ケモカイン受容体作用増強剤
【課題】
経済的であり、短時間で効果的に作用するケモカイン受容体ＣＸＣＲ４の作用増強剤を提供することを課題とする。また、ＣＸＣＲ４の作用増強剤を用いたＣＸＣＲ４作用調節物質のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【解決手段】
Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステル若しくはＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー硫酸エステル、又はその薬学的に許容される塩により、ＣＸＣＲ４作用増強剤が提供される。造血幹細胞のＣＸＣＲ４作用を増強させることができれば、造血幹細胞移植後の骨髄へのホーミングや生着が増強されることが予想され、従来より少ない幹細胞数でも移植を成立させる可能性があり、造血幹細胞移植補助剤として使用することができる。さらに、このＣＸＣＲ４作用増強剤のＣＸＣＲ４増強作用を利用することで、効果的に感度よくＣＸＣＲ４作用調節物質をスクリーニングすることができる。
経済的であり、短時間で効果的に作用するケモカイン受容体ＣＸＣＲ４の作用増強剤を提供することを課題とする。また、ＣＸＣＲ４の作用増強剤を用いたＣＸＣＲ４作用調節物質のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【解決手段】
Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステル若しくはＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー硫酸エステル、又はその薬学的に許容される塩により、ＣＸＣＲ４作用増強剤が提供される。造血幹細胞のＣＸＣＲ４作用を増強させることができれば、造血幹細胞移植後の骨髄へのホーミングや生着が増強されることが予想され、従来より少ない幹細胞数でも移植を成立させる可能性があり、造血幹細胞移植補助剤として使用することができる。さらに、このＣＸＣＲ４作用増強剤のＣＸＣＲ４増強作用を利用することで、効果的に感度よくＣＸＣＲ４作用調節物質をスクリーニングすることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルの新規用途に関する。具体的には、Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルを有効成分として含むケモカイン受容体ＣＸＣＲ４作用増強剤、並びに該ＣＸＣＲ４作用増強剤を用いたＣＸＣＲ４作用調節物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカインは、ジスルフィド結合形成に関与するシステイン残基の性質により特徴付けられる走化性誘起作用タンパク質のスーパーファミリーである。ケモカインは、様々な生物学的反応を調節し、白血球及びリンパ球等の複数系統の生体臓器組織への補充を促進する。ケモカインのうち、Stromal cell-derived factor-1／間質細胞由来因子１α（ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２）は、リンパ球やマクロファージ、造血幹・前駆細胞等を適切な場所に誘導する強力な走化性誘起因子である。細胞が本来存在すべき臓器に特異的に遊走（走化）する現象を、「我が家に帰る」という意味で「ホーミング」という。例えば骨髄移植は、提供者の骨髄に存在する造血幹細胞を受容者の末梢血中に輸中することで成り立つが、該輸中された末梢血中の造血幹細胞は、受容者の骨髄を探してホーミングし、そこで造血を再開する。
【０００３】
ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２ケモカイン受容体として、ＣＸＣＲ４が知られている。ＣＸＣＲ４は７回膜貫通タンパク質にカップリングしたＧタンパク質の一種である。ＣＸＣＲ４はＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２を感知することにより、造血幹細胞を骨髄に維持したり、骨髄移植後に造血幹細胞を骨髄に誘導するうえで、不可欠な役割を果たしている。その他、ＣＸＣＲ４は、Ｂリンパ球の生成や小脳顆粒細胞層の形成、心室中隔の形成、血管の形成などにかかわるともいわれている。ＣＸＣＲ４を遮断したり、あるいは増強させたりすることで、標的細胞の移動や各種の作用を制御することができる。
【０００４】
ＣＸＣＲ４アンタゴニストとしてペプチドについて開示がある（特許文献１）。特許文献１には、該ペプチドは、造血幹細胞の骨髄部から末梢血部への動員作用を有し、また癌治療用医薬品及び自己免疫疾患治療用医薬品として使用できる旨の記載がある。
他のＣＸＣＲ４アンタゴニストとしてＡＭＤ３１００が、Ｇ−ＣＳＦによる造血幹細胞動員効果を増強させることが報告されている（非特許文献１）。
【０００５】
ＣＸＣＲ４アゴニストとしてのペプチドについても開示がある（特許文献２）。特許文献２には、該ペプチドは、ＳＤＦ−１ポリペプチド及びＳＤＦ−１ポリペプチド同属体を含み、自家、同種の末梢血幹細胞移植への使用や、細胞障害性物質（例えば抗癌剤）の細胞障害性に対する細胞の感受性を低下させるために使用できる旨の記載がある。
その他、ＣＸＣＲ４作用を増強させる方向に作用するものとして、フコイダン（非特許文献２）、ＴＧＦ−β１（Transforming growth factor β1）（非特許文献３、４）や、リゾホスファチジルコリン（Lysophosphatidylcholine：ＬＰＣ）（非特許文献５）が研究レベルで報告されている。ＴＧＦ−β１は、造血幹・前駆細胞に対して、反応性の減弱したＣＸＣＲ４の作用を定常状態にまで戻す作用があると報告されているが（非特許文献６）、その作用を通常より強める薬剤については未だ報告されていない。また、ＴＧＦ−β１及びＬＰＣのいずれも、効果発現のためには１８〜４８時間という比較的長時間にわたる暴露が必要といわれている（非特許文献３〜６）。
【０００６】
一方、Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステル等については、多く報告されており、天然のＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーの混合物であるコロミン酸を原料として生産することができる（特許文献３，４）。コロミン酸は、１９５７年にバリー等により発見された物質で、シアル酸（アセチルノイラミン酸）を構成単位とし、α２→８で結合した分子量３万程度の高分子ポリマーである。大腸菌、髄膜炎双球菌などの血清型分類において非常に重要である。また、医薬品や化粧品の原料としても重要である。医薬品としては、例えば抗ＨＩＶ剤（特許文献３，４）、抗ロタウイルス剤（特許文献５）、抗炎症剤（特許文献６）、抗血栓剤（特許文献７）、線維芽細胞増殖因子（特許文献８）等が開示されている。
【０００７】
しかしながら、Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステル等とＣＸＣＲ４との関係については報告されておらず、ＣＸＣＲ４に対する作用も不明であった。
【０００８】
【特許文献１】特表2003-532683号公報
【特許文献２】特表2003-530355号公報
【特許文献３】特開平6-279503号公報
【特許文献４】特許第3062906号公報
【特許文献５】特開平9-278660号公報
【特許文献６】特開平9-25576号公報
【特許文献７】特開平10-158174号公報
【特許文献８】特開平10-310602号公報
【非特許文献１】Transfusion, 45, p.295-300, 2005
【非特許文献２】BLOOD, 101 (11), p.4245-4252, 2003
【非特許文献３】Immunology, 114, p.565-574, 2005
【非特許文献４】Eur. J. Immunol., 32, p.193-202, 2002
【非特許文献５】J. Leukocyte Biology, 76, p.195-202, 2004
【非特許文献６】Blood First Edition, p.1-39, prepublished online Mar. 29, 2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、経済的であり、短時間で効果的に作用するケモカイン受容体ＣＸＣＲ４（以下、単に「ＣＸＣＲ４」という。）の作用増強剤を提供することを課題とする。また、ＣＸＣＲ４作用調節物質のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルが、ＣＸＣＲ４作用を増強することを見いだし、本発明を完成した。さらに、Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルのＣＸＣＲ４増強作用を利用することで、効果的にＣＸＣＲ４作用調節物質をスクリーニングすることができることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち本発明は以下よりなる。
１．Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルを有効成分として含有するケモカイン受容体ＣＸＣＲ４作用増強剤。
２．Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルを有効成分として含有する造血幹細胞移植補助剤。
３．前項１又は２に記載のＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルは、下記一般式（Ｉ）：
【化１】
[式中、Ｒは、同一又は異なって水素原子又はＳＯ３Ｈを示し、ｎは１〜１０００の整数を示す。但し、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基１分子あたりのＳＯ３Ｈ基の数は０．１〜３である。]
で表されるＮ−アセチルノイラミン酸モノマー硫酸エステル若しくはＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー硫酸エステル、又はその薬学的に許容される塩である、ＣＸＣＲ４作用増強剤又は造血幹細胞移植補助剤。
４．ＣＸＣＲ４の測定系において、前項３に記載の一般式（Ｉ）で表されるＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルの相互作用を調べることを特徴とするＣＸＣＲ４作用調節物質のスクリーニング方法。
５．ＣＸＣＲ４の測定系において、被験化合物を加えた系と、前項３に記載の一般式（Ｉ）で表されるＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルを加えた系での測定結果を比較することを特徴とするＣＸＣＲ４作用調節物質のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１２】
Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルは、in vitroの実験系において、３時間程度で効果的にＣＸＣＲ４作用を増強することが確認され、ＴＧＦ−β１やリゾホスファチジルコリンに比べて、短時間で効果を発揮することが判明した。これにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルを有効成分として含有するＣＸＣＲ４作用増強剤が得られる。造血幹細胞のＣＸＣＲ４作用を増強させることができれば、造血幹細胞移植後の骨髄へのホーミングや生着が増強されることが予想され、従来より少ない幹細胞数でも移植を成立させる可能性がある。したがって、本発明のＣＸＣＲ４作用増強剤は、造血幹細胞移植補助剤として使用することができる。さらに、Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルをＣＸＣＲ４の測定系に使用することにより、ＣＸＣＲ４作用調節物質を効果的にスクリーニングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の「Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステル」は、Ｎ−アセチルノイラミン酸モノマー硫酸エステル及びＮ−アセチルノイラミンホモポリマー硫酸エステルを含み、さらにこれらの薬学的に許容できる塩をも含む概念で使用される。本発明のＣＸＣＲ４作用増強剤は、Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルを有効成分として含み、いいかえればＮ−アセチルノイラミン酸モノマー硫酸エステル若しくはＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー硫酸エステル、又はその薬学的に許容できる塩を有効成分として含む。
【００１４】
本発明において、Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルは、例えば特許文献３〜８に記載のものを使用することができる。原料は特に限定されるものではないが、重合度（ｎ）が一定の数であるホモポリマーを用いても良く、例えばコロミン酸のような天然のＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーの混合物を用いても良い。また取得の由来も特に限定されず、天然から抽出、精製したものでも良く、化学的手法により合成したものであっても良い。
【００１５】
本発明のＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルは、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基１分子あたりのＳＯ３Ｈ基の数が０．１〜３であることが好ましい。このような化合物として、具体的には以下に示す一般式（Ｉ）で表すことができる。ここにおいて、式中Ｒは、同一又は異なって水素原子、又はＳＯ３Ｈを示し、ｎは１〜１０００の整数、好ましくは３〜２００の整数、より好ましくは６〜１００の整数を示す。本発明のＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルは、ｎが１種のみである単一化合物であっても良く、また、５〜１０００の範囲内でｎの値が異なる複数のＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーの硫酸エステルの混合物であってもよい。好ましい分子量としては、平均分子量が5,000〜50,000であり、より好ましくは8,000〜30,000である。分子量は、プルラン、シアル酸オリゴマーなどを標準物質とし、ＨＰＬＣにより測定することができる。
【００１６】
【化２】
【００１７】
本発明におけるＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルは、以下の方法に従い製造することができる。Ｎ−アセチルノイラミン酸モノマー若しくはＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー１重量部に対し、溶媒の存在下又は不存在下に触媒０．５〜２００重量部、硫酸化剤０．２〜３０重量部を反応させる。反応時間は０．１〜４８時間程度であり、反応温度は−４０〜９０℃程度である。
【００１８】
触媒としては、ピリジン、ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミンなどが挙げられる。硫酸化剤としては、クロロスルホン酸、ピペリジン硫酸、サルファトリオキシド・トリメチルアミン錯体などが挙げられる。触媒としてピリジンなどを過剰量使用する場合には、溶媒を使用する必要はない。溶媒は、必ずしも使用する必要はないが、使用する場合には、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ホルムアミドなどを使用することができる。
硫酸化反応終了後は、公知の方法、例えば濃縮、ゲルろ過、イオン交換などの各種クロマトグラフィー、再沈殿、透析などの処理を行うことができる。
【００１９】
本発明において、薬学的に許容される塩とは、ナトリウム、カリウム、リチウムなどのアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属塩などが挙げられる。これらの塩は、Ｎ−アセチルノイラミン酸若しくはそのホモポリマーの硫酸化反応液を水酸化ナトリウム、炭酸カリウムなどの塩で中和することで製造することもでき、また、いったん硫酸化糖の遊離の酸として得た後、それを用いて塩の形態としてもよい。更に、イオン交換樹脂、イオン交換ゲル、イオン交換セルロースカラムを用いて塩の形態にしても良い。
【００２０】
本発明のＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルは、薬学的に許容される種々の添加剤とともに、ＣＸＣＲ４作用増強剤として用いることができる。本発明のＣＸＣＲ４作用増強剤は、特に限定されるものではないが、例えば、注射剤や、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、乳剤などの経口剤などの種々の形態の医薬製剤として用いることができる。また、本発明のＣＸＣＲ４作用増強剤は、前記医薬製剤のほか、健康食品、健康飲料としても用いることができる。
【００２１】
本発明のＣＸＣＲ４作用増強剤を注射剤として調製する場合、添加剤としては、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、張化剤等を適宜配合することができる。該注射剤は、例えば静脈内、筋肉内又は皮下に投与される。また、経口剤として調製する場合は、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、矯臭剤、矯味剤などを適宜配合することができる。
【００２２】
また、本発明のＣＸＣＲ４作用増強剤は、単剤で、又は既に市販されている製剤と併用して使用することができる。特に本発明のＣＸＣＲ４作用増強剤を造血幹細胞移植補助剤として使用する場合には、造血細胞移植用ドナー細胞（自家・同種の骨髄細胞、自家・同種の末梢血幹細胞、または臍帯血幹細胞）を本剤により処理し、その後、レシピエントに輸注することで効率のよい移植が成立する可能性がある。
【００２３】
本発明のＣＸＣＲ４作用増強剤を単剤として使用する場合の投与量は、投与すべき患者の年齢、性別、体重、症状などにより変動するが、有効成分として含有されるＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルは、一般的には、ヒト成人に対する１投与単位当たり、経口剤では０．１〜７０００ｍｇ程度、好ましくは２０〜１０００ｍｇ、注射剤では０．１〜７０００ｍｇ、好ましくは２０〜２０００ｍｇ程度の間から適宜選択することができる。また、既に市販されている製剤と併用して使用する場合は、症状ならびに併用される市販剤の種類、投与量との関係において、適宜決定することができる。
【００２４】
さらに、本発明のＣＸＣＲ４作用増強剤は、ＣＸＣＲ４の測定系において試薬として用いることができる。例えば、試料中のＣＸＣＲ４の有無を確認したい場合において、通常のＣＸＣＲ４の測定系では検出限界以下のＣＸＣＲ４しか存在しない場合であっても、本発明のＣＸＣＲ４作用増強剤とともに検出検査を行うと、微量のＣＸＣＲ４の作用が増強されることで、感度良くＣＸＣＲ４の有無を確認することができる。
【００２５】
ケモカインとその受容体ＣＸＣＲ４を介した情報伝達により、走化性の誘導、細胞増殖、アポトーシスの減少等をもたらすといわれている。本発明のＣＸＣＲ４作用増強剤は、上記の細胞増殖、アポトーシスの減少等の効果を利用することで、特許文献２に記載のＣＸＣＲ４アゴニストペプチドと同様、自家、同種の末梢血幹細胞移植への使用や、細胞障害性物質（例えば抗癌剤）の細胞障害性に対する細胞の感受性を低下させるための用途が期待される。また、造血幹細胞のＣＸＣＲ４作用を増強させることができれば、造血幹細胞移植後の骨髄へのホーミングや生着が増強されることが予想され、従来より少ない幹細胞数でも移植を成立させる可能性がある。したがって、本発明のＣＸＣＲ４作用増強剤は、造血幹細胞移植補助剤として使用することができる。
【００２６】
一方、ケモカインとその受容体ＣＸＣＲ４を介した情報伝達は、腫瘍細胞の増殖、ＨＩＶ感染のメカニズム等にも関与するといわれている。ＣＸＣＲ４の作用を抑制することで、腫瘍細胞の増殖抑制や、ＨＩＶ感染抑制の効果も期待できる。このように、ＣＸＣＲ４作用の調節は、生体機能を維持するために重要である。そこで、ＣＸＣＲ４の作用を調節しうる物質をスクリーニングし、新規なＣＸＣＲ４アゴニスト若しくはアンタゴニスト等を得ることができれば、各種疾患の治療に応用されうる。
【００２７】
本発明は、ＣＸＣＲ４作用調節物質のスクリーニング方法にも及ぶ。具体的には、ＣＸＣＲ４の測定系に、被験化合物及びＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルを加え、該被験化合物とＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルの相互作用を評価する方法が挙げられる。他として、ＣＸＣＲ４の測定系において、被験化合物を加えた系とＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルを加えた系での測定結果を比較し、評価する方法も挙げられる。
【００２８】
ＣＸＣＲ４の測定系とは、自体公知の測定系であってもよいし、今後開発されうる新規な測定系であっても良い。具体的には、ＣＸＣＲ４タンパク質の検出系が挙げられ、フローサイトメトリーやウエスタンブロット法などを適用することができる。また、ケモカインの細胞走化性を利用した走化性試験(Chemotaxis Assay)などを適用することができる。例えば、ＣＸＣＲ４と、化学的に合成若しくは遺伝子組換により産生したＳＤＦ−１を用いて白血球等の細胞の遊走能を調べることによる。また、ＳＤＦ−１によるシグナル伝達の結果、細胞内Ｃａ２＋流入量の増加を測定するなど、ＳＤＦ−１のケモカインとしての生物学的活性を調べるなどの方法も適用することができる。
【実施例】
【００２９】
以下実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではないことは明らかである。
【００３０】
（実施例１）Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー硫酸エステルの調製
ジメチルホルムアミド２０ｍＬに平均分子量約17,000のコロミン酸９０ｍｇ、サルファトリオキシド・ピリジン複合体４７７ｍｇ及びジメチルアミノピリジン３７ｍｇを加え、３０℃にて２４時間撹拌した。反応後氷冷し、反応液を１Ｍ炭酸水素ナトリウム５０ｍＬに滴下し、中和した。中和後、濾過により固形物を分離し、透析チューブ（VISKASE SALES社製、分画分子量12,000〜14,000）を用いて、透析を行った。
透析後、ナトリウムイオン型のイオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ−１２０Ｂ、オルガノ（株）社製）カラムに通した。カラム流出液を減圧下で濃縮し、凍結乾燥により、平均分子量約22,000の標記化合物１２６ｍｇを粉体として得た。
本実施例において、得られたＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー硫酸エステルを、便宜上、硫酸化コロミン酸（ＳＣＡ）と呼ぶ。
【００３１】
（試験例１）マウス造血前駆細胞とＳＤＦ−１の結合能によるＣＸＣＲ４作用の確認
マウス造血前駆細胞株（ＦＤＣＰ−ｍｉｘ）を、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に浮遊させ、１０６／ｍＬの細胞浮遊液を調製した。実施例１で調製した硫酸化コロミン酸（ＳＣＡ）をＰＢＳに溶解したものを、最終濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように該細胞浮遊液に加え、３７℃で３０分処理した。対照としてＳＣＡを加えないＰＢＳのみの系について同様の処理を行った。その後、ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１α受容体検出用キット(FLUOROKINE Receptor Detection Kit CXCL12/SDF-1, R&D Systems社製)を用いて、ＳＤＦ−１のＦＤＣＰ−ｍｉｘへの特異結合を調べた。具体的には、キットの使用説明書に従い、フローサイトメトリーを用いて計測した。測定機器は、FACScan (Becton Dickinson社)を使用した。
【００３２】
その結果を図１に示した。ＳＣＡを加えた系（Ｂ）では、ＳＣＡを加えない対照の系（Ａ）に比べ、ＦＤＣＰ−ｍｉｘにＳＤＦ−１がよく結合していることが観察された(a)。各々の系について、抗ＳＤＦ−１抗体を混合した系(b)及びコントロールタンパク質（大豆タンパク質トリプシン阻害剤）を用いた系(c)についても調べた。（Ａ）及び（Ｂ）について、(b)の系では、コントロールタンパク質の系(c)と同様の傾向を示していることから、(a)の結果は、ＦＤＣＰ−ｍｉｘにＳＤＦ−１が結合した結果を示していることが確認された。これにより、ＦＤＣＰ−ｍｉｘの細胞表面に発現したＣＸＣＲ４の作用が増強していることが推察された。
【００３３】
フローサイトメトリーで得られた結果について、蛍光強度を数値化し、コントロールタンパク質の系(c)で得られた結果を差し引いた値を図２に示した。その結果、ＳＣＡで処理した場合は、対照のＰＢＳのみの場合に比べて２倍以上の蛍光強度が確認された。これにより、ＳＣＡで処理した場合、すなわちＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー硫酸エステルで処理した場合は、ＣＸＣＲ４の作用が２倍以上増強することが推察された。
【００３４】
（試験例２）ＳＤＦ−１の走化性によるＣＸＣＲ４作用の確認
マウス造血前駆細胞株（ＦＤＣＰ−ｍｉｘ）を、Iscove's Modified Dulbecco's Medium（ＩＭＤＭ）に浮遊させ、１０７／ｍＬの細胞浮遊液を調製した。実施例１で調製した硫酸化コロミン酸（ＳＣＡ）を最終濃度が１ｍｇ／ｍＬになるようにＰＢＳに溶解したものを該細胞浮遊液に加え、３７℃で３０分処理した。その後、ＩＭＤＭ＋０．５ｖ／ｖ％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で細胞を２回洗浄した。トランスウエル（Transwell, 直径６．５ｍｍ、ポアサイズ５μｍ、 Corning社）の下層（６００μＬ容量）に、ＰＢＳ若しくは遺伝子組換ＳＤＦ−１（R&D Systems社）１０μｇ／ｍＬを１２μＬ（最終濃度２００ｎｇ／ｍＬ）加えた。トランスウェルの上層に１０６個の細胞を加え、３７℃で３時間放置した後、下層に遊走した細胞数を血球計算板を用いた目算により計測し、細胞の走化性を調べた。その結果を図３に示した。
【００３５】
ＳＤＦ−１を加えない系に比べ、ＳＤＦ−１を加えた系では細胞の走化性が明らかに観察され、さらに細胞をＳＣＡ処理した場合は、処理しない場合に比べてＳＤＦ−１に対する走化性が３倍以上に観察された（ｎ＝３）。これにより、ＳＣＡで処理した場合、すなわちＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー硫酸エステルで処理した場合は、ＣＸＣＲ４の作用が３倍以上増強することが推察された。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
以上説明したように、Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルは、in vitroの実験系において、効果的にＣＸＣＲ４の作用を増強することが確認され、ＴＧＦ−β１やリゾホスファチジルコリンに比べて、短時間で効果を発揮することが判明した。
これにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルを有効成分として含有するＣＸＣＲ４作用増強剤が得られる。造血幹細胞のＣＸＣＲ４作用を増強させることができれば、造血幹細胞移植後の骨髄へのホーミングや生着が増強されることが予想され、従来より少ない幹細胞数でも移植を成立させられる可能性がある。したがって、本発明のＣＸＣＲ４作用増強剤は、造血幹細胞移植補助剤として使用することができる。
さらに、被験化合物のＣＸＣＲ４作用調節能の測定において、Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルを測定系に使用することで、ＣＸＣＲ４作用調節物質を効果的に感度よくスクリーニングすることができる。そこで、新規なＣＸＣＲ４作用調節物質、例えばＣＸＣＲ４アゴニスト若しくはアンタゴニスト等を得ることができ、各種疾患の治療に応用されうる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】マウス造血前駆細胞株（ＦＤＣＰ−ｍｉｘ）とＳＤＦ−１の結合能を、フローサイトメトリーで調べた結果を示す図である。（試験例１）
【図２】ＦＤＣＰ−ｍｉｘとＳＤＦ−１の結合能を蛍光強度で示す図である。（試験例１）
【図３】ＦＤＣＰ−ｍｉｘの走化性に及ぼす影響を示す図である。（試験例２）
【符号の説明】
【００３８】
ａ ＦＤＣＰ−ｍｉｘとＳＤＦ−１の結合（図１）
ｂ 抗ＳＤＦ−１抗体を加えた場合（図１）
ｃ ＦＤＣＰ−ｍｉｘとコントロールタンパク質の結合（図１）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルの新規用途に関する。具体的には、Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルを有効成分として含むケモカイン受容体ＣＸＣＲ４作用増強剤、並びに該ＣＸＣＲ４作用増強剤を用いたＣＸＣＲ４作用調節物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカインは、ジスルフィド結合形成に関与するシステイン残基の性質により特徴付けられる走化性誘起作用タンパク質のスーパーファミリーである。ケモカインは、様々な生物学的反応を調節し、白血球及びリンパ球等の複数系統の生体臓器組織への補充を促進する。ケモカインのうち、Stromal cell-derived factor-1／間質細胞由来因子１α（ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２）は、リンパ球やマクロファージ、造血幹・前駆細胞等を適切な場所に誘導する強力な走化性誘起因子である。細胞が本来存在すべき臓器に特異的に遊走（走化）する現象を、「我が家に帰る」という意味で「ホーミング」という。例えば骨髄移植は、提供者の骨髄に存在する造血幹細胞を受容者の末梢血中に輸中することで成り立つが、該輸中された末梢血中の造血幹細胞は、受容者の骨髄を探してホーミングし、そこで造血を再開する。
【０００３】
ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２ケモカイン受容体として、ＣＸＣＲ４が知られている。ＣＸＣＲ４は７回膜貫通タンパク質にカップリングしたＧタンパク質の一種である。ＣＸＣＲ４はＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２を感知することにより、造血幹細胞を骨髄に維持したり、骨髄移植後に造血幹細胞を骨髄に誘導するうえで、不可欠な役割を果たしている。その他、ＣＸＣＲ４は、Ｂリンパ球の生成や小脳顆粒細胞層の形成、心室中隔の形成、血管の形成などにかかわるともいわれている。ＣＸＣＲ４を遮断したり、あるいは増強させたりすることで、標的細胞の移動や各種の作用を制御することができる。
【０００４】
ＣＸＣＲ４アンタゴニストとしてペプチドについて開示がある（特許文献１）。特許文献１には、該ペプチドは、造血幹細胞の骨髄部から末梢血部への動員作用を有し、また癌治療用医薬品及び自己免疫疾患治療用医薬品として使用できる旨の記載がある。
他のＣＸＣＲ４アンタゴニストとしてＡＭＤ３１００が、Ｇ−ＣＳＦによる造血幹細胞動員効果を増強させることが報告されている（非特許文献１）。
【０００５】
ＣＸＣＲ４アゴニストとしてのペプチドについても開示がある（特許文献２）。特許文献２には、該ペプチドは、ＳＤＦ−１ポリペプチド及びＳＤＦ−１ポリペプチド同属体を含み、自家、同種の末梢血幹細胞移植への使用や、細胞障害性物質（例えば抗癌剤）の細胞障害性に対する細胞の感受性を低下させるために使用できる旨の記載がある。
その他、ＣＸＣＲ４作用を増強させる方向に作用するものとして、フコイダン（非特許文献２）、ＴＧＦ−β１（Transforming growth factor β1）（非特許文献３、４）や、リゾホスファチジルコリン（Lysophosphatidylcholine：ＬＰＣ）（非特許文献５）が研究レベルで報告されている。ＴＧＦ−β１は、造血幹・前駆細胞に対して、反応性の減弱したＣＸＣＲ４の作用を定常状態にまで戻す作用があると報告されているが（非特許文献６）、その作用を通常より強める薬剤については未だ報告されていない。また、ＴＧＦ−β１及びＬＰＣのいずれも、効果発現のためには１８〜４８時間という比較的長時間にわたる暴露が必要といわれている（非特許文献３〜６）。
【０００６】
一方、Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステル等については、多く報告されており、天然のＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーの混合物であるコロミン酸を原料として生産することができる（特許文献３，４）。コロミン酸は、１９５７年にバリー等により発見された物質で、シアル酸（アセチルノイラミン酸）を構成単位とし、α２→８で結合した分子量３万程度の高分子ポリマーである。大腸菌、髄膜炎双球菌などの血清型分類において非常に重要である。また、医薬品や化粧品の原料としても重要である。医薬品としては、例えば抗ＨＩＶ剤（特許文献３，４）、抗ロタウイルス剤（特許文献５）、抗炎症剤（特許文献６）、抗血栓剤（特許文献７）、線維芽細胞増殖因子（特許文献８）等が開示されている。
【０００７】
しかしながら、Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステル等とＣＸＣＲ４との関係については報告されておらず、ＣＸＣＲ４に対する作用も不明であった。
【０００８】
【特許文献１】特表2003-532683号公報
【特許文献２】特表2003-530355号公報
【特許文献３】特開平6-279503号公報
【特許文献４】特許第3062906号公報
【特許文献５】特開平9-278660号公報
【特許文献６】特開平9-25576号公報
【特許文献７】特開平10-158174号公報
【特許文献８】特開平10-310602号公報
【非特許文献１】Transfusion, 45, p.295-300, 2005
【非特許文献２】BLOOD, 101 (11), p.4245-4252, 2003
【非特許文献３】Immunology, 114, p.565-574, 2005
【非特許文献４】Eur. J. Immunol., 32, p.193-202, 2002
【非特許文献５】J. Leukocyte Biology, 76, p.195-202, 2004
【非特許文献６】Blood First Edition, p.1-39, prepublished online Mar. 29, 2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、経済的であり、短時間で効果的に作用するケモカイン受容体ＣＸＣＲ４（以下、単に「ＣＸＣＲ４」という。）の作用増強剤を提供することを課題とする。また、ＣＸＣＲ４作用調節物質のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルが、ＣＸＣＲ４作用を増強することを見いだし、本発明を完成した。さらに、Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルのＣＸＣＲ４増強作用を利用することで、効果的にＣＸＣＲ４作用調節物質をスクリーニングすることができることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち本発明は以下よりなる。
１．Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルを有効成分として含有するケモカイン受容体ＣＸＣＲ４作用増強剤。
２．Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルを有効成分として含有する造血幹細胞移植補助剤。
３．前項１又は２に記載のＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルは、下記一般式（Ｉ）：
【化１】
[式中、Ｒは、同一又は異なって水素原子又はＳＯ３Ｈを示し、ｎは１〜１０００の整数を示す。但し、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基１分子あたりのＳＯ３Ｈ基の数は０．１〜３である。]
で表されるＮ−アセチルノイラミン酸モノマー硫酸エステル若しくはＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー硫酸エステル、又はその薬学的に許容される塩である、ＣＸＣＲ４作用増強剤又は造血幹細胞移植補助剤。
４．ＣＸＣＲ４の測定系において、前項３に記載の一般式（Ｉ）で表されるＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルの相互作用を調べることを特徴とするＣＸＣＲ４作用調節物質のスクリーニング方法。
５．ＣＸＣＲ４の測定系において、被験化合物を加えた系と、前項３に記載の一般式（Ｉ）で表されるＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルを加えた系での測定結果を比較することを特徴とするＣＸＣＲ４作用調節物質のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１２】
Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルは、in vitroの実験系において、３時間程度で効果的にＣＸＣＲ４作用を増強することが確認され、ＴＧＦ−β１やリゾホスファチジルコリンに比べて、短時間で効果を発揮することが判明した。これにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルを有効成分として含有するＣＸＣＲ４作用増強剤が得られる。造血幹細胞のＣＸＣＲ４作用を増強させることができれば、造血幹細胞移植後の骨髄へのホーミングや生着が増強されることが予想され、従来より少ない幹細胞数でも移植を成立させる可能性がある。したがって、本発明のＣＸＣＲ４作用増強剤は、造血幹細胞移植補助剤として使用することができる。さらに、Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルをＣＸＣＲ４の測定系に使用することにより、ＣＸＣＲ４作用調節物質を効果的にスクリーニングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の「Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステル」は、Ｎ−アセチルノイラミン酸モノマー硫酸エステル及びＮ−アセチルノイラミンホモポリマー硫酸エステルを含み、さらにこれらの薬学的に許容できる塩をも含む概念で使用される。本発明のＣＸＣＲ４作用増強剤は、Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルを有効成分として含み、いいかえればＮ−アセチルノイラミン酸モノマー硫酸エステル若しくはＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー硫酸エステル、又はその薬学的に許容できる塩を有効成分として含む。
【００１４】
本発明において、Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルは、例えば特許文献３〜８に記載のものを使用することができる。原料は特に限定されるものではないが、重合度（ｎ）が一定の数であるホモポリマーを用いても良く、例えばコロミン酸のような天然のＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーの混合物を用いても良い。また取得の由来も特に限定されず、天然から抽出、精製したものでも良く、化学的手法により合成したものであっても良い。
【００１５】
本発明のＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルは、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基１分子あたりのＳＯ３Ｈ基の数が０．１〜３であることが好ましい。このような化合物として、具体的には以下に示す一般式（Ｉ）で表すことができる。ここにおいて、式中Ｒは、同一又は異なって水素原子、又はＳＯ３Ｈを示し、ｎは１〜１０００の整数、好ましくは３〜２００の整数、より好ましくは６〜１００の整数を示す。本発明のＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルは、ｎが１種のみである単一化合物であっても良く、また、５〜１０００の範囲内でｎの値が異なる複数のＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマーの硫酸エステルの混合物であってもよい。好ましい分子量としては、平均分子量が5,000〜50,000であり、より好ましくは8,000〜30,000である。分子量は、プルラン、シアル酸オリゴマーなどを標準物質とし、ＨＰＬＣにより測定することができる。
【００１６】
【化２】
【００１７】
本発明におけるＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルは、以下の方法に従い製造することができる。Ｎ−アセチルノイラミン酸モノマー若しくはＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー１重量部に対し、溶媒の存在下又は不存在下に触媒０．５〜２００重量部、硫酸化剤０．２〜３０重量部を反応させる。反応時間は０．１〜４８時間程度であり、反応温度は−４０〜９０℃程度である。
【００１８】
触媒としては、ピリジン、ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミンなどが挙げられる。硫酸化剤としては、クロロスルホン酸、ピペリジン硫酸、サルファトリオキシド・トリメチルアミン錯体などが挙げられる。触媒としてピリジンなどを過剰量使用する場合には、溶媒を使用する必要はない。溶媒は、必ずしも使用する必要はないが、使用する場合には、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ホルムアミドなどを使用することができる。
硫酸化反応終了後は、公知の方法、例えば濃縮、ゲルろ過、イオン交換などの各種クロマトグラフィー、再沈殿、透析などの処理を行うことができる。
【００１９】
本発明において、薬学的に許容される塩とは、ナトリウム、カリウム、リチウムなどのアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属塩などが挙げられる。これらの塩は、Ｎ−アセチルノイラミン酸若しくはそのホモポリマーの硫酸化反応液を水酸化ナトリウム、炭酸カリウムなどの塩で中和することで製造することもでき、また、いったん硫酸化糖の遊離の酸として得た後、それを用いて塩の形態としてもよい。更に、イオン交換樹脂、イオン交換ゲル、イオン交換セルロースカラムを用いて塩の形態にしても良い。
【００２０】
本発明のＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルは、薬学的に許容される種々の添加剤とともに、ＣＸＣＲ４作用増強剤として用いることができる。本発明のＣＸＣＲ４作用増強剤は、特に限定されるものではないが、例えば、注射剤や、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、乳剤などの経口剤などの種々の形態の医薬製剤として用いることができる。また、本発明のＣＸＣＲ４作用増強剤は、前記医薬製剤のほか、健康食品、健康飲料としても用いることができる。
【００２１】
本発明のＣＸＣＲ４作用増強剤を注射剤として調製する場合、添加剤としては、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、張化剤等を適宜配合することができる。該注射剤は、例えば静脈内、筋肉内又は皮下に投与される。また、経口剤として調製する場合は、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、矯臭剤、矯味剤などを適宜配合することができる。
【００２２】
また、本発明のＣＸＣＲ４作用増強剤は、単剤で、又は既に市販されている製剤と併用して使用することができる。特に本発明のＣＸＣＲ４作用増強剤を造血幹細胞移植補助剤として使用する場合には、造血細胞移植用ドナー細胞（自家・同種の骨髄細胞、自家・同種の末梢血幹細胞、または臍帯血幹細胞）を本剤により処理し、その後、レシピエントに輸注することで効率のよい移植が成立する可能性がある。
【００２３】
本発明のＣＸＣＲ４作用増強剤を単剤として使用する場合の投与量は、投与すべき患者の年齢、性別、体重、症状などにより変動するが、有効成分として含有されるＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルは、一般的には、ヒト成人に対する１投与単位当たり、経口剤では０．１〜７０００ｍｇ程度、好ましくは２０〜１０００ｍｇ、注射剤では０．１〜７０００ｍｇ、好ましくは２０〜２０００ｍｇ程度の間から適宜選択することができる。また、既に市販されている製剤と併用して使用する場合は、症状ならびに併用される市販剤の種類、投与量との関係において、適宜決定することができる。
【００２４】
さらに、本発明のＣＸＣＲ４作用増強剤は、ＣＸＣＲ４の測定系において試薬として用いることができる。例えば、試料中のＣＸＣＲ４の有無を確認したい場合において、通常のＣＸＣＲ４の測定系では検出限界以下のＣＸＣＲ４しか存在しない場合であっても、本発明のＣＸＣＲ４作用増強剤とともに検出検査を行うと、微量のＣＸＣＲ４の作用が増強されることで、感度良くＣＸＣＲ４の有無を確認することができる。
【００２５】
ケモカインとその受容体ＣＸＣＲ４を介した情報伝達により、走化性の誘導、細胞増殖、アポトーシスの減少等をもたらすといわれている。本発明のＣＸＣＲ４作用増強剤は、上記の細胞増殖、アポトーシスの減少等の効果を利用することで、特許文献２に記載のＣＸＣＲ４アゴニストペプチドと同様、自家、同種の末梢血幹細胞移植への使用や、細胞障害性物質（例えば抗癌剤）の細胞障害性に対する細胞の感受性を低下させるための用途が期待される。また、造血幹細胞のＣＸＣＲ４作用を増強させることができれば、造血幹細胞移植後の骨髄へのホーミングや生着が増強されることが予想され、従来より少ない幹細胞数でも移植を成立させる可能性がある。したがって、本発明のＣＸＣＲ４作用増強剤は、造血幹細胞移植補助剤として使用することができる。
【００２６】
一方、ケモカインとその受容体ＣＸＣＲ４を介した情報伝達は、腫瘍細胞の増殖、ＨＩＶ感染のメカニズム等にも関与するといわれている。ＣＸＣＲ４の作用を抑制することで、腫瘍細胞の増殖抑制や、ＨＩＶ感染抑制の効果も期待できる。このように、ＣＸＣＲ４作用の調節は、生体機能を維持するために重要である。そこで、ＣＸＣＲ４の作用を調節しうる物質をスクリーニングし、新規なＣＸＣＲ４アゴニスト若しくはアンタゴニスト等を得ることができれば、各種疾患の治療に応用されうる。
【００２７】
本発明は、ＣＸＣＲ４作用調節物質のスクリーニング方法にも及ぶ。具体的には、ＣＸＣＲ４の測定系に、被験化合物及びＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルを加え、該被験化合物とＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルの相互作用を評価する方法が挙げられる。他として、ＣＸＣＲ４の測定系において、被験化合物を加えた系とＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルを加えた系での測定結果を比較し、評価する方法も挙げられる。
【００２８】
ＣＸＣＲ４の測定系とは、自体公知の測定系であってもよいし、今後開発されうる新規な測定系であっても良い。具体的には、ＣＸＣＲ４タンパク質の検出系が挙げられ、フローサイトメトリーやウエスタンブロット法などを適用することができる。また、ケモカインの細胞走化性を利用した走化性試験(Chemotaxis Assay)などを適用することができる。例えば、ＣＸＣＲ４と、化学的に合成若しくは遺伝子組換により産生したＳＤＦ−１を用いて白血球等の細胞の遊走能を調べることによる。また、ＳＤＦ−１によるシグナル伝達の結果、細胞内Ｃａ２＋流入量の増加を測定するなど、ＳＤＦ−１のケモカインとしての生物学的活性を調べるなどの方法も適用することができる。
【実施例】
【００２９】
以下実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではないことは明らかである。
【００３０】
（実施例１）Ｎ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー硫酸エステルの調製
ジメチルホルムアミド２０ｍＬに平均分子量約17,000のコロミン酸９０ｍｇ、サルファトリオキシド・ピリジン複合体４７７ｍｇ及びジメチルアミノピリジン３７ｍｇを加え、３０℃にて２４時間撹拌した。反応後氷冷し、反応液を１Ｍ炭酸水素ナトリウム５０ｍＬに滴下し、中和した。中和後、濾過により固形物を分離し、透析チューブ（VISKASE SALES社製、分画分子量12,000〜14,000）を用いて、透析を行った。
透析後、ナトリウムイオン型のイオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ−１２０Ｂ、オルガノ（株）社製）カラムに通した。カラム流出液を減圧下で濃縮し、凍結乾燥により、平均分子量約22,000の標記化合物１２６ｍｇを粉体として得た。
本実施例において、得られたＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー硫酸エステルを、便宜上、硫酸化コロミン酸（ＳＣＡ）と呼ぶ。
【００３１】
（試験例１）マウス造血前駆細胞とＳＤＦ−１の結合能によるＣＸＣＲ４作用の確認
マウス造血前駆細胞株（ＦＤＣＰ−ｍｉｘ）を、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に浮遊させ、１０６／ｍＬの細胞浮遊液を調製した。実施例１で調製した硫酸化コロミン酸（ＳＣＡ）をＰＢＳに溶解したものを、最終濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように該細胞浮遊液に加え、３７℃で３０分処理した。対照としてＳＣＡを加えないＰＢＳのみの系について同様の処理を行った。その後、ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１α受容体検出用キット(FLUOROKINE Receptor Detection Kit CXCL12/SDF-1, R&D Systems社製)を用いて、ＳＤＦ−１のＦＤＣＰ−ｍｉｘへの特異結合を調べた。具体的には、キットの使用説明書に従い、フローサイトメトリーを用いて計測した。測定機器は、FACScan (Becton Dickinson社)を使用した。
【００３２】
その結果を図１に示した。ＳＣＡを加えた系（Ｂ）では、ＳＣＡを加えない対照の系（Ａ）に比べ、ＦＤＣＰ−ｍｉｘにＳＤＦ−１がよく結合していることが観察された(a)。各々の系について、抗ＳＤＦ−１抗体を混合した系(b)及びコントロールタンパク質（大豆タンパク質トリプシン阻害剤）を用いた系(c)についても調べた。（Ａ）及び（Ｂ）について、(b)の系では、コントロールタンパク質の系(c)と同様の傾向を示していることから、(a)の結果は、ＦＤＣＰ−ｍｉｘにＳＤＦ−１が結合した結果を示していることが確認された。これにより、ＦＤＣＰ−ｍｉｘの細胞表面に発現したＣＸＣＲ４の作用が増強していることが推察された。
【００３３】
フローサイトメトリーで得られた結果について、蛍光強度を数値化し、コントロールタンパク質の系(c)で得られた結果を差し引いた値を図２に示した。その結果、ＳＣＡで処理した場合は、対照のＰＢＳのみの場合に比べて２倍以上の蛍光強度が確認された。これにより、ＳＣＡで処理した場合、すなわちＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー硫酸エステルで処理した場合は、ＣＸＣＲ４の作用が２倍以上増強することが推察された。
【００３４】
（試験例２）ＳＤＦ−１の走化性によるＣＸＣＲ４作用の確認
マウス造血前駆細胞株（ＦＤＣＰ−ｍｉｘ）を、Iscove's Modified Dulbecco's Medium（ＩＭＤＭ）に浮遊させ、１０７／ｍＬの細胞浮遊液を調製した。実施例１で調製した硫酸化コロミン酸（ＳＣＡ）を最終濃度が１ｍｇ／ｍＬになるようにＰＢＳに溶解したものを該細胞浮遊液に加え、３７℃で３０分処理した。その後、ＩＭＤＭ＋０．５ｖ／ｖ％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で細胞を２回洗浄した。トランスウエル（Transwell, 直径６．５ｍｍ、ポアサイズ５μｍ、 Corning社）の下層（６００μＬ容量）に、ＰＢＳ若しくは遺伝子組換ＳＤＦ−１（R&D Systems社）１０μｇ／ｍＬを１２μＬ（最終濃度２００ｎｇ／ｍＬ）加えた。トランスウェルの上層に１０６個の細胞を加え、３７℃で３時間放置した後、下層に遊走した細胞数を血球計算板を用いた目算により計測し、細胞の走化性を調べた。その結果を図３に示した。
【００３５】
ＳＤＦ−１を加えない系に比べ、ＳＤＦ−１を加えた系では細胞の走化性が明らかに観察され、さらに細胞をＳＣＡ処理した場合は、処理しない場合に比べてＳＤＦ−１に対する走化性が３倍以上に観察された（ｎ＝３）。これにより、ＳＣＡで処理した場合、すなわちＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー硫酸エステルで処理した場合は、ＣＸＣＲ４の作用が３倍以上増強することが推察された。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
以上説明したように、Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルは、in vitroの実験系において、効果的にＣＸＣＲ４の作用を増強することが確認され、ＴＧＦ−β１やリゾホスファチジルコリンに比べて、短時間で効果を発揮することが判明した。
これにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルを有効成分として含有するＣＸＣＲ４作用増強剤が得られる。造血幹細胞のＣＸＣＲ４作用を増強させることができれば、造血幹細胞移植後の骨髄へのホーミングや生着が増強されることが予想され、従来より少ない幹細胞数でも移植を成立させられる可能性がある。したがって、本発明のＣＸＣＲ４作用増強剤は、造血幹細胞移植補助剤として使用することができる。
さらに、被験化合物のＣＸＣＲ４作用調節能の測定において、Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルを測定系に使用することで、ＣＸＣＲ４作用調節物質を効果的に感度よくスクリーニングすることができる。そこで、新規なＣＸＣＲ４作用調節物質、例えばＣＸＣＲ４アゴニスト若しくはアンタゴニスト等を得ることができ、各種疾患の治療に応用されうる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】マウス造血前駆細胞株（ＦＤＣＰ−ｍｉｘ）とＳＤＦ−１の結合能を、フローサイトメトリーで調べた結果を示す図である。（試験例１）
【図２】ＦＤＣＰ−ｍｉｘとＳＤＦ−１の結合能を蛍光強度で示す図である。（試験例１）
【図３】ＦＤＣＰ−ｍｉｘの走化性に及ぼす影響を示す図である。（試験例２）
【符号の説明】
【００３８】
ａ ＦＤＣＰ−ｍｉｘとＳＤＦ−１の結合（図１）
ｂ 抗ＳＤＦ−１抗体を加えた場合（図１）
ｃ ＦＤＣＰ−ｍｉｘとコントロールタンパク質の結合（図１）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルを有効成分として含有するケモカイン受容体ＣＸＣＲ４作用増強剤。
【請求項２】
Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルを有効成分として含有する造血幹細胞移植補助剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルは、下記一般式（Ｉ）：
【化１】
[式中、Ｒは、同一又は異なって水素原子又はＳＯ３Ｈを示し、ｎは１〜１０００の整数を示す。但し、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基１分子あたりのＳＯ３Ｈ基の数は０．１〜３である。]
で表されるＮ−アセチルノイラミン酸モノマー硫酸エステル若しくはＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー硫酸エステル、又はその薬学的に許容される塩である、ＣＸＣＲ４作用増強剤又は造血幹細胞移植補助剤。
【請求項４】
ＣＸＣＲ４の測定系において、請求項３に記載の一般式（Ｉ）で表されるＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルの相互作用を調べることを特徴とするＣＸＣＲ４作用調節物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
ＣＸＣＲ４の測定系において、被験化合物を加えた系と、請求項３に記載の一般式（Ｉ）で表されるＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルを加えた系での測定結果を比較することを特徴とするＣＸＣＲ４作用調節物質のスクリーニング方法。
【請求項１】
Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルを有効成分として含有するケモカイン受容体ＣＸＣＲ４作用増強剤。
【請求項２】
Ｎ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルを有効成分として含有する造血幹細胞移植補助剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルは、下記一般式（Ｉ）：
【化１】
[式中、Ｒは、同一又は異なって水素原子又はＳＯ３Ｈを示し、ｎは１〜１０００の整数を示す。但し、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基１分子あたりのＳＯ３Ｈ基の数は０．１〜３である。]
で表されるＮ−アセチルノイラミン酸モノマー硫酸エステル若しくはＮ−アセチルノイラミン酸ホモポリマー硫酸エステル、又はその薬学的に許容される塩である、ＣＸＣＲ４作用増強剤又は造血幹細胞移植補助剤。
【請求項４】
ＣＸＣＲ４の測定系において、請求項３に記載の一般式（Ｉ）で表されるＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルの相互作用を調べることを特徴とするＣＸＣＲ４作用調節物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
ＣＸＣＲ４の測定系において、被験化合物を加えた系と、請求項３に記載の一般式（Ｉ）で表されるＮ−アセチルノイラミン酸硫酸エステルを加えた系での測定結果を比較することを特徴とするＣＸＣＲ４作用調節物質のスクリーニング方法。
【図２】
【図３】
【図１】
【図３】
【図１】
【公開番号】特開２００７−２２９４０（Ｐ２００７−２２９４０Ａ）
【公開日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２０４３８７（Ｐ２００５−２０４３８７）
【出願日】平成１７年７月１３日（２００５．７．１３）
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【出願人】（３０２０６９８５９）マルキンバイオ株式会社 (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月１３日（２００５．７．１３）
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【出願人】（３０２０６９８５９）マルキンバイオ株式会社 (3)
【Ｆターム（参考）】
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