グリセロールの嫌気醗酵
【課題】安価なグリセロールの世界的過剰を他の供給原料化学物質に生体変換する方法を提供する。
【解決手段】本発明はグリセロール基質上で嫌気的（発酵的）に生育させるための細菌に対する適切な培養条件の開発に関する。方法は、機能的１，２−プロパンジオール経路及び機能的ＩＩ型グリセロールデヒドロゲナーゼ−ジヒドロキシアセトンキナーゼ経路を有する細菌を、高濃度のグリセロール、中性〜弱酸性ｐＨ、低レベルのカリウム及びホスフェート、及び高レベルのＣＯ２を含有する培地中において、グリセロールが所望の生成物、例えばエタノール、水素、ホルメート、スクシネート又は１，２−プロパンジオールに変換されるように培養することを必要とする。
【解決手段】本発明はグリセロール基質上で嫌気的（発酵的）に生育させるための細菌に対する適切な培養条件の開発に関する。方法は、機能的１，２−プロパンジオール経路及び機能的ＩＩ型グリセロールデヒドロゲナーゼ−ジヒドロキシアセトンキナーゼ経路を有する細菌を、高濃度のグリセロール、中性〜弱酸性ｐＨ、低レベルのカリウム及びホスフェート、及び高レベルのＣＯ２を含有する培地中において、グリセロールが所望の生成物、例えばエタノール、水素、ホルメート、スクシネート又は１，２−プロパンジオールに変換されるように培養することを必要とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（先の関連出願）
本願は、先願の２００６年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６０／７８８，５１２号、および２００６年１１月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／８６７，５８１号に対する優先権を主張する。これらは双方とも、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【０００２】
（連邦財政支援研究に関する陳述）
本発明は政府基金により部分的に財政支援されており、合衆国政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
（マイクロフィッシュ付録の参照）
適用せず。
【０００４】
（技術分野）
本発明はグリセロール基質上で発酵的に（即ち電子受容体の非存在下）生育させるための細菌に対する適切な培養条件の開発に関する。本発明はグリセロールをより高い価値の生成物、例えばエタノール、水素、ホルメート、スクシネート、及び１，２−プロパンジオールに変換することができる方法及び菌株の開発のために特に使用される。
【背景技術】
【０００５】
大量のグリセロールはバイオディーゼル生産における副産物として生産され、グリセロールの生産は、バイオディーゼル生産における著しい世界成長により、増え続けると予測されている。グリセロールの現在の過剰は既に過去２年間で約１０倍の価格低下をもたらしている。
【０００６】
従って粗製のグリセロールは部分的にはその低コストのために発酵プロセスのための興味深い炭素源となっている。グリセロールは豊富に存在するのみならず、セルロース性の糖類と比較した場合のより高度に還元されたその状態は、還元性の同等品の易入手性により糖類からの生産が制限されている化学物質の生成物収率を顕著に増大させる可能性が高い。グリセロールにおける炭素のより高度に還元された状態を利用することは、嫌気的発酵の使用を必要とする（即ち、そうしなければ、電子受容体が所望の生成物、例えば燃料又は還元された化合物に「付着する」代わりに電子を「獲得する」ことになる）。しかしながら、発酵プロセスにおける炭素源としてのグリセロールの潜在的使用は、外部の電子受容体の非存在下にグリセロールを発酵することがエシェリシア・コリ（近代バイオテクノロジーの担い手）のような工業用微生物には不可能であることにより、阻止されている。グリセロールを発酵する能力は極少ない生物に限定されており、その大部分は病原性、厳密な嫌気的条件の必要性、生理学的情報およびその修飾のための遺伝子的ツールの欠如、及び高い栄養必要性のために工業的用途には順応させることができない。
【０００７】
グリセロールはジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）を形成する酵素グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＧｌｄＡ、ｇｌｄＡによりコードされる）により直接酸化されることができる。しかしながらＩＩ型グリセロールデヒドロゲナーゼ（ｇｌｙＤＨ−ＩＩ）として特徴づけられるＧｌｄＡは隠蔽性であるか、又は野性型Ｅ．ｃｏｌｉ菌株においては発現されないと考えられる。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＧｌｄＡの活性化はｇｌｐＫ、ｇｌｐＲ、及びｇｌｐＤの活性化、その後の突然変異誘発及び選択操作法を必要としており、これによりグリセロールを代謝するその能力を回復した突然変異体菌株が得られている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。しかしながら、その突然変異体の菌株においてさえも、ＧｌｄＡはグリセロールを発酵的に代謝する能力をＥ．ｃｏｌｉに与えていない（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊｉｎ，Ｒ．Ｚ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．１９：４２９−４３６（１９８３）
【非特許文献２】Ｔａｎｇ，Ｊ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５２：１１６９−１１７４（１９８２）
【非特許文献３】Ｔａｎｇ，Ｊ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５２：１００１−１００７（１９８２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
当該分野で必要とされているものは、安価なグリセロールの世界的過剰を他の供給原料化学物質に生体変換する方法である。方法は、グリセロールにおける炭素のより還元された状態を利用することを嫌気的発酵に基づくものとすれば、特に好都合となる。嫌気的プロセスは、それと相対する好気的プロセスがより高い資本投資を必要とし、より高い運転コストを要することから、コスト有利性もたらすことになる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の開示）
本発明者等はＥ．ｃｏｌｉが実際は特定の条件下で電子受容体非存在下にグリセロールを発酵できることを発見した。本発明者等の所見はＥ．ｃｏｌｉおよび他の腸内細菌におけるグリセロール発酵の新しいパラダイムを提示するものであり、そして低価値の粗グリセロールを高価値の薬品及び燃料に変換する微生物プラットホームの開発を可能にすることになる。
【００１１】
ｐＨ、ＣＯ２濃度、グリセロール濃度、カリウム濃度、ホスフェート濃度及びヒドロキシアセトン（ＨＡ）濃度をコントロールすることにより所望の化学的前駆体へのグリセロールの発酵的代謝を可能にするグリセロール発酵方法を記載する。
【００１２】
向上したグリセロール発酵はｐＨがほぼ中性か弱酸性の場合に得られる。好ましい実施形態においては、ｐＨは５．５〜７．５であり、より好ましくはｐＨは６．０〜６．５であり、最も好ましい実施形態においてはｐＨは約６．３である。
【００１３】
ＣＯ２濃度は必然的にｐＨに連結しており、そしてｐＨが上昇するにつれＣＯ２は重炭酸、ＨＣＯ３−に変換されるために低下する。ＣＯ２を２０〜３０％上昇させることにより７．０を超える上昇ｐＨの負の作用を低減することができる。向上したグリセロール発酵はｐＨ６．３及び１０％ＣＯ２、ｐＨ７．５及び２０％ＣＯ２の場合に観察されている。より高い濃度のＣＯ２も有利である。
【００１４】
グリセロール中の炭素の高度に還元された状態のため、酸化還元バランスを維持することは、細胞塊へのグリセロールの取り込みは還元性等価物の実質的発生をもたらすため、極めて「デリケート」なこととなる。Ｈ２は数種の反応（例えばフマレート還元酵素）においては電子供与体として作用し、これにより酸化還元バランスを相殺する。Ｈ２濃度が低下すればこれは起こらず、そしてグリセロール発酵は最適に進行する。ヘッドスペースを増大させることにより、Ｈ２は希釈され、そしてグリセロール発酵は向上している。ヘッドスペースを不活性ガス又はＣＯ２でフラッシュすることにより過剰なＨ２が除去され、グリセロール発酵が更に増進される。培地を通してガスでスパージ又はバブリングすることにより、大部分のＨ２は除去され、最良のグリセロール発酵条件がもたらされている。
【００１５】
向上したグリセロール発酵はグリセロールの供給濃度が高値、例えば５又は１０ｇ／Ｌ超、又は更に高値（２５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ）である場合に達成できる。好ましい実施形態においてはグリセロール濃度は１００ｇ／Ｌ超である。
【００１６】
向上したグリセロール発酵は低カリウム及び低ホスフェート濃度で達成できる。カリウム濃度は好ましくは１０ｍＭ未満、より好ましくは５又は２ｍＭ未満、そして最も好ましくは０．６ｍＭ未満となっている。ホスフェート濃度は好ましくは５０ｍＭ未満、より好ましくは２５又は１０ｍＭ未満となっている。より好ましくは５ｍＭ未満、最も好ましくは１．３ｍＭ未満である。低ホスフェート及びカリウムはグリセロールデヒドロゲナーゼ−ジヒドロキシアセトンキナーゼ及び１，２−ＰＤＯ経路の作動に好都合であり、後者が酸化還元バランスのとれた条件を可能にする。
【００１７】
ＨＡ（少なくとも１０、２０、又は３０ｍＭ）を培地に補充することが培養条件を更に向上させている。トリプトン補充は培地にＨＡを補充している場合は必要ではなかった。
【００１８】
１つの実施形態においては、グリセロール発酵は、Ｅ．ｃｏｌｉを１０ｇ／Ｌグリセロール、ｐＨ６．３、０．６ｍＭカリウム、及び１．３ｍＭホスフェートと共に、３７℃においてＣＯ２、Ａｒ又はＮ２をスパージしながら培養することにより最適化された。
【００１９】
他の実施形態においては、本発明は炭素源としてグリセロールを用いたスクシネート、エタノール、ホルメートまたは、水素および１，２−ＰＤＯといった所望の最終生成物の合成のような特定の用途のために使用できる。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
グリセロールが生成物に変換されるような嫌気的条件下で培地中細菌細胞を培養することを含む、グリセロールを嫌気的に発酵させることにより生成物を製造するための方法であって、
ここで該細菌細胞は機能的１，３−プロパンジオール経路を欠いているが、機能的１，２−プロパンジオール経路、機能的ＩＩ型グリセロールデヒドロゲナーゼ−ジヒドロキシアセトンキナーゼ経路、及び機能的Ｆ０Ｆ１−ＡＴＰａｓｅ経路を有しており、
ここで該培地は炭素源としての少なくとも１０ｇ／Ｌグリセロール、１０ｍＭ未満のカリウム、５０ｍＭ未満のホスフェート、１０％以上のＣＯ２、及び５．０と７．５との間のｐＨを含む、方法。
（項目２）
上記培地にヒドロキシアセトン（ＨＡ）を補充するがトリプトンは補充しない項目１に記載の方法。
（項目３）
上記培地に３０ｍＭ ＨＡを補充する項目１に記載の方法。
（項目４）
上記培地のｐＨが６．５以下の場合に細菌細胞が機能的ＦＨＬ経路も有する項目１に記載の方法。
（項目５）
上記ｐＨが約７．５の場合にＣＯ２が少なくとも２０％である項目１に記載の方法。
（項目６）
上記培地が２ｍＭ以下のカリウム及び１０ｍＭ以下のホスフェートを有する項目１に記載の方法。
（項目７）
上記培地が１ｍＭ以下のカリウム及び５ｍＭ以下のホスフェートを有する項目１に記載の方法。
（項目８）
上記生成物がエタノール、コハク酸、ギ酸、水素、１，２−ＰＤＯ、プロパノールアミド、プロピオン酸、及びブタノールよりなる群から選択される項目１に記載の方法。
（項目９）
上記培地が１ｍＭ以下のカリウム及び２ｍＭ以下のホスフェートを有する項目８に記載の方法。
（項目１０）
上記ｐＨが約６．３であり、そして上記培地が不活性ガスでスパージされており、そして上記生成物がエタノール及び水素である項目９に記載の方法。
（項目１１）
ネイティブのグリセロールデヒドロゲナーゼ−ジヒドロキシアセトンキナーゼ経路が過剰発現され、ｐｔａ及びｆｒｄＡが不活性化され、上記グリセロールが粗製のグリセロールであり、そして上記培地が更にコーンスチープリカーを含むがトリプトンを含まない項目１０に記載の方法。
（項目１２）
上記細菌細胞が機能的ＦＨＬ酵素を欠いており、上記ｐＨが約７であり、そして上記培地が不活性ガスでスパージされ、そして上記生成物がエタノール及びホルメートである項目９に記載の方法。
（項目１３）
ネイティブのグリセロールデヒドロゲナーゼ−ジヒドロキシアセトンキナーゼ経路が過剰発現され、ｐｔａ及びｆｒｄＡが不活性化され、上記グリセロールが粗製のグリセロールであり、そして上記培地が更にコーンスチープリカーを含むがトリプトンを含まない項目１２に記載の方法。
（項目１４）
上記細菌細胞がネイティブのジヒドロキシアセトンキナーゼを欠いており、そしてＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ由来のジヒドロキシアセトンキナーゼを発現し、そして上記生成物がスクシネートである項目９に記載の方法。
（項目１５）
上記培地が１０〜２０％ＣＯ２を含み、そして上記ｐＨが６〜７．５である項目１４に記載の方法。
（項目１６）
ネイティブのグリセロールデヒドロゲナーゼ及びＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉジヒドロキシアセトンキナーゼが過剰発現され、ネイティブのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが不活性化され、Ｅ．ｃｏｌｉ又はＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼが過剰発現され、ｐｔａ及びａｄｈＥが不活性化され、上記グリセロールが粗製のグリセロールであり、そして上記培地が更にコーンスチープリカーを含む項目１５に記載の方法。
（項目１７）
ネイティブのグリセロールデヒドロゲナーゼ及びジヒドロキシアセトンキナーゼが過剰発現され、そして上記生成物が１，２−ＰＤＯである項目９に記載の方法。
（項目１８）
上記ネイティブのジヒドロキシアセトンキナーゼがＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉジヒドロキシアセトンキナーゼにより置き換えられ、そして酵素メチルグリオキサルシンターゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、及びメチルグリオキサル還元酵素が全て過剰発現される項目１７に記載の方法。
（項目１９）
グリセロールをヒドロキシアセトンに変換することができる操作された、又は天然に存在するグリセロールデヒドラターゼが過剰発現される項目１７に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】２ｇ／Ｌトリプトンを補充した最少培地（ＭＭ）中のＥ．ｃｏｌｉＭＧ１６５５によるグリセロール発酵である。細胞生育（▲）、グリセロール消費（■）、及びエタノールの蓄積（●）、スクシネート（◆）及びホルメート＋アセテート（＊）。
【図２】Ｎａ＋、Ｋ＋、ＰＯ４３−、及びグリセロールの濃度の影響を示す。Ｎａ＋（３４ｍＭ）、Ｋ＋（１２８ｍＭ）及びＰＯ４３−（９８ｍＭ）を記載の通り培地に添加した。特段の記載が無い限り、実験はｐＨ７．５、３７℃、１０ｇ／Ｌグリセロール、２ｇ／Ｌトリプトンを用いてアルゴンでヘッドスペースをフラッシュしながら実施した。グリセロール発酵（直線）及び細胞生育（棒グラフ）を示す。棒グラフの色はｐＨ６．３（灰色）又は７．５（白）である。
【図３】Ｅ．ｃｏｌｉ及びＩＩ型ｇｌｙＤＨを保有する他の腸内細菌におけるグリセロール発酵に関する新しいパラダイムを示す。Ｅ．ｃｏｌｉにおける解糖系中間体ＤＨＡＰへのグリセロールの変換のための提案される経路は酵素ＧｌｄＡ及びＤＨＡＫを包含する。
【図４】グリセロール発酵の間のエタノール（直線）−Ｈ２（黒棒グラフ）及びエタノール（直線）−ギ酸（白棒グラフ）の同時生産を示す。（Ｉ）ＭＧ１６５５：ｐＨ６．３、アルゴン；（ＩＩ）ΔｈｙｃＢ：ｐＨ７．５、アルゴン。ＨｙｃＢはＦＨＬ系の必要性分である。
【図５】グリセロールからのコハク酸の生産を示す。（Ｉ）ＭＧ１６５５：ｐＨ６．３、アルゴン；（ＩＩ）ＭＧ１６５５：ｐＨ６．３、１０％ＣＯ２、（ＩＩＩ）ＭＧ１６５５：ｐＨ７．５、２０％ＣＯ２；及び（ＩＶ） ΔｄｈａＫＬＭ（ｐＺＳＫＬｃｆ）：ｐＨ７．５、２０％ＣＯ２。プラスミドｐＺＳＫＬｃｆはＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉのＤＨＡキナーゼサブユニットＤｈａＫＬを発現する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は有用な化合物を製造するために細菌を用いてグリセロールを発酵する新規な方法を提供する。
【００２２】
「隠蔽」遺伝子とは発現されないものであるか、又は遺伝子発現のための条件が未知の場合を指す。
【００２３】
「不均衡化する」とは酸化及び還元することである。
【００２４】
「破壊」及び「破壊株」という用語は本明細書においては、ネイティブの遺伝子又はプロモーターが、それによりコードされる酵素の活性を低下させるような態様において突然変異、欠失、中断又はダウンレギュレートされている細胞株を指す。遺伝子は全ゲノムＤＮＡ配列のノックアウト又は除去により完全（１００％）に低減される。フレームシフト突然変異、早期停止コドン、重要な残基の点突然変異、又は欠失又は挿入等の使用は、活性蛋白の転写及び／又は翻訳を完全に防止することにより遺伝子産物を完全に不活性化（１００％）できる。
【００２５】
「異化作用」とは生物が物質を排出化合物に変換する代謝プロセスである。
【００２６】
「外因性」という用語は蛋白又は核酸が起源の種に関わらず生物又は系の外部から導入された非ネイティブの分子であることを示す。例えば、外因性ペプチドは細胞培養物に適用してよく；外因性ＲＮＡは細胞内にトランスフェクトされた組み換えＤＮＡから発現されてよく；又は、ネイティブ遺伝子は外因性の調節配列の制御下にあってよい。
【００２７】
「発酵」とは、外部の電子受容体の完全な非存在下における炭素源の代謝又は異化を意味する。
【００２８】
「機能的１，２−プロパンジオール経路」とは、１種以上の異なる経路により１，２−ＰＤＯを生成するために必要な遺伝子（及びこれによる酵素）を細菌が機能的に発現することを意味する。例えば機能的ｍｇｓＡ（メチルグリオキサルシンターゼ：ＭＧＳ）、ｙｅａＥ、ｙｇｈＺおよびｙａｆＢ遺伝子（アルド−ケト還元酵素：ＡＫＲ）、ｇｌｄＡ（グリセロールデヒドロゲナーゼ、ＧｌｄＡ）が各々必要である。重要な区別は所定の生物は特定の経路の遺伝子／酵素を有するが、経路は隠蔽性である点である。
【００２９】
「機能的ＩＩ型グリセロールデヒドロゲナーゼ−ジヒドロキシアセトンキナーゼ経路」とは、細菌が外部電子受容体の非存在下にグリセロールからＤＨＡホスフェート（ＤＨＡＰ）を生成するために必要な酵素を有しており、これはグリセロールをＤＨＡにそしてＤＨＡＰに変換することにより行われることを意味している。例えば、細菌はＧｌｄＡ（ｇｌｄＡ）及びＤＨＡキナーゼ（ＤＨＡＫ：ｄｈａＫＬＭ）を有さなければならない。
【００３０】
「機能的Ｆ０Ｆ１−ＡＴＰシンターゼ経路」とは、プロトンポンプにＡＴＰ合成をカップリングするために必要な酵素のすべてを細菌が有することを意味する。例えば、細菌はａｔｐＦおよびａｔｐＤを含む機能的ａｔｐオペロンを有さなければならない。
【００３１】
「機能的ホルメート−水素リアーゼ（ＦＨＬ）経路」とは細菌がホルメートをＣＯ２及び水素に不均衡化するために必要な酵素の全てを有することを意味する。例えば活性ホルメートデヒドロゲナーゼ（例えばＦＤＨ−Ｆ：ｆｄｈＦ）及びヒドロゲナーゼ３（ｈｙｃオペロン）が挙げられる。
【００３２】
「機能的１，３−プロパンジオール経路」とは１，３−ＰＤＯを生成するために必要な遺伝子又は酵素を意味する。例えば、グリセロールデヒドラターゼ（ＧＤ）及び／又は１，３−ＰＤＯ還元酵素（１，３−ＰＤＯＲ）は機能的１，３−プロパンジオール経路を欠いている細胞においては不活性であるか、又は非存在である。
【００３３】
「グリセロール」とは参照により本明細書に組み込まれるＮＣＢＩ（商標）ＰｕｂＣｈｅｍ＃７５３及びＣＡＳＲｅｇ＃５６−８１−５に記載されている。
【００３４】
「過剰発現される」とは野生型と比較して増大した活性を有するように遺伝子（又は蛋白）が修飾されていることを意味する。これは遺伝子のより多くのコピーを細胞に加えることにより、抑制配列を欠失するように遺伝子を突然変異することにより、抑制剤を除去することにより、又は、活性が増大するように蛋白を変更すること等により、行うことができる。
【００３５】
本明細書においては、「組み換え」とは遺伝子操作された物質に関連するか、それより誘導されるか、又はそれを含有している。
【００３６】
「低減された活性」又は「不活性な」とは本明細書においては適切な対照種と比較した場合に蛋白活性が少なくとも７５％低減していることとして定義される。好ましくは、少なくとも８０、８５、９０又は９５％の活性低減が達成され、最も好ましい実施形態においては、活性は排除される（１００％）。蛋白は抑制剤を用いて、突然変異により、又は発現又は翻訳の抑制等により不活性化できる。「ヌル突然変異体」又は「ヌル突然変異」とは、蛋白活性が完全に不活性化されることを意味する。１つの例においては、目的の遺伝子を有さない対照プラスミドを挿入する。別の例においては、目的の遺伝子を組み換えにより完全に除去する。更に又、目的の遺伝子を不活性化、突然変異、又は活性を失わせるトランケーションにより除去してよい。
【００３７】
「スクシネート」及び「コハク酸」及び「ホルメート」及び「ギ酸」という用語は本明細書においては互換的に使用する。本明細書における化学物質は参照により本明細書に組み込まれるＮＡＴＩＯＮＡＬ ＬＩＢＲＡＲＹ ＯＦ ＭＥＤＩＮＩＣＥ（登録商標）ＰＵＢＣＨＥＭ（商標）データベース（ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に記載されている。細菌の代謝経路は参照により本明細書に組み込まれるＬｅｈｎｉｎｇｅｒ（１９９３）のＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第２版及び多くの他の生化学テキストに記載されている。
【００３８】
【表１】
【実施例】
【００３９】
（実施例１）材料及び方法
本明細書全体を通じて、遺伝子破壊突然変異体は以下の命名法、即ち：遺伝子１の単一の破壊についてはΔ遺伝子１、又は二重破壊についてはΔ遺伝子１Δ遺伝子２を用いて言及する。
【００４０】
野生型Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２菌株ＭＣ４１００（ＡＴＣＣ３５６９５）、Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）、野生型Ｅ．ｃｏｌｉＢ（ＡＴＣＣ１１３０３）及び腸内細菌エンテロバクター・クロアカエサブエスピークロアカエＮＣＤＣ２７９−５６（ＡＴＣＣ１３０４７）、ブチオウキセラ・アグレスチス（ＡＴＣＣ３３９９４）、セラチア・プリムチカ（ＡＴＣＣ１５９２８）及びレミノレラ・リカルジ（ＡＴＣＣ３３９９８）はＡＭＥＲＩＣＡＮ ＴＹＰＥ ＣＵＬＴＵＲＥ ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ（登録商標）より入手した。単一の突然変異体の組み換え菌株Δｐｔａ、ΔａｄｈＥ、ΔｃｙｄＡ、ΔｃｙｏＢ、ΔｆｒｄＡ、ΔｆｉｘＡ、ΔｇｌｐＡ、ΔｇｌｐＤ、ΔｍｇｓＡ、ΔｙｅａＥ、ΔｙｇｈＺ、ΔｙａｆＢ、ΔｆｕｃＯ、ΔａｔｐＦ、ΔａｔｐＤ、ΔｐｙｋＦ及びΔｈｙｃＢはＥ．ｃｏｌｉのゲノムプロジェクト（ウイスコンシン大学、Ｍａｄｉｓｏｎ，ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉｓｃ，ｅｄｕ）から入手するか、又はＤａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ（２０００）により記載された方法を用いて構築した。Ｋ１２菌株ＭＧ１６５５（Ｆ−ラムダ−ｉｌｖＧ−ｒｆｂ−５０ｒｐｈ−１）は遺伝子破壊突然変異体を作成するための野生型として使用した。菌株ΔｇｌｄＡ、ΔｄｈａＫＬＭ及びΔｆｄｈＦはＭＧ１６５５及びＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）の両方において構築した。多重遺伝子破壊はＰ１ファージトランスダクションの使用を介して単一突然変異を組み合わせることにより達成した。各突然変異はカナマイシンカセットを除去した後に１回１つ菌株に加えた。
【００４１】
プラスミドｐＺＳＫＬＭ（Ｅ．ｃｏｌｉＤＨＡキナーゼサブユニットＤｈａＫＬＭを発現する）及びｐＺＳＫＬｃｆ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉＤＨＡキナーゼサブユニットＤｈａＫＬを発現する）はＤｒ．Ｂ．Ｅｒｎｉ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ
Ｂｅｒｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ（Ｂａｃｈｌｅｒ等、２００５）から供与された。酵素ＤＨＡＫ及びＧｌｄＡを発現するプラスミドｐＺＳＫＬＭ＿ｇｌｄＡは以下の通り構築した。ｇｌｄＡ遺伝子の完全なオープンリーディングフレームをそのリボソーム結合部位とともにＰＣＲ増幅した。ＰｓｔＩ及びＭｌｕＩ部位は、プライマーを介してＰＣＲ産物の両端に導入することにより、プラスミドｐＳＺＫＬＭ中のｄｈａＫＬＭオペロンの下流にｇｌｄＡ遺伝子をクローニングし易くした。プラスミド及びＰＣＲ産物の両方をＰｓｔＩ及びＭｌｕＩで消化し、ライゲーションし、ＤＨ５α中に形質転換し、そして陽性コロニーを得るためのスクリーニングを行った。プラスミドの良好な構築は、ＰＣＲを介して、そしてコードされた酵素の活性の特性化により確認した。プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ菌株に形質転換し、適切な抗生物質を補充したＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）上で選択した。
【００４２】
標準的な組み換えＤＮＡ手法を用いて、クローニング、プラスミド単離、ファージＰ１トランスダクション、エレクトロポレーション、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９）。菌株は３２．５％グリセロール保存用液中−８０℃に維持した。プレートは１．５％寒天を含有するＬＢ培地を用いて作成した。抗生物質及びインデューサーを以下の濃度、即ち１００μｇ／ｍｌアンピシリン、３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、及び１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン、０．００１〜０．１ｍＭＩＰＴＧ及び１００ｎｇ／ｍｌアンヒドロテトラサイクリンにおいて、適宜、含有させた。
【００４３】
特段の記載が無い限り、０．０３〜０．２％トリプトン、５μＭセレナイト、及び１．３２ｍＭＮａ２ＨＰＯ４をＫ２ＨＰＯ４の代わりに補充したＮｅｉｄｈａｒｄｔ等（１９７４）により考案された最少培地（ＭＭ）を使用した。ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）自体のみを試験管中で実施した実験（後述）において、又はトリプトン補充を行わなかった実験において、含有させた。指定に応じて、培地には特定の濃度の以下の化合物、即ち、１塩基性及び２塩基性のナトリウム及びカリウムのリン酸塩、１塩基性及び２塩基性のリン酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、Ｌ−アミノ酸、ヌクレオチド及びビタミンを補充した。全ての薬品は特段の記載が無い限りＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標）Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＳ）より入手した。
【００４４】
全実験は嫌気的条件下、そして特段の記載が無い限り３７℃において実施した。試験管内の実験は、培地を完全に充填された、又は連続的にアルゴンでスパージされた密封嫌気性試験管（ＨＵＮＧＡＴＥ（商標）試験管：ＢＥＬＬＣＯ ＧＬＡＳＳ（登録商標）Ｉｎｃ．ＮＪ，ＵＳＡ）中において実施した（初期ｐＨ７．２）。発酵システム及びその嫌気的条件下の作動と植菌手法は文献既知である（Ｄｈａｒｍａｄｉ等、２００６）。
【００４５】
使用の前において、保存培養物（−８０℃においてグリセロール保存株として保存）をＬＢプレートに画線し、ＣＯ２ガス発生キット（ＯＸＯＩＤ（登録商標）Ｌｔｄ．Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いながらＯＸＯＩＤ（商標）嫌気性ジャー中において３７℃で一夜インキュベートした。単一のコロニーを用いて培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物及び５ｇ／Ｌグリセロールを補充したＭＭ）を完全に充填した１７．５ｍＬ容のＨＵＮＧＡＴＥ（商標）試験管に植菌した。試験管を３７℃において〜０．４のＯＤ５５０に到達するまでインキュベートした。この活発に生育している予備培養物の適切な容量を遠心分離し、ペレットを洗浄し、そして各発酵器中培地３５０ｍＬに植菌するために使用し、その際、目標とする出発光学密度は５５０ｎｍにおいて０．０５とした。
【００４６】
発酵は６本の５００ｍｌ容の作業容量の容器を有し、温度、ｐＨおよび攪拌速度（２００ｒｐｍ）の独立した制御による、ＳＩＸＦＯＲＳ（商標）多重発酵システム（ＩＮＦＯＲＳ（登録商標）ＨＴ，Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）において実施した。システムは完全装備であり、製造元のＩＲＩＳ ＮＴソフトウエアを用いてコンピューター制御した。各容器には蒸発を防止するための凝縮器が付いており、これを０℃の冷却メタノール−水供給により作動させた。嫌気的条件は０．０１ＬＰＭにおいて超高純度アルゴン（ＭＡＴＨＥＳＯＮ ＴＲＩ−ＧＡＳ（登録商標），Ｉｎｃ．Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を用いてヘッドスペースをフラッシュすることにより維持した。酸素トラップ（ＡＬＬＴＥＣＨ ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＳ（登録商標），Ｉｎｃ．Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）を使用することによりガス流から酸素の痕跡量を除去した。滅菌性を維持するために、０．２μｍ及び０．４５μｍのＨＥＰＡフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ（登録商標），Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＣＡ）を使用してそれぞれ導入口及び排出口を固着させた。
【００４７】
光学密度は５５０ｎｍで測定し、細胞密度の尺度として使用した（１ Ｏ．Ｄ。＝０．３４ｇＤＷ／Ｌ）。遠心分離の後、上澄みを−２０℃で保存し、ＨＰＬＣ分析用とした。グリセロール、ラクテート、アセテート、ホルメート、スクシネート及びエタノールの濃度を定量するために、試料をＨＰＸ−８７Ｈ有機酸カラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ（登録商標）Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を装着したＳＨＩＭＡＤＺＵ ＰＲＯＭＩＮＥＮＣＥ ＳＩＬ２０（商標）システム（ＳＨＩＭＡＤＺＵ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ（登録商標）Ｉｎｃ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）を用いたイオンエクスクルージョンＨＰＬＣにより分析した。ピーク分離を最適化するための作動条件（移動相中３０ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、カラム温度４２℃）は予め記載された研究法を用いて測定した（Ｄｈａｒｍａｄｉ ａｎｄ Ｇｏｎｚａｌｅｚ，２００５）。水素の生産は選択された試料においてガスクロマトグラフィーを用いて測定した。水素も又（エタノール＋アセテート）とホルメートのモル量の間の差として計算した。１，２−ＰＤＯ濃度は後述する通り、そして標準物質としてテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を使用しながらＮＭＲ（核磁気共鳴）実験により測定した。
【００４８】
発酵産物の同定は１Ｄ１Ｈ（プロトン）ＮＭＲ実験により行った。６０μｌのＤ２Ｏ及び１μｌの６００ｍＭのＮＭＲ内標準ＴＳＰ（３−（トリメチルシリル）プロピオン酸−Ｄ４、ナトリウム塩）を５４０μｌの試料に添加した。次に得られた溶液を５ｍｍのＮＭＲ試験管に移し、１ＤプロトンＮＭＲスペクトル分析はＰＥＮＴＡ（商標）プローブを装着したＶＡＲＩＡＮ（登録商標）５００ＭＨｚＩＮＯＶＡ（商標）スペクトル分析器において実施した。以下のパラメーター、即ち：８，０００Ｈｚスイープ幅；２．８秒獲得時間；２５６獲得；６．３μｓパルス幅；１．２ｓパルス反復遅延；及び予備飽和２秒を使用した。得られたスペクトルをソフトウエアＦＥＬＩＸ（商標）２００１（ＡＣＣＥＬＲＹＳ ＳＯＦＴＷＡＲＥ（登録商標）Ｉｎｃ．Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を用いて分析した。ピークはその化学シフト及びＪ−カップリング値により同定し、これらは代謝産物標準物質（２ｍＭ終濃度）を用いて試料をスパイクした別個の実験により得たものである。
【００４９】
試料の別の特性化は２Ｄ１Ｈ−１ＨＣＯＳＹ（相関スペクトル分析）ＮＭＲ実験により行った。ウォーターゲート溶媒抑制による二重量子フィルターＣＯＳＹスペクトルはパルスシーケンスのＢＩＯＰＡＣＫ（商標）スイートの一部であるｗｇｄｑｆｃｏｓｙパルスシーケンスを用いて得た（ＶＡＲＩＡＮ（登録商標），Ｉｎｃ．）。以下のパラメーター、即ち：６，０００Ｈｚスイープ幅；０．５秒獲得時間；ｔ１次元において６００複合点；３２遷移；５．５μｓパルス幅；及び１秒の相対遅延、を使用した。
【００５０】
蛋白発生性のバイオマス内へのグリセロールの取り込みは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて５０％Ｕ−１３Ｃ−標識グリセロールを発酵させることにより評価した。３日（７２時間）後、試験管を採取し、発酵ブロスを遠心分離した。細胞ペレットを１回９ｇ／ＬＮａＣｌ溶液で洗浄し、再度遠心分離した。得られた細胞ペレットをＲＥＡＣＴＩ−ＴＨＥＲＭ（商標）加水分解システム（ＰＩＥＲＣＥ（登録商標）Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いながら２４時間１１０℃において６Ｎの定常煮沸ＨＣｌで加水分解した。ＨＣｌを除去するために、得られた溶液をＣＥＮＴＲＩＶＡＰ（商標）システム（ＬＡＢＣＯＮＣＯ（登録商標）Ｃｏｒｐ．Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＭＯ）を用いながら２時間真空下に７５℃で急速蒸発に付した。乾燥試料を１ｍｌのＤ２Ｏ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｍｒｉｄｇｅ，ＭＡ）中に再建し、−８０℃で凍結し、その後、２４時間４．５ＬのＦＲＥＥＺＯＮＥ（商標）凍結乾燥システム（ＬＡＢＣＯＮＣＯ（登録商標）Ｃｏｒｐ）中で凍結乾燥した。次に試料を６００μＬのＤ２Ｏ中に再建し、濾過して細胞粒子を除去した。１μＬのＴＳＰ標準物質を試料に添加し、内容物をＮＭＲ試験管に移した。１３Ｃリッチ化を測定するために、１Ｄプロトンスピンエコーを用いながら、炭素５０上の同時９０°パルスの存在下又は非存在下に分析した。炭素上の９０°パルスは１３Ｃ炭素原子を再照準し、これにより、プロトン−炭素スピンカップリングにより生じる１３Ｃサテライトを抑制できる。この現象は、１２Ｃ炭素原子では生じなかった。これらの実験に関して、本発明者等は市販のパルスシーケンスｐｗｘｃａｌを５００ＭＨｚＶａｒｉａｎＩｎｎｏｖａＴＭスペクトル分析機上で使用した。以下のパラメーター、即ち：：８，０００Ｈｚスイープ幅；２．７秒獲得時間；２５６遷移；及び２５℃でｐｗｘ１０及び９０°を使用した。個々のアミノ酸はスペクトルの化学シフト及び細密構造に基づいて同定した。
【００５１】
酵素試験を実施するために、〜０．７のＯＤ５５０の嫌気的培養物に由来する細胞を遠心分離（２分、１０，０００ × ｇ）により採取し、９ｇ／リットルのＮａＣｌで洗浄し、細胞ペレットとして−２０℃で保存した。細胞をそれぞれの緩衝液０．２ｍｌ中に再懸濁し、そしてクロロホルムと共に回転混合することにより透過性とした（Ｔａｏ等、２００１）。グリセロールデヒドロゲナーゼは５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・塩酸（ｐＨ７．６）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５００μＭ ＮＡＤ＋、１０ｍＭグリセロール、及び１０〜１００μｌの粗細胞抽出物を含有する混合物中、３４０ｎｍ及び２５℃における吸光度の変化を測定することにより試験した。ＨＡによるグリセロールデヒドロゲナーゼ活性、メチルグリオキサル還元酵素活性、アルド−ケト還元酵素活性、及び反応の一次性（蛋白濃度及び時間）を全ての調製品に関して確立した。結果はマイクロモル分−１細胞蛋白ミリグラム−１として表示し、そして少なくとも３点の細胞調製品に関して平均した。
【００５２】
細胞生育（μ）、グリセロール消費、及び生成物合成に関する特定の速度は、総細胞、グリセロール、又は生成物濃度ｖｓ細胞濃度の積分値（ＩＣＣ）をプロットし、これらの区画を多項式関数にフィットさせることにより推定した。
【００５３】
（実施例２）グリセロール発酵及び培地組成の影響
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるグリセロールの代謝は呼吸条件により限定されていると考えられるが、本発明者等は電子受容体の非存在下においてこの生物がグリセロールを代謝できることを発見している。図１は２ｇ／Ｌトリプトンを補充した培地中の野生型菌株ＭＧ１６５５に関する典型的な発酵プロファイルを示す（追加的詳細は暫定出願６０／７８８，５１２ならびに６０／８６７，５８１及びＧｏｎｚａｌｅｚ等、２００７に記載されている）。約１〜２ｇ／Ｌのグリセロールは定常期培養の培地中において未発酵状態で残存していた。エタノール、１，２−プロパンジオール（１，２−ＰＤＯ）及びコハク酸、及びギ酸は異なるＮＭＲ手法を用いた場合に発酵生成物として検出された。
【００５４】
本発明者等は次にグリセロール発酵に対する種々のパラメーターの影響を発見しようと試みた。カリウム、ホスフェート、ナトリウム、グリセロール、ＨＡ、ｐＨ及びＣＯ２は細胞生育のために典型的な方法に従って滴定した。
【００５５】
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるグリセロール代謝の以前の試験で使用した典型的な培地は高レベルのホスフェート、カリウム及びナトリウムを含有しており、その主要目的は７〜７．５に培養ｐＨを制御することであった。この培地は当初Ｔａｎａｋａ等（１９６７）により報告され、そしてその後、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるグリセロール代謝の研究において殆どの研究者らにより使用されている。本発明者等はそのようなレベルのホスフェート、カリウム、及びナトリウム（即ち３４ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４及び６４ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４）を本発明者等の培地に補充することはグリセロール発酵を高度に損なう（図２）ことを発見しており、アルカリ性ｐＨにおいて特に有害な作用であった。カリウム及びホスフェートは負の作用を担っているがナトリウムは異なっていた（図２）。本発明者等の実験におけるグリセロール消費パターンの分析によればグリセロールのかなりの量が培地中未代謝で残存しており（典型的には１０〜３０ｍＭ）、グリセロールの嫌気的発酵を制限する閾値濃度の存在を示唆していた。興味深いことに、グリセロール代謝の以前の研究も又典型的には２０〜３０ｍＭの範囲のグリセロール濃度において実施されている。本発明者等は今回、高レベルのホスフェート及びカリウム、２ｇ／Ｌのグリセロールを含有する培地を使用し、そして発酵をｐＨ７．５及び３７℃で実施する場合に、グリセロール発酵および細胞生育は完全に損なわれることを観察した（図２）。
【００５６】
総括すれば、本発明者等の結果は、グリセロール発酵に負の影響を与える条件において実験を全て実施したために、Ｅ．ｃｏｌｉを用いてグリセロールを嫌気的に発酵しようとする以前の試みが成功しなかったことを明確に示している。そのような条件は中性〜アルカリ性ｐＨ（７〜７．５）、高濃度のカリウム及びホスフェート、比較的低い濃度のグリセロール、３７℃及び封鎖容器の使用を包含する。後者は水素の蓄積及びその結果としての酸化還元バランスへの影響のためにグリセロール発酵を損なうことを本発明者等が示した条件である。
【００５７】
（実施例３）グリセロール発酵の経路及び機序
腸内細菌によるグリセロールの嫌気的発酵は、活性な１，３−ＰＤＯ経路を有する種の特権であると考えられてきた。しかしながら本発明者等は、Ｅ．ｃｏｌｉは機能する１，２−ＰＤＯ経路及びｇｌｙＤＨ−ＩＩ−ＤＨＡＫ経路が存在している限り、１，３−ＰＤＯ非依存性の態様においてグリセロールを発酵的に代謝できることを明らかにしている。
【００５８】
Ｄｈａｒｍａｄｉ等（２００６）、Ｇｏｎｚａｌｅｚ等（２００７）及び暫定出願６０／８６７，５８１及び６０／７８８，５１２（各々参照により本明細書に組み込まれる）により詳細に説明されている本発明者等の所見に基づいて、本発明者等は腸内細菌におけるグリセロール発酵のための新しいパラダイムを提案するものであり、それにおいては（ｉ）１，２−ＰＤＯ経路は細胞塊の合成の間に発生する還元性等価物を消費するための手段を提供し、これにより酸化還元のバランスの取れた条件を可能にし、そして（ｉｉ）酸化還元のバランスの取れた経路を介したエタノールの合成は、基質レベルのホスホリル化を介してＡＴＰを発生することによりエネルギーの要求性を満足する。ホルメート水素リアーゼの活性及びＦ０Ｆ１−ＡＴＰａｓｅ系も又、恐らくは細胞内ｐＨ及びＣＯ２供給の維持を支援することによりグリセロールの発酵性代謝を促進することが分かっている。解糖系中間体にグリセロールを変換する経路は２つの酵素（図３）、即ちグリセロールデヒドロゲナーゼ（ｇｌｙＤＨ）及びＤＨＡキナーゼ（ＤＨＡＫ）を含むことを示しており、前者は以前には生理学的役割が未知であった。
【００５９】
【表２】
１実験は０．２％トリプトン及び１０％グリセロールの存在下に実施した。
２ＮＧ：生育観察せず；ＮＤ：検出せず；ＳＤ：標準偏差。
３μＭ：指数生育期に計算した最大特異的生育速度（ｈ−１）。
４Ｙｘ／ｓ：消費されたグリセロール当たりの菌体塊の増大として計算した生育収率（ｍｇ細胞／ｇグリセロール）。
５１，２−ＰＤＯの合成は記載した通りＮＭＲで識別した。
【００６０】
菌株ＭＧ１６５５がグリセロールを発酵できるという本発明者等の所見は、他の被験菌株（Ｗ３１１０、ＭＣ４１００及びＥ．ｃｏｌｉＢ）も又グリセロールを発酵できたため、Ｅ．ｃｏｌｉの主に一般的な特性である（表２）。２つの他のｇｌｙＤＨ類、即ちｇｌｙＤＨ−ＩＩＩ及びｇｌｙＤＨ−ＩＶはエンテロバクターのメンバーにおいて発見されているため、本発明者等はグリセロールの嫌気的発酵におけるそれらの関与を検討した。やはりＥ．ｃｏｌｉのようにｇｌｙＤＨ−ＩＩ（２）保有しているエンテロバクター・クロアカエＮＣＤＣ２７９−５６はグリセロールを発酵することができた（表２）。酵母サッカロマイセス・セレビシアエを用いた本発明者等の予備的結果は、同様の経路がこの生物におけるグリセロール発酵を支援していることを示していると考えられた。
【００６１】
上記経路はグリセロール発酵に対するｐＨ及びカリウム、ホスフェート及びグリセロールの濃度の観察された作用を説明するためのフレームワークを与える（暫定出願６０／８６７，５８１の実施例２及びＧｏｎｚａｌｅｚ等、２００７参照）。例えば高レベルのホスフェートはＤＨＡ及びＨＡ（上記した経路の２つの重要な中間体）の両方の分解を増進し、そしてＧｌｄＡの活性及びＨＡによるその誘導性に負の影響をもたらす。更に又、１，２−ＰＤＯ合成を担っている重要な酵素であるＭＧシンターゼは高ホスフェートレベルにより抑制される。高濃度のカリウムは１，２−ＰＤＯ合成における重要な中間体であるＭＧの毒性を増大させる。グリセロールに対するＧｌｄＡの低い親和性［Ｋｍが３〜４０ｍＭ］はその発酵代謝のために高濃度のグリセロールが必要であること、及び、１０〜３０ｍＭグリセロールが未代謝のまま培地中に残存していたという本発明者等の観察結果の両方を説明している。
【００６２】
グリセロール発酵に対するｐＨの影響は又、上記した経路に対するその影響にも関連している（暫定出願６０／８６７，５８１の実施例２及びＧｏｎｚａｌｅｚ等、２００７参照）。ＧｌｄＡは強力なｐＨ依存性と、より高い高アルカリ性ｐＨでの酸化活性及び中性〜アルカリ性条件での還元活性を示す。酸性条件はｇｌｙＤＨの活性のみならず、１，２−ＰＤＯの合成に必要なＭＧ還元活性も低減する。一方でアルカリ性条件は１，２−ＰＤＯの合成における重要な中間体であるＭＧの毒性を増大させる。明らかに、細胞内ｐＨは重要な酵素の低活性及びＭＧの毒性を回避するために慎重に制御する必要がある。例えば、６．３の細胞外ｐＨは明らかにＭＧ毒性を防止するが、ｇｌｙＤＨ及びＭＧＲ／ＡＫＲ活性を可能にするレベルより低値までｐＨが低下することを防止するためのシステムを、細胞はなお必要としている。ギ酸からＣＯ２及びＨ２への変換により、ＦＨＬシステムは細胞質の酸性化を防止することが知られており、これはなぜＦＨＬが酸性条件におけるグリセロール発酵のために必要であるかを説明している。しかしなおＦＨＬの活性は、蓄積すればグリセロール発酵に負の影響を与える過剰な水素を発生する場合がある。アルカリ性条件において、Ｆ０Ｆ１−ＡＴＰａｓｅ系は細胞質のアルカリ性化を防止するため、即ちＭＧ毒性を回避するために必要となる。
【００６３】
（実施例４）工業用培地中のグリセロール発酵の生産性及び実現性の向上
グリセロール発酵の向上のための本発明者等の所見の意義を明らかにするために、本発明者等は野生型菌株ＭＧ１６５５における発見された主幹経路（ＧｌｄＡ−ＤＨＡＫ）を過剰発現させ、そして細胞生育及びグリセロール発酵の両方において２倍超の増大を観察した。ＧｌｄＡ−ＤＨＡＫ経路の増幅はプラスミドｐＺＳｄｈａＫＬＭ＿ｇｌｄＡでＭＧ１６５５を形質転換することにより達成した。生産性を更に向上させるためにはＧｌｄＡ−ＤＨＡＫ経路と共に解糖系酵素（例えばトリオース−ホスフェートイソメラーゼ）の一致した過剰発現が必要であると考えられる。更に又、培地、培養系及び作動様式を更に最適化することを包含する幾つかのプロセス系の改良が実施中である。
【００６４】
工業レベルでグリセロール発酵を適用することはバイオディーゼルの製造の間に誘導されるグリセロールの使用を必要とする。本発明者等はＭＧ１６５５を純粋なグリセロール及びＦｕｔｕｒｅＦｕｒｅｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙにより運転されているバイオディーゼル工場から得られたグリセロールの２試料上で培養したところ、同様の細胞生育及びグリセロール発酵を観察しており：培養４８時間の後、細胞は４（純粋）、３．９（精製）及び３．８（粗製）ｇ／Ｌのグリセロールを発酵しており、そして１．２（純粋）、０．９６（精製）及び０．９８（粗製）の光学密度に達していた。
【００６５】
経費効率的な工業用補充物でトリプトン補充物を置き換えることが、商業的成功のための別の重要な要因である。しかしながら、本発明者等はコーンスチープリカー（工業用発酵で使用されている安価な補充物）による培地補充がトリプトン補充で観察されたものと同様のレベルにグリセロール発酵を支援することを既に明らかにしている（Ｄｈａｒｍａｄｉ等、２００６）。
【００６６】
本発明者等は又、補充物を含まない最少培地中で生育することができるＭＧ１６５５突然変異体も入手した（０．３６のＯＤ５５０であり、８．１ｇ／Ｌのグリセロールが発酵された）。これらの突然変異体は漸減量のＨＡ又はトリプトンを含有する培地中でグリセロールを発酵することができる菌株の選択を多数回行うことにより作成した。
【００６７】
（実施例５）：グリセロールからの生成物
本発明者等は又炭素源としてのグリセロール及び上記した培地を用いた生成物形成の例示的呈示を行った。例えば、本発明者等は図４に示すエタノールの生産を示している。本発明者等の結果は、僅かな遺伝子的及び環境的な改変により、Ｅ．ｃｏｌｉがエタノールとＨ２−ＣＯ２（ｐＨ６．３）又はエタノールとギ酸（ｐＨ７．５及びＦＨＬ系の破壊）の何れかへのグリセロールの変換のための良好な生体触媒となることを示している。糖類の発酵を介したエタノールの生産は、対照的に、Ｈ２やギ酸の同時生成の可能性を全く与えず、従って低効率のプロセスとなっている。エタノールとＨ２及びエタノールとギ酸の収率を更に向上させることは、スクシネート及びアセテート経路を排除することによりもたらされることになる（ｆｒｄＡ及びｐｔａ突然変異：Ｇｏｎｚａｌｅｚ等、２００７及び暫定出願６０／８６７，５８１）。生産性及び工業用培地の使用における向上は実施例４において上記した通りである。
【００６８】
別の例はコハク酸であり、その糖類からの生産は還元性等価物の利用性により限定されている。幸運なことに、グリセロールからのその合成は酸化還元バランスの取れた経路を介して可能となる。しかしながら、グリセロールからのスクシネートの極めて低い生産がＭＧ１６５５を用いた本発明者等の実験では観察されており、ＰＥＰ依存性ＧｌｄＡ−ＤＨＡＫ経路を介してグリセロールが異化される結果である（即ち低ＰＥＰ利用性）。適切なｐＨ及びＣＯ２濃度を用いながら、Ｅ．ｃｏｌｉＰＥＰ依存性ＤＨＡＫをＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉＡＴＰ依存性ＤＨＡＫに置き換えることにより、本発明者等は上記した培地を用いた場合にスクシネート収率のほぼ１０倍増加を達成している（図４）。スクシネート収率を更に向上させることはエタノール及びアセテート経路の排除からもたらされることになる（ａｄｈＥ及びｐｔａ突然変異：Ｇｏｎｚａｌｅｚ等、２００７及び暫定出願６０／８６７，５８１）。生産性及び工業用培地の使用における向上は、Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉＡＴＰ−依存性ＤＨＡＫがネイティブのＤＨＡＫの代わりに過剰発現されることになることを除き、実施例４において上記した通りである。コハク酸経路をエネルギー的により望ましいものとするために、本発明者等はＥ．ｃｏｌｉのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ、遺伝子ｐｐｃによりコードされる）及びホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）の過剰発現をＥ．ｃｏｌｉ（ｐｃｋＡ）、アクチノバチルス・スクシノゲネス（ｐｃｋＡ）又は酵素データベースＢＲＥＮＤＡに記載されている他の微生物から排除しているところである（Ｓｃｈｏｍｂｕｒｇ等、２００４）。スクシネート経路を介したより高いエネルギー生産（ＰＥＰＣと異なり、ＰＥＰＣＫはＡＴＰを形成する）はより高値の生産性及び収率の両方をもたらすはずである。
【００６９】
自身の合成がグリセロールにおける炭素の高度に還元された状態から利益を被る別の生成物は１，２−ＰＤＯである。ＧｌｄＡ−ＤＨＡＫ経路の増幅は上昇した生産性をもたらすのみならず、１，２−ＰＤＯの合成におけるほぼ２０倍の増大ももたらし：ＭＧ１６５５はわずか０．０２６ｍＭの１，２−ＰＤＯのみ生産していたのに対し、組み換え菌株ＭＧ１６５５（ｐＺＳｄｈａＫＬＭ＿ｇｌｄＡ）はこの生成物０．５１ｍＭを蓄積していた。これらの結果は、恐らくは１，２−ＰＤＯの合成におけるＧｌｄＡの関与によるものである（Ｇｏｎｚａｌｅｚ等、２００７）。
【００７０】
本発明者等は今回、下記の通りグリセロールから高レベルの１，２−ＰＤＯを生産するための数種の方策を追求している。
（１）Ｅ．ｃｏｌｉのネイティブのＰＥＰ依存性ＤＨＡＫ（ｄｈａＫＬＭ）をＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉのＡＴＰ依存性ＤＨＡＫ（ｄｈａＫＬサブユニット）と置き換えること、および、ネイティブのグリセロールデヒドロゲナーゼ（ｇｌｄＡ）と並行したその過剰発現。（２）ＤＨＡＰから１，２−ＰＤＯへの変換に全て関与している酵素メチルグリオキサルシンターゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ及びメチルグリオキサル還元酵素の過剰発現（Ｇｏｎｚａｌｅｚ等、２００７及び暫定出願６０／８６７，５８１）。
（３）トランスヒドロゲナーゼの過剰発現を介したＮＡＤＨからＮＡＤＰＨへの変換を向上させること、又はグリセロールデヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−Ｐデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ等を包含する中心的代謝経路における酵素のコファクター特異性を操作することにより、ＤＨＡＰから１，２−ＰＤＯの変換を駆動するためのＮＡＤＰＨの利用性を増大させること等。或いは、自身のネイティブの形態においてはコファクターとしてＮＡＤＰを使用するこれらの酵素の変異を他の生物からクローニングしてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させることができる。
（４）１工程におけるＨＡへのグリセロールの変換のためのグリセロールデヒドラターゼ（ＧＤ、天然にはグリセロールを３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに変換することによりこれを脱水する）の操作。次に本発明者等が既に培地に初期より存在するＨＡを化学量論的に１，２−ＰＤＯに変換した実験において明らかにした通り、ＨＡをＥ．ｃｏｌｉにおいてＧｌｄＡ又は他の酵素により１，２−ＰＤＯに変換する（暫定出願６０／８６７，５８１）。この経路は中間体としてのメチルグリオキサル（極めて毒性の生成物）を回避することになり、そしてＡＴＰが消費されないために１，２−ＰＤＯへのグリセロールの最もエネルギー効率的な経路となり、収率を顕著に増大させる。操作されたＧＤは他のＧＤとは異なり活性のために補酵素Ｂ１２を必要としないＣ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ＧＤ（ｄｈａＢＩ）を突然変異誘発することにより得られる。本発明者等は又、グリセロールをＨＡに変換できるネイティブの微生物ＧＤを得るために検索を実施中である。発見されればこの活性はＥ．ｃｏｌｉにクローニングされ、発現されることになる。
（５）化学的（グリセロールからＨＡ）及び生物学的（ＨＡから１，２−ＰＤＯ）な方策を組み合わせる。グリセロールからＨＡへの脱水は固体触媒、中程度の温度（〜２００℃）及び大気圧を使用するプロセスを用いて効率的に達成されている（Ｃｒａｂｔｒｅｅ等、２００６）。生成物はＨＡと水のみである。本発明者等はグリセロールを含有する培地中のＥ．ｃｏｌｉによるＨＡから１，２−ＰＤＯへの効率的変換を明らかにしている（Ｇｏｎｚａｌｅｚ等、２００７及び暫定出願６０／８６７，５８１）。消費されるグリセロールの量は最小限であり、ＨＡから１，２−ＰＤＯへの化学量論的変換は極めて短時間の発酵により達成される。
【００７１】
上記及び図４及び５に示した結果はグリセロールからの燃料及び還元された化学物質の生産のためのプラットホームを開発することの実現性を明確に示している。グリセロール発酵経由の生産が好都合である他の生成物は、プロパノールアミド、プロピオン酸、ブタノール等を包含する（Ｇｏｎｚａｌｅｚ等、２００７）。これらのプロセスは真のバイオリファイナリーの実施を可能にし、そしてその経済面を大きく向上させることによりバイオ燃料産業に革命をもたらすと考えられる。
【００７２】
（参考文献）
全ての参考文献は読者の都合のために掲示している。各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【００７３】
【数１】
【技術分野】
【０００１】
（先の関連出願）
本願は、先願の２００６年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６０／７８８，５１２号、および２００６年１１月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／８６７，５８１号に対する優先権を主張する。これらは双方とも、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【０００２】
（連邦財政支援研究に関する陳述）
本発明は政府基金により部分的に財政支援されており、合衆国政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
（マイクロフィッシュ付録の参照）
適用せず。
【０００４】
（技術分野）
本発明はグリセロール基質上で発酵的に（即ち電子受容体の非存在下）生育させるための細菌に対する適切な培養条件の開発に関する。本発明はグリセロールをより高い価値の生成物、例えばエタノール、水素、ホルメート、スクシネート、及び１，２−プロパンジオールに変換することができる方法及び菌株の開発のために特に使用される。
【背景技術】
【０００５】
大量のグリセロールはバイオディーゼル生産における副産物として生産され、グリセロールの生産は、バイオディーゼル生産における著しい世界成長により、増え続けると予測されている。グリセロールの現在の過剰は既に過去２年間で約１０倍の価格低下をもたらしている。
【０００６】
従って粗製のグリセロールは部分的にはその低コストのために発酵プロセスのための興味深い炭素源となっている。グリセロールは豊富に存在するのみならず、セルロース性の糖類と比較した場合のより高度に還元されたその状態は、還元性の同等品の易入手性により糖類からの生産が制限されている化学物質の生成物収率を顕著に増大させる可能性が高い。グリセロールにおける炭素のより高度に還元された状態を利用することは、嫌気的発酵の使用を必要とする（即ち、そうしなければ、電子受容体が所望の生成物、例えば燃料又は還元された化合物に「付着する」代わりに電子を「獲得する」ことになる）。しかしながら、発酵プロセスにおける炭素源としてのグリセロールの潜在的使用は、外部の電子受容体の非存在下にグリセロールを発酵することがエシェリシア・コリ（近代バイオテクノロジーの担い手）のような工業用微生物には不可能であることにより、阻止されている。グリセロールを発酵する能力は極少ない生物に限定されており、その大部分は病原性、厳密な嫌気的条件の必要性、生理学的情報およびその修飾のための遺伝子的ツールの欠如、及び高い栄養必要性のために工業的用途には順応させることができない。
【０００７】
グリセロールはジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）を形成する酵素グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＧｌｄＡ、ｇｌｄＡによりコードされる）により直接酸化されることができる。しかしながらＩＩ型グリセロールデヒドロゲナーゼ（ｇｌｙＤＨ−ＩＩ）として特徴づけられるＧｌｄＡは隠蔽性であるか、又は野性型Ｅ．ｃｏｌｉ菌株においては発現されないと考えられる。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＧｌｄＡの活性化はｇｌｐＫ、ｇｌｐＲ、及びｇｌｐＤの活性化、その後の突然変異誘発及び選択操作法を必要としており、これによりグリセロールを代謝するその能力を回復した突然変異体菌株が得られている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。しかしながら、その突然変異体の菌株においてさえも、ＧｌｄＡはグリセロールを発酵的に代謝する能力をＥ．ｃｏｌｉに与えていない（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊｉｎ，Ｒ．Ｚ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．１９：４２９−４３６（１９８３）
【非特許文献２】Ｔａｎｇ，Ｊ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５２：１１６９−１１７４（１９８２）
【非特許文献３】Ｔａｎｇ，Ｊ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５２：１００１−１００７（１９８２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
当該分野で必要とされているものは、安価なグリセロールの世界的過剰を他の供給原料化学物質に生体変換する方法である。方法は、グリセロールにおける炭素のより還元された状態を利用することを嫌気的発酵に基づくものとすれば、特に好都合となる。嫌気的プロセスは、それと相対する好気的プロセスがより高い資本投資を必要とし、より高い運転コストを要することから、コスト有利性もたらすことになる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の開示）
本発明者等はＥ．ｃｏｌｉが実際は特定の条件下で電子受容体非存在下にグリセロールを発酵できることを発見した。本発明者等の所見はＥ．ｃｏｌｉおよび他の腸内細菌におけるグリセロール発酵の新しいパラダイムを提示するものであり、そして低価値の粗グリセロールを高価値の薬品及び燃料に変換する微生物プラットホームの開発を可能にすることになる。
【００１１】
ｐＨ、ＣＯ２濃度、グリセロール濃度、カリウム濃度、ホスフェート濃度及びヒドロキシアセトン（ＨＡ）濃度をコントロールすることにより所望の化学的前駆体へのグリセロールの発酵的代謝を可能にするグリセロール発酵方法を記載する。
【００１２】
向上したグリセロール発酵はｐＨがほぼ中性か弱酸性の場合に得られる。好ましい実施形態においては、ｐＨは５．５〜７．５であり、より好ましくはｐＨは６．０〜６．５であり、最も好ましい実施形態においてはｐＨは約６．３である。
【００１３】
ＣＯ２濃度は必然的にｐＨに連結しており、そしてｐＨが上昇するにつれＣＯ２は重炭酸、ＨＣＯ３−に変換されるために低下する。ＣＯ２を２０〜３０％上昇させることにより７．０を超える上昇ｐＨの負の作用を低減することができる。向上したグリセロール発酵はｐＨ６．３及び１０％ＣＯ２、ｐＨ７．５及び２０％ＣＯ２の場合に観察されている。より高い濃度のＣＯ２も有利である。
【００１４】
グリセロール中の炭素の高度に還元された状態のため、酸化還元バランスを維持することは、細胞塊へのグリセロールの取り込みは還元性等価物の実質的発生をもたらすため、極めて「デリケート」なこととなる。Ｈ２は数種の反応（例えばフマレート還元酵素）においては電子供与体として作用し、これにより酸化還元バランスを相殺する。Ｈ２濃度が低下すればこれは起こらず、そしてグリセロール発酵は最適に進行する。ヘッドスペースを増大させることにより、Ｈ２は希釈され、そしてグリセロール発酵は向上している。ヘッドスペースを不活性ガス又はＣＯ２でフラッシュすることにより過剰なＨ２が除去され、グリセロール発酵が更に増進される。培地を通してガスでスパージ又はバブリングすることにより、大部分のＨ２は除去され、最良のグリセロール発酵条件がもたらされている。
【００１５】
向上したグリセロール発酵はグリセロールの供給濃度が高値、例えば５又は１０ｇ／Ｌ超、又は更に高値（２５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ）である場合に達成できる。好ましい実施形態においてはグリセロール濃度は１００ｇ／Ｌ超である。
【００１６】
向上したグリセロール発酵は低カリウム及び低ホスフェート濃度で達成できる。カリウム濃度は好ましくは１０ｍＭ未満、より好ましくは５又は２ｍＭ未満、そして最も好ましくは０．６ｍＭ未満となっている。ホスフェート濃度は好ましくは５０ｍＭ未満、より好ましくは２５又は１０ｍＭ未満となっている。より好ましくは５ｍＭ未満、最も好ましくは１．３ｍＭ未満である。低ホスフェート及びカリウムはグリセロールデヒドロゲナーゼ−ジヒドロキシアセトンキナーゼ及び１，２−ＰＤＯ経路の作動に好都合であり、後者が酸化還元バランスのとれた条件を可能にする。
【００１７】
ＨＡ（少なくとも１０、２０、又は３０ｍＭ）を培地に補充することが培養条件を更に向上させている。トリプトン補充は培地にＨＡを補充している場合は必要ではなかった。
【００１８】
１つの実施形態においては、グリセロール発酵は、Ｅ．ｃｏｌｉを１０ｇ／Ｌグリセロール、ｐＨ６．３、０．６ｍＭカリウム、及び１．３ｍＭホスフェートと共に、３７℃においてＣＯ２、Ａｒ又はＮ２をスパージしながら培養することにより最適化された。
【００１９】
他の実施形態においては、本発明は炭素源としてグリセロールを用いたスクシネート、エタノール、ホルメートまたは、水素および１，２−ＰＤＯといった所望の最終生成物の合成のような特定の用途のために使用できる。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
グリセロールが生成物に変換されるような嫌気的条件下で培地中細菌細胞を培養することを含む、グリセロールを嫌気的に発酵させることにより生成物を製造するための方法であって、
ここで該細菌細胞は機能的１，３−プロパンジオール経路を欠いているが、機能的１，２−プロパンジオール経路、機能的ＩＩ型グリセロールデヒドロゲナーゼ−ジヒドロキシアセトンキナーゼ経路、及び機能的Ｆ０Ｆ１−ＡＴＰａｓｅ経路を有しており、
ここで該培地は炭素源としての少なくとも１０ｇ／Ｌグリセロール、１０ｍＭ未満のカリウム、５０ｍＭ未満のホスフェート、１０％以上のＣＯ２、及び５．０と７．５との間のｐＨを含む、方法。
（項目２）
上記培地にヒドロキシアセトン（ＨＡ）を補充するがトリプトンは補充しない項目１に記載の方法。
（項目３）
上記培地に３０ｍＭ ＨＡを補充する項目１に記載の方法。
（項目４）
上記培地のｐＨが６．５以下の場合に細菌細胞が機能的ＦＨＬ経路も有する項目１に記載の方法。
（項目５）
上記ｐＨが約７．５の場合にＣＯ２が少なくとも２０％である項目１に記載の方法。
（項目６）
上記培地が２ｍＭ以下のカリウム及び１０ｍＭ以下のホスフェートを有する項目１に記載の方法。
（項目７）
上記培地が１ｍＭ以下のカリウム及び５ｍＭ以下のホスフェートを有する項目１に記載の方法。
（項目８）
上記生成物がエタノール、コハク酸、ギ酸、水素、１，２−ＰＤＯ、プロパノールアミド、プロピオン酸、及びブタノールよりなる群から選択される項目１に記載の方法。
（項目９）
上記培地が１ｍＭ以下のカリウム及び２ｍＭ以下のホスフェートを有する項目８に記載の方法。
（項目１０）
上記ｐＨが約６．３であり、そして上記培地が不活性ガスでスパージされており、そして上記生成物がエタノール及び水素である項目９に記載の方法。
（項目１１）
ネイティブのグリセロールデヒドロゲナーゼ−ジヒドロキシアセトンキナーゼ経路が過剰発現され、ｐｔａ及びｆｒｄＡが不活性化され、上記グリセロールが粗製のグリセロールであり、そして上記培地が更にコーンスチープリカーを含むがトリプトンを含まない項目１０に記載の方法。
（項目１２）
上記細菌細胞が機能的ＦＨＬ酵素を欠いており、上記ｐＨが約７であり、そして上記培地が不活性ガスでスパージされ、そして上記生成物がエタノール及びホルメートである項目９に記載の方法。
（項目１３）
ネイティブのグリセロールデヒドロゲナーゼ−ジヒドロキシアセトンキナーゼ経路が過剰発現され、ｐｔａ及びｆｒｄＡが不活性化され、上記グリセロールが粗製のグリセロールであり、そして上記培地が更にコーンスチープリカーを含むがトリプトンを含まない項目１２に記載の方法。
（項目１４）
上記細菌細胞がネイティブのジヒドロキシアセトンキナーゼを欠いており、そしてＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ由来のジヒドロキシアセトンキナーゼを発現し、そして上記生成物がスクシネートである項目９に記載の方法。
（項目１５）
上記培地が１０〜２０％ＣＯ２を含み、そして上記ｐＨが６〜７．５である項目１４に記載の方法。
（項目１６）
ネイティブのグリセロールデヒドロゲナーゼ及びＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉジヒドロキシアセトンキナーゼが過剰発現され、ネイティブのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが不活性化され、Ｅ．ｃｏｌｉ又はＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼが過剰発現され、ｐｔａ及びａｄｈＥが不活性化され、上記グリセロールが粗製のグリセロールであり、そして上記培地が更にコーンスチープリカーを含む項目１５に記載の方法。
（項目１７）
ネイティブのグリセロールデヒドロゲナーゼ及びジヒドロキシアセトンキナーゼが過剰発現され、そして上記生成物が１，２−ＰＤＯである項目９に記載の方法。
（項目１８）
上記ネイティブのジヒドロキシアセトンキナーゼがＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉジヒドロキシアセトンキナーゼにより置き換えられ、そして酵素メチルグリオキサルシンターゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、及びメチルグリオキサル還元酵素が全て過剰発現される項目１７に記載の方法。
（項目１９）
グリセロールをヒドロキシアセトンに変換することができる操作された、又は天然に存在するグリセロールデヒドラターゼが過剰発現される項目１７に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】２ｇ／Ｌトリプトンを補充した最少培地（ＭＭ）中のＥ．ｃｏｌｉＭＧ１６５５によるグリセロール発酵である。細胞生育（▲）、グリセロール消費（■）、及びエタノールの蓄積（●）、スクシネート（◆）及びホルメート＋アセテート（＊）。
【図２】Ｎａ＋、Ｋ＋、ＰＯ４３−、及びグリセロールの濃度の影響を示す。Ｎａ＋（３４ｍＭ）、Ｋ＋（１２８ｍＭ）及びＰＯ４３−（９８ｍＭ）を記載の通り培地に添加した。特段の記載が無い限り、実験はｐＨ７．５、３７℃、１０ｇ／Ｌグリセロール、２ｇ／Ｌトリプトンを用いてアルゴンでヘッドスペースをフラッシュしながら実施した。グリセロール発酵（直線）及び細胞生育（棒グラフ）を示す。棒グラフの色はｐＨ６．３（灰色）又は７．５（白）である。
【図３】Ｅ．ｃｏｌｉ及びＩＩ型ｇｌｙＤＨを保有する他の腸内細菌におけるグリセロール発酵に関する新しいパラダイムを示す。Ｅ．ｃｏｌｉにおける解糖系中間体ＤＨＡＰへのグリセロールの変換のための提案される経路は酵素ＧｌｄＡ及びＤＨＡＫを包含する。
【図４】グリセロール発酵の間のエタノール（直線）−Ｈ２（黒棒グラフ）及びエタノール（直線）−ギ酸（白棒グラフ）の同時生産を示す。（Ｉ）ＭＧ１６５５：ｐＨ６．３、アルゴン；（ＩＩ）ΔｈｙｃＢ：ｐＨ７．５、アルゴン。ＨｙｃＢはＦＨＬ系の必要性分である。
【図５】グリセロールからのコハク酸の生産を示す。（Ｉ）ＭＧ１６５５：ｐＨ６．３、アルゴン；（ＩＩ）ＭＧ１６５５：ｐＨ６．３、１０％ＣＯ２、（ＩＩＩ）ＭＧ１６５５：ｐＨ７．５、２０％ＣＯ２；及び（ＩＶ） ΔｄｈａＫＬＭ（ｐＺＳＫＬｃｆ）：ｐＨ７．５、２０％ＣＯ２。プラスミドｐＺＳＫＬｃｆはＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉのＤＨＡキナーゼサブユニットＤｈａＫＬを発現する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は有用な化合物を製造するために細菌を用いてグリセロールを発酵する新規な方法を提供する。
【００２２】
「隠蔽」遺伝子とは発現されないものであるか、又は遺伝子発現のための条件が未知の場合を指す。
【００２３】
「不均衡化する」とは酸化及び還元することである。
【００２４】
「破壊」及び「破壊株」という用語は本明細書においては、ネイティブの遺伝子又はプロモーターが、それによりコードされる酵素の活性を低下させるような態様において突然変異、欠失、中断又はダウンレギュレートされている細胞株を指す。遺伝子は全ゲノムＤＮＡ配列のノックアウト又は除去により完全（１００％）に低減される。フレームシフト突然変異、早期停止コドン、重要な残基の点突然変異、又は欠失又は挿入等の使用は、活性蛋白の転写及び／又は翻訳を完全に防止することにより遺伝子産物を完全に不活性化（１００％）できる。
【００２５】
「異化作用」とは生物が物質を排出化合物に変換する代謝プロセスである。
【００２６】
「外因性」という用語は蛋白又は核酸が起源の種に関わらず生物又は系の外部から導入された非ネイティブの分子であることを示す。例えば、外因性ペプチドは細胞培養物に適用してよく；外因性ＲＮＡは細胞内にトランスフェクトされた組み換えＤＮＡから発現されてよく；又は、ネイティブ遺伝子は外因性の調節配列の制御下にあってよい。
【００２７】
「発酵」とは、外部の電子受容体の完全な非存在下における炭素源の代謝又は異化を意味する。
【００２８】
「機能的１，２−プロパンジオール経路」とは、１種以上の異なる経路により１，２−ＰＤＯを生成するために必要な遺伝子（及びこれによる酵素）を細菌が機能的に発現することを意味する。例えば機能的ｍｇｓＡ（メチルグリオキサルシンターゼ：ＭＧＳ）、ｙｅａＥ、ｙｇｈＺおよびｙａｆＢ遺伝子（アルド−ケト還元酵素：ＡＫＲ）、ｇｌｄＡ（グリセロールデヒドロゲナーゼ、ＧｌｄＡ）が各々必要である。重要な区別は所定の生物は特定の経路の遺伝子／酵素を有するが、経路は隠蔽性である点である。
【００２９】
「機能的ＩＩ型グリセロールデヒドロゲナーゼ−ジヒドロキシアセトンキナーゼ経路」とは、細菌が外部電子受容体の非存在下にグリセロールからＤＨＡホスフェート（ＤＨＡＰ）を生成するために必要な酵素を有しており、これはグリセロールをＤＨＡにそしてＤＨＡＰに変換することにより行われることを意味している。例えば、細菌はＧｌｄＡ（ｇｌｄＡ）及びＤＨＡキナーゼ（ＤＨＡＫ：ｄｈａＫＬＭ）を有さなければならない。
【００３０】
「機能的Ｆ０Ｆ１−ＡＴＰシンターゼ経路」とは、プロトンポンプにＡＴＰ合成をカップリングするために必要な酵素のすべてを細菌が有することを意味する。例えば、細菌はａｔｐＦおよびａｔｐＤを含む機能的ａｔｐオペロンを有さなければならない。
【００３１】
「機能的ホルメート−水素リアーゼ（ＦＨＬ）経路」とは細菌がホルメートをＣＯ２及び水素に不均衡化するために必要な酵素の全てを有することを意味する。例えば活性ホルメートデヒドロゲナーゼ（例えばＦＤＨ−Ｆ：ｆｄｈＦ）及びヒドロゲナーゼ３（ｈｙｃオペロン）が挙げられる。
【００３２】
「機能的１，３−プロパンジオール経路」とは１，３−ＰＤＯを生成するために必要な遺伝子又は酵素を意味する。例えば、グリセロールデヒドラターゼ（ＧＤ）及び／又は１，３−ＰＤＯ還元酵素（１，３−ＰＤＯＲ）は機能的１，３−プロパンジオール経路を欠いている細胞においては不活性であるか、又は非存在である。
【００３３】
「グリセロール」とは参照により本明細書に組み込まれるＮＣＢＩ（商標）ＰｕｂＣｈｅｍ＃７５３及びＣＡＳＲｅｇ＃５６−８１−５に記載されている。
【００３４】
「過剰発現される」とは野生型と比較して増大した活性を有するように遺伝子（又は蛋白）が修飾されていることを意味する。これは遺伝子のより多くのコピーを細胞に加えることにより、抑制配列を欠失するように遺伝子を突然変異することにより、抑制剤を除去することにより、又は、活性が増大するように蛋白を変更すること等により、行うことができる。
【００３５】
本明細書においては、「組み換え」とは遺伝子操作された物質に関連するか、それより誘導されるか、又はそれを含有している。
【００３６】
「低減された活性」又は「不活性な」とは本明細書においては適切な対照種と比較した場合に蛋白活性が少なくとも７５％低減していることとして定義される。好ましくは、少なくとも８０、８５、９０又は９５％の活性低減が達成され、最も好ましい実施形態においては、活性は排除される（１００％）。蛋白は抑制剤を用いて、突然変異により、又は発現又は翻訳の抑制等により不活性化できる。「ヌル突然変異体」又は「ヌル突然変異」とは、蛋白活性が完全に不活性化されることを意味する。１つの例においては、目的の遺伝子を有さない対照プラスミドを挿入する。別の例においては、目的の遺伝子を組み換えにより完全に除去する。更に又、目的の遺伝子を不活性化、突然変異、又は活性を失わせるトランケーションにより除去してよい。
【００３７】
「スクシネート」及び「コハク酸」及び「ホルメート」及び「ギ酸」という用語は本明細書においては互換的に使用する。本明細書における化学物質は参照により本明細書に組み込まれるＮＡＴＩＯＮＡＬ ＬＩＢＲＡＲＹ ＯＦ ＭＥＤＩＮＩＣＥ（登録商標）ＰＵＢＣＨＥＭ（商標）データベース（ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に記載されている。細菌の代謝経路は参照により本明細書に組み込まれるＬｅｈｎｉｎｇｅｒ（１９９３）のＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第２版及び多くの他の生化学テキストに記載されている。
【００３８】
【表１】
【実施例】
【００３９】
（実施例１）材料及び方法
本明細書全体を通じて、遺伝子破壊突然変異体は以下の命名法、即ち：遺伝子１の単一の破壊についてはΔ遺伝子１、又は二重破壊についてはΔ遺伝子１Δ遺伝子２を用いて言及する。
【００４０】
野生型Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２菌株ＭＣ４１００（ＡＴＣＣ３５６９５）、Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）、野生型Ｅ．ｃｏｌｉＢ（ＡＴＣＣ１１３０３）及び腸内細菌エンテロバクター・クロアカエサブエスピークロアカエＮＣＤＣ２７９−５６（ＡＴＣＣ１３０４７）、ブチオウキセラ・アグレスチス（ＡＴＣＣ３３９９４）、セラチア・プリムチカ（ＡＴＣＣ１５９２８）及びレミノレラ・リカルジ（ＡＴＣＣ３３９９８）はＡＭＥＲＩＣＡＮ ＴＹＰＥ ＣＵＬＴＵＲＥ ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ（登録商標）より入手した。単一の突然変異体の組み換え菌株Δｐｔａ、ΔａｄｈＥ、ΔｃｙｄＡ、ΔｃｙｏＢ、ΔｆｒｄＡ、ΔｆｉｘＡ、ΔｇｌｐＡ、ΔｇｌｐＤ、ΔｍｇｓＡ、ΔｙｅａＥ、ΔｙｇｈＺ、ΔｙａｆＢ、ΔｆｕｃＯ、ΔａｔｐＦ、ΔａｔｐＤ、ΔｐｙｋＦ及びΔｈｙｃＢはＥ．ｃｏｌｉのゲノムプロジェクト（ウイスコンシン大学、Ｍａｄｉｓｏｎ，ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉｓｃ，ｅｄｕ）から入手するか、又はＤａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ（２０００）により記載された方法を用いて構築した。Ｋ１２菌株ＭＧ１６５５（Ｆ−ラムダ−ｉｌｖＧ−ｒｆｂ−５０ｒｐｈ−１）は遺伝子破壊突然変異体を作成するための野生型として使用した。菌株ΔｇｌｄＡ、ΔｄｈａＫＬＭ及びΔｆｄｈＦはＭＧ１６５５及びＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）の両方において構築した。多重遺伝子破壊はＰ１ファージトランスダクションの使用を介して単一突然変異を組み合わせることにより達成した。各突然変異はカナマイシンカセットを除去した後に１回１つ菌株に加えた。
【００４１】
プラスミドｐＺＳＫＬＭ（Ｅ．ｃｏｌｉＤＨＡキナーゼサブユニットＤｈａＫＬＭを発現する）及びｐＺＳＫＬｃｆ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉＤＨＡキナーゼサブユニットＤｈａＫＬを発現する）はＤｒ．Ｂ．Ｅｒｎｉ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ
Ｂｅｒｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ（Ｂａｃｈｌｅｒ等、２００５）から供与された。酵素ＤＨＡＫ及びＧｌｄＡを発現するプラスミドｐＺＳＫＬＭ＿ｇｌｄＡは以下の通り構築した。ｇｌｄＡ遺伝子の完全なオープンリーディングフレームをそのリボソーム結合部位とともにＰＣＲ増幅した。ＰｓｔＩ及びＭｌｕＩ部位は、プライマーを介してＰＣＲ産物の両端に導入することにより、プラスミドｐＳＺＫＬＭ中のｄｈａＫＬＭオペロンの下流にｇｌｄＡ遺伝子をクローニングし易くした。プラスミド及びＰＣＲ産物の両方をＰｓｔＩ及びＭｌｕＩで消化し、ライゲーションし、ＤＨ５α中に形質転換し、そして陽性コロニーを得るためのスクリーニングを行った。プラスミドの良好な構築は、ＰＣＲを介して、そしてコードされた酵素の活性の特性化により確認した。プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ菌株に形質転換し、適切な抗生物質を補充したＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）上で選択した。
【００４２】
標準的な組み換えＤＮＡ手法を用いて、クローニング、プラスミド単離、ファージＰ１トランスダクション、エレクトロポレーション、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９）。菌株は３２．５％グリセロール保存用液中−８０℃に維持した。プレートは１．５％寒天を含有するＬＢ培地を用いて作成した。抗生物質及びインデューサーを以下の濃度、即ち１００μｇ／ｍｌアンピシリン、３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、及び１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン、０．００１〜０．１ｍＭＩＰＴＧ及び１００ｎｇ／ｍｌアンヒドロテトラサイクリンにおいて、適宜、含有させた。
【００４３】
特段の記載が無い限り、０．０３〜０．２％トリプトン、５μＭセレナイト、及び１．３２ｍＭＮａ２ＨＰＯ４をＫ２ＨＰＯ４の代わりに補充したＮｅｉｄｈａｒｄｔ等（１９７４）により考案された最少培地（ＭＭ）を使用した。ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）自体のみを試験管中で実施した実験（後述）において、又はトリプトン補充を行わなかった実験において、含有させた。指定に応じて、培地には特定の濃度の以下の化合物、即ち、１塩基性及び２塩基性のナトリウム及びカリウムのリン酸塩、１塩基性及び２塩基性のリン酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、Ｌ−アミノ酸、ヌクレオチド及びビタミンを補充した。全ての薬品は特段の記載が無い限りＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標）Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＳ）より入手した。
【００４４】
全実験は嫌気的条件下、そして特段の記載が無い限り３７℃において実施した。試験管内の実験は、培地を完全に充填された、又は連続的にアルゴンでスパージされた密封嫌気性試験管（ＨＵＮＧＡＴＥ（商標）試験管：ＢＥＬＬＣＯ ＧＬＡＳＳ（登録商標）Ｉｎｃ．ＮＪ，ＵＳＡ）中において実施した（初期ｐＨ７．２）。発酵システム及びその嫌気的条件下の作動と植菌手法は文献既知である（Ｄｈａｒｍａｄｉ等、２００６）。
【００４５】
使用の前において、保存培養物（−８０℃においてグリセロール保存株として保存）をＬＢプレートに画線し、ＣＯ２ガス発生キット（ＯＸＯＩＤ（登録商標）Ｌｔｄ．Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いながらＯＸＯＩＤ（商標）嫌気性ジャー中において３７℃で一夜インキュベートした。単一のコロニーを用いて培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物及び５ｇ／Ｌグリセロールを補充したＭＭ）を完全に充填した１７．５ｍＬ容のＨＵＮＧＡＴＥ（商標）試験管に植菌した。試験管を３７℃において〜０．４のＯＤ５５０に到達するまでインキュベートした。この活発に生育している予備培養物の適切な容量を遠心分離し、ペレットを洗浄し、そして各発酵器中培地３５０ｍＬに植菌するために使用し、その際、目標とする出発光学密度は５５０ｎｍにおいて０．０５とした。
【００４６】
発酵は６本の５００ｍｌ容の作業容量の容器を有し、温度、ｐＨおよび攪拌速度（２００ｒｐｍ）の独立した制御による、ＳＩＸＦＯＲＳ（商標）多重発酵システム（ＩＮＦＯＲＳ（登録商標）ＨＴ，Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）において実施した。システムは完全装備であり、製造元のＩＲＩＳ ＮＴソフトウエアを用いてコンピューター制御した。各容器には蒸発を防止するための凝縮器が付いており、これを０℃の冷却メタノール−水供給により作動させた。嫌気的条件は０．０１ＬＰＭにおいて超高純度アルゴン（ＭＡＴＨＥＳＯＮ ＴＲＩ−ＧＡＳ（登録商標），Ｉｎｃ．Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を用いてヘッドスペースをフラッシュすることにより維持した。酸素トラップ（ＡＬＬＴＥＣＨ ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＳ（登録商標），Ｉｎｃ．Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）を使用することによりガス流から酸素の痕跡量を除去した。滅菌性を維持するために、０．２μｍ及び０．４５μｍのＨＥＰＡフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ（登録商標），Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＣＡ）を使用してそれぞれ導入口及び排出口を固着させた。
【００４７】
光学密度は５５０ｎｍで測定し、細胞密度の尺度として使用した（１ Ｏ．Ｄ。＝０．３４ｇＤＷ／Ｌ）。遠心分離の後、上澄みを−２０℃で保存し、ＨＰＬＣ分析用とした。グリセロール、ラクテート、アセテート、ホルメート、スクシネート及びエタノールの濃度を定量するために、試料をＨＰＸ−８７Ｈ有機酸カラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ（登録商標）Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を装着したＳＨＩＭＡＤＺＵ ＰＲＯＭＩＮＥＮＣＥ ＳＩＬ２０（商標）システム（ＳＨＩＭＡＤＺＵ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ（登録商標）Ｉｎｃ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）を用いたイオンエクスクルージョンＨＰＬＣにより分析した。ピーク分離を最適化するための作動条件（移動相中３０ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、カラム温度４２℃）は予め記載された研究法を用いて測定した（Ｄｈａｒｍａｄｉ ａｎｄ Ｇｏｎｚａｌｅｚ，２００５）。水素の生産は選択された試料においてガスクロマトグラフィーを用いて測定した。水素も又（エタノール＋アセテート）とホルメートのモル量の間の差として計算した。１，２−ＰＤＯ濃度は後述する通り、そして標準物質としてテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を使用しながらＮＭＲ（核磁気共鳴）実験により測定した。
【００４８】
発酵産物の同定は１Ｄ１Ｈ（プロトン）ＮＭＲ実験により行った。６０μｌのＤ２Ｏ及び１μｌの６００ｍＭのＮＭＲ内標準ＴＳＰ（３−（トリメチルシリル）プロピオン酸−Ｄ４、ナトリウム塩）を５４０μｌの試料に添加した。次に得られた溶液を５ｍｍのＮＭＲ試験管に移し、１ＤプロトンＮＭＲスペクトル分析はＰＥＮＴＡ（商標）プローブを装着したＶＡＲＩＡＮ（登録商標）５００ＭＨｚＩＮＯＶＡ（商標）スペクトル分析器において実施した。以下のパラメーター、即ち：８，０００Ｈｚスイープ幅；２．８秒獲得時間；２５６獲得；６．３μｓパルス幅；１．２ｓパルス反復遅延；及び予備飽和２秒を使用した。得られたスペクトルをソフトウエアＦＥＬＩＸ（商標）２００１（ＡＣＣＥＬＲＹＳ ＳＯＦＴＷＡＲＥ（登録商標）Ｉｎｃ．Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を用いて分析した。ピークはその化学シフト及びＪ−カップリング値により同定し、これらは代謝産物標準物質（２ｍＭ終濃度）を用いて試料をスパイクした別個の実験により得たものである。
【００４９】
試料の別の特性化は２Ｄ１Ｈ−１ＨＣＯＳＹ（相関スペクトル分析）ＮＭＲ実験により行った。ウォーターゲート溶媒抑制による二重量子フィルターＣＯＳＹスペクトルはパルスシーケンスのＢＩＯＰＡＣＫ（商標）スイートの一部であるｗｇｄｑｆｃｏｓｙパルスシーケンスを用いて得た（ＶＡＲＩＡＮ（登録商標），Ｉｎｃ．）。以下のパラメーター、即ち：６，０００Ｈｚスイープ幅；０．５秒獲得時間；ｔ１次元において６００複合点；３２遷移；５．５μｓパルス幅；及び１秒の相対遅延、を使用した。
【００５０】
蛋白発生性のバイオマス内へのグリセロールの取り込みは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて５０％Ｕ−１３Ｃ−標識グリセロールを発酵させることにより評価した。３日（７２時間）後、試験管を採取し、発酵ブロスを遠心分離した。細胞ペレットを１回９ｇ／ＬＮａＣｌ溶液で洗浄し、再度遠心分離した。得られた細胞ペレットをＲＥＡＣＴＩ−ＴＨＥＲＭ（商標）加水分解システム（ＰＩＥＲＣＥ（登録商標）Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いながら２４時間１１０℃において６Ｎの定常煮沸ＨＣｌで加水分解した。ＨＣｌを除去するために、得られた溶液をＣＥＮＴＲＩＶＡＰ（商標）システム（ＬＡＢＣＯＮＣＯ（登録商標）Ｃｏｒｐ．Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＭＯ）を用いながら２時間真空下に７５℃で急速蒸発に付した。乾燥試料を１ｍｌのＤ２Ｏ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｍｒｉｄｇｅ，ＭＡ）中に再建し、−８０℃で凍結し、その後、２４時間４．５ＬのＦＲＥＥＺＯＮＥ（商標）凍結乾燥システム（ＬＡＢＣＯＮＣＯ（登録商標）Ｃｏｒｐ）中で凍結乾燥した。次に試料を６００μＬのＤ２Ｏ中に再建し、濾過して細胞粒子を除去した。１μＬのＴＳＰ標準物質を試料に添加し、内容物をＮＭＲ試験管に移した。１３Ｃリッチ化を測定するために、１Ｄプロトンスピンエコーを用いながら、炭素５０上の同時９０°パルスの存在下又は非存在下に分析した。炭素上の９０°パルスは１３Ｃ炭素原子を再照準し、これにより、プロトン−炭素スピンカップリングにより生じる１３Ｃサテライトを抑制できる。この現象は、１２Ｃ炭素原子では生じなかった。これらの実験に関して、本発明者等は市販のパルスシーケンスｐｗｘｃａｌを５００ＭＨｚＶａｒｉａｎＩｎｎｏｖａＴＭスペクトル分析機上で使用した。以下のパラメーター、即ち：：８，０００Ｈｚスイープ幅；２．７秒獲得時間；２５６遷移；及び２５℃でｐｗｘ１０及び９０°を使用した。個々のアミノ酸はスペクトルの化学シフト及び細密構造に基づいて同定した。
【００５１】
酵素試験を実施するために、〜０．７のＯＤ５５０の嫌気的培養物に由来する細胞を遠心分離（２分、１０，０００ × ｇ）により採取し、９ｇ／リットルのＮａＣｌで洗浄し、細胞ペレットとして−２０℃で保存した。細胞をそれぞれの緩衝液０．２ｍｌ中に再懸濁し、そしてクロロホルムと共に回転混合することにより透過性とした（Ｔａｏ等、２００１）。グリセロールデヒドロゲナーゼは５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・塩酸（ｐＨ７．６）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５００μＭ ＮＡＤ＋、１０ｍＭグリセロール、及び１０〜１００μｌの粗細胞抽出物を含有する混合物中、３４０ｎｍ及び２５℃における吸光度の変化を測定することにより試験した。ＨＡによるグリセロールデヒドロゲナーゼ活性、メチルグリオキサル還元酵素活性、アルド−ケト還元酵素活性、及び反応の一次性（蛋白濃度及び時間）を全ての調製品に関して確立した。結果はマイクロモル分−１細胞蛋白ミリグラム−１として表示し、そして少なくとも３点の細胞調製品に関して平均した。
【００５２】
細胞生育（μ）、グリセロール消費、及び生成物合成に関する特定の速度は、総細胞、グリセロール、又は生成物濃度ｖｓ細胞濃度の積分値（ＩＣＣ）をプロットし、これらの区画を多項式関数にフィットさせることにより推定した。
【００５３】
（実施例２）グリセロール発酵及び培地組成の影響
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるグリセロールの代謝は呼吸条件により限定されていると考えられるが、本発明者等は電子受容体の非存在下においてこの生物がグリセロールを代謝できることを発見している。図１は２ｇ／Ｌトリプトンを補充した培地中の野生型菌株ＭＧ１６５５に関する典型的な発酵プロファイルを示す（追加的詳細は暫定出願６０／７８８，５１２ならびに６０／８６７，５８１及びＧｏｎｚａｌｅｚ等、２００７に記載されている）。約１〜２ｇ／Ｌのグリセロールは定常期培養の培地中において未発酵状態で残存していた。エタノール、１，２−プロパンジオール（１，２−ＰＤＯ）及びコハク酸、及びギ酸は異なるＮＭＲ手法を用いた場合に発酵生成物として検出された。
【００５４】
本発明者等は次にグリセロール発酵に対する種々のパラメーターの影響を発見しようと試みた。カリウム、ホスフェート、ナトリウム、グリセロール、ＨＡ、ｐＨ及びＣＯ２は細胞生育のために典型的な方法に従って滴定した。
【００５５】
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるグリセロール代謝の以前の試験で使用した典型的な培地は高レベルのホスフェート、カリウム及びナトリウムを含有しており、その主要目的は７〜７．５に培養ｐＨを制御することであった。この培地は当初Ｔａｎａｋａ等（１９６７）により報告され、そしてその後、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるグリセロール代謝の研究において殆どの研究者らにより使用されている。本発明者等はそのようなレベルのホスフェート、カリウム、及びナトリウム（即ち３４ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４及び６４ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４）を本発明者等の培地に補充することはグリセロール発酵を高度に損なう（図２）ことを発見しており、アルカリ性ｐＨにおいて特に有害な作用であった。カリウム及びホスフェートは負の作用を担っているがナトリウムは異なっていた（図２）。本発明者等の実験におけるグリセロール消費パターンの分析によればグリセロールのかなりの量が培地中未代謝で残存しており（典型的には１０〜３０ｍＭ）、グリセロールの嫌気的発酵を制限する閾値濃度の存在を示唆していた。興味深いことに、グリセロール代謝の以前の研究も又典型的には２０〜３０ｍＭの範囲のグリセロール濃度において実施されている。本発明者等は今回、高レベルのホスフェート及びカリウム、２ｇ／Ｌのグリセロールを含有する培地を使用し、そして発酵をｐＨ７．５及び３７℃で実施する場合に、グリセロール発酵および細胞生育は完全に損なわれることを観察した（図２）。
【００５６】
総括すれば、本発明者等の結果は、グリセロール発酵に負の影響を与える条件において実験を全て実施したために、Ｅ．ｃｏｌｉを用いてグリセロールを嫌気的に発酵しようとする以前の試みが成功しなかったことを明確に示している。そのような条件は中性〜アルカリ性ｐＨ（７〜７．５）、高濃度のカリウム及びホスフェート、比較的低い濃度のグリセロール、３７℃及び封鎖容器の使用を包含する。後者は水素の蓄積及びその結果としての酸化還元バランスへの影響のためにグリセロール発酵を損なうことを本発明者等が示した条件である。
【００５７】
（実施例３）グリセロール発酵の経路及び機序
腸内細菌によるグリセロールの嫌気的発酵は、活性な１，３−ＰＤＯ経路を有する種の特権であると考えられてきた。しかしながら本発明者等は、Ｅ．ｃｏｌｉは機能する１，２−ＰＤＯ経路及びｇｌｙＤＨ−ＩＩ−ＤＨＡＫ経路が存在している限り、１，３−ＰＤＯ非依存性の態様においてグリセロールを発酵的に代謝できることを明らかにしている。
【００５８】
Ｄｈａｒｍａｄｉ等（２００６）、Ｇｏｎｚａｌｅｚ等（２００７）及び暫定出願６０／８６７，５８１及び６０／７８８，５１２（各々参照により本明細書に組み込まれる）により詳細に説明されている本発明者等の所見に基づいて、本発明者等は腸内細菌におけるグリセロール発酵のための新しいパラダイムを提案するものであり、それにおいては（ｉ）１，２−ＰＤＯ経路は細胞塊の合成の間に発生する還元性等価物を消費するための手段を提供し、これにより酸化還元のバランスの取れた条件を可能にし、そして（ｉｉ）酸化還元のバランスの取れた経路を介したエタノールの合成は、基質レベルのホスホリル化を介してＡＴＰを発生することによりエネルギーの要求性を満足する。ホルメート水素リアーゼの活性及びＦ０Ｆ１−ＡＴＰａｓｅ系も又、恐らくは細胞内ｐＨ及びＣＯ２供給の維持を支援することによりグリセロールの発酵性代謝を促進することが分かっている。解糖系中間体にグリセロールを変換する経路は２つの酵素（図３）、即ちグリセロールデヒドロゲナーゼ（ｇｌｙＤＨ）及びＤＨＡキナーゼ（ＤＨＡＫ）を含むことを示しており、前者は以前には生理学的役割が未知であった。
【００５９】
【表２】
１実験は０．２％トリプトン及び１０％グリセロールの存在下に実施した。
２ＮＧ：生育観察せず；ＮＤ：検出せず；ＳＤ：標準偏差。
３μＭ：指数生育期に計算した最大特異的生育速度（ｈ−１）。
４Ｙｘ／ｓ：消費されたグリセロール当たりの菌体塊の増大として計算した生育収率（ｍｇ細胞／ｇグリセロール）。
５１，２−ＰＤＯの合成は記載した通りＮＭＲで識別した。
【００６０】
菌株ＭＧ１６５５がグリセロールを発酵できるという本発明者等の所見は、他の被験菌株（Ｗ３１１０、ＭＣ４１００及びＥ．ｃｏｌｉＢ）も又グリセロールを発酵できたため、Ｅ．ｃｏｌｉの主に一般的な特性である（表２）。２つの他のｇｌｙＤＨ類、即ちｇｌｙＤＨ−ＩＩＩ及びｇｌｙＤＨ−ＩＶはエンテロバクターのメンバーにおいて発見されているため、本発明者等はグリセロールの嫌気的発酵におけるそれらの関与を検討した。やはりＥ．ｃｏｌｉのようにｇｌｙＤＨ−ＩＩ（２）保有しているエンテロバクター・クロアカエＮＣＤＣ２７９−５６はグリセロールを発酵することができた（表２）。酵母サッカロマイセス・セレビシアエを用いた本発明者等の予備的結果は、同様の経路がこの生物におけるグリセロール発酵を支援していることを示していると考えられた。
【００６１】
上記経路はグリセロール発酵に対するｐＨ及びカリウム、ホスフェート及びグリセロールの濃度の観察された作用を説明するためのフレームワークを与える（暫定出願６０／８６７，５８１の実施例２及びＧｏｎｚａｌｅｚ等、２００７参照）。例えば高レベルのホスフェートはＤＨＡ及びＨＡ（上記した経路の２つの重要な中間体）の両方の分解を増進し、そしてＧｌｄＡの活性及びＨＡによるその誘導性に負の影響をもたらす。更に又、１，２−ＰＤＯ合成を担っている重要な酵素であるＭＧシンターゼは高ホスフェートレベルにより抑制される。高濃度のカリウムは１，２−ＰＤＯ合成における重要な中間体であるＭＧの毒性を増大させる。グリセロールに対するＧｌｄＡの低い親和性［Ｋｍが３〜４０ｍＭ］はその発酵代謝のために高濃度のグリセロールが必要であること、及び、１０〜３０ｍＭグリセロールが未代謝のまま培地中に残存していたという本発明者等の観察結果の両方を説明している。
【００６２】
グリセロール発酵に対するｐＨの影響は又、上記した経路に対するその影響にも関連している（暫定出願６０／８６７，５８１の実施例２及びＧｏｎｚａｌｅｚ等、２００７参照）。ＧｌｄＡは強力なｐＨ依存性と、より高い高アルカリ性ｐＨでの酸化活性及び中性〜アルカリ性条件での還元活性を示す。酸性条件はｇｌｙＤＨの活性のみならず、１，２−ＰＤＯの合成に必要なＭＧ還元活性も低減する。一方でアルカリ性条件は１，２−ＰＤＯの合成における重要な中間体であるＭＧの毒性を増大させる。明らかに、細胞内ｐＨは重要な酵素の低活性及びＭＧの毒性を回避するために慎重に制御する必要がある。例えば、６．３の細胞外ｐＨは明らかにＭＧ毒性を防止するが、ｇｌｙＤＨ及びＭＧＲ／ＡＫＲ活性を可能にするレベルより低値までｐＨが低下することを防止するためのシステムを、細胞はなお必要としている。ギ酸からＣＯ２及びＨ２への変換により、ＦＨＬシステムは細胞質の酸性化を防止することが知られており、これはなぜＦＨＬが酸性条件におけるグリセロール発酵のために必要であるかを説明している。しかしなおＦＨＬの活性は、蓄積すればグリセロール発酵に負の影響を与える過剰な水素を発生する場合がある。アルカリ性条件において、Ｆ０Ｆ１−ＡＴＰａｓｅ系は細胞質のアルカリ性化を防止するため、即ちＭＧ毒性を回避するために必要となる。
【００６３】
（実施例４）工業用培地中のグリセロール発酵の生産性及び実現性の向上
グリセロール発酵の向上のための本発明者等の所見の意義を明らかにするために、本発明者等は野生型菌株ＭＧ１６５５における発見された主幹経路（ＧｌｄＡ−ＤＨＡＫ）を過剰発現させ、そして細胞生育及びグリセロール発酵の両方において２倍超の増大を観察した。ＧｌｄＡ−ＤＨＡＫ経路の増幅はプラスミドｐＺＳｄｈａＫＬＭ＿ｇｌｄＡでＭＧ１６５５を形質転換することにより達成した。生産性を更に向上させるためにはＧｌｄＡ−ＤＨＡＫ経路と共に解糖系酵素（例えばトリオース−ホスフェートイソメラーゼ）の一致した過剰発現が必要であると考えられる。更に又、培地、培養系及び作動様式を更に最適化することを包含する幾つかのプロセス系の改良が実施中である。
【００６４】
工業レベルでグリセロール発酵を適用することはバイオディーゼルの製造の間に誘導されるグリセロールの使用を必要とする。本発明者等はＭＧ１６５５を純粋なグリセロール及びＦｕｔｕｒｅＦｕｒｅｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙにより運転されているバイオディーゼル工場から得られたグリセロールの２試料上で培養したところ、同様の細胞生育及びグリセロール発酵を観察しており：培養４８時間の後、細胞は４（純粋）、３．９（精製）及び３．８（粗製）ｇ／Ｌのグリセロールを発酵しており、そして１．２（純粋）、０．９６（精製）及び０．９８（粗製）の光学密度に達していた。
【００６５】
経費効率的な工業用補充物でトリプトン補充物を置き換えることが、商業的成功のための別の重要な要因である。しかしながら、本発明者等はコーンスチープリカー（工業用発酵で使用されている安価な補充物）による培地補充がトリプトン補充で観察されたものと同様のレベルにグリセロール発酵を支援することを既に明らかにしている（Ｄｈａｒｍａｄｉ等、２００６）。
【００６６】
本発明者等は又、補充物を含まない最少培地中で生育することができるＭＧ１６５５突然変異体も入手した（０．３６のＯＤ５５０であり、８．１ｇ／Ｌのグリセロールが発酵された）。これらの突然変異体は漸減量のＨＡ又はトリプトンを含有する培地中でグリセロールを発酵することができる菌株の選択を多数回行うことにより作成した。
【００６７】
（実施例５）：グリセロールからの生成物
本発明者等は又炭素源としてのグリセロール及び上記した培地を用いた生成物形成の例示的呈示を行った。例えば、本発明者等は図４に示すエタノールの生産を示している。本発明者等の結果は、僅かな遺伝子的及び環境的な改変により、Ｅ．ｃｏｌｉがエタノールとＨ２−ＣＯ２（ｐＨ６．３）又はエタノールとギ酸（ｐＨ７．５及びＦＨＬ系の破壊）の何れかへのグリセロールの変換のための良好な生体触媒となることを示している。糖類の発酵を介したエタノールの生産は、対照的に、Ｈ２やギ酸の同時生成の可能性を全く与えず、従って低効率のプロセスとなっている。エタノールとＨ２及びエタノールとギ酸の収率を更に向上させることは、スクシネート及びアセテート経路を排除することによりもたらされることになる（ｆｒｄＡ及びｐｔａ突然変異：Ｇｏｎｚａｌｅｚ等、２００７及び暫定出願６０／８６７，５８１）。生産性及び工業用培地の使用における向上は実施例４において上記した通りである。
【００６８】
別の例はコハク酸であり、その糖類からの生産は還元性等価物の利用性により限定されている。幸運なことに、グリセロールからのその合成は酸化還元バランスの取れた経路を介して可能となる。しかしながら、グリセロールからのスクシネートの極めて低い生産がＭＧ１６５５を用いた本発明者等の実験では観察されており、ＰＥＰ依存性ＧｌｄＡ−ＤＨＡＫ経路を介してグリセロールが異化される結果である（即ち低ＰＥＰ利用性）。適切なｐＨ及びＣＯ２濃度を用いながら、Ｅ．ｃｏｌｉＰＥＰ依存性ＤＨＡＫをＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉＡＴＰ依存性ＤＨＡＫに置き換えることにより、本発明者等は上記した培地を用いた場合にスクシネート収率のほぼ１０倍増加を達成している（図４）。スクシネート収率を更に向上させることはエタノール及びアセテート経路の排除からもたらされることになる（ａｄｈＥ及びｐｔａ突然変異：Ｇｏｎｚａｌｅｚ等、２００７及び暫定出願６０／８６７，５８１）。生産性及び工業用培地の使用における向上は、Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉＡＴＰ−依存性ＤＨＡＫがネイティブのＤＨＡＫの代わりに過剰発現されることになることを除き、実施例４において上記した通りである。コハク酸経路をエネルギー的により望ましいものとするために、本発明者等はＥ．ｃｏｌｉのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ、遺伝子ｐｐｃによりコードされる）及びホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）の過剰発現をＥ．ｃｏｌｉ（ｐｃｋＡ）、アクチノバチルス・スクシノゲネス（ｐｃｋＡ）又は酵素データベースＢＲＥＮＤＡに記載されている他の微生物から排除しているところである（Ｓｃｈｏｍｂｕｒｇ等、２００４）。スクシネート経路を介したより高いエネルギー生産（ＰＥＰＣと異なり、ＰＥＰＣＫはＡＴＰを形成する）はより高値の生産性及び収率の両方をもたらすはずである。
【００６９】
自身の合成がグリセロールにおける炭素の高度に還元された状態から利益を被る別の生成物は１，２−ＰＤＯである。ＧｌｄＡ−ＤＨＡＫ経路の増幅は上昇した生産性をもたらすのみならず、１，２−ＰＤＯの合成におけるほぼ２０倍の増大ももたらし：ＭＧ１６５５はわずか０．０２６ｍＭの１，２−ＰＤＯのみ生産していたのに対し、組み換え菌株ＭＧ１６５５（ｐＺＳｄｈａＫＬＭ＿ｇｌｄＡ）はこの生成物０．５１ｍＭを蓄積していた。これらの結果は、恐らくは１，２−ＰＤＯの合成におけるＧｌｄＡの関与によるものである（Ｇｏｎｚａｌｅｚ等、２００７）。
【００７０】
本発明者等は今回、下記の通りグリセロールから高レベルの１，２−ＰＤＯを生産するための数種の方策を追求している。
（１）Ｅ．ｃｏｌｉのネイティブのＰＥＰ依存性ＤＨＡＫ（ｄｈａＫＬＭ）をＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉのＡＴＰ依存性ＤＨＡＫ（ｄｈａＫＬサブユニット）と置き換えること、および、ネイティブのグリセロールデヒドロゲナーゼ（ｇｌｄＡ）と並行したその過剰発現。（２）ＤＨＡＰから１，２−ＰＤＯへの変換に全て関与している酵素メチルグリオキサルシンターゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ及びメチルグリオキサル還元酵素の過剰発現（Ｇｏｎｚａｌｅｚ等、２００７及び暫定出願６０／８６７，５８１）。
（３）トランスヒドロゲナーゼの過剰発現を介したＮＡＤＨからＮＡＤＰＨへの変換を向上させること、又はグリセロールデヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−Ｐデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ等を包含する中心的代謝経路における酵素のコファクター特異性を操作することにより、ＤＨＡＰから１，２−ＰＤＯの変換を駆動するためのＮＡＤＰＨの利用性を増大させること等。或いは、自身のネイティブの形態においてはコファクターとしてＮＡＤＰを使用するこれらの酵素の変異を他の生物からクローニングしてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させることができる。
（４）１工程におけるＨＡへのグリセロールの変換のためのグリセロールデヒドラターゼ（ＧＤ、天然にはグリセロールを３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに変換することによりこれを脱水する）の操作。次に本発明者等が既に培地に初期より存在するＨＡを化学量論的に１，２−ＰＤＯに変換した実験において明らかにした通り、ＨＡをＥ．ｃｏｌｉにおいてＧｌｄＡ又は他の酵素により１，２−ＰＤＯに変換する（暫定出願６０／８６７，５８１）。この経路は中間体としてのメチルグリオキサル（極めて毒性の生成物）を回避することになり、そしてＡＴＰが消費されないために１，２−ＰＤＯへのグリセロールの最もエネルギー効率的な経路となり、収率を顕著に増大させる。操作されたＧＤは他のＧＤとは異なり活性のために補酵素Ｂ１２を必要としないＣ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ＧＤ（ｄｈａＢＩ）を突然変異誘発することにより得られる。本発明者等は又、グリセロールをＨＡに変換できるネイティブの微生物ＧＤを得るために検索を実施中である。発見されればこの活性はＥ．ｃｏｌｉにクローニングされ、発現されることになる。
（５）化学的（グリセロールからＨＡ）及び生物学的（ＨＡから１，２−ＰＤＯ）な方策を組み合わせる。グリセロールからＨＡへの脱水は固体触媒、中程度の温度（〜２００℃）及び大気圧を使用するプロセスを用いて効率的に達成されている（Ｃｒａｂｔｒｅｅ等、２００６）。生成物はＨＡと水のみである。本発明者等はグリセロールを含有する培地中のＥ．ｃｏｌｉによるＨＡから１，２−ＰＤＯへの効率的変換を明らかにしている（Ｇｏｎｚａｌｅｚ等、２００７及び暫定出願６０／８６７，５８１）。消費されるグリセロールの量は最小限であり、ＨＡから１，２−ＰＤＯへの化学量論的変換は極めて短時間の発酵により達成される。
【００７１】
上記及び図４及び５に示した結果はグリセロールからの燃料及び還元された化学物質の生産のためのプラットホームを開発することの実現性を明確に示している。グリセロール発酵経由の生産が好都合である他の生成物は、プロパノールアミド、プロピオン酸、ブタノール等を包含する（Ｇｏｎｚａｌｅｚ等、２００７）。これらのプロセスは真のバイオリファイナリーの実施を可能にし、そしてその経済面を大きく向上させることによりバイオ燃料産業に革命をもたらすと考えられる。
【００７２】
（参考文献）
全ての参考文献は読者の都合のために掲示している。各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【００７３】
【数１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−２４５０１２（Ｐ２０１２−２４５０１２Ａ）
【公開日】平成２４年１２月１３日（２０１２．１２．１３）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−２０４４６９（Ｐ２０１２−２０４４６９）
【出願日】平成２４年９月１８日（２０１２．９．１８）
【分割の表示】特願２００９−５０３３２６（Ｐ２００９−５０３３２６）の分割
【原出願日】平成１９年３月３０日（２００７．３．３０）
【出願人】（５０４０８００８７）ライス ユニバーシティー (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１２月１３日（２０１２．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２０４４６９（Ｐ２０１２−２０４４６９）
【出願日】平成２４年９月１８日（２０１２．９．１８）
【分割の表示】特願２００９−５０３３２６（Ｐ２００９−５０３３２６）の分割
【原出願日】平成１９年３月３０日（２００７．３．３０）
【出願人】（５０４０８００８７）ライス ユニバーシティー (6)
【Ｆターム（参考）】
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