳動物へ投与する目的において好ましい
【００６０】
＜糖蛋白質が抗体の場合＞
上述の糖蛋白質の生産方法において、上述の糖蛋白質は、糖鎖を有する抗体であることが好ましい。上述の糖蛋白質が糖鎖を有する抗体であれば、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する抗体であることによって、哺乳動物の体内におけるＡＤＣＣ活性が向上し、かつ抗原性が低減するという優れた効果が得られるからである。
【００６１】
ここで、本実施形態において、上述の抗体とは、外来抗原刺激の結果、免疫反応によって生体内に産生される蛋白質で、抗原と特異的に結合する活性を有するものであれば任意の抗体を用いることができる。抗体としては動物に抗原を免疫し、免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブリドーマ細胞が分泌する抗体のほか、遺伝子組換え技術により作製された抗体、すなわち、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、宿主細胞へ導入することにより取得された抗体などがあげられる。具体的には、ハイブリドーマが生産する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などをあげることができる。
【００６２】
ハイブリドーマとは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、マウス等に由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を産生する細胞を意味する。
【００６３】
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：以下、ＣＤＲと略記する）移植抗体などがあげられる。ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域（以下、重鎖はＨ鎖として、可変領域はＶ領域としてＨＶまたはＶＨとも称す）および抗体軽鎖可変領域（以下、軽鎖はＬ鎖としてＬＶまたはＶＬとも称す）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、定常領域はＣ領域としてＣＨとも称す）およびヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、ＣＬとも称す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
【００６４】
ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
【００６５】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体を意味する。ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりヒト型ＣＤＲ移植抗体を発現させ、製造することができる。ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
【００６６】
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体を意味するが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーならびにヒト抗体産生トランスジェニック動物あるいはヒト抗体産生トランスジェニック植物から得られる抗体等も含まれる。ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルス等を感染させ不死化、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養物中より該抗体を精製することができる。
【００６７】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
【００６８】
＜糖鎖の構造＞
上述の糖鎖は、糖鎖の結合様式により、アスパラギンと結合する糖鎖（Ｎ−グリコシド結合糖鎖という）ならびに、セリン、スレオニンなどと結合する糖鎖（０−グリコシド結合糖鎖という）の２種類に大別される。上述のＮ−グリコシド結合糖鎖は、様々な構造を有しているが［生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］、いずれの場合も下記に示す基本となる共通のコア構造を有することが好ましい。もっとも、この点は、上述の糖蛋白質が抗体ではない場合にも、同様である。
【００６９】
すなわち、上述の生産方法において、上述の糖蛋白質には、下記化学式（１）で示される糖鎖構造
【化８】
を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質が含まれることが好ましい。
【００７０】
一般に、哺乳動物、昆虫をはじめとする動物における糖蛋白質の糖鎖構造はこのような共通のコア構造を有することが知られているからである。すなわち、このような糖鎖構造を有していれば、哺乳動物の体内に投与した場合に、抗原性を低減できるからである。
【００７１】
そして、上記の構造において、アスパラギンと結合する糖鎖の末端を還元末端、反対側を非還元末端という。還元末端のＮ−アセチルグルコサミンへのフコースの結合としては、α１，３結合、α１，６結合などがあげられる。
【００７２】
Ｎ−グリコシド結合糖鎖には、コア構造の非還元末端にマンノースのみが結合するハイマンノース型、コア構造の非還元末端側にガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃと称す。）の枝を並行して１ないしは複数本有し、更にＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンなどの構造を有するコンプレックス型、コア構造の非還元末端側にハイマンノース型とコンプレックス型の両方の枝を持つハイブリッド型などがあげられる。
【００７３】
本実施形態では、上述の糖蛋白質には、下記化学式（２）、（３）または（４）で示される糖鎖構造
【化９】
【化１０】
【化１１】
を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質が含まれることが好ましい。
【００７４】
一般に、哺乳動物における糖蛋白質の糖鎖構造はこのような共通のコア構造を有することが知られているからである。すなわち、このような糖鎖構造を有していれば、哺乳動物の体内に投与した場合に、抗原性をさらに低減でき、また、糖蛋白質の安定性や生理活性などを、哺乳動物における糖蛋白質と同等にすることができるからである。
【００７５】
そして、上述の糖蛋白質のうち、化学式（２）、（３）または（４）で示される糖鎖構造を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質の割合が１０モル％以上であることが好ましく、２０モル％以上であることがより好ましく、３０モル％以上であることが特に好ましい。
【００７６】
化学式（２）、（３）または（４）で示される糖鎖構造を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質の割合が１０モル％以上、２０モル％以上、または３０モル％以上であれば、その糖蛋白質のＮ−グリコシド結合糖鎖は、通常の昆虫細胞によって生産される糖蛋白質のＮ−グリコシド結合糖鎖に比べて、著しくヒトをはじめとする哺乳動物の細胞で生産される糖蛋白質のＮ−グリコシド結合糖鎖の糖鎖構造に近似していることになり、かなりの程度いわゆる「糖鎖がヒト型化」された糖蛋白質であるということになる。そして、「糖鎖がヒト型化」された糖蛋白質であることによって、哺乳動物の体内に投与した場合に、抗原性をより低減でき、また、糖蛋白質の安定性や生理活性などを、哺乳動物における糖蛋白質と同等にすることができる。
【００７７】
本実施形態では、上述の糖鎖構造は、Ｎ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質のうち、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合している糖鎖構造を有する糖蛋白質の割合が５モル％以下である必要があり、３モル％以下であればより好ましく、１モル％以下であれば最も好ましい。なぜなら、このようにフコースが結合している糖鎖構造を有する糖蛋白質の割合が５モル％、３モル％または１モル％以下であれば、上述の糖蛋白質が抗体の場合には、哺乳動物の体内におけるＡＤＣＣ活性を向上することができ、上述の糖蛋白質が抗体であるか否かとは関係なく、哺乳動物の体内における抗原性を低減できるためである。
【００７８】
さらに、上述の糖蛋白質のうち、Ｎ−グリコシド結合糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにα−１，６フコースが結合している糖鎖構造を有する糖蛋白質の割合は、５モル％以下であることが好ましく、３モル％以下であればより好ましく、１モル％以下であれば最も好ましい。なぜなら、上述の糖蛋白質が糖鎖を有する抗体である場合に、この割合が５モル％、３モル％または１モル％以下であれば、その抗体が、哺乳動物細胞における通常の糖鎖構造を有する同種類の抗体に比べて、増強されたＡＤＣＣ活性を有することになるため、好ましいのである。
【００７９】
ここで、ＡＤＣＣ活性とは、腫瘍細胞等に結合した抗体が、抗体Ｆｃ領域とキラー細胞、ナチュラルキラー細胞、活性化されたマクロファージ等のエフェクター細胞表面上に存在するＦｃレセプターの結合を介してエフェクター細胞を活性化し、腫瘍細胞等を障害する活性を意味する［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｐｔｅｒ ２．１（１９９５）］。
【００８０】
さらに、上述の糖蛋白質のうち、Ｎ−グリコシド結合糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにα−１，３フコースが結合している糖鎖構造を有する糖蛋白質の割合は、５モル％以下であることが好ましく、３モル％以下であればより好ましく、１モル％以下であれば最も好ましい。なぜなら、この割合が５モル％、３モル％または１モル％以下であれば、昆虫細胞における通常の糖鎖構造を有する同種類の糖蛋白質に比べて、哺乳動物の生体内で低減された抗原性を有することになるからである。このような抗原性の低減は抗体以外の糖蛋白質の糖鎖構造についてもあてはまる。
【００８１】
そして、上述の絹糸腺細胞は、βガラクトース転移酵素を発現するように形質転換されていてもよい。そして、その場合には、上述の糖蛋白質には、下記化学式（５）、（６）または（７）で示される糖鎖構造
【化１２】
【化１３】
【化１４】
を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質が含まれることが好ましい。
【００８２】
一般に、哺乳動物における糖蛋白質の糖鎖構造の多くはこのような共通のコア構造を有することが知られているからである。すなわち、このような糖鎖構造を有していれば、哺乳動物の体内に投与した場合に、抗原性をさらに低減でき、また、糖蛋白質の安定性や生理活性などを、哺乳動物における糖蛋白質と同等にすることができるからである。
【００８３】
そして、上述の糖蛋白質のうち、化学式（５）、（６）または（７）で示される糖鎖構造を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質の割合が１モル％以上であることが好ましく、２モル％以上であることがより好ましく、５モル％以上であることが特に好ましい。
【００８４】
化学式（５）、（６）または（７）で示される糖鎖構造を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質の割合が１モル％以上、２モル％以上または５モル％以上であれば、その糖蛋白質のＮ−グリコシド結合糖鎖は、通常の昆虫細胞によって生産される糖蛋白質のＮ−グリコシド結合糖鎖に比べて、著しくヒトをはじめとする哺乳動物の細胞で生産される糖蛋白質のＮ−グリコシド結合糖鎖の糖鎖構造に近似していることになり、ほとんど完全にいわゆる「糖鎖がヒト型化」された糖蛋白質であるということになる。そして、「糖鎖がヒト型化」された糖蛋白質であることによって、哺乳動物の体内に投与した場合に、抗原性をより低減でき、また、糖蛋白質の安定性や生理活性などを、哺乳動物における糖蛋白質と同等にすることができる。
【００８５】
＜糖鎖の分析方法＞
上述の糖蛋白質が糖鎖を有する抗体（代表例としてＩｇＧ）である場合の糖鎖の分析方法について説明する。もっとも、上述の糖蛋白質が糖鎖を有する抗体ではない場合にも、基本的には同様の方法で糖鎖を分析することができる。
【００８６】
中性糖・アミノ糖組成分析
ＩｇＧ糖鎖は、上記で示したように、ガラクトース、マンノース、フコースなどの中性糖、Ｎ−アセチルグルコサミンなどのアミノ糖、シアル酸などの酸性糖から構成されている。抗体の糖鎖の組成分析は、トリフルオロ酢酸等で、糖鎖の酸加水分解を行うことにより、中性糖またはアミノ糖を遊離し、その組成比を分析することができる。具体的な方法として、Ｄｉｏｎｅｘ社製糖組成分析装置（ＢｉｏＬＣ）を用いる方法が挙げられる。ＢｉｏＬＣはＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｐｕｌｓｅｄ ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］によって糖組成を分析する装置である。
【００８７】
また、２−アミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができる。具体的には、公知の方法［アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ.Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），５５（１），２８３−２８４（１９９１）］に従って酸加水分解した試料を２−アミノピリジル化で蛍光ラベル化し、ＨＰＬＣ分析して組成比を算出することができる。
【００８８】
糖鎖構造解析
抗体の糖鎖の構造解析は、２次元糖鎖マップ法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）、生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］により行うことができる。２次元糖鎖マップ法は、例えば、Ｘ軸には逆相クロマトグラフィー糖鎖の保持時間または溶出位置を、Ｙ軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、それぞれプロットし、既知糖鎖のそれらの結果と比較することにより、糖鎖構造を推定する方法である。
【００８９】
具体的には、抗体をヒドラジン分解して、抗体から糖鎖を遊離し、２−アミノピリジン（以下、ＰＡと略記する）による糖鎖の蛍光標識［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），９５，１９７（１９８４）］を行った後、ゲルろ過により糖鎖を過剰のＰＡ化試薬などと分離し、逆相クロマトグラフィーを行う。次いで、分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。これらの結果をもとに、２次元糖鎖マップ上にプロットし、糖鎖スタンダード（ＴａＫａＲａ社製）、文献［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）］とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。さらに各糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなどの質量分析を行い、２次元糖鎖マップ法により推定される構造を確認することができる。
【００９０】
＜糖蛋白質の生産方法＞
本実施形態では、鱗翅目に分類される昆虫の絹糸腺細胞において、糖蛋白質を発現させる。なぜなら、後述する実施例で示したように、鱗翅目に分類される昆虫の絹糸腺細胞において、糖蛋白質を発現させると、従来の技術常識に反して、驚いたことに、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質が得られるからである。
【００９１】
その際、上述の昆虫は、カイコであることが好ましい。なぜなら、カイコの場合には、養蚕業において飼育方法が確立しており、さらに絹糸腺から繭をはき出す能力が優れているため、上述の糖蛋白質を大量に効率よく得ることができるからである。
【００９２】
より具体的には、本発明者等が所属するネオシルク社は、カイコが有する絹タンパク質の合成能力に着目し、絹タンパク質と共に大量の組換えタンパク質を繭中に分泌する形質転換カイコの開発を行ってきている。そして、カイコは、一頭あたり０．３〜０．５ｇの繭を作るが、このほとんどは、後部絹糸腺で合成されるフィブロインや、中部絹糸腺で合成されるセリシンなどの絹タンパク質である。このように、カイコは優れたタンパク質合成能力を有した生物であり、この能力を利用すれば、抗体医薬などの組換えタンパク質を大量に、かつ、安価に生産することができるからである。
【００９３】
さらに、上述の絹糸腺細胞は、中部絹糸腺細胞であることが好ましい。なぜなら、中部絹糸腺ではセリシンが合成されるため、セリシン中に上述の糖蛋白質を発現させれば、フィブロインの周りに存在し、比較的水に溶けやすいセリシン層に、組換えタンパク質を局在させるために、中部絹糸腺で効率良く組換えタンパク質を発現させることができ、繭に含まれる組換えタンパク質を、その立体構造を変性させることなく容易に抽出することが可能となるからである。
【００９４】
すなわち、本実施形態における糖蛋白質の生産方法は、上述の糖蛋白質を発現させる工程が、上述の糖蛋白質を発現するように遺伝的に改変されてなる上述の昆虫個体の絹糸腺において上述の糖蛋白質を含む繭を生成させる工程を含むことが好ましい。ここで、誤解を招かないように注記すれば、昆虫個体の絹糸腺において上述の糖蛋白質を含む繭を生成させるということは、必然的に、昆虫の絹糸腺細胞において上述の糖蛋白質を発現させることになるということに留意されたい。
【００９５】
そして、上述の糖蛋白質を抽出する工程は、上述の絹糸腺から前記糖蛋白質を含む繭を吐出させる工程と、上述の吐出された繭から上述の糖蛋白質を抽出する工程と、を含むことが好ましい。なぜなら、絹糸腺ではフィブロインまたはセリシンが合成されるため、フィブロインまたはセリシン中に上述の糖蛋白質を発現させれば、フィブロイン層またはセリシン層に、組換えタンパク質を局在させるために、絹糸腺で効率良く組換えタンパク質を発現させることができ、繭に含まれる組換えタンパク質を抽出することが可能となるからである。
【００９６】
その際、上述の糖蛋白質が、糖鎖を有する抗体である場合には、上述の糖蛋白質を発現させる工程が、上述の昆虫個体において、その抗体を構成する抗体重鎖および抗体軽鎖を共発現するように改変されてなる前記昆虫個体を用いる工程を含むことが好ましい。このようにすれば、抗体のＨ鎖およびＬ鎖の構造遺伝子が染色体に組み込まれており、Ｈ鎖２分子およびＬ鎖２分子がジスルフィド結合で連結され、かつ、抗原に対する結合活性を有する機能的な抗体分子（ヘテロ２量体）を繭に分泌するトランスジェニックカイコを用いて、完全な抗体分子であるヘテロ２量体を優先的に繭に分泌し、他の昆虫細胞で見られるようなＨ鎖２量体などの不完全な分子が無制御に分泌されることはない。その結果、繭にはＨ鎖２量体などの不完全な分子は含まれず、そのため、繭から完全な抗体分子であるヘテロ２量体を容易に回収することができるからである。
【００９７】
そして、上述の糖蛋白質を発現させる工程は、上述の昆虫個体において、上述の抗体重鎖をコードする遺伝子および上述の抗体軽鎖をコードする遺伝子がともに上述の昆虫のゲノムにおいてセリシンプロモーターの下流に発現可能に設けられている昆虫個体を用いる工程と、上述の繭として、セリシン部に上述の抗体を含む繭を生成させる工程と、を含むことが好ましい。そして、この場合には、上述の糖蛋白質を抽出する工程が、上述の繭を抽出液に浸して、上述の繭の上述のセリシン部から上述の抽出液中に上述の抗体を抽出する工程を含むことが好ましい。
【００９８】
なぜなら、繭を構成する絹糸は、中心に存在するフィブロイン層の周りにセリシン層が存在する構造をしている。絹タンパク質を合成している絹糸腺は、機能的および形態的に、後部絹糸腺、中部絹糸腺、および前部絹糸腺に区別されるが、セリシン層を構成するセリシンは中部絹糸腺で合成され、フィブロイン層を構成するフィブロインは後部絹糸腺で合成される。抗体を発現する組織が中部絹糸腺であった場合、抗体は絹糸のセリシン層へ分泌される。一方、抗体を発現する組織が後部絹糸腺であった場合、抗体は絹糸のフィブロイン層へ分泌される。
【００９９】
そして、セリシン層に抗体を分泌するトランスジェニックカイコを作製するためには、ベクターにおいて、中部絹糸腺で抗体のＨ鎖およびＬ鎖を発現させるために、抗体のＨ鎖およびＬ鎖の構造遺伝子に加えて、例えばそれぞれの構造遺伝子の上流に、中部絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーターを組めばよい。中部絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーターとしては、例えば、セリシン１遺伝子またはセリシン２遺伝子のプロモーターをあげることができる。
【０１００】
このような発現ベクターを用いると、一回の遺伝子導入操作で、セリシン層に抗体を分泌するトランスジェニックカイコを作製することができる。一方、セリシン層に抗体を分泌するトランスジェニックカイコは複数回の遺伝子導入操作によって作製することもできる。例えば、上述の発現ベクターセットを用いて、抗体のＨ鎖を中部絹糸腺で発現するカイコと、抗体のＬ鎖を中部絹糸腺で発現するカイコとを、それぞれ別々に作製し、これらを交配して、次世代のカイコから抗体のＨ鎖およびＬ鎖の両方の遺伝子を有するカイコを選抜してセリシン層に抗体を分泌するトランスジェニックカイコを作製しても良い。
【０１０１】
また、抗体のＨ鎖を発現するカイコに抗体のＬ鎖を発現させるための発現ベクターを導入する、あるいは、抗体のＬ鎖を発現するカイコに抗体のＨ鎖を発現させるための発現ベクターを導入することによって、セリシン層に抗体を分泌するトランスジェニックカイコを作製しても良い。
【０１０２】
もっとも、フィブロイン層に抗体を分泌するトランスジェニックカイコを作製するという方法を排除する趣旨ではない。後部絹糸腺で抗体のＨ鎖およびＬ鎖を発現させるために、抗体のＨ鎖およびＬ鎖の構造遺伝子に加えて、それぞれの構造遺伝子の上流に、例えば後部絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーターが組み込まれているベクターを用いてフィブロイン層に抗体を分泌するトランスジェニックカイコを作製してもかまわない。後部絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーターとしては、例えば、フィブロインＬ鎖、フィブロインＨ鎖、またはフィブロヘキサメリンなどの遺伝子のプロモーターをあげることができる。
【０１０３】
セリシン層に抗体を分泌するトランスジェニックカイコを作製する場合と同様に、フィブロイン層に抗体を分泌するトランスジェニックカイコを作製する場合においても、上述の発現ベクターセットを用いて、複数回の遺伝子導入操作によりトランスジェニックカイコを作製しても良い。抗体のＨ鎖を後部絹糸腺で発現するカイコと、抗体のＬ鎖を後部絹糸腺で発現するカイコとを、それぞれ別々に作製し、これらを交配して、次世代カイコから抗体のＨ鎖およびＬ鎖の両方の遺伝子を有するカイコを選抜してフィブロイン層に抗体を分泌するトランスジェニックカイコを作製しても良い。また、抗体のＨ鎖を発現するカイコに抗体のＬ鎖を発現させるための発現ベクターを導入する、あるいは、抗体のＬ鎖を発現するカイコに抗体のＨ鎖を発現させるための発現ベクターを導入することによって、フィブロイン層に抗体を分泌するトランスジェニックカイコを作製することもできる。
【０１０４】
これらの発現ベクターは、カイコ染色体へ遺伝子を導入するための機能を有している。例えば、昆虫由来のＤＮＡ型トランスポゾンの部分配列が組み込まれていれば、遺伝子をカイコ染色体に導入することが可能である。具体的には、ＤＮＡ型トランスポゾンの末端に存在する一対の逆向き反復配列を有したプラスミドベクターであり、一対の逆向き反復配列に挟まれた領域に、染色体に挿入される遺伝子配列、すなわち、抗体の遺伝子とプロモーターが組み込まれている発現ベクターである。昆虫由来ＤＮＡ型トランスポゾンとしては、ｐｉｇｇｙＢａｃ、ｍａｒｉｎｅｒ（Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ９， １４５−１５５， ２０００）、およびＭｉｎｏｓ（Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ９， ２７７−２８１， ２０００）などが知られているが、この中でもｐｉｇｇｙＢａｃ由来の配列は、最も頻繁に利用されている。トランスジェニックカイコを作製するためには、このプラスミドを、ｐｉｇｇｙＢａｃのトランスポゼース発現ベクター（ヘルパープラスミド）と共にカイコ卵へ微量注入する。このヘルパープラスミドは、ｐｉｇｇｙＢａｃの逆向き反復配列の片方または両方を欠いた、実質的にはｐｉｇｇｙＢａｃのトランスポゼース遺伝子領域のみが組み込まれている組換えプラスミドベクターである。ヘルパープラスミドにおいて、トランスポゼースを発現させるためのプロモーターは、内在性のトランスポゼースプロモーターをそのまま利用しても良いし、あるいは、カイコ・アクチンプロモーターやショウジョウバエＨＳＰ７０プロモーター等を利用してもよい。次世代カイコのスクリーニングを容易にするために、挿入するポリヌクレオチドを組み込んだベクター内に同時にマーカー遺伝子を組み込んでおくこともできる。
【０１０５】
ベクターを微量注入したカイコ卵から孵化した幼虫（Ｆ０世代）を飼育する。得られた全Ｆ０世代のカイコを野生型カイコと、あるいはＦ０カイコ同士で交配し、次世代（Ｆ１世代）のカイコからトランスジェニックカイコを選抜する。トランスジェニックカイコの選抜は、例えばＰＣＲ法やサザンブロット法を用いて行う。また、マーカー遺伝子を組み込んだ場合には、その表現形質を利用して選抜することも可能である。例えばマーカー遺伝子としてＧＦＰ等の蛍光タンパク質遺伝子を利用した場合には、Ｆ１世代のカイコ卵や幼虫に励起光を照射し、蛍光タンパク質の発する蛍光を検出することにより行うことができる。以上のような方法によりトランスジェニックカイコを作出することができる。
【０１０６】
トランスジェニックカイコの繭から、機能的な抗体分子を回収する際には、抗体がセリシン層に局在する場合はセリシン層から、フィブロイン層に含まれている場合はフィブロイン層から回収する。セリシン層からの抗体の回収は、特に容易に実施することができる。セリシン層を構成するセリシンは親水性であるため、この層に局在する組換えタンパク質は、タンパク質を変性させてしまう溶液を用いることなく抽出することが可能である。セリシン層から抗体を抽出するための抽出液は、抗体の抽出が可能であるものならば特段の制限はない。例えば、中性の塩類溶液であっても良いし、界面活性剤や、その他、抽出を効率的に行うための試薬などが含まれる溶液であっても良い。これらの抽出液を使って繭から抗体を抽出するには、例えば、断片化した繭を抽出液に浸し攪拌するなどの方法を用いることができる。また、抽出の前に、繭を微粉末化する処理を行っても良いし、抽出の際に超音波処理を行うなどの機械的処理を併用しても良い。
【０１０７】
また、上述のカイコの絹糸腺細胞は、βガラクトース転移酵素を発現するように形質転換されていてもよい。上述の絹糸腺細胞がβガラクトース転移酵素を発現するように形質転換されていれば、カイコ個体に内在している絹糸腺、カイコ個体より摘出した絹糸腺組織、またはカイコ個体より摘出した絹糸腺組織より得られる絹糸腺細胞も、同様にβガラクトース転移酵素を発現する。そして、その酵素の働きによって、Ｎ−グリコシド結合糖鎖の非還元末端にさらにβガラクトースが付加されて、上述の化学式（５）、（６）または（７）で示される糖鎖構造を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質が生産される。
【０１０８】
そして、その糖蛋白質のＮ−グリコシド結合糖鎖は、通常の昆虫細胞によって生産される糖蛋白質のＮ−グリコシド結合糖鎖に比べて、著しくヒトをはじめとする哺乳動物の細胞で生産される糖蛋白質のＮ−グリコシド結合糖鎖の糖鎖構造に近似していることになり、ほとんど完全にいわゆる「糖鎖がヒト型化」された糖蛋白質であるということになる。そして、「糖鎖がヒト型化」された糖蛋白質であることによって、哺乳動物の体内に投与した場合に、抗原性をより低減でき、また、糖蛋白質の安定性や生理活性などを、哺乳動物における糖蛋白質と同等にすることができる。
【０１０９】
このとき、上記の絹糸腺細胞が、さらにＮ−アセチルグルコサミン転移酵素を発現するように形質転換されていてもよい。このようにすれば、Ｎ−グリコシド結合糖鎖の非還元末端にさらにＮ−アセチルグルコサミンが付加されて、上述の化学式（２）、（３）または（４）で示される糖鎖構造を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質の生産が増大されることになる。そして、その結果、上述の化学式（２）、（３）または（４）で示される糖鎖構造の非還元末端に、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素とともに発現されているβガラクトース転移酵素の働きによって、さらにβガラクトースが付加されて、上述の化学式（５）、（６）または（７）で示される糖鎖構造を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質の生産がさらに増大されることになる。
【０１１０】
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【０１１１】
なお、上記実施の形態では昆虫の絹糸腺細胞において、糖蛋白質を発現させるという表現を用いたが、この表現は細胞レベルでの発現、組織レベルでの発現および個体レベルでの発現を含む趣旨の表現であることに留意されたい。
【０１１２】
念のために説明すれば、例えば、細胞レベルでの発現をする際には、バイオリアクターなどで絹糸腺細胞を培養すればよい。組織レベルでの発現をする際には絹糸腺組織を培養すればよい。一方、個体レベルでの発現をする際には、鱗翅目に分類される昆虫個体の絹糸腺において、糖蛋白質を発現させて、繭の中に糖蛋白質を含有させて個体外に吐出させればよい。このようにすれば、細胞レベルで生産する場合にくらべて、養蚕業において培われた技術をそのまま適用することができ、バイオリアクターなどの設備投資が不要となる利点がある。
【０１１３】
また、上述の実施形態では、特にカイコの系統を特定せず、どのようなカイコを用いてもよいが、種々のカイコの中でも、ｐｎｄ−ｗ１系統、錦秋のような実用品種系統全般のカイコの細胞を用いることが特に好ましい。なぜなら、ｐｎｄ−ｗ１系統、錦秋のような実用品種系統全般のカイコの細胞を用いる場合には、Ｎ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質のうち、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合している糖鎖構造を有する糖蛋白質の割合が５モル％以下となることが、後述の実施例において実験データによって実証されているからである。
【実施例】
【０１１４】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【０１１５】
＜実施例１＞
抗体Ｈ鎖および抗体Ｌ鎖のｃＤＮＡのクローニング
ヒトＩｇＧを抗原とするＩｇＧ抗体を産生するマウスハイブリドーマからｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素とｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを用いてｃＤＮＡを合成した。抗体Ｈ鎖および抗体Ｌ鎖それぞれのＯＲＦをコードするｃＤＮＡを、合成したｃＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲによって取得した。
【０１１６】
抗体Ｈ鎖のｃＤＮＡを増幅するために用いたプライマーの配列は、５’−ＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＴＧＧＧＴＧＴＧＧＡＣ−３’（配列番号：１）および５’−ＧＡＴＡＴＣＴＴＡＴＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡ−３’（配列番号：２）であり、抗体Ｌ鎖のｃＤＮＡを増幅するための用いたプライマーの配列は、５’−ＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＴＣＴＣＡＧＣＴＣ−３’（配列番号：３）および５’−ＧＡＴＡＴＣＴＴＡＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号：４）である。
【０１１７】
それぞれのプライマーの５’−側両端にはＥｃｏＲＶ制限酵素サイト認識配列が付加されている。得られたＰＣＲ産物をクローニングベクターｐＣＲ４ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ＤＮＡシークエンサーにより塩基配列を解析し、該ＰＣＲ産物が抗体Ｈ鎖および抗体Ｌ鎖をコードするｃＤＮＡであることを確認した。抗体Ｈ鎖および抗体Ｌ鎖ｃＤＮＡを含有するベクターを、以下、それぞれＩｇＧ（Ｈ）／ｐＣＲ４、ＩｇＧ（Ｌ）／ｐＣＲ４と表記する。
【０１１８】
＜実施例２＞
トランスジェニックカイコ作製用ベクターの構築
５’末端がリン酸化されたオリゴヌクレオチド５’−ＡＡＴＴＣＣＴＴＡＡＧＣＴＣＧＡＧＴＣＧＣＧＡ−３’（配列番号：５）と５’−ＡＡＴＴＴＣＧＣＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴＴＡＡＧＧ−３’（配列番号：６）をアニーリングさせた２本鎖オリゴヌクレオチドを作製した。
【０１１９】
この２本鎖オリゴヌクレオチドは、ＡｆｌＩＩ、ＸｈｏＩ、ＮｒｕＩの制限酵素認識配列を有し、両末端はＥｃｏＲＩサイトに連結可能な構造をしている。マーカー遺伝子として眼や神経系で発現する赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）遺伝子を有するｐｉｇｇｙＢａｃベクターであるｐＢａｃ［３ｘＰ３−ＤｓＲｅｄ／ｐＡ］（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１，５２−５６（２００３））のＥｃｏＲＩサイトに、この２本鎖オリゴヌクレオチドを挿入し、ｐＢａｃ［３ｘＰ３−ＤｓＲｅｄ／ｐＡ］ベクターにＡｆｌＩＩ、ＸｈｏＩ、ＮｒｕＩの制限酵素認識配列を挿入した。
【０１２０】
さらに、特開２００６−１０９７７２号公報の実施例１に記載されている「ｈｒ３とセリシン１プロモーターの下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するベクター」をテンプレートとしたＰＣＲによって、ｈｒ３とセリシン１プロモーターからなり、かつ両末端にＸｈｏＩサイトを有したＤＮＡ断片を増幅した。用いたプライマーは、５’−ＣＴＣＧＡＧＧＡＴＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＣ−３’（配列番号：７）および５’−ＣＴＣＧＡＧＣＣＣＧＡＴＧＡＴＡＡＧＡＣＧＡＣＴＡＴＧ−３’（配列番号：８）である。
【０１２１】
増幅したＤＮＡ断片をＸｈｏＩで消化した後、上記のＡｆｌＩＩ、ＸｈｏＩ、ＮｒｕＩの制限酵素認識配列を挿入したｐＢａｃ［３ｘＰ３−ＤｓＲｅｄ／ｐＡ］ベクターのＸｈｏＩサイトに挿入した。これをｐＭＳＧ１．１Ｒと表記する。このベクターのマーカー遺伝子であるＤｓＲｅｄ遺伝子を、緑色蛍光タンパクＭｏｎｓｔｅｒ ＧｒｅｅｎＧＦＰ（ｈＭＧＦＰ）の遺伝子に置き換えたものも作製した。これをｐＭＳＧ１．１ＭＧと表記する。
【０１２２】
実施例１で得られたＩｇＧ（Ｈ）／ｐＣＲ４、および、ＩｇＧ（Ｌ）／ｐＣＲ４ベクターから、抗体Ｈ鎖、およびＬ鎖のｃＤＮＡ断片をＥｃｏＲＶで切り出し、上記のｐＭＳＧ１．１Ｒ、およびｐＭＳＧ１．１ＭＧにそれぞれ挿入し、抗体Ｈ鎖、および抗体Ｌ鎖をそれぞれ発現するベクターＩｇＧ（Ｈ）／ｐＭＳＧ１．１Ｒ、およびＩｇＧ（Ｌ）／ｐＭＳＧ１．１ＭＧを構築した（図１）。なお、この図１では、それぞれの略語の意味は、ｐｉｇｇｙＢａｃＲ：ｐｉｇｇｙＢａｃ ３’末端側配列、３ｘＰ３−ＴＡＴＡ：眼や神経系で発現を引き起こすプロモーター、ＤｓＲｅｄ：赤色蛍光タンパク質遺伝子、ｈＭＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質（Ｍｏｎｓｔｅｒ ＧｒｅｅｎＧＦＰ）の遺伝子、ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ：ＳＶ４０由来ポリＡ付加シグナル、Ｐｓｅｒ１：カイコセリシン１遺伝子プロモーター、ＨＲ３：ＢｍＮＰ ｈｒ３、ＩｇＧ（Ｈ）：マウスＩｇＧ抗体Ｈ鎖遺伝子、ＩｇＧ（Ｌ）：マウスＩｇＧ抗体Ｌ鎖遺伝子、ＦｉｂＬ ｐｏｌｙＡ；カイコフィブロインＬ鎖ポリＡ付加シグナル、ｐｉｇｇｙＢａｃＬ：ｐｉｇｇｙＢａｃ ５’末端側配列、Ａｍｐ：抗生物質アンピシリン耐性遺伝子の通りである。
【０１２３】
＜実施例３＞
抗体Ｈ鎖、抗体Ｌ鎖をセリシン層に分泌するトランスジェニックカイコの作出
ＩｇＧ（Ｈ）／ｐＭＳＧ１．１Ｒを塩化セシウム超遠心法で精製した後、それぞれをヘルパープラスミドであるｐＨＡ３ＰＩＧ（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，８１−８４（２０００））とプラスミド量が１：１になるように混合し、さらにエタノール沈殿を行った後、ＩｇＧ（Ｈ）／ｐＭＳＧ１．１ＲとｐＨＡ３ＰＩＧの濃度がそれぞれ２００μｇ／ｍｌになるようにインジェクションバッファー（０．５ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０，５ｍＭ ＫＣｌ）に溶解した。このＩｇＧ（Ｈ）／ｐＭＳＧ１．１Ｒを含むＤＮＡ溶液を、産卵後２〜８時間の前胚盤葉期のカイコ卵（カイコ胚）に、一つの卵あたり約１５〜２０ｎｌの液量で微量注入した。合計２８５４個の卵に微量注入した。上記の操作を、ＩｇＧ（Ｌ）／ｐＭＳＧ１．１ＭＧについても同様の操作を行い、合計３１５４個の卵に微量注入した。
【０１２４】
ベクターＤＮＡ（ＩｇＧ（Ｈ）／ｐＭＳＧ１．１Ｒ、およびＩｇＧ（Ｌ）／ｐＭＳＧ１．１ＭＧ）を微量注入した卵を２５℃でインキュベートしたところ、それぞれ５１６、および６７８個の卵が孵化した。孵化したカイコの飼育を続け、得られた生殖可能な成虫を交配し、それぞれ１３８、および、１３２グループのＦ１卵塊を得た。産卵日から５〜６日目のＦ１卵塊を蛍光実体顕微鏡で観察することにより、眼や神経系から赤色、または緑色蛍光を発するトランスジェニックカイコの卵をスクリーニングした。その結果、トランスジェニックカイコの卵を含む卵塊を、それぞれ１１、および１５グループ得ることができた。得られた卵塊を孵化させ飼育したところ、それぞれ９、および８グループの卵塊に由来するトランスジェニックカイコは、正常に繭を作り蛹となり、さらに羽化して生殖能力を有した成虫になった。そこで、野生型のカイコと交配して、トランスジェニック系統を樹立した。
【０１２５】
＜実施例４＞
抗体Ｈ鎖およびＬ鎖を共発現するトランスジェニックカイコの作出
実施例３で得られた抗体Ｈ鎖と抗体Ｌ鎖のｃＤＮＡをゲノム中に持ったトランスジェニックカイコ成虫を交配し、Ｈ鎖とＬ鎖を共に発現するカイコを作製した。実施例３で得られた２種のカイコのうち任意の一系統ずつを交配し、産卵された卵を飼育した。４齢期に至った段階で、目で発現するマーカー遺伝子の蛍光色（Ｈ鎖−ＤｓＲｅｄの赤色蛍光、Ｌ鎖−ｈＭＧＦＰの緑色蛍光）を観察し、Ｈ鎖およびＬ鎖両方を発現するカイコ（赤色と緑色蛍光が合わさって黄色の蛍光を発する）を選別した。
【０１２６】
得られたＨ鎖およびＬ鎖を発現するカイコを、特開２００６−１０９７７２号公報に記載の“バキュロウイルスＩＥ１を発現するポリヌクレオチドが組み込まれているトランスジェニックカイコ”と交配し、次世代のカイコから、Ｈ鎖、Ｌ鎖、およびＩＥ１の３つの遺伝子を発現するカイコを選別した。このカイコを２５℃で飼育し、繭を作らせた。
【０１２７】
＜実施例５＞
抗体の抽出および精製
繭１ｇをホモジナイザーで粉砕した後、１００ｍｌの３Ｍ 尿素、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０に懸濁し、４℃において２４時間インキュベートした。遠心により繭断片を取り除き、抗体を含む抽出液を回収した。この抽出液を、２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０に対して透析した後、プロテインＧカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライした。カラムを２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０にて洗浄し、吸着した抗体を０．１Ｍグリシン塩酸ｐＨ２．７により溶出した。最後に、溶出液に１Ｍトリスを加えて中和した。以上の操作により、２．４ｍｇの精製抗体を得た。
【０１２８】
＜実施例６＞
抗体に付加された糖鎖の構造解析
本発明者等は、カイコで発現させたマウスＩｇＧ上に付加された糖鎖のピリジルアミノ化するために、カイコで発現させたマウスＩｇＧ（１．２ｍｇ）を下記のプロトコルからなる定法に従って、糖鎖の切り出し、糖鎖の蛍光標識を行った。
【０１２９】
カイコで発現させたマウスＩｇＧからのピリジルアミノ化糖鎖の調製法を説明するための実験プロトコルは以下のとおりである。
Mouse IgG
↓Lyophilization
↓ Hydrazinolysis (100°C, 10h)
↓ N-Acetylation
↓ Pyridylamination
↓Phenol/Chloroform Extraction
↓RP-cartridge
PA-oligosaccharides
【０１３０】
なお、今回、糖タンパク質から糖鎖を切り出す際にヒドラジン分解を用いているが、この方法は酵素による切り出しと異なり、糖鎖やタンパク質の構造に関係なく糖鎖を切り出すことが可能であること、切り出し反応が定量的であることなどの利点がある。
【０１３１】
また糖鎖の蛍光標識に用いたピリジルアミノ化法であるが、どのような糖鎖の還元末端に対してもピリジルアミノ基を導入することが可能であり、その反応が定量的であること、ピリジルアミノ化糖鎖（ＰＡ糖鎖）は非常に高感度に検出することが可能であること、定量性に優れていること、逆相ＨＰＬＣでの分離がよいこと、ピリジルアミノ基が糖鎖構造解析を行う際に用いられる酸水解やスミス分解、メタノリシス、アセトリシスといった化学反応で脱離しないこと、質量分析器のような分析機器と非常に相性がよいことなどの利点が挙げられる。
【０１３２】
具体的には、精製した抗体１．２ｍｇを凍結乾燥し、無水ヒドラジンを加えて、１００℃にて１０時間処理した。次に、定法に従い、ヒドラジン分解により切り出した糖鎖の還元末端をＮ−アセチル化し、さらに、還元末端をピリジルアミノ化（ＰＡ化）した。
【０１３３】
次いで、カイコで発現させたマウスＩｇＧ上の糖鎖の質量分析を行うために、上記のようにして得られたＰＡ糖鎖を質量分析装置で分析した（図２）。その結果、図２に示すように、ハイマンノース型糖鎖であるＭ５やＭ６が検出された。また非還元末端にガラクトースを持たない糖鎖も検出された。
【０１３４】
続いて、カイコで発現させたマウスＩｇＧ上の糖鎖の糖鎖構造解析を行うために、上述のようにして得られたＰＡ糖鎖について、下記に示す手順でさらに構造解析をおこなった。
【０１３５】
上述のようにして得られたピリジルアミノ化糖鎖の構造解析の手順を説明するための実験プロトコルは以下の通りである。
PA-oligosaccharides
↓ Mono-Q HPLC
↓ Size-fractionation HPLC
↓ Reversed-phase HPLC
↓MALDI-TOF-MS
【０１３６】
具体的には、まず、カイコで発現させたマウスＩｇＧから調製されたＰＡ糖鎖のＭｏｎｏ−Ｑ ＨＰＬＣによる分離を行った。得られたＰＡ糖鎖を陰イオン交換ＨＰＬＣ（Ｍｏｎｏ−Ｑ ＨＰＬＣ）で分離した結果を図３に示す。図３における矢印は中性糖（Ｎ）、シアル酸が１つ結合している糖鎖（Ｓ１）、シアル酸が２つ結合している糖鎖（Ｓ２）、シアル酸が３つ結合している糖鎖（Ｓ３）、シアル酸が４つ結合している糖鎖（Ｓ４）の溶出位置を示している。ピークは中性糖部分にのみに検出されたことからその部分を分取し、次の実験をおこなった。
【０１３７】
次いで、カイコで発現させたマウスＩｇＧから調製されたＰＡ糖鎖のＳｉｚｅ−ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ＨＰＬＣによる分離を行った。得られた中性糖画分をサイズ分画ＨＰＬＣ（Ｓｉｚｅ−ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ＨＰＬＣ）で分離した結果を図４に示す。図４における矢印はＧＮがＮ−アセチルグルコサミン−ＰＡの溶出位置を示し、Ｍはハイマンノース糖鎖の溶出位置を示している。分析の結果、９種類のピークが得られ、それぞれを分取し、濃縮後、それぞれを使って次の実験をおこなった。
【０１３８】
続いて、カイコで発現させたマウスＩｇＧから調製されたＰＡ糖鎖のＲｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ ＨＰＬＣによる分離を行った。サイズ分画ＨＰＬＣで得られた９つの画分を逆相ＨＰＬＣ（Ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ ＨＰＬＣ）で分離した結果を図５に示す。それぞれの画分を質量分析で分析した結果を図５の右側に示している。６つのメジャーなピークが検出されたので、それぞれを分取し、二次元糖鎖マップ、質量分析器を使って構造解析をおこなった。
【０１３９】
カイコで発現させたマウスＩｇＧから調製されたＰＡ糖鎖の構造として、今回決定した糖鎖の構造をまとめた結果を図６に示す。図６におけるＦｒａｃｔｉｏｎ Ｎｏ．は図５の対応するＦｒａｃｔｉｏｎを示しており、図中の括弧内の数値は、Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｎｏ．３からＮｏ．８までに含まれる糖鎖のモル数と、合計モル数（７９２ｐｍｏｌ）に対する、各Ｆｒａｃｔｉｏｎ中の糖鎖モル数を百分率（％）で表示したものである。糖鎖分析に用いた、カイコで発現させたマウスＩｇＧの１．２ｍｇ（８，０００ｐｍｏｌ）には、糖鎖が１６，０００ｐｍｏｌ含まれると推定される。Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｎｏ．３からＮｏ．８までに含まれる糖鎖のモル数の合計は７９２ｐｍｏｌモルであり、糖鎖の回収率は５％であった。
【０１４０】
図６に示したように、カイコ中部絹糸腺で発現させ、繭糸のセリシン層に分泌された抗体（マウスＩｇＧ）には糖鎖が付加されており、その糖鎖の構造については、主なもので６種類が存在する。この６種類の糖鎖のいずれにおいても、糖鎖の基部に存在するＧｌｃＮＡｃの６位に付加されたフコース（α１，６フコース）、およびＧｌｃＮＡｃの３位に付加されたフコース（α１，３フコース）の存在を認めることができなかった。このように、カイコ中部絹糸腺で発現した抗体に付加された糖鎖は、そのほとんどがフコシル化をうけていないことが明らかになった。検出された糖鎖の内、最も少ない量の糖鎖の割合が、２．７モル％であることから、フコシル化を受けた糖鎖の割合は、５モル％以下であると推定した。
【０１４１】
また、従来の知見において昆虫由来の糖鎖の特徴といわれていたパウチマンノース型（少マンノース型）糖鎖は検出されず、かわりに、高マンノース型および、トリマンノシルコア構造（パウチマンノース）の１−３結合マンノース及び１−６結合マンノースにＧｌｃＮＡｃが１個または２個β１−２結合し、かつＧａｌが結合していない二分岐型の構造を持った糖鎖が多く検出された。
【０１４２】
＜実施例７＞
ｐｎｄ−ｗ１系統および実用品種系統（錦秋）におけるカイコ組織（中部絹糸腺、脂肪体）および繭の糖鎖構造解析
実施例６で得られた結果の理由について、Ａ）カイコ品種に起因するもの、Ｂ）カイコ組織に起因するもの、および、Ｃ）発現させたタンパク質に起因するもの、の３つの理由が考えられた。これらについて検証するために、ｐｎｄ−ｗ１系統と実用品種系統（錦秋）の２種類のカイコ系統について、中部絹糸腺、脂肪体の２種類の組織と繭について、前記した方法に従い、糖鎖構造解析を行った。糖鎖構造解析の結果を図８-図１３に示す。なお、図８-図１３の中の％表記の数値は、逆相ＨＰＬＣで分取したメジャーなピークの総糖鎖モル数より計算された存在比を百分率（％）で表示したものである。また、高マンノース型である、構造名Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９等の構造表記は構造異性体を含む。
【０１４３】
ｐｎｄ−ｗ１系統の中部絹糸腺から得られた糖鎖は、繭から精製したマウスＩｇＧの糖鎖と同様な構造をしていた。すなわち、昆虫由来の糖鎖構造でもっとも多いとされているパウチマンノース型（Ｍ３）が約６％と非常に少なく、Ｍ３にＧｌｃＮＡｃが少なくとも１つ付加した糖鎖が約４０％検出された。この内、ＧｌｃＮＡｃが２つ付加した糖鎖（ＧＮ２）は、２３％も存在していた。また一部に高マンノース型の構造も含まれていた（図８）。一方脂肪体では、ＧｌｃＮＡｃ付加がなく、Ｍ３およびＦＭ２なる構造が非常に多いという点で、中部絹糸腺と大きく異なっていた（図１２）。脂肪体で見られた糖鎖の構造は、従来から知られている昆虫の糖鎖構造と一致している。ｐｎｄ−ｗ１系統の繭では、中部絹糸腺と同様に、Ｍ３が少なく、ＧｌｃＮＡｃが２つ付加した構造（ＧＮ２）が約４０％と非常に多かった（図１０）。錦秋についても同様な解析を行ったが、ｐｎｄ−ｗ１と比較して、組織、繭ともに、糖鎖構造で大きな違いはなく品種の違いによる差異は見られなかった（図９、図１１、図１３）。
【０１４４】
以上のことより、繭から精製したマウスＩｇＧの糖鎖構造が、従来から報告されていた昆虫特有の糖鎖構造と異なる理由は、マウスＩｇＧを合成した組織（絹糸腺）の特異性に起因することが明らかになった。
【０１４５】
バキュロウイルス発現系では、ウイルスを脂肪体へ感染させて組換えタンパク質を発現させるのに対し、発明者らの技術は組換えタンパク質を発現させるための組織として中部絹糸腺を用いる。この中部絹糸腺での発現が、フコースの付加が無く、かつパウチマンノースが少ない糖鎖を、タンパク質に付加させることがわかった。これは、組換えタンパク質を中部絹糸腺で産生することが、ヒト型（哺乳動物型）糖鎖付加を目指す場合において非常に有利であることを意味している。
【０１４６】
＜実施例８＞
β１，４ガラクトース転移酵素１とヒトβ１，２Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素２を発現するトランスジェニックカイコの作製
ヒトβ１，４ガラクトース転移酵素１（以下、ｈＧａｌＴ１と表記する）、およびヒトβ１，２Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素２（以下、ｈＧｎＴ２と表記する）のｃＤＮＡのクローニングを行った。
【０１４７】
ヒト線維芽細胞からｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素とｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを用いてｃＤＮＡを合成した。ｈＧａｌＴ１および、ｈＧｎＴ２それぞれのＯＲＦをコードするｃＤＮＡを、合成したｃＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲによって取得した。
【０１４８】
ｈＧａｌＴ１のｃＤＮＡを増幅するために用いたプライマーの配列は、５’−ＡＴＧＡＧＧＣＴＴＣＧＧＧＡＧＣＣＧＣＴ−３’（配列番号：９）および５’−ＣＴＡＧＣＴＣＧＧＴＧＴＣＣＣＧＡＴＧＴＣＣＡ−３’（配列番号：１０）であり、ｈＧｎＴ２のｃＤＮＡを増幅するための用いたプライマーの配列は、５’−ＡＴＧＡＧＧＴＴＣＣＧＣＡＴＣＴＡＣＡＡＡ−３’（配列番号：１１）および５’−ＴＣＡＣＴＧＣＡＧＴＣＴＴＣＴＡＴＡＡＣＴＴＴＴＡＣＡＧＡＧ−３’（配列番号：１２）である。
【０１４９】
得られたＰＣＲ産物をクローニングベクターｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ２−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ＤＮＡシークエンサーにより塩基配列を解析し、該ＰＣＲ産物がｈＧａｌＴ１およびｈＧｎＴ２をコードするｃＤＮＡであることを確認した。ｈＧａｌＴ１およびｈＧｎＴ２ｃＤＮＡを含有するベクターを、以下、それぞれｈＧａｌＴ１／ｐＣＲ２、ｈＧｎＴ２／ｐＣＲ２と表記する。
【０１５０】
実施例２に記載したｐＭＳＧ１．１Ｒは、セリシンプロモーターとフィブロインＬ鎖ｐｏｌｙＡ付加配列（以下、プロモーター−ｐｏｌｙＡカセットと表記する）を持ち、その間に目的タンパク質のｃＤＮＡを導入できるよう設計されている。本実験では、２つの遺伝子を同時に発現させるために、ｐＭＳＧ１．１Ｒの制限酵素ＡｓｃＩサイトに、さらにプロモーター−ｐｏｌｙＡカセットを組み込み、新たなベクター（ｐＭＳＧ３．１Ｒ）を構築した。
【０１５１】
ｈＧａｌＴ１およびｈＧｎＴ２の翻訳効率を上げるため、カイコガ核多角体病ウイルス（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ：以下、ＢｍＮＰＶと表記）由来のポリヘドリン５’非翻訳領域（以下、５’ＵＴＲと表記、配列：ＡＡＧＴＡＴＴＴＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＧＴＡＡＣＡＧＴＴＴＴＧＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＴ（配列番号：１３））を、ｈＧａｌＴ１およびｈＧｎＴ２のｃＤＮＡの５’側に付加し、さらに、ｃＤＮＡの５’および３’の両端にＮｒｕＩの制限酵認識配列を付加するために、以下に記載したプライマーを用いたＰＣＲを行った。
【０１５２】
プライマーの配列は、ｈＧａｌＴ１用に、５’−ＣＡＣＣＴＣＧＣＧＡＡＡＧＴＡＴＴＴＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＧＴＡＡＣＡＧＴＴＴＴＧＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＴＡＴＧＡＡＧＴＴＴＣＧＧＧＡＧＣＣＧＣＴＣ−３’（配列番号：１４）と、５’−ＴＣＧＣＧＡＴＴＡＧＣＴＣＧＧＣＧＴＣＣＣＧＡＴＧＴＣ−３’（配列番号：１５）の２種、ｈＧｎＴ２用に、５’−ＣＡＣＣＴＣＧＣＧＡＡＡＧＴＡＴＴＴＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＧＴＡＡＣＡＧＴＴＴＴＧＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＴＡＴＧＡＧＧＴＴＣＣＧＣＡＴＣＴＡＣＡ−３’（配列番号：１６）と、５’−ＴＣＧＣＧＡＴＴＡＣＴＧＣＡＧＴＣＴＴＣＴＡＴＡＡＣＴＴＴＴＡＣＡＧＡＧＴ−３’（配列番号：１７）の２種である。
【０１５３】
ｈＧａｌＴ１／ｐＣＲ２、ｈＧｎＴ２／ｐＣＲ２をテンプレートとして、それぞれＰＣＲ法にてＤＮＡ断片を増幅した。増幅産物をクローニングベクタ-ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ２−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、得られたベクターを、ＵＴＲ−ｈＧａｌＴ１／ｐＣＲ２、およびＵＴＲ−ｈＧｎＴ２／ｐＣＲ２とした。
【０１５４】
ＵＴＲ−ｈＧｎＴ２／ｐＣＲ２を制限酵素ＮｒｕＩで消化し、得られたＵＴＲ−ｈＧｎＴ２のＤＮＡ断片を、ｐＭＳＧ３．１ＭＧの制限酵素Ｅｃｏ４７ＩＩＩサイトに挿入した。つぎに、ＵＴＲ−ＧａｌＴ１／ｐＣＲ２をＮｒｕＩで消化することにより得られたＵＴＲ−ｈＧａｌＴ１断片を、ＵＴＲ−ｈＧｎＴ２を挿入したベクターのＮｒｕＩサイトに挿入し、塩基配列と挿入方向が正しい事を確認した。このベクターを、ｈＧａｌＴ１−ｈＧｎＴ２／ｐＭＳＧ３．１Ｒと表記する（図１４）。
【０１５５】
図１４には、中部絹糸腺において、ｈＧａｌＴおよびｈＧｎＴ２を発現するトランスジェニックカイコを作出するためのベクターの構造を示した。この図１４では、それぞれの略称の意味は、ｐｉｇｇｙＢａｃＲ：ｐｉｇｇｙＢａｃ ３’末端側配列、３ｘＰ３−ＴＡＴＡ：眼や神経系で発現を引き起こすプロモーター、ＤｓＲｅｄ：赤色蛍光タンパク質遺伝子、ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ：ＳＶ４０由来ポリＡ付加シグナル、Ｐｓｅｒ１：カイコセリシン１遺伝子プロモーター、ＨＲ３：ＢｍＮＰ ｈｒ３、ｈＧａｌＴ１：ヒトβ１，４−ガラクトース転移酵素１遺伝子、ｈＧｎＴ２：ヒトβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素２遺伝子、ＦｉｂＬ ｐｏｌｙＡ；カイコフィブロインＬ鎖ポリＡ付加シグナル、ｐｉｇｇｙＢａｃＬ：ｐｉｇｇｙＢａｃ ５’末端側配列、Ａｍｐ：抗生物質アンピシリン耐性遺伝子、の通りである。
【０１５６】
＜実施例９＞
ｈＧａｌＴ１およびｈＧｎＴ２を発現するトランスジェニックカイコの作出
ｈＧａｌＴ１−ｈＧｎＴ２／ｐＭＳＧ３．１Ｒを、実施例３に記載した方法と同様の方法により、合計２９８４個の卵に微量注入した。
【０１５７】
ＤＮＡを微量注入した卵を２５℃でインキュベートしたところ、それぞれ８１９個の卵が孵化した。孵化したカイコの飼育を続け、得られた生殖可能な成虫を交配し、１８８グループのＦ１卵塊を得た。産卵日から５〜６日目のＦ１卵塊を蛍光実体顕微鏡で観察することにより、眼や神経系から赤色蛍光を発するトランスジェニックカイコの卵をスクリーニングした。その結果、トランスジェニックカイコの卵を含む卵塊を、それぞれ１５グループ得ることができた。得られた卵塊を孵化させ飼育したところ、１４グループの卵塊に由来するトランスジェニックカイコ（以下、ＧａｌＴ−ＧｎＴ２−ＴＧカイコと表記する）は、正常に繭を作り蛹となり、さらに羽化して生殖能力を有した成虫になった。これらのカイコを野生型のカイコと交配して、８系統のＧａｌＴ−ＧｎＴ２−ＴＧカイコを樹立した。
【０１５８】
＜実施例１０＞
ＧａｌＴ−ＧｎＴ２−ＴＧカイコの繭における糖鎖構造の解析
野生型カイコおよびＧａｌＴ−ＧｎＴ２−ＴＧカイコの繭に含まれる糖鎖の構造を、実施例６に示した方法により解析した。
【０１５９】
樹立した８系統のＧａｌＴ−ＧｎＴ２−ＴＧカイコのうち、３系統について糖鎖の構造解析を実施した。これら解析に用いた系統名は、それぞれ、１７−２、７５−１、および６５−４である。糖鎖の構造解析に先立ち、これら３系統のトランスジェニックカイコの中部絹糸腺におけるｈＧａｌＴ１の発現量を、抗ｈＧａｌＴ１抗体を用いたウエスタンブロット法（方法は特開２００６-１０９７７２の実施例などに記載）により解析した。その結果、ｈＧａｌＴ１の発現量は、低い順より、１７−２、７５−１、６５−４であった（図１５）。
【０１６０】
野生型カイコ、およびＧａｌＴ−ＧｎＴ２−ＴＧカイコ３系統（１７−２、７５−１、６５−４）の糖鎖構造解析の結果を図１６に示す。図中の％表記の数値は、逆相ＨＰＬＣで分取したメジャーなピークの総糖鎖モル数より計算された存在比を百分率（％）で表示したものである。なお、図中の％表記の数値は、逆相ＨＰＬＣで分取したメジャーなピークの総糖鎖モル数より計算された存在比を百分率（％）で表示したものである。
【０１６１】
βガラクトース（以下、Ｇａｌと表記する）が少なくとも１つ付加した構造の糖鎖は、野生型カイコの繭では０％であったのに対し、最もｈＧａｌＴ１の発現量が低い１７‐２の系統で９％であった。これは、βガラクトース糖転移酵素であるｈＧａｌＴ１遺伝子を発現するトランスジェニックカイコの中部絹糸腺において、Ｇａｌが付加されたヒト型糖鎖を付加できることを示している。また、Ｇａｌの付加率については、中部絹糸腺におけるｈＧａｌＴ１の発現量が高い系統（６５‐４）では低く、発現量の低い系統（１７‐２）の方が、Ｇａｌ付加率が高いことが示された。このことにより、Ｇａｌの付加率を上げる方法として、ｈＧａｌＴ１の発現量を低くする方法が有効であることが示された。
【０１６２】
＜実施例１１＞
ＧａｌＴ−ＧｎＴ２−ＴＧカイコでは、さらに中部絹糸腺においてＩｇＧを発現させ、そのＩｇＧにおける糖鎖構造の解析を行うための実験も実施した。その結果、カイコの中部絹糸腺においてＩｇＧを発現させ、さらにβガラクトース転移酵素も発現させることに成功した。なお、このカイコの系統としては、中部絹糸腺におけるｈＧａｌＴ１の発現量が高い系統（６５‐４）よりも、発現量の低い系統（１７‐２）の方が好ましい。なぜなら、既に説明したように、中部絹糸腺におけるｈＧａｌＴ１の発現量が高い系統（６５‐４）では低く、発現量の低い系統（１７‐２）の方が、Ｇａｌ付加率が高いためである。このＩｇＧにおける糖鎖構造の解析結果については、上述の実施例１０のＧａｌＴ−ＧｎＴ２−ＴＧカイコの繭における糖鎖構造の解析結果と同様の結果を得た（ｄａｔａ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ）。
【０１６３】
＜実験結果の考察＞
今回分析したカイコ繭総蛋白質、カイコ脂肪体組織総蛋白質、カイコ絹糸腺組織総蛋白質における糖鎖の組成について分析した結果、さらに文献から得られるＣＨＯ細胞におけるＩｇＧをはじめとする糖蛋白質の糖鎖の組成などを比較すれば、糖鎖ヒト型化に関するカイコ絹糸腺の優位性は明らかである。
【０１６４】
すなわち、昆虫糖鎖のヒト型化には、二つの技術開発（一つは糖鎖の伸長、もう一つはα１，３フコースの除去）が必要となるが、α１，３フコースの除去については、本発明者等の実験によって初めて判明した予想外の結果ではあるが、そもそもカイコの絹糸腺で合成される糖蛋白質の糖鎖には当初からα１，３フコースが存在しないことが上述の実験結果の比較から明らかである。
【０１６５】
また、同様に本発明者等の実験によって初めて判明した予想外の結果ではあるが、上述の実験結果の比較から明らかなように、そもそもカイコの絹糸腺で合成される糖蛋白質の糖鎖には、図８〜図１６における略号ＧＮｂ、ＧＮａおよびＧＮ２のような糖鎖構造を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質、すなわち別の表現をすれば、上述の化学式（２）、（３）または（４）で示される糖鎖構造を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質が２０モル％以上含まれることが明らかとなった。
【０１６６】
一方、従来の知見では、昆虫で合成される糖鎖は、マンノースを３つまたは２つもつ糖鎖（例えば、図８〜図１６における略号Ｍ３、Ｍ２のような糖鎖）が大半であると言われていた。ところが、今回の実験で明らかになったように、カイコの繭から精製したＩｇＧや、絹糸腺や繭に含まれる糖蛋白質の糖鎖ではマンノース５つ（例えば、図８〜図１６における略号Ｍ５）や、ＧｌｃＮＡｃが付いた糖鎖（例えば、図８〜図１６における略号ＧＮｂ、ＧＮａ、ＧＮ２）が多いことがわかった。
【０１６７】
ここで、いわばポジティブコントロールとして用いた比較対象のＣＨＯのデータは、従来公知の文献（Satoru Kamoda et. al, “Capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection for detailed studies on N-linked oligosaccharide profile of therapeutic recombinant monoclonal antibodies”, Journal of Chromatography A, 1133 (2006) 332-339）から引用したＩｇＧの解析結果（上述の図８〜図１６における略号を用いて説明すると、ＧＮ２ 約５１％、ＧＮａ＋ＧＮｂ 約１％、Ｍ５ 約３％、ＧＡ２ ３７％、ＧＡａ／ｂ ７％、Ｍ３ ０％、Ｍ２ ０％）であるが、その他は本発明者等が実際にカイコの繭または組織から切り出した全糖鎖の解析結果である（ＧａｌＴ−ＧｎＴ２−ＴＧカイコについては既に上述の通りに作製されたものを用いた）。
【０１６８】
カイコの脂肪体総蛋白質では、従来公知のバキュロウイルス発現系での主な発現組織となる組織であるが、従来の知見どおりの結果（例えば、図８〜図１６における略号Ｍ３、Ｍ２が大半）という予想通りの結果が得られた。一方、カイコの繭や絹糸腺の総蛋白質では、上述の絹糸腺でのＩｇＧのデータと同様な結果（図８〜図１６における略号Ｍ５、ＧＮ２、ＧＮａ、ＧＮｂが多い）が得られ、カイコの脂肪体よりも、むしろ哺乳動物細胞であるＣＨＯ細胞の糖鎖（哺乳動物型、ヒト型）に近いことがわかる。
【０１６９】
このように、カイコの絹糸腺で合成し、カイコの繭に分泌された糖蛋白質の糖鎖は、糖鎖のヒト型化（糖鎖の伸長とα１，３フコース無し）に関して非常に有利であることがわかる。また、カイコの絹糸腺で抗体を生産する場合のＡＤＣＣ活性の向上には、α１，６フコースの除去が必要であるが、この点についても、本発明者等の実験によって初めて判明した予想外の結果ではあるが、そもそもカイコの絹糸腺で合成される糖蛋白質の糖鎖には当初からα１，６フコースが存在しないことが上述の実験結果の比較から明らかである。すなわち、カイコの絹糸腺で合成し、カイコの繭に分泌された糖蛋白質の糖鎖は、α１，３フコースが除去されており、α１，６フコースも除去されており、糖鎖が伸長されているため、糖鎖のヒト型化に関して非常に有利であり、さらに抗体を生産する場合のＡＤＣＣ活性の向上にも有利であることが明らかである。
【０１７０】
また、本発明者等は、上述した通り、βガラクトース転移酵素（ＧａｌＴ）およびＮ−アセチルグルコサミン転移酵素（ＧｎＴ）を絹糸腺で発現するトランスジェニックカイコを作製し、繭タンパク質の糖鎖解析を行った。その結果は、上述の実験結果の比較のとおりであり、比率的には改善の余地があるかもしれないが、ＧｌｃＮＡｃの先にβＧａｌが付いた糖鎖を作ることに成功した。これでほぼ糖鎖のヒト型化（哺乳動物化）が完了したことになる。このように、たった１個または２個の遺伝子の導入で、糖鎖のヒト型化（糖鎖の伸長およびα１，３フコ−スの除去）が可能であり、何も遺伝子改変しなくても（α１，６フコースの除去による）ＡＤＣＣ活性の向上が可能であることから、カイコの絹糸腺を糖蛋白質の発現組織として使うメリットははかりしれないと言える。
【０１７１】
ここで、絹糸腺を発現組織として使っているわけではないが、ＧａｌＴ遺伝子を組み込んだカイコの作製については、特許文献および論文は無いが、学会等では発表されており、ホームページでも以下のＵＲＬに掲載されている。
http://www.jst.go.jp/shincho/db/seika/2006_s/2006_s_9/2006_s_9_koncyukinou/2006_s_9_koncyukinou_3_1_3.htm
【０１７２】
しかしながら、図１６に示したとおり、本発明者等は、ＧａｌＴ遺伝子を組み込んだトランスジェニックカイコを数系統樹立したが、従来公知の知見からは予想外なことに、ＧａｌＴの発現量が高い系統ではβＧａｌの付加は観察されなかった。一方、従来公知の知見からは予想外なことに、ＧａｌＴの発現量がむしろ低い系統では、逆にβＧａｌの付加が起こることが判明した。すなわち、本発明者等の実験によって初めて、正確な理由は判明していないが、カイコの絹糸腺細胞では、ＧａｌＴ発現量が高いと、かえって糖鎖伸長がうまくいかないことが明らかとなった。本発明者等は、この実験後に色々とその理由を検討したが、ヒト細胞では、ＧａｌＴなどの糖転移酵素の発現量が低いため、トランスジェニックカイコでの発現量は、ヒト細胞の１００〜１０００倍高いことが判明した。しかしながら、糖転移酵素の発現量を下げた方がうまくいくことを示唆する記述は、他の発現系に関する従来公知の文献であっても文献的な記述は一切無く、糖鎖に関する専門の大学教員にとっても驚きの結果であった。
【０１７３】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【産業上の利用可能性】
【０１７４】
以上詳しく説明したとおり、鱗翅目に分類される昆虫（カイコ）の絹糸腺細胞（中部絹糸腺細胞）または昆虫個体の絹糸腺そのものを用いることによって、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質が提供される。そのため、ＡＤＣＣ活性が向上した抗体かつ/または抗原性が低減した糖蛋白質（抗体を含む）を安価にかつ大量に生産することができるので、様々な治療に用いられている抗体医薬・バイオ医薬の原体を安価に大量生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１ａ】図１は、ＩｇＧ（Ｈ）／ｐＭＳＧ１．１ＲおよびＩｇＧ（Ｌ）／ｐＭＳＧ１．１ＭＧベクターの構造を示す図である。中部絹糸腺において、抗体Ｈ鎖を発現するトランスジェニックカイコを作出するためのベクター（ＩｇＧ（Ｈ）／ｐＭＳＧ１．１Ｒ）の構造を上段（図１ａ）に示した。
【図１ｂ】図１は、ＩｇＧ（Ｈ）／ｐＭＳＧ１．１ＲおよびＩｇＧ（Ｌ）／ｐＭＳＧ１．１ＭＧベクターの構造を示す図である。抗体Ｌ鎖を発現するトランスジェニックカイコを作出するためのベクター（ＩｇＧ（Ｌ）／ｐＭＳＧ１．１ＭＧ）の構造を下段（図１ｂ）に示した。
【図２】ＩｇＧ上のＮ−配糖体糖鎖の質量分析結果を示すチャートである。
【図３】カイコで発現させたマウスＩｇＧから調製されたＰＡ糖鎖を陰イオン交換ＨＰＬＣで分離した結果を示すチャートである。
【図４】得られた中性糖鎖をＳｉｚｅ−ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ＨＰＬＣで分離した結果を示すチャートである。
【図５】得られた糖鎖をＲｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ ＨＰＬＣで分離した結果を示すチャートである。
【図６】カイコで発現させたマウスＩｇＧ糖鎖の構造をまとめた糖鎖構造図である。図中の括弧内の数値は、Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｎｏ．３からＮｏ．８までに含まれる糖鎖のモル数と、合計モル数に対する、各Ｆｒａｃｔｉｏｎ中の糖鎖モル数を百分率（％）で表示したものである。
【図７】昆虫および哺乳動物でのＮ結合型糖鎖の生成経路について説明するための概念図である。
【図８】ｐｎｄ−ｗ１の中部絹糸腺における糖鎖構造をまとめた糖鎖構造図である。
【図９】錦秋の中部絹糸腺における糖鎖構造をまとめた糖鎖構造図である。
【図１０】ｐｎｄ−ｗ１のマユにおける糖鎖構造をまとめた糖鎖構造図である。
【図１１】錦秋のマユにおける糖鎖構造をまとめた糖鎖構造図である。
【図１２】ｐｎｄ−ｗ１の脂肪体における糖鎖構造をまとめた糖鎖構造図である。
【図１３】錦秋の脂肪体における糖鎖構造をまとめた糖鎖構造図である。
【図１４】ｈＧａｌＴ１−ｈＧｎＴ２／ｐＭＳＧ３．１Ｒベクターの構造を示したベクター構造図である。
【図１５】ＧａｌＴ−ＧｎＴ２−ＴＧカイコ３系統の中部絹糸腺におけるｈＧａｌＴ１の発現量の比較結果を示す電気泳動写真の図である。
【図１６】ＧａｌＴ−ＧｎＴ２−ＴＧカイコの繭中の糖鎖構造を比較した糖鎖構造図である。図中の数値は、糖鎖の合計モル数に対する、各Ｆｒａｃｔｉｏｎ中の糖鎖モル数を百分率（％）で表示したものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖構造に特徴を有する糖蛋白質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、組換えタンパク質として大腸菌等で生産されるタンパク質は、少量で高い効果を発揮するサイトカインやホルモンなどに加えて、比較的多量に用いなければ効果が得られない抗体や血液タンパク質のような糖タンパク質にも生産対象が広がっている。大腸菌では、糖タンパク質の合成が本来行えないので、多くの製薬会社では、ほ乳類培養細胞を使って生産が行われている。ほ乳類培養細胞を用いた場合、大量生産が難しく、高コストをさけることはできない。そのため、糖タンパク質製剤を大量にそして安価に生産できる発現系の開発が望まれている。
【０００３】
ネオシルク社および広島県産業科学技術研究所では、組換えタンパク質を絹糸の構成成分として分泌するトランスジェニックカイコを創り出すことに成功しており（特許文献１〜７）、これを用いて組換えタンパク質受託生産およびタンパク質医薬品開発を行っている。
【０００４】
一方、ネオシルク社および広島県産業科学技術研究所以外でも、昆虫細胞を利用した糖蛋白質の生産についての研究もこれまで多少行われてきた。しかし、バキュロウイルス−昆虫細胞発現系を用いて発現させた蛋白質では、Ｎ結合型糖鎖のほとんどは、図７の経路１に示すようにトリマンノシルコア型であることが知られている。なぜなら、宿主である昆虫細胞がガラクトース転移酵素（ＧａｌＴ）およびシアル酸転移酵素（ＳＴ）活性を欠くためである。さらに、昆虫細胞宿主では、ゴルジ体に局在する酵素であるＮ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＧｌｃＮＡｃａｓｅ）が昆虫細胞で発現される糖蛋白質に付加されるＮ結合型糖鎖を昆虫細胞に特徴的な構造に構築する活性を有するからでもある。すなわち、この酵素が合成経路のＮ結合型糖鎖末端のアセチルグルコサミン残基を加水分解することにより糖鎖の伸長とα１，３フコース無しが起こらないと考えられている。一方、哺乳動物由来の糖タンパク質が持つコンプレックス型（哺乳類型）糖鎖は図７の経路２によって合成され、その末端にシアル酸が付加される。
【０００５】
そのため、昆虫細胞型の糖鎖を持つ組換え糖蛋白質を哺乳動物に投与した場合には、昆虫型糖鎖は哺乳動物体内で異物として認識され、あるいは生体内に長くとどまらないなどの問題が生じていた。このため、昆虫細胞で哺乳動物由来の糖蛋白質を発現させても、哺乳動物生体内での安定性が低く、哺乳動物への投与には適さなかった。
【０００６】
そこで、生体内での安定性に優れ、哺乳動物への投与に適した形の、哺乳動物本来の持つ蛋白質に近い、シアル酸が付加された組換え糖蛋白質を昆虫細胞で発現させる方法を提供することを目的として、昆虫細胞の持つＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を抑制、阻害または除去することを含む、シアル酸が付加された糖鎖を有する組換え糖蛋白質を昆虫または昆虫細胞で発現する方法が開発されている（特許文献８）。
【０００７】
また、昆虫培養細胞で発現している糖蛋白質のＮ結合型糖鎖におけるフコースの結合について明らかにした研究によれば、糖タンパク質のＮ結合型糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンに、α１，３結合したフコースやα１，６結合したフコースが存在する場合があることが示されている（非特許文献１、２）。α１，３結合したフコース（α１，３フコース）については、哺乳動物生体内では抗原性を示すことが知られており、そのため、昆虫培養細胞を用いて生産した糖タンパク質は、哺乳動物への投与には適さないと考えられている。また、ガラクトース転移酵素遺伝子を組み込んだカイコの作製については、特許文献および論文では無いが、学会等では発表されており、ホームページにも掲載されている（非特許文献３）。
【０００８】
他方、抗腫瘍抗体の臨床応用では、現状では抗体単独の抗腫瘍効果は不十分な場合が多く、化学療法との併用療法が行われているが、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）の増強による抗体単独のより強い抗腫瘍効果が認められれば、化学療法に対する依存度が低くなり、副作用の低減も期待できる。そこで、協和醗酵工業株式会社は、各種動物細胞で生産したヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体の糖鎖を分析してＡＤＣＣ活性を高める糖鎖を特定し、免疫機能分子の活性を調節する方法を提供することを目的として、ラットミエローマＹＢ２／０細胞で生産したヒト化抗体のＡＤＣＣ活性が他の細胞で生産したヒト化抗体に比べ著しく高いことを見出している（特許文献９）。
【０００９】
この発見に基づいて、協和発酵工業株式会社は、さらに研究開発を進め、現在では、協和発酵工業株式会社の米国子会社バイオワ（ＢｉｏＷａ，Ｉｎｃ．）を通じて、ＡＤＣＣ活性を強化するポテリジェント（Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ、登録商標）技術について、世界中の製薬会社等に対してライセンス許諾等のビジネスを行っている（特許文献１０〜１８）。
【００１０】
【特許文献１】特開２００１−１６１２１４号公報
【特許文献２】特開２００２−３０６１６７号公報
【特許文献３】特開２００２−３１５５８０号公報
【特許文献４】特開２００４−１６１４４号公報
【特許文献５】特開２００４−３４４１２３号公報
【特許文献６】特開２００６−１６３２３号公報
【特許文献７】特開２００６−１０９７７２号公報
【特許文献８】特開２００３−７０４６９号公報
【特許文献９】国際公開第００／６１７３９号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第０２／０３１１４０号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第０３／０５５９９３号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第０３／０８４５６９号パンフレット
【特許文献１３】国際公開第０３／０８４５７０号パンフレット
【特許文献１４】国際公開第０３／０８５１０２号パンフレット
【特許文献１５】国際公開第０３／０８５１１８号パンフレット
【特許文献１６】国際公開第０３／０８５１１９号パンフレット
【特許文献１７】国際公開第０５／０５３７４２号パンフレット
【特許文献１８】特開２００７−１２９９０３号公報
【非特許文献１】Kubelka, V. et al., Arch. Biochem Biophys. 308, 148-157, 1994、
【非特許文献２】Staudacher, E. et al., Eur. J. Biochem. 207, 987-993, 1992
【非特許文献３】森肇著、「カイコの形質転換による有用物質生産系の開発」http://www.jst.go.jp/shincho/db/seika/2006_s/2006_s_9/2006_s_9_koncyukinou/2006_s_9_koncyukinou_3_1_3.htm
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、上記文献記載の従来技術は、以下の点で改善の余地を有していた。
第一に、特許文献１〜７では、組換えタンパク質を絹糸の構成成分として分泌するトランスジェニックカイコを創り出すこと自体は成功しているが、従来の知見では、カイコで生産されるタンパク質には糖鎖が付加されるものの、この糖鎖の構造は哺乳動物が合成するタンパク質と同じではないと考えられている。そのため、この糖鎖の構造がカイコで糖タンパク質製剤を生産する際の問題点であった。また、仮にカイコ細胞またはカイコ個体の遺伝子改変を行ってこの問題を解決するにしても、糖鎖改変に必要な糖転移酵素を選択するためには、やはりカイコで付加された糖鎖の構造を調べることが必要であった。
【００１２】
第二に、特許文献８では、シアル酸が付加された糖鎖を有する組換糖蛋白質を昆虫または昆虫細胞で発現すること自体は成功しているが、トランスジェニックカイコで発現された糖蛋白質の糖鎖構造におけるフコースの結合状態については、何ら検討されていない。そのため、トランスジェニックカイコで哺乳動物由来の抗体を生産した場合に、その抗体の哺乳動物体内でのＡＤＣＣ活性および抗原性がどのようになるかについては不明であった。
【００１３】
第三に、特許文献９〜１８では、ＡＤＣＣ活性を高める糖鎖を特定すること自体は成功しているが、そのような特定の構造の糖鎖を有する抗体を効率よく低コストで生産することのできる生産系は未だ確立されていない。すなわち、大腸菌では、糖タンパク質の合成を行うことができないので、多くの企業では、哺乳類培養細胞を使って生産が行われているが、哺乳類培養細胞を用いた場合、大量生産が難しく、高コストをさけることはできなかった。
【００１４】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、トランスジェニックカイコで生産したＩｇＧをはじめとする糖蛋白質の糖鎖構造解析をおこなうことにより、その糖鎖がどのような構造であるかについて調べることを目的とする。また、本発明の別の目的は、上記の糖鎖構造解析の結果に基づいて、糖鎖構造に特徴を有する糖蛋白質を、昆虫個体または昆虫細胞を用いて、効率的に低コストで生産する技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明によれば、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質の生産方法であって、昆虫の絹糸腺細胞において、糖蛋白質を発現させる工程を含む、糖蛋白質の生産方法が提供される。
【００１６】
この生産方法によれば、昆虫の絹糸腺細胞において、糖蛋白質を発現させるため、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質を効率よく発現させることができる。また発現された糖蛋白質を効率よく抽出することもできるので、糖鎖構造に特徴を有する糖蛋白質を、昆虫細胞を用いて、効率的に低コストで生産することができる。
【００１７】
また、本発明によれば、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質の生産方法であって、昆虫個体に内在している絹糸腺、昆虫個体より摘出した絹糸腺組織、または昆虫個体より摘出した絹糸腺より得られる絹糸腺細胞において、前記糖蛋白質を発現させる工程を含む、糖蛋白質の生産方法が提供される。
【００１８】
この生産方法によれば、昆虫個体に内在している絹糸腺、昆虫個体より摘出した絹糸腺組織、または昆虫個体より摘出した絹糸腺組織より得られる絹糸腺細胞において、糖蛋白質を発現させるため、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質を効率よく発現させることができ、発現された糖蛋白質を効率よく抽出することができるので、糖鎖構造に特徴を有する糖蛋白質を、昆虫細胞を用いて、効率的に低コストで生産することができる。
【００１９】
また、本発明によれば、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質を生産するための糖蛋白質生産細胞であって、糖蛋白質を発現するように遺伝的に改変されてなる昆虫の絹糸腺細胞である、糖蛋白質生産細胞が提供される。
【００２０】
この糖蛋白質生産細胞によれば、糖蛋白質を発現するように遺伝的に改変されてなる昆虫の絹糸腺細胞において、糖蛋白質を発現させるため、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質を効率よく発現させることができる。また発現された糖蛋白質を効率よく抽出することもできるので、糖鎖構造に特徴を有する糖蛋白質を、昆虫細胞を用いて、効率的に低コストで生産することができる。
【００２１】
また、本発明によれば、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質を生産するための糖蛋白質生産生物個体であって、糖蛋白質を絹糸腺において発現するように遺伝的に改変されてなる昆虫個体である、糖蛋白質生産生物個体が提供される。
【００２２】
この糖蛋白質生産生物個体によれば、糖蛋白質を絹糸腺において発現するように遺伝的に改変されてなる昆虫個体の絹糸腺において、糖蛋白質を発現させるため、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質を効率よく発現させることができる。また発現された糖蛋白質を効率よく抽出することもできるので、糖鎖構造に特徴を有する糖蛋白質を、昆虫細胞を用いて、効率的に低コストで生産することができる。
【００２３】
なお、上記の生産方法は本発明の一態様であり、本発明の生産方法は、以上の構成要素の任意の組合せであってもよい。また、本発明の糖蛋白質生産組織なども、同様の構成を有し、同様の作用効果を奏する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、特定の種類の昆虫個体・昆虫組織または昆虫細胞を用いるため、糖鎖構造に特徴を有する糖蛋白質を、昆虫個体・昆虫組織または昆虫細胞を用いて、効率的に低コストで生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
＜用語の説明＞
本明細書において、「下限数値〜上限数値」とは、下限数値以上かつ上限数値以下の範囲内にあることを意味するものである。
【００２６】
本明細書では、「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ；またはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）が２個以上結合した分子を意味する。ポリヌクレオチドと他のポリヌクレオチドが「機能的に連結されている」とは、各々のポリヌクレオチドが有する機能が損なわれることなく、しかも連結によって所望の機能が発揮しうる状態が確保されている状態を意味する。具体的には、一方のポリヌクレオチドの３’端ヌクレオチドと他方のポリヌクレオチドの５’端ヌクレオチドが直接、または他のリンカー配列を介して結合している状態をいう。
【００２７】
本明細書では、「蛋白質」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味し、「組換蛋白質」とは、遺伝子工学的に製造されるタンパク質を意味する。
【００２８】
本明細書において、「糖蛋白質」とは、通常の糖蛋白質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）を意味し、蛋白質を構成するアミノ酸の一部に糖鎖が結合したものである。動物においては、細胞表面や細胞外に分泌されているタンパク質のほとんどが糖蛋白質であるといわれている。蛋白質のアミノ酸の修飾では、アスパラギンに結合したもの（Ｎ結合型）とセリンやスレオニンに結合したもの（Ｏ結合型、ムチン型）の２種類が頻繁に観察される。
【００２９】
糖タンパク質に結合している糖鎖を成す糖の種類はそれほど多くなく、よく見られるものは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、キシロースなど７〜８種程度である。構造様式もある程度限られており、その中のわずかな構造の違いが識別され、精密に認識されて様々な生命現象が制御されている。
【００３０】
本明細書において、「抗体」とは、通常の抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）を意味し、リンパ球のうちＢ細胞の産生する糖タンパク分子で、特定のタンパク質などの分子（抗原）を認識して結合する働きをもつ。なお、「抗体」という名は抗原に結合するという機能を重視した名称で、物質としては免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）と呼ばれ、「Ｉｇ（アイジー）」と略される。すべての抗体は免疫グロブリンであり、血漿中のγ（ガンマ）グロブリンにあたる。
【００３１】
抗体は定常領域の構造の違いにより、いくつかのクラス（アイソタイプ）に分けられる。哺乳類では、定常領域の構造の違いによりＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥの５種類のクラスの免疫グロブリンに分類される。ヒトの場合、ＩｇＧにはＩｇＧ１〜ＩｇＧ４の４つのサブクラスが、ＩｇＡにはＩｇＡ１とＩｇＡ２の２つのサブクラスがあり、それぞれ少しずつ構造が異なっている。ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥにはサブクラスはない。なお、本明細書では、「抗体」とは、上述のクラス・サブクラスの総称を意味し、それらのＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２などの抗体断片であってもよく、さらにマウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト型抗体などが含まれる。
【００３２】
本明細書では、「蛋白質をコードする遺伝子」とは、蛋白質をコードする領域（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ： ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドであり、例えば蛋白質遺伝子のｃＤＮＡである。「遺伝子プロモーター領域」とは、タンパク質をコードする遺伝子領域の転写開始点から上流域に存在する転写を開始させるために必須な配列を含む領域であって、一般に「プロモーター領域」および「エンハンサー領域」と言われる領域を言う。そのため、「抗体のＨ鎖をコードする遺伝子」または、「抗体のＬ鎖をコードする遺伝子」とは、抗体のＨ鎖またはＬ鎖をコードする領域（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ： ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドであり、例えばこれらをコードする遺伝子のｃＤＮＡである。
【００３３】
本明細書では、「フコース」とは、通常のフコース（ｆｕｃｏｓｅ）を意味し、デオキシ糖の一種である６−デオキシ−ガラクトースで、化学式はＣ６Ｈ１２Ｏ５、分子量１６４．１６、融点１６３℃、比旋光度−７６゜で六炭糖、単糖に分類される。天然にはＬ型がＬ−フコシドの形で、動植物に幅広く存在する。哺乳動物および植物では細胞表面のＮ結合糖鎖上で見つかる。
【００３４】
本明細書では、「Ｎ−アセチルグルコサミン」とは、通常のＮ−アセチルグルコサミン（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、ＧｌｃＮＡｃ、ＮＡＧ）を意味し、グルコースから誘導された単糖で、いくつかの生化学的機構にとって重要な物質である。化学的にはこの物質はグルコサミンと酢酸の間のアミドである。Ｎ−アセチルグルコサミンは、哺乳動物においては、糖タンパク質、ヒアルロン酸などグリコサミノグリカン（ムコ多糖）の成分となっている。Ｎ−アセチルグルコサミンは、アスパラギンにマンノースを中心とするオリゴ糖鎖が結合するＮ結合型糖タンパク質の骨格をなすほか（キトビオース構造）、更に複雑構造を持つ糖鎖の主要構成糖である。
【００３５】
本明細書では、「ガラクトース」とは、通常のガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）を意味し、分子式、分子量はグルコースと同じＣ６Ｈ１２Ｏ６、１８０である。立体配置は２位（Ｆｉｓｃｈｅｒ投影式で上から２番目）、５位の−ＯＨが同じ方向３位、４位が反対方向であり、Ｄ−ガラクトースは５位Ｄ−グリセルアルデヒドと同じ配向をもっている。グルコースの４−エピマーである。天然ではＤ−ガラクトースがほとんどである。
【００３６】
本明細書では、「βガラクトース転移酵素」とは、通常のβ−ガラクトース転移酵素（β−ＧａｌＴ）を意味し、ＵＤＰ−ＧａｌからＧａｌを糖鎖末端のＧｌｃＮＡｃ残基に転移することでＧａｌβ１→３／４ＧｌｃＮＡｃという構造を形成する酵素である。なお、最近になって、これまでに知られていないβ−１，４−ＧａｌＴやβ−１，３−ＧａｌＴをコードする遺伝子が次々にクローニングされ、これらもそれぞれファミリーを形成していることが明らかになっている。例えば、ヒトβ−１，４−ＧａｌＴ遺伝子は、糖転移酵素間に見られるアミノ酸配列のホモロジーや遺伝子バンクに登録された遺伝子断片の配列情報を利用してクローニングされており、それらはβ−１，４−ＧａｌＴ Ｉとアミノ酸配列で５５，４４，４１，３７，３３％のホモロジーを持っていたので、ホモロジーの順番に従ってβ−１，４−ＧａｌＴ ＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶ，Ｖ，ＶＩと命名されている。本明細書における「βガラクトース転移酵素」には、これらのすべてのβ−１，４−ＧａｌＴやβ−１，３−ＧａｌＴが含まれるものとする。
【００３７】
本明細書では、「Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素」とは、通常のＮ−アセチルグルコサミン転移酵素（ＧｎＴ）を意味し、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶ，Ｖ，ＶＩ（ＧｎＴ−Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶ，Ｖ，ＶＩ）が知られている。これらの中でも、Ｎ型糖鎖の高分岐化に関しては、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ，ＩＶ，Ｖ，ＶＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ，ＩＶ，Ｖ，ＶＩ）が分岐構造のコアとなる部分を決定するため、これらの酵素の活性化制御が全体の糖鎖構造の変化をきたすとされている。一方、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉ，ＩＩ（ＧｎＴ−Ｉ，ＩＩ）は、基本となるコア構造の決定に重要な意味をもつとされている。本明細書における「Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素」には、これらのすべてのＮ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶ，Ｖ，ＶＩが含まれるものとする。
【００３８】
本明細書において、「昆虫」とは、通常の意味の昆虫（Ｉｎｓｅｃｔ）を意味し、昆虫綱（Ｉｎｓｅｃｔａ）に分類される生物の総称であるものとする。
【００３９】
本明細書において、「鱗翅目」とは、通常の意味の鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）を意味し、チョウ目またはガ目とも呼ばれる昆虫類の分類群の一つであるものとする。成虫の体表が鱗粉や毛で覆われることから「鱗翅目」の名がある。なお、成長段階は、卵、幼虫、蛹、成虫という完全変態をおこなう。幼虫は円筒形で柔らかい体を持ち、胸部の歩脚は短く、腹部にはイボ足をもつ。本明細書において、鱗翅目の昆虫には、成虫のみではなく、当然に卵、幼虫、蛹の段階のものも含まれるものとする。
【００４０】
本明細書において、「カイコ」とは、通常の意味のカイコ（蚕）を意味し、チョウ目（鱗翅目）・カイコガ科に属する昆虫の一種であるものとする。正式和名はカイコガで、カイコはこの幼虫の名称だが、一般的にはこの種全般をも指す。クワ（桑）を食餌とし、絹を産生して蛹の繭を作る。カイコは家蚕（かさん）とも呼ばれ、野生に生息する昆虫ではない。カイコの祖先は東アジアに生息するクワコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍａｎｄａｒｉｎａ）であると考えられている。カイコとクワコは学問的には別種とされるが、これらの雑種は生殖能力をもつ。本明細書では、カイコには、クワコが含まれるものとする。
【００４１】
本明細書において、「絹糸腺」とは、熟蚕の体内に存在する左右１対の器官であり、クワの葉から摂取した多量のタンパク質（アミノ酸）を２種類の絹タンパク質（フィブロイン、セリシン）に変える器官を意味する。絹糸腺は左右一対となっており、マユ糸の原料となる液状絹を分泌する。絹糸腺は、後部絹糸腺、中部絹糸腺、前部絹糸腺の３つの部分に分けられる。
【００４２】
後部絹糸腺とは、最後部にある細長い部分で、伸ばすと約２０ｃｍになる。ここでは後にマユ糸の中心となるフィブロインタンパク質を合成する。
【００４３】
中部絹糸腺とは、中央部分にあるＳ字に曲がった太い部分で、伸ばすと約６ｃｍになる。後部絹糸腺から送られてきたフィブロインタンパク質を濃縮して蓄え、繊維にしやすい形に整える。またもうひとつの絹タンパク質であるセリシンも分泌する。マユ糸を吐きだすとき、フィブロインタンパク質をまとめる接着剤の役割をする。
【００４４】
前部絹糸腺とは、長さは約４ｃｍの吐糸口につながる細い管で、先に行くほど細くなる。液状のフィブロインタンパク質の分子が引き伸ばされて一定方向に揃えられ、互いに集合することでさらに水分が除かれる。管の先端でもう一対の管と一本に合流し、吐糸口から吐きだされて一本のマユ糸になる。
【００４５】
カイコは５齢の終わり頃にクワを食べるのをやめる（熟蚕）。熟蚕の体の中は、マユ糸の原料となる水飴のような液（液状絹）をため込んだ一対の器官（絹糸腺）でいっぱいになっている。絹糸腺は、細い吐糸管をつうじてカイコの口元にある吐糸口につながっている。液状絹は細い吐糸管を通ることで引き伸ばされて固まり、マユ糸となる。さらには、幼虫が吐糸管から吐きだした糸を近くのものに貼りつけ、頭と胸を８の字状に動かし、引っぱるという一連の運動で、マユ糸は次々と絹糸腺から引きだされるのである。
【００４６】
本明細書において、「フィブロイン」とは、繭糸の約７５％を占める繊維状のタンパク質であり、絹の原料である。光沢があってしなやかで、水やアルカリ液でも溶けない性質がある。１本のフィブロイン繊維は約２，０００本のフィブリルでできており、フィブリルはさらに直径１０万分の１ｍｍという微細なミクロフィブリルからできている。
【００４７】
本明細書において、「セリシン」とは、繭糸の約２５％を占めるタンパク質であり、２本のフィブロイン繊維を結びつけ、マユをつくるための接着剤の役割を果たすが、水に溶けやすい。
【００４８】
本明細書におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はSambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている。
【００４９】
＜発明の経緯＞
本発明者等の所属するネオシルク社は、トランスジェニックカイコ（ＴＧカイコ）を組換えタンパク質の生産に用いる技術を開発済みである。その主要な特徴として以下の３点が挙げられる。
（１）宿主はカイコ由来の培養細胞ではなく昆虫であるカイコの個体（またはカイコの個体内に含まれる体細胞）である。
（２）バキュロウイルス等によるものではなくトランスジェニック技術による遺伝子導入法である。
（３）セリシンプロモーターまたはフィブロインプロモーターによって目的タンパク質の発現が制御される為絹糸腺特異的に、ひいてはカイコが作成する繭のなかに発現させることができる。
【００５０】
しかしながら、既述のように、ネオシルク社としては、組換えタンパク質を絹糸の構成成分として分泌するトランスジェニックカイコを創り出すこと自体は成功しているが、従来の知見では、カイコで生産されるタンパク質には糖鎖が付加されるものの、この糖鎖の構造は哺乳動物が合成するタンパク質と同じではないと考えられている。そのため、この糖鎖の構造がカイコで糖タンパク質製剤を生産する際の問題点であった。また、仮にカイコ細胞またはカイコ個体の遺伝子改変を行ってこの問題を解決するにしても、糖鎖改変に必要な糖転移酵素を選択するためには、やはりカイコで付加された糖鎖の構造を調べることが必要であった。
【００５１】
そこで、本発明者等は、後述の実施例で説明するように、上記のネオシルク社における常法によるトランスジェニックカイコに産生させたマウスＩｇＧの糖鎖の構造解析を行ったところ、以下の結果を得た（図７）。
（１）高マンノース型および、トリマンノシルコア構造の１−３結合マンノース及び１−６結合マンノースにＧｌｃＮＡｃが１個または２個β１−２結合し、かつＧａｌが結合していない二分岐型の構造を持つ。
（２）昆虫由来の糖鎖の特徴である少マンノース型構造や、還元末端のＧｌｃＮＡｃ残基にα１−３結合するフコース（以下、１−３Ｆｕｃ）も検出されず、α１−６結合フコース（以下、１−６Ｆｕｃ）の付加も同様に見られなかった。
【００５２】
ここで、一般的にカイコを含む昆虫のＮ型糖鎖は以下の点が特徴である。
（１）パウチマンノース型（少マンノース型）が主でありガラクトース（以下Ｇａｌ）付加及びシアル酸の付加は無い。
（２）Ａｓｎと結合しているＧｌｃＮＡｃにヒトを含む哺乳動物は１−６Ｆｕｃ構造を持つが、昆虫ではフコースが１−６Ｆｕｃ構造に加えて１−３Ｆｕｃ構造もとりうる。
【００５３】
すなわち、トランスジェニックカイコに産生させたマウスＩｇＧの糖鎖の構造解析を行った結果は、上述の昆虫のＮ型糖鎖の糖鎖構造とは全く異なる構造を有しており、従来の予想を覆す、驚くべき知見であった。
【００５４】
すなわち、本発明者等は、カイコ絹糸腺で合成される糖鎖には１−３Ｆｕｃも１−６Ｆｕｃも検出されないことにくわえて、従来の知見では、昆虫で合成される糖鎖は、マンノースを３つまたは２つもつ糖鎖が大半であると言われていたが、実際には、繭から精製したＩｇＧではマンノース５つや、ＧｌｃＮＡｃが付いた糖鎖が多いことを見出した。
【００５５】
すなわち、本発明者等の行った実験によれば、バキュロウイルス発現系での主な発現組織となる組織であるカイコの脂肪体では、従来の知見どおりの結果（マンノースを３つまたは２つもつ糖鎖が大半であるという結果）が再現されたが、一方、カイコの繭では、抗体（ＩｇＧ）の場合と同様な結果（マンノース５つや、ＧｌｃＮＡｃが付いた糖鎖が多いという結果）が得られた。また、この実験結果と同様な結果が、カイコの絹糸腺の糖鎖の解析からも得られた。すなわち、本発明者等の行った実験によれば、カイコの脂肪体より、むしろＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ：チャイニーズハムスターの卵巣）細胞の糖鎖（哺乳動物型、ヒト型）に近いことが判明した。
【００５６】
言い換えれば、本発明者等は、このように、カイコの絹糸腺で合成し、繭に分泌された糖蛋白質の糖鎖は、糖鎖のヒト型化（糖鎖の伸長とα１，３フコース無し）に関して非常に有利であることを見出した。このことは、従来の知見とは全く異なる予想外の結果であり、本発明者等はさらに研究を進めた。
【００５７】
その後、本発明者等は、βガラクトース転移酵素（ＧａｌＴ）およびＮ−アセチルグルコサミン転移酵素（ＧｎＴ）を絹糸腺で発現するトランスジェニックカイコを作製し、繭タンパク質の糖鎖解析を行った。その結果は、後述するとおりであり、比率的にはまだ改善の余地があるものの、ＧｌｃＮＡｃの先にβＧａｌが付いた糖鎖を作ることに成功した。すなわち、こうして得られたカイコの絹糸腺で生産された糖蛋白質の糖鎖では、まだ改善の余地があるとは言え、ほぼ糖鎖のヒト型化が実現できていることになる。このように、本発明者等の完成したカイコの絹糸腺による糖蛋白質の生産方法によれば、たった１個または２個の遺伝子（βガラクトース転移酵素遺伝子のみ、または該遺伝子に加えてＮ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子）の導入で、糖鎖のヒト型化（糖鎖の伸長とα１，３フコース無し）が達成されるわけであり、絹糸腺を発現組織として使うメリットははかりしれないと考えられる。
【００５８】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
＜実施形態の概要＞
本実施形態によれば、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質の生産方法であって、昆虫の絹糸腺細胞において、糖蛋白質を発現させる工程を含む、糖蛋白質の生産方法が提供される。
【００５９】
この生産方法によれば、鱗翅目に分類される昆虫の絹糸腺細胞において、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質を効率よく発現させることができ、発現された糖蛋白質を効率よく抽出することができるので、糖鎖構造に特徴を有する糖蛋白質を、昆虫細胞を用いて、効率的に低コストで生産することができる。また、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質は、哺乳動物体内において低い抗原性を示すため、哺乳動物へ投与する目的において好ましい
【００６０】
＜糖蛋白質が抗体の場合＞
上述の糖蛋白質の生産方法において、上述の糖蛋白質は、糖鎖を有する抗体であることが好ましい。上述の糖蛋白質が糖鎖を有する抗体であれば、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する抗体であることによって、哺乳動物の体内におけるＡＤＣＣ活性が向上し、かつ抗原性が低減するという優れた効果が得られるからである。
【００６１】
ここで、本実施形態において、上述の抗体とは、外来抗原刺激の結果、免疫反応によって生体内に産生される蛋白質で、抗原と特異的に結合する活性を有するものであれば任意の抗体を用いることができる。抗体としては動物に抗原を免疫し、免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブリドーマ細胞が分泌する抗体のほか、遺伝子組換え技術により作製された抗体、すなわち、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、宿主細胞へ導入することにより取得された抗体などがあげられる。具体的には、ハイブリドーマが生産する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などをあげることができる。
【００６２】
ハイブリドーマとは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、マウス等に由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を産生する細胞を意味する。
【００６３】
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：以下、ＣＤＲと略記する）移植抗体などがあげられる。ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域（以下、重鎖はＨ鎖として、可変領域はＶ領域としてＨＶまたはＶＨとも称す）および抗体軽鎖可変領域（以下、軽鎖はＬ鎖としてＬＶまたはＶＬとも称す）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、定常領域はＣ領域としてＣＨとも称す）およびヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、ＣＬとも称す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
【００６４】
ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
【００６５】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体を意味する。ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりヒト型ＣＤＲ移植抗体を発現させ、製造することができる。ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
【００６６】
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体を意味するが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーならびにヒト抗体産生トランスジェニック動物あるいはヒト抗体産生トランスジェニック植物から得られる抗体等も含まれる。ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルス等を感染させ不死化、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養物中より該抗体を精製することができる。
【００６７】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
【００６８】
＜糖鎖の構造＞
上述の糖鎖は、糖鎖の結合様式により、アスパラギンと結合する糖鎖（Ｎ−グリコシド結合糖鎖という）ならびに、セリン、スレオニンなどと結合する糖鎖（０−グリコシド結合糖鎖という）の２種類に大別される。上述のＮ−グリコシド結合糖鎖は、様々な構造を有しているが［生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］、いずれの場合も下記に示す基本となる共通のコア構造を有することが好ましい。もっとも、この点は、上述の糖蛋白質が抗体ではない場合にも、同様である。
【００６９】
すなわち、上述の生産方法において、上述の糖蛋白質には、下記化学式（１）で示される糖鎖構造
【化８】
を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質が含まれることが好ましい。
【００７０】
一般に、哺乳動物、昆虫をはじめとする動物における糖蛋白質の糖鎖構造はこのような共通のコア構造を有することが知られているからである。すなわち、このような糖鎖構造を有していれば、哺乳動物の体内に投与した場合に、抗原性を低減できるからである。
【００７１】
そして、上記の構造において、アスパラギンと結合する糖鎖の末端を還元末端、反対側を非還元末端という。還元末端のＮ−アセチルグルコサミンへのフコースの結合としては、α１，３結合、α１，６結合などがあげられる。
【００７２】
Ｎ−グリコシド結合糖鎖には、コア構造の非還元末端にマンノースのみが結合するハイマンノース型、コア構造の非還元末端側にガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃと称す。）の枝を並行して１ないしは複数本有し、更にＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンなどの構造を有するコンプレックス型、コア構造の非還元末端側にハイマンノース型とコンプレックス型の両方の枝を持つハイブリッド型などがあげられる。
【００７３】
本実施形態では、上述の糖蛋白質には、下記化学式（２）、（３）または（４）で示される糖鎖構造
【化９】
【化１０】
【化１１】
を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質が含まれることが好ましい。
【００７４】
一般に、哺乳動物における糖蛋白質の糖鎖構造はこのような共通のコア構造を有することが知られているからである。すなわち、このような糖鎖構造を有していれば、哺乳動物の体内に投与した場合に、抗原性をさらに低減でき、また、糖蛋白質の安定性や生理活性などを、哺乳動物における糖蛋白質と同等にすることができるからである。
【００７５】
そして、上述の糖蛋白質のうち、化学式（２）、（３）または（４）で示される糖鎖構造を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質の割合が１０モル％以上であることが好ましく、２０モル％以上であることがより好ましく、３０モル％以上であることが特に好ましい。
【００７６】
化学式（２）、（３）または（４）で示される糖鎖構造を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質の割合が１０モル％以上、２０モル％以上、または３０モル％以上であれば、その糖蛋白質のＮ−グリコシド結合糖鎖は、通常の昆虫細胞によって生産される糖蛋白質のＮ−グリコシド結合糖鎖に比べて、著しくヒトをはじめとする哺乳動物の細胞で生産される糖蛋白質のＮ−グリコシド結合糖鎖の糖鎖構造に近似していることになり、かなりの程度いわゆる「糖鎖がヒト型化」された糖蛋白質であるということになる。そして、「糖鎖がヒト型化」された糖蛋白質であることによって、哺乳動物の体内に投与した場合に、抗原性をより低減でき、また、糖蛋白質の安定性や生理活性などを、哺乳動物における糖蛋白質と同等にすることができる。
【００７７】
本実施形態では、上述の糖鎖構造は、Ｎ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質のうち、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合している糖鎖構造を有する糖蛋白質の割合が５モル％以下である必要があり、３モル％以下であればより好ましく、１モル％以下であれば最も好ましい。なぜなら、このようにフコースが結合している糖鎖構造を有する糖蛋白質の割合が５モル％、３モル％または１モル％以下であれば、上述の糖蛋白質が抗体の場合には、哺乳動物の体内におけるＡＤＣＣ活性を向上することができ、上述の糖蛋白質が抗体であるか否かとは関係なく、哺乳動物の体内における抗原性を低減できるためである。
【００７８】
さらに、上述の糖蛋白質のうち、Ｎ−グリコシド結合糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにα−１，６フコースが結合している糖鎖構造を有する糖蛋白質の割合は、５モル％以下であることが好ましく、３モル％以下であればより好ましく、１モル％以下であれば最も好ましい。なぜなら、上述の糖蛋白質が糖鎖を有する抗体である場合に、この割合が５モル％、３モル％または１モル％以下であれば、その抗体が、哺乳動物細胞における通常の糖鎖構造を有する同種類の抗体に比べて、増強されたＡＤＣＣ活性を有することになるため、好ましいのである。
【００７９】
ここで、ＡＤＣＣ活性とは、腫瘍細胞等に結合した抗体が、抗体Ｆｃ領域とキラー細胞、ナチュラルキラー細胞、活性化されたマクロファージ等のエフェクター細胞表面上に存在するＦｃレセプターの結合を介してエフェクター細胞を活性化し、腫瘍細胞等を障害する活性を意味する［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｐｔｅｒ ２．１（１９９５）］。
【００８０】
さらに、上述の糖蛋白質のうち、Ｎ−グリコシド結合糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにα−１，３フコースが結合している糖鎖構造を有する糖蛋白質の割合は、５モル％以下であることが好ましく、３モル％以下であればより好ましく、１モル％以下であれば最も好ましい。なぜなら、この割合が５モル％、３モル％または１モル％以下であれば、昆虫細胞における通常の糖鎖構造を有する同種類の糖蛋白質に比べて、哺乳動物の生体内で低減された抗原性を有することになるからである。このような抗原性の低減は抗体以外の糖蛋白質の糖鎖構造についてもあてはまる。
【００８１】
そして、上述の絹糸腺細胞は、βガラクトース転移酵素を発現するように形質転換されていてもよい。そして、その場合には、上述の糖蛋白質には、下記化学式（５）、（６）または（７）で示される糖鎖構造
【化１２】
【化１３】
【化１４】
を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質が含まれることが好ましい。
【００８２】
一般に、哺乳動物における糖蛋白質の糖鎖構造の多くはこのような共通のコア構造を有することが知られているからである。すなわち、このような糖鎖構造を有していれば、哺乳動物の体内に投与した場合に、抗原性をさらに低減でき、また、糖蛋白質の安定性や生理活性などを、哺乳動物における糖蛋白質と同等にすることができるからである。
【００８３】
そして、上述の糖蛋白質のうち、化学式（５）、（６）または（７）で示される糖鎖構造を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質の割合が１モル％以上であることが好ましく、２モル％以上であることがより好ましく、５モル％以上であることが特に好ましい。
【００８４】
化学式（５）、（６）または（７）で示される糖鎖構造を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質の割合が１モル％以上、２モル％以上または５モル％以上であれば、その糖蛋白質のＮ−グリコシド結合糖鎖は、通常の昆虫細胞によって生産される糖蛋白質のＮ−グリコシド結合糖鎖に比べて、著しくヒトをはじめとする哺乳動物の細胞で生産される糖蛋白質のＮ−グリコシド結合糖鎖の糖鎖構造に近似していることになり、ほとんど完全にいわゆる「糖鎖がヒト型化」された糖蛋白質であるということになる。そして、「糖鎖がヒト型化」された糖蛋白質であることによって、哺乳動物の体内に投与した場合に、抗原性をより低減でき、また、糖蛋白質の安定性や生理活性などを、哺乳動物における糖蛋白質と同等にすることができる。
【００８５】
＜糖鎖の分析方法＞
上述の糖蛋白質が糖鎖を有する抗体（代表例としてＩｇＧ）である場合の糖鎖の分析方法について説明する。もっとも、上述の糖蛋白質が糖鎖を有する抗体ではない場合にも、基本的には同様の方法で糖鎖を分析することができる。
【００８６】
中性糖・アミノ糖組成分析
ＩｇＧ糖鎖は、上記で示したように、ガラクトース、マンノース、フコースなどの中性糖、Ｎ−アセチルグルコサミンなどのアミノ糖、シアル酸などの酸性糖から構成されている。抗体の糖鎖の組成分析は、トリフルオロ酢酸等で、糖鎖の酸加水分解を行うことにより、中性糖またはアミノ糖を遊離し、その組成比を分析することができる。具体的な方法として、Ｄｉｏｎｅｘ社製糖組成分析装置（ＢｉｏＬＣ）を用いる方法が挙げられる。ＢｉｏＬＣはＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｐｕｌｓｅｄ ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］によって糖組成を分析する装置である。
【００８７】
また、２−アミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができる。具体的には、公知の方法［アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ.Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），５５（１），２８３−２８４（１９９１）］に従って酸加水分解した試料を２−アミノピリジル化で蛍光ラベル化し、ＨＰＬＣ分析して組成比を算出することができる。
【００８８】
糖鎖構造解析
抗体の糖鎖の構造解析は、２次元糖鎖マップ法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）、生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］により行うことができる。２次元糖鎖マップ法は、例えば、Ｘ軸には逆相クロマトグラフィー糖鎖の保持時間または溶出位置を、Ｙ軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、それぞれプロットし、既知糖鎖のそれらの結果と比較することにより、糖鎖構造を推定する方法である。
【００８９】
具体的には、抗体をヒドラジン分解して、抗体から糖鎖を遊離し、２−アミノピリジン（以下、ＰＡと略記する）による糖鎖の蛍光標識［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），９５，１９７（１９８４）］を行った後、ゲルろ過により糖鎖を過剰のＰＡ化試薬などと分離し、逆相クロマトグラフィーを行う。次いで、分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。これらの結果をもとに、２次元糖鎖マップ上にプロットし、糖鎖スタンダード（ＴａＫａＲａ社製）、文献［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）］とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。さらに各糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなどの質量分析を行い、２次元糖鎖マップ法により推定される構造を確認することができる。
【００９０】
＜糖蛋白質の生産方法＞
本実施形態では、鱗翅目に分類される昆虫の絹糸腺細胞において、糖蛋白質を発現させる。なぜなら、後述する実施例で示したように、鱗翅目に分類される昆虫の絹糸腺細胞において、糖蛋白質を発現させると、従来の技術常識に反して、驚いたことに、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質が得られるからである。
【００９１】
その際、上述の昆虫は、カイコであることが好ましい。なぜなら、カイコの場合には、養蚕業において飼育方法が確立しており、さらに絹糸腺から繭をはき出す能力が優れているため、上述の糖蛋白質を大量に効率よく得ることができるからである。
【００９２】
より具体的には、本発明者等が所属するネオシルク社は、カイコが有する絹タンパク質の合成能力に着目し、絹タンパク質と共に大量の組換えタンパク質を繭中に分泌する形質転換カイコの開発を行ってきている。そして、カイコは、一頭あたり０．３〜０．５ｇの繭を作るが、このほとんどは、後部絹糸腺で合成されるフィブロインや、中部絹糸腺で合成されるセリシンなどの絹タンパク質である。このように、カイコは優れたタンパク質合成能力を有した生物であり、この能力を利用すれば、抗体医薬などの組換えタンパク質を大量に、かつ、安価に生産することができるからである。
【００９３】
さらに、上述の絹糸腺細胞は、中部絹糸腺細胞であることが好ましい。なぜなら、中部絹糸腺ではセリシンが合成されるため、セリシン中に上述の糖蛋白質を発現させれば、フィブロインの周りに存在し、比較的水に溶けやすいセリシン層に、組換えタンパク質を局在させるために、中部絹糸腺で効率良く組換えタンパク質を発現させることができ、繭に含まれる組換えタンパク質を、その立体構造を変性させることなく容易に抽出することが可能となるからである。
【００９４】
すなわち、本実施形態における糖蛋白質の生産方法は、上述の糖蛋白質を発現させる工程が、上述の糖蛋白質を発現するように遺伝的に改変されてなる上述の昆虫個体の絹糸腺において上述の糖蛋白質を含む繭を生成させる工程を含むことが好ましい。ここで、誤解を招かないように注記すれば、昆虫個体の絹糸腺において上述の糖蛋白質を含む繭を生成させるということは、必然的に、昆虫の絹糸腺細胞において上述の糖蛋白質を発現させることになるということに留意されたい。
【００９５】
そして、上述の糖蛋白質を抽出する工程は、上述の絹糸腺から前記糖蛋白質を含む繭を吐出させる工程と、上述の吐出された繭から上述の糖蛋白質を抽出する工程と、を含むことが好ましい。なぜなら、絹糸腺ではフィブロインまたはセリシンが合成されるため、フィブロインまたはセリシン中に上述の糖蛋白質を発現させれば、フィブロイン層またはセリシン層に、組換えタンパク質を局在させるために、絹糸腺で効率良く組換えタンパク質を発現させることができ、繭に含まれる組換えタンパク質を抽出することが可能となるからである。
【００９６】
その際、上述の糖蛋白質が、糖鎖を有する抗体である場合には、上述の糖蛋白質を発現させる工程が、上述の昆虫個体において、その抗体を構成する抗体重鎖および抗体軽鎖を共発現するように改変されてなる前記昆虫個体を用いる工程を含むことが好ましい。このようにすれば、抗体のＨ鎖およびＬ鎖の構造遺伝子が染色体に組み込まれており、Ｈ鎖２分子およびＬ鎖２分子がジスルフィド結合で連結され、かつ、抗原に対する結合活性を有する機能的な抗体分子（ヘテロ２量体）を繭に分泌するトランスジェニックカイコを用いて、完全な抗体分子であるヘテロ２量体を優先的に繭に分泌し、他の昆虫細胞で見られるようなＨ鎖２量体などの不完全な分子が無制御に分泌されることはない。その結果、繭にはＨ鎖２量体などの不完全な分子は含まれず、そのため、繭から完全な抗体分子であるヘテロ２量体を容易に回収することができるからである。
【００９７】
そして、上述の糖蛋白質を発現させる工程は、上述の昆虫個体において、上述の抗体重鎖をコードする遺伝子および上述の抗体軽鎖をコードする遺伝子がともに上述の昆虫のゲノムにおいてセリシンプロモーターの下流に発現可能に設けられている昆虫個体を用いる工程と、上述の繭として、セリシン部に上述の抗体を含む繭を生成させる工程と、を含むことが好ましい。そして、この場合には、上述の糖蛋白質を抽出する工程が、上述の繭を抽出液に浸して、上述の繭の上述のセリシン部から上述の抽出液中に上述の抗体を抽出する工程を含むことが好ましい。
【００９８】
なぜなら、繭を構成する絹糸は、中心に存在するフィブロイン層の周りにセリシン層が存在する構造をしている。絹タンパク質を合成している絹糸腺は、機能的および形態的に、後部絹糸腺、中部絹糸腺、および前部絹糸腺に区別されるが、セリシン層を構成するセリシンは中部絹糸腺で合成され、フィブロイン層を構成するフィブロインは後部絹糸腺で合成される。抗体を発現する組織が中部絹糸腺であった場合、抗体は絹糸のセリシン層へ分泌される。一方、抗体を発現する組織が後部絹糸腺であった場合、抗体は絹糸のフィブロイン層へ分泌される。
【００９９】
そして、セリシン層に抗体を分泌するトランスジェニックカイコを作製するためには、ベクターにおいて、中部絹糸腺で抗体のＨ鎖およびＬ鎖を発現させるために、抗体のＨ鎖およびＬ鎖の構造遺伝子に加えて、例えばそれぞれの構造遺伝子の上流に、中部絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーターを組めばよい。中部絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーターとしては、例えば、セリシン１遺伝子またはセリシン２遺伝子のプロモーターをあげることができる。
【０１００】
このような発現ベクターを用いると、一回の遺伝子導入操作で、セリシン層に抗体を分泌するトランスジェニックカイコを作製することができる。一方、セリシン層に抗体を分泌するトランスジェニックカイコは複数回の遺伝子導入操作によって作製することもできる。例えば、上述の発現ベクターセットを用いて、抗体のＨ鎖を中部絹糸腺で発現するカイコと、抗体のＬ鎖を中部絹糸腺で発現するカイコとを、それぞれ別々に作製し、これらを交配して、次世代のカイコから抗体のＨ鎖およびＬ鎖の両方の遺伝子を有するカイコを選抜してセリシン層に抗体を分泌するトランスジェニックカイコを作製しても良い。
【０１０１】
また、抗体のＨ鎖を発現するカイコに抗体のＬ鎖を発現させるための発現ベクターを導入する、あるいは、抗体のＬ鎖を発現するカイコに抗体のＨ鎖を発現させるための発現ベクターを導入することによって、セリシン層に抗体を分泌するトランスジェニックカイコを作製しても良い。
【０１０２】
もっとも、フィブロイン層に抗体を分泌するトランスジェニックカイコを作製するという方法を排除する趣旨ではない。後部絹糸腺で抗体のＨ鎖およびＬ鎖を発現させるために、抗体のＨ鎖およびＬ鎖の構造遺伝子に加えて、それぞれの構造遺伝子の上流に、例えば後部絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーターが組み込まれているベクターを用いてフィブロイン層に抗体を分泌するトランスジェニックカイコを作製してもかまわない。後部絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーターとしては、例えば、フィブロインＬ鎖、フィブロインＨ鎖、またはフィブロヘキサメリンなどの遺伝子のプロモーターをあげることができる。
【０１０３】
セリシン層に抗体を分泌するトランスジェニックカイコを作製する場合と同様に、フィブロイン層に抗体を分泌するトランスジェニックカイコを作製する場合においても、上述の発現ベクターセットを用いて、複数回の遺伝子導入操作によりトランスジェニックカイコを作製しても良い。抗体のＨ鎖を後部絹糸腺で発現するカイコと、抗体のＬ鎖を後部絹糸腺で発現するカイコとを、それぞれ別々に作製し、これらを交配して、次世代カイコから抗体のＨ鎖およびＬ鎖の両方の遺伝子を有するカイコを選抜してフィブロイン層に抗体を分泌するトランスジェニックカイコを作製しても良い。また、抗体のＨ鎖を発現するカイコに抗体のＬ鎖を発現させるための発現ベクターを導入する、あるいは、抗体のＬ鎖を発現するカイコに抗体のＨ鎖を発現させるための発現ベクターを導入することによって、フィブロイン層に抗体を分泌するトランスジェニックカイコを作製することもできる。
【０１０４】
これらの発現ベクターは、カイコ染色体へ遺伝子を導入するための機能を有している。例えば、昆虫由来のＤＮＡ型トランスポゾンの部分配列が組み込まれていれば、遺伝子をカイコ染色体に導入することが可能である。具体的には、ＤＮＡ型トランスポゾンの末端に存在する一対の逆向き反復配列を有したプラスミドベクターであり、一対の逆向き反復配列に挟まれた領域に、染色体に挿入される遺伝子配列、すなわち、抗体の遺伝子とプロモーターが組み込まれている発現ベクターである。昆虫由来ＤＮＡ型トランスポゾンとしては、ｐｉｇｇｙＢａｃ、ｍａｒｉｎｅｒ（Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ９， １４５−１５５， ２０００）、およびＭｉｎｏｓ（Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ９， ２７７−２８１， ２０００）などが知られているが、この中でもｐｉｇｇｙＢａｃ由来の配列は、最も頻繁に利用されている。トランスジェニックカイコを作製するためには、このプラスミドを、ｐｉｇｇｙＢａｃのトランスポゼース発現ベクター（ヘルパープラスミド）と共にカイコ卵へ微量注入する。このヘルパープラスミドは、ｐｉｇｇｙＢａｃの逆向き反復配列の片方または両方を欠いた、実質的にはｐｉｇｇｙＢａｃのトランスポゼース遺伝子領域のみが組み込まれている組換えプラスミドベクターである。ヘルパープラスミドにおいて、トランスポゼースを発現させるためのプロモーターは、内在性のトランスポゼースプロモーターをそのまま利用しても良いし、あるいは、カイコ・アクチンプロモーターやショウジョウバエＨＳＰ７０プロモーター等を利用してもよい。次世代カイコのスクリーニングを容易にするために、挿入するポリヌクレオチドを組み込んだベクター内に同時にマーカー遺伝子を組み込んでおくこともできる。
【０１０５】
ベクターを微量注入したカイコ卵から孵化した幼虫（Ｆ０世代）を飼育する。得られた全Ｆ０世代のカイコを野生型カイコと、あるいはＦ０カイコ同士で交配し、次世代（Ｆ１世代）のカイコからトランスジェニックカイコを選抜する。トランスジェニックカイコの選抜は、例えばＰＣＲ法やサザンブロット法を用いて行う。また、マーカー遺伝子を組み込んだ場合には、その表現形質を利用して選抜することも可能である。例えばマーカー遺伝子としてＧＦＰ等の蛍光タンパク質遺伝子を利用した場合には、Ｆ１世代のカイコ卵や幼虫に励起光を照射し、蛍光タンパク質の発する蛍光を検出することにより行うことができる。以上のような方法によりトランスジェニックカイコを作出することができる。
【０１０６】
トランスジェニックカイコの繭から、機能的な抗体分子を回収する際には、抗体がセリシン層に局在する場合はセリシン層から、フィブロイン層に含まれている場合はフィブロイン層から回収する。セリシン層からの抗体の回収は、特に容易に実施することができる。セリシン層を構成するセリシンは親水性であるため、この層に局在する組換えタンパク質は、タンパク質を変性させてしまう溶液を用いることなく抽出することが可能である。セリシン層から抗体を抽出するための抽出液は、抗体の抽出が可能であるものならば特段の制限はない。例えば、中性の塩類溶液であっても良いし、界面活性剤や、その他、抽出を効率的に行うための試薬などが含まれる溶液であっても良い。これらの抽出液を使って繭から抗体を抽出するには、例えば、断片化した繭を抽出液に浸し攪拌するなどの方法を用いることができる。また、抽出の前に、繭を微粉末化する処理を行っても良いし、抽出の際に超音波処理を行うなどの機械的処理を併用しても良い。
【０１０７】
また、上述のカイコの絹糸腺細胞は、βガラクトース転移酵素を発現するように形質転換されていてもよい。上述の絹糸腺細胞がβガラクトース転移酵素を発現するように形質転換されていれば、カイコ個体に内在している絹糸腺、カイコ個体より摘出した絹糸腺組織、またはカイコ個体より摘出した絹糸腺組織より得られる絹糸腺細胞も、同様にβガラクトース転移酵素を発現する。そして、その酵素の働きによって、Ｎ−グリコシド結合糖鎖の非還元末端にさらにβガラクトースが付加されて、上述の化学式（５）、（６）または（７）で示される糖鎖構造を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質が生産される。
【０１０８】
そして、その糖蛋白質のＮ−グリコシド結合糖鎖は、通常の昆虫細胞によって生産される糖蛋白質のＮ−グリコシド結合糖鎖に比べて、著しくヒトをはじめとする哺乳動物の細胞で生産される糖蛋白質のＮ−グリコシド結合糖鎖の糖鎖構造に近似していることになり、ほとんど完全にいわゆる「糖鎖がヒト型化」された糖蛋白質であるということになる。そして、「糖鎖がヒト型化」された糖蛋白質であることによって、哺乳動物の体内に投与した場合に、抗原性をより低減でき、また、糖蛋白質の安定性や生理活性などを、哺乳動物における糖蛋白質と同等にすることができる。
【０１０９】
このとき、上記の絹糸腺細胞が、さらにＮ−アセチルグルコサミン転移酵素を発現するように形質転換されていてもよい。このようにすれば、Ｎ−グリコシド結合糖鎖の非還元末端にさらにＮ−アセチルグルコサミンが付加されて、上述の化学式（２）、（３）または（４）で示される糖鎖構造を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質の生産が増大されることになる。そして、その結果、上述の化学式（２）、（３）または（４）で示される糖鎖構造の非還元末端に、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素とともに発現されているβガラクトース転移酵素の働きによって、さらにβガラクトースが付加されて、上述の化学式（５）、（６）または（７）で示される糖鎖構造を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質の生産がさらに増大されることになる。
【０１１０】
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【０１１１】
なお、上記実施の形態では昆虫の絹糸腺細胞において、糖蛋白質を発現させるという表現を用いたが、この表現は細胞レベルでの発現、組織レベルでの発現および個体レベルでの発現を含む趣旨の表現であることに留意されたい。
【０１１２】
念のために説明すれば、例えば、細胞レベルでの発現をする際には、バイオリアクターなどで絹糸腺細胞を培養すればよい。組織レベルでの発現をする際には絹糸腺組織を培養すればよい。一方、個体レベルでの発現をする際には、鱗翅目に分類される昆虫個体の絹糸腺において、糖蛋白質を発現させて、繭の中に糖蛋白質を含有させて個体外に吐出させればよい。このようにすれば、細胞レベルで生産する場合にくらべて、養蚕業において培われた技術をそのまま適用することができ、バイオリアクターなどの設備投資が不要となる利点がある。
【０１１３】
また、上述の実施形態では、特にカイコの系統を特定せず、どのようなカイコを用いてもよいが、種々のカイコの中でも、ｐｎｄ−ｗ１系統、錦秋のような実用品種系統全般のカイコの細胞を用いることが特に好ましい。なぜなら、ｐｎｄ−ｗ１系統、錦秋のような実用品種系統全般のカイコの細胞を用いる場合には、Ｎ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質のうち、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合している糖鎖構造を有する糖蛋白質の割合が５モル％以下となることが、後述の実施例において実験データによって実証されているからである。
【実施例】
【０１１４】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【０１１５】
＜実施例１＞
抗体Ｈ鎖および抗体Ｌ鎖のｃＤＮＡのクローニング
ヒトＩｇＧを抗原とするＩｇＧ抗体を産生するマウスハイブリドーマからｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素とｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを用いてｃＤＮＡを合成した。抗体Ｈ鎖および抗体Ｌ鎖それぞれのＯＲＦをコードするｃＤＮＡを、合成したｃＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲによって取得した。
【０１１６】
抗体Ｈ鎖のｃＤＮＡを増幅するために用いたプライマーの配列は、５’−ＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＴＧＧＧＴＧＴＧＧＡＣ−３’（配列番号：１）および５’−ＧＡＴＡＴＣＴＴＡＴＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡ−３’（配列番号：２）であり、抗体Ｌ鎖のｃＤＮＡを増幅するための用いたプライマーの配列は、５’−ＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＴＣＴＣＡＧＣＴＣ−３’（配列番号：３）および５’−ＧＡＴＡＴＣＴＴＡＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号：４）である。
【０１１７】
それぞれのプライマーの５’−側両端にはＥｃｏＲＶ制限酵素サイト認識配列が付加されている。得られたＰＣＲ産物をクローニングベクターｐＣＲ４ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ＤＮＡシークエンサーにより塩基配列を解析し、該ＰＣＲ産物が抗体Ｈ鎖および抗体Ｌ鎖をコードするｃＤＮＡであることを確認した。抗体Ｈ鎖および抗体Ｌ鎖ｃＤＮＡを含有するベクターを、以下、それぞれＩｇＧ（Ｈ）／ｐＣＲ４、ＩｇＧ（Ｌ）／ｐＣＲ４と表記する。
【０１１８】
＜実施例２＞
トランスジェニックカイコ作製用ベクターの構築
５’末端がリン酸化されたオリゴヌクレオチド５’−ＡＡＴＴＣＣＴＴＡＡＧＣＴＣＧＡＧＴＣＧＣＧＡ−３’（配列番号：５）と５’−ＡＡＴＴＴＣＧＣＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴＴＡＡＧＧ−３’（配列番号：６）をアニーリングさせた２本鎖オリゴヌクレオチドを作製した。
【０１１９】
この２本鎖オリゴヌクレオチドは、ＡｆｌＩＩ、ＸｈｏＩ、ＮｒｕＩの制限酵素認識配列を有し、両末端はＥｃｏＲＩサイトに連結可能な構造をしている。マーカー遺伝子として眼や神経系で発現する赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）遺伝子を有するｐｉｇｇｙＢａｃベクターであるｐＢａｃ［３ｘＰ３−ＤｓＲｅｄ／ｐＡ］（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１，５２−５６（２００３））のＥｃｏＲＩサイトに、この２本鎖オリゴヌクレオチドを挿入し、ｐＢａｃ［３ｘＰ３−ＤｓＲｅｄ／ｐＡ］ベクターにＡｆｌＩＩ、ＸｈｏＩ、ＮｒｕＩの制限酵素認識配列を挿入した。
【０１２０】
さらに、特開２００６−１０９７７２号公報の実施例１に記載されている「ｈｒ３とセリシン１プロモーターの下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するベクター」をテンプレートとしたＰＣＲによって、ｈｒ３とセリシン１プロモーターからなり、かつ両末端にＸｈｏＩサイトを有したＤＮＡ断片を増幅した。用いたプライマーは、５’−ＣＴＣＧＡＧＧＡＴＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＣ−３’（配列番号：７）および５’−ＣＴＣＧＡＧＣＣＣＧＡＴＧＡＴＡＡＧＡＣＧＡＣＴＡＴＧ−３’（配列番号：８）である。
【０１２１】
増幅したＤＮＡ断片をＸｈｏＩで消化した後、上記のＡｆｌＩＩ、ＸｈｏＩ、ＮｒｕＩの制限酵素認識配列を挿入したｐＢａｃ［３ｘＰ３−ＤｓＲｅｄ／ｐＡ］ベクターのＸｈｏＩサイトに挿入した。これをｐＭＳＧ１．１Ｒと表記する。このベクターのマーカー遺伝子であるＤｓＲｅｄ遺伝子を、緑色蛍光タンパクＭｏｎｓｔｅｒ ＧｒｅｅｎＧＦＰ（ｈＭＧＦＰ）の遺伝子に置き換えたものも作製した。これをｐＭＳＧ１．１ＭＧと表記する。
【０１２２】
実施例１で得られたＩｇＧ（Ｈ）／ｐＣＲ４、および、ＩｇＧ（Ｌ）／ｐＣＲ４ベクターから、抗体Ｈ鎖、およびＬ鎖のｃＤＮＡ断片をＥｃｏＲＶで切り出し、上記のｐＭＳＧ１．１Ｒ、およびｐＭＳＧ１．１ＭＧにそれぞれ挿入し、抗体Ｈ鎖、および抗体Ｌ鎖をそれぞれ発現するベクターＩｇＧ（Ｈ）／ｐＭＳＧ１．１Ｒ、およびＩｇＧ（Ｌ）／ｐＭＳＧ１．１ＭＧを構築した（図１）。なお、この図１では、それぞれの略語の意味は、ｐｉｇｇｙＢａｃＲ：ｐｉｇｇｙＢａｃ ３’末端側配列、３ｘＰ３−ＴＡＴＡ：眼や神経系で発現を引き起こすプロモーター、ＤｓＲｅｄ：赤色蛍光タンパク質遺伝子、ｈＭＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質（Ｍｏｎｓｔｅｒ ＧｒｅｅｎＧＦＰ）の遺伝子、ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ：ＳＶ４０由来ポリＡ付加シグナル、Ｐｓｅｒ１：カイコセリシン１遺伝子プロモーター、ＨＲ３：ＢｍＮＰ ｈｒ３、ＩｇＧ（Ｈ）：マウスＩｇＧ抗体Ｈ鎖遺伝子、ＩｇＧ（Ｌ）：マウスＩｇＧ抗体Ｌ鎖遺伝子、ＦｉｂＬ ｐｏｌｙＡ；カイコフィブロインＬ鎖ポリＡ付加シグナル、ｐｉｇｇｙＢａｃＬ：ｐｉｇｇｙＢａｃ ５’末端側配列、Ａｍｐ：抗生物質アンピシリン耐性遺伝子の通りである。
【０１２３】
＜実施例３＞
抗体Ｈ鎖、抗体Ｌ鎖をセリシン層に分泌するトランスジェニックカイコの作出
ＩｇＧ（Ｈ）／ｐＭＳＧ１．１Ｒを塩化セシウム超遠心法で精製した後、それぞれをヘルパープラスミドであるｐＨＡ３ＰＩＧ（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，８１−８４（２０００））とプラスミド量が１：１になるように混合し、さらにエタノール沈殿を行った後、ＩｇＧ（Ｈ）／ｐＭＳＧ１．１ＲとｐＨＡ３ＰＩＧの濃度がそれぞれ２００μｇ／ｍｌになるようにインジェクションバッファー（０．５ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０，５ｍＭ ＫＣｌ）に溶解した。このＩｇＧ（Ｈ）／ｐＭＳＧ１．１Ｒを含むＤＮＡ溶液を、産卵後２〜８時間の前胚盤葉期のカイコ卵（カイコ胚）に、一つの卵あたり約１５〜２０ｎｌの液量で微量注入した。合計２８５４個の卵に微量注入した。上記の操作を、ＩｇＧ（Ｌ）／ｐＭＳＧ１．１ＭＧについても同様の操作を行い、合計３１５４個の卵に微量注入した。
【０１２４】
ベクターＤＮＡ（ＩｇＧ（Ｈ）／ｐＭＳＧ１．１Ｒ、およびＩｇＧ（Ｌ）／ｐＭＳＧ１．１ＭＧ）を微量注入した卵を２５℃でインキュベートしたところ、それぞれ５１６、および６７８個の卵が孵化した。孵化したカイコの飼育を続け、得られた生殖可能な成虫を交配し、それぞれ１３８、および、１３２グループのＦ１卵塊を得た。産卵日から５〜６日目のＦ１卵塊を蛍光実体顕微鏡で観察することにより、眼や神経系から赤色、または緑色蛍光を発するトランスジェニックカイコの卵をスクリーニングした。その結果、トランスジェニックカイコの卵を含む卵塊を、それぞれ１１、および１５グループ得ることができた。得られた卵塊を孵化させ飼育したところ、それぞれ９、および８グループの卵塊に由来するトランスジェニックカイコは、正常に繭を作り蛹となり、さらに羽化して生殖能力を有した成虫になった。そこで、野生型のカイコと交配して、トランスジェニック系統を樹立した。
【０１２５】
＜実施例４＞
抗体Ｈ鎖およびＬ鎖を共発現するトランスジェニックカイコの作出
実施例３で得られた抗体Ｈ鎖と抗体Ｌ鎖のｃＤＮＡをゲノム中に持ったトランスジェニックカイコ成虫を交配し、Ｈ鎖とＬ鎖を共に発現するカイコを作製した。実施例３で得られた２種のカイコのうち任意の一系統ずつを交配し、産卵された卵を飼育した。４齢期に至った段階で、目で発現するマーカー遺伝子の蛍光色（Ｈ鎖−ＤｓＲｅｄの赤色蛍光、Ｌ鎖−ｈＭＧＦＰの緑色蛍光）を観察し、Ｈ鎖およびＬ鎖両方を発現するカイコ（赤色と緑色蛍光が合わさって黄色の蛍光を発する）を選別した。
【０１２６】
得られたＨ鎖およびＬ鎖を発現するカイコを、特開２００６−１０９７７２号公報に記載の“バキュロウイルスＩＥ１を発現するポリヌクレオチドが組み込まれているトランスジェニックカイコ”と交配し、次世代のカイコから、Ｈ鎖、Ｌ鎖、およびＩＥ１の３つの遺伝子を発現するカイコを選別した。このカイコを２５℃で飼育し、繭を作らせた。
【０１２７】
＜実施例５＞
抗体の抽出および精製
繭１ｇをホモジナイザーで粉砕した後、１００ｍｌの３Ｍ 尿素、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０に懸濁し、４℃において２４時間インキュベートした。遠心により繭断片を取り除き、抗体を含む抽出液を回収した。この抽出液を、２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０に対して透析した後、プロテインＧカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライした。カラムを２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０にて洗浄し、吸着した抗体を０．１Ｍグリシン塩酸ｐＨ２．７により溶出した。最後に、溶出液に１Ｍトリスを加えて中和した。以上の操作により、２．４ｍｇの精製抗体を得た。
【０１２８】
＜実施例６＞
抗体に付加された糖鎖の構造解析
本発明者等は、カイコで発現させたマウスＩｇＧ上に付加された糖鎖のピリジルアミノ化するために、カイコで発現させたマウスＩｇＧ（１．２ｍｇ）を下記のプロトコルからなる定法に従って、糖鎖の切り出し、糖鎖の蛍光標識を行った。
【０１２９】
カイコで発現させたマウスＩｇＧからのピリジルアミノ化糖鎖の調製法を説明するための実験プロトコルは以下のとおりである。
Mouse IgG
↓Lyophilization
↓ Hydrazinolysis (100°C, 10h)
↓ N-Acetylation
↓ Pyridylamination
↓Phenol/Chloroform Extraction
↓RP-cartridge
PA-oligosaccharides
【０１３０】
なお、今回、糖タンパク質から糖鎖を切り出す際にヒドラジン分解を用いているが、この方法は酵素による切り出しと異なり、糖鎖やタンパク質の構造に関係なく糖鎖を切り出すことが可能であること、切り出し反応が定量的であることなどの利点がある。
【０１３１】
また糖鎖の蛍光標識に用いたピリジルアミノ化法であるが、どのような糖鎖の還元末端に対してもピリジルアミノ基を導入することが可能であり、その反応が定量的であること、ピリジルアミノ化糖鎖（ＰＡ糖鎖）は非常に高感度に検出することが可能であること、定量性に優れていること、逆相ＨＰＬＣでの分離がよいこと、ピリジルアミノ基が糖鎖構造解析を行う際に用いられる酸水解やスミス分解、メタノリシス、アセトリシスといった化学反応で脱離しないこと、質量分析器のような分析機器と非常に相性がよいことなどの利点が挙げられる。
【０１３２】
具体的には、精製した抗体１．２ｍｇを凍結乾燥し、無水ヒドラジンを加えて、１００℃にて１０時間処理した。次に、定法に従い、ヒドラジン分解により切り出した糖鎖の還元末端をＮ−アセチル化し、さらに、還元末端をピリジルアミノ化（ＰＡ化）した。
【０１３３】
次いで、カイコで発現させたマウスＩｇＧ上の糖鎖の質量分析を行うために、上記のようにして得られたＰＡ糖鎖を質量分析装置で分析した（図２）。その結果、図２に示すように、ハイマンノース型糖鎖であるＭ５やＭ６が検出された。また非還元末端にガラクトースを持たない糖鎖も検出された。
【０１３４】
続いて、カイコで発現させたマウスＩｇＧ上の糖鎖の糖鎖構造解析を行うために、上述のようにして得られたＰＡ糖鎖について、下記に示す手順でさらに構造解析をおこなった。
【０１３５】
上述のようにして得られたピリジルアミノ化糖鎖の構造解析の手順を説明するための実験プロトコルは以下の通りである。
PA-oligosaccharides
↓ Mono-Q HPLC
↓ Size-fractionation HPLC
↓ Reversed-phase HPLC
↓MALDI-TOF-MS
【０１３６】
具体的には、まず、カイコで発現させたマウスＩｇＧから調製されたＰＡ糖鎖のＭｏｎｏ−Ｑ ＨＰＬＣによる分離を行った。得られたＰＡ糖鎖を陰イオン交換ＨＰＬＣ（Ｍｏｎｏ−Ｑ ＨＰＬＣ）で分離した結果を図３に示す。図３における矢印は中性糖（Ｎ）、シアル酸が１つ結合している糖鎖（Ｓ１）、シアル酸が２つ結合している糖鎖（Ｓ２）、シアル酸が３つ結合している糖鎖（Ｓ３）、シアル酸が４つ結合している糖鎖（Ｓ４）の溶出位置を示している。ピークは中性糖部分にのみに検出されたことからその部分を分取し、次の実験をおこなった。
【０１３７】
次いで、カイコで発現させたマウスＩｇＧから調製されたＰＡ糖鎖のＳｉｚｅ−ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ＨＰＬＣによる分離を行った。得られた中性糖画分をサイズ分画ＨＰＬＣ（Ｓｉｚｅ−ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ＨＰＬＣ）で分離した結果を図４に示す。図４における矢印はＧＮがＮ−アセチルグルコサミン−ＰＡの溶出位置を示し、Ｍはハイマンノース糖鎖の溶出位置を示している。分析の結果、９種類のピークが得られ、それぞれを分取し、濃縮後、それぞれを使って次の実験をおこなった。
【０１３８】
続いて、カイコで発現させたマウスＩｇＧから調製されたＰＡ糖鎖のＲｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ ＨＰＬＣによる分離を行った。サイズ分画ＨＰＬＣで得られた９つの画分を逆相ＨＰＬＣ（Ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ ＨＰＬＣ）で分離した結果を図５に示す。それぞれの画分を質量分析で分析した結果を図５の右側に示している。６つのメジャーなピークが検出されたので、それぞれを分取し、二次元糖鎖マップ、質量分析器を使って構造解析をおこなった。
【０１３９】
カイコで発現させたマウスＩｇＧから調製されたＰＡ糖鎖の構造として、今回決定した糖鎖の構造をまとめた結果を図６に示す。図６におけるＦｒａｃｔｉｏｎ Ｎｏ．は図５の対応するＦｒａｃｔｉｏｎを示しており、図中の括弧内の数値は、Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｎｏ．３からＮｏ．８までに含まれる糖鎖のモル数と、合計モル数（７９２ｐｍｏｌ）に対する、各Ｆｒａｃｔｉｏｎ中の糖鎖モル数を百分率（％）で表示したものである。糖鎖分析に用いた、カイコで発現させたマウスＩｇＧの１．２ｍｇ（８，０００ｐｍｏｌ）には、糖鎖が１６，０００ｐｍｏｌ含まれると推定される。Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｎｏ．３からＮｏ．８までに含まれる糖鎖のモル数の合計は７９２ｐｍｏｌモルであり、糖鎖の回収率は５％であった。
【０１４０】
図６に示したように、カイコ中部絹糸腺で発現させ、繭糸のセリシン層に分泌された抗体（マウスＩｇＧ）には糖鎖が付加されており、その糖鎖の構造については、主なもので６種類が存在する。この６種類の糖鎖のいずれにおいても、糖鎖の基部に存在するＧｌｃＮＡｃの６位に付加されたフコース（α１，６フコース）、およびＧｌｃＮＡｃの３位に付加されたフコース（α１，３フコース）の存在を認めることができなかった。このように、カイコ中部絹糸腺で発現した抗体に付加された糖鎖は、そのほとんどがフコシル化をうけていないことが明らかになった。検出された糖鎖の内、最も少ない量の糖鎖の割合が、２．７モル％であることから、フコシル化を受けた糖鎖の割合は、５モル％以下であると推定した。
【０１４１】
また、従来の知見において昆虫由来の糖鎖の特徴といわれていたパウチマンノース型（少マンノース型）糖鎖は検出されず、かわりに、高マンノース型および、トリマンノシルコア構造（パウチマンノース）の１−３結合マンノース及び１−６結合マンノースにＧｌｃＮＡｃが１個または２個β１−２結合し、かつＧａｌが結合していない二分岐型の構造を持った糖鎖が多く検出された。
【０１４２】
＜実施例７＞
ｐｎｄ−ｗ１系統および実用品種系統（錦秋）におけるカイコ組織（中部絹糸腺、脂肪体）および繭の糖鎖構造解析
実施例６で得られた結果の理由について、Ａ）カイコ品種に起因するもの、Ｂ）カイコ組織に起因するもの、および、Ｃ）発現させたタンパク質に起因するもの、の３つの理由が考えられた。これらについて検証するために、ｐｎｄ−ｗ１系統と実用品種系統（錦秋）の２種類のカイコ系統について、中部絹糸腺、脂肪体の２種類の組織と繭について、前記した方法に従い、糖鎖構造解析を行った。糖鎖構造解析の結果を図８-図１３に示す。なお、図８-図１３の中の％表記の数値は、逆相ＨＰＬＣで分取したメジャーなピークの総糖鎖モル数より計算された存在比を百分率（％）で表示したものである。また、高マンノース型である、構造名Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９等の構造表記は構造異性体を含む。
【０１４３】
ｐｎｄ−ｗ１系統の中部絹糸腺から得られた糖鎖は、繭から精製したマウスＩｇＧの糖鎖と同様な構造をしていた。すなわち、昆虫由来の糖鎖構造でもっとも多いとされているパウチマンノース型（Ｍ３）が約６％と非常に少なく、Ｍ３にＧｌｃＮＡｃが少なくとも１つ付加した糖鎖が約４０％検出された。この内、ＧｌｃＮＡｃが２つ付加した糖鎖（ＧＮ２）は、２３％も存在していた。また一部に高マンノース型の構造も含まれていた（図８）。一方脂肪体では、ＧｌｃＮＡｃ付加がなく、Ｍ３およびＦＭ２なる構造が非常に多いという点で、中部絹糸腺と大きく異なっていた（図１２）。脂肪体で見られた糖鎖の構造は、従来から知られている昆虫の糖鎖構造と一致している。ｐｎｄ−ｗ１系統の繭では、中部絹糸腺と同様に、Ｍ３が少なく、ＧｌｃＮＡｃが２つ付加した構造（ＧＮ２）が約４０％と非常に多かった（図１０）。錦秋についても同様な解析を行ったが、ｐｎｄ−ｗ１と比較して、組織、繭ともに、糖鎖構造で大きな違いはなく品種の違いによる差異は見られなかった（図９、図１１、図１３）。
【０１４４】
以上のことより、繭から精製したマウスＩｇＧの糖鎖構造が、従来から報告されていた昆虫特有の糖鎖構造と異なる理由は、マウスＩｇＧを合成した組織（絹糸腺）の特異性に起因することが明らかになった。
【０１４５】
バキュロウイルス発現系では、ウイルスを脂肪体へ感染させて組換えタンパク質を発現させるのに対し、発明者らの技術は組換えタンパク質を発現させるための組織として中部絹糸腺を用いる。この中部絹糸腺での発現が、フコースの付加が無く、かつパウチマンノースが少ない糖鎖を、タンパク質に付加させることがわかった。これは、組換えタンパク質を中部絹糸腺で産生することが、ヒト型（哺乳動物型）糖鎖付加を目指す場合において非常に有利であることを意味している。
【０１４６】
＜実施例８＞
β１，４ガラクトース転移酵素１とヒトβ１，２Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素２を発現するトランスジェニックカイコの作製
ヒトβ１，４ガラクトース転移酵素１（以下、ｈＧａｌＴ１と表記する）、およびヒトβ１，２Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素２（以下、ｈＧｎＴ２と表記する）のｃＤＮＡのクローニングを行った。
【０１４７】
ヒト線維芽細胞からｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素とｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを用いてｃＤＮＡを合成した。ｈＧａｌＴ１および、ｈＧｎＴ２それぞれのＯＲＦをコードするｃＤＮＡを、合成したｃＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲによって取得した。
【０１４８】
ｈＧａｌＴ１のｃＤＮＡを増幅するために用いたプライマーの配列は、５’−ＡＴＧＡＧＧＣＴＴＣＧＧＧＡＧＣＣＧＣＴ−３’（配列番号：９）および５’−ＣＴＡＧＣＴＣＧＧＴＧＴＣＣＣＧＡＴＧＴＣＣＡ−３’（配列番号：１０）であり、ｈＧｎＴ２のｃＤＮＡを増幅するための用いたプライマーの配列は、５’−ＡＴＧＡＧＧＴＴＣＣＧＣＡＴＣＴＡＣＡＡＡ−３’（配列番号：１１）および５’−ＴＣＡＣＴＧＣＡＧＴＣＴＴＣＴＡＴＡＡＣＴＴＴＴＡＣＡＧＡＧ−３’（配列番号：１２）である。
【０１４９】
得られたＰＣＲ産物をクローニングベクターｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ２−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ＤＮＡシークエンサーにより塩基配列を解析し、該ＰＣＲ産物がｈＧａｌＴ１およびｈＧｎＴ２をコードするｃＤＮＡであることを確認した。ｈＧａｌＴ１およびｈＧｎＴ２ｃＤＮＡを含有するベクターを、以下、それぞれｈＧａｌＴ１／ｐＣＲ２、ｈＧｎＴ２／ｐＣＲ２と表記する。
【０１５０】
実施例２に記載したｐＭＳＧ１．１Ｒは、セリシンプロモーターとフィブロインＬ鎖ｐｏｌｙＡ付加配列（以下、プロモーター−ｐｏｌｙＡカセットと表記する）を持ち、その間に目的タンパク質のｃＤＮＡを導入できるよう設計されている。本実験では、２つの遺伝子を同時に発現させるために、ｐＭＳＧ１．１Ｒの制限酵素ＡｓｃＩサイトに、さらにプロモーター−ｐｏｌｙＡカセットを組み込み、新たなベクター（ｐＭＳＧ３．１Ｒ）を構築した。
【０１５１】
ｈＧａｌＴ１およびｈＧｎＴ２の翻訳効率を上げるため、カイコガ核多角体病ウイルス（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ：以下、ＢｍＮＰＶと表記）由来のポリヘドリン５’非翻訳領域（以下、５’ＵＴＲと表記、配列：ＡＡＧＴＡＴＴＴＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＧＴＡＡＣＡＧＴＴＴＴＧＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＴ（配列番号：１３））を、ｈＧａｌＴ１およびｈＧｎＴ２のｃＤＮＡの５’側に付加し、さらに、ｃＤＮＡの５’および３’の両端にＮｒｕＩの制限酵認識配列を付加するために、以下に記載したプライマーを用いたＰＣＲを行った。
【０１５２】
プライマーの配列は、ｈＧａｌＴ１用に、５’−ＣＡＣＣＴＣＧＣＧＡＡＡＧＴＡＴＴＴＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＧＴＡＡＣＡＧＴＴＴＴＧＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＴＡＴＧＡＡＧＴＴＴＣＧＧＧＡＧＣＣＧＣＴＣ−３’（配列番号：１４）と、５’−ＴＣＧＣＧＡＴＴＡＧＣＴＣＧＧＣＧＴＣＣＣＧＡＴＧＴＣ−３’（配列番号：１５）の２種、ｈＧｎＴ２用に、５’−ＣＡＣＣＴＣＧＣＧＡＡＡＧＴＡＴＴＴＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＧＴＡＡＣＡＧＴＴＴＴＧＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＴＡＴＧＡＧＧＴＴＣＣＧＣＡＴＣＴＡＣＡ−３’（配列番号：１６）と、５’−ＴＣＧＣＧＡＴＴＡＣＴＧＣＡＧＴＣＴＴＣＴＡＴＡＡＣＴＴＴＴＡＣＡＧＡＧＴ−３’（配列番号：１７）の２種である。
【０１５３】
ｈＧａｌＴ１／ｐＣＲ２、ｈＧｎＴ２／ｐＣＲ２をテンプレートとして、それぞれＰＣＲ法にてＤＮＡ断片を増幅した。増幅産物をクローニングベクタ-ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ２−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、得られたベクターを、ＵＴＲ−ｈＧａｌＴ１／ｐＣＲ２、およびＵＴＲ−ｈＧｎＴ２／ｐＣＲ２とした。
【０１５４】
ＵＴＲ−ｈＧｎＴ２／ｐＣＲ２を制限酵素ＮｒｕＩで消化し、得られたＵＴＲ−ｈＧｎＴ２のＤＮＡ断片を、ｐＭＳＧ３．１ＭＧの制限酵素Ｅｃｏ４７ＩＩＩサイトに挿入した。つぎに、ＵＴＲ−ＧａｌＴ１／ｐＣＲ２をＮｒｕＩで消化することにより得られたＵＴＲ−ｈＧａｌＴ１断片を、ＵＴＲ−ｈＧｎＴ２を挿入したベクターのＮｒｕＩサイトに挿入し、塩基配列と挿入方向が正しい事を確認した。このベクターを、ｈＧａｌＴ１−ｈＧｎＴ２／ｐＭＳＧ３．１Ｒと表記する（図１４）。
【０１５５】
図１４には、中部絹糸腺において、ｈＧａｌＴおよびｈＧｎＴ２を発現するトランスジェニックカイコを作出するためのベクターの構造を示した。この図１４では、それぞれの略称の意味は、ｐｉｇｇｙＢａｃＲ：ｐｉｇｇｙＢａｃ ３’末端側配列、３ｘＰ３−ＴＡＴＡ：眼や神経系で発現を引き起こすプロモーター、ＤｓＲｅｄ：赤色蛍光タンパク質遺伝子、ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ：ＳＶ４０由来ポリＡ付加シグナル、Ｐｓｅｒ１：カイコセリシン１遺伝子プロモーター、ＨＲ３：ＢｍＮＰ ｈｒ３、ｈＧａｌＴ１：ヒトβ１，４−ガラクトース転移酵素１遺伝子、ｈＧｎＴ２：ヒトβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素２遺伝子、ＦｉｂＬ ｐｏｌｙＡ；カイコフィブロインＬ鎖ポリＡ付加シグナル、ｐｉｇｇｙＢａｃＬ：ｐｉｇｇｙＢａｃ ５’末端側配列、Ａｍｐ：抗生物質アンピシリン耐性遺伝子、の通りである。
【０１５６】
＜実施例９＞
ｈＧａｌＴ１およびｈＧｎＴ２を発現するトランスジェニックカイコの作出
ｈＧａｌＴ１−ｈＧｎＴ２／ｐＭＳＧ３．１Ｒを、実施例３に記載した方法と同様の方法により、合計２９８４個の卵に微量注入した。
【０１５７】
ＤＮＡを微量注入した卵を２５℃でインキュベートしたところ、それぞれ８１９個の卵が孵化した。孵化したカイコの飼育を続け、得られた生殖可能な成虫を交配し、１８８グループのＦ１卵塊を得た。産卵日から５〜６日目のＦ１卵塊を蛍光実体顕微鏡で観察することにより、眼や神経系から赤色蛍光を発するトランスジェニックカイコの卵をスクリーニングした。その結果、トランスジェニックカイコの卵を含む卵塊を、それぞれ１５グループ得ることができた。得られた卵塊を孵化させ飼育したところ、１４グループの卵塊に由来するトランスジェニックカイコ（以下、ＧａｌＴ−ＧｎＴ２−ＴＧカイコと表記する）は、正常に繭を作り蛹となり、さらに羽化して生殖能力を有した成虫になった。これらのカイコを野生型のカイコと交配して、８系統のＧａｌＴ−ＧｎＴ２−ＴＧカイコを樹立した。
【０１５８】
＜実施例１０＞
ＧａｌＴ−ＧｎＴ２−ＴＧカイコの繭における糖鎖構造の解析
野生型カイコおよびＧａｌＴ−ＧｎＴ２−ＴＧカイコの繭に含まれる糖鎖の構造を、実施例６に示した方法により解析した。
【０１５９】
樹立した８系統のＧａｌＴ−ＧｎＴ２−ＴＧカイコのうち、３系統について糖鎖の構造解析を実施した。これら解析に用いた系統名は、それぞれ、１７−２、７５−１、および６５−４である。糖鎖の構造解析に先立ち、これら３系統のトランスジェニックカイコの中部絹糸腺におけるｈＧａｌＴ１の発現量を、抗ｈＧａｌＴ１抗体を用いたウエスタンブロット法（方法は特開２００６-１０９７７２の実施例などに記載）により解析した。その結果、ｈＧａｌＴ１の発現量は、低い順より、１７−２、７５−１、６５−４であった（図１５）。
【０１６０】
野生型カイコ、およびＧａｌＴ−ＧｎＴ２−ＴＧカイコ３系統（１７−２、７５−１、６５−４）の糖鎖構造解析の結果を図１６に示す。図中の％表記の数値は、逆相ＨＰＬＣで分取したメジャーなピークの総糖鎖モル数より計算された存在比を百分率（％）で表示したものである。なお、図中の％表記の数値は、逆相ＨＰＬＣで分取したメジャーなピークの総糖鎖モル数より計算された存在比を百分率（％）で表示したものである。
【０１６１】
βガラクトース（以下、Ｇａｌと表記する）が少なくとも１つ付加した構造の糖鎖は、野生型カイコの繭では０％であったのに対し、最もｈＧａｌＴ１の発現量が低い１７‐２の系統で９％であった。これは、βガラクトース糖転移酵素であるｈＧａｌＴ１遺伝子を発現するトランスジェニックカイコの中部絹糸腺において、Ｇａｌが付加されたヒト型糖鎖を付加できることを示している。また、Ｇａｌの付加率については、中部絹糸腺におけるｈＧａｌＴ１の発現量が高い系統（６５‐４）では低く、発現量の低い系統（１７‐２）の方が、Ｇａｌ付加率が高いことが示された。このことにより、Ｇａｌの付加率を上げる方法として、ｈＧａｌＴ１の発現量を低くする方法が有効であることが示された。
【０１６２】
＜実施例１１＞
ＧａｌＴ−ＧｎＴ２−ＴＧカイコでは、さらに中部絹糸腺においてＩｇＧを発現させ、そのＩｇＧにおける糖鎖構造の解析を行うための実験も実施した。その結果、カイコの中部絹糸腺においてＩｇＧを発現させ、さらにβガラクトース転移酵素も発現させることに成功した。なお、このカイコの系統としては、中部絹糸腺におけるｈＧａｌＴ１の発現量が高い系統（６５‐４）よりも、発現量の低い系統（１７‐２）の方が好ましい。なぜなら、既に説明したように、中部絹糸腺におけるｈＧａｌＴ１の発現量が高い系統（６５‐４）では低く、発現量の低い系統（１７‐２）の方が、Ｇａｌ付加率が高いためである。このＩｇＧにおける糖鎖構造の解析結果については、上述の実施例１０のＧａｌＴ−ＧｎＴ２−ＴＧカイコの繭における糖鎖構造の解析結果と同様の結果を得た（ｄａｔａ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ）。
【０１６３】
＜実験結果の考察＞
今回分析したカイコ繭総蛋白質、カイコ脂肪体組織総蛋白質、カイコ絹糸腺組織総蛋白質における糖鎖の組成について分析した結果、さらに文献から得られるＣＨＯ細胞におけるＩｇＧをはじめとする糖蛋白質の糖鎖の組成などを比較すれば、糖鎖ヒト型化に関するカイコ絹糸腺の優位性は明らかである。
【０１６４】
すなわち、昆虫糖鎖のヒト型化には、二つの技術開発（一つは糖鎖の伸長、もう一つはα１，３フコースの除去）が必要となるが、α１，３フコースの除去については、本発明者等の実験によって初めて判明した予想外の結果ではあるが、そもそもカイコの絹糸腺で合成される糖蛋白質の糖鎖には当初からα１，３フコースが存在しないことが上述の実験結果の比較から明らかである。
【０１６５】
また、同様に本発明者等の実験によって初めて判明した予想外の結果ではあるが、上述の実験結果の比較から明らかなように、そもそもカイコの絹糸腺で合成される糖蛋白質の糖鎖には、図８〜図１６における略号ＧＮｂ、ＧＮａおよびＧＮ２のような糖鎖構造を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質、すなわち別の表現をすれば、上述の化学式（２）、（３）または（４）で示される糖鎖構造を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質が２０モル％以上含まれることが明らかとなった。
【０１６６】
一方、従来の知見では、昆虫で合成される糖鎖は、マンノースを３つまたは２つもつ糖鎖（例えば、図８〜図１６における略号Ｍ３、Ｍ２のような糖鎖）が大半であると言われていた。ところが、今回の実験で明らかになったように、カイコの繭から精製したＩｇＧや、絹糸腺や繭に含まれる糖蛋白質の糖鎖ではマンノース５つ（例えば、図８〜図１６における略号Ｍ５）や、ＧｌｃＮＡｃが付いた糖鎖（例えば、図８〜図１６における略号ＧＮｂ、ＧＮａ、ＧＮ２）が多いことがわかった。
【０１６７】
ここで、いわばポジティブコントロールとして用いた比較対象のＣＨＯのデータは、従来公知の文献（Satoru Kamoda et. al, “Capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection for detailed studies on N-linked oligosaccharide profile of therapeutic recombinant monoclonal antibodies”, Journal of Chromatography A, 1133 (2006) 332-339）から引用したＩｇＧの解析結果（上述の図８〜図１６における略号を用いて説明すると、ＧＮ２ 約５１％、ＧＮａ＋ＧＮｂ 約１％、Ｍ５ 約３％、ＧＡ２ ３７％、ＧＡａ／ｂ ７％、Ｍ３ ０％、Ｍ２ ０％）であるが、その他は本発明者等が実際にカイコの繭または組織から切り出した全糖鎖の解析結果である（ＧａｌＴ−ＧｎＴ２−ＴＧカイコについては既に上述の通りに作製されたものを用いた）。
【０１６８】
カイコの脂肪体総蛋白質では、従来公知のバキュロウイルス発現系での主な発現組織となる組織であるが、従来の知見どおりの結果（例えば、図８〜図１６における略号Ｍ３、Ｍ２が大半）という予想通りの結果が得られた。一方、カイコの繭や絹糸腺の総蛋白質では、上述の絹糸腺でのＩｇＧのデータと同様な結果（図８〜図１６における略号Ｍ５、ＧＮ２、ＧＮａ、ＧＮｂが多い）が得られ、カイコの脂肪体よりも、むしろ哺乳動物細胞であるＣＨＯ細胞の糖鎖（哺乳動物型、ヒト型）に近いことがわかる。
【０１６９】
このように、カイコの絹糸腺で合成し、カイコの繭に分泌された糖蛋白質の糖鎖は、糖鎖のヒト型化（糖鎖の伸長とα１，３フコース無し）に関して非常に有利であることがわかる。また、カイコの絹糸腺で抗体を生産する場合のＡＤＣＣ活性の向上には、α１，６フコースの除去が必要であるが、この点についても、本発明者等の実験によって初めて判明した予想外の結果ではあるが、そもそもカイコの絹糸腺で合成される糖蛋白質の糖鎖には当初からα１，６フコースが存在しないことが上述の実験結果の比較から明らかである。すなわち、カイコの絹糸腺で合成し、カイコの繭に分泌された糖蛋白質の糖鎖は、α１，３フコースが除去されており、α１，６フコースも除去されており、糖鎖が伸長されているため、糖鎖のヒト型化に関して非常に有利であり、さらに抗体を生産する場合のＡＤＣＣ活性の向上にも有利であることが明らかである。
【０１７０】
また、本発明者等は、上述した通り、βガラクトース転移酵素（ＧａｌＴ）およびＮ−アセチルグルコサミン転移酵素（ＧｎＴ）を絹糸腺で発現するトランスジェニックカイコを作製し、繭タンパク質の糖鎖解析を行った。その結果は、上述の実験結果の比較のとおりであり、比率的には改善の余地があるかもしれないが、ＧｌｃＮＡｃの先にβＧａｌが付いた糖鎖を作ることに成功した。これでほぼ糖鎖のヒト型化（哺乳動物化）が完了したことになる。このように、たった１個または２個の遺伝子の導入で、糖鎖のヒト型化（糖鎖の伸長およびα１，３フコ−スの除去）が可能であり、何も遺伝子改変しなくても（α１，６フコースの除去による）ＡＤＣＣ活性の向上が可能であることから、カイコの絹糸腺を糖蛋白質の発現組織として使うメリットははかりしれないと言える。
【０１７１】
ここで、絹糸腺を発現組織として使っているわけではないが、ＧａｌＴ遺伝子を組み込んだカイコの作製については、特許文献および論文は無いが、学会等では発表されており、ホームページでも以下のＵＲＬに掲載されている。
http://www.jst.go.jp/shincho/db/seika/2006_s/2006_s_9/2006_s_9_koncyukinou/2006_s_9_koncyukinou_3_1_3.htm
【０１７２】
しかしながら、図１６に示したとおり、本発明者等は、ＧａｌＴ遺伝子を組み込んだトランスジェニックカイコを数系統樹立したが、従来公知の知見からは予想外なことに、ＧａｌＴの発現量が高い系統ではβＧａｌの付加は観察されなかった。一方、従来公知の知見からは予想外なことに、ＧａｌＴの発現量がむしろ低い系統では、逆にβＧａｌの付加が起こることが判明した。すなわち、本発明者等の実験によって初めて、正確な理由は判明していないが、カイコの絹糸腺細胞では、ＧａｌＴ発現量が高いと、かえって糖鎖伸長がうまくいかないことが明らかとなった。本発明者等は、この実験後に色々とその理由を検討したが、ヒト細胞では、ＧａｌＴなどの糖転移酵素の発現量が低いため、トランスジェニックカイコでの発現量は、ヒト細胞の１００〜１０００倍高いことが判明した。しかしながら、糖転移酵素の発現量を下げた方がうまくいくことを示唆する記述は、他の発現系に関する従来公知の文献であっても文献的な記述は一切無く、糖鎖に関する専門の大学教員にとっても驚きの結果であった。
【０１７３】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【産業上の利用可能性】
【０１７４】
以上詳しく説明したとおり、鱗翅目に分類される昆虫（カイコ）の絹糸腺細胞（中部絹糸腺細胞）または昆虫個体の絹糸腺そのものを用いることによって、糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質が提供される。そのため、ＡＤＣＣ活性が向上した抗体かつ/または抗原性が低減した糖蛋白質（抗体を含む）を安価にかつ大量に生産することができるので、様々な治療に用いられている抗体医薬・バイオ医薬の原体を安価に大量生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１ａ】図１は、ＩｇＧ（Ｈ）／ｐＭＳＧ１．１ＲおよびＩｇＧ（Ｌ）／ｐＭＳＧ１．１ＭＧベクターの構造を示す図である。中部絹糸腺において、抗体Ｈ鎖を発現するトランスジェニックカイコを作出するためのベクター（ＩｇＧ（Ｈ）／ｐＭＳＧ１．１Ｒ）の構造を上段（図１ａ）に示した。
【図１ｂ】図１は、ＩｇＧ（Ｈ）／ｐＭＳＧ１．１ＲおよびＩｇＧ（Ｌ）／ｐＭＳＧ１．１ＭＧベクターの構造を示す図である。抗体Ｌ鎖を発現するトランスジェニックカイコを作出するためのベクター（ＩｇＧ（Ｌ）／ｐＭＳＧ１．１ＭＧ）の構造を下段（図１ｂ）に示した。
【図２】ＩｇＧ上のＮ−配糖体糖鎖の質量分析結果を示すチャートである。
【図３】カイコで発現させたマウスＩｇＧから調製されたＰＡ糖鎖を陰イオン交換ＨＰＬＣで分離した結果を示すチャートである。
【図４】得られた中性糖鎖をＳｉｚｅ−ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ＨＰＬＣで分離した結果を示すチャートである。
【図５】得られた糖鎖をＲｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ ＨＰＬＣで分離した結果を示すチャートである。
【図６】カイコで発現させたマウスＩｇＧ糖鎖の構造をまとめた糖鎖構造図である。図中の括弧内の数値は、Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｎｏ．３からＮｏ．８までに含まれる糖鎖のモル数と、合計モル数に対する、各Ｆｒａｃｔｉｏｎ中の糖鎖モル数を百分率（％）で表示したものである。
【図７】昆虫および哺乳動物でのＮ結合型糖鎖の生成経路について説明するための概念図である。
【図８】ｐｎｄ−ｗ１の中部絹糸腺における糖鎖構造をまとめた糖鎖構造図である。
【図９】錦秋の中部絹糸腺における糖鎖構造をまとめた糖鎖構造図である。
【図１０】ｐｎｄ−ｗ１のマユにおける糖鎖構造をまとめた糖鎖構造図である。
【図１１】錦秋のマユにおける糖鎖構造をまとめた糖鎖構造図である。
【図１２】ｐｎｄ−ｗ１の脂肪体における糖鎖構造をまとめた糖鎖構造図である。
【図１３】錦秋の脂肪体における糖鎖構造をまとめた糖鎖構造図である。
【図１４】ｈＧａｌＴ１−ｈＧｎＴ２／ｐＭＳＧ３．１Ｒベクターの構造を示したベクター構造図である。
【図１５】ＧａｌＴ−ＧｎＴ２−ＴＧカイコ３系統の中部絹糸腺におけるｈＧａｌＴ１の発現量の比較結果を示す電気泳動写真の図である。
【図１６】ＧａｌＴ−ＧｎＴ２−ＴＧカイコの繭中の糖鎖構造を比較した糖鎖構造図である。図中の数値は、糖鎖の合計モル数に対する、各Ｆｒａｃｔｉｏｎ中の糖鎖モル数を百分率（％）で表示したものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質の生産方法であって、
昆虫の絹糸腺細胞において、前記糖蛋白質を発現させる工程を含む、
糖蛋白質の生産方法。
【請求項２】
請求項１記載の糖蛋白質の生産方法において、
前記昆虫が鱗翅目に分類される昆虫である、
糖蛋白質の生産方法。
【請求項３】
請求項２記載の糖蛋白質の生産方法において、
前記昆虫がカイコである、
糖蛋白質の生産方法。
【請求項４】
請求項１乃至３いずれかに記載の糖蛋白質の生産方法であって、
前記絹糸腺細胞が中部絹糸腺細胞である、
糖蛋白質の生産方法。
【請求項５】
請求項１乃至４いずれかに記載の糖蛋白質の生産方法において、
前記糖蛋白質には、下記化学式（１）で示される糖鎖構造を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質が含まれる、
【化１】
糖蛋白質の生産方法。
【請求項６】
請求項５記載の糖蛋白質の生産方法において、
前記糖蛋白質には、下記化学式（２）、（３）または（４）で示される糖鎖構造を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質が含まれる、
【化２】
【化３】
【化４】
糖蛋白質の生産方法。
【請求項７】
請求項１乃至６いずれかに記載の糖蛋白質の生産方法において、
前記糖蛋白質が糖鎖を有する抗体である、
糖蛋白質の生産方法。
【請求項８】
請求項１乃至７いずれかに記載の糖蛋白質の生産方法において、
前記糖蛋白質のうち、Ｎ−グリコシド結合糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにα−１，６フコースが結合している糖鎖構造を有する糖蛋白質の割合が５モル％以下である、糖蛋白質の生産方法。
【請求項９】
請求項８記載の糖蛋白質の生産方法において、
前記糖蛋白質が糖鎖を有する抗体であり、
該抗体が、哺乳動物細胞における通常の糖鎖構造を有する同種類の抗体に比べて、増強された抗体依存性細胞障害活性を有する、糖蛋白質の生産方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９いずれかに記載の糖蛋白質の生産方法において、
生産される全糖蛋白質のうち、Ｎ−グリコシド結合糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにα−１，３フコースが結合している糖鎖構造を有する糖蛋白質の割合が５モル％以下である、糖蛋白質の生産方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の糖蛋白質の生産方法において、
該抗体が、昆虫細胞における通常の糖鎖構造を有する同種類の糖蛋白質に比べて、哺乳動物の生体内で低減された抗原性を有する、糖蛋白質の生産方法。
【請求項１２】
請求項１乃至１１いずれかに記載の糖蛋白質の生産方法において、
前記絹糸腺細胞が、さらにＮ−アセチルグルコサミン転移酵素を発現増強するように形質転換されてなる、
糖蛋白質の生産方法。
【請求項１３】
請求項１乃至１２いずれかに記載の糖蛋白質の生産方法において、
前記絹糸腺細胞が、βガラクトース転移酵素を発現増強するように形質転換されてなり、
前記糖蛋白質には、下記化学式（５）、（６）または（７）で示される糖鎖構造を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質が含まれる、
【化５】
【化６】
【化７】
糖蛋白質の生産方法。
【請求項１４】
請求項１２または１３記載の糖蛋白質の生産方法において、
前記糖蛋白質が糖鎖を有するＩｇＧ抗体である、
糖蛋白質の生産方法。
【請求項１５】
請求項１乃至１４いずれかに記載の糖蛋白質の生産方法であって、
前記糖蛋白質を発現させる工程が、
前記糖蛋白質を発現するように遺伝的に改変されてなる前記昆虫個体の絹糸腺において前記糖蛋白質を含む成分を繭に蓄積させる工程を含む、
糖蛋白質の生産方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の糖蛋白質の生産方法であって、
前記糖蛋白質が、糖鎖を有する抗体であり、
前記糖蛋白質を発現させる工程が、
前記昆虫個体として、前記抗体を構成する抗体重鎖および抗体軽鎖を共発現するように改変されてなる前記昆虫個体を用いる工程を含む、
糖蛋白質の生産方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の糖蛋白質の生産方法であって、
前記糖蛋白質を発現させる工程が、
前記昆虫個体として、前記抗体重鎖をコードする遺伝子および前記抗体軽鎖をコードする遺伝子がともに前記昆虫のゲノムにおいて、セリシンプロモーターの下流に発現可能に設けられている昆虫個体を用いる工程と、
前記繭として、セリシン部に前記抗体を含む繭を生成させる工程と、
を含む、
糖蛋白質の生産方法。
【請求項１８】
糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質の生産方法であって、
昆虫個体に内在している絹糸腺、昆虫個体より摘出した絹糸腺組織、または昆虫個体より摘出した絹糸腺組織より得られる絹糸腺細胞において、前記糖蛋白質を発現させる工程を含む、
糖蛋白質の生産方法。
【請求項１９】
請求項１８記載の糖蛋白質の生産方法であって、
前記昆虫個体に内在している絹糸腺、昆虫個体より摘出した絹糸腺組織、または昆虫個体より摘出した絹糸腺組織より得られる絹糸腺細胞が、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素を発現増強するように形質転換されてなる、
糖蛋白質の生産方法。
【請求項２０】
請求項１８または１９記載の糖蛋白質の生産方法であって、
前記昆虫個体に内在している絹糸腺、昆虫個体より摘出した絹糸腺組織、または昆虫個体より摘出した絹糸腺組織より得られる絹糸腺細胞が、βガラクトース転移酵素を発現増強するように形質転換されてなる、
糖蛋白質の生産方法。
【請求項２１】
糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質を生産するための糖蛋白質生産細胞であって、前記糖蛋白質を発現するように遺伝的に改変されてなる昆虫の絹糸腺細胞である、糖蛋白質生産細胞。
【請求項２２】
請求項２１記載の糖蛋白質生産細胞であって、前記絹糸腺細胞が、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素を発現増強するように形質転換されてなる、糖蛋白質生産細胞。
【請求項２３】
請求項２１または２２記載の糖蛋白質生産細胞であって、前記絹糸腺細胞が、βガラクトース転移酵素を発現増強するように形質転換されてなる、糖蛋白質生産細胞。
【請求項２４】
糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質を生産するための糖蛋白質生産生物個体であって、前記糖蛋白質を絹糸腺において発現するように遺伝的に改変されてなる昆虫個体である、糖蛋白質生産生物個体。
【請求項２５】
請求項２４記載の糖蛋白質生産生物個体であって、前記昆虫個体が、絹糸腺においてＮ−アセチルグルコサミン転移酵素を発現増強するように形質転換されてなる、糖蛋白質生産生物個体。
【請求項２６】
請求項２４または２５記載の糖蛋白質生産生物個体であって、前記昆虫個体が、絹糸腺においてβガラクトース転移酵素を発現増強するように形質転換されてなる、糖蛋白質生産生物個体。
【請求項１】
糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質の生産方法であって、
昆虫の絹糸腺細胞において、前記糖蛋白質を発現させる工程を含む、
糖蛋白質の生産方法。
【請求項２】
請求項１記載の糖蛋白質の生産方法において、
前記昆虫が鱗翅目に分類される昆虫である、
糖蛋白質の生産方法。
【請求項３】
請求項２記載の糖蛋白質の生産方法において、
前記昆虫がカイコである、
糖蛋白質の生産方法。
【請求項４】
請求項１乃至３いずれかに記載の糖蛋白質の生産方法であって、
前記絹糸腺細胞が中部絹糸腺細胞である、
糖蛋白質の生産方法。
【請求項５】
請求項１乃至４いずれかに記載の糖蛋白質の生産方法において、
前記糖蛋白質には、下記化学式（１）で示される糖鎖構造を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質が含まれる、
【化１】
糖蛋白質の生産方法。
【請求項６】
請求項５記載の糖蛋白質の生産方法において、
前記糖蛋白質には、下記化学式（２）、（３）または（４）で示される糖鎖構造を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質が含まれる、
【化２】
【化３】
【化４】
糖蛋白質の生産方法。
【請求項７】
請求項１乃至６いずれかに記載の糖蛋白質の生産方法において、
前記糖蛋白質が糖鎖を有する抗体である、
糖蛋白質の生産方法。
【請求項８】
請求項１乃至７いずれかに記載の糖蛋白質の生産方法において、
前記糖蛋白質のうち、Ｎ−グリコシド結合糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにα−１，６フコースが結合している糖鎖構造を有する糖蛋白質の割合が５モル％以下である、糖蛋白質の生産方法。
【請求項９】
請求項８記載の糖蛋白質の生産方法において、
前記糖蛋白質が糖鎖を有する抗体であり、
該抗体が、哺乳動物細胞における通常の糖鎖構造を有する同種類の抗体に比べて、増強された抗体依存性細胞障害活性を有する、糖蛋白質の生産方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９いずれかに記載の糖蛋白質の生産方法において、
生産される全糖蛋白質のうち、Ｎ−グリコシド結合糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにα−１，３フコースが結合している糖鎖構造を有する糖蛋白質の割合が５モル％以下である、糖蛋白質の生産方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の糖蛋白質の生産方法において、
該抗体が、昆虫細胞における通常の糖鎖構造を有する同種類の糖蛋白質に比べて、哺乳動物の生体内で低減された抗原性を有する、糖蛋白質の生産方法。
【請求項１２】
請求項１乃至１１いずれかに記載の糖蛋白質の生産方法において、
前記絹糸腺細胞が、さらにＮ−アセチルグルコサミン転移酵素を発現増強するように形質転換されてなる、
糖蛋白質の生産方法。
【請求項１３】
請求項１乃至１２いずれかに記載の糖蛋白質の生産方法において、
前記絹糸腺細胞が、βガラクトース転移酵素を発現増強するように形質転換されてなり、
前記糖蛋白質には、下記化学式（５）、（６）または（７）で示される糖鎖構造を含むＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質が含まれる、
【化５】
【化６】
【化７】
糖蛋白質の生産方法。
【請求項１４】
請求項１２または１３記載の糖蛋白質の生産方法において、
前記糖蛋白質が糖鎖を有するＩｇＧ抗体である、
糖蛋白質の生産方法。
【請求項１５】
請求項１乃至１４いずれかに記載の糖蛋白質の生産方法であって、
前記糖蛋白質を発現させる工程が、
前記糖蛋白質を発現するように遺伝的に改変されてなる前記昆虫個体の絹糸腺において前記糖蛋白質を含む成分を繭に蓄積させる工程を含む、
糖蛋白質の生産方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の糖蛋白質の生産方法であって、
前記糖蛋白質が、糖鎖を有する抗体であり、
前記糖蛋白質を発現させる工程が、
前記昆虫個体として、前記抗体を構成する抗体重鎖および抗体軽鎖を共発現するように改変されてなる前記昆虫個体を用いる工程を含む、
糖蛋白質の生産方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の糖蛋白質の生産方法であって、
前記糖蛋白質を発現させる工程が、
前記昆虫個体として、前記抗体重鎖をコードする遺伝子および前記抗体軽鎖をコードする遺伝子がともに前記昆虫のゲノムにおいて、セリシンプロモーターの下流に発現可能に設けられている昆虫個体を用いる工程と、
前記繭として、セリシン部に前記抗体を含む繭を生成させる工程と、
を含む、
糖蛋白質の生産方法。
【請求項１８】
糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質の生産方法であって、
昆虫個体に内在している絹糸腺、昆虫個体より摘出した絹糸腺組織、または昆虫個体より摘出した絹糸腺組織より得られる絹糸腺細胞において、前記糖蛋白質を発現させる工程を含む、
糖蛋白質の生産方法。
【請求項１９】
請求項１８記載の糖蛋白質の生産方法であって、
前記昆虫個体に内在している絹糸腺、昆虫個体より摘出した絹糸腺組織、または昆虫個体より摘出した絹糸腺組織より得られる絹糸腺細胞が、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素を発現増強するように形質転換されてなる、
糖蛋白質の生産方法。
【請求項２０】
請求項１８または１９記載の糖蛋白質の生産方法であって、
前記昆虫個体に内在している絹糸腺、昆虫個体より摘出した絹糸腺組織、または昆虫個体より摘出した絹糸腺組織より得られる絹糸腺細胞が、βガラクトース転移酵素を発現増強するように形質転換されてなる、
糖蛋白質の生産方法。
【請求項２１】
糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質を生産するための糖蛋白質生産細胞であって、前記糖蛋白質を発現するように遺伝的に改変されてなる昆虫の絹糸腺細胞である、糖蛋白質生産細胞。
【請求項２２】
請求項２１記載の糖蛋白質生産細胞であって、前記絹糸腺細胞が、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素を発現増強するように形質転換されてなる、糖蛋白質生産細胞。
【請求項２３】
請求項２１または２２記載の糖蛋白質生産細胞であって、前記絹糸腺細胞が、βガラクトース転移酵素を発現増強するように形質転換されてなる、糖蛋白質生産細胞。
【請求項２４】
糖鎖の還元末端であるＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質を生産するための糖蛋白質生産生物個体であって、前記糖蛋白質を絹糸腺において発現するように遺伝的に改変されてなる昆虫個体である、糖蛋白質生産生物個体。
【請求項２５】
請求項２４記載の糖蛋白質生産生物個体であって、前記昆虫個体が、絹糸腺においてＮ−アセチルグルコサミン転移酵素を発現増強するように形質転換されてなる、糖蛋白質生産生物個体。
【請求項２６】
請求項２４または２５記載の糖蛋白質生産生物個体であって、前記昆虫個体が、絹糸腺においてβガラクトース転移酵素を発現増強するように形質転換されてなる、糖蛋白質生産生物個体。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２００９−２２５７８１（Ｐ２００９−２２５７８１Ａ）
【公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１５５９０１（Ｐ２００８−１５５９０１）
【出願日】平成２０年６月１３日（２００８．６．１３）
【出願人】（５０６３０９４５６）株式会社ネオシルク (7)
【出願人】（０００２３１６３７）日本製粉株式会社 (144)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１３日（２００８．６．１３）
【出願人】（５０６３０９４５６）株式会社ネオシルク (7)
【出願人】（０００２３１６３７）日本製粉株式会社 (144)
【Ｆターム（参考）】
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