グルコースデヒドロゲナーゼの活性向上方法
【課題】本発明の目的は、化学物質の共存によりＧＤＨの比活性を向上させることである。
【解決手段】グルコースデヒドロゲナーゼを界面活性剤と共存させてなる、グルコースデヒドロゲナーゼの活性向上方法。界面活性剤が、胆汁酸、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン誘導体およびドデシル硫酸ナトリウムからなる群より選ばれる１種類以上である、該方法。
【解決手段】グルコースデヒドロゲナーゼを界面活性剤と共存させてなる、グルコースデヒドロゲナーゼの活性向上方法。界面活性剤が、胆汁酸、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン誘導体およびドデシル硫酸ナトリウムからなる群より選ばれる１種類以上である、該方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコースの定量に有用な酵素であるグルコースデヒドロゲナーゼの活性を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨとも称する）は、Ｄ−グルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する反応を触媒する酵素であり、グルコース定量キット並びにグルコースセンサの原料に用いられている。グルコースを定量する方法としては、還元型の補酵素から電子を受け取って還元されることにより発色または退色する電子伝達物質を共存させて吸光度を測定することにより行う方法、並びに電圧を印加して得られる電気化学シグナルの強度を測定することにより行う方法が知られる。いずれの方法においても、吸光度の変化度および電気化学シグナルの強度はそれぞれ試料中のグルコース濃度に依存しており、あらかじめグルコース標準溶液を用いて作成した検量線を元にグルコースを定量することが可能である。
【０００３】
公知のグルコースデヒドロゲナーゼとしては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドりん酸（ＮＡＤＰ）を補酵素とするＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨと称する）、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするＰＱＱ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＰＱＱ−ＧＤＨと称する）、そしてフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＦＡＤ−ＧＤＨと称する）の大きく３種類に大別される。
【０００４】
グルコースの定量において望まれるＧＤＨの特性としては、基質に対する親和性の高さ、保存中の安定性の高さ、比活性の高さ、グルコースに対する基質特異性の高さなどが挙げられる。
【０００５】
これらの特性を改善するための試みはこれまでにおいても鋭意なされている。その方法としては、ＧＤＨのアミノ酸配列のうち１ないし数個を欠失・置換・挿入または付加させてなる方法、そしてそれら特性の向上に効果のある各種化学物質を共存させることによる方法が知られており、多数の出願がなされている。
【０００６】
アミノ酸配列を改変する方法は、遺伝子工学的な手法の発展により、当業者にとって容易になしうるものとなっており、これまでにも多くの成果について特許出願がなされている。しかしながらこの方法は、あるひとつの注目する特性を改変することに成功したとしても、別の重要な特性が損なわれ、結果として実用に耐えないものとなる場合も少なくない。トータルとしてより有用な改変を行うために効果のある変異導入箇所を特定することは、遺伝子工学的手法や情報科学の発展した今日にあっても莫大な実験量を要してしまうのが現状である。その点において化学物質の共存による方法は比較的簡便に実施できる方法である。
【０００７】
化学物質の共存による方法の具体例としては、特許文献１には、糖アルコール・カルボン酸・金属塩・アンモニウム塩・硫酸塩・タンパク質を共存させることによりＦＡＤ−ＧＤＨを安定化する方法、特許文献２にはフタル酸、マレイン酸などの有機酸、アミド化合物、スルホン酸の共存によるＰＱＱ−ＧＤＨの安定化方法について開示される。特許文献３には、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸、α−ケトグルコン酸、α−サイクロデキストリンの添加によるＰＱＱ−ＧＤＨの安定化方法が開示される。さらに特許文献４には、サリチル酸ナトリウムを単独で、もしくはゼラチンやアルブミンとの組合せで添加することによるＰＱＱ−ＧＤＨの安定化方法が開示される。また、特許文献５には、糖アルコール・カルボン酸・金属塩・アンモニウム塩・硫酸塩・タンパク質を共存させることによるＧＤＨの安定化方法が開示される。安定化以外の特性を改変させる方法としては、特許文献６には、コハク酸、フタル酸、グルタル酸等のジカルボン酸を添加することによるＧＤＨの基質特異性の改良方法について開示される。
【０００８】
一方で、ＧＤＨの比活性、すなわち単位ＧＤＨ量あたりのＤ−グルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンとする反応の速度を添加剤により促進させる方法についてはこれまで知見がなかった。特許文献７には、組換えＧＤＨを培養生産する際に、該ＧＤＨの補酵素を産生する能力のある微生物を宿主とすることにより得られるＧＤＨのホロ化率を向上させる方法について開示される。さらに特許文献８には、培地中にモノオールを添加することによるＧＤＨのホロ化率向上方法について開示される。しかしながらこれらの方法はあくまでホロ化率を向上させる方法であり、ホロ酵素一分子あたりの活性を向上させているわけではない。また、ＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨのような補酵素を共有結合により保持しないＧＤＨについては本方法を適用することはできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００７−１２９９６５号公報
【特許文献２】特許第３４７００９９号公報
【特許文献３】特許第３７７５５６１号公報
【特許文献４】特開２００５−３３３８７２号公報
【特許文献５】特開２００７−１１６９３５号公報
【特許文献６】特開２００７−０４３９８２号公報
【特許文献７】特開平１１−２４３９４９号公報
【特許文献８】特開２００６−０３４１６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の目的は、化学物質の共存によりＧＤＨの比活性を向上させることである。
比活性とは、一定量のタンパク質当たりの活性を意味する。比活性の向上とは一定量のタンパク質当たりの活性が上昇することを意味する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、界面活性剤の共存によりＧＤＨの比活性が高まることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１
グルコースデヒドロゲナーゼを界面活性剤と共存させてなる、グルコースデヒドロゲナーゼの活性向上方法。
項２
界面活性剤が、胆汁酸、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン誘導体およびドデシル硫酸ナトリウムからなる群より選ばれる１種類以上である、項１に記載の活性向上方法。
項３
界面活性剤の濃度が、０．０１％以上０．５％以下（Ｗ／Ｖ）である、項１または２に記載の活性向上方法。
項４
界面活性剤の量が、ＧＤＨのタンパク質としての重量１ｍｇあたり１０ｍｇ以上５００ｍｇ以下である、項１または２に記載の活性向上方法。
項５
グルコースデヒドロゲナーゼが、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび／またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドりん酸依存型である、項１〜４のいずれかに記載の活性向上方法。
項６
グルコースデヒドロゲナーゼが、超好熱性始原菌由来である、項５に記載の活性向上方法。
項７
超好熱性始原菌が、サーモプロテウス属である、項６に記載の活性向上方法。
項８
グルコースデヒドロゲナーゼが次の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかである、項１〜４のいずれかに記載の活性向上方法。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するポリペプチドからなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１ 若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドからなるタンパク質。
項９
少なくともグルコースデヒドロゲナーゼと界面活性剤とを含んでなる組成物。
項１０
界面活性剤が、胆汁酸、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン誘導体およびドデシル硫酸ナトリウムからなる群より選ばれる１種類以上である、項９に記載の組成物。
項１１
界面活性剤の濃度が、０．０１％以上０．５％以下（Ｗ／Ｖ）である、項９または１０に記載の組成物。
項１２
界面活性剤の量が、ＧＤＨのタンパク質としての重量１ｍｇあたり１０ｍｇ以上５００ｍｇ以下である、項９または１０に記載の組成物。
項１３
グルコースデヒドロゲナーゼが、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび／またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドりん酸依存型である、項９〜１２のいずれかに記載の活性向上方法。
項１４
グルコースデヒドロゲナーゼが、超好熱性始原菌由来である、項１３に記載の組成物。
項１５
超好熱性始原菌が、サーモプロテウス属である、項１４に記載の組成物。
項１６
グルコースデヒドロゲナーゼが次の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかである、項９〜１２のいずれかに記載の組成物。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するポリペプチドからなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１ 若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドからなるタンパク質。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、ＧＤＨの比活性を高めることができる。グルコース測定キット並びにグルコースセンサの作製においては、ＧＤＨの添加量を活性ベースで規定することが一般的であるため、本発明によりＧＤＨの使用量を低減でき、それによりコストを削減することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の実施形態は、ＧＤＨを含む試薬組成に、界面活性剤を共存させてなるＧＤＨの比活性向上方法である。界面活性剤としては、該ＧＤＨの比活性を向上させる効果のあるものであれば特に限定されず、好適には胆汁酸、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン誘導体、ポリオキシエチレン脂肪族エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ドデシル硫酸塩、塩化ヘキサデシルピリジニウム等が挙げられる。
より具体的には、胆汁酸としては例えばコール酸、グリココール酸、タウロコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、ヒオデオキシコール酸が挙げられる。またポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとしては例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレンソルビタンステアレートなどが挙げられる。またポリオキシエチレンアルキルエーテルとしては、 ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェノールエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェノールエーテルなどが挙げられる。またポリオキシアルキレン誘導体としては、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールなどが挙げられる。またポリオキシエチレン脂肪族エステルとしてはポリオキシエチレングリコールモノラウレート、ポリオキシエチレングリコールモノステアレート、ポリオキシエチレングリコールステアレート、ポリオキシエチレングリコールモノオレートなどが挙げられる。またグリセリン脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸モノグリセライド、オレイン酸モノグリセライドなどが挙げられる。さらにポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルとしてはテトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビットなどが挙げられる。
これらのうち最も好適には、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（商品名：Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（商品名：Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（商品名：Ｂｒｉｊ３５）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル（商品名：エマルゲンＡ６０）、ポリオキシエチレンオレイルエーテル（商品名：エマルゲン４３０）、コール酸塩、デオキシコール酸塩が挙げられる。上記の界面活性剤は、１種類のみで、もしくは数種類を混合して用いられる。
【００１５】
ＧＤＨとしては、界面活性剤の添加により比活性向上の効果がみられるものであれば限定されず、例えばＰＱＱ−ＧＤＨ（アシネトバクター属由来）、ＦＡＤ−ＧＤＨ（ブルクホリデリア属由来、アスペルギルス属由来、ペニシリウム属由来）、ＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨ（バチルス属由来、スルフォロバス属由来、サーモプラズマ属由来、サーモプロテウス属由来）等が挙げられる。これらのうち好適にはＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨが選択される。より好適には、超好熱性始原菌由来のＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨである。
【００１６】
１６ＳリボソームＲＮＡ（１６ＳｒＲＮＡ）の塩基配列（真核生物の場合は１８ＳｒＲＮＡ）に基づいた進化系統樹によれば、生物はＥｕｃａｒｙａ、Ｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｒｃｈａｅａの３つの大きな生物界に分類される。本発明に述べる「始原菌」とは、この１６ＳｒＲＮＡの進化系統樹に基づいて「Ａｒｃｈａｅａ」という生物界に分類される生物を指す。さらに超好熱性始原菌とは、９０℃以上で生育可能な始原菌であるか、もしくは至適生育温度が８０℃以上である始原菌として定義される。好ましいＧＤＨとしては、パイロディクティム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｍ）属、スルフォロバス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属、デスルフロコッカス（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモプロテウス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ）属、サーモフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ）属、サーモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）属からなる群のうちいずれかに分類されるかあるいはいずれかに近縁である超好熱始原菌に由来するＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨであり、より好ましくはサーモプロテウス属に分類される始原菌由来ＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨである。最も好ましいＧＤＨは、配列番号２に記載するアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含んでなるＧＤＨであり、そのようなＧＤＨとしては例えば配列番号４に記載するアミノ酸配列からなるＧＤＨが挙げられる。
【００１７】
共存させる界面活性剤の量は、ＧＤＨの比活性向上の効果がみられる範囲であればよいが、目安として液状であれば、好ましい下限は０．０１％（Ｗ／Ｖ）であり、さらに好ましくは０．０５（Ｗ／Ｖ）％である。また、好ましい上限は０．５％（Ｗ／Ｖ）であり、さらに好ましくは０．１％（Ｗ／Ｖ）である。
乾燥状態にあっては、試料等の添加により溶解させた状態での界面活性剤濃度が上記の範囲となるよう含まれればよい。別の観点からの共存させる界面活性剤の量は、ＧＤＨのタンパク質としての重量１ｍｇあたりに換算して、好ましい下限は１０ｍｇであり、さらに好ましくは５０ｍｇである、また、好ましい上限は５００ｍｇであり、より好ましくは１００ｍｇである。
【００１８】
ＧＤＨと界面活性剤とを含んでなる組成物の形態としては、液状でも固体状でもよく、特に限定しない。組成物には、ｐＨ５〜９の範囲で緩衝能を有する緩衝剤をさらに含んでもよく、緩衝剤としては例えばりん酸カリウム塩、りん酸ナトリウム塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ＧＯＯＤの緩衝剤などが好適に選択されうる。また、ＧＤＨがＮＡＤ（Ｐ）依存型である場合には、組成中にＮＡＤもしくはＮＡＤＰを含むことが好ましい。さらに、組成物の安定化のために、ＧＤＨの基質となりえない糖類、糖アルコール、タンパク質、金属塩、キレート剤、親水性ポリマー等を含んでもよい。
【００１９】
本発明の方法を適用したＧＤＨおよび界面活性剤を含んでなる組成物としては、ＧＤＨを含んでなる液状・粉末・錠剤のほか、グルコース定量キット、グルコースセンサもその範疇である。グルコース定量用キットおよびグルコースセンサの具体的な構成について以下に例示する。
【００２０】
グルコースアッセイキット
本発明のグルコースアッセイキットは、典型的には、本発明のＧＤＨ、補酵素、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【００２１】
グルコースセンサ
本発明のグルコースセンサは、電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上にＧＤＨを固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどを用いる方法があり、フェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。ＧＤＨがＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨである場合には補酵素であるＮＡＤもしくはＮＡＤＰと共存させた形態で電極上に固定化するが、補酵素不在の形態で固定化し、補酵素を別の層としてまたは溶液中で供給することも可能である。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００２２】
活性測定例
本発明においては、ＧＤＨ活性は特に断りのない限り、以下の方法に従って行われる。
反応液（０．１ｍｏｌ／Ｌ トリス、１０ｍｍｏｌ／Ｌ β−ＮＡＤ＋、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ−グルコース、 ｐＨ８．０）２．９ｍＬを石英セルにいれ、３７℃で５分間予備加温する。そしてＧＤＨ溶液０．１ｍＬを加えて混和し、３７℃で５分反応させ、この間３４０ｎｍ吸光度を測定する。吸光度変化の直線部分から１分間あたりの吸光度の上昇度（ΔＯＤＴＥＳＴ）を算出する。盲検は、ＧＤＨ溶液の代わりに緩衝液を加えて混和し、同様に３７℃５分インキュベートして３４０ｎｍ吸光度を記録し、１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を算出する。これらの値を以下の式に当てはめて活性値（Ｕ／ｍＬ）を算出する。なおここでは、基質存在下で１分間に１マイクロモルの補酵素を還元する酵素量を１Ｕと定義する。
ＧＤＨ活性（Ｕ／ｍＬ）＝［（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０×希釈倍率］／（６．２２×１．０×０．１）
なお、ここで
３．０ ：ＧＤＨ溶液混和後の容量（ｍＬ）
６．２２ ：ＮＡＤＨのミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）
１．０ ：光路長（ｃｍ）
０．１ ：添加するＧＤＨ溶液の液量（ｍＬ）
である。
【００２３】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
サーモプロテウス属超好熱性始原菌由来改変型ＧＤＨを以下の要領で得た。
配列番号１に示すＧＤＨ遺伝子が大腸菌用プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳＮ（＋）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入された発現プラスミドｐＢＳＧＤＨ−２を鋳型に、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ （ストラタジーン製）を用いてＧＤＨ遺伝子内の特定部位に変異を導入することにより、発現プラスミドｐＢＳＴＧＤＨ−３を得た。ｐＢＳＴＧＤＨ−３は配列番号３に相当するＤＮＡ分子をｌａｃプロモーター下に接続してなるプラスミドである。このプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセルに形質転換し、生産菌株とした。この形質転換株は、５００ｍｌ容坂口フラスコに入った２００ｍｌ前培養培地（０．５％酵母エキス、０．２５％ペプトン、０．５％塩化ナトリウム、０．５％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウム、ｐＨ７．４）に植菌し、３０℃１８０ｒｐｍで１６時間振とう培養した。得られた前培養液を、１０Ｌ容ジャーファーメンター中の６ＬのＧＤＨ生産培地（２．４％コウボエキス、２．４％ペプトン、１．２５％リン酸１水素２カリウム、０．２３％リン酸２水素１カリウム、０．４％グリセロール、０．１％消泡剤、１００μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウム、ｐＨ７．０）に全量投入し、通気量２Ｌ／分、攪拌速度３１０ｒｐｍ、槽内圧０．０２ＭＰａ、温度３７℃で２４時間通気攪拌培養を行った。得られた培養液を遠心分離することにより菌体を得、これを１Ｌの２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）に懸濁してフレンチプレス菌体破砕装置を用いて平均圧力８０ＭＰａで菌体を破砕した。さらにこの破砕液に１Ｌあたり１５２ｇの硫酸アンモニウムを加えて溶解し、６０℃１時間の加温を行い、さらに遠心分離によって沈殿を除いた。この溶液を、１５．２％硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）で緩衝化させたＯｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）にアプライしてＧＤＨを樹脂に吸着させ、さらに７．６％硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）で樹脂を洗浄した。そして硫酸アンモニウム濃度を７．６％から０％へ、同時にエチレングリコール濃度を０％から０．２％へ、それぞれグラジエントをかけながらバッファーを通液することでＧＤＨを溶出させた。次に、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）により緩衝化したＧ−２５ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂を用いて脱塩・バッファー置換を行った。最後に、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）で緩衝化したＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅにＧＤＨ溶液を通液することで夾雑タンパク質を樹脂に吸着させ、透過液を精製ＧＤＨとした。このように作製したサーモプロテウス属由来変異型ＧＤＨは配列番号４に示すアミノ酸配列を有している。これは、発明者らの別の検討において変異導入前の野生型ＧＤＨと比して３７℃以下の温度における比活性、補酵素であるＮＡＤに対する親和性、基質に対する親和性が向上した改変型ＧＤＨである。
【実施例２】
【００２５】
実施例１で作製したＧＤＨを用いて、以下の組成からなる溶液を作製した。
１０Ｕ／ｍｌ ＧＤＨ （実施例１で調製したもの）
０．０１〜０．５％ 界面活性剤
５０ｍＭ りん酸カリウム （ｐＨ８．０）
界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸、ドデシル硫酸ナトリウム、エマルゲンＡ６０、エマルゲン４３０を用いた。これら溶液と、組成中に界面活性剤を含まない溶液について、上述の活性測定例に示す方法に従ってＧＤＨ活性を測定した。界面活性剤を含まない場合のＧＤＨ活性を１００とした場合の相対活性に換算した結果を表１に示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】
これらの結果から、界面活性剤の共存によってＧＤＨ比活性が向上する効果があることが認められた。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明は、ＧＤＨを用いてグルコースを定量するためのキット並びにグルコースセンサに利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコースの定量に有用な酵素であるグルコースデヒドロゲナーゼの活性を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨとも称する）は、Ｄ−グルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する反応を触媒する酵素であり、グルコース定量キット並びにグルコースセンサの原料に用いられている。グルコースを定量する方法としては、還元型の補酵素から電子を受け取って還元されることにより発色または退色する電子伝達物質を共存させて吸光度を測定することにより行う方法、並びに電圧を印加して得られる電気化学シグナルの強度を測定することにより行う方法が知られる。いずれの方法においても、吸光度の変化度および電気化学シグナルの強度はそれぞれ試料中のグルコース濃度に依存しており、あらかじめグルコース標準溶液を用いて作成した検量線を元にグルコースを定量することが可能である。
【０００３】
公知のグルコースデヒドロゲナーゼとしては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドりん酸（ＮＡＤＰ）を補酵素とするＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨと称する）、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするＰＱＱ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＰＱＱ−ＧＤＨと称する）、そしてフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＦＡＤ−ＧＤＨと称する）の大きく３種類に大別される。
【０００４】
グルコースの定量において望まれるＧＤＨの特性としては、基質に対する親和性の高さ、保存中の安定性の高さ、比活性の高さ、グルコースに対する基質特異性の高さなどが挙げられる。
【０００５】
これらの特性を改善するための試みはこれまでにおいても鋭意なされている。その方法としては、ＧＤＨのアミノ酸配列のうち１ないし数個を欠失・置換・挿入または付加させてなる方法、そしてそれら特性の向上に効果のある各種化学物質を共存させることによる方法が知られており、多数の出願がなされている。
【０００６】
アミノ酸配列を改変する方法は、遺伝子工学的な手法の発展により、当業者にとって容易になしうるものとなっており、これまでにも多くの成果について特許出願がなされている。しかしながらこの方法は、あるひとつの注目する特性を改変することに成功したとしても、別の重要な特性が損なわれ、結果として実用に耐えないものとなる場合も少なくない。トータルとしてより有用な改変を行うために効果のある変異導入箇所を特定することは、遺伝子工学的手法や情報科学の発展した今日にあっても莫大な実験量を要してしまうのが現状である。その点において化学物質の共存による方法は比較的簡便に実施できる方法である。
【０００７】
化学物質の共存による方法の具体例としては、特許文献１には、糖アルコール・カルボン酸・金属塩・アンモニウム塩・硫酸塩・タンパク質を共存させることによりＦＡＤ−ＧＤＨを安定化する方法、特許文献２にはフタル酸、マレイン酸などの有機酸、アミド化合物、スルホン酸の共存によるＰＱＱ−ＧＤＨの安定化方法について開示される。特許文献３には、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸、α−ケトグルコン酸、α−サイクロデキストリンの添加によるＰＱＱ−ＧＤＨの安定化方法が開示される。さらに特許文献４には、サリチル酸ナトリウムを単独で、もしくはゼラチンやアルブミンとの組合せで添加することによるＰＱＱ−ＧＤＨの安定化方法が開示される。また、特許文献５には、糖アルコール・カルボン酸・金属塩・アンモニウム塩・硫酸塩・タンパク質を共存させることによるＧＤＨの安定化方法が開示される。安定化以外の特性を改変させる方法としては、特許文献６には、コハク酸、フタル酸、グルタル酸等のジカルボン酸を添加することによるＧＤＨの基質特異性の改良方法について開示される。
【０００８】
一方で、ＧＤＨの比活性、すなわち単位ＧＤＨ量あたりのＤ−グルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンとする反応の速度を添加剤により促進させる方法についてはこれまで知見がなかった。特許文献７には、組換えＧＤＨを培養生産する際に、該ＧＤＨの補酵素を産生する能力のある微生物を宿主とすることにより得られるＧＤＨのホロ化率を向上させる方法について開示される。さらに特許文献８には、培地中にモノオールを添加することによるＧＤＨのホロ化率向上方法について開示される。しかしながらこれらの方法はあくまでホロ化率を向上させる方法であり、ホロ酵素一分子あたりの活性を向上させているわけではない。また、ＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨのような補酵素を共有結合により保持しないＧＤＨについては本方法を適用することはできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００７−１２９９６５号公報
【特許文献２】特許第３４７００９９号公報
【特許文献３】特許第３７７５５６１号公報
【特許文献４】特開２００５−３３３８７２号公報
【特許文献５】特開２００７−１１６９３５号公報
【特許文献６】特開２００７−０４３９８２号公報
【特許文献７】特開平１１−２４３９４９号公報
【特許文献８】特開２００６−０３４１６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の目的は、化学物質の共存によりＧＤＨの比活性を向上させることである。
比活性とは、一定量のタンパク質当たりの活性を意味する。比活性の向上とは一定量のタンパク質当たりの活性が上昇することを意味する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、界面活性剤の共存によりＧＤＨの比活性が高まることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１
グルコースデヒドロゲナーゼを界面活性剤と共存させてなる、グルコースデヒドロゲナーゼの活性向上方法。
項２
界面活性剤が、胆汁酸、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン誘導体およびドデシル硫酸ナトリウムからなる群より選ばれる１種類以上である、項１に記載の活性向上方法。
項３
界面活性剤の濃度が、０．０１％以上０．５％以下（Ｗ／Ｖ）である、項１または２に記載の活性向上方法。
項４
界面活性剤の量が、ＧＤＨのタンパク質としての重量１ｍｇあたり１０ｍｇ以上５００ｍｇ以下である、項１または２に記載の活性向上方法。
項５
グルコースデヒドロゲナーゼが、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび／またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドりん酸依存型である、項１〜４のいずれかに記載の活性向上方法。
項６
グルコースデヒドロゲナーゼが、超好熱性始原菌由来である、項５に記載の活性向上方法。
項７
超好熱性始原菌が、サーモプロテウス属である、項６に記載の活性向上方法。
項８
グルコースデヒドロゲナーゼが次の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかである、項１〜４のいずれかに記載の活性向上方法。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するポリペプチドからなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１ 若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドからなるタンパク質。
項９
少なくともグルコースデヒドロゲナーゼと界面活性剤とを含んでなる組成物。
項１０
界面活性剤が、胆汁酸、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン誘導体およびドデシル硫酸ナトリウムからなる群より選ばれる１種類以上である、項９に記載の組成物。
項１１
界面活性剤の濃度が、０．０１％以上０．５％以下（Ｗ／Ｖ）である、項９または１０に記載の組成物。
項１２
界面活性剤の量が、ＧＤＨのタンパク質としての重量１ｍｇあたり１０ｍｇ以上５００ｍｇ以下である、項９または１０に記載の組成物。
項１３
グルコースデヒドロゲナーゼが、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび／またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドりん酸依存型である、項９〜１２のいずれかに記載の活性向上方法。
項１４
グルコースデヒドロゲナーゼが、超好熱性始原菌由来である、項１３に記載の組成物。
項１５
超好熱性始原菌が、サーモプロテウス属である、項１４に記載の組成物。
項１６
グルコースデヒドロゲナーゼが次の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかである、項９〜１２のいずれかに記載の組成物。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するポリペプチドからなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１ 若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドからなるタンパク質。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、ＧＤＨの比活性を高めることができる。グルコース測定キット並びにグルコースセンサの作製においては、ＧＤＨの添加量を活性ベースで規定することが一般的であるため、本発明によりＧＤＨの使用量を低減でき、それによりコストを削減することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の実施形態は、ＧＤＨを含む試薬組成に、界面活性剤を共存させてなるＧＤＨの比活性向上方法である。界面活性剤としては、該ＧＤＨの比活性を向上させる効果のあるものであれば特に限定されず、好適には胆汁酸、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン誘導体、ポリオキシエチレン脂肪族エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ドデシル硫酸塩、塩化ヘキサデシルピリジニウム等が挙げられる。
より具体的には、胆汁酸としては例えばコール酸、グリココール酸、タウロコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、ヒオデオキシコール酸が挙げられる。またポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとしては例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレンソルビタンステアレートなどが挙げられる。またポリオキシエチレンアルキルエーテルとしては、 ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェノールエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェノールエーテルなどが挙げられる。またポリオキシアルキレン誘導体としては、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールなどが挙げられる。またポリオキシエチレン脂肪族エステルとしてはポリオキシエチレングリコールモノラウレート、ポリオキシエチレングリコールモノステアレート、ポリオキシエチレングリコールステアレート、ポリオキシエチレングリコールモノオレートなどが挙げられる。またグリセリン脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸モノグリセライド、オレイン酸モノグリセライドなどが挙げられる。さらにポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルとしてはテトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビットなどが挙げられる。
これらのうち最も好適には、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（商品名：Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（商品名：Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（商品名：Ｂｒｉｊ３５）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル（商品名：エマルゲンＡ６０）、ポリオキシエチレンオレイルエーテル（商品名：エマルゲン４３０）、コール酸塩、デオキシコール酸塩が挙げられる。上記の界面活性剤は、１種類のみで、もしくは数種類を混合して用いられる。
【００１５】
ＧＤＨとしては、界面活性剤の添加により比活性向上の効果がみられるものであれば限定されず、例えばＰＱＱ−ＧＤＨ（アシネトバクター属由来）、ＦＡＤ−ＧＤＨ（ブルクホリデリア属由来、アスペルギルス属由来、ペニシリウム属由来）、ＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨ（バチルス属由来、スルフォロバス属由来、サーモプラズマ属由来、サーモプロテウス属由来）等が挙げられる。これらのうち好適にはＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨが選択される。より好適には、超好熱性始原菌由来のＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨである。
【００１６】
１６ＳリボソームＲＮＡ（１６ＳｒＲＮＡ）の塩基配列（真核生物の場合は１８ＳｒＲＮＡ）に基づいた進化系統樹によれば、生物はＥｕｃａｒｙａ、Ｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｒｃｈａｅａの３つの大きな生物界に分類される。本発明に述べる「始原菌」とは、この１６ＳｒＲＮＡの進化系統樹に基づいて「Ａｒｃｈａｅａ」という生物界に分類される生物を指す。さらに超好熱性始原菌とは、９０℃以上で生育可能な始原菌であるか、もしくは至適生育温度が８０℃以上である始原菌として定義される。好ましいＧＤＨとしては、パイロディクティム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｍ）属、スルフォロバス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属、デスルフロコッカス（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモプロテウス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ）属、サーモフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ）属、サーモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）属からなる群のうちいずれかに分類されるかあるいはいずれかに近縁である超好熱始原菌に由来するＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨであり、より好ましくはサーモプロテウス属に分類される始原菌由来ＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨである。最も好ましいＧＤＨは、配列番号２に記載するアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含んでなるＧＤＨであり、そのようなＧＤＨとしては例えば配列番号４に記載するアミノ酸配列からなるＧＤＨが挙げられる。
【００１７】
共存させる界面活性剤の量は、ＧＤＨの比活性向上の効果がみられる範囲であればよいが、目安として液状であれば、好ましい下限は０．０１％（Ｗ／Ｖ）であり、さらに好ましくは０．０５（Ｗ／Ｖ）％である。また、好ましい上限は０．５％（Ｗ／Ｖ）であり、さらに好ましくは０．１％（Ｗ／Ｖ）である。
乾燥状態にあっては、試料等の添加により溶解させた状態での界面活性剤濃度が上記の範囲となるよう含まれればよい。別の観点からの共存させる界面活性剤の量は、ＧＤＨのタンパク質としての重量１ｍｇあたりに換算して、好ましい下限は１０ｍｇであり、さらに好ましくは５０ｍｇである、また、好ましい上限は５００ｍｇであり、より好ましくは１００ｍｇである。
【００１８】
ＧＤＨと界面活性剤とを含んでなる組成物の形態としては、液状でも固体状でもよく、特に限定しない。組成物には、ｐＨ５〜９の範囲で緩衝能を有する緩衝剤をさらに含んでもよく、緩衝剤としては例えばりん酸カリウム塩、りん酸ナトリウム塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ＧＯＯＤの緩衝剤などが好適に選択されうる。また、ＧＤＨがＮＡＤ（Ｐ）依存型である場合には、組成中にＮＡＤもしくはＮＡＤＰを含むことが好ましい。さらに、組成物の安定化のために、ＧＤＨの基質となりえない糖類、糖アルコール、タンパク質、金属塩、キレート剤、親水性ポリマー等を含んでもよい。
【００１９】
本発明の方法を適用したＧＤＨおよび界面活性剤を含んでなる組成物としては、ＧＤＨを含んでなる液状・粉末・錠剤のほか、グルコース定量キット、グルコースセンサもその範疇である。グルコース定量用キットおよびグルコースセンサの具体的な構成について以下に例示する。
【００２０】
グルコースアッセイキット
本発明のグルコースアッセイキットは、典型的には、本発明のＧＤＨ、補酵素、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【００２１】
グルコースセンサ
本発明のグルコースセンサは、電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上にＧＤＨを固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどを用いる方法があり、フェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。ＧＤＨがＮＡＤ（Ｐ）−ＧＤＨである場合には補酵素であるＮＡＤもしくはＮＡＤＰと共存させた形態で電極上に固定化するが、補酵素不在の形態で固定化し、補酵素を別の層としてまたは溶液中で供給することも可能である。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００２２】
活性測定例
本発明においては、ＧＤＨ活性は特に断りのない限り、以下の方法に従って行われる。
反応液（０．１ｍｏｌ／Ｌ トリス、１０ｍｍｏｌ／Ｌ β−ＮＡＤ＋、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ−グルコース、 ｐＨ８．０）２．９ｍＬを石英セルにいれ、３７℃で５分間予備加温する。そしてＧＤＨ溶液０．１ｍＬを加えて混和し、３７℃で５分反応させ、この間３４０ｎｍ吸光度を測定する。吸光度変化の直線部分から１分間あたりの吸光度の上昇度（ΔＯＤＴＥＳＴ）を算出する。盲検は、ＧＤＨ溶液の代わりに緩衝液を加えて混和し、同様に３７℃５分インキュベートして３４０ｎｍ吸光度を記録し、１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を算出する。これらの値を以下の式に当てはめて活性値（Ｕ／ｍＬ）を算出する。なおここでは、基質存在下で１分間に１マイクロモルの補酵素を還元する酵素量を１Ｕと定義する。
ＧＤＨ活性（Ｕ／ｍＬ）＝［（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０×希釈倍率］／（６．２２×１．０×０．１）
なお、ここで
３．０ ：ＧＤＨ溶液混和後の容量（ｍＬ）
６．２２ ：ＮＡＤＨのミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）
１．０ ：光路長（ｃｍ）
０．１ ：添加するＧＤＨ溶液の液量（ｍＬ）
である。
【００２３】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
サーモプロテウス属超好熱性始原菌由来改変型ＧＤＨを以下の要領で得た。
配列番号１に示すＧＤＨ遺伝子が大腸菌用プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳＮ（＋）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入された発現プラスミドｐＢＳＧＤＨ−２を鋳型に、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ （ストラタジーン製）を用いてＧＤＨ遺伝子内の特定部位に変異を導入することにより、発現プラスミドｐＢＳＴＧＤＨ−３を得た。ｐＢＳＴＧＤＨ−３は配列番号３に相当するＤＮＡ分子をｌａｃプロモーター下に接続してなるプラスミドである。このプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセルに形質転換し、生産菌株とした。この形質転換株は、５００ｍｌ容坂口フラスコに入った２００ｍｌ前培養培地（０．５％酵母エキス、０．２５％ペプトン、０．５％塩化ナトリウム、０．５％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウム、ｐＨ７．４）に植菌し、３０℃１８０ｒｐｍで１６時間振とう培養した。得られた前培養液を、１０Ｌ容ジャーファーメンター中の６ＬのＧＤＨ生産培地（２．４％コウボエキス、２．４％ペプトン、１．２５％リン酸１水素２カリウム、０．２３％リン酸２水素１カリウム、０．４％グリセロール、０．１％消泡剤、１００μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウム、ｐＨ７．０）に全量投入し、通気量２Ｌ／分、攪拌速度３１０ｒｐｍ、槽内圧０．０２ＭＰａ、温度３７℃で２４時間通気攪拌培養を行った。得られた培養液を遠心分離することにより菌体を得、これを１Ｌの２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）に懸濁してフレンチプレス菌体破砕装置を用いて平均圧力８０ＭＰａで菌体を破砕した。さらにこの破砕液に１Ｌあたり１５２ｇの硫酸アンモニウムを加えて溶解し、６０℃１時間の加温を行い、さらに遠心分離によって沈殿を除いた。この溶液を、１５．２％硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）で緩衝化させたＯｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）にアプライしてＧＤＨを樹脂に吸着させ、さらに７．６％硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）で樹脂を洗浄した。そして硫酸アンモニウム濃度を７．６％から０％へ、同時にエチレングリコール濃度を０％から０．２％へ、それぞれグラジエントをかけながらバッファーを通液することでＧＤＨを溶出させた。次に、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）により緩衝化したＧ−２５ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂を用いて脱塩・バッファー置換を行った。最後に、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）で緩衝化したＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅにＧＤＨ溶液を通液することで夾雑タンパク質を樹脂に吸着させ、透過液を精製ＧＤＨとした。このように作製したサーモプロテウス属由来変異型ＧＤＨは配列番号４に示すアミノ酸配列を有している。これは、発明者らの別の検討において変異導入前の野生型ＧＤＨと比して３７℃以下の温度における比活性、補酵素であるＮＡＤに対する親和性、基質に対する親和性が向上した改変型ＧＤＨである。
【実施例２】
【００２５】
実施例１で作製したＧＤＨを用いて、以下の組成からなる溶液を作製した。
１０Ｕ／ｍｌ ＧＤＨ （実施例１で調製したもの）
０．０１〜０．５％ 界面活性剤
５０ｍＭ りん酸カリウム （ｐＨ８．０）
界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸、ドデシル硫酸ナトリウム、エマルゲンＡ６０、エマルゲン４３０を用いた。これら溶液と、組成中に界面活性剤を含まない溶液について、上述の活性測定例に示す方法に従ってＧＤＨ活性を測定した。界面活性剤を含まない場合のＧＤＨ活性を１００とした場合の相対活性に換算した結果を表１に示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】
これらの結果から、界面活性剤の共存によってＧＤＨ比活性が向上する効果があることが認められた。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明は、ＧＤＨを用いてグルコースを定量するためのキット並びにグルコースセンサに利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースデヒドロゲナーゼを界面活性剤と共存させてなる、グルコースデヒドロゲナーゼの活性向上方法。
【請求項２】
界面活性剤が、胆汁酸、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン誘導体およびドデシル硫酸ナトリウムからなる群より選ばれる１種類以上である、請求項１に記載の活性向上方法。
【請求項３】
界面活性剤の濃度が、０．０１％以上０．５％以下（Ｗ／Ｖ）である、請求項１または２に記載の活性向上方法。
【請求項４】
界面活性剤の量が、ＧＤＨのタンパク質としての重量１ｍｇあたり１０ｍｇ以上５００ｍｇ以下である、請求項１または２に記載の活性向上方法。
【請求項５】
グルコースデヒドロゲナーゼが、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび／またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドりん酸依存型である、請求項１〜４のいずれかに記載の活性向上方法。
【請求項６】
グルコースデヒドロゲナーゼが、超好熱性始原菌由来である、請求項５に記載の活性向上方法。
【請求項７】
超好熱性始原菌が、サーモプロテウス属である、請求項６に記載の活性向上方法。
【請求項８】
グルコースデヒドロゲナーゼが次の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかである、請求項１〜４のいずれかに記載の活性向上方法。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するポリペプチドからなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１ 若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドからなるタンパク質。
【請求項９】
少なくともグルコースデヒドロゲナーゼと界面活性剤とを含んでなる組成物。
【請求項１０】
界面活性剤が、胆汁酸、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン誘導体およびドデシル硫酸ナトリウムからなる群より選ばれる１種類以上である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
界面活性剤の濃度が、０．０１％以上０．５％以下（Ｗ／Ｖ）である、請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
界面活性剤の量が、ＧＤＨのタンパク質としての重量１ｍｇあたり１０ｍｇ以上５００ｍｇ以下である、請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１３】
グルコースデヒドロゲナーゼが、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび／またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドりん酸依存型である、請求項９〜１２のいずれかに記載の活性向上方法。
【請求項１４】
グルコースデヒドロゲナーゼが、超好熱性始原菌由来である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
超好熱性始原菌が、サーモプロテウス属である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
グルコースデヒドロゲナーゼが次の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかである、請求項９〜１２のいずれかに記載の組成物。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するポリペプチドからなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１ 若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドからなるタンパク質。
【請求項１】
グルコースデヒドロゲナーゼを界面活性剤と共存させてなる、グルコースデヒドロゲナーゼの活性向上方法。
【請求項２】
界面活性剤が、胆汁酸、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン誘導体およびドデシル硫酸ナトリウムからなる群より選ばれる１種類以上である、請求項１に記載の活性向上方法。
【請求項３】
界面活性剤の濃度が、０．０１％以上０．５％以下（Ｗ／Ｖ）である、請求項１または２に記載の活性向上方法。
【請求項４】
界面活性剤の量が、ＧＤＨのタンパク質としての重量１ｍｇあたり１０ｍｇ以上５００ｍｇ以下である、請求項１または２に記載の活性向上方法。
【請求項５】
グルコースデヒドロゲナーゼが、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび／またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドりん酸依存型である、請求項１〜４のいずれかに記載の活性向上方法。
【請求項６】
グルコースデヒドロゲナーゼが、超好熱性始原菌由来である、請求項５に記載の活性向上方法。
【請求項７】
超好熱性始原菌が、サーモプロテウス属である、請求項６に記載の活性向上方法。
【請求項８】
グルコースデヒドロゲナーゼが次の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかである、請求項１〜４のいずれかに記載の活性向上方法。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するポリペプチドからなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１ 若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドからなるタンパク質。
【請求項９】
少なくともグルコースデヒドロゲナーゼと界面活性剤とを含んでなる組成物。
【請求項１０】
界面活性剤が、胆汁酸、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン誘導体およびドデシル硫酸ナトリウムからなる群より選ばれる１種類以上である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
界面活性剤の濃度が、０．０１％以上０．５％以下（Ｗ／Ｖ）である、請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
界面活性剤の量が、ＧＤＨのタンパク質としての重量１ｍｇあたり１０ｍｇ以上５００ｍｇ以下である、請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１３】
グルコースデヒドロゲナーゼが、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび／またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドりん酸依存型である、請求項９〜１２のいずれかに記載の活性向上方法。
【請求項１４】
グルコースデヒドロゲナーゼが、超好熱性始原菌由来である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
超好熱性始原菌が、サーモプロテウス属である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
グルコースデヒドロゲナーゼが次の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかである、請求項９〜１２のいずれかに記載の組成物。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するポリペプチドからなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１ 若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドからなるタンパク質。
【公開番号】特開２０１１−５０２９９（Ｐ２０１１−５０２９９Ａ）
【公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２０１５３９（Ｐ２００９−２０１５３９）
【出願日】平成２１年９月１日（２００９．９．１）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月１日（２００９．９．１）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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