クロフェレマーなどのプロアントシアニジンオリゴマーを用いて疾患を治療する方法
プロアントシアニジンオリゴマーであるクロフェレマーを用いて分泌性下痢などの胃腸障害をはじめとする疾患を治療する方法が開示されている。カルシウム活性化クロライドチャネル（ＣａＣＣ）および嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）に対するクロフェレマーの抗分泌効果も開示されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づいて、２００９年１０月６日に出願された米国特許仮出願第６１／２４９，２３６号に対する優先権を主張するものであり、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本実施形態は、クロフェレマーなどのプロアントシアニジンオリゴマーの投与を含む疾患の治療方法に関する。いくつかの実施形態は、胃腸障害および他のＣｌ−チャネル関連疾患の治療に関する。いくつかの実施形態は、炎症性疾患の治療に関する。他の実施形態は、癌の治療に関する。いくつかの実施形態は、Ｃｌ−チャネルの阻害を通じて分泌性下痢を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
炎症性疾患、癌および細菌関連疾患は、効果的に治療することが依然として極めて困難である。例えば、分泌性下痢は、発展途上国および先進国における世界的規模の健康課題であり続けている。分泌性下痢は、重篤で、生命を脅かすこともある脱水症をもたらす腸管からの体液と電解質の両方の喪失を特徴とする。分泌性下痢は、種々の細菌性、ウイルス性、および原生動物性病原体と関連があり、また、潰瘍性大腸炎、炎症性腸症候群、ならびに胃腸管の癌および新生物形成などの、他の非感染性の原因に起因することもある。
【０００４】
南米の薬用植物、サングレ・デ・グラード（Ｃｒｏｔｏｎ ｌｅｃｈｌｅｒｉ）（ドラゴンブラッド）の樹液は、赤痢およびコレラを含む下痢、ならびに様々な肺の病気、胃の病気および他の病気を治療するためにエクアドルやペルーで長年用いられている（Ｕｌｉｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｊｏｎｅｓ，２００３；Ｒｉｓｃｏ ｅｔ ａｌ，２００３；Ｒｏｓｓｉｅ ｅｔ ａｌ．，２００３）。クロフェレマーは、サングレ・デ・グラードの血のように赤い樹液から精製される。クロフェレマーは、平均分子量２１００ダルトンの様々な鎖長のオリゴマー性プロアントシアニジンからなる暗赤褐色の非晶質粉末である。クロフェレマーは、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、および質量分析法によって特徴付けられ、図２Ａに示す構造が得られている（Ｕｂｉｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。クロフェレマーのポリマー鎖は、３〜３０単位の範囲であり、モノマー成分は、（＋）−カテキン、（−）−エピカテキン、（＋）−ガロカテキン、および（−）−エピガロカテキンである。薬理学的研究により、クロフェレマーは、細胞培養物およびマウスモデルで体液分泌を減少させることが示されている（Ｇａｂｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
いくつかの実施形態は、Ｃｌ−分泌を調節する方法であって、カルシウム活性化クロライドチャネル（ＣａＣＣ）を発現する細胞を有効量のクロフェレマーと接触させることを含む、方法に関する。
【０００６】
いくつかの実施形態では、ＣａＣＣはＴＭＥＭ１６Ａである。
【０００７】
いくつかの実施形態は、Ｃｌ−分泌を調節する方法であって、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）を発現する細胞を有効量のクロフェレマーと接触させることを含む、方法に関する。
【０００８】
いくつかの実施形態は、Ｎａ＋分泌を調節する方法であって、Ｎａ＋チャネルを発現する細胞を有効量のクロフェレマーと接触させることを含む、方法に関する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、Ｎａ＋チャネルは上皮ナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）である。
【００１０】
いくつかの実施形態は、少なくとも１つの胃腸障害を治療する方法であって、有効量のクロフェレマーを用いてＣａＣＣ活性を阻害することを含む、方法に関する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、胃腸障害は、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群、および過敏性腸症候群、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、または交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群と関連する腹部不快感であることができる。
【００１２】
いくつかの実施形態では、胃腸障害は分泌性下痢である。
【００１３】
いくつかの実施形態では、胃腸障害は過敏性腸症候群である。
【００１４】
いくつかの実施形態は、少なくとも１つの胃腸障害を治療するための方法であって、有効量のクロフェレマーを用いてＣＦＴＲ活性を阻害することを含む、方法に関する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、胃腸障害は、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群、および過敏性腸症候群、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、または交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群と関連する腹部不快感であることができる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、胃腸障害は分泌性下痢である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、胃腸障害は過敏性腸症候群である。
【００１８】
いくつかの実施形態は、少なくとも１つのチャネル病を治療する方法であって、有効量のクロフェレマーを用いてＣａＣＣ活性を阻害することを含む、方法に関する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、チャネル病は、嚢胞性線維症、肢端紅痛症、高カリウム血性周期性四肢麻痺、低カリウム血性周期性四肢麻痺、ＱＴ延長症候群、ＱＴ短縮症候群、悪性高体温症、先天性筋緊張症、および神経性筋強直症であることができる。
【００２０】
いくつかの実施形態は、少なくとも１つのチャネル病を治療する方法であって、有効量のクロフェレマーを用いてＣＦＴＲ活性を阻害することを含む、方法に関する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、チャネル病は、嚢胞性線維症、肢端紅痛症、高カリウム血性周期性四肢麻痺、低カリウム血性周期性四肢麻痺、ＱＴ延長症候群、ＱＴ短縮症候群、悪性高体温症、先天性筋緊張症、および神経性筋強直症からなる群から選択される。
【００２２】
いくつかの実施形態は、患者の少なくとも１つの胃腸障害を治療する方法であって、有効量のクロフェレマーを患者に投与することを含む、方法に関する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、胃腸障害は、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群、および過敏性腸症候群、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、または交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群と関連する腹部不快感であることができる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、胃腸障害は分泌性下痢である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、胃腸障害は過敏性腸症候群である。
【００２６】
いくつかの実施形態は、少なくとも１つの癌を治療するための方法であって、有効量のクロフェレマーを患者に投与することを含む、方法に関する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、癌は、扁平上皮細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、および肺扁平上皮癌を含む）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌または腹部癌（胃腸癌を含む）、膵癌、膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌および様々なタイプの頭頸部癌、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非開裂細胞性ＮＨＬ；巨大病変性ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症と関連する異常な血管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍と関連する浮腫）、およびメーグス症候群であることができる。
【００２８】
いくつかの実施形態では、癌は結腸癌である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、癌は結腸直腸癌である。
【００３０】
いくつかの実施形態は、少なくとも１つの炎症性疾患を治療するための方法であって、有効量のクロフェレマーを患者に投与することを含む、方法に関する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、炎症性疾患は、クローン病または過敏性腸症候群であることができる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、炎症性疾患は過敏性腸症候群である。
【００３３】
いくつかの実施形態は、少なくとも１つの胃腸障害を治療する方法であって、有効量のクロフェレマーを用いてＥＮａＣ活性を阻害することを含む、方法に関する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、胃腸障害は、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群、および過敏性腸症候群、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、または交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群と関連する腹部不快感であることができる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、胃腸障害は分泌性下痢である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、胃腸障害は過敏性腸症候群である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】腸細胞の頂端膜クロライドチャネルを通したクロライドと腸液の分泌を示す。
【図２】図２Ａは、プロアントシアニジンオリゴマーの混合物からなるクロフェレマーの化学構造を示す。図２Ｂは、クロフェレマーが、ｃＡＭＰおよびカルシウム上昇作動薬に応答したＴ８４ヒト腸細胞でＣｌ−分泌を低下させることを示すグラフを示す。図２Ｂはまた、フォルスコリン（１０μＭ）、ＡＴＰ（１００μＭ）またはタプシガルギン（１μＭ）によるＣｌ−分泌の活性化後のＴ８４細胞の短絡回路電流を示す。表示した濃度のクロフェレマーを管腔浴溶液に添加した。表示した点で、細胞を２０μＭのＣＦＴＲｉｎｈ−１７２で前処理し、ＣＦＴＲ Ｃｌ−電流を阻害した。
【図３】ＣＦＴＲ Ｃｌ−コンダクタンスのクロフェレマー阻害を示すグラフを示す。図３Ａは、アンフォテリシンＢによる透過処理の後、経上皮Ｃｌ−勾配（頂端［Ｃｌ−］７５ｍＭ、側底［Ｃｌ−］１５０ｍＭ）の存在下でのＣＦＴＲ発現ＦＲＴ細胞の頂端膜電流を示す。ＣＦＴＲ Ｃｌ−コンダクタンスは、１００μＭのＣＰＴ−ｃＡＭＰと、それに次ぐ管腔溶液への表示した濃度のクロフェレマーの添加によって活性化された。図３Ｂは、クロフェレマー適用の２０分後に測定されたクロフェレマー濃度−ＣＦＴＲ Ｃｌ−電流の阻害を示す（Ｓ．Ｅ．ｎ＝３〜５）。Ａと同様の実験（白丸）およびＣｌ−勾配を逆転させた実験（頂端［Ｃｌ−］１５０ｍＭ、側底［Ｃｌ−］７５ｍＭ）（黒丸）についてのデータを示す。
【図４】クロフェレマーによるＣＦＴＲ Ｃｌ−コンダクタンスの阻害を特徴付けるグラフを示す。図４Ａは、ゲニステイン（５０μＭ）、フォルスコリン（２０μＭ）およびＩＢＭＸ（１００μＭ）を含む様々な作動薬の後のＣＦＴＲのクロフェレマー阻害を示す。図４Ｂは、ＣＦＴＲのクロフェレマー阻害の緩徐な可逆性を示す。表示した点で、クロフェレマーを添加し、頂端溶液を徹底的に洗浄し、ＣＰＴ−ｃＡＭＰを再び添加した。図４Ｃは、クロフェレマー前処理の非存在下または存在下での、小分子ＣＦＴＲ阻害剤ＣＦＴＲｉｎｈ−１７２またはＧｌｙＨ−１０１によるＣＦＴＲの阻害を示す。（左）ＣＰＴ−ｃＡＭＰによるＣＦＴＲ活性化およびＣＦＴＲｉｎｈ−１７２またはＧｌｙＨ−１０１による阻害後の頂端膜電流。（右）クロフェレマー（５０μＭ）を添加して、ＣＦＴＲ Ｃｌ−電流を約５０〜６０％阻害し、その後、表示した濃度のＣＦＴＲｉｎｈ−１７２またはＧｌｙＨ−１０１を添加した。
【図５】ＣＦＴＲのクロフェレマー阻害のパッチクランプ解析の結果を示すグラフを示す。（左）０ｍＶの保持電位で、および５０μＭのクロフェレマーの非存在下および存在下、±１００ｍＶの電圧まで２０ｍＶずつパルスをかけたときに記録した全細胞ＣＦＴＲ電流。ＣＦＴＲはフォルスコリンによって刺激された。（右）Ａと同様の実験からの各電圧パルスの中間での平均電流の電流／電圧（Ｉ／Ｖ）プロット（Ｓ．Ｅ．、ｎ＝３）。フィッティングされたＩＣ５０は６．５μＭである。
【図６】カルシウム活性化Ｃｌ−チャネルのクロフェレマー阻害を示すグラフを示す。図６Ａは、経上皮Ｃｌ−勾配（頂端［Ｃｌ−］７０ｍＭ、側底［Ｃｌ−］１４０ｍＭ）の存在下におけるＴＭＥＭ１６Ａ発現ＦＲＴ細胞の頂端膜電流を示す。図６Ｂは、ＴＭＥＭ１６Ａ Ｃｌ−電流阻害のクロフェレマー濃度依存性を示す。図６Ｃは、０ｍＶの保持電位で、および１０μＭのクロフェレマーの非存在下および存在下、±１００ｍＶの電圧まで２０ｍＶずつパルスをかけたときに記録した全細胞ＴＭＥＭ１６Ａ電流を示す。ＴＭＥＭ１６Ａは１００μＭのＡＴＰによって刺激された。図６Ｄは、（各電圧パルスの中間での）平均電流の電流／電圧（Ｉ／Ｖ）プロットを示す。
【図７】クロフェレマーが、頂端膜カチオンチャネルならびに細胞内ｃＡＭＰおよびカルシウムシグナリングに対してほとんどまたは全く効果がないことを示すグラフを示す。図７Ａ（左）は、管腔溶液中、５０μＭのクロフェレマーで前処理していないＣＦＴＲ欠損ヒト気管支上皮細胞の初代培養物と５０μＭのクロフェレマーで前処理したＣＦＴＲ欠損ヒト気管支上皮細胞の初代培養物の短絡回路電流を示す。表示した点で、アミロリド（１０μＭ）およびＵＴＰ（１００μＭ）を添加した。図７Ａ（右）は、アミロリドおよびＵＴＰ添加後の短絡回路電流の差をまとめたものである（Ｓ．Ｅ．、ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５）。図７Ｂは、２０μＭのアンフォテリシンＢによる側底膜透過処理後、Ｋ＋勾配（頂端［Ｋ＋］５ｍＭ、側底［Ｋ＋］１５０ｍＭ）の存在下でのヒト気管支上皮細胞の頂端膜Ｋ＋電流を示す。図７Ｃは、基礎条件下、２０μＭのフォルスコリンによる処理の１０分後のＴ８４細胞ホモジネート中の環状ＡＭＰレベルを示す。クロフェレマーありとクロフェレマーなしで有意差はない。図７Ｄは、基礎条件下、ＡＴＰ（１００μＭ）の後にＴ８４細胞でｆｕｒａ−２蛍光によって測定されたカルシウムシグナリングを示す。表示した点で、細胞を５０μＭのクロフェレマーで前処理した。差し込み図は、ピークＡＴＰによるｆｕｒａ−２蛍光比の増加をまとめたものである（Ｓ．Ｅ．、ｎ＝４）。対照とクロフェレマーの間に有意差はない。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本実施形態は、例えば、炎症性疾患、腫瘍性疾患、細菌関連疾患、ウイルス関連疾患、チャネル病、胃腸障害および不妊症をはじめとする、多種多様な疾患、医学的状態および障害の治療に関する。チャネル病の例としては、嚢胞性線維症、肢端紅痛症、高カリウム血性周期性四肢麻痺、低カリウム血性周期性四肢麻痺、ＱＴ延長症候群、ＱＴ短縮症候群、悪性高体温症、先天性筋緊張症、および神経性筋強直症が挙げられるが、これらに限定されない。癌の例としては、骨癌、肺癌、皮膚癌、結腸直腸癌、家族性腺腫性ポリポーシスおよび網膜芽細胞腫が挙げられるが、これらに限定されない。胃腸障害の例としては、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群および上記の胃腸障害のいずれかと関連する腹部不快感が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
本実施形態はまた、限定するものではないが、悪液質、心血管疾患、免疫疾患、結核性胸膜炎、リウマチ性胸膜炎、癌またはその治療と関連する疲労、心血管疾患、皮膚の発赤、糖尿病、移植片拒絶、中耳炎（内耳感染）、副鼻腔炎およびウイルス感染、敗血性ショック、移植、移植片対宿主疾患、虚血／再灌流傷害、グレーブス眼症、橋本甲状腺炎、甲状腺関連眼症、結節性甲状腺腫、疱疹性間質角膜炎、細菌性角膜炎、周辺潰瘍性角膜炎、ベーチェット病、ブドウ膜炎、増殖性硝子体網膜症、狂犬病ウイルス性眼疾患、フォークト・コヤナギ・ハラダ病、網膜症、網膜レーザー光凝固、急性網膜壊死症候群、全身性脈管炎、再発性アフタ性口内炎、血管新生緑内障、眼感染症、眼アレルギー性疾患、網膜剥離、視神経炎、多発性硬化症、全身性硬化症、遺伝性網膜変性、トラコーマ、自己免疫疾患、化学療法関連粘膜損傷、抑鬱障害（大鬱病性障害、気分変調、小児期の鬱病、非定型鬱病、双極性障害、躁病および軽躁病）および不安障害（全般性不安障害、社会不安障害、恐怖症、強迫障害、パニック障害、心的外傷後ストレス障害）をはじめとする情動障害；月経前不快気分障害（月経前症候群としても知られる）；精神病性障害、例えば、短期精神病性障害、統合失調症、精神性感情障害（鬱病および／または躁病）；注意力欠如障害（多動を伴うものおよび伴わないもの）；肥満、摂食障害、例えば、神経性無食欲症および神経性大食症；血管運動性フラッシング；コカインおよびアルコール中毒、性的不全および関連疾患；線維筋痛、関節炎、慢性腰痛、三叉神経痛などの急性および慢性疼痛症候群；内臓痛症候群、例えば、過敏性腸症候群、非心臓性胸痛、機能性消化不良、間質性膀胱炎、本態性外陰痛、尿道症候群、睾丸痛、顎関節症、非定型顔面痛、偏頭痛、および緊張性頭痛；機能性身体障害、例えば、慢性疲労症候群；発作性障害、トゥレット・シンドローム、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、皮質下認知症および他の認知症、遅発性ジスキネジア、多発性硬化症、レット症候群または筋萎縮性側索硬化症をはじめとする神経障害、再狭窄、喘息、慢性閉塞性肺疾患、異常な血管形成、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ性悪性疾患を含む、疾患の治療に関する。癌の他の例としては、扁平上皮細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、および肺扁平上皮癌を含む）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌または腹部癌（胃腸癌を含む）、膵癌、膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌および様々なタイプの頭頸部癌、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非開裂細胞性ＮＨＬ；巨大病変性ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症と関連する異常な血管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍と関連する浮腫）、およびメーグス症候群が挙げられる。いくつかの実施形態は、分泌性下痢、過敏性腸症候群および結腸癌の治療に関する。
【００４０】
分泌性下痢は、重篤で、生命を脅かすこともある脱水症をもたらす腸管からの体液と電解質の両方の喪失によって特徴付けることができる。分泌性下痢は、種々の細菌性、ウイルス性、および原生動物性病原体と関連があり、また、潰瘍性大腸炎、炎症性腸症候群、ならびに胃腸管の癌および新生物形成などの、他の非感染性の原因に起因することもある。
【００４１】
分泌性下痢の２つの主な細菌源は、コレラ菌と大腸菌である。腸管毒素原性大腸菌は、発展途上国における分泌性下痢の重要な発生源であり、分泌性下痢と関連がある。下痢を引き起こす他の大腸菌株としては、腸管出血性株、腸管侵入性株、および腸管病原性株ならびに他の株が挙げられる。分泌性下痢と関連がある他の細菌性病原体としては、他のビブリオ属の種、カンピロバクター属の種、サルモネラ属の種、アエロモナス属の種、プレシモナス属の種、赤痢菌属の種、クレブシエラ属の種、シトロバクター属の種、エルシニア属の種、クロストリジウム属の種、バクテロイデス属の種、ブドウ球菌属の種、およびバチルス属の種、ならびに他の腸内細菌が挙げられる。
【００４２】
分泌性下痢は、クリプトスポリジウム属の種、例えば、クリプトスポリジウム・パルバムなどの原生動物性病原体と関連があることもある。一般に、Ｈｏｌｌａｎｄ，１９９０，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．３：３４５；Ｈａｒｒｉｓ，１９８８，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．１８：１０２；Ｇｒａｃｅｙ，１９８６，Ｃｌｉｎ，ｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．，１５：２１；Ｏｏｍｓ ａｎｄ Ｄｅｇｒｙｓｅ，１９８６，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１０：３５５；Ｂｌａｃｋ，１９８２，Ｍｅｄ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒ．Ａｍ．，６６：６１１を参照されたい。
【００４３】
分泌性下痢は、ウイルス感染と関連があることもあり、これには、特に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ならびにロタウイルス感染に付随して起こる下痢などがある。ほとんど全てのＡＩＤＳ患者は、疾患の経過中のどこかの時点で下痢に罹患し、ＡＩＤＳ患者の３０％は、慢性の下痢に罹患する。ＡＩＤＳに付随して起こる下痢は、「ＨＩＶ関連慢性下痢」と命名されている。ＨＩＶ疾患のこの下痢成分は、原生動物性病原体、例えば、クリプトスポリジウム属の種の二次感染と関連があり、少なくとも一部の患者では、これによるものと考えられている。さらに、ロタウイルス感染は、例えば、発展途上国における幼児および小児の下痢と関連がある。
【００４４】
分泌性下痢は、非ヒト動物、例えば、家畜、例えば、ウシ属の動物、イノシシ科の動物、ヒツジ（ヒツジ科の動物）、家禽（例えば、ニワトリ）、およびウマ科の動物、ならびに他の飼育動物、例えば、イヌ科の動物およびネコ科の動物でも問題である。下痢性疾患は、若い、離乳したばかりの家畜に見られる。家畜、例えば、ウシ、ヒツジおよびブタなどの食用動物の下痢性疾患は、腸管毒素原性大腸菌、腸管出血性大腸菌および他の大腸菌、サルモネラ属の種、ウェルシュ菌、バクテロイデス・フラギリス、カンピロバクター属の種、およびエルシニア・エンテロコリチカなどの、細菌性病原体と関連があることが多い。さらに、原生動物性病原体（例えば、クリプトスポリジウム・パルバム）、ならびにウイルス性病原体（例えば、ロタウイルスおよびコロナウイルス）は、家畜の下痢と関連がある。家畜の下痢の原因とされている他のウイルス性病原体の例としては、トガウイルス、パルボウイルス、カリシウイルス、アデノウイルス、ブレダウイルス、およびアストロウイルスが挙げられる。一般には、Ｈｏｌｌａｎｄ，１９９０，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖ．３：３４５を参照されたく、Ｇｕｔｚｗｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｂｌｕｍ，１９９６，ＡＪＶＲ ５７：５６０；Ｓｔｒｏｍｂｅｃｋ，１９９５，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ １７（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ１２；Ｖｅｒｍｕｎｔ，１９９４，Ａｕｓｔｒａｌ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｊ．７１：３３；Ｄｒｉｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ａｕｓｔｒａｌ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｊ．７０：２５９；Ｍｏｕｒｉｃｏｕｔ，１９９１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．７：５８８；Ｏｏｍｓ ａｎｄ Ｄｅｇｒｙｓｅ，１９８６，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１０：３５５も参照されたい。
【００４５】
様々な原因の分泌性下痢障害は、過剰なＣｌ−分泌という共通の特徴を共有する。腸液分泌は、側底膜表面のＮａ＋／Ｋ＋／２Ｃｌ−共輸送体から腸細胞へのＣｌ−流入、および頂端の（管腔に面する）Ｃｌ−チャネルからのＣｌ−流出を伴う（Ｂａｒｒｅｔｔ ａｎｄ Ｋｅｅｌｙ，２０００；Ｆｉｅｌｄ，２００３；Ｔｈｉａｇａｒａｊａｈ ａｎｄ Ｖｅｒｋｍａｎ，２００５）（図１）。特定の理論に束縛されることを望まないが、Ｋ＋チャネルおよび３Ｎａ＋／２Ｋ＋ポンプは、Ｃｌ−分泌のための電気化学的な駆動力を確立する。Ｎａ＋と水の分泌は、活発なＣｌ−分泌に応答して受動的に起こる。細菌腸毒素、例えば、コレラ菌や大腸菌によって産生される腸毒素は、腸細胞内の環状ヌクレオチド濃度を上昇させ、Ｃｌ−チャネル活性化や体液分泌を生じさせる。頂端膜Ｎａ＋チャネルおよび起電性Ｎａ＋共役共輸送体からのＮａ＋吸収は、正味の体液分泌に対抗する。正味の腸液分泌の速度、したがって、分泌性下痢の重症度は、これらの輸送システムのモジュレーターおよび上流の環状ヌクレオチドまたはカルシウムシグナリング経路と関連する。
【００４６】
いくつかの実施形態は、クロフェレマーの細胞内抗分泌標的に関する。いくつかの実施形態は、例えば、イオンチャネルおよびシグナル伝達経路をはじめとする、腸液分泌の一次的な管腔膜決定因子に関する。いくつかの実施形態は、カチオンチャネルまたはｃＡＭＰ／カルシウムシグナリングにほとんど影響を与えずに、頂端膜ｃＡＭＰ刺激性Ｃｌ−チャネル（ＣＦＴＲ）およびカルシウム刺激性Ｃｌ−チャネル（ＣａＣＣ）を阻害するためのクロフェレマーの使用に関する。いくつかの実施形態では、クロフェレマーは、その配列および構造に関連性がない２つの異なるＣｌ−チャネルを阻害する。特定の理論に束縛されることを望まないが、その排出の遅さに加えて、Ｃｌ−チャネルを阻害するクロフェレマーの能力は、細菌腸毒素、ウイルスおよび他のエフェクターと関連がある下痢においてその幅広い抗分泌活性をもたらすように思われる。いくつかの実施形態では、ＣＦＴＲとＣａＣＣの両方の阻害は、腸細胞内でｃＡＭＰ／カルシウムのクロストークがあり、かつ一部の下痢では２種類のＣｌ−チャネルが関与するため、有用である。
【００４７】
いくつかの実施形態は、阻害率が濃度依存的で、数分間にわたる、ＣＦＴＲ Ｃｌ−コンダクタンスの部分的拮抗薬としてのクロフェレマーの使用に関する。クロフェレマーの排出は緩徐であり、数時間かけて起こる。チアゾリジノンおよびグリシンヒドラジド系ＣＦＴＲ阻害剤とは異なり、ＣＦＴＲ Ｃｌ−コンダクタンスのクロフェレマー阻害は、高濃度であっても部分的である。いくつかの実施形態は、クロフェレマー分子および／または部分阻害と関連する本質的に非効率的なアロステリック阻害機構による外からの部分的なＣＦＴＲ孔遮断に関する。一実施形態では、パッチクランプ解析を用いて、直接的な孔閉鎖を伴わずに電位非依存性チャネル阻害を生じさせる、細胞外に面するＣＦＴＲ表面に対するクロフェレマーの作用を明らかにした。対照的に、グリシンヒドラジド群のＣＦＴＲ阻害剤は、残存するＣＦＴＲ Ｃｌ−電流の内向き整流、および膜電流の素速い揺らぎによる直接的な孔閉鎖を伴って、電位依存的な遮断を生じさせた（Ｍｕａｎｐｒａｓａｔ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｓｏｎａｗａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００６，２００７，２００８）。図４ＣおよびＤに見られるクロフェレマーおよびＧｌｙＨ−１０１作用の独立性は、ＧｌｙＨ−１０１の作用と異なる部位でのＣＦＴＲ孔を閉鎖するクロフェレマー作用と合致する。ＧｌｙＨ−１０１と比べたクロフェレマーのより大きな分子サイズは、ＣＦＴＲ孔の外側の部位でのクロフェレマー作用と合致する。先の研究（Ｇａｂｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９）では、大きいＣｌ−勾配の存在下でのＴ８４細胞におけるクロフェレマーによるＣＦＴＲ阻害の証拠が示されている。
【００４８】
いくつかの実施形態では、クロフェレマーは、ＣａＣＣを強く阻害する。腸上皮細胞内のＣａＣＣは、いくつかの抗レトロウイルス薬および化学療法薬をはじめとする特定の薬物、ならびにいくつかのウイルスと関連がある分泌性下痢におけるＣｌ−および体液分泌の重要な経路を提供する（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｂａｒｒｅｔｔ，２０００；Ｋｉｄｄ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎ，２０００；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２０００；Ｇｙｏｍｏｒｅｙ ｅｔ ａｌ．２００１；Ｒｕｆｏ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｔｈｉａｇａｒａｊａｈ ａｎｄ Ｖｅｒｋｍａｎ，２００５；Ｓｃｈｕｌｔｈｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．２００５，２００６；Ｆａｒｔｈｉｎｇ，２００６；Ｌｏｒｒｏｔ ａｎｄ Ｖａｓｓｅｕｒ，２００７）。
【００４９】
腸上皮細胞でのその発現に加えて、ＣａＣＣは多くの細胞型で広く発現している。それらの細胞型において、ＣａＣＣは、限定するものではないが、経上皮体液分泌、嗅覚シグナルおよび感覚シグナルの伝達、平滑筋収縮、ならびに心臓興奮をはじめとする、様々な機能に関与している（Ｈａｒｔｚｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｖｅｒｋｍａｎ ａｎｄ Ｇａｌｉｅｔｔａ，２００９）。ＣａＣＣの分子実体は、ＴＭＥＭ１６Ａ（アノクタミン−１）がＣａＣＣであるという発見によって明白になった（Ｃａｐｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）。いくつかの証拠から、ＴＭＥＭ１６ＡがＣａＣＣであるという結論が支持されている。例えば、ＴＭＥＭ１６Ａをトランスフェクトした細胞におけるＣａＣＣ Ｃｌ−電流は、ネイティブなＣａＣＣと電気生理学的な特徴が類似していることや、ＴＭＥＭ１６ＡのＲＮＡｉノックダウン後に、ＣａＣＣ Ｃｌ−電流が低下することが示されている。ＴＭＥＭ１６Ａは、例えば、腸上皮をはじめとする、複数の器官の上皮および他の細胞型で広く発現されている。
【００５０】
いくつかの実施形態では、クロフェレマーを用いて、ヒトＴＭＥＭ１６Ａを阻害する。特定の理論に束縛されることを望まないが、クロフェレマーによるＴＭＥＭ１６Ａの阻害は、カルシウム上昇作動薬の添加後のＴ８４細胞におけるＣｌ−電流の阻害と関連がある。いくつかの実施形態では、クロフェレマーは、＞９０％の最大阻害、６．５μＭのＩＣ５０、および電位非依存的な阻害機序で、腸のカルシウム活性化Ｃｌ−チャネルであるＴＭＥＭ１６Ａを強く阻害することが分かった。ＣａＣＣは、腸上皮細胞でのその発現に加えて、多くの細胞型で広く発現しており、いくつかの実施形態では、クロフェレマーのＣａＣＣに対する阻害効果を利用して、多種多様な用途でＣｌ−の流入および流出を調節することができ、その場合、ＣａＣＣは、限定するものではないが、経上皮体液分泌、嗅覚シグナルおよび感覚シグナルの伝達、平滑筋収縮、ならびに心臓興奮をはじめとする、様々な機能に関与する（Ｈａｒｔｚｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｖｅｒｋｍａｎ ａｎｄ Ｇａｌｉｅｔｔａ，２００９）。
【００５１】
いくつかの実施形態では、クロフェレマーの細胞内抗分泌作用は、腸の内側を覆う上皮細胞の管腔膜表面の２つの異なるＣｌ−チャネル標的に影響を与え、ＣＦＴＲとＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの二重阻害をもたらす。
【００５２】
いくつかの実施形態は、膜Ｃｌ−チャネル、嚢胞性線維症膜貫通制御因子コンダクタンス（ＣＦＴＲ）、ｃＡＭＰ刺激性Ｃｌ−チャネル、およびカルシウム活性化Ｃｌ−チャネル（ＣａＣＣ）の標的阻害剤に関する。いくつかの実施形態では、ハイスループットスクリーニングおよびフォローアップ化学実験により、これらのＣｌ−チャネルの阻害剤、例えば、ナノモル効力のチアゾリジノン系ＣＦＴＲ阻害剤（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，２００２）およびグリシンヒドラジド系ＣＦＴＲ阻害剤（Ｍｕａｎｐｒａｓａｔ ｅｔ ａｌ．，２００４）、ならびに３−アシル−２−アミノチオフェン系ＣａＣＣ阻害剤（ｄｅ ｌａ Ｆｕｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００８）を同定することができる。環状ヌクレオチド濃度および毒素誘発性腸液分泌を低下させるホスホジエステラーゼのチオフェンカルボキシレートアクチベーターも同定されている（Ｔｒａｄｔｒａｎｔｉｐ ｅｔ ａｌ．，２００８）。
【００５３】
クロフェレマーは、腸上皮細胞を横断するクロライド流量を低下させ、かつ分泌性下痢に伴う体液喪失および脱水症を引き起こす腸の管腔への体液移動を低下させる。したがって、クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤は、分泌性下痢に対する予防的および治療的適用、例えば、分泌性下痢に付随して起こる脱水症および電解質喪失の予防において有用である。他の実施形態では、クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤は、異常なＣｌ−流入および流出を伴う疾患に対する予防的および治療的適用において有用である。
【００５４】
クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤は、ヒトまたは動物のいずれかにおける任意のタイプの分泌性下痢に対して治療的にまたは予防的に用いることができる。好ましい実施形態では、クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤を用いて、腸内細菌と関連がある分泌性下痢を治療することができる。これらの腸内細菌としては、コレラ菌、腸管病原性、腸管毒素原性、腸管付着性、腸管出血性、または腸管侵入性タイプの大腸菌をはじめとする大腸菌、他のビブリオ属の種、カンピロバクター属の種、サルモネラ属の種、アエロモナス属の種、プレシモナス属の種、赤痢菌属の種、クレブシエラ属の種、シトロバクター属の種、エルシニア属の種、クロストリジウム属の種、バクテロイデス属の種、ブドウ球菌属の種、およびバチルス属が挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態には、旅行者下痢症の治療も含まれる。
【００５５】
別の実施形態では、クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤を用いて、限定するものではないが、ジアルジア属およびクリプトスポリジウム属の種、例えば、クリプトスポリジウム・パルバムをはじめとする原生動物と関連がある分泌性下痢を治療する。
【００５６】
別の実施形態では、クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤を用いて、限定するものではないが、非特異的下痢、炎症性腸症候群、潰瘍性大腸炎、ならびに胃腸管の癌および新生物形成などの、非感染性の原因と関連がある分泌性下痢を治療する。
【００５７】
別の実施形態では、クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤は、ＡＩＤＳ患者におけるＨＩＶ関連慢性下痢の治療に用いられる。また別の実施形態では、この医薬製剤を用いて、限定するものではないが、ロタウイルスと関連がある下痢をはじめとする、幼児または子供の下痢を治療する。
【００５８】
別の実施形態では、クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤は、ヒト男性および女性を含む温血動物における便秘優位型過敏性腸症候群（ｃ−ＩＢＳ）と関連がある１以上の症状を治療および／または予防するために用いられる。これらの症状としては、疼痛、腹部不快感および異常な排便回数が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法は、通常、ｃ−ＩＢＳ治療を必要とする対象に、クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤を投与することを含む。
【００５９】
別の実施形態では、クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤は、ｃ−ＩＢＳと関連がある疼痛を治療する方法であって、そのような治療を必要とする対象に、ｃ−ＩＢＳと関連がある疼痛を治療するのに有効な量のクロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤を投与することを含む方法を提供するために用いられる。
【００６０】
クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤を用いて、非ヒト動物、例えば、家畜、例えば、これに限定されないが、ウシ属の動物、イノシシ科の動物、ヒツジ科の動物、家禽（例えば、ニワトリ）、およびウマ科の動物、ならびに他の飼育動物、例えば、イヌ科の動物およびネコ科の動物の下痢を治療することもできる。特に、本発明の医薬製剤を用いて、細菌性病原体、例えば、腸管毒素原性大腸菌、腸管出血性大腸菌および他の大腸菌、サルモネラ属の種、ウェルシュ菌、バクテロイデス・フラギリス、カンピロバクター属の種、およびエルシニア・エンテロコリチカ、原生動物性病原体、例えば、クリプトスポリジウム・パルバム、ならびにウイルス性病原体、例えば、ロタウイルスおよびコロナウイルスだけでなく、トガウイルス、パルボウイルス、カリシウイルス、アデノウイルス、ブレダウイルス、およびアストロウイルスとも関連がある、非ヒト動物、例えば、ウシ、ヒツジおよびブタなどの食用動物の下痢性疾患を治療することができる。
【００６１】
さらに、クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤をヒトおよび非ヒト動物に予防的に投与して、分泌性下痢の発症を予防することもできる。
【００６２】
クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬組成物をＡＩＤＳ患者に投与して、ＨＩＶ関連慢性下痢の発症を予防することができる。また、クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬組成物を、コレラの流行またはロタウイルスの流行の危険にさらされている地域の子供に投与して、疾患の拡大を予防することができる。同様に、クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬組成物を、家畜、例えば、若いまたは離乳したばかりの家畜に投与して、下痢性疾患の発症を予防することができる。
【００６３】
本医薬製剤は、単独でまたは分泌性下痢症状の治療もしくは改善のための他の薬剤、例えば、再水和剤、抗生物質、腸運動抑制剤、および流体吸着体（例えば、アタパルジャイト）と組み合わせて投与することもできる。
【００６４】
クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤は、動物、例えば、ウシ属の動物、イノシシ科の動物、ヒツジ科の動物、家禽、ウマ科の動物、イヌ科の動物、およびネコ科の動物の分泌性下痢の治療で用いるために動物の食餌に組み入れることもできる。
【００６５】
前述の一般的な説明と以下の詳細な説明の両方は例示的でかつ説明のためのものであるに過ぎず、特許請求された本発明を限定するものではないことが理解されるべきである。本出願では、単数形の使用は、別途特に記載しない限り、複数形を含む。
【００６６】
本出願では、「または」の使用は、別途記載しない限り、「および／または」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は限定的なものではない。また、「要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）」または「構成要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」などの用語は、別途特に記載しない限り、１つのユニットを含む要素および構成要素と２以上のサブユニットを含む要素および構成要素の両方を包含する。また、「部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）」という用語の使用は、部分（ａ ｍｏｉｅｔｙ）の一部または完全な部分（ｔｈｅ ｅｎｔｉｒｅ ｍｏｉｅｔｙ）を含むことができる。
【００６７】
限定するものではないが、特許、特許出願、論文（ａｒｔｉｃｌｅ）、書籍、および論文（ｔｒｅａｔｉｓｅ）を含む、本出願で引用された全ての文書、または文書の部分は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【００６８】
当業者には容易に明らかとなるように、投与すべき有用なインビボ投薬量および特定の投与様式は、患者の年齢、体重、医学的状態、処置すべき状態の重症度、投与の経路、患者の腎機能および肝機能、ならびに処置される哺乳動物種、利用される特定の化合物、ならびにこれらの化合物が利用される特定の用途によって様々に変わる。所望の結果をもたらすのに必要な投薬レベルである有効投薬レベルの決定は、日常的な薬理学的方法を用いて当業者により実現され得る。通常、製品のヒトへの臨床的適用は、より低い投薬レベルで始め、投薬レベルを所望の効果が達成されるまで増加させる。有利なことに、本実施形態の化合物を、例えば、単回１日用量で投与してもよく、または１日の全投薬量を、１日２回、３回、もしくは４回の分割用量で投与してもよい。
【００６９】
製品の１日投薬量は、例えば、１日に成人１人当たり約０．５〜約１０，０００ｍｇのように、広範囲にわたって様々に異なり得る。経口投与については、製剤は、治療すべき患者に対する投薬量の対症的調整のために、約０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ １０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００または１０，０００ミリグラムの活性成分を含む錠剤の形態で提供されることが好ましい。本医薬製剤は、通常、１０ｍｇ〜約２０００ｍｇの本化合物、好ましくは約５０ｍｇ〜約１０００ｍｇの活性成分を含有する。本化合物の有効量は、通常、１日に体重１ｋｇ当たり約０．００２ｍｇ〜約１５０ｍｇの投薬レベルで供給される。範囲は、１日に体重１ｋｇ当たり約０．０２〜約８０ｍｇ、特に、１日に体重１ｋｇ当たり約０．２ｍｇ〜約４０ｍｇであることが好ましい。化合物は、１日当たり約１〜約１０倍のレジメンで投与することができる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、クロフェレマーの経口用量は、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、５００ｍｇ、または１，０００ｍｇである。いくつかの実施形態では、クロフェレマーの経口用量は、１日２回投与される。他の実施形態では、クロフェレマーの経口用量は１日１回投与される。いくつかの実施形態では、患者は、約１日、２日、７日、１４日、２８日、６０日、または９０日よりも長い期間、クロフェレマーの１日用量を投与される。
【００７１】
本明細書で使用する場合、測定値の「増大」または「減少」は、別途規定しない限り、通常、ベースライン値との比較によるものである。例えば、治療を受けている対象の入院までの時間の増大は、そのような治療を受けていない対象の入院までの時間のベースライン値との比較によるものであることができる。場合によっては、測定値の増大または減少は、この用語を用いる文脈に基づいて評価することができる。
【００７２】
本明細書で使用される「担体」は、利用される投薬量および濃度でそれに曝露されている細胞または哺乳動物に対して毒性がない、医薬として許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む。生理的に許容される担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理的に許容される担体の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸をはじめとする抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンをはじめとする他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／またはＴＷＥＥＮなどの非イオン性界面活性剤、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【００７３】
「有効量」という用語は、必要な投薬量および期間で、所望の結果を達成するのに有効な、例えば、患者または対象の胃腸障害を治療するのに十分な量を含む。クロフェレマーの有効量は、対象の疾患状態、年齢、および体重などの因子、ならびに対象において所望の応答を誘発するクロフェレマーの能力によって様々に異なり得る。投薬量レジメンは、最適な治療応答を提供するように調整することができる。有効量はまた、治療的に有益な作用がクロフェレマーのどの毒性作用または有害作用（例えば、副作用）をも上回る量である。
【００７４】
「改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）」、「改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）」、「改善（ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）」または同様の用語は、例えば、対象または対象の少なくとも一部、例えば、少なくとも約２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、１００％またはこれらの値の約いずれか２つの間の範囲に生じる改善（ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）と一致する検出可能な改善（ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）または検出可能な変化を指す。そのような改善（ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）または変化は、クロフェレマーで治療していない対象と比較したとき、治療した患者に認めることができる。その場合、治療していない対象は、同一または同様の疾患、状態、症状などを有しているか、またはそれらを発症しやすい。疾患、状態、症状またはアッセイパラメータの改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）は、主観的にまたは客観的に、例えば、対象による自己評価によって、臨床医の評価によって、または例えば、生活の質の評価、疾患もしくは状態の進行の緩徐化、疾患もしくは状態の重症度の低下、もしくは生体分子、細胞のレベルもしくは活性についての好適なアッセイをはじめとする適当なアッセイもしくは測定を実施することによって、または対象の胃腸障害の検出によって決定することができる。改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）は、一時的、持続的もしくは恒久的であってもよく、またはそれは、クロフェレマーを対象に投与している間または投与した後、もしくはクロフェレマーを本明細書もしくは引用した参考文献に記載されているアッセイもしくは他の方法で使用している間または使用した後の関連時間で、例えば、以下に記載する期間内で、すなわち、クロフェレマーの投与もしくは使用後約１時間から対象がそのような治療を受けた後約２８日、もしくは１、３、６、９カ月もしくはそれより長い時間で変動してもよい。
【００７５】
例えば、症状、分子のレベルもしくは生物学的活性などの「調節」は、例えば、症状または活性などを検出可能に増大または減少させることを指す。そのような増大または減少は、クロフェレマーで治療していない対象と比較したとき、治療した患者に認めることができる。その場合、治療していない対象は、同一または同様の疾患、状態、症状などを有しているか、またはそれらを発症しやすい。そのような増大または減少は、少なくとも約２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、１０００％もしくはそれより大きいか、またはこれらの値のいずれか２つの間の任意の範囲内であることができる。調節は、主観的にまたは客観的に、例えば、対象の自己評価によって、臨床医の評価によって、または例えば、生活の質の評価もしくは対象における分子、細胞もしくは細胞移動のレベルもしくは活性についての好適なアッセイをはじめとする適当なアッセイもしくは測定を実施することによって決定することができる。調節は、一時的、持続的もしくは恒久的であってもよく、またはそれは、クロフェレマーを対象に投与している間または投与した後、もしくはクロフェレマーを本明細書もしくは引用した参考文献に記載されているアッセイもしくは他の方法で使用している間または使用した後の関連時間で、例えば、以下に記載する時間内で、すなわち、クロフェレマーの投与もしくは使用後約１時間から対象がそのような治療を受けた後約３、６、９カ月もしくはそれより長い時間で変動してもよい。
【００７６】
「調節する」という用語はまた、クロフェレマーへの曝露に応答した細胞の活性の増大または減少、例えば、所望の最終結果が達成されるような、動物の細胞の少なくとも部分集団の増殖の阻害および／または分化の誘導を指すことができ、例えば、治療に用いられるクロフェレマーの治療結果は、特定の治療の間に増大することもあるし、減少することもある。
【００７７】
「クロフェレマーを得る」に見られる「得る」という用語は、クロフェレマーを購入するか、合成するか、または別の方法で獲得することを含むことが意図される。
【００７８】
本明細書で使用される「非経口投与」および「非経口的に投与される」という語句は、例えば、通常、注射による、腸内投与および局所投与以外の投与様式を含み、かつ限定するものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内および胸骨内への注射および注入を含む。
【００７９】
化合物の「予防的有効量」という語は、対象に単回または複数回用量を投与したときに、胃腸障害の予防または治療に有効な、クロフェレマーの量を指す。
【００８０】
本明細書で使用される「医薬品組成物」（または薬剤もしくは薬物）は、患者に適切に投与されたときに所望の治療効果を誘発することができる化学化合物、組成物、薬剤または薬物を指す。それは、必ずしも２種類以上の成分を必要とするものではない。
【００８１】
組成物は、経口、非経口、鼻腔内、舌下、口腔、局所または直腸投与用、または吸入器もしくは吸引器による投与用の、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、ロゼンジ、液体、ゲル調製物、滅菌非経口溶液または懸濁液、計量されたエアロゾルまたは液体スプレー、点滴剤、アンプル、自動注射装置または座剤の形態であることができる。経口投与用の錠剤およびカプセルは、単位投薬提示に好適な形態であることができ、かつ従来の賦形剤を含有することができる。これらの例には、結合剤（例えば、シロップ、アカシアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、およびポリビニルピロリドン）；増量剤（例えば、ラクトース、糖、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシン）；錠剤化潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、二酸化ケイ素、タルク、ポリエチレングリコールもしくはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン）；または許容される湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）がある。錠剤は、通常の薬務において周知の方法によってコーティングすることができる。経口用液体製剤は、例えば、水性もしくは油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップもしくはエリキシルの形態であることができるか、または使用前に水もしくは他の好適なビヒクルで再構成される乾燥製品として提示することができる。そのような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン、水素化食用脂）、乳化剤（例えば、レシチン、ソルビタンモノオレエート、またはアカシアゴム）；（食用油を含む）非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、分留ヤシ油、油性エステル（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、もしくはエチルアルコール））、；防腐剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはソルビン酸）などの通常の添加剤、ならびに所望により、従来の香味剤または着色剤を含有することができる。
【００８２】
経口投与のために、クロフェレマーを当技術分野で周知の医薬として許容される担体と組み合わせることによって、クロフェレマーを容易に処方することができる。そのような医薬として許容される担体のおかげで、本実施形態の化合物を、治療すべき患者によって経口摂取される錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方することができる。経口使用される医薬製剤は、所望により、錠剤または糖衣錠コアを得るために、好適な補助剤を添加した後、クロフェレマーを固体賦形剤と組み合わせ、場合によって得られた混合物をすりつぶし、顆粒の混合物を加工することによって得ることができる。所望により、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、もしくはアルギン酸またはそれらの塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）などの崩壊剤を添加することができる。糖衣錠コアは、好適なコーティングを用いて提供される。この目的のために、濃縮寒天溶液を用いることができ、これは場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有することができる。
【００８３】
本明細書で使用される「全身投与」、「全身に投与される」、「末梢投与」、および「末梢に投与される」という語句は、それが対象のシステムに侵入し、それにより、代謝および他の同様のプロセスを受けるようなクロフェレマーの投与、例えば、皮下投与を意味する。
【００８４】
クロフェレマーの「治療的有効量」という語は、対象に単回または複数回用量を投与したときに、細菌の増殖および／もしくは侵入を阻害するか、または症状、例えば、下痢などの胃腸障害を軽減するのに有効な、クロフェレマーの量を指す。「治療有効量」はまた、対象の胃腸障害の重症度を低下させるのに十分な治療（例えば、クロフェレマーを含む組成物）の量を指す。
【００８５】
本明細書で使用する場合、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、および「予防」という用語は、胃腸障害エピソードの再発、発病、または発症の予防を指す。予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）には、胃腸障害エピソードの発生および重症度からの防御が含まれる。
【００８６】
本明細書で使用する場合、「予防的有効量」という用語は、胃腸障害エピソードの発症、再発、もしくは発病の予防をもたらすかまたは別の治療の予防的効果を増強もしくは改善するのに十分な治療（例えば、クロフェレマーを含む組成物）の量を指す。
【００８７】
本明細書で使用する場合、「対象」は、胃腸障害もしくはクロフェレマーで治療可能な他の障害に罹患することができるか、または本明細書に記載したようなクロフェレマーの投与によって別の形で恩恵を受ける生物、例えば、ヒトおよび非ヒト動物を含む。好ましいヒト動物は、ヒト対象を含む。本発明の「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物、例えば、齧歯類、例えば、マウス、および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、例えば、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。
【００８８】
以下の実施例は、説明目的のために提示されるのであって、限定とみなされるべきではない。
【実施例】
【００８９】
実施例１
クロフェレマーはＴ８４ヒト腸上皮細胞によるＣｌ−分泌を阻害する
クロフェレマーが腸細胞のＣｌ−分泌を低下させるかどうかを検討するために、短絡回路電流を（形質膜透過処理なしで）対称性生理的溶液中のＴ８４細胞で測定した。図２Ｂは、ｃＡＭＰ作動薬のフォルスコリン（上）ならびにカルシウム作動薬のＡＴＰ（中）およびタプシガルギン（下）によってもたらされる短絡回路電流の増加のクロフェレマー濃度依存的阻害を示す。カルシウム作動薬を用いた測定は、ＣＦＴＲを阻害するＣＦＴＲｉｎｈ−１７２の存在下で行なわれた。主にＣＦＴＲ依存的であるフォルスコリン誘導性電流のクロフェレマー阻害が、緩徐で、弱く、部分的であったのに対し、ＡＴＰおよびタプシガルギン誘導性電流の阻害は、１０μＭのクロフェレマーで完全に近かった。特定の理論に束縛されることを望まないが、カルシウム作動薬によって誘導される電流のこの阻害は、クロフェレマーがＣＦＴＲチャネルとＣａＣＣチャネルの両方を阻害し、明らかに後者の阻害の方がはるかに強いことを示唆する。さらなる測定は、分離したＣＦＴＲおよびＣａＣＣに対するクロフェレマー効果を研究するために、トランスフェクトした細胞系を用いて行なわれた。
【００９０】
実施例２
クロフェレマーはＣＦＴＲ Ｃｌ−コンダクタンスの部分拮抗薬である
側底膜をアンフォテリシンＢで透過処理し、経上皮Ｃｌ−勾配をかけたＣＦＴＲ発現ＦＲＴ細胞で、ＣＦＴＲ Ｃｌ−電流を測定した。これらの条件下では、測定された電流は、ＣＦＴＲ Ｃｌ−コンダクタンスの直接的な定量的尺度を提供する。図３Ａは、ＣＦＴＲ Ｃｌ−コンダクタンスをＣＰＴ−ｃＡＭＰによって刺激し、次いで、頂端浴溶液中で様々な濃度のクロフェレマーを添加した頂端膜電流測定を示す。増加濃度のクロフェレマーは、部分的ではあるが、顕著により速やかなＣＦＴＲ Ｃｌ−電流の阻害をもたらした。側底浴溶液へのクロフェレマーの添加は、電流を阻害しなかった（図示せず）。図３Ｂ（白丸）にまとめたように、（Ｃｌ−電流の５０％阻害を生じさせる）クロフェレマーの見かけのＩＣ５０は約７μＭであり、最大阻害効力は約６０％であった。同様の結果は、頂端浴溶液と側底浴溶液を取り替えたときに得られた（頂端溶液中の高いＣｌ−）（図３Ｂ、黒丸）。特定の理論に束縛されることを望まないが、これは、ＣＦＴＲのクロフェレマー阻害が、Ｃｌ−濃度に依存しないことを示唆する。クロフェレマーによる部分阻害とは対照的に、ＣＦＴＲｉｎｈ−１７２またはＧｌｙＨ−１０１による最大ＣＦＴＲ阻害は、ほぼ１００％である（下記参照）。
【００９１】
クロフェレマー阻害効力がＣＦＴＲ活性化機構に依存するかどうかを調べるために測定を行なった。図４Ａは、ＣＦＴＲを直接活性化する作動薬（ゲニステイン）を用いた、またはｃＡＭＰ合成の増加（フォルスコリン）もしくはｃＡＭＰ分解の低下（ＩＢＭＸ）によるｃＡＭＰ依存的ＣＦＴＲリン酸化を通じた、５０および５００μＭのクロフェレマーに対する同様の応答を示す。分泌性下痢時の排出は非吸収性抗分泌剤の使用における懸念事項であるので、ＣＦＴＲのクロフェレマー阻害の可逆性を調べた。図４Ｂは、ＣＦＴＲ Ｃｌ−電流をＣＰＴ−ｃＡＭＰによって刺激し、その後、様々な濃度のクロフェレマーによって阻害した頂端電流測定を示す。徹底的に洗浄した後、残存するＣＦＴＲ阻害をＣＰＴ−ｃＡＭＰによる再刺激後の電流から決定した。クロフェレマーの非存在下の対照研究では、（ＣＰＴ−ｃＡＭＰの）排出と、それに次ぐ再刺激により、最初の刺激で見られた電流と同様の電流が生じた。しかしながら、様々な濃度のクロフェレマーによる阻害の後、排出研究により、ＣＦＴＲ阻害が、３０分にかけて部分的に（２５〜３５％）逆転することが示された。時間延長研究により、４時間でクロフェレマー阻害が５０％弱逆転することが示された（図示せず）。
【００９２】
予め添加されるクロフェレマーの非存在下および存在下でのＣＦＴＲ阻害の比較によって、ＣＦＴＲに対するクロフェレマーの作用部位が小分子チアゾリジノンおよびグリシンヒドラジド系ＣＦＴＲ阻害剤の作用部位と重複し得る可能性が検討された。図４Ｃ（左）は、ＣＦＴＲｉｎｈ−１７２およびＧｌｙＨ−１０１によるＣＦＴＲ阻害の濃度−阻害研究を示す。最大阻害は約１００％であり、ＩＣ５０値はそれぞれ、約１および約８μＭである。図４Ｃ（右）は、５０μＭのクロフェレマーを最初に添加してＣＦＴＲ Ｃｌ−電流を約５０％阻害した同様の濃度−阻害測定を示す。クロフェレマー拮抗機構が部分的であるにもかかわらず、ＣＦＴＲｉｎｈ−１７２およびＧｌｙＨ−１０１は、ＣＦＴＲをほぼ１００％阻害した。特定の理論に束縛されることを望まないが、クロフェレマーの非存在下および存在下でのＣＦＴＲｉｎｈ−１７２およびＧｌｙＨ−１０１のよく似たＩＣ５０値は、クロフェレマーおよびＣＦＴＲｉｎｈ−１７２またはＧｌｙＨ−１０１のＣＦＴＲ阻害部位が重複しないことを示唆する。
【００９３】
クロフェレマーによるＣＦＴＲ阻害の分子機構を調べるために、パッチクランプを行なった。全細胞膜電流をＣＦＴＲ発現ＦＲＴ細胞で測定した（図５、左）。１０μＭのフォルスコリンによる刺激によって、＋１００ｍＶで１７９±１８ｐＡ／ｐＦの膜電流が生じた（全膜キャパシタンス１５．８±４ｐＦ）（ｎ＝３）。５０μＭのクロフェレマーでは、ＣＦＴＲ Ｃｌ−電流の約６０％阻害が得られた。図５（右）は、ＣＦＴＲについて予想されるような、ＣＦＴＲのほぼ線形の電流−電圧関係を示す。特定の理論に束縛されることを望まないが、クロフェレマー添加後にＣＦＴＲ電流−電圧関係が線形のままであったという事実は、電荷のない阻害剤について予想されるような、電位非依存的遮断機構を示唆する。
【００９４】
実施例３
クロフェレマーはＣａＣＣ ＴＭＥＭ１６Ａの強力な阻害剤である
図２Ｂのデータから、クロフェレマーがＴ８４細胞でＣａＣＣを強く阻害することが示唆された。タンパク質ＴＭＥＭ１６ＡがクロフェレマーのＣａＣＣ標的であるかどうかを検討するために、ＴＭＥＭ１６Ａを安定に発現するＦＲＴ上皮細胞を様々な濃度のクロフェレマーで前処理し、次いで、１μＭのイオノマイシンを添加して、ＴＭＥＭ１６Ａ Ｃｌ−電流を刺激した。電流がＴＭＥＭ１６Ａ Ｃｌ−コンダクタンスの直接的な定量的尺度となるように、測定は、経上皮Ｃｌ−勾配の存在下で行なわれた。図６Ａは、高濃度のクロフェレマーで完全に近かった、ＴＭＥＭ１６Ａ Ｃｌ−電流のクロフェレマー濃度依存的阻害を示す。図６Ｂは、約６．５μＭというＴＭＥＭ１６Ａのクロフェレマー阻害のＩＣ５０を示す。
【００９５】
全細胞膜電流をＴＭＥＭ１６Ａ発現ＦＲＴ細胞で測定した（図６Ｃ）。１００μＭのＡＴＰによる刺激によって、＋１００ｍＶで５６±１３ｐＡ／ｐＦの膜電流が生じた（ｎ＝３）。１０μＭのクロフェレマーによる前処理によって、ＡＴＰ誘導性のＴＭＥＭ１６Ａ Ｃｌ−電流が５８％阻害された（２４±６ｐＡ／ｐＦ、ｎ＝３）。図６Ｄは、ＴＭＥＭ１６Ａの外向き整流電流−電圧関係を示す。電荷のない阻害剤について予想されたように、ＴＭＥＭ１６Ａ電流−電圧関係は、クロフェレマー添加後も外向き整流性のままであった。これらの結果は、クロフェレマーの少なくとも第２の異なる管腔膜Ｃｌ−チャネル標的が存在することを示唆する。
【００９６】
実施例４
クロフェレマーは頂端カチオンチャネルおよびＣａｍｐ／カルシウムシグナリングにほとんど影響がない
腸細胞の頂端膜もＮａ＋チャネルとＫ＋チャネルを有しているが、これらもまた、クロフェレマーの潜在的な標的である。クロフェレマーが上皮細胞Ｎａ＋チャネルＥＮａＣの活性を変化させるかどうかを調べるために、ＥＮａＣを強く発現し、アミロリド後の短絡回路電流の変化がＥＮａＣ活性の定量的尺度を提供するヒト気管上皮細胞の初代培養物で短絡回路電流を測定した（Ｙａｍａｙａ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。図７Ａは、５０μＭのクロフェレマーによる細胞培養物の前処理によって、約２０％のわずかなＥＮａＣ活性阻害が生じたことを示す。ヒト気管上皮細胞もＴＭＥＭ１６Ａを発現し、強いＣａＣＣ活性を有する。クロフェレマー前処理によって、カルシウム上昇作動薬ＵＴＰの後に短絡回路電流の９０％を上回る低下が生じ、上記のＴ８４細胞およびＴＭＥＭ１６ＡをトランスフェクトしたＦＲＴ細胞での結果と一致した。
【００９７】
側底膜を、経上皮Ｋ＋勾配の存在下、アンフォテリシンＢで透過処理したヒト気管上皮細胞で、クロフェレマーによる頂端Ｋ＋チャネル阻害の可能性を検討した。これらの条件下では、測定されるわずかな電流は頂端膜Ｋ＋電流である。Ｋ＋チャネルの非特異的阻害剤であるＢａＣｌ２の添加後に頂端Ｋ＋電流を測定した。図７Ｂは、５０μＭのクロフェレマーによる前処理によって、約２２％のわずかな頂端膜Ｋ＋電流阻害が生じたことを示す。
【００９８】
頂端膜受容体に対するクロフェレマーの作用が主要な細胞内シグナル伝達経路に影響を及ぼし、それによって、側底膜輸送体の活性が二次的に調節されて、細胞外へのＣｌ−分泌が間接的に阻害される可能性を検討した。図７Ｃでは、５０μＭのクロフェレマーは、Ｔ８４細胞内の基礎的なまたはフォルスコリン刺激性のｃＡＭＰ濃度に顕著な影響を及ぼさなかった。図７Ｄでは、クロフェレマーは、基礎的な細胞質カルシウム濃度を変化させることなく、ＡＴＰ処理後のＴ８４細胞内のカルシウム濃度の上昇に影響を及ぼすこともなかった。
【００９９】
上記実施例で使用することができるいくつかの試薬およびプロトコルの例としては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：フォルスコリン、アピゲニンおよび３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）はＳｉｇｍａから購入した。８−（４−クロロフェニルチオ）−ｃＡＭＰ（ＣＰＴ−ｃＡＭＰ）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。小分子ＣＦＴＲ阻害剤のＣＦＴＲｉｎｈ−１７２およびＧｌｙＨ−１０１、ならびにＣａＣＣ阻害剤のＣａＣＣｉｎｈ−０１は、報告されている通りに合成した（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｍｕａｎｐｒａｓａｔ ｅｔ ａｌ．，２００４；ｄｅ ｌａ Ｆｕｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００８）。クロフェレマーは、Ｎａｐｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）により提供された。クロフェレマーは、サングレ・デ・グラード（Ｃ．ｌｅｃｈｌｅｒｉ）の樹液からの抽出により調製した。この樹液を冷却して、相分離を誘導した後、固体残渣を廃棄し、上清をブタノールで抽出した。クロフェレマーを含有する水性相を接線流により濾過し、イオン交換カラム上の低圧液体クロマトグラフィーにかけた。クロフェレマー濃縮画分をＳｅｐｈａｄｅｘカラム上で精製し、含水アセトンの移動相を用いてクロフェレマーを溶出させた。その後、クロフェレマーを真空下で乾燥させた。
【０１００】
クロフェレマーは、平均分子量２１００ダルトンのプロアントシアニジンオリゴマーの混合物からなっており、以前に報告された平均分子量２３００ダルトンと一致する（Ｕｂｉｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。図２Ａは、クロフェレマーの構造を示す。本研究のために使用された材料は、臨床試験で使用される材料と同じである。臨床試験では、材料は、経口投与用に放出調節錠として処方される（１錠当たり１２５または２５０ｍｇのクロフェレマー）。
【０１０１】
ヒトＣＦＴＲを発現するＦｉｓｈｅｒラット甲状腺（ＦＲＴ）細胞は、記載されている通りに作製した（Ｍａ ｅｔ ａｌ，２００２）。ヒトＴＭＥＭ１６Ａ（ｃＤＮＡは、Ｇａｓｌｉｎｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｇｅｎｏａ，ＩｔａｌｙのＬｕｉｓ Ｇａｌｉｅｔｔａ博士によって提供された）を発現するＦＲＴ細胞を同様に作製した。ＦＲＴ細胞を、１０％の胎仔ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭのグルタミン、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、３５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンおよび５００μｇ／ｍｌのジェネティシンを補充したＦ−１２改変Ｃｏｏｎ培地（Ｓｉｇｍａ）中で培養した。ヒト気管上皮細胞の初代培養物を、記載されている通りに気液界面で維持した（Ｙａｍａｙａ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。Ｔ８４細胞を１０％ＦＢＳ、１００ユニット／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２（１：１）培地中で培養した。細胞を、５％ＣＯ２／９５％大気中、３７℃にてＳｎａｐｗｅｌｌ多孔質フィルター（Ｃｏｓｔａｒ ３８０１）上で増殖させた。
【０１０２】
（ＣＦＴＲまたはＴＭＥＭ１６Ａを安定に発現する）ＦＲＴ細胞をＳｎａｐｗｅｌｌフィルター上でコンフルエンスまで培養した（経上皮抵抗 ＞５００ｏｈｍ．ｃｍ）。短絡回路電流を、側底表面を浸すリンガー溶液と頂端表面を浸す２分の１リンガー溶液とを含むＵｓｓｉｎｇチャンバー（鉛直拡散チャンバー；Ｃｏｓｔａｒ）中で測定した。リンガー溶液は以下を含んでいた：１３０ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＮａ−ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのグルコース、ｐＨ７．３。２分の１リンガー溶液は、６５ｍＭのＮａＣｌをグルコン酸Ｎａに代え、ＣａＣｌ２を２ｍＭに増加させたことを除いて、同じものであった。側底膜を、記載されている通りに２５０μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢで透過処理した（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。チャンバーを空気で絶えず泡立てた。Ｔ８４細胞および気管上皮細胞については、以下のもの（単位ｍＭ）：１２０ ＮａＣｌ、５ ＫＣｌ、１ ＭｇＣｌ２、１ ＣａＣｌ２、１０ Ｄ−グルコース、５ ＨＥＰＥＳ、および２５ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ７．４）を含む対称性ＨＣＯ３緩衝溶液に細胞を浸し、３７℃にて５％ＣＯ２で曝気した。Ｔ８４細胞内の頂端Ｋ＋コンダクタンスの測定のために、ＮａＨＣＯ３およびＮａＣｌをグルコン酸Ｎａに代え、側底溶液中のグルコン酸Ｎａをグルコン酸Ｋに代え、空気で泡立てた。側底膜を２０μＭのアンフォテリシンＢで透過処理した。ＤＶＣ−１０００電圧固定装置（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、短絡回路電流を測定した。
【０１０３】
Ｔ８４細胞を２４ウェルプレート中で増殖させ、クロフェレマーで４５分間処理し、その後、０または２０μＭのフォルスコリンで１０分間処理し、超音波処理により溶解させ、遠心分離して、細胞破片を除去し、製造元の指示（Ｐａｒａｍｅｔｅｒ（商標）ｃＡＭＰイムノアッセイキット、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、上清をｃＡＭＰについてアッセイした。
【０１０４】
ＣＦＴＲまたはＴＭＥＭ１６Ａを安定に発現するＦＲＴ細胞で全細胞記録を作成した。ＣＦＴＲ用のピペット溶液は、１４０ｍＭのＮ−メチルＤ−グルカミンクロライド（ＮＭＤＧ−Ｃ１）、５ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＴｒｉｓ−ＡＴＰおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）を含んでいた。ＴＭＥＭ１６Ａ用のピペット溶液は、１３０ｍＭのＣｓＣｌ、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＴｒｉｓ−ＡＴＰおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）を含んでいた。浴溶液は、１４０ｍＭのＮ−メチルＤ−グルカミンクロライド、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのグルコースおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を含んでいた。測定は全て室温（２２〜２５℃）で行なわれた。ピペットをホウケイ酸ガラスから引いた。先端熱加工（ｆｉｒｅ ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）した後、ピペットは、３〜５Ｍｏｈｍの抵抗を有していた。シール抵抗は３〜１０Ｇｏｈｍであった。全細胞コンフィグレーションを確立した後、ＣＦＴＲをフォルスコリンおよびＩＢＭＸにより活性化し、ＴＭＥＭ１６ＡをＡＴＰにより活性化した。０ｍＶの保持電位から−１００ｍＶ〜＋１００ｍＶの電圧まで２０ｍＶずつ過分極電圧パルスおよび脱分極電圧パルスをかけることによって、全細胞電流を誘発した。電流出力に５ｋＨｚでフィルターをかけた。電流をデジタル化し、ＡｘｏＳｃｏｐｅ １０．０システムおよびＤｉｇｉｄａｔａ １４４０Ａ ＡＣ／ＤＣ変換器を用いて解析した。
【０１０５】
２μＭのｆｕｒａ−２−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）とともに３７℃で３０分間インキュベートして細胞にｆｕｒａ−２を取り込ませることによって、Ｔ８４細胞のコンフルエントな単層における［Ｃａ２＋］ｉの測定を行なった。ｆｕｒａ−２を取り込んだＴ８４細胞を倒立蛍光顕微鏡のステージ上の灌流チャンバーに入れた。細胞に以下のもの（単位ｍＭ）：１４０ ＮａＣｌ、５ ＫＣｌ、１ ＭｇＣｌ２、１ ＣａＣｌ２、１０ Ｄ−グルコースおよび１０ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を表面灌流した。ｆｕｒａ−２蛍光を励起波長３４０ｎｍおよび３８０ｎｍで記録し、結果を３４０／３８０蛍光比として表した。ベースライン測定結果を得た後、１００μＭのＡＴＰを灌流液中に添加した。５０μＭのクロフェレマーの非存在下および存在下で測定を行なった。
【０１０６】
実施例５
ヒト患者の下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、およびクローン病の症状を軽減する方法
下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、またはクローン病に罹患しているヒト患者を特定する。ある投薬量、例えば、４ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回経口投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１０７】
実施例６
ヒト患者のＡＩＤＳ関連下痢の症状を軽減する方法
ＡＩＤＳ関連下痢に罹患しているヒト患者を特定する。ある投薬量、例えば、４ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回経口投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１０８】
実施例７
ヒト患者の過敏性腸症候群の症状を軽減する方法
過敏性腸症候群に罹患しているヒト患者を特定する。ある投薬量、例えば、４ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回経口投与する。投薬量は、異常な便重量、排泄頻度、および／または疼痛を低下させるのに有効である程度に調整することができる。無痛の日数が増えたら、治療は成功であると考えられる。
【０１０９】
実施例８
ヒト患者のコレラの症状を軽減する方法
コレラに罹患しているヒト患者を特定する。さらに、ある投薬量、例えば、４ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回経口投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１１０】
実施例９
抗生物質とクロフェレマーの組合せを用いてヒト患者のコレラの症状を軽減する方法
コレラに罹患しているヒト患者を特定する。有効用量のアジスロマイシンを患者に投与する。さらに、ある投薬量、例えば、４ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回経口投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１１１】
実施例１０
補水療法とクロフェレマーの組合せを用いてヒト患者のコレラの症状を軽減する方法
コレラに罹患しているヒト患者を特定する。一定の比率の水、塩、および糖を含有する経口補水塩（ＯＲＳ）溶液を患者に投与する。ある投薬量、例えば、４ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回経口投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１１２】
実施例１１
クロフェレマーの静脈内投与によってヒト患者の下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、およびクローン病の症状を軽減する方法
下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、またはクローン病に罹患しているヒト患者を特定する。ある投薬量、例えば、４ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に静脈内投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１１３】
実施例１２
クロフェレマーおよびチアゾリジノンの投与によってヒト患者の下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、およびクローン病の症状を軽減する方法
下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、またはクローン病に罹患しているヒト患者を特定する。有効量のチアゾリジノンと組み合わせた、ある投薬量、例えば、４ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に静脈内投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１１４】
実施例１３
クロフェレマーおよびグリシンヒドラジドの投与によってヒト患者の下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、およびクローン病の症状を軽減する方法
下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、またはクローン病に罹患しているヒト患者を特定する。有効量のグリシンヒドラジドと組み合わせた、ある投薬量、例えば、４ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に静脈内投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１１５】
実施例１４
ヒト患者の下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、およびクローン病の症状を軽減する方法
下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、またはクローン病に罹患しているヒト患者を特定する。ある投薬量、例えば、７ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回経口投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１１６】
実施例１５
ヒト患者のＡＩＤＳ関連下痢の症状を軽減する方法
ＡＩＤＳ関連下痢に罹患しているヒト患者を特定する。ある投薬量、例えば、７ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回経口投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１１７】
実施例１６
ヒト患者の過敏性腸症候群を軽減する方法
過敏性腸症候群に罹患しているヒト患者を特定する。ある投薬量、例えば、７ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回経口投与する。投薬量は、異常な便重量、排泄頻度、および／または疼痛を低下させるのに有効である程度に調整することができる。無痛の日数が増えたら、治療は成功であると考えられる。
【０１１８】
実施例１７
ヒト患者のコレラの症状を軽減する方法
コレラに罹患しているヒト患者を特定する。さらに、ある投薬量、例えば、７ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回経口投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１１９】
実施例１８
抗生物質とクロフェレマーの組合せを用いてヒト患者のコレラの症状を軽減する方法
コレラに罹患しているヒト患者を特定する。有効用量のアジスロマイシンを患者に投与する。さらに、ある投薬量、例えば、７ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回経口投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１２０】
実施例１９
補水療法とクロフェレマーの組合せを用いてヒト患者のコレラの症状を軽減する方法
コレラに罹患しているヒト患者を特定する。一定の比率の水、塩、および糖を含有する経口補水塩（ＯＲＳ）溶液を患者に投与する。ある投薬量、例えば、７ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回経口投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１２１】
実施例２０
クロフェレマーの静脈内投与によってヒト患者の下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、およびクローン病の症状を軽減する方法
下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、またはクローン病に罹患しているヒト患者を特定する。ある投薬量、例えば、７ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に静脈内投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１２２】
実施例２１
クロフェレマーおよびチアゾリジノンの投与によってヒト患者の下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、およびクローン病の症状を軽減する方法
下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、またはクローン病に罹患しているヒト患者を特定する。有効量のチアゾリジノンと組み合わせた、ある投薬量、例えば、７ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に静脈内投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１２３】
実施例２２
クロフェレマーおよびグリシンヒドラジドの投与によってヒト患者の下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、およびクローン病の症状を軽減する方法
下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、またはクローン病に罹患しているヒト患者を特定する。有効量のグリシンヒドラジドと組み合わせた、ある投薬量、例えば、７ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に静脈内投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１２４】
実施例２３
ヒト患者のコレラの症状を軽減する方法
コレラに罹患しているヒト患者を特定する。さらに、ある投薬量、例えば、４ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回静脈内投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１２５】
実施例２４
ヒト患者のコレラの症状を軽減する方法
コレラに罹患しているヒト患者を特定する。さらに、ある投薬量、例えば、７ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回経口投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づいて、２００９年１０月６日に出願された米国特許仮出願第６１／２４９，２３６号に対する優先権を主張するものであり、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本実施形態は、クロフェレマーなどのプロアントシアニジンオリゴマーの投与を含む疾患の治療方法に関する。いくつかの実施形態は、胃腸障害および他のＣｌ−チャネル関連疾患の治療に関する。いくつかの実施形態は、炎症性疾患の治療に関する。他の実施形態は、癌の治療に関する。いくつかの実施形態は、Ｃｌ−チャネルの阻害を通じて分泌性下痢を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
炎症性疾患、癌および細菌関連疾患は、効果的に治療することが依然として極めて困難である。例えば、分泌性下痢は、発展途上国および先進国における世界的規模の健康課題であり続けている。分泌性下痢は、重篤で、生命を脅かすこともある脱水症をもたらす腸管からの体液と電解質の両方の喪失を特徴とする。分泌性下痢は、種々の細菌性、ウイルス性、および原生動物性病原体と関連があり、また、潰瘍性大腸炎、炎症性腸症候群、ならびに胃腸管の癌および新生物形成などの、他の非感染性の原因に起因することもある。
【０００４】
南米の薬用植物、サングレ・デ・グラード（Ｃｒｏｔｏｎ ｌｅｃｈｌｅｒｉ）（ドラゴンブラッド）の樹液は、赤痢およびコレラを含む下痢、ならびに様々な肺の病気、胃の病気および他の病気を治療するためにエクアドルやペルーで長年用いられている（Ｕｌｉｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｊｏｎｅｓ，２００３；Ｒｉｓｃｏ ｅｔ ａｌ，２００３；Ｒｏｓｓｉｅ ｅｔ ａｌ．，２００３）。クロフェレマーは、サングレ・デ・グラードの血のように赤い樹液から精製される。クロフェレマーは、平均分子量２１００ダルトンの様々な鎖長のオリゴマー性プロアントシアニジンからなる暗赤褐色の非晶質粉末である。クロフェレマーは、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、および質量分析法によって特徴付けられ、図２Ａに示す構造が得られている（Ｕｂｉｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。クロフェレマーのポリマー鎖は、３〜３０単位の範囲であり、モノマー成分は、（＋）−カテキン、（−）−エピカテキン、（＋）−ガロカテキン、および（−）−エピガロカテキンである。薬理学的研究により、クロフェレマーは、細胞培養物およびマウスモデルで体液分泌を減少させることが示されている（Ｇａｂｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
いくつかの実施形態は、Ｃｌ−分泌を調節する方法であって、カルシウム活性化クロライドチャネル（ＣａＣＣ）を発現する細胞を有効量のクロフェレマーと接触させることを含む、方法に関する。
【０００６】
いくつかの実施形態では、ＣａＣＣはＴＭＥＭ１６Ａである。
【０００７】
いくつかの実施形態は、Ｃｌ−分泌を調節する方法であって、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）を発現する細胞を有効量のクロフェレマーと接触させることを含む、方法に関する。
【０００８】
いくつかの実施形態は、Ｎａ＋分泌を調節する方法であって、Ｎａ＋チャネルを発現する細胞を有効量のクロフェレマーと接触させることを含む、方法に関する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、Ｎａ＋チャネルは上皮ナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）である。
【００１０】
いくつかの実施形態は、少なくとも１つの胃腸障害を治療する方法であって、有効量のクロフェレマーを用いてＣａＣＣ活性を阻害することを含む、方法に関する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、胃腸障害は、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群、および過敏性腸症候群、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、または交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群と関連する腹部不快感であることができる。
【００１２】
いくつかの実施形態では、胃腸障害は分泌性下痢である。
【００１３】
いくつかの実施形態では、胃腸障害は過敏性腸症候群である。
【００１４】
いくつかの実施形態は、少なくとも１つの胃腸障害を治療するための方法であって、有効量のクロフェレマーを用いてＣＦＴＲ活性を阻害することを含む、方法に関する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、胃腸障害は、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群、および過敏性腸症候群、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、または交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群と関連する腹部不快感であることができる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、胃腸障害は分泌性下痢である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、胃腸障害は過敏性腸症候群である。
【００１８】
いくつかの実施形態は、少なくとも１つのチャネル病を治療する方法であって、有効量のクロフェレマーを用いてＣａＣＣ活性を阻害することを含む、方法に関する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、チャネル病は、嚢胞性線維症、肢端紅痛症、高カリウム血性周期性四肢麻痺、低カリウム血性周期性四肢麻痺、ＱＴ延長症候群、ＱＴ短縮症候群、悪性高体温症、先天性筋緊張症、および神経性筋強直症であることができる。
【００２０】
いくつかの実施形態は、少なくとも１つのチャネル病を治療する方法であって、有効量のクロフェレマーを用いてＣＦＴＲ活性を阻害することを含む、方法に関する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、チャネル病は、嚢胞性線維症、肢端紅痛症、高カリウム血性周期性四肢麻痺、低カリウム血性周期性四肢麻痺、ＱＴ延長症候群、ＱＴ短縮症候群、悪性高体温症、先天性筋緊張症、および神経性筋強直症からなる群から選択される。
【００２２】
いくつかの実施形態は、患者の少なくとも１つの胃腸障害を治療する方法であって、有効量のクロフェレマーを患者に投与することを含む、方法に関する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、胃腸障害は、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群、および過敏性腸症候群、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、または交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群と関連する腹部不快感であることができる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、胃腸障害は分泌性下痢である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、胃腸障害は過敏性腸症候群である。
【００２６】
いくつかの実施形態は、少なくとも１つの癌を治療するための方法であって、有効量のクロフェレマーを患者に投与することを含む、方法に関する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、癌は、扁平上皮細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、および肺扁平上皮癌を含む）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌または腹部癌（胃腸癌を含む）、膵癌、膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌および様々なタイプの頭頸部癌、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非開裂細胞性ＮＨＬ；巨大病変性ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症と関連する異常な血管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍と関連する浮腫）、およびメーグス症候群であることができる。
【００２８】
いくつかの実施形態では、癌は結腸癌である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、癌は結腸直腸癌である。
【００３０】
いくつかの実施形態は、少なくとも１つの炎症性疾患を治療するための方法であって、有効量のクロフェレマーを患者に投与することを含む、方法に関する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、炎症性疾患は、クローン病または過敏性腸症候群であることができる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、炎症性疾患は過敏性腸症候群である。
【００３３】
いくつかの実施形態は、少なくとも１つの胃腸障害を治療する方法であって、有効量のクロフェレマーを用いてＥＮａＣ活性を阻害することを含む、方法に関する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、胃腸障害は、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群、および過敏性腸症候群、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、または交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群と関連する腹部不快感であることができる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、胃腸障害は分泌性下痢である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、胃腸障害は過敏性腸症候群である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】腸細胞の頂端膜クロライドチャネルを通したクロライドと腸液の分泌を示す。
【図２】図２Ａは、プロアントシアニジンオリゴマーの混合物からなるクロフェレマーの化学構造を示す。図２Ｂは、クロフェレマーが、ｃＡＭＰおよびカルシウム上昇作動薬に応答したＴ８４ヒト腸細胞でＣｌ−分泌を低下させることを示すグラフを示す。図２Ｂはまた、フォルスコリン（１０μＭ）、ＡＴＰ（１００μＭ）またはタプシガルギン（１μＭ）によるＣｌ−分泌の活性化後のＴ８４細胞の短絡回路電流を示す。表示した濃度のクロフェレマーを管腔浴溶液に添加した。表示した点で、細胞を２０μＭのＣＦＴＲｉｎｈ−１７２で前処理し、ＣＦＴＲ Ｃｌ−電流を阻害した。
【図３】ＣＦＴＲ Ｃｌ−コンダクタンスのクロフェレマー阻害を示すグラフを示す。図３Ａは、アンフォテリシンＢによる透過処理の後、経上皮Ｃｌ−勾配（頂端［Ｃｌ−］７５ｍＭ、側底［Ｃｌ−］１５０ｍＭ）の存在下でのＣＦＴＲ発現ＦＲＴ細胞の頂端膜電流を示す。ＣＦＴＲ Ｃｌ−コンダクタンスは、１００μＭのＣＰＴ−ｃＡＭＰと、それに次ぐ管腔溶液への表示した濃度のクロフェレマーの添加によって活性化された。図３Ｂは、クロフェレマー適用の２０分後に測定されたクロフェレマー濃度−ＣＦＴＲ Ｃｌ−電流の阻害を示す（Ｓ．Ｅ．ｎ＝３〜５）。Ａと同様の実験（白丸）およびＣｌ−勾配を逆転させた実験（頂端［Ｃｌ−］１５０ｍＭ、側底［Ｃｌ−］７５ｍＭ）（黒丸）についてのデータを示す。
【図４】クロフェレマーによるＣＦＴＲ Ｃｌ−コンダクタンスの阻害を特徴付けるグラフを示す。図４Ａは、ゲニステイン（５０μＭ）、フォルスコリン（２０μＭ）およびＩＢＭＸ（１００μＭ）を含む様々な作動薬の後のＣＦＴＲのクロフェレマー阻害を示す。図４Ｂは、ＣＦＴＲのクロフェレマー阻害の緩徐な可逆性を示す。表示した点で、クロフェレマーを添加し、頂端溶液を徹底的に洗浄し、ＣＰＴ−ｃＡＭＰを再び添加した。図４Ｃは、クロフェレマー前処理の非存在下または存在下での、小分子ＣＦＴＲ阻害剤ＣＦＴＲｉｎｈ−１７２またはＧｌｙＨ−１０１によるＣＦＴＲの阻害を示す。（左）ＣＰＴ−ｃＡＭＰによるＣＦＴＲ活性化およびＣＦＴＲｉｎｈ−１７２またはＧｌｙＨ−１０１による阻害後の頂端膜電流。（右）クロフェレマー（５０μＭ）を添加して、ＣＦＴＲ Ｃｌ−電流を約５０〜６０％阻害し、その後、表示した濃度のＣＦＴＲｉｎｈ−１７２またはＧｌｙＨ−１０１を添加した。
【図５】ＣＦＴＲのクロフェレマー阻害のパッチクランプ解析の結果を示すグラフを示す。（左）０ｍＶの保持電位で、および５０μＭのクロフェレマーの非存在下および存在下、±１００ｍＶの電圧まで２０ｍＶずつパルスをかけたときに記録した全細胞ＣＦＴＲ電流。ＣＦＴＲはフォルスコリンによって刺激された。（右）Ａと同様の実験からの各電圧パルスの中間での平均電流の電流／電圧（Ｉ／Ｖ）プロット（Ｓ．Ｅ．、ｎ＝３）。フィッティングされたＩＣ５０は６．５μＭである。
【図６】カルシウム活性化Ｃｌ−チャネルのクロフェレマー阻害を示すグラフを示す。図６Ａは、経上皮Ｃｌ−勾配（頂端［Ｃｌ−］７０ｍＭ、側底［Ｃｌ−］１４０ｍＭ）の存在下におけるＴＭＥＭ１６Ａ発現ＦＲＴ細胞の頂端膜電流を示す。図６Ｂは、ＴＭＥＭ１６Ａ Ｃｌ−電流阻害のクロフェレマー濃度依存性を示す。図６Ｃは、０ｍＶの保持電位で、および１０μＭのクロフェレマーの非存在下および存在下、±１００ｍＶの電圧まで２０ｍＶずつパルスをかけたときに記録した全細胞ＴＭＥＭ１６Ａ電流を示す。ＴＭＥＭ１６Ａは１００μＭのＡＴＰによって刺激された。図６Ｄは、（各電圧パルスの中間での）平均電流の電流／電圧（Ｉ／Ｖ）プロットを示す。
【図７】クロフェレマーが、頂端膜カチオンチャネルならびに細胞内ｃＡＭＰおよびカルシウムシグナリングに対してほとんどまたは全く効果がないことを示すグラフを示す。図７Ａ（左）は、管腔溶液中、５０μＭのクロフェレマーで前処理していないＣＦＴＲ欠損ヒト気管支上皮細胞の初代培養物と５０μＭのクロフェレマーで前処理したＣＦＴＲ欠損ヒト気管支上皮細胞の初代培養物の短絡回路電流を示す。表示した点で、アミロリド（１０μＭ）およびＵＴＰ（１００μＭ）を添加した。図７Ａ（右）は、アミロリドおよびＵＴＰ添加後の短絡回路電流の差をまとめたものである（Ｓ．Ｅ．、ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５）。図７Ｂは、２０μＭのアンフォテリシンＢによる側底膜透過処理後、Ｋ＋勾配（頂端［Ｋ＋］５ｍＭ、側底［Ｋ＋］１５０ｍＭ）の存在下でのヒト気管支上皮細胞の頂端膜Ｋ＋電流を示す。図７Ｃは、基礎条件下、２０μＭのフォルスコリンによる処理の１０分後のＴ８４細胞ホモジネート中の環状ＡＭＰレベルを示す。クロフェレマーありとクロフェレマーなしで有意差はない。図７Ｄは、基礎条件下、ＡＴＰ（１００μＭ）の後にＴ８４細胞でｆｕｒａ−２蛍光によって測定されたカルシウムシグナリングを示す。表示した点で、細胞を５０μＭのクロフェレマーで前処理した。差し込み図は、ピークＡＴＰによるｆｕｒａ−２蛍光比の増加をまとめたものである（Ｓ．Ｅ．、ｎ＝４）。対照とクロフェレマーの間に有意差はない。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本実施形態は、例えば、炎症性疾患、腫瘍性疾患、細菌関連疾患、ウイルス関連疾患、チャネル病、胃腸障害および不妊症をはじめとする、多種多様な疾患、医学的状態および障害の治療に関する。チャネル病の例としては、嚢胞性線維症、肢端紅痛症、高カリウム血性周期性四肢麻痺、低カリウム血性周期性四肢麻痺、ＱＴ延長症候群、ＱＴ短縮症候群、悪性高体温症、先天性筋緊張症、および神経性筋強直症が挙げられるが、これらに限定されない。癌の例としては、骨癌、肺癌、皮膚癌、結腸直腸癌、家族性腺腫性ポリポーシスおよび網膜芽細胞腫が挙げられるが、これらに限定されない。胃腸障害の例としては、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群および上記の胃腸障害のいずれかと関連する腹部不快感が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
本実施形態はまた、限定するものではないが、悪液質、心血管疾患、免疫疾患、結核性胸膜炎、リウマチ性胸膜炎、癌またはその治療と関連する疲労、心血管疾患、皮膚の発赤、糖尿病、移植片拒絶、中耳炎（内耳感染）、副鼻腔炎およびウイルス感染、敗血性ショック、移植、移植片対宿主疾患、虚血／再灌流傷害、グレーブス眼症、橋本甲状腺炎、甲状腺関連眼症、結節性甲状腺腫、疱疹性間質角膜炎、細菌性角膜炎、周辺潰瘍性角膜炎、ベーチェット病、ブドウ膜炎、増殖性硝子体網膜症、狂犬病ウイルス性眼疾患、フォークト・コヤナギ・ハラダ病、網膜症、網膜レーザー光凝固、急性網膜壊死症候群、全身性脈管炎、再発性アフタ性口内炎、血管新生緑内障、眼感染症、眼アレルギー性疾患、網膜剥離、視神経炎、多発性硬化症、全身性硬化症、遺伝性網膜変性、トラコーマ、自己免疫疾患、化学療法関連粘膜損傷、抑鬱障害（大鬱病性障害、気分変調、小児期の鬱病、非定型鬱病、双極性障害、躁病および軽躁病）および不安障害（全般性不安障害、社会不安障害、恐怖症、強迫障害、パニック障害、心的外傷後ストレス障害）をはじめとする情動障害；月経前不快気分障害（月経前症候群としても知られる）；精神病性障害、例えば、短期精神病性障害、統合失調症、精神性感情障害（鬱病および／または躁病）；注意力欠如障害（多動を伴うものおよび伴わないもの）；肥満、摂食障害、例えば、神経性無食欲症および神経性大食症；血管運動性フラッシング；コカインおよびアルコール中毒、性的不全および関連疾患；線維筋痛、関節炎、慢性腰痛、三叉神経痛などの急性および慢性疼痛症候群；内臓痛症候群、例えば、過敏性腸症候群、非心臓性胸痛、機能性消化不良、間質性膀胱炎、本態性外陰痛、尿道症候群、睾丸痛、顎関節症、非定型顔面痛、偏頭痛、および緊張性頭痛；機能性身体障害、例えば、慢性疲労症候群；発作性障害、トゥレット・シンドローム、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、皮質下認知症および他の認知症、遅発性ジスキネジア、多発性硬化症、レット症候群または筋萎縮性側索硬化症をはじめとする神経障害、再狭窄、喘息、慢性閉塞性肺疾患、異常な血管形成、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ性悪性疾患を含む、疾患の治療に関する。癌の他の例としては、扁平上皮細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、および肺扁平上皮癌を含む）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌または腹部癌（胃腸癌を含む）、膵癌、膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌および様々なタイプの頭頸部癌、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非開裂細胞性ＮＨＬ；巨大病変性ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症と関連する異常な血管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍と関連する浮腫）、およびメーグス症候群が挙げられる。いくつかの実施形態は、分泌性下痢、過敏性腸症候群および結腸癌の治療に関する。
【００４０】
分泌性下痢は、重篤で、生命を脅かすこともある脱水症をもたらす腸管からの体液と電解質の両方の喪失によって特徴付けることができる。分泌性下痢は、種々の細菌性、ウイルス性、および原生動物性病原体と関連があり、また、潰瘍性大腸炎、炎症性腸症候群、ならびに胃腸管の癌および新生物形成などの、他の非感染性の原因に起因することもある。
【００４１】
分泌性下痢の２つの主な細菌源は、コレラ菌と大腸菌である。腸管毒素原性大腸菌は、発展途上国における分泌性下痢の重要な発生源であり、分泌性下痢と関連がある。下痢を引き起こす他の大腸菌株としては、腸管出血性株、腸管侵入性株、および腸管病原性株ならびに他の株が挙げられる。分泌性下痢と関連がある他の細菌性病原体としては、他のビブリオ属の種、カンピロバクター属の種、サルモネラ属の種、アエロモナス属の種、プレシモナス属の種、赤痢菌属の種、クレブシエラ属の種、シトロバクター属の種、エルシニア属の種、クロストリジウム属の種、バクテロイデス属の種、ブドウ球菌属の種、およびバチルス属の種、ならびに他の腸内細菌が挙げられる。
【００４２】
分泌性下痢は、クリプトスポリジウム属の種、例えば、クリプトスポリジウム・パルバムなどの原生動物性病原体と関連があることもある。一般に、Ｈｏｌｌａｎｄ，１９９０，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．３：３４５；Ｈａｒｒｉｓ，１９８８，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．１８：１０２；Ｇｒａｃｅｙ，１９８６，Ｃｌｉｎ，ｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．，１５：２１；Ｏｏｍｓ ａｎｄ Ｄｅｇｒｙｓｅ，１９８６，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１０：３５５；Ｂｌａｃｋ，１９８２，Ｍｅｄ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒ．Ａｍ．，６６：６１１を参照されたい。
【００４３】
分泌性下痢は、ウイルス感染と関連があることもあり、これには、特に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ならびにロタウイルス感染に付随して起こる下痢などがある。ほとんど全てのＡＩＤＳ患者は、疾患の経過中のどこかの時点で下痢に罹患し、ＡＩＤＳ患者の３０％は、慢性の下痢に罹患する。ＡＩＤＳに付随して起こる下痢は、「ＨＩＶ関連慢性下痢」と命名されている。ＨＩＶ疾患のこの下痢成分は、原生動物性病原体、例えば、クリプトスポリジウム属の種の二次感染と関連があり、少なくとも一部の患者では、これによるものと考えられている。さらに、ロタウイルス感染は、例えば、発展途上国における幼児および小児の下痢と関連がある。
【００４４】
分泌性下痢は、非ヒト動物、例えば、家畜、例えば、ウシ属の動物、イノシシ科の動物、ヒツジ（ヒツジ科の動物）、家禽（例えば、ニワトリ）、およびウマ科の動物、ならびに他の飼育動物、例えば、イヌ科の動物およびネコ科の動物でも問題である。下痢性疾患は、若い、離乳したばかりの家畜に見られる。家畜、例えば、ウシ、ヒツジおよびブタなどの食用動物の下痢性疾患は、腸管毒素原性大腸菌、腸管出血性大腸菌および他の大腸菌、サルモネラ属の種、ウェルシュ菌、バクテロイデス・フラギリス、カンピロバクター属の種、およびエルシニア・エンテロコリチカなどの、細菌性病原体と関連があることが多い。さらに、原生動物性病原体（例えば、クリプトスポリジウム・パルバム）、ならびにウイルス性病原体（例えば、ロタウイルスおよびコロナウイルス）は、家畜の下痢と関連がある。家畜の下痢の原因とされている他のウイルス性病原体の例としては、トガウイルス、パルボウイルス、カリシウイルス、アデノウイルス、ブレダウイルス、およびアストロウイルスが挙げられる。一般には、Ｈｏｌｌａｎｄ，１９９０，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖ．３：３４５を参照されたく、Ｇｕｔｚｗｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｂｌｕｍ，１９９６，ＡＪＶＲ ５７：５６０；Ｓｔｒｏｍｂｅｃｋ，１９９５，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ １７（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ１２；Ｖｅｒｍｕｎｔ，１９９４，Ａｕｓｔｒａｌ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｊ．７１：３３；Ｄｒｉｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ａｕｓｔｒａｌ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｊ．７０：２５９；Ｍｏｕｒｉｃｏｕｔ，１９９１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．７：５８８；Ｏｏｍｓ ａｎｄ Ｄｅｇｒｙｓｅ，１９８６，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１０：３５５も参照されたい。
【００４５】
様々な原因の分泌性下痢障害は、過剰なＣｌ−分泌という共通の特徴を共有する。腸液分泌は、側底膜表面のＮａ＋／Ｋ＋／２Ｃｌ−共輸送体から腸細胞へのＣｌ−流入、および頂端の（管腔に面する）Ｃｌ−チャネルからのＣｌ−流出を伴う（Ｂａｒｒｅｔｔ ａｎｄ Ｋｅｅｌｙ，２０００；Ｆｉｅｌｄ，２００３；Ｔｈｉａｇａｒａｊａｈ ａｎｄ Ｖｅｒｋｍａｎ，２００５）（図１）。特定の理論に束縛されることを望まないが、Ｋ＋チャネルおよび３Ｎａ＋／２Ｋ＋ポンプは、Ｃｌ−分泌のための電気化学的な駆動力を確立する。Ｎａ＋と水の分泌は、活発なＣｌ−分泌に応答して受動的に起こる。細菌腸毒素、例えば、コレラ菌や大腸菌によって産生される腸毒素は、腸細胞内の環状ヌクレオチド濃度を上昇させ、Ｃｌ−チャネル活性化や体液分泌を生じさせる。頂端膜Ｎａ＋チャネルおよび起電性Ｎａ＋共役共輸送体からのＮａ＋吸収は、正味の体液分泌に対抗する。正味の腸液分泌の速度、したがって、分泌性下痢の重症度は、これらの輸送システムのモジュレーターおよび上流の環状ヌクレオチドまたはカルシウムシグナリング経路と関連する。
【００４６】
いくつかの実施形態は、クロフェレマーの細胞内抗分泌標的に関する。いくつかの実施形態は、例えば、イオンチャネルおよびシグナル伝達経路をはじめとする、腸液分泌の一次的な管腔膜決定因子に関する。いくつかの実施形態は、カチオンチャネルまたはｃＡＭＰ／カルシウムシグナリングにほとんど影響を与えずに、頂端膜ｃＡＭＰ刺激性Ｃｌ−チャネル（ＣＦＴＲ）およびカルシウム刺激性Ｃｌ−チャネル（ＣａＣＣ）を阻害するためのクロフェレマーの使用に関する。いくつかの実施形態では、クロフェレマーは、その配列および構造に関連性がない２つの異なるＣｌ−チャネルを阻害する。特定の理論に束縛されることを望まないが、その排出の遅さに加えて、Ｃｌ−チャネルを阻害するクロフェレマーの能力は、細菌腸毒素、ウイルスおよび他のエフェクターと関連がある下痢においてその幅広い抗分泌活性をもたらすように思われる。いくつかの実施形態では、ＣＦＴＲとＣａＣＣの両方の阻害は、腸細胞内でｃＡＭＰ／カルシウムのクロストークがあり、かつ一部の下痢では２種類のＣｌ−チャネルが関与するため、有用である。
【００４７】
いくつかの実施形態は、阻害率が濃度依存的で、数分間にわたる、ＣＦＴＲ Ｃｌ−コンダクタンスの部分的拮抗薬としてのクロフェレマーの使用に関する。クロフェレマーの排出は緩徐であり、数時間かけて起こる。チアゾリジノンおよびグリシンヒドラジド系ＣＦＴＲ阻害剤とは異なり、ＣＦＴＲ Ｃｌ−コンダクタンスのクロフェレマー阻害は、高濃度であっても部分的である。いくつかの実施形態は、クロフェレマー分子および／または部分阻害と関連する本質的に非効率的なアロステリック阻害機構による外からの部分的なＣＦＴＲ孔遮断に関する。一実施形態では、パッチクランプ解析を用いて、直接的な孔閉鎖を伴わずに電位非依存性チャネル阻害を生じさせる、細胞外に面するＣＦＴＲ表面に対するクロフェレマーの作用を明らかにした。対照的に、グリシンヒドラジド群のＣＦＴＲ阻害剤は、残存するＣＦＴＲ Ｃｌ−電流の内向き整流、および膜電流の素速い揺らぎによる直接的な孔閉鎖を伴って、電位依存的な遮断を生じさせた（Ｍｕａｎｐｒａｓａｔ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｓｏｎａｗａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００６，２００７，２００８）。図４ＣおよびＤに見られるクロフェレマーおよびＧｌｙＨ−１０１作用の独立性は、ＧｌｙＨ−１０１の作用と異なる部位でのＣＦＴＲ孔を閉鎖するクロフェレマー作用と合致する。ＧｌｙＨ−１０１と比べたクロフェレマーのより大きな分子サイズは、ＣＦＴＲ孔の外側の部位でのクロフェレマー作用と合致する。先の研究（Ｇａｂｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９）では、大きいＣｌ−勾配の存在下でのＴ８４細胞におけるクロフェレマーによるＣＦＴＲ阻害の証拠が示されている。
【００４８】
いくつかの実施形態では、クロフェレマーは、ＣａＣＣを強く阻害する。腸上皮細胞内のＣａＣＣは、いくつかの抗レトロウイルス薬および化学療法薬をはじめとする特定の薬物、ならびにいくつかのウイルスと関連がある分泌性下痢におけるＣｌ−および体液分泌の重要な経路を提供する（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｂａｒｒｅｔｔ，２０００；Ｋｉｄｄ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎ，２０００；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２０００；Ｇｙｏｍｏｒｅｙ ｅｔ ａｌ．２００１；Ｒｕｆｏ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｔｈｉａｇａｒａｊａｈ ａｎｄ Ｖｅｒｋｍａｎ，２００５；Ｓｃｈｕｌｔｈｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．２００５，２００６；Ｆａｒｔｈｉｎｇ，２００６；Ｌｏｒｒｏｔ ａｎｄ Ｖａｓｓｅｕｒ，２００７）。
【００４９】
腸上皮細胞でのその発現に加えて、ＣａＣＣは多くの細胞型で広く発現している。それらの細胞型において、ＣａＣＣは、限定するものではないが、経上皮体液分泌、嗅覚シグナルおよび感覚シグナルの伝達、平滑筋収縮、ならびに心臓興奮をはじめとする、様々な機能に関与している（Ｈａｒｔｚｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｖｅｒｋｍａｎ ａｎｄ Ｇａｌｉｅｔｔａ，２００９）。ＣａＣＣの分子実体は、ＴＭＥＭ１６Ａ（アノクタミン−１）がＣａＣＣであるという発見によって明白になった（Ｃａｐｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）。いくつかの証拠から、ＴＭＥＭ１６ＡがＣａＣＣであるという結論が支持されている。例えば、ＴＭＥＭ１６Ａをトランスフェクトした細胞におけるＣａＣＣ Ｃｌ−電流は、ネイティブなＣａＣＣと電気生理学的な特徴が類似していることや、ＴＭＥＭ１６ＡのＲＮＡｉノックダウン後に、ＣａＣＣ Ｃｌ−電流が低下することが示されている。ＴＭＥＭ１６Ａは、例えば、腸上皮をはじめとする、複数の器官の上皮および他の細胞型で広く発現されている。
【００５０】
いくつかの実施形態では、クロフェレマーを用いて、ヒトＴＭＥＭ１６Ａを阻害する。特定の理論に束縛されることを望まないが、クロフェレマーによるＴＭＥＭ１６Ａの阻害は、カルシウム上昇作動薬の添加後のＴ８４細胞におけるＣｌ−電流の阻害と関連がある。いくつかの実施形態では、クロフェレマーは、＞９０％の最大阻害、６．５μＭのＩＣ５０、および電位非依存的な阻害機序で、腸のカルシウム活性化Ｃｌ−チャネルであるＴＭＥＭ１６Ａを強く阻害することが分かった。ＣａＣＣは、腸上皮細胞でのその発現に加えて、多くの細胞型で広く発現しており、いくつかの実施形態では、クロフェレマーのＣａＣＣに対する阻害効果を利用して、多種多様な用途でＣｌ−の流入および流出を調節することができ、その場合、ＣａＣＣは、限定するものではないが、経上皮体液分泌、嗅覚シグナルおよび感覚シグナルの伝達、平滑筋収縮、ならびに心臓興奮をはじめとする、様々な機能に関与する（Ｈａｒｔｚｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｖｅｒｋｍａｎ ａｎｄ Ｇａｌｉｅｔｔａ，２００９）。
【００５１】
いくつかの実施形態では、クロフェレマーの細胞内抗分泌作用は、腸の内側を覆う上皮細胞の管腔膜表面の２つの異なるＣｌ−チャネル標的に影響を与え、ＣＦＴＲとＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの二重阻害をもたらす。
【００５２】
いくつかの実施形態は、膜Ｃｌ−チャネル、嚢胞性線維症膜貫通制御因子コンダクタンス（ＣＦＴＲ）、ｃＡＭＰ刺激性Ｃｌ−チャネル、およびカルシウム活性化Ｃｌ−チャネル（ＣａＣＣ）の標的阻害剤に関する。いくつかの実施形態では、ハイスループットスクリーニングおよびフォローアップ化学実験により、これらのＣｌ−チャネルの阻害剤、例えば、ナノモル効力のチアゾリジノン系ＣＦＴＲ阻害剤（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，２００２）およびグリシンヒドラジド系ＣＦＴＲ阻害剤（Ｍｕａｎｐｒａｓａｔ ｅｔ ａｌ．，２００４）、ならびに３−アシル−２−アミノチオフェン系ＣａＣＣ阻害剤（ｄｅ ｌａ Ｆｕｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００８）を同定することができる。環状ヌクレオチド濃度および毒素誘発性腸液分泌を低下させるホスホジエステラーゼのチオフェンカルボキシレートアクチベーターも同定されている（Ｔｒａｄｔｒａｎｔｉｐ ｅｔ ａｌ．，２００８）。
【００５３】
クロフェレマーは、腸上皮細胞を横断するクロライド流量を低下させ、かつ分泌性下痢に伴う体液喪失および脱水症を引き起こす腸の管腔への体液移動を低下させる。したがって、クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤は、分泌性下痢に対する予防的および治療的適用、例えば、分泌性下痢に付随して起こる脱水症および電解質喪失の予防において有用である。他の実施形態では、クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤は、異常なＣｌ−流入および流出を伴う疾患に対する予防的および治療的適用において有用である。
【００５４】
クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤は、ヒトまたは動物のいずれかにおける任意のタイプの分泌性下痢に対して治療的にまたは予防的に用いることができる。好ましい実施形態では、クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤を用いて、腸内細菌と関連がある分泌性下痢を治療することができる。これらの腸内細菌としては、コレラ菌、腸管病原性、腸管毒素原性、腸管付着性、腸管出血性、または腸管侵入性タイプの大腸菌をはじめとする大腸菌、他のビブリオ属の種、カンピロバクター属の種、サルモネラ属の種、アエロモナス属の種、プレシモナス属の種、赤痢菌属の種、クレブシエラ属の種、シトロバクター属の種、エルシニア属の種、クロストリジウム属の種、バクテロイデス属の種、ブドウ球菌属の種、およびバチルス属が挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態には、旅行者下痢症の治療も含まれる。
【００５５】
別の実施形態では、クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤を用いて、限定するものではないが、ジアルジア属およびクリプトスポリジウム属の種、例えば、クリプトスポリジウム・パルバムをはじめとする原生動物と関連がある分泌性下痢を治療する。
【００５６】
別の実施形態では、クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤を用いて、限定するものではないが、非特異的下痢、炎症性腸症候群、潰瘍性大腸炎、ならびに胃腸管の癌および新生物形成などの、非感染性の原因と関連がある分泌性下痢を治療する。
【００５７】
別の実施形態では、クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤は、ＡＩＤＳ患者におけるＨＩＶ関連慢性下痢の治療に用いられる。また別の実施形態では、この医薬製剤を用いて、限定するものではないが、ロタウイルスと関連がある下痢をはじめとする、幼児または子供の下痢を治療する。
【００５８】
別の実施形態では、クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤は、ヒト男性および女性を含む温血動物における便秘優位型過敏性腸症候群（ｃ−ＩＢＳ）と関連がある１以上の症状を治療および／または予防するために用いられる。これらの症状としては、疼痛、腹部不快感および異常な排便回数が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法は、通常、ｃ−ＩＢＳ治療を必要とする対象に、クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤を投与することを含む。
【００５９】
別の実施形態では、クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤は、ｃ−ＩＢＳと関連がある疼痛を治療する方法であって、そのような治療を必要とする対象に、ｃ−ＩＢＳと関連がある疼痛を治療するのに有効な量のクロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤を投与することを含む方法を提供するために用いられる。
【００６０】
クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤を用いて、非ヒト動物、例えば、家畜、例えば、これに限定されないが、ウシ属の動物、イノシシ科の動物、ヒツジ科の動物、家禽（例えば、ニワトリ）、およびウマ科の動物、ならびに他の飼育動物、例えば、イヌ科の動物およびネコ科の動物の下痢を治療することもできる。特に、本発明の医薬製剤を用いて、細菌性病原体、例えば、腸管毒素原性大腸菌、腸管出血性大腸菌および他の大腸菌、サルモネラ属の種、ウェルシュ菌、バクテロイデス・フラギリス、カンピロバクター属の種、およびエルシニア・エンテロコリチカ、原生動物性病原体、例えば、クリプトスポリジウム・パルバム、ならびにウイルス性病原体、例えば、ロタウイルスおよびコロナウイルスだけでなく、トガウイルス、パルボウイルス、カリシウイルス、アデノウイルス、ブレダウイルス、およびアストロウイルスとも関連がある、非ヒト動物、例えば、ウシ、ヒツジおよびブタなどの食用動物の下痢性疾患を治療することができる。
【００６１】
さらに、クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤をヒトおよび非ヒト動物に予防的に投与して、分泌性下痢の発症を予防することもできる。
【００６２】
クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬組成物をＡＩＤＳ患者に投与して、ＨＩＶ関連慢性下痢の発症を予防することができる。また、クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬組成物を、コレラの流行またはロタウイルスの流行の危険にさらされている地域の子供に投与して、疾患の拡大を予防することができる。同様に、クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬組成物を、家畜、例えば、若いまたは離乳したばかりの家畜に投与して、下痢性疾患の発症を予防することができる。
【００６３】
本医薬製剤は、単独でまたは分泌性下痢症状の治療もしくは改善のための他の薬剤、例えば、再水和剤、抗生物質、腸運動抑制剤、および流体吸着体（例えば、アタパルジャイト）と組み合わせて投与することもできる。
【００６４】
クロフェレマーまたはＣＦＴＲおよび／もしくはＣａＣＣ Ｃｌ−チャネルの他の阻害剤を含む医薬製剤は、動物、例えば、ウシ属の動物、イノシシ科の動物、ヒツジ科の動物、家禽、ウマ科の動物、イヌ科の動物、およびネコ科の動物の分泌性下痢の治療で用いるために動物の食餌に組み入れることもできる。
【００６５】
前述の一般的な説明と以下の詳細な説明の両方は例示的でかつ説明のためのものであるに過ぎず、特許請求された本発明を限定するものではないことが理解されるべきである。本出願では、単数形の使用は、別途特に記載しない限り、複数形を含む。
【００６６】
本出願では、「または」の使用は、別途記載しない限り、「および／または」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は限定的なものではない。また、「要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）」または「構成要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」などの用語は、別途特に記載しない限り、１つのユニットを含む要素および構成要素と２以上のサブユニットを含む要素および構成要素の両方を包含する。また、「部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）」という用語の使用は、部分（ａ ｍｏｉｅｔｙ）の一部または完全な部分（ｔｈｅ ｅｎｔｉｒｅ ｍｏｉｅｔｙ）を含むことができる。
【００６７】
限定するものではないが、特許、特許出願、論文（ａｒｔｉｃｌｅ）、書籍、および論文（ｔｒｅａｔｉｓｅ）を含む、本出願で引用された全ての文書、または文書の部分は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【００６８】
当業者には容易に明らかとなるように、投与すべき有用なインビボ投薬量および特定の投与様式は、患者の年齢、体重、医学的状態、処置すべき状態の重症度、投与の経路、患者の腎機能および肝機能、ならびに処置される哺乳動物種、利用される特定の化合物、ならびにこれらの化合物が利用される特定の用途によって様々に変わる。所望の結果をもたらすのに必要な投薬レベルである有効投薬レベルの決定は、日常的な薬理学的方法を用いて当業者により実現され得る。通常、製品のヒトへの臨床的適用は、より低い投薬レベルで始め、投薬レベルを所望の効果が達成されるまで増加させる。有利なことに、本実施形態の化合物を、例えば、単回１日用量で投与してもよく、または１日の全投薬量を、１日２回、３回、もしくは４回の分割用量で投与してもよい。
【００６９】
製品の１日投薬量は、例えば、１日に成人１人当たり約０．５〜約１０，０００ｍｇのように、広範囲にわたって様々に異なり得る。経口投与については、製剤は、治療すべき患者に対する投薬量の対症的調整のために、約０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ １０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００または１０，０００ミリグラムの活性成分を含む錠剤の形態で提供されることが好ましい。本医薬製剤は、通常、１０ｍｇ〜約２０００ｍｇの本化合物、好ましくは約５０ｍｇ〜約１０００ｍｇの活性成分を含有する。本化合物の有効量は、通常、１日に体重１ｋｇ当たり約０．００２ｍｇ〜約１５０ｍｇの投薬レベルで供給される。範囲は、１日に体重１ｋｇ当たり約０．０２〜約８０ｍｇ、特に、１日に体重１ｋｇ当たり約０．２ｍｇ〜約４０ｍｇであることが好ましい。化合物は、１日当たり約１〜約１０倍のレジメンで投与することができる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、クロフェレマーの経口用量は、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、５００ｍｇ、または１，０００ｍｇである。いくつかの実施形態では、クロフェレマーの経口用量は、１日２回投与される。他の実施形態では、クロフェレマーの経口用量は１日１回投与される。いくつかの実施形態では、患者は、約１日、２日、７日、１４日、２８日、６０日、または９０日よりも長い期間、クロフェレマーの１日用量を投与される。
【００７１】
本明細書で使用する場合、測定値の「増大」または「減少」は、別途規定しない限り、通常、ベースライン値との比較によるものである。例えば、治療を受けている対象の入院までの時間の増大は、そのような治療を受けていない対象の入院までの時間のベースライン値との比較によるものであることができる。場合によっては、測定値の増大または減少は、この用語を用いる文脈に基づいて評価することができる。
【００７２】
本明細書で使用される「担体」は、利用される投薬量および濃度でそれに曝露されている細胞または哺乳動物に対して毒性がない、医薬として許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む。生理的に許容される担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理的に許容される担体の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸をはじめとする抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンをはじめとする他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／またはＴＷＥＥＮなどの非イオン性界面活性剤、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【００７３】
「有効量」という用語は、必要な投薬量および期間で、所望の結果を達成するのに有効な、例えば、患者または対象の胃腸障害を治療するのに十分な量を含む。クロフェレマーの有効量は、対象の疾患状態、年齢、および体重などの因子、ならびに対象において所望の応答を誘発するクロフェレマーの能力によって様々に異なり得る。投薬量レジメンは、最適な治療応答を提供するように調整することができる。有効量はまた、治療的に有益な作用がクロフェレマーのどの毒性作用または有害作用（例えば、副作用）をも上回る量である。
【００７４】
「改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）」、「改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）」、「改善（ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）」または同様の用語は、例えば、対象または対象の少なくとも一部、例えば、少なくとも約２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、１００％またはこれらの値の約いずれか２つの間の範囲に生じる改善（ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）と一致する検出可能な改善（ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）または検出可能な変化を指す。そのような改善（ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）または変化は、クロフェレマーで治療していない対象と比較したとき、治療した患者に認めることができる。その場合、治療していない対象は、同一または同様の疾患、状態、症状などを有しているか、またはそれらを発症しやすい。疾患、状態、症状またはアッセイパラメータの改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）は、主観的にまたは客観的に、例えば、対象による自己評価によって、臨床医の評価によって、または例えば、生活の質の評価、疾患もしくは状態の進行の緩徐化、疾患もしくは状態の重症度の低下、もしくは生体分子、細胞のレベルもしくは活性についての好適なアッセイをはじめとする適当なアッセイもしくは測定を実施することによって、または対象の胃腸障害の検出によって決定することができる。改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）は、一時的、持続的もしくは恒久的であってもよく、またはそれは、クロフェレマーを対象に投与している間または投与した後、もしくはクロフェレマーを本明細書もしくは引用した参考文献に記載されているアッセイもしくは他の方法で使用している間または使用した後の関連時間で、例えば、以下に記載する期間内で、すなわち、クロフェレマーの投与もしくは使用後約１時間から対象がそのような治療を受けた後約２８日、もしくは１、３、６、９カ月もしくはそれより長い時間で変動してもよい。
【００７５】
例えば、症状、分子のレベルもしくは生物学的活性などの「調節」は、例えば、症状または活性などを検出可能に増大または減少させることを指す。そのような増大または減少は、クロフェレマーで治療していない対象と比較したとき、治療した患者に認めることができる。その場合、治療していない対象は、同一または同様の疾患、状態、症状などを有しているか、またはそれらを発症しやすい。そのような増大または減少は、少なくとも約２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、１０００％もしくはそれより大きいか、またはこれらの値のいずれか２つの間の任意の範囲内であることができる。調節は、主観的にまたは客観的に、例えば、対象の自己評価によって、臨床医の評価によって、または例えば、生活の質の評価もしくは対象における分子、細胞もしくは細胞移動のレベルもしくは活性についての好適なアッセイをはじめとする適当なアッセイもしくは測定を実施することによって決定することができる。調節は、一時的、持続的もしくは恒久的であってもよく、またはそれは、クロフェレマーを対象に投与している間または投与した後、もしくはクロフェレマーを本明細書もしくは引用した参考文献に記載されているアッセイもしくは他の方法で使用している間または使用した後の関連時間で、例えば、以下に記載する時間内で、すなわち、クロフェレマーの投与もしくは使用後約１時間から対象がそのような治療を受けた後約３、６、９カ月もしくはそれより長い時間で変動してもよい。
【００７６】
「調節する」という用語はまた、クロフェレマーへの曝露に応答した細胞の活性の増大または減少、例えば、所望の最終結果が達成されるような、動物の細胞の少なくとも部分集団の増殖の阻害および／または分化の誘導を指すことができ、例えば、治療に用いられるクロフェレマーの治療結果は、特定の治療の間に増大することもあるし、減少することもある。
【００７７】
「クロフェレマーを得る」に見られる「得る」という用語は、クロフェレマーを購入するか、合成するか、または別の方法で獲得することを含むことが意図される。
【００７８】
本明細書で使用される「非経口投与」および「非経口的に投与される」という語句は、例えば、通常、注射による、腸内投与および局所投与以外の投与様式を含み、かつ限定するものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内および胸骨内への注射および注入を含む。
【００７９】
化合物の「予防的有効量」という語は、対象に単回または複数回用量を投与したときに、胃腸障害の予防または治療に有効な、クロフェレマーの量を指す。
【００８０】
本明細書で使用される「医薬品組成物」（または薬剤もしくは薬物）は、患者に適切に投与されたときに所望の治療効果を誘発することができる化学化合物、組成物、薬剤または薬物を指す。それは、必ずしも２種類以上の成分を必要とするものではない。
【００８１】
組成物は、経口、非経口、鼻腔内、舌下、口腔、局所または直腸投与用、または吸入器もしくは吸引器による投与用の、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、ロゼンジ、液体、ゲル調製物、滅菌非経口溶液または懸濁液、計量されたエアロゾルまたは液体スプレー、点滴剤、アンプル、自動注射装置または座剤の形態であることができる。経口投与用の錠剤およびカプセルは、単位投薬提示に好適な形態であることができ、かつ従来の賦形剤を含有することができる。これらの例には、結合剤（例えば、シロップ、アカシアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、およびポリビニルピロリドン）；増量剤（例えば、ラクトース、糖、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシン）；錠剤化潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、二酸化ケイ素、タルク、ポリエチレングリコールもしくはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン）；または許容される湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）がある。錠剤は、通常の薬務において周知の方法によってコーティングすることができる。経口用液体製剤は、例えば、水性もしくは油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップもしくはエリキシルの形態であることができるか、または使用前に水もしくは他の好適なビヒクルで再構成される乾燥製品として提示することができる。そのような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン、水素化食用脂）、乳化剤（例えば、レシチン、ソルビタンモノオレエート、またはアカシアゴム）；（食用油を含む）非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、分留ヤシ油、油性エステル（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、もしくはエチルアルコール））、；防腐剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはソルビン酸）などの通常の添加剤、ならびに所望により、従来の香味剤または着色剤を含有することができる。
【００８２】
経口投与のために、クロフェレマーを当技術分野で周知の医薬として許容される担体と組み合わせることによって、クロフェレマーを容易に処方することができる。そのような医薬として許容される担体のおかげで、本実施形態の化合物を、治療すべき患者によって経口摂取される錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方することができる。経口使用される医薬製剤は、所望により、錠剤または糖衣錠コアを得るために、好適な補助剤を添加した後、クロフェレマーを固体賦形剤と組み合わせ、場合によって得られた混合物をすりつぶし、顆粒の混合物を加工することによって得ることができる。所望により、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、もしくはアルギン酸またはそれらの塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）などの崩壊剤を添加することができる。糖衣錠コアは、好適なコーティングを用いて提供される。この目的のために、濃縮寒天溶液を用いることができ、これは場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有することができる。
【００８３】
本明細書で使用される「全身投与」、「全身に投与される」、「末梢投与」、および「末梢に投与される」という語句は、それが対象のシステムに侵入し、それにより、代謝および他の同様のプロセスを受けるようなクロフェレマーの投与、例えば、皮下投与を意味する。
【００８４】
クロフェレマーの「治療的有効量」という語は、対象に単回または複数回用量を投与したときに、細菌の増殖および／もしくは侵入を阻害するか、または症状、例えば、下痢などの胃腸障害を軽減するのに有効な、クロフェレマーの量を指す。「治療有効量」はまた、対象の胃腸障害の重症度を低下させるのに十分な治療（例えば、クロフェレマーを含む組成物）の量を指す。
【００８５】
本明細書で使用する場合、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、および「予防」という用語は、胃腸障害エピソードの再発、発病、または発症の予防を指す。予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）には、胃腸障害エピソードの発生および重症度からの防御が含まれる。
【００８６】
本明細書で使用する場合、「予防的有効量」という用語は、胃腸障害エピソードの発症、再発、もしくは発病の予防をもたらすかまたは別の治療の予防的効果を増強もしくは改善するのに十分な治療（例えば、クロフェレマーを含む組成物）の量を指す。
【００８７】
本明細書で使用する場合、「対象」は、胃腸障害もしくはクロフェレマーで治療可能な他の障害に罹患することができるか、または本明細書に記載したようなクロフェレマーの投与によって別の形で恩恵を受ける生物、例えば、ヒトおよび非ヒト動物を含む。好ましいヒト動物は、ヒト対象を含む。本発明の「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物、例えば、齧歯類、例えば、マウス、および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、例えば、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。
【００８８】
以下の実施例は、説明目的のために提示されるのであって、限定とみなされるべきではない。
【実施例】
【００８９】
実施例１
クロフェレマーはＴ８４ヒト腸上皮細胞によるＣｌ−分泌を阻害する
クロフェレマーが腸細胞のＣｌ−分泌を低下させるかどうかを検討するために、短絡回路電流を（形質膜透過処理なしで）対称性生理的溶液中のＴ８４細胞で測定した。図２Ｂは、ｃＡＭＰ作動薬のフォルスコリン（上）ならびにカルシウム作動薬のＡＴＰ（中）およびタプシガルギン（下）によってもたらされる短絡回路電流の増加のクロフェレマー濃度依存的阻害を示す。カルシウム作動薬を用いた測定は、ＣＦＴＲを阻害するＣＦＴＲｉｎｈ−１７２の存在下で行なわれた。主にＣＦＴＲ依存的であるフォルスコリン誘導性電流のクロフェレマー阻害が、緩徐で、弱く、部分的であったのに対し、ＡＴＰおよびタプシガルギン誘導性電流の阻害は、１０μＭのクロフェレマーで完全に近かった。特定の理論に束縛されることを望まないが、カルシウム作動薬によって誘導される電流のこの阻害は、クロフェレマーがＣＦＴＲチャネルとＣａＣＣチャネルの両方を阻害し、明らかに後者の阻害の方がはるかに強いことを示唆する。さらなる測定は、分離したＣＦＴＲおよびＣａＣＣに対するクロフェレマー効果を研究するために、トランスフェクトした細胞系を用いて行なわれた。
【００９０】
実施例２
クロフェレマーはＣＦＴＲ Ｃｌ−コンダクタンスの部分拮抗薬である
側底膜をアンフォテリシンＢで透過処理し、経上皮Ｃｌ−勾配をかけたＣＦＴＲ発現ＦＲＴ細胞で、ＣＦＴＲ Ｃｌ−電流を測定した。これらの条件下では、測定された電流は、ＣＦＴＲ Ｃｌ−コンダクタンスの直接的な定量的尺度を提供する。図３Ａは、ＣＦＴＲ Ｃｌ−コンダクタンスをＣＰＴ−ｃＡＭＰによって刺激し、次いで、頂端浴溶液中で様々な濃度のクロフェレマーを添加した頂端膜電流測定を示す。増加濃度のクロフェレマーは、部分的ではあるが、顕著により速やかなＣＦＴＲ Ｃｌ−電流の阻害をもたらした。側底浴溶液へのクロフェレマーの添加は、電流を阻害しなかった（図示せず）。図３Ｂ（白丸）にまとめたように、（Ｃｌ−電流の５０％阻害を生じさせる）クロフェレマーの見かけのＩＣ５０は約７μＭであり、最大阻害効力は約６０％であった。同様の結果は、頂端浴溶液と側底浴溶液を取り替えたときに得られた（頂端溶液中の高いＣｌ−）（図３Ｂ、黒丸）。特定の理論に束縛されることを望まないが、これは、ＣＦＴＲのクロフェレマー阻害が、Ｃｌ−濃度に依存しないことを示唆する。クロフェレマーによる部分阻害とは対照的に、ＣＦＴＲｉｎｈ−１７２またはＧｌｙＨ−１０１による最大ＣＦＴＲ阻害は、ほぼ１００％である（下記参照）。
【００９１】
クロフェレマー阻害効力がＣＦＴＲ活性化機構に依存するかどうかを調べるために測定を行なった。図４Ａは、ＣＦＴＲを直接活性化する作動薬（ゲニステイン）を用いた、またはｃＡＭＰ合成の増加（フォルスコリン）もしくはｃＡＭＰ分解の低下（ＩＢＭＸ）によるｃＡＭＰ依存的ＣＦＴＲリン酸化を通じた、５０および５００μＭのクロフェレマーに対する同様の応答を示す。分泌性下痢時の排出は非吸収性抗分泌剤の使用における懸念事項であるので、ＣＦＴＲのクロフェレマー阻害の可逆性を調べた。図４Ｂは、ＣＦＴＲ Ｃｌ−電流をＣＰＴ−ｃＡＭＰによって刺激し、その後、様々な濃度のクロフェレマーによって阻害した頂端電流測定を示す。徹底的に洗浄した後、残存するＣＦＴＲ阻害をＣＰＴ−ｃＡＭＰによる再刺激後の電流から決定した。クロフェレマーの非存在下の対照研究では、（ＣＰＴ−ｃＡＭＰの）排出と、それに次ぐ再刺激により、最初の刺激で見られた電流と同様の電流が生じた。しかしながら、様々な濃度のクロフェレマーによる阻害の後、排出研究により、ＣＦＴＲ阻害が、３０分にかけて部分的に（２５〜３５％）逆転することが示された。時間延長研究により、４時間でクロフェレマー阻害が５０％弱逆転することが示された（図示せず）。
【００９２】
予め添加されるクロフェレマーの非存在下および存在下でのＣＦＴＲ阻害の比較によって、ＣＦＴＲに対するクロフェレマーの作用部位が小分子チアゾリジノンおよびグリシンヒドラジド系ＣＦＴＲ阻害剤の作用部位と重複し得る可能性が検討された。図４Ｃ（左）は、ＣＦＴＲｉｎｈ−１７２およびＧｌｙＨ−１０１によるＣＦＴＲ阻害の濃度−阻害研究を示す。最大阻害は約１００％であり、ＩＣ５０値はそれぞれ、約１および約８μＭである。図４Ｃ（右）は、５０μＭのクロフェレマーを最初に添加してＣＦＴＲ Ｃｌ−電流を約５０％阻害した同様の濃度−阻害測定を示す。クロフェレマー拮抗機構が部分的であるにもかかわらず、ＣＦＴＲｉｎｈ−１７２およびＧｌｙＨ−１０１は、ＣＦＴＲをほぼ１００％阻害した。特定の理論に束縛されることを望まないが、クロフェレマーの非存在下および存在下でのＣＦＴＲｉｎｈ−１７２およびＧｌｙＨ−１０１のよく似たＩＣ５０値は、クロフェレマーおよびＣＦＴＲｉｎｈ−１７２またはＧｌｙＨ−１０１のＣＦＴＲ阻害部位が重複しないことを示唆する。
【００９３】
クロフェレマーによるＣＦＴＲ阻害の分子機構を調べるために、パッチクランプを行なった。全細胞膜電流をＣＦＴＲ発現ＦＲＴ細胞で測定した（図５、左）。１０μＭのフォルスコリンによる刺激によって、＋１００ｍＶで１７９±１８ｐＡ／ｐＦの膜電流が生じた（全膜キャパシタンス１５．８±４ｐＦ）（ｎ＝３）。５０μＭのクロフェレマーでは、ＣＦＴＲ Ｃｌ−電流の約６０％阻害が得られた。図５（右）は、ＣＦＴＲについて予想されるような、ＣＦＴＲのほぼ線形の電流−電圧関係を示す。特定の理論に束縛されることを望まないが、クロフェレマー添加後にＣＦＴＲ電流−電圧関係が線形のままであったという事実は、電荷のない阻害剤について予想されるような、電位非依存的遮断機構を示唆する。
【００９４】
実施例３
クロフェレマーはＣａＣＣ ＴＭＥＭ１６Ａの強力な阻害剤である
図２Ｂのデータから、クロフェレマーがＴ８４細胞でＣａＣＣを強く阻害することが示唆された。タンパク質ＴＭＥＭ１６ＡがクロフェレマーのＣａＣＣ標的であるかどうかを検討するために、ＴＭＥＭ１６Ａを安定に発現するＦＲＴ上皮細胞を様々な濃度のクロフェレマーで前処理し、次いで、１μＭのイオノマイシンを添加して、ＴＭＥＭ１６Ａ Ｃｌ−電流を刺激した。電流がＴＭＥＭ１６Ａ Ｃｌ−コンダクタンスの直接的な定量的尺度となるように、測定は、経上皮Ｃｌ−勾配の存在下で行なわれた。図６Ａは、高濃度のクロフェレマーで完全に近かった、ＴＭＥＭ１６Ａ Ｃｌ−電流のクロフェレマー濃度依存的阻害を示す。図６Ｂは、約６．５μＭというＴＭＥＭ１６Ａのクロフェレマー阻害のＩＣ５０を示す。
【００９５】
全細胞膜電流をＴＭＥＭ１６Ａ発現ＦＲＴ細胞で測定した（図６Ｃ）。１００μＭのＡＴＰによる刺激によって、＋１００ｍＶで５６±１３ｐＡ／ｐＦの膜電流が生じた（ｎ＝３）。１０μＭのクロフェレマーによる前処理によって、ＡＴＰ誘導性のＴＭＥＭ１６Ａ Ｃｌ−電流が５８％阻害された（２４±６ｐＡ／ｐＦ、ｎ＝３）。図６Ｄは、ＴＭＥＭ１６Ａの外向き整流電流−電圧関係を示す。電荷のない阻害剤について予想されたように、ＴＭＥＭ１６Ａ電流−電圧関係は、クロフェレマー添加後も外向き整流性のままであった。これらの結果は、クロフェレマーの少なくとも第２の異なる管腔膜Ｃｌ−チャネル標的が存在することを示唆する。
【００９６】
実施例４
クロフェレマーは頂端カチオンチャネルおよびＣａｍｐ／カルシウムシグナリングにほとんど影響がない
腸細胞の頂端膜もＮａ＋チャネルとＫ＋チャネルを有しているが、これらもまた、クロフェレマーの潜在的な標的である。クロフェレマーが上皮細胞Ｎａ＋チャネルＥＮａＣの活性を変化させるかどうかを調べるために、ＥＮａＣを強く発現し、アミロリド後の短絡回路電流の変化がＥＮａＣ活性の定量的尺度を提供するヒト気管上皮細胞の初代培養物で短絡回路電流を測定した（Ｙａｍａｙａ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。図７Ａは、５０μＭのクロフェレマーによる細胞培養物の前処理によって、約２０％のわずかなＥＮａＣ活性阻害が生じたことを示す。ヒト気管上皮細胞もＴＭＥＭ１６Ａを発現し、強いＣａＣＣ活性を有する。クロフェレマー前処理によって、カルシウム上昇作動薬ＵＴＰの後に短絡回路電流の９０％を上回る低下が生じ、上記のＴ８４細胞およびＴＭＥＭ１６ＡをトランスフェクトしたＦＲＴ細胞での結果と一致した。
【００９７】
側底膜を、経上皮Ｋ＋勾配の存在下、アンフォテリシンＢで透過処理したヒト気管上皮細胞で、クロフェレマーによる頂端Ｋ＋チャネル阻害の可能性を検討した。これらの条件下では、測定されるわずかな電流は頂端膜Ｋ＋電流である。Ｋ＋チャネルの非特異的阻害剤であるＢａＣｌ２の添加後に頂端Ｋ＋電流を測定した。図７Ｂは、５０μＭのクロフェレマーによる前処理によって、約２２％のわずかな頂端膜Ｋ＋電流阻害が生じたことを示す。
【００９８】
頂端膜受容体に対するクロフェレマーの作用が主要な細胞内シグナル伝達経路に影響を及ぼし、それによって、側底膜輸送体の活性が二次的に調節されて、細胞外へのＣｌ−分泌が間接的に阻害される可能性を検討した。図７Ｃでは、５０μＭのクロフェレマーは、Ｔ８４細胞内の基礎的なまたはフォルスコリン刺激性のｃＡＭＰ濃度に顕著な影響を及ぼさなかった。図７Ｄでは、クロフェレマーは、基礎的な細胞質カルシウム濃度を変化させることなく、ＡＴＰ処理後のＴ８４細胞内のカルシウム濃度の上昇に影響を及ぼすこともなかった。
【００９９】
上記実施例で使用することができるいくつかの試薬およびプロトコルの例としては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：フォルスコリン、アピゲニンおよび３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）はＳｉｇｍａから購入した。８−（４−クロロフェニルチオ）−ｃＡＭＰ（ＣＰＴ−ｃＡＭＰ）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。小分子ＣＦＴＲ阻害剤のＣＦＴＲｉｎｈ−１７２およびＧｌｙＨ−１０１、ならびにＣａＣＣ阻害剤のＣａＣＣｉｎｈ−０１は、報告されている通りに合成した（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｍｕａｎｐｒａｓａｔ ｅｔ ａｌ．，２００４；ｄｅ ｌａ Ｆｕｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００８）。クロフェレマーは、Ｎａｐｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）により提供された。クロフェレマーは、サングレ・デ・グラード（Ｃ．ｌｅｃｈｌｅｒｉ）の樹液からの抽出により調製した。この樹液を冷却して、相分離を誘導した後、固体残渣を廃棄し、上清をブタノールで抽出した。クロフェレマーを含有する水性相を接線流により濾過し、イオン交換カラム上の低圧液体クロマトグラフィーにかけた。クロフェレマー濃縮画分をＳｅｐｈａｄｅｘカラム上で精製し、含水アセトンの移動相を用いてクロフェレマーを溶出させた。その後、クロフェレマーを真空下で乾燥させた。
【０１００】
クロフェレマーは、平均分子量２１００ダルトンのプロアントシアニジンオリゴマーの混合物からなっており、以前に報告された平均分子量２３００ダルトンと一致する（Ｕｂｉｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。図２Ａは、クロフェレマーの構造を示す。本研究のために使用された材料は、臨床試験で使用される材料と同じである。臨床試験では、材料は、経口投与用に放出調節錠として処方される（１錠当たり１２５または２５０ｍｇのクロフェレマー）。
【０１０１】
ヒトＣＦＴＲを発現するＦｉｓｈｅｒラット甲状腺（ＦＲＴ）細胞は、記載されている通りに作製した（Ｍａ ｅｔ ａｌ，２００２）。ヒトＴＭＥＭ１６Ａ（ｃＤＮＡは、Ｇａｓｌｉｎｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｇｅｎｏａ，ＩｔａｌｙのＬｕｉｓ Ｇａｌｉｅｔｔａ博士によって提供された）を発現するＦＲＴ細胞を同様に作製した。ＦＲＴ細胞を、１０％の胎仔ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭのグルタミン、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、３５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンおよび５００μｇ／ｍｌのジェネティシンを補充したＦ−１２改変Ｃｏｏｎ培地（Ｓｉｇｍａ）中で培養した。ヒト気管上皮細胞の初代培養物を、記載されている通りに気液界面で維持した（Ｙａｍａｙａ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。Ｔ８４細胞を１０％ＦＢＳ、１００ユニット／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２（１：１）培地中で培養した。細胞を、５％ＣＯ２／９５％大気中、３７℃にてＳｎａｐｗｅｌｌ多孔質フィルター（Ｃｏｓｔａｒ ３８０１）上で増殖させた。
【０１０２】
（ＣＦＴＲまたはＴＭＥＭ１６Ａを安定に発現する）ＦＲＴ細胞をＳｎａｐｗｅｌｌフィルター上でコンフルエンスまで培養した（経上皮抵抗 ＞５００ｏｈｍ．ｃｍ）。短絡回路電流を、側底表面を浸すリンガー溶液と頂端表面を浸す２分の１リンガー溶液とを含むＵｓｓｉｎｇチャンバー（鉛直拡散チャンバー；Ｃｏｓｔａｒ）中で測定した。リンガー溶液は以下を含んでいた：１３０ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＮａ−ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのグルコース、ｐＨ７．３。２分の１リンガー溶液は、６５ｍＭのＮａＣｌをグルコン酸Ｎａに代え、ＣａＣｌ２を２ｍＭに増加させたことを除いて、同じものであった。側底膜を、記載されている通りに２５０μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢで透過処理した（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。チャンバーを空気で絶えず泡立てた。Ｔ８４細胞および気管上皮細胞については、以下のもの（単位ｍＭ）：１２０ ＮａＣｌ、５ ＫＣｌ、１ ＭｇＣｌ２、１ ＣａＣｌ２、１０ Ｄ−グルコース、５ ＨＥＰＥＳ、および２５ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ７．４）を含む対称性ＨＣＯ３緩衝溶液に細胞を浸し、３７℃にて５％ＣＯ２で曝気した。Ｔ８４細胞内の頂端Ｋ＋コンダクタンスの測定のために、ＮａＨＣＯ３およびＮａＣｌをグルコン酸Ｎａに代え、側底溶液中のグルコン酸Ｎａをグルコン酸Ｋに代え、空気で泡立てた。側底膜を２０μＭのアンフォテリシンＢで透過処理した。ＤＶＣ−１０００電圧固定装置（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、短絡回路電流を測定した。
【０１０３】
Ｔ８４細胞を２４ウェルプレート中で増殖させ、クロフェレマーで４５分間処理し、その後、０または２０μＭのフォルスコリンで１０分間処理し、超音波処理により溶解させ、遠心分離して、細胞破片を除去し、製造元の指示（Ｐａｒａｍｅｔｅｒ（商標）ｃＡＭＰイムノアッセイキット、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、上清をｃＡＭＰについてアッセイした。
【０１０４】
ＣＦＴＲまたはＴＭＥＭ１６Ａを安定に発現するＦＲＴ細胞で全細胞記録を作成した。ＣＦＴＲ用のピペット溶液は、１４０ｍＭのＮ−メチルＤ−グルカミンクロライド（ＮＭＤＧ−Ｃ１）、５ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＴｒｉｓ−ＡＴＰおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）を含んでいた。ＴＭＥＭ１６Ａ用のピペット溶液は、１３０ｍＭのＣｓＣｌ、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＴｒｉｓ−ＡＴＰおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）を含んでいた。浴溶液は、１４０ｍＭのＮ−メチルＤ−グルカミンクロライド、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのグルコースおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を含んでいた。測定は全て室温（２２〜２５℃）で行なわれた。ピペットをホウケイ酸ガラスから引いた。先端熱加工（ｆｉｒｅ ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）した後、ピペットは、３〜５Ｍｏｈｍの抵抗を有していた。シール抵抗は３〜１０Ｇｏｈｍであった。全細胞コンフィグレーションを確立した後、ＣＦＴＲをフォルスコリンおよびＩＢＭＸにより活性化し、ＴＭＥＭ１６ＡをＡＴＰにより活性化した。０ｍＶの保持電位から−１００ｍＶ〜＋１００ｍＶの電圧まで２０ｍＶずつ過分極電圧パルスおよび脱分極電圧パルスをかけることによって、全細胞電流を誘発した。電流出力に５ｋＨｚでフィルターをかけた。電流をデジタル化し、ＡｘｏＳｃｏｐｅ １０．０システムおよびＤｉｇｉｄａｔａ １４４０Ａ ＡＣ／ＤＣ変換器を用いて解析した。
【０１０５】
２μＭのｆｕｒａ−２−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）とともに３７℃で３０分間インキュベートして細胞にｆｕｒａ−２を取り込ませることによって、Ｔ８４細胞のコンフルエントな単層における［Ｃａ２＋］ｉの測定を行なった。ｆｕｒａ−２を取り込んだＴ８４細胞を倒立蛍光顕微鏡のステージ上の灌流チャンバーに入れた。細胞に以下のもの（単位ｍＭ）：１４０ ＮａＣｌ、５ ＫＣｌ、１ ＭｇＣｌ２、１ ＣａＣｌ２、１０ Ｄ−グルコースおよび１０ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を表面灌流した。ｆｕｒａ−２蛍光を励起波長３４０ｎｍおよび３８０ｎｍで記録し、結果を３４０／３８０蛍光比として表した。ベースライン測定結果を得た後、１００μＭのＡＴＰを灌流液中に添加した。５０μＭのクロフェレマーの非存在下および存在下で測定を行なった。
【０１０６】
実施例５
ヒト患者の下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、およびクローン病の症状を軽減する方法
下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、またはクローン病に罹患しているヒト患者を特定する。ある投薬量、例えば、４ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回経口投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１０７】
実施例６
ヒト患者のＡＩＤＳ関連下痢の症状を軽減する方法
ＡＩＤＳ関連下痢に罹患しているヒト患者を特定する。ある投薬量、例えば、４ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回経口投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１０８】
実施例７
ヒト患者の過敏性腸症候群の症状を軽減する方法
過敏性腸症候群に罹患しているヒト患者を特定する。ある投薬量、例えば、４ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回経口投与する。投薬量は、異常な便重量、排泄頻度、および／または疼痛を低下させるのに有効である程度に調整することができる。無痛の日数が増えたら、治療は成功であると考えられる。
【０１０９】
実施例８
ヒト患者のコレラの症状を軽減する方法
コレラに罹患しているヒト患者を特定する。さらに、ある投薬量、例えば、４ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回経口投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１１０】
実施例９
抗生物質とクロフェレマーの組合せを用いてヒト患者のコレラの症状を軽減する方法
コレラに罹患しているヒト患者を特定する。有効用量のアジスロマイシンを患者に投与する。さらに、ある投薬量、例えば、４ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回経口投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１１１】
実施例１０
補水療法とクロフェレマーの組合せを用いてヒト患者のコレラの症状を軽減する方法
コレラに罹患しているヒト患者を特定する。一定の比率の水、塩、および糖を含有する経口補水塩（ＯＲＳ）溶液を患者に投与する。ある投薬量、例えば、４ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回経口投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１１２】
実施例１１
クロフェレマーの静脈内投与によってヒト患者の下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、およびクローン病の症状を軽減する方法
下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、またはクローン病に罹患しているヒト患者を特定する。ある投薬量、例えば、４ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に静脈内投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１１３】
実施例１２
クロフェレマーおよびチアゾリジノンの投与によってヒト患者の下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、およびクローン病の症状を軽減する方法
下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、またはクローン病に罹患しているヒト患者を特定する。有効量のチアゾリジノンと組み合わせた、ある投薬量、例えば、４ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に静脈内投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１１４】
実施例１３
クロフェレマーおよびグリシンヒドラジドの投与によってヒト患者の下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、およびクローン病の症状を軽減する方法
下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、またはクローン病に罹患しているヒト患者を特定する。有効量のグリシンヒドラジドと組み合わせた、ある投薬量、例えば、４ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に静脈内投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１１５】
実施例１４
ヒト患者の下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、およびクローン病の症状を軽減する方法
下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、またはクローン病に罹患しているヒト患者を特定する。ある投薬量、例えば、７ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回経口投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１１６】
実施例１５
ヒト患者のＡＩＤＳ関連下痢の症状を軽減する方法
ＡＩＤＳ関連下痢に罹患しているヒト患者を特定する。ある投薬量、例えば、７ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回経口投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１１７】
実施例１６
ヒト患者の過敏性腸症候群を軽減する方法
過敏性腸症候群に罹患しているヒト患者を特定する。ある投薬量、例えば、７ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回経口投与する。投薬量は、異常な便重量、排泄頻度、および／または疼痛を低下させるのに有効である程度に調整することができる。無痛の日数が増えたら、治療は成功であると考えられる。
【０１１８】
実施例１７
ヒト患者のコレラの症状を軽減する方法
コレラに罹患しているヒト患者を特定する。さらに、ある投薬量、例えば、７ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回経口投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１１９】
実施例１８
抗生物質とクロフェレマーの組合せを用いてヒト患者のコレラの症状を軽減する方法
コレラに罹患しているヒト患者を特定する。有効用量のアジスロマイシンを患者に投与する。さらに、ある投薬量、例えば、７ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回経口投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１２０】
実施例１９
補水療法とクロフェレマーの組合せを用いてヒト患者のコレラの症状を軽減する方法
コレラに罹患しているヒト患者を特定する。一定の比率の水、塩、および糖を含有する経口補水塩（ＯＲＳ）溶液を患者に投与する。ある投薬量、例えば、７ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回経口投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１２１】
実施例２０
クロフェレマーの静脈内投与によってヒト患者の下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、およびクローン病の症状を軽減する方法
下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、またはクローン病に罹患しているヒト患者を特定する。ある投薬量、例えば、７ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に静脈内投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１２２】
実施例２１
クロフェレマーおよびチアゾリジノンの投与によってヒト患者の下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、およびクローン病の症状を軽減する方法
下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、またはクローン病に罹患しているヒト患者を特定する。有効量のチアゾリジノンと組み合わせた、ある投薬量、例えば、７ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に静脈内投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１２３】
実施例２２
クロフェレマーおよびグリシンヒドラジドの投与によってヒト患者の下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、およびクローン病の症状を軽減する方法
下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、またはクローン病に罹患しているヒト患者を特定する。有効量のグリシンヒドラジドと組み合わせた、ある投薬量、例えば、７ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に静脈内投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１２４】
実施例２３
ヒト患者のコレラの症状を軽減する方法
コレラに罹患しているヒト患者を特定する。さらに、ある投薬量、例えば、４ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回静脈内投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【０１２５】
実施例２４
ヒト患者のコレラの症状を軽減する方法
コレラに罹患しているヒト患者を特定する。さらに、ある投薬量、例えば、７ｍｇ／ｋｇのクロフェレマーを患者に１日に２回経口投与する。投薬量は、異常な便重量および排泄頻度を低下させるのに有効である程度に調整することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｌ−分泌を調節する方法であって、カルシウム活性化クロライドチャネル（ＣａＣＣ）を発現する細胞を有効量のクロフェレマーと接触させることを含む、方法。
【請求項２】
前記ＣａＣＣがＴＭＥＭ１６Ａである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｃｌ−分泌を調節する方法であって、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）を発現する細胞を有効量のクロフェレマーと接触させることを含む、方法。
【請求項４】
Ｎａ＋分泌を調節する方法であって、Ｎａ＋チャネルを発現する細胞を有効量のクロフェレマーと接触させることを含む、方法。
【請求項５】
前記Ｎａ＋チャネルが上皮ナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの胃腸障害を治療する方法であって、有効量のクロフェレマーを用いてＣａＣＣ活性を阻害することを含む、方法。
【請求項７】
前記胃腸障害が、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群、および過敏性腸症候群、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、または交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群と関連する腹部不快感からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記胃腸障害が分泌性下痢である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記胃腸障害が過敏性腸症候群である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの胃腸障害を治療するための方法であって、有効量のクロフェレマーを用いてＣＦＴＲ活性を阻害することを含む、方法。
【請求項１１】
前記胃腸障害が、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群、および過敏性腸症候群、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、または交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群と関連する腹部不快感からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記胃腸障害が分泌性下痢である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記胃腸障害が過敏性腸症候群である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つのチャネル病を治療する方法であって、有効量のクロフェレマーを用いてＣａＣＣ活性を阻害することを含む、方法。
【請求項１５】
前記チャネル病が、嚢胞性線維症、肢端紅痛症、高カリウム血性周期性四肢麻痺、低カリウム血性周期性四肢麻痺、ＱＴ延長症候群、ＱＴ短縮症候群、悪性高体温症、先天性筋緊張症、および神経性筋強直症からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つのチャネル病を治療する方法であって、有効量のクロフェレマーを用いてＣＦＴＲ活性を阻害することを含む、方法。
【請求項１７】
前記チャネル病が、嚢胞性線維症、肢端紅痛症、高カリウム血性周期性四肢麻痺、低カリウム血性周期性四肢麻痺、ＱＴ延長症候群、ＱＴ短縮症候群、悪性高体温症、先天性筋緊張症、および神経性筋強直症からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
患者の少なくとも１つの胃腸障害を治療する方法であって、有効量のクロフェレマーを前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項１９】
前記胃腸障害が、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群、および過敏性腸症候群、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、または交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群と関連する腹部不快感からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記胃腸障害が分泌性下痢である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記胃腸障害が過敏性腸症候群である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１つの癌を治療するための方法であって、有効量のクロフェレマーを患者に投与することを含む、方法。
【請求項２３】
前記癌が、扁平上皮細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、および肺扁平上皮癌を含む）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌または腹部癌（胃腸癌を含む）、膵癌、膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌および様々なタイプの頭頸部癌、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非開裂細胞性ＮＨＬ；巨大病変性ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症と関連する異常な血管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍と関連する浮腫）、およびメーグス症候群からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記癌が結腸癌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌が結腸直腸癌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも１つの炎症性疾患を治療するための方法であって、有効量のクロフェレマーを患者に投与することを含む、方法。
【請求項２７】
前記炎症性疾患が、クローン病および過敏性腸症候群からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記炎症性疾患が過敏性腸症候群である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも１つの胃腸障害を治療する方法であって、有効量のクロフェレマーを用いてＥＮａＣ活性を阻害することを含む、方法。
【請求項３０】
前記胃腸障害が、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群、および過敏性腸症候群、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、または交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群と関連する腹部不快感からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記胃腸障害が分泌性下痢である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記胃腸障害が過敏性腸症候群である、請求項２９に記載の方法。
【請求項１】
Ｃｌ−分泌を調節する方法であって、カルシウム活性化クロライドチャネル（ＣａＣＣ）を発現する細胞を有効量のクロフェレマーと接触させることを含む、方法。
【請求項２】
前記ＣａＣＣがＴＭＥＭ１６Ａである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｃｌ−分泌を調節する方法であって、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）を発現する細胞を有効量のクロフェレマーと接触させることを含む、方法。
【請求項４】
Ｎａ＋分泌を調節する方法であって、Ｎａ＋チャネルを発現する細胞を有効量のクロフェレマーと接触させることを含む、方法。
【請求項５】
前記Ｎａ＋チャネルが上皮ナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの胃腸障害を治療する方法であって、有効量のクロフェレマーを用いてＣａＣＣ活性を阻害することを含む、方法。
【請求項７】
前記胃腸障害が、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群、および過敏性腸症候群、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、または交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群と関連する腹部不快感からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記胃腸障害が分泌性下痢である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記胃腸障害が過敏性腸症候群である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの胃腸障害を治療するための方法であって、有効量のクロフェレマーを用いてＣＦＴＲ活性を阻害することを含む、方法。
【請求項１１】
前記胃腸障害が、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群、および過敏性腸症候群、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、または交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群と関連する腹部不快感からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記胃腸障害が分泌性下痢である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記胃腸障害が過敏性腸症候群である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つのチャネル病を治療する方法であって、有効量のクロフェレマーを用いてＣａＣＣ活性を阻害することを含む、方法。
【請求項１５】
前記チャネル病が、嚢胞性線維症、肢端紅痛症、高カリウム血性周期性四肢麻痺、低カリウム血性周期性四肢麻痺、ＱＴ延長症候群、ＱＴ短縮症候群、悪性高体温症、先天性筋緊張症、および神経性筋強直症からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つのチャネル病を治療する方法であって、有効量のクロフェレマーを用いてＣＦＴＲ活性を阻害することを含む、方法。
【請求項１７】
前記チャネル病が、嚢胞性線維症、肢端紅痛症、高カリウム血性周期性四肢麻痺、低カリウム血性周期性四肢麻痺、ＱＴ延長症候群、ＱＴ短縮症候群、悪性高体温症、先天性筋緊張症、および神経性筋強直症からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
患者の少なくとも１つの胃腸障害を治療する方法であって、有効量のクロフェレマーを前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項１９】
前記胃腸障害が、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群、および過敏性腸症候群、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、または交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群と関連する腹部不快感からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記胃腸障害が分泌性下痢である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記胃腸障害が過敏性腸症候群である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１つの癌を治療するための方法であって、有効量のクロフェレマーを患者に投与することを含む、方法。
【請求項２３】
前記癌が、扁平上皮細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、および肺扁平上皮癌を含む）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌または腹部癌（胃腸癌を含む）、膵癌、膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌および様々なタイプの頭頸部癌、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非開裂細胞性ＮＨＬ；巨大病変性ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症と関連する異常な血管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍と関連する浮腫）、およびメーグス症候群からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記癌が結腸癌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌が結腸直腸癌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも１つの炎症性疾患を治療するための方法であって、有効量のクロフェレマーを患者に投与することを含む、方法。
【請求項２７】
前記炎症性疾患が、クローン病および過敏性腸症候群からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記炎症性疾患が過敏性腸症候群である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも１つの胃腸障害を治療する方法であって、有効量のクロフェレマーを用いてＥＮａＣ活性を阻害することを含む、方法。
【請求項３０】
前記胃腸障害が、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群、および過敏性腸症候群、下痢、分泌性下痢、過敏性腸症候群、便秘、クローン病、潰瘍、裂肛、便秘優位型過敏性腸症候群、下痢優位型過敏性腸症候群、または交互に起こる便秘優位型／下痢優位型過敏性腸症候群と関連する腹部不快感からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記胃腸障害が分泌性下痢である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記胃腸障害が過敏性腸症候群である、請求項２９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１３−５０６７１６（Ｐ２０１３−５０６７１６Ａ）
【公表日】平成２５年２月２８日（２０１３．２．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３３２５１（Ｐ２０１２−５３３２５１）
【出願日】平成２２年１０月５日（２０１０．１０．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５１５３０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４４１６７
【国際公開日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【出願人】（５１２０８８６６０）ザ レゲンツ オブ ジ ユニヴァーシティ オブ カリフォルニア (1)
【出願人】（５１２０８８６７１）ナポ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月２８日（２０１３．２．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月５日（２０１０．１０．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５１５３０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４４１６７
【国際公開日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【出願人】（５１２０８８６６０）ザ レゲンツ オブ ジ ユニヴァーシティ オブ カリフォルニア (1)
【出願人】（５１２０８８６７１）ナポ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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