グリオキシル酸製造用酵素及びそれを用いたグリオキシル酸の製造方法
【課題】 グリオキサールをグリオキシル酸への変換し、生成物であるグリオキシル酸には作用しない酵素を提供すること。
【解決手段】 シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌が生産するグリオキサールをグリオキシル酸へ変換し、グリオキシル酸には作用しないグリオキシル製造用酵素を提供する。また、本発明は、該グリオキシル酸製造用酵素をグリオキサールに接触させ、グリオキシル酸へと変換することによるグリオキシル酸の製造方法である。
【解決手段】 シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌が生産するグリオキサールをグリオキシル酸へ変換し、グリオキシル酸には作用しないグリオキシル製造用酵素を提供する。また、本発明は、該グリオキシル酸製造用酵素をグリオキサールに接触させ、グリオキシル酸へと変換することによるグリオキシル酸の製造方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌が産生するグリオキサールに作用する新規な酸化酵素および当該酵素を用いて医薬品の原料として有用なグリオキシル酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在グリオキシル酸は化学的な方法で製造されているが、その製造方法は煩雑で、多量の副産物が生成されるため、グリオキシル酸の収率が低い欠点を有する。この化学的な製造方法の欠点を解決するために、グリコール酸を原料としてグリコール酸酸化酵素や微生物を用いる方法が開発された。例えば特許文献１、非特許文献１〜５などが挙げられる。しかし、これらの方法はいずれも高価なグリコール酸を原料として使用しなければならない問題点を有し、またこれら方法では、グリオキシル酸にも作用する植物由来の酵素が用いられているなどの問題点を有する。最近、安価なグリオキサールを原料にしてグリオキシル酸を製造する方法が報告されたが、当該方法は、グリオキサールを化学的な方法でグリコール酸に変換し、生成されたグリコール酸に上記と同様の植物由来のグリコール酸酸化酵素を作用させる方法であり、この方法も化学的方法と酵素を組み合わせた煩雑である欠点を有する （非特許文献６）。一方、グリオキサールに対し活性を有する酸化酵素として、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ由来のグリオキサールオキシダーゼ（非特許文献７−９）が報告されている。 しかし、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ由来のグリオキサールオキシダーゼは、グリオキサールだけでなく、グリオキシル酸にも作用する酵素であり、本発明の目的であるグリオキシル酸の製造に使用することは困難である。また、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌からアルデヒド基をカルボン酸へと変換するアルデヒドオキシダーゼが報告されている（特許文献２、非特許文献１０−１１）。しかし、当該酵素のグリオキサールに対する作用については全く検討されておらず、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌がグリオキサールに作用しグリオキシル酸に全く作用しない酸化酵素を産生することは、本発明を持って初めて明らかにされた。さらに、本発明の酵素は、分子量や蛋白質の構造において、既報のアルデヒドオキシダーゼとは明らかに異なり、本発明の微生物が従来報告されていない全く新しいアルデヒド酸化酵素を産生し、当該酸化酵素がグリオキシル酸の製造に有効であることは、本発明を持って初めて明らかにされた。
【特許文献１】特開平5-501800
【特許文献２】特開昭58-179489
【非特許文献１】J. Org. Chem., 58, 2253-2259 (1993)
【非特許文献２】Bioorg. Medicin. Chem., 2, 371-378 (1994)
【非特許文献３】J. Org. Chem., 60, 3957-3963 (1995)
【非特許文献４】Gene, 194, 179-182 (1997)
【非特許文献５】J. Biotechnol., 75, 265-271 (1999)
【非特許文献６】Process Biochem., 36, 73-78 (2000)
【非特許文献７】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2936-2940 (1990)
【非特許文献８】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 7411-7413 (1993)
【非特許文献９】Enzyme Microbiol. Technol., 17, 751-756 (1995)
【非特許文献１０】J. Biosci. Bioeng., 94, 124-129 (2002)
【非特許文献１１】FEMS Microbiol Ltters, 229, 31-36 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、グリオキサールに作用しグリオキシル酸に作用しない新規な酸化酵素を産生する微生物および／または当該活性を有する酵素、および当該酸化酵素を製造する方法、更に当該酵素を用いて安価なグリオキサールを原料にしてグリオキシル酸を効率的に製造する方法を提供することにある。また、グリオキサールに作用しグリオキシル酸に作用しない新規な酸化酵素を産生する微生物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、上述の問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、グリオキサールに作用しグリオキシル酸に作用しない新規な酸化酵素をＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌に見出した。そして、当該微生物から本酸化酵素を単離、精製し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、以下の（１）〜（４）の性質を有する新規なアルデヒドオキシダーゼを提供するものである。
（１）作用：グリオキサールに存在する２個のアルデヒド基のうち、一方のアルデヒド基を酸化して、グリオキサールをグリオキシル酸に変換する
（２）基質特異性：グリオキサール、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、１−ペンタナール、２−ペンタナールに対して強い活性を示し、グリオキシル酸には実質的に活性を示さず、また、メチルグリオキサールには作用せず、メタノール、エタノール、1-プロパノール、1-ブタノールなどの一級アルコールや2-プロパノール、2-ブタノールなどの二級アルコール、あるいはエチレングリコール、1,2-プロパンジオール、1,3-プロパンジオールなどの二価アルコールおよびグリコール酸、乳酸などにも活性を示さない。
（３）作用最適pH：５．５−６．５
（４）作用最適温度：３５−５０℃
また、本発明は、更に以下（５）〜（７）
（５）分子量：ゲル濾過分析で約９５，０００の分子量を示し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動分析で約２８，０００の分子量を示す。
（６）pH安定性：３０℃、２時間加温した場合、ｐＨ６．０からｐＨ８．５の範囲で８０％以上の活性が残存する。
（７）阻害剤：フェニルヒドラジン、ヒドラジン、シアン化カリウムにより阻害される。
【０００５】
また、本発明は、グリオキサールをグリオキシル酸に酸化するが、反応生成物であるグリオキシル酸には作用しない酸化酵素を産生する微生物を提供する。さらに、本発明は、当該微生物を培養して、グリオキサールをグリオキシル酸に酸化し、反応生成物であるグリオキシル酸に作用しない酸化酵素の製造法も提供する。
【０００６】
更に本発明は、グリオキサールをグリオキシル酸に酸化するが反応生成物であるグリオキシル酸に作用しない上記の酸化酵素をグリオキサールに作用させ、グリオキサールに存在する２つのアルデヒド基のうち、一方のアルデヒド基を酸化して、グリオキシル酸に変換することを特徴とするグリオキシル酸の製造方法も提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物より得られた新規なアルデヒドオキシダーゼは、グリオキサールをグリオキシル酸に酸化するが、反応生成物であるグリオキシル酸には全く作用しない特異性の高い酸化酵素であり、本発明の酸化酵素を使用すれば、安価なグリオキサールからグリオキシル酸を効率的に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、従来報告されていないグリオキサールに作用してグリオキシル酸に作用しない新規な酸化酵素を産生する微生物を自然界から見出し、当該酵素の諸性質を明らかにし、グリオキシル酸の製造に有効であることを明らかにすることにより完成された。このような微生物は、土壌サンプルをエチレングリコール、グリコールアルデヒド、グリオキサール、２−メトキシエタノールなどを炭素源とした培地に添加し、培養を行った後、生育してきた微生物について、グリオキサールに対する酸化活性を調べる事により得ることが出来る。本発明の酵素の起源となる微生物は特に限定しないが、細菌などが好適であり、好ましくはシュードノナス属に属する微生物が挙げられ、特に好ましくは岩手大学農学部校内の土壌から分離されたシュードモナス・スピーシーズ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＡＩＵ ３６２が挙げられる。当該ＡＩＵ ３６２株は独立法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）にＦＥＲＭ Ｐ−２０３６３ として寄託されている。 ＡＩＵ ３６２株の菌学的諸性質を表１に示す。また、ＡＩＵ ３６２株の同定には、該菌株の１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子（１６ＳｒＤＮＡ）のうち５‘末端側約１５００ｂｐの領域をＰＣＲで増幅して、塩基配列を決定し、ＭｉｃｒｏＳｅｑ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｆｕｌｌ Ｇｅｎｅ Ｌｉｂｒａｒｙ ｖ．０００１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ＣＡ、ＵＳＡ）データベース及び国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）に対し相同性検索を行い、分子系統樹を作製する方法で行った。
【０００９】
本発明の酸化酵素は、該酵素を産生する微生物より、下記のようにして取得することができる。例えば、本活性を有する微生物を好適な条件で培養し、培養終了後に培養液から遠心分離などにより菌体を集め、超音波破砕、ガラスビーズを用いた破砕などの方法により、菌体を破砕し、粗酵素液を得る。さらにこの粗酵素液から塩析、各種クロマトグラフィーなどの方法により精製し、本発明の酵素を得ることができる。
【００１０】
至適反応ｐＨまたは至適温度は、反応条件のｐＨまたは温度を変えて活性を測定することにより決定される。
【００１１】
分子量は例えばＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ（７．８ｍｍ × ３０ｃｍ）（東ソー株式会社製）カラムを用いたゲル濾過分析により、標準タンパク質との相対溶出時間から算出することができ、サブユニット分子量はＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により、標準タンパク質との相対移動度から算出することができる。
【００１２】
また、Ｎ末端アミノ酸配列は、上記方法により精製した酵素、またはさらに逆相ＨＰＬＣにより精製したものをプロテインシークエンサーにて決定することができる。
【００１３】
本発明において、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する酸化酵素を産生する微生物を培養するための培地は、その微生物が増殖し得るものであれば特に限定されない。例えば、炭素源として、グルコース、シュークロースなどの糖類、エタノール、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、２−メトキシエタノールなどのアルコール類、グリオキサールなどのアルコール類、オレイン酸、ステアリン酸などの脂肪酸ならびにそのエステル類、菜種油および大豆油などの油類；窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、ペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、肉エキスおよびコーンスチープリカーなど；無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カリウム、リン酸水素ナトリウムなど；その他に麦芽エキス、肉エキスなどを有する通常の液体培地が使用され得る。
【００１４】
本発明によるグリオキシル酸の製造方法は、本発明の酸化酵素をグリオキサールに作用させ、グリオキシル酸へと変換蓄積せしめることを特徴とする。本発明で使用する酸化酵素としては、単一または部分的に精製された酵素であってもよいし、これら酵素を産生する微生物の培養液またはその処理物を使用することも可能である。ここで、「微生物の培養物」とは、菌体を含む培養液あるいは培養菌体を意味し、「その処理物」とは、例えば粗酵素液、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、あるいはそれらの破砕物、これらの混合物などを意味する。更にそれらは、酵素自体または菌体のまま公知の手段（例えば、架橋法、物理的吸着法、包括法など）で固定化されて使用できる。
【００１５】
反応条件は使用する酵素により異なるが、温度は５℃〜８０℃、好ましくは５〜６０℃の範囲、ｐＨは４〜１２、好ましくはｐＨ５〜９の範囲である。反応は、酸素条件下で行うことが好ましい。また酸素の反応液への溶解を促進するため、反応は振とう、攪拌条件下で行なわれることが好ましい。さらに大気圧以上の加圧下で反応を行うことにより、反応液への酸素の溶解度が向上し、反応がより進む場合もある。
【００１６】
【表１】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例になんら限定されるものではない。
【実施例】
【００１７】
（実施例１：グリオキサールに作用してグリオキシル酸に作用しない酸化酵素を産生する能力を持つ微生物の分離）
スクリーニングのための培地は、１２０℃で１５分間加圧殺菌した表２に示す８０ｍｌの基礎培地に、５％ ２−メトキシエタノール溶液２０ｍｌをメンブランフィルターで除菌して添加して調製した（培地中の2-メトキシエタノール濃度は１％）。この１％ ２−メトキシエタノール含有培地５ｍｌを分注した試験管に少量の土壌を添加し、３０℃で３〜７日間振盪培養した。微生物の生育が確認された培養液について、その培養液５０ｍｌを上記と同一組成の培地に植菌し、同様に３０℃で３〜７日間振盪培養した。この操作をもう一度繰り返した後、培養液を上記液体培地と同一組成に２％寒天を加えて調製した寒天平板培地にプレートアウトし、30℃で培養した。そして微生物の生育が確認された後、この寒天平板培地にグリオキサールと過酸化水素の生成を確認するための発色液を摘下して、３０℃で反応させた。この方法で、過酸化水素の生成が認められた微生物を、この平板培地と同一組成の斜面培地に植菌し、30℃で培養して保存した。次に、斜面培地に分離した微生物を再度１％ ２−メトキシエタノール含有液体培地で振盪培養した。そして培養液から遠心分離で集菌し、集めた菌体を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、１０ｍＭのグリオキサールおよびグリオキシル酸と反応させた。この菌体懸濁液を用いた反応で、グリオキサールから過酸化水素の生成が確認されるが、グリオキシル酸から過酸化水素の生成がほとんど確認されない微生物を選抜した。続いて、選抜した微生物を、１％ ２−メトキシエタノールを含む上記組成の液体培地１５０ｍｌを入れた坂口フラスコを用いて30℃で振盪培養した。この培養で得られた９００ｍｌ分の菌体を遠心分離で集め、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁してガラスビーズを用いて菌体を破砕した。そして、菌体破砕残渣を遠心分離で除去し、得られた上清液をＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラクムクロマトグラフィーに供した。即ち、菌体破砕残渣を除去して集めた上清液を１０ｍＭリン酸緩衝液と同程度の塩濃度まで脱塩した後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した２０ｍｌのＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムに通液し、このカラムを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。吸着した酵素は、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）と０．５ＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた直線濃度勾配法で溶出し、全ての画分についてグリオキサールおよびグリオキシル酸に対するオキシダーゼ活性を調べた。そして、グリオキサールに良く作用してグリオキシル酸に対するオキシダーゼ活性を示さない酵素を産生する微生物を選抜した。このような方法で得られた菌株は、上記の菌学的性質を示す微生物であり、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＡＩＵ ３６２と命名した。
尚、寒天平板培地上でのグリオキサールに対するオキシダーゼ活性は表３に示す発色液を用い、溶液でのグリオキサールに対するオキシダーゼ活性は表４に示す発色液を用いた。
【００１８】
【表２】
【００１９】
【表３】
【００２０】
【表４】
【００２１】
【表５】
（実施例２）
（実施例２：グリオキサールに作用してグリオキシル酸に作用しない酸化酵素の製造）
実施例１で分離した微生物を、１％ ２−メトキシエタノールを含む実施例１と同一組成の液体培地を用いて、試験管で３０℃，２日間振盪培養して種培養液を調製した。次に、この種培養液１．５ｍｌを、種培養と同一組成の液体培地１５０ｍｌを入れた５００ｍｌ容フラスコに植菌し、３０℃で振盪培養して、培養時間と酵素生産量との関係を調べた。その結果、グリオキサールに作用する酸化酵素の生産量は培養時間とともに増大し、当該酸化酵素の活性は培養６日付近でも高い値を維持した。
【００２２】
（実施例３：グリオキサールに作用してグリオキシル酸に作用しない酸化酵素の精製）
実施例２の結果を基に、１％ ２−メトキシエタノールを含む実施例１と同一組成の液体培地を用いて試験管で３０℃，２日間振盪培養して一次種培養液を調製した。この一次種培養液１．５ｍｌを同一組成の液体培地を１５０ｍｌ分注した５００ｍｌ容フラスコに植菌し、３０℃で２日間振盪培養して二次種培養液を調製した。続いて、この二次種培養液２０ｍｌを一次種培養と同一組成の液体培地２ Lを入れた３ L容フラスコに植菌し、３０℃で５日間振盪培養した。このようにして培養した２０Ｌの培養液から菌体を集めて、以下の方法で酵素を精製した。尚、酵素の精製にはリン酸緩衝液 ｐＨ７．０を用いた。
【００２３】
１）粗酵素液の調製
２０Ｌ培養液から集菌した菌体（湿重量：２５．５ｇ）を１０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁し、１０℃以下の温度で０．５ｍｍガラスビーズを用いて１２分間（２分ｘ６回）細胞破砕した。この細胞破砕液を遠心分離して菌体残渣を除去し、上清画分を粗酵素液として酵素の精製に用いた。
【００２４】
２）硫安塩析
上述の方法で遠心分離して集めた上清液（１，０００ｍｌ）に３５％飽和になるように硫安２０９ｇを添加した後、１時間攪拌放置し、生成した沈殿物を遠心分離で集めた。続いて、この上清画分に４５％飽和まで硫安を添加し、生成した沈殿物を遠心分離で集めた後、さらに６５％飽和まで硫安を添加し、生成した沈殿物を遠心分離で集めた。各硫安濃度で生成した沈殿物を溶解して酵素活性を調べた結果、３５−４５％飽和と４５−６５％飽和の沈殿画分に目的の酵素活性が認められたので、両画分に硫安を添加して塩濃度を１３０ｍｓ／ｃｍに調整した。
【００２５】
３）Ｐｈｅｎｙｌ−Ｔｏｐｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィー
硫安塩析で得られた３００ｍｌの粗酵素液に１．０Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化した１５０ｍｌ分のＰｈｅｎｙｌ−Ｔｏｐｏｐｅａｒｌを添加して、４℃で一夜攪拌した後、目的の酵素が吸着しているＰｈｅｎｙｌ−Ｔｏｐｏｐｅａｒｌ樹脂を濾過で集めた。このＰｈｅｎｙｌ−Ｔｏｐｏｐｅａｒｌ樹脂を１．０Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（１Ｌ）に懸濁して攪拌して濾過する方法で洗浄した。この操作を２回繰り返した後、洗浄した樹脂を同一の緩衝液に懸濁してカラムに充填し、このカラムをさらに０．７Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液２Ｌで洗浄した。次に目的とする酵素を０．２６Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液で溶出した。
【００２６】
４）ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィー
Ｐｈｅｎｙｌ−Ｔｏｐｏｐｅａｒｌカラムから溶出された酵素活性画分を限外濾過膜で２ｍｓ／ｃｍまで脱塩濃縮した後、１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム（２．５ × １２ｃｍ）に吸着させた。本カラムを４０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液１Ｌで洗浄した後、酵素を４０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（３００ｍｌ）と０．２５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（３００ｍｌ）を用いて直線濃度勾配法で溶出した。
【００２７】
５）Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅカラムクロマトグラフィー
ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムからの溶出液を限外濾過膜で脱塩濃縮し、Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅカラム（１．５ × １０ｃｍ）に吸着させた。本カラムを１０ｍＭリン酸緩衝液１００ｍｌで洗浄した後、目的とする酵素を１０ｍＭリン酸緩衝液（１００ｍｌ）と１００ｍＭリン酸緩衝液（１００ｍｌ）を用いて直線濃度勾配法で溶出した。
【００２８】
６）ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィー
Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅカラムからの溶出液を２ｍｓ／ｃｍに希釈した後、１０ｍＭリン酸緩衝液, ｐＨ７．０で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム（１ × １８ｃｍ）に吸着させた。本カラムを４０ｍＭ NaClを含む１０ｍＭリン酸緩衝液５０ｍｌで洗浄した後、酵素を４０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭン酸緩衝液（７５ｍｌ）と０．２５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（７５ｍｌ）を用いて直線濃度勾配法で溶出した。
【００２９】
７）Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５５によるゲル濾過
Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅカラムからの溶出液を限外濾過膜で０．２ｍｌまで濃縮した後、５０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５５カラム（１ × ４５ｃｍ）でゲル濾過を行った。
【００３０】
以上の方法で得られた上記7) の酵素標品をＮａｔｉｖｅおよびＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法で分析した結果、電気泳動的に単一であった。尚、本精製法による酵素の精製収率は、表６の通りであった。
【００３１】
【表６】
（実施例４：グリオキサールに作用してグリオキシル酸に作用しない酸化酵素の性質）
実施例３の方法で精製した酵素標品は、ＮａｔｉｖｅおよびＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法を用いて分析した結果、いずれの分析でも蛋白的に単一であった。よって、本精製酵素標品を用いて諸性質を検討した。
【００３２】
1. 作用
酵素活性測定用発色液２の組成を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解して調製した発色液を用いて、酵素活性測定と同様に、精製酵素を２０ｍＭグリオキサールに作用させた結果、反応時間と共に５５５ｎｍの吸光度が増大し、グリオキサールと本酵素の反応によって、過酸化水素が生成されることが明らかになった。 また、反応生成物をIsobe and Nishiseの方法 [Biosci. Biotech. Biochem., 58, 170-173, (1994)] に従ってN-methylbenzothiazolone hydrazone (MBTH)と反応させ、その吸収スペクトルおよびＣ１８の逆相カラムからの溶出時間を分析した。その結果、反応１では、グリオキシル酸とMBTHを反応させた場合と同様に、３５０ｎｍ付近に極大吸収を持つ吸収スペクトルが得られ、反応２では６２０付近に極大吸収を持つ吸収スペクトルが得られた。そしてＣ１８の逆相カラムで分析した場合も、グリオキシル酸と同じ溶出位置に新たなピークが得られた。よって、本酵素は、下記の式に従ってグリオキサールをグリオキシル酸に酸化することが明らかになった。次に、２０ｍＭグリオキシル酸を用いてグリオキサールと同様に精製酵素を作用させ、過酸化水素の生成を調べた。その結果、５５５ｎｍの吸光度の増大は認められなかった。よって、本酵素は、グリオキサールをグリオキシル酸に酸化するが、反応生成物であるグリオキシル酸には作用しないことが明らかになった。
【００３３】
OHCCHO + O2 + H2O → OHCCOOH + H2O2
２. 基質特異性
酵素活性測定用発色液２の組成を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解して調製した発色液を用いて、酵素活性測定と同様に３０℃で、２０ｍＭのアルデヒド類、有機酸類、およびアルコール類に精製酵素を作用させた。その結果、表７に示すように、本酵素は、グリオキサールに作用し、グリオキシル酸には作用しなかった。そして、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、1-ペンタナール、2-ペンタナールなどのアルデヒド類に良く作用し、ホルムアルデヒドやグリコールアルデヒドにも作用した。しかし、メタノール、エタノール、1-プロパノール、1-ブタノールなどの一級アルコール、2-プロパノール、2-ブタノールなどの二級アルコール、エチレングリコール、1,2-プロパンジオール、1,3-プロパンジオールなどの二価アルコール類には作用せず、2-メトキシエタノール、メチルグリオキサール、グリコール酸、乳酸にも作用しなかった。
【００３４】
【表７】
３．グリオキサールに対するKm値
酵素活性測定用発色液２の組成を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解して調製した発色液を用いて、グリオキサールの濃度を０．５ｍＭから２０ｍＭの範囲で変えて、グリオキサールに対するKm値を測定した。その結果、グリオキサールに対するＫｍ値は約５ｍＭであった。
【００３５】
４．分子量
本酵素の分子量は、ゲル濾過法で約９５，０００、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法で約２８，０００であった。
【００３６】
５．各種化合物の影響
酵素活性測定と同様にｐＨ６．０で２０ｍＭグリオキサールに精製酵素を作用させ、この反応液に１．０ｍＭの各種化合物を添加して、本酵素のグリオキサール酸化に対する各種化合物の影響を調べた。その結果、表８に示すように、本酵素は、ヒドラジン、フェニルヒドラジン、シアン化カリウムで強く阻害され、ヒドロキシアミンでも阻害された。そしてキレート化合物で若干活性化されることが明らかになった。
【００３７】
【表８】
６．最適pH
酵素活性測定と同じ組成の発色液をｐＨ５．５からｐＨ８．５で調製し、これらの発色液を用いて、活性測定と同様に３０℃で２０ｍＭグリオキサールと精製酵素を反応させ、グリオキサール酸化反応の最適ｐＨを調べた。その結果、図１に示すように、本酵素は酸性領域から弱アルカリ性領域の広い範囲で活性を示し、反応の最適ｐＨは６付近であった。
【００３８】
７．最適温度
酵素活性測定と同様にｐＨ６．０の発色液を用いて、２０ｍＭグリオキサールと精製酵素を２５℃から７０℃の範囲で反応させ、反応の最適温度を調べた。その結果、図２に示すように、本酵素は測定したいずれの温度でも活性を示し、反応の最適温度は３５−５０℃の範囲であった。
【００３９】
８．ｐＨ安定性
ｐＨ５．５からｐＨ８．５で酵素液を３０℃，２時間加温した後、上記の酵素活性測定法を用いて、残存酵素活性を測定した。その結果、図３に示すように、酵素活性は、酸性領域からアルカリ性領域の広い範囲で残存しており、特にｐＨ６．０からｐＨ８．５の範囲では、８０％以上の活性が残存した。よって、本酵素は、酸性領域からアルカリ性の領域領域の広い範囲で安定であることが明らかになった。
【００４０】
９．Ｎ末端アミノ酸配列
精製酵素を用いて、本酵素のＮ末端アミノ酸配列を調べた。本精製酵素のＮ末端は図４（配列番号１）に示す。
【００４１】
（実施例５）
実施例２記載の方法で得たＡＩＵ ３６２株培養液２５０ｍｌから集菌した菌体を10mMリン酸緩衝液５ｍｌに懸濁し、１０℃以下の温度で０．５ｍｍガラスビーズを用いて10分間（１分 x １０回）細胞破砕した。この細胞破砕液を遠心分離して菌体残渣を除去し、上清分画を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液０．８ｍｌに５００ｍＭグリオキサール水溶液０．１ｍｌ、５０，０００Ｕ／ｍｌカタラーゼ溶液０．１ｍｌを添加し、試験管中で２８℃、１０時間、振盪し、反応を行った。その後、得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、反応液中に７ｍＭのグリオキシル酸が生成していた。
［ＨＰＬＣ分析条件］
カラム：バイオラッド社製アミネックスＨＰＸ−８７Ｈ（７．８ｍｍ × ３００ｍｍ）
カラム温度：２５℃
溶離液：５ｍＭ Ｈ2ＳＯ4水溶液
流速：０．４ｍｌ／分
溶離時間：グリオキサール−１６分、 グリオキシル酸−１５分
検出：２３０ｍＭの吸光度および示差屈折率
（実施例６）
実施例３で得た精製酵素０．１Ｕ、グリオキサール５０ｍＭ、カタラーゼ５０００Ｕを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌを試験管に加え、３０℃、５時間、振盪し、反応を行った。その後、得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、反応液中に２７ｍＭのグリオキシル酸が生成していた。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】グリオキサール酸化反応の最適ｐＨ
【図２】グリオキサール酸化反応の最適温度
【図３】酵素のｐＨ安定性
【図４】本発明の酸化酵素のＮ末端アミノ酸配列
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌が産生するグリオキサールに作用する新規な酸化酵素および当該酵素を用いて医薬品の原料として有用なグリオキシル酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在グリオキシル酸は化学的な方法で製造されているが、その製造方法は煩雑で、多量の副産物が生成されるため、グリオキシル酸の収率が低い欠点を有する。この化学的な製造方法の欠点を解決するために、グリコール酸を原料としてグリコール酸酸化酵素や微生物を用いる方法が開発された。例えば特許文献１、非特許文献１〜５などが挙げられる。しかし、これらの方法はいずれも高価なグリコール酸を原料として使用しなければならない問題点を有し、またこれら方法では、グリオキシル酸にも作用する植物由来の酵素が用いられているなどの問題点を有する。最近、安価なグリオキサールを原料にしてグリオキシル酸を製造する方法が報告されたが、当該方法は、グリオキサールを化学的な方法でグリコール酸に変換し、生成されたグリコール酸に上記と同様の植物由来のグリコール酸酸化酵素を作用させる方法であり、この方法も化学的方法と酵素を組み合わせた煩雑である欠点を有する （非特許文献６）。一方、グリオキサールに対し活性を有する酸化酵素として、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ由来のグリオキサールオキシダーゼ（非特許文献７−９）が報告されている。 しかし、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ由来のグリオキサールオキシダーゼは、グリオキサールだけでなく、グリオキシル酸にも作用する酵素であり、本発明の目的であるグリオキシル酸の製造に使用することは困難である。また、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌からアルデヒド基をカルボン酸へと変換するアルデヒドオキシダーゼが報告されている（特許文献２、非特許文献１０−１１）。しかし、当該酵素のグリオキサールに対する作用については全く検討されておらず、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌がグリオキサールに作用しグリオキシル酸に全く作用しない酸化酵素を産生することは、本発明を持って初めて明らかにされた。さらに、本発明の酵素は、分子量や蛋白質の構造において、既報のアルデヒドオキシダーゼとは明らかに異なり、本発明の微生物が従来報告されていない全く新しいアルデヒド酸化酵素を産生し、当該酸化酵素がグリオキシル酸の製造に有効であることは、本発明を持って初めて明らかにされた。
【特許文献１】特開平5-501800
【特許文献２】特開昭58-179489
【非特許文献１】J. Org. Chem., 58, 2253-2259 (1993)
【非特許文献２】Bioorg. Medicin. Chem., 2, 371-378 (1994)
【非特許文献３】J. Org. Chem., 60, 3957-3963 (1995)
【非特許文献４】Gene, 194, 179-182 (1997)
【非特許文献５】J. Biotechnol., 75, 265-271 (1999)
【非特許文献６】Process Biochem., 36, 73-78 (2000)
【非特許文献７】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2936-2940 (1990)
【非特許文献８】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 7411-7413 (1993)
【非特許文献９】Enzyme Microbiol. Technol., 17, 751-756 (1995)
【非特許文献１０】J. Biosci. Bioeng., 94, 124-129 (2002)
【非特許文献１１】FEMS Microbiol Ltters, 229, 31-36 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、グリオキサールに作用しグリオキシル酸に作用しない新規な酸化酵素を産生する微生物および／または当該活性を有する酵素、および当該酸化酵素を製造する方法、更に当該酵素を用いて安価なグリオキサールを原料にしてグリオキシル酸を効率的に製造する方法を提供することにある。また、グリオキサールに作用しグリオキシル酸に作用しない新規な酸化酵素を産生する微生物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、上述の問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、グリオキサールに作用しグリオキシル酸に作用しない新規な酸化酵素をＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌に見出した。そして、当該微生物から本酸化酵素を単離、精製し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、以下の（１）〜（４）の性質を有する新規なアルデヒドオキシダーゼを提供するものである。
（１）作用：グリオキサールに存在する２個のアルデヒド基のうち、一方のアルデヒド基を酸化して、グリオキサールをグリオキシル酸に変換する
（２）基質特異性：グリオキサール、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、１−ペンタナール、２−ペンタナールに対して強い活性を示し、グリオキシル酸には実質的に活性を示さず、また、メチルグリオキサールには作用せず、メタノール、エタノール、1-プロパノール、1-ブタノールなどの一級アルコールや2-プロパノール、2-ブタノールなどの二級アルコール、あるいはエチレングリコール、1,2-プロパンジオール、1,3-プロパンジオールなどの二価アルコールおよびグリコール酸、乳酸などにも活性を示さない。
（３）作用最適pH：５．５−６．５
（４）作用最適温度：３５−５０℃
また、本発明は、更に以下（５）〜（７）
（５）分子量：ゲル濾過分析で約９５，０００の分子量を示し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動分析で約２８，０００の分子量を示す。
（６）pH安定性：３０℃、２時間加温した場合、ｐＨ６．０からｐＨ８．５の範囲で８０％以上の活性が残存する。
（７）阻害剤：フェニルヒドラジン、ヒドラジン、シアン化カリウムにより阻害される。
【０００５】
また、本発明は、グリオキサールをグリオキシル酸に酸化するが、反応生成物であるグリオキシル酸には作用しない酸化酵素を産生する微生物を提供する。さらに、本発明は、当該微生物を培養して、グリオキサールをグリオキシル酸に酸化し、反応生成物であるグリオキシル酸に作用しない酸化酵素の製造法も提供する。
【０００６】
更に本発明は、グリオキサールをグリオキシル酸に酸化するが反応生成物であるグリオキシル酸に作用しない上記の酸化酵素をグリオキサールに作用させ、グリオキサールに存在する２つのアルデヒド基のうち、一方のアルデヒド基を酸化して、グリオキシル酸に変換することを特徴とするグリオキシル酸の製造方法も提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物より得られた新規なアルデヒドオキシダーゼは、グリオキサールをグリオキシル酸に酸化するが、反応生成物であるグリオキシル酸には全く作用しない特異性の高い酸化酵素であり、本発明の酸化酵素を使用すれば、安価なグリオキサールからグリオキシル酸を効率的に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、従来報告されていないグリオキサールに作用してグリオキシル酸に作用しない新規な酸化酵素を産生する微生物を自然界から見出し、当該酵素の諸性質を明らかにし、グリオキシル酸の製造に有効であることを明らかにすることにより完成された。このような微生物は、土壌サンプルをエチレングリコール、グリコールアルデヒド、グリオキサール、２−メトキシエタノールなどを炭素源とした培地に添加し、培養を行った後、生育してきた微生物について、グリオキサールに対する酸化活性を調べる事により得ることが出来る。本発明の酵素の起源となる微生物は特に限定しないが、細菌などが好適であり、好ましくはシュードノナス属に属する微生物が挙げられ、特に好ましくは岩手大学農学部校内の土壌から分離されたシュードモナス・スピーシーズ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＡＩＵ ３６２が挙げられる。当該ＡＩＵ ３６２株は独立法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）にＦＥＲＭ Ｐ−２０３６３ として寄託されている。 ＡＩＵ ３６２株の菌学的諸性質を表１に示す。また、ＡＩＵ ３６２株の同定には、該菌株の１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子（１６ＳｒＤＮＡ）のうち５‘末端側約１５００ｂｐの領域をＰＣＲで増幅して、塩基配列を決定し、ＭｉｃｒｏＳｅｑ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｆｕｌｌ Ｇｅｎｅ Ｌｉｂｒａｒｙ ｖ．０００１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ＣＡ、ＵＳＡ）データベース及び国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）に対し相同性検索を行い、分子系統樹を作製する方法で行った。
【０００９】
本発明の酸化酵素は、該酵素を産生する微生物より、下記のようにして取得することができる。例えば、本活性を有する微生物を好適な条件で培養し、培養終了後に培養液から遠心分離などにより菌体を集め、超音波破砕、ガラスビーズを用いた破砕などの方法により、菌体を破砕し、粗酵素液を得る。さらにこの粗酵素液から塩析、各種クロマトグラフィーなどの方法により精製し、本発明の酵素を得ることができる。
【００１０】
至適反応ｐＨまたは至適温度は、反応条件のｐＨまたは温度を変えて活性を測定することにより決定される。
【００１１】
分子量は例えばＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ（７．８ｍｍ × ３０ｃｍ）（東ソー株式会社製）カラムを用いたゲル濾過分析により、標準タンパク質との相対溶出時間から算出することができ、サブユニット分子量はＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により、標準タンパク質との相対移動度から算出することができる。
【００１２】
また、Ｎ末端アミノ酸配列は、上記方法により精製した酵素、またはさらに逆相ＨＰＬＣにより精製したものをプロテインシークエンサーにて決定することができる。
【００１３】
本発明において、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する酸化酵素を産生する微生物を培養するための培地は、その微生物が増殖し得るものであれば特に限定されない。例えば、炭素源として、グルコース、シュークロースなどの糖類、エタノール、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、２−メトキシエタノールなどのアルコール類、グリオキサールなどのアルコール類、オレイン酸、ステアリン酸などの脂肪酸ならびにそのエステル類、菜種油および大豆油などの油類；窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、ペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、肉エキスおよびコーンスチープリカーなど；無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カリウム、リン酸水素ナトリウムなど；その他に麦芽エキス、肉エキスなどを有する通常の液体培地が使用され得る。
【００１４】
本発明によるグリオキシル酸の製造方法は、本発明の酸化酵素をグリオキサールに作用させ、グリオキシル酸へと変換蓄積せしめることを特徴とする。本発明で使用する酸化酵素としては、単一または部分的に精製された酵素であってもよいし、これら酵素を産生する微生物の培養液またはその処理物を使用することも可能である。ここで、「微生物の培養物」とは、菌体を含む培養液あるいは培養菌体を意味し、「その処理物」とは、例えば粗酵素液、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、あるいはそれらの破砕物、これらの混合物などを意味する。更にそれらは、酵素自体または菌体のまま公知の手段（例えば、架橋法、物理的吸着法、包括法など）で固定化されて使用できる。
【００１５】
反応条件は使用する酵素により異なるが、温度は５℃〜８０℃、好ましくは５〜６０℃の範囲、ｐＨは４〜１２、好ましくはｐＨ５〜９の範囲である。反応は、酸素条件下で行うことが好ましい。また酸素の反応液への溶解を促進するため、反応は振とう、攪拌条件下で行なわれることが好ましい。さらに大気圧以上の加圧下で反応を行うことにより、反応液への酸素の溶解度が向上し、反応がより進む場合もある。
【００１６】
【表１】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例になんら限定されるものではない。
【実施例】
【００１７】
（実施例１：グリオキサールに作用してグリオキシル酸に作用しない酸化酵素を産生する能力を持つ微生物の分離）
スクリーニングのための培地は、１２０℃で１５分間加圧殺菌した表２に示す８０ｍｌの基礎培地に、５％ ２−メトキシエタノール溶液２０ｍｌをメンブランフィルターで除菌して添加して調製した（培地中の2-メトキシエタノール濃度は１％）。この１％ ２−メトキシエタノール含有培地５ｍｌを分注した試験管に少量の土壌を添加し、３０℃で３〜７日間振盪培養した。微生物の生育が確認された培養液について、その培養液５０ｍｌを上記と同一組成の培地に植菌し、同様に３０℃で３〜７日間振盪培養した。この操作をもう一度繰り返した後、培養液を上記液体培地と同一組成に２％寒天を加えて調製した寒天平板培地にプレートアウトし、30℃で培養した。そして微生物の生育が確認された後、この寒天平板培地にグリオキサールと過酸化水素の生成を確認するための発色液を摘下して、３０℃で反応させた。この方法で、過酸化水素の生成が認められた微生物を、この平板培地と同一組成の斜面培地に植菌し、30℃で培養して保存した。次に、斜面培地に分離した微生物を再度１％ ２−メトキシエタノール含有液体培地で振盪培養した。そして培養液から遠心分離で集菌し、集めた菌体を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、１０ｍＭのグリオキサールおよびグリオキシル酸と反応させた。この菌体懸濁液を用いた反応で、グリオキサールから過酸化水素の生成が確認されるが、グリオキシル酸から過酸化水素の生成がほとんど確認されない微生物を選抜した。続いて、選抜した微生物を、１％ ２−メトキシエタノールを含む上記組成の液体培地１５０ｍｌを入れた坂口フラスコを用いて30℃で振盪培養した。この培養で得られた９００ｍｌ分の菌体を遠心分離で集め、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁してガラスビーズを用いて菌体を破砕した。そして、菌体破砕残渣を遠心分離で除去し、得られた上清液をＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラクムクロマトグラフィーに供した。即ち、菌体破砕残渣を除去して集めた上清液を１０ｍＭリン酸緩衝液と同程度の塩濃度まで脱塩した後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した２０ｍｌのＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムに通液し、このカラムを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。吸着した酵素は、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）と０．５ＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた直線濃度勾配法で溶出し、全ての画分についてグリオキサールおよびグリオキシル酸に対するオキシダーゼ活性を調べた。そして、グリオキサールに良く作用してグリオキシル酸に対するオキシダーゼ活性を示さない酵素を産生する微生物を選抜した。このような方法で得られた菌株は、上記の菌学的性質を示す微生物であり、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＡＩＵ ３６２と命名した。
尚、寒天平板培地上でのグリオキサールに対するオキシダーゼ活性は表３に示す発色液を用い、溶液でのグリオキサールに対するオキシダーゼ活性は表４に示す発色液を用いた。
【００１８】
【表２】
【００１９】
【表３】
【００２０】
【表４】
【００２１】
【表５】
（実施例２）
（実施例２：グリオキサールに作用してグリオキシル酸に作用しない酸化酵素の製造）
実施例１で分離した微生物を、１％ ２−メトキシエタノールを含む実施例１と同一組成の液体培地を用いて、試験管で３０℃，２日間振盪培養して種培養液を調製した。次に、この種培養液１．５ｍｌを、種培養と同一組成の液体培地１５０ｍｌを入れた５００ｍｌ容フラスコに植菌し、３０℃で振盪培養して、培養時間と酵素生産量との関係を調べた。その結果、グリオキサールに作用する酸化酵素の生産量は培養時間とともに増大し、当該酸化酵素の活性は培養６日付近でも高い値を維持した。
【００２２】
（実施例３：グリオキサールに作用してグリオキシル酸に作用しない酸化酵素の精製）
実施例２の結果を基に、１％ ２−メトキシエタノールを含む実施例１と同一組成の液体培地を用いて試験管で３０℃，２日間振盪培養して一次種培養液を調製した。この一次種培養液１．５ｍｌを同一組成の液体培地を１５０ｍｌ分注した５００ｍｌ容フラスコに植菌し、３０℃で２日間振盪培養して二次種培養液を調製した。続いて、この二次種培養液２０ｍｌを一次種培養と同一組成の液体培地２ Lを入れた３ L容フラスコに植菌し、３０℃で５日間振盪培養した。このようにして培養した２０Ｌの培養液から菌体を集めて、以下の方法で酵素を精製した。尚、酵素の精製にはリン酸緩衝液 ｐＨ７．０を用いた。
【００２３】
１）粗酵素液の調製
２０Ｌ培養液から集菌した菌体（湿重量：２５．５ｇ）を１０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁し、１０℃以下の温度で０．５ｍｍガラスビーズを用いて１２分間（２分ｘ６回）細胞破砕した。この細胞破砕液を遠心分離して菌体残渣を除去し、上清画分を粗酵素液として酵素の精製に用いた。
【００２４】
２）硫安塩析
上述の方法で遠心分離して集めた上清液（１，０００ｍｌ）に３５％飽和になるように硫安２０９ｇを添加した後、１時間攪拌放置し、生成した沈殿物を遠心分離で集めた。続いて、この上清画分に４５％飽和まで硫安を添加し、生成した沈殿物を遠心分離で集めた後、さらに６５％飽和まで硫安を添加し、生成した沈殿物を遠心分離で集めた。各硫安濃度で生成した沈殿物を溶解して酵素活性を調べた結果、３５−４５％飽和と４５−６５％飽和の沈殿画分に目的の酵素活性が認められたので、両画分に硫安を添加して塩濃度を１３０ｍｓ／ｃｍに調整した。
【００２５】
３）Ｐｈｅｎｙｌ−Ｔｏｐｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィー
硫安塩析で得られた３００ｍｌの粗酵素液に１．０Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化した１５０ｍｌ分のＰｈｅｎｙｌ−Ｔｏｐｏｐｅａｒｌを添加して、４℃で一夜攪拌した後、目的の酵素が吸着しているＰｈｅｎｙｌ−Ｔｏｐｏｐｅａｒｌ樹脂を濾過で集めた。このＰｈｅｎｙｌ−Ｔｏｐｏｐｅａｒｌ樹脂を１．０Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（１Ｌ）に懸濁して攪拌して濾過する方法で洗浄した。この操作を２回繰り返した後、洗浄した樹脂を同一の緩衝液に懸濁してカラムに充填し、このカラムをさらに０．７Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液２Ｌで洗浄した。次に目的とする酵素を０．２６Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液で溶出した。
【００２６】
４）ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィー
Ｐｈｅｎｙｌ−Ｔｏｐｏｐｅａｒｌカラムから溶出された酵素活性画分を限外濾過膜で２ｍｓ／ｃｍまで脱塩濃縮した後、１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム（２．５ × １２ｃｍ）に吸着させた。本カラムを４０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液１Ｌで洗浄した後、酵素を４０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（３００ｍｌ）と０．２５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（３００ｍｌ）を用いて直線濃度勾配法で溶出した。
【００２７】
５）Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅカラムクロマトグラフィー
ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムからの溶出液を限外濾過膜で脱塩濃縮し、Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅカラム（１．５ × １０ｃｍ）に吸着させた。本カラムを１０ｍＭリン酸緩衝液１００ｍｌで洗浄した後、目的とする酵素を１０ｍＭリン酸緩衝液（１００ｍｌ）と１００ｍＭリン酸緩衝液（１００ｍｌ）を用いて直線濃度勾配法で溶出した。
【００２８】
６）ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィー
Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅカラムからの溶出液を２ｍｓ／ｃｍに希釈した後、１０ｍＭリン酸緩衝液, ｐＨ７．０で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム（１ × １８ｃｍ）に吸着させた。本カラムを４０ｍＭ NaClを含む１０ｍＭリン酸緩衝液５０ｍｌで洗浄した後、酵素を４０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭン酸緩衝液（７５ｍｌ）と０．２５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（７５ｍｌ）を用いて直線濃度勾配法で溶出した。
【００２９】
７）Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５５によるゲル濾過
Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅカラムからの溶出液を限外濾過膜で０．２ｍｌまで濃縮した後、５０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−５５カラム（１ × ４５ｃｍ）でゲル濾過を行った。
【００３０】
以上の方法で得られた上記7) の酵素標品をＮａｔｉｖｅおよびＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法で分析した結果、電気泳動的に単一であった。尚、本精製法による酵素の精製収率は、表６の通りであった。
【００３１】
【表６】
（実施例４：グリオキサールに作用してグリオキシル酸に作用しない酸化酵素の性質）
実施例３の方法で精製した酵素標品は、ＮａｔｉｖｅおよびＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法を用いて分析した結果、いずれの分析でも蛋白的に単一であった。よって、本精製酵素標品を用いて諸性質を検討した。
【００３２】
1. 作用
酵素活性測定用発色液２の組成を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解して調製した発色液を用いて、酵素活性測定と同様に、精製酵素を２０ｍＭグリオキサールに作用させた結果、反応時間と共に５５５ｎｍの吸光度が増大し、グリオキサールと本酵素の反応によって、過酸化水素が生成されることが明らかになった。 また、反応生成物をIsobe and Nishiseの方法 [Biosci. Biotech. Biochem., 58, 170-173, (1994)] に従ってN-methylbenzothiazolone hydrazone (MBTH)と反応させ、その吸収スペクトルおよびＣ１８の逆相カラムからの溶出時間を分析した。その結果、反応１では、グリオキシル酸とMBTHを反応させた場合と同様に、３５０ｎｍ付近に極大吸収を持つ吸収スペクトルが得られ、反応２では６２０付近に極大吸収を持つ吸収スペクトルが得られた。そしてＣ１８の逆相カラムで分析した場合も、グリオキシル酸と同じ溶出位置に新たなピークが得られた。よって、本酵素は、下記の式に従ってグリオキサールをグリオキシル酸に酸化することが明らかになった。次に、２０ｍＭグリオキシル酸を用いてグリオキサールと同様に精製酵素を作用させ、過酸化水素の生成を調べた。その結果、５５５ｎｍの吸光度の増大は認められなかった。よって、本酵素は、グリオキサールをグリオキシル酸に酸化するが、反応生成物であるグリオキシル酸には作用しないことが明らかになった。
【００３３】
OHCCHO + O2 + H2O → OHCCOOH + H2O2
２. 基質特異性
酵素活性測定用発色液２の組成を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解して調製した発色液を用いて、酵素活性測定と同様に３０℃で、２０ｍＭのアルデヒド類、有機酸類、およびアルコール類に精製酵素を作用させた。その結果、表７に示すように、本酵素は、グリオキサールに作用し、グリオキシル酸には作用しなかった。そして、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、1-ペンタナール、2-ペンタナールなどのアルデヒド類に良く作用し、ホルムアルデヒドやグリコールアルデヒドにも作用した。しかし、メタノール、エタノール、1-プロパノール、1-ブタノールなどの一級アルコール、2-プロパノール、2-ブタノールなどの二級アルコール、エチレングリコール、1,2-プロパンジオール、1,3-プロパンジオールなどの二価アルコール類には作用せず、2-メトキシエタノール、メチルグリオキサール、グリコール酸、乳酸にも作用しなかった。
【００３４】
【表７】
３．グリオキサールに対するKm値
酵素活性測定用発色液２の組成を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解して調製した発色液を用いて、グリオキサールの濃度を０．５ｍＭから２０ｍＭの範囲で変えて、グリオキサールに対するKm値を測定した。その結果、グリオキサールに対するＫｍ値は約５ｍＭであった。
【００３５】
４．分子量
本酵素の分子量は、ゲル濾過法で約９５，０００、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法で約２８，０００であった。
【００３６】
５．各種化合物の影響
酵素活性測定と同様にｐＨ６．０で２０ｍＭグリオキサールに精製酵素を作用させ、この反応液に１．０ｍＭの各種化合物を添加して、本酵素のグリオキサール酸化に対する各種化合物の影響を調べた。その結果、表８に示すように、本酵素は、ヒドラジン、フェニルヒドラジン、シアン化カリウムで強く阻害され、ヒドロキシアミンでも阻害された。そしてキレート化合物で若干活性化されることが明らかになった。
【００３７】
【表８】
６．最適pH
酵素活性測定と同じ組成の発色液をｐＨ５．５からｐＨ８．５で調製し、これらの発色液を用いて、活性測定と同様に３０℃で２０ｍＭグリオキサールと精製酵素を反応させ、グリオキサール酸化反応の最適ｐＨを調べた。その結果、図１に示すように、本酵素は酸性領域から弱アルカリ性領域の広い範囲で活性を示し、反応の最適ｐＨは６付近であった。
【００３８】
７．最適温度
酵素活性測定と同様にｐＨ６．０の発色液を用いて、２０ｍＭグリオキサールと精製酵素を２５℃から７０℃の範囲で反応させ、反応の最適温度を調べた。その結果、図２に示すように、本酵素は測定したいずれの温度でも活性を示し、反応の最適温度は３５−５０℃の範囲であった。
【００３９】
８．ｐＨ安定性
ｐＨ５．５からｐＨ８．５で酵素液を３０℃，２時間加温した後、上記の酵素活性測定法を用いて、残存酵素活性を測定した。その結果、図３に示すように、酵素活性は、酸性領域からアルカリ性領域の広い範囲で残存しており、特にｐＨ６．０からｐＨ８．５の範囲では、８０％以上の活性が残存した。よって、本酵素は、酸性領域からアルカリ性の領域領域の広い範囲で安定であることが明らかになった。
【００４０】
９．Ｎ末端アミノ酸配列
精製酵素を用いて、本酵素のＮ末端アミノ酸配列を調べた。本精製酵素のＮ末端は図４（配列番号１）に示す。
【００４１】
（実施例５）
実施例２記載の方法で得たＡＩＵ ３６２株培養液２５０ｍｌから集菌した菌体を10mMリン酸緩衝液５ｍｌに懸濁し、１０℃以下の温度で０．５ｍｍガラスビーズを用いて10分間（１分 x １０回）細胞破砕した。この細胞破砕液を遠心分離して菌体残渣を除去し、上清分画を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液０．８ｍｌに５００ｍＭグリオキサール水溶液０．１ｍｌ、５０，０００Ｕ／ｍｌカタラーゼ溶液０．１ｍｌを添加し、試験管中で２８℃、１０時間、振盪し、反応を行った。その後、得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、反応液中に７ｍＭのグリオキシル酸が生成していた。
［ＨＰＬＣ分析条件］
カラム：バイオラッド社製アミネックスＨＰＸ−８７Ｈ（７．８ｍｍ × ３００ｍｍ）
カラム温度：２５℃
溶離液：５ｍＭ Ｈ2ＳＯ4水溶液
流速：０．４ｍｌ／分
溶離時間：グリオキサール−１６分、 グリオキシル酸−１５分
検出：２３０ｍＭの吸光度および示差屈折率
（実施例６）
実施例３で得た精製酵素０．１Ｕ、グリオキサール５０ｍＭ、カタラーゼ５０００Ｕを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌを試験管に加え、３０℃、５時間、振盪し、反応を行った。その後、得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、反応液中に２７ｍＭのグリオキシル酸が生成していた。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】グリオキサール酸化反応の最適ｐＨ
【図２】グリオキサール酸化反応の最適温度
【図３】酵素のｐＨ安定性
【図４】本発明の酸化酵素のＮ末端アミノ酸配列
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（４）の性質を有する酸化酵素
（１）作用：
酸素存在下、グリオキサールに作用し、グリオキシル酸と過酸化水素を生成する、
（２）基質特異性：
グリオキサール、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、１−ペンタナール、２−ペンタナールに対して強い活性を示し、グリオキシル酸には実質的に活性を示さない、
（３）作用最適ｐＨ： ５．５−６．５、
（４）作用最適温度： ３５−５０℃。
【請求項２】
更に、下記（５）〜（７）の性質を有する酸化酵素
（５）分子量： ゲル濾過分析で約９５，０００、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動分析 において約２８，０００、
（６）ｐＨ安定性： ３０℃、２時間加温した場合、ｐＨ６〜８．５で８０％以上の活性が残 存する、
（７）阻害剤： フェニルヒドラジン、ヒドラジン、シアン化カリウムにより阻害される。
【請求項３】
配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列をＮ末端に有する請求項１〜２いずれか記載の酸化酵素。
【請求項４】
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌が産生する請求項１〜３いずれか記載の酸化酵素
【請求項５】
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌がシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＡＩＵ ３６２（ＦＥＲＭ Ｐ−２０３６３）である請求項４記載の酸化酵素
【請求項６】
請求項４−５のいずれか記載の微生物を培養して請求項１の酵素を製造する方法
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか記載の酸化酵素をグリオキサールに接触させてグリオキシル酸へと変換することを特徴とするグリオキシル酸の製造方法
【請求項８】
反応時にカタラーゼを共存させることを特徴とする請求項７記載のグリオキシル酸の製造方法。
【請求項１】
下記（１）〜（４）の性質を有する酸化酵素
（１）作用：
酸素存在下、グリオキサールに作用し、グリオキシル酸と過酸化水素を生成する、
（２）基質特異性：
グリオキサール、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、１−ペンタナール、２−ペンタナールに対して強い活性を示し、グリオキシル酸には実質的に活性を示さない、
（３）作用最適ｐＨ： ５．５−６．５、
（４）作用最適温度： ３５−５０℃。
【請求項２】
更に、下記（５）〜（７）の性質を有する酸化酵素
（５）分子量： ゲル濾過分析で約９５，０００、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動分析 において約２８，０００、
（６）ｐＨ安定性： ３０℃、２時間加温した場合、ｐＨ６〜８．５で８０％以上の活性が残 存する、
（７）阻害剤： フェニルヒドラジン、ヒドラジン、シアン化カリウムにより阻害される。
【請求項３】
配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列をＮ末端に有する請求項１〜２いずれか記載の酸化酵素。
【請求項４】
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌が産生する請求項１〜３いずれか記載の酸化酵素
【請求項５】
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌がシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＡＩＵ ３６２（ＦＥＲＭ Ｐ−２０３６３）である請求項４記載の酸化酵素
【請求項６】
請求項４−５のいずれか記載の微生物を培養して請求項１の酵素を製造する方法
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか記載の酸化酵素をグリオキサールに接触させてグリオキシル酸へと変換することを特徴とするグリオキシル酸の製造方法
【請求項８】
反応時にカタラーゼを共存させることを特徴とする請求項７記載のグリオキシル酸の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００６−２１７８８３（Ｐ２００６−２１７８８３Ａ）
【公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３５８９２（Ｐ２００５−３５８９２）
【出願日】平成１７年２月１４日（２００５．２．１４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１６年度新エネルギー・産業技術総合開発機構「生物機能を活用した生産プロセスの基盤技術開発事業の委託研究」、産業活力再生特別措置法３０条の適用を受けるもの）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月１４日（２００５．２．１４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１６年度新エネルギー・産業技術総合開発機構「生物機能を活用した生産プロセスの基盤技術開発事業の委託研究」、産業活力再生特別措置法３０条の適用を受けるもの）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
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