グラム陰性菌におけるＬＰＳの脱アシル化
本件発明は、リピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性を示し、グラム陰性ＬＰＳの修飾及び／又は解毒が可能な、新規グラム陰性ポリペプチドを提供するものである。本発明はまた、本発明に記載の３−Ｏ−脱アシル化酵素活性を備え、又は該活性による処理を施され、薬学的及び／又は獣医学的な目的、特に、百日咳菌、パラ百日咳菌及び気管支敗血症菌などの病原性グラム陰性菌に対する全細胞又は無細胞ワクチンの調製に使用が可能な、グラム陰性菌、グラム陰性菌リポ多糖類（ＬＰＳ）及びＬＰＳを含む組成物も提供するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本件発明は、微生物学分野、特にグラム陰性ＬＰＳの合成及び修飾という生物学分野に関するものである。本発明はまた、医学分野、特に細菌性病原体に対するワクチン接種の分野にも関する。本発明はさらに、薬学的及び／又は獣医学的な目的、特に、百日咳菌（Bordetella pertussis）、パラ百日咳菌（Bordetella parapertussis）及び気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）などのグラム陰性菌に対するワクチンの調製に使用が可能な、グラム陰性菌、グラム陰性菌リポ多糖類（ＬＰＳ）及びＬＰＳを含む組成物にも関する。本発明はさらに、脱アシル化ＬＰＳを含有するワクチンを提供し、全細胞ワクチン及び無細胞ワクチンの調製における修飾及び解毒を施されたＬＰＳの使用を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
百日咳菌感染症は百日咳の病原因子であって、毎年の推定症例数は６０００万件とされ、全世界で年間約３５５，０００人が命を落としており（ＷＨＯ）、特に小児と免疫力の弱い人々がその犠牲者となっている。抗生物質による治療が利用可能ではあるが（エリスロマイシン）、この疾患であると診断される頃には、細菌性毒素によって重篤な障害が発生してしまっている場合が多い。したがって、この疾患の予防が非常に重要となる。主なコントロール手段は、依然としてワクチン接種である。従来から、百日咳（pertussis）（「百日咳（whooping-cough）」）感染症に対するワクチンは、百日咳菌の全細胞をベースとするものであった。加熱処理、ホルマリン又はその他の手段により殺菌した全菌体を含む全細胞百日咳ワクチンは、一般的なワクチン接種プログラムに１９５０年代初頭から含まれている。
【０００３】
幼児における百日咳の予防には効果的である一方で、全細胞百日咳ワクチンを用いた予防接種は、小児においては、発熱、けいれん及び脳障害を含む、局所性、全身性及び神経性の反応を伴うものであった。小児における百日咳の予防接種後の副作用の大部分に、ＬＰＳが関与している。動物が細菌に感染している間、ＬＰＳ又はそのリピドＡ部分は、Ｔｏｌｌ様受容体、主としてＴＬＲ−４との相互作用を通じて、先天性免疫系を活性化する。リピドＡに対する宿主反応には、陽イオン性抗菌ペプチド、サイトカイン、ケモカイン及び付加的な免疫活性化分子の産生が含まれる。限定的な感染においては、リピドＡに対する反応が細菌を除去する一助となるが、全身性敗血症においては、高いレベルの血中サイトカイン及び凝固促進活性により微小血管系が損傷する場合や、播種性血管内凝固症候群を伴うグラム陰性敗血症ショック症候群を促進する場合がある。
【０００４】
ＬＰＳに対する抗体によってある程度の防御が可能であることがマウスでの受動免疫実験で示されているものの、百日咳ワクチンにおけるＬＰＳの防御的役割についての決定的証拠は何も得られていない。しかし、これに加えて、及びより重要なことに、ワクチン中のＬＰＳの存在は、他の抗原に対する免疫応答を増大させることで、実際にアジュバント活性を提供するのである（K. Mills: Immunity to Bordetella pertussis. Microbes and Infection 3: 655-677 (2001)）。
【０００５】
安全性への懸念は、ワクチンの摂取（uptake）に悪影響を及ぼし、百日咳菌由来の高度精製抗原で調製された無細胞百日咳ワクチンを開発する動機となった。近年では、いわゆる「全細胞ワクチン」すなわち「ＷＣＶ」以外に、無細胞ワクチンすなわち「ＡＣＶ」も数カ国で導入されてきている。
【０００６】
無細胞ワクチンには、１〜３又はそれ以上の病原体の抗原が含まれているのが普通である。百日咳菌抗原の場合は、以下のものが通常使用される：百日咳毒素（ＰＴ、通常は、免疫原性を保持したままでその毒性を破壊するための処理がされている）、線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、線毛及び６９ｋＤのタンパク質又はペルタクチン（Prn）。一般に、無細胞ワクチンの反応発生率は、全細胞ワクチンの反応発生率よりもかなり低い。無細胞ワクチンに付随する全身反応（発熱、嘔吐、不機嫌、食欲不振）及び局所反応（腫脹、発赤、熱感、圧痛、硬直、疼痛）の頻度は、かなり低いものである。しかし、無細胞ワクチンの防御免疫が全細胞ワクチンの防御作用に匹敵するものであるかどうかについては、臨床データに鑑みて、いまだに意見が分かれるところである。多くの研究においては全細胞ワクチンの防御作用のほうが大きいとされ、このことが、幼児における全細胞ワクチンの、まれではあるが重篤な副作用の危険性に勝るものであるかどうかに関しては、議論が継続中である。現在、無細胞ワクチンを最多で６回接種する、各種の予防接種案が試行されている。全細胞ワクチンは当初、最後の追加免疫が４〜６歳の間に行われる定期予防接種スケジュールに組み込まれて、５回接種されていた。無細胞百日咳ワクチンは、現在、１０代での最終接種（ジフテリア・破傷風ワクチンと組み合わせたもの）を含めて６回接種することが推奨されている。無細胞ワクチンは、全細胞をベースにしたワクチンよりも安全だと思われるが、以前百日咳ワクチンに対してアレルギー反応を示したことのある小児には、どちらのワクチンも接種すべきではない。
【０００７】
百日咳全細胞ワクチンの副作用は、当該技術分野において、十分に立証されている（論評：S.H. Yeh: Pertussis: persistent pathogen, imperfect vaccines. Expert Rev. Vaccines 2: 113-127 (2003)）。現在使用されている無細胞ワクチンは、こうした副作用を部分的には克服しているものの、これらのワクチンによりもたらされる防御免疫には依然として異論もあり、かなり改善の余地がある。重要なことに、モデルマウスにおいて、全細胞ワクチンは無細胞ワクチンよりも優れた長期防御作用を示しているのである（K. Mills: Immunity to Bordetella pertussis. Microbes and Infection 3: 655-677 (2001)）。また、無細胞ワクチンのほうが製造コストが高く製造も困難であり、各種抗原の単離、高レベルの精製及び品質管理、並びにそうした抗原の、最適量・所望量での混合及び製剤が必要となってくる。百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌及びその他のグラム陰性菌のより優れたワクチンが長年にわたって求められているのは、明らかである。
【非特許文献１】K. Mills: Immunity to Bordetella pertussis. Microbes and Infection 3: 655-677 (2001)
【非特許文献２】S.H. Yeh: Pertussis: persistent pathogen, imperfect vaccines. Expert Rev. Vaccines 2: 113-127 (2003)
【発明の開示】
【０００８】
本件発明は、改良された百日咳ワクチンの調製方法及び手段を提供する。本発明は、新規ボルデテラタンパク質を開示している。これらの新規百日咳菌タンパク質、パラ百日咳菌タンパク質、及び気管支敗血症菌タンパク質、並びにこれらのタンパク質をコードするＤＮＡ分子を本発明にしたがって使用してリピドＡを修飾し、それによって、少なくとも部分的に３−Ｏ−脱アシル化され、解毒されたＬＰＳを含む、新規百日咳菌株、パラ百日咳菌株及び気管支敗血症菌株、並びにその他のグラム陰性菌細胞を提供する。本件発明は、部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたＬＰＳを含むボルデテラ菌種細菌細胞を含む、改良されたワクチン接種用組成物、及び、単離され、少なくとも部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたＬＰＳ又はインビトロで３−Ｏ−脱アシル化されたＬＰＳを含む医薬組成物をも提供する。本発明はさらに、３−Ｏ−脱アシル化されたリピドＡ及び／又はＬＰＳ分子に対して作製された特異抗体も提供する。
【０００９】
グラム陰性菌外膜の主要な成分であるリポ多糖（ＬＰＳ）は、透過障壁としての外膜の機能及び補体媒介性細胞溶解への耐性に重要であることが知られており（Raetz, C. R. H., and Whitfield, C. (2002) Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700にて論評されている）、共有結合した３つのドメインである、リピドＡ、コア部分、及びＯ−抗原からなっている。リピドＡは、疎水性膜アンカーを形成し、ＬＰＳの内毒素活性に関与している。大腸菌においてリピドＡは、２位、３位、２’位及び３’位で、エステル結合又はアミド結合を介してＲ−３−ヒドロキシミリスチン酸残基で置換されている、１，４’−ビスリン酸化β−１，６−結合グルコサミン二糖類からなっている。二次ラウロイル基及びミリストイル基は、２’位及び３’位で、Ｒ−３−ヒドロキシミリストイルのヒドロキシル基をそれぞれ置換している（図１Ａ）。リン酸基、グルコサミン二糖類、並びに正しい数及び長さのアシル鎖がリピドＡの生物学的活性に重要であることが、以前の研究により示されている（Raetz, C. R. H., and Whitfield, C. (2002) Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700；Loppnow, H., Brade, H., Durrbaum, I., Dinarello, C. A., Kusumoto, S., Rietschel, E. T., and Flad, H. D. (1989) J. Immunol. 142, 3229-3238；Steeghs, L., Berns, M., ten Hove, J., de Jong, A., Roholl, P., van Alphen, L., Tommassen, J., and van der Ley, P. (2002) Cell. Microbiol. 4, 599-611）。
【００１０】
２つのリン酸の置換パターン並びにアシル鎖の数及び長さにわずかな変異が認められるものの、リピドＡの基本構造がグラム陰性菌間でよく保存されているのは、理にかなったことである（Nikaido, H., and Vaara, M. (1987) in Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., ed) Vol. 1, pp. 7-22, American Society for Microbiology, Washington, D. C.；Caroff, M., Karibian, D., Cavaillon, J-M., and Haeffner-Cavaillon, N. (2002) Microbes Infect. 4, 915-926）。リピドＡの別の修飾（図１Ｂ）は、サルモネラ属菌のネズミチフス菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium)）において、二成分制御系PhoP/PhoQによって制御されている（Guo, L., Lim, K. B., Gunn, J. S., Bainbridge, B., Darveau, R. P., Hackett, M., and Miller, S. I. (1997) Science 276, 250-253；Guo, L., Lim, K. B., Poduje, C. M., Daniel, M., Gunn, J. S., Hackett, M., and Miller, S. I. (1998) Cell 95, 189-198）。Ｍｇ２＋の低いレベルに反応して、センサーキザーゼPhoQがリン酸化し、それによって転写活性因子のPhoPを活性化し、これが４０の異なる遺伝子の活性化又は抑制へとつながっていく（Guo, L., Lim, K. B., Gunn, J. S., Bainbridge, B., Darveau, R. P., Hackett, M., and Miller, S. I. (1997) Science 276, 250-253；Gunn, J. S., Belden, W. J., Miller, S. I. (1998) Microb. Pathog. 25, 77-90）。リピドＡの修飾に関与する第二の制御系はPmrA/PmrB二成分系であり、これはそれ自体がPhoP/PhoQによって制御されている（Gunn, J. S., Lim, K. B., Krueger, J., Kim, K., Guo, L., Hackett, M., and Miller, S. I. (1998) Mol. Microbiol. 27, 1171-1182；Gunn, J. S., Ryan, S. S., Van Velkinburgh, J. C., Ernst, R. K., and Miller, S. I. (2000) Infect. Immun. 68, 6139-6146）。PhoP/PhoQ系に変異を有する変異体は、毒性の低下及び抗菌ペプチドに対する感受性の増大を示す（Miller, S. I., Kukral, A. M., and Mekalanos, J. J. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5054-5058；Gunn, J. S., and Miller, S. I. (1996) J. Bacteriol. 178, 6857-6864）。PhoP/PhoQ及びPmrA/PmrB系の相同体が、大腸菌、ペスト菌（Yersinia pestis）、及び緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）を含む他のグラム陰性菌で同定されている（Ernst, R. K., Guina, T., and Miller, S. I. (1999) J. Infect. Dis. 179, Suppl. 2, 326-330；Ernst, R. K., Yi, E. C., Guo, L., Lim, K. B., Burns, J. L., Hackett, M., and Miller, S. I. (1999) Science 286, 1561-1565）。
【００１１】
現在までに、数種類のリピドＡ修飾酵素が同定されている。ネズミチフス菌における、１つ又は２つの４−アミノ−４−デオキシ−Ｌ−アラビノース（L-Ara4N）部分による１及び４’リン酸基の置換は、酵素ArnTに依存することがわかっている（Trent, M. S., Ribeiro, A. A., Lin, S., Cotter, R. J., and Raetz, C. R. H. (2001) J. Biol. Chem. 276, 43122-43131）。最近、Pmrcタンパク質が、サルモネラ菌において、リピドＡへのホスホエタノールアミン（pEtN）の付加を仲介していることがわかった（Lee, H., Hsu, F. F., Turk, J., and Groisman, E. A. (2004) J. Bacteriol. 186, 4124-4133）。LpxOと命名された他の酵素は、リピドＡのＯ２依存性ヒドロキシル化に触媒作用を及ぼし（Gibbons, H. S., Lin, S., Cotter, R. J., and Raetz C. R. H. (2000) J. Biol. Chem. 275, 32940-32949）、リピドＡ１−ホスホターゼは、リゾビウム レグミノサルム（Rhizobium leguminosarum）中で同定されている（Karbarz, M. J., Kalb, S. R., Cotter, R. J., and Raetz, C. R. H. (2003) J. Biol. Chem. 278, 39269-39279）。これらの酵素はすべて内膜又はペリプラズム空間内部に存在すると考えられている（Trent, M. S., Ribeiro, A. A., Lin, S., Cotter, R. J., and Raetz, C. R. H. (2001) J. Biol. Chem. 276, 43122-43131；Lee, H., Hsu, F. F., Turk, J., and Groisman, E. A. (2004) J. Bacteriol. 186, 4124-4133；Gibbons, H. S., Lin, S., Cotter, R. J., and Raetz C. R. H. (2000) J. Biol. Chem. 275, 32940-32949；Karbarz, M. J., Kalb, S. R., Cotter, R. J., and Raetz, C. R. H. (2003) J. Biol. Chem. 278, 39269-39279）。最近、新種の外膜局在リピドＡ修飾酵素が発見された。その１つがパルミトイルトランスフェラーゼPagPである（Bishop, R. E., Gibbons, H. S., Guina, T., Trent, M. S., Miller, S. I., and Raetz, C. R. H. (2000) EMBO J. 19, 5071-5080）。リピドＡのパルミトイル化は、陽イオン性抗菌ペプチドに対する耐性の増大につながる（Guo, L., Lim, K. B., Poduje, C. M., Daniel, M., Gunn, J. S., Hackett, M., and Miller, S. I. (1998) Cell 95, 189-198）。さらに、パルミトイル化リピドＡは、ＬＰＳによるヒト細胞の活性化に拮抗する（Tanamoto, K., and Azumi, S. (2000) J. Immunol. 164, 3149-3156）。PagPの相同体は、ネズミチフス菌、百日咳菌、気管支敗血症、パラ百日咳菌、在郷軍人病菌（Legionella pneumophila）、大腸菌、及びペスト菌など、他のものにおいても発見されている（Bishop, R. E., Gibbons, H. S., Guina, T., Trent, M. S., Miller, S. I., and Raetz, C. R. H. (2000) EMBO J. 19, 5071-5080；Robey, M., O'Connell, W., and Cianciotto, N. P. (2001) Infect. Immun. 69, 4276-4286）。
【００１２】
他の外膜局在リピドＡ修飾酵素に、３−Ｏ−脱アシル化酵素のPagLがある（Trent, M. S., Pabich, W., Raetz, C. R. H., and Miller, S. I.(2001) J. Biol. Chem. 276, 9083-9092）。この酵素はネズミチフス菌で発見され、リピドＡの３位でエステル結合を加水分解し、それによって一次（primary）３−ヒドロキシミリストイル部分を放出することが示されている（Trent, M. S., Pabich, W., Raetz, C. R. H., and Miller, S. I. (2001) J. Biol. Chem. 276, 9083-9092）。これまで、近縁種であるチフス菌（Salmonella typhi）及びパラチフス菌（Salmonella paratyphi）以外には、pagLの明らかな相同体を非冗長又は未完成の微生物データベースで見つけることができなかった（Trent, M. S., Pabich, W., Raetz, C. R. H., and Miller, S. I. (2001) J. Biol. Chem. 276, 9083-9092）。しかし、緑膿菌（Ernst, R. K., Yi, E. C., Guo, L., Lim, K. B., Burns, J. L., Hackett, M., and Miller, S. I. (1999) Science 286, 1561-1565）、Ｒ．レグミノサルム菌（R. leguminosarum）（Bhat, U. R., Forsberg, L. S., and Carlson, R. W. (1994) J. Biol. Chem. 269, 14402-14410）、ヘリコバクター ピロリ菌（Helicobacter pylori）（Moran, A. P., Lindner, B., and Walsh, E. J. (1997) J. Bacteriol. 179, 6453-6463）、及びポルヒロモナス ジンジバリス菌（Porhyromonas gingivalis）（Kumada, H., Haishima, Y., Umemoto, T., and Tanamoto, K. (1995) J. Bacteriol. 177, 2098-2106）などの他のグラム陰性菌のなかには、３−Ｏ−脱アシル化リピドＡ種を含有するものもあり、このことは、これらの生物がPagLと類似した活性を有する酵素を含有していることを示唆している。
【００１３】
本件発明は、様々なグラム陰性菌におけるpagL相同体の同定について開示している。各種タンパク質と進歩したバイオインフォマティクスツールとの間の限定的な配列類似性を用いて、これらの相同体及びその活性部位残基を同定した。本明細書において本発明者らは、様々なグラム陰性菌における異種発現のためのpagL相同体の存在及び使用について記載している。サルモネラ菌種由来の既知のpagL遺伝子との全体的な配列類似性はやや低いものの、Ｃ末端領域において、保存されたPagLドメインを識別することができた。
【００１４】
先行技術に記載されているのはサルモネラ菌種由来のPagLタンパク質のみである。また、開示されているのは大腸菌のみにおけるpagLの異種発現であり（Trent, M. S., Pabich, W., Raetz, C. R. H., and Miller, S. I.(2001) J. Biol. Chem. 276, 9083-9092）、その結果として脱アシル化ＬＰＳが生じている。他のグラム陰性菌におけるpagL相同体の存在に関するデータは、当該技術分野においてまったく入手できない。他のグラム陰性菌におけるpagLの相同的発現、他のグラム陰性菌においてPagLが機能しているかどうか、他のグラム陰性菌におけるリピドＡ／ＬＰＳ組成物、細菌生存率、毒性及び免疫原性に対するPagLの作用などは、すべて未知の因子である。大腸菌におけるサルモネラpagLの異種発現に関する限られたデータのみが入手可能であって、そうしたデータにおいては、グラム陰性菌感染の自然な状態を反映することのない、組換えヒトＴＬＲ４を発現する細胞中で、ＴＬＲ応答が測定されている（Kawasaki et al., J Biol Chem. 2004）。
【００１５】
本件発明の明細書は、緑膿菌及び気管支敗血症菌のpagL相同体の活性を開示している。かかる活性は大腸菌及びボルデテラ菌種での異種発現により確認されており、活性の結果としてリピドＡからＲ−３−ヒドロキシミリストイル基が除去されている。ＬＰＳの生物学的活性に対する作用を、ヒトマクロファージ細胞で分析した。PagLによる脱アシル化の際に、大腸菌リピドＡ（百日咳菌リピドＡではなく）には別の修飾が施されたが、これは内在性パルミトイルトランスフェラーゼPagPの活性の結果として生じたことだった。さらに、活性部位残基として、保存された一組のヒスチジン−セリンを同定した。このことは、セリン加水分解酵素に似た触媒機構を示唆するものである。最後に、ＬＰＳ基質上でのPagLのインビトロ活性が示されている。PagLの生物学的機能を本発明にしたがって応用して、グラム陰性菌の病原性、毒性、及び免疫原性を修飾してもよい。こうした修飾は、細菌の全菌体、又はそれから誘導可能な部分、断片又は化合物上で発生する場合がある。本発明は、最終的に、本発明に記載のグラム陰性菌の全細胞、又はこうした細菌から入手可能な及び／又は単離した、修飾したリピドＡ／ＬＰＳ、若しくはインビトロで修飾したＬＰＳ／リピドＡ分子を含む、グラム陰性菌感染症に対する新規ワクチンを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
定義：
「配列同一性」は、本明細書において、２以上のアミノ酸（ポリペプチド又はタンパク質）配列又は２以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列の間の、かかる配列を比較することによって決定される関係として定義されている。当該技術において「同一性」は、アミノ酸配列間又は核酸配列間の配列関連性の程度も意味し、配列関連性の程度は、場合によってはそうした配列間のマッチによって決定される。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、あるポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換と、第二のポリペプチドの配列とを比較することによって、決定される。「同一性」及び「類似性」は、公知の方法によって容易に計算可能である。そうした方法としては、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; 及び Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)に記載の方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
同一性を決定する好ましい方法は、テストする配列間の一致が最大となるように設計されている。同一性及び類似性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラム中で体系化されている。２つの配列間の同一性及び類似性を決定する好ましいコンピュータプログラムの方法には、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)）、BestFit、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)）などがある。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩ及びその他の情報源から公的に入手可能である（BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)）。周知のSmith Watermanアルゴリズムも、同一性の決定に用いてもよい。
【００１８】
ポリペプチド配列比較用の好ましいパラメータとして、以下のものがある：アルゴリズム：Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)；比較行列：BLOSSUM62 from Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)；ギャップペナルティー：１２；及びギャップ長ペナルティー：４。これらのパラメータに有用なプログラムは、ウィスコンシン州マディソンに所在のGenetics Computer Group社から「Ｏギャップ」プログラムとして公的に入手可能である。前述のパラメータは、アミノ酸比較用のデフォルトパラメータである（エンドギャップについてはペナルティーなし）。核酸比較用の好ましいパラメータとして、以下のものがある：アルゴリズム：Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)；比較行列：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０；ギャップペナルティー：５０；及びギャップ長ペナルティー：３。ウィスコンシン州マディソンに所在のGenetics Computer Group社からギャッププログラムとして入手可能である。上記のものは、核酸比較用のデフォルトパラメータである。
【００１９】
当業者には明らかなように、アミノ酸類似性の程度を決定する際に、当業者が任意でいわゆる「同類（conservative）」アミノ酸置換も考慮に入れる場合がある。同類アミノ酸置換とは、類似した側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループとしては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンがあり、脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループとしては、セリン及びスレオニンがあり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループとしては、アスパラギン及びグルタミンがあり、芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループとしては、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンがあり、塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループとしては、リジン、アルギニン、及びヒスチジンがあり、酸性側鎖を有するアミノ酸のグループとしては、アスパラギン酸及びグルタミン酸があり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループとしては、システイン及びメチオニンがある。好ましい同類アミノ酸置換基としては、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンがある。本明細書で開示するアミノ酸配列の置換変異型は、開示された配列中の少なくとも１つの残基が除去され、別の残基がその場所に挿入されたものである。かかるアミノ酸の変更が同類であることが好ましい。天然アミノ酸それぞれについて好ましい同類置換は以下の通りである：Ａｌａ→ｓｅｒ；Ａｒｇ→ｌｙｓ；Ａｓｎ→ｇｌｎ又はｈｉｓ；Ａｓｐ→ｇｌｕ；Ｃｙｓ→ｓｅｒ又はａｌａ；Ｇｌｎ→ａｓｎ；Ｇｌｕ→ａｓｐ；Ｇｌｙ→ｐｒｏ；Ｈｉｓ→ａｓｎ又はｇｌｎ；Ｉｌｅ→ｌｅｕ又はｖａｌ；Ｌｅｕ→ｉｌｅ又はｖａｌ；Ｌｙｓ→ａｒｇ；ｇｌｎ又はｇｌｕ；Ｍｅｔ→ｌｅｕ又はｉｌｅ；Ｐｈｅ→ｍｅｔ、ｌｅｕ又はｔｙｒ；Ｓｅｒ→ｔｈｒ；Ｔｈｒ→ｓｅｒ；Ｔｒｐ→ｔｙｒ；Ｔｙｒ→ｔｒｐ又はｐｈｅ；及びＶａｌ→ｉｌｅ又はｌｅｕ。
【００２０】
本発明のＤＮＡ断片が別のＤＮＡ断片に対して機能的な関係に置かれている場合、前記断片は「作用可能な状態で結合している」。例えば、プロモーター又はエンハンサーが、あるコード配列の転写を刺激する場合、かかるプロモーター又はエンハンサーは前記コード配列に作用可能な状態で結合している。シグナル配列用のＤＮＡが、あるポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現する場合、前記ＤＮＡはそのポリペプチドをコードするＤＮＡに作用可能な状態で結合している。一般に、作用可能な状態で結合しているＤＮＡ配列は隣接しており、シグナル配列の場合は、隣接し、かつ読取相（reading phase）内にある。しかし、エンハンサーは、そのエンハンサーが転写を制御しているコード配列に隣接している必要はない。結合は、都合のよい制限部位、又はその代わりに挿入されたアダブター若しくはリンカーでのライゲーションにより完成する。
【００２１】
適切なプロモーター配列の選択は、一般に、そのＤＮＡ断片を発現させるために選択された宿主細胞によって異なる。好適なプロモーター配列としては、当該技術分野で周知の原核細胞プロモーター及び真核細胞プロモーターが例示できる（例えば、上記Sambrook and Russell, 2001参照）。転写調節配列は一般的に、宿主によって認識される異種エンハンサー又はプロモーターを含んでいる。適切なプロモーターの選択は宿主によって異なるが、trp、lac及びファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、並びに糖分解酵素プロモーターのようなプロモーターが周知であり、利用可能である（例えば、上記Sambrook and Russell, 2001参照）。発現ベクターは複製システムを含んでおり、また、ポリペプチドコード断片用の挿入部位を備えた転写及び翻訳調節配列を用いることができる。細胞株及び発現ベクターの効果的な組み合わせの例は、Sambrook and Russell（２００１、上記）、及びMetzger et al. (1988) Nature 334: 31-36に記載されている。例えば、好適な発現ベクターを、Ｓ．セレビシエ（S.cerevisiae）などの酵母、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞、及び大腸菌又はボルデテラ菌種などの細菌細胞中で発現させることができる。
【００２２】
第一の実施形態において、本件発明は、リピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性を有し、そのため、配列番号１に対して少なくとも２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８又は９９％のアミノ酸同一性を示す新規ポリペプチドを提供する。前記ポリペプチドは、インビボについては実施例３に例示され、インビトロについては実施例９に記されている、本明細書に記載の検定により測定されたリピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性を示す。リピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性を有するポリペプチドは、配列番号１に記載のポリペプチド、気管支敗血症菌及びパラ百日咳菌のPagLタンパク質、又はその一部やその変異体、又はリピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性を有する配列番号１の一部を少なくとも含む融合タンパク質であることが好ましい。
【００２３】
別の実施形態において本件発明は、配列番号１に対して少なくとも２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８又は９９％のアミノ酸同一性を示すポリペプチドをコードする核酸配列を含む。本発明の核酸配列は、それぞれ気管支敗血症菌及びパラ百日咳菌に由来のpagL遺伝子である配列番号２又は配列番号３に記載の核酸配列に対して５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８又は９９％の同一性を示すことが好ましい。かかる核酸配列は、完全長コード配列であってもよく、又はそれに由来するコード若しくは非コード（若しくは相補）部分、断片、若しくはオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００２４】
本発明はさらに、本発明に記載の核酸配列を含む、及び／又は配列番号１に対して少なくとも２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８又は９９％のアミノ酸同一性を示すポリペプチドをコードする、ＤＮＡベクターを含むものである。本発明のＤＮＡベクターは当該技術分野で周知のいかなるベクターであってもよく、例えば、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、人工染色体、（相同）ゲノム組み込み用ベクターなどが例示されるが、これらに限定されるものではない。かかるベクターは、抗生物質への耐性、蛍光標識、分子タグなどをもたらす、選択可能なマーカーなどのマーカーを含んでいてもよい。本発明に記載の核酸のクローニング方法及びコードされたタンパク質の発現方法は、当業者には周知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 1989や、Ausubel F. et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, 2004に記されている。本件発明のベクターは、プロモーター、エンハンサー及びターミネーターなどの調節配列に核酸配列が作用可能な状態で結合しており、そのため、遺伝子が発現し、メッセンジャーがリピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素タンパク質へと翻訳されているベクターであることが好ましい。かかるベクターは、任意により誘導可能な方法で、例えば、プラスミドpMMB67上の誘導可能なtacプロモーターによって、グラム陰性菌宿主細胞に発現を起こさせ、かつリピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性を与えることができることが最も好ましい。
【００２５】
本発明は、配列番号１のポリペプチドに結合可能な抗体も提供する。本発明の抗体は、実施例に示すように、本発明のポリペプチドを注入することにより宿主中で作製したモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってもよい。診断目的で、例えば、グラム陰性菌におけるPagLタンパク質及びその変異体又はその相同体の発現を分析するために、抗体を用いてもよい。また、リピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性を示すタンパク質の単離及び／又は精製のために、抗体を用いてもよい。
【００２６】
本発明は、別の態様において、本発明の核酸分子を含む、及び／又は本発明のポリペプチド分子をコードする、グラム陰性菌に関している。かかる核酸分子は、本発明のＤＮＡベクター内部に含まれ、コードされたタンパク質のグラム陰性菌中での発現をもたらし、リピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性のソース（source）を細胞に提供することが好ましい。前記グラム陰性菌は、配列番号１においてPagLタンパク質に対してかなりの（＞４０％）同一性を有するタンパク質のようなリピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性を示す機能タンパク質をコードする遺伝子を、そのゲノムに含まない細菌であることが好ましい。リピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性のソースを提供することにより、グラム陰性菌細胞の細胞壁外膜におけるＬＰＳの組成が変化することが最も好ましい。リピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性のソースを提供されるグラム陰性菌は、配列番号２又は３にて提供されている核酸配列に対してかなりの相同性を有している、百日咳菌のように、例えば、変異、フレームシフト、又は欠損により、非機能的遺伝子を含む細菌であってもよい。
【００２７】
しかし、リピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性を有するタンパク質をコードする（部分的）機能遺伝子をそのゲノムに含むグラム陰性菌にも、本発明の範囲内で、この活性の別のソースが提供されてもよい。グラム陰性菌は、ある程度のリピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性を有していてもよいが、本発明のポリペプチドをさらに発現させること及び／又はその発現を増大させることによって、かかる活性を増大させてもよい。この結果、細菌中のリピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性が、かかる細菌のリピドＡ及び／又はＬＰＳ組成が野生型細菌と比較して一次的又は永久的に変化する又は改変される程度に、一次的又は永久的に増加することが好ましい。そうしたグラム陰性菌は、例えば、パラ百日咳菌や気管支敗血症菌であってもよいが、他のどのようなグラム陰性菌、好ましくは病原性グラム陰性菌を選択してもよく、例としては、髄膜炎菌（N.meningitidis）、淋菌（N.gonorrhoeae）、Ｎ．ラクタミミカ菌（N.lactamica）などのナイセリア菌種が挙げられる。
【００２８】
リピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性又は高レベルのリピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性を有する本発明のグラム陰性菌は、少なくとも部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたリピドＡ及び／又はＬＰＳ種を、細菌細胞壁の外膜に含んでいることが好ましい。あるいは、本発明のグラム陰性菌は、例えばリピドＡの３−Ｏ−脱アシル化後のパルミトイル化、脱リン酸化又はその他の二次修飾などの、リピドＡの３−Ｏ−脱アシル化後の二次修飾を有するＬＰＳ又はリピドＡ種を含んでいてもよい。本発明の細菌細胞は、その全ＬＰＳ／リピドＡの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％を、３−Ｏ−脱アシル化された形態で含んでいてもよく、又は、代替的に、そのリピドＡ／ＬＰＳの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％を、二次修飾を有する形態で含んでいてもよい。かかる二次修飾の例としてはパルミトイル化や脱リン酸化が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
本件発明は、別の態様において、部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたＬＰＳの製造方法を提供する。第一の実施形態において、かかる方法は、脱アシル化ＬＰＳの合成及び任意で脱アシル化ＬＰＳの回収を促進する条件下で、本発明のグラム陰性菌を培養するステップを含む。各種グラム陰性菌を培養する方法は当該技術で周知であり、例えば、Methods for General and Molecular Bacteriology. P. Gerhardt et al., Eds. American Society for Microbiology, Washington DC, 1994に掲載されている。ＬＰＳの回収、単離、及び／又は精製の方法も当該技術で周知であり（Meningococcal Vaccines, Methods and Protocols. A.J. Pollard and M.C.J. Maiden, Eds. Chapter 12: Construction of LPS mutants, pp.155-165. Humana Press, Totowa, New Jersey, 2001）、例えば、本明細書にて提供されている実施例にしたがって実施することができる。
【００３０】
あるいは、本件発明は、少なくとも部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたＬＰＳ又はリピドＡのインビトロでの製造方法を提供し、かかる方法は、ＬＰＳ又はリピドＡを含む組成物を、処理前の（crude）形態又は（部分的に）精製した形態で提供するステップ、及び、酵素によるインビトロでの３−Ｏ−脱アシル化を促進する条件下で、この組成物を本発明のポリペプチド又はタンパク質と接触させるステップを含む。かかる条件は、本件明細書において、実施例９及び方法の項に掲載されている。
【００３１】
さらに別の実施形態において、本件発明は、少なくとも部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたＬＰＳ及び／又はリピドＡを含む組成物、好ましくは、全ＬＰＳ／リピドＡの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８又は９９％を、その３−Ｏ−脱アシル化された形態、又は、３−Ｏ−脱アシル化後の二次修飾を有する別の形態、例えばパルミトイル化された形態で含む組成物を提供する。
【００３２】
部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたＬＰＳ及び／又はリピドＡを含み、任意に二次修飾を有し、細菌細胞の細胞壁外膜に含まれるか、又は処理前の形態若しくは精製した形態である本発明の組成物を、医薬組成物の製造に用いてもよい。特に好ましい実施形態において、かかる本発明の医薬組成物は、ワクチン接種用として好適な組成物であってもよい。かかる医薬組成物は、宿主生物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおいて、グラム陰性菌に対する免疫応答を引き出すことができる。少なくとも部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたＬＰＳ及び／又はリピドＡの存在、又は代替的に３−Ｏ−脱アシル化後の二次修飾を有するＬＰＳの存在により、毒性低下、対象における副作用の数の減少及び重篤度の低下、及び治療又はワクチン接種を受ける対象におけるこの組成物に対する耐量の増加など、いくつかの利点がもたらされる。かかる医薬組成物は、１以上の賦形剤及び／又はアジュバントを含んでいてもよい。薬学的に許容可能な賦形剤及びアジュバントは、当該技術分野で周知であり、当業者は、例えばCurrent protocols in Immunology, Wiley Interscience 2003又はRemmington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, 1990から自由に選択してもよい。
【００３３】
第一の実施形態において、かかる医薬組成物は、凍結、加熱処理、機械的破砕、化学処理、又は薬学及びワクチンの技術分野で周知の他の方法により不活性化された、生菌細胞若しくは弱毒化生菌細胞、又は生存不能菌細胞を含む全細胞ワクチンであってもよい（J.L. Pace, H.A. Rossi, V.M. Esposito, S.M. Frey, K.D. Tucker, R.I. Walker. Inactivated whole-cell bacterial vaccines: current status and novel strategies. Vaccine 16: 1563-1574 (1998)）。かかる細菌細胞は、グラム陰性の病原性細菌であることが好ましく、かかる細菌細胞は、ボルデテラ属、サルモネラ属、シゲラ（Shigella）属、ナイセリア属、クレブシエラ（Klebsiella）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ヘモフィルス（Haemophilus）属、エシェリキア（Escherichia）属、プロテウス（Proteus）属であることがより好ましく、百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌であることが最も好ましい。
【００３４】
第二の好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は、グラム陰性病原性細菌の免疫原性成分を１、２、３又はそれ以上含み、少なくとも部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたＬＰＳ又はリピドＡ、又は３−Ｏ−脱アシル化後の二次修飾を有する前記ＬＰＳを含む無細胞ワクチンであってもよい。部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたリピドＡ及び／又はＬＰＳは、本発明のグラム陰性病原性細菌から得られることが好ましく、かかる細菌細胞は、ボルデテラ属であることが好ましく、百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌であることが最も好ましい。脱アシル化後の二次修飾を任意に有する少なくとも部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたリピドＡ及び／又はＬＰＳを、それを産生する細菌に対する防御免疫応答を引き出すために使用してもよいが、代替案として、好適なアジュバント物質として使用するために、他の組成物と混合して使用することも可能である。ＬＰＳはワクチン接種用の好適なアジュバントとして当該技術分野で知られており、Ｔｏｌｌ様受容体を活性化し、生来の免疫応答を刺激する。本発明の部分的に３−Ｏ−脱アシル化され、少なくとも部分的に解毒されたＬＰＳ及び／又はリピドＡは、この免疫刺激（アジュバント）活性をかなり保持している一方で、局所的腫脹、発赤、疼痛及び発熱などの、毒性による副作用の発生は少ない。
【００３５】
本発明の薬学的に許容可能な組成物及びワクチンを、病原性グラム陰性菌に感染した、又は感染の危険にさらされている対象の治療方法に使用してもよい。かかる方法は、本発明の医薬組成物、全細胞ワクチン又は無細胞ワクチンを投与するステップを含んでいる。具体的なアジュバント、組成物中の物質の相対量及び絶対量、並びに投与の用法は周知である。あるいは、当業者がそれらを決定してもよく、特定の病原体感染又は治療を受ける特定の対象の状態など、各種状況に応じて適合させてもよい。かかる用法は、単回投与を含むものでもよいが、例えば、追加抗原投与などの反復投与をも含むものであってもよく、経口、経鼻又は非経口による投与を行ってもよい。ワクチン接種用の各種用法は当該技術において周知であり、当業者は、それらを適切に適合させてもよい。
［実施例］
【００３６】
実験手順
菌株及び増殖条件
本研究で使用したすべての菌株を表１に記載する。概ね、改変Luria-Bertani培地寒天、指定のＬＢ寒天（Tommassen, J., van Tol, H., and Lugtenberg, B. (1983) EMBO J. 2, 1275-1279）、又はＬＢ培地において、２００ｒｐｍで震盪しながら、大腸菌株及び緑膿菌株を３７℃で増殖させた。大腸菌については、培地に０．２％のグルコースを補充した。適切とされる場合には、プラスミドの維持及び株の選択のため、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、５０μｇ／ｍｌのナリジクス酸、又は１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンの存在下で、細菌を増殖させた。ＬＢ寒天プレート上でネズミチフス菌ＳＲ１１を３７℃で増殖させ、１５％の脱線維素ヒツジ血液を補充したBorduet-Gengou寒天（Difco社製）上で気管支敗血症菌株及び百日咳菌株を３５℃で増殖させた。百日咳菌中でpagL(Bb)遺伝子の発現を誘導するため、１ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（最終濃度）を補充した合成Thijs培地（Thalen, M., van den IJssel, J., Jiskoot, W., Zomer, B., Roholl, P., de Gooijer, C., Beuvery, C., and Trampen, J. (1999) J.Biotechnol. 75, 147-159）において、震盪しながら（１８０ｒｐｍ）、細菌を３５℃で増殖させた。
【００３７】
【表１】
【００３８】
組換えＤＮＡ技術
Promega Wizard（登録商標）Plus SV Miniprepsシステムを用いて、プラスミドＤＮＡを単離した。製造者（Fermentas社）の指示にしたがい、子牛の腸のアルカリホスファターゼ及び制限エンドヌクレアーゼを使用した。Qiagen社のクイックゲル抽出キットを用いて、アガロースゲルからＤＮＡ断片を単離した。ラピッドＤＮＡライゲーションキット（Roche社製）を使用して、ライゲーションを行った。
【００３９】
ネズミチフス菌ＳＲ１１由来のpagL遺伝子（pagL(St)）、気管支敗血症菌Ｂ５０５由来のpagL遺伝子（pagL(Bb)）、及び緑膿菌ＰＡＯ２５由来のpagL遺伝子でそのシグナル配列コード部分をもつもの又はもたないもの（pagL(Pa)、pagL(Pa)(-)）を、pET-11a（Novagen社製）のＴ７プロモーターの後ろにクローニングした。染色体ＤＮＡをテンプレートとして使用し、ＰＣＲによって遺伝子を増幅した。テンプレートＤＮＡは、以下のように調製した。１０９個以下の細菌を５０μｌの蒸留水に再懸濁し、その後、懸濁液を１５分間９５℃で加熱した。ついで懸濁液を１６，１００×ｇで１分間の遠心分離にかけた後、上清液をテンプレートＤＮＡとして使用した。NdeIサイト（下線部）を含有し、ＡＴＧ開始コドンを内包していたフォワードプライマーの配列は、5’-AACATATGAAGAGAATATTTATATATC-3’（pagL(St)）、5’-AACATATGAAGAAACTACTTCCGCTGG-3’（pagL(Pa)）、5’-AACATATGGCGGACGTCTCGGCCGCCG-3’（pagL(Pa)(-)）、及び5’-AACATATGCAATTTCTCAAGAAAAACA-3’（pagL(Bb)）であった。BamHIサイト（下線部）を含有し、終止コドンを内包していたリバースプライマーの配列は、5’-AAGGATCCTCAGAAATTATAACTAATT-3’（pagL(St)）、5’-AAGGATCCCTAGATCGGGATCTTGTAG-3’（pagL(Pa)、pagL(Pa)(-)）、及び5’-AAGGATCCTCAGAACTGGTACGTATAG-3’（pagL(Bb)）であった。以下の条件下でＰＣＲを行った：全反応量は５０μｌ、各プライマーは２５ｐｍｏｌ、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、３μｌのテンプレートＤＮＡ溶液、１．５％のジメチルスルホキシド、製造者（Roche社）より供給された、緩衝液付きのExpand High Fidelity酵素ミックスが１．７５ユニット。温度プログラムは、以下の通りである：９５℃で３分間、１回が９５℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分３０秒間というサイクルを３０回繰り返し、続いて７２℃で１０分間、その後、４℃まで冷却。アガロースゲルからＰＣＲ産物を精製し、その後、pCRII-TOPOにクローニングした。正しいクローン由来のプラスミドＤＮＡをNdeI及びBamHIで消化し、NdeI/BamHIで消化したpET-11aに、PagLコード断片をライゲーションした。ライゲーション混合物を用いて、ＣａＣｌ２方法で大腸菌ＤＨ５αを形質転換した（Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) in Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour (NY)）。NdeI及びBamHIでの消化による正しいPagLコードインサートの有無について、形質転換体由来のプラスミドＤＮＡを調べた。正しい消化プロフィールをもたらすプラスミドを、pPagL(Pa)、pPagL(Pa)(-)、pPagL(Bb)、及びpPagL(St)とした（表Ｉ）。クローニングしたpagL遺伝子の正しいコード配列を、両方向のヌクレオチドシークエンシングにより確認した。宿主範囲が広範な、低コピーpMMB67EHベクターにPagL(Bb)遺伝子をサブクローニングするため、pPagL(Bb)プラスミドＤＮＡをXbaI及びHinDIIIで消化し、XbaI/HinDIIIで消化したpMMB67EHに、PagL(Bb)コード断片をライゲーションした。ライゲーション混合物を用いて、大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行った。XbaI及びHinDIIIでの消化による正しいPagLコードインサートの有無について、形質転換体由来のプラスミドＤＮＡを調べた。正しい消化プロフィールをもたらすプラスミドを、pMMB67EH-PagL(Bb)とした（表Ｉ）。後者のプラスミドを使用して、大腸菌ＳＭ１０の形質転換を行った。それにより、その後、Stibitz et al（Stibitz, S., Black, W., and Falkow, S. (1986) Gene 50, 133-140）に記載の固体培地への結合を行って、pMMB67EH-PagL(Bb)を百日咳菌へ移し替えることが可能となった。QuikChange（登録商標） 部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene社製）及び表IIに列挙したプライマーを使用して、pagLに変異を導入した。変異が生じたテンプレートとして、プラスミドpPagL(Pa)を用いた。正しい変異の存在を、両方向のヌクレオチドシークエンシングにより確認した。
【００４０】
【表２】
【００４１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロッティング
Bio-Rad Mini-PROTEAN（登録商標）3装置を用いて、０．２％のＳＤＳを含むランニングゲルでドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680-685）を行って、タンパク質を分析した。４％のスタッキングゲルで、試料を１３％のポリアクリルアミドゲルに塗布し、１５０Ｖで電気泳動にかけた。クーマシーブリリアントブルーでタンパク質を染色した。前染色した、又は無染色の、Bio-Rad社製Precision Plus Proteina Standardを使用して、相対分子量（Ｍｒ）を測定した。ウェスタンブロッティング用に、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからニトロセルロース膜へ転写した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．６）、０．５％の無脂肪粉乳、０．１％のTween-20中で膜を一晩ブロッキングして、PagL(Pa)に対する一次抗体とともにブロッキング緩衝液中でインキュベーションし、引き続いて、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ウサギ抗モルモットＩｇＧ抗体（Sigma社製）とともにブロッキング緩衝液中でインキュベーションを行った。SuperSignal（登録商標）WestPico Chemiluminescent Substrate（Pierce社製）を用いて、ブロットを現像した。
【００４２】
セミネイティブ（semi-native）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
Bio-Rad Mini-PROTEAN（登録商標）3装置を用いて、０．２％のＳＤＳを含むランニングゲルでドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680-685）を行って、タンパク質を分析した。セミネイティブＳＤＳ−ＰＡＧＥのため、ランニング及びスタッキングゲルにＳＤＳを添加することはなく、電気泳動に先立って試料を加熱することもなかった。４％のスタッキングゲルで、試料を１３％のポリアクリルアミドゲルに塗布し、１５０Ｖで電気泳動にかけた。セミネイティブＳＤＳ−ＰＡＧＥのため、電気泳動は氷上で１５ｍＡの定電流で行われた。クーマシーブリリアントブルーでタンパク質を染色した。前染色した、又は無染色の、Bio-Rad社製Precision Plus Proteina Standardを使用して、相対分子量（Ｍｒ）を測定した。
【００４３】
トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＬＰＳ含有試料に対して、０．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（最終濃度）を試料緩衝液に添加した（Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680-685）。５５℃で６０分間、続いて、９５℃で１０分間、試料をインキュベーションして、プロテイナーゼＫを不活性化した。次いで、試料緩衝液を添加して試料を１０倍に希釈し、その後、２μｌの試料をトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに塗布した（Lesse, A. J., Campagnari, A. A., Bittner, W. E., and Apicella, M. A. (1990) J. Immunol. Methods 126, 109-117）。３５Ｖでブロモフェノールブルーを分離ゲルに流し込み、その後、電圧を１０５Ｖに上げた。最前部がゲルの底に到達した後、さらに４５分間、試料を流れるままに放置した。水／エタノール／酢酸を１１：８：１（ｖ／ｖ／ｖ）としたものの中でゲルを一晩固定し、その後、文献記載のように銀で染色した（Tsai, C. M., and Frasch, C. E. (1982) Anal. Biochem. 119, 115-119）。
【００４４】
ポリクローナル抗体
抗体の作製のため、pPagL(Pa)(-)を用いて大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）を形質転換し、切断されたpagL遺伝子の発現を可能にした。封入体中に蓄積しているPagL(Pa)タンパク質を単離し（Dekker, N., Merck, K., Tommassen, J., and Verheij, H. M. (1995) Eur. J. Biochem. 232, 214-219）、分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから精製し、Eurogentec社でのモルモットの免疫付与に使用した。
【００４５】
マイクロシークエンシング
Bio-Rad Mini-PROTEAN（登録商標）2ブロッティング装置を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから、１９２ｍＭのグリシン、２５ｍＭのTris（ｐＨ８．３）、１０％のメタノール（ｖ／ｖ）中のImmobilona-P二フッ化ポリビニリデン膜（Millipore Corp.社製）に、タンパク質を１００Ｖで１時間転写した。転写後、蒸留水で膜を１５分間、３回洗浄した。転写したタンパク質をクーマシーブリリアントブルーで染色した。膜を風乾し、推定PagLバンドを切り取って、オランダ国ユトレヒト大学のシークエンシングセンター施設で、マイクロシークエンシングにかけた。
【００４６】
ＬＰＳの単離及びガスクロマトグラフィー質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）による分析
熱フェノール／水抽出法を用いて、ＬＰＳを単離した（Steeghs, L., Berns, M., ten Hove, J., de Jong, A., Roholl, P., van Alphen, L., Tommassen, J., and van der Ley, P. (2002) Cell. Microbiol. 4, 599-611）。すなわち、プラスミドpMMB67EH-PagL(Bb)をもつ又はもたない百日咳菌株Tohamaを、１ｍＭのＩＰＴＧ（最終濃度）の存在下で、３リットルのThijs培地（Thalen, M., van den IJssel, J., Jiskoot, W., Zomer, B., Roholl, P., de Gooijer, C., Beuvery, C., and Trampen, J. (1999) J.Biotechnol. 75, 147-159）中で増殖させた。遠心分離により細胞を回収し、５ｍＭのＥＤＴＡを含む４０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に再懸濁した。細胞をリゾチームで４℃にて一晩処理し、その後、等量のフェノールを添加した。懸濁液を７０℃まで加熱し、震盪しながら３０分間インキュベーションした。懸濁液を１０℃まで冷却した後、遠心分離により相を分離した。上部相を回収し、下部相に等量の蒸留水を添加することにより、抽出を繰り返した。続いて７０℃でのインキュベーション、冷却、及び遠心分離を行った後、２つの上部相を混合し、フェノール臭が消えるまで、水道水で透析した。透析した画分を凍結乾燥させた後、ＬＰＳを濃度１ｍｇ／ｍｌでリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）中に溶解させた。ＧＣ／ＭＳによる脂肪酸分析のため、単離したＬＰＳのアリコートに５倍（ｖ／ｖ）を超えるアセトンを添加し、その後、溶液を窒素流下で６０℃にて乾燥させた。続いて、塩化アセチル／エタノールを１：９（ｖ／ｖ）としたもの１００μｌ、及び、内部標準として１０μｇのＣ１２：０（２ＯＨ）（エタノール中で１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、その後で試料を９０℃で１時間誘導体化した。冷却後、１ＭのＫ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．０）を２００μｌ添加することにより反応を停止させ、引き続いて、２００μｌの酢酸エチルでアシル−エチルエステルを抽出した。１μｌ量の上部相を、電子衝撃モードのFinnigan MAT SSQでのＧＣ／ＭＳによる分析に使用した。
【００４７】
ＬＰＳの生物学的活性
野生型百日咳菌TohamaＬＰＳ及びPagL修飾百日咳菌TohamaＬＰＳによるＩＬ−６及びＩＬ−１０の誘導について、ヒトマクロファージ細胞株ＭＭ６（Ziegler-Heitbrock, H. W., Thiel, E., Futterer, A., Herzog, V., Wirtz, A., and Riethmuller, G. (1988) J. Cancer 41, 456-461）でテストを行った。マイクロタイタープレート（２．１０５／ウェル）において、１０％のウシ胎仔血清（Gibco BRL社製）を補充した４００μｌのＩＭＤＭ（Gibco BRL社製）中にＭＭ６細胞を播種し、５％のＣＯ２を含む湿潤雰囲気中で１６〜１８時間、３７℃にて、ＬＰＳ原液の連続希釈液２００μｌで刺激した。製造者の指示にしたがい、ヒトＩＬ−６又はＩＬ−１０に対するＥＬＩＳＡで、培養上清液のＩＬ−６及びＩＬ−１０のレベルを定量した（PeliPairTM試薬セット、Sanquin Reagents社製、オランダ国、アムステルダム）。
【００４８】
細胞外皮の単離
１，５００×ｇで１０分間の遠心分離により細胞を回収し、０．９％の塩化ナトリウムの冷溶液５０ｍｌで１回洗浄した。細胞ペレットを−８０℃で少なくとも１５分間凍結した後、コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル（Roche社製）を含む、３ｍＭのＥＤＴＡ及び１０ｍＭのTris−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２０ｍｌに懸濁した。超音波処理で細胞を破壊した後、破壊されなかった細胞を、１，５００×ｇで１０分間の遠心分離により除去した。１５０，０００×ｇで１．５時間の遠心分離により、上清液から細胞外皮をペレット化し、２ｍＭのTris−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に再懸濁した。細胞外皮をアリコートの形で−８０℃にて保管した。
【００４９】
封入体の単離
封入体の単離のため、大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）中でpPagL(Pa)(-)からPagL(Pa)(-)を発現させた（表１）。アンピシリンを補充したＬＢ培地において、ＯＤ６００が０．４〜０．６になるまで、２リットルの培養物を３７℃で増殖させた。次いで、１ｍＭのＩＰＴＧ（最終濃度）を培養物に添加して、組換え遺伝子の発現を誘導し、その後、培養物を震盪しながら３７℃でさらにインキュベーションした。約４時間後、遠心分離（４０００ｒｐｍで１５分間（４℃））により、細胞を回収した。回収した細胞を４００ｍｌの０．９％ＮａＣｌで１回洗浄した後、８０ｍｌのＴＥ５０：４０（５０ｍＭのTris−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁した。スクロース（０．２５ｇ／ｍｌ（最終濃度））及びリゾチーム（０．２ｍｇ／ｍｌ（最終濃度））を添加し、その後、懸濁液を震盪しながら室温（ＲＴ）で３０分間インキュベーションした。Branson 250 Sonfierをマクロチップとともに用いて（出力９、デューティーサイクル５０％）、懸濁液を氷上で３回超音波処理した（１．５分間、間に２分間の休止をはさむ）。超音波処理に続いて、０．１３％（ｗ／ｖ）のBrij-35P（Fluka社製）を添加し、懸濁液をさらに２分間超音波処理した。４，０００ｒｐｍ（４℃）で２時間の遠心分離により高密度物質（封入体）を回収した後、ペレットを４０ｍｌのＴＥ５０：４０で１回洗浄し、引き続いて、１０ｍＭのTris−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）を４０ｍｌ用いてさらなる洗浄工程を行った。得られた封入体を、１０ｍＭのグリシン（ｐＨ８．３）を補充した８Ｍの尿素中で可溶化し、ＴＣＡで析出させた。最後に、得られたタンパク質を、１０ｍＭのグリシン（ｐＨ８．３）を補充した８Ｍの尿素中で、タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍｌで可溶化した。この混合物を１３，０００ｒｐｍで２時間の遠心分離にかけ、残留する不溶性物質及び膜を除去した。
【００５０】
PagL(Pa)(-)のリフォールディング及び精製
１０％（ｗ／ｖ）のラウリルジメチルアミン酸化物（ＬＤＡＯ）による１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液（上記参照）の２倍希釈、及びその後の１０分間の超音波処理により、PagL(Pa)(-)のリフォールディングをインビトロで行った。リフォールディングされたPagL(Pa)(-)を、１ｍｌのMonoQ（Amersham Biosiences社製）イオン交換カラムを用いた高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）により精製した。緩衝液Ａ（２０ｍＭのTris−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．０８％（ｗ／ｖ）のＣ１０Ｅ５）で、タンパク質溶液を４倍希釈した。緩衝液Ａで前平衡化し、緩衝液Ａで１回洗浄したカラムにかかる溶液を充填し、緩衝液Ａ中のＮａＣｌが０〜１Ｍとなるように直線的濃度勾配をかけてタンパク質の溶出を行った。リフォールディングされたPagL(Pa)(-)タンパク質の有無について、画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。かかるタンパク質を含有するものをプールし、分子量カットオフ値が３ｋＤａのCentricon濃縮器（Amicon社製）を使用して、タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。その後、分子量カットオフ値が３．５ｋＤａの膜を使用して、１０ｍｌの、２ｍＭのTris−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．０６％（ｗ／ｖ）のＣ１０Ｅ５で、タンパク質溶液の透析を一晩３回行った。
【００５１】
インビトロ修飾アッセイ
リフォールディングされたPagL(Pa)(-)（１０ｍｇ／ｍｌ）、又は空のベクターpET-11a若しくはpPagLプラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）から単離した細胞外皮を、再蒸留水で１０倍に希釈した。リフォールディングされたタンパク質又は細胞外皮の希釈液を、最終的な量としては１０μｌの、５０ｍＭのHepes（ｐＨ８．０）、０．１％のTriton X-100、０．５ＭのＮａＣｌ、及び０．７５ｎｍｏｌの髄膜炎菌Ｌ３−ＬＰＳ中で、３７℃にて１６時間インキュベーションした。反応が二価陽イオンに依存するかどうかをテストするため、リフォールディングされたPagL(Pa)(-)を用いた反応には５ｍＭのＥＤＴＡを添加した。試料緩衝液中での煮沸により反応を終了させ（Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680-685）、その後、試料を０．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫで１時間、５５℃にて処理し、引き続いて、９５℃で１０分間のインキュベーションを行った。試料緩衝液を添加して試料を２５倍に希釈した後、２μｌの試料をトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（上記参照）。
【００５２】
ＬＰＳの単離及びエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）による分析
熱フェノール／水抽出法（Westphal and Jann, Methods Carbohydr. Chem. 5; 83-91,1965）をわずかに改変した方法を用いて、ＬＰＳを単離した。すなわち、１ｍＭのＩＰＴＧ（最終濃度）の存在下で、細菌をTHIJS培地中で６４時間増殖させた。遠心分離により細胞を回収し、５ｍＭのＥＤＴＡを含む４０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に懸濁した。細胞をリゾチームで４℃にて一晩処理し、その後、等量のフェノールを添加した。懸濁液を７０℃まで加熱し、震盪しながら３０分間インキュベーションを行った後、懸濁液を１０℃まで冷却し、その後、８，０００×ｇで１０分間の遠心分離により相を分離した。上部相を回収し、下部相に等量の蒸留水を添加することにより、抽出を繰り返した。２つの上部相を組み合わせ、フェノール臭が消えるまで水道水で透析し、凍結乾燥させ、その後、蒸留水に入れた。続いて、１５０，０００×ｇで３時間の遠心分離によりＬＰＳをペレット化し、蒸留水に溶解した後、文献（Welch, Clin. Microbiol. Rev. 1991）記載の通り、6890 Agilentガスクロマトグラフを用いて３−ヒドロキシテトラデカン酸の含有量を分析することにより、ＬＰＳ濃度を測定した。ＥＳＩ−ＭＳのため、単離したＬＰＳ（５０ｎｍｏｌ／ｍｌ）のアリコート２００μｌを凍結乾燥させ、２％の酢酸０．１ｍｌに入れた。混合物を９５℃で２時間加熱して、ＬＰＳを加水分解し、リピドＡ部分を放出させた。続いて、混合物を室温まで冷却し、１６，１００×ｇで１０分間の遠心分離を行った。０．１ｍｌの再蒸留水でペレットを２回洗浄し、０．１ｍｌの再蒸留水に入れ、０．３ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）を添加した。激しくボルテックスした後、１６，１００×ｇで１０分間の遠心分離により相を分離した。その後、上部相を、陰イオンモードのFinnigan LCQでのナノエレクトロスプレータンデムＭＳによる精製リピドＡの構造分析に使用した（Wilm and Mann, Anal. Chem. 1996）。
【実施例１】
【００５３】
各種グラム陰性菌におけるPagL相同体の同定
ＮＣＢＩのデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi）に存在するグラム陰性菌の解読（completed）ゲノム及び未解読（unfinished）ゲノムのすべてを検索することにより、ネズミチフス菌PagL前駆タンパク質の１８７アミノ酸配列（GenBankアクセッション番号ＡＡＬ２１１４７、配列番号１７）を手がかりとして使用し、他のグラム陰性菌における推定PagL相同体を同定した。ＢＬＡＳＴ検索（Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., and Lipman, D. J. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410）により、ボルデテラ菌種の、百日咳菌、気管支敗血症菌、及びパラ百日咳菌における推定相同体の存在が明らかになった（図２）。気管支敗血症菌及びパラ百日咳菌のPagL相同体は、シグナルＰサーバー（signalP server）により予測されていたように（Nielsen, H., Brunak, S., and von Heijne, G. (1999) Protein Eng. 12, 3-9）、２５個のアミノ酸からなるＮ末端シグナルペプチドをもつ、１７８個のアミノ酸からなる、お互いに一致する２つのポリペプチドである（図２）。PagL相同体の遺伝子も百日咳菌株Tohama Iのゲノム中で発見されている（Parkhill, J., Sebaihia, M., Preston, A., Murphy, L. D., Thomson, N., Harris, D. E., Holden, M. T., Churcher, C. M., Bentley, S. D., Mungall, K. L., Cerdeno-Tarraga, A. M., Temple, L., James, K., Harris, B., Quail, M. A., Achtman, M., Atkin, R., Baker, S., Basham, D., Bason, N., Cherevach, I., Chillingworth, T., Collins, M., Cronin, A., Davis, P., Doggett, J., Feltwell, T., Goble, A., Hamlin, N., Hauser, H., Holroyd, S., Jagels, K., Leather, S., Moule, S., Norberczak, H., O'Neil, S., Ormond, D., Price, C., Rabbinowitsch, E., Rutter, S., Sanders, M., Saunders, D., Seeger, K., Sharp, S., Simmonds, M., Skelton, J., Squares, R., Squares, S., Stevens, K., Unwin, L., Whitehead, S., Barrell, B. G., and Maskell, D. J. (2003) Nat. Genet. 35, 32-40）が、このオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）はフレームシフト（配列番号４）により破壊されており、こうした破壊を配列番号５のように修復して、配列番号１のようにタンパク質をコードすることが可能な場合もある。百日咳菌Ｂ５０９株及びＢ１３４株由来のPagLＯＲＦのヌクレオチドシークエンシングでも、同じフレームシフト２の存在が示されており、このことは、PagLＯＲＦの破壊は百日咳菌株における共通の特徴であるという可能性を示している。新規に同定された気管支敗血症菌のPagL相同体をさらなるＢＬＡＳＴ分析のプローブとして用いて、別の推定PagL相同体を、以下のゲノム中で同定することができた：緑膿菌（配列番号６、３０％の同一性）、シュードモナスフルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）（配列番号７、２９％の同一性）、シュードモナス シリンゲ（Pseudomonas syringae）（配列番号８、３１％の同一性）、シュードモナスプチダ（Pseudomonas putida）、２ｘ（配列番号９＋１０、３２／３３％）、ラルストニア メタリデュランス（Ralstonia metallidurans）（配列番号１５、２８％）、青枯病菌（Ralstonia solanacearum）（配列番号１６、２９％）、鼻疽菌（Burkholderia mallei）（配列番号１２、２８％）、類鼻疽菌（Burkholderia pseudomallei）（配列番号１３、２８％）、バークホルデリア ファンゴラム（Burkholderia fungorum）（配列番号１１、２９％）、及びアゾトバクター ビネランジー（Azotobacter vinelandii）（配列番号１４、２７％）。図２に、アラインメントを示す。総合して、ネズミチフス菌に対する同一性（２４％の同一性）よりは高いとはいえ、いずれのPagL相同体も、相互間の配列同一性として全体的に低い数値を示したが、Ｃ末端付近にはっきりとした相同ドメインを含んでいた。本発明者らによるこの保存モチーフの発見によって、他の（細菌）種におけるPagL相同体の同定が可能となり、また、３−Ｏ−脱アシル化されるあらゆる宿主細菌及び／又はあらゆるＬＰＳに対して、適切なPagL相同体の使用が可能となる。
【実施例２】
【００５４】
pagLのクローニング及び大腸菌における異種発現
推定リピドＡ脱アシル化酵素活性を実証するため、本発明者らは、緑膿菌のPagL相同体（pagL(Pa)）及び気管支敗血症菌のPagL相同体（pagL(Bb)）のクローニングを行った。本発明者らにより、pagL(St)も参考用としてこれらの研究に含められた。これらのpagL遺伝子をＰＣＲにより染色体から増幅し、最終的にはＴ７プロモーターの制御下でpET-11aにクローニングした結果、pPagL(Pa)プラスミド、pPagL(Bb)プラスミド、及びpPagL(St)プラスミドが得られた。
【００５５】
大腸菌中のPagLの発現及び膜局在について調べるため、空のベクターpET-11a又はpPagLプラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）を一晩ＬＢ中で増殖させ、その後、細胞外皮を単離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析により、PagLを発現する細胞の細胞外皮中に、Ｍｒが１５０００〜１８０００の、別の顕著なバンドが存在することが明らかになった（図３）。これは、予測された成熟PagLタンパク質の分子量、すなわち、PagL(Pa)が１６．１ｋＤａ、PagL(Bb)が１７．２ｋＤａ、PagL(St)が１８．２ｋＤａという数値と合致するものである。かかる別のタンパク質バンドを同定するために、それらをマイクロシークエンシングにかけた。PagL(Pa)、PagL(Bb)、及びPagL(St)の、最初の５つのアミノ酸残基の配列は、それぞれＡＤＶＳＡ、ＱＰＴＱＧ、及びＮＤＮＶＦであった。このことは、リーダーペプチダーゼによるシグナルペプチドの開裂が、アミノ酸残基２３と２４の間（ＡＱＡ−ＡＤＶ）、２５と２６の間（ＡＱＡ−ＱＰＴ）、及び２０と２１の間（ＣＳＡ−ＮＤＮ）でそれぞれ発生していることを示している。特にPagL(Bb)の発現の場合は、より大きなＭｒを有する別のバンドがゲル上に認められた（図２）。このバンドのＮ末端配列であるＭＱＦＬＫは、PagL(Bb)の前駆体のＮ末端配列と一致していた。
【実施例３】
【００５６】
PagLによる大腸菌ＬＰＳのインビトロでの修飾
クローニングしたPagL相同体が大腸菌ＬＰＳに対して活性を示すかどうかを研究するため、空のベクターpET-11a又はpPagLプラスミドを含む対数増殖期の大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）細胞にＩＰＴＧを添加し、各種インキュベーション期間の後で、ＯＤ６００が１ユニットに相当する試料を回収し、そのＬＰＳ含有量をトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。リピドＡの３位におけるＲ−ヒドロキシミリスチン酸の予測された加水分解にしたがって、３つのPagL相同体のいずれかの発現が、より電気泳動移動度の高い形態へとＬＰＳを変換した（図４）。そうした変換は、PagL(Pa)又はPagL(Bb)が誘導されてから７５分以内にほぼ完了したが、PagL(St)の場合は、それよりもやや長い時間がかかった。
【００５７】
PagL修飾ＬＰＳの構造分析：ＬＰＳの脂肪酸含有量を測定するため、PhoP/PhoQが制御するリピドＡの修飾を抑制するために１０ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下で増殖させた細菌からＬＰＳを単離し、ＧＣ／ＭＳで分析した。PagL修飾ＬＰＳ試料のＣ１４：０／Ｃ１４：０（３ＯＨ）比は、野生型ＬＰＳのものと比較して増大しており（図５）、これは、予測されていた、リピドＡからのＣ１４−３ＯＨの除去と合致する。これらのデータを確認するため、リピドＡ部分を単離して、ＥＳＩ−ＭＳで陽イオンモードにて分析したところ、野生型ＬＰＳにおいて４つの主要なリピドＡ種の存在が明らかになった（図６Ａ）。ｍ／ｚ１７９７のピークが、大腸菌に一般に見られる特徴的なヘキサアシル化ビスリン酸種を示す一方で、ｍ／ｚ１９２８のピークは、L-Ara4N部分で置換されたヘキサアシル化ビスリン酸種に相当する。ｍ／ｚ１７１６及びｍ／ｚ１８４７における、残る２つのピークは、リン酸基を欠失した前記２つの種の断片イオンを示す可能性が高い。PagL(St)（図６Ｂ）、PagL(Pa)（図６Ｃ）、又はPagL(Bb)（図６Ｄ）の発現の際に、主要なリピドＡ種はｍ／ｚ１６２２及びｍ／ｚ１４９０に存在していた。これは、コントロールである空のベクターに存在する、ｍ／ｚ１９２８及びｍ／ｚ１７９７の主要な種からの、１つのβ−ヒドロキシミリスチン酸塩残基及び１つのリン酸基の欠失にそれぞれ相当する。ここでもまた、リン酸基の欠失は、おそらくイオン化手順の人為的影響によるものと思われる。ＧＣ／ＭＳ及びＥＳＩ−ＭＳのデータに基づき、緑膿菌及び気管支敗血症菌の同定されたPagL相同体は、ネズミチフス菌のものと同様に、活性を有するリピドＡ脱アシル化酵素であると結論づけることができる。また、かかるデータは、両方の種が効率的に脱アシル化されることから、脱アシル化がL-Ara4N部分の有無に依存しないことを示唆している。
【実施例４】
【００５８】
PagLで脱アシル化したＬＰＳの、その後のインビトロでの修飾
これらの実験の過程において、PagLの長期発現後は、PagL修飾ＬＰＳがトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で検出できなくなること、及び、PagL(Bb)発現株について図示したように、ＬＰＳが、野生型ＬＰＳの位置に再び移動することが観察された（図７Ａ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で明らかとなったように、PagLタンパク質は、この時点で依然として豊富に存在していた（データは図示せず）。また、ＧＣ／ＭＳによる分析で、Ｃ１４：０／Ｃ１４：０（３ＯＨ）比が、５時間にわたるPagL(Bb)の誘導後に単離したＬＰＳについては、二度と低下しなかったことが明らかになった（図７Ｂ）。このように、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で観察された二次修飾（図７Ａ）は、PagL修飾の修復の結果ではなく、電気泳動移動度を、野生型ＬＰＳの電気泳動移動度へと修復した別の修飾の結果であった。そのため、他の脂肪酸比を比較してみた。PagLの産生を５時間にわたって誘導した細胞のＬＰＳにおいて、Ｃ１６：０／Ｃ１４：０比の著しい増大が認められ、PagLで脱アシル化したＬＰＳが、その後パルミトイル化されたことが示唆された。
【００５９】
リピドＡにパルミチン酸を付与するタンパク質は、外膜タンパク質PagPである（Bishop, R. E., Gibbons, H. S., Guina, T., Trent, M. S., Miller, S. I., and Raetz, C. R. H. (2000) EMBO J. 19, 5071-5080）（図１）。そのため、本発明者らは、PagL修飾ＬＰＳの二次修飾は、内在性PagP活性の結果なのかもしれないとの仮説を立てた。この可能性について調べるため、本発明者らは、野生型大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）及びそのpagP変異誘導体ＪＧ１０１を、pPagL(Pa)プラスミドで形質転換した。野生型株の場合には、PagL修飾ＬＰＳの二次修飾が再び観察されたが、変異株の場合には観察されなかった（図７Ｄ）。この結果は、PagL修飾ＬＰＳの二次修飾（図７Ａ）が、実際に内在性PagP活性の結果であることを強く示唆している。
【実施例５】
【００６０】
PagL活性部位残基の同定
同定したPagL相同体相互間の配列同一性は、非常に低い（図２）。完全に保存された数個の残基のなかにヒスチジンとセリンがあり、本発明者らは、これらはセリン加水分解酵素の「古典的」Ａｓｐ／Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ触媒３残基（catalytic triad）の一部ではないかとの仮説を立てている。これらの推定活性部位残基は、本発明者らが提案した位相モデルのβ鎖の頂点付近にある脂質露出側に位置している（図８）。外膜ホスホリパーゼＡにおいて、活性部位Ｈｉｓ及び及びＳｅｒが同様の位置にあることは、興味深い（Snijder, H. J., Ubarretxena-Belandia, I., Blaauw, M., Kalk, K. H., Verheij, H. M., Egmond, M. R., Dekker, N., and Dijkstra, B. W. (1999) Nature 401, 717-721）。PagL(Pa)前駆タンパク質の１４９位と１５１位にそれぞれ位置するこれらの残基が実際に触媒活性に重要であるかどうかをテストするため、それらをアラニン又はアスパラギンで、及びアラニン又はシステインで、それぞれ置換した。コントロールとして、PagL(Pa)前駆体の８１位と８４位にれぞれ位置する非保存ヒスチジン及びセリン残基に対して同じ置換を行った。関連するプラスミドを有しＩＰＴＧで７５分間誘導した大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）細胞のタンパク質及びＬＰＳプロフィールを、イムノブロッティング（図９Ａ）及びトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図９Ｂ）でそれぞれ分析した。非保存Ｈｉｓ８１及びＳｅｒ８４の置換がＬＰＳの脱アシル化に影響しなかったのに対し、保存されたＨｉｓ１４９及びＳｅｒ１５１が置換された場合は、これらの変異タンパク質の発現が影響を受けなかった場合でさえも（図９Ａ）、ＬＰＳの脱アシル化は、もはや観察されなかった（図９Ｂ）。これらの結果は、前駆PagL(Pa)タンパク質の１４９位にある保存されたヒスチジン及び１５１位にあるセリンは活性部位残基であり、PagLはセリン加水分解酵素として機械的に機能するという仮説を、強く裏付けるものである。
【実施例６】
【００６１】
pagL(Bb)のクローニング及び百日咳菌における異種発現
百日咳菌ＬＰＳをインビボで修飾するため、本発明者らは、気管支敗血症菌のpagL遺伝子（pagL(Bb)）をクローニングした。pagL遺伝子をＰＣＲにより染色体から増幅し、最終的にはTacプロモーターの制御下でpMMB67EHにクローニングした。その結果、pMMB67EH-PagL(Bb)プラスミドが得られ、結合によってこれを百日咳菌株Tohamaへ移し替えた。
【００６２】
百日咳菌ＬＰＳのインビボでの修飾に取り組むため、１ｍＭのＩＰＴＧ（最終濃度）を補充したThijs培地で野生型百日咳菌株Tohama又はpMMB67EH-PagL(Bb)プラスミドを含む百日咳菌株Tohamaを増殖させた。熱フェノール−水抽出法でＬＰＳを単離し、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１０Ａ）及びＧＣ−ＭＳ（図１０Ｂ）で分析した。トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での分析により、PagL(Bb)発現株から単離したＬＰＳは、野生型百日咳菌ＬＰＳに比べて移動速度がやや速いことがわかった。注意を引いたのは、PagL(Bb)発現株から単離したＬＰＳが、２つの区別可能なＬＰＳ群を示していたことである。１つの群は野生型TohamaＬＰＳの高さ付近を移動し、１つの群はより速く移動していた。後者のＬＰＳ群は野生型ＬＰＳ調製物においても見ることができるが、その存在度はかなり低い。PagL発現株由来のＬＰＳが実際にその３位で脱アシル化されたことを実証するため、ＧＣ−ＭＳでの分析を行った。PagL修飾ＬＰＳ試料におけるＣ１４：０（３ＯＨ）／Ｃ１０：０（３ＯＨ）比は、野生型ＬＰＳのものと比べて増大しており（図１０Ｂ）、これは、予測されていた、百日咳菌リピドＡの３位からのＣ１０−３ＯＨの除去と合致する。
【実施例７】
【００６３】
PagL修飾ＬＰＳの生物学的活性
PagL修飾百日咳菌ＬＰＳ及び野生型百日咳菌ＬＰＳの内毒素活性を査定するため、それらのＬＰＳの、ヒトマクロファージ細胞株ＭＭ６におけるＩＬ−６及びＩＬ−１０の産生を刺激する能力を測定した。図２からわかるように、野生型ＬＰＳに関しては、ＭＭ６細胞によるＩＬ−６（図１１Ａ）及びＩＬ−１０（図１１Ｂ）の産生は、等量のPagL修飾ＬＰＳで細胞を刺激した場合と比較して、いずれも増加した。したがって、PagLによる百日咳菌ＬＰＳのインビボでの脱アシル化の結果、このＬＰＳの内毒素活性が低下すると結論づけることができる。
【実施例８】
【００６４】
PagL(Pa)のクローニング、発現、精製、及びリフォールディング
シグナル配列コード部分をもたない緑膿菌ＰＡＯ２５由来のPagL遺伝子をpET-11aにクローニングし、結果としてpPagL(Pa)(-)プラスミドを得た。封入体を得るため、シグナル配列をもたないPagLを大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）中で発現させた。封入体を単離して尿素中で可溶化し、その後、１０％のラウリルジメチルアミン酸化物（ＬＤＡＯ）で２倍に希釈することによりタンパク質をリフォールディングし、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）でさらに精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１２）及び円偏光二色性（ＣＤ）測定（データは図示せず）で正しいリフォールディングを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上では、リフォールディングされたタンパク質は変性型よりも電気泳動移動度が低かったのに対し、ＣＤ測定では、リフォールディングされたタンパク質の大部分がβシート構造を有することが示された。
【実施例９】
【００６５】
膜局在PagL及びリフォールディングされたPagLによるインビトロでのＬＰＳ修飾
膜局在PagL又はインビトロでリフォールディングされたPagLが外部から付加されたＬＰＳをインビトロで修飾できるかどうかをテストするため、本発明者らは、リフォールディングされたPagL(Pa)(-)、又は空のベクターpET-11a若しくはpPagLプラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）から単離した細胞外皮に対し、髄膜炎菌の精製ＬＰＳとともにインキュベーションを行った。ＬＰＳの修飾をトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで査定した（図１３）。リピドＡの３位におけるＲ−ヒドロキシミリスチン酸の予測された加水分解にしたがって、膜局在PagL（図１３Ａ）又はリフォールディングされたPagL(Pa)(-)（図１３Ｂ）の存在時は、ＬＰＳがより電気泳動移動度の高い形態へと変換された。ＬＰＳの脱アシル化が５ｍＭのＥＤＴＡの存在下でも依然として観察されたことから、リフォールディングされたPagL(Pa)(-)を用いた反応は、二価陽イオンの存在に依存していなかったことになる（図１３Ｂ）。
【実施例１０】
【００６６】
百日咳菌におけるPagP及びPagL発現後のリピドＡの構造変化
PagP及びPagLを百日咳菌株Tohamaで発現させるため、宿主範囲が広範な低コピー数発現ベクターpMMB67EHから、気管支敗血症菌のPagL遺伝子（pagL(Bb)）及び百日咳菌のPagP遺伝子（pagP(Bb)）を発現させた。コントロールとして、大腸菌のPagP遺伝子（pagP(Ec)）を発現する株も構築した。野生型、PagP発現又はPagL発現百日咳菌株TohamaからＬＰＳを単離し、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。PagL(Bb)発現株から単離したＬＰＳは、ゲル上で全く影響を受けていないように見受けられたのに対し、PagP発現株由来のＬＰＳは、強く修飾されているように見受けられた。というのは、野生型百日咳菌ＬＰＳのものよりも電気泳動移動度が低いバンドが検出されたためである（図１４）。また、PagP(Bb)発現株との比較では、PagP(Ec)発現株のほうが修飾効率が高いように見受けられた（図１４）。考えられるＬＰＳ修飾をより詳しく評価するため、菌株のリピドＡ部分をＥＳＩ−ＭＳで陰イオンモードにて分析した。この分析により、野生型ＬＰＳにおいて、４つの主要なリピドＡ種の存在が明らかになった（図１５Ａ）。ｍ／ｚ１５５７のピークは、百日咳菌に一般に見られる特徴的なペンタアシル化ビスリン酸種を示す（Caroff et al., Microbes. Infect., 1994）のに対し、ｍ／ｚ１４７７のピークは、ペンタアシル化モノリン酸種に相当する。ｍ／ｚ１３０７及び１２５１における残りの２つのピークは、それぞれ、３位の一次３−ヒドロキシデカン酸残基又は（２位若しくは３’位のいずれかの）一次３−ヒドロキシテトラデカン酸残基が欠失している、ｍ／ｚ１４７７の分子イオンの脱アシル化リピドＡ種を示す。これらの結果は、野生型百日咳菌のリピドＡ種間における異質性の高さを示すものであり、これについては、このゲル分析ではっきりとは解明されなかった（図１４）。興味深いことに、個々のリピドＡ種の相対量を相当するピークの高さから計算することにより、野生型百日咳菌ＬＰＳでは、大量のリピドＡ種（〜５０％）が、テトラアシル化型からなることが明らかになった。また、リピドＡ種の大多数は、モノリン酸型である（〜８０％）。低アシル化（under-acylated）又は次リン酸化リピドＡ種の存在度の高さが、リピドＡ種を単離する場合に用いる加水分解手順の人為的影響であるという可能性を排除するため、本発明者らは、加水分解時間の長短（１〜４時間まで様々である）がリピドＡ種の相対存在度に影響を及ぼすかどうかをテストしたが、そうした事実はなかった（データは図示せず）。さらに、精製した野生型百日咳菌ＬＰＳの濃度がわかっている溶液について、その全リン酸含有量を測定した。ＥＳＩ−ＭＳで検出されたモノリン酸リピドＡ種の高い陽性率と矛盾することなく、ＬＰＳが完全にリン酸化されていた場合は、予測されたリン酸含有量の半分をわずかに超える程度の量が検出されるにとどまった（データは図示せず）。
【００６７】
PagL(Bb)発現の際（図１５Ｂ）、３つのリピドＡ種が、ｍ／ｚ１０８１、１３０７、及び１３８７にそれぞれ存在していた。ｍ／ｚ１３０７の大きなピークは、３位の３−ヒドロキシデカン酸残基が欠失しているモノリン酸脱アシル化型に相当し、一方、ｍ／ｚ１３８７のピークは、ｍ／ｚ１３０７の分子イオンのビスリン酸化型に相当する。ｍ／ｚ１０８１のピークは、３−ヒドロキシデカン酸残基と３−ヒドロキシテトラデカン酸残基の両方が欠失しているモノリン酸型に相当する。３位の３−ヒドロキシデカン酸残基が欠失しているリピドＡ種の相対含有量は、野生型百日咳菌ＬＰＳにおける約３７％から、PagL(Bb)発現株における９２％超へと増加した。このように、ＬＰＳの電気泳動移動度が影響を受けない場合でさえも（図１４、２レーン）、pagL(Bb)にコードされたリピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素は百日咳菌中で活性を有していた。
【００６８】
PagP(Ec)（図１５Ｃ）及びPagP(Bp)（図１５Ｄ）発現の際、数種の新規リピドＡ種が検出された（表III）。ｍ／ｚ１３２０、１４９０、１５４５、１６２５、１７１５、及び１７９６のピークは、ｍ／ｚ１０８１、１２５１、１３０７、１３８７、１４７７、及び１５５７に存在していた分子イオンの、予測されたPagP介在性パルミトイル化にそれぞれ相当する。トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析後に見られた（図１４）、大腸菌PagPと百日咳菌PagPとの間の修飾効率における相違は、質量分析でも明らかになった。大腸菌PagPを発現する株では全リピドＡ群の最大で４７％までがパルミトイル化されたのとは対照的に、PagP(Bp)を発現する株では、最大でわずか９％であった。興味深いことに、PagP(Bp)を発現する株では、PagP(Ec)を発現する株とは対照的に、３−ヒドロキシテトラデカン酸残基が欠失しているリピドＡ種のパルミトイル化は見られなかった。この矛盾に対して可能な説明としては、それら２つのPagP酵素の特異性が異なることが挙げられる。大腸菌PagPはリピドＡの２位でアシル鎖を付加するのに対し、百日咳菌PagPは、３’位でパルミチン酸を付加する（Bishop et al., EMBO J., 2000; Preston et al., Mol. Microbiol., 2003）。このように、百日咳菌PagP発現株において、１個の３−ヒドロキシテトラデカン酸残基が欠失しているパルミトイル化リピドＡ種が全く存在しないことは、３−ヒドロキシテトラデカン酸残基が欠失しているリピドＡ分子は、それを３’位で特異的に欠失していることを示唆している。前記の示唆により、２つのPagP酵素間で観察された修飾効率の相違について、部分的に説明が可能となった。というのは、大腸菌PagPの基質プールは、百日咳菌PagPのものよりも大きいと考えられるためである。また、この仮説は、インビボで低アシル化（hypo-acylated）リピドＡ種が存在することと合致する。
【００６９】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】リピドＡの構造。Ａ：大腸菌リピドＡは、４個のＲ−３−ヒドロキシミリストイル部分で置換されたビスリン酸化グルコサミン二糖からなり、その２’及び３’脂肪アシル鎖は、それぞれラウリン酸塩及びミリスチン酸塩でエステル化されている。Ｂ：サルモネラリピドＡの制御された修飾。L-Ara4N又はpEtNによるリン酸塩部分の置換は、それぞれArnT及びPmrCにより媒介されている。LpxOによる２−ヒドロキシミリスチン酸塩で修飾したリピドＡの形成、PagPによる２位の二次パルミトイル鎖の付加、及びPagLによる３位の３−ヒドロキシミリストイル部分の除去。
【図２】PagLタンパク質の多重配列アラインメント。ClustalW（http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html）を用いて配列のアラインメントを行った。ハイフンは、最適アラインメントのために導入されたギャップを示す。完全に保存されている残基に、アスタリスクで印をつけてある。コロン及び点で示しているのは、それぞれ、保存度の高い残基及び保存度の低い残基である。百日咳菌のPagLＯＲＦは、フレームシフトにより破壊されており、コドン３３に２つのヌクレオチドを加えることによって、このアラインメント用に修復されたものである。PagL相同体のGenBankタンパク質アクセッション番号は、次の通りである：ネズミチフス菌ＡＡＬ２１１４７、気管支敗血症菌ＮＰ＿８９０３０６、パラ百日咳菌ＮＰ＿８８５４８７、百日咳菌ＢＸ４７０２４８§、緑膿菌ＮＰ＿２５３３５０、Ｐ．フルオレッセンスＮＺ＿ＡＡＡＴ０３０００００６§、Ｐ．プチダＮＣ＿００２９４７§、Ｐ．シリンゲＺＰ＿００１２５４６５、Ｂ．ファンゴラムＮＺ＿ＡＡＡＪ０３０００００３§、鼻疽菌ＮＣ＿００２９７０§、類鼻疽菌ＮＣ＿００２９３０§、Ｒ．メタリデュランスＺＰ＿００２７４７４４、青枯病菌ＮＰ＿５２２７６２、及びＡ．ビネランジーＺＰ＿０００８９５３４。§という記号は、PagL相同体の同定を手作業で行った全（未解読）ゲノムのGenBankアクセッション番号を示すものである。
【図３】大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）におけるPagLの発現及び膜局在。空のpET-11aプラスミド又はpPagLプラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）由来の膜を単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。クーマシーブリリアントブルーでタンパク質を染色した。アスタリスクは、マイクロシークエンシングを行って、成熟PagLタンパク質に相当することが判明したバンドを示す。２個のアスタリスクで示したバンドは、PagL(Bb)前駆タンパク質に相当する。左側にあるのは、分子量標準タンパク質である。
【図４】インビボでのＬＰＳ修飾の、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析。pET-11aコンストラクト又はpPagLコンストラクトを含む、対数増殖期の大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）細胞を、表示された時間、ＩＰＴＧで誘導した後、ＯＤ６００が１ユニットの培養試料を回収し、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【図５】野生型大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）ＬＰＳ及びPagL修飾大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）ＬＰＳの、ＧＣ／ＭＳによる分析。精製した大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）の野生型ＬＰＳ（ＷＴ）、PagL(St)修飾ＬＰＳ（Ｌ（Ｓｔ））、PagL(Bb)修飾ＬＰＳ（Ｌ（Ｂｂ））、及びPagL(Pa)修飾ＬＰＳ（Ｌ（Ｐａ））の、ＧＣ／ＭＳによる分析（ｔ＝誘導後の時間）。野生型ＬＰＳを１００として、それに対して基準化したＣ１４／Ｃ１４−３ＯＨ比を示している（バーの上に数値を示す）。
【図６】野生型大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）ＬＰＳ及びPagL修飾大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）ＬＰＳの、ＥＳＩ−ＭＳによる構造分析。空のpET-11aを含む野生型大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）由来のリピドＡ種（Ａ）、並びにPagL(St)で修飾したリピドＡ種（Ｂ）、PagL(Pa)で修飾したリピドＡ種（Ｃ）、及びPagL(Bb)で修飾したリピドＡ種（Ｄ）を、ＥＳＩ−ＭＳで分析した。ｍ／ｚ１７９７、１９２８、１６２２、及び１４９０における大きなピークは、それぞれ、大腸菌に一般に見られる特徴的なヘキサアシル化ビスリン酸種、L-Ara4N部分で置換されたヘキサアシル化ビスリン酸種、L-Ara4N部分で置換された３−Ｏ−脱アシル化モノリン酸種、及び３−Ｏ−脱アシル化モノリン酸種と解釈される。ｍ／ｚ１７１６及び１８４７における大きなピークは、おそらく、ｍ／ｚ１７９７及び１９２８における種の断片イオンを示すものであろう。
【図７】脱アシル化ＬＰＳのインビボでの再修飾及び内在性PagPの役割。Ａ：空のpET-11aベクター又はPagL(Bb)プラスミドを含む、対数増殖期の大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）細胞を、表示された時間、ＩＰＴＧで誘導した。ＯＤ６００が１ユニットに相当する試料を回収し、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。Ｂ及びＣ：PagL発現の誘導後、表示された時間で単離した、精製した大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）の野生型ＬＰＳ（ＷＴ）及びPagL(Bb)修飾ＬＰＳ（Ｌ（Ｂｂ））の脂肪酸含有量を、ＧＣ／ＭＳで分析した。野生型ＬＰＳを１００として、それに対して基準化したＣ１４／Ｃ１４−３ＯＨ比（Ｂ）及びＣ１６／Ｃ１４比（Ｃ）を示している（バーの上に数値を示す）。Ｄ：対数増殖期の野生型大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）、又は大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）及びpPagL(Pa)を含むそのpagP変異誘導体ＪＧ１０１を、表示された時間、ＩＰＴＧで誘導し、その後、ＯＤ６００が１ユニットの培養試料を回収し、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。
【図８】緑膿菌由来PagLの位相モデル。（Tommassen, J. (1988) in Membrane Biogenesis (Op den Kamp, J.A.F., ed) NATO ASI series, Vol. H16, pp. 351-373. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York）に記載の外膜タンパク質構造の一般原則を用いて、PagL(Pa)の位相モデルを構築した。かかるモデル案は、外部環境まで延びている４つのループ（Ｌ１−４）を備えた８本鎖のβ−バレルからなる。仮想β鎖中の残基を菱形で囲んで示し、脂質二重層に露出している残基については、菱形に影をつけている。Ｈｉｓ１４９及びＳｅｒ１５１（赤で印をつけている；PagL(Pa)前駆体中の位置）は、完全に保存されており（図２）、セリン加水分解酵素の「古典的」触媒３残基の一部であることが示唆されている。触媒３残基の酸性残基の潜在的候補を、黄色で示す。数字は、前駆体配列中の残基の位置を指す。
【図９】アミノ酸置換によるPagL(Pa)活性部位残基の同定。空のpET-11aベクター、pPagL(Pa)プラスミド又は変異pPagL(Pa)プラスミドを含む、対数増殖期の大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）細胞を、ＩＰＴＧで７５分間誘導した後、ＯＤ６００が１ユニットの培養試料を回収してトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、引きつづいて、PagL(Pa)に対する一次抗体を用いたイムノブロッテイング（Ａ）及びＬＰＳを視覚化するためのトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂ）を行った。
【図１０】百日咳菌ＬＰＳのインビボでの修飾。Ａ：野生型百日咳菌株Tahoma由来のＬＰＳ又はpMMB67EH-PagL(Bb)プラスミドを有する百日咳菌株Tahoma由来のＬＰＳを単離して、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。Ｂ：精製した百日咳菌株Tahomaの野生型ＬＰＳ（ＷＴ）及びPagL(Bb)修飾ＬＰＳ（PagL）の脂肪酸含有量を、ＧＣ／ＭＳで分析した。野生型ＬＰＳを１００として、それに対して基準化したＣ１４−３ＯＨ／Ｃ１０−３ＯＨ比を示している（バーの上に数値を示す）。
【図１１】単離したＬＰＳの生物学的活性。精製したＬＰＳによるＭＭ６細胞内でのＩＬ−６（Ａ）の誘導。横軸はｍｇ／ｍｌを単位とするＬＰＳ濃度を示し、縦軸は４５０ｎｍでのＥＬＩＳＡの表示値を示す。
【図１２】セミネイティブＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した、精製されリフォールディングされたPagL(Pa)(-)の加熱修飾可能性。精製されリフォールディングされたPagL(Pa)(-)の加熱修飾可能性を示す、クーマシーブリリアントブルーで染色したセミネイティブＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。電気泳動に先立って、０．１％のＳＤＳを含む試料緩衝液中で室温（ＲＴ）にて、又は、２％のＳＤＳを含む試料緩衝液中で１００℃（１５分間）にて、試料を処理した。左側にあるのは、分子量標準タンパク質である。
【図１３】膜結合性PagL又はインビトロでリフォールディングされたPagLによる、インビトロでのＬＰＳ修飾。インビトロでのPagL活性を示す銀染色トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ａ：精製した髄膜炎菌Ｌ３−ＬＰＳを、空のpET-11aプラスミド又はpPagLプラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）より調製した細胞外皮を用いて又は用いずに、洗浄剤含有緩衝液中で１８時間、３７℃でインキュベーションした。Ｂ：精製した髄膜炎菌Ｌ３−ＬＰＳを、５ｍＭのＥＤＴＡの存在下又は不在下で、そのシグナル配列をもたない、インビトロでリフォールディングされた４μｇのPagL(Pa)（PagL(Pa)(-)）を用いて又は用いずに、洗浄剤含有緩衝液中で１８時間、３７℃でインキュベーションした。同等量のアッセイ用混合物を、すべてのレーンにロードした。
【図１４】トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、インビトロでのＬＰＳ修飾の分析。熱フェノール／水抽出により、野生型百日咳菌株Tahoma及びPagP/PagL発現百日咳菌株TahomaからＬＰＳを単離して、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【図１５】野生型百日咳菌ＬＰＳ及びPagL/PagP修飾百日咳菌ＬＰＳの、ＥＳＩ−ＭＳによる構造分析。野生型百日咳菌株Tahoma由来のリピドＡ種（Ａ）、並びにPagL(Bb)で修飾したリピドＡ種（Ｂ）、PagP(Ec)で修飾したリピドＡ種（Ｃ）、及びPagP(Bp)で修飾したリピドＡ種（Ｄ）を、ＥＳＩ−ＭＳで分析した。ｍ／ｚ１５５７、１４７７、１３８７、１３０７、１２５１、及び１０８１における大きなピークは、それぞれ、百日咳菌に一般に見られる特徴的なペンタアシル化ビスリン酸種、相当するペンタアシル化モノリン酸種、３位の一次３−ヒドロキシデカン酸残基が欠失しているｍ／ｚ１５５７の分子イオンの脱アシル化リピドＡ種、３位の一次３−ヒドロキシデカン酸残基が欠失しているｍ／ｚ１４７７の分子イオンの脱アシル化リピドＡ種、一次３−ヒドロキシテトラデカン酸残基が欠失しているｍ／ｚ１４７７の分子イオンの脱アシル化リピドＡ種、及び３位の一次３−ヒドロキシデカン酸残基と一次３−ヒドロキシテトラデカン酸残基の両方が欠失しているｍ／ｚ１４７７の分子イオンの脱アシル化リピドＡ種と解釈される。ｍ／ｚ１３２０、１４９０、１５４５、１６２５、１７１５及び１７９６におけるピークは、それぞれ、ｍ／ｚ１０８１、１２５１、１３０７、１３８７、１４７７及び１５５７に存在する分子イオンのPagPを介したパルミトイル化に相当する。
【００７１】
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38. McClelland, M., Sanderson, K. E., Spieth, J., Clifton, S. W., Latreille, P., Courtney, L., Porwollik, S., Ali, J., Dante, M., Du, F., Hou, S., Layman, D., Leonard, S., Nguyen, C., Scott, K., Holmes, A., Grewal, N., Mulvaney, E., Ryan, E., Sun, H., Florea, L., Miller, W., Stoneking, T., Nhan, M., Waterston, R., and Wilson, R. K. (2001) Nature 413, 852-856
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【技術分野】
【０００１】
本件発明は、微生物学分野、特にグラム陰性ＬＰＳの合成及び修飾という生物学分野に関するものである。本発明はまた、医学分野、特に細菌性病原体に対するワクチン接種の分野にも関する。本発明はさらに、薬学的及び／又は獣医学的な目的、特に、百日咳菌（Bordetella pertussis）、パラ百日咳菌（Bordetella parapertussis）及び気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）などのグラム陰性菌に対するワクチンの調製に使用が可能な、グラム陰性菌、グラム陰性菌リポ多糖類（ＬＰＳ）及びＬＰＳを含む組成物にも関する。本発明はさらに、脱アシル化ＬＰＳを含有するワクチンを提供し、全細胞ワクチン及び無細胞ワクチンの調製における修飾及び解毒を施されたＬＰＳの使用を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
百日咳菌感染症は百日咳の病原因子であって、毎年の推定症例数は６０００万件とされ、全世界で年間約３５５，０００人が命を落としており（ＷＨＯ）、特に小児と免疫力の弱い人々がその犠牲者となっている。抗生物質による治療が利用可能ではあるが（エリスロマイシン）、この疾患であると診断される頃には、細菌性毒素によって重篤な障害が発生してしまっている場合が多い。したがって、この疾患の予防が非常に重要となる。主なコントロール手段は、依然としてワクチン接種である。従来から、百日咳（pertussis）（「百日咳（whooping-cough）」）感染症に対するワクチンは、百日咳菌の全細胞をベースとするものであった。加熱処理、ホルマリン又はその他の手段により殺菌した全菌体を含む全細胞百日咳ワクチンは、一般的なワクチン接種プログラムに１９５０年代初頭から含まれている。
【０００３】
幼児における百日咳の予防には効果的である一方で、全細胞百日咳ワクチンを用いた予防接種は、小児においては、発熱、けいれん及び脳障害を含む、局所性、全身性及び神経性の反応を伴うものであった。小児における百日咳の予防接種後の副作用の大部分に、ＬＰＳが関与している。動物が細菌に感染している間、ＬＰＳ又はそのリピドＡ部分は、Ｔｏｌｌ様受容体、主としてＴＬＲ−４との相互作用を通じて、先天性免疫系を活性化する。リピドＡに対する宿主反応には、陽イオン性抗菌ペプチド、サイトカイン、ケモカイン及び付加的な免疫活性化分子の産生が含まれる。限定的な感染においては、リピドＡに対する反応が細菌を除去する一助となるが、全身性敗血症においては、高いレベルの血中サイトカイン及び凝固促進活性により微小血管系が損傷する場合や、播種性血管内凝固症候群を伴うグラム陰性敗血症ショック症候群を促進する場合がある。
【０００４】
ＬＰＳに対する抗体によってある程度の防御が可能であることがマウスでの受動免疫実験で示されているものの、百日咳ワクチンにおけるＬＰＳの防御的役割についての決定的証拠は何も得られていない。しかし、これに加えて、及びより重要なことに、ワクチン中のＬＰＳの存在は、他の抗原に対する免疫応答を増大させることで、実際にアジュバント活性を提供するのである（K. Mills: Immunity to Bordetella pertussis. Microbes and Infection 3: 655-677 (2001)）。
【０００５】
安全性への懸念は、ワクチンの摂取（uptake）に悪影響を及ぼし、百日咳菌由来の高度精製抗原で調製された無細胞百日咳ワクチンを開発する動機となった。近年では、いわゆる「全細胞ワクチン」すなわち「ＷＣＶ」以外に、無細胞ワクチンすなわち「ＡＣＶ」も数カ国で導入されてきている。
【０００６】
無細胞ワクチンには、１〜３又はそれ以上の病原体の抗原が含まれているのが普通である。百日咳菌抗原の場合は、以下のものが通常使用される：百日咳毒素（ＰＴ、通常は、免疫原性を保持したままでその毒性を破壊するための処理がされている）、線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、線毛及び６９ｋＤのタンパク質又はペルタクチン（Prn）。一般に、無細胞ワクチンの反応発生率は、全細胞ワクチンの反応発生率よりもかなり低い。無細胞ワクチンに付随する全身反応（発熱、嘔吐、不機嫌、食欲不振）及び局所反応（腫脹、発赤、熱感、圧痛、硬直、疼痛）の頻度は、かなり低いものである。しかし、無細胞ワクチンの防御免疫が全細胞ワクチンの防御作用に匹敵するものであるかどうかについては、臨床データに鑑みて、いまだに意見が分かれるところである。多くの研究においては全細胞ワクチンの防御作用のほうが大きいとされ、このことが、幼児における全細胞ワクチンの、まれではあるが重篤な副作用の危険性に勝るものであるかどうかに関しては、議論が継続中である。現在、無細胞ワクチンを最多で６回接種する、各種の予防接種案が試行されている。全細胞ワクチンは当初、最後の追加免疫が４〜６歳の間に行われる定期予防接種スケジュールに組み込まれて、５回接種されていた。無細胞百日咳ワクチンは、現在、１０代での最終接種（ジフテリア・破傷風ワクチンと組み合わせたもの）を含めて６回接種することが推奨されている。無細胞ワクチンは、全細胞をベースにしたワクチンよりも安全だと思われるが、以前百日咳ワクチンに対してアレルギー反応を示したことのある小児には、どちらのワクチンも接種すべきではない。
【０００７】
百日咳全細胞ワクチンの副作用は、当該技術分野において、十分に立証されている（論評：S.H. Yeh: Pertussis: persistent pathogen, imperfect vaccines. Expert Rev. Vaccines 2: 113-127 (2003)）。現在使用されている無細胞ワクチンは、こうした副作用を部分的には克服しているものの、これらのワクチンによりもたらされる防御免疫には依然として異論もあり、かなり改善の余地がある。重要なことに、モデルマウスにおいて、全細胞ワクチンは無細胞ワクチンよりも優れた長期防御作用を示しているのである（K. Mills: Immunity to Bordetella pertussis. Microbes and Infection 3: 655-677 (2001)）。また、無細胞ワクチンのほうが製造コストが高く製造も困難であり、各種抗原の単離、高レベルの精製及び品質管理、並びにそうした抗原の、最適量・所望量での混合及び製剤が必要となってくる。百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌及びその他のグラム陰性菌のより優れたワクチンが長年にわたって求められているのは、明らかである。
【非特許文献１】K. Mills: Immunity to Bordetella pertussis. Microbes and Infection 3: 655-677 (2001)
【非特許文献２】S.H. Yeh: Pertussis: persistent pathogen, imperfect vaccines. Expert Rev. Vaccines 2: 113-127 (2003)
【発明の開示】
【０００８】
本件発明は、改良された百日咳ワクチンの調製方法及び手段を提供する。本発明は、新規ボルデテラタンパク質を開示している。これらの新規百日咳菌タンパク質、パラ百日咳菌タンパク質、及び気管支敗血症菌タンパク質、並びにこれらのタンパク質をコードするＤＮＡ分子を本発明にしたがって使用してリピドＡを修飾し、それによって、少なくとも部分的に３−Ｏ−脱アシル化され、解毒されたＬＰＳを含む、新規百日咳菌株、パラ百日咳菌株及び気管支敗血症菌株、並びにその他のグラム陰性菌細胞を提供する。本件発明は、部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたＬＰＳを含むボルデテラ菌種細菌細胞を含む、改良されたワクチン接種用組成物、及び、単離され、少なくとも部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたＬＰＳ又はインビトロで３−Ｏ−脱アシル化されたＬＰＳを含む医薬組成物をも提供する。本発明はさらに、３−Ｏ−脱アシル化されたリピドＡ及び／又はＬＰＳ分子に対して作製された特異抗体も提供する。
【０００９】
グラム陰性菌外膜の主要な成分であるリポ多糖（ＬＰＳ）は、透過障壁としての外膜の機能及び補体媒介性細胞溶解への耐性に重要であることが知られており（Raetz, C. R. H., and Whitfield, C. (2002) Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700にて論評されている）、共有結合した３つのドメインである、リピドＡ、コア部分、及びＯ−抗原からなっている。リピドＡは、疎水性膜アンカーを形成し、ＬＰＳの内毒素活性に関与している。大腸菌においてリピドＡは、２位、３位、２’位及び３’位で、エステル結合又はアミド結合を介してＲ−３−ヒドロキシミリスチン酸残基で置換されている、１，４’−ビスリン酸化β−１，６−結合グルコサミン二糖類からなっている。二次ラウロイル基及びミリストイル基は、２’位及び３’位で、Ｒ−３−ヒドロキシミリストイルのヒドロキシル基をそれぞれ置換している（図１Ａ）。リン酸基、グルコサミン二糖類、並びに正しい数及び長さのアシル鎖がリピドＡの生物学的活性に重要であることが、以前の研究により示されている（Raetz, C. R. H., and Whitfield, C. (2002) Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700；Loppnow, H., Brade, H., Durrbaum, I., Dinarello, C. A., Kusumoto, S., Rietschel, E. T., and Flad, H. D. (1989) J. Immunol. 142, 3229-3238；Steeghs, L., Berns, M., ten Hove, J., de Jong, A., Roholl, P., van Alphen, L., Tommassen, J., and van der Ley, P. (2002) Cell. Microbiol. 4, 599-611）。
【００１０】
２つのリン酸の置換パターン並びにアシル鎖の数及び長さにわずかな変異が認められるものの、リピドＡの基本構造がグラム陰性菌間でよく保存されているのは、理にかなったことである（Nikaido, H., and Vaara, M. (1987) in Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., ed) Vol. 1, pp. 7-22, American Society for Microbiology, Washington, D. C.；Caroff, M., Karibian, D., Cavaillon, J-M., and Haeffner-Cavaillon, N. (2002) Microbes Infect. 4, 915-926）。リピドＡの別の修飾（図１Ｂ）は、サルモネラ属菌のネズミチフス菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium)）において、二成分制御系PhoP/PhoQによって制御されている（Guo, L., Lim, K. B., Gunn, J. S., Bainbridge, B., Darveau, R. P., Hackett, M., and Miller, S. I. (1997) Science 276, 250-253；Guo, L., Lim, K. B., Poduje, C. M., Daniel, M., Gunn, J. S., Hackett, M., and Miller, S. I. (1998) Cell 95, 189-198）。Ｍｇ２＋の低いレベルに反応して、センサーキザーゼPhoQがリン酸化し、それによって転写活性因子のPhoPを活性化し、これが４０の異なる遺伝子の活性化又は抑制へとつながっていく（Guo, L., Lim, K. B., Gunn, J. S., Bainbridge, B., Darveau, R. P., Hackett, M., and Miller, S. I. (1997) Science 276, 250-253；Gunn, J. S., Belden, W. J., Miller, S. I. (1998) Microb. Pathog. 25, 77-90）。リピドＡの修飾に関与する第二の制御系はPmrA/PmrB二成分系であり、これはそれ自体がPhoP/PhoQによって制御されている（Gunn, J. S., Lim, K. B., Krueger, J., Kim, K., Guo, L., Hackett, M., and Miller, S. I. (1998) Mol. Microbiol. 27, 1171-1182；Gunn, J. S., Ryan, S. S., Van Velkinburgh, J. C., Ernst, R. K., and Miller, S. I. (2000) Infect. Immun. 68, 6139-6146）。PhoP/PhoQ系に変異を有する変異体は、毒性の低下及び抗菌ペプチドに対する感受性の増大を示す（Miller, S. I., Kukral, A. M., and Mekalanos, J. J. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5054-5058；Gunn, J. S., and Miller, S. I. (1996) J. Bacteriol. 178, 6857-6864）。PhoP/PhoQ及びPmrA/PmrB系の相同体が、大腸菌、ペスト菌（Yersinia pestis）、及び緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）を含む他のグラム陰性菌で同定されている（Ernst, R. K., Guina, T., and Miller, S. I. (1999) J. Infect. Dis. 179, Suppl. 2, 326-330；Ernst, R. K., Yi, E. C., Guo, L., Lim, K. B., Burns, J. L., Hackett, M., and Miller, S. I. (1999) Science 286, 1561-1565）。
【００１１】
現在までに、数種類のリピドＡ修飾酵素が同定されている。ネズミチフス菌における、１つ又は２つの４−アミノ−４−デオキシ−Ｌ−アラビノース（L-Ara4N）部分による１及び４’リン酸基の置換は、酵素ArnTに依存することがわかっている（Trent, M. S., Ribeiro, A. A., Lin, S., Cotter, R. J., and Raetz, C. R. H. (2001) J. Biol. Chem. 276, 43122-43131）。最近、Pmrcタンパク質が、サルモネラ菌において、リピドＡへのホスホエタノールアミン（pEtN）の付加を仲介していることがわかった（Lee, H., Hsu, F. F., Turk, J., and Groisman, E. A. (2004) J. Bacteriol. 186, 4124-4133）。LpxOと命名された他の酵素は、リピドＡのＯ２依存性ヒドロキシル化に触媒作用を及ぼし（Gibbons, H. S., Lin, S., Cotter, R. J., and Raetz C. R. H. (2000) J. Biol. Chem. 275, 32940-32949）、リピドＡ１−ホスホターゼは、リゾビウム レグミノサルム（Rhizobium leguminosarum）中で同定されている（Karbarz, M. J., Kalb, S. R., Cotter, R. J., and Raetz, C. R. H. (2003) J. Biol. Chem. 278, 39269-39279）。これらの酵素はすべて内膜又はペリプラズム空間内部に存在すると考えられている（Trent, M. S., Ribeiro, A. A., Lin, S., Cotter, R. J., and Raetz, C. R. H. (2001) J. Biol. Chem. 276, 43122-43131；Lee, H., Hsu, F. F., Turk, J., and Groisman, E. A. (2004) J. Bacteriol. 186, 4124-4133；Gibbons, H. S., Lin, S., Cotter, R. J., and Raetz C. R. H. (2000) J. Biol. Chem. 275, 32940-32949；Karbarz, M. J., Kalb, S. R., Cotter, R. J., and Raetz, C. R. H. (2003) J. Biol. Chem. 278, 39269-39279）。最近、新種の外膜局在リピドＡ修飾酵素が発見された。その１つがパルミトイルトランスフェラーゼPagPである（Bishop, R. E., Gibbons, H. S., Guina, T., Trent, M. S., Miller, S. I., and Raetz, C. R. H. (2000) EMBO J. 19, 5071-5080）。リピドＡのパルミトイル化は、陽イオン性抗菌ペプチドに対する耐性の増大につながる（Guo, L., Lim, K. B., Poduje, C. M., Daniel, M., Gunn, J. S., Hackett, M., and Miller, S. I. (1998) Cell 95, 189-198）。さらに、パルミトイル化リピドＡは、ＬＰＳによるヒト細胞の活性化に拮抗する（Tanamoto, K., and Azumi, S. (2000) J. Immunol. 164, 3149-3156）。PagPの相同体は、ネズミチフス菌、百日咳菌、気管支敗血症、パラ百日咳菌、在郷軍人病菌（Legionella pneumophila）、大腸菌、及びペスト菌など、他のものにおいても発見されている（Bishop, R. E., Gibbons, H. S., Guina, T., Trent, M. S., Miller, S. I., and Raetz, C. R. H. (2000) EMBO J. 19, 5071-5080；Robey, M., O'Connell, W., and Cianciotto, N. P. (2001) Infect. Immun. 69, 4276-4286）。
【００１２】
他の外膜局在リピドＡ修飾酵素に、３−Ｏ−脱アシル化酵素のPagLがある（Trent, M. S., Pabich, W., Raetz, C. R. H., and Miller, S. I.(2001) J. Biol. Chem. 276, 9083-9092）。この酵素はネズミチフス菌で発見され、リピドＡの３位でエステル結合を加水分解し、それによって一次（primary）３−ヒドロキシミリストイル部分を放出することが示されている（Trent, M. S., Pabich, W., Raetz, C. R. H., and Miller, S. I. (2001) J. Biol. Chem. 276, 9083-9092）。これまで、近縁種であるチフス菌（Salmonella typhi）及びパラチフス菌（Salmonella paratyphi）以外には、pagLの明らかな相同体を非冗長又は未完成の微生物データベースで見つけることができなかった（Trent, M. S., Pabich, W., Raetz, C. R. H., and Miller, S. I. (2001) J. Biol. Chem. 276, 9083-9092）。しかし、緑膿菌（Ernst, R. K., Yi, E. C., Guo, L., Lim, K. B., Burns, J. L., Hackett, M., and Miller, S. I. (1999) Science 286, 1561-1565）、Ｒ．レグミノサルム菌（R. leguminosarum）（Bhat, U. R., Forsberg, L. S., and Carlson, R. W. (1994) J. Biol. Chem. 269, 14402-14410）、ヘリコバクター ピロリ菌（Helicobacter pylori）（Moran, A. P., Lindner, B., and Walsh, E. J. (1997) J. Bacteriol. 179, 6453-6463）、及びポルヒロモナス ジンジバリス菌（Porhyromonas gingivalis）（Kumada, H., Haishima, Y., Umemoto, T., and Tanamoto, K. (1995) J. Bacteriol. 177, 2098-2106）などの他のグラム陰性菌のなかには、３−Ｏ−脱アシル化リピドＡ種を含有するものもあり、このことは、これらの生物がPagLと類似した活性を有する酵素を含有していることを示唆している。
【００１３】
本件発明は、様々なグラム陰性菌におけるpagL相同体の同定について開示している。各種タンパク質と進歩したバイオインフォマティクスツールとの間の限定的な配列類似性を用いて、これらの相同体及びその活性部位残基を同定した。本明細書において本発明者らは、様々なグラム陰性菌における異種発現のためのpagL相同体の存在及び使用について記載している。サルモネラ菌種由来の既知のpagL遺伝子との全体的な配列類似性はやや低いものの、Ｃ末端領域において、保存されたPagLドメインを識別することができた。
【００１４】
先行技術に記載されているのはサルモネラ菌種由来のPagLタンパク質のみである。また、開示されているのは大腸菌のみにおけるpagLの異種発現であり（Trent, M. S., Pabich, W., Raetz, C. R. H., and Miller, S. I.(2001) J. Biol. Chem. 276, 9083-9092）、その結果として脱アシル化ＬＰＳが生じている。他のグラム陰性菌におけるpagL相同体の存在に関するデータは、当該技術分野においてまったく入手できない。他のグラム陰性菌におけるpagLの相同的発現、他のグラム陰性菌においてPagLが機能しているかどうか、他のグラム陰性菌におけるリピドＡ／ＬＰＳ組成物、細菌生存率、毒性及び免疫原性に対するPagLの作用などは、すべて未知の因子である。大腸菌におけるサルモネラpagLの異種発現に関する限られたデータのみが入手可能であって、そうしたデータにおいては、グラム陰性菌感染の自然な状態を反映することのない、組換えヒトＴＬＲ４を発現する細胞中で、ＴＬＲ応答が測定されている（Kawasaki et al., J Biol Chem. 2004）。
【００１５】
本件発明の明細書は、緑膿菌及び気管支敗血症菌のpagL相同体の活性を開示している。かかる活性は大腸菌及びボルデテラ菌種での異種発現により確認されており、活性の結果としてリピドＡからＲ−３−ヒドロキシミリストイル基が除去されている。ＬＰＳの生物学的活性に対する作用を、ヒトマクロファージ細胞で分析した。PagLによる脱アシル化の際に、大腸菌リピドＡ（百日咳菌リピドＡではなく）には別の修飾が施されたが、これは内在性パルミトイルトランスフェラーゼPagPの活性の結果として生じたことだった。さらに、活性部位残基として、保存された一組のヒスチジン−セリンを同定した。このことは、セリン加水分解酵素に似た触媒機構を示唆するものである。最後に、ＬＰＳ基質上でのPagLのインビトロ活性が示されている。PagLの生物学的機能を本発明にしたがって応用して、グラム陰性菌の病原性、毒性、及び免疫原性を修飾してもよい。こうした修飾は、細菌の全菌体、又はそれから誘導可能な部分、断片又は化合物上で発生する場合がある。本発明は、最終的に、本発明に記載のグラム陰性菌の全細胞、又はこうした細菌から入手可能な及び／又は単離した、修飾したリピドＡ／ＬＰＳ、若しくはインビトロで修飾したＬＰＳ／リピドＡ分子を含む、グラム陰性菌感染症に対する新規ワクチンを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
定義：
「配列同一性」は、本明細書において、２以上のアミノ酸（ポリペプチド又はタンパク質）配列又は２以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列の間の、かかる配列を比較することによって決定される関係として定義されている。当該技術において「同一性」は、アミノ酸配列間又は核酸配列間の配列関連性の程度も意味し、配列関連性の程度は、場合によってはそうした配列間のマッチによって決定される。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、あるポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換と、第二のポリペプチドの配列とを比較することによって、決定される。「同一性」及び「類似性」は、公知の方法によって容易に計算可能である。そうした方法としては、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; 及び Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)に記載の方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
同一性を決定する好ましい方法は、テストする配列間の一致が最大となるように設計されている。同一性及び類似性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラム中で体系化されている。２つの配列間の同一性及び類似性を決定する好ましいコンピュータプログラムの方法には、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)）、BestFit、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)）などがある。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩ及びその他の情報源から公的に入手可能である（BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)）。周知のSmith Watermanアルゴリズムも、同一性の決定に用いてもよい。
【００１８】
ポリペプチド配列比較用の好ましいパラメータとして、以下のものがある：アルゴリズム：Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)；比較行列：BLOSSUM62 from Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)；ギャップペナルティー：１２；及びギャップ長ペナルティー：４。これらのパラメータに有用なプログラムは、ウィスコンシン州マディソンに所在のGenetics Computer Group社から「Ｏギャップ」プログラムとして公的に入手可能である。前述のパラメータは、アミノ酸比較用のデフォルトパラメータである（エンドギャップについてはペナルティーなし）。核酸比較用の好ましいパラメータとして、以下のものがある：アルゴリズム：Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)；比較行列：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０；ギャップペナルティー：５０；及びギャップ長ペナルティー：３。ウィスコンシン州マディソンに所在のGenetics Computer Group社からギャッププログラムとして入手可能である。上記のものは、核酸比較用のデフォルトパラメータである。
【００１９】
当業者には明らかなように、アミノ酸類似性の程度を決定する際に、当業者が任意でいわゆる「同類（conservative）」アミノ酸置換も考慮に入れる場合がある。同類アミノ酸置換とは、類似した側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループとしては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンがあり、脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループとしては、セリン及びスレオニンがあり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループとしては、アスパラギン及びグルタミンがあり、芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループとしては、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンがあり、塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループとしては、リジン、アルギニン、及びヒスチジンがあり、酸性側鎖を有するアミノ酸のグループとしては、アスパラギン酸及びグルタミン酸があり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループとしては、システイン及びメチオニンがある。好ましい同類アミノ酸置換基としては、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンがある。本明細書で開示するアミノ酸配列の置換変異型は、開示された配列中の少なくとも１つの残基が除去され、別の残基がその場所に挿入されたものである。かかるアミノ酸の変更が同類であることが好ましい。天然アミノ酸それぞれについて好ましい同類置換は以下の通りである：Ａｌａ→ｓｅｒ；Ａｒｇ→ｌｙｓ；Ａｓｎ→ｇｌｎ又はｈｉｓ；Ａｓｐ→ｇｌｕ；Ｃｙｓ→ｓｅｒ又はａｌａ；Ｇｌｎ→ａｓｎ；Ｇｌｕ→ａｓｐ；Ｇｌｙ→ｐｒｏ；Ｈｉｓ→ａｓｎ又はｇｌｎ；Ｉｌｅ→ｌｅｕ又はｖａｌ；Ｌｅｕ→ｉｌｅ又はｖａｌ；Ｌｙｓ→ａｒｇ；ｇｌｎ又はｇｌｕ；Ｍｅｔ→ｌｅｕ又はｉｌｅ；Ｐｈｅ→ｍｅｔ、ｌｅｕ又はｔｙｒ；Ｓｅｒ→ｔｈｒ；Ｔｈｒ→ｓｅｒ；Ｔｒｐ→ｔｙｒ；Ｔｙｒ→ｔｒｐ又はｐｈｅ；及びＶａｌ→ｉｌｅ又はｌｅｕ。
【００２０】
本発明のＤＮＡ断片が別のＤＮＡ断片に対して機能的な関係に置かれている場合、前記断片は「作用可能な状態で結合している」。例えば、プロモーター又はエンハンサーが、あるコード配列の転写を刺激する場合、かかるプロモーター又はエンハンサーは前記コード配列に作用可能な状態で結合している。シグナル配列用のＤＮＡが、あるポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現する場合、前記ＤＮＡはそのポリペプチドをコードするＤＮＡに作用可能な状態で結合している。一般に、作用可能な状態で結合しているＤＮＡ配列は隣接しており、シグナル配列の場合は、隣接し、かつ読取相（reading phase）内にある。しかし、エンハンサーは、そのエンハンサーが転写を制御しているコード配列に隣接している必要はない。結合は、都合のよい制限部位、又はその代わりに挿入されたアダブター若しくはリンカーでのライゲーションにより完成する。
【００２１】
適切なプロモーター配列の選択は、一般に、そのＤＮＡ断片を発現させるために選択された宿主細胞によって異なる。好適なプロモーター配列としては、当該技術分野で周知の原核細胞プロモーター及び真核細胞プロモーターが例示できる（例えば、上記Sambrook and Russell, 2001参照）。転写調節配列は一般的に、宿主によって認識される異種エンハンサー又はプロモーターを含んでいる。適切なプロモーターの選択は宿主によって異なるが、trp、lac及びファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、並びに糖分解酵素プロモーターのようなプロモーターが周知であり、利用可能である（例えば、上記Sambrook and Russell, 2001参照）。発現ベクターは複製システムを含んでおり、また、ポリペプチドコード断片用の挿入部位を備えた転写及び翻訳調節配列を用いることができる。細胞株及び発現ベクターの効果的な組み合わせの例は、Sambrook and Russell（２００１、上記）、及びMetzger et al. (1988) Nature 334: 31-36に記載されている。例えば、好適な発現ベクターを、Ｓ．セレビシエ（S.cerevisiae）などの酵母、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞、及び大腸菌又はボルデテラ菌種などの細菌細胞中で発現させることができる。
【００２２】
第一の実施形態において、本件発明は、リピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性を有し、そのため、配列番号１に対して少なくとも２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８又は９９％のアミノ酸同一性を示す新規ポリペプチドを提供する。前記ポリペプチドは、インビボについては実施例３に例示され、インビトロについては実施例９に記されている、本明細書に記載の検定により測定されたリピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性を示す。リピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性を有するポリペプチドは、配列番号１に記載のポリペプチド、気管支敗血症菌及びパラ百日咳菌のPagLタンパク質、又はその一部やその変異体、又はリピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性を有する配列番号１の一部を少なくとも含む融合タンパク質であることが好ましい。
【００２３】
別の実施形態において本件発明は、配列番号１に対して少なくとも２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８又は９９％のアミノ酸同一性を示すポリペプチドをコードする核酸配列を含む。本発明の核酸配列は、それぞれ気管支敗血症菌及びパラ百日咳菌に由来のpagL遺伝子である配列番号２又は配列番号３に記載の核酸配列に対して５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８又は９９％の同一性を示すことが好ましい。かかる核酸配列は、完全長コード配列であってもよく、又はそれに由来するコード若しくは非コード（若しくは相補）部分、断片、若しくはオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００２４】
本発明はさらに、本発明に記載の核酸配列を含む、及び／又は配列番号１に対して少なくとも２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８又は９９％のアミノ酸同一性を示すポリペプチドをコードする、ＤＮＡベクターを含むものである。本発明のＤＮＡベクターは当該技術分野で周知のいかなるベクターであってもよく、例えば、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、人工染色体、（相同）ゲノム組み込み用ベクターなどが例示されるが、これらに限定されるものではない。かかるベクターは、抗生物質への耐性、蛍光標識、分子タグなどをもたらす、選択可能なマーカーなどのマーカーを含んでいてもよい。本発明に記載の核酸のクローニング方法及びコードされたタンパク質の発現方法は、当業者には周知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 1989や、Ausubel F. et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, 2004に記されている。本件発明のベクターは、プロモーター、エンハンサー及びターミネーターなどの調節配列に核酸配列が作用可能な状態で結合しており、そのため、遺伝子が発現し、メッセンジャーがリピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素タンパク質へと翻訳されているベクターであることが好ましい。かかるベクターは、任意により誘導可能な方法で、例えば、プラスミドpMMB67上の誘導可能なtacプロモーターによって、グラム陰性菌宿主細胞に発現を起こさせ、かつリピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性を与えることができることが最も好ましい。
【００２５】
本発明は、配列番号１のポリペプチドに結合可能な抗体も提供する。本発明の抗体は、実施例に示すように、本発明のポリペプチドを注入することにより宿主中で作製したモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってもよい。診断目的で、例えば、グラム陰性菌におけるPagLタンパク質及びその変異体又はその相同体の発現を分析するために、抗体を用いてもよい。また、リピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性を示すタンパク質の単離及び／又は精製のために、抗体を用いてもよい。
【００２６】
本発明は、別の態様において、本発明の核酸分子を含む、及び／又は本発明のポリペプチド分子をコードする、グラム陰性菌に関している。かかる核酸分子は、本発明のＤＮＡベクター内部に含まれ、コードされたタンパク質のグラム陰性菌中での発現をもたらし、リピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性のソース（source）を細胞に提供することが好ましい。前記グラム陰性菌は、配列番号１においてPagLタンパク質に対してかなりの（＞４０％）同一性を有するタンパク質のようなリピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性を示す機能タンパク質をコードする遺伝子を、そのゲノムに含まない細菌であることが好ましい。リピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性のソースを提供することにより、グラム陰性菌細胞の細胞壁外膜におけるＬＰＳの組成が変化することが最も好ましい。リピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性のソースを提供されるグラム陰性菌は、配列番号２又は３にて提供されている核酸配列に対してかなりの相同性を有している、百日咳菌のように、例えば、変異、フレームシフト、又は欠損により、非機能的遺伝子を含む細菌であってもよい。
【００２７】
しかし、リピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性を有するタンパク質をコードする（部分的）機能遺伝子をそのゲノムに含むグラム陰性菌にも、本発明の範囲内で、この活性の別のソースが提供されてもよい。グラム陰性菌は、ある程度のリピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性を有していてもよいが、本発明のポリペプチドをさらに発現させること及び／又はその発現を増大させることによって、かかる活性を増大させてもよい。この結果、細菌中のリピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性が、かかる細菌のリピドＡ及び／又はＬＰＳ組成が野生型細菌と比較して一次的又は永久的に変化する又は改変される程度に、一次的又は永久的に増加することが好ましい。そうしたグラム陰性菌は、例えば、パラ百日咳菌や気管支敗血症菌であってもよいが、他のどのようなグラム陰性菌、好ましくは病原性グラム陰性菌を選択してもよく、例としては、髄膜炎菌（N.meningitidis）、淋菌（N.gonorrhoeae）、Ｎ．ラクタミミカ菌（N.lactamica）などのナイセリア菌種が挙げられる。
【００２８】
リピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性又は高レベルのリピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性を有する本発明のグラム陰性菌は、少なくとも部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたリピドＡ及び／又はＬＰＳ種を、細菌細胞壁の外膜に含んでいることが好ましい。あるいは、本発明のグラム陰性菌は、例えばリピドＡの３−Ｏ−脱アシル化後のパルミトイル化、脱リン酸化又はその他の二次修飾などの、リピドＡの３−Ｏ−脱アシル化後の二次修飾を有するＬＰＳ又はリピドＡ種を含んでいてもよい。本発明の細菌細胞は、その全ＬＰＳ／リピドＡの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％を、３−Ｏ−脱アシル化された形態で含んでいてもよく、又は、代替的に、そのリピドＡ／ＬＰＳの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％を、二次修飾を有する形態で含んでいてもよい。かかる二次修飾の例としてはパルミトイル化や脱リン酸化が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
本件発明は、別の態様において、部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたＬＰＳの製造方法を提供する。第一の実施形態において、かかる方法は、脱アシル化ＬＰＳの合成及び任意で脱アシル化ＬＰＳの回収を促進する条件下で、本発明のグラム陰性菌を培養するステップを含む。各種グラム陰性菌を培養する方法は当該技術で周知であり、例えば、Methods for General and Molecular Bacteriology. P. Gerhardt et al., Eds. American Society for Microbiology, Washington DC, 1994に掲載されている。ＬＰＳの回収、単離、及び／又は精製の方法も当該技術で周知であり（Meningococcal Vaccines, Methods and Protocols. A.J. Pollard and M.C.J. Maiden, Eds. Chapter 12: Construction of LPS mutants, pp.155-165. Humana Press, Totowa, New Jersey, 2001）、例えば、本明細書にて提供されている実施例にしたがって実施することができる。
【００３０】
あるいは、本件発明は、少なくとも部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたＬＰＳ又はリピドＡのインビトロでの製造方法を提供し、かかる方法は、ＬＰＳ又はリピドＡを含む組成物を、処理前の（crude）形態又は（部分的に）精製した形態で提供するステップ、及び、酵素によるインビトロでの３−Ｏ−脱アシル化を促進する条件下で、この組成物を本発明のポリペプチド又はタンパク質と接触させるステップを含む。かかる条件は、本件明細書において、実施例９及び方法の項に掲載されている。
【００３１】
さらに別の実施形態において、本件発明は、少なくとも部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたＬＰＳ及び／又はリピドＡを含む組成物、好ましくは、全ＬＰＳ／リピドＡの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８又は９９％を、その３−Ｏ−脱アシル化された形態、又は、３−Ｏ−脱アシル化後の二次修飾を有する別の形態、例えばパルミトイル化された形態で含む組成物を提供する。
【００３２】
部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたＬＰＳ及び／又はリピドＡを含み、任意に二次修飾を有し、細菌細胞の細胞壁外膜に含まれるか、又は処理前の形態若しくは精製した形態である本発明の組成物を、医薬組成物の製造に用いてもよい。特に好ましい実施形態において、かかる本発明の医薬組成物は、ワクチン接種用として好適な組成物であってもよい。かかる医薬組成物は、宿主生物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおいて、グラム陰性菌に対する免疫応答を引き出すことができる。少なくとも部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたＬＰＳ及び／又はリピドＡの存在、又は代替的に３−Ｏ−脱アシル化後の二次修飾を有するＬＰＳの存在により、毒性低下、対象における副作用の数の減少及び重篤度の低下、及び治療又はワクチン接種を受ける対象におけるこの組成物に対する耐量の増加など、いくつかの利点がもたらされる。かかる医薬組成物は、１以上の賦形剤及び／又はアジュバントを含んでいてもよい。薬学的に許容可能な賦形剤及びアジュバントは、当該技術分野で周知であり、当業者は、例えばCurrent protocols in Immunology, Wiley Interscience 2003又はRemmington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, 1990から自由に選択してもよい。
【００３３】
第一の実施形態において、かかる医薬組成物は、凍結、加熱処理、機械的破砕、化学処理、又は薬学及びワクチンの技術分野で周知の他の方法により不活性化された、生菌細胞若しくは弱毒化生菌細胞、又は生存不能菌細胞を含む全細胞ワクチンであってもよい（J.L. Pace, H.A. Rossi, V.M. Esposito, S.M. Frey, K.D. Tucker, R.I. Walker. Inactivated whole-cell bacterial vaccines: current status and novel strategies. Vaccine 16: 1563-1574 (1998)）。かかる細菌細胞は、グラム陰性の病原性細菌であることが好ましく、かかる細菌細胞は、ボルデテラ属、サルモネラ属、シゲラ（Shigella）属、ナイセリア属、クレブシエラ（Klebsiella）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ヘモフィルス（Haemophilus）属、エシェリキア（Escherichia）属、プロテウス（Proteus）属であることがより好ましく、百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌であることが最も好ましい。
【００３４】
第二の好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は、グラム陰性病原性細菌の免疫原性成分を１、２、３又はそれ以上含み、少なくとも部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたＬＰＳ又はリピドＡ、又は３−Ｏ−脱アシル化後の二次修飾を有する前記ＬＰＳを含む無細胞ワクチンであってもよい。部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたリピドＡ及び／又はＬＰＳは、本発明のグラム陰性病原性細菌から得られることが好ましく、かかる細菌細胞は、ボルデテラ属であることが好ましく、百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌であることが最も好ましい。脱アシル化後の二次修飾を任意に有する少なくとも部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたリピドＡ及び／又はＬＰＳを、それを産生する細菌に対する防御免疫応答を引き出すために使用してもよいが、代替案として、好適なアジュバント物質として使用するために、他の組成物と混合して使用することも可能である。ＬＰＳはワクチン接種用の好適なアジュバントとして当該技術分野で知られており、Ｔｏｌｌ様受容体を活性化し、生来の免疫応答を刺激する。本発明の部分的に３−Ｏ−脱アシル化され、少なくとも部分的に解毒されたＬＰＳ及び／又はリピドＡは、この免疫刺激（アジュバント）活性をかなり保持している一方で、局所的腫脹、発赤、疼痛及び発熱などの、毒性による副作用の発生は少ない。
【００３５】
本発明の薬学的に許容可能な組成物及びワクチンを、病原性グラム陰性菌に感染した、又は感染の危険にさらされている対象の治療方法に使用してもよい。かかる方法は、本発明の医薬組成物、全細胞ワクチン又は無細胞ワクチンを投与するステップを含んでいる。具体的なアジュバント、組成物中の物質の相対量及び絶対量、並びに投与の用法は周知である。あるいは、当業者がそれらを決定してもよく、特定の病原体感染又は治療を受ける特定の対象の状態など、各種状況に応じて適合させてもよい。かかる用法は、単回投与を含むものでもよいが、例えば、追加抗原投与などの反復投与をも含むものであってもよく、経口、経鼻又は非経口による投与を行ってもよい。ワクチン接種用の各種用法は当該技術において周知であり、当業者は、それらを適切に適合させてもよい。
［実施例］
【００３６】
実験手順
菌株及び増殖条件
本研究で使用したすべての菌株を表１に記載する。概ね、改変Luria-Bertani培地寒天、指定のＬＢ寒天（Tommassen, J., van Tol, H., and Lugtenberg, B. (1983) EMBO J. 2, 1275-1279）、又はＬＢ培地において、２００ｒｐｍで震盪しながら、大腸菌株及び緑膿菌株を３７℃で増殖させた。大腸菌については、培地に０．２％のグルコースを補充した。適切とされる場合には、プラスミドの維持及び株の選択のため、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、５０μｇ／ｍｌのナリジクス酸、又は１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンの存在下で、細菌を増殖させた。ＬＢ寒天プレート上でネズミチフス菌ＳＲ１１を３７℃で増殖させ、１５％の脱線維素ヒツジ血液を補充したBorduet-Gengou寒天（Difco社製）上で気管支敗血症菌株及び百日咳菌株を３５℃で増殖させた。百日咳菌中でpagL(Bb)遺伝子の発現を誘導するため、１ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（最終濃度）を補充した合成Thijs培地（Thalen, M., van den IJssel, J., Jiskoot, W., Zomer, B., Roholl, P., de Gooijer, C., Beuvery, C., and Trampen, J. (1999) J.Biotechnol. 75, 147-159）において、震盪しながら（１８０ｒｐｍ）、細菌を３５℃で増殖させた。
【００３７】
【表１】
【００３８】
組換えＤＮＡ技術
Promega Wizard（登録商標）Plus SV Miniprepsシステムを用いて、プラスミドＤＮＡを単離した。製造者（Fermentas社）の指示にしたがい、子牛の腸のアルカリホスファターゼ及び制限エンドヌクレアーゼを使用した。Qiagen社のクイックゲル抽出キットを用いて、アガロースゲルからＤＮＡ断片を単離した。ラピッドＤＮＡライゲーションキット（Roche社製）を使用して、ライゲーションを行った。
【００３９】
ネズミチフス菌ＳＲ１１由来のpagL遺伝子（pagL(St)）、気管支敗血症菌Ｂ５０５由来のpagL遺伝子（pagL(Bb)）、及び緑膿菌ＰＡＯ２５由来のpagL遺伝子でそのシグナル配列コード部分をもつもの又はもたないもの（pagL(Pa)、pagL(Pa)(-)）を、pET-11a（Novagen社製）のＴ７プロモーターの後ろにクローニングした。染色体ＤＮＡをテンプレートとして使用し、ＰＣＲによって遺伝子を増幅した。テンプレートＤＮＡは、以下のように調製した。１０９個以下の細菌を５０μｌの蒸留水に再懸濁し、その後、懸濁液を１５分間９５℃で加熱した。ついで懸濁液を１６，１００×ｇで１分間の遠心分離にかけた後、上清液をテンプレートＤＮＡとして使用した。NdeIサイト（下線部）を含有し、ＡＴＧ開始コドンを内包していたフォワードプライマーの配列は、5’-AACATATGAAGAGAATATTTATATATC-3’（pagL(St)）、5’-AACATATGAAGAAACTACTTCCGCTGG-3’（pagL(Pa)）、5’-AACATATGGCGGACGTCTCGGCCGCCG-3’（pagL(Pa)(-)）、及び5’-AACATATGCAATTTCTCAAGAAAAACA-3’（pagL(Bb)）であった。BamHIサイト（下線部）を含有し、終止コドンを内包していたリバースプライマーの配列は、5’-AAGGATCCTCAGAAATTATAACTAATT-3’（pagL(St)）、5’-AAGGATCCCTAGATCGGGATCTTGTAG-3’（pagL(Pa)、pagL(Pa)(-)）、及び5’-AAGGATCCTCAGAACTGGTACGTATAG-3’（pagL(Bb)）であった。以下の条件下でＰＣＲを行った：全反応量は５０μｌ、各プライマーは２５ｐｍｏｌ、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、３μｌのテンプレートＤＮＡ溶液、１．５％のジメチルスルホキシド、製造者（Roche社）より供給された、緩衝液付きのExpand High Fidelity酵素ミックスが１．７５ユニット。温度プログラムは、以下の通りである：９５℃で３分間、１回が９５℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分３０秒間というサイクルを３０回繰り返し、続いて７２℃で１０分間、その後、４℃まで冷却。アガロースゲルからＰＣＲ産物を精製し、その後、pCRII-TOPOにクローニングした。正しいクローン由来のプラスミドＤＮＡをNdeI及びBamHIで消化し、NdeI/BamHIで消化したpET-11aに、PagLコード断片をライゲーションした。ライゲーション混合物を用いて、ＣａＣｌ２方法で大腸菌ＤＨ５αを形質転換した（Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) in Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour (NY)）。NdeI及びBamHIでの消化による正しいPagLコードインサートの有無について、形質転換体由来のプラスミドＤＮＡを調べた。正しい消化プロフィールをもたらすプラスミドを、pPagL(Pa)、pPagL(Pa)(-)、pPagL(Bb)、及びpPagL(St)とした（表Ｉ）。クローニングしたpagL遺伝子の正しいコード配列を、両方向のヌクレオチドシークエンシングにより確認した。宿主範囲が広範な、低コピーpMMB67EHベクターにPagL(Bb)遺伝子をサブクローニングするため、pPagL(Bb)プラスミドＤＮＡをXbaI及びHinDIIIで消化し、XbaI/HinDIIIで消化したpMMB67EHに、PagL(Bb)コード断片をライゲーションした。ライゲーション混合物を用いて、大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行った。XbaI及びHinDIIIでの消化による正しいPagLコードインサートの有無について、形質転換体由来のプラスミドＤＮＡを調べた。正しい消化プロフィールをもたらすプラスミドを、pMMB67EH-PagL(Bb)とした（表Ｉ）。後者のプラスミドを使用して、大腸菌ＳＭ１０の形質転換を行った。それにより、その後、Stibitz et al（Stibitz, S., Black, W., and Falkow, S. (1986) Gene 50, 133-140）に記載の固体培地への結合を行って、pMMB67EH-PagL(Bb)を百日咳菌へ移し替えることが可能となった。QuikChange（登録商標） 部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene社製）及び表IIに列挙したプライマーを使用して、pagLに変異を導入した。変異が生じたテンプレートとして、プラスミドpPagL(Pa)を用いた。正しい変異の存在を、両方向のヌクレオチドシークエンシングにより確認した。
【００４０】
【表２】
【００４１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロッティング
Bio-Rad Mini-PROTEAN（登録商標）3装置を用いて、０．２％のＳＤＳを含むランニングゲルでドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680-685）を行って、タンパク質を分析した。４％のスタッキングゲルで、試料を１３％のポリアクリルアミドゲルに塗布し、１５０Ｖで電気泳動にかけた。クーマシーブリリアントブルーでタンパク質を染色した。前染色した、又は無染色の、Bio-Rad社製Precision Plus Proteina Standardを使用して、相対分子量（Ｍｒ）を測定した。ウェスタンブロッティング用に、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからニトロセルロース膜へ転写した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．６）、０．５％の無脂肪粉乳、０．１％のTween-20中で膜を一晩ブロッキングして、PagL(Pa)に対する一次抗体とともにブロッキング緩衝液中でインキュベーションし、引き続いて、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ウサギ抗モルモットＩｇＧ抗体（Sigma社製）とともにブロッキング緩衝液中でインキュベーションを行った。SuperSignal（登録商標）WestPico Chemiluminescent Substrate（Pierce社製）を用いて、ブロットを現像した。
【００４２】
セミネイティブ（semi-native）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
Bio-Rad Mini-PROTEAN（登録商標）3装置を用いて、０．２％のＳＤＳを含むランニングゲルでドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680-685）を行って、タンパク質を分析した。セミネイティブＳＤＳ−ＰＡＧＥのため、ランニング及びスタッキングゲルにＳＤＳを添加することはなく、電気泳動に先立って試料を加熱することもなかった。４％のスタッキングゲルで、試料を１３％のポリアクリルアミドゲルに塗布し、１５０Ｖで電気泳動にかけた。セミネイティブＳＤＳ−ＰＡＧＥのため、電気泳動は氷上で１５ｍＡの定電流で行われた。クーマシーブリリアントブルーでタンパク質を染色した。前染色した、又は無染色の、Bio-Rad社製Precision Plus Proteina Standardを使用して、相対分子量（Ｍｒ）を測定した。
【００４３】
トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＬＰＳ含有試料に対して、０．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（最終濃度）を試料緩衝液に添加した（Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680-685）。５５℃で６０分間、続いて、９５℃で１０分間、試料をインキュベーションして、プロテイナーゼＫを不活性化した。次いで、試料緩衝液を添加して試料を１０倍に希釈し、その後、２μｌの試料をトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに塗布した（Lesse, A. J., Campagnari, A. A., Bittner, W. E., and Apicella, M. A. (1990) J. Immunol. Methods 126, 109-117）。３５Ｖでブロモフェノールブルーを分離ゲルに流し込み、その後、電圧を１０５Ｖに上げた。最前部がゲルの底に到達した後、さらに４５分間、試料を流れるままに放置した。水／エタノール／酢酸を１１：８：１（ｖ／ｖ／ｖ）としたものの中でゲルを一晩固定し、その後、文献記載のように銀で染色した（Tsai, C. M., and Frasch, C. E. (1982) Anal. Biochem. 119, 115-119）。
【００４４】
ポリクローナル抗体
抗体の作製のため、pPagL(Pa)(-)を用いて大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）を形質転換し、切断されたpagL遺伝子の発現を可能にした。封入体中に蓄積しているPagL(Pa)タンパク質を単離し（Dekker, N., Merck, K., Tommassen, J., and Verheij, H. M. (1995) Eur. J. Biochem. 232, 214-219）、分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから精製し、Eurogentec社でのモルモットの免疫付与に使用した。
【００４５】
マイクロシークエンシング
Bio-Rad Mini-PROTEAN（登録商標）2ブロッティング装置を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから、１９２ｍＭのグリシン、２５ｍＭのTris（ｐＨ８．３）、１０％のメタノール（ｖ／ｖ）中のImmobilona-P二フッ化ポリビニリデン膜（Millipore Corp.社製）に、タンパク質を１００Ｖで１時間転写した。転写後、蒸留水で膜を１５分間、３回洗浄した。転写したタンパク質をクーマシーブリリアントブルーで染色した。膜を風乾し、推定PagLバンドを切り取って、オランダ国ユトレヒト大学のシークエンシングセンター施設で、マイクロシークエンシングにかけた。
【００４６】
ＬＰＳの単離及びガスクロマトグラフィー質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）による分析
熱フェノール／水抽出法を用いて、ＬＰＳを単離した（Steeghs, L., Berns, M., ten Hove, J., de Jong, A., Roholl, P., van Alphen, L., Tommassen, J., and van der Ley, P. (2002) Cell. Microbiol. 4, 599-611）。すなわち、プラスミドpMMB67EH-PagL(Bb)をもつ又はもたない百日咳菌株Tohamaを、１ｍＭのＩＰＴＧ（最終濃度）の存在下で、３リットルのThijs培地（Thalen, M., van den IJssel, J., Jiskoot, W., Zomer, B., Roholl, P., de Gooijer, C., Beuvery, C., and Trampen, J. (1999) J.Biotechnol. 75, 147-159）中で増殖させた。遠心分離により細胞を回収し、５ｍＭのＥＤＴＡを含む４０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に再懸濁した。細胞をリゾチームで４℃にて一晩処理し、その後、等量のフェノールを添加した。懸濁液を７０℃まで加熱し、震盪しながら３０分間インキュベーションした。懸濁液を１０℃まで冷却した後、遠心分離により相を分離した。上部相を回収し、下部相に等量の蒸留水を添加することにより、抽出を繰り返した。続いて７０℃でのインキュベーション、冷却、及び遠心分離を行った後、２つの上部相を混合し、フェノール臭が消えるまで、水道水で透析した。透析した画分を凍結乾燥させた後、ＬＰＳを濃度１ｍｇ／ｍｌでリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）中に溶解させた。ＧＣ／ＭＳによる脂肪酸分析のため、単離したＬＰＳのアリコートに５倍（ｖ／ｖ）を超えるアセトンを添加し、その後、溶液を窒素流下で６０℃にて乾燥させた。続いて、塩化アセチル／エタノールを１：９（ｖ／ｖ）としたもの１００μｌ、及び、内部標準として１０μｇのＣ１２：０（２ＯＨ）（エタノール中で１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、その後で試料を９０℃で１時間誘導体化した。冷却後、１ＭのＫ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．０）を２００μｌ添加することにより反応を停止させ、引き続いて、２００μｌの酢酸エチルでアシル−エチルエステルを抽出した。１μｌ量の上部相を、電子衝撃モードのFinnigan MAT SSQでのＧＣ／ＭＳによる分析に使用した。
【００４７】
ＬＰＳの生物学的活性
野生型百日咳菌TohamaＬＰＳ及びPagL修飾百日咳菌TohamaＬＰＳによるＩＬ−６及びＩＬ−１０の誘導について、ヒトマクロファージ細胞株ＭＭ６（Ziegler-Heitbrock, H. W., Thiel, E., Futterer, A., Herzog, V., Wirtz, A., and Riethmuller, G. (1988) J. Cancer 41, 456-461）でテストを行った。マイクロタイタープレート（２．１０５／ウェル）において、１０％のウシ胎仔血清（Gibco BRL社製）を補充した４００μｌのＩＭＤＭ（Gibco BRL社製）中にＭＭ６細胞を播種し、５％のＣＯ２を含む湿潤雰囲気中で１６〜１８時間、３７℃にて、ＬＰＳ原液の連続希釈液２００μｌで刺激した。製造者の指示にしたがい、ヒトＩＬ−６又はＩＬ−１０に対するＥＬＩＳＡで、培養上清液のＩＬ−６及びＩＬ−１０のレベルを定量した（PeliPairTM試薬セット、Sanquin Reagents社製、オランダ国、アムステルダム）。
【００４８】
細胞外皮の単離
１，５００×ｇで１０分間の遠心分離により細胞を回収し、０．９％の塩化ナトリウムの冷溶液５０ｍｌで１回洗浄した。細胞ペレットを−８０℃で少なくとも１５分間凍結した後、コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル（Roche社製）を含む、３ｍＭのＥＤＴＡ及び１０ｍＭのTris−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２０ｍｌに懸濁した。超音波処理で細胞を破壊した後、破壊されなかった細胞を、１，５００×ｇで１０分間の遠心分離により除去した。１５０，０００×ｇで１．５時間の遠心分離により、上清液から細胞外皮をペレット化し、２ｍＭのTris−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に再懸濁した。細胞外皮をアリコートの形で−８０℃にて保管した。
【００４９】
封入体の単離
封入体の単離のため、大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）中でpPagL(Pa)(-)からPagL(Pa)(-)を発現させた（表１）。アンピシリンを補充したＬＢ培地において、ＯＤ６００が０．４〜０．６になるまで、２リットルの培養物を３７℃で増殖させた。次いで、１ｍＭのＩＰＴＧ（最終濃度）を培養物に添加して、組換え遺伝子の発現を誘導し、その後、培養物を震盪しながら３７℃でさらにインキュベーションした。約４時間後、遠心分離（４０００ｒｐｍで１５分間（４℃））により、細胞を回収した。回収した細胞を４００ｍｌの０．９％ＮａＣｌで１回洗浄した後、８０ｍｌのＴＥ５０：４０（５０ｍＭのTris−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁した。スクロース（０．２５ｇ／ｍｌ（最終濃度））及びリゾチーム（０．２ｍｇ／ｍｌ（最終濃度））を添加し、その後、懸濁液を震盪しながら室温（ＲＴ）で３０分間インキュベーションした。Branson 250 Sonfierをマクロチップとともに用いて（出力９、デューティーサイクル５０％）、懸濁液を氷上で３回超音波処理した（１．５分間、間に２分間の休止をはさむ）。超音波処理に続いて、０．１３％（ｗ／ｖ）のBrij-35P（Fluka社製）を添加し、懸濁液をさらに２分間超音波処理した。４，０００ｒｐｍ（４℃）で２時間の遠心分離により高密度物質（封入体）を回収した後、ペレットを４０ｍｌのＴＥ５０：４０で１回洗浄し、引き続いて、１０ｍＭのTris−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）を４０ｍｌ用いてさらなる洗浄工程を行った。得られた封入体を、１０ｍＭのグリシン（ｐＨ８．３）を補充した８Ｍの尿素中で可溶化し、ＴＣＡで析出させた。最後に、得られたタンパク質を、１０ｍＭのグリシン（ｐＨ８．３）を補充した８Ｍの尿素中で、タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍｌで可溶化した。この混合物を１３，０００ｒｐｍで２時間の遠心分離にかけ、残留する不溶性物質及び膜を除去した。
【００５０】
PagL(Pa)(-)のリフォールディング及び精製
１０％（ｗ／ｖ）のラウリルジメチルアミン酸化物（ＬＤＡＯ）による１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液（上記参照）の２倍希釈、及びその後の１０分間の超音波処理により、PagL(Pa)(-)のリフォールディングをインビトロで行った。リフォールディングされたPagL(Pa)(-)を、１ｍｌのMonoQ（Amersham Biosiences社製）イオン交換カラムを用いた高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）により精製した。緩衝液Ａ（２０ｍＭのTris−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．０８％（ｗ／ｖ）のＣ１０Ｅ５）で、タンパク質溶液を４倍希釈した。緩衝液Ａで前平衡化し、緩衝液Ａで１回洗浄したカラムにかかる溶液を充填し、緩衝液Ａ中のＮａＣｌが０〜１Ｍとなるように直線的濃度勾配をかけてタンパク質の溶出を行った。リフォールディングされたPagL(Pa)(-)タンパク質の有無について、画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。かかるタンパク質を含有するものをプールし、分子量カットオフ値が３ｋＤａのCentricon濃縮器（Amicon社製）を使用して、タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。その後、分子量カットオフ値が３．５ｋＤａの膜を使用して、１０ｍｌの、２ｍＭのTris−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．０６％（ｗ／ｖ）のＣ１０Ｅ５で、タンパク質溶液の透析を一晩３回行った。
【００５１】
インビトロ修飾アッセイ
リフォールディングされたPagL(Pa)(-)（１０ｍｇ／ｍｌ）、又は空のベクターpET-11a若しくはpPagLプラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）から単離した細胞外皮を、再蒸留水で１０倍に希釈した。リフォールディングされたタンパク質又は細胞外皮の希釈液を、最終的な量としては１０μｌの、５０ｍＭのHepes（ｐＨ８．０）、０．１％のTriton X-100、０．５ＭのＮａＣｌ、及び０．７５ｎｍｏｌの髄膜炎菌Ｌ３−ＬＰＳ中で、３７℃にて１６時間インキュベーションした。反応が二価陽イオンに依存するかどうかをテストするため、リフォールディングされたPagL(Pa)(-)を用いた反応には５ｍＭのＥＤＴＡを添加した。試料緩衝液中での煮沸により反応を終了させ（Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680-685）、その後、試料を０．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫで１時間、５５℃にて処理し、引き続いて、９５℃で１０分間のインキュベーションを行った。試料緩衝液を添加して試料を２５倍に希釈した後、２μｌの試料をトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（上記参照）。
【００５２】
ＬＰＳの単離及びエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）による分析
熱フェノール／水抽出法（Westphal and Jann, Methods Carbohydr. Chem. 5; 83-91,1965）をわずかに改変した方法を用いて、ＬＰＳを単離した。すなわち、１ｍＭのＩＰＴＧ（最終濃度）の存在下で、細菌をTHIJS培地中で６４時間増殖させた。遠心分離により細胞を回収し、５ｍＭのＥＤＴＡを含む４０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に懸濁した。細胞をリゾチームで４℃にて一晩処理し、その後、等量のフェノールを添加した。懸濁液を７０℃まで加熱し、震盪しながら３０分間インキュベーションを行った後、懸濁液を１０℃まで冷却し、その後、８，０００×ｇで１０分間の遠心分離により相を分離した。上部相を回収し、下部相に等量の蒸留水を添加することにより、抽出を繰り返した。２つの上部相を組み合わせ、フェノール臭が消えるまで水道水で透析し、凍結乾燥させ、その後、蒸留水に入れた。続いて、１５０，０００×ｇで３時間の遠心分離によりＬＰＳをペレット化し、蒸留水に溶解した後、文献（Welch, Clin. Microbiol. Rev. 1991）記載の通り、6890 Agilentガスクロマトグラフを用いて３−ヒドロキシテトラデカン酸の含有量を分析することにより、ＬＰＳ濃度を測定した。ＥＳＩ−ＭＳのため、単離したＬＰＳ（５０ｎｍｏｌ／ｍｌ）のアリコート２００μｌを凍結乾燥させ、２％の酢酸０．１ｍｌに入れた。混合物を９５℃で２時間加熱して、ＬＰＳを加水分解し、リピドＡ部分を放出させた。続いて、混合物を室温まで冷却し、１６，１００×ｇで１０分間の遠心分離を行った。０．１ｍｌの再蒸留水でペレットを２回洗浄し、０．１ｍｌの再蒸留水に入れ、０．３ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）を添加した。激しくボルテックスした後、１６，１００×ｇで１０分間の遠心分離により相を分離した。その後、上部相を、陰イオンモードのFinnigan LCQでのナノエレクトロスプレータンデムＭＳによる精製リピドＡの構造分析に使用した（Wilm and Mann, Anal. Chem. 1996）。
【実施例１】
【００５３】
各種グラム陰性菌におけるPagL相同体の同定
ＮＣＢＩのデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi）に存在するグラム陰性菌の解読（completed）ゲノム及び未解読（unfinished）ゲノムのすべてを検索することにより、ネズミチフス菌PagL前駆タンパク質の１８７アミノ酸配列（GenBankアクセッション番号ＡＡＬ２１１４７、配列番号１７）を手がかりとして使用し、他のグラム陰性菌における推定PagL相同体を同定した。ＢＬＡＳＴ検索（Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., and Lipman, D. J. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410）により、ボルデテラ菌種の、百日咳菌、気管支敗血症菌、及びパラ百日咳菌における推定相同体の存在が明らかになった（図２）。気管支敗血症菌及びパラ百日咳菌のPagL相同体は、シグナルＰサーバー（signalP server）により予測されていたように（Nielsen, H., Brunak, S., and von Heijne, G. (1999) Protein Eng. 12, 3-9）、２５個のアミノ酸からなるＮ末端シグナルペプチドをもつ、１７８個のアミノ酸からなる、お互いに一致する２つのポリペプチドである（図２）。PagL相同体の遺伝子も百日咳菌株Tohama Iのゲノム中で発見されている（Parkhill, J., Sebaihia, M., Preston, A., Murphy, L. D., Thomson, N., Harris, D. E., Holden, M. T., Churcher, C. M., Bentley, S. D., Mungall, K. L., Cerdeno-Tarraga, A. M., Temple, L., James, K., Harris, B., Quail, M. A., Achtman, M., Atkin, R., Baker, S., Basham, D., Bason, N., Cherevach, I., Chillingworth, T., Collins, M., Cronin, A., Davis, P., Doggett, J., Feltwell, T., Goble, A., Hamlin, N., Hauser, H., Holroyd, S., Jagels, K., Leather, S., Moule, S., Norberczak, H., O'Neil, S., Ormond, D., Price, C., Rabbinowitsch, E., Rutter, S., Sanders, M., Saunders, D., Seeger, K., Sharp, S., Simmonds, M., Skelton, J., Squares, R., Squares, S., Stevens, K., Unwin, L., Whitehead, S., Barrell, B. G., and Maskell, D. J. (2003) Nat. Genet. 35, 32-40）が、このオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）はフレームシフト（配列番号４）により破壊されており、こうした破壊を配列番号５のように修復して、配列番号１のようにタンパク質をコードすることが可能な場合もある。百日咳菌Ｂ５０９株及びＢ１３４株由来のPagLＯＲＦのヌクレオチドシークエンシングでも、同じフレームシフト２の存在が示されており、このことは、PagLＯＲＦの破壊は百日咳菌株における共通の特徴であるという可能性を示している。新規に同定された気管支敗血症菌のPagL相同体をさらなるＢＬＡＳＴ分析のプローブとして用いて、別の推定PagL相同体を、以下のゲノム中で同定することができた：緑膿菌（配列番号６、３０％の同一性）、シュードモナスフルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）（配列番号７、２９％の同一性）、シュードモナス シリンゲ（Pseudomonas syringae）（配列番号８、３１％の同一性）、シュードモナスプチダ（Pseudomonas putida）、２ｘ（配列番号９＋１０、３２／３３％）、ラルストニア メタリデュランス（Ralstonia metallidurans）（配列番号１５、２８％）、青枯病菌（Ralstonia solanacearum）（配列番号１６、２９％）、鼻疽菌（Burkholderia mallei）（配列番号１２、２８％）、類鼻疽菌（Burkholderia pseudomallei）（配列番号１３、２８％）、バークホルデリア ファンゴラム（Burkholderia fungorum）（配列番号１１、２９％）、及びアゾトバクター ビネランジー（Azotobacter vinelandii）（配列番号１４、２７％）。図２に、アラインメントを示す。総合して、ネズミチフス菌に対する同一性（２４％の同一性）よりは高いとはいえ、いずれのPagL相同体も、相互間の配列同一性として全体的に低い数値を示したが、Ｃ末端付近にはっきりとした相同ドメインを含んでいた。本発明者らによるこの保存モチーフの発見によって、他の（細菌）種におけるPagL相同体の同定が可能となり、また、３−Ｏ−脱アシル化されるあらゆる宿主細菌及び／又はあらゆるＬＰＳに対して、適切なPagL相同体の使用が可能となる。
【実施例２】
【００５４】
pagLのクローニング及び大腸菌における異種発現
推定リピドＡ脱アシル化酵素活性を実証するため、本発明者らは、緑膿菌のPagL相同体（pagL(Pa)）及び気管支敗血症菌のPagL相同体（pagL(Bb)）のクローニングを行った。本発明者らにより、pagL(St)も参考用としてこれらの研究に含められた。これらのpagL遺伝子をＰＣＲにより染色体から増幅し、最終的にはＴ７プロモーターの制御下でpET-11aにクローニングした結果、pPagL(Pa)プラスミド、pPagL(Bb)プラスミド、及びpPagL(St)プラスミドが得られた。
【００５５】
大腸菌中のPagLの発現及び膜局在について調べるため、空のベクターpET-11a又はpPagLプラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）を一晩ＬＢ中で増殖させ、その後、細胞外皮を単離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析により、PagLを発現する細胞の細胞外皮中に、Ｍｒが１５０００〜１８０００の、別の顕著なバンドが存在することが明らかになった（図３）。これは、予測された成熟PagLタンパク質の分子量、すなわち、PagL(Pa)が１６．１ｋＤａ、PagL(Bb)が１７．２ｋＤａ、PagL(St)が１８．２ｋＤａという数値と合致するものである。かかる別のタンパク質バンドを同定するために、それらをマイクロシークエンシングにかけた。PagL(Pa)、PagL(Bb)、及びPagL(St)の、最初の５つのアミノ酸残基の配列は、それぞれＡＤＶＳＡ、ＱＰＴＱＧ、及びＮＤＮＶＦであった。このことは、リーダーペプチダーゼによるシグナルペプチドの開裂が、アミノ酸残基２３と２４の間（ＡＱＡ−ＡＤＶ）、２５と２６の間（ＡＱＡ−ＱＰＴ）、及び２０と２１の間（ＣＳＡ−ＮＤＮ）でそれぞれ発生していることを示している。特にPagL(Bb)の発現の場合は、より大きなＭｒを有する別のバンドがゲル上に認められた（図２）。このバンドのＮ末端配列であるＭＱＦＬＫは、PagL(Bb)の前駆体のＮ末端配列と一致していた。
【実施例３】
【００５６】
PagLによる大腸菌ＬＰＳのインビトロでの修飾
クローニングしたPagL相同体が大腸菌ＬＰＳに対して活性を示すかどうかを研究するため、空のベクターpET-11a又はpPagLプラスミドを含む対数増殖期の大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）細胞にＩＰＴＧを添加し、各種インキュベーション期間の後で、ＯＤ６００が１ユニットに相当する試料を回収し、そのＬＰＳ含有量をトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。リピドＡの３位におけるＲ−ヒドロキシミリスチン酸の予測された加水分解にしたがって、３つのPagL相同体のいずれかの発現が、より電気泳動移動度の高い形態へとＬＰＳを変換した（図４）。そうした変換は、PagL(Pa)又はPagL(Bb)が誘導されてから７５分以内にほぼ完了したが、PagL(St)の場合は、それよりもやや長い時間がかかった。
【００５７】
PagL修飾ＬＰＳの構造分析：ＬＰＳの脂肪酸含有量を測定するため、PhoP/PhoQが制御するリピドＡの修飾を抑制するために１０ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下で増殖させた細菌からＬＰＳを単離し、ＧＣ／ＭＳで分析した。PagL修飾ＬＰＳ試料のＣ１４：０／Ｃ１４：０（３ＯＨ）比は、野生型ＬＰＳのものと比較して増大しており（図５）、これは、予測されていた、リピドＡからのＣ１４−３ＯＨの除去と合致する。これらのデータを確認するため、リピドＡ部分を単離して、ＥＳＩ−ＭＳで陽イオンモードにて分析したところ、野生型ＬＰＳにおいて４つの主要なリピドＡ種の存在が明らかになった（図６Ａ）。ｍ／ｚ１７９７のピークが、大腸菌に一般に見られる特徴的なヘキサアシル化ビスリン酸種を示す一方で、ｍ／ｚ１９２８のピークは、L-Ara4N部分で置換されたヘキサアシル化ビスリン酸種に相当する。ｍ／ｚ１７１６及びｍ／ｚ１８４７における、残る２つのピークは、リン酸基を欠失した前記２つの種の断片イオンを示す可能性が高い。PagL(St)（図６Ｂ）、PagL(Pa)（図６Ｃ）、又はPagL(Bb)（図６Ｄ）の発現の際に、主要なリピドＡ種はｍ／ｚ１６２２及びｍ／ｚ１４９０に存在していた。これは、コントロールである空のベクターに存在する、ｍ／ｚ１９２８及びｍ／ｚ１７９７の主要な種からの、１つのβ−ヒドロキシミリスチン酸塩残基及び１つのリン酸基の欠失にそれぞれ相当する。ここでもまた、リン酸基の欠失は、おそらくイオン化手順の人為的影響によるものと思われる。ＧＣ／ＭＳ及びＥＳＩ−ＭＳのデータに基づき、緑膿菌及び気管支敗血症菌の同定されたPagL相同体は、ネズミチフス菌のものと同様に、活性を有するリピドＡ脱アシル化酵素であると結論づけることができる。また、かかるデータは、両方の種が効率的に脱アシル化されることから、脱アシル化がL-Ara4N部分の有無に依存しないことを示唆している。
【実施例４】
【００５８】
PagLで脱アシル化したＬＰＳの、その後のインビトロでの修飾
これらの実験の過程において、PagLの長期発現後は、PagL修飾ＬＰＳがトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で検出できなくなること、及び、PagL(Bb)発現株について図示したように、ＬＰＳが、野生型ＬＰＳの位置に再び移動することが観察された（図７Ａ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で明らかとなったように、PagLタンパク質は、この時点で依然として豊富に存在していた（データは図示せず）。また、ＧＣ／ＭＳによる分析で、Ｃ１４：０／Ｃ１４：０（３ＯＨ）比が、５時間にわたるPagL(Bb)の誘導後に単離したＬＰＳについては、二度と低下しなかったことが明らかになった（図７Ｂ）。このように、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で観察された二次修飾（図７Ａ）は、PagL修飾の修復の結果ではなく、電気泳動移動度を、野生型ＬＰＳの電気泳動移動度へと修復した別の修飾の結果であった。そのため、他の脂肪酸比を比較してみた。PagLの産生を５時間にわたって誘導した細胞のＬＰＳにおいて、Ｃ１６：０／Ｃ１４：０比の著しい増大が認められ、PagLで脱アシル化したＬＰＳが、その後パルミトイル化されたことが示唆された。
【００５９】
リピドＡにパルミチン酸を付与するタンパク質は、外膜タンパク質PagPである（Bishop, R. E., Gibbons, H. S., Guina, T., Trent, M. S., Miller, S. I., and Raetz, C. R. H. (2000) EMBO J. 19, 5071-5080）（図１）。そのため、本発明者らは、PagL修飾ＬＰＳの二次修飾は、内在性PagP活性の結果なのかもしれないとの仮説を立てた。この可能性について調べるため、本発明者らは、野生型大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）及びそのpagP変異誘導体ＪＧ１０１を、pPagL(Pa)プラスミドで形質転換した。野生型株の場合には、PagL修飾ＬＰＳの二次修飾が再び観察されたが、変異株の場合には観察されなかった（図７Ｄ）。この結果は、PagL修飾ＬＰＳの二次修飾（図７Ａ）が、実際に内在性PagP活性の結果であることを強く示唆している。
【実施例５】
【００６０】
PagL活性部位残基の同定
同定したPagL相同体相互間の配列同一性は、非常に低い（図２）。完全に保存された数個の残基のなかにヒスチジンとセリンがあり、本発明者らは、これらはセリン加水分解酵素の「古典的」Ａｓｐ／Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ触媒３残基（catalytic triad）の一部ではないかとの仮説を立てている。これらの推定活性部位残基は、本発明者らが提案した位相モデルのβ鎖の頂点付近にある脂質露出側に位置している（図８）。外膜ホスホリパーゼＡにおいて、活性部位Ｈｉｓ及び及びＳｅｒが同様の位置にあることは、興味深い（Snijder, H. J., Ubarretxena-Belandia, I., Blaauw, M., Kalk, K. H., Verheij, H. M., Egmond, M. R., Dekker, N., and Dijkstra, B. W. (1999) Nature 401, 717-721）。PagL(Pa)前駆タンパク質の１４９位と１５１位にそれぞれ位置するこれらの残基が実際に触媒活性に重要であるかどうかをテストするため、それらをアラニン又はアスパラギンで、及びアラニン又はシステインで、それぞれ置換した。コントロールとして、PagL(Pa)前駆体の８１位と８４位にれぞれ位置する非保存ヒスチジン及びセリン残基に対して同じ置換を行った。関連するプラスミドを有しＩＰＴＧで７５分間誘導した大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）細胞のタンパク質及びＬＰＳプロフィールを、イムノブロッティング（図９Ａ）及びトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図９Ｂ）でそれぞれ分析した。非保存Ｈｉｓ８１及びＳｅｒ８４の置換がＬＰＳの脱アシル化に影響しなかったのに対し、保存されたＨｉｓ１４９及びＳｅｒ１５１が置換された場合は、これらの変異タンパク質の発現が影響を受けなかった場合でさえも（図９Ａ）、ＬＰＳの脱アシル化は、もはや観察されなかった（図９Ｂ）。これらの結果は、前駆PagL(Pa)タンパク質の１４９位にある保存されたヒスチジン及び１５１位にあるセリンは活性部位残基であり、PagLはセリン加水分解酵素として機械的に機能するという仮説を、強く裏付けるものである。
【実施例６】
【００６１】
pagL(Bb)のクローニング及び百日咳菌における異種発現
百日咳菌ＬＰＳをインビボで修飾するため、本発明者らは、気管支敗血症菌のpagL遺伝子（pagL(Bb)）をクローニングした。pagL遺伝子をＰＣＲにより染色体から増幅し、最終的にはTacプロモーターの制御下でpMMB67EHにクローニングした。その結果、pMMB67EH-PagL(Bb)プラスミドが得られ、結合によってこれを百日咳菌株Tohamaへ移し替えた。
【００６２】
百日咳菌ＬＰＳのインビボでの修飾に取り組むため、１ｍＭのＩＰＴＧ（最終濃度）を補充したThijs培地で野生型百日咳菌株Tohama又はpMMB67EH-PagL(Bb)プラスミドを含む百日咳菌株Tohamaを増殖させた。熱フェノール−水抽出法でＬＰＳを単離し、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１０Ａ）及びＧＣ−ＭＳ（図１０Ｂ）で分析した。トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での分析により、PagL(Bb)発現株から単離したＬＰＳは、野生型百日咳菌ＬＰＳに比べて移動速度がやや速いことがわかった。注意を引いたのは、PagL(Bb)発現株から単離したＬＰＳが、２つの区別可能なＬＰＳ群を示していたことである。１つの群は野生型TohamaＬＰＳの高さ付近を移動し、１つの群はより速く移動していた。後者のＬＰＳ群は野生型ＬＰＳ調製物においても見ることができるが、その存在度はかなり低い。PagL発現株由来のＬＰＳが実際にその３位で脱アシル化されたことを実証するため、ＧＣ−ＭＳでの分析を行った。PagL修飾ＬＰＳ試料におけるＣ１４：０（３ＯＨ）／Ｃ１０：０（３ＯＨ）比は、野生型ＬＰＳのものと比べて増大しており（図１０Ｂ）、これは、予測されていた、百日咳菌リピドＡの３位からのＣ１０−３ＯＨの除去と合致する。
【実施例７】
【００６３】
PagL修飾ＬＰＳの生物学的活性
PagL修飾百日咳菌ＬＰＳ及び野生型百日咳菌ＬＰＳの内毒素活性を査定するため、それらのＬＰＳの、ヒトマクロファージ細胞株ＭＭ６におけるＩＬ−６及びＩＬ−１０の産生を刺激する能力を測定した。図２からわかるように、野生型ＬＰＳに関しては、ＭＭ６細胞によるＩＬ−６（図１１Ａ）及びＩＬ−１０（図１１Ｂ）の産生は、等量のPagL修飾ＬＰＳで細胞を刺激した場合と比較して、いずれも増加した。したがって、PagLによる百日咳菌ＬＰＳのインビボでの脱アシル化の結果、このＬＰＳの内毒素活性が低下すると結論づけることができる。
【実施例８】
【００６４】
PagL(Pa)のクローニング、発現、精製、及びリフォールディング
シグナル配列コード部分をもたない緑膿菌ＰＡＯ２５由来のPagL遺伝子をpET-11aにクローニングし、結果としてpPagL(Pa)(-)プラスミドを得た。封入体を得るため、シグナル配列をもたないPagLを大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）中で発現させた。封入体を単離して尿素中で可溶化し、その後、１０％のラウリルジメチルアミン酸化物（ＬＤＡＯ）で２倍に希釈することによりタンパク質をリフォールディングし、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）でさらに精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１２）及び円偏光二色性（ＣＤ）測定（データは図示せず）で正しいリフォールディングを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上では、リフォールディングされたタンパク質は変性型よりも電気泳動移動度が低かったのに対し、ＣＤ測定では、リフォールディングされたタンパク質の大部分がβシート構造を有することが示された。
【実施例９】
【００６５】
膜局在PagL及びリフォールディングされたPagLによるインビトロでのＬＰＳ修飾
膜局在PagL又はインビトロでリフォールディングされたPagLが外部から付加されたＬＰＳをインビトロで修飾できるかどうかをテストするため、本発明者らは、リフォールディングされたPagL(Pa)(-)、又は空のベクターpET-11a若しくはpPagLプラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）から単離した細胞外皮に対し、髄膜炎菌の精製ＬＰＳとともにインキュベーションを行った。ＬＰＳの修飾をトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで査定した（図１３）。リピドＡの３位におけるＲ−ヒドロキシミリスチン酸の予測された加水分解にしたがって、膜局在PagL（図１３Ａ）又はリフォールディングされたPagL(Pa)(-)（図１３Ｂ）の存在時は、ＬＰＳがより電気泳動移動度の高い形態へと変換された。ＬＰＳの脱アシル化が５ｍＭのＥＤＴＡの存在下でも依然として観察されたことから、リフォールディングされたPagL(Pa)(-)を用いた反応は、二価陽イオンの存在に依存していなかったことになる（図１３Ｂ）。
【実施例１０】
【００６６】
百日咳菌におけるPagP及びPagL発現後のリピドＡの構造変化
PagP及びPagLを百日咳菌株Tohamaで発現させるため、宿主範囲が広範な低コピー数発現ベクターpMMB67EHから、気管支敗血症菌のPagL遺伝子（pagL(Bb)）及び百日咳菌のPagP遺伝子（pagP(Bb)）を発現させた。コントロールとして、大腸菌のPagP遺伝子（pagP(Ec)）を発現する株も構築した。野生型、PagP発現又はPagL発現百日咳菌株TohamaからＬＰＳを単離し、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。PagL(Bb)発現株から単離したＬＰＳは、ゲル上で全く影響を受けていないように見受けられたのに対し、PagP発現株由来のＬＰＳは、強く修飾されているように見受けられた。というのは、野生型百日咳菌ＬＰＳのものよりも電気泳動移動度が低いバンドが検出されたためである（図１４）。また、PagP(Bb)発現株との比較では、PagP(Ec)発現株のほうが修飾効率が高いように見受けられた（図１４）。考えられるＬＰＳ修飾をより詳しく評価するため、菌株のリピドＡ部分をＥＳＩ−ＭＳで陰イオンモードにて分析した。この分析により、野生型ＬＰＳにおいて、４つの主要なリピドＡ種の存在が明らかになった（図１５Ａ）。ｍ／ｚ１５５７のピークは、百日咳菌に一般に見られる特徴的なペンタアシル化ビスリン酸種を示す（Caroff et al., Microbes. Infect., 1994）のに対し、ｍ／ｚ１４７７のピークは、ペンタアシル化モノリン酸種に相当する。ｍ／ｚ１３０７及び１２５１における残りの２つのピークは、それぞれ、３位の一次３−ヒドロキシデカン酸残基又は（２位若しくは３’位のいずれかの）一次３−ヒドロキシテトラデカン酸残基が欠失している、ｍ／ｚ１４７７の分子イオンの脱アシル化リピドＡ種を示す。これらの結果は、野生型百日咳菌のリピドＡ種間における異質性の高さを示すものであり、これについては、このゲル分析ではっきりとは解明されなかった（図１４）。興味深いことに、個々のリピドＡ種の相対量を相当するピークの高さから計算することにより、野生型百日咳菌ＬＰＳでは、大量のリピドＡ種（〜５０％）が、テトラアシル化型からなることが明らかになった。また、リピドＡ種の大多数は、モノリン酸型である（〜８０％）。低アシル化（under-acylated）又は次リン酸化リピドＡ種の存在度の高さが、リピドＡ種を単離する場合に用いる加水分解手順の人為的影響であるという可能性を排除するため、本発明者らは、加水分解時間の長短（１〜４時間まで様々である）がリピドＡ種の相対存在度に影響を及ぼすかどうかをテストしたが、そうした事実はなかった（データは図示せず）。さらに、精製した野生型百日咳菌ＬＰＳの濃度がわかっている溶液について、その全リン酸含有量を測定した。ＥＳＩ−ＭＳで検出されたモノリン酸リピドＡ種の高い陽性率と矛盾することなく、ＬＰＳが完全にリン酸化されていた場合は、予測されたリン酸含有量の半分をわずかに超える程度の量が検出されるにとどまった（データは図示せず）。
【００６７】
PagL(Bb)発現の際（図１５Ｂ）、３つのリピドＡ種が、ｍ／ｚ１０８１、１３０７、及び１３８７にそれぞれ存在していた。ｍ／ｚ１３０７の大きなピークは、３位の３−ヒドロキシデカン酸残基が欠失しているモノリン酸脱アシル化型に相当し、一方、ｍ／ｚ１３８７のピークは、ｍ／ｚ１３０７の分子イオンのビスリン酸化型に相当する。ｍ／ｚ１０８１のピークは、３−ヒドロキシデカン酸残基と３−ヒドロキシテトラデカン酸残基の両方が欠失しているモノリン酸型に相当する。３位の３−ヒドロキシデカン酸残基が欠失しているリピドＡ種の相対含有量は、野生型百日咳菌ＬＰＳにおける約３７％から、PagL(Bb)発現株における９２％超へと増加した。このように、ＬＰＳの電気泳動移動度が影響を受けない場合でさえも（図１４、２レーン）、pagL(Bb)にコードされたリピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素は百日咳菌中で活性を有していた。
【００６８】
PagP(Ec)（図１５Ｃ）及びPagP(Bp)（図１５Ｄ）発現の際、数種の新規リピドＡ種が検出された（表III）。ｍ／ｚ１３２０、１４９０、１５４５、１６２５、１７１５、及び１７９６のピークは、ｍ／ｚ１０８１、１２５１、１３０７、１３８７、１４７７、及び１５５７に存在していた分子イオンの、予測されたPagP介在性パルミトイル化にそれぞれ相当する。トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析後に見られた（図１４）、大腸菌PagPと百日咳菌PagPとの間の修飾効率における相違は、質量分析でも明らかになった。大腸菌PagPを発現する株では全リピドＡ群の最大で４７％までがパルミトイル化されたのとは対照的に、PagP(Bp)を発現する株では、最大でわずか９％であった。興味深いことに、PagP(Bp)を発現する株では、PagP(Ec)を発現する株とは対照的に、３−ヒドロキシテトラデカン酸残基が欠失しているリピドＡ種のパルミトイル化は見られなかった。この矛盾に対して可能な説明としては、それら２つのPagP酵素の特異性が異なることが挙げられる。大腸菌PagPはリピドＡの２位でアシル鎖を付加するのに対し、百日咳菌PagPは、３’位でパルミチン酸を付加する（Bishop et al., EMBO J., 2000; Preston et al., Mol. Microbiol., 2003）。このように、百日咳菌PagP発現株において、１個の３−ヒドロキシテトラデカン酸残基が欠失しているパルミトイル化リピドＡ種が全く存在しないことは、３−ヒドロキシテトラデカン酸残基が欠失しているリピドＡ分子は、それを３’位で特異的に欠失していることを示唆している。前記の示唆により、２つのPagP酵素間で観察された修飾効率の相違について、部分的に説明が可能となった。というのは、大腸菌PagPの基質プールは、百日咳菌PagPのものよりも大きいと考えられるためである。また、この仮説は、インビボで低アシル化（hypo-acylated）リピドＡ種が存在することと合致する。
【００６９】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】リピドＡの構造。Ａ：大腸菌リピドＡは、４個のＲ−３−ヒドロキシミリストイル部分で置換されたビスリン酸化グルコサミン二糖からなり、その２’及び３’脂肪アシル鎖は、それぞれラウリン酸塩及びミリスチン酸塩でエステル化されている。Ｂ：サルモネラリピドＡの制御された修飾。L-Ara4N又はpEtNによるリン酸塩部分の置換は、それぞれArnT及びPmrCにより媒介されている。LpxOによる２−ヒドロキシミリスチン酸塩で修飾したリピドＡの形成、PagPによる２位の二次パルミトイル鎖の付加、及びPagLによる３位の３−ヒドロキシミリストイル部分の除去。
【図２】PagLタンパク質の多重配列アラインメント。ClustalW（http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html）を用いて配列のアラインメントを行った。ハイフンは、最適アラインメントのために導入されたギャップを示す。完全に保存されている残基に、アスタリスクで印をつけてある。コロン及び点で示しているのは、それぞれ、保存度の高い残基及び保存度の低い残基である。百日咳菌のPagLＯＲＦは、フレームシフトにより破壊されており、コドン３３に２つのヌクレオチドを加えることによって、このアラインメント用に修復されたものである。PagL相同体のGenBankタンパク質アクセッション番号は、次の通りである：ネズミチフス菌ＡＡＬ２１１４７、気管支敗血症菌ＮＰ＿８９０３０６、パラ百日咳菌ＮＰ＿８８５４８７、百日咳菌ＢＸ４７０２４８§、緑膿菌ＮＰ＿２５３３５０、Ｐ．フルオレッセンスＮＺ＿ＡＡＡＴ０３０００００６§、Ｐ．プチダＮＣ＿００２９４７§、Ｐ．シリンゲＺＰ＿００１２５４６５、Ｂ．ファンゴラムＮＺ＿ＡＡＡＪ０３０００００３§、鼻疽菌ＮＣ＿００２９７０§、類鼻疽菌ＮＣ＿００２９３０§、Ｒ．メタリデュランスＺＰ＿００２７４７４４、青枯病菌ＮＰ＿５２２７６２、及びＡ．ビネランジーＺＰ＿０００８９５３４。§という記号は、PagL相同体の同定を手作業で行った全（未解読）ゲノムのGenBankアクセッション番号を示すものである。
【図３】大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）におけるPagLの発現及び膜局在。空のpET-11aプラスミド又はpPagLプラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）由来の膜を単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。クーマシーブリリアントブルーでタンパク質を染色した。アスタリスクは、マイクロシークエンシングを行って、成熟PagLタンパク質に相当することが判明したバンドを示す。２個のアスタリスクで示したバンドは、PagL(Bb)前駆タンパク質に相当する。左側にあるのは、分子量標準タンパク質である。
【図４】インビボでのＬＰＳ修飾の、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析。pET-11aコンストラクト又はpPagLコンストラクトを含む、対数増殖期の大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）細胞を、表示された時間、ＩＰＴＧで誘導した後、ＯＤ６００が１ユニットの培養試料を回収し、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【図５】野生型大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）ＬＰＳ及びPagL修飾大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）ＬＰＳの、ＧＣ／ＭＳによる分析。精製した大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）の野生型ＬＰＳ（ＷＴ）、PagL(St)修飾ＬＰＳ（Ｌ（Ｓｔ））、PagL(Bb)修飾ＬＰＳ（Ｌ（Ｂｂ））、及びPagL(Pa)修飾ＬＰＳ（Ｌ（Ｐａ））の、ＧＣ／ＭＳによる分析（ｔ＝誘導後の時間）。野生型ＬＰＳを１００として、それに対して基準化したＣ１４／Ｃ１４−３ＯＨ比を示している（バーの上に数値を示す）。
【図６】野生型大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）ＬＰＳ及びPagL修飾大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）ＬＰＳの、ＥＳＩ−ＭＳによる構造分析。空のpET-11aを含む野生型大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）由来のリピドＡ種（Ａ）、並びにPagL(St)で修飾したリピドＡ種（Ｂ）、PagL(Pa)で修飾したリピドＡ種（Ｃ）、及びPagL(Bb)で修飾したリピドＡ種（Ｄ）を、ＥＳＩ−ＭＳで分析した。ｍ／ｚ１７９７、１９２８、１６２２、及び１４９０における大きなピークは、それぞれ、大腸菌に一般に見られる特徴的なヘキサアシル化ビスリン酸種、L-Ara4N部分で置換されたヘキサアシル化ビスリン酸種、L-Ara4N部分で置換された３−Ｏ−脱アシル化モノリン酸種、及び３−Ｏ−脱アシル化モノリン酸種と解釈される。ｍ／ｚ１７１６及び１８４７における大きなピークは、おそらく、ｍ／ｚ１７９７及び１９２８における種の断片イオンを示すものであろう。
【図７】脱アシル化ＬＰＳのインビボでの再修飾及び内在性PagPの役割。Ａ：空のpET-11aベクター又はPagL(Bb)プラスミドを含む、対数増殖期の大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）細胞を、表示された時間、ＩＰＴＧで誘導した。ＯＤ６００が１ユニットに相当する試料を回収し、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。Ｂ及びＣ：PagL発現の誘導後、表示された時間で単離した、精製した大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）の野生型ＬＰＳ（ＷＴ）及びPagL(Bb)修飾ＬＰＳ（Ｌ（Ｂｂ））の脂肪酸含有量を、ＧＣ／ＭＳで分析した。野生型ＬＰＳを１００として、それに対して基準化したＣ１４／Ｃ１４−３ＯＨ比（Ｂ）及びＣ１６／Ｃ１４比（Ｃ）を示している（バーの上に数値を示す）。Ｄ：対数増殖期の野生型大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）、又は大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）及びpPagL(Pa)を含むそのpagP変異誘導体ＪＧ１０１を、表示された時間、ＩＰＴＧで誘導し、その後、ＯＤ６００が１ユニットの培養試料を回収し、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。
【図８】緑膿菌由来PagLの位相モデル。（Tommassen, J. (1988) in Membrane Biogenesis (Op den Kamp, J.A.F., ed) NATO ASI series, Vol. H16, pp. 351-373. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York）に記載の外膜タンパク質構造の一般原則を用いて、PagL(Pa)の位相モデルを構築した。かかるモデル案は、外部環境まで延びている４つのループ（Ｌ１−４）を備えた８本鎖のβ−バレルからなる。仮想β鎖中の残基を菱形で囲んで示し、脂質二重層に露出している残基については、菱形に影をつけている。Ｈｉｓ１４９及びＳｅｒ１５１（赤で印をつけている；PagL(Pa)前駆体中の位置）は、完全に保存されており（図２）、セリン加水分解酵素の「古典的」触媒３残基の一部であることが示唆されている。触媒３残基の酸性残基の潜在的候補を、黄色で示す。数字は、前駆体配列中の残基の位置を指す。
【図９】アミノ酸置換によるPagL(Pa)活性部位残基の同定。空のpET-11aベクター、pPagL(Pa)プラスミド又は変異pPagL(Pa)プラスミドを含む、対数増殖期の大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）細胞を、ＩＰＴＧで７５分間誘導した後、ＯＤ６００が１ユニットの培養試料を回収してトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、引きつづいて、PagL(Pa)に対する一次抗体を用いたイムノブロッテイング（Ａ）及びＬＰＳを視覚化するためのトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂ）を行った。
【図１０】百日咳菌ＬＰＳのインビボでの修飾。Ａ：野生型百日咳菌株Tahoma由来のＬＰＳ又はpMMB67EH-PagL(Bb)プラスミドを有する百日咳菌株Tahoma由来のＬＰＳを単離して、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。Ｂ：精製した百日咳菌株Tahomaの野生型ＬＰＳ（ＷＴ）及びPagL(Bb)修飾ＬＰＳ（PagL）の脂肪酸含有量を、ＧＣ／ＭＳで分析した。野生型ＬＰＳを１００として、それに対して基準化したＣ１４−３ＯＨ／Ｃ１０−３ＯＨ比を示している（バーの上に数値を示す）。
【図１１】単離したＬＰＳの生物学的活性。精製したＬＰＳによるＭＭ６細胞内でのＩＬ−６（Ａ）の誘導。横軸はｍｇ／ｍｌを単位とするＬＰＳ濃度を示し、縦軸は４５０ｎｍでのＥＬＩＳＡの表示値を示す。
【図１２】セミネイティブＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した、精製されリフォールディングされたPagL(Pa)(-)の加熱修飾可能性。精製されリフォールディングされたPagL(Pa)(-)の加熱修飾可能性を示す、クーマシーブリリアントブルーで染色したセミネイティブＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。電気泳動に先立って、０．１％のＳＤＳを含む試料緩衝液中で室温（ＲＴ）にて、又は、２％のＳＤＳを含む試料緩衝液中で１００℃（１５分間）にて、試料を処理した。左側にあるのは、分子量標準タンパク質である。
【図１３】膜結合性PagL又はインビトロでリフォールディングされたPagLによる、インビトロでのＬＰＳ修飾。インビトロでのPagL活性を示す銀染色トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ａ：精製した髄膜炎菌Ｌ３−ＬＰＳを、空のpET-11aプラスミド又はpPagLプラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１StarTM（ＤＥ３）より調製した細胞外皮を用いて又は用いずに、洗浄剤含有緩衝液中で１８時間、３７℃でインキュベーションした。Ｂ：精製した髄膜炎菌Ｌ３−ＬＰＳを、５ｍＭのＥＤＴＡの存在下又は不在下で、そのシグナル配列をもたない、インビトロでリフォールディングされた４μｇのPagL(Pa)（PagL(Pa)(-)）を用いて又は用いずに、洗浄剤含有緩衝液中で１８時間、３７℃でインキュベーションした。同等量のアッセイ用混合物を、すべてのレーンにロードした。
【図１４】トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、インビトロでのＬＰＳ修飾の分析。熱フェノール／水抽出により、野生型百日咳菌株Tahoma及びPagP/PagL発現百日咳菌株TahomaからＬＰＳを単離して、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【図１５】野生型百日咳菌ＬＰＳ及びPagL/PagP修飾百日咳菌ＬＰＳの、ＥＳＩ−ＭＳによる構造分析。野生型百日咳菌株Tahoma由来のリピドＡ種（Ａ）、並びにPagL(Bb)で修飾したリピドＡ種（Ｂ）、PagP(Ec)で修飾したリピドＡ種（Ｃ）、及びPagP(Bp)で修飾したリピドＡ種（Ｄ）を、ＥＳＩ−ＭＳで分析した。ｍ／ｚ１５５７、１４７７、１３８７、１３０７、１２５１、及び１０８１における大きなピークは、それぞれ、百日咳菌に一般に見られる特徴的なペンタアシル化ビスリン酸種、相当するペンタアシル化モノリン酸種、３位の一次３−ヒドロキシデカン酸残基が欠失しているｍ／ｚ１５５７の分子イオンの脱アシル化リピドＡ種、３位の一次３−ヒドロキシデカン酸残基が欠失しているｍ／ｚ１４７７の分子イオンの脱アシル化リピドＡ種、一次３−ヒドロキシテトラデカン酸残基が欠失しているｍ／ｚ１４７７の分子イオンの脱アシル化リピドＡ種、及び３位の一次３−ヒドロキシデカン酸残基と一次３−ヒドロキシテトラデカン酸残基の両方が欠失しているｍ／ｚ１４７７の分子イオンの脱アシル化リピドＡ種と解釈される。ｍ／ｚ１３２０、１４９０、１５４５、１６２５、１７１５及び１７９６におけるピークは、それぞれ、ｍ／ｚ１０８１、１２５１、１３０７、１３８７、１４７７及び１５５７に存在する分子イオンのPagPを介したパルミトイル化に相当する。
【００７１】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に対して少なくとも２５％のアミノ酸同一性を示し、リピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性を示すポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１記載のアミノ酸配列を示すポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に定義したアミノ酸配列を備えたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。
【請求項４】
請求項３記載のＤＮＡ配列を含むＤＮＡベクター。
【請求項５】
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、転写調節配列に作用可能な状態で結合している、請求項４記載のＤＮＡベクター。
【請求項６】
請求項１又は２記載のポリペプチドに結合可能な抗体。
【請求項７】
請求項４又は５記載のＤＮＡベクターを含むグラム陰性菌。
【請求項８】
請求項１又は２記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む百日咳菌。
【請求項９】
その外膜に、部分的又は完全に３−Ｏ−脱アシル化されたリポ多糖（ＬＰＳ）種を含む、請求項８記載の百日咳菌。
【請求項１０】
その外膜に、パルミトイル化ＬＰＳを含む、請求項９記載の百日咳菌。
【請求項１１】
部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたＬＰＳを製造する方法であって、３−Ｏ−脱アシル化ＬＰＳの合成、及び、任意で、３−Ｏ−脱アシル化ＬＰＳの回収を促進する条件下で、請求項７〜１０に定義した細菌を培養するステップを含む方法。
【請求項１２】
少なくとも部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたＬＰＳを含むボルデテラ菌種から入手可能なＬＰＳを含む組成物。
【請求項１３】
ボルデテラ感染症、好ましくは百日咳菌感染症の治療薬又は予防薬を製造するための、請求項７〜１０記載の細菌の使用。
【請求項１４】
ボルデテラ感染症の治療薬又は予防薬を製造するための、少なくとも部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたＬＰＳを含む単離されたボルデテラＬＰＳの使用。
【請求項１５】
請求項７〜１０のいずれか記載の細菌を含む全細胞ワクチン。
【請求項１６】
請求項１２記載の組成物を含む無細胞ワクチン。
【請求項１７】
グラム陰性ＬＰＳ又はグラム陰性ＬＰＳを含む組成物を脱アシル化するためのインビトロ法であって、グラム陰性ＬＰＳの、酵素による脱アシル化を促進する条件下で、前記ＬＰＳ又は前記組成物を請求項１記載のポリペプチドと接触させるステップを含む方法。
【請求項１８】
ボルデテラに対する免疫応答を引き起こす方法であって、ボルデテラ菌種由来の３−Ｏ−脱アシル化リピドＡ、３−Ｏ−脱アシル化ＬＰＳ、又はパルミトイル化ＬＰＳのソースを、対象に投与することを含む方法。
【請求項１】
配列番号１に対して少なくとも２５％のアミノ酸同一性を示し、リピドＡ３−Ｏ−脱アシル化酵素活性を示すポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１記載のアミノ酸配列を示すポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に定義したアミノ酸配列を備えたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。
【請求項４】
請求項３記載のＤＮＡ配列を含むＤＮＡベクター。
【請求項５】
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、転写調節配列に作用可能な状態で結合している、請求項４記載のＤＮＡベクター。
【請求項６】
請求項１又は２記載のポリペプチドに結合可能な抗体。
【請求項７】
請求項４又は５記載のＤＮＡベクターを含むグラム陰性菌。
【請求項８】
請求項１又は２記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む百日咳菌。
【請求項９】
その外膜に、部分的又は完全に３−Ｏ−脱アシル化されたリポ多糖（ＬＰＳ）種を含む、請求項８記載の百日咳菌。
【請求項１０】
その外膜に、パルミトイル化ＬＰＳを含む、請求項９記載の百日咳菌。
【請求項１１】
部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたＬＰＳを製造する方法であって、３−Ｏ−脱アシル化ＬＰＳの合成、及び、任意で、３−Ｏ−脱アシル化ＬＰＳの回収を促進する条件下で、請求項７〜１０に定義した細菌を培養するステップを含む方法。
【請求項１２】
少なくとも部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたＬＰＳを含むボルデテラ菌種から入手可能なＬＰＳを含む組成物。
【請求項１３】
ボルデテラ感染症、好ましくは百日咳菌感染症の治療薬又は予防薬を製造するための、請求項７〜１０記載の細菌の使用。
【請求項１４】
ボルデテラ感染症の治療薬又は予防薬を製造するための、少なくとも部分的に３−Ｏ−脱アシル化されたＬＰＳを含む単離されたボルデテラＬＰＳの使用。
【請求項１５】
請求項７〜１０のいずれか記載の細菌を含む全細胞ワクチン。
【請求項１６】
請求項１２記載の組成物を含む無細胞ワクチン。
【請求項１７】
グラム陰性ＬＰＳ又はグラム陰性ＬＰＳを含む組成物を脱アシル化するためのインビトロ法であって、グラム陰性ＬＰＳの、酵素による脱アシル化を促進する条件下で、前記ＬＰＳ又は前記組成物を請求項１記載のポリペプチドと接触させるステップを含む方法。
【請求項１８】
ボルデテラに対する免疫応答を引き起こす方法であって、ボルデテラ菌種由来の３−Ｏ−脱アシル化リピドＡ、３−Ｏ−脱アシル化ＬＰＳ、又はパルミトイル化ＬＰＳのソースを、対象に投与することを含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２００８−５２３８０５（Ｐ２００８−５２３８０５Ａ）
【公表日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４６５８９（Ｐ２００７−５４６５８９）
【出願日】平成１７年１２月１６日（２００５．１２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００５／０５００８１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６５１３９
【国際公開日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【出願人】（５０７２０３０２１）エヌヴィアイ ネーデルランズ バクシンインスティテュート (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月１６日（２００５．１２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００５／０５００８１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６５１３９
【国際公開日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【出願人】（５０７２０３０２１）エヌヴィアイ ネーデルランズ バクシンインスティテュート (1)
【Ｆターム（参考）】
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