クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素に対する抗体
本発明は、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）（Ｃ．ディフィシル）感染の予防または処置において使用するための、ヒツジ抗体を含む抗体組成物を提供し、前記抗体はＣ．ディフィシル毒素に結合する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒツジ抗体、およびクロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）（Ｃ．ディフィシル）感染（ＣＤＩ）の予防または処置におけるその使用に関する。
【０００２】
クロストリジウム・ディフィシル感染（ＣＤＩ）は、現在、世界中の病院において大きな問題である。前記細菌は、院内の抗生物質関連疾病を引き起こし、これは軽度の自己限定的な下痢から生命を危うくする可能性のある重度の大腸炎までいくつかの形態で現れる。高齢の患者は、これらの生命を危うくする可能性のある疾病のリスクが最も高く、そしてＣＤＩの事件は過去１０年間において劇的に増加した。２００７年に英国においてＣＤＩの症例は５０，０００を超え、関連死は８，０００を超えた。ＣＤＩにかかる国民健康保険の費用は１年につき５億ポンドを超える。
【０００３】
Ｃ．ディフィシルの種々の株は、多くの方法によって分類され得る。最も一般的に使用されるものの１つはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）リボタイピングであり、ＰＣＲを使用してＣ．ディフィシルの１６Ｓ〜２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子間スペーサー領域を増幅する。これに由来する反応産物は、単離株の細菌リボタイプを同定する特徴的なバンドパターンを与える。毒素タイピングは別のタイピング法であり、Ｃ．ディフィシル毒素をコードするＤＮＡに由来する制限酵素パターンを使用して株の毒素タイプを同定する。異なる株の毒素遺伝子間で観察される制限酵素パターンの差異もまた、Ｃ．ディフィシル毒素ファミリー内の配列変異を示す。毒素Ｂはいくつかの領域において配列変異を示す。例えば、毒素タイプ０の毒素ＢのＣ末端６０ｋＤａ領域には、毒素タイプＩＩＩの同じ領域と比較して、約１３％の配列差異が存在する。このような配列差異は比較的小さいが、それらは分子の抗原性特性に関しては極めて重要であり得、そして抗体の結合に対して、従って、抗体による毒素中和特性に対して顕著な影響を及ぼし得る。
【０００４】
Ｃ．ディフィシル株は、多種多様な病原性因子を産生し、その中でも顕著なのは、いくつかのタンパク質毒素、すなわち、毒素Ａ、毒素Ｂ、およびいくつかの株においては、Clostridium perfringensイオタ毒素に類似している二元毒素である。毒素Ａは、感染の病態において役割を果たす巨大タンパク質の細胞毒／エンテロトキシンであり、そして腸内コロニー形成過程において影響を及ぼし得る。ＣＤＩの大流行は、毒素Ａ陰性／毒素Ｂ陽性株によると報告されており、このことは、毒素Ｂもまた疾病の病態において重要な役割を果たし得ることを示唆する。毒素ＡおよびＢの両方が、多段階の機序を介してその作用機序を発揮し、これは、細胞表面上のレセプターへの結合、内部移行、その後の転位そして細胞のサイトゾルへのエフェクタードメインの放出、並びに最後には細胞内作用を含む。毒素ＡおよびＢの両方について、これはＲｈｏファミリーの低分子量ＧＴＰａｓｅファミリーの不活性化を含む。この不活性化のために、各々の毒素は、Ｒｈｏタンパク質のアミノ残基上へのグルコース部分（ＵＤＰ−グルコースからの）の転移を触媒する。毒素ＡおよびＢの両方がまた、システインプロテアーゼの形態で第２の酵素活性を含み、これは転位後のサイトゾルへのエフェクタードメインの放出において役割を果たすようである。Ｃ．ディフィシル二元毒素は、異なる様式で作用し、そのターゲットタンパク質上へのＮＡＤからのＡＤＰ−リボース部分の転移を含む機序によって細胞のアクチンを修飾する。
【０００５】
Ｃ．ディフィシル感染の処置は、現在、抗生物質に依拠し、その中でメトロニダゾールおよびバンコマイシンが第１選択の処置である。しかしながら、これらの抗生物質は全ての場合において有効ではなく、患者の２０〜３０％は疾病の再発に苦しむ。大きな関心を寄せられているものの中に英国におけるより病原性の高い株の出現があり、これは２００２年にカナダで初めて同定された。これらの株は、ＰＣＲリボタイプ０２７、毒素タイプＩＩＩに属するが、これは以前に観察されたよりも３倍高い直接的に起因し得る死亡率でＣＤＩを引き起こす。
【０００６】
それ故、新たな治療薬が特に緊急に必要とされる。なぜなら現在の抗生物質の効力が低下しているようであるからである。
【０００７】
従って、Ｃ．ディフィシル感染（ＣＤＩ）に特異的に対処することのできる新たな治療／治療薬が当技術分野において必要である。この必要性は本発明によって対処され、これは前記の問題の１つ以上を解決する。
【０００８】
より詳細には、本発明の第１の局面は、ＣＤＩの予防または処置において使用するためのヒツジ抗体を提供する。別の局面において、本発明は、ＣＤＩの予防または処置において使用するための、ヒツジ抗体を含む抗体組成物を提供する。１つの態様において、ヒツジ抗体はポリクローナル抗体である。
【０００９】
使用時に、本発明の抗体はＣ．ディフィシル毒素またはそのフラグメントに結合し、好ましくは前記毒素またはそのフラグメントの生物学的活性を中和する。従って、本発明の抗体は、ＣＤＩを予防または処置することができ、好ましくは患者における再発を予防することもできる。
【００１０】
本発明の抗体は、患者に対する低い免疫原性効果を有しつつ、Ｃ．ディフィシルの１つ以上の毒素の生物学的作用を阻害することができる点で、他の治療薬を上回る明瞭な利点を提供する。さらに、本発明の抗体を、高い力価で産生することができる。従って、ヒツジ抗体を容易に得ることができ、そして最小限の副作用でもってＣ．ディフィシルによって生じる病的作用に対して患者を保護および／またはすることができる。本発明の抗体はまた、ＣＤＩに対する受動免疫化のためのワクチンの開発にも使用され得る。
【００１１】
本発明の主要なターゲットは、Ｃ．ディフィシル毒素またはそのフラグメントである。本発明の抗体が結合および／または中和し得る適切なＣ．ディフィシル毒素は、ＣＤＩまたはその症状を引き起こすかまたはそれに関連した任意のＣ．ディフィシル毒素を含む。さらなる態様において、本発明の抗体は、以下：Ｃ．ディフィシル毒素Ａまたはそのフラグメント、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂまたはそのフラグメント、およびＣ．ディフィシル二元毒素またはそのフラグメントから選択されたＣ．ディフィシル毒素の少なくとも１つのタイプに結合および／または中和する。
【００１２】
従って、１つの態様において、本発明の抗体組成物は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和するヒツジ抗体を含む。別の態様において、本発明の抗体組成物は、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和するヒツジ抗体を含む。さらに別の態様において、本発明の抗体組成物は、Ｃ．ディフィシル二元毒素（またはそのフラグメント）に結合および／または中和するヒツジ抗体を含む。
【００１３】
別の態様において、本発明の抗体組成物は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（またはそのフラグメント）およびＣ．ディフィシル毒素Ｂ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和するヒツジ抗体を含む。別の態様において、本発明の抗体組成物は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（またはそのフラグメント）およびＣ．ディフィシル二元毒素（またはそのフラグメント）に結合および／または中和するヒツジ抗体を含む。さらに別の態様において、本発明の抗体組成物は、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ（またはそのフラグメント）およびＣ．ディフィシル二元毒素（またはそのフラグメント）に結合および／または中和するヒツジ抗体を含む。
【００１４】
本発明の抗体組成物はまた、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（またはそのフラグメント）、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ（またはそのフラグメント）およびＣ．ディフィシル二元毒素（またはそのフラグメント）に結合および／または中和するヒツジ抗体も含み得る。
【００１５】
１つの態様において、抗体組成物は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和する第１抗体、並びにＣ．ディフィシル毒素Ｂ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和する抗体あるいはＣ．ディフィシル二元毒素（またはそのフラグメント）に結合および／または中和する抗体から選択された第２抗体を含む。この態様において、第２抗体はＣ．ディフィシル毒素Ｂ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和し得、そして前記組成物は場合により、Ｃ．ディフィシル二元毒素（またはそのフラグメント）に結合および／または中和する第３抗体を含む。
【００１６】
別の態様において、抗体組成物は、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和する第１抗体、並びにＣ．ディフィシル毒素Ａ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和する抗体あるいはＣ．ディフィシル二元毒素（またはそのフラグメント）に結合および／または中和する抗体から選択された第２抗体を含む。この態様において、第２抗体は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和し得、そして前記組成物は場合により、Ｃ．ディフィシル二元毒素（またはそのフラグメント）に結合および／または中和する第３抗体を含む。
【００１７】
別の態様において、抗体組成物は、Ｃ．ディフィシル二元毒素（またはそのフラグメント）に結合および／または中和する第１抗体、並びにＣ．ディフィシル毒素Ａ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和する抗体あるいはＣ．ディフィシル毒素Ｂ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和する抗体から選択された第２抗体を含む。この態様において、第２抗体は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和し得、そして前記組成物は場合により、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和する第３抗体を含む。あるいは、第２抗体は、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和し得、そして前記組成物は場合により、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和する第３抗体を含む。
【００１８】
本発明の抗体は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（またはそのフラグメント）またはＣ．ディフィシル毒素Ｂ（またはそのフラグメント）またはＣ．ディフィシル二元毒素（またはそのフラグメント）の１つに（特異的に）結合および／または中和し得る。あるいは、本発明の抗体は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（またはそのフラグメント）またはＣ．ディフィシル毒素Ｂ（またはそのフラグメント）またはＣ．ディフィシル二元毒素（またはそのフラグメント）の２つ以上に結合し得る。抗体が２つ以上の毒素タイプに結合および／または中和する場合、前記抗体は、好ましくは、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ（またはそのフラグメント）と、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（またはそのフラグメント）および／またはＣ．ディフィシル二元毒素（またはそのフラグメント）の一方もしくは両方に結合および／または中和する。
【００１９】
本発明の抗体は、毒素の特異的なエピトープと相互作用する。例えば、抗体は、Ｃ．ディフィシル毒素ＡのＮ末端ドメイン（例えばアミノ酸１〜９５７）または中間領域ドメイン（例えばアミノ酸９５８〜１８３１）またはＣ末端反復ドメイン（例えばアミノ酸１８３２〜２７１０）におけるエピトープと結合することができる。例えば、抗体は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａのアミノ酸１８３２〜２７１０内のエピトープに結合し得る。同様に、抗体は、毒素ＢのＮ末端ドメイン（例えばアミノ酸１〜９５５）または中間領域ドメイン（例えばアミノ酸９５６〜１８３１）またはＣ末端反復ドメイン（例えばアミノ酸１８３２〜２３６６）におけるエピトープと結合することができる。例えば、抗体は、毒素Ｂのアミノ酸１８３２〜２３６６内のエピトープに結合し得る。二元毒素の場合、抗体は、触媒ドメイン（フラグメントＡ）、またはフラグメントＢのＣ末端部分に存在するレセプター結合ドメイン；および／またはフラグメントＡとの結合およびフラグメントＡの細胞中への転位に関与するフラグメントＢのＮ末端半分（およそ残基１〜４００）に結合し得る。
【００２０】
１つの態様において、Ｃ．ディフィシル毒素は、毒素タイプ０からＸＶまでの１つから選択される。好ましい毒素タイプ（それに加えてリボタイプおよび株）を、すぐ下の表１に列挙する。列挙された毒素タイプは純粋に例示的なものであり、そして本発明を限定するものではない。
【００２１】
【表１】
【００２２】
本発明の種々の抗体が、Ｃ．ディフィシル毒素の同じまたは異なる株に結合および／または中和し得る。例えば、抗体は、以下：Ｃ．ディフィシル毒素Ａ−毒素タイプ０；Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ−毒素タイプ０；Ｃ．ディフィシル毒素Ａ−毒素タイプＩＩＩ；Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ−毒素タイプＩＩＩ；Ｃ．ディフィシル毒素Ａ−毒素タイプＶ；および／またはＣ．ディフィシル毒素Ｂ−毒素タイプＶの１つ以上に結合および／または中和し得る。好ましくは、これらの全ての毒素タイプの毒素ＡおよびＢに結合および／または中和する、抗体の混合物が使用される。本発明の抗体は、前記のＣ．ディフィシル毒素Ａおよび／またはＣ．ディフィシル毒素Ｂの株のＮ末端ドメイン、中間領域ドメインおよび／またはＣ末端反復ドメインにおけるエピトープと結合し得る。
【００２３】
特定の態様において、本発明の抗体は、配列番号１〜６またはそのフラグメントに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上同一なアミノ酸配列を含む、少なくとも１つのＣ．ディフィシル毒素に結合および／または中和し得る。
【００２４】
本発明はまた、ＣＤＩの予防または処置のための対応する方法を包含し、前記方法は、本発明の抗体組成物を患者に投与することを含む。患者は、Ｃ．ディフィシルに感染し得るか、あるいはＣ．ディフィシルの症状（例えば、軽度の自己限定的な下痢、腹痛、発熱および食欲不振から、偽膜性大腸炎および細胞中毒性巨大結腸症などの生命を危うくする容態まで）を有し得るか、あるいはＣ．ディフィシル感染への素因を有し得る（例えば抗生物質の処置を受けている、Ｃ．ディフィシルに罹患したことがあり再発のリスクがある、またはＣ．ディフィシル感染に関連した臨床症状を示す第２の個体にさらされたことがある）。本発明は、そのため、ＣＤＩを予防または処置するための効果的な手段を提供する。
【００２５】
１つの態様において、前記のＣＤＩ処置法は、Ｃ．ディフィシルに感染するかまたはＣＤＩの症状を患う患者に、本発明の抗体組成物を投与することを含む。これは、治療有効量の抗体を使用して達成することができる。このような投与は、長期間におよぶ、本発明の抗体組成物の反復投与によって行ない得る。前記組成物の抗体成分は同じでもまたは異なっていてもよく（その毒素タイプ特異性および／またはＣ．ディフィシル毒素上のターゲティングする結合領域もしくはエピトープに関して）、そして投与は同時でもまたは連続的でもよく、そして任意の順序で行なうことができる。
【００２６】
別の態様において、前記のＣＤＩ予防法は、患者に本発明の抗体組成物を投与して、ＣＤＩに対する受動免疫を与えることを含む。これは、ＣＤＩの発症前またはＣＤＩの非常に早期の段階で予防有効量の抗体を使用して達成することができる。このような投与は、長期間におよぶ、本発明の抗体組成物の反復投与によって行ない得る。前記組成物の抗体成分は同じでもまたは異なっていてもよく（その毒素タイプ特異性および／またはＣ．ディフィシル毒素上のターゲティングする結合領域もしくはエピトープに関して）、そして投与は同時でもまたは連続的でもよく、そして任意の順序で行なうことができる。
【００２７】
抗体調製
ヒツジ抗体は、ヒツジにおいて生じた抗体である。従って、本発明は、本発明の抗体組成物において使用するためのヒツジ抗体の産生法を含み、前記方法は、一般に、（ｉ）Ｃ．ディフィシル毒素またはそのフラグメントを含む免疫原をヒツジに投与する工程、（ｉｉ）ヒツジにおける抗体の生成のために十分な時間をかける工程、そして（ｉｉｉ）ヒツジから抗体を得る工程を含む。本明細書において使用したヒツジは、Ovis属（例えば、Ovis ammon, Ovis orientalis aries, Ovis orientalis orientalis, Ovis orientalis vignei, Ovis Canadensis, Ovis dalli, Ovis nivicola）内に該当する任意の種を含む。
【００２８】
本発明はまた、本発明の抗体組成物において使用するためのヒツジ抗体の産生法を含み、ヒツジ抗体は、Ｃ．ディフィシル毒素またはそのフラグメント（好ましくは、完全長の天然毒素と抗原性の交差反応性を有するおよび／または完全長の天然毒素の毒素活性または毒素様活性を保持するフラグメント）を含む免疫原に応答してヒツジによって誘起される。
【００２９】
抗体は、ヒツジの血清から得ることができる。従って、手順は、Ｃ．ディフィシル毒素に結合および中和することのできる抗体を含むヒツジ抗血清を生じさせる。さらなる態様において、抗体は単離および／または精製される。従って、本発明の別の局面は、ヒツジ抗血清からの抗体の精製を含む。
【００３０】
１つの態様において、本発明の抗体を生成するために使用される免疫原はＣ．ディフィシル毒素またはそのフラグメントであり、これは場合により精製されている。適切なＣ．ディフィシル毒素は、ＣＤＩまたはその症状を引き起こすかそれに関連した任意のＣ．ディフィシル毒素を含む。さらなる態様において、毒素は、以下の毒素：Ｃ．ディフィシル毒素Ａまたはそのフラグメント、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂまたはそのフラグメント、およびＣ．ディフィシル二元毒素またはそのフラグメント、の少なくとも１つから選択される。Ｃ．ディフィシル毒素はまた、本明細書において前記したような毒素タイプ０からＸＶの１つから選択された毒素であり得る。
【００３１】
精製されたＣ．ディフィシル毒素の産生を実施例において例示する。特定の態様において、免疫原はＣ．ディフィシル毒素変異体である。別の態様において、免疫原は、配列番号１〜６またはそのフラグメントに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上同一なアミノ酸配列を含む。
【００３２】
本発明の抗体を生成するために使用される免疫原はまた、部分的または完全に不活性化され得、すなわち、低下した毒性を有する。改変の例は、化学的処理（例えばＵＤＰ−ジアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、過酸化物または酸素を用いての処理）および組換え法（例えば毒素における欠失または突然変異）を含む。例えば、免疫原は、ホルムアルデヒドを用いての処理によって天然の毒素から誘導されたＣ．ディフィシルトキソイドまたはそのフラグメントであり得る。あるいは、組換えトキソイドは、部位特異的突然変異誘発によって活性部位モチーフを選択的に不活性化することによって生成され得る。毒素ＡおよびＢの毒性作用を低下または除去する部位特異的突然変異誘発の一例は、毒素のＮ末端ドメインにおけるＤＸＤモチーフの改変である。アスパラギン酸および／または他の残基を例えばアラニンに突然変異させて、毒素ＡおよびＢのいずれかの生物学的活性を減少させることができる。例えば、毒素Ａでは、以下のアミノ酸の１つ以上を突然変異させることができる：Ａｓｐ２６９、Ａｓｐ２８５、Ａｓｐ２８７、Ａｓｎ３８３、Ｔｒｐ５１９、Ｔｙｒ２８３、Ａｒｇ２７２。毒素Ｂでは、以下のアミノ酸の１つ以上を突然変異させることができる：Ａｓｐ２７０、Ａｓｐ２８６、Ａｓｐ２８８、Ａｓｎ３８４、Ｔｒｐ５２０、Ｔｙｒ２８４、Ａｒｇ２７３。
【００３３】
抗原をアジュバントと共に製剤化し得る。適切なアジュバントは、ヒトにおいて広範に使用されるミョウバン（リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）、並びに他のアジュバント、例えばサポニンおよびその精製成分のQuil A、フロイント完全アジュバント、ＲＩＢＢＩアジュバント、並びに研究および獣医学的な適用に使用される他のアジュバントを含み得る。
【００３４】
Ｃ．ディフィシル毒素またはトキソイドを免疫原として、別々にまたは組み合わせて、同時にまたは連続的にのいずれかで使用して、個々のＣ．ディフィシル毒素または組合せに特異的な抗体を産生し得る。例えば、２つ以上の毒素またはトキソイドを一緒に混合し、そして単一の免疫原として使用し得る。あるいは、Ｃ．ディフィシル毒素（例えばＣ．ディフィシル毒素Ａ）を別々に第１の免疫原として第１のヒツジまたはヤギに使用し得、そして別のＣ．ディフィシル毒素（例えばＣ．ディフィシル毒素Ｂ）を別々に第２のヒツジまたはヤギに使用し得る。別々の免疫化によって産生された抗体を合わせて、Ｃ．ディフィシル毒素に対して向けられる抗体組成物を得ることができる。
【００３５】
前記方法は、皮下、筋肉内、腹腔内および静脈内を含む、全ての免疫化形態を含む。本発明はまた、多種多様な免疫化計画を考える。１つの態様において、ヒツジまたはヤギは毒素（群）を０日目に投与され、そして続いてその後は間隔をおいて毒素（群）を受ける。必要とされる間隔の範囲および投与量の範囲は、免疫原の正にその性質、投与経路、製剤の性質、および担当者の判断に依存する。これらの投与量レベルの変更を、最適化のための標準的で経験的な慣行を使用して調整することができる。同様に、本発明は、抗体を回収するための任意の特定の計画に限定されるものではない。好ましい回収時間は、５６日目以後のいつかである。特異的抗体のレベル、すなわち免疫原に結合する抗体のレベルは、血清１リットルあたり少なくとも３ｇを示す。
【００３６】
本発明の抗体は、必要に応じて回収後に改変され得、よって特定の場合においては、本発明の抗体は、それらが投与された患者において、より免疫原性が低い。例えば、患者がヒトである場合、抗体は、当技術分野において周知の方法によって非種特異化され得る。抗体をどのようにより免疫原性を低くし得るかに関する一例は、（Ｆａｂ）２フラグメントの調製である。本発明の抗体を使用して、このような抗体フラグメントを産生し得、このために種々の技術が開発されている。例えば、フラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解的消化によって誘導され得る。その産生のための他の技術は当業者には明らかであろう。
【００３７】
抗体送達
使用時に、本発明は、非経口投与に、通常は静脈内投与に適した形態で、本発明の抗体組成物を含む薬学的組成物を使用する。精製されたインタクトな抗体またはそのフラグメントは、このような送達のために製剤化される。例えば、抗体またはそのフラグメントは、５〜５０または１５〜５０または２５〜５０ｇ/リットルの濃度で、緩衝液中で製剤化され得る。適切な緩衝液の成分の例としては、生理的塩、例えばクエン酸ナトリウムおよび／またはクエン酸が挙げられる。好ましい緩衝液は、１００〜２００または１２５〜１７５または約１５０（例えば１５３）mMの生理的塩、例えば塩化ナトリウムを含む。好ましい緩衝液は、患者の生理的ｐＨに近いｐＨで、例えば５．５〜６．４のｐＨ、または５．６〜６．３のｐＨ、または５．７〜６．２のｐＨ、または５．８〜６．２のｐＨで薬学的組成物を維持する。本発明の抗体含有組成物は、好ましくは、アジュバント（群）を排除する。なぜなら、患者において前記抗体に対する免疫応答を刺激することは望ましくないからである。
【００３８】
本発明の抗体は、筋肉内、皮下または静脈内送達のために製剤化され得るがそれらに限定されない。筋肉内、皮下または静脈内注入に適した組成物は、無菌水性液剤を含む。このような水性液剤は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤を、最初に、十分な食塩水またはグルコースを用いて等張とすべきである。本発明の抗体組成物は経口製剤ではなく、そしてこの投与形態は使用されない。これに関して、経口送達での重要な問題は、十分な抗体が、必要とされる場所である大腸に確実に到達することである。抗体が腸に到達することを妨害する因子としては、抗体分子を分解する、消化器分泌物中に存在するタンパク質分解酵素、並びにまた、いくつかの場合においては消化管の下方への液体の移動を妨げる麻痺性イレウスおよび他の合併症を引き起こし得るＣＤＩそれ自体の作用が挙げられる。
【００３９】
注入に適した組成物は、液剤、懸濁剤、または使用前に適切なビヒクル中に溶解もしくは懸濁する乾燥散剤の形態であり得る。
【００４０】
調製時に抗体またはそのフラグメントの溶液をビヒクルに溶かすことができ、溶液は必要であれば塩化ナトリウムの添加によって等張性とし、そして無菌技術を使用して滅菌フィルターを通したろ過によって滅菌し、その後、適切な滅菌バイアルまたはアンプルに充填し、そして封をする。有利には、緩衝剤、可溶化剤、安定化剤、保存剤または殺菌剤または懸濁化剤および／または局所麻酔剤などの添加剤をビヒクル中に溶解してもよい。
【００４１】
使用前に適切なビヒクル中に溶解または懸濁した乾燥散剤は、滅菌区域で無菌技術を使用して滅菌容器中に予め滅菌した成分を充填することによって調製され得る。あるいは、成分を、滅菌区域で無菌技術を使用して適切な容器中に溶解し得る。その後、産物を凍結乾燥し、そして容器を無菌的に封をする。
【００４２】
本発明の抗体の投与のための投与量範囲は、所望の治療効果をもたらすものである。必要とされる投与量の範囲は、抗体または組成物の正にその性質、投与経路、製剤の性質、患者の年齢、患者の容態の性質、程度または重度、禁忌（ある場合）、および担当医の判断に依存する。これらの投与量レベルの変更を、最適化のための標準的で経験的な慣行を使用して調整することができる。
【００４３】
適切な１日投与量は、体重１kgあたり５〜２０mgの範囲である。単位投与量は、１００mg未満から変動し得るが、しかし典型的には１用量あたり２５０〜２０００mgの領域にあり、これは１日１回またはより少ない頻度で（例えば１週間まで１日おきに）投与され得る。
【００４４】
ＣＤＩの予防または処置のための治療法において本発明の抗体を、互いに組み合わせて、またはＣＤＩの処置に通常使用される他の確立された療法の補助として、またはそれと併せて使用することも本発明の範囲内である。例えば、本発明の抗体は、適切な抗生物質（例えばメトロニダゾールおよび／またはバンコマイシン）と併せて投与され得る。
【００４５】
組合せ処置は、当業者によって必要であるまたは簡便であると思われる任意の方法で行われ得、そして本明細書の目的においては、組合せて使用しようとする化合物の順序、量、反復または相対量に関しての制限は全く考えない。
【００４６】
定義の章
クロストリジウム・ディフィシルは、クロストリジウム属のグラム陽性細菌の一種である。
【００４７】
クロストリジウム・ディフィシル感染（ＣＤＩ）はヒトおよび動物に罹患し、そして軽度の自己限定的な下痢から、偽膜性大腸炎および細胞中毒性巨大結腸症などの生命を危うくする容態までの範囲の症状をもたらす、細菌感染を意味する。この疾病においては、Ｃ．ディフィシルは正常な腸の細菌叢を交代させ、そして腸上皮を攻撃しそして傷害を及ぼす細胞毒を産生する。ヒトＣＤＩに対する主要なリスク因子としては、広域スペクトルの抗生物質を受けていること、６５歳を超えていること、および入院していることが挙げられる。
【００４８】
クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａは、約３００ｋＤａのサイズのタンパク質細胞毒／エンテロトキシンのファミリーである。毒素Ａは、Ｎ末端領域内に酵素活性を有し、これは哺乳動物細胞の細胞骨格を破壊して細胞死を引き起こすように作用する。クロストリジウム・ディフィシル株内には数多くの天然に存在する毒素Ａの変異体が存在し、これは「毒素タイプ」と呼ばれる。毒素Ａの種々の毒素タイプは、その一次配列内に、通常全体で１０％未満の変異を有する。適切な毒素Ａ配列の例としては配列番号１および３が挙げられる。
【００４９】
クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂは、約２７０ｋＤａのサイズのタンパク質細胞毒のファミリーであり、これは毒素Ａと類似しているが、有意により細胞毒性が高い。毒素Ａのように、毒素Ｂは、Ｎ末端領域内に酵素活性を有し、これが哺乳動物細胞の細胞骨格を破壊し、細胞死を引き起こすように作用する。Ｃ．ディフィシル株内には数多くの天然に存在する毒素Ｂの変異体が存在し、これは「毒素タイプ」と呼ばれる。毒素Ｂの種々の毒素タイプは、その一次配列内に、通常全体で１５％未満の変異を有する。適切な毒素Ａ配列の例としては、配列番号２および４が挙げられる。
【００５０】
二元毒素は、いくつかのしかし全てではないＣ．ディフィシル株によって産生される２成分の細胞毒である。二元毒素は、Clostridium botulinum C2およびClostridium perfringensイオタ毒素に作用が類似しており、これはＣ．ディフィシル二元毒素のように、約１００ｋＤａの細胞結合フラグメントおよび約５０ｋＤａの酵素的に活性な「エフェクター」フラグメントからなる。適切な二元毒素配列の例としては配列番号５および６が挙げられる。
【００５１】
本明細書において使用する「毒素」という用語は、前記の毒素フラグメントも包含する。前記フラグメントは、参照毒素の１０〜２７００（例えば、少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、７５０、１０００、１５００、２０００または２５００）の任意の数のアミノ酸の範囲であり得る。前記フラグメントは、好ましくは、問題の遺伝子産物の少なくとも１つのエピトープを含む。前記「フラグメント」はまた、それが由来する毒素と共通の抗原性交差反応性および／または実質的に同じin vivoにおける生物学的活性を有し得る。例えば、フラグメントに結合することのできる抗体は、それが由来する毒素にも結合することができるだろう。あるいは、前記フラグメントは、Ｃ．ディフィシル毒素の抗原性成分に以前にさらされたことがあるＴリンパ球の「想起応答」を誘導する共通した能力を共有し得る。
【００５２】
毒素という用語への言及は、その「変異体」、例えば、Ｃ．ディフィシル毒素に対して少なくとも８０または８５または９０または９５または９６または９７または９８または９９％のアミノ酸配列相同性を有するペプチドまたはペプチドフラグメントを包含する。さらなる態様において、「変異体」は、前記ペプチドまたはペプチドフラグメントの模倣体であり得、この模倣体は、ペプチドまたはペプチドフラグメントの少なくとも１つのエピトープを再現する。
【００５３】
毒素への言及は、毒素「トキソイド」を包含し、これは以下においてより詳細に考察する。
【００５４】
毒素タイプは、Ｃ．ディフィシル株を分類するために使用されることが多い。毒素タイプは、毒素遺伝子を用いて得られた制限酵素パターンを特徴付ける方法に基づく。前記したように、毒素ＡおよびＢの毒素タイプは、一次アミノ酸配列による、これらのタンパク質毒素の変異体を示す。
【００５５】
クロストリジウム・ディフィシルトキソイドは、部分的にまたは完全に不活性化されたＣ．ディフィシル毒素（毒素Ａ、毒素Ｂまたは二元毒素）またはＣ．ディフィシル毒素の混合物を説明するために使用される。毒素は、in vitroにおける細胞毒性アッセイによってまたは動物毒性によって測定したところ、非処理毒素よりも低い毒性（例えば１００％、９９％、９５％または９０％低い毒性）を有する場合に不活性化されていると考える。
【００５６】
対象の毒素に結合する抗体は、前記抗体が治療剤として有用であるような十分な親和性でその毒素に結合することのできるものである。対象の毒素に結合する抗体は、Ｃ．ディフィシルの毒素に少なくとも１０４Ｍの親和性（Ｋａ）で結合するものである。
【００５７】
毒素中和は、Ｃ．ディフィシルの１つ以上の細胞毒（毒素Ａおよび／または毒素Ｂおよび／または二元毒素）の生物学的作用を遮断する物質（例えば抗体）の作用を意味する。細胞毒の生物学的作用は、哺乳動物の腸上皮の特定の細胞において哺乳動物細胞を殺滅またはその機能を損なうその能力として定義される。物質の毒素中和活性は、培養液中で増殖した哺乳動物細胞の死滅を防ぐその能力によって測定され得る。
【００５８】
治療有効量は、ＣＤＩ、またはＣＤＩの臨床症状の少なくとも１つを処置するために患者に単独でまたは組み合わせて投与された場合に、疾病または症状のこのような処置を行なうに十分である、抗体の量を指す。治療有効量は、例えば、抗体、感染、および／または感染の症状、感染の重度、および／または感染の症状、処置しようとする患者の年齢、体重および／または健康、並びに処方医の判断に依存して変更され得る。任意の所与の場合における適切な治療有効量は、当業者によって確認され得るか、または慣用的な実験によって決定することができる。また、治療有効量は、抗体の任意の毒性作用または有害な作用よりも有益な作用がまさるものである。
【００５９】
「予防有効量」は、単独でまたは組み合わせて患者に投与した場合に、ＣＤＩの発症もしくは再発またはＣＤＩの臨床症状の少なくとも１つを阻害または遅延させる、抗体の任意の量である。いくつかの態様において、予防有効量は、クロストリジウム・ディフィシル感染の発症または再発を完全に予防する。発症を「阻害する」とは、感染の発症の可能性を低下させるか、または発症を完全に予防することのいずれかを意味する。
【００６０】
ヒツジは、Ovis属（例えばOvis ammon, Ovis orientalis aries, Ovis orientalis orientalis, Ovis orientalis vignei, Ovis Canadensis, Ovis dalli, Ovis nivicola）内に該当する任意の種を意味する。
【００６１】
ヤギは、Capra属（例えばCapra pyrenaicais, Capra ibex, Capra nubiana, Capra sibirica, Capra walie, Capra caucasica, Capra cylindricornis Capra aegagrus, Capra falconeri）内に該当する任意の種を意味する。
【００６２】
ヒツジ抗体は、ヒツジにおいて生じた抗体に対して少なくとも１００％、９９％、９５％、９０％、８０％、７５％、６０％、５０％、２５％または１０％のアミノ酸配列同一性を有する抗体である。
【００６３】
配列の比較のために、典型的には１つの配列が参照配列として作用し、これと試験配列を比較し得る。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピューターに入力し、必要であればその後の座標を指定し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。その後、配列比較アルゴリズムは、指定したプログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較した試験配列（群）についての配列同一率を計算する。
【００６４】
比較のための配列の最適なアラインメントを、例えば、Smith and Waterman [Adv. Appl. Math. 2: 484 (1981)]の局所相同性アラインメントアルゴリズムによって、Needleman & Wunsch [J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)]のアルゴリズムによって、Pearson & Lipman [Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)]の類似性の方法についての探索によって、これらのアルゴリズムのコンピューター実行によって（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Genetics Computer Groupの配列解析ソフトウェアパッケージ、University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705）、または目視検査によって[Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausbel et al, eds, Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, In. And John Wiley & Sons, Inc. (1995 Supplement) Ausbubelを参照]、実施し得る。
【００６５】
配列類似率を決定するのに適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである[Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215: pp. 403-410;および"http://www.ncbi.nlm.nih.gov/" of the National Center for Biotechnology Informationを参照]。
【００６６】
好ましい相同性比較において、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも２０アミノ酸、より好ましくは３０アミノ酸残基長である配列領域にわたって同一性が存在する。
【００６７】
「抗体」は最も広い意味で使用され、そしてそれらが所望の生物学的活性を示す限りポリクローナル抗体および抗体フラグメントも特に網羅する。特に、抗体は、少なくとも１つまたは２つの重鎖（Ｈ）可変領域（本明細書においてはＶＨＣと略称する）、および少なくとも１つまたは２つの軽鎖（Ｌ）可変領域（本明細書においてはＶＬＣと略称する）を含むタンパク質である。ＶＨＣおよびＶＬＣ領域はさらに、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域の散在した、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変領域にさらに分類され得る。フレームワーク領域およびＣＤＲの程度は正確に定義されている（Kabat, E.A., et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991, およびChothia, C. et al, J. MoI. Biol. 196:901-917, 1987を参照、これは参照により本明細書に組み入れられる）。
【００６８】
好ましくは、各々のＶＨＣおよびＶＬＣは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、これはアミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で整列している：ＦＲＩ、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００６９】
抗体のＶＨＣ鎖またはＶＬＣ鎖はさらに、重鎖または軽鎖の定常領域の全部または一部をさらに含むことができる。１つの態様において、抗体は２つの重鎖免疫グロブリンと２つの軽鎖免疫グロブリンとの四量体であり、重鎖および軽鎖の免疫グロブリン鎖は、例えばジスルフィド結合によって内部接続されている。重鎖定常領域は、３つのドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、すなわちＣＬからなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、典型的には、宿主組織または因子（免疫系の種々の細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的な補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）を含む）への抗体の結合を媒介する。「抗体」という用語は、ＩｇＡ型、ＩｇＧ型、ＩｇＥ型、ＩｇＤ型、ＩｇＭ型（ならびにそのサブタイプ）のインタクトな免疫グロブリンを含み、免疫グロブリンの軽鎖は、κ型またはλ型であり得る。
【００７０】
本明細書において使用する抗体という用語はまた、Ｃ．ディフィシルの毒素（例えば毒素Ｂ）に結合する抗体の部分、例えば、１つ以上の免疫グロブリン鎖が全長ではないが毒素に結合する分子を指す。抗体という用語に包含される結合部分の例としては、（ｉ）ＶＬＣドメイン、ＶＨＣドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨＣドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｃフラグメント；（ｉｖ）抗体の単腕のＶＬＣドメインおよびＶＨＣドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨＣドメインからなるｄＡｂフラグメント(Ward et al, Nature 341:544-546, 1989)；および（ｖｉ）結合するために十分なフレームワークを有する単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば可変領域の抗原結合部分が挙げられる。軽鎖可変領域の抗原結合部分および重鎖可変領域の抗原結合部分、例えばＦｖフラグメントの２つのドメインである、ＶＬＣおよびＶＨＣを、組換え法を使用して、１つのタンパク質鎖として作製することを可能とする合成リンカーによって接続することができ、ＶＬＣ領域とＶＨＣ領域は対を形成して一価の分子を形成する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Bird et al. (1988) Science lAl-ATi-Alβ;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. ScL USA 85:5879-5883参照）。このような単鎖抗体もまた抗体という用語に包含される。これらは、当業者に公知の慣用的な技術を使用して得られ、そして前記部分を、インタクトな抗体と同じように有用性についてスクリーニングする。
【００７１】
これから図面の簡単な説明を以下に示し、これは本発明の局面および／または態様を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】アフィニティクロマトグラフィーによる血清中における毒素Ａに対する抗体の測定。その後に溶出された、セファロースゲルに固定された毒素Ａに結合している抗体。図は、ローディングされた血清と溶出された毒素Ａ特異的抗体との間の直線関係を示す。実験の詳細を実施例９において提供する。
【図２】アフィニティクロマトグラフィーによる血清中における毒素Ａに対する抗体の測定。その後に溶出された、セファロースゲルに固定された毒素Ａに結合している抗体。図は、毒素Ａのトキソイドを用いて免疫化されたヒツジにおける特異的抗体を実証する。毒素Ａに対する抗体は、ヒツジ血清中に３mg/ml（３ｇ/リットル）超で存在していた。実験の詳細を実施例９において提供する。
【図３】ヒツジ抗クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢの混合物を用いての受動免疫化による、ＣＤＩからの防御。シリアンハムスター（１０匹の群）に、指定した時間に、１０mg/用量（▼）、２mg/用量（■）の毒素ＡおよびＢに対するヒツジ抗体、または非特異的対照抗体（●）のいずれかを用いて受動免疫化（腹腔内）した。−２日目および０日目にクリンダマイシンを受けた動物に、Ｃ．ディフィシル胞子（２×１０２コロニー形成単位）を用いてチャレンジした。生存率、チャレンジ後の日数をプロットによって示す。
【図４】ヒツジ抗クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡまたはＢを用いての受動免疫化による、ＣＤＩからの防御。シリアンハムスター（１０匹の群）に、指定した時間に、１０mg/用量の毒素Ａ＋Ｂに対するヒツジ抗体（▼）、１０mg/用量の毒素Ａ抗体単独（△）、１０mg/用量の毒素Ｂ抗体単独（○）、または非特異的対照抗体（□）のいずれかを用いて受動免疫化（腹腔内）した。−２日目および０日目にクリンダマイシンを受けた動物に、Ｃ．ディフィシル胞子（２×１０２コロニー形成単位）を用いてチャレンジした。生存率、チャレンジ後の日数をプロットによって示す。
【図５】ヒツジ抗クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢの混合物を用いての受動免疫化による、「超病原性」クロストリジウム・ディフィシルのリボタイプ０２７（Ｒ２０２９１株、Stoke Mandeville）によって誘発されたＣＤＩからの防御。シリアンハムスター（１０匹の群）に、指定した時間に、１０mg/用量の毒素ＡおよびＢに対するヒツジ抗体（▼）または非特異的対照抗体（■）のいずれかを用いて受動免疫化（腹腔内）した。−３日目および０日目にクリンダマイシンを受けた動物に、Ｃ．ディフィシル胞子（１×１０３コロニー形成単位）を用いてチャレンジした。チャレンジ後の日数における疾病状態をプロットによって示す。
【図６】ヒツジ抗クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢの混合物を用いての受動免疫化による、「超病原性」クロストリジウム・ディフィシル（毒素タイプ５）のリボタイプ０７８によって誘発されたＣＤＩからの防御。シリアンハムスター（１０匹の群）に、指定した時間に、１０mg/用量の毒素ＡおよびＢに対するヒツジ抗体（▼）または非特異的対照抗体（●）のいずれかを用いて受動免疫化（腹腔内）した。−２日目および０日目にクリンダマイシンを受けた動物に、Ｃ．ディフィシル胞子（２×１０３コロニー形成単位）を用いてチャレンジした。チャレンジ後の日数における疾病状態をプロットによって示す。
【００７３】
実施例の要約
実施例１ Ｃ．ディフィシルの毒素タイプ０の毒素ＡおよびＢの精製。
実施例２ Ｃ．ディフィシルの他の毒素タイプの毒素ＡおよびＢの精製。
実施例３ 組換えＣ．ディフィシル毒素ＡおよびＢの精製。
実施例４ Ｃ．ディフィシル二元毒素の精製。
実施例５ Ｃ．ディフィシル毒素ＡおよびＢのトキソイドの調製。
実施例６ 抗血清の調製。
実施例７ 毒素タイプ０の毒素ＡおよびＢに対する抗血清の調製。
実施例８ in vitro細胞アッセイを使用した、毒素に対する抗血清の中和効力の評価。
実施例９ イムノアフィニティカラムを使用した血清中のＣ．ディフィシル毒素に対する特異的抗体の量の定量。
実施例１０ 抗体混合物の調製。
実施例１１ ＣＤＩを予防するためのヒツジ抗体のin vivoにおける効力の評価。
実施例１２ ＣＤＩを処置するためのヒツジ抗血清のin vivoにおける効力の評価。
実施例１３ 抗体製剤の臨床的使用。
実施例１４ ヒツジ抗クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢの抗体混合物を用いての受動免疫化による、ＣＤＩからの防御。
実施例１５ ヒツジ抗クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡもしくはＢ抗体を用いての、またはヒツジ抗クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢの抗体混合物を用いての受動免疫化による、ＣＤＩからの防御。
実施例１６ ヒツジ抗クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢの混合物を用いての受動免疫化による、「超病原性」クロストリジウム・ディフィシルのリボタイプ０２７（Ｒ２０２９１株、Stoke Mandeville）によって誘発されたＣＤＩからの防御。
実施例１７ ヒツジ抗クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢの混合物を用いての受動免疫化による、「超病原性」クロストリジウム・ディフィシル単離株のリボタイプ０７８によって誘発されたＣＤＩからの防御。
【００７４】
配列番号の要約
最初のＭｅｔアミノ酸残基または対応する開始コドンが、以下のいずれの配列番号において示されているが、前記残基／コドンは任意選択である。
１．クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ−毒素タイプ０のタンパク質配列
２．クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂ−毒素タイプ０のタンパク質配列
３．クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ−毒素タイプＩＩＩのタンパク質配列
４．クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂ−毒素タイプＩＩＩのタンパク質配列
５．クロストリジウム・ディフィシル二元毒素フラグメントＡのタンパク質配列
６．クロストリジウム・ディフィシル二元毒素フラグメントＢのタンパク質配列
【００７５】
実施例
実施例１ クロストリジウム・ディフィシルの毒素タイプ０の毒素ＡおよびＢの精製
毒素タイプ０の毒素ＡおよびＢを産生するＣ．ディフィシル株（例えばＶＰＩ １０４６３）を、記載(Roberts and Shone (2001) Toxicon 39: 325-333)のように透析サック培養液中で増殖させた。増殖後、細胞スラリーを透析サックから回収し、そしてその後、１００００×ｇで３０分間遠心分離にかけ、そして得られた上清の液体のｐＨをｐＨ７．５に調整し、そして硫酸アンモニウムに関して７０％飽和とさせた。毒素を含む沈降物を遠心分離によって回収し、その後、５０mMビストリスｐＨ６．５緩衝液中に再懸濁し、そして４℃の同じ緩衝液に対して透析した。透析後、毒素ＡおよびＢの粗溶液をＱセファロースクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製し、そして毒素を含むタンパク質ピークをＮａＣｌ勾配で溶出した。毒素Ａを含むピークを、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む５０mM Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）緩衝液に対して透析し、Ｚｎキレートカラム（Ｚｎセファロース）で精製した。毒素をローディングし、そしてカラムから汚染タンパク質を洗浄した後、精製した毒素Ａを、５０mM Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、２０mM ＥＤＴＡおよび０．１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液を用いて溶出した。精製した毒素Ａを、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０mM Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）緩衝液に対して透析し、そして使用するまで４℃で保存するかまたは凍結させた。最初のＱセファロースカラムからの毒素Ｂを含むピークを、高分解能のＭｏｎｏＱ陰イオン交換樹脂のカラムクロマトグラフィーによってさらに精製した。毒素を、５０mMビストリス（ｐＨ６．５）緩衝液中のカラムにローディングした後、精製した毒素Ｂを、ＮａＣｌ勾配を用いて溶出し、そして毒素を含む画分をプールした。精製した毒素Ｂを、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０mM Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）緩衝液に対して透析し、そして使用するまで４℃で保存するかまたは凍結させた。
【００７６】
実施例２ Ｃ．ディフィシルの他の毒素タイプの毒素ＡおよびＢの精製
公知の任意の毒素タイプを示す毒素ＡおよびＢを、実施例１に記載のように精製し得る。種々の毒素タイプの毒素ＡおよびＢを産生する公知のＣ．ディフィシル株を表１に示し、そして精製のために必要な株を選択することによって、必要とされる毒素タイプの毒素ＡおよびＢを精製し得る。あるいは、所望の毒素タイプの毒素を産生するＣ．ディフィシル株が得られるまで、Ｃ．ディフィシルを以前に記載（Rupnik et al. (1998) J. Clinical Microbiol. 36: 2240-2247; Rupnik et al. (2001) Microbiology 147: 439-447）のように毒素タイプ分類し得る。
【００７７】
毒素タイプＩＩＩの毒素ＡおよびＢを産生するために、Ｃ．ディフィシルＲ２０２９１株（またＮＣＴＣ１ ３３６６としても知られる）を、透析サック培養液中で記載（Roberts and Shone (2001) Toxicon 39: 325-333）のように増殖させ、そして毒素を実施例１に記載のように精製した。
【００７８】
実施例３ 組換えＣ．ディフィシル毒素ＡおよびＢの精製
Ｃ．ディフィシル毒素ＡおよびＢの例のアミノ酸配列を配列番号１〜４に示す。これらのペプチドをコードする遺伝子は、任意の所望の発現宿主（例えばE.coli、Pichia pastoris）のためのコドン偏位をもって商業的に作製され得る。ペプチドをこれらの遺伝子から標準的な分子生物学的方法（例えばSambrook et al. 1989, Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）を使用して発現させ、そして得られた可溶性の発現されたポリペプチドを、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびセラミックヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーの組合せによって精製する。タンパク質精製技術分野においては周知である他のクロマトグラフィー技術、例えばサイズ排除クロマトグラフィーおよび／またはアフィニティクロマトグラフィーも使用し得る。後者のために、組換えフラグメントは、pET vector Expression System Manual, 11th Edition published by Merck KGaA, Darmstadt, Germanyにおいて記載のようにアフィニティ精製タグ（例えばヒスチジン−６、ｓｔｒｅｐｔａｇ）と共に発現され得る。
【００７９】
配列が不明であるＣ．ディフィシルの毒素タイプから組換え毒素を産生するために、標準的な分子生物学的方法によってＤＮＡを最初に抽出し、そして毒素配列（群）を誘導することが必要である。一旦、配列が誘導されたら、組換え毒素を、前記のように合成遺伝子から発現させることができる。
【００８０】
実施例４ Ｃ．ディフィシル二元毒素の精製
Ｃ．ディフィシル二元毒素フラグメントＡおよびＢのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５および６に示す。これらのペプチドをコードする遺伝子は、任意の所望の発現宿主（例えばE.coli、Pichia pastoris）のためのコドン偏位をもって商業的に作製され得る。ペプチドをこれらの遺伝子から標準的な分子生物学的方法（例えばSambrook et al. 1989, Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）を使用して発現させ、そして得られた可溶性の発現されたペプチドを、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびセラミックヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーの組合せによって精製する。タンパク質精製技術分野においては周知である他のクロマトグラフィー技術、例えばサイズ排除クロマトグラフィーおよび／またはアフィニティクロマトグラフィーも使用し得る。あるいは、組換えフラグメントは、pET vector Expression System Manual, 11th Edition published by Merck KGaA, Darmstadt, Germanyにおいて記載のようにアフィニティ精製タグ（例えばヒスチジン−６、ｓｔｒｅｐｔａｇ）と共に発現され得る。
【００８１】
ペプチドが不溶性の形態で産生される場合、次いでそれらを市販されている発現ベクター（例えばｐＥＴ５２ｂ）を使用してヒスチジン−６精製タグと共に発現させ得、そしてLia et al.の概説およびその中に含まれる参考文献（Lia M et al (2004) Protein Expression & Purification 33, 1-10、これは参照により本明細書に組み入れられる）によって記載のようなオンカラムリフォールディングによってリフォールディングし得る。
【００８２】
実施例５ Ｃ．ディフィシル毒素ＡおよびＢのトキソイドの調製
０．２〜２mg/mlの濃度の精製されたＣ．ディフィシル毒素を、適切な緩衝液（例えば、１５０mM ＮａＣｌを含む１０mM Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４）に対して透析し、そしてその後、０．０５〜０．５％の最終濃度でホルムアルデヒドを加え、そして１〜２５日間３５℃でインキュベーションする。インキュベーション後、ホルムアルデヒドを透析によって除去する。ホルムアルデヒドを用いての処理のための条件は、ペプチドによって変動し得、そして最終条件は、防御効力の評価の結果に基づいて微調整し得る。
【００８３】
実施例６ 抗血清の調製
最適な体液性抗体応答を達成するために、抗血清の調製中には多くの因子を考慮する。これらは：
動物の繁殖、
アジュバントの選択、
免疫化部位の数および場所、
免疫原の量
投与の回数および投与間隔
を含む。
【００８４】
これらのパラメーターの最適化の結果として、血清１リットルあたり６ｇ超の特異的な抗体レベルを得ることが通例である。
【００８５】
ヒツジのために、１０〜５００μgのＣ．ディフィシル抗原を含む２mlの緩衝溶液を、２．６mlのフロイントアジュバントと混合する。完全形のアジュバントを一次免疫化のために使用し、そして不完全フロイントアジュバントをその後の全てのブーストのために使用する。安定なエマルションが確実に得られるように、アジュバントの混合を数分間かけて行なう。約４．２mlの抗原／アジュバント混合物を使用して、筋肉内注入によって各ヒツジを免疫化し、そして首および全ての上肢を含む６つの部位に広げる。これを２８日毎に繰り返す。血液試料を各免疫化の１４日後に採取する。一旦、適切な抗体レベルが達成されると、より多くの容量を滅菌バッグに採取する（体重１kgあたり１０ml）。バッグをゆっくりと回転させて凝血を加速させ、４５００×ｇで３０分間遠心分離にかけ、そして血清を無菌条件下で取り出し、そしてプールする。所望のＣ．ディフィシル抗原に対して低い力価を示したあらゆる動物を集団から除去する。
【００８６】
実施例７ 毒素タイプ０の毒素ＡおよびＢに対する抗血清の調製
毒素タイプ０の株（例えばＶＰＩ １０４６３）からの毒素ＡおよびＢを実施例１に記載のように調製した。あるいは、毒素ＡまたはＢを、Yang et al.（Yang G, Zhou B, Wang J, He X, Sun X, Nie W, Tzipori S, Feng H (2008) Expression of recombinant Clostridium difficile toxin A and B in Bacillus megaterium. BMC Microbiol. 8: 192）によって記載のような組換え法によって作製し得る。精製した毒素を、実施例５に記載のようにトキソイド化し得る。
【００８７】
トキソイドＡまたはＢを用いてのヒツジの免疫化のために、１０〜５００μgのＣ．ディフィシルトキソイドＡまたはＢのいずれかを含む２mlの緩衝溶液を、２．６mlのフロイントアジュバントと混合した。完全形のアジュバントを一次免疫化のために使用し、そして不完全フロイントアジュバントをその後の全てのブーストのために使用した。安定なエマルションが確実に得られるように、アジュバントの混合を数分間かけて行なう。混合後、約４．２mlの抗原／アジュバント混合物を使用して、筋肉内注入によって各ヒツジを免疫化し、そして首および全ての上肢を含む６つの部位に広げた。これを２８日毎に繰り返し、そして血清試料を各免疫化の１４日後に回収した。一旦、適切な抗体レベルが達成されると、より多くの産生試料を滅菌バッグに採取した（体重１kgあたり１０ml）。バッグをゆっくりと回転させて凝血を加速させ、４５００×ｇで３０分間遠心分離にかけ、そして血清を無菌条件下で取り出し、そしてプールした。毒素ＡまたはＢのいずれかに対して低い力価を示したあらゆる動物を集団から排除した。
【００８８】
実施例８ in vitroにおける細胞アッセイを使用した、毒素に対する抗血清の中和効力の評価
Ｃ．ディフィシル毒素に対する抗血清の毒素中和活性を、Ｖｅｒｏ細胞を使用して細胞毒性アッセイによって測定する。一定量の精製されたＣ．ディフィシル毒素ＡまたはＢのいずれかを、種々の希釈の抗体と混合し、３７℃で１時間インキュベーションし、そしてその後、２４ウェル組織培養プレート上で増殖しているＶｅｒｏ細胞に適用する。毒素ＡおよびＢの両方が細胞毒性活性を有し、その結果、２４〜７２時間の期間におよびＶｅｒｏ細胞の特徴的な円形化が起こる。中和抗体の存在下においてはこの活性は阻害され、そして抗体調製物の中和強度は、指定された量の毒素ＡまたはＢのいずれかの効果を中和するのに必要とされる希釈によって評価され得る。
【００８９】
Ｃ．ディフィシル毒素Ａに対するヒツジ抗体の中和活性を実証したデータを表２に示す。この実験においては、種々の希釈のヒツジ抗体を毒素Ａと５０ng/mlの最終濃度で混合し、そして３７℃で１時間インキュベーションし、そしてその後、前記のようにＶｅｒｏ細胞に適用し、そして３７℃でインキュベーションし、そして２４〜７２時間の期間かけてモニタリングした。毒素Ａの細胞毒性作用に対して細胞を防御する抗体希釈を計算した。表２は、１４週間の期間かけて免疫化したヒツジが、１６０００の中和力価を有していたことを示す（すなわち１／１６０００の希釈の血清が、細胞を、毒素Ａの細胞毒性作用から防御した）。
【００９０】
表２−ホルムアルデヒドで処理した毒素Ａに対して生じたヒツジ抗体の中和力価：
【００９１】
【表２】
【００９２】
表３−ホルムアルデヒドで処理した毒素Ｂに対して生じたヒツジ抗体の中和力価
これらのデータ（以下）は、Ｖｅｒｏ細胞の細胞毒性アッセイによって測定したところ、より高い免疫化用量のトキソイドＢ抗原が、より良好なヒツジ毒素中和免疫応答をもたらすことを示す。使用したアッセイを、すぐ上の実施例８において記載する。
【００９３】
【表３】
【００９４】
表４−等価な濃度の毒素タイプ０および毒素タイプＩＩＩの毒素Ｂに対する、ヒツジ抗毒素Ｂの中和力価
これらのデータ（以下）は、等価な量の毒素Ｂ（毒素タイプ０）および毒素Ｂ（毒素タイプＩＩＩ）を中和する、毒素Ｂ（毒素タイプ０）から誘導されたトキソイドＢに対して生じたヒツジ抗体の能力を比較する。毒素Ｂ（毒素タイプ０）および毒素Ｂ（毒素タイプＩＩＩ）をそれぞれＣ．ディフィシルＶＰＩ １０４６３株およびＲ２０２９１株から精製した。
【００９５】
細胞アッセイをすぐ上に実施例８において記載したように、等価な細胞毒性量の毒素Ｂの各タイプを使用して実施した。滴定を、１つの実験においては４単位（細胞死を誘導するのに必要とされる量の４倍）および別の実験においては１０単位で固定した毒素Ｂに対して行なった。
【００９６】
データは、毒素タイプ０の株から誘導されたトキソイドＢを使用して毒素Ｂに対して生じたヒツジ抗体が、毒素Ｂ（毒素タイプ０）および毒素Ｂ（毒素タイプＩＩＩ）を同じ効力で中和したことを示す。
【００９７】
【表４】
【００９８】
表５．等価な濃度の毒素タイプ０および毒素タイプＶの毒素Ｂに対するヒツジ抗毒素Ｂの中和力価
これらのデータは、等価な量の毒素Ｂ（毒素タイプ０）および毒素Ｂ（毒素タイプＶ）を中和する、毒素Ｂ（毒素タイプ０）から誘導されたトキソイドＢに対して生じたヒツジ抗体の能力を比較する。毒素Ｂ（毒素タイプ０）および毒素Ｂ（毒素タイプＶ）を、Ｃ．ディフィシルＶＰＩ １０４６３株およびＣ．ディフィシルリボタイプ０７８単離株からそれぞれ精製した。
【００９９】
細胞アッセイを、実施例８のように、等価な細胞毒性量の毒素Ｂの各タイプを使用して実施した。滴定を、１つの実験においては４単位（細胞死を誘導するのに必要とされる量の４倍）および別の実験においては１０単位で固定した毒素Ｂに対して行なった。
【０１００】
データは、毒素タイプ０の株から誘導されたトキソイドＢを使用して、毒素Ｂに対して生じたヒツジ抗体が、毒素Ｂ（毒素タイプ０）およびまた毒素Ｂ（毒素タイプＩＩＩ）を２倍低下した効力で中和したことを示す。
【０１０１】
【表５】
【０１０２】
実施例９ イムノアフィニティカラムを使用した、血清中のＣ．ディフィシル毒素に対する特異的抗体の量の定量
カラム調製
必要量のＣＮＢｒ活性化セファロース４ファストフロー（０．５ｇ乾燥重量）を適切な清潔な容器（ガラスまたはプラスチック）に評量する。約１０mlの希塩酸（１mM）を加えてゲルを膨潤させ、そして２０〜３０分後、ゲルを１０mLのガラスカラムに移し、そしてさらなる２０mLのＨＣｌ（１mM）で洗浄し、その後、２０mLのカップリング緩衝液（５００mMの塩化ナトリウムを含む重炭酸ナトリウム、１００mM、ｐＨ８．３）で洗浄する。１mg/mLの濃度の毒素（毒素Ａ、毒素Ｂまたは二元毒素フラグメント溶液（１mL））をカップリング緩衝液を用いて５mLに希釈し、そして活性化ゲルを含むカラムに加え、そしてゲルが再懸濁されるまで内容物を穏やかに混合し、そして室温で一晩（１６〜１８時間）回転させる。その後、カラムを流し、そして５mlの遮断試薬（エタノールアミン溶液、１Ｍ）を加え、穏やかに混合し、そして室温で２時間回転させる。次に、カラムを２０mLのカップリング緩衝液で洗浄し、その後、２０mLの溶出緩衝液（グリシン溶液、１００mM、ｐＨ２．５）で洗浄する。この工程を２回繰り返す。カラムを最後に２０mLのアッセイ緩衝液（５００mM塩化ナトリウムおよび最終濃度１ｇ/Ｌのアジ化ナトリウムを含む、リン酸ナトリウム緩衝液、１０mM、ｐＨ７．４）で洗浄し、そして使用するまで２〜８℃で３〜５mLのアッセイ緩衝液中に保存する。
【０１０３】
カラム評価
カラムの特異的結合容量および非特異的な容量を使用前に評価しなければならない。カラムを冷蔵庫から取り出し、そして室温で平衡化させ、そしてその後、２５mLのアッセイ緩衝液で洗浄する。漸増容量の産物（全抗血清、精製ＩｇＧ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）を個々にカラムにローディングし、そして室温で１時間穏やかに回転させて混合する。非結合画分を２５mLのアッセイ緩衝液で洗浄除去し、そしてその後、結合した画分をカラムから２０mlの溶出緩衝液（グリシン緩衝液１００mM、ｐＨ２．５）を用いて溶出する。溶出画分のタンパク質含量を、産物に関連した吸光係数、すなわちヒツジＩｇＧについては１．５（Curd et al., 1971）またはヒツジＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２については１．４（Allen, 1996）を使用して２８０nmにおける分光測定で決定する。ローディングされた容量に対して溶出タンパク質の量をプロットすることによって飽和曲線を得る。
【０１０４】
非特異的結合（ＮＳＢ）を免疫化前の通常のヒツジ血清（ＮＳＳ）を使用して評価する。従って、これと、正常の血清中のいくつかの特異的な抗体に起因する結合とを区別する必要がある（全ての動物がＣ．ディフィシルにさらされたことがあろうため）。図１は、抗血清ローディング容量の増加の結果としての、特異的な結合の増加を示す、典型的な結合能曲線を実証する。ローディング容量の増加により非特異的結合（ＮＳＢ）に僅かな変化がある。１mgの毒素（カップリング比は２mg/g）を含む０．５ｇ（１．５〜２．０mLの膨潤したゲル）は、ローディングする特異的な抗血清の容量（０．５〜４mL）に対して十分である。しかしながら、１mlが、容易かつ簡便な計算のために推奨されるローディング容量である。
【０１０５】
１０個のレプリケートの変動係数（アッセイ間変動ＣＶ）は、約６％である。時間に伴う（８０〜１００回使用した場合と推定）カラム容量の減少は全くない。このことは、カラムからの毒素の浸出が全くないことを示す。
【０１０６】
産物の評価のためのアフィニティカラム
カラムを、製造工程および最終産物、すなわち全抗血清、精製ＩｇＧ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２のＧＭＰ／ＧＬＰの評価のために使用する。それはまた、免疫化動物の免疫応答を評価およびモニタリングするため、並びにヒト試料中の抗毒素抗体を検出するために使用される。
【０１０７】
カラムを冷蔵庫から取り出し、そして室温で平衡化させ、２５mLのアッセイ緩衝液で洗浄する。産物（１mL）をカラムに加え、そして室温で１時間穏やかに回転させて混合し、その後、非結合画分を２５mLのアッセイ緩衝液（５００mM塩化ナトリウムおよび最終濃度１ｇ/Ｌのアジ化ナトリウムを含む、リン酸ナトリウム緩衝液、１０mM、ｐＨ７．４）で洗浄除去する。その後、結合画分を２０mlの溶出緩衝液（グリシン緩衝液１００mM、ｐＨ２．５）で溶出し、そしてそのタンパク質含量を、産物に関連した吸光係数を使用して２８０nmにおける分光測定で決定する。図２は、毒素Ａのトキソイドを用いて免疫化したヒツジに由来する血清の分析を示す。
【０１０８】
実施例１０ 抗体混合物の調製
毒素ＡおよびＢおよびその種々のアイソフォーム（毒素タイプ）に対する必要とされる中和活性が最終混合物に存在するように、抗体をブレンドして最終産物を形成する。
【０１０９】
種々のＣ．ディフィシル毒素タイプに対して調製された抗体をブレンドして、実施例１０において評価したように類似した交差防御的効力を与え得る。例えば、毒素タイプ０およびＩＩＩから誘導されたＣ．ディフィシル毒素Ｂに対する類似した交差防御を与えるために、抗体を種々の比率（例えば１：１、２：１、１：２の比）で混合して、毒素Ｂの各毒素タイプに対する類似した特異的な中和活性を与え得る。
【０１１０】
実施例１１ ＣＤＩを予防するためのヒツジ抗体のin vivoにおける効力の評価
in vivoにおけるＣＤＩに対する抗体の予防的、防止的効力を実証するために、シリアンハムスターを、Ｃ．ディフィシルの１つ以上の毒素に対して中和活性を有するヒツジ抗体を用いて受動免疫化する。予防効力を評価するために、ハムスターに、静脈内または腹腔内経路のいずれかで、Ｃ．ディフィシルによるチャレンジの９６時間前からチャレンジから２４０時間後までの種々の時点において抗体を投与する。
【０１１１】
受動免疫化されたハムスターに、広域スペクトル抗生物質（例えばクリンダマイシン）を投与し、そして１２〜７２時間後に経口によりＣ．ディフィシル胞子を用いてチャレンジする。その後、動物を１５日間までＣ．ディフィシルに関連した疾病の症状についてモニタリングする。対照、すなわち非免疫化動物は疾病の兆候（例えば下痢、膨張した腹部、傾眠、毛を逆立たせる）を発症するが、一方、ヒツジ抗体を用いて受動免疫化された動物は正常のようである。
【０１１２】
実施例１２ ＣＤＩを処置するためのヒツジ抗血清のin vivoにおける効力の評価
in vivoにおいてＣＤＩを処置するための抗血清の効力を実証するために、シリアンハムスターを、Ｃ．ディフィシルの１つ以上の毒素に対して中和活性を有するヒツジ抗体を用いて受動免疫化する。処置製剤の効力を評価するために、ハムスターに、静脈内または腹腔内経路のいずれかで、Ｃ．ディフィシルによるチャレンジの６時間前からチャレンジから２４０時間後までの種々の時点において抗体を投与する。
【０１１３】
受動免疫化の前に、ハムスターに広域スペクトル抗生物質（例えばクリンダマイシン）を投与し、そして１２〜７２時間後に経口によりＣ．ディフィシル胞子を用いてチャレンジする。その後、動物を１５日間までＣ．ディフィシルに関連した疾病の症状についてモニタリングする。対照、すなわち非免疫化動物は疾病の兆候（例えば下痢、膨張した腹部、傾眠、毛を逆立たせる）を発症するが、一方、ヒツジ抗体を用いて処置された動物は正常のようである。
【０１１４】
実施例１３ 抗体製剤の臨床使用
３つの実施例が、そのＣＤＩの重度が種々である患者における、全身性のヒツジ産物の治療価を説明するのに役立つ。
【０１１５】
軽度のＣＤＩ
６７歳の男性が、重度の心筋梗塞後に冠疾患集中治療室に入院した。無事に回復したが、回復時に、軽度の下痢を発症し、他の兆候または症状は全くなかった。病院において最近ＣＤＩのエピソードがあったので、糞便試料を直ちに試験のために送り、そして毒素Ａおよび毒素Ｂの両方を含んでいることが判明した。専属のトイレを有する個室に隔離された後、静脈内に２５０mgのヒツジＦ（ａｂ’）２を受け、その後、２日後に２回目の注射を受けた。下痢は迅速に止まり、そしてメトロニダゾールまたはバンコマイシンのいずれの必要もなく完全に回復した。
【０１１６】
再発のリスクを伴う重度ＣＤＩ
８１歳の女性が自宅で転倒し、そして左股関節の骨折を被った。直ちに入院し、股関節は成功裏に固定された。虚弱な容態は早期の退院の妨げ、数日後、湿性咳を発症し、そのために広域スペクトル抗生物質を投与された。さらに８日後、腹痛および圧痛を伴う重篤な下痢を発症し、そして適切な糞便検査によってＣＤＩと診断された。その時点で顕著に上昇した白血球数および脱水を伴うかなりの体液喪失という全身的な徴候のエビデンスもあった。患者は直ちに経口バンコマイシンを開始し、同時に、静脈内に２５０mgのヒツジＦ（ａｂ’）２に基づいた産物の１日１回の５回の注射の初回を受けた。ＣＤＩの兆候および症状、並びにＣＤＩの検査的な徴候は急速に回復した。しかしながら、バンコマイシンを止めた後のＣＤＩの再発のリスクを避けるために、さらに２週間、経口形の抗体療法の処置を続けた。全く再発しなかった。
【０１１７】
合併症を伴う重度ＣＤＩ
８７歳の女性が、長期滞在介護施設に住んでいる間に気管支肺炎を発症した。地元の一般開業医は、抗生物質療法のコースを開始し、直ちに利点が得られた。しかしながら、抗生物質を止めた８日後に、重度の下痢を発症した。容態は悪化し始め、病院への入院が必要となり、そこでＥＬＩＳＡ検査によって糞便中に毒素Ａが検出された。この時までに、循環不全のエビデンスを伴い極めて病気が重く、そして下痢は止まった。後者は、麻痺性イレウスおよび中毒性巨大結腸症の併発に起因するものと判明し、そして緊急の全結腸切除術が必須と考えられた。このような手術は６０％を超える死亡率を伴うので、２アンプル（５００mg）の含量の産物と一緒に静脈内への補充療法を受けた。４時間後に手術室へと運ばれた時までに、全身容態はかなり改善し、そして手術を切り抜けて生き延びた。
【０１１８】
実施例１４ 抗Ｃ．ディフィシル毒素ＡおよびＢの抗体混合物を用いての受動免疫化によるＣＤＩからの防御
シリアンハムスター（１０匹の群）に、指定した時間において、１０mg/用量（▼）、２mg/用量（■）の毒素ＡおよびＢに対するヒツジ抗体、または非特異的な対照抗体（●）のいずれかを用いて受動免疫化（腹腔内）した。−２日目および０日目にクリンダマイシンを受けた動物に、Ｃ．ディフィシル胞子（２×１０２コロニー形成単位）を用いてチャレンジした。生存率、チャレンジ後の日数をプロットによって示す。
【０１１９】
データ（図３参照）は明瞭に、毒素ＡおよびＢに対するヒツジ抗体の混合物を用いての受動免疫化が、ＣＤＩからの防御を与えることを示す。この実験において、高い抗体用量を与えられた動物の９０％がチャレンジから１２日後において無症候性であった。
【０１２０】
実施例１５ ヒツジ抗クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡまたはＢの抗体を用いての、またはヒツジ抗クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢの抗体混合物を用いての受動免疫化によるＣＤＩからの防御
シリアンハムスター（１０匹の群）に、指定した時間において、１０mg/用量の毒素Ａ＋Ｂに対するヒツジ抗体（▼）、１０mg/用量の毒素Ａ抗体のみ（△）、１０mg/用量の毒素Ｂ抗体のみ（○）、または非特異的な対照抗体（□）のいずれかを用いて受動免疫化（腹腔内）した。−２日目および０日目においてクリンダマイシンを受けた動物に、Ｃ．ディフィシル胞子（２×１０２コロニー形成単位）を用いてチャレンジした。生存率、チャレンジ後の日数をプロットによって示す。
【０１２１】
データ（図４参照）は、ＣＤＩに対する防御に関して、毒素Ａ＋Ｂの抗体の混合物の効力は、単独で投与されたいずれの抗体よりも有意に良好であることを示す。
【０１２２】
実施例１６ ヒツジ抗クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢの混合物を用いての受動免疫化による、「超病原性」クロストリジウム・ディフィシルのリボタイプ０２７（Ｒ２０２９１株、Stoke Mandeville）によって誘発されるＣＤＩからの防御
シリアンハムスター（１０匹の群）に、指定した時間において、１０mg/用量の毒素ＡおよびＢに対するヒツジ抗体（▼）または非特異的対照抗体（■）のいずれかを用いて受動免疫化（腹腔内）した。−３日目および０日目にクリンダマイシンを受けた動物にＣ．ディフィシル胞子（１×１０３コロニー形成単位）を用いてチャレンジした。チャレンジ後の日数における疾病状態をプロットによって示す。
【０１２３】
データ（図５参照）は明瞭に、毒素ＡおよびＢに対するヒツジ抗体の混合物を用いての受動免疫化が、「超病原性」Ｃ．ディフィシルの０２７（Ｒ２０２９１株、Stoke Mandeville）によって誘発されるＣＤＩからの防御を与えることを示す。この実験において、毒素Ａ／Ｂ抗体を投与された動物の９０％が、チャレンジ後の１８日目において無症候性であり、一方、非免疫化対照の８０％が重度なＣＤＩの症状を示した。
【０１２４】
実施例１７ ヒツジ抗クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢの混合物を用いての受動免疫化による、「超病原性」Ｃ．ディフィシル単離株のリボタイプ０７８によって誘発されるＣＤＩからの防御
シリアンハムスター（１０匹の群）に、指定した時間において、１０mg/用量の毒素ＡおよびＢに対するヒツジ抗体（▼）または非特異的対照抗体（●）のいずれかを用いて受動免疫化（腹腔内）した。−２日目および０日目にクリンダマイシンを受けた動物にＣ．ディフィシル胞子（２×１０３コロニー形成単位）を用いてチャレンジした。チャレンジ後の日数における疾病状態をプロットによって示す。
【０１２５】
データ（図６参照）は明瞭に、毒素ＡおよびＢに対するヒツジ抗体の混合物を用いての受動免疫化が、「超病原性」Ｃ．ディフィシルの０７８によって誘発されるＣＤＩからの防御を与えることを示す。この実験において、毒素Ａ／Ｂの抗体を投与された動物の１００％が、チャレンジ後の１８日目において無症候性であり、一方、非免疫化対照の８０％が重度なＣＤＩの症状を示した。
【０１２６】
配列番号
１．クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ−毒素タイプ０
【化１】
【０１２７】
２．Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ−毒素タイプ０のタンパク質配列
【化２】
【０１２８】
３．Ｃ．ディフィシル毒素Ａ−毒素タイプＩＩＩのタンパク質配列
【化３】
【０１２９】
４．Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ−毒素タイプＩＩＩのタンパク質配列
【化４】
【０１３０】
５．Ｃ．ディフィシル二元毒素フラグメントＡのタンパク質配列
【化５】
【０１３１】
６．Ｃ．ディフィシル二元毒素フラグメントＢのタンパク質配列
【化６】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒツジ抗体、およびクロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）（Ｃ．ディフィシル）感染（ＣＤＩ）の予防または処置におけるその使用に関する。
【０００２】
クロストリジウム・ディフィシル感染（ＣＤＩ）は、現在、世界中の病院において大きな問題である。前記細菌は、院内の抗生物質関連疾病を引き起こし、これは軽度の自己限定的な下痢から生命を危うくする可能性のある重度の大腸炎までいくつかの形態で現れる。高齢の患者は、これらの生命を危うくする可能性のある疾病のリスクが最も高く、そしてＣＤＩの事件は過去１０年間において劇的に増加した。２００７年に英国においてＣＤＩの症例は５０，０００を超え、関連死は８，０００を超えた。ＣＤＩにかかる国民健康保険の費用は１年につき５億ポンドを超える。
【０００３】
Ｃ．ディフィシルの種々の株は、多くの方法によって分類され得る。最も一般的に使用されるものの１つはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）リボタイピングであり、ＰＣＲを使用してＣ．ディフィシルの１６Ｓ〜２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子間スペーサー領域を増幅する。これに由来する反応産物は、単離株の細菌リボタイプを同定する特徴的なバンドパターンを与える。毒素タイピングは別のタイピング法であり、Ｃ．ディフィシル毒素をコードするＤＮＡに由来する制限酵素パターンを使用して株の毒素タイプを同定する。異なる株の毒素遺伝子間で観察される制限酵素パターンの差異もまた、Ｃ．ディフィシル毒素ファミリー内の配列変異を示す。毒素Ｂはいくつかの領域において配列変異を示す。例えば、毒素タイプ０の毒素ＢのＣ末端６０ｋＤａ領域には、毒素タイプＩＩＩの同じ領域と比較して、約１３％の配列差異が存在する。このような配列差異は比較的小さいが、それらは分子の抗原性特性に関しては極めて重要であり得、そして抗体の結合に対して、従って、抗体による毒素中和特性に対して顕著な影響を及ぼし得る。
【０００４】
Ｃ．ディフィシル株は、多種多様な病原性因子を産生し、その中でも顕著なのは、いくつかのタンパク質毒素、すなわち、毒素Ａ、毒素Ｂ、およびいくつかの株においては、Clostridium perfringensイオタ毒素に類似している二元毒素である。毒素Ａは、感染の病態において役割を果たす巨大タンパク質の細胞毒／エンテロトキシンであり、そして腸内コロニー形成過程において影響を及ぼし得る。ＣＤＩの大流行は、毒素Ａ陰性／毒素Ｂ陽性株によると報告されており、このことは、毒素Ｂもまた疾病の病態において重要な役割を果たし得ることを示唆する。毒素ＡおよびＢの両方が、多段階の機序を介してその作用機序を発揮し、これは、細胞表面上のレセプターへの結合、内部移行、その後の転位そして細胞のサイトゾルへのエフェクタードメインの放出、並びに最後には細胞内作用を含む。毒素ＡおよびＢの両方について、これはＲｈｏファミリーの低分子量ＧＴＰａｓｅファミリーの不活性化を含む。この不活性化のために、各々の毒素は、Ｒｈｏタンパク質のアミノ残基上へのグルコース部分（ＵＤＰ−グルコースからの）の転移を触媒する。毒素ＡおよびＢの両方がまた、システインプロテアーゼの形態で第２の酵素活性を含み、これは転位後のサイトゾルへのエフェクタードメインの放出において役割を果たすようである。Ｃ．ディフィシル二元毒素は、異なる様式で作用し、そのターゲットタンパク質上へのＮＡＤからのＡＤＰ−リボース部分の転移を含む機序によって細胞のアクチンを修飾する。
【０００５】
Ｃ．ディフィシル感染の処置は、現在、抗生物質に依拠し、その中でメトロニダゾールおよびバンコマイシンが第１選択の処置である。しかしながら、これらの抗生物質は全ての場合において有効ではなく、患者の２０〜３０％は疾病の再発に苦しむ。大きな関心を寄せられているものの中に英国におけるより病原性の高い株の出現があり、これは２００２年にカナダで初めて同定された。これらの株は、ＰＣＲリボタイプ０２７、毒素タイプＩＩＩに属するが、これは以前に観察されたよりも３倍高い直接的に起因し得る死亡率でＣＤＩを引き起こす。
【０００６】
それ故、新たな治療薬が特に緊急に必要とされる。なぜなら現在の抗生物質の効力が低下しているようであるからである。
【０００７】
従って、Ｃ．ディフィシル感染（ＣＤＩ）に特異的に対処することのできる新たな治療／治療薬が当技術分野において必要である。この必要性は本発明によって対処され、これは前記の問題の１つ以上を解決する。
【０００８】
より詳細には、本発明の第１の局面は、ＣＤＩの予防または処置において使用するためのヒツジ抗体を提供する。別の局面において、本発明は、ＣＤＩの予防または処置において使用するための、ヒツジ抗体を含む抗体組成物を提供する。１つの態様において、ヒツジ抗体はポリクローナル抗体である。
【０００９】
使用時に、本発明の抗体はＣ．ディフィシル毒素またはそのフラグメントに結合し、好ましくは前記毒素またはそのフラグメントの生物学的活性を中和する。従って、本発明の抗体は、ＣＤＩを予防または処置することができ、好ましくは患者における再発を予防することもできる。
【００１０】
本発明の抗体は、患者に対する低い免疫原性効果を有しつつ、Ｃ．ディフィシルの１つ以上の毒素の生物学的作用を阻害することができる点で、他の治療薬を上回る明瞭な利点を提供する。さらに、本発明の抗体を、高い力価で産生することができる。従って、ヒツジ抗体を容易に得ることができ、そして最小限の副作用でもってＣ．ディフィシルによって生じる病的作用に対して患者を保護および／またはすることができる。本発明の抗体はまた、ＣＤＩに対する受動免疫化のためのワクチンの開発にも使用され得る。
【００１１】
本発明の主要なターゲットは、Ｃ．ディフィシル毒素またはそのフラグメントである。本発明の抗体が結合および／または中和し得る適切なＣ．ディフィシル毒素は、ＣＤＩまたはその症状を引き起こすかまたはそれに関連した任意のＣ．ディフィシル毒素を含む。さらなる態様において、本発明の抗体は、以下：Ｃ．ディフィシル毒素Ａまたはそのフラグメント、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂまたはそのフラグメント、およびＣ．ディフィシル二元毒素またはそのフラグメントから選択されたＣ．ディフィシル毒素の少なくとも１つのタイプに結合および／または中和する。
【００１２】
従って、１つの態様において、本発明の抗体組成物は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和するヒツジ抗体を含む。別の態様において、本発明の抗体組成物は、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和するヒツジ抗体を含む。さらに別の態様において、本発明の抗体組成物は、Ｃ．ディフィシル二元毒素（またはそのフラグメント）に結合および／または中和するヒツジ抗体を含む。
【００１３】
別の態様において、本発明の抗体組成物は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（またはそのフラグメント）およびＣ．ディフィシル毒素Ｂ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和するヒツジ抗体を含む。別の態様において、本発明の抗体組成物は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（またはそのフラグメント）およびＣ．ディフィシル二元毒素（またはそのフラグメント）に結合および／または中和するヒツジ抗体を含む。さらに別の態様において、本発明の抗体組成物は、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ（またはそのフラグメント）およびＣ．ディフィシル二元毒素（またはそのフラグメント）に結合および／または中和するヒツジ抗体を含む。
【００１４】
本発明の抗体組成物はまた、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（またはそのフラグメント）、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ（またはそのフラグメント）およびＣ．ディフィシル二元毒素（またはそのフラグメント）に結合および／または中和するヒツジ抗体も含み得る。
【００１５】
１つの態様において、抗体組成物は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和する第１抗体、並びにＣ．ディフィシル毒素Ｂ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和する抗体あるいはＣ．ディフィシル二元毒素（またはそのフラグメント）に結合および／または中和する抗体から選択された第２抗体を含む。この態様において、第２抗体はＣ．ディフィシル毒素Ｂ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和し得、そして前記組成物は場合により、Ｃ．ディフィシル二元毒素（またはそのフラグメント）に結合および／または中和する第３抗体を含む。
【００１６】
別の態様において、抗体組成物は、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和する第１抗体、並びにＣ．ディフィシル毒素Ａ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和する抗体あるいはＣ．ディフィシル二元毒素（またはそのフラグメント）に結合および／または中和する抗体から選択された第２抗体を含む。この態様において、第２抗体は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和し得、そして前記組成物は場合により、Ｃ．ディフィシル二元毒素（またはそのフラグメント）に結合および／または中和する第３抗体を含む。
【００１７】
別の態様において、抗体組成物は、Ｃ．ディフィシル二元毒素（またはそのフラグメント）に結合および／または中和する第１抗体、並びにＣ．ディフィシル毒素Ａ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和する抗体あるいはＣ．ディフィシル毒素Ｂ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和する抗体から選択された第２抗体を含む。この態様において、第２抗体は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和し得、そして前記組成物は場合により、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和する第３抗体を含む。あるいは、第２抗体は、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和し得、そして前記組成物は場合により、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（またはそのフラグメント）に結合および／または中和する第３抗体を含む。
【００１８】
本発明の抗体は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（またはそのフラグメント）またはＣ．ディフィシル毒素Ｂ（またはそのフラグメント）またはＣ．ディフィシル二元毒素（またはそのフラグメント）の１つに（特異的に）結合および／または中和し得る。あるいは、本発明の抗体は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（またはそのフラグメント）またはＣ．ディフィシル毒素Ｂ（またはそのフラグメント）またはＣ．ディフィシル二元毒素（またはそのフラグメント）の２つ以上に結合し得る。抗体が２つ以上の毒素タイプに結合および／または中和する場合、前記抗体は、好ましくは、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ（またはそのフラグメント）と、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（またはそのフラグメント）および／またはＣ．ディフィシル二元毒素（またはそのフラグメント）の一方もしくは両方に結合および／または中和する。
【００１９】
本発明の抗体は、毒素の特異的なエピトープと相互作用する。例えば、抗体は、Ｃ．ディフィシル毒素ＡのＮ末端ドメイン（例えばアミノ酸１〜９５７）または中間領域ドメイン（例えばアミノ酸９５８〜１８３１）またはＣ末端反復ドメイン（例えばアミノ酸１８３２〜２７１０）におけるエピトープと結合することができる。例えば、抗体は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａのアミノ酸１８３２〜２７１０内のエピトープに結合し得る。同様に、抗体は、毒素ＢのＮ末端ドメイン（例えばアミノ酸１〜９５５）または中間領域ドメイン（例えばアミノ酸９５６〜１８３１）またはＣ末端反復ドメイン（例えばアミノ酸１８３２〜２３６６）におけるエピトープと結合することができる。例えば、抗体は、毒素Ｂのアミノ酸１８３２〜２３６６内のエピトープに結合し得る。二元毒素の場合、抗体は、触媒ドメイン（フラグメントＡ）、またはフラグメントＢのＣ末端部分に存在するレセプター結合ドメイン；および／またはフラグメントＡとの結合およびフラグメントＡの細胞中への転位に関与するフラグメントＢのＮ末端半分（およそ残基１〜４００）に結合し得る。
【００２０】
１つの態様において、Ｃ．ディフィシル毒素は、毒素タイプ０からＸＶまでの１つから選択される。好ましい毒素タイプ（それに加えてリボタイプおよび株）を、すぐ下の表１に列挙する。列挙された毒素タイプは純粋に例示的なものであり、そして本発明を限定するものではない。
【００２１】
【表１】
【００２２】
本発明の種々の抗体が、Ｃ．ディフィシル毒素の同じまたは異なる株に結合および／または中和し得る。例えば、抗体は、以下：Ｃ．ディフィシル毒素Ａ−毒素タイプ０；Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ−毒素タイプ０；Ｃ．ディフィシル毒素Ａ−毒素タイプＩＩＩ；Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ−毒素タイプＩＩＩ；Ｃ．ディフィシル毒素Ａ−毒素タイプＶ；および／またはＣ．ディフィシル毒素Ｂ−毒素タイプＶの１つ以上に結合および／または中和し得る。好ましくは、これらの全ての毒素タイプの毒素ＡおよびＢに結合および／または中和する、抗体の混合物が使用される。本発明の抗体は、前記のＣ．ディフィシル毒素Ａおよび／またはＣ．ディフィシル毒素Ｂの株のＮ末端ドメイン、中間領域ドメインおよび／またはＣ末端反復ドメインにおけるエピトープと結合し得る。
【００２３】
特定の態様において、本発明の抗体は、配列番号１〜６またはそのフラグメントに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上同一なアミノ酸配列を含む、少なくとも１つのＣ．ディフィシル毒素に結合および／または中和し得る。
【００２４】
本発明はまた、ＣＤＩの予防または処置のための対応する方法を包含し、前記方法は、本発明の抗体組成物を患者に投与することを含む。患者は、Ｃ．ディフィシルに感染し得るか、あるいはＣ．ディフィシルの症状（例えば、軽度の自己限定的な下痢、腹痛、発熱および食欲不振から、偽膜性大腸炎および細胞中毒性巨大結腸症などの生命を危うくする容態まで）を有し得るか、あるいはＣ．ディフィシル感染への素因を有し得る（例えば抗生物質の処置を受けている、Ｃ．ディフィシルに罹患したことがあり再発のリスクがある、またはＣ．ディフィシル感染に関連した臨床症状を示す第２の個体にさらされたことがある）。本発明は、そのため、ＣＤＩを予防または処置するための効果的な手段を提供する。
【００２５】
１つの態様において、前記のＣＤＩ処置法は、Ｃ．ディフィシルに感染するかまたはＣＤＩの症状を患う患者に、本発明の抗体組成物を投与することを含む。これは、治療有効量の抗体を使用して達成することができる。このような投与は、長期間におよぶ、本発明の抗体組成物の反復投与によって行ない得る。前記組成物の抗体成分は同じでもまたは異なっていてもよく（その毒素タイプ特異性および／またはＣ．ディフィシル毒素上のターゲティングする結合領域もしくはエピトープに関して）、そして投与は同時でもまたは連続的でもよく、そして任意の順序で行なうことができる。
【００２６】
別の態様において、前記のＣＤＩ予防法は、患者に本発明の抗体組成物を投与して、ＣＤＩに対する受動免疫を与えることを含む。これは、ＣＤＩの発症前またはＣＤＩの非常に早期の段階で予防有効量の抗体を使用して達成することができる。このような投与は、長期間におよぶ、本発明の抗体組成物の反復投与によって行ない得る。前記組成物の抗体成分は同じでもまたは異なっていてもよく（その毒素タイプ特異性および／またはＣ．ディフィシル毒素上のターゲティングする結合領域もしくはエピトープに関して）、そして投与は同時でもまたは連続的でもよく、そして任意の順序で行なうことができる。
【００２７】
抗体調製
ヒツジ抗体は、ヒツジにおいて生じた抗体である。従って、本発明は、本発明の抗体組成物において使用するためのヒツジ抗体の産生法を含み、前記方法は、一般に、（ｉ）Ｃ．ディフィシル毒素またはそのフラグメントを含む免疫原をヒツジに投与する工程、（ｉｉ）ヒツジにおける抗体の生成のために十分な時間をかける工程、そして（ｉｉｉ）ヒツジから抗体を得る工程を含む。本明細書において使用したヒツジは、Ovis属（例えば、Ovis ammon, Ovis orientalis aries, Ovis orientalis orientalis, Ovis orientalis vignei, Ovis Canadensis, Ovis dalli, Ovis nivicola）内に該当する任意の種を含む。
【００２８】
本発明はまた、本発明の抗体組成物において使用するためのヒツジ抗体の産生法を含み、ヒツジ抗体は、Ｃ．ディフィシル毒素またはそのフラグメント（好ましくは、完全長の天然毒素と抗原性の交差反応性を有するおよび／または完全長の天然毒素の毒素活性または毒素様活性を保持するフラグメント）を含む免疫原に応答してヒツジによって誘起される。
【００２９】
抗体は、ヒツジの血清から得ることができる。従って、手順は、Ｃ．ディフィシル毒素に結合および中和することのできる抗体を含むヒツジ抗血清を生じさせる。さらなる態様において、抗体は単離および／または精製される。従って、本発明の別の局面は、ヒツジ抗血清からの抗体の精製を含む。
【００３０】
１つの態様において、本発明の抗体を生成するために使用される免疫原はＣ．ディフィシル毒素またはそのフラグメントであり、これは場合により精製されている。適切なＣ．ディフィシル毒素は、ＣＤＩまたはその症状を引き起こすかそれに関連した任意のＣ．ディフィシル毒素を含む。さらなる態様において、毒素は、以下の毒素：Ｃ．ディフィシル毒素Ａまたはそのフラグメント、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂまたはそのフラグメント、およびＣ．ディフィシル二元毒素またはそのフラグメント、の少なくとも１つから選択される。Ｃ．ディフィシル毒素はまた、本明細書において前記したような毒素タイプ０からＸＶの１つから選択された毒素であり得る。
【００３１】
精製されたＣ．ディフィシル毒素の産生を実施例において例示する。特定の態様において、免疫原はＣ．ディフィシル毒素変異体である。別の態様において、免疫原は、配列番号１〜６またはそのフラグメントに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上同一なアミノ酸配列を含む。
【００３２】
本発明の抗体を生成するために使用される免疫原はまた、部分的または完全に不活性化され得、すなわち、低下した毒性を有する。改変の例は、化学的処理（例えばＵＤＰ−ジアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、過酸化物または酸素を用いての処理）および組換え法（例えば毒素における欠失または突然変異）を含む。例えば、免疫原は、ホルムアルデヒドを用いての処理によって天然の毒素から誘導されたＣ．ディフィシルトキソイドまたはそのフラグメントであり得る。あるいは、組換えトキソイドは、部位特異的突然変異誘発によって活性部位モチーフを選択的に不活性化することによって生成され得る。毒素ＡおよびＢの毒性作用を低下または除去する部位特異的突然変異誘発の一例は、毒素のＮ末端ドメインにおけるＤＸＤモチーフの改変である。アスパラギン酸および／または他の残基を例えばアラニンに突然変異させて、毒素ＡおよびＢのいずれかの生物学的活性を減少させることができる。例えば、毒素Ａでは、以下のアミノ酸の１つ以上を突然変異させることができる：Ａｓｐ２６９、Ａｓｐ２８５、Ａｓｐ２８７、Ａｓｎ３８３、Ｔｒｐ５１９、Ｔｙｒ２８３、Ａｒｇ２７２。毒素Ｂでは、以下のアミノ酸の１つ以上を突然変異させることができる：Ａｓｐ２７０、Ａｓｐ２８６、Ａｓｐ２８８、Ａｓｎ３８４、Ｔｒｐ５２０、Ｔｙｒ２８４、Ａｒｇ２７３。
【００３３】
抗原をアジュバントと共に製剤化し得る。適切なアジュバントは、ヒトにおいて広範に使用されるミョウバン（リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）、並びに他のアジュバント、例えばサポニンおよびその精製成分のQuil A、フロイント完全アジュバント、ＲＩＢＢＩアジュバント、並びに研究および獣医学的な適用に使用される他のアジュバントを含み得る。
【００３４】
Ｃ．ディフィシル毒素またはトキソイドを免疫原として、別々にまたは組み合わせて、同時にまたは連続的にのいずれかで使用して、個々のＣ．ディフィシル毒素または組合せに特異的な抗体を産生し得る。例えば、２つ以上の毒素またはトキソイドを一緒に混合し、そして単一の免疫原として使用し得る。あるいは、Ｃ．ディフィシル毒素（例えばＣ．ディフィシル毒素Ａ）を別々に第１の免疫原として第１のヒツジまたはヤギに使用し得、そして別のＣ．ディフィシル毒素（例えばＣ．ディフィシル毒素Ｂ）を別々に第２のヒツジまたはヤギに使用し得る。別々の免疫化によって産生された抗体を合わせて、Ｃ．ディフィシル毒素に対して向けられる抗体組成物を得ることができる。
【００３５】
前記方法は、皮下、筋肉内、腹腔内および静脈内を含む、全ての免疫化形態を含む。本発明はまた、多種多様な免疫化計画を考える。１つの態様において、ヒツジまたはヤギは毒素（群）を０日目に投与され、そして続いてその後は間隔をおいて毒素（群）を受ける。必要とされる間隔の範囲および投与量の範囲は、免疫原の正にその性質、投与経路、製剤の性質、および担当者の判断に依存する。これらの投与量レベルの変更を、最適化のための標準的で経験的な慣行を使用して調整することができる。同様に、本発明は、抗体を回収するための任意の特定の計画に限定されるものではない。好ましい回収時間は、５６日目以後のいつかである。特異的抗体のレベル、すなわち免疫原に結合する抗体のレベルは、血清１リットルあたり少なくとも３ｇを示す。
【００３６】
本発明の抗体は、必要に応じて回収後に改変され得、よって特定の場合においては、本発明の抗体は、それらが投与された患者において、より免疫原性が低い。例えば、患者がヒトである場合、抗体は、当技術分野において周知の方法によって非種特異化され得る。抗体をどのようにより免疫原性を低くし得るかに関する一例は、（Ｆａｂ）２フラグメントの調製である。本発明の抗体を使用して、このような抗体フラグメントを産生し得、このために種々の技術が開発されている。例えば、フラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解的消化によって誘導され得る。その産生のための他の技術は当業者には明らかであろう。
【００３７】
抗体送達
使用時に、本発明は、非経口投与に、通常は静脈内投与に適した形態で、本発明の抗体組成物を含む薬学的組成物を使用する。精製されたインタクトな抗体またはそのフラグメントは、このような送達のために製剤化される。例えば、抗体またはそのフラグメントは、５〜５０または１５〜５０または２５〜５０ｇ/リットルの濃度で、緩衝液中で製剤化され得る。適切な緩衝液の成分の例としては、生理的塩、例えばクエン酸ナトリウムおよび／またはクエン酸が挙げられる。好ましい緩衝液は、１００〜２００または１２５〜１７５または約１５０（例えば１５３）mMの生理的塩、例えば塩化ナトリウムを含む。好ましい緩衝液は、患者の生理的ｐＨに近いｐＨで、例えば５．５〜６．４のｐＨ、または５．６〜６．３のｐＨ、または５．７〜６．２のｐＨ、または５．８〜６．２のｐＨで薬学的組成物を維持する。本発明の抗体含有組成物は、好ましくは、アジュバント（群）を排除する。なぜなら、患者において前記抗体に対する免疫応答を刺激することは望ましくないからである。
【００３８】
本発明の抗体は、筋肉内、皮下または静脈内送達のために製剤化され得るがそれらに限定されない。筋肉内、皮下または静脈内注入に適した組成物は、無菌水性液剤を含む。このような水性液剤は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤を、最初に、十分な食塩水またはグルコースを用いて等張とすべきである。本発明の抗体組成物は経口製剤ではなく、そしてこの投与形態は使用されない。これに関して、経口送達での重要な問題は、十分な抗体が、必要とされる場所である大腸に確実に到達することである。抗体が腸に到達することを妨害する因子としては、抗体分子を分解する、消化器分泌物中に存在するタンパク質分解酵素、並びにまた、いくつかの場合においては消化管の下方への液体の移動を妨げる麻痺性イレウスおよび他の合併症を引き起こし得るＣＤＩそれ自体の作用が挙げられる。
【００３９】
注入に適した組成物は、液剤、懸濁剤、または使用前に適切なビヒクル中に溶解もしくは懸濁する乾燥散剤の形態であり得る。
【００４０】
調製時に抗体またはそのフラグメントの溶液をビヒクルに溶かすことができ、溶液は必要であれば塩化ナトリウムの添加によって等張性とし、そして無菌技術を使用して滅菌フィルターを通したろ過によって滅菌し、その後、適切な滅菌バイアルまたはアンプルに充填し、そして封をする。有利には、緩衝剤、可溶化剤、安定化剤、保存剤または殺菌剤または懸濁化剤および／または局所麻酔剤などの添加剤をビヒクル中に溶解してもよい。
【００４１】
使用前に適切なビヒクル中に溶解または懸濁した乾燥散剤は、滅菌区域で無菌技術を使用して滅菌容器中に予め滅菌した成分を充填することによって調製され得る。あるいは、成分を、滅菌区域で無菌技術を使用して適切な容器中に溶解し得る。その後、産物を凍結乾燥し、そして容器を無菌的に封をする。
【００４２】
本発明の抗体の投与のための投与量範囲は、所望の治療効果をもたらすものである。必要とされる投与量の範囲は、抗体または組成物の正にその性質、投与経路、製剤の性質、患者の年齢、患者の容態の性質、程度または重度、禁忌（ある場合）、および担当医の判断に依存する。これらの投与量レベルの変更を、最適化のための標準的で経験的な慣行を使用して調整することができる。
【００４３】
適切な１日投与量は、体重１kgあたり５〜２０mgの範囲である。単位投与量は、１００mg未満から変動し得るが、しかし典型的には１用量あたり２５０〜２０００mgの領域にあり、これは１日１回またはより少ない頻度で（例えば１週間まで１日おきに）投与され得る。
【００４４】
ＣＤＩの予防または処置のための治療法において本発明の抗体を、互いに組み合わせて、またはＣＤＩの処置に通常使用される他の確立された療法の補助として、またはそれと併せて使用することも本発明の範囲内である。例えば、本発明の抗体は、適切な抗生物質（例えばメトロニダゾールおよび／またはバンコマイシン）と併せて投与され得る。
【００４５】
組合せ処置は、当業者によって必要であるまたは簡便であると思われる任意の方法で行われ得、そして本明細書の目的においては、組合せて使用しようとする化合物の順序、量、反復または相対量に関しての制限は全く考えない。
【００４６】
定義の章
クロストリジウム・ディフィシルは、クロストリジウム属のグラム陽性細菌の一種である。
【００４７】
クロストリジウム・ディフィシル感染（ＣＤＩ）はヒトおよび動物に罹患し、そして軽度の自己限定的な下痢から、偽膜性大腸炎および細胞中毒性巨大結腸症などの生命を危うくする容態までの範囲の症状をもたらす、細菌感染を意味する。この疾病においては、Ｃ．ディフィシルは正常な腸の細菌叢を交代させ、そして腸上皮を攻撃しそして傷害を及ぼす細胞毒を産生する。ヒトＣＤＩに対する主要なリスク因子としては、広域スペクトルの抗生物質を受けていること、６５歳を超えていること、および入院していることが挙げられる。
【００４８】
クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａは、約３００ｋＤａのサイズのタンパク質細胞毒／エンテロトキシンのファミリーである。毒素Ａは、Ｎ末端領域内に酵素活性を有し、これは哺乳動物細胞の細胞骨格を破壊して細胞死を引き起こすように作用する。クロストリジウム・ディフィシル株内には数多くの天然に存在する毒素Ａの変異体が存在し、これは「毒素タイプ」と呼ばれる。毒素Ａの種々の毒素タイプは、その一次配列内に、通常全体で１０％未満の変異を有する。適切な毒素Ａ配列の例としては配列番号１および３が挙げられる。
【００４９】
クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂは、約２７０ｋＤａのサイズのタンパク質細胞毒のファミリーであり、これは毒素Ａと類似しているが、有意により細胞毒性が高い。毒素Ａのように、毒素Ｂは、Ｎ末端領域内に酵素活性を有し、これが哺乳動物細胞の細胞骨格を破壊し、細胞死を引き起こすように作用する。Ｃ．ディフィシル株内には数多くの天然に存在する毒素Ｂの変異体が存在し、これは「毒素タイプ」と呼ばれる。毒素Ｂの種々の毒素タイプは、その一次配列内に、通常全体で１５％未満の変異を有する。適切な毒素Ａ配列の例としては、配列番号２および４が挙げられる。
【００５０】
二元毒素は、いくつかのしかし全てではないＣ．ディフィシル株によって産生される２成分の細胞毒である。二元毒素は、Clostridium botulinum C2およびClostridium perfringensイオタ毒素に作用が類似しており、これはＣ．ディフィシル二元毒素のように、約１００ｋＤａの細胞結合フラグメントおよび約５０ｋＤａの酵素的に活性な「エフェクター」フラグメントからなる。適切な二元毒素配列の例としては配列番号５および６が挙げられる。
【００５１】
本明細書において使用する「毒素」という用語は、前記の毒素フラグメントも包含する。前記フラグメントは、参照毒素の１０〜２７００（例えば、少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、７５０、１０００、１５００、２０００または２５００）の任意の数のアミノ酸の範囲であり得る。前記フラグメントは、好ましくは、問題の遺伝子産物の少なくとも１つのエピトープを含む。前記「フラグメント」はまた、それが由来する毒素と共通の抗原性交差反応性および／または実質的に同じin vivoにおける生物学的活性を有し得る。例えば、フラグメントに結合することのできる抗体は、それが由来する毒素にも結合することができるだろう。あるいは、前記フラグメントは、Ｃ．ディフィシル毒素の抗原性成分に以前にさらされたことがあるＴリンパ球の「想起応答」を誘導する共通した能力を共有し得る。
【００５２】
毒素という用語への言及は、その「変異体」、例えば、Ｃ．ディフィシル毒素に対して少なくとも８０または８５または９０または９５または９６または９７または９８または９９％のアミノ酸配列相同性を有するペプチドまたはペプチドフラグメントを包含する。さらなる態様において、「変異体」は、前記ペプチドまたはペプチドフラグメントの模倣体であり得、この模倣体は、ペプチドまたはペプチドフラグメントの少なくとも１つのエピトープを再現する。
【００５３】
毒素への言及は、毒素「トキソイド」を包含し、これは以下においてより詳細に考察する。
【００５４】
毒素タイプは、Ｃ．ディフィシル株を分類するために使用されることが多い。毒素タイプは、毒素遺伝子を用いて得られた制限酵素パターンを特徴付ける方法に基づく。前記したように、毒素ＡおよびＢの毒素タイプは、一次アミノ酸配列による、これらのタンパク質毒素の変異体を示す。
【００５５】
クロストリジウム・ディフィシルトキソイドは、部分的にまたは完全に不活性化されたＣ．ディフィシル毒素（毒素Ａ、毒素Ｂまたは二元毒素）またはＣ．ディフィシル毒素の混合物を説明するために使用される。毒素は、in vitroにおける細胞毒性アッセイによってまたは動物毒性によって測定したところ、非処理毒素よりも低い毒性（例えば１００％、９９％、９５％または９０％低い毒性）を有する場合に不活性化されていると考える。
【００５６】
対象の毒素に結合する抗体は、前記抗体が治療剤として有用であるような十分な親和性でその毒素に結合することのできるものである。対象の毒素に結合する抗体は、Ｃ．ディフィシルの毒素に少なくとも１０４Ｍの親和性（Ｋａ）で結合するものである。
【００５７】
毒素中和は、Ｃ．ディフィシルの１つ以上の細胞毒（毒素Ａおよび／または毒素Ｂおよび／または二元毒素）の生物学的作用を遮断する物質（例えば抗体）の作用を意味する。細胞毒の生物学的作用は、哺乳動物の腸上皮の特定の細胞において哺乳動物細胞を殺滅またはその機能を損なうその能力として定義される。物質の毒素中和活性は、培養液中で増殖した哺乳動物細胞の死滅を防ぐその能力によって測定され得る。
【００５８】
治療有効量は、ＣＤＩ、またはＣＤＩの臨床症状の少なくとも１つを処置するために患者に単独でまたは組み合わせて投与された場合に、疾病または症状のこのような処置を行なうに十分である、抗体の量を指す。治療有効量は、例えば、抗体、感染、および／または感染の症状、感染の重度、および／または感染の症状、処置しようとする患者の年齢、体重および／または健康、並びに処方医の判断に依存して変更され得る。任意の所与の場合における適切な治療有効量は、当業者によって確認され得るか、または慣用的な実験によって決定することができる。また、治療有効量は、抗体の任意の毒性作用または有害な作用よりも有益な作用がまさるものである。
【００５９】
「予防有効量」は、単独でまたは組み合わせて患者に投与した場合に、ＣＤＩの発症もしくは再発またはＣＤＩの臨床症状の少なくとも１つを阻害または遅延させる、抗体の任意の量である。いくつかの態様において、予防有効量は、クロストリジウム・ディフィシル感染の発症または再発を完全に予防する。発症を「阻害する」とは、感染の発症の可能性を低下させるか、または発症を完全に予防することのいずれかを意味する。
【００６０】
ヒツジは、Ovis属（例えばOvis ammon, Ovis orientalis aries, Ovis orientalis orientalis, Ovis orientalis vignei, Ovis Canadensis, Ovis dalli, Ovis nivicola）内に該当する任意の種を意味する。
【００６１】
ヤギは、Capra属（例えばCapra pyrenaicais, Capra ibex, Capra nubiana, Capra sibirica, Capra walie, Capra caucasica, Capra cylindricornis Capra aegagrus, Capra falconeri）内に該当する任意の種を意味する。
【００６２】
ヒツジ抗体は、ヒツジにおいて生じた抗体に対して少なくとも１００％、９９％、９５％、９０％、８０％、７５％、６０％、５０％、２５％または１０％のアミノ酸配列同一性を有する抗体である。
【００６３】
配列の比較のために、典型的には１つの配列が参照配列として作用し、これと試験配列を比較し得る。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピューターに入力し、必要であればその後の座標を指定し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。その後、配列比較アルゴリズムは、指定したプログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較した試験配列（群）についての配列同一率を計算する。
【００６４】
比較のための配列の最適なアラインメントを、例えば、Smith and Waterman [Adv. Appl. Math. 2: 484 (1981)]の局所相同性アラインメントアルゴリズムによって、Needleman & Wunsch [J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)]のアルゴリズムによって、Pearson & Lipman [Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)]の類似性の方法についての探索によって、これらのアルゴリズムのコンピューター実行によって（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Genetics Computer Groupの配列解析ソフトウェアパッケージ、University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705）、または目視検査によって[Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausbel et al, eds, Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, In. And John Wiley & Sons, Inc. (1995 Supplement) Ausbubelを参照]、実施し得る。
【００６５】
配列類似率を決定するのに適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである[Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215: pp. 403-410;および"http://www.ncbi.nlm.nih.gov/" of the National Center for Biotechnology Informationを参照]。
【００６６】
好ましい相同性比較において、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも２０アミノ酸、より好ましくは３０アミノ酸残基長である配列領域にわたって同一性が存在する。
【００６７】
「抗体」は最も広い意味で使用され、そしてそれらが所望の生物学的活性を示す限りポリクローナル抗体および抗体フラグメントも特に網羅する。特に、抗体は、少なくとも１つまたは２つの重鎖（Ｈ）可変領域（本明細書においてはＶＨＣと略称する）、および少なくとも１つまたは２つの軽鎖（Ｌ）可変領域（本明細書においてはＶＬＣと略称する）を含むタンパク質である。ＶＨＣおよびＶＬＣ領域はさらに、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域の散在した、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変領域にさらに分類され得る。フレームワーク領域およびＣＤＲの程度は正確に定義されている（Kabat, E.A., et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991, およびChothia, C. et al, J. MoI. Biol. 196:901-917, 1987を参照、これは参照により本明細書に組み入れられる）。
【００６８】
好ましくは、各々のＶＨＣおよびＶＬＣは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、これはアミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で整列している：ＦＲＩ、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００６９】
抗体のＶＨＣ鎖またはＶＬＣ鎖はさらに、重鎖または軽鎖の定常領域の全部または一部をさらに含むことができる。１つの態様において、抗体は２つの重鎖免疫グロブリンと２つの軽鎖免疫グロブリンとの四量体であり、重鎖および軽鎖の免疫グロブリン鎖は、例えばジスルフィド結合によって内部接続されている。重鎖定常領域は、３つのドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、すなわちＣＬからなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、典型的には、宿主組織または因子（免疫系の種々の細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的な補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）を含む）への抗体の結合を媒介する。「抗体」という用語は、ＩｇＡ型、ＩｇＧ型、ＩｇＥ型、ＩｇＤ型、ＩｇＭ型（ならびにそのサブタイプ）のインタクトな免疫グロブリンを含み、免疫グロブリンの軽鎖は、κ型またはλ型であり得る。
【００７０】
本明細書において使用する抗体という用語はまた、Ｃ．ディフィシルの毒素（例えば毒素Ｂ）に結合する抗体の部分、例えば、１つ以上の免疫グロブリン鎖が全長ではないが毒素に結合する分子を指す。抗体という用語に包含される結合部分の例としては、（ｉ）ＶＬＣドメイン、ＶＨＣドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨＣドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｃフラグメント；（ｉｖ）抗体の単腕のＶＬＣドメインおよびＶＨＣドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨＣドメインからなるｄＡｂフラグメント(Ward et al, Nature 341:544-546, 1989)；および（ｖｉ）結合するために十分なフレームワークを有する単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば可変領域の抗原結合部分が挙げられる。軽鎖可変領域の抗原結合部分および重鎖可変領域の抗原結合部分、例えばＦｖフラグメントの２つのドメインである、ＶＬＣおよびＶＨＣを、組換え法を使用して、１つのタンパク質鎖として作製することを可能とする合成リンカーによって接続することができ、ＶＬＣ領域とＶＨＣ領域は対を形成して一価の分子を形成する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Bird et al. (1988) Science lAl-ATi-Alβ;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. ScL USA 85:5879-5883参照）。このような単鎖抗体もまた抗体という用語に包含される。これらは、当業者に公知の慣用的な技術を使用して得られ、そして前記部分を、インタクトな抗体と同じように有用性についてスクリーニングする。
【００７１】
これから図面の簡単な説明を以下に示し、これは本発明の局面および／または態様を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】アフィニティクロマトグラフィーによる血清中における毒素Ａに対する抗体の測定。その後に溶出された、セファロースゲルに固定された毒素Ａに結合している抗体。図は、ローディングされた血清と溶出された毒素Ａ特異的抗体との間の直線関係を示す。実験の詳細を実施例９において提供する。
【図２】アフィニティクロマトグラフィーによる血清中における毒素Ａに対する抗体の測定。その後に溶出された、セファロースゲルに固定された毒素Ａに結合している抗体。図は、毒素Ａのトキソイドを用いて免疫化されたヒツジにおける特異的抗体を実証する。毒素Ａに対する抗体は、ヒツジ血清中に３mg/ml（３ｇ/リットル）超で存在していた。実験の詳細を実施例９において提供する。
【図３】ヒツジ抗クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢの混合物を用いての受動免疫化による、ＣＤＩからの防御。シリアンハムスター（１０匹の群）に、指定した時間に、１０mg/用量（▼）、２mg/用量（■）の毒素ＡおよびＢに対するヒツジ抗体、または非特異的対照抗体（●）のいずれかを用いて受動免疫化（腹腔内）した。−２日目および０日目にクリンダマイシンを受けた動物に、Ｃ．ディフィシル胞子（２×１０２コロニー形成単位）を用いてチャレンジした。生存率、チャレンジ後の日数をプロットによって示す。
【図４】ヒツジ抗クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡまたはＢを用いての受動免疫化による、ＣＤＩからの防御。シリアンハムスター（１０匹の群）に、指定した時間に、１０mg/用量の毒素Ａ＋Ｂに対するヒツジ抗体（▼）、１０mg/用量の毒素Ａ抗体単独（△）、１０mg/用量の毒素Ｂ抗体単独（○）、または非特異的対照抗体（□）のいずれかを用いて受動免疫化（腹腔内）した。−２日目および０日目にクリンダマイシンを受けた動物に、Ｃ．ディフィシル胞子（２×１０２コロニー形成単位）を用いてチャレンジした。生存率、チャレンジ後の日数をプロットによって示す。
【図５】ヒツジ抗クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢの混合物を用いての受動免疫化による、「超病原性」クロストリジウム・ディフィシルのリボタイプ０２７（Ｒ２０２９１株、Stoke Mandeville）によって誘発されたＣＤＩからの防御。シリアンハムスター（１０匹の群）に、指定した時間に、１０mg/用量の毒素ＡおよびＢに対するヒツジ抗体（▼）または非特異的対照抗体（■）のいずれかを用いて受動免疫化（腹腔内）した。−３日目および０日目にクリンダマイシンを受けた動物に、Ｃ．ディフィシル胞子（１×１０３コロニー形成単位）を用いてチャレンジした。チャレンジ後の日数における疾病状態をプロットによって示す。
【図６】ヒツジ抗クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢの混合物を用いての受動免疫化による、「超病原性」クロストリジウム・ディフィシル（毒素タイプ５）のリボタイプ０７８によって誘発されたＣＤＩからの防御。シリアンハムスター（１０匹の群）に、指定した時間に、１０mg/用量の毒素ＡおよびＢに対するヒツジ抗体（▼）または非特異的対照抗体（●）のいずれかを用いて受動免疫化（腹腔内）した。−２日目および０日目にクリンダマイシンを受けた動物に、Ｃ．ディフィシル胞子（２×１０３コロニー形成単位）を用いてチャレンジした。チャレンジ後の日数における疾病状態をプロットによって示す。
【００７３】
実施例の要約
実施例１ Ｃ．ディフィシルの毒素タイプ０の毒素ＡおよびＢの精製。
実施例２ Ｃ．ディフィシルの他の毒素タイプの毒素ＡおよびＢの精製。
実施例３ 組換えＣ．ディフィシル毒素ＡおよびＢの精製。
実施例４ Ｃ．ディフィシル二元毒素の精製。
実施例５ Ｃ．ディフィシル毒素ＡおよびＢのトキソイドの調製。
実施例６ 抗血清の調製。
実施例７ 毒素タイプ０の毒素ＡおよびＢに対する抗血清の調製。
実施例８ in vitro細胞アッセイを使用した、毒素に対する抗血清の中和効力の評価。
実施例９ イムノアフィニティカラムを使用した血清中のＣ．ディフィシル毒素に対する特異的抗体の量の定量。
実施例１０ 抗体混合物の調製。
実施例１１ ＣＤＩを予防するためのヒツジ抗体のin vivoにおける効力の評価。
実施例１２ ＣＤＩを処置するためのヒツジ抗血清のin vivoにおける効力の評価。
実施例１３ 抗体製剤の臨床的使用。
実施例１４ ヒツジ抗クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢの抗体混合物を用いての受動免疫化による、ＣＤＩからの防御。
実施例１５ ヒツジ抗クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡもしくはＢ抗体を用いての、またはヒツジ抗クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢの抗体混合物を用いての受動免疫化による、ＣＤＩからの防御。
実施例１６ ヒツジ抗クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢの混合物を用いての受動免疫化による、「超病原性」クロストリジウム・ディフィシルのリボタイプ０２７（Ｒ２０２９１株、Stoke Mandeville）によって誘発されたＣＤＩからの防御。
実施例１７ ヒツジ抗クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢの混合物を用いての受動免疫化による、「超病原性」クロストリジウム・ディフィシル単離株のリボタイプ０７８によって誘発されたＣＤＩからの防御。
【００７４】
配列番号の要約
最初のＭｅｔアミノ酸残基または対応する開始コドンが、以下のいずれの配列番号において示されているが、前記残基／コドンは任意選択である。
１．クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ−毒素タイプ０のタンパク質配列
２．クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂ−毒素タイプ０のタンパク質配列
３．クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ−毒素タイプＩＩＩのタンパク質配列
４．クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂ−毒素タイプＩＩＩのタンパク質配列
５．クロストリジウム・ディフィシル二元毒素フラグメントＡのタンパク質配列
６．クロストリジウム・ディフィシル二元毒素フラグメントＢのタンパク質配列
【００７５】
実施例
実施例１ クロストリジウム・ディフィシルの毒素タイプ０の毒素ＡおよびＢの精製
毒素タイプ０の毒素ＡおよびＢを産生するＣ．ディフィシル株（例えばＶＰＩ １０４６３）を、記載(Roberts and Shone (2001) Toxicon 39: 325-333)のように透析サック培養液中で増殖させた。増殖後、細胞スラリーを透析サックから回収し、そしてその後、１００００×ｇで３０分間遠心分離にかけ、そして得られた上清の液体のｐＨをｐＨ７．５に調整し、そして硫酸アンモニウムに関して７０％飽和とさせた。毒素を含む沈降物を遠心分離によって回収し、その後、５０mMビストリスｐＨ６．５緩衝液中に再懸濁し、そして４℃の同じ緩衝液に対して透析した。透析後、毒素ＡおよびＢの粗溶液をＱセファロースクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製し、そして毒素を含むタンパク質ピークをＮａＣｌ勾配で溶出した。毒素Ａを含むピークを、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む５０mM Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）緩衝液に対して透析し、Ｚｎキレートカラム（Ｚｎセファロース）で精製した。毒素をローディングし、そしてカラムから汚染タンパク質を洗浄した後、精製した毒素Ａを、５０mM Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、２０mM ＥＤＴＡおよび０．１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液を用いて溶出した。精製した毒素Ａを、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０mM Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）緩衝液に対して透析し、そして使用するまで４℃で保存するかまたは凍結させた。最初のＱセファロースカラムからの毒素Ｂを含むピークを、高分解能のＭｏｎｏＱ陰イオン交換樹脂のカラムクロマトグラフィーによってさらに精製した。毒素を、５０mMビストリス（ｐＨ６．５）緩衝液中のカラムにローディングした後、精製した毒素Ｂを、ＮａＣｌ勾配を用いて溶出し、そして毒素を含む画分をプールした。精製した毒素Ｂを、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０mM Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）緩衝液に対して透析し、そして使用するまで４℃で保存するかまたは凍結させた。
【００７６】
実施例２ Ｃ．ディフィシルの他の毒素タイプの毒素ＡおよびＢの精製
公知の任意の毒素タイプを示す毒素ＡおよびＢを、実施例１に記載のように精製し得る。種々の毒素タイプの毒素ＡおよびＢを産生する公知のＣ．ディフィシル株を表１に示し、そして精製のために必要な株を選択することによって、必要とされる毒素タイプの毒素ＡおよびＢを精製し得る。あるいは、所望の毒素タイプの毒素を産生するＣ．ディフィシル株が得られるまで、Ｃ．ディフィシルを以前に記載（Rupnik et al. (1998) J. Clinical Microbiol. 36: 2240-2247; Rupnik et al. (2001) Microbiology 147: 439-447）のように毒素タイプ分類し得る。
【００７７】
毒素タイプＩＩＩの毒素ＡおよびＢを産生するために、Ｃ．ディフィシルＲ２０２９１株（またＮＣＴＣ１ ３３６６としても知られる）を、透析サック培養液中で記載（Roberts and Shone (2001) Toxicon 39: 325-333）のように増殖させ、そして毒素を実施例１に記載のように精製した。
【００７８】
実施例３ 組換えＣ．ディフィシル毒素ＡおよびＢの精製
Ｃ．ディフィシル毒素ＡおよびＢの例のアミノ酸配列を配列番号１〜４に示す。これらのペプチドをコードする遺伝子は、任意の所望の発現宿主（例えばE.coli、Pichia pastoris）のためのコドン偏位をもって商業的に作製され得る。ペプチドをこれらの遺伝子から標準的な分子生物学的方法（例えばSambrook et al. 1989, Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）を使用して発現させ、そして得られた可溶性の発現されたポリペプチドを、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびセラミックヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーの組合せによって精製する。タンパク質精製技術分野においては周知である他のクロマトグラフィー技術、例えばサイズ排除クロマトグラフィーおよび／またはアフィニティクロマトグラフィーも使用し得る。後者のために、組換えフラグメントは、pET vector Expression System Manual, 11th Edition published by Merck KGaA, Darmstadt, Germanyにおいて記載のようにアフィニティ精製タグ（例えばヒスチジン−６、ｓｔｒｅｐｔａｇ）と共に発現され得る。
【００７９】
配列が不明であるＣ．ディフィシルの毒素タイプから組換え毒素を産生するために、標準的な分子生物学的方法によってＤＮＡを最初に抽出し、そして毒素配列（群）を誘導することが必要である。一旦、配列が誘導されたら、組換え毒素を、前記のように合成遺伝子から発現させることができる。
【００８０】
実施例４ Ｃ．ディフィシル二元毒素の精製
Ｃ．ディフィシル二元毒素フラグメントＡおよびＢのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５および６に示す。これらのペプチドをコードする遺伝子は、任意の所望の発現宿主（例えばE.coli、Pichia pastoris）のためのコドン偏位をもって商業的に作製され得る。ペプチドをこれらの遺伝子から標準的な分子生物学的方法（例えばSambrook et al. 1989, Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）を使用して発現させ、そして得られた可溶性の発現されたペプチドを、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびセラミックヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーの組合せによって精製する。タンパク質精製技術分野においては周知である他のクロマトグラフィー技術、例えばサイズ排除クロマトグラフィーおよび／またはアフィニティクロマトグラフィーも使用し得る。あるいは、組換えフラグメントは、pET vector Expression System Manual, 11th Edition published by Merck KGaA, Darmstadt, Germanyにおいて記載のようにアフィニティ精製タグ（例えばヒスチジン−６、ｓｔｒｅｐｔａｇ）と共に発現され得る。
【００８１】
ペプチドが不溶性の形態で産生される場合、次いでそれらを市販されている発現ベクター（例えばｐＥＴ５２ｂ）を使用してヒスチジン−６精製タグと共に発現させ得、そしてLia et al.の概説およびその中に含まれる参考文献（Lia M et al (2004) Protein Expression & Purification 33, 1-10、これは参照により本明細書に組み入れられる）によって記載のようなオンカラムリフォールディングによってリフォールディングし得る。
【００８２】
実施例５ Ｃ．ディフィシル毒素ＡおよびＢのトキソイドの調製
０．２〜２mg/mlの濃度の精製されたＣ．ディフィシル毒素を、適切な緩衝液（例えば、１５０mM ＮａＣｌを含む１０mM Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４）に対して透析し、そしてその後、０．０５〜０．５％の最終濃度でホルムアルデヒドを加え、そして１〜２５日間３５℃でインキュベーションする。インキュベーション後、ホルムアルデヒドを透析によって除去する。ホルムアルデヒドを用いての処理のための条件は、ペプチドによって変動し得、そして最終条件は、防御効力の評価の結果に基づいて微調整し得る。
【００８３】
実施例６ 抗血清の調製
最適な体液性抗体応答を達成するために、抗血清の調製中には多くの因子を考慮する。これらは：
動物の繁殖、
アジュバントの選択、
免疫化部位の数および場所、
免疫原の量
投与の回数および投与間隔
を含む。
【００８４】
これらのパラメーターの最適化の結果として、血清１リットルあたり６ｇ超の特異的な抗体レベルを得ることが通例である。
【００８５】
ヒツジのために、１０〜５００μgのＣ．ディフィシル抗原を含む２mlの緩衝溶液を、２．６mlのフロイントアジュバントと混合する。完全形のアジュバントを一次免疫化のために使用し、そして不完全フロイントアジュバントをその後の全てのブーストのために使用する。安定なエマルションが確実に得られるように、アジュバントの混合を数分間かけて行なう。約４．２mlの抗原／アジュバント混合物を使用して、筋肉内注入によって各ヒツジを免疫化し、そして首および全ての上肢を含む６つの部位に広げる。これを２８日毎に繰り返す。血液試料を各免疫化の１４日後に採取する。一旦、適切な抗体レベルが達成されると、より多くの容量を滅菌バッグに採取する（体重１kgあたり１０ml）。バッグをゆっくりと回転させて凝血を加速させ、４５００×ｇで３０分間遠心分離にかけ、そして血清を無菌条件下で取り出し、そしてプールする。所望のＣ．ディフィシル抗原に対して低い力価を示したあらゆる動物を集団から除去する。
【００８６】
実施例７ 毒素タイプ０の毒素ＡおよびＢに対する抗血清の調製
毒素タイプ０の株（例えばＶＰＩ １０４６３）からの毒素ＡおよびＢを実施例１に記載のように調製した。あるいは、毒素ＡまたはＢを、Yang et al.（Yang G, Zhou B, Wang J, He X, Sun X, Nie W, Tzipori S, Feng H (2008) Expression of recombinant Clostridium difficile toxin A and B in Bacillus megaterium. BMC Microbiol. 8: 192）によって記載のような組換え法によって作製し得る。精製した毒素を、実施例５に記載のようにトキソイド化し得る。
【００８７】
トキソイドＡまたはＢを用いてのヒツジの免疫化のために、１０〜５００μgのＣ．ディフィシルトキソイドＡまたはＢのいずれかを含む２mlの緩衝溶液を、２．６mlのフロイントアジュバントと混合した。完全形のアジュバントを一次免疫化のために使用し、そして不完全フロイントアジュバントをその後の全てのブーストのために使用した。安定なエマルションが確実に得られるように、アジュバントの混合を数分間かけて行なう。混合後、約４．２mlの抗原／アジュバント混合物を使用して、筋肉内注入によって各ヒツジを免疫化し、そして首および全ての上肢を含む６つの部位に広げた。これを２８日毎に繰り返し、そして血清試料を各免疫化の１４日後に回収した。一旦、適切な抗体レベルが達成されると、より多くの産生試料を滅菌バッグに採取した（体重１kgあたり１０ml）。バッグをゆっくりと回転させて凝血を加速させ、４５００×ｇで３０分間遠心分離にかけ、そして血清を無菌条件下で取り出し、そしてプールした。毒素ＡまたはＢのいずれかに対して低い力価を示したあらゆる動物を集団から排除した。
【００８８】
実施例８ in vitroにおける細胞アッセイを使用した、毒素に対する抗血清の中和効力の評価
Ｃ．ディフィシル毒素に対する抗血清の毒素中和活性を、Ｖｅｒｏ細胞を使用して細胞毒性アッセイによって測定する。一定量の精製されたＣ．ディフィシル毒素ＡまたはＢのいずれかを、種々の希釈の抗体と混合し、３７℃で１時間インキュベーションし、そしてその後、２４ウェル組織培養プレート上で増殖しているＶｅｒｏ細胞に適用する。毒素ＡおよびＢの両方が細胞毒性活性を有し、その結果、２４〜７２時間の期間におよびＶｅｒｏ細胞の特徴的な円形化が起こる。中和抗体の存在下においてはこの活性は阻害され、そして抗体調製物の中和強度は、指定された量の毒素ＡまたはＢのいずれかの効果を中和するのに必要とされる希釈によって評価され得る。
【００８９】
Ｃ．ディフィシル毒素Ａに対するヒツジ抗体の中和活性を実証したデータを表２に示す。この実験においては、種々の希釈のヒツジ抗体を毒素Ａと５０ng/mlの最終濃度で混合し、そして３７℃で１時間インキュベーションし、そしてその後、前記のようにＶｅｒｏ細胞に適用し、そして３７℃でインキュベーションし、そして２４〜７２時間の期間かけてモニタリングした。毒素Ａの細胞毒性作用に対して細胞を防御する抗体希釈を計算した。表２は、１４週間の期間かけて免疫化したヒツジが、１６０００の中和力価を有していたことを示す（すなわち１／１６０００の希釈の血清が、細胞を、毒素Ａの細胞毒性作用から防御した）。
【００９０】
表２−ホルムアルデヒドで処理した毒素Ａに対して生じたヒツジ抗体の中和力価：
【００９１】
【表２】
【００９２】
表３−ホルムアルデヒドで処理した毒素Ｂに対して生じたヒツジ抗体の中和力価
これらのデータ（以下）は、Ｖｅｒｏ細胞の細胞毒性アッセイによって測定したところ、より高い免疫化用量のトキソイドＢ抗原が、より良好なヒツジ毒素中和免疫応答をもたらすことを示す。使用したアッセイを、すぐ上の実施例８において記載する。
【００９３】
【表３】
【００９４】
表４−等価な濃度の毒素タイプ０および毒素タイプＩＩＩの毒素Ｂに対する、ヒツジ抗毒素Ｂの中和力価
これらのデータ（以下）は、等価な量の毒素Ｂ（毒素タイプ０）および毒素Ｂ（毒素タイプＩＩＩ）を中和する、毒素Ｂ（毒素タイプ０）から誘導されたトキソイドＢに対して生じたヒツジ抗体の能力を比較する。毒素Ｂ（毒素タイプ０）および毒素Ｂ（毒素タイプＩＩＩ）をそれぞれＣ．ディフィシルＶＰＩ １０４６３株およびＲ２０２９１株から精製した。
【００９５】
細胞アッセイをすぐ上に実施例８において記載したように、等価な細胞毒性量の毒素Ｂの各タイプを使用して実施した。滴定を、１つの実験においては４単位（細胞死を誘導するのに必要とされる量の４倍）および別の実験においては１０単位で固定した毒素Ｂに対して行なった。
【００９６】
データは、毒素タイプ０の株から誘導されたトキソイドＢを使用して毒素Ｂに対して生じたヒツジ抗体が、毒素Ｂ（毒素タイプ０）および毒素Ｂ（毒素タイプＩＩＩ）を同じ効力で中和したことを示す。
【００９７】
【表４】
【００９８】
表５．等価な濃度の毒素タイプ０および毒素タイプＶの毒素Ｂに対するヒツジ抗毒素Ｂの中和力価
これらのデータは、等価な量の毒素Ｂ（毒素タイプ０）および毒素Ｂ（毒素タイプＶ）を中和する、毒素Ｂ（毒素タイプ０）から誘導されたトキソイドＢに対して生じたヒツジ抗体の能力を比較する。毒素Ｂ（毒素タイプ０）および毒素Ｂ（毒素タイプＶ）を、Ｃ．ディフィシルＶＰＩ １０４６３株およびＣ．ディフィシルリボタイプ０７８単離株からそれぞれ精製した。
【００９９】
細胞アッセイを、実施例８のように、等価な細胞毒性量の毒素Ｂの各タイプを使用して実施した。滴定を、１つの実験においては４単位（細胞死を誘導するのに必要とされる量の４倍）および別の実験においては１０単位で固定した毒素Ｂに対して行なった。
【０１００】
データは、毒素タイプ０の株から誘導されたトキソイドＢを使用して、毒素Ｂに対して生じたヒツジ抗体が、毒素Ｂ（毒素タイプ０）およびまた毒素Ｂ（毒素タイプＩＩＩ）を２倍低下した効力で中和したことを示す。
【０１０１】
【表５】
【０１０２】
実施例９ イムノアフィニティカラムを使用した、血清中のＣ．ディフィシル毒素に対する特異的抗体の量の定量
カラム調製
必要量のＣＮＢｒ活性化セファロース４ファストフロー（０．５ｇ乾燥重量）を適切な清潔な容器（ガラスまたはプラスチック）に評量する。約１０mlの希塩酸（１mM）を加えてゲルを膨潤させ、そして２０〜３０分後、ゲルを１０mLのガラスカラムに移し、そしてさらなる２０mLのＨＣｌ（１mM）で洗浄し、その後、２０mLのカップリング緩衝液（５００mMの塩化ナトリウムを含む重炭酸ナトリウム、１００mM、ｐＨ８．３）で洗浄する。１mg/mLの濃度の毒素（毒素Ａ、毒素Ｂまたは二元毒素フラグメント溶液（１mL））をカップリング緩衝液を用いて５mLに希釈し、そして活性化ゲルを含むカラムに加え、そしてゲルが再懸濁されるまで内容物を穏やかに混合し、そして室温で一晩（１６〜１８時間）回転させる。その後、カラムを流し、そして５mlの遮断試薬（エタノールアミン溶液、１Ｍ）を加え、穏やかに混合し、そして室温で２時間回転させる。次に、カラムを２０mLのカップリング緩衝液で洗浄し、その後、２０mLの溶出緩衝液（グリシン溶液、１００mM、ｐＨ２．５）で洗浄する。この工程を２回繰り返す。カラムを最後に２０mLのアッセイ緩衝液（５００mM塩化ナトリウムおよび最終濃度１ｇ/Ｌのアジ化ナトリウムを含む、リン酸ナトリウム緩衝液、１０mM、ｐＨ７．４）で洗浄し、そして使用するまで２〜８℃で３〜５mLのアッセイ緩衝液中に保存する。
【０１０３】
カラム評価
カラムの特異的結合容量および非特異的な容量を使用前に評価しなければならない。カラムを冷蔵庫から取り出し、そして室温で平衡化させ、そしてその後、２５mLのアッセイ緩衝液で洗浄する。漸増容量の産物（全抗血清、精製ＩｇＧ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）を個々にカラムにローディングし、そして室温で１時間穏やかに回転させて混合する。非結合画分を２５mLのアッセイ緩衝液で洗浄除去し、そしてその後、結合した画分をカラムから２０mlの溶出緩衝液（グリシン緩衝液１００mM、ｐＨ２．５）を用いて溶出する。溶出画分のタンパク質含量を、産物に関連した吸光係数、すなわちヒツジＩｇＧについては１．５（Curd et al., 1971）またはヒツジＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２については１．４（Allen, 1996）を使用して２８０nmにおける分光測定で決定する。ローディングされた容量に対して溶出タンパク質の量をプロットすることによって飽和曲線を得る。
【０１０４】
非特異的結合（ＮＳＢ）を免疫化前の通常のヒツジ血清（ＮＳＳ）を使用して評価する。従って、これと、正常の血清中のいくつかの特異的な抗体に起因する結合とを区別する必要がある（全ての動物がＣ．ディフィシルにさらされたことがあろうため）。図１は、抗血清ローディング容量の増加の結果としての、特異的な結合の増加を示す、典型的な結合能曲線を実証する。ローディング容量の増加により非特異的結合（ＮＳＢ）に僅かな変化がある。１mgの毒素（カップリング比は２mg/g）を含む０．５ｇ（１．５〜２．０mLの膨潤したゲル）は、ローディングする特異的な抗血清の容量（０．５〜４mL）に対して十分である。しかしながら、１mlが、容易かつ簡便な計算のために推奨されるローディング容量である。
【０１０５】
１０個のレプリケートの変動係数（アッセイ間変動ＣＶ）は、約６％である。時間に伴う（８０〜１００回使用した場合と推定）カラム容量の減少は全くない。このことは、カラムからの毒素の浸出が全くないことを示す。
【０１０６】
産物の評価のためのアフィニティカラム
カラムを、製造工程および最終産物、すなわち全抗血清、精製ＩｇＧ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２のＧＭＰ／ＧＬＰの評価のために使用する。それはまた、免疫化動物の免疫応答を評価およびモニタリングするため、並びにヒト試料中の抗毒素抗体を検出するために使用される。
【０１０７】
カラムを冷蔵庫から取り出し、そして室温で平衡化させ、２５mLのアッセイ緩衝液で洗浄する。産物（１mL）をカラムに加え、そして室温で１時間穏やかに回転させて混合し、その後、非結合画分を２５mLのアッセイ緩衝液（５００mM塩化ナトリウムおよび最終濃度１ｇ/Ｌのアジ化ナトリウムを含む、リン酸ナトリウム緩衝液、１０mM、ｐＨ７．４）で洗浄除去する。その後、結合画分を２０mlの溶出緩衝液（グリシン緩衝液１００mM、ｐＨ２．５）で溶出し、そしてそのタンパク質含量を、産物に関連した吸光係数を使用して２８０nmにおける分光測定で決定する。図２は、毒素Ａのトキソイドを用いて免疫化したヒツジに由来する血清の分析を示す。
【０１０８】
実施例１０ 抗体混合物の調製
毒素ＡおよびＢおよびその種々のアイソフォーム（毒素タイプ）に対する必要とされる中和活性が最終混合物に存在するように、抗体をブレンドして最終産物を形成する。
【０１０９】
種々のＣ．ディフィシル毒素タイプに対して調製された抗体をブレンドして、実施例１０において評価したように類似した交差防御的効力を与え得る。例えば、毒素タイプ０およびＩＩＩから誘導されたＣ．ディフィシル毒素Ｂに対する類似した交差防御を与えるために、抗体を種々の比率（例えば１：１、２：１、１：２の比）で混合して、毒素Ｂの各毒素タイプに対する類似した特異的な中和活性を与え得る。
【０１１０】
実施例１１ ＣＤＩを予防するためのヒツジ抗体のin vivoにおける効力の評価
in vivoにおけるＣＤＩに対する抗体の予防的、防止的効力を実証するために、シリアンハムスターを、Ｃ．ディフィシルの１つ以上の毒素に対して中和活性を有するヒツジ抗体を用いて受動免疫化する。予防効力を評価するために、ハムスターに、静脈内または腹腔内経路のいずれかで、Ｃ．ディフィシルによるチャレンジの９６時間前からチャレンジから２４０時間後までの種々の時点において抗体を投与する。
【０１１１】
受動免疫化されたハムスターに、広域スペクトル抗生物質（例えばクリンダマイシン）を投与し、そして１２〜７２時間後に経口によりＣ．ディフィシル胞子を用いてチャレンジする。その後、動物を１５日間までＣ．ディフィシルに関連した疾病の症状についてモニタリングする。対照、すなわち非免疫化動物は疾病の兆候（例えば下痢、膨張した腹部、傾眠、毛を逆立たせる）を発症するが、一方、ヒツジ抗体を用いて受動免疫化された動物は正常のようである。
【０１１２】
実施例１２ ＣＤＩを処置するためのヒツジ抗血清のin vivoにおける効力の評価
in vivoにおいてＣＤＩを処置するための抗血清の効力を実証するために、シリアンハムスターを、Ｃ．ディフィシルの１つ以上の毒素に対して中和活性を有するヒツジ抗体を用いて受動免疫化する。処置製剤の効力を評価するために、ハムスターに、静脈内または腹腔内経路のいずれかで、Ｃ．ディフィシルによるチャレンジの６時間前からチャレンジから２４０時間後までの種々の時点において抗体を投与する。
【０１１３】
受動免疫化の前に、ハムスターに広域スペクトル抗生物質（例えばクリンダマイシン）を投与し、そして１２〜７２時間後に経口によりＣ．ディフィシル胞子を用いてチャレンジする。その後、動物を１５日間までＣ．ディフィシルに関連した疾病の症状についてモニタリングする。対照、すなわち非免疫化動物は疾病の兆候（例えば下痢、膨張した腹部、傾眠、毛を逆立たせる）を発症するが、一方、ヒツジ抗体を用いて処置された動物は正常のようである。
【０１１４】
実施例１３ 抗体製剤の臨床使用
３つの実施例が、そのＣＤＩの重度が種々である患者における、全身性のヒツジ産物の治療価を説明するのに役立つ。
【０１１５】
軽度のＣＤＩ
６７歳の男性が、重度の心筋梗塞後に冠疾患集中治療室に入院した。無事に回復したが、回復時に、軽度の下痢を発症し、他の兆候または症状は全くなかった。病院において最近ＣＤＩのエピソードがあったので、糞便試料を直ちに試験のために送り、そして毒素Ａおよび毒素Ｂの両方を含んでいることが判明した。専属のトイレを有する個室に隔離された後、静脈内に２５０mgのヒツジＦ（ａｂ’）２を受け、その後、２日後に２回目の注射を受けた。下痢は迅速に止まり、そしてメトロニダゾールまたはバンコマイシンのいずれの必要もなく完全に回復した。
【０１１６】
再発のリスクを伴う重度ＣＤＩ
８１歳の女性が自宅で転倒し、そして左股関節の骨折を被った。直ちに入院し、股関節は成功裏に固定された。虚弱な容態は早期の退院の妨げ、数日後、湿性咳を発症し、そのために広域スペクトル抗生物質を投与された。さらに８日後、腹痛および圧痛を伴う重篤な下痢を発症し、そして適切な糞便検査によってＣＤＩと診断された。その時点で顕著に上昇した白血球数および脱水を伴うかなりの体液喪失という全身的な徴候のエビデンスもあった。患者は直ちに経口バンコマイシンを開始し、同時に、静脈内に２５０mgのヒツジＦ（ａｂ’）２に基づいた産物の１日１回の５回の注射の初回を受けた。ＣＤＩの兆候および症状、並びにＣＤＩの検査的な徴候は急速に回復した。しかしながら、バンコマイシンを止めた後のＣＤＩの再発のリスクを避けるために、さらに２週間、経口形の抗体療法の処置を続けた。全く再発しなかった。
【０１１７】
合併症を伴う重度ＣＤＩ
８７歳の女性が、長期滞在介護施設に住んでいる間に気管支肺炎を発症した。地元の一般開業医は、抗生物質療法のコースを開始し、直ちに利点が得られた。しかしながら、抗生物質を止めた８日後に、重度の下痢を発症した。容態は悪化し始め、病院への入院が必要となり、そこでＥＬＩＳＡ検査によって糞便中に毒素Ａが検出された。この時までに、循環不全のエビデンスを伴い極めて病気が重く、そして下痢は止まった。後者は、麻痺性イレウスおよび中毒性巨大結腸症の併発に起因するものと判明し、そして緊急の全結腸切除術が必須と考えられた。このような手術は６０％を超える死亡率を伴うので、２アンプル（５００mg）の含量の産物と一緒に静脈内への補充療法を受けた。４時間後に手術室へと運ばれた時までに、全身容態はかなり改善し、そして手術を切り抜けて生き延びた。
【０１１８】
実施例１４ 抗Ｃ．ディフィシル毒素ＡおよびＢの抗体混合物を用いての受動免疫化によるＣＤＩからの防御
シリアンハムスター（１０匹の群）に、指定した時間において、１０mg/用量（▼）、２mg/用量（■）の毒素ＡおよびＢに対するヒツジ抗体、または非特異的な対照抗体（●）のいずれかを用いて受動免疫化（腹腔内）した。−２日目および０日目にクリンダマイシンを受けた動物に、Ｃ．ディフィシル胞子（２×１０２コロニー形成単位）を用いてチャレンジした。生存率、チャレンジ後の日数をプロットによって示す。
【０１１９】
データ（図３参照）は明瞭に、毒素ＡおよびＢに対するヒツジ抗体の混合物を用いての受動免疫化が、ＣＤＩからの防御を与えることを示す。この実験において、高い抗体用量を与えられた動物の９０％がチャレンジから１２日後において無症候性であった。
【０１２０】
実施例１５ ヒツジ抗クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡまたはＢの抗体を用いての、またはヒツジ抗クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢの抗体混合物を用いての受動免疫化によるＣＤＩからの防御
シリアンハムスター（１０匹の群）に、指定した時間において、１０mg/用量の毒素Ａ＋Ｂに対するヒツジ抗体（▼）、１０mg/用量の毒素Ａ抗体のみ（△）、１０mg/用量の毒素Ｂ抗体のみ（○）、または非特異的な対照抗体（□）のいずれかを用いて受動免疫化（腹腔内）した。−２日目および０日目においてクリンダマイシンを受けた動物に、Ｃ．ディフィシル胞子（２×１０２コロニー形成単位）を用いてチャレンジした。生存率、チャレンジ後の日数をプロットによって示す。
【０１２１】
データ（図４参照）は、ＣＤＩに対する防御に関して、毒素Ａ＋Ｂの抗体の混合物の効力は、単独で投与されたいずれの抗体よりも有意に良好であることを示す。
【０１２２】
実施例１６ ヒツジ抗クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢの混合物を用いての受動免疫化による、「超病原性」クロストリジウム・ディフィシルのリボタイプ０２７（Ｒ２０２９１株、Stoke Mandeville）によって誘発されるＣＤＩからの防御
シリアンハムスター（１０匹の群）に、指定した時間において、１０mg/用量の毒素ＡおよびＢに対するヒツジ抗体（▼）または非特異的対照抗体（■）のいずれかを用いて受動免疫化（腹腔内）した。−３日目および０日目にクリンダマイシンを受けた動物にＣ．ディフィシル胞子（１×１０３コロニー形成単位）を用いてチャレンジした。チャレンジ後の日数における疾病状態をプロットによって示す。
【０１２３】
データ（図５参照）は明瞭に、毒素ＡおよびＢに対するヒツジ抗体の混合物を用いての受動免疫化が、「超病原性」Ｃ．ディフィシルの０２７（Ｒ２０２９１株、Stoke Mandeville）によって誘発されるＣＤＩからの防御を与えることを示す。この実験において、毒素Ａ／Ｂ抗体を投与された動物の９０％が、チャレンジ後の１８日目において無症候性であり、一方、非免疫化対照の８０％が重度なＣＤＩの症状を示した。
【０１２４】
実施例１７ ヒツジ抗クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢの混合物を用いての受動免疫化による、「超病原性」Ｃ．ディフィシル単離株のリボタイプ０７８によって誘発されるＣＤＩからの防御
シリアンハムスター（１０匹の群）に、指定した時間において、１０mg/用量の毒素ＡおよびＢに対するヒツジ抗体（▼）または非特異的対照抗体（●）のいずれかを用いて受動免疫化（腹腔内）した。−２日目および０日目にクリンダマイシンを受けた動物にＣ．ディフィシル胞子（２×１０３コロニー形成単位）を用いてチャレンジした。チャレンジ後の日数における疾病状態をプロットによって示す。
【０１２５】
データ（図６参照）は明瞭に、毒素ＡおよびＢに対するヒツジ抗体の混合物を用いての受動免疫化が、「超病原性」Ｃ．ディフィシルの０７８によって誘発されるＣＤＩからの防御を与えることを示す。この実験において、毒素Ａ／Ｂの抗体を投与された動物の１００％が、チャレンジ後の１８日目において無症候性であり、一方、非免疫化対照の８０％が重度なＣＤＩの症状を示した。
【０１２６】
配列番号
１．クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ−毒素タイプ０
【化１】
【０１２７】
２．Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ−毒素タイプ０のタンパク質配列
【化２】
【０１２８】
３．Ｃ．ディフィシル毒素Ａ−毒素タイプＩＩＩのタンパク質配列
【化３】
【０１２９】
４．Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ−毒素タイプＩＩＩのタンパク質配列
【化４】
【０１３０】
５．Ｃ．ディフィシル二元毒素フラグメントＡのタンパク質配列
【化５】
【０１３１】
６．Ｃ．ディフィシル二元毒素フラグメントＢのタンパク質配列
【化６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ．ディフィシル（C. difficile）の予防または処置において使用するためのヒツジ抗体を含む抗体組成物であって、前記抗体はＣ．ディフィシル毒素に結合する、前記抗体組成物。
【請求項２】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項１記載の抗体組成物。
【請求項３】
抗体が、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ、Ｃ．ディフィシル毒素ＢおよびＣ．ディフィシル二元毒素からなる群より選択される少なくとも１つのＣ．ディフィシル毒素に結合する、請求項１〜２のいずれか記載の抗体組成物。
【請求項４】
抗体がＣ．ディフィシル毒素ＡおよびＣ．ディフィシル毒素Ｂに結合する、請求項３記載の抗体組成物。
【請求項５】
抗体がＣ．ディフィシル毒素ＡおよびＣ．ディフィシル二元毒素に結合する、請求項３記載の抗体組成物。
【請求項６】
抗体がＣ．ディフィシル毒素ＢおよびＣ．ディフィシル二元毒素に結合する、請求項３記載の抗体組成物。
【請求項７】
Ｃ．ディフィシル毒素が、以下の群：毒素タイプ０、毒素タイプＩＩＩおよび毒素タイプＶから選択される毒素Ａである、請求項１〜５のいずれか記載の抗体組成物。
【請求項８】
Ｃ．ディフィシル毒素が、以下の群：毒素タイプ０、毒素タイプＩＩＩおよび毒素タイプＶから選択される毒素Ｂである、請求項１〜３、請求項４または請求項６のいずれか記載の抗体組成物。
【請求項９】
請求項１〜８記載の抗体組成物を、薬学的に許容される担体、賦形剤および／または塩から選択された少なくとも１つの成分と一緒に含む、非経口投与のための、薬学的組成物。
【請求項１０】
Ｃ．ディフィシル感染の予防または処置のための方法であって、前記方法は、請求項１〜８記載の抗体組成物または請求項９記載の薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１１】
請求項１〜８記載の抗体組成物において使用するための、または請求項９記載の薬学的組成物において使用するための、ヒツジ抗体を生産する方法であって、前記ヒツジ抗体は、Ｃ．ディフィシル毒素またはそのフラグメントを含む免疫原に応答してヒツジによって誘発される、前記方法。
【請求項１２】
請求項１〜７記載の抗体組成物において使用するための、または請求項８記載の薬学的組成物において使用するためのヒツジ抗体を生産する方法であって、前記方法は、（ｉ）Ｃ．ディフィシル毒素またはそのフラグメントを含む免疫原をヒツジに投与する工程、（ｉｉ）ヒツジにおける抗体の生成のために十分な時間をかける工程、そして（ｉｉｉ）ヒツジから抗体を得る工程を含む、前記方法。
【請求項１３】
免疫原がＣ．ディフィシルトキソイドである、請求項１１または請求項１２記載の方法。
【請求項１】
Ｃ．ディフィシル（C. difficile）の予防または処置において使用するためのヒツジ抗体を含む抗体組成物であって、前記抗体はＣ．ディフィシル毒素に結合する、前記抗体組成物。
【請求項２】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項１記載の抗体組成物。
【請求項３】
抗体が、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ、Ｃ．ディフィシル毒素ＢおよびＣ．ディフィシル二元毒素からなる群より選択される少なくとも１つのＣ．ディフィシル毒素に結合する、請求項１〜２のいずれか記載の抗体組成物。
【請求項４】
抗体がＣ．ディフィシル毒素ＡおよびＣ．ディフィシル毒素Ｂに結合する、請求項３記載の抗体組成物。
【請求項５】
抗体がＣ．ディフィシル毒素ＡおよびＣ．ディフィシル二元毒素に結合する、請求項３記載の抗体組成物。
【請求項６】
抗体がＣ．ディフィシル毒素ＢおよびＣ．ディフィシル二元毒素に結合する、請求項３記載の抗体組成物。
【請求項７】
Ｃ．ディフィシル毒素が、以下の群：毒素タイプ０、毒素タイプＩＩＩおよび毒素タイプＶから選択される毒素Ａである、請求項１〜５のいずれか記載の抗体組成物。
【請求項８】
Ｃ．ディフィシル毒素が、以下の群：毒素タイプ０、毒素タイプＩＩＩおよび毒素タイプＶから選択される毒素Ｂである、請求項１〜３、請求項４または請求項６のいずれか記載の抗体組成物。
【請求項９】
請求項１〜８記載の抗体組成物を、薬学的に許容される担体、賦形剤および／または塩から選択された少なくとも１つの成分と一緒に含む、非経口投与のための、薬学的組成物。
【請求項１０】
Ｃ．ディフィシル感染の予防または処置のための方法であって、前記方法は、請求項１〜８記載の抗体組成物または請求項９記載の薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１１】
請求項１〜８記載の抗体組成物において使用するための、または請求項９記載の薬学的組成物において使用するための、ヒツジ抗体を生産する方法であって、前記ヒツジ抗体は、Ｃ．ディフィシル毒素またはそのフラグメントを含む免疫原に応答してヒツジによって誘発される、前記方法。
【請求項１２】
請求項１〜７記載の抗体組成物において使用するための、または請求項８記載の薬学的組成物において使用するためのヒツジ抗体を生産する方法であって、前記方法は、（ｉ）Ｃ．ディフィシル毒素またはそのフラグメントを含む免疫原をヒツジに投与する工程、（ｉｉ）ヒツジにおける抗体の生成のために十分な時間をかける工程、そして（ｉｉｉ）ヒツジから抗体を得る工程を含む、前記方法。
【請求項１３】
免疫原がＣ．ディフィシルトキソイドである、請求項１１または請求項１２記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１２−５１８６２４（Ｐ２０１２−５１８６２４Ａ）
【公表日】平成２４年８月１６日（２０１２．８．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５５０６５２（Ｐ２０１１−５５０６５２）
【出願日】平成２２年２月１９日（２０１０．２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０５０２８８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９４９７０
【国際公開日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【出願人】（５０３１９１２１０）ヘルス プロテクション エージェンシー (19)
【出願人】（５１１２０３２２６）マイクロファーム・リミテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＭＩＣＲＯＰＨＡＲＭ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年８月１６日（２０１２．８．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１９日（２０１０．２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０５０２８８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９４９７０
【国際公開日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【出願人】（５０３１９１２１０）ヘルス プロテクション エージェンシー (19)
【出願人】（５１１２０３２２６）マイクロファーム・リミテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＭＩＣＲＯＰＨＡＲＭ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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