クロマトグラフィーカラムを乾式充填する方法
本発明は、乾燥膨潤性粒子から出発して高効率のクロマトグラフィーカラムの充填方法、並びにその方法で充填されたカラム及びそのカラムの生体分子の分離における使用を提供する。本充填方法では、カラムチャンバー体積の約１０５〜１２０％の液体膨潤体積を与えるのに充分な量の乾燥膨潤性粒子をカラムに移し、カラムを閉じ、液体をカラムに供給する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子の液体クロマトグラフィー分離に有用な充填ベッドカラム、かかるカラムの充填方法、及びかかるカラムで生体分子を分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体クロマトグラフィー用のカラムは、通例、液体キャリアが流れる多孔質クロマトグラフィー媒体の充填ベッドを包囲する管体を含んでおり、分離は液体キャリアと多孔質媒体の固相との間の分配によって起こる。
【０００３】
分離プロセスに先立って、カラム内に導入される微粒子状媒体から始めてベッドを調製しなければならない。ベッドの形成プロセスは「充填手順」といわれ、正確に充填されたベッドは充填ベッドを含有するカラムの性能に影響する重大な要因である。通例、充填ベッドを調製するにはスラリーを充填、つまりカラム内にポンプ送給、注入又は吸引されたスラリーといわれる液体中の離散粒子の懸濁液を圧密化する。所定体積のスラリーがカラムに送り込まれたら、可動アダプターを、カラムの縦軸に沿ってカラムの下部に向けて、通常は一定の速度で動かすことによって、さらに圧密化し圧縮する必要がある。この手順中過剰の液体はカラム出口で排出され、媒体粒子は、孔が小さすぎて媒体粒子が通り抜けることのできないフィルター材料（いわゆる「ベッド支持体」）によって保持される。充填ベッドが最適な圧縮度に圧縮されたら充填プロセスは完了である。カラムにスラリーを充填する別の手法は流動充填法であり、この場合多孔質構造体の圧縮を達成するには主としてカラム全体に高流量を適用し、これにより出口ベッド支持体から始まる多孔質構造体を形成する。その結果得られる多孔質構造体中の粒子に対する牽引力は最終的に圧力降下及びベッドの圧縮を引き起こす。こうして圧縮されたベッドは最後にアダプターを正規の位置に配置することにより閉じ込められる。
【０００４】
その後のクロマトグラフ分離の効率は、１）充填ベッドの流体入口及び出口における液体分配及び収集系、２）充填ベッド内の媒体粒子の特別な配向（充填ジオメトリーともいわれる）、並びに３）充填ベッドの圧縮に強く依存している。充填ベッドの圧縮が低すぎると、そのベッドで実行されるクロマトグラフ分離が「テーリング」を起こし、一般に、かかる不充分に圧縮されたベッドは不安定である。充填ベッドの圧縮が高すぎると、そのベッドで実行されるクロマトグラフ分離は「リーディング」を起こし、かかる過圧縮ベッドは処理能力及び結合能力に影響する可能性があり、一般に、作動圧力がずっと高くなる。圧縮が最適であれば、使用中に形成される分離ピークは、リーディング又はテーリングがずっと少なくなり、実質的に対称である。最適な圧縮度はまた、多孔質構造体の良好な長期安定性を達成することにより、多くのプロセスサイクルを通じて最適な性能を確保するのにも重大である。カラムに必要とされる最適な圧縮度は各カラムの大きさ（幅又は直径）、ベッド高さ、及び媒体の種類に対して実験的に決定される。
【０００５】
代わりの充填法は「乾式充填」といわれ、カラムを多孔質媒体の乾燥粒子で満たした後液体をカラムに導入するものである。これは、充填液体に保存剤を添加する必要がなく、また輸送中の重量を最小にすることなく、顧客に乾燥状態で送ることができるプレフィルドカラムで有益である。乾式充填は通例、例えば、Ｇ Ｇｕｉｏｃｈｏｎ Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ ７０４ （１９９５） ２４７−２６８に記載されているように、小さい分子の分離を目的として、シリカ媒体に対して使用されるが、得られるカラム効率はかなり悪い。しかし、生体分子の分離に通常使用されるデキストラン又はアガロース系媒体のような膨潤性クロマトグラフィー媒体の場合、乾式充填は、粒子が膨潤すると充填ベッドの性能が落ちると認識されていたため避けられてきた。米国特許第４３５３８０１号には、溶媒膨潤性スチレン−ジビニルベンゼン粒子の乾式充填が湿式充填より劣ると述べられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第４３６６０６０号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の１つの態様は、乾燥膨潤性粒子から始めて高効率クロマトグラフィーカラムを充填する方法を提供する。これは、ａ）カラムチャンバー体積の約１０５〜１２０％の液体膨潤体積Ｖｓを与えるのに充分な量の乾燥膨潤性粒子５をクロマトグラフィーカラム１内のカラムチャンバー２に移し、ｂ）カラムを閉じ、ｃ）液体をカラムに供給する工程を含む方法によって達成される。言い換えると、この方法は、乾燥膨潤性粒子５のアリコート（一定の試料）を（例えば秤量することにより）量り取り、アリコートをクロマトグラフィーカラム１内のカラムチャンバー２に供給し、カラムチャンバーを閉じ、カラムチャンバーに液体を供給することを含んでおり、ここでアリコートの膨潤体積Ｖｓはカラムチャンバー体積の約１０５〜１２０％である。
【０００８】
本発明の特定の態様は、ユーザーに容易に輸送されユーザーにより平衡化される貯蔵安定性のプレフィルドカラムである。これは、乾燥膨潤性粒子を含むカラムにより達成され、ここで粒子の量はカラムチャンバー体積の約１０５〜１２０％の水性液体膨潤体積Ｖｓを与えるのに充分なものである。
【０００９】
１以上の上記態様は特許請求の範囲に定義される本発明によって達成され得る。本発明の追加の態様、詳細及び利点は以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、カラム及び乾燥膨潤性粒子で充填する方法の概略図である。
【図２】図２は、可撓性容器がカラムチャンバー内に挿入された実施形態を示す。
【図３】図３は、管状のカラムチャンバーが剛性ハウジング内に装着された実施形態を示す。
【図４】図４は、充填方法の流れ図である。
【図５】図５は、乾燥膨潤性粒子の液体吸収率を決定する実施形態の流れ図である。
【図６】図６は、液体を加える前にカラムを振動させる実施形態の流れ図である。
【図７】図７は、カラム性能を計算するやり方を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義
本明細書中で、用語「膨潤性粒子」は、液体中に浸漬したときに大きさが増大する粒子を意味する。これは、同じ量の乾燥粒子の嵩体積よりずっと大きい液体中の沈降体積として観察することができる。
【００１２】
本明細書中で、用語「膨潤体積」（Ｖｓ）は、液体に懸濁させ平衡化させた粒子のアリコートの沈降体積を意味する。沈降体積を測定するには、粒子のアリコートを懸濁させ、最大２４ｈ平衡化させ、必要であれば粒子を再懸濁させ、粒子を沈降させ、目盛付容器（例えばメスシリンダー）で沈降体積を測定することができる。
【００１３】
本明細書中で、用語「液体吸収率」（Ｖｓ／ｍｄ）は、上で定義された粒子のアリコートの膨潤体積Ｖｓと、液体に浸漬する前の粒子アリコートの乾燥重量ｍｄとの比を意味する。
【００１４】
図１及び図４に示す本発明の一実施形態では、ある量の乾燥膨潤性粒子５をクロマトグラフィーカラム１内のカラムチャンバー２に移す。ここで、粒子の量は、液体膨潤体積Ｖｓがカラムチャンバー体積の約１０５〜１２０％になるのに充分である。次に、カラムを閉じ、カラムチャンバーに液体を供給する。膨潤体積はカラムチャンバー体積より大きいので、粒子ベッドは対応する程度（充填されたカラムの圧縮率ＣＦは通常Ｖｓ／Ｖｃｏｌと定義され、ここでＶｃｏｌはカラムチャンバー体積である）に圧縮され、その結果高いカラム効率と低いピークの非対称性が得られる。カラム効率は換算段高さｈとして表すことができ、これは段高さを粒子の平均直径で割った値である。段高さは当技術分野で周知の方法で測定される。ピークの非対称性は非対称係数Ａｓで表すことができ、これはピークの後部曲線からピークの中心までの間隔と、前部曲線からピーク中心までの間隔との比である（全て、ピーク高さの１０％のところで測定する）。段高さと非対称係数はいずれも小さい分子の保持されない種に対して適切に測定される。カラムは軸流式又は輻流式として設計し得、また流体分配器３を含み得る。カラムチャンバーの入口と出口は、粒子を保持し液体を通過させるために多孔質スクリーン４により区切られ得る。多孔質スクリーンは製織メッシュ、焼結フリット又はその他あらゆる種類の多孔質材料から製造し得る。
【００１５】
図５に示す別の実施形態では、本方法における最初の工程は、乾燥膨潤性粒子の液体吸収率Ｖｓ／ｍｄを決定し、液体吸収率からカラムチャンバーに移すべき乾燥膨潤性粒子の量を決定することである。液体吸収率は、代表的な試料に関して確立されている方法を使用して粒子の個々の試料アリコートから決定することができる。試料を乾燥状態で（すなわち周囲の大気と平衡した状態で）秤量した後試験液体に懸濁させる。試験液体は、カラムの充填及び作動に使用されるものと同じ液体、又は同様な組成の液体、通例同様なイオン強度／導電率及びｐＨの水性緩衝液又は塩溶液であることができる。試験液体中の粒子を、通例約１時間、いかなる場合でも２４時間以下の時間平衡化させる。粒子を再懸濁させ、沈降させる。沈降体積を、例えばメスシリンダーで測定する。次に、沈降体積Ｖｓと乾燥粒子試料の重量ｍｄとの比Ｖｓ／ｍｄとして液体吸収率を計算する。液体吸収率を最初に測定することの１つの利点は、カラム内の粒子の膨潤体積を予測することができ、その結果圧縮及びカラム効率をより良好に制御できることである。特定の実施形態では、液体吸収率は、カラム性能の制御における高い精度を可能にするべく、５％未満の変動係数で、又はさらには２％未満の変動係数で決定される。
【００１６】
代わりの実施形態では、液体吸収率は、基準として乾燥粒子の重量を使用する代わりに乾燥粒子の体積を基準にして決定される。同様に、所与の具体的なカラムの１以上のカラムに充填されるアリコートの調製は、乾燥粒子の質量の代わりに乾燥粒子の体積を基準にして行い得る。
【００１７】
幾つかの実施形態では、カラムチャンバー内の乾燥膨潤性粒子は、液体をカラムに供給する前により一様な空間的分布が可能になるように操作することができる。図６に示す一実施形態では、液体の供給前にカラムを振動させ、別の実施形態ではガス（例えば空気）を液体の供給前にカラムの下端から注入する。これらの作用はいずれも乾燥粒子の少なくとも部分的な流動化を引き起こすことができ、その結果カラムチャンバーの水平底面全体でより一様な粒子の分布が得られる。このことの１つの利点は、液体を加えた後に膨潤粒子のより一様な空間的分布を達成し得ることである。この振動又はガス注入は、乾燥膨潤性粒子をカラムチャンバー又は可撓性容器に移した後のどの段階でも行い得る。一実施形態では、不活性ガスをカラム中に注入して、貯蔵中の酸化的分解反応に対する保護を提供し得る。
【００１８】
一実施形態では、液体は、上向流方向でカラムに供給される。そこで液体は底部入口から乾燥粒子ベッドを通って垂直方向に一様に上昇する結果、液体をカラムの上部から下向きに注入する場合より一様な粒子分布が得られる。粒子が液体により膨潤したら、その後カラムは任意の方向（上向流、下向流、傾斜形等）に作動させ得る。特定の実施形態では、乾燥膨潤性粒子への液体の添加速度は粒子による毛管吸引の速度を超えない。毛管吸引の速度は、例えば、乾燥膨潤性粒子を含むカラムを、乾燥ベッドの下端まで液体を含有するトラフ内に入れ、ベッドを通って上昇する液体の速度を光学、重量分析又はその他の方法で測定することによって決定することができる。液体の添加速度を毛管吸引の速度以下に保つことは、膨潤後より均質な粒子分布が、従ってより良好なカラム性能が得られるという利点を有する。液体の添加速度はカラムチャンバー内の液体速度（液体流量をカラムチャンバーの内部断面積で割った値）として表すことができる。特定の実施形態では、カラムチャンバー内の液体速度は液体を乾燥粒子に添加する間１００ｃｍ／ｈ未満、例えば５〜７０ｃｍ／ｈである。一実施形態では、液体は水性であり、その場合低級アルコール、例えばエタノールのような湿潤剤（表面張力を減少させる添加剤）、又は界面活性剤を含むことができる。その１つの利点は、膨潤後に、粒子の分布の均一性が向上することである。
【００１９】
図２に示す一実施形態では、膨潤性乾燥粒子をクロマトグラフィーカラム内のカラムチャンバーに移す工程は、最初に乾燥膨潤性粒子５を可撓性容器７に移した後可撓性容器をカラムチャンバー２内に入れることを含む。これには、容易に輸送される安価な可撓性容器に包装された粒子をユーザーに供給することができ、ユーザーがその容器をカラムに入れ、液体を供給することができるという利点がある。可撓性容器の壁はカラムチャンバーの多孔質上部及び下部プレートに対して嵌合される多孔質部分を有することができる。可撓性容器は例えばプラスチック製のバッグ構造であるか、又は成形及び／又は押出部品から組み立てることができる。一実施形態では、可撓性容器は膨潤粒子により拡大されてカラムチャンバーに嵌合する。
【００２０】
一実施形態では、本方法は、乾燥膨潤性粒子をカラムチャンバー８に移した後カラムを閉じる前に、ゲルの膨潤中及び／又はカラムの作動中のカラムチャンバーの寸法安定性をもたらすためにカラムチャンバー８を剛性ハウジング１１に移す工程を含んでいる。これに関連して、自立性カラムチャンバー８はゲルの膨潤中、又はカラムの作動中の加圧に起因して多少曲がり得る。剛性ハウジング１１はかかる偏り及びそれに関連するカラム性能の低下を防止する。
【００２１】
一実施形態では、本方法は、液体をカラムに添加する前に、カラム又は可撓性容器を乾燥膨潤性粒子と共に放射線殺菌する工程を含む。この工程は本方法のどの段階で行ってもよい。放射線殺菌はガンマ線又は電子線照射によって行うことができる。
【００２２】
本発明の一実施形態は乾燥膨潤性粒子を含むカラムであり、粒子の量はカラムチャンバー体積の約１０５〜１２０％の水性液体膨潤体積Ｖｓを与えるのに充分である。一実施形態では、この液体は２０℃の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の０．１ｍｏｌ／ｌ水溶液である。かかる溶液はおよそ１０ｍＳ／ｃｍの導電率を有しており、これは生体分子／バイオ医薬分離に使用される多くの緩衝液の範囲内である。
【００２３】
一実施形態では、乾燥膨潤性粒子の液体吸収率Ｖｓ／ｍｄ（０．１ＭＮａＣｌ水溶液中２０℃）は５〜２５ｍｌ／ｇ、例えば５〜１５ｍｌ／ｇである。この実施形態の１つの利点は、圧縮率の良好な制御及びカラムの作動中加えられる液体の組成による膨潤（及びカラム性能）の最小化された変動である。一実施形態では、乾燥膨潤性粒子の蒸留水中での液体吸収率は０．１ＭＮａＣｌ水溶液中での液体吸収率の１．５倍未満である。その利点は、液体組成による膨潤の変動が低く保たれることである。
【００２４】
一実施形態では、カラム体積は固定される。固定された体積のカラムは可動部品（アダプター等）を使用しないで構築することができ、これは構造を簡単化し、コストの観点から有利である。一実施形態では、カラムは成形又は押出部品からなる。射出成形、ブロー成形、回転成形、圧縮成形等のような成形及び押出法は、例えば熱可塑性材料からカラム部品を製造するのに便利で費用効果的な方法である。
【００２５】
一実施形態では、カラムチャンバー体積は少なくとも１リットルである。１リットルより大きいベッド体積を有するカラムが工業的なバイオ医薬の精製に使用されことが多い。これらは複雑であり、可動部品を備えた高価な鋼構造であることが多く、従って簡単なプラスチック構造を使用できる解決策が望ましい．
図２に示す一実施形態では、カラム１は、乾燥膨潤性粒子５を含む可撓性容器７からなる。これは、容易に輸送される安価な可撓性容器に包装された形態で粒子をユーザーに供給することができ、ユーザーがその容器をカラムに入れ液体を加えることができるという利点を有する。可撓性容器は１以上の可撓性壁、すなわち、支持されてない容器に１バールの過圧がかけられたとき容器の少なくとも１％の体積変化を生じるのに十分なほど曲がることができる壁を含むことができる。可撓性容器の壁はカラムチャンバー２の多孔質上部及び下部プレート１３に対して嵌合する多孔質部分を有することができる。可撓性容器は、例えばプラスチックバッグ構造であるか、又は成形及び／又は押出部品か組み立てることができる。一実施形態では、可撓性容器は粒子が膨潤する際にカラムチャンバーに嵌合するように膨潤することができる。別の実施形態では、粒子を保持し液体分布を提供する多孔質上部及び下部プレートセグメントは可撓性容器中に組み込み得る。この場合、可撓性容器は閉鎖系であり、可撓性容器を外部から機械的に支持するハウジング又はその他の部品と流体接触しない。
【００２６】
図３に示す一実施形態では、カラムは、例えば円形、楕円形又は矩形の横断面を有し、１以上の剛性管壁９と１以上の可撓性エンドピース１０を有する１以上の管状カラムチャンバー８を含んでいる。可撓性エンドピースは多孔質であって、多孔質上部又は下部プレート１３と直接接触して剛性ハウジング１１内に配置することができる。剛性ハウジングの上端及び下端は当技術分野で周知の一般的なクランピング構造体（図３には図示せず）により共に保持することができる。
【００２７】
一実施形態では、乾燥膨潤性粒子は架橋アガロースのような多糖類からなる。架橋アガロース粒子は高いスループット及び低い非特異的な吸着のために生体分子及びバイオ医薬の精製に極めて有用である。これらは通常水性エタノール溶液として供給され、乾燥アガロース粒子を使用することの利点は可燃性エタノールを取り扱う必要がないことである。アガロース粒子の乾燥は例えば凍結乾燥、噴霧乾燥又は真空乾燥を用いて行うことができる。
【００２８】
実施形態では、乾燥膨潤性粒子は荷電リガンドを含む。かかるリガンドは主としてイオン交換及び多モードの分離に使用され、これらはいずれも生体分子及びバイオ医薬の分離に極めて有用である。陽イオン交換体、陰イオン交換体及び多モードイオン交換体のいずれも考えられる。
【００２９】
一実施形態では、乾燥膨潤性粒子は疎水性官能基を含むリガンドを含む。かかるリガンドは疎水性相互作用クロマトグラフィー及び多くの多モード分離に使用され、いずれも生体分子及びバイオ医薬の分離に極めて有用である。リガンド及び疎水性官能基を有するリガンド部分の例はアルキル及びアリール基である。
【００３０】
一実施形態では、乾燥膨潤性粒子はアフィニティーリガンドを含む。かかるリガンドは生体分子及びバイオ医薬の高い選択性分離に極めて有用である。アフィニティーリガンドの例はプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、レクチン、酵素基質、レクチン、ビオチン、アビジン、抗体、抗体断片、抗原等である。
【００３１】
一実施形態では、乾燥膨潤性粒子と共にカラムに供給される液体はバイオ医薬のような１種以上の生体分子を含む。かかる液体の例には、タンパク質溶液及びウィルス懸濁液、例えばバイオプロセシング操作で精製されるべき供給材料がある。乾燥粒子を直接に供給材料で膨潤することの利点は、別の膨潤工程を省くことができること、及び膨潤自体が膨潤構造体中に浸透しない化学種に対する分離及び濃縮効果を提供することができることである。
【００３２】
本発明の一実施形態は、既に記載した実施形態に従って充填された膨潤粒子を含むカラムである。特定の実施形態では、カラムはある試験化学種に対して１５未満、例えば１０未満の換算段高さｈを有する。この試験化学種は無機塩又はアセトンのような保持されない小さい分子であることができる。別の実施形態では、カラムの非対称係数Ａｓは上記のように選択されるある試験化学種に対して３未満、例えば２．５未満である。
【００３３】
一実施形態は、同じバッチの乾燥膨潤性粒子から製造された少なくとも２つのカラムである。特定の実施形態では、これらのカラムは並列に接続される。同一のベッド体積、粒子種類及びベッド高さのカラムの並列接続は合計断面積及びスループットを増大させる便利な手段である。しかし、並列に接続されたカラムを使用する場合、各々のカラムで同一の分離が確実に達成されるように複数のカラムで流体速度を同じにすることが非常に重要である。これは、流体力学的抵抗及び圧力流挙動に関してカラムの再現性に高い要求を課す。複数のカラムに同一のバッチからの乾燥膨潤性粒子を使用することで、併用を可能にするように十分良好に流体力学的抵抗及び圧力流挙動を制御することが可能である。
【００３４】
一実施形態では、膨潤粒子を含むカラムはバイオ医薬のような１種以上の生体分子の分離に使用される。適切な生体分子はタンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、ウィルス粒子等であり得る。適切なバイオ医薬は免疫グロブリン（例えばモノクローナル抗体）、免疫グロブリン断片及びその他の構築体、インスリン及びその他の治療用ペプチド、エリスロポエチン、血漿タンパク質、オリゴヌクレオチド、プラスミド、ワクチン等であり得る。特定の実施形態では、生体分子又はバイオ医薬はタンパク質である。
【００３５】
一実施形態では、生体分子又はバイオ医薬は粒子に結合し、１種以上の不純物は洗浄液で洗浄することにより除去される。その後、生体分子又はバイオ医薬は溶出液により粒子から溶出され得る。この様式は結合−溶出分離といわれることが多く、不純物の量が多量であるとき及び／又は非常に高い分離選択性が要求されるときに特に有用である。
【００３６】
別の実施形態では、１種以上の不純物が粒子に結合し、生体分子又はバイオ医薬がカラムのフロースルーで回収される。この様式はフロースルー分離と呼ばれることが多く、特に不純物の量が比較的少ないとき、非常に高いスループットを提供する。
【００３７】
本発明のその他の特徴及び利点は以下の実施例及び特許請求の範囲から明らかとなろう。
【００３８】
本明細書の記載では、最良の態様を含めて本発明を開示するために、また当業者があらゆる装置又は系を作成し使用し、かつあらゆる組み込まれた方法を実行することを含めて本発明を実施するとができるように、実施例を使用する。本発明の特許可能な範囲は特許請求の範囲により定義されており、当業者には自明の他の例を包含し得る。かかる他の例は、特許請求の範囲の文言と異ならない構造要素を有する場合、又は特許請求の範囲の文言から実質的な差異のない等価な構造要素を含んでいる場合、特許請求の範囲内に入るものと考えられる。
【００３９】
図面の詳細な説明
図１ｉ）は、流体分配器３及び多孔質スクリーン４により区切られたカラムチャンバー２を有するカラム１の概略図である。
【００４０】
図１ｉｉ）は、カラムチャンバー内に乾燥膨潤性粒子５を有するカラムを示す。
【００４１】
図１ｉｉｉ）は、液体を加えた後膨潤粒子６がカラムチャンバーを満たしているカラムを示す。
【００４２】
図２ｉ）は、乾燥膨潤性粒子５を有する可撓性容器７の概略図である。
【００４３】
図２ｉｉ）は、多孔質プレート１３を有するカラムチャンバー２内に入れた可撓性容器７を示す。
【００４４】
図２ｉｉｉ）は、液体を加えた後カラムチャンバー内で膨潤粒子６が可撓性容器を満たし拡大しているカラムを示す。
【００４５】
図３は、剛性管壁９、可撓性多孔質エンドピース１０を有し、多孔質エンドピース１０と接触した流体分配器１２及び多孔質プレート１３を有する剛性ハウジング１１に嵌合された管状カラムチャンバー８内に乾燥膨潤性粒子５を有するカラム１４の概略図である。
【００４６】
図４は、工程ａ）が乾燥粒子をカラムに移すことからなり、工程ｂ）がカラムを閉じることからなり、工程ｃ）が液体をカラムに供給することからなる実施形態の流れ図である。
【００４７】
図５は、工程ａ）の前に、乾燥粒子の液体吸収率を決定し、その液体吸収率からカラムに移すべき粒子の量を決定することからなる工程ａ’）を含む実施形態の流れ図である。
【００４８】
図６は、工程ｃ）の前に、カラムを振動させることからなる工程ｃ’）を含む実施形態の流れ図である。
【００４９】
図７は、カラムの換算段高さｈ及び非対称係数Ａｓの計算を図解する。
【実施例】
【００５０】
カラム効率試験
カラム出口における滞留時間分布を分析するために、トレーサーとして、カラム体積の１〜１．５％の体積のトレーサー（アセトン２％ｖ／ｖ、ＤＩ水中）を適用する（ＵＶシグナル＠２８０ｎｍ）。滞留時間分布は単一のピークとして表されるべきである（図７参照）。評価は以下に記載する。
【００５１】
カラム効率は通例、以下の２つのパラメーターで定義される。
・カラムでのピークの広がりは相当理論段数（相当段数）で表される。
・ピークの対称性はピーク非対称係数Ａsで表される。
【００５２】
相対ピーク幅は（理論）段数Ｎ、理論段相当高さＨＥＴＰ又は好ましくは換算段高さｈとして定義される。
【００５３】
【数１】
非対称係数Ａsは理想的なＧａｕｓｓｉａｎピーク形状からの偏差を表し、ピーク高さの１０％におけるピーク幅から計算される。
【００５４】
【数２】
用語の定義
段数 Ｎ
平均滞留時間1 μ1
分散1 σ２
保持時間2 ｔR
保持体積2 ＶR
ピーク半値幅 ｗh
ベッド高さ Ｌ
粒子径 ｄp
理論段相当高さ ＨＥＴＰ
換算段高さ ｈ＝ＨＥＴＰ／ｄp
非対称係数 Ａs
1 トレーサーシグナルの積分から導かれる滞留時間分布（ＲＴＤ）曲線の一次及び二次モーメント
2 最大ピーク高さにでの時間（又は溶出体積）に対応する保持時間（保持体積）。
【００５５】
実施例１
使用した乾燥膨潤性粒子は、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）であり、水中で膨潤したときの平均直径が３４μｍの架橋アガロースビーズにテトラメチルアンモニウム基リガンドが結合した陰イオン交換体である。Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ粒子はアセトンに移してから室温で真空乾燥しておいたものである。
【００５６】
カラムチャンバー体積１ｍｌ当たり１２９ｍｇの乾燥粒子を異なる種類の２つの垂直に直立したカラム、すなわち、直径２６ｍｍ、高さ３０ｍｍ及び体積１５．９３ｍｌのカラムチャンバーを有するＸＫ２６カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）、及び直径５０ｍｍ、高さ３１ｍｍ及び体積６０．８７ｍｌのカラムチャンバーを有するＸＫ５０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）に移した。
【００５７】
２０％エタノールの水溶液を各々のカラムの底部入口に６０ｃｍ／ｈの流体速度でポンプ送給した。３カラムチャンバー体積がカラムを通過するまでポンプ送給を続けた後、３カラム体積の蒸留水を２００ｃｍ／ｈの流体速度でポンプ送給した。上向流及び下向流モードで交互に３００ｃｍ／ｈでポンプ送給した４×３のカラムチャンバー体積の蒸留水によってカラムを調整した。
【００５８】
カラムの性能を上記カラム効率試験により評価した。性能の結果を表１に示す。
【００５９】
【表１】
実施例２
使用した乾燥膨潤性粒子は、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）であり、水中で膨潤したときの平均直径が９０μｍのデキストラン修飾架橋アガロースビーズにスルホン酸基リガンドが結合した陽イオン交換体である。Ｃａｐｔｏ Ｓ粒子はアセトンに移してから室温で真空乾燥しておいたものである。
【００６０】
３．３４ｇの乾燥粒子を、直径２６ｍｍ、高さ３０ｍｍ及び体積１５．９３ｍｌのカラムチャンバーを有する垂直に直立したＸＫ２６カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）に移した。
【００６１】
２０％エタノールの水溶液を流体速度３０ｃｍ／ｈでカラムの底部入口にポンプ送給した。ポンプ送給を３カラムチャンバー体積がカラムを通過するまで続けた後、１．５カラム体積の蒸留水を流体速度１００ｃｍ／ｈでポンプ送給した。
【００６２】
カラムの性能を上記カラム効率試験で評価した。また、上向流モードの３４０ｃｍ／ｈの蒸留水を用いて２０ｈ安定性試験も行った。性能及び安定性の結果を表２に示す。
【００６３】
【表２】
本明細書中で挙げた特許、特許刊行物、及びその他の刊行文献は全て、各々が個別にかつ明確に援用されているかのように、その全体が援用により本明細書の一部をなすものとする。本発明の好ましい例示の実施形態に関して説明してきたが、当業者には了解されるように、本発明は、限定ではなく例示の目的で示しただけのもの以外の実施形態で実施することができる。本発明は後続の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子の液体クロマトグラフィー分離に有用な充填ベッドカラム、かかるカラムの充填方法、及びかかるカラムで生体分子を分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体クロマトグラフィー用のカラムは、通例、液体キャリアが流れる多孔質クロマトグラフィー媒体の充填ベッドを包囲する管体を含んでおり、分離は液体キャリアと多孔質媒体の固相との間の分配によって起こる。
【０００３】
分離プロセスに先立って、カラム内に導入される微粒子状媒体から始めてベッドを調製しなければならない。ベッドの形成プロセスは「充填手順」といわれ、正確に充填されたベッドは充填ベッドを含有するカラムの性能に影響する重大な要因である。通例、充填ベッドを調製するにはスラリーを充填、つまりカラム内にポンプ送給、注入又は吸引されたスラリーといわれる液体中の離散粒子の懸濁液を圧密化する。所定体積のスラリーがカラムに送り込まれたら、可動アダプターを、カラムの縦軸に沿ってカラムの下部に向けて、通常は一定の速度で動かすことによって、さらに圧密化し圧縮する必要がある。この手順中過剰の液体はカラム出口で排出され、媒体粒子は、孔が小さすぎて媒体粒子が通り抜けることのできないフィルター材料（いわゆる「ベッド支持体」）によって保持される。充填ベッドが最適な圧縮度に圧縮されたら充填プロセスは完了である。カラムにスラリーを充填する別の手法は流動充填法であり、この場合多孔質構造体の圧縮を達成するには主としてカラム全体に高流量を適用し、これにより出口ベッド支持体から始まる多孔質構造体を形成する。その結果得られる多孔質構造体中の粒子に対する牽引力は最終的に圧力降下及びベッドの圧縮を引き起こす。こうして圧縮されたベッドは最後にアダプターを正規の位置に配置することにより閉じ込められる。
【０００４】
その後のクロマトグラフ分離の効率は、１）充填ベッドの流体入口及び出口における液体分配及び収集系、２）充填ベッド内の媒体粒子の特別な配向（充填ジオメトリーともいわれる）、並びに３）充填ベッドの圧縮に強く依存している。充填ベッドの圧縮が低すぎると、そのベッドで実行されるクロマトグラフ分離が「テーリング」を起こし、一般に、かかる不充分に圧縮されたベッドは不安定である。充填ベッドの圧縮が高すぎると、そのベッドで実行されるクロマトグラフ分離は「リーディング」を起こし、かかる過圧縮ベッドは処理能力及び結合能力に影響する可能性があり、一般に、作動圧力がずっと高くなる。圧縮が最適であれば、使用中に形成される分離ピークは、リーディング又はテーリングがずっと少なくなり、実質的に対称である。最適な圧縮度はまた、多孔質構造体の良好な長期安定性を達成することにより、多くのプロセスサイクルを通じて最適な性能を確保するのにも重大である。カラムに必要とされる最適な圧縮度は各カラムの大きさ（幅又は直径）、ベッド高さ、及び媒体の種類に対して実験的に決定される。
【０００５】
代わりの充填法は「乾式充填」といわれ、カラムを多孔質媒体の乾燥粒子で満たした後液体をカラムに導入するものである。これは、充填液体に保存剤を添加する必要がなく、また輸送中の重量を最小にすることなく、顧客に乾燥状態で送ることができるプレフィルドカラムで有益である。乾式充填は通例、例えば、Ｇ Ｇｕｉｏｃｈｏｎ Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ ７０４ （１９９５） ２４７−２６８に記載されているように、小さい分子の分離を目的として、シリカ媒体に対して使用されるが、得られるカラム効率はかなり悪い。しかし、生体分子の分離に通常使用されるデキストラン又はアガロース系媒体のような膨潤性クロマトグラフィー媒体の場合、乾式充填は、粒子が膨潤すると充填ベッドの性能が落ちると認識されていたため避けられてきた。米国特許第４３５３８０１号には、溶媒膨潤性スチレン−ジビニルベンゼン粒子の乾式充填が湿式充填より劣ると述べられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第４３６６０６０号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の１つの態様は、乾燥膨潤性粒子から始めて高効率クロマトグラフィーカラムを充填する方法を提供する。これは、ａ）カラムチャンバー体積の約１０５〜１２０％の液体膨潤体積Ｖｓを与えるのに充分な量の乾燥膨潤性粒子５をクロマトグラフィーカラム１内のカラムチャンバー２に移し、ｂ）カラムを閉じ、ｃ）液体をカラムに供給する工程を含む方法によって達成される。言い換えると、この方法は、乾燥膨潤性粒子５のアリコート（一定の試料）を（例えば秤量することにより）量り取り、アリコートをクロマトグラフィーカラム１内のカラムチャンバー２に供給し、カラムチャンバーを閉じ、カラムチャンバーに液体を供給することを含んでおり、ここでアリコートの膨潤体積Ｖｓはカラムチャンバー体積の約１０５〜１２０％である。
【０００８】
本発明の特定の態様は、ユーザーに容易に輸送されユーザーにより平衡化される貯蔵安定性のプレフィルドカラムである。これは、乾燥膨潤性粒子を含むカラムにより達成され、ここで粒子の量はカラムチャンバー体積の約１０５〜１２０％の水性液体膨潤体積Ｖｓを与えるのに充分なものである。
【０００９】
１以上の上記態様は特許請求の範囲に定義される本発明によって達成され得る。本発明の追加の態様、詳細及び利点は以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、カラム及び乾燥膨潤性粒子で充填する方法の概略図である。
【図２】図２は、可撓性容器がカラムチャンバー内に挿入された実施形態を示す。
【図３】図３は、管状のカラムチャンバーが剛性ハウジング内に装着された実施形態を示す。
【図４】図４は、充填方法の流れ図である。
【図５】図５は、乾燥膨潤性粒子の液体吸収率を決定する実施形態の流れ図である。
【図６】図６は、液体を加える前にカラムを振動させる実施形態の流れ図である。
【図７】図７は、カラム性能を計算するやり方を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義
本明細書中で、用語「膨潤性粒子」は、液体中に浸漬したときに大きさが増大する粒子を意味する。これは、同じ量の乾燥粒子の嵩体積よりずっと大きい液体中の沈降体積として観察することができる。
【００１２】
本明細書中で、用語「膨潤体積」（Ｖｓ）は、液体に懸濁させ平衡化させた粒子のアリコートの沈降体積を意味する。沈降体積を測定するには、粒子のアリコートを懸濁させ、最大２４ｈ平衡化させ、必要であれば粒子を再懸濁させ、粒子を沈降させ、目盛付容器（例えばメスシリンダー）で沈降体積を測定することができる。
【００１３】
本明細書中で、用語「液体吸収率」（Ｖｓ／ｍｄ）は、上で定義された粒子のアリコートの膨潤体積Ｖｓと、液体に浸漬する前の粒子アリコートの乾燥重量ｍｄとの比を意味する。
【００１４】
図１及び図４に示す本発明の一実施形態では、ある量の乾燥膨潤性粒子５をクロマトグラフィーカラム１内のカラムチャンバー２に移す。ここで、粒子の量は、液体膨潤体積Ｖｓがカラムチャンバー体積の約１０５〜１２０％になるのに充分である。次に、カラムを閉じ、カラムチャンバーに液体を供給する。膨潤体積はカラムチャンバー体積より大きいので、粒子ベッドは対応する程度（充填されたカラムの圧縮率ＣＦは通常Ｖｓ／Ｖｃｏｌと定義され、ここでＶｃｏｌはカラムチャンバー体積である）に圧縮され、その結果高いカラム効率と低いピークの非対称性が得られる。カラム効率は換算段高さｈとして表すことができ、これは段高さを粒子の平均直径で割った値である。段高さは当技術分野で周知の方法で測定される。ピークの非対称性は非対称係数Ａｓで表すことができ、これはピークの後部曲線からピークの中心までの間隔と、前部曲線からピーク中心までの間隔との比である（全て、ピーク高さの１０％のところで測定する）。段高さと非対称係数はいずれも小さい分子の保持されない種に対して適切に測定される。カラムは軸流式又は輻流式として設計し得、また流体分配器３を含み得る。カラムチャンバーの入口と出口は、粒子を保持し液体を通過させるために多孔質スクリーン４により区切られ得る。多孔質スクリーンは製織メッシュ、焼結フリット又はその他あらゆる種類の多孔質材料から製造し得る。
【００１５】
図５に示す別の実施形態では、本方法における最初の工程は、乾燥膨潤性粒子の液体吸収率Ｖｓ／ｍｄを決定し、液体吸収率からカラムチャンバーに移すべき乾燥膨潤性粒子の量を決定することである。液体吸収率は、代表的な試料に関して確立されている方法を使用して粒子の個々の試料アリコートから決定することができる。試料を乾燥状態で（すなわち周囲の大気と平衡した状態で）秤量した後試験液体に懸濁させる。試験液体は、カラムの充填及び作動に使用されるものと同じ液体、又は同様な組成の液体、通例同様なイオン強度／導電率及びｐＨの水性緩衝液又は塩溶液であることができる。試験液体中の粒子を、通例約１時間、いかなる場合でも２４時間以下の時間平衡化させる。粒子を再懸濁させ、沈降させる。沈降体積を、例えばメスシリンダーで測定する。次に、沈降体積Ｖｓと乾燥粒子試料の重量ｍｄとの比Ｖｓ／ｍｄとして液体吸収率を計算する。液体吸収率を最初に測定することの１つの利点は、カラム内の粒子の膨潤体積を予測することができ、その結果圧縮及びカラム効率をより良好に制御できることである。特定の実施形態では、液体吸収率は、カラム性能の制御における高い精度を可能にするべく、５％未満の変動係数で、又はさらには２％未満の変動係数で決定される。
【００１６】
代わりの実施形態では、液体吸収率は、基準として乾燥粒子の重量を使用する代わりに乾燥粒子の体積を基準にして決定される。同様に、所与の具体的なカラムの１以上のカラムに充填されるアリコートの調製は、乾燥粒子の質量の代わりに乾燥粒子の体積を基準にして行い得る。
【００１７】
幾つかの実施形態では、カラムチャンバー内の乾燥膨潤性粒子は、液体をカラムに供給する前により一様な空間的分布が可能になるように操作することができる。図６に示す一実施形態では、液体の供給前にカラムを振動させ、別の実施形態ではガス（例えば空気）を液体の供給前にカラムの下端から注入する。これらの作用はいずれも乾燥粒子の少なくとも部分的な流動化を引き起こすことができ、その結果カラムチャンバーの水平底面全体でより一様な粒子の分布が得られる。このことの１つの利点は、液体を加えた後に膨潤粒子のより一様な空間的分布を達成し得ることである。この振動又はガス注入は、乾燥膨潤性粒子をカラムチャンバー又は可撓性容器に移した後のどの段階でも行い得る。一実施形態では、不活性ガスをカラム中に注入して、貯蔵中の酸化的分解反応に対する保護を提供し得る。
【００１８】
一実施形態では、液体は、上向流方向でカラムに供給される。そこで液体は底部入口から乾燥粒子ベッドを通って垂直方向に一様に上昇する結果、液体をカラムの上部から下向きに注入する場合より一様な粒子分布が得られる。粒子が液体により膨潤したら、その後カラムは任意の方向（上向流、下向流、傾斜形等）に作動させ得る。特定の実施形態では、乾燥膨潤性粒子への液体の添加速度は粒子による毛管吸引の速度を超えない。毛管吸引の速度は、例えば、乾燥膨潤性粒子を含むカラムを、乾燥ベッドの下端まで液体を含有するトラフ内に入れ、ベッドを通って上昇する液体の速度を光学、重量分析又はその他の方法で測定することによって決定することができる。液体の添加速度を毛管吸引の速度以下に保つことは、膨潤後より均質な粒子分布が、従ってより良好なカラム性能が得られるという利点を有する。液体の添加速度はカラムチャンバー内の液体速度（液体流量をカラムチャンバーの内部断面積で割った値）として表すことができる。特定の実施形態では、カラムチャンバー内の液体速度は液体を乾燥粒子に添加する間１００ｃｍ／ｈ未満、例えば５〜７０ｃｍ／ｈである。一実施形態では、液体は水性であり、その場合低級アルコール、例えばエタノールのような湿潤剤（表面張力を減少させる添加剤）、又は界面活性剤を含むことができる。その１つの利点は、膨潤後に、粒子の分布の均一性が向上することである。
【００１９】
図２に示す一実施形態では、膨潤性乾燥粒子をクロマトグラフィーカラム内のカラムチャンバーに移す工程は、最初に乾燥膨潤性粒子５を可撓性容器７に移した後可撓性容器をカラムチャンバー２内に入れることを含む。これには、容易に輸送される安価な可撓性容器に包装された粒子をユーザーに供給することができ、ユーザーがその容器をカラムに入れ、液体を供給することができるという利点がある。可撓性容器の壁はカラムチャンバーの多孔質上部及び下部プレートに対して嵌合される多孔質部分を有することができる。可撓性容器は例えばプラスチック製のバッグ構造であるか、又は成形及び／又は押出部品から組み立てることができる。一実施形態では、可撓性容器は膨潤粒子により拡大されてカラムチャンバーに嵌合する。
【００２０】
一実施形態では、本方法は、乾燥膨潤性粒子をカラムチャンバー８に移した後カラムを閉じる前に、ゲルの膨潤中及び／又はカラムの作動中のカラムチャンバーの寸法安定性をもたらすためにカラムチャンバー８を剛性ハウジング１１に移す工程を含んでいる。これに関連して、自立性カラムチャンバー８はゲルの膨潤中、又はカラムの作動中の加圧に起因して多少曲がり得る。剛性ハウジング１１はかかる偏り及びそれに関連するカラム性能の低下を防止する。
【００２１】
一実施形態では、本方法は、液体をカラムに添加する前に、カラム又は可撓性容器を乾燥膨潤性粒子と共に放射線殺菌する工程を含む。この工程は本方法のどの段階で行ってもよい。放射線殺菌はガンマ線又は電子線照射によって行うことができる。
【００２２】
本発明の一実施形態は乾燥膨潤性粒子を含むカラムであり、粒子の量はカラムチャンバー体積の約１０５〜１２０％の水性液体膨潤体積Ｖｓを与えるのに充分である。一実施形態では、この液体は２０℃の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の０．１ｍｏｌ／ｌ水溶液である。かかる溶液はおよそ１０ｍＳ／ｃｍの導電率を有しており、これは生体分子／バイオ医薬分離に使用される多くの緩衝液の範囲内である。
【００２３】
一実施形態では、乾燥膨潤性粒子の液体吸収率Ｖｓ／ｍｄ（０．１ＭＮａＣｌ水溶液中２０℃）は５〜２５ｍｌ／ｇ、例えば５〜１５ｍｌ／ｇである。この実施形態の１つの利点は、圧縮率の良好な制御及びカラムの作動中加えられる液体の組成による膨潤（及びカラム性能）の最小化された変動である。一実施形態では、乾燥膨潤性粒子の蒸留水中での液体吸収率は０．１ＭＮａＣｌ水溶液中での液体吸収率の１．５倍未満である。その利点は、液体組成による膨潤の変動が低く保たれることである。
【００２４】
一実施形態では、カラム体積は固定される。固定された体積のカラムは可動部品（アダプター等）を使用しないで構築することができ、これは構造を簡単化し、コストの観点から有利である。一実施形態では、カラムは成形又は押出部品からなる。射出成形、ブロー成形、回転成形、圧縮成形等のような成形及び押出法は、例えば熱可塑性材料からカラム部品を製造するのに便利で費用効果的な方法である。
【００２５】
一実施形態では、カラムチャンバー体積は少なくとも１リットルである。１リットルより大きいベッド体積を有するカラムが工業的なバイオ医薬の精製に使用されことが多い。これらは複雑であり、可動部品を備えた高価な鋼構造であることが多く、従って簡単なプラスチック構造を使用できる解決策が望ましい．
図２に示す一実施形態では、カラム１は、乾燥膨潤性粒子５を含む可撓性容器７からなる。これは、容易に輸送される安価な可撓性容器に包装された形態で粒子をユーザーに供給することができ、ユーザーがその容器をカラムに入れ液体を加えることができるという利点を有する。可撓性容器は１以上の可撓性壁、すなわち、支持されてない容器に１バールの過圧がかけられたとき容器の少なくとも１％の体積変化を生じるのに十分なほど曲がることができる壁を含むことができる。可撓性容器の壁はカラムチャンバー２の多孔質上部及び下部プレート１３に対して嵌合する多孔質部分を有することができる。可撓性容器は、例えばプラスチックバッグ構造であるか、又は成形及び／又は押出部品か組み立てることができる。一実施形態では、可撓性容器は粒子が膨潤する際にカラムチャンバーに嵌合するように膨潤することができる。別の実施形態では、粒子を保持し液体分布を提供する多孔質上部及び下部プレートセグメントは可撓性容器中に組み込み得る。この場合、可撓性容器は閉鎖系であり、可撓性容器を外部から機械的に支持するハウジング又はその他の部品と流体接触しない。
【００２６】
図３に示す一実施形態では、カラムは、例えば円形、楕円形又は矩形の横断面を有し、１以上の剛性管壁９と１以上の可撓性エンドピース１０を有する１以上の管状カラムチャンバー８を含んでいる。可撓性エンドピースは多孔質であって、多孔質上部又は下部プレート１３と直接接触して剛性ハウジング１１内に配置することができる。剛性ハウジングの上端及び下端は当技術分野で周知の一般的なクランピング構造体（図３には図示せず）により共に保持することができる。
【００２７】
一実施形態では、乾燥膨潤性粒子は架橋アガロースのような多糖類からなる。架橋アガロース粒子は高いスループット及び低い非特異的な吸着のために生体分子及びバイオ医薬の精製に極めて有用である。これらは通常水性エタノール溶液として供給され、乾燥アガロース粒子を使用することの利点は可燃性エタノールを取り扱う必要がないことである。アガロース粒子の乾燥は例えば凍結乾燥、噴霧乾燥又は真空乾燥を用いて行うことができる。
【００２８】
実施形態では、乾燥膨潤性粒子は荷電リガンドを含む。かかるリガンドは主としてイオン交換及び多モードの分離に使用され、これらはいずれも生体分子及びバイオ医薬の分離に極めて有用である。陽イオン交換体、陰イオン交換体及び多モードイオン交換体のいずれも考えられる。
【００２９】
一実施形態では、乾燥膨潤性粒子は疎水性官能基を含むリガンドを含む。かかるリガンドは疎水性相互作用クロマトグラフィー及び多くの多モード分離に使用され、いずれも生体分子及びバイオ医薬の分離に極めて有用である。リガンド及び疎水性官能基を有するリガンド部分の例はアルキル及びアリール基である。
【００３０】
一実施形態では、乾燥膨潤性粒子はアフィニティーリガンドを含む。かかるリガンドは生体分子及びバイオ医薬の高い選択性分離に極めて有用である。アフィニティーリガンドの例はプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、レクチン、酵素基質、レクチン、ビオチン、アビジン、抗体、抗体断片、抗原等である。
【００３１】
一実施形態では、乾燥膨潤性粒子と共にカラムに供給される液体はバイオ医薬のような１種以上の生体分子を含む。かかる液体の例には、タンパク質溶液及びウィルス懸濁液、例えばバイオプロセシング操作で精製されるべき供給材料がある。乾燥粒子を直接に供給材料で膨潤することの利点は、別の膨潤工程を省くことができること、及び膨潤自体が膨潤構造体中に浸透しない化学種に対する分離及び濃縮効果を提供することができることである。
【００３２】
本発明の一実施形態は、既に記載した実施形態に従って充填された膨潤粒子を含むカラムである。特定の実施形態では、カラムはある試験化学種に対して１５未満、例えば１０未満の換算段高さｈを有する。この試験化学種は無機塩又はアセトンのような保持されない小さい分子であることができる。別の実施形態では、カラムの非対称係数Ａｓは上記のように選択されるある試験化学種に対して３未満、例えば２．５未満である。
【００３３】
一実施形態は、同じバッチの乾燥膨潤性粒子から製造された少なくとも２つのカラムである。特定の実施形態では、これらのカラムは並列に接続される。同一のベッド体積、粒子種類及びベッド高さのカラムの並列接続は合計断面積及びスループットを増大させる便利な手段である。しかし、並列に接続されたカラムを使用する場合、各々のカラムで同一の分離が確実に達成されるように複数のカラムで流体速度を同じにすることが非常に重要である。これは、流体力学的抵抗及び圧力流挙動に関してカラムの再現性に高い要求を課す。複数のカラムに同一のバッチからの乾燥膨潤性粒子を使用することで、併用を可能にするように十分良好に流体力学的抵抗及び圧力流挙動を制御することが可能である。
【００３４】
一実施形態では、膨潤粒子を含むカラムはバイオ医薬のような１種以上の生体分子の分離に使用される。適切な生体分子はタンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、ウィルス粒子等であり得る。適切なバイオ医薬は免疫グロブリン（例えばモノクローナル抗体）、免疫グロブリン断片及びその他の構築体、インスリン及びその他の治療用ペプチド、エリスロポエチン、血漿タンパク質、オリゴヌクレオチド、プラスミド、ワクチン等であり得る。特定の実施形態では、生体分子又はバイオ医薬はタンパク質である。
【００３５】
一実施形態では、生体分子又はバイオ医薬は粒子に結合し、１種以上の不純物は洗浄液で洗浄することにより除去される。その後、生体分子又はバイオ医薬は溶出液により粒子から溶出され得る。この様式は結合−溶出分離といわれることが多く、不純物の量が多量であるとき及び／又は非常に高い分離選択性が要求されるときに特に有用である。
【００３６】
別の実施形態では、１種以上の不純物が粒子に結合し、生体分子又はバイオ医薬がカラムのフロースルーで回収される。この様式はフロースルー分離と呼ばれることが多く、特に不純物の量が比較的少ないとき、非常に高いスループットを提供する。
【００３７】
本発明のその他の特徴及び利点は以下の実施例及び特許請求の範囲から明らかとなろう。
【００３８】
本明細書の記載では、最良の態様を含めて本発明を開示するために、また当業者があらゆる装置又は系を作成し使用し、かつあらゆる組み込まれた方法を実行することを含めて本発明を実施するとができるように、実施例を使用する。本発明の特許可能な範囲は特許請求の範囲により定義されており、当業者には自明の他の例を包含し得る。かかる他の例は、特許請求の範囲の文言と異ならない構造要素を有する場合、又は特許請求の範囲の文言から実質的な差異のない等価な構造要素を含んでいる場合、特許請求の範囲内に入るものと考えられる。
【００３９】
図面の詳細な説明
図１ｉ）は、流体分配器３及び多孔質スクリーン４により区切られたカラムチャンバー２を有するカラム１の概略図である。
【００４０】
図１ｉｉ）は、カラムチャンバー内に乾燥膨潤性粒子５を有するカラムを示す。
【００４１】
図１ｉｉｉ）は、液体を加えた後膨潤粒子６がカラムチャンバーを満たしているカラムを示す。
【００４２】
図２ｉ）は、乾燥膨潤性粒子５を有する可撓性容器７の概略図である。
【００４３】
図２ｉｉ）は、多孔質プレート１３を有するカラムチャンバー２内に入れた可撓性容器７を示す。
【００４４】
図２ｉｉｉ）は、液体を加えた後カラムチャンバー内で膨潤粒子６が可撓性容器を満たし拡大しているカラムを示す。
【００４５】
図３は、剛性管壁９、可撓性多孔質エンドピース１０を有し、多孔質エンドピース１０と接触した流体分配器１２及び多孔質プレート１３を有する剛性ハウジング１１に嵌合された管状カラムチャンバー８内に乾燥膨潤性粒子５を有するカラム１４の概略図である。
【００４６】
図４は、工程ａ）が乾燥粒子をカラムに移すことからなり、工程ｂ）がカラムを閉じることからなり、工程ｃ）が液体をカラムに供給することからなる実施形態の流れ図である。
【００４７】
図５は、工程ａ）の前に、乾燥粒子の液体吸収率を決定し、その液体吸収率からカラムに移すべき粒子の量を決定することからなる工程ａ’）を含む実施形態の流れ図である。
【００４８】
図６は、工程ｃ）の前に、カラムを振動させることからなる工程ｃ’）を含む実施形態の流れ図である。
【００４９】
図７は、カラムの換算段高さｈ及び非対称係数Ａｓの計算を図解する。
【実施例】
【００５０】
カラム効率試験
カラム出口における滞留時間分布を分析するために、トレーサーとして、カラム体積の１〜１．５％の体積のトレーサー（アセトン２％ｖ／ｖ、ＤＩ水中）を適用する（ＵＶシグナル＠２８０ｎｍ）。滞留時間分布は単一のピークとして表されるべきである（図７参照）。評価は以下に記載する。
【００５１】
カラム効率は通例、以下の２つのパラメーターで定義される。
・カラムでのピークの広がりは相当理論段数（相当段数）で表される。
・ピークの対称性はピーク非対称係数Ａsで表される。
【００５２】
相対ピーク幅は（理論）段数Ｎ、理論段相当高さＨＥＴＰ又は好ましくは換算段高さｈとして定義される。
【００５３】
【数１】
非対称係数Ａsは理想的なＧａｕｓｓｉａｎピーク形状からの偏差を表し、ピーク高さの１０％におけるピーク幅から計算される。
【００５４】
【数２】
用語の定義
段数 Ｎ
平均滞留時間1 μ1
分散1 σ２
保持時間2 ｔR
保持体積2 ＶR
ピーク半値幅 ｗh
ベッド高さ Ｌ
粒子径 ｄp
理論段相当高さ ＨＥＴＰ
換算段高さ ｈ＝ＨＥＴＰ／ｄp
非対称係数 Ａs
1 トレーサーシグナルの積分から導かれる滞留時間分布（ＲＴＤ）曲線の一次及び二次モーメント
2 最大ピーク高さにでの時間（又は溶出体積）に対応する保持時間（保持体積）。
【００５５】
実施例１
使用した乾燥膨潤性粒子は、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）であり、水中で膨潤したときの平均直径が３４μｍの架橋アガロースビーズにテトラメチルアンモニウム基リガンドが結合した陰イオン交換体である。Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ粒子はアセトンに移してから室温で真空乾燥しておいたものである。
【００５６】
カラムチャンバー体積１ｍｌ当たり１２９ｍｇの乾燥粒子を異なる種類の２つの垂直に直立したカラム、すなわち、直径２６ｍｍ、高さ３０ｍｍ及び体積１５．９３ｍｌのカラムチャンバーを有するＸＫ２６カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）、及び直径５０ｍｍ、高さ３１ｍｍ及び体積６０．８７ｍｌのカラムチャンバーを有するＸＫ５０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）に移した。
【００５７】
２０％エタノールの水溶液を各々のカラムの底部入口に６０ｃｍ／ｈの流体速度でポンプ送給した。３カラムチャンバー体積がカラムを通過するまでポンプ送給を続けた後、３カラム体積の蒸留水を２００ｃｍ／ｈの流体速度でポンプ送給した。上向流及び下向流モードで交互に３００ｃｍ／ｈでポンプ送給した４×３のカラムチャンバー体積の蒸留水によってカラムを調整した。
【００５８】
カラムの性能を上記カラム効率試験により評価した。性能の結果を表１に示す。
【００５９】
【表１】
実施例２
使用した乾燥膨潤性粒子は、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）であり、水中で膨潤したときの平均直径が９０μｍのデキストラン修飾架橋アガロースビーズにスルホン酸基リガンドが結合した陽イオン交換体である。Ｃａｐｔｏ Ｓ粒子はアセトンに移してから室温で真空乾燥しておいたものである。
【００６０】
３．３４ｇの乾燥粒子を、直径２６ｍｍ、高さ３０ｍｍ及び体積１５．９３ｍｌのカラムチャンバーを有する垂直に直立したＸＫ２６カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）に移した。
【００６１】
２０％エタノールの水溶液を流体速度３０ｃｍ／ｈでカラムの底部入口にポンプ送給した。ポンプ送給を３カラムチャンバー体積がカラムを通過するまで続けた後、１．５カラム体積の蒸留水を流体速度１００ｃｍ／ｈでポンプ送給した。
【００６２】
カラムの性能を上記カラム効率試験で評価した。また、上向流モードの３４０ｃｍ／ｈの蒸留水を用いて２０ｈ安定性試験も行った。性能及び安定性の結果を表２に示す。
【００６３】
【表２】
本明細書中で挙げた特許、特許刊行物、及びその他の刊行文献は全て、各々が個別にかつ明確に援用されているかのように、その全体が援用により本明細書の一部をなすものとする。本発明の好ましい例示の実施形態に関して説明してきたが、当業者には了解されるように、本発明は、限定ではなく例示の目的で示しただけのもの以外の実施形態で実施することができる。本発明は後続の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラフィーカラム（１）を乾燥膨潤性粒子で充填する方法であって、ａ）カラムチャンバー体積の約１０５〜１２０％の液体膨潤体積Ｖｓを与えるのに充分な量の乾燥膨潤性粒子（５）をクロマトグラフィーカラム内のカラムチャンバー（２）に移す工程と、ｂ）カラムを閉じる工程と、ｃ）液体をカラムに供給する工程と
を含む方法。
【請求項２】
さらに、工程ａ）の前に、乾燥膨潤性粒子の液体吸収率Ｖｓ／ｍｄを決定し、その液体吸収率から、カラムチャンバーに移すべき乾燥膨潤性粒子の量を決定する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
液体吸収率を５％未満の変動係数で決定する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
さらに、工程ｃ）の前に、カラムを振動に付す工程を含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
工程ｃ）において、液体を上向流方向でカラムに供給する、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
工程ｃ）において、液体の添加速度が粒子による毛管吸引速度を超えない、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
工程ａ）が、最初に乾燥膨潤性粒子を可撓性容器（７）に移した後、可撓性容器をカラムチャンバー（２）内に入れることを含む、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
工程ａ）が、ゲルの膨潤中及び／又はカラムの作動中カラムチャンバーに対する寸法安定性をもたらす剛性ハウジング（１１）にカラムチャンバー（８）を移すことを含む、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
さらに、工程ｃ）の前に、カラム又は可撓性容器を乾燥膨潤性粒子と共に放射線殺菌する工程を含む、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
乾燥膨潤性粒子と共にカラムに供給される液体が１種以上のバイオ医薬のような生体分子を含む、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
乾燥膨潤性粒子を含むカラムであって、粒子の量が、カラムチャンバー体積の約１０５〜１２０％の水性液体膨潤体積Ｖｓを与えるのに充分である、カラム。
【請求項１２】
前記液体が２０℃の０．１ＭＮａＣｌ水溶液である、請求項１１記載のカラム。
【請求項１３】
前記乾燥膨潤性粒子の液体吸収率Ｖｓ／ｍｄ（０．１ＭＮａＣｌ水溶液中、２０℃）が５〜２５ｍｌ／ｇ、例えば５〜１５ｍｌ／ｇである、請求項１１又は請求項１２記載のカラム。
【請求項１４】
前記乾燥膨潤性粒子の蒸留水中での液体吸収率が０．１ＭＮａＣｌ水溶液中での液体吸収率の１．５倍未満である、請求項１１乃至請求項１３のいずれか１項記載のカラム。
【請求項１５】
前記カラム体積が一定である、請求項１１乃至請求項１４のいずれか１項記載のカラム。
【請求項１６】
前記カラムが、乾燥膨潤性粒子（５）を含む可撓性容器（７，８）からなる、請求項１１乃至請求項１５のいずれか１項記載のカラム。
【請求項１７】
前記カラムが、１以上の剛性管壁（９）及び１以上の可撓性エンドピース（１０）を有する１以上の管状カラムチャンバー（８）を含む、請求項１１乃至請求項１５のいずれか１項記載のカラム。
【請求項１８】
前記管状カラムチャンバーが剛性ハウジング（１１）内に装着されている、請求項１７記載のカラム。
【請求項１９】
前記カラムが成形又は押出部品からなる、請求項１１乃至請求項１８のいずれか１項記載のカラム。
【請求項２０】
前記乾燥膨潤性粒子が架橋アガロースからなる、請求項１１乃至請求項１９のいずれか１項記載のカラム。
【請求項２１】
前記乾燥膨潤性粒子が荷電リガンドを含む、請求項１１乃至請求項２０のいずれか１項記載のカラム。
【請求項２２】
前記乾燥膨潤性粒子が疎水性官能基を含むリガンドを含む、請求項１１乃至請求項２１のいずれか１項記載のカラム。
【請求項２３】
前記乾燥膨潤性粒子がアフィニティーリガンドを含む、請求項１１乃至請求項２２のいずれか１項記載のカラム。
【請求項２４】
前記液体が１種以上のバイオ医薬のような生体分子を含む、請求項１１乃至請求項２３のいずれか１項記載のカラム。
【請求項２５】
請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法で製造された、膨潤粒子を含むカラム。
【請求項２６】
換算段高さｈが１５未満、例えば１０未満である、請求項２５記載のカラム。
【請求項２７】
非対称係数Ａｓが３未満、例えば２．５未満である、請求項２５又は２６記載のカラム。
【請求項２８】
同一バッチの乾燥膨潤性粒子から製造された、請求項１１乃至請求項２７のいずれか１項記載の少なくとも２つのカラム。
【請求項２９】
並列に接続された、請求項２８記載の少なくとも２つのカラム。
【請求項３０】
請求項２５乃至請求項２９のいずれか１項記載の１以上のカラムの、１種以上のバイオ医薬のような生体分子の分離のための使用。
【請求項３１】
前記生体分子又はバイオ医薬がタンパク質である、請求項３０記載の使用。
【請求項３２】
生体分子又はバイオ医薬が粒子に結合し、１種以上の不純物が洗浄液で洗浄することにより除去される、請求項３０又は請求項３１記載の使用。
【請求項３３】
１種以上の不純物が粒子に結合し、生体分子又はバイオ医薬がカラムのフロースルーで回収される、請求項３０乃至請求項３２のいずれか１項記載の使用。
【請求項１】
クロマトグラフィーカラム（１）を乾燥膨潤性粒子で充填する方法であって、ａ）カラムチャンバー体積の約１０５〜１２０％の液体膨潤体積Ｖｓを与えるのに充分な量の乾燥膨潤性粒子（５）をクロマトグラフィーカラム内のカラムチャンバー（２）に移す工程と、ｂ）カラムを閉じる工程と、ｃ）液体をカラムに供給する工程と
を含む方法。
【請求項２】
さらに、工程ａ）の前に、乾燥膨潤性粒子の液体吸収率Ｖｓ／ｍｄを決定し、その液体吸収率から、カラムチャンバーに移すべき乾燥膨潤性粒子の量を決定する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
液体吸収率を５％未満の変動係数で決定する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
さらに、工程ｃ）の前に、カラムを振動に付す工程を含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
工程ｃ）において、液体を上向流方向でカラムに供給する、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
工程ｃ）において、液体の添加速度が粒子による毛管吸引速度を超えない、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
工程ａ）が、最初に乾燥膨潤性粒子を可撓性容器（７）に移した後、可撓性容器をカラムチャンバー（２）内に入れることを含む、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
工程ａ）が、ゲルの膨潤中及び／又はカラムの作動中カラムチャンバーに対する寸法安定性をもたらす剛性ハウジング（１１）にカラムチャンバー（８）を移すことを含む、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
さらに、工程ｃ）の前に、カラム又は可撓性容器を乾燥膨潤性粒子と共に放射線殺菌する工程を含む、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
乾燥膨潤性粒子と共にカラムに供給される液体が１種以上のバイオ医薬のような生体分子を含む、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
乾燥膨潤性粒子を含むカラムであって、粒子の量が、カラムチャンバー体積の約１０５〜１２０％の水性液体膨潤体積Ｖｓを与えるのに充分である、カラム。
【請求項１２】
前記液体が２０℃の０．１ＭＮａＣｌ水溶液である、請求項１１記載のカラム。
【請求項１３】
前記乾燥膨潤性粒子の液体吸収率Ｖｓ／ｍｄ（０．１ＭＮａＣｌ水溶液中、２０℃）が５〜２５ｍｌ／ｇ、例えば５〜１５ｍｌ／ｇである、請求項１１又は請求項１２記載のカラム。
【請求項１４】
前記乾燥膨潤性粒子の蒸留水中での液体吸収率が０．１ＭＮａＣｌ水溶液中での液体吸収率の１．５倍未満である、請求項１１乃至請求項１３のいずれか１項記載のカラム。
【請求項１５】
前記カラム体積が一定である、請求項１１乃至請求項１４のいずれか１項記載のカラム。
【請求項１６】
前記カラムが、乾燥膨潤性粒子（５）を含む可撓性容器（７，８）からなる、請求項１１乃至請求項１５のいずれか１項記載のカラム。
【請求項１７】
前記カラムが、１以上の剛性管壁（９）及び１以上の可撓性エンドピース（１０）を有する１以上の管状カラムチャンバー（８）を含む、請求項１１乃至請求項１５のいずれか１項記載のカラム。
【請求項１８】
前記管状カラムチャンバーが剛性ハウジング（１１）内に装着されている、請求項１７記載のカラム。
【請求項１９】
前記カラムが成形又は押出部品からなる、請求項１１乃至請求項１８のいずれか１項記載のカラム。
【請求項２０】
前記乾燥膨潤性粒子が架橋アガロースからなる、請求項１１乃至請求項１９のいずれか１項記載のカラム。
【請求項２１】
前記乾燥膨潤性粒子が荷電リガンドを含む、請求項１１乃至請求項２０のいずれか１項記載のカラム。
【請求項２２】
前記乾燥膨潤性粒子が疎水性官能基を含むリガンドを含む、請求項１１乃至請求項２１のいずれか１項記載のカラム。
【請求項２３】
前記乾燥膨潤性粒子がアフィニティーリガンドを含む、請求項１１乃至請求項２２のいずれか１項記載のカラム。
【請求項２４】
前記液体が１種以上のバイオ医薬のような生体分子を含む、請求項１１乃至請求項２３のいずれか１項記載のカラム。
【請求項２５】
請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法で製造された、膨潤粒子を含むカラム。
【請求項２６】
換算段高さｈが１５未満、例えば１０未満である、請求項２５記載のカラム。
【請求項２７】
非対称係数Ａｓが３未満、例えば２．５未満である、請求項２５又は２６記載のカラム。
【請求項２８】
同一バッチの乾燥膨潤性粒子から製造された、請求項１１乃至請求項２７のいずれか１項記載の少なくとも２つのカラム。
【請求項２９】
並列に接続された、請求項２８記載の少なくとも２つのカラム。
【請求項３０】
請求項２５乃至請求項２９のいずれか１項記載の１以上のカラムの、１種以上のバイオ医薬のような生体分子の分離のための使用。
【請求項３１】
前記生体分子又はバイオ医薬がタンパク質である、請求項３０記載の使用。
【請求項３２】
生体分子又はバイオ医薬が粒子に結合し、１種以上の不純物が洗浄液で洗浄することにより除去される、請求項３０又は請求項３１記載の使用。
【請求項３３】
１種以上の不純物が粒子に結合し、生体分子又はバイオ医薬がカラムのフロースルーで回収される、請求項３０乃至請求項３２のいずれか１項記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１３−５１５２５８（Ｐ２０１３−５１５２５８Ａ）
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４５９００（Ｐ２０１２−５４５９００）
【出願日】平成２２年１２月２０日（２０１０．１２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２０１０／０５１４２４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７８７７２
【国際公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（５９７０６４７１３）ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ (109)
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２０日（２０１０．１２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２０１０／０５１４２４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７８７７２
【国際公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（５９７０６４７１３）ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ (109)
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