カーボンナノチューブを含む非共有結合複合体
本発明は、正電荷及び／又は負電荷を含むカーボンナノチューブの使用であって、前記電荷が電荷を担持している基少なくとも１つによって担持され、前記電荷を担持している基が前記カーボンナノチューブの表面に共有結合しており、前記カーボンナノチューブと前記荷電分子との結合が本質的に静電的であり、そして前記カーボンナノチューブが正電荷を含む場合は、前記荷電分子は負電荷少なくとも１つを含んでおり、及び／又は前記カーボンナノチューブが負電荷を含む場合は、前記荷電分子は正電荷少なくとも１つを含んでいるものとする、カーボンナノチューブと荷電分子少なくとも１つ（但し、前記荷電分子はＣｌ−とＴＦＡ−と異なっている）との複合体の製造への前記使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、カーボンナノチューブを含む非共有複合体、及び分子を細胞に運ぶための非共有複合体の使用に関する。
【０００２】
機械的、熱的、化学的、及び電子的性質の例外的な組み合わせにより、単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）及び多層カーボンナノチューブ（ＭＷＮＴ）は、特異な材料として考えられており、特にナノテクノロジー、ナノエレクトロニクス、複合材料及び医化学の分野において、今後の応用が期待されている。
【０００３】
しかしながら、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）が生理溶液中に溶解しないことを主な理由として、カーボンナノチューブの生物学的応用の可能性は、今まで全く検討されていない。
【０００４】
カーボンナノチューブとＤＮＡ又はタンパク質等の種々の分子とのいくつかの非共有複合体は、従来技術に記載されている。ほとんどの場合において、前記分子と前記カーボンナノチューブとは、疎水的相互作用及び／又はπ−スタッキング相互作用により結合している。
【０００５】
従って、ゼング（Ｚｈｅｎｇ）ら［ネイチャー・マテリアル（Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒ．）２００３年、第２巻、ｐ．３３８−３４２］は、一本鎖ＤＮＡ分子によるカーボンナノチューブの可溶化を記載しており、前記ＤＮＡ分子は、π−スタッキング相互作用によりカーボンナノチューブの周りにらせん状に巻きついており、可溶性複合体を形成する。
【０００６】
別の場合において、国際公開０２／０９５０９９パンフレットは、π−スタッキング相互作用、ファン・デル・ワールス相互作用及び疎水的相互作用によってカーボンナノチューブの側壁への分子（好ましくはタンパク質又はＤＮＡを含む）の前記不可逆的な吸着から形成される複合体に関する。
【０００７】
前記複合体に関連する１つの欠点は、複合体の解離が困難であり及び／又は確実に評価されていないことである。
【０００８】
これらの複合体に関連するもう１つの欠点は、カーボンナノチューブが複合体から解離すれば、カーボンナノチューブそれ自体が水溶系に溶解せず、そして沈殿する疎水性凝集を形成することである。更に、機能化されていないカーボンナノチューブは、有毒であることがいくつか示されている（Ｗａｒｈｅｉｔ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ７７：１１７−１２５；Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ７７：１２６−１３４；Ｓｈｖｅｄｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ，ＰａｒｔＡ６６：１９０９−１９２６）。
【０００９】
このような欠点は、生体系において、前記カーボンナノチューブに、複合化された分子を運ぶために使用される前記非共有複合体の能力を大幅に低下させる。
【００１０】
更に、前記の複合体が細胞内へ浸透することができることは、証明されていない。
【００１１】
従って、本発明の１つの目的は、カーボンナノチューブ及び目的の分子を含み、そして前記目的の分子を放出する傾向にある複合体を提供することである。
【００１２】
本発明のもう１つの目的は、カーボンナノチューブを含む複合体を提供することであり、カーボンナノチューブがそれ自体溶解性である。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、カーボンナノチューブを含む生物学的に相性がよい複合体及び毒性のない複合体を提供することであり、前記複合体は、細胞へ浸透することが可能である。
【００１４】
本発明のもう１つの目的は、前記特性を示しているカーボンナノチューブを含む複合体を調製する方法を提供することである。
【００１５】
本発明は、正電荷及び／又は負電荷を含むカーボンナノチューブの使用であって、前記電荷が電荷を担持している基少なくとも１つによって担持され、前記電荷を担持している基が前記カーボンナノチューブの表面に共有結合しており、前記カーボンナノチューブと前記荷電分子との結合が本質的に静電的であり、そして前記カーボンナノチューブが正電荷を含む場合は、前記荷電分子は負電荷少なくとも１つを含んでおり、及び／又は前記カーボンナノチューブが負電荷を含む場合は、前記荷電分子は正電荷少なくとも１つを含んでいるものとする、前記カーボンナノチューブと荷電分子少なくとも１つ（但し、前記荷電分子はＣｌ−とＴＦＡ−と異なっている）との複合体の製造への、前記使用に関する。
【００１６】
また、本発明は、正電荷及び／又は負電荷を含む前記カーボンナノチューブの使用であって、前記電荷が電荷を担持している基少なくとも１つによって担持され、前記電荷を担持している基が前記カーボンナノチューブの表面において共有結合しており、前記カーボンナノチューブと前記荷電分子との結合が本質的に静電的であり、そして前記カーボンナノチューブが正電荷を含む場合は、前記荷電分子は負電荷少なくとも１つを含んでおり、及び／又は前記カーボンナノチューブが負電荷を含む場合は、前記荷電分子は正電荷少なくとも１つを含んでいる、前記カーボンナノチューブと約１１５より大きい分子量を有する荷電分子少なくとも１つとの複合体の製造への、前記使用に関する。
【００１７】
また、本発明は、正電荷及び／又は負電荷を含んでいるカーボンナノチューブと荷電分子少なくとも１つとを含む複合体であって、前記電荷が電荷を担持している基少なくとも１つによって担持され、前記電荷を担持している基が前記カーボンナノチューブの表面において共有結合しており、
前記カーボンナノチューブが正電荷を含む場合は、前記荷電分子は負電荷少なくとも１つを含んでおり、及び／又は前記カーボンナノチューブが負電荷を含む場合は、前記荷電分子は少なくとも１つの正電荷を含んでおり（但し、前記荷電分子がＣｌ−とＴＦＡ−と異なるものとする）、
前記カーボンナノチューブと前記荷電分子との結合が本質的に静電的である、前記複合体に関する。
【００１８】
また、本発明は、正電荷及び／又は負電荷を含んでいるカーボンナノチューブと約１１５より大きい分子量を有する荷電分子少なくとも１つを含む複合体であって、前記電荷が電荷を担持している基少なくとも１つによって担持され、前記電荷を担持している基が前記カーボンナノチューブの表面において共有結合しており、そして、前記カーボンナノチューブが正電荷を含む場合は、前記荷電分子が負電荷少なくとも１つを含んでおり、及び／又は前記カーボンナノチューブが負電荷を含む場合は、前記荷電分子は正電荷少なくとも１つを含んでおり、
前記カーボンナノチューブと前記荷電分子との結合が本質的に静電結合である、前記複合体に関する。
【００１９】
用語「カーボンナノチューブ」は、円筒形に配列された炭素原子のみで構成された分子を意味し、前記円筒形は、所定の長さ及び直径によって特徴づけられている。前記カーボンナノチューブは、平面グラファィトを丸めることにより形成される円筒形グラファイトと似ている。前記円筒形側壁の炭素原子は、平面グラファイトと同様に、縮合ベンゼン環を形成するために配列されている。
【００２０】
用語「電荷を担持している基」は、電荷少なくとも１つを担持している基を示している。前記電荷を担持している基は、正電荷のみ、負電荷のみ、又は両方の電荷を担持することができる。更に、前記電荷を担持している基は、負電荷よりも正電荷を多く含むことができる。つまり、その正味の電荷、又は全体的な電荷は、正電荷である。反対に、前記電荷を担持している基が正電荷よりも負電荷を多く含むことができる。つまり、その正味の電荷、又は全体的な電荷は、負電荷である。また、前記電荷を担持している基は、等しい量の正電荷及び負電荷を含むことができる。つまり、その正味の電荷、又は全体的な電荷は、中性である。
【００２１】
用語「荷電分子」は、電荷少なくとも１つを担持している分子を示している。前記荷電分子は、正電荷のみ、負電荷のみ、又は両方の電荷を担持することができる。更に、前記荷電分子は、負電荷よりも正電荷を多く含むことができる。つまり、その正味の電荷、又は全体的な電荷は、正電荷である。反対に、前記電荷を担持している基が正電荷よりも負電荷を多く含むことができる。つまり、その正味の電荷、又は全体的な電荷は、負電荷である。また、前記荷電分子は、等しい量の正電荷及び負電荷を含むことができる。つまり、その正味の電荷、又は全体的な電荷は、中性である。
【００２２】
本発明によれば、電荷を担持している基は、カーボンナノチューブの側壁に関連する前記炭素原子少なくとも１つを必要とする結合によって、前記カーボンナノチューブの表面に共有結合している。前記カーボンナノチューブは、前記電荷を担持している基によって、機能されていると考えることができる。
「ＴＦＡ−」は、トリフルオロ酢酸に関する。
本発明における複合体の結束性を維持する力は、本質的には、静電気力である。例えば、前記複合体の結束性は、前記電荷を担持している基及び前記荷電分子のそれぞれに属している異極性電荷によって、もう一方の電荷に働きかける引力によって維持されている。本発明における静電結合は、特に、イオン結合に関する。前記電荷を担持している基に属する１又は数個の電荷が、前記荷電分子に属する１又は数個の電荷とそれぞれ互いに作用しあうことができることは、当業者によって明らかであろう。電荷を担持している基、又は荷電分子が１つより多い電荷を含む場合には、すべての電荷が必ずしも、荷電分子、又は電荷を担持している基にそれぞれ属している電荷と作用しあうわけではないこともまた明らかであろう。
条件、例えばｐＨによって、前記カーボンナノチューブの電荷、前記電荷を担持している基の電荷、又は前記荷電分子の電荷は変化する。
【００２３】
前記発明の好ましい実施態様によれば、前記定義された複合体が、水性溶媒に可溶であり、そして毒性がないことを特徴とする。
特に、前記複合体は、１・１０−１２〜１・１０−２ｍｏｌ／ｌ濃度で水中に溶ける。
水性溶媒は、特に、水、生理溶液、及び生体液、例えば血液、リンパ液又は細胞質を含む。
「毒性のない」ことによって、本発明の複合体は、細胞に対して、又は複合体を投与した個体に対して、本質的に有害性を生じないことを意味している。
特に、本発明の複合体は、１・１０−２ｍｏｌ／ｌと同じ高濃度であっても毒性はない。
本発明の複合体を含む前記カーボンナノチューブは、好ましくは水性溶媒に可溶し、そして毒性がない。
前記複合体の溶解性は、前記荷電分子ばかりでなく、カーボンナノチューブの表面に共有結合している電荷を担持している基の存在にも起因している。
前記複合体の溶解性は、また、生物学的過程、特に細胞過程を害するカーボンナノチューブの疎水性凝集に起因する毒性を防ぐ。
前記複合体の溶解性及び毒性の欠如は、生体への、特に分子を細胞に運ぶ構成での前記複合体の投与を可能にする
【００２４】
本発明のもう１つの好ましい実施態様によれば、前記複合体は、荷電分子と前記カーボンナノチューブの結合エネルギーが約９０ｋＪ／ｍｏｌ未満であり、特に約１２ｋＪ／ｍｏｌから約８５ｋＪ／ｍｏｌであり、より特には約２０ｋＪ／ｍｏｌから約７０ｋＪ／ｍｏｌであり、そして好ましくは約２０ｋＪ／ｍｏｌから約５０ｋＪ／ｍｏｌであることを特徴とする。
前記結合エネルギーは、２５℃で示されている。
８５ｋＪ／ｍｏｌの結合エネルギーは、約１０−１５ｍｏｌ／ｌの解離定数に相当している。
７０ｋＪ／ｍｏｌの結合エネルギーは、約１０−１２ｍｏｌ／ｌの解離定数に相当している。
５０ｋＪ／ｍｏｌの結合エネルギーは、約１０−９ｍｏｌ／ｌの解離定数に相当している。
特に、前記結合エネルギーは、共有結合に相当する結合エネルギー、概ね４２０ｋＪ／ｍｏｌよりも小さい。
前記荷電分子と前記カーボンナノチューブの前記結合エネルギーは、細胞外生体液、例えば血液又はリンパ液中での前記複合体の結束性を可能にし、そして、細胞液、例えば細胞質中での前記荷電分子の放出を可能にする複合体の解離ができるものが好ましい。本発明の前記複合体の解離を、例えば、ｐＨの変化によって引き起こすことができる。
前記複合体のさらなる好ましい実施態様によれば、前記カーボンナノチューブが正電荷又は負電荷のいずれかを含み、そして前記荷電分子がそれぞれ負電荷少なくとも１つ、又は正電荷少なくとも１つのいずれかを含む。
この実施態様によれば、前記カーボンナノチューブは、正電荷のみ又は負電荷のみのいずれかを含み、反対の電荷をそれぞれ含んでいる荷電分子との結合を容易にする。
【００２５】
特に好ましい実施態様によれば、前記カーボンナノチューブは、同一の電荷を担持している基のみを含んでいる。
前記複合体のもう１つの好ましい実施態様によれば、前記カーボンナノチューブは、前記荷電分子の電荷当たり、約０．００１〜約１００電荷、特に、約１〜約２０電荷を含んでいる。
従って、与えられる荷電分子及びカーボンナノチューブ間の相互作用の強さを、前記カーボンナノチューブの電荷密度を変更することによって調節することは可能である。故に、前記電荷密度を大きくすることによって、前記相互作用は強くなる結果となり、そして前記電荷密度を小さくすることによって、前記相互作用は弱くなる結果となる。
前記カーボンナノチューブと荷電分子との電荷比は、約０．００１〜約１００であり、特には約１〜約２０である。約０．００１より小さい電荷比においては、溶液中で遊離している前記荷電分子からの電荷が過剰量であり、これは前記カーボンナノチューブと相互作用しない荷電分子が過剰になりやすく、従って十分には複合しない。１００より大きい電荷比においては、前記カーボンナノチューブ上の電荷が過剰量あり、従って前記荷電分子は、前記カーボンナノチューブ上で全てしっかりと複合しており、故に強く安定した複合体になりやすく、従って前記カーボンナノチューブ表面からの前記荷電分子の放出を困難にさせる。
【００２６】
前記複合体のもう１つの好ましい実施態様によれば、前記カーボンナノチューブが、前記荷電分子の存在する又は存在しない有機溶媒及び／又は水性溶媒中において、実質的に無傷であり、そして可溶であり、及び前記電荷を担持している基が前記カーボンナノチューブの表面上に均一に分布している。
【００２７】
用語「均一に分布している」は、前記荷電を担持している基が、本質的に前記カーボンナノチューブの表面に全てに分布しており、前記カーボンナノチューブの一部分、例えば前記カーボンナノチューブの先端部分に単純に集中していないことを意味している。更に、電荷を担持している基の数と前記カーボンナノチューブの炭素原子の数の比率があり、特に、前記カーボンナノチューブの約５０〜約１０００の炭素原子当たり１つの電荷を担持している基であり、より好ましくは前記カーボンナノチューブの約１００の炭素原子当たり１つの電荷を担持している基である。
【００２８】
用語「実質的に無傷であり」は、前記表面上の欠陥は極少量であり、そして前記カーボンナノチューブの先端の炭素原子を酸化し、カルボン酸にするために、前記カーボンナノチューブが脆くないことを意味する。
【００２９】
特に、前記カーボンナノチューブは、水性溶媒中、特には生体液、例えば血液、リンパ液又は細胞質中に、それ自体で可溶している。従って、本発明の前記複合体の解離は、２つの水に可溶性の成分、前記荷電分子及び前記カーボンナノチューブを生じる。前記解離が細胞中で起こった場合、前記カーボンナノチューブは溶けたままであり、このことは細胞からカーボンナノチューブが廃棄されるのを助け、そしてカーボンナノチューブの凝集及び凝集に相当する細胞毒性を防ぐ。
【００３０】
前記複合体のもう１つのさらなる実施態様によれば、前記カーボンナノチューブが、単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）又は多層カーボンナノチューブ（ＭＷＮＴ）である。
前記単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）は、例えば、アジャヤン及びイイジマ（Ａｊａｙａｎ，ＰＭ＆Ｉｉｊｉｍａ Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６１：３３３−３３４；Ｒａｏ ＣＮＲ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２：７８−１０５）によって、定義されている。
前記多層カーボンナノチューブ（ＭＷＮＴ）は、例えば、イイジマ（Ｉｉｊｉｍａ Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３５４：５６−５８；Ｒａｏ ＣＮＲ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２：７８−１０５）によって、定義されている。
【００３１】
前記で定義された複合体のさらなる実施態様によれば、前記カーボンナノチューブが、下記の一般式：
［Ｃｎ］−Ｘｍ
（式中、Ｃｎは、実質的に一定の直径である実質的に円筒形であるカーボンナノチューブの表面の炭素であり、前記直径が約０．５〜約５０ｎｍであり、特に、ＳＷＮＴにおいて約０．５〜５ｎｍであり、ＭＷＮＴにおいて約２０〜約５０ｎｍであり、
Ｘは、同一又は異なる、１又は数個の官能基であり、但し、Ｘ基少なくとも１つが、電荷を担持している基少なくとも１つを含み、
ｎは約３・１０３〜約３・１０６の整数であり、
ｍは約０．００１ｎ〜約０．１ｎの整数であり、
カーボンナノチューブ表面ｃｍ２当たり約２・１０−１１ｍｏｌ〜約２・１０−９ｍｏｌの官能基Ｘが存在している）
で表される。
【００３２】
前記カーボンナノチューブは、５より大きい直径に対する長さの比、及び０．２μｍ未満、好ましくは０．０５μｍ未満の直径を有している。
置換カーボンナノチューブにおいて、前記表面の原子Ｃｎは、官能基と反応する。表層中のほとんどの炭素原子は、基底面炭素、例えばベンゼン環で構成されている炭素である。従来技術において、一般的に基底面炭素は、欠損部位にある基底面炭素、又はグラファイト層の先端炭素原子に類似の基底面炭素を除いては、相対的に化学攻撃に対して不活性であると考えられている。
【００３３】
カーボンナノチューブの先端の炭素原子は、欠損部位にさらされた炭素原子及び先端炭素原子を含むことができる。
有利な実施態様によれば、本発明は機能化カーボンナノチューブを含む水溶液又は有機溶液に関し、前記カーボンナノチューブの長さ範囲の分布は機能化前の前記カーボンナノチューブの長さ範囲の分布と本質的に同じである。
前記カーボンナノチューブの長さは、約２０ｎｍ〜約２０μｍの範囲内で有利に選ばれる。
カーボンナノチューブの表面（ｃｍ２）当たりの官能基の分布、（有利なのは２・１０−１１ｍｏｌｅ〜２・１０−９ｍｏｌｅである）をＤＳＣ（示差走査熱量測定法）、ＴＧＡ（熱重量分析）、滴定及び分光光度測定により、決定することができる。
その均質性を高分解能透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により決定することができる。但し、分解能が、前記カーボンナノチューブ表面の電子密度及び電子を担持している前記官能基の電子密度を見るには十分であるものとし、標識原子、例えば１５Ｎ、１３Ｃ又は２Ｈが、官能基中に含まれるものとする。
カーボンナノチューブ表面（ｃｍ２）当たりの官能基の分布範囲のより高い数値及びより低い数値に関与するパラメータは、カーボンナノチューブの曲率、反応時間、反応温度、試薬の化学安定性及び溶媒である。
官能基の量は、特には、カーボンナノチューブ１ｇ当たり約０．４〜約１ｍｍｏｌの範囲であることが好ましい。
本発明の前記カーボンナノチューブは本質的には純粋であり、そして無定形炭素又は熱分解沈殿炭素（ｐｙｒｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ ｃａｒｂｏｎ）、炭素粒子、又はフラーレンを含んでなく、そして、特には、カーボンナノチューブの生成において触媒として一般的に使用される金属、例えばＦｅ、Ｎｉ、Ｃｏを含んでいない。
【００３４】
前記で定義された複合体の好ましい実施態様において、Ｘが、２つの異なる官能基Ｘ１及びＸ２であり、そして前記カーボンナノチューブが下記の式：
［Ｃｎ］−［Ｘ１ｍ１］［Ｘ２ｍ２］
（式中、ｍ１及びｍ２は、相互に独立し、約０．００１ｎ〜約０．１ｎの整数を示し、但し、Ｘ１又はＸ２少なくとも一方が、電荷を担持している基少なくとも１つを含むものとする）
で表されている。
【００３５】
前記定義された複合体のもう１つの好ましい実施態様において、Ｘが、同一又は異なる、１又は数個の置換されたピロリジン環であり、但し、前記置換されたピロリジン環少なくとも１つが電荷を担持している基少なくとも１つによって置換されている、下記の一般式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、Ｒ及びＲ’は、相互に独立し、−Ｈ、又は式−Ｍ−Ｙ−（Ｚ）ａ−（Ｐ）ｂで表される基であり、ａは０又は１であり、そしてｂは０〜８の整数であり、好ましくは０、１又は２であり、Ｐは、ｂが１より大きい場合に同一又は異なる基であり、但し、Ｒ及びＲ’は同時に水素原子とすることはできないものであり、そして、
Ｍは、約１〜約１００原子のスペーサー基、例えば−（ＣＨ２）γ−又は−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）γ−ＣＨ２−ＣＨ２−を含む群から選択される基、γは１〜２０の整数であり、あてはまる場合には電荷を担持している基を含み、
Ｙは、ａ＝ｂ＝０の場合の反応基、例えば−ＯＨ、−ＮＨ３＋、−ＣＯＯ−、−ＳＨ、−ＣＨＯ、ケトン例えば−ＣＯＣＨ３、アジ化物、又はハロゲン化物を含む群から選択される基であり、あてはまる場合には電荷を担持している基を含み、
又は、ａ又はｂが０と異なる場合に、反応基から誘導され、例えば−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＣＯＯ−、−Ｓ−、−ＣＨ＝、−ＣＨ２−、−ＣＣｋＨ２ｋ＋１＝、ｋは１〜１０の整数であり、特には−ＣＣＨ３、又は−ＣＨＣｋＨ２ｋ＋１−であり、ｋは１〜１０の整数であり、特には−ＣＨＣＨ３−を含む群から選択される基であり、
Ｚは、リンカー基、例えばａ＝１、及びｂ＝０の場合に以下の式の１つの基であり、あてはまる場合には電荷を担持している基を含んでおり、Ｐ基少なくとも１つと結合する傾向があり、そして、必要な場合には前記Ｐ基を放出する傾向があり、
【化２】
ｑは、１〜１０の整数であり、又は、
ａ＝１、及びｂ＝１又は２の場合に、以下の式の１つで表され、
【化３】
ｑは、１〜１０の整数であり、
Ｐは、有効基であり、あてはまる場合には電荷を担持している基を含み、前記機能化カーボンナノチューブの分光検出を可能にし、フルオロフォア、例えばＦＩＴＣ、キレート剤、例えばＤＴＰＡ、又は生物学的作用を誘発する傾向がある活性分子、例えばアミノ酸、ペプチド、擬似ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、例えば酵素又は抗体、核酸、炭水化物又は薬であり、
あてはまる場合にはＹ、Ｚ、又はＰ基少なくとも１つを、キャッピング基、例えばＣＨ３ＣＯ−（アセチル）、メチル、エチル、ベンジルカルボニル、又は保護基、例えばメチル、エチル、ベンジル、ｔｅｒｔ−ブチル、トリチル、３−ニトロ−２−ピリジルサルフェニル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、トリメチルシリルエチルオキシカルボニル、フタルイミド、ジメチルアセタール、又は１，３−ジオキソランによって置換することができる）
の複合体である。
【００３６】
置換ピロリジンを含むカーボンナノチューブを、ジョーガキラスら（Ｇｅｏｒｇａｋｉｌａｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：７６０−７６１）の記載したアゾメチンイリドの１、３−双極子環状付加に基づく一般方法を使用することにより調製することができる。
前記ピロリジン環は、安定で、そして強固な環状分子であり、反応基が存在又は挿入することができる末端においてスペーサー基をもつことができる窒素原子が存在しているという利点を持っている。
【００３７】
用語「Ｙは反応基である」は、Ｙはヘテロ原子を表しており、新しい共有結合を形成するための化学反応を行う準備があることを意味する。
用語「Ｍはスペーサー基」は、Ｍが前記カーボンナノチューブ上の前記ピロリジンを前記反応作用基Ｙから引き離す直鎖状有機鎖であることを意味する。
用語「Ｙは反応基から誘導される」は、Ｙが新しい共有結合を引き起こす化学反応によって修飾させられるヘテロ原子又は官能基であることを意味する。
−Ｏ−は前記反応基−ＯＨからの誘導体であり、−ＮＨは前記反応基−ＮＨ２からの誘導体であり、−ＣＯＯ−は前記反応基−ＣＯＯＨからの誘導体であり、−Ｓ−は前記反応基−ＳＨからの誘導体であり、−Ｃ＝及び−ＣＨ２−は前記反応基−ＣＨＯからの誘導体であり、−ＣＣｋＨ２ｋ＋１及び−ＣＨＣｋＨ２ｋ＋１は、前記反応基のケトンからの誘導体であり、そして特には−ＣＣＨ３＝及び−ＣＨＣＨ３−は反応基−ＣＯＣＨ３−からの誘導体であることは、前記の説明から明らかである。
アジ化物に関しては、アジ化物は保護基である。
ハロゲン化物に関しては、相当する誘導基を−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯＯ−又はアジ化物とすることができる。
用語「Ｚはリンカー基である」は、ＺがＹに共有結合している化学物質であり、Ｐのカップリングを可能にし、そしてＰのカップリングの条件において化学反応を妨害し、Ｐを放出することが可能であるが、Ｙから放出されることは可能ではないことを意味する。
好ましい実施態様によれば、Ｚは以下の式のリンカー基を意味する。
【化４】
ｑは、１〜１０の整数である。
リンカー基Ｚは、Ｚが遊離しているか、又は−Ｙ−に結合しているか及び／又は−Ｐに結合しているか、又は−Ｐから開裂しているか、そしてＺが保護されているかどうかに依存する変化する形状で存在している。本発明の好ましいリンカー基の主要形状は以下の通りである。
遊離非保護型
【化５】
遊離保護型
【化６】
非保護Ｙ結合型
【化７】
保護Ｙ結合型
【化８】
非保護Ｙ及びＰ結合型
【化９】
保護Ｙ及びＰ結合型
【化１０】
非保護Ｙ及びＰ由来開裂結合型
【化１１】
非保護Ｙ及びＰ由来開裂結合型
【化１２】
非保護Ｐ結合型
【化１３】
保護Ｐ結合型
【化１４】
遊離非保護型
【化１５】
遊離保護型
【化１６】
非保護Ｙ結合型
【化１７】
保護Ｙ結合型
【化１８】
Ｙ及びＰ結合型
【化１９】
Ｐ結合型
【化２０】
マレイミドの遊離型
【化２１】
Ｙ結合マレイミド型
【化２２】
Ｙ及びＰ結合マレイミド型
【化２３】
Ｐ結合マレイミド型
【化２４】
【００３８】
ｑは１〜１０の整数であり、Ｑは保護基であり、そして−Ｙ−はスペーサーＭを介して本発明の機能化されたカーボンナノチューブに共有結合している。
【００３９】
用語「Ｐは有効基である」は、Ｐが、Ｐを担持している前記カーボンナノチューブに新しい物理的、化学的又は生物学的特性を与えることができる基であることを意味する。
【００４０】
本発明の用語「Ｐは前記カーボンナノチューブの分光検出を可能にすることができる」は、Ｐが基、例えば、蛍光顕微鏡検査法、又は核磁気共鳴又はＦＴＩＲ（フーリエ変換赤外）分光等の分光技術によって同定されることを可能にする発色団であることを意味する。
【００４１】
用語「生物学的作用を誘発する傾向がある活性分子」は、前記分子が、前記生体系の要素と特異的な相互作用を行うことにより、与えられる生体系の工程を修飾することができることを意味する。
「ＦＩＴＣ」は、フルオロセイン・イソチオシアネートを示す。
【００４２】
「ＤＴＰＡ」は、ジエチレントリアミン五酢酸二無水物を示す。
【００４３】
用語「擬似ペプチド」は、天然由来又は非天然由来のアミノ酸の鎖を示しており、前記鎖が少なくとも１つの結合、アミド結合とは異なる結合の化学的性質を含んでいる。
【００４４】
用語「キャッピング基」は、反応性官能基Ｙを阻止することができ、そして化学反応によって取り除くことができない基を意味する。
【００４５】
用語「保護基」は、反応性官能基を一時的に阻止することができ、そしてさらなる改善の目的で、反応作用基Ｙを遊離するために化学反応によって続いて取り除くことができる基を意味する。
【００４６】
Ｐが存在している場合、Ｚの性質は２種類のカーボンナノチューブ、Ｐを放出することができるか、又はＰを放出することができないものを生じさせる。
【００４７】
もしＰが存在している場合、用語「Ｐの放出」は、−Ｍ−Ｙ−Ｚ−Ｐ基において、開裂はＺ基の右端で起こる可能性があることを意味する。
【００４８】
前記開裂は前記Ｚ基のこの端で起こる場合に、その後Ｐが放出される。
Ｚが以下の２つの分子の１つを表す場合、そしてＰが存在している場合には、Ｐを放出することができる。なぜならば、左の分子については、開裂はＳ原子に隣接する結合で起こることができ、又右の分子については、Ｐは右端−ＣＯＯ−から放出されることができるからである。
【化２５】
【００４９】
Ｚが以下の分子を表している場合、そしてＰが存在している場合、特に生理学的条件、例えば血清中の条件下、又は生理学的条件を再現する条件下、例えばｐＨ７．４で０．１５ＭＮａＣｌ、又はｐＨ７．４でＰＢＳにおいて、Ｐを放出することができない。
【化２６】
【００５０】
本発明のもう１つの実施態様によれば、本発明の機能化されたナノチューブは、ＭとＹとの間、そしてＹとＺとの間において一般に開裂はない。
【００５１】
前記定義された複合体のさらなる実施態様において、Ｘは、２つの異なる置換されたピロリジン環であり、但し、以下の一般式（Ｉ’）：
【化２７】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、Ｒ１及びＲ２は、異なっており、そして相互に独立し、−Ｈ、又は式−Ｍ−Ｙ−（Ｚ）ａ−（Ｐ）ｂの基であり、Ｍ、Ｙ、Ｚ、Ｐ、ａ及びｂは、前記定義されたものと同じ意味であり、Ｒ１及びＲ２少なくとも１つが電荷を担持している基を含んでいる）
の前記ピロリジン環少なくとも１つを、電荷を担持している基少なくとも１つによって置換されるものである。
前記定義された複合体の好ましい実施態様において、前記複合体は、以下の一般式（ＩＩ）：
【化２８】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、Ａは荷電分子であり、そしてＲは、式−Ｍ−Ｗ基であり、そして、
Ｍは、約１〜約１００原子のスペーサー基、例えば−（ＣＨ２）γ−、又は−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）γ−ＣＨ２−ＣＨ２−を含む群から選択される基であり、γは１〜０の整数であり、
Ｗは、約１〜約４００原子の電荷を担持している基、例えば−ＮＨ３＋、又は−ＣＯＯ−である）
で表されることを特徴とする。
【００５２】
前記複合体の特に好ましい実施態様において、前記複合体は、以下の一般式（ＩＩ’）：
【化２９】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、Ａは、荷電分子であり、そして
Ｒ１は、−Ｍ−Ｙ−（Ｚ）ａ−（Ｐ）ｂ基であり、Ｍ、Ｙ、Ｚ、Ｐ、ａ及びｂは、前記定義されたものと同じ意味であり、特にＲ１は、フルオロフォアを担持している基であり、そして
Ｒ２は、式−Ｍ−Ｗ基であり、Ｗは約１〜約４００原子の電荷を担持している基、例えば、−ＮＨ３＋、又は−ＣＯＯ−である）
で表されることを特徴とする。
【００５３】
いくつもの方法が、２つの異なるピロリジン環をもつカーボンナノチューブの機能化（ビス機能化カーボンナノチューブ）のために利用可能である。詳細は、実施例１Ａ、１Ｂ、１Ｃにおいて報告されている。
【００５４】
本発明のもう１つの特に好ましい実施態様において、前記荷電分子が、
２〜１０６のヌクレオチドを含む核酸、例えばＲＮＡ又はＤＮＡ、特にはプラスミド又は人工染色体、
２〜５０００、好ましくは５０〜５０００のアミノ酸を含むペプチド、ポリペプチド又はタンパク質、
炭水化物、特には正電荷の炭水化物、例えばグルコサミン又はキトサン、
放射性核種、及び
細胞毒の分子を含む群から選択されている。
【００５５】
本発明の複合体は、一本鎖核酸又は二本鎖核酸をより特に含む。一本鎖核酸を担持している複合体は、アンチセンスＤＮＡを細胞に運ぶために特に適している。二本鎖ＤＮＡを担持している複合体は、細胞を形質転換又はトランスフェクトするために特に適している。そして、二本鎖ＲＮＡを担持している複合体は、干渉ＲＮＡを細胞に運ぶために特に有用である。
【００５６】
本発明の放射性核種を含む複合体は、イメージング又は治療目的のために特に有用である。
本発明の細胞傷害性分子を含む複合体は、悪性細胞を破壊する治療目的、特にガン治療の枠組みにおいて特に有用である。
【００５７】
前記定義された複合体の、更にもう１つの特に好ましい実施態様において、前記複合体は、以下の式：
【化３０】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、そしてＡは、荷電分子であり、負電荷少なくとも１つを含む、例えばＤＮＡである）
で表されることを特徴とする。
【００５８】
このような複合体は、ＤＮＡによる細胞の形質転換又はトランスフェクションに特に適している。
【００５９】
前記定義された複合体のもう１つの特に好ましい実施態様において、前記複合体は、以下の式：
【化３１】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、そしてＡは、荷電分子であり、負電荷少なくとも１つを含む、例えばＤＮＡである）
で表されることを特徴とする。
【００６０】
このような複合体は、更に、ＤＮＡによる細胞の形質転換又はトランスフェクションに特に適している。
【００６１】
本発明のさらなるもう１つの特に好ましい実施態様において、前記複合体は、以下の式：
【化３２】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、そしてＡは、正電荷少なくとも１つを含む荷電分子である）
で表されることを特徴とする。
【００６２】
例えば、前記カーボンナノチューブを、正荷電分子、例えば正荷電タンパク質を担持するために特に使用することができる。
【００６３】
本発明のさらなるもう１つの特に好ましい実施態様において、前記複合体は、以下の式：
【化３３】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、そしてＡは、正電荷少なくとも１つを含む荷電分子である）
で表されることを特徴とする。
【００６４】
例えば、前記ＤＴＰＡ置換カーボンナノチューブを、正電荷分子、例えば正電荷タンパク質を担持するために特に使用することができる。
本発明は、又、前記荷電分子を細胞内に運ぶための複合体の使用に関する。
従って、前記複合体を個体に投与することができ、そして前記複合体は、個々人の輸送流体、例えば血液又はリンパ液中で運ばれる間は会合された形態のままであり、そして、複合体が細胞膜を通過する間、その後、細胞に浸透するとすぐに、複合体は解離し、前記荷電分子を遊離させることができる。
【００６５】
本発明の前記複合体は、エネルギー非依存性メカニズムによって細胞に浸透することができる。特には、前記浸透は、エンドサイトーシス及びファゴサイトーシス非依存性であることができる。
【００６６】
本発明は、更に、薬剤学的に許容可能な担体と共に、前記複合体を活性物質として含む、医薬組成物に関する。
【００６７】
前記医薬組成物は、遺伝薬剤又は免疫療法医薬品及びワクチン接種医薬品の製造に有用である。より具体的には、前記医薬組成物は、治療上のタンパク質の細胞への輸送、又は遺伝子治療又はＤＮＡワクチンの枠において有用であり、治療の又は予防の核酸断片を運ぶために、有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、アンモニウム機能化単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋ １）、アンモニウム機能化多層カーボンナノチューブ（ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋ ２）、そしてリジン機能化単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋ ３）を示す。
【００６９】
【図２】図２Ａ〜図２Ｄは、アミノｆ−ＭＷＮＴ（ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋ ２）（濃度 ２．５ｍｇ／ｍＬ）で処理したヒーラ（ＨｅＬａ）細胞の超薄横断切片を示す。培養後、細胞は固定され、染色され、脱水され、エポン８１２レジン（Ｅｐｏｎ ８１２ ｒｅｓｉｎ）［商品名］に包埋された。超薄層（厚さ９０ｎｍ）は、超ミクロトームで切断された。図２Ａ（Ａ）は細胞全体であり、図２Ｂ（Ｂ）及び図２Ｃ（Ｃ）は２つ続けて拡大したものである。図２Ｄ（Ｄ）は、細胞膜を横切っている多層カーボンナノチューブを示す。白い点の矢印は染色質を示し、白いダッシュの矢印はミトコンドリアを示し、白い細い矢印はゴルジ複合体を示し、中間の矢印は核膜を示し、白い太い矢印は液胞（ｖａｃｕｏｌｕｍ）を示す。
【００７０】
【図３】図３Ａ〜図３Ｆは、ＨｅＬａ細胞のフローサイトメトリー分析結果であり、カーボンナノチューブの不存在下（図３Ａ）そして各々０．０１ｍｇ／ｍＬ（図３Ｂ）、０．１ｍｇ／ｍＬ（図３Ｃ）、１．０ｍｇ／ｍＬ（図３Ｄ）、１０ｍｇ／ｍＬ（図３Ｅ）の濃度におけるＳＷＮＴ−ＮＨ３＋１で培養された場合を示す。６時間培養及び洗浄後、細胞を分析した。それぞれの独立した実験において、細胞をプロピジンアイオダイド（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）（Ｙ軸の相対強度）及びアネキシン（ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ−ＡＰＣ（Ｘ軸の相対強度）で染色した。機能化カーボンナノチューブの内在化をＦＡＣＳ法によりモニターし、前記ＳＷＮＴに共有結合したフルオレセインプローブの前記細胞相対含有量を分析した（図３Ｆ）。連続の黒い線は、３．０ｍｇ／ｍＬＳＷＮＴ−ＦＩＴＣで処理後分析された細胞集団（１２濃度）であり、灰色の領域は処理前の細胞集団である。細胞の９５％より多くは、前記蛍光標識を内在化している。
【００７１】
【図４】図４は、ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋１によるプラスミドＤＮＡの送達及び発現を示す。ＣＨＯ細胞中の総タンパク質（ｍｇ）当たりの相対発光量マーカー遺伝子（β−Ｇａｌ）発現のレベル。異なる電荷比（ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ）で、３つの異なる培養時点で試験を行った。細胞分離及び細胞死を示す毒性は、この試験全体を通じて観察されなかった。ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋１及びプラスミドＤＮＡをそれぞれＣｎｔ及びＤとして図に示す。
【００７２】
【図５】図５Ａ〜図５Ｃは、第８〜１０週齢のオスＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓（図５Ａ）、肺（図５Ｂ）及び脾臓（図５Ｃ）中のルシフェラーゼの発現を示す。一群当たり３匹の動物に、５０μｇプラスミドＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ−Ｌｕｃ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のみ、又はラピッドハイドロダイナミック注入法（ｒａｐｉｄ ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ：Ｌｅｃｏｃｑ ｅｔ ａｌ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５（２）：１４２−１５６、２００３）による、０．９％（ｗ／ｗ）ＮａＣｌ水性緩衝液中の６００μｇＳＷＮＴ−ＮＨ３＋１のプレ複合体を投与した。組織は投与後１６時間経過後集められ、そしてルシフェラーゼ発現はトロピックスラックスクリーン（Ｔｒｏｐｉｘ ＬｕｃＳｃｒｅｅｎ）アッセイキット及びバートルド９５０７照度計（Ｂｅｒｔｈｈｏｌｄ ９５０７ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を使用することにより分析を行った。
【００７３】
【図６】図６ＡはプラスミドｐＥＧＦＰＬｕｃの制限地図を模式的に示しており、図６ＢはプラスミドｐＣＭＶβの制限地図を模式的に示す。
【００７４】
【図７】図７はプラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）の制限地図を模式的に示す。
【００７５】
【図８】図８Ａ〜図８Ｆは、ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ（図８Ａ〜図８Ｃ）及びＳＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ（図８Ｄ〜図８Ｆ）について６：１の電荷比で形成されたカーボンナノチューブ：ＤＮＡ複合体のＳＥＭ画像を示す。
【００７６】
【図９】図９は、ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋２で機能化されたセンサーチップのＳＥＭ画像を示す。
【００７７】
【図１０】図１０は、プラスミドＤＮＡとｆ−ＣＮＴとの相互作用のセンサグラムを示す。上図：プラスミドの濃度を増加することによるＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋３へのプラスミド結合のセンサグラムであり、それぞれの曲線は、一番低い曲線から一番高い曲線の順に、６．３μｇ／ｍＬ、１２．６μｇ／ｍＬ、２５．２μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬである。下図：プラスミドの濃度を増加することによるＭＷＮＴ−ＮＨ３＋２へのプラスミドＤＮＡの結合のセンサグラムであり、それぞれの曲線は、一番低い曲線から一番高い曲線の順に、２５．２μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬである。
【００７８】
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｃは、機能化されたカーボンナノチューブの複合後のＤＮＡ凝縮を示す。ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ（図１１Ａ）、ＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ（図１１Ｂ）及びＭＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ（図１１Ｃ）について２．５μｇ／ｍＬ ｆｒｅｅ ＤＮＡのピコグリーン蛍光（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）パーセントとして示した、さまざまな電荷比でのｆ−ＣＮＴへ複合された２．５μｇ／ｍＬ ＤＮＡの凝縮。
【００７９】
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｃは、ｆ−ＣＮＴ−ＤＮＡ複合体の電気泳動の運動性を示す。全てのパネルにおいて、レーン１は０．２μｇ遊離ＤＮＡを示す。他の全てのレーンは、ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ（図１２Ａ）、ＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ（図１２Ｂ）及びＭＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ（図１２Ｃ）における様々な＋／−電荷比（レーン２は１：１、レーン３は６：１、レーン４は１０：１）で、０．２μｇＤＮＡに複合されているｆ−ＣＮＴを含んでいる。ＯＣは開環を示し、ＳＣはスーパーコイルを示す。
【００８０】
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｂは、様々な電荷比、ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ（図１３Ａ）、ＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ（図１３Ｂ）及びＭＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ（図１３Ｃ）でのｆ−ＣＮＴ：ｐＤＮＡをもつ遺伝子送達を伴うヒト肺癌細胞（Ａ５４９）におけるβ−ｇａｌマーカー遺伝子の発現を示す（イムノメトリーアッセイの使用によるＣＮＴ不存在下における前記ＤＮＡ対照を示している遺伝子発現レベル）。
【実施例】
【００８１】
《実施例１》
カーボンナノチューブは、アゾメチンイリドの１、３−双極子環状付加に基づく方法を用いて共有結合的に修飾されている（Ｇｅｏｒｇａｋｉｌａｓ ｅｔ ａｌ．（２２０２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：７６０−７６１）。単層カーボンナノチューブ及び多層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ及びＭＷＮＴ）の両方は、遊離アミノ末端トリエチレングリコール部分の窒素をもつピロリジン環で機能化された（図１）。カーボンナノチューブの周りの官能基（ｆ）の量を、前記ｆ−ＳＷＮＴ及び前記ｆ−ＭＷＮＴにおいて、それぞれ約０．５５及び０．９０ｍｍｏｌ／ｇで計算した。リジンで機能化されたＳＷＮＴを、パンタロットら（Ｐａｎｔａｒｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００３、１０，９６１−９６６）の記載より、ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋から調製した。チューブの周りのアミノ基の量は、約０．９２ｍｍｏｌ／ｇで計算した。前記の正電荷分布は、水溶液中に高度に可溶化する物質であることを示している。
ｆ−ＳＷＮＴ：ＤＮＡ複合体の形成において、アミノ機能化された単層カーボンナノチューブは、６ｍｇ／ｍＬ濃度で脱イオン水において水和された。プラスミドＤＮＡ、ｐＥＧＦＰ−Ｌｕｃ（図６Ａ）、又はｐＣＭＶβ（図６Ｂ）、（いずれもＣｌｏｎｔｅｃｈ）は、１ｍｇ／ｍＬ濃度で脱イオン水において水和された。アリコートは、必要になるまで−２０℃で冷凍貯蔵された。インビトロの研究のため、適当な容量のナノチューブを、３００μＬの総容量のオプティメム（ｏｐｔｉｍｅｍ）で希釈した。ｐＣＭＶβ３μｇは、３００μＬのオプティメムを含む別のチューブに加えた。次に、希釈されたナノチューブを、ＤＮＡに滴下し、そして混合物を簡単にピペットで採取した。複合体は、使用前の１０分間で形成されることができる。この工程は、試験されるそれぞれの電荷比において繰り返された。インビボの研究のために、ナノチューブ６００μｇを、０．９％ＮａＣｌ ７５０μＬ中に希釈した。０．９％ＮａＣｌ ７５０μＬ中に希釈されたｐＥＧＦＰ−Ｌｕｃ５０μｇを、ナノチューブに滴下し、そして混合物を簡単にピペットで採取した。この工程を三回繰り返し、すべての場合においてナノチューブとＤＮＡ比が２：１のものを作り出した。
【００８２】
《実施例１Ａ》
ビス機能化カーボンナノチューブの調製
第一手順を、以下の記載された反応工程で進行することができる。
【化３４】
簡単には、カーボンナノチューブ（１００ｍｇ）及びパラホルムアルデヒド（１５０ｍｇを２４時間毎３回）をＤＭＦ１００ｍＬ中に懸濁する。 Ｂｏｃ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣＨ２ＣＯＯＨ約１５０ｍｇ及びＺ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣＨ２ＣＯＯＨ１６７ｍｇ（モル比１：１）を添加し、前記反応物を１２５℃で７２時間加熱した。加熱を停止し、そして有機相を、遠心分離及びＰＴＦＥフィルター（０．２２μｍ）でのろ過により、未反応物質から分離した。ろ液を蒸発し、そして褐色の残留物をＤＣＭ中に溶解し、水で一度洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥する。前記溶媒を蒸発し、生成物をメタノール／ジエチルエーテルから数回再沈殿する。前記機能化カーボンナノチューブをＴＥＭ及び１Ｈ−ＮＭＲにより明らかにする。
【００８３】
《実施例１Ｂ》
ビス機能化カーボンナノチューブの調製
第二手順を、以下に記載された反応スキームで進行することができる。
【化３５】
簡単には、カーボンナノチューブ（１００ｍｇ）及びパラホルムアルデヒド（１５０ｍｇを２４時間毎３回）をＤＭＦ１００ｍＬ中に懸濁する。Ｂｏｃ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣＨ２ＣＯＯＨ、約１５０ｍｇ及びＰｈｔ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣＨ２ＣＯＯＨ、１６５ｍｇ（モル比１：１）を添加し、前記反応物は１２５℃で７２時間加熱される。加熱を止められ、そして有機相を、遠心分離及びＰＴＦＥフィルター（０．２２μｍ）でのろ過により、未反応物質から分離した。ろ液を蒸発し、そして褐色の残留物をＤＣＭ中に溶解し、水で一度洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥する。前記溶媒を蒸発し、前記生成物をメタノール／ジエチルエーテルから数回再沈殿する。前記機能化カーボンナノチューブをＴＥＭ及び１Ｈ−ＮＭＲにより明らかにする。
第一手順及び第二手順でのＢｏｃ保護基の開裂を、以下に記載された方法により行うことができる。ジオキサン中の４ＭのＨＣｌ溶液をビス機能化カーボンナノチューブ（５ｍｇ）に添加し、そして混合物を常温で５時間撹拌する。溶媒を減圧下で除去し、生成物をメタノール／ジエチルエーテルから数回再沈殿する。機能化カーボンナノチューブをＴＥＭ及び１Ｈ−ＮＭＲにより明らかにする。定量カイザーテスト：０．３５ｍｍｏｌ／ｇの遊離ＮＨ２。
【００８４】
第一手順（実施例１Ａ）において、Ｚ及びＢｏｃ保護基の同時開裂を以下のプロトコルにより行うことができる。ＴＦＡ／ＴＭＳＯＴｆ／ｐ−クレゾール（３２５：８７：４２．５ μＬ／μＬ／ｍｇ）溶液（４００μＬ）をビス機能化カーボンナノチューブ（５ｍｇ）に添加し、そして混合物を常温で１２時間撹拌する。生成物をジエチルエーテル中で直接に沈殿し、そしてメタノール／ジエチルエーテルからの再沈殿により数回洗浄する。機能化カーボンナノチューブの特性をＴＥＭ及び１Ｈ−ＮＭＲにより明らかにする（ＴＭＳＯＴｆ、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルフォン酸塩）。定量カイザーテスト：０．７０ｍｍｏｌ／ｇの遊離ＮＨ２。
【００８５】
前記Ｚ／Ｂｏｃの計画は、完全に直交していない。実際には、前記カーボンナノチューブ側壁上の前記アミノ基の部分を保護する前記Ｂｏｃ基に影響を及ぼさないで前記Ｚ基を取り除くことは可能ではない。
【００８６】
第二手順（実施例１Ｂ）においては、フタルイミド保護基の開裂を以下のように行う。エタノール（１０ｍＬ）中のヒドラジン（３６．５μＬ、７５２μｍｏｌ）をビス機能化カーボンナノチューブ（９．４ｍｇ）に添加し、そして混合物をアルゴン下、常温で１６時間撹拌する。前記溶媒を除去し、メタノールを添加し、フタルヒドラジドを除去するために溶液を遠心分離する。前記生成物をメタノール／ジエチルエーテルから数回再沈殿する。機能化カーボンナノチューブの特性をＴＥＭ及び１Ｈ−ＮＭＲにより、明らかにする。定量カイザーテスト：０．６ｍｍｏｌ／ｇのＮＨ２。
【００８７】
選択的に再び保護されれば、前記のそれぞれのピロリジン環に相当する反応基を当業者に公知の方法に従って置換することができる。
【００８８】
《実施例１Ｃ》
ビス機能化カーボンナノチューブの調製
第三手順において、ビス機能化カーボンナノチューブをフルオレセインイソチオシアネートと反応することができる。この方法は、以下の反応工程に示されている。
【化３６】
【００８９】
簡単には、アミノ機能化カーボンナノチューブ（定量カイザーテストで測定される遊離ＮＨ２の量に相当する７ｍｇ、４．２μｍｏｌ）を、ＤＭＦ２００μＬに可溶化する。ＤＭＦ２００μＬ中のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（４．９ｍｇ、１２．６μｍｏｌ）溶液を添加し、そして前記溶液を常温で一晩撹拌する。溶媒を除去し、そして生成物をメタノール／ジエチルエーテルから数回沈殿する。カイザーテストは陰性である。前記機能化カーボンナノチューブをＴＥＭ及びＵＶ−Ｖｉｓにより明らかにする。
【００９０】
第三手順のために、前記Ｂｏｃ保護基の開裂を以下のように行うことができる。ジオキサン中の４ＭのＨＣｌ溶液をビス機能化カーボンナノチューブ（５ｍｇ）に添加し、そして混合物を室温で５時間撹拌する。前記溶媒を減圧下で除去し、生成物をメタノール／ジエチルエーテルから数回再沈殿する。前記機能化カーボンナノチューブをＴＥＭにより明らかにする。定量カイザーテスト：０．３５ｍｍｏｌ／ｇのＮＨ２。
【００９１】
《実施例２》
細胞内に透過する機能化カーボンナノチューブの能力を調べた。
以前に、発明者らは、蛍光プローブ（ＦＩＴＣ）で標識したカーボンナノチューブで、細胞と相互作用し、そして細胞内へ摂取されるカーボンナノチューブを視覚化することができた。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用する別の実験的なアプローチを、カーボンナノチューブの局在化が起こっている特定の細胞内区画を同定するために、今回行なった。
【００９２】
ＨｅＬａ細胞を３７℃でＤＭＥＭ培地を用い培養し、８０％密集度を超えて増殖した後、２．５ｍｇ／ｍＬ濃度のアミノ遊離ｆ−ＳＷＮＴ及びｆ−ＭＷＮＴ（図１）を細胞に添加した。ナノチューブを１時間細胞と相互作用させ、そして前記細胞を、その後洗浄し、固定し、染色し、脱水し、エポン８１２レジン（Ｅｐｏｎ ８１２ ｒｅｓｉｎ）［商品名］に包埋した。前記ポリマーは、その後ダイアモンド超ミクロトームを使用し約９０ｎｍの超薄層に切断し、そしていくつかの薄片をＴＥＭで分析した。
【００９３】
より正確には、ＳＷＮＴ及びＭＷＮＴ［カーボンナノテクノロジー社（Ｃａｒｂｏｎ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．）及びナノストラクチャー・アンド・アモルファスマテリアルズ社（Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ＆Ａｍｏｒｐｈｏｕｓ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｉｎｃ．）からそれぞれ得られた］は、ジョーガキラスら（Ｇｅｏｒｇａｋｉｌａｓ ｅｔ ａｌ．（２２０２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：７６０−７６１）の記載により機能化した。ＨｅＬａ細胞（１．２５×１０５）を、７５％密集度まで３７℃及び５％ＣＯ２でＤＭＥＭ培地を使用し１６ウエルプレートに培養した。細胞を、その後ｆ−ＳＷＮＴ−ＮＨ２及びｆ−ＭＷＮＴ−ＮＨ２溶液（ＰＢＳ中の２．５ｍｇ／ｍＬ）で２時間培養し、ＰＢＳで２回洗浄し、カコジレイト緩衝液（０．０７５Ｍカコジレイトナトリウム、１ｍＭＣａＣｌ２、１ｍＭＣａＣｌ２、４．５％スクロース、ｐＨ７．３）中のグルタルアルデヒドで、常温で２時間固定した。カコジレイト緩衝液中のピクリン酸の１／１０飽和溶液の１０容量／容量％の量を、その後それぞれのウエルに添加し、そして４℃で一晩中培養した。蒸留水を使用し検体を１５分間３回洗浄し、その後常温で２時間カコジレイト緩衝液の１％ＯｓＯ４溶液で処理した。細胞を蒸留水で注意深くすすぎ、そして４℃で一晩、水溶液中の２％酢酸ウラニル溶液で後固定した。数回洗浄後、前記細胞を１０分間、７０％及び９０％エタノールでそれぞれ乾燥し、そして２０分間無水エタノールで２回乾燥した。未使用のエポン８１２レジン［商品名］の量をＥＭＳ（電子顕微鏡科学）技術データシートによって提案されているように調製し、そしてそれぞれのウエルに分配した。前記プレートを３日間６５℃でオーブンに貯蔵した。それぞれのレジンブロックを、その後プラスチック支持体から除去し、そして切断した。ダイアモンドナイフ超薄切片法をもつレイクハートジャング・ウルトラカットＥ・ウルトラマイクロトーム４５°（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ Ｕｌｔｒａｃｕｔ−Ｅ ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｔｏｍｅ［商品名］４５°）を前記レジンに包埋された前記細胞を切断するために使用した。９０ｎｍの厚さ値を選択した。３つの連続薄片をフォームバーグリッド（ｆｏｒｍｖａｒ ｇｒｉｄ）に置き、７５ｋＶでエレクトロニックトランスミッション顕微鏡（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｈｉｔａｃｈｉ６００）で観察した。画像を異なるレベルの倍率でＡＭＴ高感度カメラにより撮影した。
【００９４】
図２Ａ〜図２Ｄは、前記ｆ−ＭＷＮＴと培養したＨｅＬａ細胞を示している。異なる細胞区画を図２Ａ中の白い矢印により示している。様々なナノチューブが細胞内において明らかに見え、それに続く倍率（図２Ｂ及び図２Ｃ）は、前記ｆ−ＭＷＮＴの細胞内局在化の高解像度の視野を可能にする。ＨｅＬａ細胞との相互作用の同じパターンが、ＳＷＮＴにおいて見られた。大変興味深いことに、前記ナノチューブのいくつかの核内での局在が、確かにサンプルのすべてに常に観察された。しかしながら、カーボンナノチューブの細胞内移動、カーボンナノチューブの核転座の効率及びメカニズムを議論するためには、より詳細な研究が必要とされる。前記の細胞切片の注意深い観察も、前記細胞膜バリアの横断工程の間における、ナノチューブ観察を可能にする。図２Ｄは細胞膜との相互作用、そして取り込まれているｆ−ＭＷＮＴを示している。見られるナノチューブは直径約２０ｎｍ及び長さ２００ｎｍを有している。細胞の取り込みの形式は、まだ明らかではないが、チューブの半剛体及び細長い形状はエンドサイトーシスの過程を除外している。このことは、エンドサイトーシスメカニズムを含むエネルギー依存性の細胞過程の典型的な阻害物質であるアジ化ナトリウム又は２，４−ジニトロフェノールによる、細胞の前培養によっても確認された。カーボンナノチューブは、受動的メカニズムを介して前記細胞に入る可能性がある。それらはナノニードレス（ｎａｎｏｎｅｅｄｌｅｓ）のように振る舞うように思われ、細胞死を起こさないで細胞膜に穴を開ける。実際、これは他のカチオン巨大分子、例えばペプチド及びデンドリマーと対比すると、一般的に細胞溶解の原因となる細胞膜の不安定化の原因となる（Ｒｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．５：１０４−１４；Ｂｏａｓ ａｎｄ Ｈｅｅｇａａｒｄ（２００４）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．Ｓｏｃ．３３：４３−６３）。
【００９５】
そして、異なる濃度での前記カーボンナノチューブの細胞毒性は、フローサイトメトリーにより評価された。この実験では、フルオレセインイソチオシアネートで誘導したアミノｆ−ＳＷＮＴ又はｆ−ＳＷＮＴを、細胞と培養した。
【００９６】
簡単には、ＦＡＣＳによって細胞の生存を分析するために、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清を添加したＤＭＥＭの、指数増殖中のＨｅＬａ細胞を、異なる濃度（０．０１−１０ｍｇ／ｍＬ）のｆ−ＳＷＮＴ−ＮＨ２及びｆ−ＭＷＮＴ−ＮＨ２溶液と６時間培養した。すすぎ、そして３７℃で５分間トリプシンで剥離させ、１０００ｔｒ／ｍｉｎで遠心分離し、アネキシン（ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ緩衝溶液で３回洗浄した。１００μＬの同じ緩衝液及びアネキシンＶ−ＦＩＴＣ０．５μＬを前記の細胞に添加し、そして暗所で１５分間培養した。その後、プロピジウムヨウ化物染色溶液（５０μｇ／ｍＬ）５μＬを添加した。前記分析をサイトフルオリメトリー・ファックスキャリバー（ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）を使用し行った。機器を４９４ｎｍ及び６４７ｎｍ励起波長で操作した。セルクエスト（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）［商品名］ソフトウェアをデータ分析に使用した。サンプル当たり最少４０，０００イベントを分析した。また、ＨｅＬａ細胞を引例６に記載の異なる濃度でＳＷＮＴ−ＦＩＴＣと培養した。
【００９７】
図３Ａ〜図３Ｅは、アミノｆ−ＳＷＮＴの０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ濃度の範囲における、細胞動態を示す。１ｍｇ／ｍＬまでは、細胞の８０％は生きており、そしてナノチューブの最高濃度においては、生存率は５０％に減少することがわかった。アミノ機能化ＣＮＴは、以前研究されたＳＷＮＴ−ＦＩＴＣよりも、より少ない毒性であることを見出すことができる。更に、前記機能化カーボンナノチューブが細胞内にあることを証明するために、後者の実験では、ＳＷＮＴ−ＦＩＴＣ（３ｍｇ／ｍＬ）で培養され、そしてＦＡＣＳ方法で可視化した（図３Ｆ）。９５％より多い細胞が、蛍光的に標識されたナノチューブを取り込んでおり、このデータは、細胞表面への強い親和性そして続いて細胞内在化を示すことを示唆している。前記のデータは図２Ａ〜図２Ｄで示される電子顕微鏡観察と相関しており、ナノチューブと細胞との強い相互作用を示している。
【００９８】
従って、アミノ機能化カーボンナノチューブの細胞に入り、核に達する高い能力は、プラスミドＤＮＡの送達のために活用される。
【００９９】
ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（すべてＧｉｂｃｏから）を添加したＦ１２−Ｋ培地で、９６ウエル組織培養ディシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ）中に９０％密集度に増殖させた。培地を除去し、そして前記ｆ−ＳＷＮＴ：ＤＮＡ複合体５０μＬをそれぞれの条件で、３つのウエルに添加した。３０、９０、又は１８０分間後、トランスフェクション培地を除去し、新鮮な培地に置き替えた。対照として、３つのウエルをオプティメム５０μＬ中のＤＮＡ０．２５μｇでトランスフェクションした。細胞を４８時間培養し、その後集菌した。β−ガラクトシダーゼ活性を、トロピックス・ガラクトライト・プラスキット（Ｔｒｏｐｉｘ Ｇａｌａｃｔｏｌｉｇｈｔ Ｐｌｕｓ ｋｉｔ）及びバートルド（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）９５０７照度計を使用し、メーカーの取扱説明書に従い、測定した。
【０１００】
図４は、ナノチューブと遺伝子をコードしているプラスミドＤＮＡとの相互作用後に得られたＣＨＯ細胞中のマーカー遺伝子（β−Ｇａｌ）発現のレベルを示す。他の非ウィルス遺伝子送達ベクターと同じで、ＳＷＮＴ表面でのアミノ基とＤＮＡ骨格のリン酸基との間の電荷比は、得られた遺伝子発現のレベルの決定要素であると考えられる。ｆ−ＳＷＮＴ：ＤＮＡ電荷の２：１と６：１（＋／−）との間の比は、ＤＮＡのみと比較すると、５〜１０倍高い遺伝子発現のレベルを提供する。細胞毒性はこの実験を通じて観察されず、たとえ、前記ｆ−ＳＷＮＴ：ＤＮＡとＣＨＯ細胞との培養時間が３時間でも観測されなかった。
【０１０１】
《実施例３》
本発明によるアミノ機能化されたＳＷＮＴとプラスミドＤＮＡ複合体を、生体内の遺伝子送達の研究に使用した。
【０１０２】
簡単には、すべての実験動物の研究は、事前の許可及びＵＫ Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅにより示されている規制下で行われた。第８〜１０週齢のオスＢＡＬＢ／ｃマウスを、イソフルレン吸入により麻酔した。５０μｇＤＮＡを含むナノチューブ：ＤＮＡ複合体１．５ｍＬ、対照として生理食塩中１．５ｍＬ中のＤＮＡ５０μｇを投与した。ラコックら（Ｌｅｃｏｃｑ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．５：１４２−１５６）の記載のラピッドハイドロダイナミック注入（ｒａｐｉｄ ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって、マウスの尾静脈を介して注入された。その後、マウスを１６時間後に安楽死させ、肺、肝臓及び脾臓を回収した。組織を−８０℃、一晩で凍結し、融解し、そして、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、２ｍＭＤＴＴ、２ｍＭＥＧＴＡ、１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（すべてＳｉｇｍａから）を含む溶解緩衝液中においてホモジェナイズした。ルシフェラーゼ活性をトロピックスラックスクリーン（Ｔｒｏｐｉｘ ＬｕｃＳｃｒｅｅｎ）アッセイキット及びバートルド（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）９５０７照度計を使用し決定した。検体はピアスＢＣＡアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ）を使用し、総タンパク量を補正した。実験は、グループ当たり３匹の動物を使用し、すべてのアッセイは、４回の検体の検査を行なった。
【０１０３】
結果を図５Ａ〜図５Ｃに示しているが、尾静脈ハイドロダイナミック（ｔａｉｌ ｖｅｉｎ ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ）投与の後に、アミノ機能化ＳＷＮＴとプラスミドＤＮＡとの相互作用は生体内の遺伝子発現レベルを妨げないことを示している。ＤＮＡがｆ−ＳＷＮＴと複合化した場合、すべての３つの組織におけるルシフェラーゼ遺伝子発現レベルは、２４時間前投与で緩やかな（肝臓組織発現においては統計的に有意ではない）アップレギュレーションを示した。興味深いことに、肺及び脾臓組織中の発現データから、前記ｆ−ＳＷＮＴ：ＤＮＡのルシフェラーゼ発現においては２〜３倍の増大があり、プラスミドのみのＤＮＡ投与と比較してＤＮＡの生体分布の変化を示している。より重要にもかかわらず、特にこれはカーボンナノチューブを使用し行われた最初の生体内の遺伝子送達研究であるので、チューブは３つの組織中のいずれかにおいて遺伝子発現を下方制御するとは全く思われない。一方、先端の投与プロトコルにもかかわらず、すべての動物は遺伝子送達システムに副作用がないことを示した。遺伝子送達ベクターシステムの要素としてカーボンナノチューブにより提供することができる遺伝子発現の効率及び強化を最適化及び評価するために、更なる研究が必要である。本研究において報告されているデータは、新規ナノチューブベースの遺伝子送達ベクターシステムを巧に処理するための要素として使用されるカーボンナノチューブの最初の例を構成している。使用された機能化ナノチューブは、エンドソーム非依存性メカニズムであると思われ、細胞中で相互作用し、そして細胞中に取り込まれることができることを示している。細胞障害試験は、典型的な遺伝子導入への適用で使用される濃度より高い、１０ｍｇ／ｍＬ濃度まで、機能化ナノチューブが細胞に許容されることを示している（本遺伝子送達実験において、使用される最も高いナノチューブ濃度は３ｍｇ／ｍＬであった）。更に、ＤＮＡのみと比較してより高いＤＮＡ取り込み及びインビトロの遺伝子発現を容易にするため、ｆ−ＳＷＮＴをプラスミドＤＮＡと相互作用した。レベルは市販の遺伝子トランスフェクション試薬ほど高くはないが、それらは最適化できることを示している。更に興味深いことに、尾静脈ハイドロダイナミック（ｔａｉｌ ｖｅｉｎ ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ）投与による生体内の遺伝子発現は障害されることなく、そしてすべての動物に寛容であった。従って、機能化カーボンナノチューブを、更に遺伝子送達ベクターの構築のための新規なナノチューブとして探索することができ、好ましい生体内の細胞障害性の許容レベル及び生体内の副作用効果の徴候もないことを示し、そして、遺伝子発現の有益なレベルを維持している。
【０１０４】
《実施例４》
ＨＢｓＡｇをコードしたプラスミド（ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ、図７）と複合化したアミノ機能化ＳＷＮＴ（ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋ １）をマウスにおけるワクチン実験に使用した。
【０１０５】
簡単には、６週〜８週齢のＢａｌｂ／ｃマウス６匹の４つのグループにおいて、最初に対照実験を行い、マウスは筋肉内（ＩＭ）注射によって、それぞれ：
−ＰＢＳ；
−ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）（１０μｇ／マウス）；
−ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）（１００μｇ／マウス）；
−ＨＢｓが挿入されていないプラスミド（１００μｇ／マウス）；
を免疫された。
【０１０６】
前記免疫遺伝子をＰＢＳ１００μＬに懸濁する。それぞれのマウスは、それぞれの後脚の脛骨の筋肉に、１回の両側の注入（５０μＬ）を受けた。
【０１０７】
ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）／ｆ−ＳＷＮＴ複合体の実験において、各種の負電荷／正電荷比でｆ−ＳＷＮＴに吸着されたプラスミドの投与は、それぞれの免疫ルート、及びそれぞれのプラスミドの量において行われた。ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）／ｆ−ＳＷＮＴ複合体の３つの負電荷／正電荷比（１：１、１：２、及び１：６）を使用する。
【０１０８】
従って、６週〜８週齢のマウス、Ｂａｌｂ／ｃ６匹の９つのグループは、それぞれ：
−ＰＢＳ
−ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）／ｆ−ＳＷＮＴ 負電荷／正電荷 １：１
（１０μｇ／マウスのプラスミド）、
−ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）／ｆ−ＳＷＮＴ 負電荷／正電荷 １：２
（１０μｇ／マウスのプラスミド）、
−ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）／ｆ−ＳＷＮＴ 負電荷／正電荷 １：６
（１０μｇ／マウスのプラスミド）、
−ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）／ｆ−ＳＷＮＴ 負電荷／正電荷 １：１
（１００μｇ／マウスのプラスミド）、
−ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）／ｆ−ＳＷＮＴ 負電荷／正電荷 １：２
（１００μｇ／マウスのプラスミド）、
−ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）／ｆ−ＳＷＮＴ 負電荷／正電荷 １：６
（１００μｇ／マウスのプラスミド）、
−ｆ−ＳＷＮＴのみ（１：６比の投与量に相当する量）、
−ｆ−ＳＷＮＴに複合化したＨＢｓが挿入されていないプラスミド（対照実験に基づいて作られた１つの負電荷／正電荷比）、
を免役された。
【０１０９】
マウスは、それぞれの前脛骨筋（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｔｉｂｉａｌｉｓ）に、ＰＢＳ５０μＬに懸濁した５又は１０μｇプラスミドＤＮＡの１回の両側筋肉内（ＩＭ）注射を受ける。対照マウスは、ＨＢｓが挿入されていない１００μｇプラスミドを含む２×ＰＢＳ５０μＬをＩＭ注射された。
【０１１０】
あるいは、前記と同様のプロトコルを、尾の付け根の皮下（ＳＣ）注射（１０若しくは１００μｇのプラスミド、又は各種のｆ−ＳＷＮＴとの複合体を含む、ＰＢＳ２００μＬ）を用いて、繰り返すことができる。
【０１１１】
誘導された細胞応答を、投与後１０日で分析し（３マウス）、一方、液性反応を１０週間後に調べた（３マウス）。抗体反応の経過を調べるために、血清検体を、１０週の期間にわたり、免疫原の投与後１５日毎に集める。動物は細胞応答を検査するため、１０週後に安楽死する。
【０１１２】
抗−ＨＢｓの液性免疫反応をヨーン（Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．,１９９９,Ｊ Ｋｏｒｅａｎ Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．１４：１８７−９２）の記載により、測定する。簡単には、ＩＭ及びＳＣ免疫マウスの血清中の抗−ＨｂｓＩｇＧ抗体産生をＥＬＩＳＡ法により測定する。ＥＬＩＳＡプレートを、０．０５Ｍ 炭酸塩−重炭酸塩緩衝（ｐＨ９．６）中に溶解した１μｇ／ｍＬ ＨＢＶプレＳ２抗原（ａ．ａ．１２０−１４５、Ｓｉｇｍａ、Ｈ−７３９５、ＵＳＡ）で、４℃、一晩コートした。ブロッキングは、ブロッキング溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳに０．５％ＢＳＡを溶解）２００μＬで、３７℃、２時間プレートをインキュベートすることにより行った。マウス血清を抗体緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳの０．５％ ＢＳＡ溶液）中で１：５０から１：１６００に２倍段階希釈し、そして希釈された血清１００μＬを、プレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。抗体緩衝液に１：１０００に希釈したセイヨウワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を二次抗体として使用し、前記プレートを、更に３７℃１時間インキュベートした。洗浄後、最後の反応は、ウエルあたり、基質溶液（１０％クエン酸リン酸緩衝液ｐＨ５、＋０．０４％Ｈ２Ｏ２ ＋ ９０％の７２ｍＬジメチルスルホキシドを含む溶液＋グリセロール１８ｍＬ＋３，３’，５，５’−テトラメチレンベンジジン３００ｍｇ）１５０μＬを、３７℃、１５分間添加することにより、視覚化された。反応を０．２５Ｍ ＨＣｌで停止し、そして４５０ｎｍで吸光度を測定した。データは、ＯＤが０．２の希釈の逆数に相当する抗体価として表わす。
【０１１３】
脾臓のＣＴＬの頻度の決定は、クイサら（Ｋｗｉｓｓａ ｅｔ ａｌ．、２００３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８１：９１−１０１）に記載に従い行われる。簡単には、脾臓を無菌的に取り出し、そして貯蔵した。単細胞の懸濁液は、滅菌したメッシュスクリーン（１００μｍ）に、組織を静かに通過させることにより調製した。赤血球をトリス緩衝塩化アンモニウムで溶解し、残った細胞を５０μＭβ−メルカプトエタノール、１００ＩＵ／ｍＬゲンタマイシン及び２５ｍＭＨＥＰＥＳ添加ＲＰＭＩ１６４０（完全培地、ＣＭ）で、よく洗浄した。脾細胞は、ＦＡＣＳ解析及びエリスポット（Ｅｌｉｓｐｏｔ）アッセイのために、いずれかを直接、使用された。次に、脾臓細胞（１×１０７／ｍＬ）を、５μｇ／ｍＬのＨＢｓＡｇ由来の合成Ｌｄ結合Ｓ２８−２９ＩＰＱＳＬＤＳＷＷＴＳＬペプチド、又はＤｄ結合Ｓ２０１−２０９ＷＧＰＳＬＹＳＩＬペプチドとＲＰＭＩ−１６４０培地で１時間インキュベートする。その後、５μｇ／ｍＬのブレフェルジンＡ（ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ：ｓｉｇｍａ １５８７０）を添加し、そして培養物を、更に４時間インキュベートした。細胞を集菌し、そして表面をフィコエリトリン標識抗ＣＤ８モノクロナール抗体で染色した。表面を染色された細胞を、細胞内のＩＦＮγの染色前に、リン酸緩衝液中の２％パラホルムアルデヒドで固定した。固定された細胞を透過緩衝液（Ｈａｎｋ平衡塩類溶液、０．５％ウシ血清アルブミン、０．５％サポニン、０．０５％アジ化ナトリウム）中で再懸濁し、そして常温で３０分間、フルオレセインイソチオシアネート標識抗ＩＦＮγモノクロナール抗体と培養し、そして透過緩衝液で３回洗浄した。染色された細胞を、０．１質量／容量％アジ化ナトリウムを添加したリン酸緩衝液／０．３質量／容量％ウシ血清アルブミンで再懸濁した。ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋ＣＴＬの頻度をフローサイトメトリー分析により決定する。
【０１１４】
エリスポット（Ｅｌｉｓｐｏｔ）ＩＦＮγは、以下のように行なう。ニトロセルロースマイクロプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｏｌｓｈｅｉｍ、Ｆｒａｎｃｅ）を、ラット抗マウスＩＦＮγ（Ｒ４．６Ａ２、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｌｅ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｃｌａｉｘ、Ｆｒａｎｃｅ）でコートし、そして次に、洗浄し、１０％ＦＣＳのＣＭを満たした。エフェクター細胞の複製アリコート（１×１０６脾細胞／ウエルを新たに単離した）をヒトｒＩＬ２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）３０Ｕ／ｍＬを加えたＣＭ−１０％ＦＣＳを含む前記のウエルに添加した。エフェクター細胞を１０μｇ／ｍＬ ＨＢｓＡｇ由来、合成Ｌｄ−結合Ｓ２８−２９ＩＰＱＳＬＤＳＷＷＴＳＬペプチド又はＤｄ−結合Ｓ２０１−２０９ＷＧＰＳＬＹＳＩＬペプチドと培養した。３７℃で２０時間後、ビオチン化ラット抗マウスＩＦＮγ ｍＡｂ（ＸＭＧ１．２、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を加え、一晩インキュベーションした。洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識エクストラアビジン（ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ：ｓｉｇｍａ）を添加し、そしてウエルを室温で１時間培養した。最後に、アルカリフォスファターゼ標識基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅ、ＣＡ）を３０分間添加した。Ｓｐｏｔを形成した細胞をコンピューターアシスト・ビデオイメージアナライザー（ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｖｉｄｅｏ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｚｅｒ：Ｚｅｉｓｓ−Ｋｏｎｔｒｏｎ、Ｊｅｎａ、Ｇｇｅｒｍａｎｙ）を用いて計測した。
【０１１５】
《実施例５》
本実施例において、真核細胞にＤＮＡをトランスフェクトする、複合化された機能化カーボンナノチューブ（ｆ−ＣＮＴ）の能力を検証した。
【０１１６】
原料及び方法
総則
図１に示している、アンモニウム機能化単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋ １）、アミノ機能化多層カーボンナノチューブ（ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋ ２）、及びリジンにより機能化単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋ ３）は、実施例１に記載されている方法により調製した。
【０１１７】
アンモニウム機能化単層カーボンナノチューブ（１）及びアンモニウム機能化多層カーボンナノチューブ（２）を、６ｍｇ／ｍＬ及び６．６ｍｇ／ｍＬ濃度で、それぞれ脱イオン水に溶解した。リジン機能化単層カーボンナノチューブ（３）は、３．３ｍｇ／ｍＬ濃度で脱イオン水に溶解した。すべての溶液を、超音波処理槽（ｂａｔｈ ｓｏｎｉｃａｔｏｒ：８０Ｗ、ＥＭｓｃｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＫ）中で、室温１分間、超音波処理し、その後、使用時まで４℃で貯蔵した。使用前に、ナノチューブ溶液をもう一度簡単に超音波処理した。これらの研究に使用されるプラスミドは、ｐＣＭＶ−Ｂｇａｌ（ＢＤ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｕ．Ｋ．）、７．２ｋｂ、真核細胞発現ベクターであった。高度に精製されたスーパーコイルＤＮＡの大量精製（ｇｉｇａｐｒｅｐ）は、バヨウ・バイオラボ（Ｂａｙｏｕ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＬＡ、ＵＳＡ）により調製した。ストック溶液は、１ｍｇ／ｍＬ濃度で脱イオン水により調製した。アリコートを使用まで−８０℃で冷凍保存した。
【０１１８】
ｆ−ＣＮＴ：ＤＮＡ複合体
機能化カーボンナノチューブ（ｆ−ＣＮＴ）：ＤＮＡ複合体を調製するために、適当な量のそれぞれの型のナノチューブを、総容量２００μＬの脱イオン化された水で希釈し、その後、それぞれの濃度のｆ−ＣＮＴ用に、５０μＬずつの４つのアリコートに分割した。前記ナノチューブの型及び必な電荷比に応じて、ｆ−ＣＮＴ濃度は１６．５μｇ／ｍＬから３００μｇ／ｍＬの範囲とした。次に、同じ容量の５μｇ／ｍＬＤＮＡ溶液を、３つの前記ｆ−ＣＮＴアリコートに添加し、その後、素早く１０回ピペッティングすることより混合し、２５０ｎｇ／ｍＬの最終ＤＮＡ濃度を作成した。５０μＬ脱イオン化された水を、ナノチューブのみの対照として、それぞれのグループの第４のｆ−ＣＮＴアリコートに添加した。複合体は、使用前に室温、３０分間で形成させることができた。前記の工程は、試験されるそれぞれの電荷比で繰り返しされ、相当する濃度で条件当たり、ナノチューブのみのサンプルに加え、３つのサンプルを作成した。
【０１１９】
走査電子顕微鏡
ＳＥＭを使用し、プラスミドと複合化されたＳＷＮＴ−ＮＨ３＋１及びＭＷＮＴ−ＮＨ３＋２の像を取得する。画像の作成は、前記６：１（ＣＮＴ：ＤＮＡ）電荷比の複合体サンプル、又は同じ濃度のナノチューブのみのサンプル３０μＬを、ＳＥＭスタブ（ｓｔｕｂ）に置くことによって実行し、そして金のコーティング前に室温で乾燥させた。この工程は、２０ｍＡで２分間、エミテックＫ５５０スパッタ−・コーター（Ｅｍｉｔｅｃｈ Ｋ５５０ Ｓｐｕｔｔｅｒ Ｃｏａｔｅｒ）で行なった。画像の作成は、２０−２５ＫＶ間の加速電圧でＦＥＩフィリップスＸＬ３０（ＦＥＩ／Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ ３０）走査電子顕微鏡（Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の下で実施した（それぞれの像も参照）。像を補足し、そしてデジタル化し保存した。
【０１２０】
表面プラズモン共鳴
ＢＩＡｃｏｒｅ３０００システム、センサーチップＣＭ５、界面活性剤Ｐ２０、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド（ＮＨＳ）及びＮ−エチルＮ’−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）を含むアミンカップリングキットは、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）のものである。すべてのバイオセンサー試験は、泳動バッファーとしてＨＢＳ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１４０ｍＭ酢酸カリウム、３ｍＭ酢酸マグネシウム、０．０２％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．３）で実行した。ナノチューブの固定化は、ナノチューブ（酢酸緩衝液中の１００μｇ／ｍＬ、ｐＨ４．０）３５μＬをＥＤＣ／ＮＨＳで活性化したセンサーチップＣＭ５の表面に注入することによって行なった。これを、マトリックスの活性化されたフリーの部位を飽和させるために、続いて２０μＬエタノールアミン塩酸塩ｐＨ８．５を注入した。チップ上に非共有結合的に固定化されているナノチューブを除去するために、１００ｍＭＨ３ＰＯ４溶液を使用した。すべての結合実験は、２５℃、３０μＬ／ｍｉｎの一定流速で行なった。ｐＣＭＶ−ＢＧａｌを前記泳動バッファー中に溶解した。各種の濃度のプラスミド（６．３から１００μｇ／ｍＬ）を９０秒間注入し、そして２分間の解離フェイズを続けた。すべての実験において、センサーチップを１５μＬの３ＭＭｇＣｌ２で再生した。速度パラメータは、ＢＩＡｅｖａｌ３．１ソフトフェアを使用し計算した。分析は、簡易ラングミュア結合モデルを用いて行った。特異結合プロファイルは、チャンネルコントロールから応答シグナルを引いた後、得られた。それぞれのモデルの適合性は、カイ二乗値、及び理論モデルと比較した残留分布のランダム性によって判断した。
【０１２１】
ｆ−ＣＮＴ：ＤＮＡ複合体のためのピコグリーンアッセイ（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ａｓｓａｙ）
ｆ−ＣＮＴとの複合化した後のＤＮＡの近接性の程度を、二本鎖ＤＮＡ結合試薬であるピコグリーン（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ＯＲ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）によって評価した。簡単には、カーボンナノチューブ：ＤＮＡ複合体を、脱イオン化された水で１０倍希釈し、２５０ｎｇ／ｍＬの最終ＤＮＡ濃度を作成した。次に、サンプル１００μＬをコースター９６ウエルスペシャルオプティクスブラックプレート（ＣｏＳｔａｒ ９６−ｗｅｌｌ ｓｐｅｃｉａｌ ｏｐｔｉｃｓ ｂｌａｃｋ プレート：Ｃｏｍｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）の３つのウエルに添加した。本研究で使用されるプラスミド、ｐＣＭＶ−Ｂｇａｌは、そもそもスーパーコイルの状態であり、アッセイキットを含まれるコントロールよりむしろ、前記プラスミドを用いて１０００ｎｇ／ｍＬ〜３１．２５ｎｇ／ｍＬの範囲の標準曲線を作成した。２ｘＴＥ緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ／２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中のピコグリーン試薬１００μＬを、それぞれのウエル中に添加し、そして、プレートを３分間暗所でインキュベートし、その後、ワラックビクター（Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ：Ｗａｌｌａｃ、ＵＫ）マルチウエルプレートリーダーを用いて、それぞれ４８５ｎｍ及び５３０ｎｍの励起及び放射波長で測定した。測定される波長において、カーボンナノチューブのみでも自己蛍光を発するため、カーボンナノチューブのみの第２の標準曲線を作成し、バックグラウンドの蛍光を定量化した。その後、これをそれぞれのサンプルから引いた。パーセント遊離ＤＮＡは、それぞれの複合体のバックグラウンド補正されたＰｉｃｏＧｒｅｅｎカウントを、ｐＢｇａｌ２５０ｎｇ／ｍＬのみのバックグラウンド補正された測定値（１００％遊離ＤＮＡを示す）で割ることによって決定した。データを３つのサンプルの平均で示し、プラス又はマイナスの標準偏差を示す。
【０１２２】
電気泳動運動性移動アッセイ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ Ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ）
異なる電荷比の３つの型のカーボンナノチューブに複合化されているＤＮＡ（ｐＢｇａｌ）０．２μｇ、又は対照としての遊離ＤＮＡ０．２μｇを、臭化エチジウムを含むＴＡＥ緩衝液中の１％アガロースゲルに添加した。ゲルを９０Ｖで２時間、泳動し、その後ＵＶＰゲルドキュメンテーションシステム（ＵＶＰ Ｇｅｌ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ：Ｕｐｌａｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用し、紫外光の下で撮影した。それぞれの検体は、２検体ずつ泳動した。
【０１２３】
遺伝子導入実験
Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ、Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ、ＵＫ）を９６ウエルプレートにほぼ密集するまで、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）で培養した。複合体は、無血清ＤＭＥＭで０．７５μｇのｐＣＭＶ−ＢＧａｌを希釈し、そして、７５μＬの無血清ＤＭＥＭ中で適当量のＳＷＮＴ−ＮＨ３＋１、ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋２又はＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋３を希釈することにより形成し、ＤＮＡ０．７５μｇを有する目的の電荷比を作成した。ＤＮＡ溶液は、迅速なピペッティングにより、ｆ−ＣＮＴと混合し、そして３０分間で安定化させた。完全培地を前記Ａ５４９細胞から取り除き、そして各種のｆ−ＣＮＴ：ＤＮＡ複合体１５０μＬに置換した。コントロールとして、培地のみで処理した細胞、又はＤＮＡ０．７５μｇを含む培地で処理した細胞を、使用した。細胞を３７℃で９０分間、複合体と培養し、そして、次にトランスフェクション培地を除去し、完全培地に置き換えた。細胞を４８時間置き、ＰＢＳ中で１回洗浄し、溶解し、そしてトロピックス・ガラクトライト・プラスキット（Ｔｒｏｐｉｘ Ｇａｌａｃｔｏｌｉｇｈｔ Ｐｌｕｓ ｋｉｔ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）及びルマットＬＢ（Ｌｕｍａｔ ＬＢ）９５０７照度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂａｄ Ｗｉｌｄｂａｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用しβ−ガラクトシダーゼの発現を分析した。データは、ＤＮＡのみの群を引いた後、３つのサンプルの平均として示し、平均のプラス／マイナスの標準偏差を示した。
【０１２４】
結果
プラスミドＤＮＡとｆ−ＣＮＴとの相互作用の後に形成される複合体を視覚化するために、ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋１とＭＷＮＴ−ＮＨ３＋２との両方を走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）によりβ−ｇａｌ発現プラスミドの存在下（図８Ａ〜８Ｆ）で、分析した。
５μｇ／ｍＬ濃度のプラスミドＤＮＡと複合化されている水溶液中の１８０μｇ／ｍＬ濃度のＳＷＮＴ−ＮＨ３＋１（６：１電荷比を生じる）が、生体内での遺伝子発現のピークレベルを作り出すことを、前記の観察は（実施例２）は証明した。本実験において、ＳＥＭにより得られる複合体の物理的特性及び形態特性を調べるために、前記と同じ条件を使用した。同じＤＮＡ濃度と複合化される場合、利用可能な機能化アミノ基（０．９０ｍｍｏｌ／ｇ ＮＨ２）の使用量が相違するので、ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋２を９９μｇ／ｍＬ濃度で可溶化し、同等の電荷比を作成した。カーボンナノチューブ：ＤＮＡ複合体を６：１の電荷比で形成した場合、塊状の構造の非常に鮮明な像が、前記ＳＥＭサンプルグリッド（図８Ａ〜８Ｆ）を通じて観察された。
【０１２５】
ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ複合体は４μｍより大きい凝集体を形成し、平面格子構造をもっていた。ＤＮＡ凝縮体は、ナノチューブの中に埋められているナノチューブを有する凝結物様の平面構造を形成する（図８Ａ〜８Ｃ）。塊のような前記凝結物様のブロックを分離するエッジを定義しているウエル（ｗｅｌｌ）なしに、ＤＮＡは非常によりタイトに密集しているように見える。ｆ−ＳＷＮＴの周りの直径１〜４μｍのほとんどバラバラの凝集体粒子の形成によっても明らかなように、ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ複合体のＳＥＭの画像は、異なる構造的特徴を示している。この場合において、単層カーボンナノチューブは、個別のチューブを連結する球状のＤＮＡ束状構造を有する並列格子を形成するように思われ、それらの末端は、複合体の端から伸びているように見ることができる。ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡの場合に観察された凝結物様の格子というよりも、ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ複合体は球体構造であることを十分定義することによって特徴づけられる。それらは、前記カチオンナノチューブの周りの凝縮したプラスミドＤＮＡによって実現する様々な構造によるものであると発明者は信じている。前記の相違は、ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋の表面上のより大きいカチオン電荷密度、及びＤＮＡをナノチューブ自身とより密接に結びつくことを可能にしている増加した表面領域の両方に帰することができる。
【０１２６】
機能化カーボンナノチューブ及びプラスミドＤＮＡの間の親和性を定量化する試みにおいて、それらの相互作用を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。この研究において、ＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋３に相当するｆ−ＣＮＴの２型も使用した（図１）。チューブ上のＮＨ２基及びチップの金表面のカルボキシル基（順にカルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシニイミドで活性化した）の間の安定なアミド結合を形成することによって、図１のナノチューブをセンサーチップ上に固定化した。第１ステップの後に酸洗浄処理を続け、すべての試薬及び過剰なカーボンナノチューブを除去した。前記のナノチューブの共有結合による固定化は、センサグラム応答の明らかな増加によって証明された。
【０１２７】
ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋１及びＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋３の両方の場合において、固定されたチューブの量は、１００ｍＭリン酸で丁寧な洗浄後に、著しく減少した。これは、センサーチップ上に一定量のナノチューブが非特異的に結合しているためとすることができる。共鳴ユニットの著しい減少は検出されなかったので、酸処理はＭＷＮＴ−ＮＨ３＋２には影響しなかった。ナノチューブを有するセンサーチップの機能性をより明らかにするために、前記センサーチップのＳＥＭ分析を行なった。前記の技術を用いて、チップ表面へ共有結合されたナノチューブを可視化することができた。図９は、前記センサーチップチップ表面を被覆するカルボキシメチル化デキストランの上部のＷＮＴ−ＮＨ３＋２のＳＥＭ画像を鮮明に示している。チューブは、直径２０ｎｍと７０ｎｍとの間であり、それらは単一体として存在する。
【０１２８】
センサーチップ上への各種のチューブの固定化の後に、プラスミドＤＮＡ、ｐＣＭＶ−Ｂｇａｌとそれらの相互作用を検討した。前記プラスミドを、注入される緩衝液（６．３〜１００μｇ／ｍＬ）中において異なる濃度で使用した。それぞれの濃度において、結合曲線（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ）及び解離曲線を簡易ラングミュア結合モデルを使用し別々に適合させた。ＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋３及び前記ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋２とプラスミドの結合のセンサーグラムデータを図１０にまとめた。前記フィッティングパラメータの分析は、ＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋３、及びＭＷＮＴ−ＮＨ３＋２のそれぞれの見かけの平衡結合定数である４．４５×１０８Ｍ及び２．３６×１０７Ｍ−１を、我々に計算させることを可能にする。
【０１２９】
ＳＰＲ（共鳴ユニットとして示される応答）は、金表面上の１００ｎｍまでの流体相中の複合体の検出を可能にする。固定化されたカーボンナノチューブと前記プラスミドＤＮＡとのすべての相互作用が、金表面（１００ｎｍの厚さ）の信号感受領域内で検出されるそれらの相互作用によって、一般的に示すことができるという仮定の下で、前記の２つの関与した要素の間の正電荷／負電荷比を計算することができる。ＲＵ値（１ＲＵ＝１ｐｉｃｏｇｒａｍ／ｍｍ２）の単純な変換は、ＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ、及びＭＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ複合体のそれぞれの電荷比６２．５：１及び１１．５：１を示す。ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋は、ＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋と比較してより多い量のＤＮＡを凝縮することができる。電荷密度は両方の系において、ほぼ同じであるので、前記の相違は、２つの型のナノチューブの相対的大きさによるものであることは確実である。ＭＷＮＴは、ＤＮＡと相互作用するための、より多くの利用可能な表面を提供する。ＳＰＲの研究から、ｆ−ＣＮＴはプラスミドＤＮＡと強い親和性を持っており、強いイオン相互作用によって安定される超分子複合体を形成すると結論づけることができる。塩化マグネシウムによるセンサーチップの再生工程中のプラスミドの完全解離によって確認されるように、静電相互作用は、完全に可逆的である。
【０１３０】
別の技術を前記ｆ−ＣＮＴ：ＤＮＡの研究のために使用した。ピコグリーン・ダイ・エクスクルージョン（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｙｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）アッセイを、溶液中のナノチューブによるＤＮＡの凝縮の程度を評価するために用いることができる。ピコグリーン蛍光は、二本鎖ＤＮＡ塩基対間への挿入により約１０００培増加する。ＤＮＡが凝縮した場合、前記色素はＤＮＡと相互作用することを妨害される。従って、凝縮したＤＮＡを同じ濃度の遊離ＤＮＡと比較した場合、蛍光の減少が観察される。
【０１３１】
この研究において記載されている３つすべての型のｆ−ＣＮＴの相互作用は、図１１Ａ〜図１１Ｃにおいて示されているＤＮＡとの電荷比の範囲にわたって評価された。複合体形成のあいだのプラスミドＤＮＡ濃度は２．５μｇ／ｍＬで一定であり、一方、ナノチューブの濃度は８．２５μｇ／ｍＬから１５０μｇ／ｍＬの範囲であり、それは、検討されるチューブの型と電荷比に依存している。３つのすべての場合において、ｆ−ＣＮＴはＤＮＡを明らかに凝縮することができる。ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋１（図１１Ａ）は、ＤＮＡの凝縮において、最少の効率のようである。電荷比１：１で、ＤＮＡの４３％のみを凝縮し、６：１で５８％に徐々に増加する。さらなる凝縮は、より高い電荷比において起こることはほとんどないようである。９６％を超えるＤＮＡが、電荷比１：１のＭＷＮＴ−ＮＨ３＋２（図１１Ｃ）によって凝縮され、そして９９％のＤＮＡが電荷比６：１及びそれ以上の電荷比によって、凝縮される。ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋と同様の表面電荷負荷をもつＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋３の場合（図１１Ｂ）において、約７４％のＤＮＡは電荷比１：１で凝縮されるようであり、６：１で８５％まで徐々に増加し、１０：１で最大凝縮に到達し、９２％を超えるＤＮＡが凝縮される。
【０１３２】
前記ピコグリーンデータは、前記のＳＥＭ像（図８）において見られたように、ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋と比較してＳＷＮＴ−ＮＨ３＋との相互作用後のＤＮＡの明らかに少ない凝縮パックの観察を確認する。これは、より低い電荷負荷効率（ｃｈａｒｇｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）、及び他の型のｆ−ＣＮＴと比較した場合に、ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋上で利用可能な正電荷への接近が比較的制限されていることによるものであると考えられている。同様に、ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋は、非常に効率良くＤＮＡを凝縮するようである。
【０１３３】
次に、ｆ−ＣＮＴ：ＤＮＡ複合体の移動を、アガロースゲル電気泳動及びＥｔＢｒ（臭化エチジウム）排除によるＤＮＡ凝縮によって検討した（図１２Ａ〜図１２Ｃ）。これらの検討において使用される前記プラスミドｐＣＭＶ−βＧａｌは高度に精製され、約８５％はスーパーコイル化され、残りの１５％はオープンサーキュラー型であった（レーン１、図１２Ａ）。ｆ−ＣＮＴによるＤＮＡの凝縮は、ＥｔＢｒ挿入を排除し、蛍光シグナルを消す。従って、前記ｆ−ＣＮＴ：ＤＮＡ複合体に関与する凝縮されたＤＮＡを観察することは可能ではない。一般的に、図１２Ａ〜図１２Ｃで観察される前記蛍光バンドは、十分なＥｔＢｒ挿入を可能にする遊離（複合化されていない）ＤＮＡから発生している。また、図１２Ａ〜図１２Ｃもｆ−ＣＮＴ：ＤＮＡ電荷比の増加に伴い、遊離ＤＮＡバンドの蛍光強度の全体的な減少を示しており、これは、より高い程度のＤＮＡ凝縮を原因とする、ＥｔＢｒ挿入のための利用できるＤＮＡ塩基の低下によるものである。典型的には、このアッセイは、ＤＮＡ移動度のシフトによって示されるように、ＤＮＡ構造の異なる型の移動を検討するために使用されている。この場合においては、完全にＤＮＡを凝縮することができると思われないＳＷＮＴ−ＮＨ３＋の場合（図１２Ａ）においてのみ、検討が可能であり、レーン２、３及び４において、遊離ＤＮＡの異なる構造（傷の入ったＤＮＡを含む）が明らかである。
また、図１２Ａ〜図１２Ｃのデータは以前の実験と著しく一致していることがわかる。ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡの場合において、強い蛍光シグナルは、１：１電荷比（図１２Ａ）に相当するレーン２中で観察され、多量の遊離ＤＮＡが存在していることを示している。電荷比が６：１まで増加するにつれて、蛍光強度の強い減少、及び前記遊離ＤＮＡバンドの上方へのシフトの増加が起こるが、前記＋／−電荷比が１０：１に更に増加しても、相違はほとんど見られない。複合化したＤＮＡの量がこの範囲ではプラトーに達していることをピコグリーンデータは示していたので、これは予想されることである（図１１Ａも参照）。ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡの複合化と比較した場合、ＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋３及びＤＮＡの複合化（図１２Ｂ）はより強いものであり、それは、遊離ＤＮＡバンドの総体的により弱い蛍光強度、及び電荷比の増加に伴う蛍光の漸進的な消失により観察されるものである。それは、挿入に利用可能な遊離ＤＮＡ量が、更にもっと減少していることを示している。ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋ ２の場合において、存在する遊離ＤＮＡの量がとても小さいために、前記１：１電荷比でかすかな蛍光シグナルのみを見ることができる（ｌａｎｅ ２、図１２Ｃ、また図１１Ｃ参照）。同じレーンにおいて、検出されたかすかなスメアーは、前記ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋２と相互作用するＤＮＡによるものであるが、完全に凝縮されていないものであると我々は信じており、いくらかのＥｔＢｒ挿入を許し、またこれらの複合体の広く大量な分布を示している。より高いＭＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ比においては、ＤＮＡの全体の量は完全に凝縮されているので、蛍光バンドは消失する。
【０１３４】
ｆ−ＣＮＴは前記ゲル中に存在する場合、前記遊離ＤＮＡバンドの位置の上方へシフトすることが見られるが、ナノチューブそれ自身の高いイオン強度のために、泳動バッファーの交代がほとんどの原因のようである。この移動は前記スーパーコイルのＤＮＡの傷（ｎｉｃｋｉｎｇ）のためであってもおこり、ナノチューブとの相互作用によるもの、又は混合工程中に維持するためのどちらでも、ＤＮＡをより開放した形に緩和させる原因となるけれども、高濃度のＳＷＮＴ−ＮＨ３＋１のみ（１２ ｍｇ／ｍＬ）を、ブルーグリーン泳動バッファー（ｂｌｕｅ−ｇｒｅｅｎ ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）中で泳動したコントロール実験は、泳動バッファーのイオン強度がゲル中の分子移動における変化に関与することができることを示す、色素移動の明らかな遅延を証明した。
【０１３５】
最後に、形成される様々なｆ−ＣＮＴ：ＤＮＡ複合体の遺伝子導入の効率を検討した。データは、すべての３つの型の複合体は、すべての３つの図（図１３Ａ〜図１３Ｃ）においてゼロの値に標準化されている、むき出しのＤＮＡより高い効率でＡ５４９細胞をトランスフェクトすることができることを証明する。８：１の電荷比でＤＮＡに複合される場合において、ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋１は遺伝子導入において最も効果があると思われ、ＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋３は１：１の電荷比で最も効果があると思われる。興味深いことに、ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋１の場合は、前記の電荷比において、約３０％のＤＮＡは色素と相互作用するために遊離しており、そしてＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋３の場合は、同様に２５％のＤＮＡは遊離していることを、ピコグリーンのデータは示している。このデータは、ｆ−ＣＮＴによるＤＮＡ凝縮の最適な程度が、より高いレベルの遺伝子発現を引き起こすことを示している。予想どおりに、ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋２の場合は、とても低い電荷比においてさえもＤＮＡは完全に凝縮されるので、研究されるすべての電荷比及びＤＮＡ量にわたって、これらのナノチューブのトランスフェクション効率においてかなり違ってくるとは思われない。高い電荷比において９５％のＤＮＡを凝縮した、ＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋３のトランスフェクション効率は、電荷比の増加とともに減少すると思われるが、同じ効果はＭＷＮＴ−ＮＨ３＋２のグループでは見られず、示したように、すべての電荷比にわたってトランスフェクション効率の同様のレベルを維持することに注意することが重要である。これは、単層ナノチューブより長くそして広い、多層ナノチューブの構造もまた重要な役割を果たすことができるという示唆であることができる。
【０１３６】
《実施例６》
水中で１０と１００μｇ／ｍＬとの間の濃度のＤＴＰＡをもつ機能化カーボンナノチューブを、ＰＢＳバッファー中の０．１と１μＭとの間の濃度でタンパク質と２時間混合する。タンパク質は、例えば、ストレプトアビジン、プロテインＡ、ウシ血清アルブミン、チトクロームＣを含む。特に、７より大きい等電点をもつタンパク質が静電相互作用を完全に有効に利用できるために理想的である。前記複合体はＴＥＭ及びＡＦＭによって特性を明らかにされ、そしてその後に細胞に供給される。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、カーボンナノチューブを含む非共有複合体、及び分子を細胞に運ぶための非共有複合体の使用に関する。
【０００２】
機械的、熱的、化学的、及び電子的性質の例外的な組み合わせにより、単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）及び多層カーボンナノチューブ（ＭＷＮＴ）は、特異な材料として考えられており、特にナノテクノロジー、ナノエレクトロニクス、複合材料及び医化学の分野において、今後の応用が期待されている。
【０００３】
しかしながら、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）が生理溶液中に溶解しないことを主な理由として、カーボンナノチューブの生物学的応用の可能性は、今まで全く検討されていない。
【０００４】
カーボンナノチューブとＤＮＡ又はタンパク質等の種々の分子とのいくつかの非共有複合体は、従来技術に記載されている。ほとんどの場合において、前記分子と前記カーボンナノチューブとは、疎水的相互作用及び／又はπ−スタッキング相互作用により結合している。
【０００５】
従って、ゼング（Ｚｈｅｎｇ）ら［ネイチャー・マテリアル（Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒ．）２００３年、第２巻、ｐ．３３８−３４２］は、一本鎖ＤＮＡ分子によるカーボンナノチューブの可溶化を記載しており、前記ＤＮＡ分子は、π−スタッキング相互作用によりカーボンナノチューブの周りにらせん状に巻きついており、可溶性複合体を形成する。
【０００６】
別の場合において、国際公開０２／０９５０９９パンフレットは、π−スタッキング相互作用、ファン・デル・ワールス相互作用及び疎水的相互作用によってカーボンナノチューブの側壁への分子（好ましくはタンパク質又はＤＮＡを含む）の前記不可逆的な吸着から形成される複合体に関する。
【０００７】
前記複合体に関連する１つの欠点は、複合体の解離が困難であり及び／又は確実に評価されていないことである。
【０００８】
これらの複合体に関連するもう１つの欠点は、カーボンナノチューブが複合体から解離すれば、カーボンナノチューブそれ自体が水溶系に溶解せず、そして沈殿する疎水性凝集を形成することである。更に、機能化されていないカーボンナノチューブは、有毒であることがいくつか示されている（Ｗａｒｈｅｉｔ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ７７：１１７−１２５；Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ７７：１２６−１３４；Ｓｈｖｅｄｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ，ＰａｒｔＡ６６：１９０９−１９２６）。
【０００９】
このような欠点は、生体系において、前記カーボンナノチューブに、複合化された分子を運ぶために使用される前記非共有複合体の能力を大幅に低下させる。
【００１０】
更に、前記の複合体が細胞内へ浸透することができることは、証明されていない。
【００１１】
従って、本発明の１つの目的は、カーボンナノチューブ及び目的の分子を含み、そして前記目的の分子を放出する傾向にある複合体を提供することである。
【００１２】
本発明のもう１つの目的は、カーボンナノチューブを含む複合体を提供することであり、カーボンナノチューブがそれ自体溶解性である。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、カーボンナノチューブを含む生物学的に相性がよい複合体及び毒性のない複合体を提供することであり、前記複合体は、細胞へ浸透することが可能である。
【００１４】
本発明のもう１つの目的は、前記特性を示しているカーボンナノチューブを含む複合体を調製する方法を提供することである。
【００１５】
本発明は、正電荷及び／又は負電荷を含むカーボンナノチューブの使用であって、前記電荷が電荷を担持している基少なくとも１つによって担持され、前記電荷を担持している基が前記カーボンナノチューブの表面に共有結合しており、前記カーボンナノチューブと前記荷電分子との結合が本質的に静電的であり、そして前記カーボンナノチューブが正電荷を含む場合は、前記荷電分子は負電荷少なくとも１つを含んでおり、及び／又は前記カーボンナノチューブが負電荷を含む場合は、前記荷電分子は正電荷少なくとも１つを含んでいるものとする、前記カーボンナノチューブと荷電分子少なくとも１つ（但し、前記荷電分子はＣｌ−とＴＦＡ−と異なっている）との複合体の製造への、前記使用に関する。
【００１６】
また、本発明は、正電荷及び／又は負電荷を含む前記カーボンナノチューブの使用であって、前記電荷が電荷を担持している基少なくとも１つによって担持され、前記電荷を担持している基が前記カーボンナノチューブの表面において共有結合しており、前記カーボンナノチューブと前記荷電分子との結合が本質的に静電的であり、そして前記カーボンナノチューブが正電荷を含む場合は、前記荷電分子は負電荷少なくとも１つを含んでおり、及び／又は前記カーボンナノチューブが負電荷を含む場合は、前記荷電分子は正電荷少なくとも１つを含んでいる、前記カーボンナノチューブと約１１５より大きい分子量を有する荷電分子少なくとも１つとの複合体の製造への、前記使用に関する。
【００１７】
また、本発明は、正電荷及び／又は負電荷を含んでいるカーボンナノチューブと荷電分子少なくとも１つとを含む複合体であって、前記電荷が電荷を担持している基少なくとも１つによって担持され、前記電荷を担持している基が前記カーボンナノチューブの表面において共有結合しており、
前記カーボンナノチューブが正電荷を含む場合は、前記荷電分子は負電荷少なくとも１つを含んでおり、及び／又は前記カーボンナノチューブが負電荷を含む場合は、前記荷電分子は少なくとも１つの正電荷を含んでおり（但し、前記荷電分子がＣｌ−とＴＦＡ−と異なるものとする）、
前記カーボンナノチューブと前記荷電分子との結合が本質的に静電的である、前記複合体に関する。
【００１８】
また、本発明は、正電荷及び／又は負電荷を含んでいるカーボンナノチューブと約１１５より大きい分子量を有する荷電分子少なくとも１つを含む複合体であって、前記電荷が電荷を担持している基少なくとも１つによって担持され、前記電荷を担持している基が前記カーボンナノチューブの表面において共有結合しており、そして、前記カーボンナノチューブが正電荷を含む場合は、前記荷電分子が負電荷少なくとも１つを含んでおり、及び／又は前記カーボンナノチューブが負電荷を含む場合は、前記荷電分子は正電荷少なくとも１つを含んでおり、
前記カーボンナノチューブと前記荷電分子との結合が本質的に静電結合である、前記複合体に関する。
【００１９】
用語「カーボンナノチューブ」は、円筒形に配列された炭素原子のみで構成された分子を意味し、前記円筒形は、所定の長さ及び直径によって特徴づけられている。前記カーボンナノチューブは、平面グラファィトを丸めることにより形成される円筒形グラファイトと似ている。前記円筒形側壁の炭素原子は、平面グラファイトと同様に、縮合ベンゼン環を形成するために配列されている。
【００２０】
用語「電荷を担持している基」は、電荷少なくとも１つを担持している基を示している。前記電荷を担持している基は、正電荷のみ、負電荷のみ、又は両方の電荷を担持することができる。更に、前記電荷を担持している基は、負電荷よりも正電荷を多く含むことができる。つまり、その正味の電荷、又は全体的な電荷は、正電荷である。反対に、前記電荷を担持している基が正電荷よりも負電荷を多く含むことができる。つまり、その正味の電荷、又は全体的な電荷は、負電荷である。また、前記電荷を担持している基は、等しい量の正電荷及び負電荷を含むことができる。つまり、その正味の電荷、又は全体的な電荷は、中性である。
【００２１】
用語「荷電分子」は、電荷少なくとも１つを担持している分子を示している。前記荷電分子は、正電荷のみ、負電荷のみ、又は両方の電荷を担持することができる。更に、前記荷電分子は、負電荷よりも正電荷を多く含むことができる。つまり、その正味の電荷、又は全体的な電荷は、正電荷である。反対に、前記電荷を担持している基が正電荷よりも負電荷を多く含むことができる。つまり、その正味の電荷、又は全体的な電荷は、負電荷である。また、前記荷電分子は、等しい量の正電荷及び負電荷を含むことができる。つまり、その正味の電荷、又は全体的な電荷は、中性である。
【００２２】
本発明によれば、電荷を担持している基は、カーボンナノチューブの側壁に関連する前記炭素原子少なくとも１つを必要とする結合によって、前記カーボンナノチューブの表面に共有結合している。前記カーボンナノチューブは、前記電荷を担持している基によって、機能されていると考えることができる。
「ＴＦＡ−」は、トリフルオロ酢酸に関する。
本発明における複合体の結束性を維持する力は、本質的には、静電気力である。例えば、前記複合体の結束性は、前記電荷を担持している基及び前記荷電分子のそれぞれに属している異極性電荷によって、もう一方の電荷に働きかける引力によって維持されている。本発明における静電結合は、特に、イオン結合に関する。前記電荷を担持している基に属する１又は数個の電荷が、前記荷電分子に属する１又は数個の電荷とそれぞれ互いに作用しあうことができることは、当業者によって明らかであろう。電荷を担持している基、又は荷電分子が１つより多い電荷を含む場合には、すべての電荷が必ずしも、荷電分子、又は電荷を担持している基にそれぞれ属している電荷と作用しあうわけではないこともまた明らかであろう。
条件、例えばｐＨによって、前記カーボンナノチューブの電荷、前記電荷を担持している基の電荷、又は前記荷電分子の電荷は変化する。
【００２３】
前記発明の好ましい実施態様によれば、前記定義された複合体が、水性溶媒に可溶であり、そして毒性がないことを特徴とする。
特に、前記複合体は、１・１０−１２〜１・１０−２ｍｏｌ／ｌ濃度で水中に溶ける。
水性溶媒は、特に、水、生理溶液、及び生体液、例えば血液、リンパ液又は細胞質を含む。
「毒性のない」ことによって、本発明の複合体は、細胞に対して、又は複合体を投与した個体に対して、本質的に有害性を生じないことを意味している。
特に、本発明の複合体は、１・１０−２ｍｏｌ／ｌと同じ高濃度であっても毒性はない。
本発明の複合体を含む前記カーボンナノチューブは、好ましくは水性溶媒に可溶し、そして毒性がない。
前記複合体の溶解性は、前記荷電分子ばかりでなく、カーボンナノチューブの表面に共有結合している電荷を担持している基の存在にも起因している。
前記複合体の溶解性は、また、生物学的過程、特に細胞過程を害するカーボンナノチューブの疎水性凝集に起因する毒性を防ぐ。
前記複合体の溶解性及び毒性の欠如は、生体への、特に分子を細胞に運ぶ構成での前記複合体の投与を可能にする
【００２４】
本発明のもう１つの好ましい実施態様によれば、前記複合体は、荷電分子と前記カーボンナノチューブの結合エネルギーが約９０ｋＪ／ｍｏｌ未満であり、特に約１２ｋＪ／ｍｏｌから約８５ｋＪ／ｍｏｌであり、より特には約２０ｋＪ／ｍｏｌから約７０ｋＪ／ｍｏｌであり、そして好ましくは約２０ｋＪ／ｍｏｌから約５０ｋＪ／ｍｏｌであることを特徴とする。
前記結合エネルギーは、２５℃で示されている。
８５ｋＪ／ｍｏｌの結合エネルギーは、約１０−１５ｍｏｌ／ｌの解離定数に相当している。
７０ｋＪ／ｍｏｌの結合エネルギーは、約１０−１２ｍｏｌ／ｌの解離定数に相当している。
５０ｋＪ／ｍｏｌの結合エネルギーは、約１０−９ｍｏｌ／ｌの解離定数に相当している。
特に、前記結合エネルギーは、共有結合に相当する結合エネルギー、概ね４２０ｋＪ／ｍｏｌよりも小さい。
前記荷電分子と前記カーボンナノチューブの前記結合エネルギーは、細胞外生体液、例えば血液又はリンパ液中での前記複合体の結束性を可能にし、そして、細胞液、例えば細胞質中での前記荷電分子の放出を可能にする複合体の解離ができるものが好ましい。本発明の前記複合体の解離を、例えば、ｐＨの変化によって引き起こすことができる。
前記複合体のさらなる好ましい実施態様によれば、前記カーボンナノチューブが正電荷又は負電荷のいずれかを含み、そして前記荷電分子がそれぞれ負電荷少なくとも１つ、又は正電荷少なくとも１つのいずれかを含む。
この実施態様によれば、前記カーボンナノチューブは、正電荷のみ又は負電荷のみのいずれかを含み、反対の電荷をそれぞれ含んでいる荷電分子との結合を容易にする。
【００２５】
特に好ましい実施態様によれば、前記カーボンナノチューブは、同一の電荷を担持している基のみを含んでいる。
前記複合体のもう１つの好ましい実施態様によれば、前記カーボンナノチューブは、前記荷電分子の電荷当たり、約０．００１〜約１００電荷、特に、約１〜約２０電荷を含んでいる。
従って、与えられる荷電分子及びカーボンナノチューブ間の相互作用の強さを、前記カーボンナノチューブの電荷密度を変更することによって調節することは可能である。故に、前記電荷密度を大きくすることによって、前記相互作用は強くなる結果となり、そして前記電荷密度を小さくすることによって、前記相互作用は弱くなる結果となる。
前記カーボンナノチューブと荷電分子との電荷比は、約０．００１〜約１００であり、特には約１〜約２０である。約０．００１より小さい電荷比においては、溶液中で遊離している前記荷電分子からの電荷が過剰量であり、これは前記カーボンナノチューブと相互作用しない荷電分子が過剰になりやすく、従って十分には複合しない。１００より大きい電荷比においては、前記カーボンナノチューブ上の電荷が過剰量あり、従って前記荷電分子は、前記カーボンナノチューブ上で全てしっかりと複合しており、故に強く安定した複合体になりやすく、従って前記カーボンナノチューブ表面からの前記荷電分子の放出を困難にさせる。
【００２６】
前記複合体のもう１つの好ましい実施態様によれば、前記カーボンナノチューブが、前記荷電分子の存在する又は存在しない有機溶媒及び／又は水性溶媒中において、実質的に無傷であり、そして可溶であり、及び前記電荷を担持している基が前記カーボンナノチューブの表面上に均一に分布している。
【００２７】
用語「均一に分布している」は、前記荷電を担持している基が、本質的に前記カーボンナノチューブの表面に全てに分布しており、前記カーボンナノチューブの一部分、例えば前記カーボンナノチューブの先端部分に単純に集中していないことを意味している。更に、電荷を担持している基の数と前記カーボンナノチューブの炭素原子の数の比率があり、特に、前記カーボンナノチューブの約５０〜約１０００の炭素原子当たり１つの電荷を担持している基であり、より好ましくは前記カーボンナノチューブの約１００の炭素原子当たり１つの電荷を担持している基である。
【００２８】
用語「実質的に無傷であり」は、前記表面上の欠陥は極少量であり、そして前記カーボンナノチューブの先端の炭素原子を酸化し、カルボン酸にするために、前記カーボンナノチューブが脆くないことを意味する。
【００２９】
特に、前記カーボンナノチューブは、水性溶媒中、特には生体液、例えば血液、リンパ液又は細胞質中に、それ自体で可溶している。従って、本発明の前記複合体の解離は、２つの水に可溶性の成分、前記荷電分子及び前記カーボンナノチューブを生じる。前記解離が細胞中で起こった場合、前記カーボンナノチューブは溶けたままであり、このことは細胞からカーボンナノチューブが廃棄されるのを助け、そしてカーボンナノチューブの凝集及び凝集に相当する細胞毒性を防ぐ。
【００３０】
前記複合体のもう１つのさらなる実施態様によれば、前記カーボンナノチューブが、単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）又は多層カーボンナノチューブ（ＭＷＮＴ）である。
前記単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）は、例えば、アジャヤン及びイイジマ（Ａｊａｙａｎ，ＰＭ＆Ｉｉｊｉｍａ Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６１：３３３−３３４；Ｒａｏ ＣＮＲ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２：７８−１０５）によって、定義されている。
前記多層カーボンナノチューブ（ＭＷＮＴ）は、例えば、イイジマ（Ｉｉｊｉｍａ Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３５４：５６−５８；Ｒａｏ ＣＮＲ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２：７８−１０５）によって、定義されている。
【００３１】
前記で定義された複合体のさらなる実施態様によれば、前記カーボンナノチューブが、下記の一般式：
［Ｃｎ］−Ｘｍ
（式中、Ｃｎは、実質的に一定の直径である実質的に円筒形であるカーボンナノチューブの表面の炭素であり、前記直径が約０．５〜約５０ｎｍであり、特に、ＳＷＮＴにおいて約０．５〜５ｎｍであり、ＭＷＮＴにおいて約２０〜約５０ｎｍであり、
Ｘは、同一又は異なる、１又は数個の官能基であり、但し、Ｘ基少なくとも１つが、電荷を担持している基少なくとも１つを含み、
ｎは約３・１０３〜約３・１０６の整数であり、
ｍは約０．００１ｎ〜約０．１ｎの整数であり、
カーボンナノチューブ表面ｃｍ２当たり約２・１０−１１ｍｏｌ〜約２・１０−９ｍｏｌの官能基Ｘが存在している）
で表される。
【００３２】
前記カーボンナノチューブは、５より大きい直径に対する長さの比、及び０．２μｍ未満、好ましくは０．０５μｍ未満の直径を有している。
置換カーボンナノチューブにおいて、前記表面の原子Ｃｎは、官能基と反応する。表層中のほとんどの炭素原子は、基底面炭素、例えばベンゼン環で構成されている炭素である。従来技術において、一般的に基底面炭素は、欠損部位にある基底面炭素、又はグラファイト層の先端炭素原子に類似の基底面炭素を除いては、相対的に化学攻撃に対して不活性であると考えられている。
【００３３】
カーボンナノチューブの先端の炭素原子は、欠損部位にさらされた炭素原子及び先端炭素原子を含むことができる。
有利な実施態様によれば、本発明は機能化カーボンナノチューブを含む水溶液又は有機溶液に関し、前記カーボンナノチューブの長さ範囲の分布は機能化前の前記カーボンナノチューブの長さ範囲の分布と本質的に同じである。
前記カーボンナノチューブの長さは、約２０ｎｍ〜約２０μｍの範囲内で有利に選ばれる。
カーボンナノチューブの表面（ｃｍ２）当たりの官能基の分布、（有利なのは２・１０−１１ｍｏｌｅ〜２・１０−９ｍｏｌｅである）をＤＳＣ（示差走査熱量測定法）、ＴＧＡ（熱重量分析）、滴定及び分光光度測定により、決定することができる。
その均質性を高分解能透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により決定することができる。但し、分解能が、前記カーボンナノチューブ表面の電子密度及び電子を担持している前記官能基の電子密度を見るには十分であるものとし、標識原子、例えば１５Ｎ、１３Ｃ又は２Ｈが、官能基中に含まれるものとする。
カーボンナノチューブ表面（ｃｍ２）当たりの官能基の分布範囲のより高い数値及びより低い数値に関与するパラメータは、カーボンナノチューブの曲率、反応時間、反応温度、試薬の化学安定性及び溶媒である。
官能基の量は、特には、カーボンナノチューブ１ｇ当たり約０．４〜約１ｍｍｏｌの範囲であることが好ましい。
本発明の前記カーボンナノチューブは本質的には純粋であり、そして無定形炭素又は熱分解沈殿炭素（ｐｙｒｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ ｃａｒｂｏｎ）、炭素粒子、又はフラーレンを含んでなく、そして、特には、カーボンナノチューブの生成において触媒として一般的に使用される金属、例えばＦｅ、Ｎｉ、Ｃｏを含んでいない。
【００３４】
前記で定義された複合体の好ましい実施態様において、Ｘが、２つの異なる官能基Ｘ１及びＸ２であり、そして前記カーボンナノチューブが下記の式：
［Ｃｎ］−［Ｘ１ｍ１］［Ｘ２ｍ２］
（式中、ｍ１及びｍ２は、相互に独立し、約０．００１ｎ〜約０．１ｎの整数を示し、但し、Ｘ１又はＸ２少なくとも一方が、電荷を担持している基少なくとも１つを含むものとする）
で表されている。
【００３５】
前記定義された複合体のもう１つの好ましい実施態様において、Ｘが、同一又は異なる、１又は数個の置換されたピロリジン環であり、但し、前記置換されたピロリジン環少なくとも１つが電荷を担持している基少なくとも１つによって置換されている、下記の一般式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、Ｒ及びＲ’は、相互に独立し、−Ｈ、又は式−Ｍ−Ｙ−（Ｚ）ａ−（Ｐ）ｂで表される基であり、ａは０又は１であり、そしてｂは０〜８の整数であり、好ましくは０、１又は２であり、Ｐは、ｂが１より大きい場合に同一又は異なる基であり、但し、Ｒ及びＲ’は同時に水素原子とすることはできないものであり、そして、
Ｍは、約１〜約１００原子のスペーサー基、例えば−（ＣＨ２）γ−又は−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）γ−ＣＨ２−ＣＨ２−を含む群から選択される基、γは１〜２０の整数であり、あてはまる場合には電荷を担持している基を含み、
Ｙは、ａ＝ｂ＝０の場合の反応基、例えば−ＯＨ、−ＮＨ３＋、−ＣＯＯ−、−ＳＨ、−ＣＨＯ、ケトン例えば−ＣＯＣＨ３、アジ化物、又はハロゲン化物を含む群から選択される基であり、あてはまる場合には電荷を担持している基を含み、
又は、ａ又はｂが０と異なる場合に、反応基から誘導され、例えば−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＣＯＯ−、−Ｓ−、−ＣＨ＝、−ＣＨ２−、−ＣＣｋＨ２ｋ＋１＝、ｋは１〜１０の整数であり、特には−ＣＣＨ３、又は−ＣＨＣｋＨ２ｋ＋１−であり、ｋは１〜１０の整数であり、特には−ＣＨＣＨ３−を含む群から選択される基であり、
Ｚは、リンカー基、例えばａ＝１、及びｂ＝０の場合に以下の式の１つの基であり、あてはまる場合には電荷を担持している基を含んでおり、Ｐ基少なくとも１つと結合する傾向があり、そして、必要な場合には前記Ｐ基を放出する傾向があり、
【化２】
ｑは、１〜１０の整数であり、又は、
ａ＝１、及びｂ＝１又は２の場合に、以下の式の１つで表され、
【化３】
ｑは、１〜１０の整数であり、
Ｐは、有効基であり、あてはまる場合には電荷を担持している基を含み、前記機能化カーボンナノチューブの分光検出を可能にし、フルオロフォア、例えばＦＩＴＣ、キレート剤、例えばＤＴＰＡ、又は生物学的作用を誘発する傾向がある活性分子、例えばアミノ酸、ペプチド、擬似ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、例えば酵素又は抗体、核酸、炭水化物又は薬であり、
あてはまる場合にはＹ、Ｚ、又はＰ基少なくとも１つを、キャッピング基、例えばＣＨ３ＣＯ−（アセチル）、メチル、エチル、ベンジルカルボニル、又は保護基、例えばメチル、エチル、ベンジル、ｔｅｒｔ−ブチル、トリチル、３−ニトロ−２−ピリジルサルフェニル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、トリメチルシリルエチルオキシカルボニル、フタルイミド、ジメチルアセタール、又は１，３−ジオキソランによって置換することができる）
の複合体である。
【００３６】
置換ピロリジンを含むカーボンナノチューブを、ジョーガキラスら（Ｇｅｏｒｇａｋｉｌａｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：７６０−７６１）の記載したアゾメチンイリドの１、３−双極子環状付加に基づく一般方法を使用することにより調製することができる。
前記ピロリジン環は、安定で、そして強固な環状分子であり、反応基が存在又は挿入することができる末端においてスペーサー基をもつことができる窒素原子が存在しているという利点を持っている。
【００３７】
用語「Ｙは反応基である」は、Ｙはヘテロ原子を表しており、新しい共有結合を形成するための化学反応を行う準備があることを意味する。
用語「Ｍはスペーサー基」は、Ｍが前記カーボンナノチューブ上の前記ピロリジンを前記反応作用基Ｙから引き離す直鎖状有機鎖であることを意味する。
用語「Ｙは反応基から誘導される」は、Ｙが新しい共有結合を引き起こす化学反応によって修飾させられるヘテロ原子又は官能基であることを意味する。
−Ｏ−は前記反応基−ＯＨからの誘導体であり、−ＮＨは前記反応基−ＮＨ２からの誘導体であり、−ＣＯＯ−は前記反応基−ＣＯＯＨからの誘導体であり、−Ｓ−は前記反応基−ＳＨからの誘導体であり、−Ｃ＝及び−ＣＨ２−は前記反応基−ＣＨＯからの誘導体であり、−ＣＣｋＨ２ｋ＋１及び−ＣＨＣｋＨ２ｋ＋１は、前記反応基のケトンからの誘導体であり、そして特には−ＣＣＨ３＝及び−ＣＨＣＨ３−は反応基−ＣＯＣＨ３−からの誘導体であることは、前記の説明から明らかである。
アジ化物に関しては、アジ化物は保護基である。
ハロゲン化物に関しては、相当する誘導基を−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯＯ−又はアジ化物とすることができる。
用語「Ｚはリンカー基である」は、ＺがＹに共有結合している化学物質であり、Ｐのカップリングを可能にし、そしてＰのカップリングの条件において化学反応を妨害し、Ｐを放出することが可能であるが、Ｙから放出されることは可能ではないことを意味する。
好ましい実施態様によれば、Ｚは以下の式のリンカー基を意味する。
【化４】
ｑは、１〜１０の整数である。
リンカー基Ｚは、Ｚが遊離しているか、又は−Ｙ−に結合しているか及び／又は−Ｐに結合しているか、又は−Ｐから開裂しているか、そしてＺが保護されているかどうかに依存する変化する形状で存在している。本発明の好ましいリンカー基の主要形状は以下の通りである。
遊離非保護型
【化５】
遊離保護型
【化６】
非保護Ｙ結合型
【化７】
保護Ｙ結合型
【化８】
非保護Ｙ及びＰ結合型
【化９】
保護Ｙ及びＰ結合型
【化１０】
非保護Ｙ及びＰ由来開裂結合型
【化１１】
非保護Ｙ及びＰ由来開裂結合型
【化１２】
非保護Ｐ結合型
【化１３】
保護Ｐ結合型
【化１４】
遊離非保護型
【化１５】
遊離保護型
【化１６】
非保護Ｙ結合型
【化１７】
保護Ｙ結合型
【化１８】
Ｙ及びＰ結合型
【化１９】
Ｐ結合型
【化２０】
マレイミドの遊離型
【化２１】
Ｙ結合マレイミド型
【化２２】
Ｙ及びＰ結合マレイミド型
【化２３】
Ｐ結合マレイミド型
【化２４】
【００３８】
ｑは１〜１０の整数であり、Ｑは保護基であり、そして−Ｙ−はスペーサーＭを介して本発明の機能化されたカーボンナノチューブに共有結合している。
【００３９】
用語「Ｐは有効基である」は、Ｐが、Ｐを担持している前記カーボンナノチューブに新しい物理的、化学的又は生物学的特性を与えることができる基であることを意味する。
【００４０】
本発明の用語「Ｐは前記カーボンナノチューブの分光検出を可能にすることができる」は、Ｐが基、例えば、蛍光顕微鏡検査法、又は核磁気共鳴又はＦＴＩＲ（フーリエ変換赤外）分光等の分光技術によって同定されることを可能にする発色団であることを意味する。
【００４１】
用語「生物学的作用を誘発する傾向がある活性分子」は、前記分子が、前記生体系の要素と特異的な相互作用を行うことにより、与えられる生体系の工程を修飾することができることを意味する。
「ＦＩＴＣ」は、フルオロセイン・イソチオシアネートを示す。
【００４２】
「ＤＴＰＡ」は、ジエチレントリアミン五酢酸二無水物を示す。
【００４３】
用語「擬似ペプチド」は、天然由来又は非天然由来のアミノ酸の鎖を示しており、前記鎖が少なくとも１つの結合、アミド結合とは異なる結合の化学的性質を含んでいる。
【００４４】
用語「キャッピング基」は、反応性官能基Ｙを阻止することができ、そして化学反応によって取り除くことができない基を意味する。
【００４５】
用語「保護基」は、反応性官能基を一時的に阻止することができ、そしてさらなる改善の目的で、反応作用基Ｙを遊離するために化学反応によって続いて取り除くことができる基を意味する。
【００４６】
Ｐが存在している場合、Ｚの性質は２種類のカーボンナノチューブ、Ｐを放出することができるか、又はＰを放出することができないものを生じさせる。
【００４７】
もしＰが存在している場合、用語「Ｐの放出」は、−Ｍ−Ｙ−Ｚ−Ｐ基において、開裂はＺ基の右端で起こる可能性があることを意味する。
【００４８】
前記開裂は前記Ｚ基のこの端で起こる場合に、その後Ｐが放出される。
Ｚが以下の２つの分子の１つを表す場合、そしてＰが存在している場合には、Ｐを放出することができる。なぜならば、左の分子については、開裂はＳ原子に隣接する結合で起こることができ、又右の分子については、Ｐは右端−ＣＯＯ−から放出されることができるからである。
【化２５】
【００４９】
Ｚが以下の分子を表している場合、そしてＰが存在している場合、特に生理学的条件、例えば血清中の条件下、又は生理学的条件を再現する条件下、例えばｐＨ７．４で０．１５ＭＮａＣｌ、又はｐＨ７．４でＰＢＳにおいて、Ｐを放出することができない。
【化２６】
【００５０】
本発明のもう１つの実施態様によれば、本発明の機能化されたナノチューブは、ＭとＹとの間、そしてＹとＺとの間において一般に開裂はない。
【００５１】
前記定義された複合体のさらなる実施態様において、Ｘは、２つの異なる置換されたピロリジン環であり、但し、以下の一般式（Ｉ’）：
【化２７】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、Ｒ１及びＲ２は、異なっており、そして相互に独立し、−Ｈ、又は式−Ｍ−Ｙ−（Ｚ）ａ−（Ｐ）ｂの基であり、Ｍ、Ｙ、Ｚ、Ｐ、ａ及びｂは、前記定義されたものと同じ意味であり、Ｒ１及びＲ２少なくとも１つが電荷を担持している基を含んでいる）
の前記ピロリジン環少なくとも１つを、電荷を担持している基少なくとも１つによって置換されるものである。
前記定義された複合体の好ましい実施態様において、前記複合体は、以下の一般式（ＩＩ）：
【化２８】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、Ａは荷電分子であり、そしてＲは、式−Ｍ−Ｗ基であり、そして、
Ｍは、約１〜約１００原子のスペーサー基、例えば−（ＣＨ２）γ−、又は−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）γ−ＣＨ２−ＣＨ２−を含む群から選択される基であり、γは１〜０の整数であり、
Ｗは、約１〜約４００原子の電荷を担持している基、例えば−ＮＨ３＋、又は−ＣＯＯ−である）
で表されることを特徴とする。
【００５２】
前記複合体の特に好ましい実施態様において、前記複合体は、以下の一般式（ＩＩ’）：
【化２９】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、Ａは、荷電分子であり、そして
Ｒ１は、−Ｍ−Ｙ−（Ｚ）ａ−（Ｐ）ｂ基であり、Ｍ、Ｙ、Ｚ、Ｐ、ａ及びｂは、前記定義されたものと同じ意味であり、特にＲ１は、フルオロフォアを担持している基であり、そして
Ｒ２は、式−Ｍ−Ｗ基であり、Ｗは約１〜約４００原子の電荷を担持している基、例えば、−ＮＨ３＋、又は−ＣＯＯ−である）
で表されることを特徴とする。
【００５３】
いくつもの方法が、２つの異なるピロリジン環をもつカーボンナノチューブの機能化（ビス機能化カーボンナノチューブ）のために利用可能である。詳細は、実施例１Ａ、１Ｂ、１Ｃにおいて報告されている。
【００５４】
本発明のもう１つの特に好ましい実施態様において、前記荷電分子が、
２〜１０６のヌクレオチドを含む核酸、例えばＲＮＡ又はＤＮＡ、特にはプラスミド又は人工染色体、
２〜５０００、好ましくは５０〜５０００のアミノ酸を含むペプチド、ポリペプチド又はタンパク質、
炭水化物、特には正電荷の炭水化物、例えばグルコサミン又はキトサン、
放射性核種、及び
細胞毒の分子を含む群から選択されている。
【００５５】
本発明の複合体は、一本鎖核酸又は二本鎖核酸をより特に含む。一本鎖核酸を担持している複合体は、アンチセンスＤＮＡを細胞に運ぶために特に適している。二本鎖ＤＮＡを担持している複合体は、細胞を形質転換又はトランスフェクトするために特に適している。そして、二本鎖ＲＮＡを担持している複合体は、干渉ＲＮＡを細胞に運ぶために特に有用である。
【００５６】
本発明の放射性核種を含む複合体は、イメージング又は治療目的のために特に有用である。
本発明の細胞傷害性分子を含む複合体は、悪性細胞を破壊する治療目的、特にガン治療の枠組みにおいて特に有用である。
【００５７】
前記定義された複合体の、更にもう１つの特に好ましい実施態様において、前記複合体は、以下の式：
【化３０】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、そしてＡは、荷電分子であり、負電荷少なくとも１つを含む、例えばＤＮＡである）
で表されることを特徴とする。
【００５８】
このような複合体は、ＤＮＡによる細胞の形質転換又はトランスフェクションに特に適している。
【００５９】
前記定義された複合体のもう１つの特に好ましい実施態様において、前記複合体は、以下の式：
【化３１】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、そしてＡは、荷電分子であり、負電荷少なくとも１つを含む、例えばＤＮＡである）
で表されることを特徴とする。
【００６０】
このような複合体は、更に、ＤＮＡによる細胞の形質転換又はトランスフェクションに特に適している。
【００６１】
本発明のさらなるもう１つの特に好ましい実施態様において、前記複合体は、以下の式：
【化３２】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、そしてＡは、正電荷少なくとも１つを含む荷電分子である）
で表されることを特徴とする。
【００６２】
例えば、前記カーボンナノチューブを、正荷電分子、例えば正荷電タンパク質を担持するために特に使用することができる。
【００６３】
本発明のさらなるもう１つの特に好ましい実施態様において、前記複合体は、以下の式：
【化３３】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、そしてＡは、正電荷少なくとも１つを含む荷電分子である）
で表されることを特徴とする。
【００６４】
例えば、前記ＤＴＰＡ置換カーボンナノチューブを、正電荷分子、例えば正電荷タンパク質を担持するために特に使用することができる。
本発明は、又、前記荷電分子を細胞内に運ぶための複合体の使用に関する。
従って、前記複合体を個体に投与することができ、そして前記複合体は、個々人の輸送流体、例えば血液又はリンパ液中で運ばれる間は会合された形態のままであり、そして、複合体が細胞膜を通過する間、その後、細胞に浸透するとすぐに、複合体は解離し、前記荷電分子を遊離させることができる。
【００６５】
本発明の前記複合体は、エネルギー非依存性メカニズムによって細胞に浸透することができる。特には、前記浸透は、エンドサイトーシス及びファゴサイトーシス非依存性であることができる。
【００６６】
本発明は、更に、薬剤学的に許容可能な担体と共に、前記複合体を活性物質として含む、医薬組成物に関する。
【００６７】
前記医薬組成物は、遺伝薬剤又は免疫療法医薬品及びワクチン接種医薬品の製造に有用である。より具体的には、前記医薬組成物は、治療上のタンパク質の細胞への輸送、又は遺伝子治療又はＤＮＡワクチンの枠において有用であり、治療の又は予防の核酸断片を運ぶために、有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、アンモニウム機能化単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋ １）、アンモニウム機能化多層カーボンナノチューブ（ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋ ２）、そしてリジン機能化単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋ ３）を示す。
【００６９】
【図２】図２Ａ〜図２Ｄは、アミノｆ−ＭＷＮＴ（ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋ ２）（濃度 ２．５ｍｇ／ｍＬ）で処理したヒーラ（ＨｅＬａ）細胞の超薄横断切片を示す。培養後、細胞は固定され、染色され、脱水され、エポン８１２レジン（Ｅｐｏｎ ８１２ ｒｅｓｉｎ）［商品名］に包埋された。超薄層（厚さ９０ｎｍ）は、超ミクロトームで切断された。図２Ａ（Ａ）は細胞全体であり、図２Ｂ（Ｂ）及び図２Ｃ（Ｃ）は２つ続けて拡大したものである。図２Ｄ（Ｄ）は、細胞膜を横切っている多層カーボンナノチューブを示す。白い点の矢印は染色質を示し、白いダッシュの矢印はミトコンドリアを示し、白い細い矢印はゴルジ複合体を示し、中間の矢印は核膜を示し、白い太い矢印は液胞（ｖａｃｕｏｌｕｍ）を示す。
【００７０】
【図３】図３Ａ〜図３Ｆは、ＨｅＬａ細胞のフローサイトメトリー分析結果であり、カーボンナノチューブの不存在下（図３Ａ）そして各々０．０１ｍｇ／ｍＬ（図３Ｂ）、０．１ｍｇ／ｍＬ（図３Ｃ）、１．０ｍｇ／ｍＬ（図３Ｄ）、１０ｍｇ／ｍＬ（図３Ｅ）の濃度におけるＳＷＮＴ−ＮＨ３＋１で培養された場合を示す。６時間培養及び洗浄後、細胞を分析した。それぞれの独立した実験において、細胞をプロピジンアイオダイド（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）（Ｙ軸の相対強度）及びアネキシン（ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ−ＡＰＣ（Ｘ軸の相対強度）で染色した。機能化カーボンナノチューブの内在化をＦＡＣＳ法によりモニターし、前記ＳＷＮＴに共有結合したフルオレセインプローブの前記細胞相対含有量を分析した（図３Ｆ）。連続の黒い線は、３．０ｍｇ／ｍＬＳＷＮＴ−ＦＩＴＣで処理後分析された細胞集団（１２濃度）であり、灰色の領域は処理前の細胞集団である。細胞の９５％より多くは、前記蛍光標識を内在化している。
【００７１】
【図４】図４は、ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋１によるプラスミドＤＮＡの送達及び発現を示す。ＣＨＯ細胞中の総タンパク質（ｍｇ）当たりの相対発光量マーカー遺伝子（β−Ｇａｌ）発現のレベル。異なる電荷比（ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ）で、３つの異なる培養時点で試験を行った。細胞分離及び細胞死を示す毒性は、この試験全体を通じて観察されなかった。ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋１及びプラスミドＤＮＡをそれぞれＣｎｔ及びＤとして図に示す。
【００７２】
【図５】図５Ａ〜図５Ｃは、第８〜１０週齢のオスＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓（図５Ａ）、肺（図５Ｂ）及び脾臓（図５Ｃ）中のルシフェラーゼの発現を示す。一群当たり３匹の動物に、５０μｇプラスミドＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ−Ｌｕｃ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のみ、又はラピッドハイドロダイナミック注入法（ｒａｐｉｄ ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ：Ｌｅｃｏｃｑ ｅｔ ａｌ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５（２）：１４２−１５６、２００３）による、０．９％（ｗ／ｗ）ＮａＣｌ水性緩衝液中の６００μｇＳＷＮＴ−ＮＨ３＋１のプレ複合体を投与した。組織は投与後１６時間経過後集められ、そしてルシフェラーゼ発現はトロピックスラックスクリーン（Ｔｒｏｐｉｘ ＬｕｃＳｃｒｅｅｎ）アッセイキット及びバートルド９５０７照度計（Ｂｅｒｔｈｈｏｌｄ ９５０７ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を使用することにより分析を行った。
【００７３】
【図６】図６ＡはプラスミドｐＥＧＦＰＬｕｃの制限地図を模式的に示しており、図６ＢはプラスミドｐＣＭＶβの制限地図を模式的に示す。
【００７４】
【図７】図７はプラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）の制限地図を模式的に示す。
【００７５】
【図８】図８Ａ〜図８Ｆは、ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ（図８Ａ〜図８Ｃ）及びＳＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ（図８Ｄ〜図８Ｆ）について６：１の電荷比で形成されたカーボンナノチューブ：ＤＮＡ複合体のＳＥＭ画像を示す。
【００７６】
【図９】図９は、ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋２で機能化されたセンサーチップのＳＥＭ画像を示す。
【００７７】
【図１０】図１０は、プラスミドＤＮＡとｆ−ＣＮＴとの相互作用のセンサグラムを示す。上図：プラスミドの濃度を増加することによるＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋３へのプラスミド結合のセンサグラムであり、それぞれの曲線は、一番低い曲線から一番高い曲線の順に、６．３μｇ／ｍＬ、１２．６μｇ／ｍＬ、２５．２μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬである。下図：プラスミドの濃度を増加することによるＭＷＮＴ−ＮＨ３＋２へのプラスミドＤＮＡの結合のセンサグラムであり、それぞれの曲線は、一番低い曲線から一番高い曲線の順に、２５．２μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬである。
【００７８】
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｃは、機能化されたカーボンナノチューブの複合後のＤＮＡ凝縮を示す。ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ（図１１Ａ）、ＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ（図１１Ｂ）及びＭＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ（図１１Ｃ）について２．５μｇ／ｍＬ ｆｒｅｅ ＤＮＡのピコグリーン蛍光（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）パーセントとして示した、さまざまな電荷比でのｆ−ＣＮＴへ複合された２．５μｇ／ｍＬ ＤＮＡの凝縮。
【００７９】
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｃは、ｆ−ＣＮＴ−ＤＮＡ複合体の電気泳動の運動性を示す。全てのパネルにおいて、レーン１は０．２μｇ遊離ＤＮＡを示す。他の全てのレーンは、ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ（図１２Ａ）、ＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ（図１２Ｂ）及びＭＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ（図１２Ｃ）における様々な＋／−電荷比（レーン２は１：１、レーン３は６：１、レーン４は１０：１）で、０．２μｇＤＮＡに複合されているｆ−ＣＮＴを含んでいる。ＯＣは開環を示し、ＳＣはスーパーコイルを示す。
【００８０】
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｂは、様々な電荷比、ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ（図１３Ａ）、ＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ（図１３Ｂ）及びＭＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ（図１３Ｃ）でのｆ−ＣＮＴ：ｐＤＮＡをもつ遺伝子送達を伴うヒト肺癌細胞（Ａ５４９）におけるβ−ｇａｌマーカー遺伝子の発現を示す（イムノメトリーアッセイの使用によるＣＮＴ不存在下における前記ＤＮＡ対照を示している遺伝子発現レベル）。
【実施例】
【００８１】
《実施例１》
カーボンナノチューブは、アゾメチンイリドの１、３−双極子環状付加に基づく方法を用いて共有結合的に修飾されている（Ｇｅｏｒｇａｋｉｌａｓ ｅｔ ａｌ．（２２０２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：７６０−７６１）。単層カーボンナノチューブ及び多層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ及びＭＷＮＴ）の両方は、遊離アミノ末端トリエチレングリコール部分の窒素をもつピロリジン環で機能化された（図１）。カーボンナノチューブの周りの官能基（ｆ）の量を、前記ｆ−ＳＷＮＴ及び前記ｆ−ＭＷＮＴにおいて、それぞれ約０．５５及び０．９０ｍｍｏｌ／ｇで計算した。リジンで機能化されたＳＷＮＴを、パンタロットら（Ｐａｎｔａｒｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００３、１０，９６１−９６６）の記載より、ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋から調製した。チューブの周りのアミノ基の量は、約０．９２ｍｍｏｌ／ｇで計算した。前記の正電荷分布は、水溶液中に高度に可溶化する物質であることを示している。
ｆ−ＳＷＮＴ：ＤＮＡ複合体の形成において、アミノ機能化された単層カーボンナノチューブは、６ｍｇ／ｍＬ濃度で脱イオン水において水和された。プラスミドＤＮＡ、ｐＥＧＦＰ−Ｌｕｃ（図６Ａ）、又はｐＣＭＶβ（図６Ｂ）、（いずれもＣｌｏｎｔｅｃｈ）は、１ｍｇ／ｍＬ濃度で脱イオン水において水和された。アリコートは、必要になるまで−２０℃で冷凍貯蔵された。インビトロの研究のため、適当な容量のナノチューブを、３００μＬの総容量のオプティメム（ｏｐｔｉｍｅｍ）で希釈した。ｐＣＭＶβ３μｇは、３００μＬのオプティメムを含む別のチューブに加えた。次に、希釈されたナノチューブを、ＤＮＡに滴下し、そして混合物を簡単にピペットで採取した。複合体は、使用前の１０分間で形成されることができる。この工程は、試験されるそれぞれの電荷比において繰り返された。インビボの研究のために、ナノチューブ６００μｇを、０．９％ＮａＣｌ ７５０μＬ中に希釈した。０．９％ＮａＣｌ ７５０μＬ中に希釈されたｐＥＧＦＰ−Ｌｕｃ５０μｇを、ナノチューブに滴下し、そして混合物を簡単にピペットで採取した。この工程を三回繰り返し、すべての場合においてナノチューブとＤＮＡ比が２：１のものを作り出した。
【００８２】
《実施例１Ａ》
ビス機能化カーボンナノチューブの調製
第一手順を、以下の記載された反応工程で進行することができる。
【化３４】
簡単には、カーボンナノチューブ（１００ｍｇ）及びパラホルムアルデヒド（１５０ｍｇを２４時間毎３回）をＤＭＦ１００ｍＬ中に懸濁する。 Ｂｏｃ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣＨ２ＣＯＯＨ約１５０ｍｇ及びＺ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣＨ２ＣＯＯＨ１６７ｍｇ（モル比１：１）を添加し、前記反応物を１２５℃で７２時間加熱した。加熱を停止し、そして有機相を、遠心分離及びＰＴＦＥフィルター（０．２２μｍ）でのろ過により、未反応物質から分離した。ろ液を蒸発し、そして褐色の残留物をＤＣＭ中に溶解し、水で一度洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥する。前記溶媒を蒸発し、生成物をメタノール／ジエチルエーテルから数回再沈殿する。前記機能化カーボンナノチューブをＴＥＭ及び１Ｈ−ＮＭＲにより明らかにする。
【００８３】
《実施例１Ｂ》
ビス機能化カーボンナノチューブの調製
第二手順を、以下に記載された反応スキームで進行することができる。
【化３５】
簡単には、カーボンナノチューブ（１００ｍｇ）及びパラホルムアルデヒド（１５０ｍｇを２４時間毎３回）をＤＭＦ１００ｍＬ中に懸濁する。Ｂｏｃ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣＨ２ＣＯＯＨ、約１５０ｍｇ及びＰｈｔ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣＨ２ＣＯＯＨ、１６５ｍｇ（モル比１：１）を添加し、前記反応物は１２５℃で７２時間加熱される。加熱を止められ、そして有機相を、遠心分離及びＰＴＦＥフィルター（０．２２μｍ）でのろ過により、未反応物質から分離した。ろ液を蒸発し、そして褐色の残留物をＤＣＭ中に溶解し、水で一度洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥する。前記溶媒を蒸発し、前記生成物をメタノール／ジエチルエーテルから数回再沈殿する。前記機能化カーボンナノチューブをＴＥＭ及び１Ｈ−ＮＭＲにより明らかにする。
第一手順及び第二手順でのＢｏｃ保護基の開裂を、以下に記載された方法により行うことができる。ジオキサン中の４ＭのＨＣｌ溶液をビス機能化カーボンナノチューブ（５ｍｇ）に添加し、そして混合物を常温で５時間撹拌する。溶媒を減圧下で除去し、生成物をメタノール／ジエチルエーテルから数回再沈殿する。機能化カーボンナノチューブをＴＥＭ及び１Ｈ−ＮＭＲにより明らかにする。定量カイザーテスト：０．３５ｍｍｏｌ／ｇの遊離ＮＨ２。
【００８４】
第一手順（実施例１Ａ）において、Ｚ及びＢｏｃ保護基の同時開裂を以下のプロトコルにより行うことができる。ＴＦＡ／ＴＭＳＯＴｆ／ｐ−クレゾール（３２５：８７：４２．５ μＬ／μＬ／ｍｇ）溶液（４００μＬ）をビス機能化カーボンナノチューブ（５ｍｇ）に添加し、そして混合物を常温で１２時間撹拌する。生成物をジエチルエーテル中で直接に沈殿し、そしてメタノール／ジエチルエーテルからの再沈殿により数回洗浄する。機能化カーボンナノチューブの特性をＴＥＭ及び１Ｈ−ＮＭＲにより明らかにする（ＴＭＳＯＴｆ、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルフォン酸塩）。定量カイザーテスト：０．７０ｍｍｏｌ／ｇの遊離ＮＨ２。
【００８５】
前記Ｚ／Ｂｏｃの計画は、完全に直交していない。実際には、前記カーボンナノチューブ側壁上の前記アミノ基の部分を保護する前記Ｂｏｃ基に影響を及ぼさないで前記Ｚ基を取り除くことは可能ではない。
【００８６】
第二手順（実施例１Ｂ）においては、フタルイミド保護基の開裂を以下のように行う。エタノール（１０ｍＬ）中のヒドラジン（３６．５μＬ、７５２μｍｏｌ）をビス機能化カーボンナノチューブ（９．４ｍｇ）に添加し、そして混合物をアルゴン下、常温で１６時間撹拌する。前記溶媒を除去し、メタノールを添加し、フタルヒドラジドを除去するために溶液を遠心分離する。前記生成物をメタノール／ジエチルエーテルから数回再沈殿する。機能化カーボンナノチューブの特性をＴＥＭ及び１Ｈ−ＮＭＲにより、明らかにする。定量カイザーテスト：０．６ｍｍｏｌ／ｇのＮＨ２。
【００８７】
選択的に再び保護されれば、前記のそれぞれのピロリジン環に相当する反応基を当業者に公知の方法に従って置換することができる。
【００８８】
《実施例１Ｃ》
ビス機能化カーボンナノチューブの調製
第三手順において、ビス機能化カーボンナノチューブをフルオレセインイソチオシアネートと反応することができる。この方法は、以下の反応工程に示されている。
【化３６】
【００８９】
簡単には、アミノ機能化カーボンナノチューブ（定量カイザーテストで測定される遊離ＮＨ２の量に相当する７ｍｇ、４．２μｍｏｌ）を、ＤＭＦ２００μＬに可溶化する。ＤＭＦ２００μＬ中のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（４．９ｍｇ、１２．６μｍｏｌ）溶液を添加し、そして前記溶液を常温で一晩撹拌する。溶媒を除去し、そして生成物をメタノール／ジエチルエーテルから数回沈殿する。カイザーテストは陰性である。前記機能化カーボンナノチューブをＴＥＭ及びＵＶ−Ｖｉｓにより明らかにする。
【００９０】
第三手順のために、前記Ｂｏｃ保護基の開裂を以下のように行うことができる。ジオキサン中の４ＭのＨＣｌ溶液をビス機能化カーボンナノチューブ（５ｍｇ）に添加し、そして混合物を室温で５時間撹拌する。前記溶媒を減圧下で除去し、生成物をメタノール／ジエチルエーテルから数回再沈殿する。前記機能化カーボンナノチューブをＴＥＭにより明らかにする。定量カイザーテスト：０．３５ｍｍｏｌ／ｇのＮＨ２。
【００９１】
《実施例２》
細胞内に透過する機能化カーボンナノチューブの能力を調べた。
以前に、発明者らは、蛍光プローブ（ＦＩＴＣ）で標識したカーボンナノチューブで、細胞と相互作用し、そして細胞内へ摂取されるカーボンナノチューブを視覚化することができた。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用する別の実験的なアプローチを、カーボンナノチューブの局在化が起こっている特定の細胞内区画を同定するために、今回行なった。
【００９２】
ＨｅＬａ細胞を３７℃でＤＭＥＭ培地を用い培養し、８０％密集度を超えて増殖した後、２．５ｍｇ／ｍＬ濃度のアミノ遊離ｆ−ＳＷＮＴ及びｆ−ＭＷＮＴ（図１）を細胞に添加した。ナノチューブを１時間細胞と相互作用させ、そして前記細胞を、その後洗浄し、固定し、染色し、脱水し、エポン８１２レジン（Ｅｐｏｎ ８１２ ｒｅｓｉｎ）［商品名］に包埋した。前記ポリマーは、その後ダイアモンド超ミクロトームを使用し約９０ｎｍの超薄層に切断し、そしていくつかの薄片をＴＥＭで分析した。
【００９３】
より正確には、ＳＷＮＴ及びＭＷＮＴ［カーボンナノテクノロジー社（Ｃａｒｂｏｎ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．）及びナノストラクチャー・アンド・アモルファスマテリアルズ社（Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ＆Ａｍｏｒｐｈｏｕｓ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｉｎｃ．）からそれぞれ得られた］は、ジョーガキラスら（Ｇｅｏｒｇａｋｉｌａｓ ｅｔ ａｌ．（２２０２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：７６０−７６１）の記載により機能化した。ＨｅＬａ細胞（１．２５×１０５）を、７５％密集度まで３７℃及び５％ＣＯ２でＤＭＥＭ培地を使用し１６ウエルプレートに培養した。細胞を、その後ｆ−ＳＷＮＴ−ＮＨ２及びｆ−ＭＷＮＴ−ＮＨ２溶液（ＰＢＳ中の２．５ｍｇ／ｍＬ）で２時間培養し、ＰＢＳで２回洗浄し、カコジレイト緩衝液（０．０７５Ｍカコジレイトナトリウム、１ｍＭＣａＣｌ２、１ｍＭＣａＣｌ２、４．５％スクロース、ｐＨ７．３）中のグルタルアルデヒドで、常温で２時間固定した。カコジレイト緩衝液中のピクリン酸の１／１０飽和溶液の１０容量／容量％の量を、その後それぞれのウエルに添加し、そして４℃で一晩中培養した。蒸留水を使用し検体を１５分間３回洗浄し、その後常温で２時間カコジレイト緩衝液の１％ＯｓＯ４溶液で処理した。細胞を蒸留水で注意深くすすぎ、そして４℃で一晩、水溶液中の２％酢酸ウラニル溶液で後固定した。数回洗浄後、前記細胞を１０分間、７０％及び９０％エタノールでそれぞれ乾燥し、そして２０分間無水エタノールで２回乾燥した。未使用のエポン８１２レジン［商品名］の量をＥＭＳ（電子顕微鏡科学）技術データシートによって提案されているように調製し、そしてそれぞれのウエルに分配した。前記プレートを３日間６５℃でオーブンに貯蔵した。それぞれのレジンブロックを、その後プラスチック支持体から除去し、そして切断した。ダイアモンドナイフ超薄切片法をもつレイクハートジャング・ウルトラカットＥ・ウルトラマイクロトーム４５°（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ Ｕｌｔｒａｃｕｔ−Ｅ ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｔｏｍｅ［商品名］４５°）を前記レジンに包埋された前記細胞を切断するために使用した。９０ｎｍの厚さ値を選択した。３つの連続薄片をフォームバーグリッド（ｆｏｒｍｖａｒ ｇｒｉｄ）に置き、７５ｋＶでエレクトロニックトランスミッション顕微鏡（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｈｉｔａｃｈｉ６００）で観察した。画像を異なるレベルの倍率でＡＭＴ高感度カメラにより撮影した。
【００９４】
図２Ａ〜図２Ｄは、前記ｆ−ＭＷＮＴと培養したＨｅＬａ細胞を示している。異なる細胞区画を図２Ａ中の白い矢印により示している。様々なナノチューブが細胞内において明らかに見え、それに続く倍率（図２Ｂ及び図２Ｃ）は、前記ｆ−ＭＷＮＴの細胞内局在化の高解像度の視野を可能にする。ＨｅＬａ細胞との相互作用の同じパターンが、ＳＷＮＴにおいて見られた。大変興味深いことに、前記ナノチューブのいくつかの核内での局在が、確かにサンプルのすべてに常に観察された。しかしながら、カーボンナノチューブの細胞内移動、カーボンナノチューブの核転座の効率及びメカニズムを議論するためには、より詳細な研究が必要とされる。前記の細胞切片の注意深い観察も、前記細胞膜バリアの横断工程の間における、ナノチューブ観察を可能にする。図２Ｄは細胞膜との相互作用、そして取り込まれているｆ−ＭＷＮＴを示している。見られるナノチューブは直径約２０ｎｍ及び長さ２００ｎｍを有している。細胞の取り込みの形式は、まだ明らかではないが、チューブの半剛体及び細長い形状はエンドサイトーシスの過程を除外している。このことは、エンドサイトーシスメカニズムを含むエネルギー依存性の細胞過程の典型的な阻害物質であるアジ化ナトリウム又は２，４−ジニトロフェノールによる、細胞の前培養によっても確認された。カーボンナノチューブは、受動的メカニズムを介して前記細胞に入る可能性がある。それらはナノニードレス（ｎａｎｏｎｅｅｄｌｅｓ）のように振る舞うように思われ、細胞死を起こさないで細胞膜に穴を開ける。実際、これは他のカチオン巨大分子、例えばペプチド及びデンドリマーと対比すると、一般的に細胞溶解の原因となる細胞膜の不安定化の原因となる（Ｒｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．５：１０４−１４；Ｂｏａｓ ａｎｄ Ｈｅｅｇａａｒｄ（２００４）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．Ｓｏｃ．３３：４３−６３）。
【００９５】
そして、異なる濃度での前記カーボンナノチューブの細胞毒性は、フローサイトメトリーにより評価された。この実験では、フルオレセインイソチオシアネートで誘導したアミノｆ−ＳＷＮＴ又はｆ−ＳＷＮＴを、細胞と培養した。
【００９６】
簡単には、ＦＡＣＳによって細胞の生存を分析するために、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清を添加したＤＭＥＭの、指数増殖中のＨｅＬａ細胞を、異なる濃度（０．０１−１０ｍｇ／ｍＬ）のｆ−ＳＷＮＴ−ＮＨ２及びｆ−ＭＷＮＴ−ＮＨ２溶液と６時間培養した。すすぎ、そして３７℃で５分間トリプシンで剥離させ、１０００ｔｒ／ｍｉｎで遠心分離し、アネキシン（ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ緩衝溶液で３回洗浄した。１００μＬの同じ緩衝液及びアネキシンＶ−ＦＩＴＣ０．５μＬを前記の細胞に添加し、そして暗所で１５分間培養した。その後、プロピジウムヨウ化物染色溶液（５０μｇ／ｍＬ）５μＬを添加した。前記分析をサイトフルオリメトリー・ファックスキャリバー（ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）を使用し行った。機器を４９４ｎｍ及び６４７ｎｍ励起波長で操作した。セルクエスト（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）［商品名］ソフトウェアをデータ分析に使用した。サンプル当たり最少４０，０００イベントを分析した。また、ＨｅＬａ細胞を引例６に記載の異なる濃度でＳＷＮＴ−ＦＩＴＣと培養した。
【００９７】
図３Ａ〜図３Ｅは、アミノｆ−ＳＷＮＴの０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ濃度の範囲における、細胞動態を示す。１ｍｇ／ｍＬまでは、細胞の８０％は生きており、そしてナノチューブの最高濃度においては、生存率は５０％に減少することがわかった。アミノ機能化ＣＮＴは、以前研究されたＳＷＮＴ−ＦＩＴＣよりも、より少ない毒性であることを見出すことができる。更に、前記機能化カーボンナノチューブが細胞内にあることを証明するために、後者の実験では、ＳＷＮＴ−ＦＩＴＣ（３ｍｇ／ｍＬ）で培養され、そしてＦＡＣＳ方法で可視化した（図３Ｆ）。９５％より多い細胞が、蛍光的に標識されたナノチューブを取り込んでおり、このデータは、細胞表面への強い親和性そして続いて細胞内在化を示すことを示唆している。前記のデータは図２Ａ〜図２Ｄで示される電子顕微鏡観察と相関しており、ナノチューブと細胞との強い相互作用を示している。
【００９８】
従って、アミノ機能化カーボンナノチューブの細胞に入り、核に達する高い能力は、プラスミドＤＮＡの送達のために活用される。
【００９９】
ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（すべてＧｉｂｃｏから）を添加したＦ１２−Ｋ培地で、９６ウエル組織培養ディシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ）中に９０％密集度に増殖させた。培地を除去し、そして前記ｆ−ＳＷＮＴ：ＤＮＡ複合体５０μＬをそれぞれの条件で、３つのウエルに添加した。３０、９０、又は１８０分間後、トランスフェクション培地を除去し、新鮮な培地に置き替えた。対照として、３つのウエルをオプティメム５０μＬ中のＤＮＡ０．２５μｇでトランスフェクションした。細胞を４８時間培養し、その後集菌した。β−ガラクトシダーゼ活性を、トロピックス・ガラクトライト・プラスキット（Ｔｒｏｐｉｘ Ｇａｌａｃｔｏｌｉｇｈｔ Ｐｌｕｓ ｋｉｔ）及びバートルド（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）９５０７照度計を使用し、メーカーの取扱説明書に従い、測定した。
【０１００】
図４は、ナノチューブと遺伝子をコードしているプラスミドＤＮＡとの相互作用後に得られたＣＨＯ細胞中のマーカー遺伝子（β−Ｇａｌ）発現のレベルを示す。他の非ウィルス遺伝子送達ベクターと同じで、ＳＷＮＴ表面でのアミノ基とＤＮＡ骨格のリン酸基との間の電荷比は、得られた遺伝子発現のレベルの決定要素であると考えられる。ｆ−ＳＷＮＴ：ＤＮＡ電荷の２：１と６：１（＋／−）との間の比は、ＤＮＡのみと比較すると、５〜１０倍高い遺伝子発現のレベルを提供する。細胞毒性はこの実験を通じて観察されず、たとえ、前記ｆ−ＳＷＮＴ：ＤＮＡとＣＨＯ細胞との培養時間が３時間でも観測されなかった。
【０１０１】
《実施例３》
本発明によるアミノ機能化されたＳＷＮＴとプラスミドＤＮＡ複合体を、生体内の遺伝子送達の研究に使用した。
【０１０２】
簡単には、すべての実験動物の研究は、事前の許可及びＵＫ Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅにより示されている規制下で行われた。第８〜１０週齢のオスＢＡＬＢ／ｃマウスを、イソフルレン吸入により麻酔した。５０μｇＤＮＡを含むナノチューブ：ＤＮＡ複合体１．５ｍＬ、対照として生理食塩中１．５ｍＬ中のＤＮＡ５０μｇを投与した。ラコックら（Ｌｅｃｏｃｑ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．５：１４２−１５６）の記載のラピッドハイドロダイナミック注入（ｒａｐｉｄ ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって、マウスの尾静脈を介して注入された。その後、マウスを１６時間後に安楽死させ、肺、肝臓及び脾臓を回収した。組織を−８０℃、一晩で凍結し、融解し、そして、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、２ｍＭＤＴＴ、２ｍＭＥＧＴＡ、１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（すべてＳｉｇｍａから）を含む溶解緩衝液中においてホモジェナイズした。ルシフェラーゼ活性をトロピックスラックスクリーン（Ｔｒｏｐｉｘ ＬｕｃＳｃｒｅｅｎ）アッセイキット及びバートルド（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）９５０７照度計を使用し決定した。検体はピアスＢＣＡアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ）を使用し、総タンパク量を補正した。実験は、グループ当たり３匹の動物を使用し、すべてのアッセイは、４回の検体の検査を行なった。
【０１０３】
結果を図５Ａ〜図５Ｃに示しているが、尾静脈ハイドロダイナミック（ｔａｉｌ ｖｅｉｎ ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ）投与の後に、アミノ機能化ＳＷＮＴとプラスミドＤＮＡとの相互作用は生体内の遺伝子発現レベルを妨げないことを示している。ＤＮＡがｆ−ＳＷＮＴと複合化した場合、すべての３つの組織におけるルシフェラーゼ遺伝子発現レベルは、２４時間前投与で緩やかな（肝臓組織発現においては統計的に有意ではない）アップレギュレーションを示した。興味深いことに、肺及び脾臓組織中の発現データから、前記ｆ−ＳＷＮＴ：ＤＮＡのルシフェラーゼ発現においては２〜３倍の増大があり、プラスミドのみのＤＮＡ投与と比較してＤＮＡの生体分布の変化を示している。より重要にもかかわらず、特にこれはカーボンナノチューブを使用し行われた最初の生体内の遺伝子送達研究であるので、チューブは３つの組織中のいずれかにおいて遺伝子発現を下方制御するとは全く思われない。一方、先端の投与プロトコルにもかかわらず、すべての動物は遺伝子送達システムに副作用がないことを示した。遺伝子送達ベクターシステムの要素としてカーボンナノチューブにより提供することができる遺伝子発現の効率及び強化を最適化及び評価するために、更なる研究が必要である。本研究において報告されているデータは、新規ナノチューブベースの遺伝子送達ベクターシステムを巧に処理するための要素として使用されるカーボンナノチューブの最初の例を構成している。使用された機能化ナノチューブは、エンドソーム非依存性メカニズムであると思われ、細胞中で相互作用し、そして細胞中に取り込まれることができることを示している。細胞障害試験は、典型的な遺伝子導入への適用で使用される濃度より高い、１０ｍｇ／ｍＬ濃度まで、機能化ナノチューブが細胞に許容されることを示している（本遺伝子送達実験において、使用される最も高いナノチューブ濃度は３ｍｇ／ｍＬであった）。更に、ＤＮＡのみと比較してより高いＤＮＡ取り込み及びインビトロの遺伝子発現を容易にするため、ｆ−ＳＷＮＴをプラスミドＤＮＡと相互作用した。レベルは市販の遺伝子トランスフェクション試薬ほど高くはないが、それらは最適化できることを示している。更に興味深いことに、尾静脈ハイドロダイナミック（ｔａｉｌ ｖｅｉｎ ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ）投与による生体内の遺伝子発現は障害されることなく、そしてすべての動物に寛容であった。従って、機能化カーボンナノチューブを、更に遺伝子送達ベクターの構築のための新規なナノチューブとして探索することができ、好ましい生体内の細胞障害性の許容レベル及び生体内の副作用効果の徴候もないことを示し、そして、遺伝子発現の有益なレベルを維持している。
【０１０４】
《実施例４》
ＨＢｓＡｇをコードしたプラスミド（ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ、図７）と複合化したアミノ機能化ＳＷＮＴ（ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋ １）をマウスにおけるワクチン実験に使用した。
【０１０５】
簡単には、６週〜８週齢のＢａｌｂ／ｃマウス６匹の４つのグループにおいて、最初に対照実験を行い、マウスは筋肉内（ＩＭ）注射によって、それぞれ：
−ＰＢＳ；
−ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）（１０μｇ／マウス）；
−ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）（１００μｇ／マウス）；
−ＨＢｓが挿入されていないプラスミド（１００μｇ／マウス）；
を免疫された。
【０１０６】
前記免疫遺伝子をＰＢＳ１００μＬに懸濁する。それぞれのマウスは、それぞれの後脚の脛骨の筋肉に、１回の両側の注入（５０μＬ）を受けた。
【０１０７】
ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）／ｆ−ＳＷＮＴ複合体の実験において、各種の負電荷／正電荷比でｆ−ＳＷＮＴに吸着されたプラスミドの投与は、それぞれの免疫ルート、及びそれぞれのプラスミドの量において行われた。ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）／ｆ−ＳＷＮＴ複合体の３つの負電荷／正電荷比（１：１、１：２、及び１：６）を使用する。
【０１０８】
従って、６週〜８週齢のマウス、Ｂａｌｂ／ｃ６匹の９つのグループは、それぞれ：
−ＰＢＳ
−ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）／ｆ−ＳＷＮＴ 負電荷／正電荷 １：１
（１０μｇ／マウスのプラスミド）、
−ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）／ｆ−ＳＷＮＴ 負電荷／正電荷 １：２
（１０μｇ／マウスのプラスミド）、
−ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）／ｆ−ＳＷＮＴ 負電荷／正電荷 １：６
（１０μｇ／マウスのプラスミド）、
−ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）／ｆ−ＳＷＮＴ 負電荷／正電荷 １：１
（１００μｇ／マウスのプラスミド）、
−ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）／ｆ−ＳＷＮＴ 負電荷／正電荷 １：２
（１００μｇ／マウスのプラスミド）、
−ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）／ｆ−ＳＷＮＴ 負電荷／正電荷 １：６
（１００μｇ／マウスのプラスミド）、
−ｆ−ＳＷＮＴのみ（１：６比の投与量に相当する量）、
−ｆ−ＳＷＮＴに複合化したＨＢｓが挿入されていないプラスミド（対照実験に基づいて作られた１つの負電荷／正電荷比）、
を免役された。
【０１０９】
マウスは、それぞれの前脛骨筋（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｔｉｂｉａｌｉｓ）に、ＰＢＳ５０μＬに懸濁した５又は１０μｇプラスミドＤＮＡの１回の両側筋肉内（ＩＭ）注射を受ける。対照マウスは、ＨＢｓが挿入されていない１００μｇプラスミドを含む２×ＰＢＳ５０μＬをＩＭ注射された。
【０１１０】
あるいは、前記と同様のプロトコルを、尾の付け根の皮下（ＳＣ）注射（１０若しくは１００μｇのプラスミド、又は各種のｆ−ＳＷＮＴとの複合体を含む、ＰＢＳ２００μＬ）を用いて、繰り返すことができる。
【０１１１】
誘導された細胞応答を、投与後１０日で分析し（３マウス）、一方、液性反応を１０週間後に調べた（３マウス）。抗体反応の経過を調べるために、血清検体を、１０週の期間にわたり、免疫原の投与後１５日毎に集める。動物は細胞応答を検査するため、１０週後に安楽死する。
【０１１２】
抗−ＨＢｓの液性免疫反応をヨーン（Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．,１９９９,Ｊ Ｋｏｒｅａｎ Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．１４：１８７−９２）の記載により、測定する。簡単には、ＩＭ及びＳＣ免疫マウスの血清中の抗−ＨｂｓＩｇＧ抗体産生をＥＬＩＳＡ法により測定する。ＥＬＩＳＡプレートを、０．０５Ｍ 炭酸塩−重炭酸塩緩衝（ｐＨ９．６）中に溶解した１μｇ／ｍＬ ＨＢＶプレＳ２抗原（ａ．ａ．１２０−１４５、Ｓｉｇｍａ、Ｈ−７３９５、ＵＳＡ）で、４℃、一晩コートした。ブロッキングは、ブロッキング溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳに０．５％ＢＳＡを溶解）２００μＬで、３７℃、２時間プレートをインキュベートすることにより行った。マウス血清を抗体緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳの０．５％ ＢＳＡ溶液）中で１：５０から１：１６００に２倍段階希釈し、そして希釈された血清１００μＬを、プレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。抗体緩衝液に１：１０００に希釈したセイヨウワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を二次抗体として使用し、前記プレートを、更に３７℃１時間インキュベートした。洗浄後、最後の反応は、ウエルあたり、基質溶液（１０％クエン酸リン酸緩衝液ｐＨ５、＋０．０４％Ｈ２Ｏ２ ＋ ９０％の７２ｍＬジメチルスルホキシドを含む溶液＋グリセロール１８ｍＬ＋３，３’，５，５’−テトラメチレンベンジジン３００ｍｇ）１５０μＬを、３７℃、１５分間添加することにより、視覚化された。反応を０．２５Ｍ ＨＣｌで停止し、そして４５０ｎｍで吸光度を測定した。データは、ＯＤが０．２の希釈の逆数に相当する抗体価として表わす。
【０１１３】
脾臓のＣＴＬの頻度の決定は、クイサら（Ｋｗｉｓｓａ ｅｔ ａｌ．、２００３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８１：９１−１０１）に記載に従い行われる。簡単には、脾臓を無菌的に取り出し、そして貯蔵した。単細胞の懸濁液は、滅菌したメッシュスクリーン（１００μｍ）に、組織を静かに通過させることにより調製した。赤血球をトリス緩衝塩化アンモニウムで溶解し、残った細胞を５０μＭβ−メルカプトエタノール、１００ＩＵ／ｍＬゲンタマイシン及び２５ｍＭＨＥＰＥＳ添加ＲＰＭＩ１６４０（完全培地、ＣＭ）で、よく洗浄した。脾細胞は、ＦＡＣＳ解析及びエリスポット（Ｅｌｉｓｐｏｔ）アッセイのために、いずれかを直接、使用された。次に、脾臓細胞（１×１０７／ｍＬ）を、５μｇ／ｍＬのＨＢｓＡｇ由来の合成Ｌｄ結合Ｓ２８−２９ＩＰＱＳＬＤＳＷＷＴＳＬペプチド、又はＤｄ結合Ｓ２０１−２０９ＷＧＰＳＬＹＳＩＬペプチドとＲＰＭＩ−１６４０培地で１時間インキュベートする。その後、５μｇ／ｍＬのブレフェルジンＡ（ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ：ｓｉｇｍａ １５８７０）を添加し、そして培養物を、更に４時間インキュベートした。細胞を集菌し、そして表面をフィコエリトリン標識抗ＣＤ８モノクロナール抗体で染色した。表面を染色された細胞を、細胞内のＩＦＮγの染色前に、リン酸緩衝液中の２％パラホルムアルデヒドで固定した。固定された細胞を透過緩衝液（Ｈａｎｋ平衡塩類溶液、０．５％ウシ血清アルブミン、０．５％サポニン、０．０５％アジ化ナトリウム）中で再懸濁し、そして常温で３０分間、フルオレセインイソチオシアネート標識抗ＩＦＮγモノクロナール抗体と培養し、そして透過緩衝液で３回洗浄した。染色された細胞を、０．１質量／容量％アジ化ナトリウムを添加したリン酸緩衝液／０．３質量／容量％ウシ血清アルブミンで再懸濁した。ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋ＣＴＬの頻度をフローサイトメトリー分析により決定する。
【０１１４】
エリスポット（Ｅｌｉｓｐｏｔ）ＩＦＮγは、以下のように行なう。ニトロセルロースマイクロプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｏｌｓｈｅｉｍ、Ｆｒａｎｃｅ）を、ラット抗マウスＩＦＮγ（Ｒ４．６Ａ２、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｌｅ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｃｌａｉｘ、Ｆｒａｎｃｅ）でコートし、そして次に、洗浄し、１０％ＦＣＳのＣＭを満たした。エフェクター細胞の複製アリコート（１×１０６脾細胞／ウエルを新たに単離した）をヒトｒＩＬ２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）３０Ｕ／ｍＬを加えたＣＭ−１０％ＦＣＳを含む前記のウエルに添加した。エフェクター細胞を１０μｇ／ｍＬ ＨＢｓＡｇ由来、合成Ｌｄ−結合Ｓ２８−２９ＩＰＱＳＬＤＳＷＷＴＳＬペプチド又はＤｄ−結合Ｓ２０１−２０９ＷＧＰＳＬＹＳＩＬペプチドと培養した。３７℃で２０時間後、ビオチン化ラット抗マウスＩＦＮγ ｍＡｂ（ＸＭＧ１．２、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を加え、一晩インキュベーションした。洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識エクストラアビジン（ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ：ｓｉｇｍａ）を添加し、そしてウエルを室温で１時間培養した。最後に、アルカリフォスファターゼ標識基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅ、ＣＡ）を３０分間添加した。Ｓｐｏｔを形成した細胞をコンピューターアシスト・ビデオイメージアナライザー（ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｖｉｄｅｏ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｚｅｒ：Ｚｅｉｓｓ−Ｋｏｎｔｒｏｎ、Ｊｅｎａ、Ｇｇｅｒｍａｎｙ）を用いて計測した。
【０１１５】
《実施例５》
本実施例において、真核細胞にＤＮＡをトランスフェクトする、複合化された機能化カーボンナノチューブ（ｆ−ＣＮＴ）の能力を検証した。
【０１１６】
原料及び方法
総則
図１に示している、アンモニウム機能化単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋ １）、アミノ機能化多層カーボンナノチューブ（ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋ ２）、及びリジンにより機能化単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋ ３）は、実施例１に記載されている方法により調製した。
【０１１７】
アンモニウム機能化単層カーボンナノチューブ（１）及びアンモニウム機能化多層カーボンナノチューブ（２）を、６ｍｇ／ｍＬ及び６．６ｍｇ／ｍＬ濃度で、それぞれ脱イオン水に溶解した。リジン機能化単層カーボンナノチューブ（３）は、３．３ｍｇ／ｍＬ濃度で脱イオン水に溶解した。すべての溶液を、超音波処理槽（ｂａｔｈ ｓｏｎｉｃａｔｏｒ：８０Ｗ、ＥＭｓｃｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＫ）中で、室温１分間、超音波処理し、その後、使用時まで４℃で貯蔵した。使用前に、ナノチューブ溶液をもう一度簡単に超音波処理した。これらの研究に使用されるプラスミドは、ｐＣＭＶ−Ｂｇａｌ（ＢＤ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｕ．Ｋ．）、７．２ｋｂ、真核細胞発現ベクターであった。高度に精製されたスーパーコイルＤＮＡの大量精製（ｇｉｇａｐｒｅｐ）は、バヨウ・バイオラボ（Ｂａｙｏｕ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＬＡ、ＵＳＡ）により調製した。ストック溶液は、１ｍｇ／ｍＬ濃度で脱イオン水により調製した。アリコートを使用まで−８０℃で冷凍保存した。
【０１１８】
ｆ−ＣＮＴ：ＤＮＡ複合体
機能化カーボンナノチューブ（ｆ−ＣＮＴ）：ＤＮＡ複合体を調製するために、適当な量のそれぞれの型のナノチューブを、総容量２００μＬの脱イオン化された水で希釈し、その後、それぞれの濃度のｆ−ＣＮＴ用に、５０μＬずつの４つのアリコートに分割した。前記ナノチューブの型及び必な電荷比に応じて、ｆ−ＣＮＴ濃度は１６．５μｇ／ｍＬから３００μｇ／ｍＬの範囲とした。次に、同じ容量の５μｇ／ｍＬＤＮＡ溶液を、３つの前記ｆ−ＣＮＴアリコートに添加し、その後、素早く１０回ピペッティングすることより混合し、２５０ｎｇ／ｍＬの最終ＤＮＡ濃度を作成した。５０μＬ脱イオン化された水を、ナノチューブのみの対照として、それぞれのグループの第４のｆ−ＣＮＴアリコートに添加した。複合体は、使用前に室温、３０分間で形成させることができた。前記の工程は、試験されるそれぞれの電荷比で繰り返しされ、相当する濃度で条件当たり、ナノチューブのみのサンプルに加え、３つのサンプルを作成した。
【０１１９】
走査電子顕微鏡
ＳＥＭを使用し、プラスミドと複合化されたＳＷＮＴ−ＮＨ３＋１及びＭＷＮＴ−ＮＨ３＋２の像を取得する。画像の作成は、前記６：１（ＣＮＴ：ＤＮＡ）電荷比の複合体サンプル、又は同じ濃度のナノチューブのみのサンプル３０μＬを、ＳＥＭスタブ（ｓｔｕｂ）に置くことによって実行し、そして金のコーティング前に室温で乾燥させた。この工程は、２０ｍＡで２分間、エミテックＫ５５０スパッタ−・コーター（Ｅｍｉｔｅｃｈ Ｋ５５０ Ｓｐｕｔｔｅｒ Ｃｏａｔｅｒ）で行なった。画像の作成は、２０−２５ＫＶ間の加速電圧でＦＥＩフィリップスＸＬ３０（ＦＥＩ／Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ ３０）走査電子顕微鏡（Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の下で実施した（それぞれの像も参照）。像を補足し、そしてデジタル化し保存した。
【０１２０】
表面プラズモン共鳴
ＢＩＡｃｏｒｅ３０００システム、センサーチップＣＭ５、界面活性剤Ｐ２０、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド（ＮＨＳ）及びＮ−エチルＮ’−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）を含むアミンカップリングキットは、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）のものである。すべてのバイオセンサー試験は、泳動バッファーとしてＨＢＳ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１４０ｍＭ酢酸カリウム、３ｍＭ酢酸マグネシウム、０．０２％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．３）で実行した。ナノチューブの固定化は、ナノチューブ（酢酸緩衝液中の１００μｇ／ｍＬ、ｐＨ４．０）３５μＬをＥＤＣ／ＮＨＳで活性化したセンサーチップＣＭ５の表面に注入することによって行なった。これを、マトリックスの活性化されたフリーの部位を飽和させるために、続いて２０μＬエタノールアミン塩酸塩ｐＨ８．５を注入した。チップ上に非共有結合的に固定化されているナノチューブを除去するために、１００ｍＭＨ３ＰＯ４溶液を使用した。すべての結合実験は、２５℃、３０μＬ／ｍｉｎの一定流速で行なった。ｐＣＭＶ−ＢＧａｌを前記泳動バッファー中に溶解した。各種の濃度のプラスミド（６．３から１００μｇ／ｍＬ）を９０秒間注入し、そして２分間の解離フェイズを続けた。すべての実験において、センサーチップを１５μＬの３ＭＭｇＣｌ２で再生した。速度パラメータは、ＢＩＡｅｖａｌ３．１ソフトフェアを使用し計算した。分析は、簡易ラングミュア結合モデルを用いて行った。特異結合プロファイルは、チャンネルコントロールから応答シグナルを引いた後、得られた。それぞれのモデルの適合性は、カイ二乗値、及び理論モデルと比較した残留分布のランダム性によって判断した。
【０１２１】
ｆ−ＣＮＴ：ＤＮＡ複合体のためのピコグリーンアッセイ（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ａｓｓａｙ）
ｆ−ＣＮＴとの複合化した後のＤＮＡの近接性の程度を、二本鎖ＤＮＡ結合試薬であるピコグリーン（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ＯＲ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）によって評価した。簡単には、カーボンナノチューブ：ＤＮＡ複合体を、脱イオン化された水で１０倍希釈し、２５０ｎｇ／ｍＬの最終ＤＮＡ濃度を作成した。次に、サンプル１００μＬをコースター９６ウエルスペシャルオプティクスブラックプレート（ＣｏＳｔａｒ ９６−ｗｅｌｌ ｓｐｅｃｉａｌ ｏｐｔｉｃｓ ｂｌａｃｋ プレート：Ｃｏｍｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）の３つのウエルに添加した。本研究で使用されるプラスミド、ｐＣＭＶ−Ｂｇａｌは、そもそもスーパーコイルの状態であり、アッセイキットを含まれるコントロールよりむしろ、前記プラスミドを用いて１０００ｎｇ／ｍＬ〜３１．２５ｎｇ／ｍＬの範囲の標準曲線を作成した。２ｘＴＥ緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ／２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中のピコグリーン試薬１００μＬを、それぞれのウエル中に添加し、そして、プレートを３分間暗所でインキュベートし、その後、ワラックビクター（Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ：Ｗａｌｌａｃ、ＵＫ）マルチウエルプレートリーダーを用いて、それぞれ４８５ｎｍ及び５３０ｎｍの励起及び放射波長で測定した。測定される波長において、カーボンナノチューブのみでも自己蛍光を発するため、カーボンナノチューブのみの第２の標準曲線を作成し、バックグラウンドの蛍光を定量化した。その後、これをそれぞれのサンプルから引いた。パーセント遊離ＤＮＡは、それぞれの複合体のバックグラウンド補正されたＰｉｃｏＧｒｅｅｎカウントを、ｐＢｇａｌ２５０ｎｇ／ｍＬのみのバックグラウンド補正された測定値（１００％遊離ＤＮＡを示す）で割ることによって決定した。データを３つのサンプルの平均で示し、プラス又はマイナスの標準偏差を示す。
【０１２２】
電気泳動運動性移動アッセイ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ Ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ）
異なる電荷比の３つの型のカーボンナノチューブに複合化されているＤＮＡ（ｐＢｇａｌ）０．２μｇ、又は対照としての遊離ＤＮＡ０．２μｇを、臭化エチジウムを含むＴＡＥ緩衝液中の１％アガロースゲルに添加した。ゲルを９０Ｖで２時間、泳動し、その後ＵＶＰゲルドキュメンテーションシステム（ＵＶＰ Ｇｅｌ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ：Ｕｐｌａｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用し、紫外光の下で撮影した。それぞれの検体は、２検体ずつ泳動した。
【０１２３】
遺伝子導入実験
Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ、Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ、ＵＫ）を９６ウエルプレートにほぼ密集するまで、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）で培養した。複合体は、無血清ＤＭＥＭで０．７５μｇのｐＣＭＶ−ＢＧａｌを希釈し、そして、７５μＬの無血清ＤＭＥＭ中で適当量のＳＷＮＴ−ＮＨ３＋１、ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋２又はＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋３を希釈することにより形成し、ＤＮＡ０．７５μｇを有する目的の電荷比を作成した。ＤＮＡ溶液は、迅速なピペッティングにより、ｆ−ＣＮＴと混合し、そして３０分間で安定化させた。完全培地を前記Ａ５４９細胞から取り除き、そして各種のｆ−ＣＮＴ：ＤＮＡ複合体１５０μＬに置換した。コントロールとして、培地のみで処理した細胞、又はＤＮＡ０．７５μｇを含む培地で処理した細胞を、使用した。細胞を３７℃で９０分間、複合体と培養し、そして、次にトランスフェクション培地を除去し、完全培地に置き換えた。細胞を４８時間置き、ＰＢＳ中で１回洗浄し、溶解し、そしてトロピックス・ガラクトライト・プラスキット（Ｔｒｏｐｉｘ Ｇａｌａｃｔｏｌｉｇｈｔ Ｐｌｕｓ ｋｉｔ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）及びルマットＬＢ（Ｌｕｍａｔ ＬＢ）９５０７照度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂａｄ Ｗｉｌｄｂａｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用しβ−ガラクトシダーゼの発現を分析した。データは、ＤＮＡのみの群を引いた後、３つのサンプルの平均として示し、平均のプラス／マイナスの標準偏差を示した。
【０１２４】
結果
プラスミドＤＮＡとｆ−ＣＮＴとの相互作用の後に形成される複合体を視覚化するために、ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋１とＭＷＮＴ−ＮＨ３＋２との両方を走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）によりβ−ｇａｌ発現プラスミドの存在下（図８Ａ〜８Ｆ）で、分析した。
５μｇ／ｍＬ濃度のプラスミドＤＮＡと複合化されている水溶液中の１８０μｇ／ｍＬ濃度のＳＷＮＴ−ＮＨ３＋１（６：１電荷比を生じる）が、生体内での遺伝子発現のピークレベルを作り出すことを、前記の観察は（実施例２）は証明した。本実験において、ＳＥＭにより得られる複合体の物理的特性及び形態特性を調べるために、前記と同じ条件を使用した。同じＤＮＡ濃度と複合化される場合、利用可能な機能化アミノ基（０．９０ｍｍｏｌ／ｇ ＮＨ２）の使用量が相違するので、ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋２を９９μｇ／ｍＬ濃度で可溶化し、同等の電荷比を作成した。カーボンナノチューブ：ＤＮＡ複合体を６：１の電荷比で形成した場合、塊状の構造の非常に鮮明な像が、前記ＳＥＭサンプルグリッド（図８Ａ〜８Ｆ）を通じて観察された。
【０１２５】
ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ複合体は４μｍより大きい凝集体を形成し、平面格子構造をもっていた。ＤＮＡ凝縮体は、ナノチューブの中に埋められているナノチューブを有する凝結物様の平面構造を形成する（図８Ａ〜８Ｃ）。塊のような前記凝結物様のブロックを分離するエッジを定義しているウエル（ｗｅｌｌ）なしに、ＤＮＡは非常によりタイトに密集しているように見える。ｆ−ＳＷＮＴの周りの直径１〜４μｍのほとんどバラバラの凝集体粒子の形成によっても明らかなように、ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ複合体のＳＥＭの画像は、異なる構造的特徴を示している。この場合において、単層カーボンナノチューブは、個別のチューブを連結する球状のＤＮＡ束状構造を有する並列格子を形成するように思われ、それらの末端は、複合体の端から伸びているように見ることができる。ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡの場合に観察された凝結物様の格子というよりも、ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ複合体は球体構造であることを十分定義することによって特徴づけられる。それらは、前記カチオンナノチューブの周りの凝縮したプラスミドＤＮＡによって実現する様々な構造によるものであると発明者は信じている。前記の相違は、ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋の表面上のより大きいカチオン電荷密度、及びＤＮＡをナノチューブ自身とより密接に結びつくことを可能にしている増加した表面領域の両方に帰することができる。
【０１２６】
機能化カーボンナノチューブ及びプラスミドＤＮＡの間の親和性を定量化する試みにおいて、それらの相互作用を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。この研究において、ＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋３に相当するｆ−ＣＮＴの２型も使用した（図１）。チューブ上のＮＨ２基及びチップの金表面のカルボキシル基（順にカルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシニイミドで活性化した）の間の安定なアミド結合を形成することによって、図１のナノチューブをセンサーチップ上に固定化した。第１ステップの後に酸洗浄処理を続け、すべての試薬及び過剰なカーボンナノチューブを除去した。前記のナノチューブの共有結合による固定化は、センサグラム応答の明らかな増加によって証明された。
【０１２７】
ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋１及びＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋３の両方の場合において、固定されたチューブの量は、１００ｍＭリン酸で丁寧な洗浄後に、著しく減少した。これは、センサーチップ上に一定量のナノチューブが非特異的に結合しているためとすることができる。共鳴ユニットの著しい減少は検出されなかったので、酸処理はＭＷＮＴ−ＮＨ３＋２には影響しなかった。ナノチューブを有するセンサーチップの機能性をより明らかにするために、前記センサーチップのＳＥＭ分析を行なった。前記の技術を用いて、チップ表面へ共有結合されたナノチューブを可視化することができた。図９は、前記センサーチップチップ表面を被覆するカルボキシメチル化デキストランの上部のＷＮＴ−ＮＨ３＋２のＳＥＭ画像を鮮明に示している。チューブは、直径２０ｎｍと７０ｎｍとの間であり、それらは単一体として存在する。
【０１２８】
センサーチップ上への各種のチューブの固定化の後に、プラスミドＤＮＡ、ｐＣＭＶ−Ｂｇａｌとそれらの相互作用を検討した。前記プラスミドを、注入される緩衝液（６．３〜１００μｇ／ｍＬ）中において異なる濃度で使用した。それぞれの濃度において、結合曲線（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ）及び解離曲線を簡易ラングミュア結合モデルを使用し別々に適合させた。ＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋３及び前記ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋２とプラスミドの結合のセンサーグラムデータを図１０にまとめた。前記フィッティングパラメータの分析は、ＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋３、及びＭＷＮＴ−ＮＨ３＋２のそれぞれの見かけの平衡結合定数である４．４５×１０８Ｍ及び２．３６×１０７Ｍ−１を、我々に計算させることを可能にする。
【０１２９】
ＳＰＲ（共鳴ユニットとして示される応答）は、金表面上の１００ｎｍまでの流体相中の複合体の検出を可能にする。固定化されたカーボンナノチューブと前記プラスミドＤＮＡとのすべての相互作用が、金表面（１００ｎｍの厚さ）の信号感受領域内で検出されるそれらの相互作用によって、一般的に示すことができるという仮定の下で、前記の２つの関与した要素の間の正電荷／負電荷比を計算することができる。ＲＵ値（１ＲＵ＝１ｐｉｃｏｇｒａｍ／ｍｍ２）の単純な変換は、ＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ、及びＭＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ複合体のそれぞれの電荷比６２．５：１及び１１．５：１を示す。ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋は、ＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋と比較してより多い量のＤＮＡを凝縮することができる。電荷密度は両方の系において、ほぼ同じであるので、前記の相違は、２つの型のナノチューブの相対的大きさによるものであることは確実である。ＭＷＮＴは、ＤＮＡと相互作用するための、より多くの利用可能な表面を提供する。ＳＰＲの研究から、ｆ−ＣＮＴはプラスミドＤＮＡと強い親和性を持っており、強いイオン相互作用によって安定される超分子複合体を形成すると結論づけることができる。塩化マグネシウムによるセンサーチップの再生工程中のプラスミドの完全解離によって確認されるように、静電相互作用は、完全に可逆的である。
【０１３０】
別の技術を前記ｆ−ＣＮＴ：ＤＮＡの研究のために使用した。ピコグリーン・ダイ・エクスクルージョン（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｙｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）アッセイを、溶液中のナノチューブによるＤＮＡの凝縮の程度を評価するために用いることができる。ピコグリーン蛍光は、二本鎖ＤＮＡ塩基対間への挿入により約１０００培増加する。ＤＮＡが凝縮した場合、前記色素はＤＮＡと相互作用することを妨害される。従って、凝縮したＤＮＡを同じ濃度の遊離ＤＮＡと比較した場合、蛍光の減少が観察される。
【０１３１】
この研究において記載されている３つすべての型のｆ−ＣＮＴの相互作用は、図１１Ａ〜図１１Ｃにおいて示されているＤＮＡとの電荷比の範囲にわたって評価された。複合体形成のあいだのプラスミドＤＮＡ濃度は２．５μｇ／ｍＬで一定であり、一方、ナノチューブの濃度は８．２５μｇ／ｍＬから１５０μｇ／ｍＬの範囲であり、それは、検討されるチューブの型と電荷比に依存している。３つのすべての場合において、ｆ−ＣＮＴはＤＮＡを明らかに凝縮することができる。ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋１（図１１Ａ）は、ＤＮＡの凝縮において、最少の効率のようである。電荷比１：１で、ＤＮＡの４３％のみを凝縮し、６：１で５８％に徐々に増加する。さらなる凝縮は、より高い電荷比において起こることはほとんどないようである。９６％を超えるＤＮＡが、電荷比１：１のＭＷＮＴ−ＮＨ３＋２（図１１Ｃ）によって凝縮され、そして９９％のＤＮＡが電荷比６：１及びそれ以上の電荷比によって、凝縮される。ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋と同様の表面電荷負荷をもつＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋３の場合（図１１Ｂ）において、約７４％のＤＮＡは電荷比１：１で凝縮されるようであり、６：１で８５％まで徐々に増加し、１０：１で最大凝縮に到達し、９２％を超えるＤＮＡが凝縮される。
【０１３２】
前記ピコグリーンデータは、前記のＳＥＭ像（図８）において見られたように、ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋と比較してＳＷＮＴ−ＮＨ３＋との相互作用後のＤＮＡの明らかに少ない凝縮パックの観察を確認する。これは、より低い電荷負荷効率（ｃｈａｒｇｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）、及び他の型のｆ−ＣＮＴと比較した場合に、ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋上で利用可能な正電荷への接近が比較的制限されていることによるものであると考えられている。同様に、ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋は、非常に効率良くＤＮＡを凝縮するようである。
【０１３３】
次に、ｆ−ＣＮＴ：ＤＮＡ複合体の移動を、アガロースゲル電気泳動及びＥｔＢｒ（臭化エチジウム）排除によるＤＮＡ凝縮によって検討した（図１２Ａ〜図１２Ｃ）。これらの検討において使用される前記プラスミドｐＣＭＶ−βＧａｌは高度に精製され、約８５％はスーパーコイル化され、残りの１５％はオープンサーキュラー型であった（レーン１、図１２Ａ）。ｆ−ＣＮＴによるＤＮＡの凝縮は、ＥｔＢｒ挿入を排除し、蛍光シグナルを消す。従って、前記ｆ−ＣＮＴ：ＤＮＡ複合体に関与する凝縮されたＤＮＡを観察することは可能ではない。一般的に、図１２Ａ〜図１２Ｃで観察される前記蛍光バンドは、十分なＥｔＢｒ挿入を可能にする遊離（複合化されていない）ＤＮＡから発生している。また、図１２Ａ〜図１２Ｃもｆ−ＣＮＴ：ＤＮＡ電荷比の増加に伴い、遊離ＤＮＡバンドの蛍光強度の全体的な減少を示しており、これは、より高い程度のＤＮＡ凝縮を原因とする、ＥｔＢｒ挿入のための利用できるＤＮＡ塩基の低下によるものである。典型的には、このアッセイは、ＤＮＡ移動度のシフトによって示されるように、ＤＮＡ構造の異なる型の移動を検討するために使用されている。この場合においては、完全にＤＮＡを凝縮することができると思われないＳＷＮＴ−ＮＨ３＋の場合（図１２Ａ）においてのみ、検討が可能であり、レーン２、３及び４において、遊離ＤＮＡの異なる構造（傷の入ったＤＮＡを含む）が明らかである。
また、図１２Ａ〜図１２Ｃのデータは以前の実験と著しく一致していることがわかる。ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡの場合において、強い蛍光シグナルは、１：１電荷比（図１２Ａ）に相当するレーン２中で観察され、多量の遊離ＤＮＡが存在していることを示している。電荷比が６：１まで増加するにつれて、蛍光強度の強い減少、及び前記遊離ＤＮＡバンドの上方へのシフトの増加が起こるが、前記＋／−電荷比が１０：１に更に増加しても、相違はほとんど見られない。複合化したＤＮＡの量がこの範囲ではプラトーに達していることをピコグリーンデータは示していたので、これは予想されることである（図１１Ａも参照）。ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡの複合化と比較した場合、ＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋３及びＤＮＡの複合化（図１２Ｂ）はより強いものであり、それは、遊離ＤＮＡバンドの総体的により弱い蛍光強度、及び電荷比の増加に伴う蛍光の漸進的な消失により観察されるものである。それは、挿入に利用可能な遊離ＤＮＡ量が、更にもっと減少していることを示している。ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋ ２の場合において、存在する遊離ＤＮＡの量がとても小さいために、前記１：１電荷比でかすかな蛍光シグナルのみを見ることができる（ｌａｎｅ ２、図１２Ｃ、また図１１Ｃ参照）。同じレーンにおいて、検出されたかすかなスメアーは、前記ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋２と相互作用するＤＮＡによるものであるが、完全に凝縮されていないものであると我々は信じており、いくらかのＥｔＢｒ挿入を許し、またこれらの複合体の広く大量な分布を示している。より高いＭＷＮＴ−ＮＨ３＋：ＤＮＡ比においては、ＤＮＡの全体の量は完全に凝縮されているので、蛍光バンドは消失する。
【０１３４】
ｆ−ＣＮＴは前記ゲル中に存在する場合、前記遊離ＤＮＡバンドの位置の上方へシフトすることが見られるが、ナノチューブそれ自身の高いイオン強度のために、泳動バッファーの交代がほとんどの原因のようである。この移動は前記スーパーコイルのＤＮＡの傷（ｎｉｃｋｉｎｇ）のためであってもおこり、ナノチューブとの相互作用によるもの、又は混合工程中に維持するためのどちらでも、ＤＮＡをより開放した形に緩和させる原因となるけれども、高濃度のＳＷＮＴ−ＮＨ３＋１のみ（１２ ｍｇ／ｍＬ）を、ブルーグリーン泳動バッファー（ｂｌｕｅ−ｇｒｅｅｎ ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）中で泳動したコントロール実験は、泳動バッファーのイオン強度がゲル中の分子移動における変化に関与することができることを示す、色素移動の明らかな遅延を証明した。
【０１３５】
最後に、形成される様々なｆ−ＣＮＴ：ＤＮＡ複合体の遺伝子導入の効率を検討した。データは、すべての３つの型の複合体は、すべての３つの図（図１３Ａ〜図１３Ｃ）においてゼロの値に標準化されている、むき出しのＤＮＡより高い効率でＡ５４９細胞をトランスフェクトすることができることを証明する。８：１の電荷比でＤＮＡに複合される場合において、ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋１は遺伝子導入において最も効果があると思われ、ＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋３は１：１の電荷比で最も効果があると思われる。興味深いことに、ＳＷＮＴ−ＮＨ３＋１の場合は、前記の電荷比において、約３０％のＤＮＡは色素と相互作用するために遊離しており、そしてＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋３の場合は、同様に２５％のＤＮＡは遊離していることを、ピコグリーンのデータは示している。このデータは、ｆ−ＣＮＴによるＤＮＡ凝縮の最適な程度が、より高いレベルの遺伝子発現を引き起こすことを示している。予想どおりに、ＭＷＮＴ−ＮＨ３＋２の場合は、とても低い電荷比においてさえもＤＮＡは完全に凝縮されるので、研究されるすべての電荷比及びＤＮＡ量にわたって、これらのナノチューブのトランスフェクション効率においてかなり違ってくるとは思われない。高い電荷比において９５％のＤＮＡを凝縮した、ＳＷＮＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ３＋３のトランスフェクション効率は、電荷比の増加とともに減少すると思われるが、同じ効果はＭＷＮＴ−ＮＨ３＋２のグループでは見られず、示したように、すべての電荷比にわたってトランスフェクション効率の同様のレベルを維持することに注意することが重要である。これは、単層ナノチューブより長くそして広い、多層ナノチューブの構造もまた重要な役割を果たすことができるという示唆であることができる。
【０１３６】
《実施例６》
水中で１０と１００μｇ／ｍＬとの間の濃度のＤＴＰＡをもつ機能化カーボンナノチューブを、ＰＢＳバッファー中の０．１と１μＭとの間の濃度でタンパク質と２時間混合する。タンパク質は、例えば、ストレプトアビジン、プロテインＡ、ウシ血清アルブミン、チトクロームＣを含む。特に、７より大きい等電点をもつタンパク質が静電相互作用を完全に有効に利用できるために理想的である。前記複合体はＴＥＭ及びＡＦＭによって特性を明らかにされ、そしてその後に細胞に供給される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
正電荷及び／又は負電荷を含むカーボンナノチューブの使用であって、前記電荷が電荷を担持している基少なくとも１つによって担持され、前記電荷を担持している基が前記カーボンナノチューブの表面に共有結合しており、前記カーボンナノチューブと前記荷電分子との結合が本質的に静電的であり、そして前記カーボンナノチューブが正電荷を含む場合は、前記荷電分子は負電荷少なくとも１つを含んでおり、及び／又は前記カーボンナノチューブが負電荷を含む場合は、前記荷電分子は正電荷少なくとも１つを含んでいるものとする、前記カーボンナノチューブと荷電分子少なくとも１つ（但し、前記荷電分子はＣｌ−とＴＦＡ−と異なっている）との複合体の製造への、前記使用。
【請求項２】
正電荷及び／又は負電荷を含む前記カーボンナノチューブの使用であって、前記電荷が電荷を担持している基少なくとも１つによって担持され、前記電荷を担持している基が前記カーボンナノチューブの表面において共有結合しており、前記カーボンナノチューブと前記荷電分子との結合が本質的に静電的であり、そして前記カーボンナノチューブが正電荷を含む場合は、前記荷電分子は負電荷少なくとも１つを含んでおり、及び／又は前記カーボンナノチューブが負電荷を含む場合は、前記荷電分子は正電荷少なくとも１つを含んでいる、前記カーボンナノチューブと約１１５より大きい分子量を有する荷電分子少なくとも１つとの複合体の製造への、前記使用。
【請求項３】
正電荷及び／又は負電荷を含んでいるカーボンナノチューブと荷電分子少なくとも１つとを含む複合体であって、前記電荷が電荷を担持している基少なくとも１つによって担持され、前記電荷を担持している基が前記カーボンナノチューブの表面において共有結合しており、
前記カーボンナノチューブが正電荷を含む場合は、前記荷電分子は負電荷少なくとも１つを含んでおり、及び／又は前記カーボンナノチューブが負電荷を含む場合は、前記荷電分子は少なくとも１つの正電荷を含んでおり（但し、前記荷電分子がＣｌ−とＴＦＡ−と異なるものとする）、
前記カーボンナノチューブと前記荷電分子との結合が本質的に静電的である、前記複合体。
【請求項４】
正電荷及び／又は負電荷を含んでいるカーボンナノチューブと約１１５より大きい分子量を有する荷電分子少なくとも１つを含む複合体であって、前記電荷が電荷を担持している基少なくとも１つによって担持され、前記電荷を担持している基が前記カーボンナノチューブの表面において共有結合しており、そして、前記カーボンナノチューブが正電荷を含む場合は、前記荷電分子が負電荷少なくとも１つを含んでおり、及び／又は前記カーボンナノチューブが負電荷を含む場合は、前記荷電分子は正電荷少なくとも１つを含んでおり、
前記カーボンナノチューブと前記荷電分子との結合が本質的に静電結合である、前記複合体。
【請求項５】
複合体が、水性溶媒に可溶であり、そして毒性がないことを特徴とする、請求項３又は４に記載の複合体。
【請求項６】
荷電分子と前記カーボンナノチューブの結合エネルギーが約９０ｋＪ／ｍｏｌ未満であり、特に約１２ｋＪ／ｍｏｌから約８５ｋＪ／ｍｏｌであり、より特には約２０ｋＪ／ｍｏｌから約７０ｋＪ／ｍｏｌであり、そして好ましくは約２０ｋＪ／ｍｏｌから約５０ｋＪ／ｍｏｌであることを特徴とする、請求項３〜５のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項７】
前記カーボンナノチューブが正電荷又は負電荷のいずれかを含み、そして前記荷電分子がそれぞれ負電荷少なくとも１つ、又は正電荷少なくとも１つのいずれかを含む、請求項３〜６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項８】
前記カーボンナノチューブが、前記荷電分子の電荷当たり約０．００１〜約１００電荷、特に約１〜約２０電荷を含む、請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
前記カーボンナノチューブが、前記荷電分子の存在する又は存在しない有機溶媒及び／又は水性溶媒中において、実質的に無傷であり、そして可溶であり、及び前記電荷を担持している基が前記カーボンナノチューブの表面上に均一に分布している、請求項３〜８のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１０】
前記カーボンナノチューブが、単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）又は多層カーボンナノチューブ（ＭＷＮＴ）である、請求項３〜９のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１１】
前記カーボンナノチューブが、下記の一般式：
［Ｃｎ］−Ｘｍ
（式中、Ｃｎは、実質的に一定の直径で、実質的に円筒形であるカーボンナノチューブの表面の炭素であり、前記直径が約０．５〜約５０ｎｍであり、特に、ＳＷＮＴにおいて約０．５〜５ｎｍであり、ＭＷＮＴにおいて約２０〜約５０ｎｍであり、
Ｘは、同一又は異なる、１又は数個の官能基であり、但し、Ｘ基少なくとも１つが、電荷を担持している基少なくとも１つを含み、
ｎは約３・１０３〜約３・１０６の整数であり、
ｍは約０．００１ｎ〜約０．１ｎの整数であり、
カーボンナノチューブ表面ｃｍ２当たり約２・１０−１１ｍｏｌ〜約２・１０−９ｍｏｌの官能基Ｘが存在している）
で表される、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１２】
Ｘが、２つの異なる官能基Ｘ１及びＸ２であり、そして前記カーボンナノチューブが下記の式：
［Ｃｎ］−［Ｘ１ｍ１］［Ｘ２ｍ２］
（式中、ｍ１及びｍ２は、相互に独立し、約０．００１ｎ〜約０．１ｎの整数を示し、但し、Ｘ１又はＸ２少なくとも一方が、電荷を担持している基少なくとも１つを含むものとする）
で表されている、請求項１１に記載の複合体。
【請求項１３】
Ｘが、同一又は異なる、１又は数個の置換されたピロリジン環であり、但し、前記置換されたピロリジン環少なくとも１つが電荷を担持している基少なくとも１つによって置換されている、下記の一般式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、Ｒ及びＲ’は、相互に独立し、−Ｈ、又は式−Ｍ−Ｙ−（Ｚ）ａ−（Ｐ）ｂで表される基であり、ａは０又は１であり、そしてｂは０〜８の整数であり、好ましくは０、１又は２であり、Ｐは、ｂが１より大きい場合に同一又は異なる基であり、但し、Ｒ及びＲ’は同時に水素原子とすることはできないものであり、そして、
Ｍは、約１〜約１００原子のスペーサー基、例えば−（ＣＨ２）γ−又は−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）γ−ＣＨ２−ＣＨ２−を含む群から選択される基、γは１〜２０の整数であり、あてはまる場合には電荷を担持している基を含み、
Ｙは、ａ＝ｂ＝０の場合の反応基、例えば−ＯＨ、−ＮＨ３＋、−ＣＯＯ−、−ＳＨ、−ＣＨＯ、ケトン例えば−ＣＯＣＨ３＝、アジ化物、又はハロゲン化物を含む群から選択される基であり、あてはまる場合には電荷を担持している基を含み、
又は、ａ又はｂが０と異なる場合に、反応基から誘導され、例えば−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＣＯＯ−、−Ｓ−、−ＣＨ＝、−ＣＨ２−、−ＣＣｋＨ２ｋ＋１＝、ｋは１〜１０の整数であり、特には−ＣＣＨ３、又は−ＣＨＣｋＨ２ｋ＋１−であり、ｋは１〜１０の整数であり、特には−ＣＨＣＨ３−を含む群から選択される基であり、
Ｚは、リンカー基、例えばａ＝１、及びｂ＝０の場合に以下の式の１つの基であり、あてはまる場合には電荷を担持している基を含んでおり、Ｐ基少なくとも１つと結合する傾向があり、そして、必要な場合には前記Ｐ基を放出する傾向があり、
【化２】
ｑは、１〜１０の整数であり、又は、
ａ＝１、及びｂ＝１又は２の場合に、以下の式の１つで表され、
【化３】
ｑは、１〜１０の整数であり、
Ｐは、有効基であり、あてはまる場合には電荷を担持している基を含み、前記機能化カーボンナノチューブの分光検出を可能にし、フルオロフォア、例えばＦＩＴＣ、キレート剤、例えばＤＴＰＡ、又は生物学的作用を誘発する傾向がある活性分子、例えばアミノ酸、ペプチド、擬似ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、例えば酵素又は抗体、核酸、炭水化物又は薬であり、
あてはまる場合にはＹ、Ｚ、又はＰ基少なくとも１つを、キャッピング基、例えばＣＨ３ＣＯ−（アセチル）、メチル、エチル、ベンジルカルボニル、又は保護基、例えばメチル、エチル、ベンジル、ｔｅｒｔ−ブチル、トリチル、３−ニトロ−２−ピリジルサルフェニル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、トリメチルシリルエチルオキシカルボニル、フタルイミド、ジメチルアセタール、又は１，３−ジオキソランによって置換することができる）
の、請求項１１又は１２に記載の複合体。
【請求項１４】
Ｘは、２つの異なる置換されたピロリジン環であり、但し、前記ピロリジン環少なくとも１つを、電荷を担持している基少なくとも１つによって置換されるものとする、以下の一般式（Ｉ’）：
【化４】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、Ｒ１及びＲ２は、異なっており、そして相互に独立し、−Ｈ、又は式−Ｍ−Ｙ−（Ｚ）ａ−（Ｐ）ｂの基であり、Ｍ、Ｙ、Ｚ、Ｐ、ａ及びｂは、請求項１３と同じ意味であり、Ｒ１及びＲ２少なくとも１つが電荷を担持している基を含んでいる）
の、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１５】
複合体が、以下の一般式（ＩＩ）：
【化５】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、Ａは荷電分子であり、そしてＲは、式−Ｍ−Ｗ基であり、そして、
Ｍは、約１〜約１００原子のスペーサー基、例えば−（ＣＨ２）γ−、又は−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）γ−ＣＨ２−ＣＨ２−を含む群から選択される基であり、γは１〜０の整数であり、
Ｗは、約１〜約４００原子の電荷を担持している基、例えば−ＮＨ３＋、又は−ＣＯＯ−である）
で表されることを特徴とする、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１６】
複合体が、以下の一般式（ＩＩ’）：
【化６】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、Ａは、荷電分子であり、そして
Ｒ１は、−Ｍ−Ｙ−（Ｚ）ａ−（Ｐ）ｂ基であり、Ｍ、Ｙ、Ｚ、Ｐ、ａ及びｂは、請求項１１と同じ意味であり、特にＲ１は、フルオロフォアを担持している基であり、そして
Ｒ２は、式−Ｍ−Ｗ基であり、Ｗは約１〜約４００原子の電荷を担持している基、例えば、−ＮＨ３＋、又は−ＣＯＯ−である）
で表されることを特徴とする、請求項１４に記載の複合体。
【請求項１７】
前記荷電分子が、
２〜１０６のヌクレオチドを含む核酸、例えばＲＮＡ又はＤＮＡ、特にはプラスミド又は人工染色体、
２〜５０００、好ましくは５０〜５０００のアミノ酸を含むペプチド、ポリペプチド又はタンパク質、
炭水化物、特には正電荷の炭水化物、例えばグルコサミン又はキトサン、
放射性核種、及び
細胞毒の分子を含む群から選択されている、請求項３〜１６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１８】
複合体が、以下の式：
【化７】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、そしてＡは、荷電分子であり、負電荷少なくとも１つを含む、例えばＤＮＡである）
で表されることを特徴とする、請求項３〜１７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１９】
複合体が、以下の式：
【化８】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、そしてＡは、荷電分子を示し、負電荷少なくとも１つを含む、例えばＤＮＡである）
で表されることを特徴とする、請求項３〜１７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２０】
複合体が、以下の式：
【化９】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、そしてＡは、正電荷少なくとも１つを含む荷電分子である）
で表されることを特徴とする、請求項３〜１７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２１】
複合体が、以下の式：
【化１０】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、そしてＡは、正電荷少なくとも１つを含む荷電分子である）
で表されることを特徴とする、請求項３〜１７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２２】
荷電分子を細胞内に運ぶための、請求項３〜２１のいずれか一項に記載の複合体の使用。
【請求項２３】
薬剤学的に許容可能な担体と共に、複合体、例えば請求項３〜２１のいずれか１項と同じ意味である複合体を、活性物質として含む、医薬組成物。
【請求項１】
正電荷及び／又は負電荷を含むカーボンナノチューブの使用であって、前記電荷が電荷を担持している基少なくとも１つによって担持され、前記電荷を担持している基が前記カーボンナノチューブの表面に共有結合しており、前記カーボンナノチューブと前記荷電分子との結合が本質的に静電的であり、そして前記カーボンナノチューブが正電荷を含む場合は、前記荷電分子は負電荷少なくとも１つを含んでおり、及び／又は前記カーボンナノチューブが負電荷を含む場合は、前記荷電分子は正電荷少なくとも１つを含んでいるものとする、前記カーボンナノチューブと荷電分子少なくとも１つ（但し、前記荷電分子はＣｌ−とＴＦＡ−と異なっている）との複合体の製造への、前記使用。
【請求項２】
正電荷及び／又は負電荷を含む前記カーボンナノチューブの使用であって、前記電荷が電荷を担持している基少なくとも１つによって担持され、前記電荷を担持している基が前記カーボンナノチューブの表面において共有結合しており、前記カーボンナノチューブと前記荷電分子との結合が本質的に静電的であり、そして前記カーボンナノチューブが正電荷を含む場合は、前記荷電分子は負電荷少なくとも１つを含んでおり、及び／又は前記カーボンナノチューブが負電荷を含む場合は、前記荷電分子は正電荷少なくとも１つを含んでいる、前記カーボンナノチューブと約１１５より大きい分子量を有する荷電分子少なくとも１つとの複合体の製造への、前記使用。
【請求項３】
正電荷及び／又は負電荷を含んでいるカーボンナノチューブと荷電分子少なくとも１つとを含む複合体であって、前記電荷が電荷を担持している基少なくとも１つによって担持され、前記電荷を担持している基が前記カーボンナノチューブの表面において共有結合しており、
前記カーボンナノチューブが正電荷を含む場合は、前記荷電分子は負電荷少なくとも１つを含んでおり、及び／又は前記カーボンナノチューブが負電荷を含む場合は、前記荷電分子は少なくとも１つの正電荷を含んでおり（但し、前記荷電分子がＣｌ−とＴＦＡ−と異なるものとする）、
前記カーボンナノチューブと前記荷電分子との結合が本質的に静電的である、前記複合体。
【請求項４】
正電荷及び／又は負電荷を含んでいるカーボンナノチューブと約１１５より大きい分子量を有する荷電分子少なくとも１つを含む複合体であって、前記電荷が電荷を担持している基少なくとも１つによって担持され、前記電荷を担持している基が前記カーボンナノチューブの表面において共有結合しており、そして、前記カーボンナノチューブが正電荷を含む場合は、前記荷電分子が負電荷少なくとも１つを含んでおり、及び／又は前記カーボンナノチューブが負電荷を含む場合は、前記荷電分子は正電荷少なくとも１つを含んでおり、
前記カーボンナノチューブと前記荷電分子との結合が本質的に静電結合である、前記複合体。
【請求項５】
複合体が、水性溶媒に可溶であり、そして毒性がないことを特徴とする、請求項３又は４に記載の複合体。
【請求項６】
荷電分子と前記カーボンナノチューブの結合エネルギーが約９０ｋＪ／ｍｏｌ未満であり、特に約１２ｋＪ／ｍｏｌから約８５ｋＪ／ｍｏｌであり、より特には約２０ｋＪ／ｍｏｌから約７０ｋＪ／ｍｏｌであり、そして好ましくは約２０ｋＪ／ｍｏｌから約５０ｋＪ／ｍｏｌであることを特徴とする、請求項３〜５のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項７】
前記カーボンナノチューブが正電荷又は負電荷のいずれかを含み、そして前記荷電分子がそれぞれ負電荷少なくとも１つ、又は正電荷少なくとも１つのいずれかを含む、請求項３〜６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項８】
前記カーボンナノチューブが、前記荷電分子の電荷当たり約０．００１〜約１００電荷、特に約１〜約２０電荷を含む、請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
前記カーボンナノチューブが、前記荷電分子の存在する又は存在しない有機溶媒及び／又は水性溶媒中において、実質的に無傷であり、そして可溶であり、及び前記電荷を担持している基が前記カーボンナノチューブの表面上に均一に分布している、請求項３〜８のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１０】
前記カーボンナノチューブが、単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）又は多層カーボンナノチューブ（ＭＷＮＴ）である、請求項３〜９のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１１】
前記カーボンナノチューブが、下記の一般式：
［Ｃｎ］−Ｘｍ
（式中、Ｃｎは、実質的に一定の直径で、実質的に円筒形であるカーボンナノチューブの表面の炭素であり、前記直径が約０．５〜約５０ｎｍであり、特に、ＳＷＮＴにおいて約０．５〜５ｎｍであり、ＭＷＮＴにおいて約２０〜約５０ｎｍであり、
Ｘは、同一又は異なる、１又は数個の官能基であり、但し、Ｘ基少なくとも１つが、電荷を担持している基少なくとも１つを含み、
ｎは約３・１０３〜約３・１０６の整数であり、
ｍは約０．００１ｎ〜約０．１ｎの整数であり、
カーボンナノチューブ表面ｃｍ２当たり約２・１０−１１ｍｏｌ〜約２・１０−９ｍｏｌの官能基Ｘが存在している）
で表される、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１２】
Ｘが、２つの異なる官能基Ｘ１及びＸ２であり、そして前記カーボンナノチューブが下記の式：
［Ｃｎ］−［Ｘ１ｍ１］［Ｘ２ｍ２］
（式中、ｍ１及びｍ２は、相互に独立し、約０．００１ｎ〜約０．１ｎの整数を示し、但し、Ｘ１又はＸ２少なくとも一方が、電荷を担持している基少なくとも１つを含むものとする）
で表されている、請求項１１に記載の複合体。
【請求項１３】
Ｘが、同一又は異なる、１又は数個の置換されたピロリジン環であり、但し、前記置換されたピロリジン環少なくとも１つが電荷を担持している基少なくとも１つによって置換されている、下記の一般式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、Ｒ及びＲ’は、相互に独立し、−Ｈ、又は式−Ｍ−Ｙ−（Ｚ）ａ−（Ｐ）ｂで表される基であり、ａは０又は１であり、そしてｂは０〜８の整数であり、好ましくは０、１又は２であり、Ｐは、ｂが１より大きい場合に同一又は異なる基であり、但し、Ｒ及びＲ’は同時に水素原子とすることはできないものであり、そして、
Ｍは、約１〜約１００原子のスペーサー基、例えば−（ＣＨ２）γ−又は−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）γ−ＣＨ２−ＣＨ２−を含む群から選択される基、γは１〜２０の整数であり、あてはまる場合には電荷を担持している基を含み、
Ｙは、ａ＝ｂ＝０の場合の反応基、例えば−ＯＨ、−ＮＨ３＋、−ＣＯＯ−、−ＳＨ、−ＣＨＯ、ケトン例えば−ＣＯＣＨ３＝、アジ化物、又はハロゲン化物を含む群から選択される基であり、あてはまる場合には電荷を担持している基を含み、
又は、ａ又はｂが０と異なる場合に、反応基から誘導され、例えば−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＣＯＯ−、−Ｓ−、−ＣＨ＝、−ＣＨ２−、−ＣＣｋＨ２ｋ＋１＝、ｋは１〜１０の整数であり、特には−ＣＣＨ３、又は−ＣＨＣｋＨ２ｋ＋１−であり、ｋは１〜１０の整数であり、特には−ＣＨＣＨ３−を含む群から選択される基であり、
Ｚは、リンカー基、例えばａ＝１、及びｂ＝０の場合に以下の式の１つの基であり、あてはまる場合には電荷を担持している基を含んでおり、Ｐ基少なくとも１つと結合する傾向があり、そして、必要な場合には前記Ｐ基を放出する傾向があり、
【化２】
ｑは、１〜１０の整数であり、又は、
ａ＝１、及びｂ＝１又は２の場合に、以下の式の１つで表され、
【化３】
ｑは、１〜１０の整数であり、
Ｐは、有効基であり、あてはまる場合には電荷を担持している基を含み、前記機能化カーボンナノチューブの分光検出を可能にし、フルオロフォア、例えばＦＩＴＣ、キレート剤、例えばＤＴＰＡ、又は生物学的作用を誘発する傾向がある活性分子、例えばアミノ酸、ペプチド、擬似ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、例えば酵素又は抗体、核酸、炭水化物又は薬であり、
あてはまる場合にはＹ、Ｚ、又はＰ基少なくとも１つを、キャッピング基、例えばＣＨ３ＣＯ−（アセチル）、メチル、エチル、ベンジルカルボニル、又は保護基、例えばメチル、エチル、ベンジル、ｔｅｒｔ−ブチル、トリチル、３−ニトロ−２−ピリジルサルフェニル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、トリメチルシリルエチルオキシカルボニル、フタルイミド、ジメチルアセタール、又は１，３−ジオキソランによって置換することができる）
の、請求項１１又は１２に記載の複合体。
【請求項１４】
Ｘは、２つの異なる置換されたピロリジン環であり、但し、前記ピロリジン環少なくとも１つを、電荷を担持している基少なくとも１つによって置換されるものとする、以下の一般式（Ｉ’）：
【化４】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、Ｒ１及びＲ２は、異なっており、そして相互に独立し、−Ｈ、又は式−Ｍ−Ｙ−（Ｚ）ａ−（Ｐ）ｂの基であり、Ｍ、Ｙ、Ｚ、Ｐ、ａ及びｂは、請求項１３と同じ意味であり、Ｒ１及びＲ２少なくとも１つが電荷を担持している基を含んでいる）
の、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１５】
複合体が、以下の一般式（ＩＩ）：
【化５】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、Ａは荷電分子であり、そしてＲは、式−Ｍ−Ｗ基であり、そして、
Ｍは、約１〜約１００原子のスペーサー基、例えば−（ＣＨ２）γ−、又は−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）γ−ＣＨ２−ＣＨ２−を含む群から選択される基であり、γは１〜０の整数であり、
Ｗは、約１〜約４００原子の電荷を担持している基、例えば−ＮＨ３＋、又は−ＣＯＯ−である）
で表されることを特徴とする、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１６】
複合体が、以下の一般式（ＩＩ’）：
【化６】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、Ａは、荷電分子であり、そして
Ｒ１は、−Ｍ−Ｙ−（Ｚ）ａ−（Ｐ）ｂ基であり、Ｍ、Ｙ、Ｚ、Ｐ、ａ及びｂは、請求項１１と同じ意味であり、特にＲ１は、フルオロフォアを担持している基であり、そして
Ｒ２は、式−Ｍ−Ｗ基であり、Ｗは約１〜約４００原子の電荷を担持している基、例えば、−ＮＨ３＋、又は−ＣＯＯ−である）
で表されることを特徴とする、請求項１４に記載の複合体。
【請求項１７】
前記荷電分子が、
２〜１０６のヌクレオチドを含む核酸、例えばＲＮＡ又はＤＮＡ、特にはプラスミド又は人工染色体、
２〜５０００、好ましくは５０〜５０００のアミノ酸を含むペプチド、ポリペプチド又はタンパク質、
炭水化物、特には正電荷の炭水化物、例えばグルコサミン又はキトサン、
放射性核種、及び
細胞毒の分子を含む群から選択されている、請求項３〜１６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１８】
複合体が、以下の式：
【化７】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、そしてＡは、荷電分子であり、負電荷少なくとも１つを含む、例えばＤＮＡである）
で表されることを特徴とする、請求項３〜１７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１９】
複合体が、以下の式：
【化８】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、そしてＡは、荷電分子を示し、負電荷少なくとも１つを含む、例えばＤＮＡである）
で表されることを特徴とする、請求項３〜１７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２０】
複合体が、以下の式：
【化９】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、そしてＡは、正電荷少なくとも１つを含む荷電分子である）
で表されることを特徴とする、請求項３〜１７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２１】
複合体が、以下の式：
【化１０】
（式中、Ｔは、カーボンナノチューブであり、そしてＡは、正電荷少なくとも１つを含む荷電分子である）
で表されることを特徴とする、請求項３〜１７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２２】
荷電分子を細胞内に運ぶための、請求項３〜２１のいずれか一項に記載の複合体の使用。
【請求項２３】
薬剤学的に許容可能な担体と共に、複合体、例えば請求項３〜２１のいずれか１項と同じ意味である複合体を、活性物質として含む、医薬組成物。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２００８−５０１６１５（Ｐ２００８−５０１６１５Ａ）
【公表日】平成２０年１月２４日（２００８．１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２６２６８（Ｐ２００７−５２６２６８）
【出願日】平成１７年６月６日（２００５．６．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００６０３６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１２１７９９
【国際公開日】平成１７年１２月２２日（２００５．１２．２２）
【出願人】（５０５４０９２４７）サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェ シアンティフィク (16)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【出願人】（５０６４１０３２７）ユニバーシティ オブ ロンドン，ザ スクール オブ ファーマシー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＬＯＮＤＯＮ，ＴＨＥ ＳＣＨＯＯＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ
【出願人】（５０６４１１２０９）ウニヴェルシタ デリ ストゥディ ディ トリエステ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡ ＤＥＧＬＩ ＳＴＵＤＩ ＤＩ ＴＲＩＥＳＴＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月２４日（２００８．１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月６日（２００５．６．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００６０３６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１２１７９９
【国際公開日】平成１７年１２月２２日（２００５．１２．２２）
【出願人】（５０５４０９２４７）サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェ シアンティフィク (16)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【出願人】（５０６４１０３２７）ユニバーシティ オブ ロンドン，ザ スクール オブ ファーマシー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＬＯＮＤＯＮ，ＴＨＥ ＳＣＨＯＯＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ
【出願人】（５０６４１１２０９）ウニヴェルシタ デリ ストゥディ ディ トリエステ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡ ＤＥＧＬＩ ＳＴＵＤＩ ＤＩ ＴＲＩＥＳＴＥ
【Ｆターム（参考）】
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