クロストリジウム属細菌を用いた水素及びブタノールの生産方法
【課題】クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の異なる性質を利用して、セルロースの糖化と水素及びブタノールの生産をクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌のみで実施することが可能な水素及びブタノール生産技術を提供する。
【解決手段】クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の混合培養によるセルロース基質からの水素及びブタノール生産方法であって、セルロース資化能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌によってセルロース基質を糖化する工程と、水素及びブタノール生産能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌によって水素及びブタノールを生産する工程と、を有する、水素及びブタノール生産方法により解決する。
【解決手段】クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の混合培養によるセルロース基質からの水素及びブタノール生産方法であって、セルロース資化能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌によってセルロース基質を糖化する工程と、水素及びブタノール生産能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌によって水素及びブタノールを生産する工程と、を有する、水素及びブタノール生産方法により解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロストリジウム属細菌を用いた水素及びブタノールの生産方法に関し、より具体的には、クロストリジウム属細菌の混合培養によるセルロースを基質とした水素及びブタノールの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、化石燃料への依存による地球温暖化問題がクローズアップされている。同時に、石油の枯渇が指摘されており、エネルギー確保が人類共通の重要課題となっている。そこで、石油由来の燃料生産に代わりバイオマス由来の燃料生産が求められている。殊に、食物と競合しない非食料バイオマス由来のバイオマス燃料への期待が高まっている。
【０００３】
バイオマス燃料としては、バイオエタノールが知られているが、バイオマス燃料としてのブタノールも注目されている。ブタノールは、燃焼エネルギー効率がエタノールよりも高く、既存の化石燃料へ高い比率で混合することができる。また、溶剤としても従来よりよく利用されているなど、利用用途の広さという観点でも、エタノールよりも優れているといえる。
【０００４】
一方、バイオマス燃料としては、エタノールやブタノールの他にメタンガスや水素ガスも注目されている。特に、水素ガスは燃焼する際に二酸化炭素を生成せず、クリーンな燃料として大きく期待されている。
【０００５】
これまで知られているバイオマス燃料としてのブタノール生産技術としては、例えば、特開２００５−３２８８０１号公報に開示されている、食品残渣と焼酎粕に水を配合したものを用いて培地を調製し、当該培地をＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ Ｎ１−４やＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ
ＡＴＣＣ ２７０２１Ｔのブタノール生産菌によりブタノール発酵を行うブタノールの生産方法（特許文献１）や、特開２００５−２６１２３９号公報に開示されている、セルロース系物質及び／又はセルロース系物質由来の糖質を含む培地で、ジオバシラス属に属し、セルロース系物質及び／又はセルロース系物質由来の糖質から１−ブタノールなどの低級アルコールを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物から１−ブタノールなどの低級アルコールを採取する低級アルコールの製造法（特許文献２）が知られている。
【０００６】
一方、水素生産技術としては、例えば、特開２００６−２２３９６２号公報に開示されている、残飯や食品加工残渣などの有機性廃棄物にクロストリジウム属の単一菌を接種することで水素生産を伴った有機性廃棄物の処理方法（特許文献３）や、特開２００１−１５７５９５号公報に開示されている、セルロースを成分とする有機材料にクロストリジウムｓｐ．（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）Ｎｏ．２株を添加した後、撹拌を行い、反応が収束した時点で再度クロストリジウムｓｐ．（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）Ｎｏ．２株の添加を繰り返す水素製造方法（特許文献４）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−３２８８０１号公報
【特許文献２】特開２００５−２６１２３９号公報
【特許文献３】特開２００６−２２３９６２号公報
【特許文献４】特開２００１−１５７５９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ブタノール生産菌としては、代表的なものとしてクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌が知られている。しかしながら、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌のうち、ブタノール生産能を有する菌株は、セルロースを資化することができず、一方で、セルロース資化能を有する菌株は、ブタノールをほとんど生産できないという問題がある。
【０００９】
一方、ブタノール生産菌によるブタノール生産の場合、副産物として水素も生成する。ブタノール生産菌によるブタノール発酵においては、酢酸や酪酸などの酸生成期では代謝系の余剰電子が水素として放出されるが、ブタノールやアセトンなどのソルベント生成期ではＮＡＤＨに変換されてソルベントの生成に利用されるため、水素の収量が低くなるという問題がある。そのような事情から、これまで該水素は利用されておらず、エネルギーとして活用するには至っていない。
【００１０】
そのため、セルロース系バイオマスから効率よくエネルギーを生産するという観点から、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌によってセルロース基質から水素及びブタノールを１つの系で同時に生産する技術の開発が望まれている。
【００１１】
そこで本発明は、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の異なる性質を利用して、１つの系でセルロースの糖化と水素及びブタノールの生産をクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌のみで実施することが可能な水素及びブタノールの効率的な生産技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、セルロース資化菌によるセルロース糖化と、水素及びブタノール生産菌による水素及びブタノール発酵を１つの系で行う混合培養法を実施したところ、セルロース基質から水素及びブタノールを効率的に生産することができるとの知見を得た。
【００１３】
本発明はかかる知見に基づきなされたものであり、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の混合培養によるセルロース基質からの水素及びブタノール生産方法であって、セルロース資化能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌によってセルロース基質を糖化する工程と、水素及びブタノール生産能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌によって水素及びブタノールを生産する工程と、を有する、水素及びブタノール生産方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の水素及びブタノール生産方法によれば、セルロース資化菌によるセルロース糖化と、水素及びブタノール高生産菌を組み合わせた混合培養により、１つの系でセルロース基質の糖化を行いつつ、水素及びブタノールを生産することができるため、セルロース基質を用いた水素及びブタノール生産を効率よく実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】セルロースを基質としたセルロース資化菌と水素及びブタノール生産菌の混合培養による水素生成量を示す図である。
【図２】セルロースを基質としたセルロース資化菌と水素及びブタノール生産菌の混合培養による各種発酵生産物の濃度を示す図である。
【図３】グルコースを基質とした水素及びブタノール生産菌の単独培養による水素生成量を示す図である。
【図４】グルコースを基質とした水素及びブタノール生産菌の単独培養による各種発酵生産物の濃度を示す図である。
【図５】ｐＮＡＫｈｕｐａｓ（ｈｕｐアンチセンスＲＮＡ）及びｐＮＡＫｈｕｐ（コントロール）の構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の実施形態について詳細に説明する。本発明の水素及びブタノール生産方法は、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の混合培養によるセルロース基質からの水素及びブタノール生産方法であって、セルロース資化能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌によってセルロース基質を糖化する工程と、水素及びブタノール生産能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌によって水素及びブタノールを生産する工程と、を有する。
【００１７】
セルロース基質としては、セルロース系バイオマスであればその種類に限定されない。ここで、セルロース系バイオマスとは、セルロースを含む物質を意味し、例えば、レーヨン、綿、麻などの植物系の繊維のわた、糸、布帛などの繊維類；新聞紙、ろ紙、雑誌、コピー紙やダンボールなどの紙類；稲わら、野菜くずなどの農産廃棄物のほか、結晶性セルロースなどを挙げることができる。
【００１８】
セルロース基質の濃度は、水素及びブタノールの生産効率の観点からは、０．５〜１０％（ｗ／ｗ）であることが好ましく、２〜８％（ｗ／ｗ）であることがより好ましく、３〜５％（ｗ／ｗ）であることがさらに好ましい。
【００１９】
なお、前記セルロース基質には、ヘミセルラーゼを添加することが好ましい。ヘミセルラーゼを添加することにより、ヘミセルロースを含むセルロース系バイオマスの糖化が促進され、ブタノール生産菌が資化するためのセロビオースやグルコースの量が増加する結果、ブタノール生産量を増加させることができる。ヘミセルラーゼの添加量は任意に設定することができるが、添加量が多ければ糖化をより促進させることができる。
【００２０】
前記ヘミセルロースを含むセルロース系バイオマスとしては、木質系バイオマスが挙げられる。本実施形態において木質系バイオマスとは、植物体の一部をなしていた木質系部分を含む材料であって、家畜等の動物の消化管を通ったことがなく、かつ、工業的に食品または飼料とするために加工又は分解工程を受けたことがなく、かつ、食品又は食品原料として不適である、主としてセルロース、ヘミセルロースおよびリグニンから構成されるバイオマスをいう。具体的には、例えば、間伐材、剪定枝葉、木材チップ、おが屑や籾殻、製材工場等の残廃材、建築廃材、建築解体材などが挙げられる。
【００２１】
前記セルロース資化能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌は、セルロース基質中のセルロースを資化（糖化）する能力が高いという観点から、クロストリジウム サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ＮＢＲＣ１０３４００株（以下「ＮＢＲＣ１０３４００株」という。）であることが好ましい。クロストリジウム サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）は、セルロースを嫌気的条件下で糖化してセロビオース及びグルコースを生成する。また、好熱性菌としても知られ、その至適温度は５５〜６０℃と、他のクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の至適温度と比較すると高い。
【００２２】
また、前記セルロース資化能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌として、遺伝子組み換えにより、セルロース資化能が高められた組み換え体を用いることもできる。従って、本実施形態においては、セルロース資化能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌には、遺伝子組み換えにより、セルロース資化能が高められた組み換え体も含まれる。
【００２３】
前記水素及びブタノール生産能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌は、水素及びブタノールを生産する能力が高いという観点から、クロストリジウム サッカロパーブチルアセトニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）Ｎ１−４株（以下「Ｎ１−４株」という。）のＨｕｐＣＢＡの発現を抑制したクロストリジウム サッカロパーブチルアセトニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）ＮＲＩＣ０８１６（以下「ＮＲＩＣ０８１６株（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）」という。）であることが好ましい。なお、ＨｕｐＣＢＡは、ハイドロゲナーゼ（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の１種である。
【００２４】
前記ＮＲＩＣ０８１６株（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）は、アンチセンスＲＮＡ法を用いて前記Ｎ１−４株のｈｕｐＣＢＡ遺伝子の発現を抑制するように遺伝子を改変することで得ることができる。すなわち、アンチセンスＲＮＡの発現には構成的な発現を制御するｂｄｈプロモーターを使用し、転写終結にはｈｕｐＡの下流領域を用いる。また、発現させたアンチセンスＲＮＡは、ｈｕｐＣＢＡの転写開始点２ｎｔ上流からその下流１８０ｎｔを用い、ｈｕｐＣＢＡのｍＲＮＡとハイブリダイズし、リボソームの結合を阻害することでＨｕｐＣが発現抑制を行うようにデザインする。それぞれのＤＮＡ断片を予め制限酵素サイトを付加したプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、連結した後 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ−Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍＮ１−４間のシャトルベクターであるｐＮＡＫ１に挿入することでアンチセンス発現プラスミドｐＮＡＫ２を構築することができる（図５）。このアンチセンス発現プラスミドｐＮＡＫ２をエレクトロポレーション法によってＮ１−４株に導入することでｈｕｐＣＢＡ遺伝子の発現が抑制されたＮＲＩＣ０８１６株（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）を得ることができる。なお、前記ＮＲＩＣ０８１６株は、東京農業大学応用生物科学部菌株保存室で分譲が可能である。
【００２５】
また、アンチセンスＲＮＡによって該遺伝子の発現が抑制されたかどうかについては、ＨｕｐＣタンパクの存在を抗ＨｕｐＣ抗体を用いたウエスタンブロット解析によって調べることができる。すなわち、コントロールであるプラスミドｐＮＡＫ１を導入した形質転換体においてはＨｕｐＣのシグナルが検出されるのに対し、アンチセンス発現プラスミドｐＮＡＫ２を導入した形質転換体では、そのシグナルが検出されず、１８０ｎｔのアンチセンスＲＮＡが効果的にＨｕｐＣの発現を抑制していることを確認することができる。
【００２６】
クロストリジウム サッカロパーブチルアセトニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）は、前記ＮＢＲＣ１０３４００株がセルロースを糖化して生成したセロビオース及び／又はグルコースを基質として嫌気的条件下で発酵を行い、水素及びブタノールを生産するほか、アセトン、エタノール、酢酸、酪酸などを産生する。また、至適温度は２５〜３４℃であり、３７℃を超えるとブタノール生産を停止してしまうという性質を有している。
【００２７】
クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の混合培養は、前記セルロース基質を糖化する工程を開始してから少なくとも２４時間経過後に、前記水素及びブタノールを生産する工程を実施することによって行われる。
【００２８】
すなわち、前記水素及びブタノール生産菌はセルロース基質を直接資化することができないため、前記水素及びブタノール生産菌が水素及びブタノールを生産するためには、前記セルロース資化菌がセルロース基質を糖化する工程が前提として必要となる。そのため、仮に前記セルロース資化菌と前記水素及びブタノール生産菌を同時に培地に添加しても、所望量のブタノールを生産することができない。
【００２９】
しかし、前記セルロース資化菌がセルロースを糖化し始めれば、同時並行的に前記水素及びブタノール生産菌が水素及びブタノールを生産することが可能となる。
【００３０】
前記セルロース基質を糖化する工程は、前記セルロース資化能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の至適温度で実施し、前記水素及びブタノールを生産する工程を、前記水素及びブタノール生産能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の至適温度で実施することが水素及びブタノールの効率的生産の観点から好ましい。
【００３１】
前記セルロース資化能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の至適温度は５５〜６０℃であり、前記水素及びブタノール生産能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の至適温度は２５〜３４℃である。従って、前記セルロース基質を糖化する工程は、５５〜６０℃で実施することが好ましく、前記水素及びブタノールを生産する工程は、２５〜３４℃で実施することが好ましい。
【００３２】
また、得られた水素は、必要に応じて、吸収法、深冷分離法、吸着法や膜分離法などによる精製を実施することで、水素ガスの純度を高めることができる。
【００３３】
さらに、水素及びブタノール生産工程の終了後、必要に応じて、得られたブタノールを蒸留し高濃度のブタノールを分取する蒸留工程を実施する。蒸留工程では、培養液を蒸留装置等によって蒸留し、ブタノール濃度を所望の濃度に濃縮する。
【００３４】
蒸留工程で副生された蒸留残渣はセルロース基質（セルロース系バイオマス）やクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌に由来する栄養素を豊富に含み、栄養学的に優れていることから、飼料化や肥料化を行うことにより、家畜の飼料や農作物の肥料として有効利用することができる。
【００３５】
蒸留残渣を家畜の飼料として利用する場合は、例えば、蒸留残渣をそのまま又は乾燥処理を実施した上で、家畜に供給することができる。また、蒸留残渣を農作物の肥料として利用する場合は、例えば、必要に応じて炭素源又は窒素源を添加し、Ｃ／Ｎ比を適宜調整することにより、作物に有用な肥料が得られる。
【実施例】
【００３６】
１．セルロース基質での混合培養
セルロース資化性菌として、ＮＢＲＣ１０３４００株を使用した。また、水素及びブタノール生産菌として、Ｎ１−４株、ＮＲＩＣ０８１６株（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）、クロストリジウム アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ０８２４株（以下「ＡＴＣＣ０８２４株」という。）及びクロストリジウム ベイジェリンキー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）ＮＣＩＭＢ８０５２株（以下「ＮＣＩＭＢ８０５２株」という。）の４菌株を用いた。
【００３７】
セルロース資化性菌と水素及びブタノール生産菌の混合培養は、以下のとおりに行った。すなわち、結晶性セルロース（Ａｖｉｃｅｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）４％（ｗ／ｖ）を基質としたＮＢＲＣ９７９培地５０ｍＬに、あらかじめ調製したＮＢＲＣ１０３４００株の前培養液５０ｍＬを用いて初発菌体濃度Ｏ．Ｄ．６００ｎｍが０．１となるように適宜植菌し、嫌気的条件下で６０℃、２４時間（１日間）培養を行った。また、培養開始２４時間（１日間）後、あらかじめ調製した水素及びブタノール生産菌の前培養液１０ｍＬを用いて初発菌体濃度Ｏ．Ｄ．６００ｎｍが０．１となるように適宜添加し、培養温度を３０℃に変更して１８日間嫌気的条件下で混合培養を行った。なお、ＮＢＲＣ９７９培地を表１に示した。
【００３８】
【表１】
【００３９】
水素生成量は、産生した水素をガスパックに回収し、ガスクロマトグラフィーを用いて測定した。また、その結果を図１に示した。一方、培地中の発酵生産物であるブタノール、アセトン、エタノール、酢酸及び酪酸量は、高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した。また、その結果を図２に示した。
【００４０】
水素生成量について、図１に示すように、セルロース資化性菌ＮＢＲＣ１０３４００株とＮＲＩＣ０８１６株（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）とを混合培養した場合、水素生成量が１７４．４ｍＬと他の菌株の場合と比べて最も高い値を示し、Ｎ１−４株の２．６倍、ＡＴＣＣ０８２４株の１．３倍、ＮＣＩＭＢ８０５２株の３．５倍の値であった。
【００４１】
一方、各種発酵生産物について、図２に示すように、混合培養終了後のブタノール生産量は、Ｎ１−４株の場合では５．６ｇ／Ｌ、ＮＲＩＣ０８１６株（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）の場合では４．５ｇ／Ｌであり、ＡＴＣＣ０８２４株の場合の２．１ｇ／Ｌ、ＮＣＩＭＢ８０５２株の場合の２．７ｇ／Ｌと比べて高い値であった。
【００４２】
また、混合培養終了後のアセトン生産量は、ＮＲＩＣ０８１６株（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）の場合では１．５ｇ／Ｌであったのに対し、Ｎ１−４株の場合では０．２ｇ／Ｌ、ＡＴＣＣ０８２４株の場合では０．２ｇ／Ｌ、ＮＣＩＭＢ８０５２株の場合では検出されなかった。
【００４３】
以上をまとめると、セルロースを基質としたセルロース資化菌との混合培養において、ＮＲＩＣ０８１６株（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）を用いた場合は、ブタノールの生産量が最も高かったＮ１−４株と比べてブタノール生産性がわずかに劣るものの、水素の生産性が非常に高く、セルロースから効率的に水素及びブタノールを同時に生産するという観点から最も適することがわかった。なお、ＮＲＩＣ０８１６株（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）が親株であるＮ１−４株と比べて高い水素生産性を示す要因としては、Ｎ１−４株のＨｕｐＣＢＡが水素からＮＡＤＨを生成する水素取込型ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅとして機能するが、ＮＲＩＣ０８１６株（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）では該水素取込型ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅの発現が抑制されているため、ブタノールやアセトンなどのソルベント生成期においてＮＡＤＨが生成されずに水素として放出されることによると考えられる。
【００４４】
２．グルコース基質での単独培養
４％（ｗ／ｖ）グルコース（関東化学株式会社製）を基質としたＴＹＡ培地１００ｍＬに、あらかじめ調製した水素及びブタノール生産菌の前培養液１０ｍＬを用いて初発菌体濃度Ｏ．Ｄ．６００ｎｍが０．１となるように適宜植菌し、培養温度３０℃で５日間嫌気的条件下で培養を行った。なお、ＴＹＡ培地組成を表２に示した。また、調製したＴＹＡ培地のｐＨが６．５付近であったので、培地のｐＨ調整は行わず、そのまま使用した。
【００４５】
【表２】
【００４６】
水素生成量及び培地中の発酵生産物であるブタノール、アセトン、エタノール、酢酸及び酪酸量は、上記１．と同様の方法で測定した。
【００４７】
水素生成量について、図３に示すように、ＮＲＩＣ０８１６（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）を培養した場合、水素生成量が４９５．４ｍＬと他の菌株の場合と比べて最も高い値を示し、親株であるＮ１−４株の２．１倍、ＡＴＣＣ０８２４株の１．６倍、ＮＣＩＭＢ８０５２株の９．０倍であった。
【００４８】
一方、各種発酵生産物について、図４に示すように、培養終了後のブタノール量は、Ｎ１−４株を培養した場合は８．９ｇ／Ｌ、ＮＲＩＣ０８１６株（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）の場合は７．４ｇ／Ｌであった。また、ＡＴＣＣ０８２４株の場合は５．８ｇ／Ｌ、ＮＣＩＭＢ８０５２株の場合は生成されず、クロストリジウム サッカロパーブチルアセトニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）Ｎ１−４株及びＮＲＩＣ０８１６株（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）に比べて低い値であった。
【００４９】
また、培養終了後のアセトン量は、ＮＲＩＣ０８１６株（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）を培養した場合は、５．１ｇ／Ｌであったのに対し、Ｎ１−４株の場合は３．０ｇ／Ｌ、ＡＴＣＣ０８２４株の場合は２．１ｇ／Ｌ、ＮＣＩＭＢ８０５２株の場合は検出されなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロストリジウム属細菌を用いた水素及びブタノールの生産方法に関し、より具体的には、クロストリジウム属細菌の混合培養によるセルロースを基質とした水素及びブタノールの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、化石燃料への依存による地球温暖化問題がクローズアップされている。同時に、石油の枯渇が指摘されており、エネルギー確保が人類共通の重要課題となっている。そこで、石油由来の燃料生産に代わりバイオマス由来の燃料生産が求められている。殊に、食物と競合しない非食料バイオマス由来のバイオマス燃料への期待が高まっている。
【０００３】
バイオマス燃料としては、バイオエタノールが知られているが、バイオマス燃料としてのブタノールも注目されている。ブタノールは、燃焼エネルギー効率がエタノールよりも高く、既存の化石燃料へ高い比率で混合することができる。また、溶剤としても従来よりよく利用されているなど、利用用途の広さという観点でも、エタノールよりも優れているといえる。
【０００４】
一方、バイオマス燃料としては、エタノールやブタノールの他にメタンガスや水素ガスも注目されている。特に、水素ガスは燃焼する際に二酸化炭素を生成せず、クリーンな燃料として大きく期待されている。
【０００５】
これまで知られているバイオマス燃料としてのブタノール生産技術としては、例えば、特開２００５−３２８８０１号公報に開示されている、食品残渣と焼酎粕に水を配合したものを用いて培地を調製し、当該培地をＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ Ｎ１−４やＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ
ＡＴＣＣ ２７０２１Ｔのブタノール生産菌によりブタノール発酵を行うブタノールの生産方法（特許文献１）や、特開２００５−２６１２３９号公報に開示されている、セルロース系物質及び／又はセルロース系物質由来の糖質を含む培地で、ジオバシラス属に属し、セルロース系物質及び／又はセルロース系物質由来の糖質から１−ブタノールなどの低級アルコールを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物から１−ブタノールなどの低級アルコールを採取する低級アルコールの製造法（特許文献２）が知られている。
【０００６】
一方、水素生産技術としては、例えば、特開２００６−２２３９６２号公報に開示されている、残飯や食品加工残渣などの有機性廃棄物にクロストリジウム属の単一菌を接種することで水素生産を伴った有機性廃棄物の処理方法（特許文献３）や、特開２００１−１５７５９５号公報に開示されている、セルロースを成分とする有機材料にクロストリジウムｓｐ．（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）Ｎｏ．２株を添加した後、撹拌を行い、反応が収束した時点で再度クロストリジウムｓｐ．（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）Ｎｏ．２株の添加を繰り返す水素製造方法（特許文献４）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−３２８８０１号公報
【特許文献２】特開２００５−２６１２３９号公報
【特許文献３】特開２００６−２２３９６２号公報
【特許文献４】特開２００１−１５７５９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ブタノール生産菌としては、代表的なものとしてクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌が知られている。しかしながら、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌のうち、ブタノール生産能を有する菌株は、セルロースを資化することができず、一方で、セルロース資化能を有する菌株は、ブタノールをほとんど生産できないという問題がある。
【０００９】
一方、ブタノール生産菌によるブタノール生産の場合、副産物として水素も生成する。ブタノール生産菌によるブタノール発酵においては、酢酸や酪酸などの酸生成期では代謝系の余剰電子が水素として放出されるが、ブタノールやアセトンなどのソルベント生成期ではＮＡＤＨに変換されてソルベントの生成に利用されるため、水素の収量が低くなるという問題がある。そのような事情から、これまで該水素は利用されておらず、エネルギーとして活用するには至っていない。
【００１０】
そのため、セルロース系バイオマスから効率よくエネルギーを生産するという観点から、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌によってセルロース基質から水素及びブタノールを１つの系で同時に生産する技術の開発が望まれている。
【００１１】
そこで本発明は、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の異なる性質を利用して、１つの系でセルロースの糖化と水素及びブタノールの生産をクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌のみで実施することが可能な水素及びブタノールの効率的な生産技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、セルロース資化菌によるセルロース糖化と、水素及びブタノール生産菌による水素及びブタノール発酵を１つの系で行う混合培養法を実施したところ、セルロース基質から水素及びブタノールを効率的に生産することができるとの知見を得た。
【００１３】
本発明はかかる知見に基づきなされたものであり、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の混合培養によるセルロース基質からの水素及びブタノール生産方法であって、セルロース資化能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌によってセルロース基質を糖化する工程と、水素及びブタノール生産能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌によって水素及びブタノールを生産する工程と、を有する、水素及びブタノール生産方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の水素及びブタノール生産方法によれば、セルロース資化菌によるセルロース糖化と、水素及びブタノール高生産菌を組み合わせた混合培養により、１つの系でセルロース基質の糖化を行いつつ、水素及びブタノールを生産することができるため、セルロース基質を用いた水素及びブタノール生産を効率よく実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】セルロースを基質としたセルロース資化菌と水素及びブタノール生産菌の混合培養による水素生成量を示す図である。
【図２】セルロースを基質としたセルロース資化菌と水素及びブタノール生産菌の混合培養による各種発酵生産物の濃度を示す図である。
【図３】グルコースを基質とした水素及びブタノール生産菌の単独培養による水素生成量を示す図である。
【図４】グルコースを基質とした水素及びブタノール生産菌の単独培養による各種発酵生産物の濃度を示す図である。
【図５】ｐＮＡＫｈｕｐａｓ（ｈｕｐアンチセンスＲＮＡ）及びｐＮＡＫｈｕｐ（コントロール）の構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の実施形態について詳細に説明する。本発明の水素及びブタノール生産方法は、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の混合培養によるセルロース基質からの水素及びブタノール生産方法であって、セルロース資化能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌によってセルロース基質を糖化する工程と、水素及びブタノール生産能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌によって水素及びブタノールを生産する工程と、を有する。
【００１７】
セルロース基質としては、セルロース系バイオマスであればその種類に限定されない。ここで、セルロース系バイオマスとは、セルロースを含む物質を意味し、例えば、レーヨン、綿、麻などの植物系の繊維のわた、糸、布帛などの繊維類；新聞紙、ろ紙、雑誌、コピー紙やダンボールなどの紙類；稲わら、野菜くずなどの農産廃棄物のほか、結晶性セルロースなどを挙げることができる。
【００１８】
セルロース基質の濃度は、水素及びブタノールの生産効率の観点からは、０．５〜１０％（ｗ／ｗ）であることが好ましく、２〜８％（ｗ／ｗ）であることがより好ましく、３〜５％（ｗ／ｗ）であることがさらに好ましい。
【００１９】
なお、前記セルロース基質には、ヘミセルラーゼを添加することが好ましい。ヘミセルラーゼを添加することにより、ヘミセルロースを含むセルロース系バイオマスの糖化が促進され、ブタノール生産菌が資化するためのセロビオースやグルコースの量が増加する結果、ブタノール生産量を増加させることができる。ヘミセルラーゼの添加量は任意に設定することができるが、添加量が多ければ糖化をより促進させることができる。
【００２０】
前記ヘミセルロースを含むセルロース系バイオマスとしては、木質系バイオマスが挙げられる。本実施形態において木質系バイオマスとは、植物体の一部をなしていた木質系部分を含む材料であって、家畜等の動物の消化管を通ったことがなく、かつ、工業的に食品または飼料とするために加工又は分解工程を受けたことがなく、かつ、食品又は食品原料として不適である、主としてセルロース、ヘミセルロースおよびリグニンから構成されるバイオマスをいう。具体的には、例えば、間伐材、剪定枝葉、木材チップ、おが屑や籾殻、製材工場等の残廃材、建築廃材、建築解体材などが挙げられる。
【００２１】
前記セルロース資化能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌は、セルロース基質中のセルロースを資化（糖化）する能力が高いという観点から、クロストリジウム サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ＮＢＲＣ１０３４００株（以下「ＮＢＲＣ１０３４００株」という。）であることが好ましい。クロストリジウム サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）は、セルロースを嫌気的条件下で糖化してセロビオース及びグルコースを生成する。また、好熱性菌としても知られ、その至適温度は５５〜６０℃と、他のクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の至適温度と比較すると高い。
【００２２】
また、前記セルロース資化能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌として、遺伝子組み換えにより、セルロース資化能が高められた組み換え体を用いることもできる。従って、本実施形態においては、セルロース資化能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌には、遺伝子組み換えにより、セルロース資化能が高められた組み換え体も含まれる。
【００２３】
前記水素及びブタノール生産能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌は、水素及びブタノールを生産する能力が高いという観点から、クロストリジウム サッカロパーブチルアセトニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）Ｎ１−４株（以下「Ｎ１−４株」という。）のＨｕｐＣＢＡの発現を抑制したクロストリジウム サッカロパーブチルアセトニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）ＮＲＩＣ０８１６（以下「ＮＲＩＣ０８１６株（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）」という。）であることが好ましい。なお、ＨｕｐＣＢＡは、ハイドロゲナーゼ（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の１種である。
【００２４】
前記ＮＲＩＣ０８１６株（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）は、アンチセンスＲＮＡ法を用いて前記Ｎ１−４株のｈｕｐＣＢＡ遺伝子の発現を抑制するように遺伝子を改変することで得ることができる。すなわち、アンチセンスＲＮＡの発現には構成的な発現を制御するｂｄｈプロモーターを使用し、転写終結にはｈｕｐＡの下流領域を用いる。また、発現させたアンチセンスＲＮＡは、ｈｕｐＣＢＡの転写開始点２ｎｔ上流からその下流１８０ｎｔを用い、ｈｕｐＣＢＡのｍＲＮＡとハイブリダイズし、リボソームの結合を阻害することでＨｕｐＣが発現抑制を行うようにデザインする。それぞれのＤＮＡ断片を予め制限酵素サイトを付加したプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、連結した後 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ−Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍＮ１−４間のシャトルベクターであるｐＮＡＫ１に挿入することでアンチセンス発現プラスミドｐＮＡＫ２を構築することができる（図５）。このアンチセンス発現プラスミドｐＮＡＫ２をエレクトロポレーション法によってＮ１−４株に導入することでｈｕｐＣＢＡ遺伝子の発現が抑制されたＮＲＩＣ０８１６株（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）を得ることができる。なお、前記ＮＲＩＣ０８１６株は、東京農業大学応用生物科学部菌株保存室で分譲が可能である。
【００２５】
また、アンチセンスＲＮＡによって該遺伝子の発現が抑制されたかどうかについては、ＨｕｐＣタンパクの存在を抗ＨｕｐＣ抗体を用いたウエスタンブロット解析によって調べることができる。すなわち、コントロールであるプラスミドｐＮＡＫ１を導入した形質転換体においてはＨｕｐＣのシグナルが検出されるのに対し、アンチセンス発現プラスミドｐＮＡＫ２を導入した形質転換体では、そのシグナルが検出されず、１８０ｎｔのアンチセンスＲＮＡが効果的にＨｕｐＣの発現を抑制していることを確認することができる。
【００２６】
クロストリジウム サッカロパーブチルアセトニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）は、前記ＮＢＲＣ１０３４００株がセルロースを糖化して生成したセロビオース及び／又はグルコースを基質として嫌気的条件下で発酵を行い、水素及びブタノールを生産するほか、アセトン、エタノール、酢酸、酪酸などを産生する。また、至適温度は２５〜３４℃であり、３７℃を超えるとブタノール生産を停止してしまうという性質を有している。
【００２７】
クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の混合培養は、前記セルロース基質を糖化する工程を開始してから少なくとも２４時間経過後に、前記水素及びブタノールを生産する工程を実施することによって行われる。
【００２８】
すなわち、前記水素及びブタノール生産菌はセルロース基質を直接資化することができないため、前記水素及びブタノール生産菌が水素及びブタノールを生産するためには、前記セルロース資化菌がセルロース基質を糖化する工程が前提として必要となる。そのため、仮に前記セルロース資化菌と前記水素及びブタノール生産菌を同時に培地に添加しても、所望量のブタノールを生産することができない。
【００２９】
しかし、前記セルロース資化菌がセルロースを糖化し始めれば、同時並行的に前記水素及びブタノール生産菌が水素及びブタノールを生産することが可能となる。
【００３０】
前記セルロース基質を糖化する工程は、前記セルロース資化能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の至適温度で実施し、前記水素及びブタノールを生産する工程を、前記水素及びブタノール生産能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の至適温度で実施することが水素及びブタノールの効率的生産の観点から好ましい。
【００３１】
前記セルロース資化能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の至適温度は５５〜６０℃であり、前記水素及びブタノール生産能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の至適温度は２５〜３４℃である。従って、前記セルロース基質を糖化する工程は、５５〜６０℃で実施することが好ましく、前記水素及びブタノールを生産する工程は、２５〜３４℃で実施することが好ましい。
【００３２】
また、得られた水素は、必要に応じて、吸収法、深冷分離法、吸着法や膜分離法などによる精製を実施することで、水素ガスの純度を高めることができる。
【００３３】
さらに、水素及びブタノール生産工程の終了後、必要に応じて、得られたブタノールを蒸留し高濃度のブタノールを分取する蒸留工程を実施する。蒸留工程では、培養液を蒸留装置等によって蒸留し、ブタノール濃度を所望の濃度に濃縮する。
【００３４】
蒸留工程で副生された蒸留残渣はセルロース基質（セルロース系バイオマス）やクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌に由来する栄養素を豊富に含み、栄養学的に優れていることから、飼料化や肥料化を行うことにより、家畜の飼料や農作物の肥料として有効利用することができる。
【００３５】
蒸留残渣を家畜の飼料として利用する場合は、例えば、蒸留残渣をそのまま又は乾燥処理を実施した上で、家畜に供給することができる。また、蒸留残渣を農作物の肥料として利用する場合は、例えば、必要に応じて炭素源又は窒素源を添加し、Ｃ／Ｎ比を適宜調整することにより、作物に有用な肥料が得られる。
【実施例】
【００３６】
１．セルロース基質での混合培養
セルロース資化性菌として、ＮＢＲＣ１０３４００株を使用した。また、水素及びブタノール生産菌として、Ｎ１−４株、ＮＲＩＣ０８１６株（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）、クロストリジウム アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ０８２４株（以下「ＡＴＣＣ０８２４株」という。）及びクロストリジウム ベイジェリンキー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）ＮＣＩＭＢ８０５２株（以下「ＮＣＩＭＢ８０５２株」という。）の４菌株を用いた。
【００３７】
セルロース資化性菌と水素及びブタノール生産菌の混合培養は、以下のとおりに行った。すなわち、結晶性セルロース（Ａｖｉｃｅｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）４％（ｗ／ｖ）を基質としたＮＢＲＣ９７９培地５０ｍＬに、あらかじめ調製したＮＢＲＣ１０３４００株の前培養液５０ｍＬを用いて初発菌体濃度Ｏ．Ｄ．６００ｎｍが０．１となるように適宜植菌し、嫌気的条件下で６０℃、２４時間（１日間）培養を行った。また、培養開始２４時間（１日間）後、あらかじめ調製した水素及びブタノール生産菌の前培養液１０ｍＬを用いて初発菌体濃度Ｏ．Ｄ．６００ｎｍが０．１となるように適宜添加し、培養温度を３０℃に変更して１８日間嫌気的条件下で混合培養を行った。なお、ＮＢＲＣ９７９培地を表１に示した。
【００３８】
【表１】
【００３９】
水素生成量は、産生した水素をガスパックに回収し、ガスクロマトグラフィーを用いて測定した。また、その結果を図１に示した。一方、培地中の発酵生産物であるブタノール、アセトン、エタノール、酢酸及び酪酸量は、高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した。また、その結果を図２に示した。
【００４０】
水素生成量について、図１に示すように、セルロース資化性菌ＮＢＲＣ１０３４００株とＮＲＩＣ０８１６株（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）とを混合培養した場合、水素生成量が１７４．４ｍＬと他の菌株の場合と比べて最も高い値を示し、Ｎ１−４株の２．６倍、ＡＴＣＣ０８２４株の１．３倍、ＮＣＩＭＢ８０５２株の３．５倍の値であった。
【００４１】
一方、各種発酵生産物について、図２に示すように、混合培養終了後のブタノール生産量は、Ｎ１−４株の場合では５．６ｇ／Ｌ、ＮＲＩＣ０８１６株（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）の場合では４．５ｇ／Ｌであり、ＡＴＣＣ０８２４株の場合の２．１ｇ／Ｌ、ＮＣＩＭＢ８０５２株の場合の２．７ｇ／Ｌと比べて高い値であった。
【００４２】
また、混合培養終了後のアセトン生産量は、ＮＲＩＣ０８１６株（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）の場合では１．５ｇ／Ｌであったのに対し、Ｎ１−４株の場合では０．２ｇ／Ｌ、ＡＴＣＣ０８２４株の場合では０．２ｇ／Ｌ、ＮＣＩＭＢ８０５２株の場合では検出されなかった。
【００４３】
以上をまとめると、セルロースを基質としたセルロース資化菌との混合培養において、ＮＲＩＣ０８１６株（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）を用いた場合は、ブタノールの生産量が最も高かったＮ１−４株と比べてブタノール生産性がわずかに劣るものの、水素の生産性が非常に高く、セルロースから効率的に水素及びブタノールを同時に生産するという観点から最も適することがわかった。なお、ＮＲＩＣ０８１６株（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）が親株であるＮ１−４株と比べて高い水素生産性を示す要因としては、Ｎ１−４株のＨｕｐＣＢＡが水素からＮＡＤＨを生成する水素取込型ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅとして機能するが、ＮＲＩＣ０８１６株（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）では該水素取込型ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅの発現が抑制されているため、ブタノールやアセトンなどのソルベント生成期においてＮＡＤＨが生成されずに水素として放出されることによると考えられる。
【００４４】
２．グルコース基質での単独培養
４％（ｗ／ｖ）グルコース（関東化学株式会社製）を基質としたＴＹＡ培地１００ｍＬに、あらかじめ調製した水素及びブタノール生産菌の前培養液１０ｍＬを用いて初発菌体濃度Ｏ．Ｄ．６００ｎｍが０．１となるように適宜植菌し、培養温度３０℃で５日間嫌気的条件下で培養を行った。なお、ＴＹＡ培地組成を表２に示した。また、調製したＴＹＡ培地のｐＨが６．５付近であったので、培地のｐＨ調整は行わず、そのまま使用した。
【００４５】
【表２】
【００４６】
水素生成量及び培地中の発酵生産物であるブタノール、アセトン、エタノール、酢酸及び酪酸量は、上記１．と同様の方法で測定した。
【００４７】
水素生成量について、図３に示すように、ＮＲＩＣ０８１６（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）を培養した場合、水素生成量が４９５．４ｍＬと他の菌株の場合と比べて最も高い値を示し、親株であるＮ１−４株の２．１倍、ＡＴＣＣ０８２４株の１．６倍、ＮＣＩＭＢ８０５２株の９．０倍であった。
【００４８】
一方、各種発酵生産物について、図４に示すように、培養終了後のブタノール量は、Ｎ１−４株を培養した場合は８．９ｇ／Ｌ、ＮＲＩＣ０８１６株（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）の場合は７．４ｇ／Ｌであった。また、ＡＴＣＣ０８２４株の場合は５．８ｇ／Ｌ、ＮＣＩＭＢ８０５２株の場合は生成されず、クロストリジウム サッカロパーブチルアセトニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）Ｎ１−４株及びＮＲＩＣ０８１６株（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）に比べて低い値であった。
【００４９】
また、培養終了後のアセトン量は、ＮＲＩＣ０８１６株（Ｎ１−４ ＨｕｐＣＢＡ抑制株）を培養した場合は、５．１ｇ／Ｌであったのに対し、Ｎ１−４株の場合は３．０ｇ／Ｌ、ＡＴＣＣ０８２４株の場合は２．１ｇ／Ｌ、ＮＣＩＭＢ８０５２株の場合は検出されなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の混合培養によるセルロース基質からの水素及びブタノール生産方法であって、
セルロース資化能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌によってセルロース基質を糖化する工程と、
水素及びブタノール生産能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌によって水素及びブタノールを生産する工程と、
を有する、水素及びブタノール生産方法。
【請求項２】
前記セルロース資化能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌が、クロストリジウム サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ＮＢＲＣ１０３４００である、
請求項１に記載の水素及びブタノール生産方法。
【請求項３】
前記水素及びブタノール生産能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌が、クロストリジウム サッカロパーブチルアセトニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）ＮＲＩＣ０８１６である、
請求項１又は２に記載の水素及びブタノール生産方法。
【請求項４】
前記セルロース基質が、セルロース系バイオマス又は木質系バイオマスを含む、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の水素及びブタノール生産方法。
【請求項５】
前記セルロース基質を糖化する工程を開始してから少なくとも２４時間経過後に、前記水素及びブタノールを生産する工程を実施する、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の水素及びブタノール生産方法。
【請求項６】
前記セルロース基質を糖化する工程を、前記セルロース資化能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の至適温度で実施し、前記水素及びブタノールを生産する工程を、前記水素及びブタノール生産能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の至適温度で実施する、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の水素及びブタノール生産方法。
【請求項７】
前記セルロース資化能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の至適温度が６０℃であり、前記水素及びブタノール生産能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の至適温度が３０℃である、
請求項６に記載の水素及びブタノール生産方法。
【請求項８】
前記セルロース基質を糖化する工程において、ヘミセルラーゼを添加する工程を更に有する、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の水素及びブタノール生産方法。
【請求項１】
クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の混合培養によるセルロース基質からの水素及びブタノール生産方法であって、
セルロース資化能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌によってセルロース基質を糖化する工程と、
水素及びブタノール生産能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌によって水素及びブタノールを生産する工程と、
を有する、水素及びブタノール生産方法。
【請求項２】
前記セルロース資化能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌が、クロストリジウム サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ＮＢＲＣ１０３４００である、
請求項１に記載の水素及びブタノール生産方法。
【請求項３】
前記水素及びブタノール生産能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌が、クロストリジウム サッカロパーブチルアセトニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）ＮＲＩＣ０８１６である、
請求項１又は２に記載の水素及びブタノール生産方法。
【請求項４】
前記セルロース基質が、セルロース系バイオマス又は木質系バイオマスを含む、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の水素及びブタノール生産方法。
【請求項５】
前記セルロース基質を糖化する工程を開始してから少なくとも２４時間経過後に、前記水素及びブタノールを生産する工程を実施する、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の水素及びブタノール生産方法。
【請求項６】
前記セルロース基質を糖化する工程を、前記セルロース資化能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の至適温度で実施し、前記水素及びブタノールを生産する工程を、前記水素及びブタノール生産能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の至適温度で実施する、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の水素及びブタノール生産方法。
【請求項７】
前記セルロース資化能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の至適温度が６０℃であり、前記水素及びブタノール生産能を有するクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌の至適温度が３０℃である、
請求項６に記載の水素及びブタノール生産方法。
【請求項８】
前記セルロース基質を糖化する工程において、ヘミセルラーゼを添加する工程を更に有する、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の水素及びブタノール生産方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−２１３３７８（Ｐ２０１２−２１３３７８Ａ）
【公開日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【公開請求】
【出願番号】特願２０１１−２４６９７１（Ｐ２０１１−２４６９７１）
【出願日】平成２３年１１月１０日（２０１１．１１．１０）
【出願人】（５９８０９６９９１）学校法人東京農業大学 (85)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２４６９７１（Ｐ２０１１−２４６９７１）
【出願日】平成２３年１１月１０日（２０１１．１１．１０）
【出願人】（５９８０９６９９１）学校法人東京農業大学 (85)
【Ｆターム（参考）】
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