キメラ第ＶＩＩ因子分子
本発明は、キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドおよびそれを使用する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[優先権の主張]
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下に、その内容全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとする、２００９年６月２５日出願の米国特許仮出願第６１／２２０，２７８号の優先権を主張する。
【０００２】
[政府支援の言明]
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された認可番号５−Ｐ０１−ＨＬ０６３５０の下での政府支援を得て為された。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、現在使用可能な第ＶＩＩ因子ポリペプチドよりも高い凝固活性を有し、血栓合併症がより少ないキメラヒト凝固第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチド、ならびにかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物、該ポリヌクレオチドを含み、これを発現するベクターおよび宿主細胞、医薬組成物、使用および治療の方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
血液凝固は、最終的にフィブリン血餅を生じさせる、様々な血液成分（または因子）の複雑な相互作用からなるプロセスである。一般に、凝固「カスケード」と称されてきたものに関与する血液成分は、アクチベータ（これ自体は活性化された凝固因子である）の作用によってタンパク質分解酵素に変換される、酵素的に不活性なタンパク質（プロ酵素またはチモーゲン）である。かかる変換を受けた凝固因子は、一般に「活性因子」と称され、凝固因子の名称に「ａ」の文字を付加することによって表される（例えば活性化第ＶＩＩ因子は第ＶＩＩａ因子またはＦＶＩＩａと表される）。
【０００５】
通常、止血プロセスの開始は、組織因子と第ＶＩＩａ因子との間の複合体の形成によって媒介される。この複合体は、次に、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）および第Ｘ因子（ＦＸ）をそれらの活性型に変換する。第Ｘａ因子（ＦＸａ）は、組織因子担持細胞上で限られた量のプロトロンビンをトロンビンに変換する。トロンビンは血小板を活性化し、第Ｖ因子（ＦＶ）および第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を第Ｖａ因子（ＦＶａ）および第ＶＩＩＩａ因子（ＦＶＩＩＩａ）へと活性化して、これらの両補因子がさらなるプロセスにおいて完全なトロンビンバーストを導く。このプロセスは、第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）（第ＶＩＩＩａ因子との複合体として）による第Ｘａ因子の産生を含み、活性化された血小板の表面上で起こる。トロンビンは、最終的にフィブリノーゲンをフィブリンへと変換し、フィブリン血餅の形成をもたらす。近年、第ＶＩＩ因子および組織因子が血液凝固の主たるイニシエータであることが見出された。
【０００６】
第ＶＩＩ因子は、一本鎖チモーゲンとして血液中を循環する血漿糖タンパク質である。チモーゲンは最小限の触媒活性を有する。一本鎖第ＶＩＩ因子は、インビトロで第Ｘａ因子、第ＸＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第ＶＩＩａ因子またはトロンビンによって二本鎖第ＶＩＩａ因子に変換され得る。第Ｘａ因子は第ＶＩＩ因子の主要な生理的アクチベータであると考えられている。止血に関与するいくつかの他の血漿タンパク質と同様に、第ＶＩＩ因子はその活性に関してビタミンＫに依存し、該活性は該タンパク質のアミノ末端に近接してクラスタ形成している複数のグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化のために必要である。これらのγ−カルボキシル化されたグルタミン酸は、リン脂質と第ＶＩＩ因子との金属イオン誘導性相互作用に必要とされる。チモーゲン第ＶＩＩ因子の活性化二本鎖分子への変換は、内部のＡｒｇ１５２−Ｉｌｅ１５３ペプチド結合の切断によって生じる。加えて、高濃度の第ＶＩＩ因子がインビトロで自己活性化を導くことは公知である。組織因子、リン脂質およびカルシウムイオンの存在下で、二本鎖第ＶＩＩａ因子は、限定的なタンパク質分解によって第Ｘ因子または第ＩＸ因子を速やかに活性化する。
【０００７】
ヒトＦＶＩＩ（ｈＦＶＩＩ）をコードする遺伝子は、第１３番染色体のｑ３４−ｑｔｅｒ９にマッピングされている（ｄｅ Ｇｒｏｕｃｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８４；６６：２３０−２３３）。この遺伝子は９個のエクソンを含み、１２．８Ｋｂにわたる（Ｏ’Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８７；８４：５１５８−５１６２）。ＦＶＩＩの遺伝子構成およびタンパク質構造は他のビタミンＫ依存性プロ凝固タンパク質のものに類似し、エクソン１ａおよび１ｂはシグナル配列をコードし、エクソン２はプロペプチドおよびＧＬＡドメイン、エクソン３は短い疎水性領域、エクソン４および５は上皮増殖因子様ドメイン、ならびにエクソン６から８はセリンプロテアーゼ触媒ドメインをコードする（Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８５；２４：３７３６−３７５０）。
【０００８】
第ＩＸ因子（クリスマス因子）は、正常な止血において活性なセリンプロテアーゼのチモーゲンであり、その酵素活性は特定のグルタミン酸残基のカルボキシル化を必要とする。第ＩＸ、Ｘ、ＶＩＩ因子およびプロテインＣは、同じファミリーのセリンプロテアーゼの密接に関連するパラログであり、これらのタンパク質をコードする遺伝子の高い度合のアミノ酸配列同一性およびイントロン−エクソン配置を有する。これらの密接に関連するタンパク質は、アミノ末端からカルボキシル末端までの機能性ドメインの類似構造を有し、γ−カルボキシグルタミン酸（ＧＬＡ）ドメイン、２つの上皮増殖因子様（ＥＧＦ）ドメイン、活性化ペプチドおよび触媒ドメインを含む。プロテインＳは、６６６アミノ酸の、ＧＬＡドメイン、４つのＥＧＦ様ドメイン、トロンビン感受性領域および２つのラミニンドメインを有するビタミンＫ依存性タンパク質である。
【０００９】
ビタミンＫ依存性凝固血漿タンパク質は、膜へのタンパク質結合の部位として機能するＧＬＡドメインを含み、ＧＬＡドメインは様々な凝固タンパク質の間で高度に保存されている。それらの類似性にもかかわらず、ＧＬＡドメインはリン脂質に対して広い範囲の親和性を示し、プロテインＳのＧＬＡドメインがリン脂質に対して最も高い親和性を有する（Ｅｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８；３７：７９９７−８００３）、（ＭｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９７；３６：５１２０−２７）。
【００１０】
被験体において凝固カスケードを刺激するまたは改善することがしばしば望ましい。第ＶＩＩａ因子は、凝固因子欠損症（例えば血友病ＡおよびＢまたは凝固第ＸＩ因子もしくは第ＶＩＩ因子の欠損）または凝固因子インヒビターなどのいくつかの原因を有する出血性疾患を管理するために使用されてきた。第ＶＩＩａ因子はまた、正常に機能する血液凝固カスケードを有する（凝固因子欠損、または凝固因子のいずれかに対するインヒビターを有さない）被験体において生じる過剰の出血を制御するためにも使用されてきた。かかる出血は、例えば、血小板機能欠損、血小板減少症またはフォン・ヴィレブランド病によって引き起こされ得る。
【００１１】
出血はまた、手術および他の形態の外傷に関連する重大な問題である。例えば、第ＶＩＩ因子はイラクおよびアフガニスタンで負傷した兵士を治療するために広く使用された（Ｐｅｒｋｉｎｓ ＪＧ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｕｍａ．２００７；６２：１０９５−９；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ９−１０１）。その使用は多くの命を救ったことで高い評価を得ているが、大部分の医学的治療に関しては、治療後の脳卒中または他の血栓事象などの副作用が存在する。しかし、ＦＶＩＩａを使用する医師の全体的な印象は、その使用はそのために失われた命よりも多くの命を救ってきたというものである。おそらく、このことを最もよく表しているのは、過去の戦争において負傷者の約３０％が損傷のために死亡しているのに対し、現在の湾岸戦争ではその数が約１０％に減少したことである（Ｇａｗａｎｄｅ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００４；３５１：２４７１−５）。
【００１２】
第ＶＩＩａ因子を発現するトランスジェニック血友病Ｂマウスの試験は、低レベル（１．５μｇ／ｍｌ未満）の持続的な第ＶＩＩａ因子発現が血友病Ｂマウスにおいて凝固活性を回復させることを明らかにした。しかし、野生型または血友病Ｂマウスでの２μｇ／ｍｌを上回る第ＶＩＩａ因子レベルは、心臓および肺における血栓症を導いた。心臓および肺はどちらも、組織因子の高発現部位である。これは、循環中の高レベルの第ＶＩＩａ因子は、心臓および肺の血管損傷後に暴露される組織因子に接触した場合血栓症を誘発することを示唆する（Ｍａｒｇａｒｉｔａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００４；１１３：１０２５−３１）。さらに、血友病のイヌにおけるベクターを介したイヌ第ＶＩＩａ因子の遺伝子導入が、短期および中期的に安全かつ有効であることが試験で示された（Ｍａｒｇａｒｉｔａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００９；１１３：３６８２−３６８９）。
【００１３】
第ＶＩＩ因子による治療に関する警告が、現在、規制認可を求める製品について提案されている。例えば、欧州医薬品庁、人体用医薬品評価ユニット（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ，Ｈｕｍａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ）は、現在の第ＶＩＩ因子治療には、特に第ＶＩＩ因子が冠状動脈性心疾患または肝疾患の病歴を有する患者、術後患者、新生児ならびに血栓症および播種性血管内凝固症候群の危険性がある患者に投与される状況では、血栓症および播種性血管内凝固症候群の危険性の警告を付すことを推奨している。例えば、２００４年７月のＣｏｒｅ ＳＰＣ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＣＰＭＰ／ＢＰＷＧ／２０４８／０１）参照。
【００１４】
これまでに、第ＶＩＩａ因子のＥＧＦ−１ドメインが組織因子に対する第ＶＩＩａ因子の親和性に重要な役割を果たすことが示されている。組織因子の存在下および不存在下の両方で、合成基質と第Ｘ因子の両方を使用して、第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインを有する第ＶＩＩａ因子ポリペプチドは野生型第ＶＩＩａ因子よりも低い触媒活性を有していた（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９，２８：１１８５−９２）。一見したところ、これは出血を治療するためのキメラ構築物の使用を排除すると思われる。しかし、Ｍｏｎｒｏｅ（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ １９９７；９９：５４２−５４９）は、血友病および出血を治療するうえでのＦＶＩＩａの機構は組織因子非依存性であると提案した。しかし、第ＶＩＩａ因子が組織因子とは独立して活性でないかどうかに関しては当技術分野で見解が分かれる。
【００１５】
ヒト組換えＦＶＩＩａの市販製剤は、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）ＲＴとして販売されている。ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）ＲＴは、血友病ＡまたはＢ患者における出血エピソードの治療に適用され、出血エピソードの治療のための市場で入手可能な唯一のｒＦＶＩＩａである。近年、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）が、第ＶＩＩ因子を損傷部位に局在化させるために組み合わせて投与できる、再水和された凍結乾燥血小板に結合し得ることが明らかにされた（Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ，２００８；１９：１８２−９１）。加えて、第ＶＩＩ因子の選択的なＰＥＧ化は血漿半減期を上昇させ得ること（Ｓｔｅｎｎｉｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ，２００８；１００：９２０−２８）および３個のアミノ酸置換を有する組換えヒト第ＶＩＩ因子は血小板の表面上で高い活性を有すること（Ｍｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，２００９；７：２９９−３０５）が示された。本発明のキメラ第ＶＩＩａ因子分子のＰＥＧ化は、同様に血漿半減期を上昇させるように働くと期待される。同じように、コンジュゲートを形成する非ポリペプチド部分の共有結合などの、当技術分野で知られているタンパク質の他の修飾、例えばグリコシル化は、本発明のキメラ第ＶＩＩａ因子分子において同様に機能すると期待され、すなわち非ポリペプチド部分の共有結合によってタンパク質に与えられる特性がキメラ第ＶＩＩａ因子分子に付与されると予想される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
利用可能な治療に結びつく、比較的低い用量で投与できる高い凝固活性を有する第ＶＩＩａ因子の変異体、および血栓合併症などの望ましくない副作用を生じさせることが少ない変異体が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本出願は、１以上の望ましい恩恵を提供する、キメラＦＶＩＩａ分子、特にｈＦＶＩＩａドメインと凝固系の１以上のタンパク質からのドメインを含むキメラｈＦＶＩＩａ分子を開示する。従って、本発明のキメラＦＶＩＩａ分子は、市販のｒＦＶＩＩａと比較して１以上の改善された特性を有し、かかる特性は、より高い凝固活性を有することおよび／または比較的低い用量で投与できることおよび／または血栓合併症を生じさせることがより少ないことを含む。その結果として、本発明のキメラによる医学的治療は、潜在的により低い用量および／またはより少ない望ましくない副作用などの、現在使用可能なｒＦＶＩＩａ化合物を上回る利点を提供する。
【００１８】
本発明の代表的なキメラＦＶＩＩａポリペプチドは、ＦＶＩＩのＥＧＦ−２および触媒ドメインと、ビタミンＫ依存性凝固タンパク質のＧＬＡドメインと、ビタミンＫ依存性凝固タンパク質のＥＧＦ−１ドメインとを含むキメラＦＶＩＩａを包含する。本発明の特定の実施形態では、本発明のキメラＦＶＩＩａポリペプチドは、１）ＦＩＸのＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインとＦＶＩＩのＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラＦＶＩＩａ、２）ＦＩＸのＥＧＦ−１ドメインとＦＶＩＩのＧＬＡ、ＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラＦＶＩＩａ、３）プロテインＳのＧＬＡドメインと、ＦＩＸのＥＧＦ−１ドメインと、ＦＶＩＩのＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラＦＶＩＩａ、４）プロテインＳのＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインとＦＶＩＩのＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラＦＶＩＩａ、５）プロテインＳのＥＧＦ−１ドメインとＦＶＩＩのＧＬＡ、ＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラＦＶＩＩａ、ならびに６）プロテインＳのＥＧＦ−１ドメインと、ＦＩＸのＧＬＡドメインと、ＦＶＩＩのＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラＦＶＩＩａを包含する。本発明の代表的なキメラＦＶＩＩａポリペプチドはまた、ＥＧＦ−１ドメインまたはＧＬＡドメイン内にアミノ酸置換を有する、野生型ＦＶＩＩａまたは上述したキメラＦＶＩＩａポリペプチドのいずれかを包含し得る。置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。かかる置換は、ＥＧＦ−１ドメインの残基６９のイソロイシンのアラニンによる置換および／または残基７９のアルギニンのアラニンによる置換を含み得る。さらなる置換は、ＧＬＡドメインにＩＶ型コラーゲンに対するより高い結合親和性をもたらすが、血小板結合には影響を及ぼさないと思われる、残基５のリシンのアルギニンによる置換（Ｇｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．２００９；７：１８４３−１８５１）、残基３０６のメチオニンの別のアミノ酸による置換、好ましくは保存的アミノ酸置換、より好ましくは、組織因子に対する親和性をさらに低下させるアラニンによる置換、ならびにより高い比活性を有する第ＶＩＩａ因子を生じさせる、残基１５８のバリンのアスパラギン酸による置換、残基２９６のグルタミン酸のバリンによる置換および／または残基２９８のメチオニンのグルタミンによる置換を含み得る。
【００１９】
また、本明細書で述べるキメラＦＶＩＩａポリペプチドの１以上を投与することにより、出血性疾患を有する被験体において該出血性疾患を治療する方法も提供される。出血性疾患を治療する方法は、本発明のキメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を被験体に投与する方法を含み得る。
【００２０】
加えて、本発明は、ＧＬＡドメインを含むタンパク質を投与することにより、出血性疾患を有する被験体において該出血性疾患を治療する方法を提供し、該タンパク質は、血餅の部位に標的されるおよび／または被験体の血漿中の循環タンパク質の濃度に比べて血餅の部位付近で濃縮されている。これは、血餅形成部位でまたはその付近で認められる、現在使用可能な第ＶＩＩ因子ポリペプチドよりも高い親和性で血小板に結合するドメインを使用することを含み得る。かかるドメインの例は、血小板の表面に位置する負に荷電したリン脂質層に結合する様々な凝固タンパク質のＧＬＡドメインである。かかるＧＬＡドメインの非限定的な例は、ＦＶＩＩａのＧＬＡドメインよりもはるかに密接に血小板およびリン脂質に結合する、ＦＩＸのＧＬＡドメイン（Ｍｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．「Ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｉｎ ｚｙｍｏｇｅｎ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ」Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ １２：２３７−２４３（２００１））ならびに任意の他の公知のＧＬＡドメインよりも密接にリン脂質に結合する、プロテインＳのＧＬＡドメイン（ＭｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｔａｃｔ ｓｉｔｅ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：３６：５１２０−５１２７（１９９７））を含む。ＧＬＡドメインを含むタンパク質の非限定的な例は、ＦＩＸもしくはプロテインＳのＧＬＡドメインを含む組換えタンパク質、ＦＩＸもしくはプロテインＳのＧＬＡドメインを含むキメラタンパク質、および／またはＦＩＸもしくはプロテインＳのＧＬＡドメインを含む本発明のキメラＦＶＩＩａポリペプチドを包含する。
【００２１】
もう１つの実施形態では、本発明は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドに由来する触媒ドメインおよび１以上の血小板標的ドメインを含む本発明のキメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドを投与することにより、出血性疾患を有する被験体を治療する方法を提供する。かかる血小板標的ドメインは、血小板の表面と相互作用するまたは結合するタンパク質からのドメインを含む。血小板の表面とのかかる相互作用または表面への結合は、血小板の膜リン脂質を通してまたは血小板細胞表面タンパク質および／もしくは受容体を通して媒介され得る。かかるドメインの非限定的な例は、血小板糖タンパク質Ｉｂについての主要結合部位である、フォン・ヴィレブランド因子のＡ１ドメイン（Ｅｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ，２７３：１０３９６−１０４０１（１９９８））ならびに血小板膜タンパク質および／または受容体に結合する抗体、例えば血小板膜リン脂質に結合する抗体のＦａｂフラグメント（ドメイン）（Ｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，７７：２６５５−２６５９（１９９１））を含む。
【００２２】
血小板に結合し、組織因子に対して低い親和性を有するドメインを使用した、血餅部位への凝固タンパク質のかかる標的化は、血栓形成性などの、現在の第ＶＩＩ因子療法に関連する合併症の危険度を低下させるという付加的な、しかし予想外の利益を有する。このアプローチはまた、他の治療上有用なポリペプチドまたは他の分子を血小板または血餅部位に標的するためにも使用できる。かかる治療上有用な分子は、抗凝固剤等を含み得る。
【００２３】
本発明はさらに、第ＶＩＩ因子の血栓形成性に比べて低い血栓形成性（例えば、天然第ＶＩＩ因子の血栓形成性と比較して少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％低い等）を有するポリペプチドを被験体に投与することにより、出血性疾患を有する被験体において該出血性疾患を治療する方法を提供する。「低い血栓形成性」は、当技術分野で知られている方法に従って様々なやり方で、例えば、対照と比較して、血餅の測定数がより少ない、血餅がより小さい、血餅が生じるのにより長い時間を要する（インビボまたはインビトロアッセイにおいて）、血栓形成による被験体の死亡がより少ないおよび／または生存期間が長いことを含むが、これらに限定されない方法で測定できる。第ＶＩＩ因子と比較して低い血栓形成性を有するポリペプチドは、例えば、本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドまたはその活性フラグメントであり得る。かかるポリペプチドの非限定的な例は、ＦＩＸのＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインとＦＶＩＩのＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラＦＶＩＩａ、ならびにプロテインＳのＧＬＡドメインと、ＦＩＸのＥＧＦ−１ドメインと、ＦＶＩＩのＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラＦＶＩＩａを包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本発明において有用なキメラＦＶＩＩａ分子の図式的表示を示す。ＦＶＩＩ：第ＶＩＩ因子、ＦＩＸ：第ＩＸ因子。
【図２】図２は、様々な濃度の野生型第ＶＩＩａ因子についての血友病の細胞モデル系における正常条件および血友病条件（第ＩＸ因子および第ＶＩＩＩ因子の除去）でのトロンビン産生（ｎＭ）を示す。
【図３】図３は、５０ｎＭの野生型第ＶＩＩａ因子または１０ｎＭのキメラ第ＶＩＩａ因子を投与した血友病の細胞モデル系における正常条件および血友病条件（第ＩＸ因子および第ＶＩＩＩ因子の除去）でのトロンビン産生（ｎＭ）を示す。
【図４】図４は、５０ｎＭの野生型第ＶＩＩａ因子または１０ｎＭのキメラ第ＶＩＩａ因子の投与後の血友病の細胞モデル系において産生される、対照値と比較した、ピークトロンビンを示す。
【図５】図５は、処置していない血友病Ｂマウス、２ｍｇ／ｋｇのＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を投与した血友病Ｂマウス、２ｍｇ／ｋｇのキメラＦＶＩＩａ分子を投与した血友病Ｂマウスおよび処置していない野生型マウスについての凝固アッセイにおける崩壊止血時間（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ｔｉｍｅ）を示す。
【図６】図６は、シグナル、プロペプチド、第ＩＸ因子のＧＬＡおよびＥＧＦ１ドメイン（下線）を含む、本発明の例示的なキメラ第ＶＩＩ因子の配列（配列番号：１）を示す。
【図７】図７は、シグナル、プロペプチドおよび第ＩＸ因子のＥＧＦ１ドメイン（下線）およびプロテインＳのＧＬＡドメイン（太字）を含む、本発明の例示的なキメラ第ＶＩＩ因子の配列（配列番号：２）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明を以下でより詳細に説明する。しかし本発明は、種々の形態で具体化でき、本明細書で述べる実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、この開示が詳細かつ完全となり、当業者に本発明の範囲を十分に伝えるために提供されるものである。
【００２６】
本明細書で本発明の説明において使用される用語は、特定の実施形態を説明することだけを目的とし、本発明の限定を意図されない。本発明の説明および付随の特許請求の範囲において使用される、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形態は、文脈によって明確に指示されない限り、複数形態も包含することが意図されている。
【００２７】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての用語（技術および学術用語を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。一般的に使用される辞書において定義されるもののような用語は、本出願および関連技術分野におけるそれらの意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、本明細書において明白に定義されない限り理想的なまたは過度に正式な意味に解釈されるべきではないことがさらに了解される。本明細書で本発明の説明において使用される用語は、特定の実施形態を説明することを目的とし、本発明の限定を意図されない。本明細書で言及するすべての出版物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【００２８】
また本明細書で使用される、「および／または」は、関連して列挙される項目の１以上のありとあらゆる可能な組合せ、ならびに選択的に解釈される場合（「または」）は組合せの欠如を指し、これらを包含する。
【００２９】
文脈によって特に指示されない限り、本明細書で述べる本発明の様々な特徴は任意の組合せで使用できることが明確に意図されている。
【００３０】
さらに、本発明はまた、本発明の一部の実施形態では、本明細書で述べる任意の特徴または特徴の組合せが排除または除外され得ることを企図する。例示すると、明細書において複合体が成分Ａ、ＢおよびＣを含むと記述される場合、Ａ、ＢまたはＣのいずれかまたはそれらの組合せが、単独でまたは任意の組合せで除外され、排除され得ることが明確に意図されている。
【００３１】
本明細書で使用される、「〜から実質的になる」という移行句（および文法的変形）は、列挙される物質または段階ならびに特許請求される本発明の「基本的なおよび新規の特徴に実質的に影響を及ぼさないもの」を包含すると解釈されるべきである。Ｉｎ ｒｅ Ｈｅｒｚ，５３７ Ｆ．２ｄ ５４９，５５１−５２，１９０ Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｑ．４６１，４６３（ＣＣＰＡ １９７６）（原文での強調）参照、ＭＰＥＰ §２１１１．０３も参照のこと。従って、本明細書で使用される「〜から実質的になる」という用語は、「含む」と等価であると解釈されるべきではない。
【００３２】
量または濃度等のような測定可能な値に言及する場合に本明細書で使用される、「約」という用語は、特定される量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％またはさらに０．１％の変動を包含することが意図されている。
【００３３】
本明細書で使用される「活性」という用語は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドがその基質である第Ｘ因子を活性な第Ｘａ因子に変換する能力を意味する。
【００３４】
「固有活性」という用語はまた、組織因子の不存在下に活性化血小板の表面でトロンビンを産生する能力も包含する。
【００３５】
「Ｎ末端ＧＬＡドメイン」という用語は、配列番号：１８のアミノ酸配列の約アミノ酸残基６１から約アミノ酸残基１０５までのアミノ酸配列、配列番号：１９のアミノ酸配列の約アミノ酸残基４７から約アミノ酸残基９２までのアミノ酸配列、同定されたアミノ酸配列への任意の翻訳後修飾、同定されたアミノ酸配列における任意の保存的アミノ酸置換、同定されたアミノ酸配列へのアミノ酸残基の付加、同定されたアミノ酸配列からのアミノ酸残基の欠失、またはリン脂質膜に結合する凝固カスケードタンパク質からの任意の他のアミノ酸配列を包含する。
【００３６】
「ＥＧＦ−１」という用語は、ジスルフィド結合１〜３、２〜４および５〜６を含むほとんどすべての公知のＥＧＦ様ドメインを含む、ＥＧＦ（上皮増殖因子）中ならびにまた細胞シグナル伝達および凝固タンパク質に関与する一連のタンパク質中でもともと認められる６個のシステインを含む３０〜４０アミノ酸の領域を表す。第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−１ドメインは、配列番号：１８のアミノ酸配列の約アミノ酸残基１０６から約アミノ酸残基１４２までである。第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインは、配列番号：１９のアミノ酸配列の約アミノ酸残基９３から約アミノ酸残基１２９までである。プロテインＳのＥＧＦ−１ドメインは、配列番号：２０のアミノ酸配列の約アミノ酸残基１１７から約アミノ酸残基１５５までである。これらのアミノ酸配列は、同定されたアミノ酸配列への任意の翻訳後修飾、同定されたアミノ酸配列における任意の保存的アミノ酸置換、同定されたアミノ酸配列へのアミノ酸残基の任意の付加および／または同定されたアミノ酸配列からのアミノ酸残基の任意の欠失を含み得る。
【００３７】
「ＥＧＦ−２」という用語は、（２またはそれ以上のＥＧＦ様ドメインの）一続きにおける２番目のＥＧＦ様ドメインを意味する。第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２ドメインは、配列番号：１８のアミノ酸配列の約アミノ酸残基１４７から約アミノ酸残基１８８までである。第ＩＸ因子のＥＧＦ−２ドメインは、配列番号：１９のアミノ酸配列の約アミノ酸残基１３０から約アミノ酸残基１７１までである。プロテインＳのＥＧＦ−２ドメインは、配列番号：２０のアミノ酸配列の約アミノ酸残基１５７から約アミノ酸残基２００までである。これらのアミノ酸配列は、同定されたアミノ酸配列への任意の翻訳後修飾、同定されたアミノ酸配列における任意の保存的アミノ酸置換、同定されたアミノ酸配列へのアミノ酸残基の付加および／または同定されたアミノ酸配列からのアミノ酸残基の任意の欠失を含み得る。
【００３８】
本明細書で使用される「触媒ドメイン」という用語は、ペプチド結合の切断を媒介するタンパク質中のドメインを意味する。第ＶＩＩ因子の触媒ドメインは、配列番号：１８のアミノ酸配列の約アミノ酸残基２１３から約アミノ酸残基４５２までである。第ＩＸ因子の触媒ドメインは、配列番号：１９のアミノ酸配列の約アミノ酸残基２２７から約アミノ酸残基４５９までである。これらのアミノ酸配列は、同定されたアミノ酸配列への任意の翻訳後修飾、同定されたアミノ酸配列における任意の保存的アミノ酸置換、同定されたアミノ酸配列へのアミノ酸残基の任意の付加および／または同定されたアミノ酸配列からのアミノ酸残基の任意の欠失を含み得る。
【００３９】
「ＧＬＡ」という３文字表記は４−カルボキシグルタミン酸（γ−カルボキシグルタミン酸）を意味する。
【００４０】
「プロテアーゼドメイン」という用語は、一般に配列番号：１８の約アミノ酸残基２１３からカルボキシ末端アミノ酸残基までとみなされる、ペプチド結合の切断を媒介するタンパク質中のドメインを意味する（第ＶＩＩａ因子の重鎖）。本明細書で使用される「第ＶＩＩ因子ポリペプチド」という用語は、天然ヒト第ＶＩＩ因子のアミノ酸配列６１〜４６６（配列番号：１８）を含む任意のタンパク質またはその変異体もしくはフラグメントを意味する。これは、ヒト第ＶＩＩ因子、ヒト第ＶＩＩａ因子およびそれらの変異体を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される「第ＶＩＩ因子」という用語は、不活性な一本鎖チモーゲン第ＶＩＩ因子分子ならびに活性化二本鎖第ＶＩＩ因子分子（第ＶＩＩａ因子）を含むことが意図されている。これは、天然ヒト第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子のアミノ酸配列６１〜４６６（配列番号：１８）を有するタンパク質を包含する。当業者は、小さな配列変化は同様に機能すると予想されること、ならびに関与するドメイン、ポリペプチドおよび第ＶＩＩ因子は、本発明から逸脱することなくわずかに短縮もしくは伸長され得るまたは置換を含み得ることを認識する。従って、この定義はまた、わずかに修飾されたアミノ酸配列、例えばＮ末端アミノ酸欠失または付加を含む修飾されたＮ末端を有するタンパク質およびペプチドも包含し、一部の実施形態ではそれらのタンパク質は第ＶＩＩａ因子の活性を実質的に保持する（例えば天然第ＶＩＩａ因子の活性の約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％等を保持する）。本明細書で使用される「第ＶＩＩａ因子」または「ＦＶＩＩａ」という用語は、活性化形態（第ＶＩＩａ因子）からなる生成物を意味する。上記定義内の「第ＶＩＩ因子」または「第ＶＩＩａ因子」はまた、個体によって存在し、生じ得る天然の対立遺伝子変異も包含する。また、グリコシル化または他の翻訳後修飾の程度と位置は、発現の選択される宿主細胞、組織または動物種および宿主の細胞または組織環境の性質に依存して異なり得る。
【００４１】
本明細書で使用される「ドメイン」という用語は、タンパク質鎖の残りの部分とは独立して進化し、機能し、存在し得るタンパク質配列および構造の一部を包含することが意図されている。ドメインはコンパクトな三次元構造を形成することができ、しばしば独立して安定化され、折りたたまれ得る。１つのドメインが様々な進化的に関連するタンパク質中に出現し得る。ドメインの長さは、約２５アミノ酸から約５００アミノ酸長までにわたる。「ドメイン」はまた、単数または複数のアミノ酸残基が保存的置換によって置き換えられた野生型タンパク質からのドメインも包含し得る。それらはタンパク質媒質中で自己安定性であるので、ドメインは、キメラタンパク質を作製するためにあるタンパク質と別のタンパク質との間で遺伝子操作によって「交換」され得る。
【００４２】
本明細書で使用される「変異体（単数または複数）」という用語は、天然ヒト第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子のアミノ酸配列６１〜４６６（配列番号：１８）を有する第ＶＩＩ因子を表すことが意図され、ここで、親タンパク質の１もしくはそれ以上のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている、および／または、親タンパク質の１もしくはそれ以上のアミノ酸が欠失している、および／または、１もしくはそれ以上のアミノ酸がタンパク質に挿入されている、および／または、１もしくはそれ以上のアミノ酸が親タンパク質に付加されている、および／または、ＧＬＡドメインが異なるタンパク質からのＧＬＡドメイン（例えば血小板膜もしくはリン脂質膜に結合するＧＬＡドメイン）で置換されている、および／または、ＧＬＡドメインが異なるタンパク質からの血小板結合ドメイン（例えば血小板糖タンパク質Ｉｂについての主要結合部位である、フォン・ヴィレブランド因子のＡ１ドメイン（Ｅｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ，２７３：１０３９６−１０４０１（１９９８））ならびに血小板膜タンパク質および／もしくは受容体に結合する抗体、例えば血小板膜リン脂質に結合する抗体のＦａｂフラグメント（ドメイン）（Ｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，７７：２６５５−２６５９（１９９１））で置換されている、および／または、第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−１ドメインが異なるタンパク質からのＥＧＦ−１ドメイン（例えば第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインなどの、組織因子により低い親和性で結合するＥＧＦ−１ドメイン）で置換されている。かかる付加は、親タンパク質のＮ末端またはＣ末端またはその両方で、ならびに内部で生じ得る。従って、一部の実施形態では、本発明の「変異体（単数または複数）」は、活性化形態のＦＶＩＩの凝固活性をまだ有し得る。一部の実施形態では、本発明の変異体（単数または複数）は凝固活性を有さなくてもよい。
【００４３】
従って、一部の実施形態では、変異体は、天然ヒト第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子のアミノ酸配列６１〜４６６（配列番号：１８）と少なくとも４０％、５０％、６０％または７０％同一である。例えば、ＦＶＩＩのＥＧＦ−１ドメインはＦＩＸのＥＧＦ−１ドメインと６５．７％の同一性を有し、ＦＶＩＩのＧＬＡドメインはＦＩＸのＧＬＡドメインと５８．６％の同一性およびプロテインＳのＧＬＡドメインと５１％の同一性を有する。１つの実施形態では、変異体は、天然ヒト第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子のアミノ酸配列６１〜４６６（配列番号：１８）と少なくとも８０％同一である。もう１つの実施形態では、変異体は、天然ヒト第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子のアミノ酸配列６１〜４６６（配列番号：１８）と少なくとも９０％同一である。さらなる実施形態では、変異体は、天然ヒト第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子のアミノ酸配列６１〜４６６（配列番号：１８）と少なくとも９５％同一である。
【００４４】
本明細書で使用される「任意の他のアミノ酸」という用語は、その位置に天然に存在するアミノ酸とは異なる１つのアミノ酸を意味する。これは、ポリヌクレオチドによってコードされ得るアミノ酸を含むが、これに限定されない。好ましくは、異なるアミノ酸は天然Ｌ型であり、ポリヌクレオチドによってコードされ得る。具体的な例はＬ−システイン（Ｃｙｓ）である。
【００４５】
本明細書で使用される、「作動可能に連結された」という用語は、配列の正常な機能を果たすことができるような相互の立体配置での、酵素的連結または別の方法による２またはそれ以上のヌクレオチド配列の共有結合を指す。例えば、プレ配列または分泌リーダーをコードするヌクレオチド配列は、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。プロモータまたはエンハンサは、それが対象とする配列の転写に影響を及ぼす場合は、コード配列に作動可能に連結されている。リボソーム結合部位は、それが対象とするタンパク質またはペプチドへの翻訳を促進するように位置づけられている場合は、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結されている」とは、連結されているヌクレオチド配列が連続していることを意味し、分泌リーダーの場合は、連続しかつ読み枠内にあることを意味する。連結は、好都合な制限部位での結合によって最も容易に達成される。かかる部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを標準的な組換えＤＮＡ法と共に使用する。
【００４６】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、宿主細胞において増幅することができる任意の核酸実体を意味する。従って、ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、その複製が染色体の複製から独立している、染色体外実体として存在するベクター、例えばプラスミドであり得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入された場合、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。ベクターの選択は、それが導入される宿主細胞に依存することが多い。ベクターは、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスまたはコスミドベクターを含むが、これらに限定されない。ベクターは通常、複製起点および少なくとも１つの選択可能な遺伝子、すなわち容易に検出可能であるかまたはその存在が細胞増殖に必須である生成物をコードする遺伝子を含む。
【００４７】
本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、雑種細胞を含む、異種ＤＮＡがその中で発現され得る任意の細胞を意味する。典型的な宿主細胞は、昆虫細胞、酵母細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞およびＣＯＳ細胞などのヒト細胞を含む哺乳動物細胞を含むが、これらに限定されない。本発明を実施する場合、培養される宿主細胞は、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくは、限定されることなく、ＣＨＯ細胞株（例えばＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、ＣＯＳ−１細胞株（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞株およびＨＥＫ２９３細胞株（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３；Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２，１９７７）を含む、樹立哺乳動物細胞株である。適切なＢＨＫ細胞株は、本明細書中ではＢＨＫ ５７０細胞と称する、ｔｋ−ｔｓ１３ＢＨＫ細胞株である（Ｗａｅｃｈｔｅｒ ａｎｄ Ｂａｓｅｒｇａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：１１０６−１１１０，１９８２）。ＢＨＫ ５７０細胞株は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ １０３１４の下に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０から入手可能である。ｔｋ−ｔｓ１３ＢＨＫ細胞株も、アクセッション番号ＣＲＬ １６３２の下にＡＴＣＣから入手可能である。他の適切な細胞株は、限定されることなく、Ｒａｔ Ｈｅｐ Ｉ細胞（ラット肝細胞癌；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６００）、Ｒａｔ Ｈｅｐ ＩＩ細胞（ラット肝細胞癌；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５４８）、ＴＣＭＫ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １３９）、ヒト肺細胞（ＡＴＣＣ ＨＢ ８０６５）、ＮＣＴＣ １４６９細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９．１）およびＤＵＫＸ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０，１９８０）を含む。また、３Ｔ３細胞、ナマルバ細胞、骨髄腫細胞および骨髄腫細胞と他の細胞の融合物も有用である。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「適切な増殖培地」という用語は、細胞の増殖および本発明の第ＶＩＩ因子ポリペプチドをコードする核酸配列の発現のために必要な栄養素および他の成分を含む培地を意味する。
【００４９】
「コンジュゲート」（または交換可能に「コンジュゲート化ポリペプチド」）という用語は、１以上のポリペプチドの、ポリマー分子、親油性化合物、糖成分または有機誘導体化剤などの１以上の非ポリペプチド部分への共有結合によって形成される異種（複合体またはキメラという意味で）分子を示すことが意図されている。好ましくは、コンジュゲートは適切な濃度および条件で可溶性である、すなわち血液などの生理的液体に可溶性である。本発明のコンジュゲート化ポリペプチドの例は、グリコシル化および／またはＰＥＧ化ポリペプチドを含む。
【００５０】
「共有結合」という用語は、ポリペプチドと非ポリペプチド部分が互いに直接共有結合で連結されているか、または架橋、スペーサーもしくは単数もしくは複数の連結部分などの、単数もしくは複数の介在部分を介して互いに間接的に共有結合で連結されていることを意味する。「非コンジュゲート化ポリペプチド」という用語は、コンジュゲートのポリペプチド部分を指すために使用できる。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「非ポリペプチド部分」という用語は、本発明のポリペプチドの結合基にコンジュゲート化することができる分子を意味する。かかる分子の適切な例は、ポリマー分子、糖成分、親油性化合物または有機誘導体化剤を含む。本発明のコンジュゲートに関連して使用される場合、非ポリペプチド部分はポリペプチドの結合基を介してコンジュゲートのポリペプチド部分に連結されることが了解される。上記で説明したように、非ポリペプチド部分は、結合基に直接共有結合で連結され得るかまたは架橋、スペーサーもしくは単数もしくは複数の連結部分などの、単数もしくは複数の介在部分を介して間接的に結合基に共有結合で連結され得る。
【００５２】
「ポリマー分子」は、２またはそれ以上のモノマーの共有結合によって形成される分子であり、ポリマーがヒトアルブミンまたは別の豊富な血漿タンパク質である場合を除き、いずれのモノマーもアミノ酸残基ではない。「ポリマー」という用語は、「ポリマー分子」という用語と交換可能に使用できる。この用語は、インビトログリコシル化、すなわち、任意選択的に架橋剤を使用して、通常はポリペプチドの結合基に炭水化物分子を共有結合連結することを含む、インビトロで実施される合成的グリコシル化によって結合された炭水化物分子を包含することが意図されている。
【００５３】
Ｎ−グリコシル化またはＯ−グリコシル化（以下でさらに説明する）などのインビボでのグリコシル化によって結合された炭水化物分子を本明細書では「糖成分」と称する。コンジュゲート中のポリマー分子または糖成分などの非ポリペプチド部分の数が明白に示されている場合を除き、本発明で使用されるコンジュゲートまたは別のものに含まれる「非ポリペプチド部分」へのあらゆる言及は、ポリマー分子または糖成分などの１以上の非ポリペプチド部分への言及であるものとする。
【００５４】
「結合基」という用語は、ポリマー分子、親油性分子、糖成分または有機誘導体化剤などの非ポリペプチド部分に結合することができる、ポリペプチドの官能基、特にそのアミノ酸残基または炭水化物部分の官能基を示すことが意図されている。
【００５５】
インビボでのＮ−グリコシル化に関しては、「結合基」という用語は通常と異なるように使用され、Ｎ−グリコシル化部位（配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ／Ｃ［式中、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸残基であり、Ｎはアスパラギンであり、およびＳ／Ｔ／Ｃはセリン、トレオニンまたはシステインのいずれか、好ましくはセリンまたはトレオニン、最も好ましくはトレオニンである］を有する）を構成するアミノ酸残基を示す。Ｎ−グリコシル化部位のアスパラギン残基は、グリコシル化の間に糖成分が結合される残基であるが、かかる結合は、Ｎ−グリコシル化部位のその他のアミノ酸残基が存在しない限り達成され得ない。
【００５６】
従って、非ポリペプチド部分が糖成分であり、コンジュゲート化がＮ−グリコシル化によって行われる場合、対象とするポリペプチドのアミノ酸配列の変化に関連して使用される「非ポリペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基」という用語は、Ｎ−グリコシル化部位を構成する１以上のアミノ酸残基が、機能的Ｎ−グリコシル化部位がアミノ酸配列内に導入されるかまたは該配列から除去されるように変化していることを意味すると理解される。
【００５７】
本明細書において、「治療する」または「治療」という用語は、出血を阻止するまたは最小限に抑えることを目的とした、手術におけるような予想される出血の管理および／または予防、ならびに外傷または血友病患者のためのオンデマンド治療におけるような既に発生している出血の制御の両方を含むことが意図されている。従って本発明による第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの予防的投与は、「治療」の用語に包含される。
【００５８】
「出血エピソード」という用語は、制御されない、かつ過剰の出血を含むことが意図されている。出血エピソードは、手術および他の形態の組織損傷の両方に関して重大な問題であり得る。制御されない、かつ過剰の出血は、正常な凝固系を有する被験体および凝固または出血性疾患を有する被験体において起こり得る。
【００５９】
本明細書で使用される「出血性疾患」という用語は、出血として現れる、細胞、生理または分子起源の、先天性、後天性または誘導された何らかの欠損を反映する。例としては、凝固因子欠損症（例えば血友病ＡおよびＢまたは凝固第ＸＩもしくは第ＶＩＩ因子の欠損症）、凝固因子インヒビター、血小板機能欠損、血小板減少症、フォン・ヴィレブランド病、または手術もしくは外傷によって誘発される出血である。
【００６０】
過剰の出血はまた、正常に機能する血液凝固カスケードを有する（凝固因子欠損または凝固因子のいずれかに対するインヒビターを有さない）被験体においても発生し、血小板機能欠損、血小板減少症またはフォン・ヴィレブランド病によって引き起こされ得る。かかる場合、出血は血友病によって引き起こされる出血にたとえられることがあり、というのは、止血系が、血友病におけるように、欠如しているかまたは、重大な出血を引き起こす、必須の凝固「化合物」（血小板またはフォン・ヴィレブランド因子タンパク質など）の異常を有しているからである。手術または外傷に関連する広範囲の組織損傷を経験した被験体では、正常な止血機構が即時止血の必要性によって圧倒されることがあり、該被験体は、正常な止血機構にも関わらず出血を発現し得る。十分な止血を達成することは、外科的止血の可能性が限られる、脳、内耳領域および眼などの器官で出血が起こる場合にも問題である。同じ問題が、様々な器官（肝臓、肺、腫瘍組織、胃腸管）から生検を採取する過程ならびに腹腔鏡手術において生じ得る。これらすべての状況に共通するのは、外科的手術手技（縫合、クリップ等）によって止血を行うことの困難さであり、これはまた、出血が広汎性である場合（出血性胃炎および大量の子宮出血）にもあてはまる。急性かつ大量の出血は、抗凝固療法時に、与えられた治療によって不完全な止血が誘発された被験体においても起こり得る。かかる被験体は、抗凝固作用を速やかに中和しなければならない場合は外科的処置を必要とし得る。根治的恥骨後前立腺切除術は、限局性前立腺癌を有する被験体に対して一般的に実施される手技である。この手術は、重大な、時として大量の失血によってしばしば困難になる。前立腺切除術の間の多量の失血は、主として、外科的止血が容易にアクセスできない様々な密に血管形成された部位を伴い、大きな領域から広範な出血を生じさせ得る、複雑な解剖学的状況に関連する。また、脳内出血は脳卒中の最も治療が難しい形態であり、脳内出血後数時間以内に高い死亡率と血腫成長に結びつく。ｒＦＶＩＩａによる治療は、血腫の成長を制限し、死亡率を低下させ、９０日目の機能転帰を改善することができる。しかしながら、現在使用可能なｒＦＶＩＩａに関しては、血栓塞栓性有害事象の危険性が存在する。血栓形成性がより低い本発明のキメラ第ＶＩＩ因子分子は、脳卒中治療におけるこの問題を克服し得る。不十分な止血の場合に問題を引き起こし得るもう１つの状況は、正常な止血機構を有する被験体が血栓塞栓症を予防するために抗凝固療法を受ける場合である。かかる療法は、ヘパリン、他の形態のプロテオグリカン、ワルファリンまたは他の形態のビタミンＫアンタゴニストならびにアスピリンおよび他の血小板凝固阻害剤を含み得る。
【００６１】
本発明の１つの実施形態では、出血は血友病に関連する。もう１つの実施形態では、出血は、後天性インヒビターを有する血友病に関連する。もう１つの実施形態では、出血は血小板減少症に関連する。もう１つの実施形態では、出血はフォン・ヴィレブランド病に関連する。もう１つの実施形態では、出血は重症組織損傷に関連する。もう１つの実施形態では、出血は重度の外傷に関連する。もう１つの実施形態では、出血は手術に関連する。もう１つの実施形態では、出血は腹腔鏡手術に関連する。もう１つの実施形態では、出血は出血性胃炎に関連する。もう１つの実施形態では、出血は大量の子宮出血に関連する。もう１つの実施形態では、出血は、機械的止血の可能性が限られている器官で起こる。もう１つの実施形態では、出血は脳、内耳領域または眼において生じる。もう１つの実施形態では、出血は生検を採取する過程に関連する。もう１つの実施形態では、出血は抗凝固療法に関連する。
【００６２】
本明細書で使用される「被験体」という用語は、任意の動物、特にヒトなどの哺乳動物を意味することが意図され、適切な場合は、「患者」という用語と交換可能に使用され得る。
【００６３】
「正常な止血系の増強」という用語は、トロンビンを産生するまたは機能性血餅を生成する能力の改善を意味する。
【００６４】
「遺伝子治療」という用語は、遺伝子の外因性投与によって内因性遺伝子の発現を変化させる方法を指す。本明細書で使用される、「遺伝子治療」はまた、その必要のある個体の体細胞または幹細胞に、欠陥があるまたは欠如している遺伝子に対応する機能性遺伝子を導入することによる、欠陥タンパク質をコードする欠陥遺伝子の置換または欠如遺伝子の補充を指す。遺伝子治療は、分化した細胞または体性幹細胞を個体の体内から取り出し、続いて、ウイルスベクターを遺伝子送達ビヒクルとして用いて欠陥遺伝子の正常なコピーを外植された細胞に導入する、エクスビボ法によって実施され得る。加えて、インビボでの直接遺伝子導入技術は、治療効果を達成するために広範囲のウイルスベクター、リポソーム、タンパク質ＤＮＡ複合体または裸のＤＮＡを用いてインサイチューで個体の細胞に遺伝子導入することを可能にする。「遺伝子治療」という用語はまた、欠陥遺伝子またはタンパク質が欠陥でなかった場合に機能するはずであるのと実質的に同じように機能するポリヌクレオチドを、その必要のある個体の体細胞または幹細胞に導入することによる、欠陥タンパク質をコードする欠陥遺伝子の置換を指す。
【００６５】
本発明において、遺伝子治療は、本発明のキメラＦＶＩＩをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を被験体に投与することに関連して用いられる。従って、本発明は、本発明のキメラＦＶＩＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。かかる核酸分子は核酸構築物（例えばベクターまたはプラスミド）中に存在し得る。かかる核酸構築物は細胞中に存在し得る。さらに、本発明のキメラＦＶＩＩタンパク質を細胞に送達する方法が本明細書で提供され、該方法は、キメラＦＶＩＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を、該ヌクレオチド配列が細胞において発現されてキメラＦＶＩＩタンパク質を生成する条件下で細胞に導入することを含む。細胞は、被験体に導入される細胞であり得るおよび／または被験体において既に存在する細胞であり得る。
【００６６】
[キメラ第ＶＩＩ因子の作製]
本明細書で述べるキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、組換え核酸技術によって作製され得る。一般に、クローニングされた野生型第ＶＩＩ因子核酸配列を、所望タンパク質をコードするように修飾する。次に、この修飾された配列を発現ベクターに挿入し、今度はこの発現ベクターを宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトする。高等真核細胞、特に培養された哺乳動物細胞が宿主細胞として適切である。ヒト第ＶＩＩ因子についての完全なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が知られており（組換えヒト第ＶＩＩ因子のクローニングおよび発現が記載されている米国特許第４，７８４，９５０号、ならびにＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号Ｊ０２９３３およびＡＡＡ５１９８３ならびにＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０８７０９−１参照）、該アミノ酸配列を本明細書で配列番号：１８として示す。ウシ第ＶＩＩ因子配列は、Ｔａｋｅｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４８６８−１４８７２（１９８８））に記載されている。第ＩＸ因子についての完全なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が知られており（Ｄａｖｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ １９８２；７９：６４６１−６４６４；Ｊａｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８３；１１：２３２５−２３３５；およびＭｃＧｒａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８５；８２：２８４７−２８５１ならびにＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号Ｊ００１３６およびＡＡＡ９８７２６ならびにＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ００７４０参照）、該アミノ酸配列を本明細書で配列番号：１９として提供する。プロテインＳについても完全なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が知られており（Ｈｏｓｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８７；８４：３４９−３５３ならびにＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号Ｍ１５０３６およびＡＡＡ３６４７９ならびにＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０７２２５参照）、該アミノ酸配列を本明細書で配列番号：２０として提供する。他の凝固タンパク質についての完全なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列も知られており、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔを用いてまたはＮＣＢＩウエブページで見ることができる。
【００６７】
アミノ酸配列の変化は様々な技術によって達成され得る。核酸配列の修飾は、部位特異的突然変異誘発によって実施し得る。部位特異的突然変異誘発のための技術は当技術分野において公知であり、例えば、Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（ＤＮＡ ３：４７９−４８８，１９８４）または「Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｖｅｒｌａｐ」，Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ７７，１９８９，ｐｐ．６１−６８に記載されている。従って、第ＶＩＩ因子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を使用して、選択した変化を導入し得る。同様に、特異的なプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応を用いてＤＮＡ構築物を作製するための手順も当業者に公知である（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ参照）。加えて、本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、様々なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にユニーク制限部位を導入することによって作製でき、これを使用して、様々なポリペプチドのドメイン全体をコードするヌクレオチド配列のフラグメントを単離することができる。その後、これらの様々なヌクレオチド配列を組み換えて、本発明の様々なキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドを作製することができる。
【００６８】
例えば、ＧＬＡ、ＥＧＦ−１、ＥＧＦ−２および触媒ドメインを様々な凝固タンパク質の間で自由に交換し得るように、様々な凝固タンパク質をコードするヌクレオチド配列にユニーク制限部位を導入し得る。ＥＧＦ−１ドメインはＥＧＦ−２ドメインの周囲を自由に回転することができるが（Ｐｉｋｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９９；９６：８９２５−８９３０）、ＧＬＡドメインおよびＥＧＦ−１ドメインは、カルシウムが存在する場合は互いの周囲を自由に回転できない（Ｓｕｎｎｅｒｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９５；２：５０４−５０９）。この実施形態では、ＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインは同じ凝固タンパク質に由来し得るが、ＥＧＦ−２および触媒ドメインとは異なるタンパク質に由来し得る。従って、本発明のキメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドは、１つのドメインの少なくとも５０％が第ＶＩＩ因子ドメインであることを条件として、凝固タンパク質の任意のものに由来するドメインを含み得る。さらに、本発明のキメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドは、同じタンパク質または異なるタンパク質に由来するＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインを含み得る。
【００６９】
本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドをコードする核酸構築物は、適切には、例えば標準的な技術に従ってゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを作製し、合成オリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションによって様々なポリペプチドの全部または一部をコードするＤＮＡ配列をスクリーニングすることによって得られる、ゲノムまたはｃＤＮＡ起源のものであり得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ．Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９参照）。
【００７０】
キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドをコードする核酸構築物はまた、確立された標準的な方法、例えばＢｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２（１９８１），１８５９−１８６９によって述べられているホスホルアミダイト法またはＭａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ３（１９８４），８０１−８０５によって述べられている方法によって合成的に作製し得る。ホスホルアミダイト法によれば、例えば自動ＤＮＡ合成装置において、オリゴヌクレオチドを合成し、精製して、アニーリングし、連結して、適切なベクターにクローニングする。
【００７１】
さらに、核酸構築物は、標準的な技術に従って、核酸構築物全体の様々な部分に対応するフラグメントである、合成、ゲノムまたはｃＤＮＡ起源（適宜に）のフラグメントを連結することによって作製される、合成とゲノムの混合型、合成とｃＤＮＡ起源の混合型またはゲノムとｃＤＮＡ起源の混合型であり得る。
【００７２】
本発明によるキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドを作製する際に使用するためのＤＮＡ配列は、典型的には、適切な翻訳後プロセシング（例えばグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化）および宿主細胞からの分泌を得るために第ＶＩＩ因子のアミノ末端でプレプロポリペプチドをコードする。該プレプロポリペプチドは、第ＶＩＩ因子または別のビタミンＫ依存性血漿タンパク質、例えば第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロトロンビン、プロテインＣもしくはプロテインＳなどのものであり得る。当業者に認識されるように、付加的な修飾は、それらの修飾が凝固因子として働くタンパク質の能力を有意に損なわない場合は、キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドのアミノ酸配列において為され得る。
【００７３】
第ＶＩＩａ因子変異体を発現する際に使用するための発現ベクターは、クローニングされた遺伝子またはｃＤＮＡの転写を指令することができるプロモータを含む。培養された哺乳動物細胞における使用のための適切なプロモータは、ウイルスプロモータおよび細胞プロモータを含む。ウイルスプロモータは、ＳＶ４０プロモータ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４−８６４，１９８１）およびＣＭＶプロモータ（Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０，１９８５）を含む。特に適切なウイルスプロモータは、アデノウイルス２由来の主要後期プロモータである（Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１３０４−１３１９，１９８２）。もう１つの特に好ましいプロモータは、チャイニーズハムスター伸長因子１−α（ＣＨＥＦ１）プロモータである。細胞プロモータは、マウスκ遺伝子プロモータ（Ｂｅｒｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：７０４１−７０４５，１９８３）およびマウスＶＨプロモータ（Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３３：８５−９３，１９８３）を含む。特に適切な細胞プロモータは、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモータである（Ｐａｌｍｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２：８０９−８１４，１９８３）。発現ベクターはまた、プロモータから下流でかつキメラ第ＶＩＩ因子配列自体の挿入部位から上流に位置する一組のＲＮＡスプライス部位を含み得る。適切なＲＮＡスプライス部位は、アデノウイルスおよび／または免疫グロブリン遺伝子から得られ得る。また、挿入部位の下流に位置するポリアデニル化シグナルも発現ベクター中に含まれる。特に適切なポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０由来の早期または後期ポリアデニル化シグナル（Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ）、アデノウイルス５ Ｅｌｂ領域由来のポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター（ＤｅＮｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：３７１９−３７３０，１９８１）またはヒト第ＶＩＩ因子遺伝子もしくはウシ第ＶＩＩ因子遺伝子由来のポリアデニル化シグナルを含む。発現ベクターはまた、プロモータとＲＮＡスプライス部位の間に位置するアデノウイルス２の３分節リーダーなどの非コードウイルスリーダー配列、およびＳＶ４０エンハンサなどのエンハンサ配列も含み得る。
【００７４】
クローニングされたＤＮＡ配列を、例えばリン酸カルシウムを介したトランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １４：７２５−７３２，１９７８；Ｃｏｒｓａｒｏ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：６０３−６１６，１９８１；Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２ｄ：４５６−４６７，１９７３）または電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１：８４１−８４５，１９８２）によって、培養された哺乳動物細胞に導入する。外因性ＤＮＡを発現する細胞を同定し、選択するために、選択可能な表現型を付与する遺伝子（選択マーカー）を、一般に、対象とする遺伝子またはｃＤＮＡと共に細胞に導入する。適切な選択マーカーは、ネオマイシン、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を付与する遺伝子を含む。選択マーカーは、増幅可能な選択マーカーであり得る。適切な増幅可能選択マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）配列である。もう１つの適切な選択マーカーはヒスチジノールである。選択マーカーは、Ｔｈｉｌｌｙ（引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，ＭＡ）によって総説されている。当業者は、適切な選択マーカーを容易に選択することができる。
【００７５】
選択マーカーは、対象とする遺伝子と同時に別々のプラスミド上で細胞に導入され得るか、または同じプラスミド上で導入され得る。同じプラスミド上の場合、選択マーカーと対象遺伝子は異なるプロモータまたは同じプロモータの制御下にあってよく、後者の配置はジシストロニックメッセージを生成する。このタイプの構築物は当技術分野において知られている（例えば、Ｌｅｖｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｓｉｍｏｎｓｅｎ，米国特許第４，７１３，３３９号）。また、「担体ＤＮＡ」として知られている付加的なＤＮＡを、細胞に導入される混合物に添加することも好都合であり得る。
【００７６】
細胞はＤＮＡを取り込んだ後、適切な増殖培地において、典型的には１〜２日間増殖され、対象とする遺伝子の発現を開始する。細胞を培養するために使用する培地は、適切な添加物を含有する最小または複合培地などの、宿主細胞を増殖させるのに適した任意の従来培地であり得る。適切な培地は、商業的供給者から入手可能であるか、または公表されている配合（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログにおいて）に従って調製され得る。培地は当技術分野において知られている手順を用いて調製される（例えば、細菌および酵母に関する参考文献；Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｗ．ａｎｄ ＬａＳｕｒｅ，Ｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｍｏｒｅ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｕｎｇｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＣＡ， １９９１参照）。増殖培地は一般に、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、必須糖、ビタミン、塩、リン脂質、タンパク質および増殖因子を含有する。γ−カルボキシル化されたキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドの生成のためには、培地はビタミンＫを、好ましくは約０．１ｎｇ／ｍｌから約２０μｇ／ｍｌの濃度で含有する。次に薬剤選択を適用して、選択マーカーを安定に発現している細胞の増殖物を選択する。増幅可能な選択マーカーでトランスフェクトした細胞に関しては、増大したコピー数のクローン化配列を選択するために、薬剤濃度を高めてもよく、それによって発現レベルを上昇させ得る。次に、安定にトランスフェクトされた細胞のクローンを、所望のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドの発現に関してスクリーニングする。
【００７７】
適切な哺乳動物細胞株は、ＣＨＯ細胞株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、ＣＯＳ−１細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞株および２９３細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３；Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２，１９７７）を含む。適切なＢＨＫ細胞株は、本明細書中以下ではＢＨＫ５７０細胞と称する、ｔｋ．ｓｕｐ．−ｔｓ１３ ＢＨＫ細胞株である（Ｗａｅｃｈｔｅｒ ａｎｄ Ｂａｓｅｒｇａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：１１０６−１１１０，１９８２）。ＢＨＫ ５７０細胞株は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ １０３１４の下にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０８５２から入手可能である。ｔｋ−ｔｓ１３ＢＨＫ細胞株も、アクセッション番号ＣＲＬ １６３２の下にＡＴＣＣから入手可能である。加えて、Ｒａｔ Ｈｅｐ Ｉ細胞（ラット肝細胞癌；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６００）、Ｒａｔ Ｈｅｐ ＩＩ細胞（ラット肝細胞癌；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５４８）、ＴＣＭＫ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １３９）、ヒト肺細胞（ＡＴＣＣ ＨＢ ８０６５）、ＮＣＴＣ １４６９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９．１）およびＤＵＫＸ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０，１９８０）を含む、多くの他の細胞株を使用し得る。
【００７８】
本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、インビボでのポリペプチドの半減期を延長させるためにコンジュゲート化し得る。かかるコンジュゲート化は、キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドの投与頻度を低減する一方で、腎クリアランスを低下させ、インビボで存在する第ＶＩＩ因子の量を増加させ得る。適切なコンジュゲートおよびコンジュゲート化第ＶＩＩ因子ポリペプチドを作製する方法は、その全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとする、米国特許第７，４４２，５２４号に記載されている。
【００７９】
[トランスジェニック動物]
本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドを作製するためにトランスジェニック動物技術を使用し得る。宿主雌性哺乳動物の乳腺中でタンパク質を生成することが好ましい。乳腺中での発現およびその後の乳中への対象タンパクの分泌は、他の供給源からタンパク質を単離する際に遭遇する多くの困難を克服する。乳は容易に収集され、大量に入手可能であり、生化学的に広く特徴付けられている。さらに、主要な乳タンパク質は乳中に高濃度で存在する（典型的には約１〜１５ｇ／ｌ）。本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドはまた、宿主動物の尿中でも生成でき、これは、雄性と雌性の両方の動物が尿を生成することおよび単離のためには乳中よりも尿中の方が失われるタンパク質が少ないという点で乳中での生成よりも有利である。
【００８０】
本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドの供給源として乳を使用することを考慮する場合、商業的見地から、大量の乳算出量を有する種を宿主として用いることが明らかに好ましい。マウスおよびラットなどのより小さな動物も使用できる（および原理段階の証明においては好ましい）が、ブタ、ヤギ、ヒツジおよびウシを含むがこれらに限定されない、家畜哺乳動物を用いることが好ましい。ヒツジは、この種における遺伝子組換えの前歴、乳算出量、コストおよびヒツジの乳を収集するための装置が容易に利用可能であることなどの因子のために、特に好ましい（例えば、宿主の種の選択に影響を及ぼす因子の比較に関しては国際公開公報第ＷＯ８８／００２３９号参照）。イーストフリースランドシープ（Ｅａｓｔ Ｆｒｉｅｓｌａｎｄ ｓｈｅｅｐ）のような、酪農用に育種された宿主動物の品種を選択すること、または後日にトランスジェニック系統の交配によって搾乳用家畜を導入することが一般に望ましい。いずれの場合も、既知の、健康状態の良好な動物を使用すべきである。
【００８１】
乳腺における発現を得るために、乳タンパク質遺伝子由来の転写プロモータを使用する。乳タンパク質遺伝子は、カゼイン（米国特許第５，３０４，４８９号参照）、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミンおよび乳清酸性タンパク質をコードする遺伝子を含む。β−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）プロモータが適切である。ヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子の場合は、遺伝子の５’フランキング配列の少なくとも近位の４０６ｂｐの領域が一般的に使用されるが、β−ラクトグロブリン遺伝子の５’フランキングプロモータおよび非コード部分を包含する約４．２５ｋｂｐのＤＮＡセグメントなどの、約５ｋｂｐまでの５’フランキング配列のより大きな部分が適切である（Ｗｈｉｔｅｌａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８６：３１−３９（１９９２）参照）。他の種に由来するプロモータＤＮＡの同様のフラグメントも適切である。
【００８２】
尿における発現を得るために、尿路上皮特異的プロモータを使用する。例えば、ウロプラキン関連遺伝子の発現を駆動するプロモータが使用できる（例えば、その全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとする、米国特許第６，００１，６４６号参照）。
【００８３】
β−ラクトグロブリン遺伝子の他の領域も、発現される遺伝子のゲノム領域と同様に、構築物に組み込み得る。イントロンを欠く構築物は、例えば、かかるＤＮＡ配列を含むものと比較して十分に発現されないことが当技術分野で一般的に認められている（各々を引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：８３６−８４０（１９８８）；Ｐａｌｍｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４７８−４８２（１９９１）；Ｗｈｉｔｅｌａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．１：３−１３（１９９１）；国際公開公報第ＷＯ８９／０１３４３号；および国際公開公報第ＷＯ９１／０２３１８号参照）。これに関して、可能な場合は、対象とするタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子の天然イントロンの全部または一部を含むゲノム配列を使用することが一般に好ましく、従って、例えばβ−ラクトグロブリン遺伝子由来の、少なくともいくつかのイントロンをさらに含むことが好ましい。かかる領域の１つは、ヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子の３’非コード領域由来の、イントロンのスプライシングおよびＲＮＡのポリアデニル化を提供するＤＮＡセグメントである。遺伝子の天然３’非コード配列を置換した場合、このヒツジβ−ラクトグロブリンセグメントは、対象タンパク質またはポリペプチドの発現レベルを高めかつ安定化することができる。他の実施形態では、キメラ第ＶＩＩ因子配列の開始ＡＴＧの周囲の領域を、乳特異的タンパク質遺伝子由来の対応する配列で置換する。かかる置換は、発現を増強する推定上の組織特異的開始環境を提供する。キメラ第ＶＩＩ因子プレプロ配列全体および５’非コード配列を、例えばＢＬＧ遺伝子のもので置換することは好都合であるが、より小さな領域を置換してもよい。
【００８４】
トランスジェニック動物におけるキメラＦＶＩＩａポリペプチドの発現のために、キメラ第ＶＩＩａ因子をコードするＤＮＡセグメントを、発現ユニットを生成するためにその発現に必要とされる付加的なＤＮＡセグメントに作動可能に連結する。かかる付加的なセグメントは、上記で挙げたプロモータ、ならびにｍＲＮＡの転写およびポリアデニル化の終結をもたらす配列を含む。発現ユニットは、キメラ第ＶＩＩａ因子をコードするセグメントに作動可能に連結された分泌シグナル配列をコードするＤＮＡセグメントをさらに含む。この分泌シグナル配列は、天然第ＶＩＩ因子分泌シグナル配列であり得るかまたは乳タンパク質などの別のタンパク質のものであり得る（例えば、引用することにより本明細書の一部をなすものとする、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０（１９８６）；およびＭｅａｄｅ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８７３，３１６号参照）。
【００８５】
トランスジェニック動物に使用するための発現ユニットの構築は、キメラ第ＶＩＩ因子配列を、付加的なＤＮＡセグメントを含むプラスミドまたはファージベクターに挿入することによって好都合に実施されるが、発現ユニットは、基本的には任意の一連の連結によって構築され得る。乳タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを含むベクターを提供し、乳タンパク質についてのコード配列をキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドのもので置換して、それにより乳タンパク質遺伝子の発現制御配列を含む遺伝子融合物を生成することは特に好都合である。いずれの場合も、プラスミドまたは他のベクターへの発現ユニットのクローニングは、キメラ第ＶＩＩ因子配列の増幅を促進する。増幅は、好都合には細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））宿主細胞において実施され、従ってベクターは、典型的には細菌宿主細胞において機能性の複製起点および選択マーカーを含む。発現ユニットを、次に、選択した宿主種の受精卵（初期胚を含む）に導入する。異種ＤＮＡの導入は、マイクロインジェクション（例えば米国特許第４，８７３，１９１号）、レトロウイルス感染（Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１４６８−１４７４（１９８８））または胚性幹（ＥＳ）細胞を用いた部位指定組込み（Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：５３４−５３９（１９９２）によって総説されている）を含む、いくつかの経路の１つによって実施できる。該卵をその後、偽妊娠雌性動物の卵管または子宮に移植し、出産まで発育させる。生殖細胞系に導入されたＤＮＡを担持する子は、そのＤＮＡを正常なメンデルの様式で子孫に伝えることができ、トランスジェニック集団の発生を可能にする。トランスジェニック動物を作製するための一般的な手順は当技術分野において知られている（例えば、Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８６；Ｓｉｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１７９−１８３（１９８８）；Ｗａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．３２：６４５−６５１（１９８５）；Ｂｕｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１４０−１４３（１９９０）；Ｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：８３５−８３８（１９９１）；Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：８４４−８４７（１９９１）；Ｗａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４９：１１３−１２０（１９９２）；米国特許第４，８７３，１９１号；米国特許第４，８７３，３１６号；国際公開公報第ＷＯ８８／００２３９号、国際公開公報第ＷＯ９０／０５１８８号、国際公開公報第ＷＯ９２／１１７５７号；およびイギリス特許公開公報第ＧＢ８７／００４５８号参照）。外来性ＤＮＡ配列を哺乳動物およびそれらの生殖細胞に導入するための技術はマウスにおいて最初に開発された（例えば、Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：７３８０−７３８４（１９８０）；Ｇｏｒｄｏｎ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１４：１２４４−１２４６（１９８１）；Ｐａｌｍｉｔｅｒ ａｎｄ Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｃｅｌｌ ４１：３４３−３４５（１９８５）；Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４４３８−４４４２（１９８５）；およびＨｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．参照）。これらの技術は、その後、家畜種を含むより大きな動物に関する使用のために適合された（例えば国際公開公報第ＷＯ８８／００２３９号、国際公開公報第ＷＯ９０／０５１８８号および国際公開公報第ＷＯ９２／１１７５７号；ならびにＳｉｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１７９−１８３（１９８８）参照）。要約すると、トランスジェニックマウスまたは家畜の作製においてこれまでに使用された最も効率的な経路では、対象とするＤＮＡの数百の直鎖状分子を、確立された技術に従って受精卵の前核の１つに注入する。接合子の細胞質へのＤＮＡの注入も使用し得る。
【００８６】
トランスジェニック植物における生産も使用し得る。発現は、植物全体または塊茎などの特定の器官を対象とし得る（Ｈｉａｔｔ，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：４６９−４７９（１９９０）；Ｅｄｅｌｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．１２：４４９−４５３（１９９２）；Ｓｉｊｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２１７−２２１（１９９０）；および欧州特許第ＥＰ ０ ２５５ ３７８号参照）。
【００８７】
本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドの作製はまた、例えばウサギ網状赤血球溶解物、コムギ胚芽抽出物および大腸菌無細胞系等による、インビトロでの翻訳を介して達成され得る。インビトロ翻訳はまた、連鎖または共役させ得る。連鎖インビトロ翻訳は、バクテリオファージポリメラーゼでの転写、それに続くウサギ網状赤血球溶解物またはコムギ胚芽溶解物系での翻訳に基づく。共役インビトロ翻訳は大腸菌無細胞系に基づく。
【００８８】
[回収および活性化]
本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、細胞培養培地または乳から回収される。本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、当技術分野において知られている様々な方法によって精製でき、かかる方法は、クロマトグラフィ（例えばイオン交換、アフィニティ、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動法（例えば分取等電点電気泳動（ＩＥＦ）、示差溶解度（例えば硫安沈殿）または抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．−Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｌａｒｓ Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９参照）を含むが、これらに限定されない。さらなる精製は、高速液体クロマトグラフィなどの従来の化学的精製手段によって達成され得る。クエン酸バリウム沈殿を含む他の精製方法が当技術分野において知られており、本明細書で述べる新規キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドの精製に適用し得る（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，１９８２参照）。
【００８９】
治療目的には、本発明のキメラ第ＶＩＩ因子は実質的に純粋であることが好ましい。従って、本発明の１つの実施形態では、本発明の第ＶＩＩ因子変異体は、少なくとも約９０〜９５％の純度、好ましくは少なくとも約９８％の純度に精製される。純度は、例えばゲル電気泳動、アミノ末端のアミノ酸配列決定および逆相ＨＰＬＣによって評価し得る。
【００９０】
キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、二本鎖の形態に変換するためにその活性化部位で切断される。活性化は、Ｏｓｔｅｒｕｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１：２８５３−２８５７（１９７２）；Ｔｈｏｍａｓ，米国特許第４，４５６，５９１号；Ｈｅｄｎｅｒ ａｎｄ Ｋｉｓｉｅｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７１：１８３６−１８４１（１９８３）；またはＫｉｓｉｅｌ ａｎｄ Ｆｕｊｉｋａｗａ，Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．７３：２９−４２（１９８３）によって開示されているような、当技術分野で知られている手順に従って実施し得る。あるいは、キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドを濃縮し、正に荷電した表面または樹脂と接触させることによってキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドを活性化することができ、例えばＢｊｏｅｒｎ ｅｔ ａｌ．（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ，２６９ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９８６，ｐｐ．５６４−５６５）によって述べられているように、第ＶＩＩ因子をＭｏｎｏ Ｑ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）等のようなイオン交換クロマトグラフィカラムに通すことによって活性化し得る。キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドはまた、キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドの実質的に精製された製剤を含有する溶液を得、その溶液にアミン化合物、Ｃａ２＋を約５ｍＭ〜約５０ｍＭ（約１０ｍＭ〜約３０ｍＭなど）の最終濃度になるように添加して、溶液の最終ｐＨを約７．２〜８．６（約７．６〜約８．２など）に調整し、生じた活性化混合物を約２℃〜約２５℃で、少なくとも９０％のキメラＦＶＩＩポリペプチドをキメラＦＶＩＩａポリペプチドに変換するのに十分な時間インキュベートして、任意選択的に、活性化混合物からＦＶＩＩａを単離することによって溶液中で活性化し得る。生じた活性化キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドを、その後、以下のように製剤し、投与し得る。
【００９１】
[遺伝子治療]
本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドはまた、遺伝子治療によって出血性疾患を治療する方法においても使用し得る。本発明のこの実施形態では、本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、エクスビボでの導入またはインビボでの導入によって被験体の細胞に導入され得る核酸分子によってコードされる。
【００９２】
当技術分野で利用可能な遺伝子治療のための方法のいずれもが本発明に従って使用できる。例示的な方法を以下で述べる。遺伝子治療の方法の一般的な総説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １９９３，１２：４８８−５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ １９９１，３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１９９３，３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３，２６０：９２６−９３２；およびＭｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９３，６２：１９１−２１７；Ｍａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １９９３，１１：１５５−２１５参照。使用できる組換えＤＮＡ技術の当技術分野で一般的に知られている方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；およびｉｎ Ｃｈａｐｔｅｒｓ １２ ａｎｄ １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ；Ｃｏｌｏｓｉｍｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２０００；２９（２）：３１４−８，３２０−２，３２４に記載されている。
【００９３】
キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、適切なクローニングベクターに挿入し得る。遺伝子治療に適するベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルスおよびレトロウイルス、パルボウイルス、レンチウイルスなどのウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクターならびに様々な真核および原核生物宿主における発現に関して記述されている、遺伝子治療ならびに単純なタンパク質発現のために使用し得る当技術分野で典型的に使用される他の組換えビヒクルを含む。
【００９４】
１つの実施形態では、該ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクター、特にアデノウイルスベクターは、標的細胞のウイルス感染の効率を上昇させる、カチオン性脂質、ポリＬ−リシン（ＰＬＬ）およびジエチルアミノエチルデキストラン（ＤＥＬＡＥ−デキストラン）などのカチオン性両親媒物質と複合体形成することができる（例えば、引用することにより本明細書の一部をなすものとする、１９９７年１１月２０日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／２１４９６号参照）。本発明において使用するための適切なウイルスベクターは、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、ＡＡＶおよびレトロウイルス由来のベクターを含む。遺伝子治療におけるウイルスベクターの総説については、Ｍａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２００２；４１（１２）：９０１−１１；Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．２００２；１２ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ２３−９参照。
【００９５】
１つの実施形態では、コード配列および任意の他の所望配列がゲノム内の所望部位での相同的組換えを促進する領域によって隣接され、それによりゲノムに組み込まれた核酸分子からの構築物の発現を提供するベクターが使用される（各々その全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Ｋｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８９，８６：８９３２−８９３５；Ｚｉｊｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９８９，３４２：４３５−４３８；Ｚａｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．への米国特許第６，２４４，１１３号；およびＰａｔｉ ｅｔ ａｌ．への米国特許第６，２００，８１２号）。
【００９６】
患者へのベクターの送達は、患者をベクターもしくは送達複合体に直接暴露する直接的送達、または細胞を最初にインビトロにてベクターで形質転換し、その後患者に移植する間接的送達のいずれかであり得る。これら２つのアプローチは、それぞれインビボおよびエクスビボ遺伝子治療として知られている。
【００９７】
１つの実施形態では、ベクターをインビボで直接投与し、そこでベクターは被験体の細胞に進入して、遺伝子の発現を媒介する。これは、当技術分野で知られている数多くの方法および上記で論じた方法のいずれかによって、例えばそれを適切な発現ベクターの一部として構築し、例えば欠陥もしくは弱毒化レトロウイルスまたは他のウイルスベクターを用いた感染によって（例えば米国特許第４，９８０，２８６号参照）、または裸のＤＮＡの直接注入によって、または微粒子ボンバードメント（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用によって、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤でのコーティング、バイオポリマー（例えばポリ−β−１−６４−Ｎ−アセチルグルコサミン多糖；米国特許第５，６３５，４９３号参照）への封入、リポソーム、微粒子もしくはマイクロカプセルへの封入の使用によって、ペプチドもしくは核内に進入することが公知の他のリガンドに連結して投与することによって、または受容体媒介性エンドサイトーシスを受けるリガンドに連結して投与すること（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８７，６２：４４２９−４４３２）等によって、細胞内に組み込まれるように投与することによって実施できる。もう１つの実施形態では、リガンドが、エンドソームを崩壊させ、核酸がリソソーム分解を回避することを可能にする膜融合性ウイルスペプチド、または治療用ＤＮＡを細胞に導入するために使用できる、例えばアンテナペディア由来の、カチオン性１２量体ペプチドを含む、核酸−リガンド複合体を形成することができる（Ｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ２０００，２：３３９−４７参照）。さらにもう１つの実施形態では、特定の受容体を標的することにより、細胞特異的な取込みおよび発現のために核酸をインビボで標的することができる（例えば、国際公開公報第ＷＯ９２／０６１８０号、国際公開公報第ＷＯ９２／２２６３５号、国際公開公報第ＷＯ９２／２０３１６号および国際公開公報第ＷＯ９３／１４１８８号参照）。加えて、マグネトフェクションと称される技術を、ベクターを哺乳動物に送達するために使用し得る。この技術は、磁場の影響下で送達するためにベクターと超常磁性ナノ粒子を結合させる。この適用は、送達時間を短縮し、ベクターの有効性を高める（Ｓｃｈｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００２；９：１０２−９）。
【００９８】
１つの実施形態では、核酸は脂質担体を用いて投与し得る。細胞膜の通過を促進するために脂質担体を裸の核酸（例えばプラスミドＤＮＡ）と結合することができる。カチオン性、アニオン性または中性脂質がこのために使用できる。しかし、カチオン性脂質は、一般に負の電荷を有するＤＮＡとより良好に結合することが示されているため、適切である。カチオン性脂質はまた、プラスミドＤＮＡの細胞内送達を媒介することが示されている（Ｆｅｌｇｎｅｒ ａｎｄ Ｒｉｎｇｏｌｄ，Ｎａｔｕｒｅ １９８９；３３７：３８７）。マウスへのカチオン性脂質−プラスミド複合体の静脈内注射は、肺におけるＤＮＡの発現を生じさせることが示された（Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．１９８９；２９８：２７８）。また、Ｏｓａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９９６；８５（６）：６１２−６１８；Ｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １９９３；４：７８１−７８８；Ｓｅｎｉｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １９９１；１０７０：１７３−１７９）；Ｋａｂａｎｏｖ ａｎｄ Ｋａｂａｎｏｖ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１９９５；６：７−２０；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．１９９６；１３；Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１９９４；５：６４７−６５４；Ｂｅｈｒ，Ｊ−Ｐ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ １９９４；５：３８２−３８９；Ｗｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７；３６：３００８−３０１７；Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．への米国特許第５，９３９，４０１号；Ｓｃｈｅｕｌｅ ｅｔ ａｌ．への米国特許第６，３３１，５２４号も参照のこと。
【００９９】
代表的なカチオン性脂質は、例えば、その開示を引用することにより本明細書の一部をなすものとする、米国特許第５，２８３，１８５号および米国特許第５，７６７，０９９号に開示されているものを含む。１つの実施形態では、カチオン性脂質は、米国特許第５，７６７，０９９号に開示されているＮ４−スペルミンコレステリルカルバメート（ＧＬ−６７）である。さらなる適切な脂質は、Ｎ４−スペルミジンコレステリルカルバメート（ＧＬ−５３）および１−（Ｎ４−スペルミン）−２，３−ジラウリルグリセロールカルバメート（ＧＬ−８９）を含む。
【０１００】
ウイルスベクターのインビボでの投与に関して、ウイルスベクターおよびトランスフェクトされた細胞の免疫脱活性化を回避するために、適切な免疫抑制治療をウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクターと組み合わせて使用し得る。例えば、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）または抗ＣＤ４抗体などの免疫抑制性サイトカインが、ウイルスベクターに対する体液性または細胞性免疫応答をブロックするために投与し得る。それに関して、ごく少数の抗原を発現するように遺伝子操作されたウイルスベクターを用いることが好都合である。
【０１０１】
体細胞は、上述した方法のいずれかを用いて本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドをコードする構築物でエクスビボにて遺伝子操作し、個体に再移植し得る。この方法は、Ｓｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ．への国際公開公報第ＷＯ９３／０９２２２号において一般的に説明されている。加えて、この技術は、Ｐａｙｕｍｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐａｅｄ．ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｒｅｓ．２００２；４０３Ｓ：Ｓ２２８−Ｓ２４２に記載されている、細胞ベースの送達についての特許ＩｍＰＡＣＴ技術で使用される。かかる遺伝子治療系では、体細胞（例えば線維芽細胞、肝細胞または内皮細胞）を患者から取り出し、インビトロで培養して、治療対象の遺伝子でトランスフェクトし、特徴付けて、患者に再び導入する。一次細胞（個体または組織に由来し、継代の前に遺伝子操作された）および二次細胞（インビボでの導入の前にインビトロで継代した）の両方、ならびに当技術分野で知られている不死化細胞株を使用し得る。本発明の方法のために有用な体細胞は、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、血液の有形成分、筋肉細胞、培養できる他の体細胞および体細胞前駆体などの体細胞を含むが、これらに限定されない。１つの実施形態では、細胞は肝細胞である。
【０１０２】
本発明のキメラＦＶＩＩａポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および、任意選択的に、選択マーカーをコードする核酸を、受容者の一次または二次細胞におけるキメラＦＶＩＩａの発現のために必要な付加的配列と共に含む構築物を使用して、コードされた産物が生成される一次または二次細胞をトランスフェクトする。かかる構築物は、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、耳下腺炎ウイルスおよびポリオウイルスベクターなどの感染性ベクターを含むがこれらに限定されず、この目的に使用し得る。
【０１０３】
経皮送達は、ケラチノサイト、メラノサイトおよび樹状細胞を含む表皮の細胞型を用いた間接的導入に特に適する（Ｐｆｕｔｚｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ ２０００；９：２０６９−８３）。
【０１０４】
１つの実施形態では、遺伝子治療のためのベクターは、一本鎖自己相補性アデノ随伴ウイルスである。加えて、この自己相補性アデノ随伴ウイルスは、小さなトランスサイレチンプロモータ−エンハンサ、マウス微小ウイルスからのイントロンおよびウシ成長ホルモンからのポリアデニル化シグナルを含み得る。ベクターはまた、第ＶＩＩ因子を活性化形態、すなわち第ＶＩＩａ因子として分泌させる、Ｍａｒｇａｒｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．によって記述されたＲＫＲＲＫＲ配列も含み得る（Ｍａｒｇａｒｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２００４；１１３：１０２５−３１）。
【０１０５】
[投与および医薬組成物]
本発明によるキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、凝固因子欠損症（例えば血友病ＡおよびＢまたは凝固第ＸＩ因子もしくは第ＶＩＩ因子の欠損）または凝固因子インヒビターなどのいくつかの原因を有する出血性疾患を管理するために使用され得、あるいはそれらは、正常に機能する血液凝固カスケードを有する（凝固因子欠損または凝固因子のいずれかに対するインヒビターを有さない）被験体において生じる過剰の出血を制御するために使用され得る。出血は、血小板機能欠損、血小板減少症またはフォン・ヴィレブランド病によって引き起こされ得る。出血はまた、様々な刺激によって線維素溶解活性の上昇が誘発された被験体でも見られ得る。
【０１０６】
手術または外傷に関連する広範囲の組織損傷を経験した被験体では、正常な止血機構が即時止血の必要性によって圧倒されることがあり、該被験体は、正常な止血機構にも関わらず出血を発現し得る。十分な止血を達成することは、脳、内耳領域および眼などの器官で出血が起こる場合にも問題であり、また、発生源を同定することが困難である広汎性出血（出血性胃炎および大量の子宮出血）の場合にも問題であり得る。同じ問題が、様々な器官（肝臓、肺、腫瘍組織、胃腸管）から生検を採取する過程ならびに腹腔鏡手術において生じ得る。これらの状況は、外科的手術手技（縫合、クリップ等）によって止血を行うことが困難であるという共通点を有する。急性かつ大量の出血はまた、抗凝固療法時に、与えられた治療によって不完全な止血が誘発された被験体においても起こり得る。かかる被験体は、抗凝固作用を速やかに中和しなければならない場合は外科的処置を必要とし得る。不十分な止血の場合に問題を引き起こし得るもう１つの状況は、正常な止血機構を有する被験体が血栓塞栓症を予防するために抗凝固療法を受ける場合である。かかる療法は、ヘパリン、他の形態のプロテオグリカン、ワルファリンまたは他の形態のビタミンＫアンタゴニストならびにアスピリンおよび他の血小板凝固阻害剤を含み得る。
【０１０７】
計画的処置に関連する治療に関して、本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、典型的には処置を実施する前の約２４時間以内、およびその後７日間またはそれ以上投与される。凝固薬としての投与は、本明細書で述べる様々な経路によって実施できる。
【０１０８】
キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドの用量は、被験体の体重および状態の重症度に依存して、負荷用量および維持用量として７０ｋｇの被験体について約０．０５ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日、好ましくは約１ｍｇ／日〜約２００ｍｇ／日、より好ましくは約１０ｍｇ／日〜約１７５ｍｇ／日の範囲である。当業者は、所与の被験体および所与の状態についての最適用量を決定することができる。
【０１０９】
医薬組成物は、主として予防的および／または治療的処置のための非経口投与を意図される。好ましくは、医薬組成物は非経口的に、すなわち静脈内、皮下もしくは筋肉内経路で投与されるか、または持続的もしくはパルス注入によって投与され得る。あるいは、医薬組成物は、経口的、皮下的、静脈内、脳内、鼻内、経皮的、腹腔内、筋肉内、肺内、経膣的、経直腸的、眼内経路または任意の他の許容される方法を含むがこれらに限定されない、様々な方法での投与用に製剤され得る。
【０１１０】
非経口投与用の組成物は、医薬的に許容される担体、好ましくは水性担体と組み合わせた、好ましくはその中に溶解された、本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する。水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グリシン等のような、様々な水性担体を使用し得る。本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドはまた、メチオニンおよびスクロースなどの、安定性および保存を延長させる組成物と共に製剤化され得る。本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドはまた、損傷の部位への送達または標的化のためにリポソーム製剤に製剤することができる。リポソーム製剤は、例えば米国特許第４，８３７，０２８号、米国特許第４，５０１，７２８号および米国特許第４，９７５，２８２号において一般的に説明されている。組成物は、従来の公知の滅菌技術によって滅菌され得る。生じた水溶液を、使用のために包装し得るか、または無菌条件下でろ過し、凍結乾燥して、凍結乾燥製剤を投与の前に滅菌水溶液と組み合わせ得る。組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、張度調整剤等のような、生理的条件に近付けるために必要な医薬的に許容される補助物質、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等を含有し得る。組成物はまた、防腐剤、等張化剤、非イオン性界面活性剤または洗浄剤、抗酸化剤および／または他の種々の添加物も含有し得る。
【０１１１】
これらの製剤中のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドの濃度は広く異なり、すなわち約０．５重量％未満、通常は約１重量％またはそれ以下から約１５または２０重量％までにわたり得、選択される特定の投与方法に従い、主として液体の容量、粘度等によって選択される。従って、静脈内注入用の典型的な医薬組成物は、滅菌リンガー液２５０ｍｌおよびキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチド１０ｍｇを含有するように作製され得る。非経口的に投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、公知であるかまたは当業者に明らかであり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０）の中でより詳細に説明されている。
【０１１２】
本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与できる。治療適用では、組成物を、上述したように既に疾患に罹患している被験体に、疾患およびその合併症を治療する、緩和するまたは部分的に停止させるのに十分な量で投与する。これを達成するのに適切な量は、「治療有効量」と定義される。当業者に理解されるように、このために有効な量は、疾患または損傷の重症度ならびに被験体の体重および全身状態に依存する。しかし一般に、有効量は、７０ｋｇの被験体についてキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチド約０．０５ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日の範囲であり、キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチド約１．０ｍｇ／日〜約２００ｍｇ／日の用量がより一般的に使用される。
【０１１３】
本発明の物質は、一般に、重篤な疾患または損傷状態、すなわち生命を脅かすまたは潜在的に生命を脅かす状況において使用され得ることに留意しなければならない。かかる場合、外来性物質が最小限であることおよび一般にヒトにおいてヒト第ＶＩＩ因子の免疫原性がないことを考慮すると、実質的に過剰なこれらのキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチド組成物を投与することが可能であり、治療医師はこれを望ましいと考えるはずである。
【０１１４】
予防適用では、本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する組成物を、被験体自身の凝固能力を増強するために疾患状態または損傷を生じやすいまたはその危険性がある被験体に投与する。かかる量は、「予防有効量」と定義される。予防適用では、正確な量は、やはり被験体の健康状態と体重に依存するが、用量は一般に７０ｋｇの被験体について約０．０５ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日、より一般的には７０ｋｇの被験体について約１．０ｍｇ／日〜約２００ｍｇ／日の範囲である。
【０１１５】
組成物の単回または多回投与を、治療医師によって選択される用量レベルおよびパターンで実施し得る。毎日の維持レベルを必要とする通院被験体については、キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドを、例えば携帯ポンプシステムを用いた持続注入によって投与し得る。
【０１１６】
本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドはまた、徐放性または持続放出性製剤に製剤化し得る。徐放性または持続放出性製剤を製剤化する方法は当技術分野において知られており、ポリペプチドを含有する固体疎水性粒子の半透性マトリックスを含むが、これに限定されない。
【０１１７】
例えば局所適用などの、本発明のキメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの局所送達は、例えば、スプレー、灌流、二重バルーンカテーテル、ステントによって、人工血管またはステントに組み込んで、バルーンカテーテルを被覆するのに使用されるヒドロゲルによって、または他の広く確立された方法によって実施し得る。いずれの場合も、医薬組成物は、被験体を有効に治療するのに十分な量の第ＶＩＩ因子変異体を提供すべきである。
【０１１８】
以下の実施例は本発明を説明するために含まれるものである。以下の実施例の特定の態様を、本発明の実施において良好に機能するように発明者が見出したまたは企図した技術および手順に関して述べる。本開示および当技術分野の一般的な技術レベルに照らして、当業者は、以下の実施例が例示だけを意図し、本発明の範囲から逸脱することなく数多くの変更、修正および改変を用い得ることを認識する。
【０１１９】
[実施例１：キメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの構築および発現]
ヒト第ＶＩＩ因子およびヒト第ＩＸ因子の両方のｃＤＮＡを入手し、ドメイン交換を容易にするために以下のユニーク制限部位を導入した。
ＢｓｔＥＩＩ部位をＥＧＦ−１ドメインの５’末端に（第ＶＩＩ因子の残基４７〜４９、第ＩＸ因子の残基４８〜５０）、
ＳａｃＩ部位をＥＧＦ−１とＥＧＦ−２ドメインの接合部に（第ＶＩＩ因子の残基８２〜８３、第ＩＸ因子の残基８３〜８４）、
ＮｏｔＩ部位をＥＧＦ−２ドメインの３’末端に（第ＶＩＩ因子の残基１３５〜１３７、第ＩＸ因子の残基１３２〜１３４）導入した。
【０１２０】
第ＶＩＩ因子と第ＩＸ因子の間でドメインを交換するためのこれらの制限部位を用いて様々なキメラを構築し、図１に示している。同じかまたは同様の制限部位を使用して第ＶＩＩ因子とプロテインＳとの間でドメインを交換し得る。
【０１２１】
生じたキメラのアミノ酸配列を配列番号：１（第ＩＸ因子のシグナル、プロペプチド、ＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインと、第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメイン）および配列番号：２（第ＩＸ因子のシグナルおよびプロペプチドドメインと、プロテインＳのＧＬＡドメインと、第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインと、第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメイン）に示す。これらの組換えＤＮＡから選択したものを、哺乳動物細胞のトランスフェクションのために発現ベクターｐＣＭＶ５にサブクローニングした。
【０１２２】
生じた組換え構築物を、次に、ｐＳＶ２ｎｅｏおよびｐＣＭＶｈＧＣを用いて２９３ヒト腎細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）に同時トランスフェクトした。高レベルの各構築物を発現するクローンを選択し、先に述べられているようにスクリーニングした（Ｔｏｏｍｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１９１９８−１９２０２）。各々のスクリーニングしたクローンを、大規模生産のために９００ｃｍ２のローラーボトルに広げ、組換えタンパク質を、Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いた偽アフィニティクロマトグラフィ法、および、カルシウム勾配、次いでＮａＣｌ勾配での溶出によって精製した。
【０１２３】
[実施例２：第ＶＩＩａ因子ポリペプチドのトロンビン産生]
第ＶＩＩａ因子のトロンビン産生を、血友病のインビトロモデルを用いて測定した。単球を組織因子の供給源として使用し、不活性化血小板と、血漿濃度の第Ｖ、第ＶＩＩ、第ＩＸ、第ＶＩＩＩおよび第ＸＩ因子ならびに血漿濃度の抗トロンビンおよびＴＦＰＩを含有する合成血漿とを組み合わせた。第ＶＩＩＩおよび第ＩＸ因子を除外することによって血友病状態を作り出した。
【０１２４】
健常個体から血液４ｍｌを採取し、クエン酸ナトリウム管に入れて単球を調製した。血液を１５ｍｌ円錐管中のＡｃｃｕ−Ｐｒｅｐ（商標）リンパ球分離培地（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＮＹ，ＵＳＡ）３ｍｌの上に注意深く層状に重ね、１５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。次に単核層を取り出し、４℃で等容量のＶｅｒｓｅｎｅ（Ｌｉｎｅｂｅｒｇｅｒ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ）に添加して、８００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。生じたペレットを４℃でＶｅｒｓｅｎｅ ５ｍｌに再懸濁し、８００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。生じたペレットを、５００ｎｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ，ＵＳＡ）を添加したマクロファージＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）４ｍｌに再懸濁し、細胞を９６ウェルプレートに２００μｌ／ウェルで播種した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートし、次にマクロファージＳＦＭ培地で３回洗浄して、その後一晩インキュベートした。
【０１２５】
健常個体から血液４ｍｌを採取し、クエン酸ナトリウム管に入れて血小板を調製した。血液を、１５ｍｌ円錐管中のＡｃｃｕ−Ｐｒｅｐ（商標）リンパ球分離培地（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＮＹ，ＵＳＡ）５ｍｌの上に、注意深く層状に重ね、１５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。次に血小板層を取り出し、等容量のクエン酸−グルコース−食塩水および１０μｇ／ｍｌのプロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ，ＵＳＡ）に添加して、８００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。生じたペレットを廃棄し、１ｍｇ／ｍｌオボアルブミンを添加したカルシウム不含タイロード緩衝液中でセファロースゲルろ過によって血漿タンパク質から血小板を単離した。回収した血小板を３７℃で保存した。
【０１２６】
血友病を模倣するインビトロアッセイのための合成血漿を、５μｇ／ｍｌの濃度の第ＸＩ因子Ｃ−１エステラーゼインヒビターを使用して、あらかじめ調製しておいた単球と共に１時間インキュベートした後、２００μｇ／ｍｌの抗トロンビン、０．０７μｇ／ｍｌのＴＦＰＩ、１００ｍｇ／ｍｌのプロトロンビン、８μｇ／ｍｌの第Ｘ因子および０．５μｇ／ｍｌの第ＶＩＩ因子を添加して作製した。一晩インキュベートした後、第Ｖ因子を７μｇ／ｍｌの濃度で添加した。正常条件については、１時間インキュベートした後、第ＩＸ因子を４μｇ／ｍｌの濃度で添加し、一晩インキュベートした後、第ＶＩＩＩ因子を１Ｕ／ｍｌで添加した。
【０１２７】
血小板２６０μｌを上記合成血漿溶液に添加し、生じた懸濁液を単球に添加して反応を開始させた。一定の時間間隔で試料１０μｌを取り出し、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５ｍＭ Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（Ｃｅｎｔｅｒｃｈｅｍ Ｉｎｃ．，ＣＴ，ＵＳＡ）を含有するトロンビンアッセイ緩衝液９０μｌに添加した。５０％酢酸１００μｌを添加して合成基質切断を停止させ、４０５ｎｍでＯＤを測定した。以下の式を用いてトロンビン濃度を決定した。
［トロンビン］＝希釈×（（Ａ４０５−バックグラウンド）／（停止−開始））／（変換係数）
式中、変換係数が１ｎＭである場合、トロンビンは４０５ｎｍで０．０１１７ＯＤ／分の変化量を与える。
【０１２８】
正常条件（第ＶＩＩＩおよび第ＩＸ因子を含む）でのトロンビン産生は、短い遅滞期でピークトロンビン産生を示す（図２）。野生型第ＶＩＩａ因子の濃度上昇は、血友病条件でのトロンビン産生を改善した（図２）。
【０１２９】
[実施例３：キメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドのトロンビン産生]
実施例１で作製したキメラタンパク質のトロンビン産生を、実施例２で述べた血友病のインビトロモデルを用いて測定した。１０ｎＭの、第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインと第ＩＸ因子のＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインとを含むキメラ第ＶＩＩａ因子、または第ＶＩＩ因子のＧＬＡ、ＥＧＦ−２および触媒ドメインと第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインとを含むキメラ第ＶＩＩａ因子の添加は、５０ｎＭの野生型第ＶＩＩａ因子と同様の活性を有していた（図３）。
【０１３０】
対照と比較してピークトロンビン産生を検討すると、野生型第ＶＩＩａ因子または試験したキメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドのいずれもが、対照レベルまでのピークトロンビン産生を回復していなかった。しかし、１０ｎＭの、第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインと第ＩＸ因子のＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインとを含むキメラ第ＶＩＩａ因子、または第ＶＩＩ因子のＧＬＡ、ＥＧＦ−２および触媒ドメインと第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインとを含むキメラ第ＶＩＩａ因子は、５０ｎＭの野生型第ＶＩＩａ因子によって産生されるのと同様のレベルまでピークトロンビン産生を回復していた（図４）。
【０１３１】
[実施例４：キメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの凝固アッセイ]
キメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの凝固活性を、Ｂｕｙｕｅ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｂｌｏｏｄ，１１２：３２３４−３２４１によって述べられているように、凝固アッセイにおいてインビボで評価した。簡単に述べると、第ＶＩＩ因子を、脚の静脈に挿入したカテーテルを介して、血友病Ｂマウスに投与した（２ｍｇ／ｋｇのＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）、２ｍｇ／ｋｇの、第ＩＸ因子のＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインと第ＶＩＩａ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラ第ＶＩＩａ因子、または１．４ｍｇ／ｋｇの、プロテインＳのＧＬＡドメインと、第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインと、第ＶＩＩａ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラ第ＶＩＩａ因子）。野生型マウスを対照として使用した。マウスを麻酔し、他方の脚の伏在静脈を、小さなゲージの針を押し通すことによって離断した。次に鋏の先端を静脈に挿入し、小さな杯を作製するように鋏で切って遠位部分を切断した。血餅を形成させ、出血が停止するまでの時間を記録した。次に３０ゲージの針を用いて血餅を除去し、出血が停止するまでの時間を再び記録した。この工程を３０分間反復した。血餅の数を崩壊の数として記録した。記録した時間を平均し、平均時間として記録した。実験を、野生型マウス、ならびに、プロテインＳのＧＬＡドメインと第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインと第ＶＩＩａ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラ第ＶＩＩａ因子について１匹のマウスで実施した。第ＩＸ因子のＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインと第ＶＩＩａ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラ第ＶＩＩａ因子については、２匹の血友病Ｂマウスで実験を実施し、同じ結果を得た。第ＶＩＩ因子を投与しなかった血友病Ｂマウスに関して、以下の表１において記録した０．２５の崩壊は、４匹のマウスのうち１匹だけが初期損傷で出血しなかったことを示す。
【０１３２】
【表１】
【０１３３】
処置を行わなかった１匹の血友病Ｂマウス、２ｍｇ／ｋｇのＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を投与した１匹の血友病Ｂマウス、２ｍｇ／ｋｇの、第ＩＸ因子のＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインと第ＶＩＩａ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラ第ＶＩＩａ因子を投与した１匹の血友病Ｂマウスならびに処置を行わなかった１匹の野生型マウスに関して実験を反復した。２ｍｇ／ｋｇの、第ＩＸ因子のＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインと第ＶＩＩａ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラ第ＶＩＩａ因子を投与した血友病Ｂマウスは、２ｍｇ／ｋｇのＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を投与した血友病Ｂマウスおよび野生型マウスよりも出血の停止までの平均時間がより短かった（図５）。
【０１３４】
[実施例５：キメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの血栓形成性]
本発明のキメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの血栓形成性を、高レベルのこれらのタンパク質を発現するマウスモデルにおいて試験することができる。近年、２μｇ／ｍｌ以上の組換え野生型マウス第ＶＩＩａ因子を発現するマウスの５０％が１６か月以内に血栓症で死亡することが示された。同様のレベルの第ＶＩＩａ因子を発現する血友病Ｂマウスは同じ死亡率を有し、マウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス系統に戻し交配した場合、はるかに早期に（４か月未満）血栓症が起こった（Ａｌｊａｍａｌｉ ＭＮ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００８；１１８：１８２５−１８３４）。
【０１３５】
２〜１０μｇまたはそれ以上のキメラポリペプチドを発現する血友病Ｂマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統）を作製することができ、キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドの発現が血栓症を引き起こす場合、これらのマウスは早期に（４か月未満）血栓症を発現するはずである。
【０１３６】
ＵＮＣにおけるｔｈｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ＣｅｎｔｅｒのＤｒ．Ｐａｕｌ Ｍｏｎａｈａｎによって開発された新しい自己相補性アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）を使用することによってマウス系統を開発し得る（Ｗｕ Ｚ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００８；１６：２８０−２８９）。このベクターは、小さなトランスサイレチンプロモータ−エンハンサ（ＴＴＲプロモータ）、マウスの微小ウイルスからのイントロン、ＭＶＭおよびウシ成長ホルモンｐＡシグナルを含む。このベクターに基づく、１×１０１１のベクターゲノムの門脈への注入は、感染から８週間以内に７μｇ／ｍｌの第ＩＸ因子の持続的発現を生じさせた（Ｗｕ Ｚ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００８；１６：２８０−２８９）。
【０１３７】
マウスおよびヒトの両方の第ＶＩＩａ因子ならびに本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドのｃＤＮＡを、血栓形成性を評価するために使用し得る。第ＶＩＩ因子を活性化形態、すなわち第ＶＩＩａ因子として分泌させる、Ｍａｒｇａｒｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．によって記述されたＲＫＲＲＫＲ（配列番号：２１）配列も使用し得る（Ｍａｒｇａｒｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２００４；１１３：１０２５−３１）。
【０１３８】
この仮説を検証するため、野生型およびキメラ第ＶＩＩ因子マウスポリペプチドを作製することができる。マウス組織因子はヒト第ＶＩＩ因子と反応しないことが報告されているので、組織因子は外傷において投与される第ＶＩＩａ因子の作用とは無関係であるが、血栓症に関係することを明らかにするためにマウスポリペプチドを使用する。この仮説を検証するために使用できるマウスポリペプチドは、野生型マウス第ＶＩＩ因子（配列番号：３）、ポリペプチドを二本鎖の活性形態（ＦＶＩＩａ）で分泌させるＲＫＲＲＫＲ配列を有する野生型マウス第ＶＩＩ因子（配列番号：４）、マウス第ＩＸ因子のシグナル、プロペプチド、ＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインと第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインならびにＲＫＲＲＫＲ配列（配列番号：５）、ならびにマウス第ＩＸ因子のシグナルおよびプロペプチドドメイン、プロテインＳのＧＬＡドメイン、第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインと第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインならびにＲＫＲＲＫＲ配列（配列番号：６）を包含する。キメラマウス第ＶＩＩ因子ポリペプチド（配列番号：５および配列番号：６）は、組織因子に対して低い親和性を有し（おそらく野生型ＦＶＩＩ分子と比較して１００倍低い）、これは望ましくない血栓症を予防するのに十分なはずである。
【０１３９】
キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドはまた、組織因子に対する親和性をさらに低減するように付加的に修飾し得る。かかる突然変異の一例は、残基３０６のメチオニンをアラニンに変更することである。第ＶＩＩａ因子のより高い比活性を生じさせるキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドの他の修飾も含み得る。かかる修飾の例は、ヒト配列の残基１５８、２９６および２９８に対する以下の等価物、Ｖ１５８Ｄ、Ｅ２９６ＶおよびＭ２９８Ｑを含む。
【０１４０】
上述した野生型およびキメラマウス第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、マウス第ＶＩＩ因子ｃＤＮＡを鋳型として使用し、様々なドメインを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを用い、次いで、この構築物をｐＳＣ−ＴＴＲ−ｍｖｍベクターに挿入することによって構築でき、該構築は、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００８；１６：２８０−２８９に記載されている。具体的には、野生型マウス第ＶＩＩ因子は、以下のプライマー、５’−ＴＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＴＣＣＡＣＡＧＧＣＧＣＡＴＧＧＧＣＴ−３’（配列番号：７）および５’−ＴＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＡＣＡＧＴＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣ−３’（配列番号：８）を使用してマウス第ＶＩＩ因子ｃＤＮＡから増幅できる。次に、増幅したフラグメントをＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩで消化し、ＢｇｌＩＩ／ＳｐｈＩ部位の間でｐＳＣ−ＴＴＲ−ｍｖｍベクターに挿入し得る。その後、ＢＧＨポリアデニル化配列を、生じたベクターにＳｐｈＩ部位で挿入し得る。
【０１４１】
ＲＫＲＲＫＲ配列を有する野生型マウス第ＶＩＩ因子構築物は、同様の方法で構築し得る。具体的には、ＲＫＲＲＫＲ配列を有する野生型マウス第ＶＩＩ因子は、以下のプライマー、
１番目のフラグメントを作製するための、５’−ＴＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＴＣＣＡＣＡＧＧＣＧＣＡＴＧＧＧＣＴ−３’（配列番号：７）および５’−ＡＣＡＡＴＧＣＧＴＴＴＴＣＧＣＣＧＣＴＴＡＣＧＧＣＧＧＣＣＴＴＧＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴ−３’（配列番号：９）、ならびに
２番目のフラグメントを作製するための、５’−ＴＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＡＣＡＧＴＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣ−３’（配列番号：８）および５’−ＧＣＣＧＣＣＧＴＡＡＧＣＧＧＣＧＡＡＡＡＣＧＣＡＴＴＧＴＧＧＧＡＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＧＣＣＣ−３’（配列番号：１０）
を使用してマウス第ＶＩＩ因子ｃＤＮＡから増幅できる。次に、これらの２つのフラグメントを鋳型として使用し、以下のプライマー、
５’−ＴＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＴＣＣＡＣＡＧＧＣＧＣＡＴＧＧＧＣＴ−３’（配列番号：７）および５’−ＴＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＡＣＡＧＴＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣ−３’（配列番号：８）
を用いてオーバーラップＰＣＲを実施する。次に、生じた増幅フラグメントをＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩで消化し、ＢｇｌＩＩ／ＳｐｈＩ部位の間でｐＳＣ−ＴＴＲ−ｍｖｍベクターに挿入し得る。その後、ＢＧＨポリアデニル化配列を、生じたベクターにＳｐｈＩ部位で挿入し得る。
【０１４２】
マウス第ＩＸ因子のシグナル、プロペプチド、ＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインと第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインならびにＲＫＲＲＫＲ配列を含む構築物（配列番号：５）を同様に構築する。具体的には、１番目のフラグメントを、マウス第ＩＸ因子ｃＤＮＡを鋳型として使用し、以下のプライマー、
５’−ＡＧＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＡＣＣＧＴＣ−３’（配列番号：１１）および
５’−ＧＡＴＣＡＧＣＴＧＣＴＣＡＴＴＣＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＧＴＴＣＣＴＴＣＣＴＴＣＡＡＡＴＣ−３’（配列番号：１２）
を用いて作製する。２番目のフラグメントは、マウス第ＶＩＩ因子を鋳型として使用し、以下のプライマー、
５’−ＧＡＴＴＴＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＡＣＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＧＣＡＡＧＡＡＴＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＴＣ−３’（配列番号：１３）および
５’−ＡＣＡＡＴＧＣＧＴＴＴＴＣＧＣＣＧＣＴＴＡＣＧＧＣＧＧＣＣＴＴＧＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴ−３’（配列番号：９）
を用いて作製する。
【０１４３】
３番目のフラグメントは、マウス第ＶＩＩ因子を鋳型として使用し、以下のプライマー、
５’−ＴＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＡＣＡＧＴＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣ−３’（配列番号：８）および
５’−ＧＣＣＧＣＣＧＴＡＡＧＣＧＧＣＧＡＡＡＡＣＧＣＡＴＴＧＴＧＧＧＡＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＧＣＣＣ−３’（配列番号：１０）
を用いて作製できる。次に、これらの３つフラグメントを鋳型として使用し、以下のプライマー、
５’−ＡＧＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＡＣＣＧＴＣ−３’（配列番号：１１）および
５’−ＴＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＡＣＡＧＴＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣ−３’（配列番号：８）
を用いてオーバーラップＰＣＲを実施し得る。次に、生じた増幅フラグメントをＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩで消化し、ＢｇｌＩＩ／ＳｐｈＩ部位の間でｐＳＣ−ＴＴＲ−ｍｖｍベクターに挿入する。その後、ＢＧＨポリアデニル化配列を、生じたベクターにＳｐｈＩ部位で挿入する。
【０１４４】
同様の工程を使用して、マウス第ＩＸ因子のシグナルおよびプロペプチドドメイン、プロテインＳのＧＬＡドメイン、第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインと第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインならびにＲＫＲＲＫＲ配列を含む構築物（配列番号：６）を作製し得る。具体的には、１番目のフラグメントを、マウス第ＩＸ因子ｃＤＮＡおよび以下のプライマー、
５’−ＡＧＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＡＣＣＧＴＣ−３’（配列番号：１１）および
５’−ＧＴＴＴＣＴＴＣＧＡＡＣＡＡＧＧＴＡＴＴＴＧＣＴＣＴＣＴＴＴＧＧＡＣＧＧＧＴＡＡＧＡＡＴＴＴＴＧ−３’（配列番号：１４）
を使用して作製し得る。２番目のフラグメントは、マウスプロテインＳを鋳型として使用し、以下のプライマー、
５’−ＣＡＡＡＡＴＴＣＴＴＡＣＣＣＧＴＣＣＡＡＡＧＡＧＡＧＣＡＡＡＴＡＣＣＴＴＧＴＴＣＧＡＡＧＡＡＡＣ−３’（配列番号：１５）および
５’−ＧＡＴＣＴＣＣＡＴＣＡＡＣＡＴＡＣＴＧＣＴＴＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＴＣＣＧＴＣＴＣＧＧＧＡＴＴ−３’（配列番号：１６）
を用いて作製し得る。３番目のフラグメントは、マウス第ＩＸ因子のシグナル、プロペプチド、ＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインと第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインならびにＲＫＲＲＫＲ配列を有するベクターを鋳型として使用し、以下のプライマー、
５’−ＡＡＴＣＣＣＧＡＧＡＣＧＧＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＡＡＧＣＡＧＴＡＴＧＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＣ−３’（配列番号：１７）および
５’−ＴＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＡＣＡＧＴＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣ−３’（配列番号：８）
を用いて作製し得る。次に、これらの３つフラグメントを鋳型として使用し、以下のプライマー、
５’−ＡＧＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＡＣＣＧＴＣ−３’（配列番号：１１）および
５’−ＴＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＡＣＡＧＴＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣ−３’（配列番号：８）
を用いてオーバーラップＰＣＲを実施する。次に、生じた増幅フラグメントをＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩで消化し、ＢｇｌＩＩ／ＳｐｈＩ部位の間でｐＳＣ−ＴＴＲ−ｍｖｍベクターに挿入する。その後、ＢＧＨポリアデニル化配列を、生じたベクターにＳｐｈＩ部位で挿入し得る。
【０１４５】
野生型マウス第ＶＩＩ因子（配列番号：３）およびＲＫＲＲＫＲ配列を有する野生型マウス第ＶＩＩ因子（配列番号：４）のベクター構築物を、各々、年齢が適合する２匹の雄性血友病Ｂマウスに注射した（マウスにつき５×１０１１ベクターゲノム）。マウス第ＩＸ因子のシグナル、プロペプチド、ＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインと第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインならびにＲＫＲＲＫＲ配列（配列番号：５）、ならびにマウス第ＩＸ因子のシグナルおよびプロペプチドドメイン、プロテインＳのＧＬＡドメイン、第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインと第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインならびにＲＫＲＲＫＲ配列（配列番号：６）のベクター構築物を、各々、年齢が適合する３匹の雄性血友病Ｂマウスに注射した（マウスにつき５×１０１１ベクターゲノム）。注射の約３週間後、野生型マウス第ＶＩＩ因子（配列番号：３）またはＲＫＲＲＫＲ配列を有する野生型マウス第ＶＩＩ因子（配列番号：４）のいずれかを注射したすべてのマウスが死亡した。マウス第ＩＸ因子のシグナル、プロペプチド、ＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインと、第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインならびにＲＫＲＲＫＲ配列（配列番号：５）、またはマウス第ＩＸ因子のシグナルおよびプロペプチドドメイン、プロテインＳのＧＬＡドメイン、第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインと第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインならびにＲＫＲＲＫＲ配列（配列番号：６）の、いずれかを注射したマウスは、注射の約５週間後に生存し、有害症状を示さなかった。マウスから週に１回血液を採取し、注射の６〜８週間後にマウス第ＶＩＩ因子ポリペプチドのレベルを測定し得る。また、マウス第ＶＩＩ因子ポリペプチドに対する抗原レベルは、注射したマウスの血液試料からインビトロで凝固活性を測定することによって間接的に測定し得る（Ｍａｒｇａｒｉｔａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００９；１１３：３６８２−３６８９）。
【０１４６】
上記は本発明の説明であり、本発明を限定すると解釈されるべきではない。本発明は、以下の特許請求の範囲およびその中に含まれる特許請求の範囲の等価物によって定義される。本明細書で引用されるすべての出版物、特許出願、特許、特許公開、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースおよび／またはＳＮＰアクセッション番号によって同定される配列、ならびに他の参考文献は、参考文献が提示される文および／または段落に関連する教示に関してそれらの全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【技術分野】
【０００１】
[優先権の主張]
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下に、その内容全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとする、２００９年６月２５日出願の米国特許仮出願第６１／２２０，２７８号の優先権を主張する。
【０００２】
[政府支援の言明]
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された認可番号５−Ｐ０１−ＨＬ０６３５０の下での政府支援を得て為された。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、現在使用可能な第ＶＩＩ因子ポリペプチドよりも高い凝固活性を有し、血栓合併症がより少ないキメラヒト凝固第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチド、ならびにかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物、該ポリヌクレオチドを含み、これを発現するベクターおよび宿主細胞、医薬組成物、使用および治療の方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
血液凝固は、最終的にフィブリン血餅を生じさせる、様々な血液成分（または因子）の複雑な相互作用からなるプロセスである。一般に、凝固「カスケード」と称されてきたものに関与する血液成分は、アクチベータ（これ自体は活性化された凝固因子である）の作用によってタンパク質分解酵素に変換される、酵素的に不活性なタンパク質（プロ酵素またはチモーゲン）である。かかる変換を受けた凝固因子は、一般に「活性因子」と称され、凝固因子の名称に「ａ」の文字を付加することによって表される（例えば活性化第ＶＩＩ因子は第ＶＩＩａ因子またはＦＶＩＩａと表される）。
【０００５】
通常、止血プロセスの開始は、組織因子と第ＶＩＩａ因子との間の複合体の形成によって媒介される。この複合体は、次に、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）および第Ｘ因子（ＦＸ）をそれらの活性型に変換する。第Ｘａ因子（ＦＸａ）は、組織因子担持細胞上で限られた量のプロトロンビンをトロンビンに変換する。トロンビンは血小板を活性化し、第Ｖ因子（ＦＶ）および第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を第Ｖａ因子（ＦＶａ）および第ＶＩＩＩａ因子（ＦＶＩＩＩａ）へと活性化して、これらの両補因子がさらなるプロセスにおいて完全なトロンビンバーストを導く。このプロセスは、第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）（第ＶＩＩＩａ因子との複合体として）による第Ｘａ因子の産生を含み、活性化された血小板の表面上で起こる。トロンビンは、最終的にフィブリノーゲンをフィブリンへと変換し、フィブリン血餅の形成をもたらす。近年、第ＶＩＩ因子および組織因子が血液凝固の主たるイニシエータであることが見出された。
【０００６】
第ＶＩＩ因子は、一本鎖チモーゲンとして血液中を循環する血漿糖タンパク質である。チモーゲンは最小限の触媒活性を有する。一本鎖第ＶＩＩ因子は、インビトロで第Ｘａ因子、第ＸＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第ＶＩＩａ因子またはトロンビンによって二本鎖第ＶＩＩａ因子に変換され得る。第Ｘａ因子は第ＶＩＩ因子の主要な生理的アクチベータであると考えられている。止血に関与するいくつかの他の血漿タンパク質と同様に、第ＶＩＩ因子はその活性に関してビタミンＫに依存し、該活性は該タンパク質のアミノ末端に近接してクラスタ形成している複数のグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化のために必要である。これらのγ−カルボキシル化されたグルタミン酸は、リン脂質と第ＶＩＩ因子との金属イオン誘導性相互作用に必要とされる。チモーゲン第ＶＩＩ因子の活性化二本鎖分子への変換は、内部のＡｒｇ１５２−Ｉｌｅ１５３ペプチド結合の切断によって生じる。加えて、高濃度の第ＶＩＩ因子がインビトロで自己活性化を導くことは公知である。組織因子、リン脂質およびカルシウムイオンの存在下で、二本鎖第ＶＩＩａ因子は、限定的なタンパク質分解によって第Ｘ因子または第ＩＸ因子を速やかに活性化する。
【０００７】
ヒトＦＶＩＩ（ｈＦＶＩＩ）をコードする遺伝子は、第１３番染色体のｑ３４−ｑｔｅｒ９にマッピングされている（ｄｅ Ｇｒｏｕｃｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９８４；６６：２３０−２３３）。この遺伝子は９個のエクソンを含み、１２．８Ｋｂにわたる（Ｏ’Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８７；８４：５１５８−５１６２）。ＦＶＩＩの遺伝子構成およびタンパク質構造は他のビタミンＫ依存性プロ凝固タンパク質のものに類似し、エクソン１ａおよび１ｂはシグナル配列をコードし、エクソン２はプロペプチドおよびＧＬＡドメイン、エクソン３は短い疎水性領域、エクソン４および５は上皮増殖因子様ドメイン、ならびにエクソン６から８はセリンプロテアーゼ触媒ドメインをコードする（Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８５；２４：３７３６−３７５０）。
【０００８】
第ＩＸ因子（クリスマス因子）は、正常な止血において活性なセリンプロテアーゼのチモーゲンであり、その酵素活性は特定のグルタミン酸残基のカルボキシル化を必要とする。第ＩＸ、Ｘ、ＶＩＩ因子およびプロテインＣは、同じファミリーのセリンプロテアーゼの密接に関連するパラログであり、これらのタンパク質をコードする遺伝子の高い度合のアミノ酸配列同一性およびイントロン−エクソン配置を有する。これらの密接に関連するタンパク質は、アミノ末端からカルボキシル末端までの機能性ドメインの類似構造を有し、γ−カルボキシグルタミン酸（ＧＬＡ）ドメイン、２つの上皮増殖因子様（ＥＧＦ）ドメイン、活性化ペプチドおよび触媒ドメインを含む。プロテインＳは、６６６アミノ酸の、ＧＬＡドメイン、４つのＥＧＦ様ドメイン、トロンビン感受性領域および２つのラミニンドメインを有するビタミンＫ依存性タンパク質である。
【０００９】
ビタミンＫ依存性凝固血漿タンパク質は、膜へのタンパク質結合の部位として機能するＧＬＡドメインを含み、ＧＬＡドメインは様々な凝固タンパク質の間で高度に保存されている。それらの類似性にもかかわらず、ＧＬＡドメインはリン脂質に対して広い範囲の親和性を示し、プロテインＳのＧＬＡドメインがリン脂質に対して最も高い親和性を有する（Ｅｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８；３７：７９９７−８００３）、（ＭｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９７；３６：５１２０−２７）。
【００１０】
被験体において凝固カスケードを刺激するまたは改善することがしばしば望ましい。第ＶＩＩａ因子は、凝固因子欠損症（例えば血友病ＡおよびＢまたは凝固第ＸＩ因子もしくは第ＶＩＩ因子の欠損）または凝固因子インヒビターなどのいくつかの原因を有する出血性疾患を管理するために使用されてきた。第ＶＩＩａ因子はまた、正常に機能する血液凝固カスケードを有する（凝固因子欠損、または凝固因子のいずれかに対するインヒビターを有さない）被験体において生じる過剰の出血を制御するためにも使用されてきた。かかる出血は、例えば、血小板機能欠損、血小板減少症またはフォン・ヴィレブランド病によって引き起こされ得る。
【００１１】
出血はまた、手術および他の形態の外傷に関連する重大な問題である。例えば、第ＶＩＩ因子はイラクおよびアフガニスタンで負傷した兵士を治療するために広く使用された（Ｐｅｒｋｉｎｓ ＪＧ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｕｍａ．２００７；６２：１０９５−９；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ９−１０１）。その使用は多くの命を救ったことで高い評価を得ているが、大部分の医学的治療に関しては、治療後の脳卒中または他の血栓事象などの副作用が存在する。しかし、ＦＶＩＩａを使用する医師の全体的な印象は、その使用はそのために失われた命よりも多くの命を救ってきたというものである。おそらく、このことを最もよく表しているのは、過去の戦争において負傷者の約３０％が損傷のために死亡しているのに対し、現在の湾岸戦争ではその数が約１０％に減少したことである（Ｇａｗａｎｄｅ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００４；３５１：２４７１−５）。
【００１２】
第ＶＩＩａ因子を発現するトランスジェニック血友病Ｂマウスの試験は、低レベル（１．５μｇ／ｍｌ未満）の持続的な第ＶＩＩａ因子発現が血友病Ｂマウスにおいて凝固活性を回復させることを明らかにした。しかし、野生型または血友病Ｂマウスでの２μｇ／ｍｌを上回る第ＶＩＩａ因子レベルは、心臓および肺における血栓症を導いた。心臓および肺はどちらも、組織因子の高発現部位である。これは、循環中の高レベルの第ＶＩＩａ因子は、心臓および肺の血管損傷後に暴露される組織因子に接触した場合血栓症を誘発することを示唆する（Ｍａｒｇａｒｉｔａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００４；１１３：１０２５−３１）。さらに、血友病のイヌにおけるベクターを介したイヌ第ＶＩＩａ因子の遺伝子導入が、短期および中期的に安全かつ有効であることが試験で示された（Ｍａｒｇａｒｉｔａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００９；１１３：３６８２−３６８９）。
【００１３】
第ＶＩＩ因子による治療に関する警告が、現在、規制認可を求める製品について提案されている。例えば、欧州医薬品庁、人体用医薬品評価ユニット（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ，Ｈｕｍａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ）は、現在の第ＶＩＩ因子治療には、特に第ＶＩＩ因子が冠状動脈性心疾患または肝疾患の病歴を有する患者、術後患者、新生児ならびに血栓症および播種性血管内凝固症候群の危険性がある患者に投与される状況では、血栓症および播種性血管内凝固症候群の危険性の警告を付すことを推奨している。例えば、２００４年７月のＣｏｒｅ ＳＰＣ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＣＰＭＰ／ＢＰＷＧ／２０４８／０１）参照。
【００１４】
これまでに、第ＶＩＩａ因子のＥＧＦ−１ドメインが組織因子に対する第ＶＩＩａ因子の親和性に重要な役割を果たすことが示されている。組織因子の存在下および不存在下の両方で、合成基質と第Ｘ因子の両方を使用して、第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインを有する第ＶＩＩａ因子ポリペプチドは野生型第ＶＩＩａ因子よりも低い触媒活性を有していた（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９，２８：１１８５−９２）。一見したところ、これは出血を治療するためのキメラ構築物の使用を排除すると思われる。しかし、Ｍｏｎｒｏｅ（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ １９９７；９９：５４２−５４９）は、血友病および出血を治療するうえでのＦＶＩＩａの機構は組織因子非依存性であると提案した。しかし、第ＶＩＩａ因子が組織因子とは独立して活性でないかどうかに関しては当技術分野で見解が分かれる。
【００１５】
ヒト組換えＦＶＩＩａの市販製剤は、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）ＲＴとして販売されている。ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）ＲＴは、血友病ＡまたはＢ患者における出血エピソードの治療に適用され、出血エピソードの治療のための市場で入手可能な唯一のｒＦＶＩＩａである。近年、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）が、第ＶＩＩ因子を損傷部位に局在化させるために組み合わせて投与できる、再水和された凍結乾燥血小板に結合し得ることが明らかにされた（Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ，２００８；１９：１８２−９１）。加えて、第ＶＩＩ因子の選択的なＰＥＧ化は血漿半減期を上昇させ得ること（Ｓｔｅｎｎｉｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ，２００８；１００：９２０−２８）および３個のアミノ酸置換を有する組換えヒト第ＶＩＩ因子は血小板の表面上で高い活性を有すること（Ｍｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，２００９；７：２９９−３０５）が示された。本発明のキメラ第ＶＩＩａ因子分子のＰＥＧ化は、同様に血漿半減期を上昇させるように働くと期待される。同じように、コンジュゲートを形成する非ポリペプチド部分の共有結合などの、当技術分野で知られているタンパク質の他の修飾、例えばグリコシル化は、本発明のキメラ第ＶＩＩａ因子分子において同様に機能すると期待され、すなわち非ポリペプチド部分の共有結合によってタンパク質に与えられる特性がキメラ第ＶＩＩａ因子分子に付与されると予想される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
利用可能な治療に結びつく、比較的低い用量で投与できる高い凝固活性を有する第ＶＩＩａ因子の変異体、および血栓合併症などの望ましくない副作用を生じさせることが少ない変異体が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本出願は、１以上の望ましい恩恵を提供する、キメラＦＶＩＩａ分子、特にｈＦＶＩＩａドメインと凝固系の１以上のタンパク質からのドメインを含むキメラｈＦＶＩＩａ分子を開示する。従って、本発明のキメラＦＶＩＩａ分子は、市販のｒＦＶＩＩａと比較して１以上の改善された特性を有し、かかる特性は、より高い凝固活性を有することおよび／または比較的低い用量で投与できることおよび／または血栓合併症を生じさせることがより少ないことを含む。その結果として、本発明のキメラによる医学的治療は、潜在的により低い用量および／またはより少ない望ましくない副作用などの、現在使用可能なｒＦＶＩＩａ化合物を上回る利点を提供する。
【００１８】
本発明の代表的なキメラＦＶＩＩａポリペプチドは、ＦＶＩＩのＥＧＦ−２および触媒ドメインと、ビタミンＫ依存性凝固タンパク質のＧＬＡドメインと、ビタミンＫ依存性凝固タンパク質のＥＧＦ−１ドメインとを含むキメラＦＶＩＩａを包含する。本発明の特定の実施形態では、本発明のキメラＦＶＩＩａポリペプチドは、１）ＦＩＸのＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインとＦＶＩＩのＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラＦＶＩＩａ、２）ＦＩＸのＥＧＦ−１ドメインとＦＶＩＩのＧＬＡ、ＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラＦＶＩＩａ、３）プロテインＳのＧＬＡドメインと、ＦＩＸのＥＧＦ−１ドメインと、ＦＶＩＩのＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラＦＶＩＩａ、４）プロテインＳのＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインとＦＶＩＩのＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラＦＶＩＩａ、５）プロテインＳのＥＧＦ−１ドメインとＦＶＩＩのＧＬＡ、ＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラＦＶＩＩａ、ならびに６）プロテインＳのＥＧＦ−１ドメインと、ＦＩＸのＧＬＡドメインと、ＦＶＩＩのＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラＦＶＩＩａを包含する。本発明の代表的なキメラＦＶＩＩａポリペプチドはまた、ＥＧＦ−１ドメインまたはＧＬＡドメイン内にアミノ酸置換を有する、野生型ＦＶＩＩａまたは上述したキメラＦＶＩＩａポリペプチドのいずれかを包含し得る。置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。かかる置換は、ＥＧＦ−１ドメインの残基６９のイソロイシンのアラニンによる置換および／または残基７９のアルギニンのアラニンによる置換を含み得る。さらなる置換は、ＧＬＡドメインにＩＶ型コラーゲンに対するより高い結合親和性をもたらすが、血小板結合には影響を及ぼさないと思われる、残基５のリシンのアルギニンによる置換（Ｇｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．２００９；７：１８４３−１８５１）、残基３０６のメチオニンの別のアミノ酸による置換、好ましくは保存的アミノ酸置換、より好ましくは、組織因子に対する親和性をさらに低下させるアラニンによる置換、ならびにより高い比活性を有する第ＶＩＩａ因子を生じさせる、残基１５８のバリンのアスパラギン酸による置換、残基２９６のグルタミン酸のバリンによる置換および／または残基２９８のメチオニンのグルタミンによる置換を含み得る。
【００１９】
また、本明細書で述べるキメラＦＶＩＩａポリペプチドの１以上を投与することにより、出血性疾患を有する被験体において該出血性疾患を治療する方法も提供される。出血性疾患を治療する方法は、本発明のキメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を被験体に投与する方法を含み得る。
【００２０】
加えて、本発明は、ＧＬＡドメインを含むタンパク質を投与することにより、出血性疾患を有する被験体において該出血性疾患を治療する方法を提供し、該タンパク質は、血餅の部位に標的されるおよび／または被験体の血漿中の循環タンパク質の濃度に比べて血餅の部位付近で濃縮されている。これは、血餅形成部位でまたはその付近で認められる、現在使用可能な第ＶＩＩ因子ポリペプチドよりも高い親和性で血小板に結合するドメインを使用することを含み得る。かかるドメインの例は、血小板の表面に位置する負に荷電したリン脂質層に結合する様々な凝固タンパク質のＧＬＡドメインである。かかるＧＬＡドメインの非限定的な例は、ＦＶＩＩａのＧＬＡドメインよりもはるかに密接に血小板およびリン脂質に結合する、ＦＩＸのＧＬＡドメイン（Ｍｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．「Ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｉｎ ｚｙｍｏｇｅｎ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ」Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ １２：２３７−２４３（２００１））ならびに任意の他の公知のＧＬＡドメインよりも密接にリン脂質に結合する、プロテインＳのＧＬＡドメイン（ＭｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｔａｃｔ ｓｉｔｅ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：３６：５１２０−５１２７（１９９７））を含む。ＧＬＡドメインを含むタンパク質の非限定的な例は、ＦＩＸもしくはプロテインＳのＧＬＡドメインを含む組換えタンパク質、ＦＩＸもしくはプロテインＳのＧＬＡドメインを含むキメラタンパク質、および／またはＦＩＸもしくはプロテインＳのＧＬＡドメインを含む本発明のキメラＦＶＩＩａポリペプチドを包含する。
【００２１】
もう１つの実施形態では、本発明は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドに由来する触媒ドメインおよび１以上の血小板標的ドメインを含む本発明のキメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドを投与することにより、出血性疾患を有する被験体を治療する方法を提供する。かかる血小板標的ドメインは、血小板の表面と相互作用するまたは結合するタンパク質からのドメインを含む。血小板の表面とのかかる相互作用または表面への結合は、血小板の膜リン脂質を通してまたは血小板細胞表面タンパク質および／もしくは受容体を通して媒介され得る。かかるドメインの非限定的な例は、血小板糖タンパク質Ｉｂについての主要結合部位である、フォン・ヴィレブランド因子のＡ１ドメイン（Ｅｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ，２７３：１０３９６−１０４０１（１９９８））ならびに血小板膜タンパク質および／または受容体に結合する抗体、例えば血小板膜リン脂質に結合する抗体のＦａｂフラグメント（ドメイン）（Ｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，７７：２６５５−２６５９（１９９１））を含む。
【００２２】
血小板に結合し、組織因子に対して低い親和性を有するドメインを使用した、血餅部位への凝固タンパク質のかかる標的化は、血栓形成性などの、現在の第ＶＩＩ因子療法に関連する合併症の危険度を低下させるという付加的な、しかし予想外の利益を有する。このアプローチはまた、他の治療上有用なポリペプチドまたは他の分子を血小板または血餅部位に標的するためにも使用できる。かかる治療上有用な分子は、抗凝固剤等を含み得る。
【００２３】
本発明はさらに、第ＶＩＩ因子の血栓形成性に比べて低い血栓形成性（例えば、天然第ＶＩＩ因子の血栓形成性と比較して少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％低い等）を有するポリペプチドを被験体に投与することにより、出血性疾患を有する被験体において該出血性疾患を治療する方法を提供する。「低い血栓形成性」は、当技術分野で知られている方法に従って様々なやり方で、例えば、対照と比較して、血餅の測定数がより少ない、血餅がより小さい、血餅が生じるのにより長い時間を要する（インビボまたはインビトロアッセイにおいて）、血栓形成による被験体の死亡がより少ないおよび／または生存期間が長いことを含むが、これらに限定されない方法で測定できる。第ＶＩＩ因子と比較して低い血栓形成性を有するポリペプチドは、例えば、本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドまたはその活性フラグメントであり得る。かかるポリペプチドの非限定的な例は、ＦＩＸのＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインとＦＶＩＩのＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラＦＶＩＩａ、ならびにプロテインＳのＧＬＡドメインと、ＦＩＸのＥＧＦ−１ドメインと、ＦＶＩＩのＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラＦＶＩＩａを包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本発明において有用なキメラＦＶＩＩａ分子の図式的表示を示す。ＦＶＩＩ：第ＶＩＩ因子、ＦＩＸ：第ＩＸ因子。
【図２】図２は、様々な濃度の野生型第ＶＩＩａ因子についての血友病の細胞モデル系における正常条件および血友病条件（第ＩＸ因子および第ＶＩＩＩ因子の除去）でのトロンビン産生（ｎＭ）を示す。
【図３】図３は、５０ｎＭの野生型第ＶＩＩａ因子または１０ｎＭのキメラ第ＶＩＩａ因子を投与した血友病の細胞モデル系における正常条件および血友病条件（第ＩＸ因子および第ＶＩＩＩ因子の除去）でのトロンビン産生（ｎＭ）を示す。
【図４】図４は、５０ｎＭの野生型第ＶＩＩａ因子または１０ｎＭのキメラ第ＶＩＩａ因子の投与後の血友病の細胞モデル系において産生される、対照値と比較した、ピークトロンビンを示す。
【図５】図５は、処置していない血友病Ｂマウス、２ｍｇ／ｋｇのＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を投与した血友病Ｂマウス、２ｍｇ／ｋｇのキメラＦＶＩＩａ分子を投与した血友病Ｂマウスおよび処置していない野生型マウスについての凝固アッセイにおける崩壊止血時間（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ｔｉｍｅ）を示す。
【図６】図６は、シグナル、プロペプチド、第ＩＸ因子のＧＬＡおよびＥＧＦ１ドメイン（下線）を含む、本発明の例示的なキメラ第ＶＩＩ因子の配列（配列番号：１）を示す。
【図７】図７は、シグナル、プロペプチドおよび第ＩＸ因子のＥＧＦ１ドメイン（下線）およびプロテインＳのＧＬＡドメイン（太字）を含む、本発明の例示的なキメラ第ＶＩＩ因子の配列（配列番号：２）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明を以下でより詳細に説明する。しかし本発明は、種々の形態で具体化でき、本明細書で述べる実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、この開示が詳細かつ完全となり、当業者に本発明の範囲を十分に伝えるために提供されるものである。
【００２６】
本明細書で本発明の説明において使用される用語は、特定の実施形態を説明することだけを目的とし、本発明の限定を意図されない。本発明の説明および付随の特許請求の範囲において使用される、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形態は、文脈によって明確に指示されない限り、複数形態も包含することが意図されている。
【００２７】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての用語（技術および学術用語を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。一般的に使用される辞書において定義されるもののような用語は、本出願および関連技術分野におけるそれらの意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、本明細書において明白に定義されない限り理想的なまたは過度に正式な意味に解釈されるべきではないことがさらに了解される。本明細書で本発明の説明において使用される用語は、特定の実施形態を説明することを目的とし、本発明の限定を意図されない。本明細書で言及するすべての出版物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【００２８】
また本明細書で使用される、「および／または」は、関連して列挙される項目の１以上のありとあらゆる可能な組合せ、ならびに選択的に解釈される場合（「または」）は組合せの欠如を指し、これらを包含する。
【００２９】
文脈によって特に指示されない限り、本明細書で述べる本発明の様々な特徴は任意の組合せで使用できることが明確に意図されている。
【００３０】
さらに、本発明はまた、本発明の一部の実施形態では、本明細書で述べる任意の特徴または特徴の組合せが排除または除外され得ることを企図する。例示すると、明細書において複合体が成分Ａ、ＢおよびＣを含むと記述される場合、Ａ、ＢまたはＣのいずれかまたはそれらの組合せが、単独でまたは任意の組合せで除外され、排除され得ることが明確に意図されている。
【００３１】
本明細書で使用される、「〜から実質的になる」という移行句（および文法的変形）は、列挙される物質または段階ならびに特許請求される本発明の「基本的なおよび新規の特徴に実質的に影響を及ぼさないもの」を包含すると解釈されるべきである。Ｉｎ ｒｅ Ｈｅｒｚ，５３７ Ｆ．２ｄ ５４９，５５１−５２，１９０ Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｑ．４６１，４６３（ＣＣＰＡ １９７６）（原文での強調）参照、ＭＰＥＰ §２１１１．０３も参照のこと。従って、本明細書で使用される「〜から実質的になる」という用語は、「含む」と等価であると解釈されるべきではない。
【００３２】
量または濃度等のような測定可能な値に言及する場合に本明細書で使用される、「約」という用語は、特定される量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％またはさらに０．１％の変動を包含することが意図されている。
【００３３】
本明細書で使用される「活性」という用語は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドがその基質である第Ｘ因子を活性な第Ｘａ因子に変換する能力を意味する。
【００３４】
「固有活性」という用語はまた、組織因子の不存在下に活性化血小板の表面でトロンビンを産生する能力も包含する。
【００３５】
「Ｎ末端ＧＬＡドメイン」という用語は、配列番号：１８のアミノ酸配列の約アミノ酸残基６１から約アミノ酸残基１０５までのアミノ酸配列、配列番号：１９のアミノ酸配列の約アミノ酸残基４７から約アミノ酸残基９２までのアミノ酸配列、同定されたアミノ酸配列への任意の翻訳後修飾、同定されたアミノ酸配列における任意の保存的アミノ酸置換、同定されたアミノ酸配列へのアミノ酸残基の付加、同定されたアミノ酸配列からのアミノ酸残基の欠失、またはリン脂質膜に結合する凝固カスケードタンパク質からの任意の他のアミノ酸配列を包含する。
【００３６】
「ＥＧＦ−１」という用語は、ジスルフィド結合１〜３、２〜４および５〜６を含むほとんどすべての公知のＥＧＦ様ドメインを含む、ＥＧＦ（上皮増殖因子）中ならびにまた細胞シグナル伝達および凝固タンパク質に関与する一連のタンパク質中でもともと認められる６個のシステインを含む３０〜４０アミノ酸の領域を表す。第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−１ドメインは、配列番号：１８のアミノ酸配列の約アミノ酸残基１０６から約アミノ酸残基１４２までである。第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインは、配列番号：１９のアミノ酸配列の約アミノ酸残基９３から約アミノ酸残基１２９までである。プロテインＳのＥＧＦ−１ドメインは、配列番号：２０のアミノ酸配列の約アミノ酸残基１１７から約アミノ酸残基１５５までである。これらのアミノ酸配列は、同定されたアミノ酸配列への任意の翻訳後修飾、同定されたアミノ酸配列における任意の保存的アミノ酸置換、同定されたアミノ酸配列へのアミノ酸残基の任意の付加および／または同定されたアミノ酸配列からのアミノ酸残基の任意の欠失を含み得る。
【００３７】
「ＥＧＦ−２」という用語は、（２またはそれ以上のＥＧＦ様ドメインの）一続きにおける２番目のＥＧＦ様ドメインを意味する。第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２ドメインは、配列番号：１８のアミノ酸配列の約アミノ酸残基１４７から約アミノ酸残基１８８までである。第ＩＸ因子のＥＧＦ−２ドメインは、配列番号：１９のアミノ酸配列の約アミノ酸残基１３０から約アミノ酸残基１７１までである。プロテインＳのＥＧＦ−２ドメインは、配列番号：２０のアミノ酸配列の約アミノ酸残基１５７から約アミノ酸残基２００までである。これらのアミノ酸配列は、同定されたアミノ酸配列への任意の翻訳後修飾、同定されたアミノ酸配列における任意の保存的アミノ酸置換、同定されたアミノ酸配列へのアミノ酸残基の付加および／または同定されたアミノ酸配列からのアミノ酸残基の任意の欠失を含み得る。
【００３８】
本明細書で使用される「触媒ドメイン」という用語は、ペプチド結合の切断を媒介するタンパク質中のドメインを意味する。第ＶＩＩ因子の触媒ドメインは、配列番号：１８のアミノ酸配列の約アミノ酸残基２１３から約アミノ酸残基４５２までである。第ＩＸ因子の触媒ドメインは、配列番号：１９のアミノ酸配列の約アミノ酸残基２２７から約アミノ酸残基４５９までである。これらのアミノ酸配列は、同定されたアミノ酸配列への任意の翻訳後修飾、同定されたアミノ酸配列における任意の保存的アミノ酸置換、同定されたアミノ酸配列へのアミノ酸残基の任意の付加および／または同定されたアミノ酸配列からのアミノ酸残基の任意の欠失を含み得る。
【００３９】
「ＧＬＡ」という３文字表記は４−カルボキシグルタミン酸（γ−カルボキシグルタミン酸）を意味する。
【００４０】
「プロテアーゼドメイン」という用語は、一般に配列番号：１８の約アミノ酸残基２１３からカルボキシ末端アミノ酸残基までとみなされる、ペプチド結合の切断を媒介するタンパク質中のドメインを意味する（第ＶＩＩａ因子の重鎖）。本明細書で使用される「第ＶＩＩ因子ポリペプチド」という用語は、天然ヒト第ＶＩＩ因子のアミノ酸配列６１〜４６６（配列番号：１８）を含む任意のタンパク質またはその変異体もしくはフラグメントを意味する。これは、ヒト第ＶＩＩ因子、ヒト第ＶＩＩａ因子およびそれらの変異体を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される「第ＶＩＩ因子」という用語は、不活性な一本鎖チモーゲン第ＶＩＩ因子分子ならびに活性化二本鎖第ＶＩＩ因子分子（第ＶＩＩａ因子）を含むことが意図されている。これは、天然ヒト第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子のアミノ酸配列６１〜４６６（配列番号：１８）を有するタンパク質を包含する。当業者は、小さな配列変化は同様に機能すると予想されること、ならびに関与するドメイン、ポリペプチドおよび第ＶＩＩ因子は、本発明から逸脱することなくわずかに短縮もしくは伸長され得るまたは置換を含み得ることを認識する。従って、この定義はまた、わずかに修飾されたアミノ酸配列、例えばＮ末端アミノ酸欠失または付加を含む修飾されたＮ末端を有するタンパク質およびペプチドも包含し、一部の実施形態ではそれらのタンパク質は第ＶＩＩａ因子の活性を実質的に保持する（例えば天然第ＶＩＩａ因子の活性の約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％等を保持する）。本明細書で使用される「第ＶＩＩａ因子」または「ＦＶＩＩａ」という用語は、活性化形態（第ＶＩＩａ因子）からなる生成物を意味する。上記定義内の「第ＶＩＩ因子」または「第ＶＩＩａ因子」はまた、個体によって存在し、生じ得る天然の対立遺伝子変異も包含する。また、グリコシル化または他の翻訳後修飾の程度と位置は、発現の選択される宿主細胞、組織または動物種および宿主の細胞または組織環境の性質に依存して異なり得る。
【００４１】
本明細書で使用される「ドメイン」という用語は、タンパク質鎖の残りの部分とは独立して進化し、機能し、存在し得るタンパク質配列および構造の一部を包含することが意図されている。ドメインはコンパクトな三次元構造を形成することができ、しばしば独立して安定化され、折りたたまれ得る。１つのドメインが様々な進化的に関連するタンパク質中に出現し得る。ドメインの長さは、約２５アミノ酸から約５００アミノ酸長までにわたる。「ドメイン」はまた、単数または複数のアミノ酸残基が保存的置換によって置き換えられた野生型タンパク質からのドメインも包含し得る。それらはタンパク質媒質中で自己安定性であるので、ドメインは、キメラタンパク質を作製するためにあるタンパク質と別のタンパク質との間で遺伝子操作によって「交換」され得る。
【００４２】
本明細書で使用される「変異体（単数または複数）」という用語は、天然ヒト第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子のアミノ酸配列６１〜４６６（配列番号：１８）を有する第ＶＩＩ因子を表すことが意図され、ここで、親タンパク質の１もしくはそれ以上のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている、および／または、親タンパク質の１もしくはそれ以上のアミノ酸が欠失している、および／または、１もしくはそれ以上のアミノ酸がタンパク質に挿入されている、および／または、１もしくはそれ以上のアミノ酸が親タンパク質に付加されている、および／または、ＧＬＡドメインが異なるタンパク質からのＧＬＡドメイン（例えば血小板膜もしくはリン脂質膜に結合するＧＬＡドメイン）で置換されている、および／または、ＧＬＡドメインが異なるタンパク質からの血小板結合ドメイン（例えば血小板糖タンパク質Ｉｂについての主要結合部位である、フォン・ヴィレブランド因子のＡ１ドメイン（Ｅｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ，２７３：１０３９６−１０４０１（１９９８））ならびに血小板膜タンパク質および／もしくは受容体に結合する抗体、例えば血小板膜リン脂質に結合する抗体のＦａｂフラグメント（ドメイン）（Ｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，７７：２６５５−２６５９（１９９１））で置換されている、および／または、第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−１ドメインが異なるタンパク質からのＥＧＦ−１ドメイン（例えば第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインなどの、組織因子により低い親和性で結合するＥＧＦ−１ドメイン）で置換されている。かかる付加は、親タンパク質のＮ末端またはＣ末端またはその両方で、ならびに内部で生じ得る。従って、一部の実施形態では、本発明の「変異体（単数または複数）」は、活性化形態のＦＶＩＩの凝固活性をまだ有し得る。一部の実施形態では、本発明の変異体（単数または複数）は凝固活性を有さなくてもよい。
【００４３】
従って、一部の実施形態では、変異体は、天然ヒト第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子のアミノ酸配列６１〜４６６（配列番号：１８）と少なくとも４０％、５０％、６０％または７０％同一である。例えば、ＦＶＩＩのＥＧＦ−１ドメインはＦＩＸのＥＧＦ−１ドメインと６５．７％の同一性を有し、ＦＶＩＩのＧＬＡドメインはＦＩＸのＧＬＡドメインと５８．６％の同一性およびプロテインＳのＧＬＡドメインと５１％の同一性を有する。１つの実施形態では、変異体は、天然ヒト第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子のアミノ酸配列６１〜４６６（配列番号：１８）と少なくとも８０％同一である。もう１つの実施形態では、変異体は、天然ヒト第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子のアミノ酸配列６１〜４６６（配列番号：１８）と少なくとも９０％同一である。さらなる実施形態では、変異体は、天然ヒト第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子のアミノ酸配列６１〜４６６（配列番号：１８）と少なくとも９５％同一である。
【００４４】
本明細書で使用される「任意の他のアミノ酸」という用語は、その位置に天然に存在するアミノ酸とは異なる１つのアミノ酸を意味する。これは、ポリヌクレオチドによってコードされ得るアミノ酸を含むが、これに限定されない。好ましくは、異なるアミノ酸は天然Ｌ型であり、ポリヌクレオチドによってコードされ得る。具体的な例はＬ−システイン（Ｃｙｓ）である。
【００４５】
本明細書で使用される、「作動可能に連結された」という用語は、配列の正常な機能を果たすことができるような相互の立体配置での、酵素的連結または別の方法による２またはそれ以上のヌクレオチド配列の共有結合を指す。例えば、プレ配列または分泌リーダーをコードするヌクレオチド配列は、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。プロモータまたはエンハンサは、それが対象とする配列の転写に影響を及ぼす場合は、コード配列に作動可能に連結されている。リボソーム結合部位は、それが対象とするタンパク質またはペプチドへの翻訳を促進するように位置づけられている場合は、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結されている」とは、連結されているヌクレオチド配列が連続していることを意味し、分泌リーダーの場合は、連続しかつ読み枠内にあることを意味する。連結は、好都合な制限部位での結合によって最も容易に達成される。かかる部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを標準的な組換えＤＮＡ法と共に使用する。
【００４６】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、宿主細胞において増幅することができる任意の核酸実体を意味する。従って、ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、その複製が染色体の複製から独立している、染色体外実体として存在するベクター、例えばプラスミドであり得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入された場合、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。ベクターの選択は、それが導入される宿主細胞に依存することが多い。ベクターは、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスまたはコスミドベクターを含むが、これらに限定されない。ベクターは通常、複製起点および少なくとも１つの選択可能な遺伝子、すなわち容易に検出可能であるかまたはその存在が細胞増殖に必須である生成物をコードする遺伝子を含む。
【００４７】
本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、雑種細胞を含む、異種ＤＮＡがその中で発現され得る任意の細胞を意味する。典型的な宿主細胞は、昆虫細胞、酵母細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞およびＣＯＳ細胞などのヒト細胞を含む哺乳動物細胞を含むが、これらに限定されない。本発明を実施する場合、培養される宿主細胞は、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくは、限定されることなく、ＣＨＯ細胞株（例えばＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、ＣＯＳ−１細胞株（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞株およびＨＥＫ２９３細胞株（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３；Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２，１９７７）を含む、樹立哺乳動物細胞株である。適切なＢＨＫ細胞株は、本明細書中ではＢＨＫ ５７０細胞と称する、ｔｋ−ｔｓ１３ＢＨＫ細胞株である（Ｗａｅｃｈｔｅｒ ａｎｄ Ｂａｓｅｒｇａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：１１０６−１１１０，１９８２）。ＢＨＫ ５７０細胞株は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ １０３１４の下に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０から入手可能である。ｔｋ−ｔｓ１３ＢＨＫ細胞株も、アクセッション番号ＣＲＬ １６３２の下にＡＴＣＣから入手可能である。他の適切な細胞株は、限定されることなく、Ｒａｔ Ｈｅｐ Ｉ細胞（ラット肝細胞癌；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６００）、Ｒａｔ Ｈｅｐ ＩＩ細胞（ラット肝細胞癌；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５４８）、ＴＣＭＫ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １３９）、ヒト肺細胞（ＡＴＣＣ ＨＢ ８０６５）、ＮＣＴＣ １４６９細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９．１）およびＤＵＫＸ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０，１９８０）を含む。また、３Ｔ３細胞、ナマルバ細胞、骨髄腫細胞および骨髄腫細胞と他の細胞の融合物も有用である。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「適切な増殖培地」という用語は、細胞の増殖および本発明の第ＶＩＩ因子ポリペプチドをコードする核酸配列の発現のために必要な栄養素および他の成分を含む培地を意味する。
【００４９】
「コンジュゲート」（または交換可能に「コンジュゲート化ポリペプチド」）という用語は、１以上のポリペプチドの、ポリマー分子、親油性化合物、糖成分または有機誘導体化剤などの１以上の非ポリペプチド部分への共有結合によって形成される異種（複合体またはキメラという意味で）分子を示すことが意図されている。好ましくは、コンジュゲートは適切な濃度および条件で可溶性である、すなわち血液などの生理的液体に可溶性である。本発明のコンジュゲート化ポリペプチドの例は、グリコシル化および／またはＰＥＧ化ポリペプチドを含む。
【００５０】
「共有結合」という用語は、ポリペプチドと非ポリペプチド部分が互いに直接共有結合で連結されているか、または架橋、スペーサーもしくは単数もしくは複数の連結部分などの、単数もしくは複数の介在部分を介して互いに間接的に共有結合で連結されていることを意味する。「非コンジュゲート化ポリペプチド」という用語は、コンジュゲートのポリペプチド部分を指すために使用できる。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「非ポリペプチド部分」という用語は、本発明のポリペプチドの結合基にコンジュゲート化することができる分子を意味する。かかる分子の適切な例は、ポリマー分子、糖成分、親油性化合物または有機誘導体化剤を含む。本発明のコンジュゲートに関連して使用される場合、非ポリペプチド部分はポリペプチドの結合基を介してコンジュゲートのポリペプチド部分に連結されることが了解される。上記で説明したように、非ポリペプチド部分は、結合基に直接共有結合で連結され得るかまたは架橋、スペーサーもしくは単数もしくは複数の連結部分などの、単数もしくは複数の介在部分を介して間接的に結合基に共有結合で連結され得る。
【００５２】
「ポリマー分子」は、２またはそれ以上のモノマーの共有結合によって形成される分子であり、ポリマーがヒトアルブミンまたは別の豊富な血漿タンパク質である場合を除き、いずれのモノマーもアミノ酸残基ではない。「ポリマー」という用語は、「ポリマー分子」という用語と交換可能に使用できる。この用語は、インビトログリコシル化、すなわち、任意選択的に架橋剤を使用して、通常はポリペプチドの結合基に炭水化物分子を共有結合連結することを含む、インビトロで実施される合成的グリコシル化によって結合された炭水化物分子を包含することが意図されている。
【００５３】
Ｎ−グリコシル化またはＯ−グリコシル化（以下でさらに説明する）などのインビボでのグリコシル化によって結合された炭水化物分子を本明細書では「糖成分」と称する。コンジュゲート中のポリマー分子または糖成分などの非ポリペプチド部分の数が明白に示されている場合を除き、本発明で使用されるコンジュゲートまたは別のものに含まれる「非ポリペプチド部分」へのあらゆる言及は、ポリマー分子または糖成分などの１以上の非ポリペプチド部分への言及であるものとする。
【００５４】
「結合基」という用語は、ポリマー分子、親油性分子、糖成分または有機誘導体化剤などの非ポリペプチド部分に結合することができる、ポリペプチドの官能基、特にそのアミノ酸残基または炭水化物部分の官能基を示すことが意図されている。
【００５５】
インビボでのＮ−グリコシル化に関しては、「結合基」という用語は通常と異なるように使用され、Ｎ−グリコシル化部位（配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ／Ｃ［式中、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸残基であり、Ｎはアスパラギンであり、およびＳ／Ｔ／Ｃはセリン、トレオニンまたはシステインのいずれか、好ましくはセリンまたはトレオニン、最も好ましくはトレオニンである］を有する）を構成するアミノ酸残基を示す。Ｎ−グリコシル化部位のアスパラギン残基は、グリコシル化の間に糖成分が結合される残基であるが、かかる結合は、Ｎ−グリコシル化部位のその他のアミノ酸残基が存在しない限り達成され得ない。
【００５６】
従って、非ポリペプチド部分が糖成分であり、コンジュゲート化がＮ−グリコシル化によって行われる場合、対象とするポリペプチドのアミノ酸配列の変化に関連して使用される「非ポリペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基」という用語は、Ｎ−グリコシル化部位を構成する１以上のアミノ酸残基が、機能的Ｎ−グリコシル化部位がアミノ酸配列内に導入されるかまたは該配列から除去されるように変化していることを意味すると理解される。
【００５７】
本明細書において、「治療する」または「治療」という用語は、出血を阻止するまたは最小限に抑えることを目的とした、手術におけるような予想される出血の管理および／または予防、ならびに外傷または血友病患者のためのオンデマンド治療におけるような既に発生している出血の制御の両方を含むことが意図されている。従って本発明による第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの予防的投与は、「治療」の用語に包含される。
【００５８】
「出血エピソード」という用語は、制御されない、かつ過剰の出血を含むことが意図されている。出血エピソードは、手術および他の形態の組織損傷の両方に関して重大な問題であり得る。制御されない、かつ過剰の出血は、正常な凝固系を有する被験体および凝固または出血性疾患を有する被験体において起こり得る。
【００５９】
本明細書で使用される「出血性疾患」という用語は、出血として現れる、細胞、生理または分子起源の、先天性、後天性または誘導された何らかの欠損を反映する。例としては、凝固因子欠損症（例えば血友病ＡおよびＢまたは凝固第ＸＩもしくは第ＶＩＩ因子の欠損症）、凝固因子インヒビター、血小板機能欠損、血小板減少症、フォン・ヴィレブランド病、または手術もしくは外傷によって誘発される出血である。
【００６０】
過剰の出血はまた、正常に機能する血液凝固カスケードを有する（凝固因子欠損または凝固因子のいずれかに対するインヒビターを有さない）被験体においても発生し、血小板機能欠損、血小板減少症またはフォン・ヴィレブランド病によって引き起こされ得る。かかる場合、出血は血友病によって引き起こされる出血にたとえられることがあり、というのは、止血系が、血友病におけるように、欠如しているかまたは、重大な出血を引き起こす、必須の凝固「化合物」（血小板またはフォン・ヴィレブランド因子タンパク質など）の異常を有しているからである。手術または外傷に関連する広範囲の組織損傷を経験した被験体では、正常な止血機構が即時止血の必要性によって圧倒されることがあり、該被験体は、正常な止血機構にも関わらず出血を発現し得る。十分な止血を達成することは、外科的止血の可能性が限られる、脳、内耳領域および眼などの器官で出血が起こる場合にも問題である。同じ問題が、様々な器官（肝臓、肺、腫瘍組織、胃腸管）から生検を採取する過程ならびに腹腔鏡手術において生じ得る。これらすべての状況に共通するのは、外科的手術手技（縫合、クリップ等）によって止血を行うことの困難さであり、これはまた、出血が広汎性である場合（出血性胃炎および大量の子宮出血）にもあてはまる。急性かつ大量の出血は、抗凝固療法時に、与えられた治療によって不完全な止血が誘発された被験体においても起こり得る。かかる被験体は、抗凝固作用を速やかに中和しなければならない場合は外科的処置を必要とし得る。根治的恥骨後前立腺切除術は、限局性前立腺癌を有する被験体に対して一般的に実施される手技である。この手術は、重大な、時として大量の失血によってしばしば困難になる。前立腺切除術の間の多量の失血は、主として、外科的止血が容易にアクセスできない様々な密に血管形成された部位を伴い、大きな領域から広範な出血を生じさせ得る、複雑な解剖学的状況に関連する。また、脳内出血は脳卒中の最も治療が難しい形態であり、脳内出血後数時間以内に高い死亡率と血腫成長に結びつく。ｒＦＶＩＩａによる治療は、血腫の成長を制限し、死亡率を低下させ、９０日目の機能転帰を改善することができる。しかしながら、現在使用可能なｒＦＶＩＩａに関しては、血栓塞栓性有害事象の危険性が存在する。血栓形成性がより低い本発明のキメラ第ＶＩＩ因子分子は、脳卒中治療におけるこの問題を克服し得る。不十分な止血の場合に問題を引き起こし得るもう１つの状況は、正常な止血機構を有する被験体が血栓塞栓症を予防するために抗凝固療法を受ける場合である。かかる療法は、ヘパリン、他の形態のプロテオグリカン、ワルファリンまたは他の形態のビタミンＫアンタゴニストならびにアスピリンおよび他の血小板凝固阻害剤を含み得る。
【００６１】
本発明の１つの実施形態では、出血は血友病に関連する。もう１つの実施形態では、出血は、後天性インヒビターを有する血友病に関連する。もう１つの実施形態では、出血は血小板減少症に関連する。もう１つの実施形態では、出血はフォン・ヴィレブランド病に関連する。もう１つの実施形態では、出血は重症組織損傷に関連する。もう１つの実施形態では、出血は重度の外傷に関連する。もう１つの実施形態では、出血は手術に関連する。もう１つの実施形態では、出血は腹腔鏡手術に関連する。もう１つの実施形態では、出血は出血性胃炎に関連する。もう１つの実施形態では、出血は大量の子宮出血に関連する。もう１つの実施形態では、出血は、機械的止血の可能性が限られている器官で起こる。もう１つの実施形態では、出血は脳、内耳領域または眼において生じる。もう１つの実施形態では、出血は生検を採取する過程に関連する。もう１つの実施形態では、出血は抗凝固療法に関連する。
【００６２】
本明細書で使用される「被験体」という用語は、任意の動物、特にヒトなどの哺乳動物を意味することが意図され、適切な場合は、「患者」という用語と交換可能に使用され得る。
【００６３】
「正常な止血系の増強」という用語は、トロンビンを産生するまたは機能性血餅を生成する能力の改善を意味する。
【００６４】
「遺伝子治療」という用語は、遺伝子の外因性投与によって内因性遺伝子の発現を変化させる方法を指す。本明細書で使用される、「遺伝子治療」はまた、その必要のある個体の体細胞または幹細胞に、欠陥があるまたは欠如している遺伝子に対応する機能性遺伝子を導入することによる、欠陥タンパク質をコードする欠陥遺伝子の置換または欠如遺伝子の補充を指す。遺伝子治療は、分化した細胞または体性幹細胞を個体の体内から取り出し、続いて、ウイルスベクターを遺伝子送達ビヒクルとして用いて欠陥遺伝子の正常なコピーを外植された細胞に導入する、エクスビボ法によって実施され得る。加えて、インビボでの直接遺伝子導入技術は、治療効果を達成するために広範囲のウイルスベクター、リポソーム、タンパク質ＤＮＡ複合体または裸のＤＮＡを用いてインサイチューで個体の細胞に遺伝子導入することを可能にする。「遺伝子治療」という用語はまた、欠陥遺伝子またはタンパク質が欠陥でなかった場合に機能するはずであるのと実質的に同じように機能するポリヌクレオチドを、その必要のある個体の体細胞または幹細胞に導入することによる、欠陥タンパク質をコードする欠陥遺伝子の置換を指す。
【００６５】
本発明において、遺伝子治療は、本発明のキメラＦＶＩＩをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を被験体に投与することに関連して用いられる。従って、本発明は、本発明のキメラＦＶＩＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。かかる核酸分子は核酸構築物（例えばベクターまたはプラスミド）中に存在し得る。かかる核酸構築物は細胞中に存在し得る。さらに、本発明のキメラＦＶＩＩタンパク質を細胞に送達する方法が本明細書で提供され、該方法は、キメラＦＶＩＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を、該ヌクレオチド配列が細胞において発現されてキメラＦＶＩＩタンパク質を生成する条件下で細胞に導入することを含む。細胞は、被験体に導入される細胞であり得るおよび／または被験体において既に存在する細胞であり得る。
【００６６】
[キメラ第ＶＩＩ因子の作製]
本明細書で述べるキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、組換え核酸技術によって作製され得る。一般に、クローニングされた野生型第ＶＩＩ因子核酸配列を、所望タンパク質をコードするように修飾する。次に、この修飾された配列を発現ベクターに挿入し、今度はこの発現ベクターを宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトする。高等真核細胞、特に培養された哺乳動物細胞が宿主細胞として適切である。ヒト第ＶＩＩ因子についての完全なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が知られており（組換えヒト第ＶＩＩ因子のクローニングおよび発現が記載されている米国特許第４，７８４，９５０号、ならびにＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号Ｊ０２９３３およびＡＡＡ５１９８３ならびにＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０８７０９−１参照）、該アミノ酸配列を本明細書で配列番号：１８として示す。ウシ第ＶＩＩ因子配列は、Ｔａｋｅｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４８６８−１４８７２（１９８８））に記載されている。第ＩＸ因子についての完全なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が知られており（Ｄａｖｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ １９８２；７９：６４６１−６４６４；Ｊａｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８３；１１：２３２５−２３３５；およびＭｃＧｒａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８５；８２：２８４７−２８５１ならびにＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号Ｊ００１３６およびＡＡＡ９８７２６ならびにＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ００７４０参照）、該アミノ酸配列を本明細書で配列番号：１９として提供する。プロテインＳについても完全なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が知られており（Ｈｏｓｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８７；８４：３４９−３５３ならびにＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号Ｍ１５０３６およびＡＡＡ３６４７９ならびにＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０７２２５参照）、該アミノ酸配列を本明細書で配列番号：２０として提供する。他の凝固タンパク質についての完全なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列も知られており、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔを用いてまたはＮＣＢＩウエブページで見ることができる。
【００６７】
アミノ酸配列の変化は様々な技術によって達成され得る。核酸配列の修飾は、部位特異的突然変異誘発によって実施し得る。部位特異的突然変異誘発のための技術は当技術分野において公知であり、例えば、Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（ＤＮＡ ３：４７９−４８８，１９８４）または「Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｖｅｒｌａｐ」，Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ７７，１９８９，ｐｐ．６１−６８に記載されている。従って、第ＶＩＩ因子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を使用して、選択した変化を導入し得る。同様に、特異的なプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応を用いてＤＮＡ構築物を作製するための手順も当業者に公知である（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ参照）。加えて、本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、様々なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にユニーク制限部位を導入することによって作製でき、これを使用して、様々なポリペプチドのドメイン全体をコードするヌクレオチド配列のフラグメントを単離することができる。その後、これらの様々なヌクレオチド配列を組み換えて、本発明の様々なキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドを作製することができる。
【００６８】
例えば、ＧＬＡ、ＥＧＦ−１、ＥＧＦ−２および触媒ドメインを様々な凝固タンパク質の間で自由に交換し得るように、様々な凝固タンパク質をコードするヌクレオチド配列にユニーク制限部位を導入し得る。ＥＧＦ−１ドメインはＥＧＦ−２ドメインの周囲を自由に回転することができるが（Ｐｉｋｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９９；９６：８９２５−８９３０）、ＧＬＡドメインおよびＥＧＦ−１ドメインは、カルシウムが存在する場合は互いの周囲を自由に回転できない（Ｓｕｎｎｅｒｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９５；２：５０４−５０９）。この実施形態では、ＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインは同じ凝固タンパク質に由来し得るが、ＥＧＦ−２および触媒ドメインとは異なるタンパク質に由来し得る。従って、本発明のキメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドは、１つのドメインの少なくとも５０％が第ＶＩＩ因子ドメインであることを条件として、凝固タンパク質の任意のものに由来するドメインを含み得る。さらに、本発明のキメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドは、同じタンパク質または異なるタンパク質に由来するＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインを含み得る。
【００６９】
本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドをコードする核酸構築物は、適切には、例えば標準的な技術に従ってゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを作製し、合成オリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションによって様々なポリペプチドの全部または一部をコードするＤＮＡ配列をスクリーニングすることによって得られる、ゲノムまたはｃＤＮＡ起源のものであり得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ．Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９参照）。
【００７０】
キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドをコードする核酸構築物はまた、確立された標準的な方法、例えばＢｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２（１９８１），１８５９−１８６９によって述べられているホスホルアミダイト法またはＭａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ３（１９８４），８０１−８０５によって述べられている方法によって合成的に作製し得る。ホスホルアミダイト法によれば、例えば自動ＤＮＡ合成装置において、オリゴヌクレオチドを合成し、精製して、アニーリングし、連結して、適切なベクターにクローニングする。
【００７１】
さらに、核酸構築物は、標準的な技術に従って、核酸構築物全体の様々な部分に対応するフラグメントである、合成、ゲノムまたはｃＤＮＡ起源（適宜に）のフラグメントを連結することによって作製される、合成とゲノムの混合型、合成とｃＤＮＡ起源の混合型またはゲノムとｃＤＮＡ起源の混合型であり得る。
【００７２】
本発明によるキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドを作製する際に使用するためのＤＮＡ配列は、典型的には、適切な翻訳後プロセシング（例えばグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化）および宿主細胞からの分泌を得るために第ＶＩＩ因子のアミノ末端でプレプロポリペプチドをコードする。該プレプロポリペプチドは、第ＶＩＩ因子または別のビタミンＫ依存性血漿タンパク質、例えば第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロトロンビン、プロテインＣもしくはプロテインＳなどのものであり得る。当業者に認識されるように、付加的な修飾は、それらの修飾が凝固因子として働くタンパク質の能力を有意に損なわない場合は、キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドのアミノ酸配列において為され得る。
【００７３】
第ＶＩＩａ因子変異体を発現する際に使用するための発現ベクターは、クローニングされた遺伝子またはｃＤＮＡの転写を指令することができるプロモータを含む。培養された哺乳動物細胞における使用のための適切なプロモータは、ウイルスプロモータおよび細胞プロモータを含む。ウイルスプロモータは、ＳＶ４０プロモータ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４−８６４，１９８１）およびＣＭＶプロモータ（Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０，１９８５）を含む。特に適切なウイルスプロモータは、アデノウイルス２由来の主要後期プロモータである（Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１３０４−１３１９，１９８２）。もう１つの特に好ましいプロモータは、チャイニーズハムスター伸長因子１−α（ＣＨＥＦ１）プロモータである。細胞プロモータは、マウスκ遺伝子プロモータ（Ｂｅｒｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：７０４１−７０４５，１９８３）およびマウスＶＨプロモータ（Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３３：８５−９３，１９８３）を含む。特に適切な細胞プロモータは、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモータである（Ｐａｌｍｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２：８０９−８１４，１９８３）。発現ベクターはまた、プロモータから下流でかつキメラ第ＶＩＩ因子配列自体の挿入部位から上流に位置する一組のＲＮＡスプライス部位を含み得る。適切なＲＮＡスプライス部位は、アデノウイルスおよび／または免疫グロブリン遺伝子から得られ得る。また、挿入部位の下流に位置するポリアデニル化シグナルも発現ベクター中に含まれる。特に適切なポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０由来の早期または後期ポリアデニル化シグナル（Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ）、アデノウイルス５ Ｅｌｂ領域由来のポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター（ＤｅＮｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：３７１９−３７３０，１９８１）またはヒト第ＶＩＩ因子遺伝子もしくはウシ第ＶＩＩ因子遺伝子由来のポリアデニル化シグナルを含む。発現ベクターはまた、プロモータとＲＮＡスプライス部位の間に位置するアデノウイルス２の３分節リーダーなどの非コードウイルスリーダー配列、およびＳＶ４０エンハンサなどのエンハンサ配列も含み得る。
【００７４】
クローニングされたＤＮＡ配列を、例えばリン酸カルシウムを介したトランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １４：７２５−７３２，１９７８；Ｃｏｒｓａｒｏ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：６０３−６１６，１９８１；Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２ｄ：４５６−４６７，１９７３）または電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１：８４１−８４５，１９８２）によって、培養された哺乳動物細胞に導入する。外因性ＤＮＡを発現する細胞を同定し、選択するために、選択可能な表現型を付与する遺伝子（選択マーカー）を、一般に、対象とする遺伝子またはｃＤＮＡと共に細胞に導入する。適切な選択マーカーは、ネオマイシン、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を付与する遺伝子を含む。選択マーカーは、増幅可能な選択マーカーであり得る。適切な増幅可能選択マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）配列である。もう１つの適切な選択マーカーはヒスチジノールである。選択マーカーは、Ｔｈｉｌｌｙ（引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，ＭＡ）によって総説されている。当業者は、適切な選択マーカーを容易に選択することができる。
【００７５】
選択マーカーは、対象とする遺伝子と同時に別々のプラスミド上で細胞に導入され得るか、または同じプラスミド上で導入され得る。同じプラスミド上の場合、選択マーカーと対象遺伝子は異なるプロモータまたは同じプロモータの制御下にあってよく、後者の配置はジシストロニックメッセージを生成する。このタイプの構築物は当技術分野において知られている（例えば、Ｌｅｖｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｓｉｍｏｎｓｅｎ，米国特許第４，７１３，３３９号）。また、「担体ＤＮＡ」として知られている付加的なＤＮＡを、細胞に導入される混合物に添加することも好都合であり得る。
【００７６】
細胞はＤＮＡを取り込んだ後、適切な増殖培地において、典型的には１〜２日間増殖され、対象とする遺伝子の発現を開始する。細胞を培養するために使用する培地は、適切な添加物を含有する最小または複合培地などの、宿主細胞を増殖させるのに適した任意の従来培地であり得る。適切な培地は、商業的供給者から入手可能であるか、または公表されている配合（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログにおいて）に従って調製され得る。培地は当技術分野において知られている手順を用いて調製される（例えば、細菌および酵母に関する参考文献；Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｗ．ａｎｄ ＬａＳｕｒｅ，Ｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｍｏｒｅ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｕｎｇｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＣＡ， １９９１参照）。増殖培地は一般に、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、必須糖、ビタミン、塩、リン脂質、タンパク質および増殖因子を含有する。γ−カルボキシル化されたキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドの生成のためには、培地はビタミンＫを、好ましくは約０．１ｎｇ／ｍｌから約２０μｇ／ｍｌの濃度で含有する。次に薬剤選択を適用して、選択マーカーを安定に発現している細胞の増殖物を選択する。増幅可能な選択マーカーでトランスフェクトした細胞に関しては、増大したコピー数のクローン化配列を選択するために、薬剤濃度を高めてもよく、それによって発現レベルを上昇させ得る。次に、安定にトランスフェクトされた細胞のクローンを、所望のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドの発現に関してスクリーニングする。
【００７７】
適切な哺乳動物細胞株は、ＣＨＯ細胞株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、ＣＯＳ−１細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞株および２９３細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３；Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２，１９７７）を含む。適切なＢＨＫ細胞株は、本明細書中以下ではＢＨＫ５７０細胞と称する、ｔｋ．ｓｕｐ．−ｔｓ１３ ＢＨＫ細胞株である（Ｗａｅｃｈｔｅｒ ａｎｄ Ｂａｓｅｒｇａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：１１０６−１１１０，１９８２）。ＢＨＫ ５７０細胞株は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ １０３１４の下にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０８５２から入手可能である。ｔｋ−ｔｓ１３ＢＨＫ細胞株も、アクセッション番号ＣＲＬ １６３２の下にＡＴＣＣから入手可能である。加えて、Ｒａｔ Ｈｅｐ Ｉ細胞（ラット肝細胞癌；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６００）、Ｒａｔ Ｈｅｐ ＩＩ細胞（ラット肝細胞癌；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５４８）、ＴＣＭＫ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １３９）、ヒト肺細胞（ＡＴＣＣ ＨＢ ８０６５）、ＮＣＴＣ １４６９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９．１）およびＤＵＫＸ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０，１９８０）を含む、多くの他の細胞株を使用し得る。
【００７８】
本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、インビボでのポリペプチドの半減期を延長させるためにコンジュゲート化し得る。かかるコンジュゲート化は、キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドの投与頻度を低減する一方で、腎クリアランスを低下させ、インビボで存在する第ＶＩＩ因子の量を増加させ得る。適切なコンジュゲートおよびコンジュゲート化第ＶＩＩ因子ポリペプチドを作製する方法は、その全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとする、米国特許第７，４４２，５２４号に記載されている。
【００７９】
[トランスジェニック動物]
本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドを作製するためにトランスジェニック動物技術を使用し得る。宿主雌性哺乳動物の乳腺中でタンパク質を生成することが好ましい。乳腺中での発現およびその後の乳中への対象タンパクの分泌は、他の供給源からタンパク質を単離する際に遭遇する多くの困難を克服する。乳は容易に収集され、大量に入手可能であり、生化学的に広く特徴付けられている。さらに、主要な乳タンパク質は乳中に高濃度で存在する（典型的には約１〜１５ｇ／ｌ）。本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドはまた、宿主動物の尿中でも生成でき、これは、雄性と雌性の両方の動物が尿を生成することおよび単離のためには乳中よりも尿中の方が失われるタンパク質が少ないという点で乳中での生成よりも有利である。
【００８０】
本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドの供給源として乳を使用することを考慮する場合、商業的見地から、大量の乳算出量を有する種を宿主として用いることが明らかに好ましい。マウスおよびラットなどのより小さな動物も使用できる（および原理段階の証明においては好ましい）が、ブタ、ヤギ、ヒツジおよびウシを含むがこれらに限定されない、家畜哺乳動物を用いることが好ましい。ヒツジは、この種における遺伝子組換えの前歴、乳算出量、コストおよびヒツジの乳を収集するための装置が容易に利用可能であることなどの因子のために、特に好ましい（例えば、宿主の種の選択に影響を及ぼす因子の比較に関しては国際公開公報第ＷＯ８８／００２３９号参照）。イーストフリースランドシープ（Ｅａｓｔ Ｆｒｉｅｓｌａｎｄ ｓｈｅｅｐ）のような、酪農用に育種された宿主動物の品種を選択すること、または後日にトランスジェニック系統の交配によって搾乳用家畜を導入することが一般に望ましい。いずれの場合も、既知の、健康状態の良好な動物を使用すべきである。
【００８１】
乳腺における発現を得るために、乳タンパク質遺伝子由来の転写プロモータを使用する。乳タンパク質遺伝子は、カゼイン（米国特許第５，３０４，４８９号参照）、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミンおよび乳清酸性タンパク質をコードする遺伝子を含む。β−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）プロモータが適切である。ヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子の場合は、遺伝子の５’フランキング配列の少なくとも近位の４０６ｂｐの領域が一般的に使用されるが、β−ラクトグロブリン遺伝子の５’フランキングプロモータおよび非コード部分を包含する約４．２５ｋｂｐのＤＮＡセグメントなどの、約５ｋｂｐまでの５’フランキング配列のより大きな部分が適切である（Ｗｈｉｔｅｌａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８６：３１−３９（１９９２）参照）。他の種に由来するプロモータＤＮＡの同様のフラグメントも適切である。
【００８２】
尿における発現を得るために、尿路上皮特異的プロモータを使用する。例えば、ウロプラキン関連遺伝子の発現を駆動するプロモータが使用できる（例えば、その全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとする、米国特許第６，００１，６４６号参照）。
【００８３】
β−ラクトグロブリン遺伝子の他の領域も、発現される遺伝子のゲノム領域と同様に、構築物に組み込み得る。イントロンを欠く構築物は、例えば、かかるＤＮＡ配列を含むものと比較して十分に発現されないことが当技術分野で一般的に認められている（各々を引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：８３６−８４０（１９８８）；Ｐａｌｍｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４７８−４８２（１９９１）；Ｗｈｉｔｅｌａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．１：３−１３（１９９１）；国際公開公報第ＷＯ８９／０１３４３号；および国際公開公報第ＷＯ９１／０２３１８号参照）。これに関して、可能な場合は、対象とするタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子の天然イントロンの全部または一部を含むゲノム配列を使用することが一般に好ましく、従って、例えばβ−ラクトグロブリン遺伝子由来の、少なくともいくつかのイントロンをさらに含むことが好ましい。かかる領域の１つは、ヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子の３’非コード領域由来の、イントロンのスプライシングおよびＲＮＡのポリアデニル化を提供するＤＮＡセグメントである。遺伝子の天然３’非コード配列を置換した場合、このヒツジβ−ラクトグロブリンセグメントは、対象タンパク質またはポリペプチドの発現レベルを高めかつ安定化することができる。他の実施形態では、キメラ第ＶＩＩ因子配列の開始ＡＴＧの周囲の領域を、乳特異的タンパク質遺伝子由来の対応する配列で置換する。かかる置換は、発現を増強する推定上の組織特異的開始環境を提供する。キメラ第ＶＩＩ因子プレプロ配列全体および５’非コード配列を、例えばＢＬＧ遺伝子のもので置換することは好都合であるが、より小さな領域を置換してもよい。
【００８４】
トランスジェニック動物におけるキメラＦＶＩＩａポリペプチドの発現のために、キメラ第ＶＩＩａ因子をコードするＤＮＡセグメントを、発現ユニットを生成するためにその発現に必要とされる付加的なＤＮＡセグメントに作動可能に連結する。かかる付加的なセグメントは、上記で挙げたプロモータ、ならびにｍＲＮＡの転写およびポリアデニル化の終結をもたらす配列を含む。発現ユニットは、キメラ第ＶＩＩａ因子をコードするセグメントに作動可能に連結された分泌シグナル配列をコードするＤＮＡセグメントをさらに含む。この分泌シグナル配列は、天然第ＶＩＩ因子分泌シグナル配列であり得るかまたは乳タンパク質などの別のタンパク質のものであり得る（例えば、引用することにより本明細書の一部をなすものとする、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０（１９８６）；およびＭｅａｄｅ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８７３，３１６号参照）。
【００８５】
トランスジェニック動物に使用するための発現ユニットの構築は、キメラ第ＶＩＩ因子配列を、付加的なＤＮＡセグメントを含むプラスミドまたはファージベクターに挿入することによって好都合に実施されるが、発現ユニットは、基本的には任意の一連の連結によって構築され得る。乳タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを含むベクターを提供し、乳タンパク質についてのコード配列をキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドのもので置換して、それにより乳タンパク質遺伝子の発現制御配列を含む遺伝子融合物を生成することは特に好都合である。いずれの場合も、プラスミドまたは他のベクターへの発現ユニットのクローニングは、キメラ第ＶＩＩ因子配列の増幅を促進する。増幅は、好都合には細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））宿主細胞において実施され、従ってベクターは、典型的には細菌宿主細胞において機能性の複製起点および選択マーカーを含む。発現ユニットを、次に、選択した宿主種の受精卵（初期胚を含む）に導入する。異種ＤＮＡの導入は、マイクロインジェクション（例えば米国特許第４，８７３，１９１号）、レトロウイルス感染（Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１４６８−１４７４（１９８８））または胚性幹（ＥＳ）細胞を用いた部位指定組込み（Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：５３４−５３９（１９９２）によって総説されている）を含む、いくつかの経路の１つによって実施できる。該卵をその後、偽妊娠雌性動物の卵管または子宮に移植し、出産まで発育させる。生殖細胞系に導入されたＤＮＡを担持する子は、そのＤＮＡを正常なメンデルの様式で子孫に伝えることができ、トランスジェニック集団の発生を可能にする。トランスジェニック動物を作製するための一般的な手順は当技術分野において知られている（例えば、Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８６；Ｓｉｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１７９−１８３（１９８８）；Ｗａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．３２：６４５−６５１（１９８５）；Ｂｕｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１４０−１４３（１９９０）；Ｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：８３５−８３８（１９９１）；Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：８４４−８４７（１９９１）；Ｗａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４９：１１３−１２０（１９９２）；米国特許第４，８７３，１９１号；米国特許第４，８７３，３１６号；国際公開公報第ＷＯ８８／００２３９号、国際公開公報第ＷＯ９０／０５１８８号、国際公開公報第ＷＯ９２／１１７５７号；およびイギリス特許公開公報第ＧＢ８７／００４５８号参照）。外来性ＤＮＡ配列を哺乳動物およびそれらの生殖細胞に導入するための技術はマウスにおいて最初に開発された（例えば、Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：７３８０−７３８４（１９８０）；Ｇｏｒｄｏｎ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１４：１２４４−１２４６（１９８１）；Ｐａｌｍｉｔｅｒ ａｎｄ Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｃｅｌｌ ４１：３４３−３４５（１９８５）；Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４４３８−４４４２（１９８５）；およびＨｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．参照）。これらの技術は、その後、家畜種を含むより大きな動物に関する使用のために適合された（例えば国際公開公報第ＷＯ８８／００２３９号、国際公開公報第ＷＯ９０／０５１８８号および国際公開公報第ＷＯ９２／１１７５７号；ならびにＳｉｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１７９−１８３（１９８８）参照）。要約すると、トランスジェニックマウスまたは家畜の作製においてこれまでに使用された最も効率的な経路では、対象とするＤＮＡの数百の直鎖状分子を、確立された技術に従って受精卵の前核の１つに注入する。接合子の細胞質へのＤＮＡの注入も使用し得る。
【００８６】
トランスジェニック植物における生産も使用し得る。発現は、植物全体または塊茎などの特定の器官を対象とし得る（Ｈｉａｔｔ，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：４６９−４７９（１９９０）；Ｅｄｅｌｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．１２：４４９−４５３（１９９２）；Ｓｉｊｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２１７−２２１（１９９０）；および欧州特許第ＥＰ ０ ２５５ ３７８号参照）。
【００８７】
本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドの作製はまた、例えばウサギ網状赤血球溶解物、コムギ胚芽抽出物および大腸菌無細胞系等による、インビトロでの翻訳を介して達成され得る。インビトロ翻訳はまた、連鎖または共役させ得る。連鎖インビトロ翻訳は、バクテリオファージポリメラーゼでの転写、それに続くウサギ網状赤血球溶解物またはコムギ胚芽溶解物系での翻訳に基づく。共役インビトロ翻訳は大腸菌無細胞系に基づく。
【００８８】
[回収および活性化]
本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、細胞培養培地または乳から回収される。本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、当技術分野において知られている様々な方法によって精製でき、かかる方法は、クロマトグラフィ（例えばイオン交換、アフィニティ、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動法（例えば分取等電点電気泳動（ＩＥＦ）、示差溶解度（例えば硫安沈殿）または抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．−Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｌａｒｓ Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９参照）を含むが、これらに限定されない。さらなる精製は、高速液体クロマトグラフィなどの従来の化学的精製手段によって達成され得る。クエン酸バリウム沈殿を含む他の精製方法が当技術分野において知られており、本明細書で述べる新規キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドの精製に適用し得る（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，１９８２参照）。
【００８９】
治療目的には、本発明のキメラ第ＶＩＩ因子は実質的に純粋であることが好ましい。従って、本発明の１つの実施形態では、本発明の第ＶＩＩ因子変異体は、少なくとも約９０〜９５％の純度、好ましくは少なくとも約９８％の純度に精製される。純度は、例えばゲル電気泳動、アミノ末端のアミノ酸配列決定および逆相ＨＰＬＣによって評価し得る。
【００９０】
キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、二本鎖の形態に変換するためにその活性化部位で切断される。活性化は、Ｏｓｔｅｒｕｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１：２８５３−２８５７（１９７２）；Ｔｈｏｍａｓ，米国特許第４，４５６，５９１号；Ｈｅｄｎｅｒ ａｎｄ Ｋｉｓｉｅｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７１：１８３６−１８４１（１９８３）；またはＫｉｓｉｅｌ ａｎｄ Ｆｕｊｉｋａｗａ，Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．７３：２９−４２（１９８３）によって開示されているような、当技術分野で知られている手順に従って実施し得る。あるいは、キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドを濃縮し、正に荷電した表面または樹脂と接触させることによってキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドを活性化することができ、例えばＢｊｏｅｒｎ ｅｔ ａｌ．（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ，２６９ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９８６，ｐｐ．５６４−５６５）によって述べられているように、第ＶＩＩ因子をＭｏｎｏ Ｑ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）等のようなイオン交換クロマトグラフィカラムに通すことによって活性化し得る。キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドはまた、キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドの実質的に精製された製剤を含有する溶液を得、その溶液にアミン化合物、Ｃａ２＋を約５ｍＭ〜約５０ｍＭ（約１０ｍＭ〜約３０ｍＭなど）の最終濃度になるように添加して、溶液の最終ｐＨを約７．２〜８．６（約７．６〜約８．２など）に調整し、生じた活性化混合物を約２℃〜約２５℃で、少なくとも９０％のキメラＦＶＩＩポリペプチドをキメラＦＶＩＩａポリペプチドに変換するのに十分な時間インキュベートして、任意選択的に、活性化混合物からＦＶＩＩａを単離することによって溶液中で活性化し得る。生じた活性化キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドを、その後、以下のように製剤し、投与し得る。
【００９１】
[遺伝子治療]
本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドはまた、遺伝子治療によって出血性疾患を治療する方法においても使用し得る。本発明のこの実施形態では、本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、エクスビボでの導入またはインビボでの導入によって被験体の細胞に導入され得る核酸分子によってコードされる。
【００９２】
当技術分野で利用可能な遺伝子治療のための方法のいずれもが本発明に従って使用できる。例示的な方法を以下で述べる。遺伝子治療の方法の一般的な総説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １９９３，１２：４８８−５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ １９９１，３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１９９３，３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３，２６０：９２６−９３２；およびＭｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９３，６２：１９１−２１７；Ｍａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １９９３，１１：１５５−２１５参照。使用できる組換えＤＮＡ技術の当技術分野で一般的に知られている方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；およびｉｎ Ｃｈａｐｔｅｒｓ １２ ａｎｄ １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ；Ｃｏｌｏｓｉｍｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２０００；２９（２）：３１４−８，３２０−２，３２４に記載されている。
【００９３】
キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、適切なクローニングベクターに挿入し得る。遺伝子治療に適するベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルスおよびレトロウイルス、パルボウイルス、レンチウイルスなどのウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクターならびに様々な真核および原核生物宿主における発現に関して記述されている、遺伝子治療ならびに単純なタンパク質発現のために使用し得る当技術分野で典型的に使用される他の組換えビヒクルを含む。
【００９４】
１つの実施形態では、該ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクター、特にアデノウイルスベクターは、標的細胞のウイルス感染の効率を上昇させる、カチオン性脂質、ポリＬ−リシン（ＰＬＬ）およびジエチルアミノエチルデキストラン（ＤＥＬＡＥ−デキストラン）などのカチオン性両親媒物質と複合体形成することができる（例えば、引用することにより本明細書の一部をなすものとする、１９９７年１１月２０日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／２１４９６号参照）。本発明において使用するための適切なウイルスベクターは、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、ＡＡＶおよびレトロウイルス由来のベクターを含む。遺伝子治療におけるウイルスベクターの総説については、Ｍａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２００２；４１（１２）：９０１−１１；Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．２００２；１２ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ２３−９参照。
【００９５】
１つの実施形態では、コード配列および任意の他の所望配列がゲノム内の所望部位での相同的組換えを促進する領域によって隣接され、それによりゲノムに組み込まれた核酸分子からの構築物の発現を提供するベクターが使用される（各々その全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Ｋｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８９，８６：８９３２−８９３５；Ｚｉｊｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９８９，３４２：４３５−４３８；Ｚａｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．への米国特許第６，２４４，１１３号；およびＰａｔｉ ｅｔ ａｌ．への米国特許第６，２００，８１２号）。
【００９６】
患者へのベクターの送達は、患者をベクターもしくは送達複合体に直接暴露する直接的送達、または細胞を最初にインビトロにてベクターで形質転換し、その後患者に移植する間接的送達のいずれかであり得る。これら２つのアプローチは、それぞれインビボおよびエクスビボ遺伝子治療として知られている。
【００９７】
１つの実施形態では、ベクターをインビボで直接投与し、そこでベクターは被験体の細胞に進入して、遺伝子の発現を媒介する。これは、当技術分野で知られている数多くの方法および上記で論じた方法のいずれかによって、例えばそれを適切な発現ベクターの一部として構築し、例えば欠陥もしくは弱毒化レトロウイルスまたは他のウイルスベクターを用いた感染によって（例えば米国特許第４，９８０，２８６号参照）、または裸のＤＮＡの直接注入によって、または微粒子ボンバードメント（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用によって、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤でのコーティング、バイオポリマー（例えばポリ−β−１−６４−Ｎ−アセチルグルコサミン多糖；米国特許第５，６３５，４９３号参照）への封入、リポソーム、微粒子もしくはマイクロカプセルへの封入の使用によって、ペプチドもしくは核内に進入することが公知の他のリガンドに連結して投与することによって、または受容体媒介性エンドサイトーシスを受けるリガンドに連結して投与すること（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８７，６２：４４２９−４４３２）等によって、細胞内に組み込まれるように投与することによって実施できる。もう１つの実施形態では、リガンドが、エンドソームを崩壊させ、核酸がリソソーム分解を回避することを可能にする膜融合性ウイルスペプチド、または治療用ＤＮＡを細胞に導入するために使用できる、例えばアンテナペディア由来の、カチオン性１２量体ペプチドを含む、核酸−リガンド複合体を形成することができる（Ｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ２０００，２：３３９−４７参照）。さらにもう１つの実施形態では、特定の受容体を標的することにより、細胞特異的な取込みおよび発現のために核酸をインビボで標的することができる（例えば、国際公開公報第ＷＯ９２／０６１８０号、国際公開公報第ＷＯ９２／２２６３５号、国際公開公報第ＷＯ９２／２０３１６号および国際公開公報第ＷＯ９３／１４１８８号参照）。加えて、マグネトフェクションと称される技術を、ベクターを哺乳動物に送達するために使用し得る。この技術は、磁場の影響下で送達するためにベクターと超常磁性ナノ粒子を結合させる。この適用は、送達時間を短縮し、ベクターの有効性を高める（Ｓｃｈｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００２；９：１０２−９）。
【００９８】
１つの実施形態では、核酸は脂質担体を用いて投与し得る。細胞膜の通過を促進するために脂質担体を裸の核酸（例えばプラスミドＤＮＡ）と結合することができる。カチオン性、アニオン性または中性脂質がこのために使用できる。しかし、カチオン性脂質は、一般に負の電荷を有するＤＮＡとより良好に結合することが示されているため、適切である。カチオン性脂質はまた、プラスミドＤＮＡの細胞内送達を媒介することが示されている（Ｆｅｌｇｎｅｒ ａｎｄ Ｒｉｎｇｏｌｄ，Ｎａｔｕｒｅ １９８９；３３７：３８７）。マウスへのカチオン性脂質−プラスミド複合体の静脈内注射は、肺におけるＤＮＡの発現を生じさせることが示された（Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．１９８９；２９８：２７８）。また、Ｏｓａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９９６；８５（６）：６１２−６１８；Ｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １９９３；４：７８１−７８８；Ｓｅｎｉｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １９９１；１０７０：１７３−１７９）；Ｋａｂａｎｏｖ ａｎｄ Ｋａｂａｎｏｖ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１９９５；６：７−２０；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．１９９６；１３；Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１９９４；５：６４７−６５４；Ｂｅｈｒ，Ｊ−Ｐ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ １９９４；５：３８２−３８９；Ｗｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７；３６：３００８−３０１７；Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．への米国特許第５，９３９，４０１号；Ｓｃｈｅｕｌｅ ｅｔ ａｌ．への米国特許第６，３３１，５２４号も参照のこと。
【００９９】
代表的なカチオン性脂質は、例えば、その開示を引用することにより本明細書の一部をなすものとする、米国特許第５，２８３，１８５号および米国特許第５，７６７，０９９号に開示されているものを含む。１つの実施形態では、カチオン性脂質は、米国特許第５，７６７，０９９号に開示されているＮ４−スペルミンコレステリルカルバメート（ＧＬ−６７）である。さらなる適切な脂質は、Ｎ４−スペルミジンコレステリルカルバメート（ＧＬ−５３）および１−（Ｎ４−スペルミン）−２，３−ジラウリルグリセロールカルバメート（ＧＬ−８９）を含む。
【０１００】
ウイルスベクターのインビボでの投与に関して、ウイルスベクターおよびトランスフェクトされた細胞の免疫脱活性化を回避するために、適切な免疫抑制治療をウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクターと組み合わせて使用し得る。例えば、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）または抗ＣＤ４抗体などの免疫抑制性サイトカインが、ウイルスベクターに対する体液性または細胞性免疫応答をブロックするために投与し得る。それに関して、ごく少数の抗原を発現するように遺伝子操作されたウイルスベクターを用いることが好都合である。
【０１０１】
体細胞は、上述した方法のいずれかを用いて本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドをコードする構築物でエクスビボにて遺伝子操作し、個体に再移植し得る。この方法は、Ｓｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ．への国際公開公報第ＷＯ９３／０９２２２号において一般的に説明されている。加えて、この技術は、Ｐａｙｕｍｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐａｅｄ．ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｒｅｓ．２００２；４０３Ｓ：Ｓ２２８−Ｓ２４２に記載されている、細胞ベースの送達についての特許ＩｍＰＡＣＴ技術で使用される。かかる遺伝子治療系では、体細胞（例えば線維芽細胞、肝細胞または内皮細胞）を患者から取り出し、インビトロで培養して、治療対象の遺伝子でトランスフェクトし、特徴付けて、患者に再び導入する。一次細胞（個体または組織に由来し、継代の前に遺伝子操作された）および二次細胞（インビボでの導入の前にインビトロで継代した）の両方、ならびに当技術分野で知られている不死化細胞株を使用し得る。本発明の方法のために有用な体細胞は、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、血液の有形成分、筋肉細胞、培養できる他の体細胞および体細胞前駆体などの体細胞を含むが、これらに限定されない。１つの実施形態では、細胞は肝細胞である。
【０１０２】
本発明のキメラＦＶＩＩａポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および、任意選択的に、選択マーカーをコードする核酸を、受容者の一次または二次細胞におけるキメラＦＶＩＩａの発現のために必要な付加的配列と共に含む構築物を使用して、コードされた産物が生成される一次または二次細胞をトランスフェクトする。かかる構築物は、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、耳下腺炎ウイルスおよびポリオウイルスベクターなどの感染性ベクターを含むがこれらに限定されず、この目的に使用し得る。
【０１０３】
経皮送達は、ケラチノサイト、メラノサイトおよび樹状細胞を含む表皮の細胞型を用いた間接的導入に特に適する（Ｐｆｕｔｚｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ ２０００；９：２０６９−８３）。
【０１０４】
１つの実施形態では、遺伝子治療のためのベクターは、一本鎖自己相補性アデノ随伴ウイルスである。加えて、この自己相補性アデノ随伴ウイルスは、小さなトランスサイレチンプロモータ−エンハンサ、マウス微小ウイルスからのイントロンおよびウシ成長ホルモンからのポリアデニル化シグナルを含み得る。ベクターはまた、第ＶＩＩ因子を活性化形態、すなわち第ＶＩＩａ因子として分泌させる、Ｍａｒｇａｒｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．によって記述されたＲＫＲＲＫＲ配列も含み得る（Ｍａｒｇａｒｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２００４；１１３：１０２５−３１）。
【０１０５】
[投与および医薬組成物]
本発明によるキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、凝固因子欠損症（例えば血友病ＡおよびＢまたは凝固第ＸＩ因子もしくは第ＶＩＩ因子の欠損）または凝固因子インヒビターなどのいくつかの原因を有する出血性疾患を管理するために使用され得、あるいはそれらは、正常に機能する血液凝固カスケードを有する（凝固因子欠損または凝固因子のいずれかに対するインヒビターを有さない）被験体において生じる過剰の出血を制御するために使用され得る。出血は、血小板機能欠損、血小板減少症またはフォン・ヴィレブランド病によって引き起こされ得る。出血はまた、様々な刺激によって線維素溶解活性の上昇が誘発された被験体でも見られ得る。
【０１０６】
手術または外傷に関連する広範囲の組織損傷を経験した被験体では、正常な止血機構が即時止血の必要性によって圧倒されることがあり、該被験体は、正常な止血機構にも関わらず出血を発現し得る。十分な止血を達成することは、脳、内耳領域および眼などの器官で出血が起こる場合にも問題であり、また、発生源を同定することが困難である広汎性出血（出血性胃炎および大量の子宮出血）の場合にも問題であり得る。同じ問題が、様々な器官（肝臓、肺、腫瘍組織、胃腸管）から生検を採取する過程ならびに腹腔鏡手術において生じ得る。これらの状況は、外科的手術手技（縫合、クリップ等）によって止血を行うことが困難であるという共通点を有する。急性かつ大量の出血はまた、抗凝固療法時に、与えられた治療によって不完全な止血が誘発された被験体においても起こり得る。かかる被験体は、抗凝固作用を速やかに中和しなければならない場合は外科的処置を必要とし得る。不十分な止血の場合に問題を引き起こし得るもう１つの状況は、正常な止血機構を有する被験体が血栓塞栓症を予防するために抗凝固療法を受ける場合である。かかる療法は、ヘパリン、他の形態のプロテオグリカン、ワルファリンまたは他の形態のビタミンＫアンタゴニストならびにアスピリンおよび他の血小板凝固阻害剤を含み得る。
【０１０７】
計画的処置に関連する治療に関して、本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、典型的には処置を実施する前の約２４時間以内、およびその後７日間またはそれ以上投与される。凝固薬としての投与は、本明細書で述べる様々な経路によって実施できる。
【０１０８】
キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドの用量は、被験体の体重および状態の重症度に依存して、負荷用量および維持用量として７０ｋｇの被験体について約０．０５ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日、好ましくは約１ｍｇ／日〜約２００ｍｇ／日、より好ましくは約１０ｍｇ／日〜約１７５ｍｇ／日の範囲である。当業者は、所与の被験体および所与の状態についての最適用量を決定することができる。
【０１０９】
医薬組成物は、主として予防的および／または治療的処置のための非経口投与を意図される。好ましくは、医薬組成物は非経口的に、すなわち静脈内、皮下もしくは筋肉内経路で投与されるか、または持続的もしくはパルス注入によって投与され得る。あるいは、医薬組成物は、経口的、皮下的、静脈内、脳内、鼻内、経皮的、腹腔内、筋肉内、肺内、経膣的、経直腸的、眼内経路または任意の他の許容される方法を含むがこれらに限定されない、様々な方法での投与用に製剤され得る。
【０１１０】
非経口投与用の組成物は、医薬的に許容される担体、好ましくは水性担体と組み合わせた、好ましくはその中に溶解された、本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する。水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グリシン等のような、様々な水性担体を使用し得る。本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドはまた、メチオニンおよびスクロースなどの、安定性および保存を延長させる組成物と共に製剤化され得る。本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドはまた、損傷の部位への送達または標的化のためにリポソーム製剤に製剤することができる。リポソーム製剤は、例えば米国特許第４，８３７，０２８号、米国特許第４，５０１，７２８号および米国特許第４，９７５，２８２号において一般的に説明されている。組成物は、従来の公知の滅菌技術によって滅菌され得る。生じた水溶液を、使用のために包装し得るか、または無菌条件下でろ過し、凍結乾燥して、凍結乾燥製剤を投与の前に滅菌水溶液と組み合わせ得る。組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、張度調整剤等のような、生理的条件に近付けるために必要な医薬的に許容される補助物質、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等を含有し得る。組成物はまた、防腐剤、等張化剤、非イオン性界面活性剤または洗浄剤、抗酸化剤および／または他の種々の添加物も含有し得る。
【０１１１】
これらの製剤中のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドの濃度は広く異なり、すなわち約０．５重量％未満、通常は約１重量％またはそれ以下から約１５または２０重量％までにわたり得、選択される特定の投与方法に従い、主として液体の容量、粘度等によって選択される。従って、静脈内注入用の典型的な医薬組成物は、滅菌リンガー液２５０ｍｌおよびキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチド１０ｍｇを含有するように作製され得る。非経口的に投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、公知であるかまたは当業者に明らかであり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０）の中でより詳細に説明されている。
【０１１２】
本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与できる。治療適用では、組成物を、上述したように既に疾患に罹患している被験体に、疾患およびその合併症を治療する、緩和するまたは部分的に停止させるのに十分な量で投与する。これを達成するのに適切な量は、「治療有効量」と定義される。当業者に理解されるように、このために有効な量は、疾患または損傷の重症度ならびに被験体の体重および全身状態に依存する。しかし一般に、有効量は、７０ｋｇの被験体についてキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチド約０．０５ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日の範囲であり、キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチド約１．０ｍｇ／日〜約２００ｍｇ／日の用量がより一般的に使用される。
【０１１３】
本発明の物質は、一般に、重篤な疾患または損傷状態、すなわち生命を脅かすまたは潜在的に生命を脅かす状況において使用され得ることに留意しなければならない。かかる場合、外来性物質が最小限であることおよび一般にヒトにおいてヒト第ＶＩＩ因子の免疫原性がないことを考慮すると、実質的に過剰なこれらのキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチド組成物を投与することが可能であり、治療医師はこれを望ましいと考えるはずである。
【０１１４】
予防適用では、本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する組成物を、被験体自身の凝固能力を増強するために疾患状態または損傷を生じやすいまたはその危険性がある被験体に投与する。かかる量は、「予防有効量」と定義される。予防適用では、正確な量は、やはり被験体の健康状態と体重に依存するが、用量は一般に７０ｋｇの被験体について約０．０５ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日、より一般的には７０ｋｇの被験体について約１．０ｍｇ／日〜約２００ｍｇ／日の範囲である。
【０１１５】
組成物の単回または多回投与を、治療医師によって選択される用量レベルおよびパターンで実施し得る。毎日の維持レベルを必要とする通院被験体については、キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドを、例えば携帯ポンプシステムを用いた持続注入によって投与し得る。
【０１１６】
本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドはまた、徐放性または持続放出性製剤に製剤化し得る。徐放性または持続放出性製剤を製剤化する方法は当技術分野において知られており、ポリペプチドを含有する固体疎水性粒子の半透性マトリックスを含むが、これに限定されない。
【０１１７】
例えば局所適用などの、本発明のキメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの局所送達は、例えば、スプレー、灌流、二重バルーンカテーテル、ステントによって、人工血管またはステントに組み込んで、バルーンカテーテルを被覆するのに使用されるヒドロゲルによって、または他の広く確立された方法によって実施し得る。いずれの場合も、医薬組成物は、被験体を有効に治療するのに十分な量の第ＶＩＩ因子変異体を提供すべきである。
【０１１８】
以下の実施例は本発明を説明するために含まれるものである。以下の実施例の特定の態様を、本発明の実施において良好に機能するように発明者が見出したまたは企図した技術および手順に関して述べる。本開示および当技術分野の一般的な技術レベルに照らして、当業者は、以下の実施例が例示だけを意図し、本発明の範囲から逸脱することなく数多くの変更、修正および改変を用い得ることを認識する。
【０１１９】
[実施例１：キメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの構築および発現]
ヒト第ＶＩＩ因子およびヒト第ＩＸ因子の両方のｃＤＮＡを入手し、ドメイン交換を容易にするために以下のユニーク制限部位を導入した。
ＢｓｔＥＩＩ部位をＥＧＦ−１ドメインの５’末端に（第ＶＩＩ因子の残基４７〜４９、第ＩＸ因子の残基４８〜５０）、
ＳａｃＩ部位をＥＧＦ−１とＥＧＦ−２ドメインの接合部に（第ＶＩＩ因子の残基８２〜８３、第ＩＸ因子の残基８３〜８４）、
ＮｏｔＩ部位をＥＧＦ−２ドメインの３’末端に（第ＶＩＩ因子の残基１３５〜１３７、第ＩＸ因子の残基１３２〜１３４）導入した。
【０１２０】
第ＶＩＩ因子と第ＩＸ因子の間でドメインを交換するためのこれらの制限部位を用いて様々なキメラを構築し、図１に示している。同じかまたは同様の制限部位を使用して第ＶＩＩ因子とプロテインＳとの間でドメインを交換し得る。
【０１２１】
生じたキメラのアミノ酸配列を配列番号：１（第ＩＸ因子のシグナル、プロペプチド、ＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインと、第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメイン）および配列番号：２（第ＩＸ因子のシグナルおよびプロペプチドドメインと、プロテインＳのＧＬＡドメインと、第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインと、第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメイン）に示す。これらの組換えＤＮＡから選択したものを、哺乳動物細胞のトランスフェクションのために発現ベクターｐＣＭＶ５にサブクローニングした。
【０１２２】
生じた組換え構築物を、次に、ｐＳＶ２ｎｅｏおよびｐＣＭＶｈＧＣを用いて２９３ヒト腎細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）に同時トランスフェクトした。高レベルの各構築物を発現するクローンを選択し、先に述べられているようにスクリーニングした（Ｔｏｏｍｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１９１９８−１９２０２）。各々のスクリーニングしたクローンを、大規模生産のために９００ｃｍ２のローラーボトルに広げ、組換えタンパク質を、Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いた偽アフィニティクロマトグラフィ法、および、カルシウム勾配、次いでＮａＣｌ勾配での溶出によって精製した。
【０１２３】
[実施例２：第ＶＩＩａ因子ポリペプチドのトロンビン産生]
第ＶＩＩａ因子のトロンビン産生を、血友病のインビトロモデルを用いて測定した。単球を組織因子の供給源として使用し、不活性化血小板と、血漿濃度の第Ｖ、第ＶＩＩ、第ＩＸ、第ＶＩＩＩおよび第ＸＩ因子ならびに血漿濃度の抗トロンビンおよびＴＦＰＩを含有する合成血漿とを組み合わせた。第ＶＩＩＩおよび第ＩＸ因子を除外することによって血友病状態を作り出した。
【０１２４】
健常個体から血液４ｍｌを採取し、クエン酸ナトリウム管に入れて単球を調製した。血液を１５ｍｌ円錐管中のＡｃｃｕ−Ｐｒｅｐ（商標）リンパ球分離培地（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＮＹ，ＵＳＡ）３ｍｌの上に注意深く層状に重ね、１５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。次に単核層を取り出し、４℃で等容量のＶｅｒｓｅｎｅ（Ｌｉｎｅｂｅｒｇｅｒ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ）に添加して、８００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。生じたペレットを４℃でＶｅｒｓｅｎｅ ５ｍｌに再懸濁し、８００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。生じたペレットを、５００ｎｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ，ＵＳＡ）を添加したマクロファージＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）４ｍｌに再懸濁し、細胞を９６ウェルプレートに２００μｌ／ウェルで播種した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートし、次にマクロファージＳＦＭ培地で３回洗浄して、その後一晩インキュベートした。
【０１２５】
健常個体から血液４ｍｌを採取し、クエン酸ナトリウム管に入れて血小板を調製した。血液を、１５ｍｌ円錐管中のＡｃｃｕ−Ｐｒｅｐ（商標）リンパ球分離培地（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＮＹ，ＵＳＡ）５ｍｌの上に、注意深く層状に重ね、１５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。次に血小板層を取り出し、等容量のクエン酸−グルコース−食塩水および１０μｇ／ｍｌのプロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ，ＵＳＡ）に添加して、８００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。生じたペレットを廃棄し、１ｍｇ／ｍｌオボアルブミンを添加したカルシウム不含タイロード緩衝液中でセファロースゲルろ過によって血漿タンパク質から血小板を単離した。回収した血小板を３７℃で保存した。
【０１２６】
血友病を模倣するインビトロアッセイのための合成血漿を、５μｇ／ｍｌの濃度の第ＸＩ因子Ｃ−１エステラーゼインヒビターを使用して、あらかじめ調製しておいた単球と共に１時間インキュベートした後、２００μｇ／ｍｌの抗トロンビン、０．０７μｇ／ｍｌのＴＦＰＩ、１００ｍｇ／ｍｌのプロトロンビン、８μｇ／ｍｌの第Ｘ因子および０．５μｇ／ｍｌの第ＶＩＩ因子を添加して作製した。一晩インキュベートした後、第Ｖ因子を７μｇ／ｍｌの濃度で添加した。正常条件については、１時間インキュベートした後、第ＩＸ因子を４μｇ／ｍｌの濃度で添加し、一晩インキュベートした後、第ＶＩＩＩ因子を１Ｕ／ｍｌで添加した。
【０１２７】
血小板２６０μｌを上記合成血漿溶液に添加し、生じた懸濁液を単球に添加して反応を開始させた。一定の時間間隔で試料１０μｌを取り出し、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５ｍＭ Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（Ｃｅｎｔｅｒｃｈｅｍ Ｉｎｃ．，ＣＴ，ＵＳＡ）を含有するトロンビンアッセイ緩衝液９０μｌに添加した。５０％酢酸１００μｌを添加して合成基質切断を停止させ、４０５ｎｍでＯＤを測定した。以下の式を用いてトロンビン濃度を決定した。
［トロンビン］＝希釈×（（Ａ４０５−バックグラウンド）／（停止−開始））／（変換係数）
式中、変換係数が１ｎＭである場合、トロンビンは４０５ｎｍで０．０１１７ＯＤ／分の変化量を与える。
【０１２８】
正常条件（第ＶＩＩＩおよび第ＩＸ因子を含む）でのトロンビン産生は、短い遅滞期でピークトロンビン産生を示す（図２）。野生型第ＶＩＩａ因子の濃度上昇は、血友病条件でのトロンビン産生を改善した（図２）。
【０１２９】
[実施例３：キメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドのトロンビン産生]
実施例１で作製したキメラタンパク質のトロンビン産生を、実施例２で述べた血友病のインビトロモデルを用いて測定した。１０ｎＭの、第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインと第ＩＸ因子のＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインとを含むキメラ第ＶＩＩａ因子、または第ＶＩＩ因子のＧＬＡ、ＥＧＦ−２および触媒ドメインと第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインとを含むキメラ第ＶＩＩａ因子の添加は、５０ｎＭの野生型第ＶＩＩａ因子と同様の活性を有していた（図３）。
【０１３０】
対照と比較してピークトロンビン産生を検討すると、野生型第ＶＩＩａ因子または試験したキメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドのいずれもが、対照レベルまでのピークトロンビン産生を回復していなかった。しかし、１０ｎＭの、第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインと第ＩＸ因子のＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインとを含むキメラ第ＶＩＩａ因子、または第ＶＩＩ因子のＧＬＡ、ＥＧＦ−２および触媒ドメインと第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインとを含むキメラ第ＶＩＩａ因子は、５０ｎＭの野生型第ＶＩＩａ因子によって産生されるのと同様のレベルまでピークトロンビン産生を回復していた（図４）。
【０１３１】
[実施例４：キメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの凝固アッセイ]
キメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの凝固活性を、Ｂｕｙｕｅ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｂｌｏｏｄ，１１２：３２３４−３２４１によって述べられているように、凝固アッセイにおいてインビボで評価した。簡単に述べると、第ＶＩＩ因子を、脚の静脈に挿入したカテーテルを介して、血友病Ｂマウスに投与した（２ｍｇ／ｋｇのＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）、２ｍｇ／ｋｇの、第ＩＸ因子のＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインと第ＶＩＩａ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラ第ＶＩＩａ因子、または１．４ｍｇ／ｋｇの、プロテインＳのＧＬＡドメインと、第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインと、第ＶＩＩａ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラ第ＶＩＩａ因子）。野生型マウスを対照として使用した。マウスを麻酔し、他方の脚の伏在静脈を、小さなゲージの針を押し通すことによって離断した。次に鋏の先端を静脈に挿入し、小さな杯を作製するように鋏で切って遠位部分を切断した。血餅を形成させ、出血が停止するまでの時間を記録した。次に３０ゲージの針を用いて血餅を除去し、出血が停止するまでの時間を再び記録した。この工程を３０分間反復した。血餅の数を崩壊の数として記録した。記録した時間を平均し、平均時間として記録した。実験を、野生型マウス、ならびに、プロテインＳのＧＬＡドメインと第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインと第ＶＩＩａ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラ第ＶＩＩａ因子について１匹のマウスで実施した。第ＩＸ因子のＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインと第ＶＩＩａ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラ第ＶＩＩａ因子については、２匹の血友病Ｂマウスで実験を実施し、同じ結果を得た。第ＶＩＩ因子を投与しなかった血友病Ｂマウスに関して、以下の表１において記録した０．２５の崩壊は、４匹のマウスのうち１匹だけが初期損傷で出血しなかったことを示す。
【０１３２】
【表１】
【０１３３】
処置を行わなかった１匹の血友病Ｂマウス、２ｍｇ／ｋｇのＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を投与した１匹の血友病Ｂマウス、２ｍｇ／ｋｇの、第ＩＸ因子のＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインと第ＶＩＩａ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラ第ＶＩＩａ因子を投与した１匹の血友病Ｂマウスならびに処置を行わなかった１匹の野生型マウスに関して実験を反復した。２ｍｇ／ｋｇの、第ＩＸ因子のＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインと第ＶＩＩａ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインとを含むキメラ第ＶＩＩａ因子を投与した血友病Ｂマウスは、２ｍｇ／ｋｇのＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を投与した血友病Ｂマウスおよび野生型マウスよりも出血の停止までの平均時間がより短かった（図５）。
【０１３４】
[実施例５：キメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの血栓形成性]
本発明のキメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの血栓形成性を、高レベルのこれらのタンパク質を発現するマウスモデルにおいて試験することができる。近年、２μｇ／ｍｌ以上の組換え野生型マウス第ＶＩＩａ因子を発現するマウスの５０％が１６か月以内に血栓症で死亡することが示された。同様のレベルの第ＶＩＩａ因子を発現する血友病Ｂマウスは同じ死亡率を有し、マウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス系統に戻し交配した場合、はるかに早期に（４か月未満）血栓症が起こった（Ａｌｊａｍａｌｉ ＭＮ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００８；１１８：１８２５−１８３４）。
【０１３５】
２〜１０μｇまたはそれ以上のキメラポリペプチドを発現する血友病Ｂマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統）を作製することができ、キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドの発現が血栓症を引き起こす場合、これらのマウスは早期に（４か月未満）血栓症を発現するはずである。
【０１３６】
ＵＮＣにおけるｔｈｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ＣｅｎｔｅｒのＤｒ．Ｐａｕｌ Ｍｏｎａｈａｎによって開発された新しい自己相補性アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）を使用することによってマウス系統を開発し得る（Ｗｕ Ｚ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００８；１６：２８０−２８９）。このベクターは、小さなトランスサイレチンプロモータ−エンハンサ（ＴＴＲプロモータ）、マウスの微小ウイルスからのイントロン、ＭＶＭおよびウシ成長ホルモンｐＡシグナルを含む。このベクターに基づく、１×１０１１のベクターゲノムの門脈への注入は、感染から８週間以内に７μｇ／ｍｌの第ＩＸ因子の持続的発現を生じさせた（Ｗｕ Ｚ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００８；１６：２８０−２８９）。
【０１３７】
マウスおよびヒトの両方の第ＶＩＩａ因子ならびに本発明のキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドのｃＤＮＡを、血栓形成性を評価するために使用し得る。第ＶＩＩ因子を活性化形態、すなわち第ＶＩＩａ因子として分泌させる、Ｍａｒｇａｒｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．によって記述されたＲＫＲＲＫＲ（配列番号：２１）配列も使用し得る（Ｍａｒｇａｒｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２００４；１１３：１０２５−３１）。
【０１３８】
この仮説を検証するため、野生型およびキメラ第ＶＩＩ因子マウスポリペプチドを作製することができる。マウス組織因子はヒト第ＶＩＩ因子と反応しないことが報告されているので、組織因子は外傷において投与される第ＶＩＩａ因子の作用とは無関係であるが、血栓症に関係することを明らかにするためにマウスポリペプチドを使用する。この仮説を検証するために使用できるマウスポリペプチドは、野生型マウス第ＶＩＩ因子（配列番号：３）、ポリペプチドを二本鎖の活性形態（ＦＶＩＩａ）で分泌させるＲＫＲＲＫＲ配列を有する野生型マウス第ＶＩＩ因子（配列番号：４）、マウス第ＩＸ因子のシグナル、プロペプチド、ＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインと第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインならびにＲＫＲＲＫＲ配列（配列番号：５）、ならびにマウス第ＩＸ因子のシグナルおよびプロペプチドドメイン、プロテインＳのＧＬＡドメイン、第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインと第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインならびにＲＫＲＲＫＲ配列（配列番号：６）を包含する。キメラマウス第ＶＩＩ因子ポリペプチド（配列番号：５および配列番号：６）は、組織因子に対して低い親和性を有し（おそらく野生型ＦＶＩＩ分子と比較して１００倍低い）、これは望ましくない血栓症を予防するのに十分なはずである。
【０１３９】
キメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドはまた、組織因子に対する親和性をさらに低減するように付加的に修飾し得る。かかる突然変異の一例は、残基３０６のメチオニンをアラニンに変更することである。第ＶＩＩａ因子のより高い比活性を生じさせるキメラ第ＶＩＩ因子ポリペプチドの他の修飾も含み得る。かかる修飾の例は、ヒト配列の残基１５８、２９６および２９８に対する以下の等価物、Ｖ１５８Ｄ、Ｅ２９６ＶおよびＭ２９８Ｑを含む。
【０１４０】
上述した野生型およびキメラマウス第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、マウス第ＶＩＩ因子ｃＤＮＡを鋳型として使用し、様々なドメインを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを用い、次いで、この構築物をｐＳＣ−ＴＴＲ−ｍｖｍベクターに挿入することによって構築でき、該構築は、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００８；１６：２８０−２８９に記載されている。具体的には、野生型マウス第ＶＩＩ因子は、以下のプライマー、５’−ＴＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＴＣＣＡＣＡＧＧＣＧＣＡＴＧＧＧＣＴ−３’（配列番号：７）および５’−ＴＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＡＣＡＧＴＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣ−３’（配列番号：８）を使用してマウス第ＶＩＩ因子ｃＤＮＡから増幅できる。次に、増幅したフラグメントをＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩで消化し、ＢｇｌＩＩ／ＳｐｈＩ部位の間でｐＳＣ−ＴＴＲ−ｍｖｍベクターに挿入し得る。その後、ＢＧＨポリアデニル化配列を、生じたベクターにＳｐｈＩ部位で挿入し得る。
【０１４１】
ＲＫＲＲＫＲ配列を有する野生型マウス第ＶＩＩ因子構築物は、同様の方法で構築し得る。具体的には、ＲＫＲＲＫＲ配列を有する野生型マウス第ＶＩＩ因子は、以下のプライマー、
１番目のフラグメントを作製するための、５’−ＴＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＴＣＣＡＣＡＧＧＣＧＣＡＴＧＧＧＣＴ−３’（配列番号：７）および５’−ＡＣＡＡＴＧＣＧＴＴＴＴＣＧＣＣＧＣＴＴＡＣＧＧＣＧＧＣＣＴＴＧＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴ−３’（配列番号：９）、ならびに
２番目のフラグメントを作製するための、５’−ＴＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＡＣＡＧＴＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣ−３’（配列番号：８）および５’−ＧＣＣＧＣＣＧＴＡＡＧＣＧＧＣＧＡＡＡＡＣＧＣＡＴＴＧＴＧＧＧＡＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＧＣＣＣ−３’（配列番号：１０）
を使用してマウス第ＶＩＩ因子ｃＤＮＡから増幅できる。次に、これらの２つのフラグメントを鋳型として使用し、以下のプライマー、
５’−ＴＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＴＣＣＡＣＡＧＧＣＧＣＡＴＧＧＧＣＴ−３’（配列番号：７）および５’−ＴＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＡＣＡＧＴＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣ−３’（配列番号：８）
を用いてオーバーラップＰＣＲを実施する。次に、生じた増幅フラグメントをＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩで消化し、ＢｇｌＩＩ／ＳｐｈＩ部位の間でｐＳＣ−ＴＴＲ−ｍｖｍベクターに挿入し得る。その後、ＢＧＨポリアデニル化配列を、生じたベクターにＳｐｈＩ部位で挿入し得る。
【０１４２】
マウス第ＩＸ因子のシグナル、プロペプチド、ＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインと第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインならびにＲＫＲＲＫＲ配列を含む構築物（配列番号：５）を同様に構築する。具体的には、１番目のフラグメントを、マウス第ＩＸ因子ｃＤＮＡを鋳型として使用し、以下のプライマー、
５’−ＡＧＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＡＣＣＧＴＣ−３’（配列番号：１１）および
５’−ＧＡＴＣＡＧＣＴＧＣＴＣＡＴＴＣＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＧＴＴＣＣＴＴＣＣＴＴＣＡＡＡＴＣ−３’（配列番号：１２）
を用いて作製する。２番目のフラグメントは、マウス第ＶＩＩ因子を鋳型として使用し、以下のプライマー、
５’−ＧＡＴＴＴＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＡＣＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＧＣＡＡＧＡＡＴＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＴＣ−３’（配列番号：１３）および
５’−ＡＣＡＡＴＧＣＧＴＴＴＴＣＧＣＣＧＣＴＴＡＣＧＧＣＧＧＣＣＴＴＧＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴ−３’（配列番号：９）
を用いて作製する。
【０１４３】
３番目のフラグメントは、マウス第ＶＩＩ因子を鋳型として使用し、以下のプライマー、
５’−ＴＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＡＣＡＧＴＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣ−３’（配列番号：８）および
５’−ＧＣＣＧＣＣＧＴＡＡＧＣＧＧＣＧＡＡＡＡＣＧＣＡＴＴＧＴＧＧＧＡＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＧＣＣＣ−３’（配列番号：１０）
を用いて作製できる。次に、これらの３つフラグメントを鋳型として使用し、以下のプライマー、
５’−ＡＧＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＡＣＣＧＴＣ−３’（配列番号：１１）および
５’−ＴＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＡＣＡＧＴＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣ−３’（配列番号：８）
を用いてオーバーラップＰＣＲを実施し得る。次に、生じた増幅フラグメントをＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩで消化し、ＢｇｌＩＩ／ＳｐｈＩ部位の間でｐＳＣ−ＴＴＲ−ｍｖｍベクターに挿入する。その後、ＢＧＨポリアデニル化配列を、生じたベクターにＳｐｈＩ部位で挿入する。
【０１４４】
同様の工程を使用して、マウス第ＩＸ因子のシグナルおよびプロペプチドドメイン、プロテインＳのＧＬＡドメイン、第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインと第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインならびにＲＫＲＲＫＲ配列を含む構築物（配列番号：６）を作製し得る。具体的には、１番目のフラグメントを、マウス第ＩＸ因子ｃＤＮＡおよび以下のプライマー、
５’−ＡＧＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＡＣＣＧＴＣ−３’（配列番号：１１）および
５’−ＧＴＴＴＣＴＴＣＧＡＡＣＡＡＧＧＴＡＴＴＴＧＣＴＣＴＣＴＴＴＧＧＡＣＧＧＧＴＡＡＧＡＡＴＴＴＴＧ−３’（配列番号：１４）
を使用して作製し得る。２番目のフラグメントは、マウスプロテインＳを鋳型として使用し、以下のプライマー、
５’−ＣＡＡＡＡＴＴＣＴＴＡＣＣＣＧＴＣＣＡＡＡＧＡＧＡＧＣＡＡＡＴＡＣＣＴＴＧＴＴＣＧＡＡＧＡＡＡＣ−３’（配列番号：１５）および
５’−ＧＡＴＣＴＣＣＡＴＣＡＡＣＡＴＡＣＴＧＣＴＴＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＴＣＣＧＴＣＴＣＧＧＧＡＴＴ−３’（配列番号：１６）
を用いて作製し得る。３番目のフラグメントは、マウス第ＩＸ因子のシグナル、プロペプチド、ＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインと第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインならびにＲＫＲＲＫＲ配列を有するベクターを鋳型として使用し、以下のプライマー、
５’−ＡＡＴＣＣＣＧＡＧＡＣＧＧＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＡＡＧＣＡＧＴＡＴＧＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＣ−３’（配列番号：１７）および
５’−ＴＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＡＣＡＧＴＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣ−３’（配列番号：８）
を用いて作製し得る。次に、これらの３つフラグメントを鋳型として使用し、以下のプライマー、
５’−ＡＧＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＡＣＣＧＴＣ−３’（配列番号：１１）および
５’−ＴＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＡＣＡＧＴＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣ−３’（配列番号：８）
を用いてオーバーラップＰＣＲを実施する。次に、生じた増幅フラグメントをＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩで消化し、ＢｇｌＩＩ／ＳｐｈＩ部位の間でｐＳＣ−ＴＴＲ−ｍｖｍベクターに挿入する。その後、ＢＧＨポリアデニル化配列を、生じたベクターにＳｐｈＩ部位で挿入し得る。
【０１４５】
野生型マウス第ＶＩＩ因子（配列番号：３）およびＲＫＲＲＫＲ配列を有する野生型マウス第ＶＩＩ因子（配列番号：４）のベクター構築物を、各々、年齢が適合する２匹の雄性血友病Ｂマウスに注射した（マウスにつき５×１０１１ベクターゲノム）。マウス第ＩＸ因子のシグナル、プロペプチド、ＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインと第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインならびにＲＫＲＲＫＲ配列（配列番号：５）、ならびにマウス第ＩＸ因子のシグナルおよびプロペプチドドメイン、プロテインＳのＧＬＡドメイン、第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインと第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインならびにＲＫＲＲＫＲ配列（配列番号：６）のベクター構築物を、各々、年齢が適合する３匹の雄性血友病Ｂマウスに注射した（マウスにつき５×１０１１ベクターゲノム）。注射の約３週間後、野生型マウス第ＶＩＩ因子（配列番号：３）またはＲＫＲＲＫＲ配列を有する野生型マウス第ＶＩＩ因子（配列番号：４）のいずれかを注射したすべてのマウスが死亡した。マウス第ＩＸ因子のシグナル、プロペプチド、ＧＬＡおよびＥＧＦ−１ドメインと、第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインならびにＲＫＲＲＫＲ配列（配列番号：５）、またはマウス第ＩＸ因子のシグナルおよびプロペプチドドメイン、プロテインＳのＧＬＡドメイン、第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインと第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２および触媒ドメインならびにＲＫＲＲＫＲ配列（配列番号：６）の、いずれかを注射したマウスは、注射の約５週間後に生存し、有害症状を示さなかった。マウスから週に１回血液を採取し、注射の６〜８週間後にマウス第ＶＩＩ因子ポリペプチドのレベルを測定し得る。また、マウス第ＶＩＩ因子ポリペプチドに対する抗原レベルは、注射したマウスの血液試料からインビトロで凝固活性を測定することによって間接的に測定し得る（Ｍａｒｇａｒｉｔａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００９；１１３：３６８２−３６８９）。
【０１４６】
上記は本発明の説明であり、本発明を限定すると解釈されるべきではない。本発明は、以下の特許請求の範囲およびその中に含まれる特許請求の範囲の等価物によって定義される。本明細書で引用されるすべての出版物、特許出願、特許、特許公開、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースおよび／またはＳＮＰアクセッション番号によって同定される配列、ならびに他の参考文献は、参考文献が提示される文および／または段落に関連する教示に関してそれらの全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドを投与することにより、出血性疾患を有する被験体において該出血性疾患を治療する方法。
【請求項２】
前記キメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドが第ＶＩＩ因子の触媒ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記キメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドが第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２ドメインをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記キメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドが、ビタミンＫ依存性凝固タンパク質のＧＬＡドメインをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記キメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドが、ビタミンＫ依存性凝固タンパク質のＥＧＦ−１ドメインをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ＧＬＡドメインが、第ＩＸ因子のＧＬＡドメインおよびプロテインＳのＧＬＡドメインからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥＧＦ−１ドメインが、第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインおよびプロテインＳのＥＧＦ−１ドメインからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
キメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドを投与することにより、出血性疾患を有する被験体において該出血性疾患を治療する方法であって、該キメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドが、第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２ドメインおよび触媒ドメインと、第ＩＸ因子のＧＬＡドメインおよびプロテインＳのＧＬＡドメインからなる群より選択されるＧＬＡドメインと、第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインおよびプロテインＳのＥＧＦ−１ドメインからなる群より選択されるＥＧＦ−１ドメインとを含む、方法。
【請求項９】
前記出血性疾患が、凝固因子欠損症、血小板機能欠損、血小板減少症、フォン・ヴィレブランド病、凝固因子の阻害、手術によって誘発される出血、および外傷によって誘発される出血からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記出血性疾患が凝固因子欠損症である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記凝固因子欠損症が血友病である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記出血性疾患の治療が、キメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を前記被験体に投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＧＬＡドメインを含むタンパク質を投与することにより、出血性疾患を有する被験体において該出血性疾患を治療する方法であって、該タンパク質が、循環中の該タンパク質の濃度に比べて血餅の部位付近で濃縮されている、方法。
【請求項１４】
プロテインＳのＧＬＡドメインと、
プロテインＳのＥＧＦ−１ドメインおよび第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインから選択されるＥＧＦ−１ドメインと、
第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２ドメインおよび触媒ドメインと
を含む、キメラ凝固タンパク質。
【請求項１５】
請求項１４に記載のキメラ凝固タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１４に記載のキメラ凝固タンパク質を含む細胞。
【請求項１８】
請求項１６に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１９】
第ＶＩＩ因子の血栓形成性に比べて低い血栓形成性を有するポリペプチドを投与することにより、出血性疾患を有する被験体において該出血性疾患を治療する方法。
【請求項１】
キメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドを投与することにより、出血性疾患を有する被験体において該出血性疾患を治療する方法。
【請求項２】
前記キメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドが第ＶＩＩ因子の触媒ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記キメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドが第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２ドメインをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記キメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドが、ビタミンＫ依存性凝固タンパク質のＧＬＡドメインをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記キメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドが、ビタミンＫ依存性凝固タンパク質のＥＧＦ−１ドメインをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ＧＬＡドメインが、第ＩＸ因子のＧＬＡドメインおよびプロテインＳのＧＬＡドメインからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥＧＦ−１ドメインが、第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインおよびプロテインＳのＥＧＦ−１ドメインからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
キメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドを投与することにより、出血性疾患を有する被験体において該出血性疾患を治療する方法であって、該キメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドが、第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２ドメインおよび触媒ドメインと、第ＩＸ因子のＧＬＡドメインおよびプロテインＳのＧＬＡドメインからなる群より選択されるＧＬＡドメインと、第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインおよびプロテインＳのＥＧＦ−１ドメインからなる群より選択されるＥＧＦ−１ドメインとを含む、方法。
【請求項９】
前記出血性疾患が、凝固因子欠損症、血小板機能欠損、血小板減少症、フォン・ヴィレブランド病、凝固因子の阻害、手術によって誘発される出血、および外傷によって誘発される出血からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記出血性疾患が凝固因子欠損症である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記凝固因子欠損症が血友病である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記出血性疾患の治療が、キメラ第ＶＩＩａ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を前記被験体に投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＧＬＡドメインを含むタンパク質を投与することにより、出血性疾患を有する被験体において該出血性疾患を治療する方法であって、該タンパク質が、循環中の該タンパク質の濃度に比べて血餅の部位付近で濃縮されている、方法。
【請求項１４】
プロテインＳのＧＬＡドメインと、
プロテインＳのＥＧＦ−１ドメインおよび第ＩＸ因子のＥＧＦ−１ドメインから選択されるＥＧＦ−１ドメインと、
第ＶＩＩ因子のＥＧＦ−２ドメインおよび触媒ドメインと
を含む、キメラ凝固タンパク質。
【請求項１５】
請求項１４に記載のキメラ凝固タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１４に記載のキメラ凝固タンパク質を含む細胞。
【請求項１８】
請求項１６に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１９】
第ＶＩＩ因子の血栓形成性に比べて低い血栓形成性を有するポリペプチドを投与することにより、出血性疾患を有する被験体において該出血性疾患を治療する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１２−５３１２０６（Ｐ２０１２−５３１２０６Ａ）
【公表日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１７７５９（Ｐ２０１２−５１７７５９）
【出願日】平成２２年６月２５日（２０１０．６．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３９９３４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１５１７３６
【国際公開日】平成２２年１２月２９日（２０１０．１２．２９）
【出願人】（５０００９３８３４）ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル (14)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月２５日（２０１０．６．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３９９３４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１５１７３６
【国際公開日】平成２２年１２月２９日（２０１０．１２．２９）
【出願人】（５０００９３８３４）ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル (14)
【Ｆターム（参考）】
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